MXPA03011752A - Proceso para preparar 21-acetato de 11b,17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-1, 4-dieno-3, 20- diona. - Google Patents

Abstract

La presente invencion es un proceso novedoso para la transformacion de 17-acetato de 17a-hidroxi-6a-metilpregn-4-eno-3,20-diona (I) (ver formula) en 21-acetato de 11??, 17a,21-trihidroxi-6a-metilpregna-1,4-dieno-3,20-diona (VI). (ver formula).

Description

PROCESO PARA PREPARAR 21-ACETATO DE 11 ß , 17a, 21-TRIHIDROXI- 6 a-METILPREGNA- 1, 4 -DIENO-3 , 20 -DIONA REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Ninguna .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención es un proceso para transformar acetato de medroxiprogesterona (I) en 21-acetato de 11ß , 17a, 21-trihidroxi-6 a-metilpregna-l , 4-dieno-3,20-diona (VI) .

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA La A^deshidrogenación enzimática microbiana de esteroides se conoce por los expertos en la técnica. Biotechnology and Bioengineering, 37, 97-102 (19'91) describe la A1-des idrogenación de 21-acetato de 6a-metilhidrocortisona por Arthrobacter simplex en un solvente orgánico. La Patente de EE.UU. 4,684,610 describe un proceso para convertir esteroides 1 , 2 -saturados en esteroides 1,2-dehidro al poner en contacto el esteroide 1,2-saturado con A. simplex ó Bacillis cyclooxydans en presencia de un portador de electrón exógeno y un solvente P03/ie2-PUC de hidrocarburo aromático inmiscible en agua. La Patente de EE.UU. 4,749,649 describe el uso de eliminadores de especies tóxicas del oxígeno en la ?1-deshidrogenación microbiana de esteroides. La ??ß-hidroxilación enzimática microbiana de esteroides con microorganismos como Curvularia lunata se conoce por los expertos en la técnica, ver por ejemplo Patente de EE.UU. 3,419,470. La concentración del sustrato que experimenta ??ß-hidroxilación es bastante baja. Por ejemplo, la Patente de EE.UU. 3,530,038 menciona que la concentración máxima de sustratos de esteroide 17a-acetoxipregn-4-en-21-ol-3 , 20-diona y 17a, 21-diacetoxipregn-4-eno-3 , 20-diona es 0.5 g/L. La Patente Europea EP 0 042 451 Al nuevamente menciona que la cantidad de concentración del sustrato de esteroide no excede 0.5 g/L, la Patente de EE.UU. 4,353,985 no proporciona ejemplos específicos y utiliza 17a, 21-ortoésteres . La Patente de EE.UU. 4,588,683 menciona que la concentración del sustrato de esteroides de 17a, 20ß, 21-trihidroxipregn-4-eno-3 -ona es 0.5 g/L. La Patente de EE.UU. 4,898,693 menciona que la concentración del sustrato de esteroide de 6a-fluoro-17a-hidroxi-16a-metilpregn-4-eno-3 , 20-diona es 0.4 g/L. Todas menos la última patente enumerada anteriormente se refiere a la eliminación de una 14a-hidroxilación indeseada resultando en elevadas producciones de un producto 11ß- P03/162-PUC hidroxilado (80-92%) . Sin embargo, la carga del sustrato a la fermentación no excede 0.5 g/L. La Solicitud Japonesa Publicada 62-118898 describe el uso de C. lunata CI1690 (registrado en el Instituto de la Industria Microbiana, cepa No. 8515) a una concentración de sustrato de 10 g/L pero con la sustancia S y análogos de la misma, no con el sustrato de la presente invención. El proceso de la presente invención utiliza un cultivo diferente que el documento Japonés 68-118898 y proporciona elevadas producciones utilizando elevadas concentraciones del sustrato . La funcionalización del grupo metilo-C2i de pregnanos seguida por el desplazamiento con acetato para producir el 21 -acetato correspondiente se conoce por los expertos en la técnica. El documento GB 2,318,790 describe la transformación del grupo metilo-C2i de un esteroide ?1-??ß-hidroxilo en el esteroide 21-hidroxilo correspondiente mediante la funcionalización con un átomo de bromo seguido por el desplazamiento con acetato. El proceso de la presente invención no utiliza bromo. El documento GB 2,318,790 describe la transformación 17-acetato de 17a-hidroxi-6oc-metilpregn-4-eno-3 , 20-diona (I) en 11ß , 17a-dihidroxi-21-diyodo-6a-metilpregna-1, 4-dieno-3 , 20-diona (V) mediante una ?1-deshidrogenación microbiana mediante el uso de Nocardia P03/162-PUC simplex, ??ß-hidroxilación microbiana mediante el uso de C. lunata y 21-hidroxilación mediante el uso de bromo. La presente invención transforma al 17-acetato de 17a-hidroxi-6oc-metilpregn-4~eno-3 , 20-diona (I) en 11ß, 17oc-dihidroxi-21~ diyodo-6oc-metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20-diona (V) pero no utiliza bromo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se describe un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6oc-metilpregna-l , -dieno-3, 20-diona (VI) que comprende: (1) poner en contacto 17-acetato de 17a-hidroxi-6a-metilpregn-4-eno-3, 20-diona (I) con una ?1-des idrogenasa para producir 17 acetato de 17ct-hidroxi-6a~ metilpregna-1, 4-dieno-3 , 20-diona (II); (2) poner en contacto 17 acetato de 17a-hidroxi-6oc-metilpregna-l , 4-dieno-3 , 20-diona (II) con una 11ß-hidroxilasa para producir 17-acetato de 11ß, 17ot-dihidroxi-6 -metilpregna-l , 4-dieno-3 , 20-diona (III) ; (3) hidrolizar 17-acetato de 11ß, 17a-dihidroxi- 6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20-diona (III) para producir 11ß, 17a-dihidroxi-6a-metilpregna-l , 4-dieno-3 , 20-diona (IV) ; (4) poner en contacto ??ß, 17a-dihidroxi-6ct-metilpregna-1, 4-dieno-3 , 20-diona (IV) con yodo, un catalizador, una base suave para producir 11ß,17a- P03/162-PUC dihidroxi-21-diyodo-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20-diona (V) y (5) poner en contacto la 11ß , 17ct-dihidroxi-21-diyodo-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20-diona (V) con una sal de ácido acético. También se describe un esteroide diyodo de la fórmula : Además se describe un proceso para el retiro de un material residual no hidroxilado que comprende : (1) poner en contacto 17-acetato de 17oc-hidroxi-6a-metilpregn-4 -eno-3 , 20-diona (I) con una ?1-deshidrogenasa para producir 17 acetato de 17a-hidroxi-6a~ metilpregna-1 , 4-dieno-3 , 20-diona (II) ; (2) cristalizar el 17 acetato de 17a-hidroxi-6a-metilpregna-l; 4-dieno-3 , 20-diona (II) para producir un solvente no polar o una mezcla de solvente. Además, se describe un proceso para la purificación 17-acetato de 11ß , 17a-dihidroxi-Sot-metilpregna-1, 4-dieno-3 , 20-diona (III) mediante una 11ß- P03/162-PUC hidroxilasa que comprende: (1) la cristalización de un solvente seleccionado a partir del grupo que comprende tolueno, benceno, xileno, acetato de n-butilo y mezclas de los mismos con solventes de hidrocarburos seleccionados a partir del grupo que comprende hexano, heptano, isooctano, ciclohexano y metilciclohexano .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los primeros dos pasos individuales de la presente invención, la A1-deshidrogenación microbiana con A. simplex y la ??ß-hidroxilación con C. lunata se conocen por los expertos en la técnica. La transformación química de un grupo metilo-C2i de pregnano en el 21-acetato correspondiente también se conoce generalmente por los expertos en la técnica. Sin embargo, el uso del esteroide diyodo (V) es novedoso.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DEL PASO DE A1-DESHIDROGENACIÓN El 17-acetato de 17a-hidroxi-6a-metilpregn-4-eno- 3,20-diona (I) se deshidrogena para formar 17-acetato de 17a-hidroxi-6 -metilpregna-l , -dieno-3 , 20-diona (II) como se expone a continuación y más específicamente como se expone en los EJEMPLOS 1-11. La conversión de 17-acetato de 17a-hidroxi-6oc- P03/162-PUC metilpregn-4-eno-3 , 20-diona (I) en 17 acetato de 17a-hidroxi-6a-metilpregna-l , 4-dieno-3 , 20-diona (II) puede llevarse a cabo mediante diferentes preparaciones enzimáticas de A. simplex. La preparación enzimática puede estar en forma de un cultivo de crecimiento activo, un concentrado de células completas, un extracto libre celular o como células inmovilizadas. Preferiblemente, se utilizan los concentrados de células completas . En un sistema bifásico, se prefiere utilizar concentrados de células completas. La fase no acuosa contiene 17-acetato de 17cc-hidroxi-6a-metilpregn-4-eno-3, 20-diona (I), un portador de electrón exógeno y un solvente orgánico inmiscible en agua. Los aceptores de electrones exógenos operables se seleccionan del grupo que comprende menadiona, bisulfito de menadiona, 1,4-naftoquinona, metosulfato de fenazina, etosulfato de fenazina y compuestos tipo vitamina K. Se prefiere que el portador de electrón exógeno se seleccione del grupo que comprende menadiona y 1, 4-naftoquinona; se prefiere aún más que el portador de electrón exógeno sea menadiona. El portador de electrón exógeno se agrega en cantidades catalíticas, por ejemplo en cantidades que abarcan desde aproximadamente 4 a 6% (peso del portador de electrón exógeno/peso 17-acetato de 17a-hidroxi-6a-metilpregn-4-eno-3, 20-diona (I)) . Se prefiere aún más que el portador de P03/162-PUC d electrón exógeno esté presente en una cantidad de aproximadamente 5%. Los solventes orgánicos inmiscibles en agua operables se seleccionan del grupo que comprende tolueno, xileno, benceno, heptano, cloruro de metileno, n-octanol, tetracloruro de carbono y n-alcoholes superiores o mezclas de los mismos. Se prefiere que el solvente orgánico inmiscible en agua sea una mezcla de cloruro de metileno y tolueno. Se prefiere que el solvente orgánico inmiscible en agua esté presente en un intervalo de aproximadamente 1 a 99%; se prefiere aún más que el mismo esté presente en un intervalo de aproximadamente 60 a 95%. Se prefiere que 17-acetato de 17cc-hidroxi-6a-metilpregn-4-eno-3 , 20-diona (I) esté presente en una concentración que abarca desde aproximadamente 10 g/L a 125g/L; se prefiere aún más que 17-acetato de 17a-hidroxi-6ot-metilpregn-4-eno-3 , 20-diona (I) esté presente en una concentración que abarca desde aproximadamente 50 g/L a 100 g/L. La fase acuosa se prepara al mezclar catalasa, agua y un concentrado celular de A . simplex. Se prefiere que la fase acuosa contenga catalasa. La fase acuosa se agrega agitándose para iniciar la bioconversión. La temperatura se regula a 30° y el pH se regula entre 8.7 y 8.9 mediante la adición de una base, preferiblemente hidróxido y con mayor preferencia hidróxido P03/162-PUC de sodio. Preferiblemente, la mezcla de reacción se enfria a chorro, tanto con aire (1 parte) como con nitrógeno (2 partes) y se le permite reaccionar hasta que sobre menos que aproximadamente 1% de 17-acetato de 17cc-hidroxi-6a-metilpregn-4-eno-3 , 20-diona (I) residual. Si es necesario, se agrega una fuente adicional de enzima para asegurar el término de la reacción. Cuando la reacción está completa, se desactiva la agitación, la alimentación de aire y nitrógeno y la regulación del pH. Luego se separan las fases y se pueden utilizar solventes orgánicos inmiscibles en agua adicionales para volver a extraer la fase acuosa para una recuperación adic onal. Nuevamente se finaliza la agitación y se le permite a la fase acuosa dividirse en partes . La fase del solvente orgánico inmiscible en agua se drena del reactor y se desecha la capa celular acuosa gastada. La fase del solvente orgánico inmiscible en agua se filtra para asegurar el retiro celular. El filtrado depurado se concentra y se aisla 17-acetato de 17oc-hidroxi-6cc-metilpregna-1, 4-dieno-3 , 20-diona (II) deseado mediante métodos que se conocen por los expertos en la técnica.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DEL PASO DE 11ß-HIDROXILACIÓN El 17 acetato de 17oc-hidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20-diona (II) se hidroxila para formar 17 acetato P03/162-PUC de 11ß, 17 -dihidroxi-6 -metilpregna-l , 4-dieno-3 , 20-diona (III) como se conoce por los expertos en la técnica y más específicamente como se expone a continuación y más específicamente como se expone en los EJEMPLOS 12-14. El 17 acetato de 17a-hidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20-diona (II) se hidroxila microbiológicamente en la posición -11 para producir 17 acetato de 11ß,17a-dihidroxi-6a-metilpregna-l , 4-dieno-3 , 20-diona (III). Se pueden utilizar en los procesos de la invención cualquiera de los hongos filamentosos pertenecientes al género Curvularia (Cochliobolus, Pseudocochliobolus, teleomorfos) capaces de ??ß-hidroxilar el 17 acetato de 17a-hidroxi-6a-metilpregna-1, 4-dieno-3 , 20-diona (II). Preferiblemente, se utilizan Curvularia lunata (Cochliobolus lunatus, Pseudochocliobolus lunatus, teleomorfos) . Más preferiblemente, se utiliza Curvularia lunata NRRL 2380 (ATCC 12017) . La hidroxilasa fungica puede utilizarse en forma de un cultivo de crecimiento activo, un concentrado de células completas o un extracto de células libres. Preferiblemente, el hongo se cultiva en un cultivo sumergido en condiciones aeróbicas, utilizando un procedimiento reconocido en la técnica y la reacción de ??ß-hidroxilación se lleva a cabo in situ. El hongo deseado puede cultivarse en condiciones P03/162-PUC identificadas en los EJEMPLOS 12-14 utilizando los ingredientes especificados, u otras fuentes adecuadas de carbono y nitrógeno como se sabe por los expertos en la técnica. Generalmente, se utiliza un procedimiento de siembra vegetativa primaria y secundaria en la preparación para la hidroxilación fúngica de esteroide. Alternativamente, se puede utilizar una siembra vegetativa primaria directamente para inocular el medio de bioconversión. Los cultivos de siembra vegetativa primaria pueden incubarse durante un período de aproximadamente 24 a 72 horas (preferiblemente de aproximadamente 48 horas) a una temperatura entre aproximadamente 22° y 37° (preferiblemente de aproximadamente 28°) , y a un pH entre aproximadamente 3.0 y 7.5. Un medio de siembra vegetativa secundaria se inocula con aproximadamente 0.006% a 0.1% (v/v) de cultivo de siembra vegetativa primaria, pero normalmente con aproximadamente 0.012% (v/v) y se incuba durante un período de aproximadamente 36 a 72 horas (preferiblemente de aproximadamente 48 a 65 horas) a una temperatura entre aproximadamente 22° y 37° (preferiblemente aproximadamente 28°) . El pH del medio secundario de siembra puede ser de aproximadamente 2.5 y 5.0, pero preferiblemente 3.0 y 4.0. El medio de bioconversión, que puede ser igual o similar al medio P03/162-PUC vegetativo de siembra primaria, se inocula con aproximadamente 1% a 10% (v/v) del cultivo vegetativo de siembra secundaria, pero normalmente con aproximadamente 3% (v/v) . Las condiciones de fermentación para la bioconversión pueden ser iguales a las utilizadas para el cultivar el cultivo vegetativo de siembra secundaria. Luego del período inicial de incubación de aproximadamente 9 a 72 horas (preferiblemente de aproximadamente 18 a 24 horas) , se agrega al cultivo de bioconversión 17-acetato de 17a-hidroxi-6a-metilpregna-l , -dieno-3 , 20-diona (II), preferiblemente micronizado. El 17 acetato de 17a-hidroxi-6oc-metilpregna-l , 4-dieno-3 , 20-diona (II) micronizado puede agregarse como un polvo seco o suspensión acuosa, ya sea como una sola adición, una serie de adiciones o una alimentación continua. Se prefiere utilizar el sustrato micronizado de 17-acetato de 17a-hidroxi-6ct-metilpregna-1, 4-dieno-3 , 20-diona (II) a una concentración mayor que 1 g/L, con mayor preferencia mayor que 2.5 g/L, incluso con mayor preferencia mayor que 5 g/L. Se procede a la bioconversión de 17-acetato de 17a-hidroxi-6a-metilpregna-1, -dieno-3, 20-diona (II) en 17-acetato de 11ß,17a-dihidroxi-6a-metilpregna-l , 4-dieno-3 , 20-diona (III) durante un período de tiempo entre 6 y 12 días, pero normalmente entre 9 y 10 días. La velocidad y grado de la ??ß-hidroxilación P03/162-PUC puede mejorarse en gran medida al: (i) cultivar los hongos seleccionados y llevar a cabo la bioconversion en presencia de un detergente . El detergente puede seleccionarse a partir del grupo que comprende detergentes no iónicos, pero preferiblemente del subgrupo que comprende alquilfenoles etoxilados. Con mayor preferencia, se utiliza el polietoxietanol de oc ilfenoxilo; (ii) cultivar el hongo seleccionado y llevar a cabo la bioconversion, en presencia de un aceite natural . El aceite natural se puede seleccionar entre otros, del grupo que comprende aceite de ricino, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de manteca de cerdo, aceite de linaza, aceite de oliva, aceite de cacahuate, aceite de colza, aceite de cártamo, aceite de soya, aceite de girasol y aceite de germen de trigo. Preferiblemente, se utiliza el aceite de soya; (iii) usar una adición regulada de nitrato. La fuente de nitrato puede seleccionarse, entre otros, del grupo que comprende nitrato de amonio, nitrato de calcio y nitrato de sodio. Preferiblemente se utiliza el nitrato de amonio. El nitrato puede agregarse en cualquier momento después de la adición del sustrato, pero preferiblemente entre aproximadamente 17 y 24 horas después de la adición del sustrato; (iv) utilizando un desplazamiento regulado de la temperatura de aproximadamente 28° a 37°. El desplazamiento térmico puede llevarse a cabo en cualquier momento después P03/162-PUC de la adición del sustrato, pero preferiblemente entre aproximadamente 17 a 24 horas después de la adición del sustrato; (v) usar cualquier combinación de las metodologías identificadas en los incisos (i) - (iv) . Una vez que está completa la bioconversión del 17 acetato de 17oc-hidroxi-6a-metilpregna-l , 4-dieno-3 , 20-diona (II) en 17 acetato de 11ß, 17a-dihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20-diona (III), se puede aislar el 17 acetato de 11ß, 17a-dihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20-diona (III) usando cualquiera de los procedimientos conocidos en la técnica. Preferiblemente, el concentrado íntegro se extrae con un solvente orgánico inmiscible en agua, como acetato de etilo o acetato de butilo y el 17 acetato de 11ß,17a-dihidroxi-6a-metilpregna-l , -dieno-3 , 20-diona (III) es aislado mediante cristalización. El intermediario crudo ??ß-hidroxilado, 17 acetato de 11ß, 17ct-dihidroxi-6a-metilpregna-l , 4-dieno-3 , 20-diona (III) , se purifica mediante cristalización en un solvente no polar o una mezcla de solvente. Se prefiere que los solventes de cristalización incluyan un solvente seleccionado a partir del grupo que comprende tolueno, benceno, xileno, acetato de n-butilo y mezclas de los mismos con solventes de hidrocarburo seleccionados del grupo que comprende hexano, heptano, isooctano, ciclohexano y metilciclohexano . El solvente de cristalización preferido P03/1S2-PUC es una mezcla de tolueno/isooctano (1/1). La cristalización se lleva a cabo a temperaturas tan bajas como aproximadamente -40° o tan elevadas como aproximadamente +25°. La temperatura preferida de cristalización es de aproximadamente 0o.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DEL PASO DE LA FORMACIÓN DE 21-ACETATO El 17 acetato de 11ß, 17a-dihidroxi-6cc-metilpregna-1, 4-dieno-3 , 20-diona (III) purificado se deacetila para producir el 11ß , 17oc-dihidroxi- 6a-metilpregna-1, 4-dieno-3 , 20-diona (IV) correspondiente. La deacilación o hidrolización se logran mediante un tratamiento con una base seleccionada a partir del grupo que comprende carbonato, hidróxido o alcóxido Ci-C4. Se prefiere que la base se seleccione del grupo que comprende carbonato en metanol, hidróxido en metanol acuoso o metóxido . Se prefiere aún más que la base sea metóxido. El método preferido es tratamiento del sustrato con metóxido sódico en metanol aproximadamente a 25°. El etanol, isopropanol n-propanol y otros alcoholes inferiores también son solventes operables. Las sales de alcóxido de otros elementos electropositivos como el potasio, litio, magnesio, calcio, titanio, aluminio también son operables. La reacción se lleva a cabo a temperaturas tan bajas como aproximadamente -40° o tan elevadas como aproximadamente P03/1S2-PUC +65°. La gama preferida de temperatura es de aproximadamente 0 a 25° . La temperatura más preferida es de aproximadamente 25° debido a que la reacción se completa en menos de 3 horas a esta temperatura. Luego, el 11ß, 17a-dihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20-diona (IV) se acetoxila-21 para producir 17-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l , 4-dieno-3, 20-diona (VI) deseado. Esta acetoxilación-21 se efectúa mediante el tratamiento con yodo, un catalizador como bromuro de calcio, y una base suave como hidróxido de calcio. Se prefiere utilizar una mezcla de óxido de calcio, hidróxido de calcio y bromuro de calcio en metanol. Este proceso es operable con aproximadamente 1.5-2.5 equivalentes de yodo y aproximadamente 1.0-10 equivalentes de hidróxido y/u óxido de calcio. El proceso es operable con tan poco como 0.05 equivalentes de bromuro de calcio. Se prefieren utilizar 2.0 equivalentes de yodo, 1.2 equivalentes de óxido de calcio, 3.75 equivalentes de hidróxido de calcio y 0.7 equivalentes de bromuro de calcio. Es importante agregar el yodo con mayor lentitud de los que se consume para evitar una yodatación excesiva lo cuál produce 17 -carbometoxi- 6a-metil-lip, 17a-dihidroxiandrosta-1 , 4-dien-3 -ona . La temperatura de reacción debe ser mayor que +10°, preferiblemente mayor que +25°, con mayor preferencia +25° durante la adición de la P03/162-PUC primera mitad del yodo a fin de evitar la formación de 17ß-carbometoxi-6a-metil-lip , 17a-dihidroxiandrosta-l , -dien-3 -ona. La temperatura de reacción deberá ser menor a +40°, preferiblemente menor a +25°, con mayor preferencia a 0o durante la segunda mitad de la agregación del yodo a fin de minimizar la degradación del producto diyodo. El 11ß, 17a-di idroxi-21-diyodo-6oc-metilpregna-1, 4-dieno-3 , 20-diona (V) finalmente se pone en contacto con una sal de ácido acético, preferiblemente trietilamonio o acetato de potasio. Sin embargo, el sodio, magnesio u otra sal de amina o metal del ácido acético es operable.

DEFINICIONES Las siguientes definiciones y explicaciones son para los términos según se utilizan durante este documento completo incluyendo tanta la especificación y las reivindicaciones . Todas las temperaturas son en grados Celsius. En esta descripción, las siglas RPM se refieren a revoluciones por minuto. Las siglas SCFM se refieren a pies cúbicos estándar por minuto. Las siglas TLC se refieren a una cromatografía en capa fina . Las siglas HPLC se refieren a una cromatografía P03/162-PUC en fase líquida a alta presión. psig se refiere a presión manomérica en libras por pulgada cuadrada. Las siglas DO se refieren a oxígeno disuelto. Las siglas RO se refieren a osmosis inversa. Las siglas SLM se refieren a litros estándar por minuto . Las siglas WM se refieren a volumen por minuto . Las siglas OUR se refieren a velocidad de absorción de oxígeno. Las siglas DDQ se refieren a 2 , 3-dicloro-5, 6-diciano-1 , 4-benzoquinona . En esta descripción, el término cromatografía (en columna y cromatografía rápida) se refieren a la purificación/separación de los compuestos expresados como (soporte, eluyente) . Se entiende que las fracciones apropiadas se agrupan y concentran para producir los compuestos deseados . En esta descripción, el término sal farmacéuticamente aceptable se refiere a aquellas propiedades y/o sustancias que son aceptables para el paciente desde el punto de vista farmacológico/toxicológico y al químico farmacéutico que las fabrica desde un punto de vista físico/químico con respecto a la composición, formulación, estabilidad, biodisponibilidad y aceptación P03/162-PUC por el paciente. Cuando se utilizan pares solventes, las proporciones de solventes que se utilizan son en volumen/volumen (v/v) . Cuando se utiliza la solubilidad de un sólido en un solvente, la proporción del sólido al solvente está en peso/volumen (peso/v) .

EJEMPLOS Sin más elaboración, se piensa que utilizando la descripción precedente el experto en la técnica puede llevar a la práctica plenamente esta invención. Los siguientes ejemplos detallados describen cómo preparar los diversos compuestos y/o llevar a cabo los diversos procesos de la invención, que simplemente se deberán interpretar como ilustrativos y no inclusivos de la descripción precedente en ninguna forma. Aquellos expertos en la técnica reconocerán rápidamente las variaciones apropiadas a partir de los procedimientos en cuanto a reactivos y a las condiciones de reacción y técnicas.

EJEMPLO 1 Bioconversión de 17-acetato de 17a-hidroxi-6a-metilpregn-4- eno-3 , 20-diona (I) en 17 acetato de 17a-hidroxi-6a- metilpregna-l,4-dieno-3, 20-diona (II) P03/162-PUC Se mezclan 17-acetato de 17a-hidroxi-6a-metilpregn-4-eno-3 , 20-diona (I, 500 g) y menadiona (10 g) con tolueno (2200 mi) y cloruro de metileno (2300 mi) . La fase acuosa se prepara como una mezcla de catalasa (0.25 g) , un concentrado celular de A. simplex (obtenido mediante fermentación, concentrado para que contenga aproximadamente 20% de sólidos secos, 1000 mi) y agua (1000 mi) . La fase acuosa se agrega a la mezcla de tolueno agitada vigorosamente (360 RPM) para comenzar la bioconversión. La temperatura se regula a 30° utilizando un baño en agua y el pH se regula para tener entre 8.7 y 8.9 usando adiciones (2N) de hidróxido de sodio. La mezcla de la reacción se enfría a chorro con un flujo regulado de aire (0.3 SCFH) y nitrógeno (0.6 SCF ) , respectivamente. Se hace reaccionar la mezcla hasta que queda menos de 1% de la materia prima residual (I) . Si es necesario, se agregan más células de A. simplex durante la reacción para asegurar su término . Cuando la reacción está completa, se desactiva la agitación, alimentación de nitrógeno, alimentación de aire y regulación del pH y la fase acuosa se deja flotar. La mezcla de cloruro de metileno/tolueno se extrae del fondo del reactor. Se agrega más cloruro de metileno (3000 mi) en el crisol de bioconversión y se activa el agitador para extraer aún más la capa acuosa. La agitación finaliza y se P03/162-PUC deja que suba la fase acuosa. El extracto de cloruro de metileno empobrecido se drena del reactor y se desecha la capa celular acuosa gastada. Se filtran los extractos ricos y empobrecidos. El filtrado depurado se concentra hasta formar una lechada espesa. Los sólidos se recolectan mediante filtración, se lavan con octano ramificado (450 mi) y se secan en un horno al vacío a 50° para producir el compuesto del titulo (II) .

EJEMPLOS 2-11 Bioconversión de 17-acetato de 17a-hídroxi-6a-metilpregn-4- eno-3 , 20-diona (I) en 17 acetato de 17oc-hidroxi-6oc- metilpregna-1 , 4-dieno-3 , 20-diona (II) El siguiente procedimiento general del EJEMPLO 1 y la elaboración de variaciones no críticas sin alterar la cantidad de células, agua y la reacción se exponen a continuación, se obtiene el compuesto del título (II) .

P03/162-PUC EJEMPLO SUSTRATO CÉLULAS AGUA TIEMPO DE (g) (mi) (mi) REACCIÓN (horas) 2 500 1000 0 161 3 500 1000 0 162 4 500 1000 500 95 5 500 1000 1000 97 6 500 750 1250 146 7 500 1000 1000 97 8 500 1000 1000 125 9 500 1000 1000 120 10 500 1000 1000 120 11 500 1000 1000 117 EJEMPLO 12 Bloconversión de 17 acetato de 17a-hidroxi-6ct-metilpregna- 1, 4-dieno-3 , 20-diona (II) en 17-acetato de 11ß,17a- dihidroxi~6a-metilpregna-l , 4-dieno-3 , 20-diona (III) La bioconversión de 17 acetato de 17oc-hidroxi-6a-metilpregna-1 , 4-dieno-3 , 20-diona (II) en 17-acetato de ??ß, 17 -dihidroxi-6a-metilpregna-l , 4-dieno-3 , 20-diona (III) se lleva a cabo utilizando un cultivo sumergido de Curvularia lunata NRRL 2380 (ATCC 12017) a una escala de 10 L.

(A) Etapa de siembra primaria Se deshielan células vegetativas congeladas de C. lunata NRRL 2380, se transfieren a placas de papa-dextrosa- P03/162-PUC agar (PDA) y se incuban a 28° durante 72 horas, se utilizan tapones miceliales individuales (6-7 mm de diámetro) para inocular matraces de agitación granulados y siliconizados de 500 mi que contienen 100 mi del medio de siembra primaria. El medio de siembra primaria comprende (por litro de agua de osmosis inversa) ; dextrina, 50 g; harina de soya, 35 g; cerelosa, 5 g; cloruro de cobalto hexahidratado, 2 mg; desespumante de silicona (SAG 471) 0.5 mi, preesterilización a pH de 7.0-7.2, regulado con hidróxido de sodio (2N) . Curvularia lunata NRRL 2380 se incuba durante 48 horas a 28°, utilizando una unidad incubadora-agitador con ambiente controlado ajustado a 280 rpm, (carrera orbital de 1") .

(B) Etapa de siembra secundaria Se inoculan fermentaciones de siembra secundaria de diez litros utilizando un cultivo vegetativo de siembra primaria (1.2 mi; tasa de inoculación 0.012% [v/v] ) . El medio de siembra secundaria contiene (por litro de agua de osmosis inversa) : glucosa anhidra (20 g) ; harina de soya (20 g) , aceite de soya (30 mi) ; polietoxietanol de octilfenoxilo (0.25 mi), riboflavina (10 mg) , desespumante de silicona (SAG 471, 0.5 mi); magnesio heptahidratado (1 g) , fosfato monobásico de potasio (0.74 g) , preesterilización a pH = 2.95-3.00 y el pH se regula con P03/162-PUC ácido sulfúrico concentrado. Los termentadores, que contienen el medio de siembra secundaria, se esterilizan durante 20 minutos a 121° usando tanto vapor en camisa como inyectado. La velocidad de agitación durante la esterilización es 200 rpm. Después de la esterilización, el pH del medio se ajusta en 3.0 usando ácido sulfúrico estéril (5%) . Se incuba Curvularia lunata NRRL 2380 a 28° usando los siguientes parámetros iniciales: agitación, 100 rpm; contrapresión = 5 psig; flujo de aire = 2.5 SL (0.25 WM) ; bajo punto de determinación de oxígeno disuelto (DO) , 30%; regulación del, pH, ninguna. Cuando baja inicialmente el DO al 30%, el flujo de aire se incrementa a 5 SLM (0.5 WM) . Cuando el cultivo nuevamente alcanza un bajo DO, se mantiene un 30% de DO usando un control de agitación. Una vez que se observa una caída notable en la velocidad de absorción de oxígeno (OUR) de los cultivos (generalmente una caída de 12-14 a 8-9 mmol/L/hr) , conforme agotan la glucosa se cosechan cultivos de siembra secundaria cinco horas después (aproximadamente 60-65 horas después de la inoculación) .

(C) Bioconversión de esteroide Se inoculan las fermentaciones de diez litros para la bioconversión de esteroide utilizando 300 mi de cultivos de siembra secundaria vegetativa (tasa de P03/1S2-PUC inoculación 3.0%) . El medio de la bioconversión de esteroide es esencialmente igual al medio de siembra secundaria, con la excepción de que se incrementa la cantidad de polietoxietanol de octilfenoxilo de 0.25 ml/L a 2.5 ml/L y la glucosa anhidra disminuye de 20 g/L a 15 g/L. Las condiciones de esterilización y la regulación del pH son como se describen para el medio de siembra secundaria. Curvularia lunata NRRL 2380 se incuban a 28° usando esencialmente los mismos parámetros iniciales que los usados para el cultivo de siembra secundaria, con la excepción de que la velocidad inicial de agitación se incrementa de 100 rpm a 200 rpm. Cuando primero disminuye el DO a 30%, el flujo de aire se aumenta de 2.5 SLM (0.25 WM) a 5 SLM (0.5 WM) . Luego de este cambio inicial de flujo de aire, una vez que el DO alcanza 30% nuevamente, se mezcla 17 acetato de 17a-hidroxi~6a-metilpregna-l , 4-dieno-3,20-diona micronizado (II, 80 g) en polietoxietanol de octilfenoxilo (0.2%, 500 mi) y se agrega a la fermentación. En este punto, el OUR del cultivo normalmente se estaría en el intervalo de 9.5-10.5 mmol/L/h (generalmente 18-24 horas después de la inoculación) . Cuando el OUR del cultivo disminuye entre 6.5-6.0 mmol/L/h (generalmente 17-18 horas después de la adición del sustrato) , se disuelve nitrato de amonio (7.2 g) en RO, se agrega agua (50 mi) a la fermentación y la temperatura de incubación se incrementa P03/162-PUC gradualmente de 28° a 37° (2° cada 15 minutos) . Luego del cambio inicial en el flujo de aire, la regulación de la agitación, hasta un máximo de 550 rpm se utiliza durante la fermentación para mantener el DO a 30%. Una vez que se logra la máxima agitación, se utiliza la contrapresión, en incrementos de 2 psig, para mantener el DO. La bioconversión está completa en un periodo de 9-10 días conteniendo 68-70 g del concentrado de fermentación del compuesto del titulo, 17-acetato de 11ß, 17a-dihidroxi-6a-metilpregna-1 , 4-dieno-3 , 20-diona (III) . Los cultivos de bioconversión se analizan a diario utilizando HPLC para determinar 17-acetato de 11ß, 17oc-dihidroxi-6a-metilpregna-l,4-dieno-3, 20-diona (III) . Se llevan a cabo extracciones de los cultivos completos usando dos volúmenes de acetona caliente, agitando constantemente durante una hora. Las células se separan de la mezcla de acetona acuosa mediante centrifugación (3,000 x g durante 10 minutos) y se seca una alícuota en nitrógeno. Los extractos de esteroide se vuelven a disolver en un volumen apropiado de metanol, conteniendo 17-acetato de 17a-hidroxi~6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20-diona como el patrón interno. Las condiciones para el HPLC son las siguientes : cromatógrafo Spectra-Physics provisto con una columna de fase inversa C18, columna (150 x 4.6 mm) ; temperatura de columna 30°; fase P03/162-PUC móvil, metanol/acetonitrilo/O .25% de ácido fosfórico (10/60/30, v/v/v) ; velocidad de flujo = 1 ml/minuto; detección, 240 nm; tiempo de funcionamiento = 10 minutos.

(D) Procedimiento de aislamiento Se mezcla bien la extracción del concentrado íntegro. Se agrega un agente floculante al caldo y tanto se recuperan mediante centrifugación los sólidos concentrados. Los sólidos concentrados se extraen con acetato de butilo y el extracto concentrado se recupera mediante centrifugación. El extracto se depura y concentra mediante destilación hasta un volumen especifico y se enfría para cristalizar el producto. La suspensión acuosa transparente se filtra y el licor madre se guarda para aislar los cristales del segundo cultivo. Los cristales húmedos se vuelven a disolver en acetato de butilo caliente y la mezcla se concentra hasta desaturarse y luego se enfría para cristalizar el producto. La lechada de cristales se filtra y el sedimento se lava con octano ramificado y se seca. El producto puede volverse a cristalizar en acetato de butilo o tolueno para mejorar la calidad. Los sólidos enriquecidos también pueden extraerse con acetona. La lechada de acetona se centrifuga para retirar la masa celular. El extracto de acetona enriquecida se depura y concentra mediante destilación en vacío hasta P03/162-PUC obtener una lechada acuosa. La lechada se extrae con acetato de butilo y el extracto orgánico se depura, se concentra mediante destilación en vacío hasta obtener un volumen específico y se enfría para cristalizar el producto. La lechada de cristales se filtra y el licor madre se guarda para aislar un los cristales del segundo cultivo. Los cristales húmedos se vuelven a disolver en acetato de butilo caliente y la solución se concentra hasta el punto de saturación y luego se enfría para cristalizar el producto. La lechada de cristales se filtra y el sedimento se lava con octano ramificado y se seca. El producto puede volver a cristalizarse con acetato de butilo o tolueno para mejorar la calidad.

EJEMPLO 13 Bioconversion de 17 acetato de 17a-hidroxi-6a-metilpregna- 1, 4-dieno-3 , 20-diona (II) en 17-acetato en ?1ß,17a- dihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20-diona (III) Siguiendo el procedimiento general del EJEMPLO 12 y no haciendo variaciones críticas, pero usando el 17 acetato de 17a-hidroxi-6a-metilpregna-l , 4-dieno-3 , 20-diona (II) a una concentración de sustrato de aproximadamente 6 g/L, se obtiene el compuesto del título.

P03/162-PUC EJEMPLO 14 Bioconversión del 17 acetato de 17a-h.idroxi-6a-metilpregna- 1, 4-dieno-3 , 20-diona (II) en 17-acetato de 11ß,17 -, di idroxi-6 -metilpregna-l , 4-dieno-3 , 20-diona (III) La bioconversión del 17 acetato de 17a-hidroxi- 6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20-diona (II) en 17-acetato de 11ß, 17a-dihidroxi-6a-metilpregna-l , 4-dieno-3 , 20-diona (III) se lleva a cabo usando un cultivo sumergido de Curvularia Innata NRRL 2380 (ATCC 12017) a escala en matraz de agitación.

(A) Etapa de siembra primaria Las condiciones de incubación y el medio de siembra para C. lunata NRRL 2380 son como se describen en el EJEMPLO 12.

(B) Etapa de siembra secundaria Se inoculan cien mililitros de medio de siembra secundaria, en un matraz de agitación siliconizado de 500 mi, usando una gota del cultivo vegetativo de siembra primaria. El medio de siembra secundaria contiene (por litro de agua de osmosis inversa) ; cerelosa, 20 g; dextrina, 50 g; harina de soya, 35 g aceite de soya, 30 mi; polietoxietanol de octifenoxilo, 0.25 mi; desespumante de silicona (SAG 471), 0.5 mi; pre-esterilización a pH = P03/162-PUC 2.95-3.00 regulado con ácido sulfúrico concentrado. Curvularia lunata NRRL 2380 se incuba durante 48-50 horas a 28° una incubadora-agitador con ambiente controlado establecida en 275 rpm. (carrera orbital de 2") .

(C ) Bioconversión de esteroide Se inoculan cien mililitros de medio para bioconversión de esteroide, en un matraz de agitación granulado y siliconizado de 500 mi, usando 3 mi de cultivo vegetativo de siembra secundaria (tasa de inoculación 3.0%) . El medio de bioconversión de esteroide es esencialmente igual que el medio de siembra secundaria, con la excepción de que se aumenta el polietoxietanol de octilfenoxilo a una cantidad de 0.25 ml/L a 2.5 ml/L y el pH de esterilización se regula a 3.95-4.00 con ácido sulfúrico concentrado. Se incuba inicialmente Curvularia lunata NRRL 2380 a 28° usando esencialmente los mismos parámetros que los usados para el ¦ cultivo de siembra secundaria. Aproximadamente a las 17-18 horas después de la inoculación, se agrega 1 g de 17 acetato de 17ct-hidroxi-6a-metilpregna-1 , -dieno-3 , 20 -diona (II) micronizado en la fermentación a manera de polvo seco. Aproximadamente 22-24 horas después de la adición del sustrato, se agregan 0.5 mi de solución de nitrato de amonio (7.2 g por 50 mi de agua de osmosis inversa) en la fermentación y el cultivo se P03/162-PUC incuba aún más a 37° agitándose (275 rpm, carrera orbital de 2") . La bioconversión termina 8-11 días conteniendo el concentrado de fermentación, aproximadamente 0.90 g de 17-acetato de 11ß, 17a-dihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20-diona (III) . Los cultivos de bioconversión se analizan periódicamente para determinar 17-acetato de 11ß,17a-dihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20-diona (III) siguiendo el procedimiento descrito en el EJEMPLO 12.

EJEMPLO 15 Transformación de 17-acetato de 11ß, 17oc-dihidroxi-6a- metilpregna-1, 4 -dieno-3, 20-diona (III) en 11ß,17a- dihidroxi-6oc-metilpregna-l , 4-dieno-3 , 20-diona (IV) Se agrega metóxido de sodio (1.4175 g, 26.2403 mM, 1.05 eq.) en metanol (25%, 6.0 mi) a una mezcla de 17-acetato de 11ß, 17a-dihidroxi-6cc-metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20-diona (III, EJEMPLO 12, 9.9961 g, 24.9578 mM) en cloruro de metileno (24 mi) y metanol (10 mi) . La mezcla se agita a 20-25° durante 2 horas. Luego la reacción se extingue con ácido acético (1.6 mi, 1.678 g, 27.95 mM, 1.12 eq.), se diluye con agua/metanol (1/1; 40 mi) , se agita a 20-25° durante una hora, luego se diluye con agua (100 mi) y se concentra en presión reducida. El residuo se diluye con metanol (20 mi) y agua (40 mi) , se concentra en presión reducida y se filtra la lechada. El sedimento se lava con P03/162-PUC agua (20 mi) y se seca mediante un flujo de nitrógeno para producir el compuesto del titulo.

EJEMPLO 16 Transformación de 11ß, 17cc-dihidroxi-6oc-metilpregna-l,4- dieno-3 , 20-diona (IV) en 11ß, 17a-dihidroxi-21-diyodo-6a- metilpregna-1 , 4-dieno-3 , 20-diona (V) Una lechada de 11ß, 17a-dihidroxi-6a-metilpregna-l,4-dieno-3, 20-diona (IV, EJEMPLO 15, 30.0050 g, 83.7006 mM) , óxido de calcio (5.7275 g, 102.13 mM, 1.22 eq. ) , hidróxido de calcio (23.2488 g, 313.79 mM, 3.75 eq.) y bromuro de calcio (0.5786 g, 2.8946 mM, 0.035 eq.) en metanol (117) a 25° se somete a tratamiento con una mezcla de yodo (42.5052 g, 167.47 mM, 2.00 eq.) y bromuro de calcio (10.897 g, 54.51 mM, 0.65 eq.) en metanol (120 mi) a una velocidad constante durante 4 horas. La mezcla de la reacción se enfría a 0o a la mitad de la adición. La mezcla de la reacción se vierte en una solución de ácido acético (90 mi) en agua (2.25 L) . Se filtra la lechada resultante y el sedimento se seca mediante un flujo de nitrógeno para producir el compuesto del título.

EJEMPLO 17 Transformación de 11ß , 17a-dihidroxi-21-diyodo-6a- metilpregna-1 , 4-dieno-3 , 20-diona (V) en 17-acetato de P03/162-PUC 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l,4-dieno-3 , 20-diona (VI) Se agrega ??ß , 17a-dihidroxi-21-diyodo-6<x-metilpregna-1, 4-dieno-3, 20-diona (V, EJEMPLO 16, 45.0033 g, 73.7433 mM) a una mezcla de ácido acético (110 mi, 115.4 g, 1.922 moles, 26.1 eq.) y trietilamina (167 mi, 121.2 g, 1.198 moles, 16.2 eq.) en 610 mi de acetona. La mezcla resultante se agita a 45° durante 2 horas, luego se enfría a 20-25° y se concentra en presión reducida. El residuo se absorbe en cloruro de metileno (500 mi) , se lava con ácido clorhídrico acuoso (5%, 180 mi) seguido por bicarbonato de sodio saturado (300 mi) , seguido por agua (340 mi) , luego se filtra a través de una almohadilla de magnesol de calidad para cartucho (91.72 g) , se eluye con cloruro de metileno (1.2 L) seguido por cloruro de metileno/acetona (5/95; 400 mi). El eluato combinado se concentra a presión reducida hasta obtener aproximadamente 400 mi, se diluye con metanol (150 mi) y se concentra hasta obtener aproximadamente 300 mi. Se agrega más metanol (150 mi) y la mezcla se concentra hasta obtener aproximadamente 250 mi. Se agrega más metanol (100 mi) y la mezcla se concentra aún más, con lo cuál se cristaliza el producto. La lechada se enfría a -19°, se agita durante 2 horas y luego se filtra. El sedimento se lava con metanol/agua (1/1; 3 x 20 mi) y se seca con un flujo de nitrógeno para producir el compuesto P03/162-PUC del título. Se disuelve una porción de los sólidos anteriores (3.994 g) en cloruro de metileno/metanol (2/1; 40 mi) , se concentra en presión reducida hasta obtener aproximadamente 30 mi, se diluye con metanol (10 mi) y se concentra hasta obtener aproximadamente 15 mi (2 x) para producir una lechada que se enfría a -19° , se agita durante 2 horas y se filtra. El sedimento se lava con metanol/agua (1/1; 0o; 2 x 10 mi) y se seca con un flujo de nitrógeno.

EJEMPLO 18 Cristalización de 17-acetato de 11ß , 17a~dihidroxi-6cc- metilpregna-1 , 4-dieno-3 , 20-diona (III) para retirar 17- acetato de 17a-hidroxi-6a-metilpregna-l , 4-dieno-3 , 20-diona residual Se pone en reflujo con tolueno (12 mi) , 17-acetato de 11ß, 17a-dihidroxi-6 -metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20-diona crudo (III, 0.9195 g) de material que contiene 17-acetato de 17a-hidroxi~6a-metilpregna-l , 4-dieno-3 , 20-diona (4.13%), luego se enfría a 0o, se diluye con isooctano (12 mi) y se filtra. El sedimento se lava con isooctano (3 x 3 mi) luego se seca mediante un flujo de nitrógeno para producir el compuesto del título que contiene 17-acetato de 17a-hidroxi-6oc-metilpregna-l , 4-dieno-3 , 20-diona (1.12% , 0.8774 g) para una recuperación del 99.5%. El producto filtrado se concentra hasta obtener un sólido que consiste P03/162-PUC ??

Claims (41)

1. REIVINDICACIONES ; 1. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20- diona (VI), caracterizado porque comprende: 5 (1) poner en contacto 17-acetato de 17a-hidroxi- 6a-metilpregn-4-eno-3 , 20-diona (I) con una ?1- des idrogenasa para producir 17 acetato de 17a- idroxi-6a- metilpregna-1, 4 -dieno-3 , 20-diona (II) ; (2) poner en contacto 17 acetato de 17a-hidroxi- 10 6a-metilpregna-l , -dieno-3 , 20-diona (II) con una 11ß- hidroxilasa para producir 17-acetato de 11ß, 17a-dihidroxi- 6a-metilpregna-l , 4-dieno-3 , 20-diona (III) ; (3) hidrolizar 17-acetato de 11ß, 17a-dihidroxi- 6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20-diona (III) para producir 15 11ß, 17a-dihidroxi-6a-metilpregna-l , 4-dieno-3 , 20-diona (IV); (4) poner en contacto 11ß , 17a-dihidroxi-6a- metilpregna-1, 4-dieno-3 , 20-diona (IV) con yodo, un catalizador, una base suave para producir 11ß,17a- dihidroxi-21-diyodo-6a-metilpregna-l , 4-dieno-3 , 20-diona (V) •20 y (5) poner en contacto la 11ß , 17a-dihidroxi-21- diyodo-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20-diona (V) con una sal de ácido acético. 2. Un proceso para la preparación de 21-acetato 25 de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20-
2. P03/162-PUC diona (VI) de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el contacto con la A1-deshidrogenasa es con A1-des idrogenasa de A. simplex.
3. 3. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6oc-metilpregna-lí 4-dieno-3 , 20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la A1-deshidrogenasa de A. simplex se utiliza como fermentación, concentrado e células completas, células completas, células libres o células inmóviles.
4. 4. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 ,20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la A1-deshidrogenasa de A. simplex se utiliza por el concentrado de células completas.
5. 5. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l , 4-dieno-3 ,20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la A1-deshidrogenación se lleva a cabo en presencia de catalasa.
6. 6. Un proceso para la preparación de 21-acetato de ??ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 ,20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la A1-deshidrogenación se lleva a cabo en presencia de un aceptor de electrón exógeno.
7. 7. Un proceso para la preparación de 21-acetato P03/162-PUC de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el aceptor de electrón exógeno se selecciona a partir del grupo que comprende menadiona, bisulfito de menadiona, 1 , 4-naftoquinona, metosulfato de fenazina, etosulfato de fenazina y compuestos de tipo vitamina K.
8. 8. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 ,20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el aceptor de electrón exógeno es menadiona .
9. 9. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l , 4-dieno-3 , 20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la A1-deshidrogenación se lleva a cabo en presencia de un solvente orgánico inmiscible en agua.
10. 10. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el solvente orgánico inmiscible en agua se selecciona a partir del grupo que comprende tolueno, xileno, benceno, heptano, cloruro de metileno, n-octanol, tetracloruro de carbono y n-alcoholes superiores o mezclas de los mismos. P03/1S2-PUC
11. 11. Un proceso para la preparación de 21-acetato de ??ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 ,20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el solvente orgánico inmiscible en agua es una mezcla de cloruro de metileno y tolueno.
12. 12. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 ,20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la ??ß-hidroxilasa es de C. lunata.
13. 13. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 ,20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la ??ß-hidroxilasa es de C. lunata mediante la reacción libre de células o células completas, concentrado celular o fermentación.
14. 14. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 ,20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la ??ß-hidroxilasa es de C. lunata mediante fermentación.
15. 15. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a~metilpregna-l, 4-dieno-3 ,20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque C. lunata se cultiva en presencia de un detergente. P03/1S2-PUC
16. 16. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna~l/ 4-dieno-3 ,20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el detergente es un detergente no iónico seleccionado a partir del grupo que comprende alcoholes etoxilados, ácidos grasos etoxilados, aceites y esteres grasos etoxilados, alquilfenoles etoxilados, esteres de ácidos grasos de polioxietilen sorbitán, éteres de polioxietileno, polietilenglicoléteres de alquilfenoles, éteres de polietilenglicol de alcoholes primarios y éteres de polietilenglicol de alcoholes secundarios.
17. 17. Un proceso para la preparación de 21-acetato de ??ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 ,20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el detergente no iónico es un alquilfenol etoxilado.
18. 18. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß/ 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 ,20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el alquilfenol alquilo es un polietoxietanol de octilfenoxilo .
19. 19. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 ,20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque C. lunata se cultiva en presencia de P03/162-PUC un aceite natural .
20. 20. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 ,20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porgue el aceite natural se selecciona a partir del grupo que comprende aceite de soya, aceite de ricino, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de manteca de cerdo, aceite de linaza, aceite de oliva, aceite de cacahuate, aceite de colza y aceite de cártamo.
21. 21. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 ,20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el aceite natural es aceite de soya.
22. 22. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l , 4-dieno-3 ,20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque utiliza una adición regulada de nitrato .
23. 23. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l , 4-dieno-3 ,20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la fuente de nitrato es seleccionada del grupo que comprende nitrato de amonio, nitrato de aluminio, nitrato de calcio, nitrato de sodio, nitrato de P03/162-PUC bario, nitrato de potasio, nitrato cúprico, nitrato de cesio, nitrato de magnesio, nitrato de manganeso, nitrato férrico, nitrato de zinc, nitrato de cobalto, nitrato de litio y ácido nítrico.
24. 24. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 ,20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la fuente de nitrato es nitrato de amonio .
25. 25. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3, 20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque utiliza un desplazamiento de temperatura .
26. 26. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 ,20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el desplazamiento de temperatura es de aproximadamente 28° a 37°.
27. 27. Un proceso para la preparación de 21-acetato de ??ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 ,20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la hidrolización se lleva a cabo con una base seleccionada del grupo que comprende carbonato, hidróxido o alcóxido Ci-C4. P03/1S2-PUC
28. 28. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß; 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la base se selecciona del grupo que comprende carbonato en metanol, hidróxido en metanol acuoso o metóxido.
29. 29. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 ,20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la base es metóxido.
30. 30. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3, 20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque se utiliza más de un equivalente de base.
31. 31. Un proceso para la preparación de 21-acetato de ??ß/ 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l , 4-dieno-3, 20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el producto del paso (3) se pone en contacto con yodo en presencia de una base de ión de bromuro .
32. 32. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß/ 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3, 20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la base se selecciona del grupo que P03/162-PUC comprende idróxido, alcóxido C3.-C4.
33. 33. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la base es hidróxido.
34. 34. Un proceso para la preparación de 21-acetato de ??ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3, 20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el bromuro está presente en una cantidad catalítica.
35. 35. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 ,20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el producto del paso (4) se pone en contacto con CH3-COO".
36. 36. Un proceso para la preparación de 21-acetato de 11ß, 17a, 21-trihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20-diona (VI) de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el 21-acetato de 11ß,17a,21-trihidroxi-6a~metilpregna-l , 4-dieno-3 , 20-diona (VI) que se produce contiene no más de 0.1% de cualquier impureza.
37. 37. Un esteroide diyodo de la fórmula: P03/1S2-PUC
38. 38. Un proceso para el retiro de material residual no hidroxilado, caracterizado porque comprende: (1) poner en contacto 17-acetato de 17a-hidroxi- 6a-metilpregn-4-eno-3 , 20-diona (I) con una ?1-deshidrogenasa para producir 17 acetato de 17a-hidroxi- 6a-metilpregna-1, 4-dieno-3 , 20-diona (II) ; (2) cristalizar el 17 acetato de 17a-hidroxi-6a-metilpregna-1, 4-dieno-3 , 20-diona (II) producido a partir de un solvente no polar o una mezcla de solventes.
39. 39. Un proceso para retirar el material residual no hidroxilado de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el solvente no polar o mezcla de solventes se seleccionan del grupo que comprende benceno, tolueno, xileno, acetato de n-butilo, hexano, heptano e isooctano .
40. 40. Un proceso para retirar el material residual no hidroxilado de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el solvente no polar o la mezcla de solventes es acetato de 21-butilo o una mezcla de P03/162-PUC tolueno/isooctano (1/1) a 0o.
41. 41. Un proceso para la purificación de 17-acetato de 11ß, 17a-dihidroxi-6a-metilpregna-l, 4-dieno-3 , 20-diona (III) producido mediante una ??ß-hidroxilasa, caracterizado porque comprende: (1) cristalización de un solvente seleccionado del grupo que comprende tolueno, benceno, xileno, acetato de zz-butilo y mezclas de los mismos con solventes de hidrocarburo seleccionados del grupo que comprende hexano, heptano, isooctano, ciclohexano y metilciclohexano. P03/162-PUC