CN114350737B - 5α,6α-环氧-11β,17α-二羟基孕甾-3,20-二乙二醇缩酮的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种5α,6α‑环氧‑11β,17α‑二羟基孕甾‑3,20‑二乙二醇缩酮的制备方法，以缓冲液或者纯水作为反应体系，加入底物6‑甲基还原物、氧供体以及氧载体，使用脂肪酶进行生物催化合成反应；反应结束后，将反应物分离、纯化得到产物6‑甲基环氧化合物即为5α,6α‑环氧‑11β,17α‑二羟基孕甾‑3,20‑二乙二醇缩酮，反应式如下本发明使用酶法生物催化合成6‑甲基环氧化合物，可以避免化学合成对环境带来的不利影响，且酶法可原位合成用于环氧反应的过氧酸，可避免化学合成过程中双氧水添加存在的风险。
Description
技术领域
本发明涉及一种5α,6α-环氧-11β,17α-二羟基孕甾-3,20-二乙二醇缩酮的制备方法，属于生物催化领域。
背景技术
甲泼尼龙为中效合成品，属于内分泌系统药物中的肾上腺皮质激素类药，用于危重疾病的急救，还可用于内分泌失调、风湿性疾病、胶原性病、皮肤疾病、过敏反应、眼科疾病、胃肠道疾病、血液疾病、白血病、休克、脑水肿、多发性神经炎、脊髓炎及防止癌症化疗引起的呕吐等。专利CN 108912192公开了一种6β-甲基泼尼松龙的合成方法，其中5α,6α-环氧-11β,17α-二羟基孕甾-3,20-二乙二醇缩酮为合成甲泼尼龙的中间体，5α,6α-环氧-11β,17α-二羟基孕甾-3,20-二乙二醇缩酮即为6-甲基环氧化合物，结构式如下
目前，6-甲基环氧化合物的合成仅有化学法，具体可参见专利CN 107602652。这种方法在反应过程中会产生大量有毒的副产物，对环境有毒害作用，生产过程中具有一定的风险性。
发明内容
本发明的目的是解决上述背景技术中提及的缺陷，利用生物催化的方法进行氧化反应，在相对温和的反应条件下制备所需的氧化产物，不会对环境造成很大的毒害作用。脂肪酶催化过程不需要依赖辅因子催化氧化反应，且原位生产过氧酸可解决过酸储存过程中的风险性。
为实现上述发明目的，本发明提供一种5α,6α-环氧-11β,17α-二羟基孕甾-3,20-二乙二醇缩酮的制备方法，以缓冲液或者纯水作为反应体系，加入底物6-甲基还原物、氧供体以及氧载体，使用脂肪酶进行生物催化合成反应；反应结束后，将反应物分离、纯化得到产物6-甲基环氧化合物即为5α,6α-环氧-11β,17α-二羟基孕甾-3,20-二乙二醇缩酮，反应式如下
进一步地，反应结束后，反应液在4℃、4000rpm离心，砂芯漏斗抽滤得滤饼，滤饼经有机溶剂乙酸乙酯洗涤提纯至检测纯度为97％，60℃真空干燥至恒重，其中提纯方法可采用有机溶剂萃取。
进一步地，所述缓冲液为磷酸钠缓冲液、乙酸钠缓冲液和柠檬酸钠缓冲液中的一种。优选乙酸钠缓冲液。
进一步地，所述脂肪酶为、固定化脂肪酶IM、生物柴油NS81006和脂肪酶LIPF中的一种。优选为脂肪酶LIPF。
进一步地，所述脂肪酶的用量以底物质量百分比计2.5％-17.5％。优选7.5％。
进一步地，所述反应温度为15℃-45℃。优选30℃。
进一步地，所述氧供体为H2O2，氧供体与底物的摩尔比为1：2-1：8，优选1：8。
进一步地，所述氧载体为乙酸乙酯、丙酮、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、癸酸、柠檬酸和棕榈酸中的一种或一种以上的混合物；优选为辛酸；所述氧载体与底物的摩尔比为1：2-1：5，优选1：5。
进一步地，还在所述反应体系中添加助溶剂，所述助溶剂为疏水溶剂和/或亲水溶剂；所述疏水溶剂为正己烷、四氢呋喃、丙酮、甲苯和乙酸乙酯中的一种或一种以上的混合物，所述亲水溶剂为乙醇、异丙醇、乙腈和甲醇中的一种或一种以上的混合物。所述助溶剂优选为异丙醇(2.5％-10％，v/v)。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
使用酶法生物催化合成6-甲基环氧化合物，可以避免化学合成对环境带来的不利影响，且酶法可原位合成用于环氧反应的过氧酸，可避免化学合成过程中双氧水添加存在的风险。
附图说明
图1是5α,6α-环氧-11β,17α-二羟基孕甾-3,20-二乙二醇缩酮的对照品色谱图；
图2是本发明一个实施例反应过程的色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例1：
(1)催化剂筛选：筛选市售固定化脂肪酶NOV 40086，生物柴油NS81006，Vland8340，固定化脂肪酶IM，脂肪酶LIP F，分别进行催化环氧反应。
(2)生物转化流程：催化环氧反应体系包含50mM底物6-甲基还原物，1M乙酸/乙酸钠缓冲液(pH 5.8)，乙酸乙酯7.5％(v/v)，底物：辛酸：双氧水为1：5：8，双氧水(30％的H2O2水溶液)一次添加完毕，再加入不同的催化剂(相较于底物的质量百分比，w/w，酶液以体系体积比计，固定化酶或者酶粉以质量计)，30℃，220rpm开始反应。
(3)液相检测流程：转化结束后通过液相检测其产率或者纯度，液相检测条件为示差检测器的，ODS柱(35μm，4.6×250mm)，乙腈：水(60：40)，流速：1ml/min。
产率计算：
产率＝Ca/Cb*100％
Ca、Cb分别为初始添加底物100％转化后相比于产物的质量浓度、反应结束时产物的质量浓度
液相检测其产率，其中有产物生成的酶为生物柴油NS81006，脂肪酶LIP F等。选择催化效率最佳的两种酶：固定化脂肪酶IM，脂肪酶LIP F分别优化最适添加量，结果如表1，优选脂肪酶LIP F作为环氧反应的催化剂进行后续反应。
表1不同催化剂催化效率的比较
实施例2：
1M的乙酸/乙酸钠缓冲液(pH 5.8)中包含200g/L底物6-甲基还原物，乙酸乙酯7.5％(v/v)，底物：辛酸：双氧水为1：5：8，双氧水(30％的H2O2水溶液)一次添加完毕，添加65％(w/w)的固定化脂肪酶LIP F加入反应体系中，于不同反应温度下反应。反应结束后，采用实施例1中的液相检测方法测产率，结果如表2所示，优选30℃为最佳反应温度。
表2不同反应温度的比较
实施例3：
为缩减成本，使用酶粉替代固定化脂肪酶LIP F，并优化适宜的催化剂加量。优化体系为1M的乙酸/乙酸钠缓冲液(pH 5.8)中包含200g/L底物6-甲基还原物，乙酸乙酯7.5％(v/v)，底物：辛酸：双氧水为1：5：8，双氧水(30％的H2O2水溶液)一次添加完毕，添加不同质量的LIP F酶粉加入反应体系中，30℃，220rpm开始反应。反应结束后，采用实施例1中的液相检测方法测反应液中产物纯度，结果如表3所示，综合考虑成本和杂质含量，优选7.5％(w/w)的LIP F酶粉加量，此时产率为75.62％。
表3催化剂加量对环氧反应的影响
实施例4：
1M的乙酸/乙酸钠缓冲液(pH 5.8)中包含200g/L底物6-甲基还原物，乙酸乙酯7.5％(v/v)，底物：不同种类的氧载体：双氧水为1：5：8，双氧水(30％的H2O2水溶液)一次添加完毕，添加7.5％(w/w)LIP F酶粉加入反应体系中，30℃，220rpm开始反应。反应结束后，采用实施例1中的液相检测方法测产率，结果如表4所示，相较于其它氧载体，优选辛酸作为环氧反应的氧载体。
表4氧载体类型对环氧反应的影响
实施例5：
1M的乙酸/乙酸钠缓冲液(pH 5.8)中包含200g/L底物6-甲基还原物，乙酸乙酯7.5％(v/v)，采用不同的底物：辛酸：双氧水摩尔比，双氧水(30％的H2O2水溶液)一次添加完毕，添加7.5％(w/w)LIP F酶粉加入反应体系中，30℃，220rpm开始反应。反应结束后，采用实施例1中的液相检测方法测产率，结果如表5所示，辛酸与H2O2比例对催化效率影响较为显著，优选辅料底物：辛酸：H2O2添加比例为1：5：8。
表5辅料比例对环氧反应的影响
实施例6：
1M的乙酸/乙酸钠缓冲液(pH 5.8)中包含200g/L底物6-甲基还原物，助溶剂加量疏水溶剂7.5％(v/v)，亲水溶剂5％(v/v)，底物：辛酸：双氧水添加比例为1：5：8，双氧水(30％的H2O2水溶液)一次添加完毕，添加7.5％(w/w)LIP F酶粉加入反应体系中开始反应。反应结束后，采用实施例1中的液相检测方法测产率，结果如表6所示，优选异丙醇作为本研究的助溶剂，且对异丙醇添加比例进行优选(如表7)，选择7.5％作为该反应溶剂的最适加量。
表6助溶剂类型对环氧反应的影响
表7助溶剂加量对环氧反应的影响
实施例7：
添加原料(200g/L底物6-甲基还原物，底物：辛酸：双氧水(30％的H2O2水溶液)为1：5：8(摩尔比)，7.5％异丙醇(v/v)，7.5％的催化剂脂肪酶LIP F酶粉(相较于底物的质量百分比，w/w)，所有辅料一次添加完毕，于30℃，245rpm下反应。反应完毕后，离心，取离心后沉淀经砂芯漏斗抽滤得滤饼，滤饼使用合适比例的乙酸乙酯洗涤除杂至产物液相检测纯度为97％，并于60℃下真空干燥至恒重，重量收率为75％。
将图1所示5α,6α-环氧-11β,17α-二羟基孕甾-3,20-二乙二醇缩酮的对照品液相色谱与图2所示本发明实施例反应过程的液相色谱进行比对，二者出峰时间一致，证明本发明实施例制得的产物为目标产物5α,6α-环氧-11β,17α-二羟基孕甾-3,20-二乙二醇缩酮。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求保护范围之内。
Claims (7)
1.一种5α,6α-环氧-11β,17α-二羟基孕甾-3,20-二乙二醇缩酮的制备方法，其特征在于，以缓冲液或者纯水作为反应体系，加入底物6-甲基还原物、氧供体以及氧载体，使用脂肪酶进行生物催化合成反应，所述脂肪酶的用量以底物质量百分比计2.5％-17.5％，所述反应温度为15℃-45℃，所述脂肪酶为生物柴油NS81006和脂肪酶LIPF中的一种；反应结束后，将反应物分离、纯化得到产物6-甲基环氧化合物即为5α,6α-环氧-11β,17α-二羟基孕甾-3,20-二乙二醇缩酮，反应式如下
2.根据权利要求1所述的5α,6α-环氧-11β,17α-二羟基孕甾-3,20-二乙二醇缩酮的制备方法，其特征在于，反应结束后，反应液在4℃、4000rpm离心，砂芯漏斗抽滤得滤饼，滤饼经有机溶剂乙酸乙酯洗涤提纯至检测纯度为97％，60℃真空干燥至恒重。
3.如权利要求2所述的5α,6α-环氧-11β,17α-二羟基孕甾-3,20-二乙二醇缩酮的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸钠缓冲液、乙酸钠缓冲液和柠檬酸钠缓冲液中的一种。
4.如权利要求3所述的5α,6α-环氧-11β,17α-二羟基孕甾-3,20-二乙二醇缩酮的制备方法，其特征在于，所述脂肪酶为LIPF。
5.如权利要求1所述的5α,6α-环氧-11β,17α-二羟基孕甾-3,20-二乙二醇缩酮的制备方法，其特征在于，所述氧供体为H2O2，氧供体与底物的摩尔比为1：2-1：8。
6.如权利要求1所述的5α,6α-环氧-11β,17α-二羟基孕甾-3,20-二乙二醇缩酮的制备方法，其特征在于，所述氧载体为乙酸乙酯、丙酮、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、癸酸、柠檬酸和棕榈酸中的一种或一种以上的混合物；所述氧载体与底物的摩尔比为1：2-1：5。
7.如权利要求1所述的5α,6α-环氧-11β,17α-二羟基孕甾-3,20-二乙二醇缩酮的制备方法，其特征在于，还在所述反应体系中添加助溶剂，所述助溶剂为疏水溶剂和/或亲水溶剂；所述疏水溶剂为正己烷、四氢呋喃、丙酮、甲苯和乙酸乙酯中的一种或一种以上的混合物，所述亲水溶剂为乙醇、异丙醇、乙腈和甲醇中的一种或一种以上的混合物。
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