JPH0614874B2 - ステロイド転化プロセス - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 コーチコステロイド類が治療に初めて使われた実例は19
50年代で、リューマチ様関節炎にコーチゾンアセテート
処置を導入した。

その後の研究で、ハイドロコーチゾンとコーチゾンの1,
2−位置へ不飽和を挿入すると、生ずるステロイドのプ
レドニソロン及びプレドニソンの効果が高くなり、薬剤
で誘発される塩の滞留が少なくなることが立証された。
コーチコステロイドに応答する病気の処置用に使われる
ほとんどのその他のステロイド類はそれ以後、ステロイ
ド分子の1,2−位置に二重結合を含むものが合成される
ようになった。1977年に、ステロール前駆物質からコー
チコステロイド類を合成する新しい方法を示す二つの米
国特許が発行された。合衆国特許第4.035,236号は、シ
トステロール、スチグマステロール又はコレステロール
の発酵を通して９α−ヒドロキシアンドロステンジオン
をつくる方法を記述している。合衆国特許第4,041,055
号はこのアンドロステンから医学的に有用なコーチコス
テロイド類を合成する一般的方法を明らかにしている。
この化学で扱われる中間体類は３−ケト−Δ^4,9(11)立
体配置をもちうる。

〔従来の技術と発明が解決しようとする課題〕

以下は、1,2−飽和ステロイドから対応する1,2−デヒド
ロステロイドへの生物学的転化を明らかにした先行技術
の方法である。

・合衆国特許第2,837,464号「コリネバクテリウム(Cory
nebacterium)によるジエン類の製造法」 アルトロバクター（コリネバクテリウム）・シンプレッ
クスによる発酵液中のステロイド類の１−脱水素の記
述。

・「１−デヒドロステロイド類の製法」と題する合衆国
特許第3,360,439号。

基質及び水素キャリヤーと混合する前に、低級アルカノ
ール又はアセトンのような低級アルカノンで事前処理さ
れたA.シンプレックス菌体の使用によるステロイド類の
１−脱水素の記述。

・チャーネィ・ダブリュー(Charney.W.)及びハーゾグ・
エッチ(Herzog.H.)、1967年、ステロイドの微生物的転
化。アカデミック・プレス社、ニューヨーク、４〜９
頁、236〜261頁。

ステロイドの生物転化に関する歴史的背景、及び１−脱
水素を行なうことで知られている微生物の分類学的一覧
表。

・T.ヤマネ、H.ナカタニ、E.サダ、T.オマタ、A.タナカ
及びS.フクイ、Biotechnology and Bioengineering 21
巻1979年。

この著者らは50％ベンゼン−ヘプタンからなる混合物中
で、ノカルジア・ロドグラス(Nocardia rhodocrous)に
よる４−アンドロステン−3,17−ジオンの１−脱水素の
研究を行なった。生物転化混合物にこの溶媒を加える既
報の利点は、反応速度を180の係数で増加させるにあっ
た。しかし、ベンゼンは知られた発がん物質である。ノ
カルジア・ロドクラスの活性に好ましい電子受容体はフ
ェナジンメトサルフェートであった。この電子受容体は
価格が高すぎかつ不安定すぎるため、生物転化製造法で
この微生物活性を実用的又は有用にはできない。ノカル
ジア・ロドクラスの酵素は、アルトロバクター・シンプ
レックス用に選ばれる電子受容体のメナジオンの存在下
に活性を持たない。N.ロドクラス中の酵素はA.シンプレ
ックスでつくられているものとは異なっているに違いな
い。反応は、ステロイドでわずか20％飽和された有機溶
媒水準で進められた。ステロイド濃度を高めると反応速
度が低下することが示された。酵素は１−脱水素反応の
必須試薬である。溶媒（50％ベンゼン−ヘプタン）は酵
素の存在下に可燃性である。爆発的な環境を作らずに反
応器へ酸素を導入する方法は論じられなかった。

・K.ソノモト、I.ジン、A.タナカ及びS.フクイ、Agric.
Biol.Chem.44巻119−1126頁、1980年。

同じ研究室がA.シンプレックスによるハイドロコーチゾ
ンの１−脱水素を研究した。水と混ざらないｎ−ブタノ
ールとｎ−アミルアルコールの２溶媒を試験したが、こ
れらの溶媒の存在下に生物転化反応は進行しなかった。
10％メタノール−水や10プロピレングリコール−水のよ
うな水と混ざる溶媒が好ましい溶媒として選ばれた。

先行技術は本改良法を開示又は示唆しなかった。

〔課題を解決する手段〕

ステロイドの１−脱水素を触媒できる空気乾燥又は加熱
乾燥された微生物の菌体を使用して、水性環境で、特に
外因性の電子受容体の存在下に、最もよく知られた先行
技術の方法で得られるよりも、1,2−飽和ステロイドか
ら対応する1,2−デヒドロ誘導体への能率的な転化が得
られる。

また、本願の分割出願の発明では、A.シンプレックス菌
体と外因性電子受容体及び脱水素化されるステロイドか
らなる水性スラリーに、水と混ざらない溶媒として芳香
族炭化水素を添加することを伴う方法が開示され特許請
求されている。スラリーをかきまぜ、気体空洞の酸素含
有量が酸素の最少燃焼量より低くなる程度に酸素を供給
するか、又は有機溶媒の引火点より低温で反応を行な
う。

これらの手順は以下の理由から、微生物による先行技術
のステロイド脱水素技術よりすぐれている。

ａ）この生物転化では、未転化ステロイド基質水準が低
くなる。

ｂ）この方法は、より高いステロイド濃度で実施でき
る。

ｃ）所定量のステロイドを転化するのに、微生物菌体、
例えばA.シンプレックスの量が少なくて済む。

ｄ）本方法は、ステロイド中に存在する有機可溶性不純
物、微生物菌体内に存在する不純物、又は菌体によって
ステロイドからつくられる不純物に対する耐性が大き
い。

ｅ）微生物菌体内に存在するステロイド分解酵素を減少
又は全面的に排除するため、望んでいる生成物のより高
収量が得られる。

更に、ノカルジア・ロドクラスのようなその他の微生物
活性でステロイドを脱水素させる先行技術より溶媒手順
がすぐれている。というのは、A.シンプレックスで触媒
される反応はメナジオンのような安定で安価な電子受容
体で実施できるからである。

微生物 本方法に使用できる微生物は１−脱水素菌として知られ
る周知の多数微生物の任意のものである。このような微
生物は、チャーネィ・ダブリュウ(Charney.W.)及びハー
ゾグ・エッチ(Herzog.H.)、1967年、「ステロイド類の
微生物転化」（アカデミック・プレス社、ニューヨー
ク）、に名前をあげてある。

ステロイドの１−脱水素を行なう細菌は、「バーキーズ
マニュアルオブデターミネーテイブバイオロジー」第８
版で確定された２群に分けられる。本明細書に記載の手
順は、「第17部・放線菌及び関連生物」に含まれるアル
トロバクター属とコリネバクテリウム属からの種に対し
て実証することに成功した。ノカルジア、ミコバクテリ
ウム、ストレプトミセス及びバクテリウムのような第17
部のその他幾つかの属の１−脱水素種も恐らく有用であ
る。

ステロイド類の１−脱水素を行なうことが知られている
一般に入手可能な二つの微生物が、この種の方法に役立
つことが示された。合衆国特許第3,065,146号に１−脱
水素菌−ATCCNo.12673として包含されるバクテリウム・
シクロオキシダンスは、有用な微生物として検査され
た。ステロイドの１−脱水素にもっと広範囲に使われた
細菌はアルトロバクター・シンプレックス、ATCC6946で
あり、これは合衆国特許第2,837,464号に明らかにされ
ている。このため、以下の多くは本方法を例示するのに
この微生物を使用している。しかし、本方法が任意の１
−脱水素微生物の使用を含めることを理解すべきであ
る。

微生物の生育 微生物は以下のものを含有する水性栄養培地中で生育す
る。

(a)生育に必要な窒素を供給する硝酸塩又はアンモニウ
ム塩のような無機化合物又は有機窒素化合物（酵母エキ
ス、ペフトン、コーンスチープリカー等）。

(b)炭素・エネルギー源、例えば炭水化物と糖誘導体、
油、脂肪酸、及びそれらのメチルエステル、アルコー
ル、アミノ酸又は有機酸類。

(c)イオン及び微量元素、例えば水道水又は（コーンス
チープリカーのような）精製度の低い培地成分によって
供給される水準のナトリウム、カリウム、マグネシウ
ム、燐酸塩、硫酸塩、マンガン、銅、コバルト、モリブ
デン等。

生物は生育のため大気中に存在する酸素を必要とする。
生育温度の範囲は10〜45℃であり、A.シンプレックスに
ついては28〜37℃が最適である。生育の最適pHは中性付
近である。

ステロイド−１−脱水素酵素の産生 アンドロスタ−４−エン−3,17−ジオン又はコーチゾン
アセテートのような1,2−飽和３−ケト−ステロイド化
合物を培地の0.005％（ｗ／ｖ）又はそれ以上の水準で
加えることによって、菌体のステロイド−１−脱水素酵
素活性が誘発される。誘発物質の存在下に培養を少なく
とも６時間続けてから、菌体を乾燥のため取り入れる。

誘発物質を生育周期の任意の点で添加できる。ラード油
のような栄養素で生育する培養基はステロイド−１−脱
水素酵素の合成を急速に開始するが、グリコースで生育
する培養基は酵素合成が起る前に基質の消耗が必要であ
る。誘発物質を加えてから６時間ないしそれ以上にわた
って培養を続け、次に溶媒手順用又は乾燥用に菌体を取
り入れる。

乾燥用菌体回収手順 菌体は、栄養培地から分離し、遠心分離又は凝集、ろ
過、限外ろ過のような慣用手段によって濃縮する。分離
された菌体は約１ないし約10％の範囲の含水量まで、１
〜85℃（55〜75°が好適）で減圧下におくか、加熱しな
がら空気乾燥、又は噴霧乾燥又はタンブル乾燥によって
乾燥される。約５％の含水量が好ましい。菌体を生物転
化に使用するまで５℃で保存する。乾燥した活性菌体
は、「酵素学の方法」XLIV巻、１９７６年、（アカデミ
ックプレス社、ニューヨーク）、11〜317頁に記載のよ
うに、ポリアクリルアミドゲル及びコラーゲン内への閉
じ込め、又は高分子電解質担体への菌体の共有結合によ
り、乾燥菌体を固定することによってもつくられる。

生物転化法 生物転化は、調製された菌体をステロイド基質に露出す
ることによって達成される。典型的には、６〜10のpH
（最適pH7.25〜8.5）をもつ弱い緩衝度の水溶液に菌体
とステロイドを懸濁させる。菌量は１当り0.1〜50ｇ
の範囲であり、ステロイドを0.05ないし5.0（ステロイ
ド：菌体）の重量比で加える。水性環境で生物転化を行
なう時は、当り５〜10ｇのステロイドに当り８〜10
ｇの菌量が好ましい。反応を刺激するために、触媒量
（例えば５×10^-4Ｍメナジオン）の外因性電子キャリヤ
ーを加える。有用な化合物はメナジオン（２−メチル−
1,4−ナフトキノン）、フェナジンメトサルフェート、
ジクロロフェノール−インドフェノール、1,4−ナフト
キノン、メナジオン重亜硫酸塩、ユビキノン類（補酵素
Ｑ）及びビタミンＫ型化合物を包含する。混合物を５〜
45℃の温度範囲で０〜14日間培養する。培養中、混合物
を分子状酵素に接触させ、好ましくはかきまぜる。１−
脱水素率は典型的には時間と共に減少する。生物転化
は、当たり10ｇの基質を使用して、24時間に満たない
うちに完了率98〜100％まで進む。

使用できる種々の手順の例は以下を包含する。

(a)弱い緩衝度の水溶液にステロイドとメナジオンを懸
濁し、続いて乾燥菌体を添加する。ツウイーン80のよう
な表面活性剤を低濃度、例えば０〜５％で添加し、ステ
ロイドを懸濁しやすくさせる。

(b)水性緩衝液系に菌体を懸濁させ、続いてエタノー
ル、メタノール、アセトン中に溶解された電子キャリヤ
ーを添加する（最終容積の５％まで）。ステロイド基質
を乾燥粉末として添加するか、又はジメチルホルムアミ
ド、エタノール、メタノール、アセトン、ジメチルスル
ホキシドのような水と混ざる有機溶媒、又はトルエンの
ような混ざらない有機溶媒中に溶解（懸濁）できる。

(c)乾燥菌体を少量の緩衝液に再水和し、続いて緩衝液
や有機溶媒を更に加える。エタノール、アセトン、キシ
レン、酢酸ブチル、塩化メチレン又はトルエン等を加え
ると、０〜95％（容量／容量）の最終有機溶媒含有量が
得られる。芳香族炭化水素の使用量は、出発ステロイド
又は生成物ステロイドの最も易溶のものを溶解するのに
必要な量の約半量から、出発ステロイド又は生成物ステ
ロイドの最も難溶のものを溶解するのに必要な量の約４
倍までの範囲にある。ステロイドと電子キャリヤーは反
応を開始するために加えられる。ステロイドと共に芳香
族炭化水素を加えるのが好ましい。しかし、これを後か
ら、又はもっと早い時期に加えてもよい。

(d)湿った菌体ケーキを弱い緩衝度の水溶液に懸濁させ
るか、発酵液を同水溶液で希釈し、続いて外因性電子キ
ャリヤー、ステロイド及び芳香族炭化水素を添加する。

基質範囲 本発明の実施に有用な化合物類は、３−ケト−Δ⁴−ア
ンドロステン及び３−ケト−Δ⁴−プレグネン系のステ
ロイドに属している。ステロイド−１−脱水素酵素用の
基質はＡ環の炭素Ｃ１とＣ２との間に飽和をもち、Ａ環
の３位置にヒドロキシル又はケト基をもつことが認めら
れる。アンドロステン系の成員は以下を包含する。

１）アンドロスタ−４−エン−3,17−ジオン ２）アンドロスタ−4,9(11)−ジエン−3,17−ジオン及
びその６α−フルオロ、６α−メチル又は16−メチル誘
導体 ３）11β−ヒドロキシアンドロスタ−４−エン−3,17−
ジオン及びその誘導体 使用できる３−ケト−Δ⁴−プレグネン系のステロイド
には次のものがある。

１．17α−ヒドロキシプレグネ−４−エン−20−イン−
３−オン及びその16−メチル誘導体 ２．11β，21−ジヒドロキシ−プレグナー4,17(20)−ジ
エン−３−オン及びその６α−メチル誘導体 ３．20−クロロ−プレグナ−4,9(11),17(20)−トリエン
−21−アール−３−オン ４．以下を含めた3,20−ジケト−Δ⁴−プレグネンの幾
つかの群。

ａ）11,17,21−トリヒドロキシ化合物、例えばハイドロ
コーチゾンとその６α−メチル誘導体 ｂ）９β，11β−エポキシ−17,21−ジヒドロキシ化合
物、例えば９β，11β−エポキシ−17,21−ジヒドロキ
シ−16β−メチル−プレグネ−４−エン−3,20−ジオン ｃ）3,20−ジケト−4,9(11)−プレグネジエン類、例え
ば17α，21−ジヒドロキシ−プレグナ−4,9(11)−ジエ
ン−3,20−ジオン及びその16α−メチル、16β−メチル
又は16α−ヒドロキシ誘導体類又は17α−アセテートエ
ステル ｄ）3,20−ジケト−4,9(11),4,9(11),16−プレグネトリ
エン類、例えば21−ヒドロキシ−プレグナ−4,9(11),16
−トリエン−3,20−ジオン及びその６α−フルオロ誘導
体 21−ヒドロキシル基（＃２及び＃４）を含有するステロ
イド類の21−エステル誘導体類も基質として役立つ。好
ましい21−エステル類は低級脂肪酸、例えば酢酸と単環
式カルボン酸、例えば安息香酸のような低級アルキル又
はアリール基からなる。

生物転化生成物及び未転化基質は慣用手段によって混合
物から回収できる。ステロイド類は典型的には、ろ過に
続いてフィルターケーキをアセトン又は塩化メチレンの
ような有機溶媒で抽出することによって回収できる。そ
の代わりに、酢酸ブチル又は塩化メチレンのような水と
混ざらない溶媒と混合することによって、全生物転化混
合物を抽出できる。次に生成物は有機溶媒から単離され
る。

以下は、先行技術の方法に対する本発明方法の優秀性を
示す異なる生物転化の結果である。生物転化は、上に詳
述された条件を用いて行なわれた。

実施例１ 乾燥菌体の調製 セレロース、ペプトン及びコーンスチープリカー（各々
６g/）からなるpH7.0の培地を含有する振とうフラス
コ中にバクテリウム・シクロオキシダンス(ATCC12673)
を接種した。28℃の回転振とう機上で、グルコースの消
滅が起るまで培養基を培養した。この時点でコーチゾン
アセテート（0.5g/）を加え、フラスコを更に16時間
培養した。菌体を遠心分離によって採取し、水で２回洗
ってから、乾燥するまで45℃の低真空炉に入れた。

６α−メチルハイドロコーチゾンの生物転化 上記のとおりに調製された乾燥菌体0.5ｇをpH7.5の50mM
燐酸緩衝液50mlにかきまぜながら再水和した。メナジオ
ンをエタノール溶液（8.6mg/mlエタノール）として0.02
5ml／50mlの水準で菌懸濁液に加えた。基質をジメチル
ホルムアミド(DMF)溶液（DMFml当り６α−メチルハイド
ロコーチゾン100mg）として、0.5g/の最終生物転化濃
度まで添加した。混合物をかきまぜながら28℃で培養し
た。４時間培養後、ステロイドの91％が転化された。６
α−メチルプレドニソロンを慣用手段で回収した。

実施例２ アンドロスタ−1,4,9(11)−トリエン−3,17−ジオン産
生 ａ）生物触媒の調製 グルコース６g/、コーンスチープリカー６g/及び噴
霧乾燥されたラード水６g/を含有する振とうフラスコ
内の培地中でアルトロバクター・シンプレックス(ATCC6
946)を生育させた。培養基を回転振とう機上で、グルコ
ース消滅が起るまで28℃で培養した。この時点で、ステ
ロイド−１−デヒドロゲナーゼ合成を誘発するためにコ
ーチゾンアセテート（0.5g/）を加えた。一夜培養
後、低速遠心分離によって菌体を取り入れた。菌ペレッ
トを乾燥のため55℃の低真空炉へ24時間入れた。24時間
後、乾燥済み材料を気密容器に移し、生物転化に必要な
時まで５℃で保存した。

ｂ）アンドロスタ−4,9(11)−ジエン−3,17−ジオンの
生物転化 乾燥菌体10g/をpH7.5の50mM燐酸緩衝液中で30分かき
まぜて水和した。次にメナジオンを乾燥粉末として86mg
/の最終濃度まで菌懸濁液に加えた。微粉砕したアン
トロスタ−4,9(11)−ジエン−3,17−ジオンをジメチル
ホルムアミド中にスラリー化し、当たりステロイド2.
5ｇ及び２％（ｖ／ｖ）DMFの水準で生物転化混合物に加
えた。混合物を31℃でかきまぜながら空気の存在下、24
時間培養した。培養終了後、アンドロスタ−1,4,9(11)
−トリエン−3,17−ジオンを慣用手段によって回収し
た。

実施例３ 前実施例記載の条件に従って、下のステロイド化合物類
をA.シンプレックスの乾燥菌体に露出し、対応する1,2
−デヒドロ誘導体を得た。

番号 名前 1. アンドロスタ−４−エン−3,17−ジオン 2. ６α−フルオロ−アンドロスタ−4,9(11)−ジエン
−3,17−ジオン 3. ６α−メチル−アンドロスタ−4,9(11)−ジエン−
3,17−ジオン 4. 16β−メチル−アンドロスタ−4,9(11)−ジエン−
3,17−ジオン 5. 17α−ヒドロキシプレグネ−４−エン−20−イン−
３−オン 6. 17α−ヒドロキシプレグナ−4,9(11)−ジエン−20
−イン−３−オン 7. 17α−ヒドロキシ−16β−メチル−プレグナ−4,9
(11)−ジエン−20−イン−３−オン 8. 11β，21−ジヒドロキシ−プレグナ−4,17(20)−ジ
エン−３−オン 9. 21−アセトキシ−11β−ヒドロキシ−プレグナ−4,
17(20)−ジエン−３−オン 10. ６α−メチル−11β，21−ジヒドロキシ−プレグ
ナ−4,17(20)−ジエン−３−オン 11. 20−クロロ−プレグナ−4,9(11),17(20)−トリエ
ン−21−アール−３−オン 12. ハイドロコーチゾン 13. ６α−メチルハイドロコーチゾン 14. 21−アセトキシ−11β，17−ジヒドロキシ−16β
−メチル−プレグナ−４−エン−3,20−ジオン 15. 21−アセトキシ−９α−フルオロ−11β，17−ジ
ヒドロキシ−16β−メチル−プレグナ−４−エン−3,20
−ジオン 16. 21−アセトキシ−９β，11β−エポキシ−17−ヒ
ドロキシ−16β−メチル−プレグネ−４−エン−3,20−
ジオン 17. 21−アセトキシ−17−ヒドロキシ−プレグナ−4,9
(11)−ジエン−3,20−ジオン 18. 21−アセトキシ−16α．17−ジヒドロキシ−プレ
グナ−4,9(11)−ジエン−3,20−ジオン 19. 21−アセトキシ−17−ヒドロキシ−16α−メチル
−プレグナ−4,9(11)−ジエン−3,20−ジオン 20. 21−ベンジロキシ−17−ヒドロキシ−16β−メチ
ル−プレグナ−4,9(11)−ジエン−3,20−ジオン 21. 21−アセトキシ−17−ヒドロキシ−16β−メチル
−プレグナ−4,9(11)−ジエン−3,20−ジオン 22. 21−アセトキシ−プレグナ−4,9(11),16(17)−ト
リエン−3,20−ジオン 23. 21−アセトキシ−６α−フルオロ−プレグナ−4,9
(11),16−トリエン−3,20−ジオン 転化から得られる対応生成物は次のとおりである。

番号 生成物 １ａ アンドロスタ−1,4−ジエン−3,17−ジオン ２ａ ６α−フルオロ−アンドロスタ−1,4,9(11)−ト
リエン−3,17−ジオン ３ａ ６α−メチル−アンドロスタ−1,4,9(11)−トリ
エン−3,17−ジオン ４ａ 16β−メチル−アンドロスタ−1,4,9(11)−トリ
エン−3,17−ジオン ５ａ 17α−ヒドロキシ−プレグナ−1,4−ジエン−20
−イン−３−オン ６ａ 17α−ヒドロキシ−プレグナ−1,4,9(11)−トリ
エン−20−イン−３−オン ７ａ 17α−ヒドロキシ−16β−メチル−プレグナ−1,
4,9(11)−トリエン−20−イン−３−オン ８ａ 11β，21−ジヒドロキシ−プレグナ−1,4,17(20)
−トリエン−３−オン ９ａ 21−アセトキシ−11β−ヒドロキシ−プレグナ−
1,4,17(20)−トリエン−３−オン及び11β，21−ジヒド
ロキシ−プレグナ−1,4,17(20)−トリエン−３−オン 10ａ ６α−メチル−11β，21−ジヒドロキシ−プレグ
ナ−1,4,17(20)−トリエン−３−オン 11ａ 20−クロロ−プレグナ−1,4,9(11),17(20)−テト
ラエン−21−アール−３−オン 12ａ プレドニソロン 13ａ ６α−メチル−プレドニソロン 14ａ 21−アセトキシ−11β，17−ジヒドロキシ−16β
−メチル−プレグナ−1,4−ジエン−3,20−ジオン、及
び11β，17,21−トリヒドロキシ−16β−メチル−プレ
グナ−1,4−ジエン−3,20−ジオン 15ａ 21−アセトキシ−９α−フルオロ−11β，17−ジ
ヒドロキシ−16β−メチル−プレグナ−1,4−ジエン−
3,20−ジオン及び９α−フルオロ−11β，17,21−トリ
ヒドロキシ−16β−メチル−プレグナ−1,4−ジエン−
3,20−ジオン 16ａ 21−アセトキシ−９β，11β−エポキシ−17−ヒ
ドロキシ−16β−メチル−プレグナ−1,4−ジエン−3,2
0−ジオン及び９β，11β−エポキシ−17,21−ジヒドロ
キシ−16β−メチル−プレグナ−1,4−ジエン−3,20−
ジオン 17ａ 21−アセトキシ−17−ヒドロキシ−プレグナ−1,
4,9(11)−トリエン−3,20−ジオン及び17,21−ジヒドロ
キシ−プレグナ−1,4,9(11)−トリエン−3,20−ジオン 18ａ 21−アセトキシ−16α，17−ジヒドロキシ−プレ
グナ−1,4,9(11)−トリエン−3,20−ジオン及び16α，1
7,21−トリヒドロキシ−プレグナ−1,4,9(11)−トリエ
ン−3,20−ジオン 19ａ 21−アセトキシ−17−ヒドロキシ−16α−メチル
−プレグナ−1,4,9(11)−トリエン−3,20−ジオン及び1
7,21−ジヒドロキシ−16α−メチル−プレグナ−1,4,9
(11)−トリエン−3,20−ジオン 20ａ 21−ベンジロキシ−17−ヒドロキシ−16β−メチ
ル−プレグナ−1,4,9(11)−トリエン−3,20−ジオン 21ａ 21−アセトキシ−17−ヒドロキシ−16β−メチル
−プレグナ−1,4,9(11)−トリエン−3,20−ジオン及び1
7,21−ジヒドロキシ−16β−メチル−プレグナ−1,4,9
(11)−トリエン−3,20−ジオン 22ａ 21−アセトキシ−プレグナ−1,4,9(11),16−テト
ラエン−3,20−ジオン及び21−ヒドロキシ−プレグナ−
1,4,9(11),16−テトラエン−3,20−ジオン 23ａ 21−アセトキシ−６α−フルオロ−プレグナ−1,
4,9(11),16−テトラエン−3,20−ジオン及び６α−フル
オロ−21−ヒドロキシ−プレグナ−1,4,9(11),16−テト
ラエン−3,20−ジオン 実施例４ 二つの異なるステロイドを発酵液中のA.シンプレックス
菌体及び乾燥したA.シンプレックス菌体によって生物転
化した。各生物転化が終了したと判断されたあと（残留
基質水準がそれ以上減少しないことで示される）、混合
物のステロイドを抽出、単離し、各条件に対する収率デ
ータを得た。下の表はこの結果をまとめたものである。

(a)有用ステロイドの定義は、その後の合成に使用でき
るΔ¹化合物、又は生成物をつくるために別の生物転化
に再循環できる1,2−ジヒドロ基質のいずれかである。

(b)その他の望ましくないステロイド分子の相当量も回
収された。

実施例５ アルトロバクター・シンプレックスを５の「マイクロ
ファーム」発酵器で生育させ、ステロイド−１−脱水素
酵素の合成を誘発させ、遠心分離によって収穫した。回
収された菌ペーストの一部を二つの異なる分離方法にか
けた。第一は本明細書に記載の手順で、減圧下に55℃で
菌体を乾燥させるものであった。第二の方法は、アセト
ン乾燥された菌体の調製について合衆国特許第3,360,43
9号で勧告された手順であった。菌をアセトンと混合
し、収穫して減圧下に５℃で乾燥した。次に乾燥菌調製
剤を使用して、振とうフラスコ内で当たり10ｇの菌と
当たり10ｇのステロイドでΔ^9,11−アンドロステンジ
オンを生物転化した。

実施例６ 実施例１の６α−メチルハイドロコーチゾン又は実施例
２のアンドロスタ−4,9(11)−ジエン−3,17−ジオンの
代わりに以下に列挙した基質を使用して、対応する列挙
された生成物が得られる。

基質 １．21−アセトキシ−９α−フルオロ−11β，16α，17
−トリヒドロキシ−プレグナ−４−エン−3,20−ジオン ２．21−アセトキシ−６α，９α−ジフルオロ−11β，
16α，17−トリヒドロキシ−プレグナ−４−エン−3,20
−ジオン−16,17−アセトニド ３．21−アセトキシ−６α−フルオロ−11β−ヒドロキ
シ−16α−メチル−プレグナ−４−エン−3,20−ジオン ４．21−アセトキシ−６α−フルオロ−11β，17−ヒド
ロキシ−プレグナ−４−エン−3,20−ジオン ５．21−アセトキシ−６α，９α−ジフルオロ−11β，
17−ジヒドロキシ−16α−メチル−プレグナ−４−エン
−3,20−ジオン ６．21−アセトキシ−９α−フルオロ−11β，16α，17
−トリヒドロキシ−プレグナ−４−エン−3,20−ジオン
−16,17−アセトニド ７．21−アセトキシ−９β，11β−エポキシ−６α−フ
ルオロ−16α，17−ジヒドロキシ−プレグナ−４−エン
−3,20−ジオン−16,17−アセトニド ８．21−アセトキシ−９β，11β−エポキシ−１６α−
ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−3,20−ジオン ９．21−アセトキシ−９β，11β−エポキシ−16α，17
−ジヒドロキシ−プレグナ−４−エン−3,20−ジオン−
16,17−アセトニド 生成物 １．21−アセトキシ−９α−フルオロ−11β，16α，17
−トリヒドロキシ−プレグナ−1,4−ジエン−3,20−ジ
オン及び９α−フルオロ−11β，16α，17,21−テトラ
ヒドロキシ−プレグナ−1,4−ジエン−3,20−ジオン ２．21−アセトキシ−６α，９α−ジフルオロ−11β，
16α，17−トリヒドロキシ−プレグナ−1,4−ジエン−
3,20−ジオン−16,17−アセトニド及び６α，９α−フ
ルオロ−11β，16α，17,21−テトラヒドロキシ−プレ
グナ−1,4−ジエン−3,20−ジオン16,17−アセトニド ３．21−アセトキシ−６α−フルオロ−11β−ヒドロキ
シ−16α−メチル−プレグナ−1,4−ジエン−3,20−ジ
オン及び６α−フルオロ−11β，21−ジヒドロキシ−16
α−メチル−プレグナ−1,4−ジエン−3,20−ジオン ４．21−アセトキシ−６α−フルオロ−11β，17−ヒド
ロキシ−プレグナ−1,4−ジエン−3,20−ジオン及び６
α−フルオロ−11β，17,21−トリヒドロキシ−1,4−ジ
エン−3,20−ジオン ５．21−アセトキシ−６α，９α−ジフルオロ−11β，
17−ジヒドロキシ−16α−メチル−プレグナ−1,4−ジ
エン−3,20−ジオン及び６α，９α−ジフルオロ−11
β，17,21−トリヒドロキシ−1,4−ジエン−3,20−ジオ
ン ６．21−アセトキシ−９α−フルオロ−11β，16α，17
−トリヒドロキシ−プレグナ−1,4−ジエン−3,20−ジ
オン−16,17−アセトニド ７．21−アセトキシ−９β，11β−エポキシ−６α−フ
ルオロ−16α，17−ジヒドロキシ−プレグナ−1,4−ジ
エン−3,20−ジオン−16,17−アセトニド ８．21−アセトキシ−９β，11β−エポキシ−16−ヒド
ロキシ−プレグナ−1,4−ジエン−3,20−ジオン及び９
β，11β−エポキシ−16α，21−ジヒドロキシ−プレグ
ナ−1,4−ジエン−3,20−ジオン ９．21−アセトキシ−９β，11β−エポキシ−16α，17
−ジヒドロキシ−プレグナ−1,4−ジエン−3,20−ジオ
ン−16,17−アセトニド 実施例７ 11β−ヒドロキシ−アンドロスタ−４−エン−3,17−ジ
オンの生物変換 実施例２に記載のようにつくられたA.シンプレックス乾
燥菌体１ｇをpH7.5の50mM燐酸緩衝液100mlに再懸濁し
た。３Ａエタノールに溶解したメナジオンを86mg／の
最終濃度に加えた。11β−ヒドロキシ−アンドロステン
ジオン0.5ｇをフラスコに加えた。混合物を31℃の回転
振とう機上で培養した。１日の培養後採取すると、塩化
メチレン抽出物の薄層クロマトグラフィによって２生成
物が得られた。ステロイドの約95％は11β−ヒドロキシ
−アンドロスタ−1,4−ジエン−3,17−ジオンとして存
在した。残りは未転化基質であった。

実施例８ 実施例７の条件に従って、Ｃ−11位置が変更された次の
アンドロステンジオン誘導体が、下記生成物へ１−脱水
素化できる。

基質→生成物 (1)11β−ヒドロキシ−16β−メチル−アンドロスタ−
４−エン−3,17−ジオン →11β−ヒドロキシ−16β−メチル−アンドロスタ−1,
4−ジエン−3,17−ジオン (2)11β−ヒドロキシ−16α−メチル−アンドロスタ−
４−エン−3,17−ジオン →11β−ヒドロキシ−16α−メチル−アンドロスタ−1,
4−ジエン−3,17−ジオン (3)６α−フルオロ−11β−ヒドロキシ−アンドロスタ
−４−エン−3,17−ジオン →６α−フルオロ−11β−ヒドロキシ−アンドロスタ−
1,4−ジエン−3,17−ジオン (4)６α−メチル−11β−ヒドロキシ−アンドロスタ−
４−エン−3,17−ジオン →６α−メチル−11β−ヒドロキシ−アンドロスタ−1,
4−ジエン−3,17−ジオン (5)11α−ヒドロキシ−アンドロスタ−４−エン−3,17
−ジオン →11α−ヒドロキシ−アンドロスタ−1,4−ジエン−3,1
7−ジオン (6)アンドロスタ−４−エン−3,11,17−トリオン →アンドロスタ−1,4−ジエン−3,11,17−トリオン 実施例９ １）反応容器（１のもの）内で次のものを一緒にす
る。

ａ）50mMKPO₄緩衝液(pH7.5)0.9 ｂ）A.シンプレックス乾燥菌体3.66ｇ ｃ）メナジオン0.08ｇ ｄ）21−アセトキシ−プレグナ−4,9(11),16−トリエン
−3,20−ジオン８ｇ ｅ）トルエン100ml ２）15cal/minでかきまぜる。

３）反応容器のガス空間で酸素を約３〜６％に保つため
に、必要に応じて空気を送る。

５）25時間後、トルエン相を集める。

本実施例でトルエン相のステロイドは次のとおりであっ
た。

94.3％ 21−アセトキシ−プレグナ−1,4,9(11),16−テ
トラエン−3,20−ジオン 4.2％ 21−ヒドロキシ−プレグナ−1,4,9(11),16−テ
トラエン−3,20−ジオン 1.5％ 21−アセトキシ−プレグナ−4,9(11),16−トリ
エン−3,20−ジオン 上の段階に対して次の範囲の変数を使用できる。

段階１） ａ）緩衝液pHは６〜10の範囲にありうる。

ｂ）A.シンプレックス量を、反応終了に導くのに十分な
だけの水準に減少させる。典型的な水準は、ステロイド
ｇ当たり0.05ないし1.0ｇである。酵素の微生物給源は
アルトロバクター（コロネバクテリウム）シンプレック
ス(ATCC6946)又はバクテリウム・シクロオキシダンス(A
TCC12673)である。

微生物の調製：A.シンプレックスの菌体を、この技術で
周知のように発酵液中で使用するか、又は菌体を集め乾
燥し、アセトン処理又は固定によって変更する。

ｃ）電子受容体を次のものから選択できる。メナジオン
（２−メチル−1,4−ナフトキノン）、メナジオン重亜
硫酸塩、1,4−ナフトキノン及びその他のビタミンＫ型
化合物類 電子受容体水準は価格と反応速度に対する配慮によって
決まる。反応速度はメナジオン濃度に直線的に比例して
いる。典型的な水準はステロイドKg当たり約５ないし約
40ｇである。

ｄ）ステロイド濃度は、効率的な転化がある限り、でき
るだけ高くすべきである。

ステロイドは３−ケト−Δ⁴−アンドロステン又は３−
ケト−Δ⁴−プレグネン系に属し、好ましくは有機溶媒
中で５g/以上の溶解度をもつ。

ｅ）芳香族炭化水素はトルエン、ベンゼン又はキシレン
から選ばれる。これらの溶媒は一緒に使用してもよい
し、ヘプタン又は塩化メチレンのような水と混ざらない
別の溶媒で希釈してもよい。

芳香族炭化水素量は、出発ステロイド又は生成物ステロ
イドの最も易溶のものを溶解するのに必要な量の約半量
から、出発ステロイド又は生成物ステロイドの最も難溶
なものを溶解するのに必要な量の約４倍までの範囲にあ
る。

本実施例では、反応終了時にステロイドを溶解するのに
十分なだけの水準のトルエンを添加した。

芳香族炭化水素をステロイドと一緒に加えるが好まし
い。しかし、芳香族炭化水素を後から、又は早い時期に
添加できる。

段階２） できるだけ高いかきまぜ力でかきまぜる。反応速度はか
きまぜ力の強い関数である。

段階３） 反応は、最終水素（電子及び陽子）受容体として酸素を
必要とする。しかし、芳香族炭化水素が存在するため、
反応器のガス空間に爆発環境が存在する。この災害を克
服するために、ガス空間の酸素濃度を燃焼用最少酸素量
より十分に低い濃度に保持するのが有利である。ベンゼ
ンの場合、最少酸素量は11.2％である。キシレン類の場
合、引火点より低温で反応を行なうことも可能である。
ｍ−キシレン、ｏ−キシレン及びｐ−キシレンの引火点
は、それぞれ29、32及び39℃である。

段階４） 反応温度は約０ないし約45℃でありうる。

段階５） 反応は典型的には２日間行なわれる。数時間から数週間
まで反応を行なえる。

参考例10 トルエン手順と水性手順の比較 (A)手順 次のものを一緒にする。

A.シンプレックス菌体 0.4ｇ 50mMKPO₄ 緩衝液(pH7.5)50ml ２時間又は均質スラリーが得られるまでかきまぜる。

25mlフラクション２本を取り、125mlフラスコに入れ
る。

各フラスコに次のものを加える。

３Ａアルコール中の50mMメナジオン 0.25ml アンドロスタ−4,9(11)−ジエン−3,17−ジオン 0.2ｇ 密栓されたフラスコの一つにトルエン２mlを加える。

手首動作（リストアクション）振とう機上で４日間かき
まぜる。

４日後トルエン25mlで抽出する。

抽出物を分析する。

(B)結果 実施例11 実施例９に記載の条件に従って、A.シンプレックスの乾
燥菌体へ次のステロイド化合物を露出し、対応する1,2
−デヒドロ誘導体を得た。

番号 名前 1. アンドロスタ−４−エン−3,17−ジオン 2. ６α−フルオロ−アンドロスタ−4,9(11)−ジエン
−3,17−ジオン 3. ６α−メチル−アンドロスタ−4,9(11)−ジエン−
3,17−ジオン 4. 16β−メチル−アンドロスタ−4,9(11)−ジエン−
3,17−ジオン 5. 17α−ヒドロキシプレグネ−４−エン−20−イン−
３−オン 6. 17α−ヒドロキシプレグネ−4,9(11)−ジエン−20
−イン−３−オン 7. 17α−ヒドロキシ−16β−メチル−プレグナ−4,9
(11)−ジエン−20−イン−３−オン 8. 21−アセトキシ−11β−ヒドロキシ−プレグナ−4,
17(20)−ジエン−３−オン 9. 20−クロロ−プレグナ−4,9(11),17(20)−トリエン
−21−アール−３−オン 10. 21−アセトキシ−17−ヒドロキシ−プレグナ−4,9
(11)−ジエン−3,20−ジオン 11. 21−アセトキシ−17−ヒドロキシ−16α−メチル
−プレグナ−4,9(11)−ジエン−3,20−ジオン 12. 21−ベンゾイロキシ−17−ヒドロキシ−16β−メ
チル−プレグナ−4,9(11)−ジエン−3,20−ジオン 13. 21−アセトキシ−17−ジヒドロキシ−16β−メチ
ル−プレグナ−4,9(11)−ジエン−3,20−ジオン 14. 21−アセトキシ− プレグナ−4,9(11),16−トリ
エン−3,20−ジオン 15. 21−アセトキシ−６α−フルオロ−プレグナ−4,9
(11),16(17)−トリエン−3,20−ジオン 転化から得られる対応生成物は次のとおりである。

番号 生成物 １ａ アンドロスタ−1,4−ジエン−3,17−ジオン ２ａ ６α−フルオロ−アンドロスタ−1,4,9(11)−ト
リエン−3,17−ジオン ３ａ ６α−メチル−アンドロスタ−1,4,9(11)−トリ
エン−3,17−ジオン ４ａ 16β−メチル−アンドロスタ−1,4,9(11)−トリ
エン−3,17−ジオン ５ａ 17α−ヒドロキシプレグナ−1,4−ジエン−20−
イン−３−オン ６ａ 17α−ヒドロキシプレグナ−1,4,9(11)−トリエ
ン−20−イン−３−オン ７ａ 17α−ヒドロキシ−16β−メチル−プレグナ−1,
4,9(11)−トリエン−20−イン−３−オン ８ａ 21−アセトキシ11β−ヒドロキシ−プレグナ−1,
4,17(20)−トリエン−３−オン及び11β，21−ジヒドロ
キシ−プレグナ−1,4,17(20)−トリエン−３−オン ９ａ 20−クロロ−プレグナ−1,4,9(11),17(20)−テト
ラエン−21−アール−３−オン 10ａ 21−アセトキシ−17−ヒドロキシ−プレグナ−1,
4,9(11)−トリエン−3,20−ジオン及び17,21−ジヒドロ
キシ−プレグナ−1,4,9(11)−トリエン−3,20−ジオン 11ａ 21−アセトキシ−17−ヒドロキシ−16α−メチル
−プレグナ−1,4,9(11)−トリエン−3,20−ジオン及び1
7,21−ジヒドロキシ−16α−メチル−プレグナ−1,4,9
(11)−トリエン−3,20−ジオン 12ａ 21−ベンゾイロキシ−17−ヒドロキシ−16β−メ
チル−プレグナ−1,4,9(11)−トリエン−3,20−ジオン 13ａ 21−アセトキシ−17−ヒドロキシ−16β−メチル
−プレグナ−1,4,9(11)−トリエン−3,20−ジオン及び1
7,21−ジヒドロキシ−16β−メチル−プレグナ−1,4,9
(11)−トリエン−3,20−ジオン 14ａ 21−アセトキシ−プレグナ−1,4,9(11),16−テト
ラエン−3,20−ジオン及び21−ヒドロキシ−プレグナ−
1,4,9(11),16−テトラエン−3,20−ジオン 15ａ 21−アセトキシ−６α−フルオロ−プレグナ−1,
4,9(11),16−テトラエン−3,20−ジオン及び６α−フル
オロ−21−ヒドロキシ−プレグナ−1,4,9(11),16−テト
ラエン−3,20−ジオン 1,2−デヒドロステロイド類の有用性はよく知られてい
る。例えば合衆国特許第3,284,447号を参照。この特許
は、炭素16が置換された利尿性コーチコステロイドの合
成におけるΔ^1,4,9(11)プレグネトリエン類の有用性を
明らかにしている。合衆国特許第4,041,055号はΔ^1,4−
アンドロステンジオン誘導体からのコーチコステロイド
の合成法を明らかにしており、1,2−デヒドロアンドロ
ステン類の有用性を、医学的に有用なステロイドの製造
における重要な中間体として示している。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】１−脱水素作用をもつ微生物の空気乾燥又
   は加熱乾燥された菌体に1,2−飽和ステロイド類を露出
   することからなる、1,2−飽和３−ケトステロイドを1,2
   −デヒドロステロイド類に変換する方法。
2. 【請求項２】空気乾燥又は加熱乾燥された微生物の菌体
   が約１〜約10％の含水量をもつ、特許請求の範囲第１項
   による方法。
3. 【請求項３】１−脱水素作用をもつ微生物がアルトロバ
   クター・シンプレックス(Arthrobacter simplex)又はバ
   クテリウム・シクロオキシダンス(Bacterium cyclooxyd
   ans)である、特許請求の範囲第１項による方法。
4. 【請求項４】外因性の電子キャリヤーの存在下に、１−
   脱水素作用をもつ微生物の空気乾燥又は加熱乾燥された
   細菌菌体に1,2−飽和ステロイド類を露出することから
   なる、1,2−飽和ステロイド類を1,2−デヒドロステロイ
   ド類へ変換する特許請求の範囲第１項に記載の方法。
5. 【請求項５】外因性の電子キャリヤーがメナジオン、フ
   ェナジンメトサルフェート、ジクロロフェノールインド
   フェノール、1,4−ナフトキノン、メナジオン重亜硫酸
   塩、ユビキノン類（補酵素Ｑ）又はビタミンＫ型化合物
   類である特許請求の範囲第４項による方法。
6. 【請求項６】空気乾燥又は加熱乾燥した微生物菌体が約
   １〜約10％の含水量をもっている、特許請求の範囲第４
   項による方法。
7. 【請求項７】１−脱水化作用をもつ微生物がアルトロバ
   クター・シンプレックス又はバクテリウム・シクロオキ
   シダンスである、特許請求の範囲第４項による方法。