MX2014011274A

MX2014011274A - Composicion farmaceutica para el tratamiento y/o prevencion de cancer de vesicula biliar.

Info

Publication number: MX2014011274A
Application number: MX2014011274A
Authority: MX
Inventors: Fumiyoshi Okano; Takanori Saito; Takayoshi Ido
Original assignee: Toray Industries
Priority date: 2012-03-30
Filing date: 2013-03-29
Publication date: 2014-10-06
Also published as: AU2013241043B2; MX357965B; US9428581B2; JPWO2013147176A1; HUE036425T2; ES2656501T3; US20150299314A1; DK2832366T3; RU2649802C2; KR20150002618A; WO2013147176A1; BR112014024209A2; CA2869123C; RU2014143784A; CN104203281A; EP2832366A4; CA2869123A1; PT2832366T; EP2832366B1; AU2013241043A1

Abstract

La presente invención se refiere a un anticuerpo efectivo para tratamiento y/o prevención de cáncer de vesícula biliar. Una composición farmacéutica para tratamiento y/o prevención de cáncer de vesícula biliar contiene como un ingrediente activo un anticuerpo o un fragmento del mismo que tiene reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1 o un fragmento de la misma que comprende al menos siete residuos de aminoácido consecutivos de la secuencia de aminoácido de la proteína.

Description

COMPOSICION FARMACEUTICA PARA EL TRATAMIENTO Y/O PREVENCION DE CANCER DE VESICULA BILIAR Campo de la Invención La presente invención se refiere a un uso medicinal novedoso de un anticuerpo contra una proteina CAPRIN-1 o un fragmento de la misma, por ejemplo, como un agente para tratar y/o prevenir el cáncer de vesícula biliar.

Antecedentes de la Invención Recientemente, se han hecho en el mundo varios fármacos de anticuerpos para tratar cánceres dirigiendo las proteínas de antígenos en células de cáncer. Los fármacos de anticuerpo muestran ciertos efectos benéficos como agentes terapéuticos específicos del cáncer y han recibido la atención. Sin embargo, la mayoría de las proteínas de antígeno objetivo son expresadas también en células normales, y la administración de tal anticuerpo deteriora no solamente las células de cáncer, sino también las células normales que expresan el antígeno, resultando en un problema de efectos secundarios a partir de estos. Por consiguiente, si un antígeno de cáncer que es específicamente expresado en la superficie de las células de cáncer es identificado y un anticuerpo que dirige el antígeno puede ser usado como un agente de tratamiento, puede esperarse el tratamiento con un fármaco de anticuerpo con menos efectos secundarios.

REF.: 250857 Se conoce por aquellos expertos en la técnica como conocimiento técnico general que el cáncer de vesícula biliar, entre varios cánceres, es muy difícil de detectar en una etapa temprana debido a su carencia de síntomas y síntomas tempranos; el cáncer de vesícula biliar avanzado tal como metástasis de nodo linfático, metástasis del hígado, metástasis del pulmón, metástasis del hueso, o metástasis peritoneal es muy difícil tratar, conduciendo a una tasa de supervivencia de cinco años de casi 0% para pacientes con cáncer de vesícula biliar no susceptible de cirugía; y el cáncer de vesícula biliar es muy difícil de tratar y no se han desarrollado terapias efectivas para el cáncer.

La proteína 1 asociada a la proliferación (por sus siglas en inglés, CAPRIN-1) ha sido conocida como una proteína intercelular que es expresada en la activación de células normales en la fase de reposo o en la incidencia de la división celular y está involucrada en el control del transporte y traducción del ARNm a través de la formación de gránulos de estrés intracelular con ARN en las células. Se encontró que la CAPRIN-1 es específicamente expresada en la superficie de células de cáncer tales como células de cáncer de mama, y la CAPRIN-1 ha sido estudiada como un objetivo de fármacos de anticuerpo para terapia de cáncer (Literatura de Patente 1) . Sin embargo, en la Literatura de Patente 1, la expresión de proteína CAPRIN-1 en las células de cáncer de vesícula biliar no se reconoce, y no se describe o sugiere que la proteína CAPRIN-1 puede ser una proteína de antígeno del cáncer de vesícula biliar.

Lista de Citación Literatura de Patente Literatura de Patente 1: WO2010/016526 Breve Descripción de la Invención Problema Técnico Es un objeto de la presente invención identificar una proteína de antígeno de cáncer siendo expresada en la superficie de células de cáncer de vesícula biliar y proporcionar un uso de un anticuerpo que dirige la proteína como un agente para tratar y/o prevenir cáncer de vesícula biliar .

Solución al Problema Los presentes inventores han estudiado de manera diligente y, como un resultado, han encontrado que una parte de la proteína CAPRIN-1 es expresada en la superficie celular de células de cáncer de vesícula biliar y también han encontrado que un anticuerpo contra la proteína CAPRIN-1 deteriora las células de cáncer de vesícula biliar que expresan la proteína CAPRIN-1, y han realizado la presente invención .

Por consiguiente, la presente invención tiene las siguientes características.

La presente invención proporciona una composición farmacéutica para tratar y/o prevenir cáncer de vesícula biliar, que comprende, como un ingrediente activo, un anticuerpo o un fragmento del mismo que tiene reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1 que comprende una secuencia de aminoácido expuesta en cualquiera de los números de secuencia incluso a partir de las SEC ID NOs: 2 hasta 30 o una secuencia de aminoácido que tiene una identidad de secuencia de 80% o más, preferiblemente 85% o más, más preferiblemente 90% o más, y muy preferiblemente 95% o más con la secuencia de aminoácido, o un fragmento de la proteína CAPRIN-1 que comprende al menos siete residuos de aminoácido consecutivos de la secuencia de aminoácido de la proteína.

En otra modalidad, el anticuerpo descrito anteriormente es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal .

En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de cadena única, o un anticuerpo multiespecífico .

En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo que tiene reactividad inmunológica con un péptido que comprende una secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 271, SEC ID NO: 273, SEC ID NO: 266, SEC ID NO: 270, SEC ID NO: 272, o SEC ID NO: 269 o una secuencia de aminoácido que tiene una identidad de secuencia de 80% o más, preferiblemente 85% o más, más preferiblemente 90% o más, y muy preferiblemente 95% o más con la secuencia de aminoácido o un fragmento del péptido.

En otra modalidad, el anticuerpo es cualquiera de los siguientes anticuerpos (a) hasta (ao) que tiene reactividad inmunológica con la proteína CAPRIN-1, o una composición farmacéutica para tratar y/o prevenir cáncer de vesícula biliar, que comprende el anticuerpo como un ingrediente activo. (a) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 37, 38, y 39, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 41, 42, y 43, respectivamente. (b) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 47, 48, y 49, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3 ) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 51, 52, y 53, respectivamente . (c) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 57, 58, y 59, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 61, 62, y 63, respectivamente . (d) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3 ) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 67, 68, y 69, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 71, 72, y 73, respectivamente. (e) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 77, 78, y 79, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 81, 82, y 83, respectivamente . (f) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 87, 88, y 89, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 91, 92, y 93, respectivamente. (g) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 97, 98, y 99, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3 ) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 101, 102, y 103, respectivamente . (h) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3 ) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 107, 108, y 109, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 111, 112, y 113, respectivamente. (i) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 117, 118, y 119, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 121, 122, y 123, respectivamente. (j) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 127, 128, y 129, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 121, 122, y 123, respectivamente. (k) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 132, 133, y 134, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 136, 137, y 138, respectivamente. (1) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 142, 143, y 144, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 146, 147, y 148, respectivamente. (m) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3 ) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 142, 143, y 144, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 152, 153, y 154, respectivamente. (n) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 157, 158, y 159, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 161, 162, y 163, respectivamente. (o) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 167, 168, y 169, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 171, 172, y 173, respectivamente. (p) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 167, 168, y 169, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 177, 178, y 179, respectivamente. (q) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 167, 168, y 169, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 182, 183, y 184, respectivamente. (r) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 167, 168, y 169, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 187, 188, y 189, respectivamente. (s) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 167, 168, y 169, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 192, 193, y 194, respectivamente. (t) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 197, 198, y 199, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 201, 202, y 203, respectivamente. (u) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 207, 208, y 209, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 211, 212, y 213, respectivamente. (v) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 217, 218, y 219, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 221, 222, y 223, respectivamente. (w) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 227, 228, y 229, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 231, 232, y 233, respectivamente. (x) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 237, 238, y 239, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 241, 242, y 243, respectivamente. (y) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 247, 248, y 249, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 251, 252, y 253, respectivamente. (z) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 276, 277, y 278, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 280, 281, y 282, respectivamente. (aa) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3 ) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 276, 277, y 278, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 286, 287, y 288, respectivamente. (ab) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 291, 292, y 293, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDRl, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 295, 296, y 297, respectivamente. (ac) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDRl, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 301, 302, y 303, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDRl, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 305, 306, y 307, respectivamente. (ad) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDRl, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 311, 312, y 313, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDRl, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 315, 316, y 317, respectivamente. (ae) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 321, 322, y 323, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3 ) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 325, 326, y 327, respectivamente. (af) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3 ) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 331, 332, y 333, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 335, 336, y 337, respectivamente. (ag) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 341, 342, y 343, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 345, 346, y 347, respectivamente. (ah) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 351, 352, y 353, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 354, 355, y 356, respectivamente. (ai) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 351, 352, y 357, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 354, 355, y 356, respectivamente. (aj) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 373, 374, y 375, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CD 1, CDR2 , y CDR ) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 377, 378, y 379, respectivamente. (ak) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 383, 384, y 385, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 387, 388, y 389, respectivamente. (al) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 393, 394, y 395, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 387, 388, y 389, respectivamente. (am) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 398, 399, y 400, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 402, 403, y 404, respectivamente. (an) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consiste de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 408, 409, y 410, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consiste de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 412, 413, y 414, respectivamente. (ao) Un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3 ) que consiste de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 418, 419, y 420, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consiste de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 422, 423, y 424, respectivamente.

En otra modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo de la presente invención son conjugados a un agente antitumoral .

La presente invención proporciona además un agente farmacéutico de combinación que comprende la combinación de la composición farmacéutica de la presente invención y una composición farmacéutica que contiene un agente antitumoral.

La presente invención proporciona además un método para tratar y/o prevenir cáncer de vesícula biliar, que comprende administrar la composición farmacéutica o el agente farmacéutico de combinación de la presente invención a un sujeto.

La presente descripción abarca los contenidos en la descripción y/o las figuras de la Solicitud de Patente Japonesa No. 2012-080780 con base en la cual la presente solicitud reivindica la prioridad.

Efectos Ventajosos de la Invención El anticuerpo contra la proteína CAPRIN-1 usada en la presente invención (posteriormente, a menudo referido como un "anticuerpo anti -CAPRIN- 1" ) deteriora las células de cáncer de vesícula biliar. Por consiguiente, el anticuerpo contra la proteína CAPRIN- 1 es útil para el tratamiento y prevención de cáncer de vesícula biliar.

Descripción Detallada de la Invención La actividad antitumoral de un anticuerpo usado en la presente invención contra un polipéptido que consiste de una secuencia de aminoácido expuesta en cualquiera de los números de secuencia incluso a partir de las SEC ID NOs : 2 hasta 30 puede ser evaluada investigando la supresión in vivo del crecimiento del tumor en un animal que porta el tumor o investigando, como se describe abajo, si o no una citotoxicidad a través de las células inmunes o un complemento se observa en las células tumorales que expresan el polipéptido in vitro.

Las secuencias de nucleótido de polinucleótidos que codifican proteínas que consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en números de secuencia incluso a partir de las SEC ID NOs : 2 hasta 30 (es decir, SEC ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, y 30) son expuestas en números de secuencia impares a partir de las SEC ID NOs : 1 hasta 29 (es decir, SEC ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, y 29).

Las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 6, 8, 10, 12, y 14 en el listado de secuencia son secuencias de aminoácido de una proteína CAPRIN-1 aislada como polipéptidos que se unen a un anticuerpo específicamente presente en suero derivado de perros que portan tumores por un método SEREX usando una biblioteca de ADNc derivada de tejido de testículos de perro y suero de un perro con cáncer de mama; las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 2 y 4 son secuencias de aminoácido aisladas como factores homólogos humanos (homólogos u ortólogos) de los polipéptidos ,- la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 16 es una secuencia de aminoácido aislada como un factor homólogo bovino del mismo; la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 18 es una secuencia de aminoácido aislada como un factor homólogo de caballo del mismo; las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 20 hasta 28 son secuencias de aminoácido aisladas como factores homólogos de ratón del mismo; y la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO : 30 es una secuencia de aminoácido aislada como un factor homólogo de pollo (véase el Ejemplo 1 descrito abajo) del mismo. La proteína CAPRIN-1 se conoce por ser expresada en la activación de células normales en la fase de reposo o en la incidencia de la división celular.

La investigación reveló que la proteína CAPRIN-1 es expresada en la superficie celular de células de cáncer de vesícula biliar. En la presente invención, un anticuerpo que se une a una parte de la proteína CAPRIN-1 expresada en la superficie celular de células de cáncer de vesícula biliar es preferiblemente usado. Ejemplos del péptido parcial (fragmento) de la proteína CAPRIN-1 expresada en la superficie celular de células de cáncer de vesícula biliar incluyen péptidos que comprenden al menos siete residuos de aminoácido consecutivos en la región de las posiciones de residuo de aminoácido (aa) 233 hasta (aa) 343, posiciones de residuo de aminoácido (aa) 512 hasta el C-terminal, o posiciones de residuo de aminoácido (aa) 50 hasta (aa) 98 de las secuencias de aminoácido expuestas en números de secuencia incluso a partir de las SEC ID NOs : 2 hasta 30, excluyendo las SEC ID NOs : 6 y 18, en el listado de secuencia. Específicamente, por ejemplo, el péptido parcial (fragmento) es un péptido que comprende al menos siete residuos de aminoácido consecutivos en una secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO : 429, SEC ID NO: 428, SEC ID NO: 273 (en la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 273, la región de la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 274 o SEC ID NO: 275 es preferida), SEC ID NO: 266 (en la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 266, la región de la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 267 o SEC ID NO: 268 es preferida), SEC ID NO: 270, SEC ID NO: 272, SEC ID NO: 269, SEC ID NO: 430, SEC ID NO: 431, o SEC ID NO: 432, o en una secuencia de aminoácido que tiene una identidad de secuencia de 80% o más, preferiblemente 85% o más, más preferiblemente 90% o más, y muy preferiblemente 95% o más, tal como 96% o más, 97% o más, 98% o más, o 99% o más, con la secuencia de aminoácido mencionada anteriormente. Ejemplos del anticuerpo usado en la presente invención incluyen todos los anticuerpos que se unen a cualquiera de estos péptidos y muestran actividad antitumoral.

El anticuerpo anti-CAPRIN-1 usado en la presente invención puede ser cualquier tipo de anticuerpo que muestra actividad antitumoral , y ejemplos del mismo incluyen anticuerpos monoclonales ; anticuerpos policlonales ; anticuerpos recombinantes tales como anticuerpos sintéticos, anticuerpos multiespecífieos (por ejemplo, diacuerpos y triacuerpos) , anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, y anticuerpos de cadena única (scFv) ; anticuerpos humanos; y fragmentos de anticuerpo de los mismos tales como Fab, F(ab' )2/ Y Fv. Estos anticuerpos y fragmentos del mismo pueden ser preparados por aquellos expertos en la técnica a través de un método conocido. En la presente invención, un anticuerpo capaz de unirse específicamente a una proteína CAPRIN-1 es deseable, y se prefiere un anticuerpo monoclonal . Sin embargo, el puede ser un anticuerpo policlonal que es homogéneo y puede ser establemente producido. Cuando el sujeto es un ser humano, un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado es deseable para inhibir o suprimir la reacción de rechazo.

Aquí, el término "unirse específicamente a una proteína CAPRIN-1" se refiere a unirse específicamente a una proteína CAPRIN-1 y sustancialmente no se une a otras proteínas.

La actividad antitumoral del anticuerpo que puede ser usado en la presente invención puede ser evaluada mediante, como se describe abajo, investigando la supresión in vivo del crecimiento del tumor en un animal que porta el tumor o investigar si o no una citotoxicidad a través de las células inmunes o un complemento se observa en las células tumorales que expresan el polipéptido in vitro.

El sujeto como un objeto del tratamiento y/o prevención del cáncer de vesícula biliar en la presente invención es un mamífero tal como un ser humano, un animal de mascota, un animal doméstico, o un animal para uso competitivo; y es preferiblemente un ser humano.

La producción de un antígeno, la producción de un anticuerpo, y una composición farmacéutica de conformidad con la presente invención serán ahora descritas. <Producción de antígeno para producir anticuerpo La proteína o fragmento de la misma para ser usada como un antígeno sensibilizante para preparar un anticuerpo anti-CAPRIN-1 usada en la presente invención puede ser derivada de cualquiera de las especies animales, tales como un ser humano, perro, bovino, caballo, ratón, rata, o pollo, y es preferiblemente seleccionada con consideración para compatibilidad con las células progenitoras usadas para fusión celular. En general, la proteína es preferiblemente una proteína derivada de un mamífero, en particular, un ser humano. Por ejemplo, cuando la proteína CAPRIN-1 es una proteína CAPRIN-1 humana, una proteína CAPRIN-1 humana, un péptido parcial del mismo, o células que expresan una proteína CAPRIN-1 humana pueden ser usadas.

Las secuencias de nucleótido y las secuencias de aminoácido de una proteína CAPRIN-1 humana y un homólogo de la misma se pueden obtener mediante, por ejemplo, acceder al GenBank (NCBI, USA) y usando el algoritmo tal como BLAST o FASTA (Karlin and Altschul, Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 90: 5873-5877, 1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402, 1997) .

En la presente invención, el objetivo es un ácido nucleico o proteína que consiste de una secuencia que tiene una identidad de secuencia de 70% hasta 100%, preferiblemente 80% hasta 100%, más preferiblemente 90% hasta 100%, y muy preferiblemente 95% hasta 100%, tal como 97% hasta 100%, 98% hasta 100%, 99% hasta 100%, o 99.5% hasta 100%, con la secuencia de nucleótido o la secuencia de aminoácido del ORF o la parte madura del gen CAPRIN-1 humano cuando la secuencia de nucleótido y la secuencia de aminoácido de la misma se basan en las secuencias expuestas en la SEC ID NO : 1 o 3 y SEC ID NO : 2 o 4, respectivamente. Aquí, el término "% de identidad de secuencia" entre dos secuencias de aminoácido (o nucleótido) se refiere al porcentaje (%) del número de aminoácidos (o nucleótidos) en una secuencia que coincide con aquellas en la otra secuencia con el número total cuando las dos secuencias son alineadas (alineamiento) con un grado máximo de similitud o coincidencia introduciendo una abertura o no .

Un fragmento de la proteína CAPRIN-1 tiene una longitud desde una longitud de aminoácido de un epítopo (determinante de antígeno) , la cual es una unidad mínima reconocida por un anticuerpo, o a una longitud de aminoácido más corta que la longitud total de la proteína. El epítopo se refiere a un fragmento de péptido que tiene antigenicidad o inmunogenicidad en un mamífero, preferiblemente en un ser humano, y su unidad mínima consiste de aproximadamente 7 hasta 12 aminoácidos, tal como 8 hasta 11 aminoácidos. Ejemplos del epítopo incluyen las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NO: 273, SEC ID NO: 266, SEC ID NO: 270, SEC ID NO: 272, y SEC ID NO: 269; y una secuencia de aminoácido que tiene una identidad de secuencia de 80% o más, preferiblemente 85% o más, más preferiblemente 90% o más, y muy preferiblemente 95% o más con cualquiera de las secuencias de aminoácido.

El polipéptido que comprende una proteína CAPRIN-1 humana o un péptido parcial de la misma puede ser sintetizado, por ejemplo, de conformidad con una síntesis química tal como un método de fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) o un método de t-butiloxicarbonilo (tBoc) , método 1 (Seikagaku Jikken Koza (Curso de Experimentos de Bioquímica) , Tanpakushitsu no Kagaku (Química de Proteína) IV, Kagaku shushoku to peputido gosei (Modificación química y síntesis peptídica) , editado por la Sociedad Japonesa de Bioquímica, Tokyo Kagaku Dojin (Japan) , 1981). Alternativamente, el péptido puede ser sintetizado por un método usual usando varios sintetizadores peptídicos comercialmente disponibles. Además, un polipéptido objetivo se puede obtener preparando un ADN que codifica el polipéptido por un procedimiento de ingeniería genética conocido (por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning, 2da. edición, Current Protocols in Molecular Biology (1989) , Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3ra. edición, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons), incorporando el ADN en un vector de expresión e introduciéndolo en una célula hospedera, y permitiendo la producción del péptido en la célula hospedera.

El ADN que codifica el polipéptido puede ser fácilmente preparado por un procedimiento de ingeniería genética conocido, o por un método usual con un sintetizador peptídico comercialmente disponible. Por ejemplo, un ADN que comprende la secuencia de nucleótido expuesta en la SEC ID NO: 1 puede ser preparado por PCR usando un par de cebadores diseñados de manera que la secuencia de nucleótido expuesta en la SEC ID NO : 1 puede ser amplificada usando una biblioteca de ADNc o cromosoma humano como una plantilla. Las condiciones de reacción para la PCR pueden ser apropiadamente determinadas, y ejemplos no limitantes de la misma incluyen condiciones en las cuales se usa un amortiguador de PCR que contiene una polimerasa de ADN estable al calor (por ejemplo, polimerasa Taq) y Mg2+, y la amplificación se realiza repitiendo, por ejemplo, 30 ciclos de un proceso que consiste de reacciones a 94 °C por 30 segundos (desnaturalización) , a 55°C por 30 segundos hasta 1 minuto (templado) , y a 72 °C por 2 minutos (extensión) y después realizar una reacción a 72 °C por 7 minutos. El procedimiento, condiciones y otros factores de PCR se describen en, por ejemplo, Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3ra. edición, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, (1995) , John Wiley & Sons (en particular, el capítulo 15) .

Un ADN deseado puede ser aislado preparando sondas y cebadores apropiados con base en la información de las secuencias de nucleótido y las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 1 hasta 30 del listado de secuencia en la descripción y selección, por ejemplo, una biblioteca de ADNc humano usando las sondas y cebadores resultantes. La biblioteca de ADN es preferiblemente construida de células, un órgano, o tejido que expresa las proteínas expuestas en cualquiera de los números de secuencia incluso a partir de las SEC ID NOs: 2 hasta 30. Ejemplos de células y tejidos incluyen aquellas derivadas de testículos y células de cáncer o tumor, tales como leucemia, cáncer de mama, linfoma, tumor cerebral, cáncer de pulmón, cáncer de colon y cáncer de vesícula biliar. Los procedimientos descritos anteriormente tales como la preparación de sondas o cebadores, construcción de una biblioteca de ADNc, selección de la biblioteca de ADNc, y clonación de un gen objetivo se conocen por aquellos expertos en la técnica y pueden ser realizados, por ejemplo, de conformidad con el método descrito en, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning, 2da. edición, Current Protocols in Molecular Biology, (1989) o Ausbel, et al. (arriba). Un ADN que codifica una proteína CAPRI -l humana o un péptido parcial de la misma, puede ser preparado a partir del ADN preparado de este modo.

La célula hospedera puede ser cualquier célula que expresa el péptido mencionado anteriormente, y ejemplos de la misma incluyen, pero no se limitan a, células procarióticas tales como células de E. coli y células eucarióticas tales como células de mamífero, por ejemplo, células COSI de riñon de mono, y células CHO de ovario de hámster Chino, línea de células de riñon embriónico humano HEK293 , línea de células del fibroblasto embriónico de ratón NIH3T3, células de levadura, por ejemplo, células de levadura de fisión y levaduras gemantes, células del gusano de seda, y células de huevos de Xenopus .

Cuando las células procarióticas son usadas como células hospederas, se usa un vector de expresión que tiene un origen de replicable en la célula procariótica, un promotor, un sitio de unión al ribosoma, un sitio de multiclonación, un terminador, un gen de resistencia al fármaco, un gen com lementario auxotrófico, etc.. Ejemplos del vector de expresión para E. coli incluyen el vector pUC, pBluescriptII , sistema de expresión pET, y sistema de expresión pGEX. El polipéptido descrito anteriormente puede ser expresado en células hospederas procarióticas incorporando un ADN que codifica el polipéptido en tal vector de expresión, transformando las células hospederas procarióticas con el vector, y después cultivando el transformante resultante. En esta ocasión, el polipéptido también puede ser expresado como una proteína de fusión con otra proteína.

Cuando las células eucarióticas son usadas como células hospederas, se usa un vector de expresión para células eucarióticas que tienen un promotor, una región empalmante, un sitio de adición poli (A) , etc. Ejemplos del vector de expresión incluyen pKAl, pCDM8 , pSVK3 , pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, vector EBV, pRS, pcDNA3 , y pYES2. El polipéptido descrito anteriormente puede ser expresado en células hospederas eucarióticas como anteriormente incorporando un ADN que codifica el polipéptido en tal vector de expresión, transformando las células hospederas eucarióticas con el vector, y después cultivando el transformante resultante. Cuando el vector de expresión es, por ejemplo, pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-Nl, o pEGFP-Cl, el polipéptido puede ser expresado como una proteína de fusión con una etiqueta tal como etiqueta His (por ejemplo, (His)6 a (His)io), etiqueta FLAG, etiqueta myc, etiqueta HA, o GFP.

La introducción del vector de expresión en células hospederas puede ser realizada por un método conocido tal como electroporación, transfección de fosfato de calcio, un método de liposoma, un método de DEAE-Dextrano, micro-inyección, infección por virus, lipofección, o unión a un péptido que penetra la célula.

Un polipéptido objetivo puede ser aislado y purificado a partir de las células hospederas combinando procedimientos de separación conocidos. Ejemplos de los procedimientos de separación incluyen, pero no se limitan a, tratamiento con un desnaturalizante tal como urea o un tensioactivo, ultrasonicación, digestión enzimática, salificación, precipitación fraccional de solvente, diálisis, centrifugación, ultrafiltración, filtración en gel, SDS-PAGE, foresis de enfoque isoeléctrico, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica, cromatografía de afinidad, y cromatografía de fase inversa <Estructura del anticuerpo> Un anticuerpo es usualmente una glicoproteína heteromultimérica al menos que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas pesadas. Excepto para IgM, un anticuerpo es una glicoproteína heterotetramérica de aproximadamente 150 kDa que comprende las mismas dos cadenas ligeras (L) y las mismas dos cadenas pesadas (H) . Típicamente, una cadena ligera está ligada a una cadena pesada a través de un enlace covalente de disulfuro, y el número de enlaces disulfuro entre las cadenas pesadas varía dependiendo del isotipo de inmunoglobulina . Las cadenas pesadas y las cadenas ligeras cada una tiene un enlace disulfuro intracadena. Cada cadena pesada tiene un dominio variable (dominio VH) en un extremo, seguido por varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (dominio VL) y un dominio constante en su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera es alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera es alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Los dominios variables de un anticuerpo confieren especificidad de unión en el anticuerpo con regiones específicas que presentan variabilidad particular llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDRs) . Las porciones relativamente conservadas de los dominios variables son llamadas regiones de armazón (FRs) . Los dominios variables de cadenas pesada y ligera intactos cada uno comprende cuatro FRs conectados por tres CDRs. Las tres CDRs en la cadena pesada son llamadas CDRH1, CDRH2, y CDRH3 en este orden a partir de los lados N-terminales. De manera similar, en la cadena ligera, las CDRs son llamadas CDRL1, CDRL2, y CDRL3. CDRH3 es muy importante en la especificidad de unión de un anticuerpo a un antígeno. Las CDRs de cada cadena se mantienen en conjunto en un estado contiguo por las FRs y contribuyen en conjunto con las CDRs de otra cadena para la formación del sitio de unión al antígeno del anticuerpo. Los dominios constantes no están directamente involucrados en la unión del anticuerpo al antígeno, pero exhiben varias funciones efectoras tales como participación en la citotoxicidad mediada por células dependientes del anticuerpo (ADCC) , fagocitosis mediante unión al receptor Fe ?, receptor Fe neonatal mediante el índice de vida media/separación (FcRn) , y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) mediante el componente Clq de la cascada del complemento. <Producción del anticuerpo El anticuerpo anti-CAPRIN- 1 en la presente invención es un anticuerpo que tiene una reactividad inmunológica con la longitud completa o un fragmento de una proteína CAPRIN-1.

Aquí, el término "reactividad inmunológica" se refiere a una propiedad que un anticuerpo y un antígeno de CAPRIN-1 se une entre sí in vivo, y una función de deterioro del tumor (por ejemplo, muerte, supresión, o regresión) se presenta a través de tal unión. Es decir, el anticuerpo usado en la presente invención puede ser cualquier anticuerpo que se une a una proteína CAPRIN-1 y de este modo puede alterar el cáncer de vesícula biliar.

Ejemplos del anticuerpo incluyen anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales , anticuerpos sintéticos, anticuerpos multiespecíficos , anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadena única, y fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Fab, F(ab y Fv) . El anticuerpo es una clase apropiada de moléculas de inmunoglobulina, tal como IgG, IgE, IgM, IgA, IgD, o IgY, o una subclase apropiada, tal como Igd, IgG2, IgG3 , IgG4, IgAl7 o IgA2.

El anticuerpo puede ser además modificado mediante, por ejemplo, acetilación, formilación, amidación, fosforilación, o polietilenglicolación (PEGilación) , así como también glicosilación .

Ejemplos de producción de varios anticuerpos serán ahora descritos.

En un anticuerpo monoclonal, por ejemplo, un ratón es inmunizado con una proteína CAPRIN-1, células de cáncer de vesícula biliar que expresan la proteína CAPRIN-1, o una línea celular (por ejemplo, TGBC1 TKB) de la misma; el bazo es extraído a partir del ratón; las células del bazo son separadas y son fusionadas con células de mieloma de ratón; y clones que producen anticuerpos que tienen actividad inhibidora del crecimiento de células de cáncer son seleccionados a partir de las células fusionadas resultantes (hibridomas) . Un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que tiene actividad inhibidora del crecimiento de células de cáncer es aislado y es cultivado, y el anticuerpo es purificado a partir del sobrenadante de cultivo por purificación de afinidad usual para preparar un anticuerpo monoclonal .

El hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal también puede ser producido mediante, por ejemplo, como sigue. Primero, un animal es inmunizado con un agente sensibilizante de conformidad con un método conocido. En general, el agente sensibilizante es intraperitonealmente o subcutáneamente inyectado a un mamífero. Específicamente, el antígeno sensibilizante es apropiadamente diluido con, por ejemplo, salina amortiguada de fosfato (PBS) o salina fisiológica. La suspensión resultante es opcionalmente mezclada con una cantidad apropiada de un adyuvante normal, tal como adyuvante Freund completo y emulsificado, y es entonces administrado al mamífero varias veces a intervalos de 4 a 21 días. Además, un portador apropiado puede ser usado en inmunización con el antígeno sensibilizante.

Después de la inmunización al mamífero y confirmación de un incremento en el nivel de un anticuerpo deseado en el suero, las células inmunes son recolectadas del mamífero y son sometidas a fusión celular. Las células inmunes son preferiblemente células del bazo.

Las células de mieloma de mamífero son usadas como otras células precursoras para ser fusionadas con las células inmunes. Como las células de mieloma, varias líneas de células conocidas, por ejemplo, P3U1 (P3-X63Ag8Ul) , P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol . , (1979), 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology, (1978), 81, 1-7), NS-1 (Kohler, G. and Milstein, C, Eur. J. Immunol,. (1976), 6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D.H., et al., Cell, (1976), 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M . et al., Nature, (1978), 276, 269-270), FO (deSt. Groth, S.F., et al., J. Immunol. Methods, (1980), 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med., (1978), 148, 313-323), o R210 (Galfre, G. et al., Nature, (1979), 277, 131-133), pueden ser adecuadamente usados .

Las células inmune y las células de mieloma pueden ser fundamentalmente fusionadas por un método conocido, por ejemplo, de conformidad con el método de Kohler and Milstein (Kohler, G. and Milstein, C, Methods Enzymol . , (1981), 73, 3-46) .

Más específicamente, se realiza la fusión celular, por ejemplo, en una solución de cultivo de nutriente normal en la presencia de un acelerador de fusión celular. Ejemplos del acelerador de fusión celular incluyen polietilenglicol (PEG) y virus Sendai (HVJ) . Además, un agente auxiliar tal como dimetilsulfóxido puede ser opcionalmente usado para incrementar la eficiencia de fusión.

La relación en número entre las células inmunes y las células de mieloma puede ser arbitrariamente determinada. Por ejemplo, la relación del número de las células inmunes al número de células de mieloma es preferiblemente 1 hasta 10. La solución de cultivo usada en la fusión celular puede ser, por ejemplo, una solución de cultivo RP I1640 o solución de cultivo MEM adecuada para crecimiento de la línea de células de mieloma o una solución de cultivo normal que se usa para tal cultivo celular. Además, un reemplazo de suero tal como suero de ternera fetal (FCS) puede ser agregado a la solución de cultivo.

La fusión celular es realizada mezclando suficientemente cantidades predeterminadas de las células inmunes y las células de mieloma en la solución de cultivo, agregando una solución de PEG (peso molecular promedio: por ejemplo, aproximadamente 1000 hasta 6000) previamente calentada hasta aproximadamente 37°C a la mezcla, usualmente, a una concentración de 30% a 60% (p/v) , y mezclándola para formar un hibridoma deseado. Sucesivamente, se agrega una solución de cultivo apropiada a la mezcla, y el sobrenadante es removido por centrifugación. Este procedimiento es repetido para remover los componentes, tal como el promotor de fusión, que son indeseables para el crecimiento de hibridomas .

El hibridoma de este modo preparado puede ser seleccionado por cultivo en una solución de cultivo de selección usual, por ejemplo, una solución de cultivo HAT (solución de cultivo que contiene hipoxintina, aminopterina, y timidina) . El cultivo en la solución de cultivo HAT se continúa por un periodo de tiempo suficiente (usualmente, varios días a varias semanas) para eliminar las células (células no fusionadas) distinto de las hibridomas objetivo. Subsecuentemente, un método de dilución limitante usual se realiza para selección y clonación individual del hibridoma que produce el anticuerpo objetivo.

En lugar del método para obtener un hibridoma inmunizando un animal no humano con un antígeno, un hibridoma que produce un anticuerpo humano que tiene la actividad deseada (por ejemplo, actividad inhibidora del crecimiento celular) se puede obtener sensibilizando los linfocitos humanos, por ejemplo, linfocitos humanos infectados con virus EB, con una proteína, células que expresan la proteína, o lisado del mismo in vitro, y fusionar los linfocitos sensibilizados con células de mieloma derivados a partir de un ser humano y que tienen capacidad de división permanente, por ejemplo, U266 (Registro No. TIB196) .

El hibridoma de este modo preparado que produce un anticuerpo monoclonal puede ser pasado en una solución de cultivo usual y puede ser almacenado en un nitrógeno líquido por un largo tiempo.

Es decir, un antígeno deseado o una célula que expresa el antígeno deseado se usa como el antígeno sensibilizante y es inmunizado de conformidad con un método usual; las células inmune resultantes son fusionadas con células parentales conocidas por una fusión celular usual; y una célula que produce el anticuerpo monoclonal (hibridoma) se selecciona por un método de selección usual. De este modo, un hibridoma puede ser producido.

Otro ejemplo del anticuerpo que puede ser usado en la presente invención es un anticuerpo policlonal. El anticuerpo policlonal puede ser preparado, por ejemplo, como sigue .

El suero se prepara inmunizando un animal pequeño, tal como un ratón, un ratón que produce anticuerpo humano, o un conejo, con una proteína CAPRIN-1 nativa, una proteína CAPRIN-1 recombinante expresada en microorganismos, tales como E. coli, como una proteína de fusión con, por ejemplo, GST, o un péptido parcial del mismo. El suero es purificado mediante, por ejemplo, precipitación de sulfato de amonio, cromatografía en columna de proteína G o proteína A, cromatografía de intercambio iónico DEAE, o una cromatografía en columna de afinidad acoplada con una proteína CAPRIN-1 o un péptido sintético. En ejemplos descritos abajo, se produjo un anticuerpo policlonal de conejo contra la proteína CAPRIN-1, y se confirmó un efecto antitumoral .

Aquí, como el ratón que produce anticuerpo humano, se conocen un ratón KM (Kirin Pharma Company, Limited/Medarex Inc.) y un ratón Xeno (Amgen Inc.) (por ejemplo, Publicaciones Internacionales Nos. O02/43478 y WO02/092812) . La inmunización de tal ratón con una proteína CAPRIN-1 o un fragmento de la misma pueden proporcionar un anticuerpo policlonal humano completo en la sangre. Alternativamente, un anticuerpo monoclonal de tipo humano puede ser producido extrayendo las células del bazo a partir del ratón inmunizado y enfocando las células del bazo con las células de mieloma.

El antígeno puede ser preparado de conformidad con, por ejemplo, un método usando células animales (Publicación de Patente JP (Kohyo) No. 2007-530068) o un método usando baculovirus (por ejemplo, Publicación Internacional No. W098/46777) . Un antígeno que tiene baja inmunogenicidad puede ser inmunizado como un conjugado con una macromolécula que tiene inmunogenicidad, tal como albúmina.

Además, puede ser usado un anticuerpo transgénico generado por tecnología de recombinación de gen mediante clonación de un gen de anticuerpo a partir de un hibridoma, incorporando el gen en un vector apropiado, e introduciendo el vector en una célula hospedera (por ejemplo, véase Cari, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC ANTICUERPOS MONOCLONALES , Publicado en el Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990) . Específicamente, un ADNc del dominio variable (dominio V) de un anticuerpo es sintetizado usando una transcriptasa inversa a partir del ARNm de un hibridoma. Si un ADN que codifica el dominio V de un anticuerpo objetivo se prepara, el ADN es ligado a un ADN que codifica un dominio constante de anticuerpo deseado (dominio C) , seguido por incorporación en un vector de expresión. Alternativamente, un ADN que codifica el dominio V de un anticuerpo puede ser incorporado en un vector de expresión que contiene el ADN del dominio de anticuerpo C. El ADN es incorporado en el vector de expresión de manera que el ADN es expresado bajo el control de un dominio que controla la expresión, por ejemplo, un potenciador y un promotor. Subsecuentemente, la célula hospedera es transformada con el vector de expresión para expresar el anticuerpo.

El anticuerpo anti-CAPRIN-1 usado en la presente invención es preferiblemente un anticuerpo monoclonal, pero puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo genéticamente alterado (por ejemplo, anticuerpo quimérico o anticuerpo humanizado) .

Ejemplos del anticuerpo monoclonal incluyen anticuerpos monoclonales humanos, animal anticuerpos monoclonales no humanos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de ratón, anticuerpos monoclonales de rata, anticuerpos monoclonales de conejo, y anticuerpos monoclonales de pollo) . El anticuerpo monoclonal puede ser producido cultivando hibridomas preparados fusionando células de mieloma con las células del bazo derivadas a partir de un mamífero no humano (por ejemplo, ratón que produce anticuerpo humano o de ratón) inmunizado con una proteína CAPRIN-1. En ejemplos descritos abajo, se produjeron anticuerpos monoclonales , y los efectos antitumorales de los mismos se confirmaron. Estos anticuerpos monoclonales cada uno comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 40, SEC ID NO: 50, SEC ID NO: 60, SEC ID NO: 70, SEC ID NO: 80, SEC ID NO: 90, SEC ID NO: 100, SEC ID NO: 110, SEC ID NO: 120, SEC ID NO: 130, SEC ID NO: 135, SEC ID NO: 145, SEC ID NO: 160, SEC ID NO: 170, SEC ID NO: 200, SEC ID NO: 210, SEC ID NO: 220, SEC ID NO: 230, SEC ID NO: 240, SEC ID NO: 250, SEC ID NO: 279, SEC ID NO: 294, SEC ID NO: 304, SEC ID NO: 314, SEC ID NO: 324, SEC ID NO: 334, SEC ID NO: 344, SEC ID NO: 359, SEC ID NO: 363, SEC ID NO: 368, SEC ID NO: 372, SEC ID NO: 376, SEC ID NO: 386, SEC ID NO: 396, SEC ID NO: 401, SEC ID NO: 411, o SEC ID NO: 421 y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 44, SEC ID NO: 54, SEC ID NO: 64, SEC ID NO: 74, SEC ID NO: 84, SEC ID NO: 94, SEC ID NO: 104, SEC ID NO: 114, SEC ID NO: 124, SEC ID NO: 139, SEC ID NO: 149, SEC ID NO: 155, SEC ID NO: 164, SEC ID NO: 174, SEC ID NO: 180, SEC ID NO: 185, SEC ID NO: 190, SEC ID NO: 195, SEC ID NO: 204, SEC ID NO: 214, SEC ID NO: 224, SEC ID NO: 234, SEC ID NO: 244, SEC ID NO: 254, SEC ID NO: 283, SEC ID NO: 289, SEC ID NO: 298, SEC ID NO: 308, SEC ID NO: 318, SEC ID NO: 328, SEC ID NO: 338, SEC ID NO: 348, SEC ID NO: 361, SEC ID NO: 365, SEC ID NO: 370, SEC ID NO: 380, SEC ID NO: 390, SEC ID NO: 405, SEC ID NO: 415, o SEC ID NO: 425. El dominio VH comprende la CDRl representada por la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 37, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 57, SEC ID NO: 67, SEC ID NO: 77, SEC ID NO: 87, SEC ID NO: 97, SEC ID NO: 107, SEC ID NO: 117, SEC ID NO: 127, SEC ID NO: 132, SEC ID NO: 142, SEC ID NO: 157, SEC ID NO: 167, SEC ID NO: 197, SEC ID NO: 207, SEC ID NO: 217, SEC ID NO: 227, SEC ID NO: 237, SEC ID NO:247, SEC ID NO: 276, SEC ID NO: 291, SEC ID NO: 301, SEC ID NO: 311, SEC ID NO: 321, SEC ID NO: 331, SEC ID NO: 341, SEC ID NO: 351, SEC ID NO: 373, SEC ID NO: 383, SEC ID NO: 393, SEC ID NO: 398, SEC ID NO: 408, o SEC ID NO: 418, CDR2 representada por la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 38, SEC ID NO: 48, SEC ID NO: 58, SEC ID NO: 68, SEC ID NO: 78, SEC ID NO: 88, SEC ID NO: 98, SEC ID NO: 108, SEC ID NO: 118, SEC ID NO: 128, SEC ID NO: 133, SEC ID NO: 143, SEC ID NO: 158, SEC ID NO: 168, SEC ID NO: 198, SEC ID NO: 208, SEC ID NO: 218, SEC ID NO: 228, SEC ID NO: 238, SEC ID NO: 248, SEC ID NO: 277, SEC ID NO: 292, SEC ID NO: 302, SEC ID NO: 312, SEC ID NO: 322, SEC ID NO: 332, SEC ID NO: 342, SEC ID NO: 352, SEC ID NO: 374, SEC ID NO: 384, SEC ID NO: 394, SEC ID NO: 399, SEC ID NO: 409, o SEC ID NO: 419, y CDR3 representada por la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 39, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 59, SEC ID NO: 69, SEC ID NO: 79, SEC ID NO: 89, SEC ID NO: 99, SEC ID NO: 109, SEC ID NO: 119, SEC ID NO: 129, SEC ID NO: 134, SEC ID NO: 144, SEC ID NO: 159, SEC ID NO: 169, SEC ID NO: 199, SEC ID NO: 209, SEC ID NO: 219, SEC ID NO: 229, SEC ID NO: 239, SEC ID NO: 249, SEC ID NO: 278, SEC ID NO: 293, SEC ID NO: 303, SEC ID NO: 313, SEC ID NO: 323, SEC ID NO: 333, SEC ID NO: 343, SEC ID NO: 353, SEC ID NO: 357, SEC ID NO: 375, SEC ID NO: 385, SEC ID NO: 395, SEC ID NO: 400, SEC ID NO: 410, SEC ID NO: 420. El dominio VL comprende la CDRl representada por la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 51, SEC ID NO : 61, SEC ID NO: 71, SEC ID NO: 81, SEC ID NO: 91, SEC ID NO: 101, SEC ID NO: 111, SEC ID NO: 121, SEC ID NO: 136, SEC ID NO: 146, SEC ID NO: 152, SEC ID NO: 161, SEC ID NO: 171, SEC ID NO: 177, SEC ID NO: 182, SEC ID NO: 187, SEC ID NO: 192, SEC ID NO: 201, SEC ID NO: 211, SEC ID NO: 221, SEC ID NO: 231, SEC ID NO: 241, SEC ID NO: 251, SEC ID NO: 280, SEC ID NO: 286, SEC ID NO: 295, SEC ID NO: 305, SEC ID NO: 315, SEC ID NO: 325, SEC ID NO: 335, SEC ID NO: 345, SEC ID NO: 354, SEC ID NO: 377, SEC ID NO: 387, SEC ID NO: 402, SEC ID NO: 412, O SEC ID NO: 422, CDR2 representada por la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 42, SEC ID NO: 52, SEC ID NO: 62, SEC ID NO: 72, SEC ID NO: 82, SEC ID NO: 92, SEC ID NO: 102, SEC ID NO: 112, SEC ID NO: 122, SEC ID NO: 137, SEC ID NO: 147, SEC ID NO: 153, SEC ID NO: 162, SEC ID NO: 172, SEC ID NO: 178, SEC ID NO: 183, SEC ID NO: 188, SEC ID NO: 193, SEC ID NO: 202, SEC ID NO: 212, SEC ID NO: 222, SEC ID NO: 232, SEC ID NO: 242, SEC ID NO: 252, SEC ID NO: 281, SEC ID NO: 287, SEC ID NO: 296, SEC ID NO: 306, SEC ID NO: 316, SEC ID NO: 326, SEC ID NO: 336, SEC ID NO: 346, SEC ID NO: 355, SEC ID NO: 378, SEC ID NO: 388, SEC ID NO: 403, SEC ID NO: 413, o SEC ID NO: 423, y CDR3 representada por la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 43, SEC ID NO: 53, SEC ID NO: 63, SEC ID NO: 73, SEC ID NO: 83, SEC ID NO: 93, SEC ID NO: 103, SEC ID NO: 113, SEC ID NO: 123, SEC ID NO: 138, SEC ID NO: 148, SEC ID NO: 154, SEC ID NO: 163, SEC ID NO: 173, SEC ID NO: 179, SEC ID NO: 184, SEC ID NO: 189, SEC ID NO: 194, SEC ID NO: 203, SEC ID NO: 213, SEC ID NO: 223, SEC ID NO: 233, SEC ID NO: 243, SEC ID NO: 253, SEC ID NO: 282, SEC ID NO: 288, SEC ID NO: 297, SEC ID NO: 307, SEC ID NO: 317, SEC ID NO : 327, SEC ID NO: 337, SEC ID NO: 347, SEC ID NO: 356, SEC ID NO: 379, SEC ID NO: 389, SEC ID NO: 404, SEC ID NO: 414, o SEC ID NO: 424.

Un anticuerpo quimérico se produce combinando secuencias derivadas de diferentes animales y es, por ejemplo, un anticuerpo que consiste de los dominios variables de cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo de ratón y los dominios constantes de cadena pesada y ligera de un anticuerpo humano. El anticuerpo quimérico puede ser producido por un método conocido, por ejemplo, enlazando un ADN que codifica un dominio de anticuerpo V y un ADN que codifica un dominio de anticuerpo humano C, incorporándolo en un vector de expresión e introduciendo el vector de expresión en un hospedero .

Ejemplos del anticuerpo policlonal incluyen anticuerpos preparados inmunizando un animal que produce un anticuerpo humano (por ejemplo, ratón) con una proteína CAPRIN-1.

El anticuerpo humanizado es un anticuerpo alterado también llamado anticuerpo humano reformado. El anticuerpo humanizado es construido transplantando CDRs de un anticuerpo derivado de un animal inmune en la región determinante de la complementariedad de un anticuerpo humano. También se conoce un método por una tecnología general de recombinación de gen.

Específicamente, una secuencia de ADN designada para enlazar las CDRs de un anticuerpo de ratón y las regiones de armazón (FRs ; que incluyen FR1 hasta FR4) de un anticuerpo humano en el orden: FR1-CDR1-FR2 -CDR2 -FR3-CDR3-FR4, a partir del lado N-terminal es sintetizada por PCR a partir de varios oligonucleótidos producidos para así tener porciones traslapantes en las regiones terminales. El ADN resultante está ligado a un ADN que codifica el dominio constante de un anticuerpo humano y es incorporado en un vector de expresión, y el vector de expresión es introducido en un hospedero para producir un anticuerpo humanizado (véase Solicitud de Patente EP No. EP239400 y Publicación Internacional No. WO96/02576) . Los FRs de un anticuerpo humano ligado mediante CDRs son seleccionados de manera que la región determinante de complementariedad forma un sitio de unión al antígeno satisfactorio. Como se necesite, un aminoácido en la región de armazón en el dominio variable del anticuerpo puede ser sustituido de manera que la región determinante de complementariedad del anticuerpo humano reformado forma un sitio de unión al antígeno apropiado (Sato K. et al., Cáncer Research, 1993, 53: 851-856). La región de armazón puede ser sustituida por una región de armazón derivada de varios anticuerpos humanos (véase Publicación Internacional No. W099/51743) .

El anticuerpo quimérico o anticuerpo humanizado resultante puede ser además sometido a, por ejemplo, sustitución de un aminoácido en el dominio variable (por ejemplo, FR) o dominio constante por otro aminoácido.

En la sustitución de aminoácido, por ejemplo, menos de 15, menos de 10, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos de aminoácidos, preferiblemente uno a cinco aminoácidos, y más preferiblemente uno o dos aminoácidos son sustituidos. El anticuerpo sustituido debe ser funcionalmente equivalente al anticuerpo no sustituido. La sustitución es deseablemente sustitución de aminoácido conservativa, la cual es una sustitución entre aminoácidos que tienen propiedades similares tales como carga, cadena lateral, polaridad y aromaticidad. Los aminoácidos que tienen propiedades similares pueden ser clasificados en, por ejemplo, aminoácidos básicos (arginina, lisina, e histidina) , aminoácidos acídicos (ácido aspártico y ácido glutámico) , aminoácidos polares no cargados (glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, cisteína, y tirosina) , aminoácidos no polares (leucina, isoleucina, alanina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano, y metionina) , aminoácidos de cadena ramificada (leucina, valina, e isoleucina) , o aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptofano e histidina) .

Ejemplos de anticuerpos modificados incluyen anticuerpos unidos a varias moléculas tales como polietilenglicol (PEG) . El anticuerpo modificado usado en la presente invención, el anticuerpo puede ser unido a cualquier material. Estos anticuerpos modificados pueden ser preparados modificando químicamente un anticuerpo preparado. El método para la modificación ha sido ya establecido en este campo.

Aquí, el término "funcionalmente equivalente" se refiere a que el anticuerpo objetivo tiene actividad biológica o bioquímica similar a aquella de un anticuerpo usado en la presente invención, específicamente, por ejemplo, que el anticuerpo objetivo tiene una función de deteriorar el tumor y no causa sustancialmente rechazo a la reacción en la aplicación a un ser humano. Tal actividad es, por ejemplo, actividad inhibidora del crecimiento celular o avidez.

El método bien conocido por aquellos expertos en la técnica para preparar un polipéptido funcionalmente equivalente a un cierto polipéptido es un método para introducir una variación en el polipéptido. Por ejemplo, una persona experta en la técnica puede preparar un anticuerpo funcionalmente equivalente a un anticuerpo usado en la presente invención introduciendo una variación apropiada en el anticuerpo a través de, por ejemplo, mutagénesis de sitio dirigido (Hashimoto-Gotoh, T. et al., (1995), Gene, 152, 271-275; Zoller, M.J., and Smith, M. , (1983), Methods Enzymol . , 100, 468-500; Kramer, . et al., (1984), Nucleic Acids Res., 12, 9441-9456; Kramer, W. and Fritz, H.J., (1987), Methods Enzymol., 154, 350-367; Kunkel, TA., (1985), Proc . Nati. Acad. Sci. USA., 82, 488-492; Kunkel, (1988), Methods Enzymol., 85, 2763-2766).

Un anticuerpo que reconoce el epítopo de una proteína CAPRIN-1 que es reconocida por el anticuerpo anti-CAPRIN-1 puede ser preparado por un método conocido por aquellos expertos en la técnica. El anticuerpo puede ser preparado mediante, por ejemplo, un método para producir un anticuerpo determinando un epítopo de la proteína CAPRIN-1 reconocida por un anticuerpo anti-CAPRIN-1 a través de un método usual (por ejemplo, mapeo de epítopo) y usando un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido del epítopo como el inmunógeno o un método para seleccionar un anticuerpo que tiene el mismo epítopo como aquel de un anticuerpo anti-CAPRIN-1 a partir de anticuerpos que tienen varios epítopos producidos por un método usual.

El anticuerpo usado en la presente invención preferiblemente tiene una constante de afinidad Ka (kasoc/kdisoc) de 107 M"1 o más, 108 M"1 o más, 5xl08 M"1 o más, 109 M"1 o más, 5xl09 M"1 o más, 1010 M"1 o más, 5xl010 "1 o más, 1011 M"1 o más, 5x1o11 M"1 o más, 1012 M"1 o más, o 1013 M"1 o más.

El anticuerpo usado en la presente invención puede conjugarse con un agente antitumoral. El anticuerpo y el agente antitumoral pueden ser unidos entre sí mediante un espaciador que tiene un grupo reactivo, tal como un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo hidroxilo, o un grupo tiol (por ejemplo, un grupo imidil succínico, un grupo formilo, un grupo 2 -piridiltio, un grupo maleimidilo, un grupo alcoxicarbonilo, o un grupo hidroxi) .

Ejemplos del agente antitumoral incluyen los siguientes agentes antitumorales públicamente conocidos a través de los documentos u otros puntos, es decir, paclitaxel, doxorubicina, daunorubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo, tiotepa, busulfano, improsulfano, piposulfano, benzodopa, carboquona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilenetiofosforamida, trimetilolomelamina, bulatacina, bulatacinona, camptotecina, brioestatina, caliestatina, critoficina 1, criptoficina 8, dolaestatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratiestatina, sarcodictiina, espongiestatina, clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, calicamicina, dinemicina, clodonato, esperamicina, aclacinomicina , actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, adriamicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitemicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas , peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozoxina, tubercidina, ubenimex, zinoestatina, zorubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifuridina, enocitabina, floxuridina, andrógenos tales como calusterona, propionato de drostanolona, epitioestanol , mepitiostano, y testolactona, aminoglutetimida, mitotano, trilostano, ácido frolínico, aceglatona, aldofosfamidaglicósido, ácido aminolevulínico, eniluracilo, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, desfofamina, desmecolcina, diaziquona, elfornitina, acetato de eliptinio, epotilona, etoglucido, lentinano, lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentoestatina, fenamet, pirarubicina, losoxantrona, ácido podofilínico, 2 -etilhidrazida, procarbazina, razoxano, rizoxina, esquizofilano, espirogermanio, ácido tenuazónico, triaziquona, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol , mitolactol, pipobromano, gacitosina, docetaxel, clorambucilo, gencitabina, 6-tioguanina, mercaptopurina, cisplatino, oxaliplatino, carboplatino, vinblastina, etopósido, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, novantrona, tenipósido, edatrexato, daunomicina, aminopterina, xeloda, ibandronato, irinodecano, inhibidores de topoisomerasa, difluorometilolnitina (DMFO) , ácido retinoico, capecitabina, y sales farmacéuticamente aceptables (conocidas) o derivados de las mismas (conocidas) .

Sea o no un conjugado de un anticuerpo y un agente antitumoral que muestra actividad antitumoral puede ser evaluado mediante, por ejemplo, si el anticuerpo es un anticuerpo anti-CAPRIN-1 derivado de un ratón, evaluando el efecto antitumoral en células de cáncer humano in vitro a través de la reacción simultánea de un conjugado de un anticuerpo secundario que se une a un anticuerpo de ratón y a un fármaco. Por ejemplo, la evaluación puede ser realizada usando un anticuerpo IgG anti-humano conjugado con saporina (Hum-ZAP (Advanced Targeting Systems, Inc.)).

Además, la combinación de administración del anticuerpo usado en la presente invención y un agente antitumoral puede proporcionar un efecto terapéutico superior. Este método puede ser aplicado a un paciente con cáncer que expresa una proteína CAPRIN-1 ya sea antes o después de la cirugía. En particular, después de la cirugía, prevención superior de recurrencia de cáncer y periodo de supervivencia más largo se pueden obtener en un cáncer que expresa una proteína CAPRIN-1 convencionalmente tratada con un agente antitumoral solo.

Ejemplos del agente antitumoral usados en la combinación de administración incluyen los agentes antitumorales mencionados anteriormente públicamente conocidos a través de los documentos u otros puntos, y sales farmacéuticamente aceptables (conocidas) o derivados de las mismas (conocidas) . Entre estos agentes, en particular, preferiblemente usados son ciclofosfamida , paclitaxel, docetaxel, vinorelbina, etc.

Alternativamente, el anticuerpo usado en la presente invención puede ser etiquetado con un radioisótopo públicamente conocido a través de documentos u otros puntos, tales como 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 175Lu, o 1 6Lu. El isótopo es deseablemente uno efectivo para terapia o diagnóstico del tumor.

El anticuerpo usado en la presente invención es un anticuerpo que tiene reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1 o se une específicamente a una proteína CAPRIN-1 y presenta citotoxicidad o actividad inhibidora del crecimiento del tumor contra el cáncer de vesícula biliar. El anticuerpo debe tener una estructura que puede casi o completamente evitar el rechazo de la reacción en el animal objetivo al cual el anticuerpo es administrado. Ejemplos de tales anticuerpos incluyen, cuando el animal objetivo es un ser humano, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos quiméricos de humano-ratón) , anticuerpos de cadena única, y anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, diacuerpos y triacuerpos) . Tal anticuerpo es un anticuerpo recombinante en el cual los dominios variables de las cadenas pesada y ligera se derivan a partir de un anticuerpo humano, o en el cual los dominios variables de las cadenas pesada y ligera consisten de regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) derivadas a partir de un anticuerpo animal no humano y una región de armazón derivada de un anticuerpo humano, o en la cual los dominios variables de las cadenas pesada y ligera se derivan a partir de un anticuerpo animal no humano y los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera se derivan a partir de un anticuerpo humano. Los anticuerpos anteriores son preferidos .

Estos anticuerpos recombinantes pueden ser producidos como sigue. Un ADN que codifica un anticuerpo monoclonal CAPRIN-1 anti -humano (por ejemplo, anticuerpo monoclonal humano, anticuerpo monoclonal de ratón, anticuerpo monoclonal de rata, anticuerpo monoclonal de conejo, o anticuerpo monoclonal de pollo) es clonado a partir de células que producen anticuerpo tales como hibridomas; un ADN que codifica el dominio variable de cadena ligera y el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo se produce usando el ADN resultante como una plantilla mediante, por ejemplo, RT-PCR; y la secuencia de cada dominio variable de las cadenas ligera y pesada o la secuencias de cada una de CDR1, CDR2 , y CDR3 se determina con base en el sistema de numeración Estadounidense de Kabat (Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991) ) .

Además, los ADNs que codifican los dominios variables o ADNs que codifican las CDRs son producidos por tecnología de recombinación de gen (Sambrook, et al . , Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)) o con un sintetizador de ADN. Aquí, el hibridoma que produce anticuerpo monoclonal humano puede ser producido inmunizando un animal que produce un anticuerpo humano (por ejemplo, ratón) con una proteína CAPRIN-1 humana y después fusionando las células de baso escindidas a partir del animal inmune con células de mieloma. De manera separada, como sea necesario, un ADN que codifica el dominio variable y el dominio constante de una cadena ligera o pesada derivada a partir de un anticuerpo humano se produce por tecnología de recombinación de gen o con un sintetizador de ADN.

En el caso de un anticuerpo humanizado, las secuencias codificantes de CDR en los ADNs que codifican los dominios variables de la cadena ligera o la cadena pesada derivada a partir de un anticuerpo humano son sustituidas con las secuencias codificantes de CDR correspondientes de un anticuerpo derivado a partir de un animal (por ejemplo, ratón, rata, o pollo) distinto de seres humanos para producir ADNs. Los ADNs resultantes están ligados a ADNs que codifican los dominios constantes de la cadena ligera o la cadena pesada derivados a partir de un anticuerpo humano para producir un ADN que codifica un anticuerpo humanizado.

En el caso de un anticuerpo quimérico, los ADNs que codifican los dominios variables de la cadena ligera o la cadena pesada de un anticuerpo derivados a partir de un animal (por ejemplo, ratón, rata, o pollo) distinto de seres humanos están ligados a ADNs que codifican los dominios constantes de la cadena ligera o la cadena pesada derivados a partir de un anticuerpo humano para producir un ADN que codifica a anticuerpo quimérico.

En el caso de un anticuerpo de cadena única, el anticuerpo está compuesto de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera linealmente ligados entre sí mediante un enlazador, y un ADN que codifica el anticuerpo de cadena única puede ser producido uniendo un ADN que codifica el dominio variable de cadena pesada, un ADN que codifica el enlazador, y un ADN que codifica el dominio variable de cadena ligera. Aquí, el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera son ambos derivados a partir de un anticuerpo humano o derivados a partir de un anticuerpo humano en el cual solamente la CDR es sustituida con la CDR de un anticuerpo derivado a partir de un animal (por ejemplo, ratón, rata, pollo) distinto de seres humanos. El enlazador está compuesto de 12 hasta 19 aminoácidos, y ejemplos de los mismos incluyen (G4S) 3 de 15 aminoácidos (G. -B. Kim, et al., Protein Engineering Design and Selection, 2007, 20(9): 425-432).

En el caso de un anticuerpo biespecífico (diacuerpo) , el anticuerpo puede unirse específicamente a dos diferentes epítopos, y un ADN que codifica el anticuerpo biespecífico puede ser producido mediante, por ejemplo, unión de un ADN que codifica el dominio variable de cadena pesada A, un ADN que codifica el dominio variable de cadena ligera B, un ADN que codifica el dominio variable de cadena pesada B, y un ADN que codifica el dominio variable de cadena ligera A en este orden (siempre que el ADN que codifica el dominio variable de cadena ligera B y el ADN que codifica el dominio variable de cadena pesada B están unidos entre sí mediante un ADN que codifica un enlazador como se describe anteriormente) . Aquí, el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera son ambos derivados a partir de un anticuerpo humano o derivados a partir de un anticuerpo humano en el cual solamente la CDR es sustituida con la CDR de un anticuerpo derivado a partir de un animal (por ejemplo, ratón, rata, pollo) distinto de seres humanos.

Un anticuerpo recombinante puede ser producido incorporando el ADN recombinante de este modo producido en uno o más vectores apropiados e introducir el vector o vectores en las células hospederas (por ejemplo, células de mamífero, células de levadura, o células de insecto) para (co) expresar el ADN (P.J. Delves . , ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES, 1997; WILEY, P. Sheferd, and C. Dean., Monoclonal Antibodies, 2000, OXFORD UNIVERSITY PRESS; J.W. Goding., Monoclonal Antibodies: principies and practice, 1993, ACADEMIC PRESS) .

Ejemplos de los anticuerpos de la presente invención producidos por los métodos descritos anteriormente incluyen los siguientes anticuerpos (a) hasta (ao) . (a) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 37, 38, y 39, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 41, 42, y 43, respectivamente, descritas en el documento O2011/096528 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 40 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 44) . (b) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 47, 48, y 49, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 51, 52, y 53, respectivamente, descritas en el documento WO2011/096519 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 50 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 54) . (c) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 57, 58, y 59, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 61, 62, y 63, respectivamente, descritas en el documento WO2011/096517 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 60 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 64) . (d) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 67, 68, y 69, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 71, 72, y 73, respectivamente, descritas en el documento WO2011/096528 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 70 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 74) . (e) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 77, 78, y 79, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 81, 82, y 83, respectivamente, descritas en el documento WO2011/096528 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 80 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 84) . (f) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 87, 88, y 89, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 91, 92, y 93, respectivamente, descritas en el documento WO2011/096528 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 90 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 94) . (g) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 97, 98, y 99, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 101, 102, y 103, respectivamente, descritas en el documento WO2011/096528 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 100 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 104) . (h) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 107, 108, y 109, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3 ) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 111, 112, y 113, respectivamente, descritas en el documento WO2011/096528 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 110 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 114) . (i) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 117, 118, y 119, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 121, 122, y 123, respectivamente, descritas en el documento O2011/096533 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 120 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 124) . (j) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 127, 128, y 129, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 121, 122, y 123, respectivamente, descritas en el documento WO2011/096533 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 130 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 124) . (k) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 132, 133, y 134, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 136, 137, y 138, respectivamente, descritas en el documento O2011/096533 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 135 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 139) . (1) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 142, 143, y 144, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 146, 147, y 148, respectivamente, descritas en el documento WO2011/096534 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 145 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 149) . (m) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 142, 143, y 144, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 152, 153, y 154, respectivamente, descritas en el documento WO2011/096534 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 145 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 155) . (n) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende CDRs de las SEC ID NOs : 157, 158, y 159, y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDRs de las SEC ID NOs : 161, 162, y 163, descritas en el documento WO2011/096534 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 160 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 164) . (o) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 167, 168, y 169, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 171, 172, y 173, respectivamente, descritas en el documento O2011/096534 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 170 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 174) . (p) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 167, 168, y 169, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 177, 178, y 179, respectivamente, descritas en el documento WO2010/016526 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 170 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 180) . (q) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 167, 168, y 169, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 182, 183, y 184, respectivamente, descritas en el documento WO2010/016526 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 170 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 185) . (r) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 167, 168, y 169, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3 ) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 187, 188, y 189, respectivamente, descritas en el documento WO2010/016526 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 170 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 190) . (s) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 167, 168, y 169, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 192, 193, y 194, respectivamente, descritas en el documento WO2010/016526 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 170 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 195) . (t) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 197, 198, y 199, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 201, 202, y 203, respectivamente, descritas en el documento WO2010/016526 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 200 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 204) . (u) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 207, 208, y 209, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3 ) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 211, 212, y 213, respectivamente, descritas en el documento WO2010/016526 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 210 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 214) . (v) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 217, 218, y 219, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3 ) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 221, 222, y 223, respectivamente, descritas en el documento WO2010/016526, (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 220 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 224) . (w) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 227, 228, y 229, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 231, 232, y 233, respectivamente, descritas en el documento WO2010/016526 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 230 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 234) . (x) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3 ) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 237, 238, y 239, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 241, 242, y 243, respectivamente, descritas en el documento WO2010/016526 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 240 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 244) . (y) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 247, 248, y 249, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementa iedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 251, 252, y 253, respectivamente, descritas en el documento WO2010/016526 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 250 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 254) . (z) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 276, 277, y 278, respectivamente y regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 280, 281, y 282, respectivamente, descritas en el documento WO2013/018894 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 279 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 283) . (aa) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 276, 277, y 278, respectivamente y regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 286, 287, y 288, respectivamente, descritas en el documento WO2013/018894 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 279 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 289) . (ab) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 291, 292, y 293, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 295, 296, y 297, respectivamente, descritas en el documento WO2013/018894 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO : 294 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 298) . (ac) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 301, 302, y 303, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 305, 306, y 307, respectivamente, descritas en el documento WO2013/018892 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 304 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 308) . (ad) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 311, 312, y 313, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 315, 316, y 317, respectivamente, descritas en el documento WO2013/018891 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 314 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 318) . (ae) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 321, 322, y 323, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 325, 326, y 327, respectivamente, descritas en el documento WO2013/018889 , (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 324 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 328) . (af) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 331, 332, y 333, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 335, 336, y 337, respectivamente, descritas en el documento WO2013/018883, (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 334 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 338) . (ag) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 341, 342, y 343, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 345, 346, y 347, respectivamente, o fragmentos de los anticuerpos (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 344 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 348) . (ah) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 351, 352, y 353, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 354, 355, y 356, respectivamente, o fragmentos de los anticuerpos (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 359 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 361, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 368 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 370, y un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 372 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 370) . (ai) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 351, 352, y 357, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 354, 355, y 356, respectivamente, o fragmentos de los anticuerpos (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 363 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 365) . (aj) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 373, 374, y 375, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 377, 378, y 379, respectivamente, o fragmentos de los anticuerpos (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 376 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 380) . (ak) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 383, 384, y 385, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 387, 388, y 389, respectivamente, o fragmentos de los anticuerpos (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 386 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 390) . (al) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 393, 394, y 395, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 387, 388, y 389, respectivamente, o fragmentos de los anticuerpos (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 396 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 390) . (am) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 398, 399, y 400, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3 ) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 402, 403, y 404, respectivamente, o fragmentos de los anticuerpos (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 401 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 405) . (an) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) expuestas en las SEC ID NOs : 408, 409, y 410, respec ivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) expuestas en las SEC ID NOs: 412, 413, y 414, respectivamente, o fragmentos de los anticuerpos (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 411 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 415) . (ao) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) expuestas en las SEC ID NOs : 418, 419, y 420, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) expuestas en las SEC ID NOs : 422, 423, y 424, respectivamente, o fragmentos de los anticuerpos (por ejemplo, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 421 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 425) .

Aquí, las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 67, 68, y 69 son CDR1 , CDR2 , y CDR3 , respectivamente del dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo de ratón, de manera similar, series de secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID NOs : 77, 78, y 79, SEC ID NO: 87, 88, y 89, SEC ID NO: 97, 98, y 99, SEC ID NO: 107, 108, y 109, SEC ID NO: 117, 118, y 119, SEC ID NO: 127, 128, y 129, SEC ID NO: 132, 133, y 134, SEC ID NO: 142, 143, y 144, SEC ID NO: 157, 158, y 159, SEC ID NO: 167, 168, y 169, SEC ID NO: 197, 198, y 199, SEC ID NO: 207, 208, y 209, SEC ID NO: 217, 218, y 219, SEC ID NO: 227, 228, y 229, SEC ID NO: 237, 238, y 239, SEC ID NOs : 247, 248, y 249, SEC ID NOs : 276, 277, y 278; 291, 292, y 293; 301, 302, y 303; 311, 312, y 313; 321, 322, y 323; 331, 332, y 333; 341, 342, y 343; 373, 374, y 375; 383, 384, y 385; 393, 394, y 395; 398, 399, y 400; 408, 409, y 410; y 418, 419, y 420 son cada una, una serie de CDR1 , CDR2 , y CDR3 del dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo de ratón. De manera similar, series de secuencias de aminoácidos expuestas en la SEC ID NO: 71, 72, y 73, SEC ID NO: 81, 82, y 83, SEC ID NO: 91, 92, y 93, SEC ID NO: 101, 102, y 103, SEC ID NO: 111, 112, y 113, SEC ID NO: 121, 122, y 123, SEC ID NO: 136, 137, y 138, SEC ID NO: 146, 147, y 148, SEC ID NO: 152, 153, y 154, SEC ID NO: 161, 162, y 163, SEC ID NO: 171, 172, y 173, SEC ID NO: 177, 178, y 179, SEC ID NO: 182, 183, y 184, SEC ID NO: 187, 188, y 189, SEC ID NO: 192, 193, y 194, SEC ID NO: 201, 202, y 203, SEC ID NO: 211, 212, y 213, SEC ID NO: 221, 222, y 223, SEC ID NO: 231, 232, y 233, SEC ID NO: 241, 242, y 243, SEC ID NO: 251, 252, y 253, SEC ID NO: 280, 281, y 282, SEC ID NO: 286, 287, y 288, SEC ID NO: 295, 296, y 297, SEC ID NO: 305, 306, y 307, SEC ID NO: 315, 316, y 317, SEC ID NO: 325, 326, y 327, SEC ID NO: 335, 336, y 337, SEC ID NO: 345, 346, y 347, SEC ID NO: 377, 378, y 379, SEC ID NO: 387, 388, y 389, SEC ID NO: 402, 403, y 404, SEC ID NO: 412, 413, y 414, SEC ID NO: 422, 423, y 424 son cada una, una serie de CDRl, CDR2, y CDR3 del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo de ratón.

De manera similar, las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 37, 38, y 39, SEC ID NOs : 47, 48, y 49, o SEC ID NOs : 57, 58, y 59 son cada una CDR2 , CDR2, y CDR3 , respectivamente del dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo de pollo; y las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 41, 42, y 43, SEC ID NOs : 51, 52, y 53, o SEC ID NOs : 61, 62, y 63 son cada una CDR2 , CDR2, y CDR3 , respectivamente del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo de pollo.

De manera similar, las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 351, 352, y 353 son CDRl, CDR2 , y CDR3 , respectivamente del dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo de conejo; y las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 354, 355, y 356 son CDRl, CDR2, y CDR3 , respectivamente del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo de conejo.

Ejemplos del anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico, anticuerpo de cadena única, y anticuerpo multiespecífico usado en la presente invención incluyen los siguientes anticuerpos (aquellos ejemplificados como anticuerpos (ah) ) . (i) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 351, 352, y 353 y la secuencia de aminoácido de la región de armazón derivada de un anticuerpo humano; y un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 354, 355, y 356 y la secuencia de aminoácido de la región de armazón derivada de un anticuerpo humano. (ii) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 351, 352, y 353 y la secuencia de aminoácido de la región de armazón derivada de un anticuerpo humano; un dominio constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido derivada de un anticuerpo humano; un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 354, 355, y 356 y la secuencia de aminoácido de la región de armazón derivada de un anticuerpo humano; y un dominio constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido derivada de un anticuerpo humano. (iii) Anticuerpos que comprenden cada uno un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 368, un dominio constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido derivada de un anticuerpo humano, un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácido expuestas en la SEC ID NO: 370, y un dominio constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido derivada de un anticuerpo humano.

Las secuencias de los dominios constantes y los dominios variables de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo humano están disponibles a partir de, por ejemplo, NCBI (por ejemplo, GenBank o UniGene, USA) . Por ejemplo, la secuencia del dominio constante de cadena pesada IgGi humano puede ser referida como el Registro No. J00228, la secuencia del dominio constante de cadena pesada IgG2 humana puede ser referida como el Registro No. J00230, la secuencia del dominio constante de cadena pesada IgG3 humana puede ser referida como el Registro No. X03604, la secuencia del dominio constante de cadena pesada IgG4 humana puede ser referida como el Registro No. K01316, la secuencia del dominio constante K de cadena ligera humana puede ser referida como, por ejemplo, el Registro No. V00557, X64135, o X64133, y la secuencia del dominio constante ? de cadena ligera humana puede ser referida como, por ejemplo, Registro No. X64132 o X64134.

Ejemplos de los anticuerpos humanizados ejemplificados como los anticuerpos (ah) incluyen los anticuerpos (ai) , anticuerpos que comprenden el dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 368 y el dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 370, y anticuerpos que comprenden el dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 372 y el dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 370.

Estos anticuerpos preferiblemente tienen citotoxicidad y puede de este modo mostrar efectos antitumorales .

Es obvio que las secuencias específicas de los dominios variables y CDRs de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos mencionados anteriormente están propuestas para mostrar solamente ejemplos y no están limitadas a secuencias específicas. Se produce un hibridoma que produce otro anticuerpo humano o un anticuerpo animal no humano (por ejemplo, anticuerpo de ratón) contra una proteína CAPRIN-1 humana, y el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma se recolecta y se determina si o no el anticuerpo es un anticuerpo objetivo usando la afinidad inmunológica a la proteína CAPRIN-1 humana y la citotoxicidad como índices. Después de la identificación del hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal objetivo, el ADN que codifica los dominios variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo objetivo se produce a parir del hibridoma como se describe anteriormente, y el ADN es secuenciado. El ADN es usado para producir otro anticuerpo.

Además, el anticuerpo usado en la presente invención puede tener sustitución, supresión, o adición de uno a varios (preferiblemente uno o dos) aminoácidos de cada uno de los anticuerpos (i) a (iv) , en particular, en la secuencia de la región de armazón y/o el dominio constante de la secuencia, tan pronto como la especificidad, es decir, se mantiene el reconocimiento específico de la proteína CAPRIN-1. Aquí, el término "varios" se refiere a dos a cinco, preferiblemente dos o tres.

El efecto antitumoral por el anticuerpo anti-CAPRIN-1 usado en la presente invención en células de cáncer de vesícula biliar que expresan la proteína CAPRIN-1 se cree por ser causado por el siguiente mecanismo.

El mecanismo involucra la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo de la célula efectora (ADCC) de células que expresan la proteína CAPRIN-1 y citotoxicidad celular dependiente del complemento (CDC) de células que expresan la proteína CAPRIN-1.

Por consiguiente, la actividad del anticuerpo anti-CAPRIN-1 usada en la presente invención puede ser evaluada midiendo la actividad de ADCC o actividad de CDC en células de cáncer de vesícula biliar que expresan la proteína CAPRIN-1 in vitro, como se muestra específicamente en los siguientes ej emplos .

El anticuerpo anti-CAPRIN- 1 usado en la presente invención se une a la proteína CAPRIN-1 en células de cáncer de vesícula biliar y muestra acción antitumoral por la actividad mencionada anteriormente, y por lo tanto se cree que el anticuerpo es útil para terapia o prevención de cáncer de vesícula biliar. Es decir, la presente invención proporciona una composición farmacéutica, de la cual el ingrediente activo es el anticuerpo anti-CAPRIN-1 , para tratar y/o prevenir cáncer de vesícula biliar. En el caso de administrar el anticuerpo anti-CAPRIN-1 a un ser humano (terapia de anticuerpo) , el anticuerpo es preferiblemente anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado para reducir la inmunogenicidad.

Una afinidad de unión superior del anticuerpo anti-CAPRIN-1 a la proteína CAPRIN-1 en la superficie de células de cáncer de vesícula biliar proporciona actividad antitumoral superior por el anticuerpo anti-CAPRIN- 1. Por consiguiente, un anticuerpo anti-CAPRIN-1 que tiene alta afinidad de unión a una proteína CAPRIN- 1 se espera muestre un efecto antitumoral más fuerte y puede ser aplicado a una composición farmacéutica para tratar y/o prevenir cáncer de vesícula biliar. Como la alta afinidad de unión, como se describe anteriormente, la constante de unión (constante de afinidad) Ka (kaSoc/kdisoc) es preferiblemente 107 M"1 o más, 108 NT1 o más, 5xl08 NT1 o más, 109 M"1 o más, 5xl09 M"1 o más, 1010 NT1 o más, 5xl010 M"1 o más, 1011 NT1 o más, 5x1o11 M"1 o más, 1012 "1 o más, o 1013 M"1 o más. <Unión a células que expresan el antígeno> La capacidad de un anticuerpo para unirse a una proteína CAPRIN-1 puede ser especificada a través del ensayo de unión mediante, por ejemplo, ELISA, manchado Western, inmunofluorescencia, o citometría de flujo, como se describe en los Ejemplos. <Teñido inmunohistoquímico> El anticuerpo que reconoce una proteína CAPRIN-1 puede ser probado por reactividad con la proteína CAPRIN-1 por un método inmunohistoquímico bien conocido por aquellos expertos en la técnica usando secciones congeladas fijas con acetona o paraformaldehído o secciones de tejido sumergidas en parafina fijas con paraformaldehído a partir de tejido derivado de un paciente durante la cirugía o tejido derivado de un animal que lleva heterotransplante inoculado con una línea de células que expresa una proteína CAPRIN-1 naturalmente o después de la transfeccion.

Un anticuerpo reactivo con una proteína CAPRIN-1 puede ser teñido por varios métodos por teñido inmunohistoquímico. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser visualizado haciendo reaccionar un anticuerpo anti-ratón o anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante. <Composición farmacéutica> El objetivo de la composición farmacéutica para tratar y/o prevenir cáncer de vesícula biliar de la presente invención puede ser cualquiera de cáncer de vesícula biliar (células) que expresa un gen CAPRIN-1.

Los términos "tumor" y "cáncer" usados a través de la presente descripción se refieren a un neoplasma maligno y se usan de manera intercambiable.

El cáncer de vesícula biliar como un objetivo en la presente invención expresa un gen que codifica una secuencia de aminoácido expuesta en cualquiera de los números de secuencia incluso a partir de las SEC ID NOs : 2 hasta 30, una secuencia de aminoácido que tiene una identidad de secuencia de 80% o más, preferiblemente 90% o más, más preferiblemente 95% o más, y muy preferiblemente 97% o más con la secuencia de aminoácido, o una secuencia parcial que comprende al menos siete, preferiblemente al menos ocho residuos de aminoácido consecutivos de cualquiera de estas secuencias de aminoácido. Ejemplos del cáncer de vesícula biliar incluyen, pero no se limitan a, carcinoma que se origina en la vesícula biliar (cáncer primario) y cáncer metastásico.

El animal objetivo son mamíferos tales como un primate, un animal de mascota, un animal doméstico, y un animal para uso competitivo, y es preferiblemente un ser humano, un perro, o un gato.

La composición farmacéutica del anticuerpo usado en la presente invención puede ser fácilmente formulada por un método conocido por aquellos expertos en la técnica. La composición farmacéutica puede ser usada, por ejemplo, parenteralmente en una forma de una solución aséptica con agua u otro líquido farmacéuticamente aceptable o una inyección de una preparación de suspensión. Por ejemplo, se propone formular combinando apropiadamente la composición farmacéutica con un portador o medio farmacológicamente aceptable, específicamente, agua esterilizada, salina fisiológica, aceite vegetal, un emulsificante , un agente de suspensión, un tensioactivo, un estabilizador, un agente saborizante, un excipiente, un vehículo, un antiséptico, o un aglutinante, y mezclándolos en una forma de dosificación unitaria deseada en la aplicación de la manufactura de fármaco generalmente reconocido. La cantidad del ingrediente activo en tal fármaco es controlada para así proporcionar una dosis apropiada dentro de un intervalo indicado.

La composición aséptica para inyección puede ser prescrita de conformidad con la aplicación de preparación farmacéutica usual usando un vehículo tal como agua destilada para inyección.

Ejemplos de soluciones acuosas para inyección incluyen salina fisiológica y soluciones isotónicas que contienen glucosa u otros adyuvantes, tales como D-sorbitol, D-manosa, D-manitol, o cloruro de sodio. La solución acuosa puede ser usada en conjunto con un solubilizador apropiado, por ejemplo, alcohol, específicamente, etanol o polialcohol; propilenglicol , polietilenglicol , o un detergente no iónico; o polisorbato 80 (TM) o HCO-60.

Ejemplos de líquidos aceitosos incluyen aceite de sésamo y aceite de soya, y el líquido aceitoso puede ser usado en conjunto con benzoato de bencilo o alcohol bencílico como un solubilizador. Además, un amortiguador tal como un amortiguador de fosfato o un amortiguador de acetato de sodio, un agente relajante tal como clorhidrato de procaína, un estabilizador tal como alcohol bencílico o fenol, o un antioxidante, pueden ser combinados. La inyección preparada es usualmente envasada en una ampolleta apropiada.

La administración es oral o parenteral y es preferiblemente parenteral, y ejemplos de la misma incluyen formas de dosificación por inyección, transnasal, pulmonar y transdermal. En la forma de dosificación por inyección, por ejemplo, la administración local o sistémica puede ser realizada por inyección intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea.

El método de administración puede ser apropiadamente seleccionado con base en la edad, peso, sexo, síntomas, etc. de un paciente. La dosis de la composición farmacéutica que contiene un anticuerpo o un polinucleótido que codifica el anticuerpo puede ser seleccionada, por ejemplo, dentro de un intervalo de 0.0001 hasta 1000 mg/kg de peso corporal por una vez o, por ejemplo, dentro de un intervalo de 0.001 hasta 100000 mg/cuerpo por paciente. Estos valores numéricos no son necesariamente restrictivos. El método de administración y dosis varía dependiendo del peso, edad, sexo, síntomas, etc., de un paciente, pero puede ser apropiadamente seleccionado por aquellos expertos en la técnica.

El cáncer de vesícula biliar puede ser tratado y/o prevenido administrando la composición farmacéutica de la presente invención a un sujeto.

La presente invención además abarca un método para tratar y/o prevenir cáncer de vesícula biliar que comprende administrar la composición farmacéutica de la presente invención junto con un agente antitumoral como se ejemplifica anteriormente o una composición farmacéutica que contiene tal agente antitumoral a un sujeto. El anticuerpo o un fragmento del mismo de la presente invención y el agente antitumoral pueden ser simultáneamente o separadamente administrados a un sujeto. En el caso de administración separada, ya sea la composición farmacéutica puede ser administrada antes o después, y el intervalo de administración, dosis, rutas de administración, y la frecuencia de administración de la misma pueden ser apropiadamente seleccionada por un especialista médico. Ejemplos de otras formas de dosificación medicinales para ser simultáneamente administradas también incluyen composiciones farmacéuticas preparadas mezclando el anticuerpo o un fragmento del mismo de la presente invención y un agente antitumoral en un portador farmacológicamente aceptable (o medio) y formular la mezcla. La descripción para la prescripción, formulación, ruta de administración, dosis, cáncer, etc., que se refiere a la composición farmacéutica que contiene el anticuerpo de la presente invención y la forma de dosificación puede ser aplicada a cualquiera de las composiciones farmacéuticas que contienen agentes antitumorales y las formas de dosificación. Por lo tanto, la presente invención también proporciona un agente farmacéutico de combinación (también referido como "kit farmacéutico") para tratamiento y/o prevención de cáncer de vesícula biliar, que comprende la composición farmacéutica de la presente invención y una composición farmacéutica que contiene un agente antitumoral como se ejemplifica anteriormente.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica para tratar y/o prevenir cáncer de vesícula biliar, que comprende el anticuerpo o un fragmento del mismo de la presente invención y un agente antitumoral junto con un portador farmacológicamente aceptable.

Alternativamente, el agente antitumoral puede ser conjugado con el anticuerpo o un fragmento del mismo de la presente invención. El conjugado puede ser mezclado con un portador farmacológicamente aceptable (o medio) y formulado en una composición farmacéutica como anteriormente.

Ejemplos La presente invención será ahora más específicamente descrita con base en los ejemplos, pero el alcance de la presente invención no está limitado por estos ej emplos .

[Ejemplo 1] Identificación de proteína del antígeno de cáncer de vesícula biliar por el método SEREX (1) Preparación de la biblioteca de ADNc El ARN total se extrajo a partir del tejido testicular de un perro sano por un método de ácido guanidio-fenol-cloroformo, y ARN poli (A) se purificó usando el kit de purificación de ARNm 01igotex-dT30 (manufacturado por Takara Shuzo Co., Ltd.) de conformidad con el protocolo adjunto al kit.

Una biblioteca de fago de ADNc derivada a partir de testículos de perro se sintetizó usando el ARNm obtenido (5 µg) . La biblioteca de fago de ADNc se preparó usando Kit de Síntesis de ADNc, Kit de Síntesis de ZAP-ADNc, y Kit de Clonación ZA-ADNc Gigapack III Gold (manufacturado por Stratagene Corporation) de conformidad con los protocolos adjuntos a los kits. El tamaño de la biblioteca de fago de ADNc producido fue 7.73xl05 pfu/mL. (2) Selección de la biblioteca de ADNc con suero La biblioteca de fago de ADNc derivada a partir de testículos de perro se usó para inmunoselección. Específicamente, células hospederas de (MRF' XLl-Blue) se infectaron con la biblioteca de manera que los clones 2210 se formaron en una placa de garosa NZY de F 90X15 mm. Entonces, las células hospederas de E. coli se cultivaron a 42 °C por 3 hasta 4 horas para producir las placas. La placa se cubrió con una membrana de nitrocelulosa (Hybond C Extra: manufacturada por GE Healthcare Bio-Sciences) , impregnada con isopropil^-D-tiogalactosida (IPTG) , a 37°C por 4 horas para introducir y expresar proteínas, y las proteínas se transfirieron a la membrana. Subsecuentemente, la membrana se recolectó y sumergió en TBS (10 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, pH 7.5) que contiene 0.5% de leche desnatada y se sacudió durante la noche a 4°C para prevenir la reacción no específica. Este filtro se hizo reaccionar con suero de perro enfermo diluido 500 veces a temperatura ambiente por 2 hasta 3 horas .

Se usó suero de perro enfermo recolectado a partir de perros con cáncer de mama. El suero se almacenó a -80°C y se trató previamente inmediatamente antes del uso. El pretratamiento del suero se realizó como sigue: células hospederas de E. coli (MRF' XLl-Blure) se infectaron con fago Express ? ZAP en el cual no se insertaron genes extraños y se cultivaron en medio de placa NZY a 37°C durante la noche. Subsecuentemente, un amortiguador de 0.2 M de NaHC03, pH 8.3, que contiene 0.5 M de NaCl se agregó a la placa, seguido por dejarla en reposo a 4°C por 15 horas. Entonces, el sobrenadante se recolectó como un extracto de E. coli/fago. Subsecuentemente, el extracto de E. coli/fago recolectado se dejó pasar a través de la columna NHS (manufacturado por GE Healthcare Bio-Sciences) para inmovilizar las proteínas derivadas a partir de E. coli y el fago. El suero de los perros enfermos se dejó pasar a través de la columna de proteína inmovilizada para remover, a partir del suero, anticuerpos que absorben a E. coli o al fago. La fracción del suero pasada a través de la columna fue diluida 500 veces con TBS que contiene 0.5% de leche desnatada para proporcionar un material de inmunoselección .

La membrana manchada con el suero de este modo tratado y la proteína de fusión se lavó con TBS-T (0.05% de Tween 20/TBS) cuatro veces y entonces se sometió a reacción con un anticuerpo secundario, IgG anti-perro de cabra diluido 5000 veces con TBS que contiene 0.5% de leche desnatada (conjugado de HRP IgG-h+I anti-perro de cabra: manufacturado por BETIL Laboratories, Inc.), a temperatura ambiente por 1 hora. Se realizó detección por reacción enzimática de color usando una solución de reacción NBT/BCIP (manufacturado por Roche Diagnostics K.K.), y las colonias que corresponden a las posiciones positivas de reacción del color en la placa de garosa NZY de F 90x15 mm se recolectaron y cada una fueron disueltas en 500 iL de un amortiguador de SM (100 mM de NaCl, 10 mM de MgClS04, 50 mM de Tris-HCl, 0.01% de gelatina pH 7.5) . Se realizaron segunda, tercera o más selecciones por el mismo procedimiento como anteriormente hasta que se unificó la colonia positiva de reacción de color. Como un resultado, se aislaron cinco clones positivos por selección de 30940 clones de fago que reaccionan con IgG en suero. (3) Búsqueda de homología del gen de antígeno aislado Con el fin de usar los cinco clones positivos aislados por el método descrito anteriormente para análisis de secuencia de nucleótido, el vector de fago se convirtió a un vector de plásmido. Específicamente, 200 µ?_ de una solución hospedera de E. coli (MRF' XLl-Blue) ajustada a una absorbancia OD600 de 1.0 se mezcló con 250 L de solución de fago purificada y 1 pL de fago auxiliador ExAssist (manufacturado por Stratagene Corporation) . Después de la reacción a 37°C por 15 minutos, 3 mL de un medio de LB se agregó a la mezcla, seguido por cultivación a 37°C por 2.5 a 3 horas. Inmediatamente después del cultivo, el medio de cultivo se calentó en un baño de agua de 70°C por 20 minutos, seguido por centrifugación a 4°C, lOOOxg, por 15 minutos. El sobrenadante se recolectó como una solución de fagémido.

Subsecuentemente, 200 µ? de una solución de E. col i de hospedero fagémido (SOLR) ajustada a una absorbancia OD600 de 1.0 se mezcló con 10 \iL de una solución de fago purificada. Después de la reacción a 37°C por 15 minutos, 50 \ih de la mezcla de reacción se sembró en un medio de agar de LB que contiene ampicilina (concentración final: 50 µg/mL) , seguido por cultivación a 37°C durante la noche. Colonias individuales de SOLR transformado se recolectaron y se cultivaron en un medio de LB que contiene ampicilina (concentración final: 50 g/mL) a 37°C, y un ADN de plásmido que tiene una inserción propuesta se purificó con Kit Miniprep de plásmido QIAGEN (manufacturado por Qiagen) .

El plásmido purificado se sometió a análisis de la secuencia de inserto de longitud completa por un método ambulante de cebador usando el cebador T3 expuesto en la SEC ID NO: 31 y el cebador T7 expuesto en la SEC ID NO : 32. Como un resultado de este análisis de secuencia, se obtuvieron las secuencias del gen expuestas en las SEC ID NOs : 5, 7, 9, 11, y 13. La búsqueda de homología de las secuencias de nucleótido y las secuencias de aminoácido (SEC ID NOs : 6, 8, 10, 12, y 14) de los genes para genes conocidos usando un programa de búsqueda de homología, búsqueda BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) revelaron que todos los cinco genes resultantes cada uno codifica una proteína CAPRIN-1. La identidad de secuencia entre los cinco genes fue 100% en la secuencia de nucleótido, en la región para ser traducida en una proteína, y 99% en la secuencia de aminoácido. La identidad de secuencia de los genes con un gen que codifica un factor homólogo humano fue 94% en la secuencia de nucleótido, en la región para ser traducida en una proteína, y 98% en la secuencia de aminoácido. Las secuencias de nucleótido del factor homólogo humano son expuestas en las SEC ID NOs : 1 y 3, y las secuencias de aminoácido son expuestas en las SEC ID NOs : 2 y 4. La identidad de secuencia de los genes de perro obtenidos con un gen que codifica un factor homólogo bovino fue 94% en la secuencia de nucleótido, en la región para ser traducida en una proteína, y 97% en la secuencia de aminoácido. La secuencia de nucleótido del factor homólogo de bovino es expuesta en la SEC ID NO: 15, y la secuencia de aminoácido es expuesta en la SEC ID NO: 16. La identidad de secuencia entre el gen que codifica el factor homólogo humano y del gen que codifica el factor homólogo bovino fue 94% en la secuencia de nucleótido, en la región para ser traducida en una proteína, y 93% a 97% en la secuencia de aminoácido. La identidad de secuencia de los genes de perro obtenidos con un gen que codifica un factor homólogo de caballo fue 93% en la secuencia de nucleótido, en la región para ser traducida en una proteína, y 97% en la secuencia de aminoácido. La secuencia de nucleótido del factor homólogo de caballo es expuesta en la SEC ID NO: 17, y la secuencia de aminoácido es expuesta en la SEC ID NO: 18. La identidad de secuencia entre el gen que codifica el factor homólogo humano y del gen que codifica el factor homólogo de caballo fue 93% en la secuencia de nucleótido, en la región para ser traducida en una proteína, y 96% en la secueñcia de aminoácido. La identidad de secuencia de los genes de perro obtenidos con un gen que codifica un factor homólogo de ratón fue 87% hasta 89% en la secuencia de nucleótido, en la región para ser traducida en una proteína, y 95% hasta 97% en la secuencia de aminoácido. Las secuencias de nucleótido del factor homólogo de ratón son expuestas en las SEC ID NOs : 19, 21, 23, 25, y 27, y las secuencias de aminoácido son expuestas en las SEC ID NOs : 20, 22, 24, 26, y 28. La identidad de secuencia entre el gen que codifica el factor homólogo humano y del gen que codifica el factor homólogo de ratón fue 89% hasta 91% en la secuencia de nucleótido, en la región para ser traducida en una proteína, y 95% hasta 96% en la secuencia de aminoácido. La identidad de secuencia de los genes de perro obtenidos con un gen que codifica un factor homólogo de pollo fue 82% en la secuencia de nucleótido, en la región para ser traducida en una proteína, y 87% en la secuencia de aminoácido. La secuencia de nucleótido del factor homólogo de pollo es expuesta en la SEC ID NO : 29, y la secuencia de aminoácido es expuesta en la SEC ID NO: 30. La identidad de secuencia entre el gen que codifica el factor homólogo humano y del gen que codifica el factor homólogo de pollo fue 81% hasta 82% en la secuencia de nucleótido, en la región para ser traducida en una proteína, y 86% en la secuencia de aminoácido. (4) Análisis de expresión del gen CAPRIN-1 con células de cáncer de vesícula biliar humano Los genes obtenidos por el método descrito anteriormente se investigaron para determinar la expresión en cuatro líneas de células de cáncer de vesícula biliar humano TGBC14TKB (obtenido a partir de The Institute of Physical y Chemical Research) por RT-PCR. Se realizó transcripción inversa como sigue: El ARN total se extrajo des 50 hasta 100 mg de cada tejido y 5 hasta lOxlO6 células de cada línea celular con reactivo TRIZOL (manufacturado por Invitrogen) de conformidad con el protocolo adjunto al reactivo. Usando este ARN total, se sintetizó ADNc con el Sistema de Síntesis de Primera Hebra Superscript por RT-PCR (manufacturado por Invitrogen) de conformidad con el protocolo adjunto al sistema. La PCR se realizó usando cebadores (expuestos en las SEC ID NOs : 33 y 34) específicos al gen resultante como sigue: El volumen total de una mezcla que contiene 0.25 ih de la muestra preparada por la transcripción inversa, 2 µ? de cada uno de los cebadores, 0.2 mM de cada dNTP, y 0.65 U de polimerasa ExTaq (manufacturado por Takara Shuzo Co. , Ltd.) se ajustó a 25 µL con el amortiguador adjunto al reactivo, y un proceso que consiste de reacciones a 94°C por 30 segundos, a 60°C por 30 segundos, y a 72°C por 30 segundos se repitió 30 ciclos con Ciclizador Térmico (manufacturado por BIO-RAD Laboratories, Inc.). Los cebadores específicos del gen amplifican la región de 698 hasta 1124 nucleótidos de la secuencia de nucleótido (gen CAPRIN-1 humano) expuesta en la SEC ID NO: 1. Por comparación, cebadores específicos de GAPDH (expuestos en las SEC ID NOs : 35 y 36) fueron usados simultáneamente. Como un resultado, se observó la expresión en la línea de células TGBC14TKB.

[Ejemplo 2] Producción de anticuerpo policlonal CAPRIN-l anti-humano.

Una mezcla de 1 mg de una proteína recombinante de CAPRIN-1 humana producida de conformidad con ejemplo 3 del documento WO2010/016526 y un volumen equivalente de una solución de adyuvante Freund incompleto (IFA, por sus siglas en inglés) se inyectó subcutáneamente a un conejo cuatro veces con intervalos de 2 semanas . La sangre entonces se recolectó para obtener antisuero que contiene un anticuerpo policlonal. El antisuero fue además purificado usando un portador de proteína G (manufacturado por GE Healthcare Bioscience) para obtener un anticuerpo policlonal anti-CAPRIN-1. El suero de un conejo no administrado con el antígeno fue purificado de manera similar con un portador de proteína G y se usó como un anticuerpo de control.

[Ejemplo 3] Análisis de expresión de la proteína CAPRIN-1 en cáncer de vesícula biliar humano (1) Análisis de expresión de la proteína CAPRIN-1 en células de cáncer de vesícula biliar humano Una línea de célula de cáncer de vesícula biliar humano TGBC14TKB, la cual se confirmó por expresar el gen CAPRIN-1, se investigó por sí o no una proteína CAPRIN-1 es expresada en la superficie celular. lxlO6 células de cada TGBC14TKB de la cual se confirmó la expresión del gen anteriormente, se centrifugaron con un tubo de microcentrifugación de 1.5 mL. A las células se agregó 2 \ig (5 µ??) del anticuerpo policlonal anti-CAPRIN-1 preparado en el Ejemplo 2. La mezcla se suspendió en 95 ih de PBS que contiene 0.1% de suero bovino fetal, y la suspensión se dejó reposar en hielo por 1 hora. Después del lavado con PBS, las células se suspendieron en 5 µ?? de un anticuerpo IgG anticonejo de cabra etiquetado con FITC (manufacturado por Santa Cruz Biotechnology, Inc.) y 95 µ?.. de PBS que contiene 0.1% de suero bovino fetal (FBS) , y la suspensión se dejó reposar en hielo por 1 hora. Después del lavado con PBS, la intensidad de fluorescencia se midió con FACS Calibur disponible de Becton, Dickinson and Company. De manera separada, como un control, se realizó el mismo procedimiento como anteriormente usando el anticuerpo de control preparado en el Ejemplo 2, en lugar del anticuerpo policlonal anti-CAPRIN-1. Como un resultado, la intensidad de fluorescencia en TGBC14TKB a la cual se agregó el anticuerpo policlonal CAPRIN-1 anti-humano fue 20% o más superior que aquellas en el control en cada caso. Esto demuestra que la proteína CAPRIN-1 fue expresada en la superficie celular de la línea de células de cáncer de vesícula biliar humano. El índice de incremento en la intensidad de fluorescencia es representado por el índice de incremento en la intensidad de fluorescencia media (valor MFI) en cada célula y se calcula por la siguiente fórmula de cálculo: índice de incremento en la intensidad de fluorescencia media (índice de incremento en la intensidad de fluorescencia) (%) = ( (valor MFI de células que reaccionan con anticuerpo CAPRIN-1 anti-humano) - (valor MFI de control) )/ (valor MFI de control) X 100. (2) Análisis de expresión de la proteína CAPRIN-1 en tejido de cáncer de vesícula biliar humano Veintiséis muestras de tejido de cáncer de vesícula biliar de un arreglo de tejido de cáncer de vesícula biliar humano sumergido en parafina (manufacturado por BIOMAX, Inc.) se sometieron a teñido inmunohistoquímico . El arreglo de tejido de cáncer de vesícula biliar humano se trató a 60°C por 3 horas y entonces se colocó en una botella de teñido llena con xileno. El xileno en la botella se reemplazó por uno fresco tres veces cada 5 minutos. Subsecuentemente, el mismo procedimiento se realizó usando etanol y PBS-T en lugar de xileno. El arreglo de tejido de cáncer de vesícula biliar humano se colocó en una botella de teñido llena con amortiguador de ácido cítrico 10 mM (pH 6.0) que contiene 0.05% de Tween 20 y se trató a 125°C por 5 minutos, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 40 minutos o más. El exceso de agua alrededor de la sección se enjuagó con un Kimwipe, la sección se encerró una pluma Dako, y una cantidad apropiada de Bloque de Peroxidasa (manufacturado por DAKO) se agregó por goteo a esta. Después de dejarse reposar a temperatura ambiente por 5 minutos, la sección se colocó en una botella de teñido llena con PBS-T, y el PBS-T se reemplazó por uno fresco tres veces cada 5 minutos. Como una solución de bloqueo, una solución de PBS-T que contiene 10% de FBS se colocó en la sección, seguido se dejó reposar en una cámara de humedad a temperatura ambiente por 1 hora. Una solución en la cual la concentración del anticuerpo policlonal anti-CAPRIN-1 preparado en el Ejemplo 2 se ajustó hasta 10 µg/mL con una solución de PBS-T que contiene 5% de FBS se colocó además en la sección, y la sección se dejó reposar en una cámara húmeda a 4°C durante la noche y entonces se lavó en PBS-T por 10 minutos tres veces. Una cantidad apropiada de Conjugado de Polímero Etiquetado con Peroxidasa (manufacturado por DAKO) se colocó por goteo en la sección, seguido se dejó reposar en una cámara de humedad a temperatura ambiente por 30 minutos. Después del lavado en PBS-T por 10 minutos tres veces, la solución que desarrolla color DAB (manufacturado por DAKO) se colocó en la sección, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por aproximadamente 10 minutos. La solución que desarrolla color se removió, y la sección se lavó en PBS-T por 10 minutos tres veces, entonces se enjuagó con agua destilada, se colocó en soluciones de etanol al 70%, 80%, 90%, 95%, y 100% en este orden por 1 minuto en cada solución de etanol, y se dejó reposar en xileno durante la noche. La laminilla de vidrio se tomó y se encerró en Medio de Montaje de Glicergel (manufacturado por DAKO) para observación. Los resultados demuestran que la proteína CAPRIN-1 fue altamente expresada en 19 muestras (73%) de 26 muestras de tejido de cáncer de vesícula biliar en total.

[Ejemplo 4] Efecto antitumoral (actividad de ADCC) de anticuerpo policlonal anti-CAPRIN-1 en células de cáncer de vesícula biliar Se investigó sí o no un anticuerpo anti-CAPRIN-1 puede deteriorar las células de cáncer de vesícula biliar que expresan una proteína CAPRIN-1. Se realizó la evaluación usando el anticuerpo policlonal CAPRIN-1 anti-humano preparado en el Ejemplo 2. lxlO6 células de la línea de células de cáncer de vesícula biliar humano TGBC14TKB, la cual se confirmó por expresar la proteína CAPRIN-1, se recolectaron en un tubo de centrifugación de 50 mL, y 100 µ?? de 51cromo se agregaron a esta, seguido por incubación a 37°C por 2 horas. Subsecuentemente, las células se lavaron con medio RPMI 1640 que contiene 10% de suero de ternera fetal tres veces y entonces se agregaron a una placa en fondo en V de 96 cavidades a lxlO3 células por cavidad. A cada cavidad se agregó 1 µg del anticuerpo policlonal CAPRIN-1 anti-humano y además se agregaron 2xl05 linfocitos aislados a partir de sangre periférica humana, seguido por cultivación a 37°C en 5% de C02 por 4 horas. Después del cultivo, la cantidad de 51cromo (Cr) secretado a partir de las células de tumor deterioradas en el sobrenadante de cultivo se midió para calcular la actividad de ADCC en las células de cáncer de vesícula biliar por el anticuerpo policlonal CAPRIN-1 anti-humano. Los resultados demuestran que en el caso del anticuerpo policlonal CAPRIN-1 anti-humano, la actividad de ADCC en TGBC14TKB fue 14% o más, mientras la actividad de ADCC en TGBC14TKB fue menos de 5% en el caso de usar el anticuerpo de control preparado a partir de la sangre periférica de un conejo no inmunizado con el antígeno y también fue menos de 5% en el caso de no usar cualquiera de los anticuerpos. Por consiguiente, se reveló que la actividad de ADCC en el uso de un anticuerpo anti-CAPRIN-1 puede deteriorar las células de cáncer de vesícula biliar que expresan la proteína CAPRIN-1. La citotoxicidad es el resultado, como se describe anteriormente, cuando el anticuerpo anti-CAPRIN- 1 usado en la presente invención, linfocitos, y lxlO3 células tumorales con 51cromo fueron mezcladas y cultivadas por 4 horas, y se mostró como la citotoxicidad en las células tumorales calculada por la siguiente fórmula de cálculo * midiendo la cantidad de 51cromo liberado en el medio después del cultivo.

Fórmula *: citotoxicidad (%) = (cantidad de 51cromo liberado a partir de células tumorales en la presencia del anticuerpo anti-CAPRIN- 1 y linfocitos) / (cantidad de 51cromo liberado a partir de células tumorales en la presencia de ácido clorhídrico 1N) X 100.

[Ejemplo 5] Producción de anticuerpos monoclonales de pollo y ratón anti -CAPRIN- 1 La proteína recombinante CAPRIN-1 humana (100 µg) producida en el Ejemplo 2 se mezcló con la misma cantidad de adyuvante MPL/TD (manufacturado por Sigma-Aldrich Co., LLC), y la mezcla se usó como una solución de antígeno para un ratón. La solución del antígeno se administró intraperitonealmente a ratones Balb/c de 6 semanas de edad (manufacturado por Japan SLC, Inc.) y se administró además tres veces o 24 veces con intervalos de una semana para completar la inmunización. El bazo se extrajo al tercer día de la última inmunización y se trituró entre dos laminillas de vidrio esterilizadas y se lavó con PBS (-) (manufacturado por Nissui Pharmaceutical Co. , Ltd.) , seguido por centrif gación a 1500 rpm por 10 minutos para remover el sobrenadante. Este procedimiento se repitió tres veces para obtener células del bazo. Las células del bazo y células de mieloma de ratón SP2/0 resultantes (adquiridas de ATCC) se mezclaron a una relación de 10:1, y una solución de PEG preparada mezclando 200 µL de medio RPMI1640 que contiene 10% de FBS y 800 ]iL de PEG 1500 (manufacturado por Boehringer Ingelheim GmbH) y calentada a 37°C se agregó a la mezcla resultante, seguido se dejó reposar por 5 minutos para fusión celular. Se realizó centrifugación a 1700 rpm por 5 minutos, y el sobrenadante se removió. Las células se suspendieron en una mezcla de 150 mL de medio RPMI1640 (medio de selección HAT) que contiene 15% de FBS y 2% de equivalentes de una solución HAT manufacturada por Gibco, y la suspensión se sembró en 15 placas, las cuales fueron placas de 96 cavidades (manufacturadas por Nunc) , a 100 yL por cavidad. La cultivación a 37°C en 5% de C02 por 7 días proporcionó los hibridomas de las células del bazo y las células de mieloma.

Se seleccionaron hibridomas usando, como un índice, la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas a una proteína CAPRIN-1. Una solución de 1 yg/mL de la proteína CAPRIN-1 preparada en el Ejemplo 2 se agregó a una placa de 96 cavidades a 100 ih por cavidad, seguido se dejó reposar a 4°C por 18 horas. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 400 ih de una solución de albúmina de suero bovino (BSA) al 0.5% (manufacturada por Sigma-Aldrich Co. , LLC.) se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 3 horas. La solución se removió, y cada cavidad se lavó con 400 ]iL de PBS-T tres veces, y 100 pL del sobrenadante de cultivo de hibridoma preparado anteriormente se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 2 horas . Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 100 L de un anticuerpo IgG anti-ratón etiquetado con HRP (H+L) (manufacturado por life technologies) diluido por 5000 veces con PBS se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 1 hora. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 100 ih de una solución de sustrato TMB (manufacturado por Thermo Fisher Scientific K.K.) se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar por 15 a 30 minutos para la reacción de color. Después de la coloración, 100 µ?? de ácido sulfúrico 1N se agregaron a cada cavidad para detener la reacción. La absorbancia se midió a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como un resultado, se seleccionaron varios hibridomas que producen anticuerpos que muestran valores de alta absorbancia.

Los hibridomas seleccionados se sembraron en una placa de 96 cavidades a 0.5 células por cavidad y se cultivaron. Después de una semana, los hibridomas que forman colonias únicas se observaron en las cavidades. Las células en las cavidades además se cultivaron, y se seleccionaron hibridomas usando, como un índice, la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas clonados a una proteína CAPRIN-1. Una solución de 1 µ9/t??. de la proteína CAPRIN-1 preparada en el Ejemplo 2 se agregó a una placa de 96 cavidades a 100 ]ih por cavidad, seguido se dejó reposar a 4°C por 18 horas. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 400 µ??. de una solución de BSA al 0.5% se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 3 horas. La solución se removió, y cada cavidad se lavó con 400 µL de PBS-T tres veces, y 100 uL del sobrenadante de cultivo de hibridoma preparado anteriormente se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 2 horas. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 100 ]il¡ de un anticuerpo IgG anti-ratón etiquetado con HRP (H+L) (manufacturado por life technologies) diluido por 5000 veces con PBS se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 1 hora. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 100 uL de una solución de sustrato TMB (manufacturado por Thermo Fisher Scientific K.K.) se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar por 15 a 30 minutos para la reacción de color. Después de la coloración, 100 uL de ácido sulfúrico 1N se agregaron a cada cavidad para detener la reacción. La absorbancia se midió a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como un resultado, se obtuvieron 150 cepas de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales de ratón reactivos a una proteína CAPRIN-1.

Subsecuentemente, a partir de estos anticuerpos monoclonales de ratón, se seleccionaron los anticuerpos reactivos a la superficie celular de células de cáncer que expresan la proteína CAPRIN-1. Específicamente, 1x10s células de la línea de células de cáncer de mama humano MDA-MB-231V se centrifugaron con un tubo de microcentrifugación de 1.5 mL. A las células se agregaron 100 ]xL del sobrenadante de cultivo de los hibridomas descritos anteriormente, seguido se dejó reposar en hielo por 1 hora. Después del lavado con PBS, a las células se agregaron un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra etiquetado con FITC (manufacturado por life technologies) diluido por 500 veces con PBS que contiene 0.1% de FBS, seguido se dejó reposar en hielo por 1 hora. Después del lavado con PBS, la intensidad de fluorescencia se midió con FACS Calibur disponible de Becton, Dickinson and Company. De manera separada, como un control, se realizó el mismo procedimiento como anteriormente usando suero no tratado de un ratón Balb/c de 6 semanas de edad diluido por 500 veces con un medio de cultivo de hibridoma, en lugar del anticuerpo. Como un resultado, se seleccionaron 22 anticuerpos monoclonales de ratón (anticuerpos monoclonales de ratón #1 hasta #22) que mostraron intensidades de fluorescencia superiores comparadas con el control, es decir, reaccionan con la superficie celular de las células de cáncer de mama .

Con el fin de producir un anticuerpo monoclonal de pollo, 300 g de una proteína de antígeno (proteína CAPRIN-1 humana) expuesta en la SEC ID NO: 2 preparada en el Ejemplo 2 se mezclaron con la misma cantidad de adyuvante Freund completo, y la mezcla se usó como una solución de antígeno para un pollo. La solución del antígeno se administró intraperitonealmente a pollos de 7 semanas de edad y se administró además siete veces con intervalos de cuatro semanas para completar la inmunización. El bazo se extrajo al cuarto día de la última inmunización y se trituró entre dos laminillas de vidrio esterilizadas y se lavó con PBS (-) (manufacturado por Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), seguido por centrifugación a 1500 rpm por 10 minutos para remover el sobrenadante. Este procedimiento se repitió tres veces para obtener células del bazo. Las células del bazo y células de mieloma de pollo deficiente en cadena ligera resultantes establecidas por transformación del pollo usando el virus de reticuloendoteliosis de ave se mezclaron a una relación de 5:1, y una solución de PEG preparada mezclando 200 pL de medio IMDM que contiene 10% de FBS y 800 pL de PEG 1500 (manufacturado por Boehringer Ingelheim GmbH) y calentada a 37µ? se agregó a la mezcla resultante, seguido se dejó reposar por 5 minutos para fusión celular. Se realizó centrifugación a 1700 rpm por 5 minutos, y el sobrenadante se removió. Las células se suspendieron en una mezcla de 300 mL de medio IMDM (medio de selección HAT) que contiene 10% de FBS y 2% de equivalentes de una solución HAT manufacturada por Gibco, y la suspensión se sembró a 30 placas, las cuales fueron placas de 96 cavidades (manufacturadas por Nunc) , a 100 L por cavidad. La cultivación a 37°C en 5% de C02 por 7 días proporcionó los hibridomas por fusión de las células del bazo y las células de mieloma.

Se seleccionaron hibridomas usando, como un índice, la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas a una proteína CAPRIN-1. Una solución de 1 µ9/p? de la proteína CAPRIN-1 preparada en el Ejemplo 2 se agregó a una placa de 96 cavidades a 100 µL por cavidad, seguido se dejó reposar a 4°C por 18 horas. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 400 uL de una solución de albúmina de suero bovino (BSA) al 0.5% (manufacturada por Sigma-Aldrich Co., LLC.) se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 3 horas. La solución se removió, y cada cavidad se lavó con 400 ih de PBS-T tres veces, y 100 L del sobrenadante de cultivo de hibridoma preparado anteriormente se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 2 horas . Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 100 uL de un anticuerpo IgY anti-pollo etiquetado con HRP (manufacturado por Sigma-Aldrich Co., LLC.) diluido por 5000 veces con PBS se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 1 hora. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 100 µ?? de una solución de sustrato TMB (manufacturado por Thermo Fisher Scientific K.K.) se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar por 15 a 30 minutos para la reacción de color. Después de la coloración, 100 µ?. de ácido sulfúrico 1N se agregaron a cada cavidad para detener la reacción. La absorbancia se midió a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como un resultado, se seleccionaron varios hibridomas que producen anticuerpos que muestran valores de alta absorbancia.

Los hibridomas seleccionados se sembraron en una placa de 96 cavidades a 0.5 células por cavidad y se cultivaron. Después de una semana, los hibridomas que forman colonias únicas se observaron en las cavidades. Las células en las cavidades además se cultivaron, y se seleccionaron hibridomas usando, como un índice, la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas clonados a una proteína CAPRIN-1. Una solución de 1 µg/mL de proteína CAPRIN-1 humana se agregó a una placa de 96 cavidades a 100 µL por cavidad, seguido se dejó reposar a 4°C por 18 horas. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 400 µL de una solución de BSA al 0.5% se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 3 horas. La solución se removió, y cada cavidad se lavó con 400 µ]1? de PBS-T tres veces, y 100 µ?? del sobrenadante de cultivo de hibridoma preparado anteriormente se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 2 horas. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 100 de un anticuerpo IgY an i-pollo etiquetado con HRP (manufacturado por Sigma-Aldrich Co., LLC.) diluido por 5000 veces con PBS se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 1 hora. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 100 UL de una solución de sustrato TMB (manufacturado por Thermo Fisher Scientific K.K.) se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar por 15 a 30 minutos para la reacción de color. Después de la coloración, 100 ih de ácido sulfúrico 1N se agregaron a cada cavidad para detener la reacción. La absorbancia se midió a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como un resultado, se obtuvieron varias cepas de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales que muestran reactividad con la proteína CAPRIN-1.

Subsecuentemente, a partir de estos anticuerpos monoclonales, se seleccionaron los anticuerpos reactivos a la superficie celular de células de cáncer que expresan la proteína CAPRIN-1. Específicamente, 5xl05 células de la línea de células de cáncer de mama humano MDA- B-231V se centrifugaron con un tubo de microcentrifugación de 1.5 mL. A las células se agregaron 100 uL del sobrenadante de cultivo de los hibridomas descritos anteriormente, seguido se dejó reposar en hielo por 1 hora. Después del lavado con PBS, a las células se agregaron a anticuerpo IgG anti-pollo de cabra etiquetado con FITC (H+L) (manufacturado por SouthernBiotech) diluido por 30 veces con PBS que contiene 0.1% de FBS, seguido se dejó reposar en hielo por 1 hora. Después del lavado con PBS, la intensidad de fluorescencia se midió con FACS Calibur disponible de Becton, Dickinson and Company. De manera separada, se realizó el mismo procedimiento como anteriormente usando un medio de cultivo de hibridoma para preparar una muestra de control. Como un resultado, se seleccionaron tres anticuerpos monoclonales (anticuerpos monoclonales de pollo #1, #2, y #3) que mostraron intensidades de fluorescencia superiores comparadas con el control, es decir, reaccionan con la superficie celular de las células de cáncer de mama que expresan la proteína CAPRIN-1.

[Ejemplo 6] Caracterización del anticuerpo seleccionado (1) Clonación del gen de dominio variable del anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 El ARNm se extrajo a partir de cada una de las cepas de hibridoma que producen 22 anticuerpos monoclonales de ratón y 3 anticuerpos monoclonales de pollo seleccionados en el Ejemplo 5. Se prepararon genes de los dominios variables de cadena pesada (VH) y los dominios variables de cadena ligera (VL) de todos los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 por RT-PCR usando cebadores específicos para la secuencia derivada de FRl de ratón y la secuencia derivada de FR4 de ratón en los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales de ratón y cebadores específicos para la secuencia derivada de FRl de pollo y la secuencia derivada de FR4 de pollo en los anticuerpos monoclonales de pollo que producen hibridoma. Estos genes se clonaron en un vector pCR2.1 (manufacturado por life technologies) para secuenciamiento . (1) -1 RT-PCR Se preparó AR m a partir de lxlO6 hibridomas de cada cepa que producen el anticuerpo monoclonal de ratón con un kit de micro purificación por ARNm (manufacturado por GE Healthcare Bio-Sciences) , y el ARNm resultante fue transcrito inversamente con el kit de síntesis de Ira. hebra SuperScriptII (manufacturado por life technologies) para sintetizar el ADN. Estos procedimientos se realizaron de conformidad con el protocolo adjunto a cada kit. El gen del anticuerpo se amplificó por PCR usando el ADNc resultante. Con el fin de obtener un gel del dominio VH, se usaron un cebador (SEC ID NO: 257) específico a la secuencia FRl de cadena pesada de ratón y un cebador (SEC ID NO: 258) específico a la secuencia FR4 de cadena pesada de ratón. Con el fin de obtener un gel del dominio VL, se usaron un cebador (SEC ID NO: 259) específico a la secuencia FR1 de cadena ligera de ratón y un cebador (SEC ID NO: 260) específico al FR4 de cadena ligera de ratón.

Estos cebadores se diseñaron con referencia a Jones, S.T. and Bending, M. ., Bio/Technology, 9, 88-89 (1991) . En la PCR, se usó Ex-taq (manufacturado por Takara Bio Inc . ) . Una muestra de ADNc se agregó a 5 µ?? de amortiguador Taq 10XEX, 4 ih (2.5 mM) de mezcla dNTP, 2 i (1.0 µ?) de cada cebador, y 0.25 uL (5 U/uD de Ex Taq, y el volumen total se ajustó a 50 ih con agua esterilizada. Después del tratamiento a 94 °C por 2 minutos, un ciclo que consiste de desnaturalización a 94°C por 1 minuto, templado a 58°C por 30 segundos, y extensión a 72°C por 1 minuto se repitió por 30 ciclos.

El ARN total se extrajo a partir de lxlO6 hibridomas de cada cepa que producen un anticuerpo monoclonal de pollo usando el Kit de Aislamiento de ARN Alto en Pureza (manufacturado por Roche Diagnostics K.K.), y el ADNc se sintetizó usando el kit de Síntesis de ADNc de Ira hebra PrimeScript II (manufacturado por Takara Bio Inc.). Estos procedimientos se realizaron de conformidad con el protocolo adjunto a cada kit. El gen de dominio variable de cadena pesada del anticuerpo de pollo y el gen de dominio variable de cadena ligera del anticuerpo de pollo fueron cada uno amplificados usando el ADNc sintetizado como una plantilla y Polimerasa KOD-Plus-ADN (manufacturada por Toyobo Co., Ltd.) por PCR de conformidad con un método usual. Con el fin de obtener un gel del dominio VH de un anticuerpo de pollo, se usaron un cebador específico a la secuencia FRl de la cadena pesada de pollo y un cebador específico a la secuencia FR4 de cadena pesada de pollo. Con el fin de obtener un gen del dominio VL, se usaron un cebador específico a la secuencia FRl de la cadena ligera de pollo y un cebador específico al FR4 de cadena ligera de pollo. (1) -2 Clonación Cada producto de PCR preparado anteriormente se sometió a electroforesis en gel de agarosa, y se cortaron las bandas de ADN del dominio VH y el dominio VL. Los fragmentos de ADN se purificaron con el kit de purificación de gel de QIAquick Gel (manufacturado por Qiagen) de conformidad con el protocolo adjunto al kit. Cada ADN purificado se clonó en un vector pCR2.1 usando un kit de clonación TA (manufacturado por life technologies) . El vector ligado se transformó en células competentes DH5a (manufacturado por Toyobo Co., Ltd.) de conformidad con un método usual. Se cultivaron diez clones de cada transformantes en un medio (100 ug/mL de ampicilina) a 37 °C durante la noche, y cada plásmido de ADN se purificó usando kit Qiaspin Miniprep (manufacturado por Qiagen) . (l)-3 Secuenciamiento Los genes del dominio VH y VL en cada uno de los plásmidos preparados anteriormente se secuenciaron usando el cebador delantero M13 (SEC ID NO: 261) y cebador inverso M13 (SEC ID NO: 262) con un secuenciador de fluorescencia (secuenciador de ADN 3130XL, manufacturado por ABI) usando el kit de secuenciamiento de ciclo Ver 3.1 terminador BigDye manufacturado por ABI de conformidad con el protocolo adjunto al kit. Como un resultado, se seleccionaron cada secuencia de gen y cada secuencia de aminoácido.

Es decir, estos anticuerpos monoclonales cada uno comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) (el número de secuencia de la secuencia del gen se muestra en paréntesis) que comprende la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 40 (SEC ID NO: 45), SEC ID NO: 50 (SEC ID NO: 55), SEC ID NO: 60 (SEC ID NO: 65), SEC ID NO: 70 (SEC ID NO: 75), SEC ID NO: 80 (SEC ID NO: 85), SEC ID NO: 90 (SEC ID NO: 95), SEC ID NO: 100 (SEC ID NO: 105), SEC ID NO: 110 (SEC ID NO: 115), SEC ID NO: 120 (SEC ID NO: 125), SEC ID NO: 130 (SEC ID NO: 131), SEC ID NO: 135 (SEC ID NO: 140), SEC ID NO: 145 (SEC ID NO: 150), SEC ID NO: 160 (SEC ID NO: 165), SEC ID NO: 170 (SEC ID NO: 175), SEC ID NO: 200 (SEC ID NO: 205), SEC ID NO: 210 (SEC ID NO: 215), SEC ID NO: 220 (SEC ID NO: 225), SEC ID NO: 230 (SEC ID NO: 235), SEC ID NO: 240 (SEC ID NO: 245), o SEC ID NO: 250 (SEC ID NO: 255) y un dominio variable de cadena ligera (VL) (el número de secuencia de la secuencia del gen se muestra en paréntesis) que comprende la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 44 (SEC ID NO: 46), SEC ID NO: 54 (SEC ID NO: 56), SEC ID NO: 64 (SEC ID NO: 66), SEC ID NO: 74 (SEC ID NO: 76), SEC ID NO: 84 (SEC ID NO: 86), SEC ID NO: 94 (SEC ID NO: 96), SEC ID NO: 104 (SEC ID NO: 106), SEC ID NO: 114 (SEC ID NO: 116), SEC ID NO: 124 (SEC ID NO: 126), SEC ID NO: 139 (SEC ID NO: 141), SEC ID NO: 149 (SEC ID NO: 151), SEC ID NO: 155 (SEC ID NO: 156), SEC ID NO: 164 (SEC ID NO: 166), SEC ID NO: 174 (SEC ID NO: 176), SEC ID NO: 180 (SEC ID NO: 181), SEC ID NO: 185 (SEC ID NO: 186) , SEC ID NO: 190 (SEC ID NO: 191) , SEC ID NO: 195 (SEC ID NO: 196), SEC ID NO: 204 (SEC ID NO: 206), SEC ID NO: 214 (SEC ID NO: 216), SEC ID NO: 224 (SEC ID NO: 226), SEC ID NO: 234 (SEC ID NO: 236), SEC ID NO: 244 (SEC ID NO: 246), o SEC ID NO: 254 (SEC ID NO: 256). El dominio VH comprende la CDRl representada por la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 37, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 57, SEC ID NO: 67, SEC ID NO: 77, SEC ID NO: 87, SEC ID NO: 97, SEC ID NO: 107, SEC ID NO: 117, SEC ID NO: 127, SEC ID NO: 132, SEC ID NO: 142, SEC ID NO: 157, SEC ID NO: 167, SEC ID NO: 197, SEC ID NO: 207, SEC ID NO: 217, SEC ID NO: 227, SEC ID NO: 237, o SEC ID NO: 247, CDR2 representada por la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 38, SEC ID NO: 48, SEC ID NO: 58, SEC ID NO: 68, SEC ID NO: 78, SEC ID NO: 88, SEC ID NO: 98, SEC ID NO: 108, SEC ID NO: 118, SEC ID NO: 128, SEC ID NO: 133, SEC ID NO: 143, SEC ID NO: 158, SEC ID NO: 168, SEC ID NO: 198, SEC ID NO: 208, SEC ID NO: 218, SEC ID NO: 228, SEC ID NO: 238, o SEC ID NO: 248, y CDR3 representada por la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 39, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 59, SEC ID NO: 69, SEC ID NO: 79, SEC ID NO: 89, SEC ID NO: 99, SEC ID NO: 109, SEC ID NO: 119, SEC ID NO: 129, SEC ID NO: 134, SEC ID NO: 144, SEC ID NO: 159, SEC ID NO: 169, SEC ID NO: 199, SEC ID NO: 209, SEC ID NO: 219, SEC ID NO: 229, SEC ID NO: 239, o SEC ID NO: 249. El dominio VL comprende la CDRl representada por la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 51, SEC ID NO: 61, SEC ID NO: 71, SEC ID NO: 81, SEC ID NO: 91, SEC ID NO: 101, SEC ID NO: 111, SEC ID NO: 121, SEC ID NO: 136, SEC ID NO: 146, SEC ID NO: 152, SEC ID NO: 161, SEC ID NO: 171, SEC ID NO: 177, SEC ID NO: 182, SEC ID NO: 187, SEC ID NO: 192, SEC ID NO: 201, SEC ID NO: 211, SEC ID NO: 221, SEC ID NO: 231, SEC ID NO: 241, o SEC ID NO: 251, CDR2 representada por la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 42, SEC ID NO: 52, SEC ID NO: 62, SEC ID NO: 72, SEC ID NO: 82, SEC ID NO: 92, SEC ID NO: 102, SEC ID NO: 112, SEC ID NO: 122, SEC ID NO: 137, SEC ID NO: 147, SEC ID NO: 153, SEC ID NO: 162, SEC ID NO: 172, SEC ID NO: 178, SEC ID NO: 183, SEC ID NO: 188, SEC ID NO: 193, SEC ID NO: 202, SEC ID NO: 212, SEC ID NO: 222, SEC ID NO: 232, SEC ID NO: 242, o SEC ID NO: 252, y CDR3 representada por la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 43, SEC ID NO: 53, SEC ID NO: 63, SEC ID NO: 73, SEC ID NO: 83, SEC ID NO: 93, SEC ID NO: 103, SEC ID NO: 113, SEC ID NO: 123, SEC ID NO: 138, SEC ID NO: 148, SEC ID NO: 154, SEC ID NO: 163, SEC ID NO: 173, SEC ID NO: 179, SEC ID NO: 184, SEC ID NO: 189, SEC ID NO: 194, SEC ID NO: 203, SEC ID NO: 213, SEC ID NO: 223, SEC ID NO: 233, SEC ID NO: 243, o SEC ID NO: 253.

La secuencia de aminoácido del dominio variable de cadena pesada de cada uno de los anticuerpos monoclonales resultantes es expuesta en la SEC ID NO: 40, SEC ID NO: 50, SEC ID NO: 60, SEC ID NO: 70, SEC ID NO: 80, SEC ID NO: 90, SEC ID NO: 100, SEC ID NO: 110, SEC ID NO: 120, SEC ID NO: 130, SEC ID NO: 135, SEC ID NO: 145, SEC ID NO: 160, SEC ID NO: 170, SEC ID NO: 200, SEC ID NO: 210, SEC ID NO: 220, SEC ID NO: 230, SEC ID NO: 240, y SEC ID NO: 250, y la secuencia de aminoácido del dominio variable de cadena ligera es expuesta en la SEC ID NO: 44, SEC ID NO: 54, SEC ID NO: 64, SEC ID NO: 74, SEC ID NO: 84, SEC ID NO: 94, SEC ID NO: 104, SEC ID NO: 114, SEC ID NO: 124, SEC ID NO: 139, SEC ID NO: 149, SEC ID NO: 155, SEC ID NO: 164, SEC ID NO: 174, SEC ID NO: 180, SEC ID NO: 185, SEC ID NO: 190, SEC ID NO: 195, SEC ID NO: 204, SEC ID NO: 214, SEC ID NO: 224, SEC ID NO: 234, SEC ID NO: 244, y SEC ID NO: 254.

Es decir, el anticuerpo monoclonal de ratón #1 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 70 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 74; el anticuerpo monoclonal de ratón #2 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 80 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 84; el anticuerpo monoclonal de ratón #3 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 90 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 94; el anticuerpo monoclonal de ratón #4 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 100 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 104; el anticuerpo monoclonal de ratón #5 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 110 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 114; el anticuerpo monoclonal de ratón #6 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 120 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 124; el anticuerpo monoclonal de ratón #7 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 130 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 124; el anticuerpo monoclonal de ratón #8 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 135 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 139; el anticuerpo monoclonal de ratón #9 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 145 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 149; el anticuerpo monoclonal de ratón #10 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 145 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 155; el anticuerpo monoclonal de ratón #11 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 160 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 164; el anticuerpo monoclonal de ratón #12 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 170 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 174; el anticuerpo monoclonal de ratón #13 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 170 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 180; el anticuerpo monoclonal de ratón #14 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 170 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 185; el anticuerpo monoclonal de ratón #15 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 170 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 190; el anticuerpo monoclonal de ratón #16 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 170 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 195; el anticuerpo monoclonal de ratón #17 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 200 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 204; el anticuerpo monoclonal de ratón #18 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 210 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 214; el anticuerpo monoclonal de ratón #19 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 220 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 224; el anticuerpo monoclonal de ratón #20 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 230 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 234; el anticuerpo monoclonal de ratón #21 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 240 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 244; y el anticuerpo monoclonal de ratón #22 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 250 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 254.

Las secuencias de aminoácido del dominio variable de cadenas pesadas de los anticuerpos monoclonales de pollo resultantes son expuestas en las SEC ID NOs : 40, 50, y 60; y las secuencias de aminoácido del dominio variable de cadena ligeras son expuestas en las SEC ID NOs : 44, 54, y 6 .

Es decir, el anticuerpo monoclonal de pollo #1 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 40 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 44, en donde las CDRs 1 hasta 3 en el dominio variable de cadena pesada consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 37, 38, y 39, respectivamente; y las CDRs 1 hasta 3 en el dominio variable de cadena ligera consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 41, 42, y 43, respectivamente. El anticuerpo monoclonal de pollo #2 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 50 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 54, en donde las CDRs 1 hasta 3 en el dominio variable de cadena pesada consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 47, 48, y 49, respectivamente; y las CDRs 1 hasta 3 en el dominio variable de cadena ligera consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 51, 52, y 53, respectivamente. El anticuerpo monoclonal de pollo #3 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 60 y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 64, en donde las CDRs 1 hasta 3 en el dominio variable de cadena pesada consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 57, 58, y 59, respectivamente; y las CDRs 1 hasta 3 en el dominio variable de cadena ligera consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 61, 62, y 63, respectivamente. (2) Producción de anticuerpo recombinante quimérico de humano-pollo y anticuerpo quimérico de ratón-pollo Ambas terminales de un fragmento amplificado del gen del dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO : 40 del anticuerpo monoclonal de pollo #1 preparado en el (1) anterior se trataron con enzimas de restricción, y el fragmento se purificó y se insertó en el vector de ADNpc4/my-His (manufacturado por life technologies) que contiene una secuencia líder derivada de un anticuerpo de pollo que comprende la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 263 y el dominio constante de cadena H de IgGi humano que comprende la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 264 de conformidad con un método usual. De manera separada, ambas terminales de un fragmento amplificado del gen del dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 44 del anticuerpo monoclonal de pollo #1 se trataron con enzimas de restricción, y el fragmento se purificó y se insertó en el vector ADNpc3.1/myc-His (manufacturado por life technologies) que contiene una secuencia líder derivada de un anticuerpo de pollo que comprende la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 263 y el dominio constante de cadena L de IgG humano que comprende la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 265 de conformidad con un método usual.

Subsecuentemente, el vector recombinante que contiene el dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 40 del anticuerpo monoclonal de pollo #1 y el vector recombinante que contiene el dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 44 del anticuerpo monoclonal de pollo #1 se introdujeron en células CH0-K1 (obtenidas de Riken Cell Bank) . Específicamente, células 2xl05 CHO-K1 cultivadas en cada cavidad, de una placa de cultivo de 12 cavidades, que contiene 1 mL de medio F12 de Ham (manufacturado por life technologies) que contiene 10% de FBS se lavaron con PBS (-) . A cada cavidad se agregaron 1 mL de medio F12 de Ham fresco que contiene 10% de FBS y una mezcla de 30 ih de OptiMEM (manufacturado por life technologies) que contiene 250 ng de cada uno de los vectores mencionados anteriormente y 30 \il¡ de reactivo de transfección Polyfect (manufacturado por Qiagen) . Las células CHO-K1 introducidas con los vectores recombinantes se cultivaron en medio F12 de Ham que contiene 10% de FBS, 200 g/mL de Zeocina (manufacturada por life technologies) , y 200 ug/mL de Geneticina (manufacturada por Roche) y entonces se sembraron a una placa de 96 cavidades a 0.5 células por cavidad para producir una línea de células que produce establemente anticuerpo quimérico de humano-pollo #1 (#1) que comprende el dominio variable del anticuerpo monoclonal de pollo #1. De manera similar, líneas celulares que producen establemente anticuerpo quimérico de humano-pollo #2 (#2) y anticuerpo quimérico de humano-pollo #3 (#3) se produjeron a partir de anticuerpos monoclonales de pollo #2 y #3, respectivamente.

Las líneas de células producidas fueron cada una cultivadas a 5xl05 células/mL en un matraz de 150-cm2 que contiene 30 mL de medio OptiCHO libre de suero (manufacturado por life technologies) por 5 días para obtener un sobrenadante de cultivo que contiene #1, #2, o #3.

De manera similar, ambas terminales de un fragmento amplificado del gen del dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 40 del anticuerpo monoclonal de pollo #1 se trataron con enzimas de restricción, y el fragmento se purificó y se insertó en el vector de ADNpc4/my-His (manufacturado por life technologies) que contiene una secuencia líder derivada de un anticuerpo de pollo y el dominio constante de cadena H de IgGi de ratón de conformidad con un método usual. De manera separada, ambas terminales de un fragmento amplificado del gen del dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 44 del anticuerpo monoclonal de pollo #1 se trataron con enzimas de restricción, y el fragmento se purificó y se insertó en el vector ADNpc3. l/myc-His (manufacturado por life technologies) que contiene una secuencia líder derivada de un anticuerpo de pollo y el dominio constante de cadena L de IgGi de ratón de conformidad con un método usual. Estos vectores se introdujeron en células CH0-K1 como anteriormente para producir una línea de células que produce establemente anticuerpo quimérico de ratón-pollo #1 que comprende el dominio variable de anticuerpo monoclonal de pollo #1. De manera similar, líneas celulares que producen establemente anticuerpo quimérico de ratón-pollo #2 (#2) y anticuerpo quimérico de ratón-pollo #3 (#3) se produjeron a partir de anticuerpos monoclonales de pollo #2 y #3, respectivamente.

Las líneas de células producidas fueron cada una cultivadas a 5xl05 células/mL en un matraz de 150-cm2 que contiene 30 mL de medio OptiCHO libre de suero (manufacturado por life technologies) por 5 días para obtener un sobrenadante de cultivo que contiene anticuerpo quimérico de ratón-pollo #1, anticuerpo quimérico de ratón-pollo #2, y anticuerpo quimérico de ratón-pollo #3. (3) Expresión de la proteína CAPRIN-1 en la superficie de células de cáncer de vesícula biliar usando anticuerpo monoclonal preparado Subsecuentemente, una línea de célula de cáncer de vesícula biliar TGBC14TKB , la cual se confirmó por expresar un gen CAPRIN-1, se investigó por sí o no una proteína CAPRIN-1 es expresada en las superficies de estas células. lxlO6 células de TGBC14TKB se centrifugaron con un tubo de microcentrifugación de 1.5 mL. A las células se agregaron el sobrenadante de cultivo (100 iL) que contiene cualquiera de los anticuerpos monoclonales de ratón anti-CAPRIN-1 #1 hasta #22 que reaccionan con la superficie de la célula de cáncer producida en el Ejemplo 4 y los anticuerpos quiméricos de ratón-pollo anti-CAPRIN-l #1 hasta #3 contra una proteína CAPRIN-1 producida en el anterior (2) , seguido se dejó reposar en hielo por 1 hora. Después del lavado con PBS, las células se suspendieron en un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra etiquetado con FITC (manufacturado por life technologies) diluido por 500 veces con PBS que contiene 0.1% de FBS, seguido se dejó reposar en hielo por 1 hora. Después del lavado con PBS, la intensidad de fluorescencia se midió con FACS Calibur disponible de Becton, Dickinson and Company. De manera separada, como un control, se realizó el mismo procedimiento como anteriormente usando un anticuerpo de control de iso-tipo, en lugar de los sobrenadantes de cultivo que contienen los anticuerpos monoclonales de ratón anti-CAPRIN-1 #1 hasta #22 y los anticuerpos quiméricos de ratón-pollo #1 hasta #3. Como un resultado, la intensidad de fluorescencia en las células a las cuales cualquiera de los anticuerpos monoclonales #1 hasta #22 y los anticuerpos quiméricos de ratón-pollo #1 hasta #3 se agregó fue 20% o más superior que aquella en el control en cada caso. Específicamente, en el caso de usar anticuerpo quimérico de ratón-pollo #1, la intensidad de fluorescencia se mejoró por 200% o más. Esto demuestra que la proteína CAPRIN-1 fue expresada en la superficie celular de las líneas de células de cáncer de vesícula biliar humano. El índice de incremento en la intensidad de fluorescencia es representado por el índice de incremento en la intensidad de fluorescencia media (valor MFI) en cada célula y se calcula por la siguiente fórmula de cálculo: índice de incremento en la intensidad de fluorescencia media (índice de incremento en la intensidad de fluorescencia) (%) = ( (valor MFI de células que reaccionan con anticuerpo CAPRIN-1 anti -humano) - (valor MFI de control) )/ (valor MFI de control) x 100. (4) Efecto antitumoral (actividad de ADCC) del anticuerpo anti-CAPRIN-1 en células de cáncer de vesícula biliar humano Entre los anticuerpos preparados anteriormente, se usó anticuerpo quimérico de humano-pollo #1 para evaluación de citotoxicidad (actividad de ADCC) en células de cáncer de vesícula biliar humano. El anticuerpo quimérico de humano-pollo #1 contenido en el sobrenadante de cultivo preparado en el anterior (2) se purificó usando Sefarosa FF de Proteína A Hitrap (manufacturado por GE Healthcare Bio-Sciences) , sustituido con PBS (-), y se filtró a través de un filtro de 0.22 µp? (manufacturado por Millipore Corporation), y se usó como el anticuerpo para medir la actividad. lxlO6 células de la línea de célula de cáncer de vesícula biliar humano TGBC14TKB se recolectaron en un tubo de centrifugación de 50 mL, y 100 de 51cromo se agregaron a estas, seguido por incubación a 37°C por 2 horas. Subsecuentemente, las células se lavaron con medio RPMI 1640 que contiene 10% de FBS tres veces y entonces se agregaron a una placa en fondo en V de 96 cavidades at 2xl03 células por cavidad como células objetivo. A cada cavidad se agregó 1.2 µg del anticuerpo purificado anteriormente. De manera separada, una población celular que contiene células NK humanas se aisló a partir de linfocitos de sangre periférica humana por el siguiente procedimiento: Células mononucleares periféricas humanas se sometieron a reacción anticuerpos etiquetados con tinte fluorescente FITC (anticuerpo anti -humano CD3 , anticuerpo anti-humano CD20, anticuerpo anti-humano CD19, anticuerpo anti-humano CDllc, y anticuerpo anti -HLA-DR (Becton, Dickinson and Company) ) , y una población celular que contiene células NK no teñidas con estos anticuerpos se aisló usando un clasificador celular (FACS Vantage SE (Becton, Dickinson and Company) ) o un kit de separación de células NK humanas (Kit de Aislamiento de Células NK (manufacturado por Miltenyi Biotec GmbH) ) . La población celular que contiene células NK además se agregaron a la placa a 2xl05 células por cavidad, seguido por cultivación a 37°C en 5% de C02 por 4 horas. Después del cultivo, la cantidad de 51cromo secretado a partir de las células de tumor deterioradas en el sobrenadante de cultivo se midió para calcular la actividad de ADCC en las células de cáncer de vesícula biliar por el anticuerpo anti-CAPRIN-1. Como un resultado, las citotoxicidades del anticuerpo quimérico de humano-pollo #1 en TGBC14TKB fueron 20%, mientras las citotoxicidades en TGBC14TKB fueron ambas menos de 5% en el caso de usar el anticuerpo monoclonal que reacciona con la proteína CAPRIN- 1 misma pero no reacciona con la superficie celular de células de cáncer y en el caso de no usar anticuerpos. De manera similar, las citotoxicidades en TGBC14TKB de anticuerpos monoclonales de ratón anti-CAPRIN-1 #1 hasta #22, anticuerpos quiméricos humanos-de pollo #2 y #3 también fueron investigados y fueron todos 12% o más, mientras las citotoxicidades fueron menos de 5% en el caso de usar el anticuerpo monoclonal que reacciona con la proteína CAPRIN-1 misma pero no reacciona con la superficie celular de células de cáncer y en el caso de no usar anticuerpos. Los resultados anteriores demuestran que los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 preparados deterioran células de cáncer que expresan la proteína CAPRIN-1 a través de la actividad de ADCC. La citotoxicidad es el resultado, como se describe anteriormente, cuando el anticuerpo anti-CAPRIN-1 usado en la presente invención, la población celular que contiene células NK humanas, y 2xl03 células tumorales con 51cromo fueron mezcladas y cultivadas por 4 horas, y se mostró como la citotoxicidad en las células tumorales calculada por la siguiente fórmula de cálculo * midiendo la cantidad de 51cromo liberado en el medio después del cultivo.

Fórmula *: citotoxicidad (%) = (cantidad de "cromo liberado a partir de células tumorales en la presencia de la población celular que contiene el anticuerpo ant i-CAPRIN- 1 y células NK humanas) / (cantidad de 51cromo liberado a partir de células tumorales en la presencia de ácido clorhídrico 1N) x 100.

[Ejemplo 7] Identificación del péptido de la proteína CAPRIN-1 que se une al anticuerpo anti-CAPRIN-1 que reacciona con la superficie celular de células de cáncer Secuencias parciales de la proteína CAPRIN-1 reconocidas por anticuerpos anti -CAPRIN- 1 se identificaron usando anticuerpos monoclonales anti -CAPRIN-1 #12 hasta #22, los cuales reaccionan con la superficie celular de células de cáncer, preparadas anteriormente.

Primero, el DTT (manufacturado por Fluka) se agregó a una concentración final de 10 mM hasta 100 µ?. de una solución de 1 g/]iL de proteína CAPRIN-1 recombinante en PBS, seguido por reacción a 95 °C por 5 minutos para reducir el enlace de disulfuro en la proteína CAPRIN-1. Después, se agregó yodoacetamida (manufacturado por Wako Puré Chemical Industries, Ltd.) a esta a una concentración final de 20 mM, seguido por alquilación del grupo tiol a 37°C bajo una condición cubierta de luz por 30 minutos. A 40 ig de la proteína CAPRIN-1 alquilada reducida resultante, se agregó 50 ]ig de cualquiera de los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN- 1 #12 hasta #22. La cantidad total de cada mezcla se ajustó hasta 1 mL con un amortiguador de fosfato de 20 mM (pH 7.0), seguido por reacción a 4°C durante la noche con agitación.

Subsecuentemente, se agregó tripsina (manuf cturado por Promega K.K.) a una concentración final de 0.2 ug a cada mezcla de reacción, seguido por reacción a 37°C por 1, 2, 4, o 12 horas. La mezcla de reacción se mezcló con perlillas de vidrio de proteína-A (manufacturado por GE Healthcare Bio-Sciences) bloqueadas con PBS que contiene 1% de BSA (manufacturado por Sigma-Aldrich Co. , LLC.) y se lavó con PBS por adelantado y 1 mM de carbonato de calcio en un amortiguador NP-40 (20 mM de amortiguador de fosfato (pH 7.4), 5 mM de EDTA, 150 mM de NaCl, 1% de NP-40), seguido por reacción por 30 minutos.

Cada solución de reacción se lavó con 25 mM de amortiguador de carbonato de amonio (pH 8.0), seguido por elución de complejos de antígeno-anticuerpo con 100 ih de ácido fórmico al 0.1%. Lo eluado se analizó por LC-MS usando Q-TOF Premier (manufacturado por Waters-MicroMass) de conformidad con el protocolo adjunto al instrumento.

Como un resultado, un polipéptido expuesto en la SEC ID NO: 273 se identificó como una secuencia parcial de la proteína CAPRIN-1 reconocida por todos los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 #12 hasta #22. Además, un péptido expuesto en la SEC ID NO: 274 se identificó como una secuencia parcial del polipéptido expuesto en la anterior SEC ID NO: 273 reconocida por los anticuerpos monoclonales #13 hasta #16, #17 hasta #19, y #21; y un péptido de secuencia parcial expuesto en la SEC ID NO: 275 se encontró por ser reconocido por los anticuerpos monoclonales #13 hasta #16.

Los péptidos epítopos en la proteína CAPRIN-1 reconocida por los anticuerpos se identificaron usando anticuerpo monoclonal quimérico de humano-pollo #1, anticuerpo monoclonal quimérico de humano-pollo #3, y anticuerpos monoclonales de ratón #1 hasta #11. Los péptidos candidatos (93 péptidos) cada uno que consiste de 12 hasta 16 aminoácidos de la secuencia de aminoácido de la proteína CAPRIN-1 humana se sintetizaron y se disolvieron cada uno a una concentración de 1 mg/mL en DMSO .

Cada péptido se disolvió a una concentración de 30 µ9/???^ en un amortiguador de carbonato de sodio 0.1 M (pH 9.6) . La solución se agregó a una placa de 96 cavidades (manufacturado por Nunc, Producto No. 436006) a 100 µL por cavidad, seguido se dejó reposar a 4°C durante la noche. La solución se removió, y 200 ]iL de 10 mM de etanolamina/amor guador de carbonato de sodio 0.1 M (pH 9.6) se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 1 hora. La solución se removió, y cada cavidad se lavó con PBS que contiene 0.5% de Tween 20 (PBST) dos veces para preparar una placa de péptido inmovilizado .

El sobrenadante de cultivo celular que contiene anticuerpo monoclonal quimérico de humano-pollo #1 (#1) , anticuerpo monoclonal quimérico de humano-pollo #3 (#3), o el anticuerpo monoclonal de ratón (#1, #2, #3, #4, #5, #6, #7, #8, #9, #10, o #11) se agregó a cada placa a una cantidad de 50 µ? por cavidad, seguido por sacudimiento a temperatura ambiente por 1 hora. La solución se removió, y cada cavidad se lavó con PBST tres veces. Subsecuentemente, una solución de anticuerpo secundario que contiene un anticuerpo IgG antihumano etiquetado con HRP (manufacturado por life technologies) diluido por 3000 hasta 4000 veces con PBST se agregó a las cavidades del anticuerpo monoclonal quimérico de humano-pollo a 50 µ?? por cavidad, mientras una solución de anticuerpo secundario que contiene un anticuerpo IgG antiratón etiquetado con HRP (manufacturado por life technologies) diluido por 3000 hasta 4000 veces con PBST se agregó a las cavidades de anticuerpo monoclonal de ratón a 50 µ??? por cavidad. La solución se removió, y cada cavidad se lavó con PBST seis veces.

Se realizó la reacción de color agregando 100 ]ih de una solución de sustrato TMB (manufacturado por Thermo Fisher Scientific K.K.) a cada cavidad y dejando reposar la mezcla por 15 a 30 minutos. Después de la coloración, 100 VL1¡ de ácido sulfúrico 1N se agregaron a cada cavidad para detener la reacción. La absorbancia se midió a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como un resultado, un polipéptido expuesto en la SEC ID NO: 266 se identificó como una secuencia parcial de la CAPRIN-1 reconocida por todos los anticuerpos anti -CAPRIN- 1 : anticuerpo monoclonal quimérico de humano-pollo #1 y anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 #1 hasta #5. Además, un péptido expuesto en la SEC ID NO: 267 se identificó como un péptido parcial del polipéptido expuesto en la SEC ID NO: 266 reconocido por el anticuerpo monoclonal quimérico de humano-pollo #1 y anticuerpos monoclonales de ratón #3 y # ; y un péptido expuesto en la SEC ID NO: 268 se identificó como un péptido parcial del polipéptido expuesto en la SEC ID NO: 266 reconocido por el anticuerpos monoclonales de ratón #1, #2, y #5. Por lo tanto se demostró que el polipéptido expuesto en la SEC ID NO: 266 contiene una región de epítopo para los anticuerpos anti -CAPRIN-1 : anticuerpo monoclonal quimérico de humano-pollo #1 y anticuerpos monoclonales de ratón #1 hasta #5. Además, un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 270 se identificó como una secuencia parcial de la proteína CAPRIN- 1 reconocida por todos los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN- 1 #6, #7, y #8. Por lo tanto se demostró que el polipéptido expuesto en la SEC ID NO: 270 contiene una región de epítopo para los anticuerpos anti-CAPRIN-1 #6, #7, y #8. Además, un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 272 se identificó como una secuencia parcial de la proteína CAPRIN-1 reconocida por todos los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 #9, #10, y #11. Por lo tanto se demostró que el polipéptido expuesto en la SEC ID NO: 272 contiene una región de epítopo para los anticuerpos anti-CAPRIN-1 #9, #10, y #11. Además, un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 269 se identificó como una secuencia parcial de la proteína CAPRIN-1 reconocido por el anticuerpo monoclonal quimérico de humano-pollo #3. Por lo tanto se demostró que el polipéptido expuesto en la SEC ID NO: 269 contiene una región de epítopo para el anticuerpo monoclonal quimérico de humano-pollo #3.

[Ejemplo 8] Producción de anticuerpos monoclonales de ratón #30 y #34 hasta #36 contra la proteína CAPRIN-1 (1) Producción de anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 de ratón #30 y #34 hasta #36 Una mezcla de 100 µg de una proteína CAPRIN-1 humana que comprende la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO : 2 preparada de conformidad con ejemplo 3 del documento O2010/016526 mezclada con la misma cantidad de adyuvante PL+TDM (manufacturado por Sigma-Aldrich Co., LLC.) se usó como una solución de antígeno para un ratón. La solución del antígeno se administró intraperitonealmente a ratones Balb/c de 6 semanas de edad (manufacturado por Japan SLC, Inc.) y se administró además siete veces con intervalos de una semana para completar la inmunización. El bazo se extrajo al tercer día de la última inmunización y se trituró entre dos laminillas de vidrio esterilizadas y se lavó con PBS (-) (manufacturado por Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), seguido por centrifugación a 1500 rpm por 10 minutos para remover el sobrenadante. Este procedimiento se repitió tres veces para obtener células del bazo. Las células del bazo y células de mieloma de ratón SP2/0 resultantes (adquiridas de ATCC) se mezclaron a una relación de 10:1, y una solución de PEG preparada mezclando 200 xl¡ de medio RPMI1640 que contiene 10% de FBS y 800 iL de PEG 1500 (manufacturado por Boehringer Ingelheim GmbH) y calentada a 37°C se agregó a la mezcla resultante, seguido se dejó reposar por 5 minutos para fusión celular. Se realizó centrifugación a 1700 rpm por 5 minutos, y el sobrenadante se removió. Las células se suspendieron en una mezcla de 150 mL de medio RPMI1640 (medio de selección HAT) que contiene 15% de FBS y 2% de equivalentes de una solución HAT manufacturada por Gibco, y la suspensión se sembró en 15 placas, las cuales fueron placas de 96 cavidades (manufacturadas por Nunc) , a 100 µL por cavidad. La cultivación a 37 °C en 5% de C02 por 7 días proporcionó los hibridomas por fusión de las células del bazo y las células de mieloma.

Se seleccionaron hibridomas usando, como un índice, la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas a una proteína CAPRIN-1. Una solución de 1 ug/mL de la proteína CAPRIN-1 preparada por el método descrito en ejemplo 3 del documento WO2010/016526 se agregó a una placa de 96 cavidades a 100 µ?. por cavidad, seguido se dejó reposar a 4°C por 18 horas. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 400 µ?? de una solución de albúmina de suero bovino (BSA) al 0.5% (manufacturada por Sigma-Aldrich Co. , LLC.) se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 3 horas. La solución se removió, y cada cavidad se lavó con 400 µ?^ de PBS-T tres veces, y 100 µL del sobrenadante de cultivo de hibridoma preparado anteriormente se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 2 horas. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 100 uL de un anticuerpo IgG anti-ratón etiquetado con HRP (H+L) (manufacturado por life technologies) diluido por 5000 veces con PBS se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 1 hora. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 100 µ?? de una solución de sustrato TMB (manufacturado por Thermo Fisher Scientific K.K.) se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar por 15 a 30 minutos para la reacción de color. Después de la coloración, 100 µ?. de ácido sulfúrico 1N se agregaron a cada cavidad para detener la reacción. La absorbancia se midió a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como un resultado, se seleccionaron varios hibridomas que producen anticuerpos que muestran valores de alta absorbancia.

Los hibridomas seleccionados se sembraron en una placa de 96 cavidades a 0.5 células por cavidad y se cultivaron. Después de una semana, los hibridomas que forman colonias únicas se observaron en las cavidades. Las células en las cavidades además se cultivaron, y se seleccionaron hibridomas usando, como un índice, la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas clonados a una proteína CAPRIN-1. Una solución de 1 pg/mL de la proteína CAPRIN-1 preparada por el método descrito en ejemplo 3 del documento WO2010/016526 se agregó a una placa de 96 cavidades a 100 iL por cavidad, seguido se dejó reposar a 4°C por 18 horas. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 400 pL de una solución de BSA al 0.5% se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 3 horas. La solución se removió, y cada cavidad se lavó con 400 ]iL de PBS-T tres veces, y 100 ]íL del sobrenadante de cultivo de hibridoma preparado anteriormente se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 2 horas. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 100 \ih de un anticuerpo IgG anti-ratón etiquetado con HRP (H+L) (manufacturado por life techonologies) diluido por 5000 veces con PBS se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 1 hora. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 100 ih de una solución de sustrato TMB (manufacturado por Thermo Fisher Scientific K.K.) se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar por 15 a 30 minutos para la reacción de color. Después de la coloración, 100 ]il¡ de ácido sulfúrico 1N se agregaron a cada cavidad para detener la reacción. La absorbancia se midió a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como un resultado, se obtuvieron varias líneas de células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales reactivos a la proteína CAPRIN-1.

Subsecuentemente, a partir de los anticuerpos monoclonales resultantes, anticuerpos reactivos a la superficie celular de células de cáncer de mama que expresan la CAPRIN-1 se seleccionaron. Específicamente, lxlO6 células de la línea de células de cáncer de mama humano MDA-MB-231V se centrifugaron con un tubo de microcentrifugación de 1.5 mL. A las células se agregaron 100 µ??? del sobrenadante de cultivo de los hibridomas descritos anteriormente, seguido se dejó reposar en hielo por 1 hora. Después del lavado con PBS, a las células se agregaron un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra etiquetado con FITC (manufacturado por life techonologies) diluido por 500 veces con PBS que contiene 0.1% de FBS, seguido se dejó reposar en hielo por 1 hora. Después del lavado con PBS, la intensidad de fluorescencia se midió con FACS Cal ibur disponible de Becton, Dickinson and Company . De manera separada , se realizó el mismo procedimiento como anteriormente como un control usando suero no tratado de un ratón Balb/c de 6 semanas de edad diluido por 500 veces con un medio de cultivo de hibridoma , en lugar del anticuerpo . Como un resultado , cuatro anticuerpos monoclonales (mouse anti-CAPRIN-1 anticuerpos #30 y #34 hasta #36) que mostraron intensidades de fluorescencia superiores comparadas con el control, es decir, reaccionan con la superficie celular de las células de cáncer de mama se seleccionaron. (2) Identificación del epítopo de CAPRIN-1 reconocido por cada anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de ratón Se identificaron las regiones de epítopo de CAPRIN-1 reconocidas por los cuatro anticuerpos monoclonales resultantes . Los péptidos candidatos (93 péptidos) cada uno que consiste de 12 hasta 16 aminoácidos de la secuencia de aminoácido de la proteína CAPRIN- 1 humana se sintetizaron y se disolvieron cada uno a una concentración de 1 mg/mL en DMSO .

Cada péptido se disolvió a una concentración de 30 µg/mL en un amortiguador de carbonato de sodio 0 . 1 M (pH 9 . 6 ) . La solución se agregó a una placa de 96 cavidades (manufacturado por Munc , Producto No . 436006 ) a 100 L por cavidad, seguido se dej ó reposar a 4 °C durante la noche . La solución se removió, y 200 ]J !> de etanolamina 10 itiM/ amortiguador de carbonato de sodio 0 . 1 M (pH 9 . 6 ) se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 1 hora. La solución se removió, y cada cavidad se lavó con PBS que contiene 0.5% de Tween 20 (PBST) dos veces para preparar una placa de péptido inmovilizado.

El sobrenadante de cultivo celular que contiene anticuerpo anti -CAPRIN- 1 #1 se agregó a la placa en una cantidad de 50 µ?. por cavidad, seguido por sacudimiento a temperatura ambiente por 1 hora. La solución se removió, y cada cavidad se lavó con PBST tres veces. Subsecuentemente, 50 µL de una solución de anticuerpo secundario que contiene un anticuerpo IgG anti -ratón etiquetado con HRP (manufacturado por life technologies) diluido por 3000 hasta 4000 veces con PBST se agregó a cada cavidad. La solución se removió, y cada cavidad se lavó con PBST seis veces.

Se realizó la reacción de color agregando 100 µL de una solución de sustrato TMB (manufacturado por Thermo Fisher Scientific K.K.) a cada cavidad y dejando reposar la mezcla por 15 a 30 minutos. Después de la coloración, 100 µL de ácido sulfúrico 1N se agregaron a cada cavidad para detener la reacción. La absorbancia se midió a 450 ntn y 595 nm con un espectrómetro de absorción.

Como un resultado, un polipéptido expuesto en la SEC ID NO: 429 se identificó como una secuencia parcial de CAPRIN-1 reconocida por el anticuerpo anti-CAPRIN-1 de ratón anti-CAPRIN-1 #30; un polipéptido expuesto en la SEC ID NO: 431 se identificó como una secuencia parcial de CAPRIN-1 reconocida por el anticuerpo anti -CAPRIN- 1 de ratón anti-CAPRIN-1 #34; y un polipéptido expuesto en la SEC ID NO: 432 se identificó como una secuencia parcial de CAPRIN- 1 reconocida por mouse anti-CAPRIN-1 anticuerpos #35 y #36. (3) Clonación del gen de dominio variable de cada anticuerpo monoclonal anti -CAPRIN- 1 de ratón Los anticuerpos monoclonales resultantes se analizaron por la secuencia del gen que codifica los dominios variables y sus secuencias de aminoácido de conformidad con el método descrito en ejemplo 5 del documento WO2010/016526.

Los resultados demuestran que el anticuerpo anti-CAPRIN-1 de ratón #30 comprende un dominio variable de cadena pesada que consiste de la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 344 y un dominio variable de cadena ligera que consiste de la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 348. La secuencia del gen que codifica el dominio variable de cadena pesada es expuesta en la SEC ID NO: 349; y la secuencia del gen que codifica el dominio variable de cadena ligera es expuesta en la SEC ID NO: 350. Las CDRs 1 hasta 3 en el dominio variable de cadena pesada consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 341, 342, y 343, respectivamente. Las CDRs 1 hasta 3 en el dominio variable de cadena ligera consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 345, 346, y 347, respectivamente .

Además, los resultados demuestran que el anticuerpo anti-CAPRIN-l de ratón #34 comprende un dominio variable de cadena pesada que consiste de la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 401 y un dominio variable de cadena ligera que consiste de la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 405. La secuencia del gen que codifica el dominio variable de cadena pesada es expuesta en la SEC ID NO: 406; y la secuencia del gen que codifica el dominio variable de cadena ligera es expuesta en la SEC ID NO: 407. Las CDRs 1 hasta 3 en el dominio variable de cadena pesada consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 398, 399, y 400, respectivamente. Las CDRs 1 hasta 3 en el dominio variable de cadena ligera consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 402, 403, y 404, respectivamente.

Los resultados demuestran que el anticuerpo anti-CAPRIN-1 de ratón #35 comprende un dominio variable de cadena pesada que consiste de la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 411 y un dominio variable de cadena ligera que consiste de la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 415. La secuencia del gen que codifica el dominio variable de cadena pesada es expuesta en la SEC ID NO: 416; y la secuencia del gen que codifica el dominio variable de cadena ligera es expuesta en la SEC ID NO: 417. Las CDRs 1 hasta 3 en el dominio variable de cadena pesada consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 408, 409, y 410, respectivamente. Las CDRs 1 hasta 3 en el dominio variable de cadena ligera consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 412, 413, y 414, respectivamente.

Los resultados demuestran que el anticuerpo anti-CAPRIN-l de ratón #36 comprende un dominio variable de cadena pesada que consiste de la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 421 y un dominio variable de cadena ligera que consiste de la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 425. La secuencia del gen que codifica el dominio variable de cadena pesada es expuesta en la SEC ID NO: 426; y la secuencia del gen que codifica el dominio variable de cadena ligera es expuesta en la SEC ID NO: 427. Las CDRs 1 hasta 3 en el dominio variable de cadena pesada consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 418, 419, y 420, respectivamente. Las CDRs 1 hasta 3 en el dominio variable de cadena ligera consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 422, 423, y 424, respectivamente. (4) Análisis de expresión de la proteína CAPRIN-1 en la superficie de células de cáncer de vesícula biliar usando cada anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de ratón Una línea de célula de cáncer de vesícula biliar humano TGBC14TKB se investigó sí o no una proteína CAPRIN-1 es expresada en la superficie celular. 5xl05 células de la línea de célula de cáncer de vesícula biliar se centrifugaron con un tubo de microcentrifugación de 1.5 mL. Las células se sometieron a reacción con cada anticuerpo anti-CAPRIN-1 de ratón a una concentración final de 20 µ9/p???? seguido se dejó reposar en hielo por 1 hora. Después del lavado con PBS, las células se hicieron reaccionar con un anticuerpo IgG antiratón de cabra etiquetado con Alexa488 diluido 100 veces (manufacturado por life technologies) , seguido se dejó reposar en hielo por 30 horas. Después del lavado con PBS, la intensidad de fluorescencia se midió con FACS Calibur disponible de Becton, Dickinson and Company. Como un control negativo, solamente el anticuerpo secundario se usó en la reacción. Como un resultado, las intensidades de fluorescencia en las células a las cuales el anticuerpo anti-CAPRIN-1 se agregó fueron 35% o más superiores que aquellas en el control en la línea de células de cáncer de vesícula biliar. Esto demuestra que la proteína CAPRIN-1 es expresada en la superficie celular de las líneas de células de cáncer de vesícula biliar.

[Ejemplo 9] Producción de anticuerpos monoclonales de ratón #31 hasta #33 contra la proteína CAPRIN-1 (1) Producción de anticuerpo anti-CAPRIN-1 de ratón #31 Una mezcla de 100 Ug de una proteína CAPRIN-1 humana que comprende la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO : 2 preparada de conformidad con ejemplo 3 del documento WO2010/016526 mezclada con la misma cantidad de adyuvante MPL+TDM (manufacturado por Sigma-Aldrich Co. , LLC.) se usó como una solución de antígeno para un ratón. La solución del antígeno se administró intraperitonealmente a ratones Balb/c de 6 semanas de edad (manufacturado por Japan SLC, Inc.) y se administró además siete veces con intervalos de una semana para completar la inmunización. El bazo se extrajo al tercer día de la última inmunización y se trituró entre dos laminillas de vidrio esterilizadas y se lavó con PBS (-) (manufacturado por Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), seguido por centrifugación a 1500 rpm por 10 minutos para remover el sobrenadante. Este procedimiento se repitió tres veces para obtener células del bazo. Las células del bazo y células de mieloma de ratón SP2/0 resultantes (adquiridas de ATCC) se mezclaron a una relación de 10:1, y una solución de PEG preparada mezclando 200 L de medio RPMI1640 que contiene 10% de FBS y 800 ]i de PEG 1500 (manufacturado por Boehringer Ingelheim GmbH) y calentada a 37°C se agregó a la mezcla resultante, seguido se dejó reposar por 5 minutos para fusión celular. Se realizó centrifugación a 1700 rpm por 5 minutos, y el sobrenadante se removió. Las células se suspendieron en una mezcla de 150 mL de medio RP I1640 (medio de selección HAT) que contiene 15% de FBS y 2% de equivalentes de una solución HAT manufacturada por Gibco, y la suspensión se sembró en 15 placas, las cuales fueron placas de 96 cavidades (manufacturadas por Nunc) , a 100 L por cavidad. La cultivación a 37 °C en 5% de C02 por 7 días proporcionó los hibridomas por fusión de las células del bazo y las células de mieloma.

Se seleccionaron hibridomas usando, como un índice, la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas a una proteína CAPRIN-1. Una solución de 1 µ9/p?. de la proteína CAPRIN-1 preparada por el método descrito en ejemplo 3 del documento WO2010/016526 se agregó a una placa de 96 cavidades a 100 µ?? por cavidad, seguido se dejó reposar a 4°C por 18 horas. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 400 pL de una solución de albúmina de suero bovino (BSA) al 0.5% (manufacturada por Sigma-Aldrich Co. , LLC.) se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 3 horas. La solución se removió, y cada cavidad se lavó con 400 µ?? de PBS-T tres veces, y 100 µ??, del sobrenadante de cultivo de hibridoma preparado anteriormente se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 2 horas. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 100 iL de un anticuerpo IgG anti-ratón etiquetado con HRP (H+L) (manufacturado por life technologies) diluido por 5000 veces con PBS se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 1 hora. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 100 ?? de una solución de sustrato TMB (manufacturado por Thermo Fisher Scientific K.K.) se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar por 15 a 30 minutos para la reacción de color.

Después de la coloración, 100 \iL de ácido sulfúrico 1N se agregaron a cada cavidad para detener la reacción. La absorbancia se midió a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como un resultado, se seleccionaron varios hibridomas que producen anticuerpos que muestran valores de alta absorbancia.

Los hibridomas seleccionados se sembraron en una placa de 96 cavidades a 0.5 células por cavidad y se cultivaron. Después de una semana, los hibridomas que forman colonias únicas se observaron en las cavidades. Las células en las cavidades además se cultivaron, y se seleccionaron hibridomas usando, como un índice, la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas clonados a una proteína CAPRIN-1. Una solución de 1 ug/mL de la proteína CAPRIN-1 preparada por el método descrito en ejemplo 3 del documento WO2010/016526 se agregó a una placa de 96 cavidades a 100 ih por cavidad, seguido se dejó reposar a 4°C por 18 horas. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 400 iL de una solución de BSA al 0.5% se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 3 horas. La solución se removió, y cada cavidad se lavó con 400 pL de PBS-T tres veces, y 100 iL del sobrenadante de cultivo de hibridoma preparado anteriormente se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 2 horas. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 100 ]ih de un anticuerpo IgG anti -ratón etiquetado con HRP (H+L) (manufacturado por Invitrogen Corporation) diluido por 5000 veces con PBS se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 1 hora. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 100 ih de una solución de sustrato TMB (manufacturado por Thermo Fisher Scientific K.K.) se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar por 15 a 30 minutos para la reacción de color. Después de la coloración, 100 µ? de ácido sulfúrico 1N se agregaron a cada cavidad para detener la reacción. La absorbancia se midió a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como un resultado, se obtuvieron 61 hibridomas que producen anticuerpos monoclonales reactivos a la proteína CAPRIN-1.

Subsecuentemente, a partir de los anticuerpos monoclonales resultantes, anticuerpos reactivos a la superficie celular de células de cáncer de mama que expresan CAPRIN-1 se seleccionaron. Específicamente, lxlO6 células de la línea de células de cáncer de mama humano MDA-MB-231V se centrifugaron con un tubo de microcentrifugación de 1.5 mL. A las células se agregaron 100 \il¡ del sobrenadante de cultivo de los hibridomas descritos anteriormente, seguido se dejó reposar en hielo por 1 hora. Después del lavado con PBS, a las células se agregaron un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra etiquetado con FITC (manufacturado por life technologies) diluido por 500 veces con PBS que contiene 0.1% de FBS, seguido se dejó reposar en hielo por 1 hora. Después del lavado con PBS, la intensidad de fluorescencia se midió con FACS Calibur disponible de Becton, Dickinson and Company. De manera separada, se realizó el mismo procedimiento como anteriormente como un control usando suero no tratado de un ratón Balb/c de 6 semanas de edad diluido por 500 veces con un medio de cultivo de hibridoma, en lugar del anticuerpo. Como un resultado, se seleccionó uno del anticuerpo monoclonal de ratón (anticuerpo anti-CAPRIN-1 de ratón #31) que muestra intensidad de fluorescencia superior comparado con el control, es decir, que reacciona con la superficie celular de las células de cáncer de mama. (2) Identificación del epítopo de CAPRIN-1 reconocido por el anticuerpo anti-CAPRIN-1 de ratón #31 La región de epítopo de CAPRIN-1 reconocida se identificó usando anticuerpo monoclonal (anticuerpo anti-CAPRIN-1 de ratón #31) contra CAPRIN-1 reactivos a la superficie celular de células de cáncer obtenidas en el anterior (1) . Los péptidos candidatos (93 péptidos) cada uno que consiste de 12 hasta 16 aminoácidos de la secuencia de aminoácido de la proteína CAPRIN-1 humana se sintetizaron y se disolvieron cada uno a una concentración de 1 mg/mL en DMSO.

Cada péptido se disolvió a una concentración de 30 g/mL en un amortiguador de carbonato de sodio 0.1 M (pH 9.6) . La solución se agregó a una placa de 96 cavidades (manufacturado por Nunc, Producto No. 436006) a 100 pL por cavidad, seguido se dejó reposar a 4°C durante la noche. La solución se removió, y 200 \ih de etanolamina 10 mM/amortiguador de carbonato de sodio 0.1 M (pH 9.6) se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 1 hora. La solución se removió, y cada cavidad se lavó con PBS que contiene 0.5% de Tween 20 (PBST) dos veces para preparar una placa de péptido inmovilizado.

El sobrenadante de cultivo celular que contiene anticuerpo anti-CAPRIN-1 #31 se agregó a la placa en una cantidad de 50 ih por cavidad, seguido por sacudimiento a temperatura ambiente por 1 hora. La solución se removió, y cada cavidad se lavó con PBST tres veces. Subsecuentemente, 50 ih de una solución de anticuerpo secundario que contiene un anticuerpo IgG anti-ratón etiquetado con HRP (manufacturado por life technologies) diluido por 3000 hasta 4000 veces con PBST se agregó a cada cavidad. La solución se removió, y cada cavidad se lavó con PBST seis veces.

Se realizó la reacción de color agregando 100 pL de una solución de sustrato TMB (manufacturado por Thermo Fisher Scientific K.K.) a cada cavidad y dejando reposar la mezcla por 15 a 30 minutos. Después de la coloración, 100 ih de ácido sulfúrico 1N se agregaron a cada cavidad para detener la reacción. La absorbancia se midió a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción.

Como un resultado, un polipéptido expuesto en la SEC ID NO: 430 se identificó como una secuencia parcial de CAPRIN-1 reconocida por el anticuerpo anti -CAPRIN- 1 de ratón anti-CAPRIN-1 #31 preparada en el anterior (1) . (3) Producción de anticuerpos anti-CAPRIN-1 de ratón #32 y #33 Como en el método del anterior (1) , una proteína de fusión de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 430 identificada en el anterior (2) y una proteína portadora, hemocianina de lapa Californiana ( LH) , se usó como un inmunógeno; el inmunógeno se mezcló con la misma cantidad de adyuvante, TiterMax Gold (marca registrada) (CytRx Corp.); y la mezcla se administró intraperitonealmente a cada ratón cuatro veces a intervalos de 7 días a 100 g por una vez. Las células del bazo se extrajeron al tercer día de la última inmunización. Como en el método del anterior (1) , las células del bazo se fusionaron con células de mieloma de ratón para producir hibridomas. Subsecuentemente, se seleccionaron anticuerpos usando, como un índice, la reactividad de los anticuerpos contenidos en el sobrenadante de cultivos de los hibridomas resultantes con una solución de 1 ug/mL de la proteína CAPRIN-1 preparada en el Ejemplo 3 del documento WO2010/016526 y con una proteína de fusión de la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 5 usada como el inmunógeno y una proteína portadora, BSA. Específicamente, 100 µL de una solución de 1 g/mL de la proteína CAPRIN-1 preparada en el Ejemplo 3 del documento WO2010/016526 y 100 µ-lj de una solución de 30 µg/mL de la proteína de fusión de la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO : 5 y la proteína portadora, BSA, se agregaron a cada cavidad de una placa de 96 cavidades, seguido se dejó reposar a 4°C por 18 horas. Cada cavidad se lavó con PBS-T, y 400 µL de una solución de Bloque Ace (DS Pharma Biomedical Co . , Ltd.) se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 3 horas. La solución se removió, y cada cavidad se lavó con PBS-T, y 100 µL del sobrenadante de cultivo de hibridoma preparado anteriormente se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 2 horas. Cada cavidad se lavó con PBS-T, y 100 µL de un anticuerpo IgG anti-ratón etiquetado con HRP (H+L) (manufacturado por life technologies) diluido por 5000 veces con PBS se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 1 hora. Cada cavidad se lavó con PBS-T, y 100 µL de una solución de sustrato TMB (manufacturado por Thermo Fisher Scientific K.K.) se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar por 5 a 30 minutos para la reacción de color. Después de la coloración, 100 µL de ácido sulfúrico 1N se agregaron a cada cavidad para detener la reacción. La absorbancia se midió a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción.

Como un resultado, se seleccionaron hibridomas que producen anticuerpos que muestran valores de alta absorbancia.

Los hibridomas seleccionados se sembraron en una placa de 96 cavidades a 0.3 células por cavidad y se cultivaron. Después de una semana, los hibridomas que forman colonias únicas se observaron en las cavidades. Las células en las cavidades además se cultivaron, y los hibridomas que producen anticuerpos contra una secuencia parcial de la proteína CAPRIN-1, la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 430, se seleccionaron usando, como un índice, la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas clonados a la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 430.

Anticuerpos monoclonales reactivos a la superficie celular de células de cáncer de mama que expresan CAPRIN-1 se seleccionaron a partir de los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas resultantes. Específicamente, lxlO6 células de la línea de células de cáncer de mama humano MDA-MB-231V se centrifugaron con un tubo de microcentrifugación de 1.5 mL. A las células se agregaron 100 i del sobrenadante de cultivo de los hibridomas descritos anteriormente, seguido se dejó reposar en hielo por 1 hora. Después del lavado con PBS, a las células se agregaron un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra etiquetado con FITC (manufacturado por life technologies) diluido por 500 veces con PBS que contiene 0.1% de FBS, seguido se dejó reposar en hielo por 1 hora. Después del lavado con PBS, la intensidad de fluorescencia se midió con FACS Calibur disponible de Becton, Dickinson and Company. De manera separada, se realizó el mismo procedimiento como anteriormente como un control negativo usando suero no tratado de un ratón Balb/c de 6 semanas de edad diluido por 500 veces con un medio de cultivo de hibridoma en lugar del anticuerpo y usando solamente el anticuerpo secundario en la reacción. Como un resultado, se obtuvieron dos anticuerpos monoclonales de ratón (anticuerpo anti-CAPRIN-1 de ratón #32 y anticuerpo anti-CAPRIN-1 de ratón #33) que muestran intensidad de fluorescencia superior comparada con el control negativo, es decir, que reaccionan en la superficie celular de células de cáncer de mama.

Se investigó sí o no los anticuerpos anti-CAPRIN-1 de ratón resultantes #32 y #33 específicamente reaccionan con un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 430, una secuencia parcial de CAPRIN-1, usada como el inmunógeno. Una solución de 30 g/mL de la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 430 o de una secuencia parcial distinta de la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 430 de CAPRIN-1 en una solución acuosa de carbonato de sodio 0.1 M se agregó a una placa de 96 cavidades por ELISA, Immobilizer Amino (Nunc) , en una cantidad de 100 g/mL, seguido por reacción a 4°C durante la noche para inmovilizar el péptido a la cavidad. Una solución acuosa de carbonato de sodio 0.1 M que contiene 10 mM de etanolamina se agregó a las cavidades de péptido inmovilizado, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 1 hora. La solución en las cavidades se removió. Después del lavado con PBS-T, 400 ih de una solución de Bloque Ace se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 3 horas. La solución en las cavidades se removió. Después del lavado con PBS-T, 50 ih del sobrenadante de cultivo que contiene anti-CAPRIN-31 de ratón #32 o #33 se agregó a cada cavidad, seguido por reacción a temperatura ambiente por 1 hora. Después del lavado con PBS-T, 50 ]ih de un anticuerpo IgG anti-ratón etiquetado con HRP (H+L) (manufacturado por life technologies) diluido por 5000 veces con la solución de Bloque Ace se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 1 hora. Cada cavidad se lavó de manera suficiente con PBS-T, y 100 ih de una solución de sustrato TMB (manufacturado por Thermo Fisher Scientific K.K.) se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar por 5 a 30 minutos para la reacción de color. Después de la coloración, 100 µL de ácido sulfúrico 1N se agregaron a cada cavidad para detener la reacción. La absorbancia se midió a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como un resultado, anticuerpos anti-CAPRIN-1 de ratón #32 y #33 no reaccionan con la secuencia parcial de CAPRIN-1 que no contiene la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 430 y específicamente reacciona solamente con los péptidos que comprenden la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 430. Esto demuestra por lo tanto que el polipéptido expuesto en la SEC ID NO: 430 comprende una región de epítopo para los anticuerpos monoclonales de ratón #32 y #33. (4) Caracterización de anticuerpos anti-CAPRIN-1 de ratón #31 hasta #33 A partir de los anticuerpos anti-CAPRIN-1 de ratón #31 hasta #33 preparados en el anterior (1) y (3) , fragmentos amplificados de los genes que codifican dominios variables se obtuvieron de conformidad con el método descrito en ejemplo 5 del documento WO2010/016526 , y se analizaron las secuencias del gen y las secuencias de aminoácido. La secuencia del gen resultante que codifica el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CAPRIN-1 de ratón #31 es expuesta en la SEC ID NO: 381, y su secuencia de aminoácido es expuesta en la SEC ID NO: 376. La secuencia del gen que codifica el dominio variable de cadena ligera es expuesta en la SEC ID NO: 382, y su secuencia de aminoácido es expuesta en la SEC ID NO: 380. De manera similar, la secuencia del gen resultante que codifica el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CAPRIN-1 de ratón #32 es expuesta en la SEC ID NO: 391, y su secuencia de aminoácido es expuesta en la SEC ID NO: 386. La secuencia del gen que codifica el dominio variable de cadena ligera es expuesta en la SEC ID NO: 392, y su secuencia de aminoácido es expuesta en la SEC ID NO: 390. La secuencia del gen resultante que codifica el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CAPRIN-1 de ratón #33 es expuesta en la SEC ID NO: 397, y su secuencia de aminoácido es expuesta en la SEC ID NO: 396. La secuencia del gen que codifica el dominio variable de cadena ligera es expuesta en la SEC ID NO: 392, y su secuencia de aminoácido es expuesta en la SEC ID NO: 390.

Además, se confirmó que las CDRs 1 hasta 3 en el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CAPRIN-1 de ratón #31 consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 373, 374, y 375, respectivamente, y que las CDRs 1 hasta 3 en el dominio variable de cadena ligera consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 377, 378, y 379, respectivamente. De manera similar, se confirmó que las CDRs 1 hasta 3 en el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CAPRIN-1 de ratón #32 consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 383, 384, y 385, respectivamente, y que las CDRs 1 hasta 3 en el dominio variable de cadena ligera consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 387, 388, y 389, respectivamente. También se confirmó que las CDRs 1 hasta 3 en el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CAPRIN-1 de ratón #33 consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 393, 394, y 395, respectivamente, y que las CDRs 1 hasta 3 en el dominio variable de cadena ligera consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 387, 388, y 389, respectivamente.

[Ejemplo 10] Análisis de expresión de la proteína CAPRIN-l en la superficie de células de cáncer de vesícula biliar usando anticuerpos monoclonales anti -CAPRIN- 1 de ratón #30 hasta #36 Una línea de célula de cáncer de vesícula biliar humano TGBC14TKB se investigó sí o no una proteína CAPRIN-1 es expresada en la superficie celular usando anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 de ratón #30 hasta #36. 5xl05 células de TGBC14TKB se centrifugaron con un tubo de microcentrifugación de 1.5 mL. Las células se sometieron a reacción con cada uno de anticuerpos anti-CAPRIN- 1 de ratón #30 hasta #36 a una concentración final de 20 µg/mL, seguido se dejó reposar en hielo por 1 hora. Después del lavado con PBS, las células se hicieron reaccionar con un anticuerpo IgG anti -ratón de cabra etiquetado con Alexa488 diluido 100 veces (manufacturado por life technologies) , seguido se dejó reposar en hielo por 30 horas. Después del lavado con PBS, la intensidad de fluorescencia se midió con FACS Calibur disponible de Becton, Dickinson and Company. De manera separada, las células se sometieron a reacción con solamente el anticuerpo secundario como un control negativo. Como un resultado, las intensidades de fluorescencia en TGBC14TKB a las cuales anticuerpos monoclonales anti-CAP IN-1 de ratón #30 hasta #36 se agregaron fueron 35% o más superiores que aquellas en el control. Esto demuestra que la proteína CAPRIN-1 es expresada en la superficie de la membrana celular de las líneas de células de cáncer de vesícula biliar.

[Ejemplo 11] Producción de anticuerpo anti-CAPRIN-1 quimérico de humano-ratón Ambas terminales de un fragmento amplificado del gen que comprende el dominio variable de cadena pesada de cada uno de los anticuerpos anti-CAPRIN-1 de ratón #30 hasta #36 se trataron cón enzimas de restricción, y el fragmento se purificó y se insertó en el vector de ADNpc4/my-His (manufacturado por life technologies) que contiene una secuencia líder derivada de un anticuerpo de ratón y el dominio constante de cadena H de IgGi humano que comprende la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 264, de conformidad con un método usual. Ambas terminales de un fragmento amplificado del gen que comprende el dominio variable de cadena ligera de cada uno de los anticuerpos anti-CAPRIN-1 de ratón #30 hasta #36 se trataron con enzimas de restricción, y el fragmento se purificó y se insertó en el vector de ADNpc4/my-His (manufacturado por life technologies) que contiene una secuencia líder derivada de un anticuerpo de ratón y el dominio constante de cadena L de IgGi humano que comprende la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 265, de conformidad con un método usual.

Subsecuentemente, el vector recombinante que contiene el dominio variable de cadena pesada de cualquiera de los anticuerpos anti-CAPRIN-1 de ratón #30 hasta #36 y el vector recombinante que contiene el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo anti-CAPRIN-1 de ratón se introdujeron en células CHO-K1 (obtenidas de Riken Cell Bank) . Específicamente, 2xl05 células CHO-K1 cultivadas en cada cavidad, de una placa de cultivo de 12 cavidades, que contiene 1 mL de medio F12 de Ham (manufacturado por life technologies) que contiene 10% de FBS se lavaron con PBS (-) . A cada cavidad se agregaron 1 mL de medio F12 de Ham fresco que contiene 10% de FBS y una mezcla de 30 uL de QptiMEM (manufacturado por life technologies) que contiene 250 ng de cada uno de los vectores mencionados anteriormente y 30 uL de reactivo de transfección Polyfect (manufacturado por Qiagen) . Las células CH0-K1 introducidas con los vectores recombinantes se cultivaron en medio F12 de Ham que contiene 10% de FBS, 200 µg/mL de Zeocina (manufacturado por life technologies) , y 200 µg/mL de Geneticina (manufacturado por Roche) y entonces se sembraron a una placa de 96 cavidades a 0.5 células por cavidad para producir líneas celulares que producen establemente anticuerpos anti-CAPRIN-1 quiméricos de humano-ratón #30 hasta #36 que comprenden los dominios variables de los anticuerpos anti -CAPRIN- 1 de ratón #30 hasta #36.

Las líneas de células producidas fueron cada una cultivadas a 5xl05 células/mL en un matraz de 150-cm2 que contiene 30 mL de medio OptiCHO libre de suero (manufacturado por life technologies) por 5 días para obtener sobrenadantes de cultivo que contienen anticuerpo anti-CAPRIN- 1 quimérico de humano-ratón #30 hasta #36, respectivamente.

[Ejemplo 12] Actividad antitumoral (actividad de ADCC) de anticuerpos anti-CAPRIN-1 en células de cáncer de vesícula biliar Con el fin de evaluar la intensidad de la citotoxicidad, en células de cáncer de vesícula biliar que expresan CAPRIN- 1 , de los anticuerpos contra péptidos derivados a partir de CAPRIN- 1 expuestas en las SEC ID NOs : 429 a 432, se midió la actividad de ADCC usando anticuerpos anti-CAPRIN-1 quiméricos de humano-ratón #30 hasta #36. lxlO5 células de cada una de la línea de célula de cáncer de vesícula biliar TGBC14TKB se recolectaron en un tubo de microcentrifugación de 50 mL y fueron incubadas con 100 de 51cromo a 37°C por 2 horas. Subsecuentemente, las células se lavaron con medio RPMI 1640 que contiene 10% de suero bovino fetal tres veces. De manera separada, cualquiera de los anticuerpos anti-CAPRIN-1 quiméricos de humano-ratón #30 hasta #36 se agregó a cada cavidad de una placa de fondo en V de 96 cavidades a una concentración final de 5 µ9/p?]1?? y 2xl05 células NK humanas separadas de linfocitos de sangre periférica humana como células efectoras por un método usual se agregaron a cada cavidad. A cada cavidad se agregaron 2xl03 células de cáncer de vesícula biliar con 51cromo preparado anteriormente, y la mezcla se cultivó por 4 horas. La cantidad de 51cromo liberado en el medio después del cultivo, y la citotoxicidad en células de cáncer de vesícula biliar se calculó por la siguiente fórmula de cálculo *: Fórmula *: citotoxicidad (%) = (cantidad de 51cromo liberado a partir de células objetivo en la presencia del anticuerpo contra CAPRIN-1 y linfocitos) / (cantidad de 51cromo liberado a partir de células objetivo en la presencia de ácido clorhídrico 1N) x 100.

Como un resultado, cada anticuerpo anti-CAPRIN-l quimérico de humano-ratón mostró 20% o más actividad en las células de cáncer de vesícula biliar, mientras la actividad de un anticuerpo IgGi humano usado como el control negativo fue menos de 7% en las células de cáncer de vesícula biliar.

[Ejemplo 13] Producción de anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 usando conejo (1) Producción de anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de conejo #1 Una mezcla de 300 g de una proteína de antígeno (CAPRIN-1 humana) mezclada con la misma cantidad de un adyuvante Freund completo se usó como una solución de antígeno para un conejo. En la segunda y subsecuente inmunización, se usó una mezcla con un adyuvante Freund incompleto. La solución del antígeno se administró intraperitonealmente a conejos de 7 semanas de edad y se administró además siete veces con intervalos de cuatro semanas para completar la inmunización. El bazo se extrajo al cuarto día de la última inmunización y se trituró entre dos laminillas de vidrio esterilizadas y se lavó con PBS (-) (manufacturado por Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), seguido por centrifugación a 1500 rpm por 10 minutos para remover el sobrenadante. Este procedimiento se repitió tres veces para obtener células del bazo. Las células del bazo y células de mieloma de conejo resultantes se mezclaron a una relación de 5:1, y una solución de PEG preparada mezclando 200 ÍL de medio IMDM que contiene 10% de FBS y 800 \ih de PEG 1500 (manufacturado por Boehringer Ingelheim GmbH) y calentada a 37°C se agregó a la mezcla resultante, seguido se dejó reposar por 5 minutos para fusión celular. Se realizó centrifugación a 1700 rpm por 5 minutos, y el sobrenadante se removió. Las células se suspendieron en una mezcla de 300 mL de medio IMDM (medio de selección HAT) que contiene 10% de FBS y 2% de equivalentes de una solución HAT manufacturada por Gibco, y la suspensión se sembró a 30 placas, las cuales fueron placas de 96 cavidades (manufacturadas por Nunc) , a 100 por cavidad. La cultivación a 37°C en 5% de C02 por 7 días proporcionó los hibridomas de las células del bazo y las células de mieloma de conejo.

Se seleccionaron hibridomas usando, como un índice, la reactividad de los anticuerpos producidos por los hibridomas a una proteína CAPRIN-1. Una solución de 1 ug/mL de la proteína CAPRIN-1 se agregó a una placa de 96 cavidades a 100 µ?. por cavidad, seguido se dejó reposar a 4°C por 18 horas. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 400 uL de una solución de albúmina de suero bovino (BSA) al 0.5% (manufacturada por Sigma-Aldrich Co., LLC.) se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 3 horas. La solución se removió, y cada cavidad se lavó con 400 µL de PBS-T tres veces, y 100 µL del sobrenadante de cultivo de hibridoma preparado anteriormente se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 2 horas. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 100 uL de un anticuerpo anti-conejo etiquetado con HRP diluido por 5000 veces con PBS se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 1 hora. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 100 µL de una solución de sustrato TMB (manufacturado por Thermo Fisher Scientific K.K.) se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar por 15 a 30 minutos para la reacción de color. Después de la coloración, 100 µL de ácido sulfúrico 1N se agregaron a cada cavidad para detener la reacción. La absorbancia se midió a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como un resultado, se seleccionaron varios hibridomas que producen anticuerpos que muestran valores de alta absorbancia.

Los hibridomas seleccionados se sembraron en una placa de 96 cavidades a 0.5 células por cavidad y se cultivaron. Después de una semana, los hibridomas que forman colonias únicas se observaron en las cavidades. Las células en las cavidades además se cultivaron, y se seleccionaron hibridomas usando, como un índice, la reactividad de los anticuerpos producidos por los hibridomas clonados a una proteína CAPRIN-1. Una solución de 1 µ9/pa^ de la proteína CAPRIN-1 se agregó a una placa de 96 cavidades a 100 µL por cavidad, seguido se dejó reposar a 4°C por 18 horas. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 400 µL de una solución de BSA al 0.5% se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 3 horas. La solución se removió, y cada cavidad se lavó con 400 µL de PBS-T tres veces, y 100 µL del sobrenadante de cultivo de hibridoma preparado anteriormente se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 2 horas. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 100 µL de un anticuerpo IgG anti-conejo etiquetado con HRP diluido por 5000 veces con PBS se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 1 hora. Cada cavidad se lavó con PBS-T tres veces, y 100 µ?? de una solución de sustrato TMB (manufacturado por Thermo Fisher Scientific K.K.) se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar por 15 a 30 minutos para la reacción de color. Después de la coloración, 100 uL de ácido sulfúrico 1N se agregaron a cada cavidad para detener la reacción. La absorbancia se midió a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como un resultado, varias los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales reactivos a la proteína CAPRIN-1 se obtuvieron.

Subsecuentemente, anticuerpos monoclonales reactivos a la superficie celular de células de cáncer que expresan CAPRIN-1 se seleccionaron a partir de los anticuerpos monoclonales de conejo reactivos a la proteína CAPRIN-1. Específicamente, 2xl05 células de la línea de células de cáncer de mama humano MDA-MB-231V y de la línea de células de cáncer de pulmón humano QG56 se centrifugaron con un tubo de microcentrifugación de 1.5 mL. A las células se agregaron 100 µ?. del sobrenadante de cultivo de los hibridomas descritos anteriormente, seguido se dejó reposar en hielo por 1 hora. Después del lavado con PBS, a las células se agregaron un anticuerpo IgG anti-conejo etiquetado con FITC (H+L) o IgG anti-conejo etiquetado con Alexa488 (H+L) diluido por 100 veces con PBS (-) que contiene 0.05% de FBS, seguido se dejó reposar en hielo por 1 hora. Después del lavado con PBS, la intensidad de fluorescencia se midió con FACS Calibur disponible de Becton, Dickinson and Company. De manera separada, se realizó el mismo procedimiento como anteriormente usando un medio de cultivo de hibridoma para preparar una muestra de control negativo. Como un resultado, se seleccionó un anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de conejo (anticuerpo monoclonal anti -CAPRIN- 1 de conejo #1) que muestra intensidad de fluorescencia superior comparada con el control negativo, es decir, que reacciona en la superficie celular de líneas de células de cáncer MDA-MB-231 y QG56 que expresan CAPRIN- 1.

Subsecuentemente, se identificó el epítopo de CAPRIN- 1 reconocido por el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de conejo seleccionado #1. Los péptidos candidatos (93 péptidos) cada uno que consiste de 12 hasta 16 aminoácidos de la secuencia de aminoácido de la proteína CAPRIN- 1 humana se sintetizaron y se disolvieron cada uno a una concentración de 1 mg/mL en DMSO. Cada péptido se disolvió a una concentración de 30 g/mL en un amortiguador de carbonato de sodio 0.1 M (pH 9.6) . La solución se agregó a una placa de 96 cavidades (manufacturado por Nunc, Producto No. 436006) a 100 ]i por cavidad, seguido se dejó reposar a 4°C durante la noche. La solución se removió, y 200 µL de etanolamina 10 mM/amortiguador de carbonato de sodio 0.1 M (pH 9.6) se agregó a cada cavidad, seguido se dejó reposar a temperatura ambiente por 1 hora. La solución se removió, y cada cavidad se lavó con PBS que contiene 0.5% de Tween 20 (PBST) dos veces para preparar una placa de péptido inmovilizado. Para confirmación, esta placa también se proporcionó con una cavidad a la cual la proteína CAPRIN-1 se inmovilizó de conformidad con el método descrito anteriormente. El anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de conejo #1 purificado a una concentración de 0.1 µ9/p?11 por un método usual se agregó a la placa en una cantidad de 50 µ]1? por cavidad, seguido por sacudimiento a temperatura ambiente por 1 hora. La solución se removió, y cada cavidad se lavó con PBST tres veces. Subsecuentemente, 50 µ?? de una solución de anticuerpo secundario que contiene un anticuerpo IgG anti -conejo etiquetado con HRP diluido por 3000 hasta 4000 veces con PBST se agregó a cada cavidad. La solución se removió, y cada cavidad se lavó con PBST seis veces. Se realizó la reacción de color agregando 100 µL de una solución de sustrato TMB (manufacturado por Thermo Fisher Scientific K.K.) a cada cavidad y dejando reposar la mezcla por 15 a 30 minutos. Después de la coloración, 100 µL de ácido sulfúrico 1N se agregaron a cada cavidad para detener la reacción. La absorbancia se midió a 450 nm y 595 nm con un espectrómetro de absorción. Como un resultado, el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de conejo, el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de conejo #1 fue reactivo a solamente los polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 430 en 93 péptidos sintetizados como péptidos parciales de CAPRIN-1 y no fue reactivo a otros polipéptidos . Además, el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de conejo #1 fue específicamente reactivo a la proteína CAPRIN-1. Este resultado demuestra que un epítopo para el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de conejo #1 está contenidos en el polipéptido expuesto en la SEC ID NO: 430.

Subsecuentemente, a partir del anticuerpo monoclonal anti -CAPRIN- 1 de conejo #1 preparado anteriormente, un fragmento amplificado del gen que codifica el dominio variable se obtuvo de conformidad con el método descrito en ejemplo 5 del documento WO2010/016526 , y la secuencia del gen y la secuencia de aminoácido fueron analizadas. Específicamente, el ARNm se extrajo a partir del hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de conejo #1, y los genes del dominio variable de cadena pesada (VH) y el dominio variable de cadena ligera (VL) del anticuerpo se obtuvieron por RT-PCR usando cebadores específicos a las secuencias de dominio variable de conejo. Con el fin de determinar la secuencia, los genes fueron clonados en vectores pCR2.1 (manufacturado por life technologies) . Las secuencias del gen del dominio VH y el dominio VL en cada plásmido preparado por clonación, fueron determinadas usando cebador delantero M13 y cebador inverso M13 con un secuenciador de fluorescencia.

Los resultados demuestran que el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de conejo resultante #1 comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 359 en el cual las CDRs 1 hasta 3 consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 351, 352, y 353, respectivamente, y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 361 en el cual las CDRs 1 hasta 3 consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 354, 355, y 356, respectivamente. (2) Producción de anticuerpo anti-CAPRIN-1 quimérico de humano-conejo #1 El gen expuesto en la SEC ID NO: 358 para expresar el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de conejo #1 preparado anteriormente y el gen expuesto en la SEC ID NO: 360 para expresar el dominio variable de cadena ligera fueron respectivamente insertados en un vector de expresión de células de mamífero que contiene un domino constante de cadena pesada IgGi humano y un vector de expresión de células de mamífero que contiene un dominio constante de cadena ligera IgGi. Se obtuvo un sobrenadante de cultivo que contiene anticuerpo anti-CAPRIN-1 quimérico de humano-conejo #1 humanizado introduciendo los dos vectores de expresión recombinantes producidos en células de mamífero de conformidad con un método usual. (3) Especificidad del antígeno, reactividad con células de cáncer, y actividad antitumoral del anticuerpo anti -CAPRIN- 1 quimérico de humano-conejo #1 El anticuerpo anti-CAPRIN-1 quimérico de humano-conejo #1 contenido en el sobrenadante de cultivo preparado en el anterior (2) se purificó usando Sefarosa FF de Proteína A Hitrap (manufacturado por GE Healthcare Bio-Sciences) de conformidad con un método usual, sustituido con PBS (-), y se filtró a través de un filtro de 0.22 µp? (manufacturado por Millipore Corporation) , y se usó para investigación de la especificidad del antígeno, reactividad con células de cáncer, y efecto antitumoral.

Primero, como en el anterior (1) , se investigó la especificidad de la reacción del anticuerpo anti-CAPRIN-1 quimérico de humano-conejo #1 en la proteína CAPRIN-1 y un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 430, la cual es el epítopo para el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de conejo #1. Los resultados demuestran que anticuerpo anti-CAPRIN-1 quimérico de humano-conejo #1 tiene especificidad de reacción en la proteína CAPRIN-1 y el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 430, como en el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de conejo #1.

Después, se investigó la reactividad de anticuerpo anti-CAPRIN-1 quimérico de humano-conejo #1 hasta la proteína CAPRIN-1 en la superficie celular de la línea de célula de cáncer de vesícula biliar TGBC14TKB. lxlO6 células de cada línea celular se centrifugaron con un tubo de microcentrifugación de 1.5 mL. A las células se agregaron el sobrenadante de cultivo celular (100 L) que contiene el anticuerpo, seguido se dejó reposar en hielo por 1 hora. Después del lavado con PBS, a las células se agregaron un anticuerpo IgG anti-humano de cabra etiquetado con Alexa488 (H+L) (manufacturado por life technologies) diluido por 100 veces con PBS que contiene 0.1% de FBS, seguido se dejó reposar a 4°C por 60 minutos. Después del lavado con PBS (-), la intensidad de fluorescencia se midió con FACS Calibur disponible de Becton, Dickinson and Company. De manera separada, las células se hicieron reaccionar con solamente el anticuerpo secundario como un control negativo. Como un resultado, el anticuerpo anti-CAPRIN-1 quimérico de humano-conejo #1 mostró reactividad superior por 30% o más intensidad de fluorescencia superior comparada con el control negativo. Esto demostró que una parte de la proteína CAPRIN-1 expuesta en la SEC ID NO: 430 fue expresada en la superficie celular de las líneas de células de cáncer humano. El índice de incremento en la intensidad de fluorescencia es representado por el índice de incremento en la intensidad de fluorescencia media (valor MFI) en cada célula y se calcula por la siguiente fórmula de cálculo: índice de incremento en la intensidad de fluorescencia media (índice de incremento en la intensidad de fluorescencia) (%) = ( (valor MFI de células que reaccionan con anticuerpo CAPRIN-1 anti -humano) - (valor MFI de control) )/ (valor MFI de control) X 100.

Además, se evaluó la actividad antitumoral del anticuerpo anti-CAPRIN-1 quimérico de humano-conejo #1 en la línea de célula de cáncer de vesícula biliar TGBC14TKB. lxlO6 células de la línea de célula de cáncer de vesícula biliar se recolectaron en un tubo de microcentrifugación de 50 mL y fueron incubadas con 100 µ?? de 51cromo a 37 °C por 2 horas. Subsecuentemente, las células se lavaron con medio RPMI 1640 que contiene 10% de FBS tres veces para preparar células objetivo. El anticuerpo anti -CAPRIN- 1 quimérico de humano-conejo purificado #1 se agregó a una placa en fondo en V de 96 cavidades a una concentración final de 5 µg/mL. Subsecuentemente, 2xl05 células NK humanas separadas a partir de linfocitos de sangre periférica humana preparada de conformidad con un método usual se agregaron a cada cavidad. 2xl03 células objetivo fueron mezcladas con el anticuerpo en cada cavidad de la placa de fondo en V de 96 cavidades, seguido por cultivación a 37°C en 5% de C02 por 4 horas. Después del cultivo, la cantidad de 51cromo secretado a partir de las células de tumor deterioradas en el sobrenadante de cultivo se midió para calcular la citotoxicidad en las células de cáncer de vesícula biliar por el anticuerpo anti-CAPRIN-1. De manera separada, la reacción se realizó usando un anticuerpo de control de iso-tipo como un control negativo. Como un resultado, el anticuerpo anti-CAPRIN-1 quimérico de humano-conejo #1 mostró actividad antitumoral de 25% o más en las células de cáncer de vesícula biliar, mientras la citotoxicidad en el caso de usar el anticuerpo de control de iso-tipo fue menos de 5% en las células de cáncer de vesícula biliar. Estos resultados revelaron que el anticuerpo contra el péptido derivado de CAPRIN-1 expuesta en la SEC ID NO: 430, el anticuerpo anti-CAPRIN-1 quimérico de humano-conejo #1, mostró actividad antitumoral en las células de cáncer de vesícula biliar que expresan CAPRIN-1 a través de la actividad de ADCC.

[Ejemplo 14] Producción de anticuerpos anti-CAPRIN- 1 humanizados #1 hasta #3 Se produjo un anticuerpo humanizado de anticuerpo anti-CAPRIN-1 de conejo. Con base en la información de la secuencia de aminoácido del dominio variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de conejo #1, la secuencia de nucleótido expuesta en la SEC ID NO: 362 se diseñó de manera que las CDRs 1 hasta 3 en el dominio variable de cadena pesada consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 351, 352, y 357, respectivamente, y que la región de armazón puede expresar un dominio variable de cadena pesada (SEC ID NO: 363) que comprende la secuencia de un anticuerpo humano. La secuencia de nucleótido se insertó en un vector de expresión de células de mamífero que contiene el dominio constante de cadena pesada de IgGi humano. De manera similar, la secuencia de nucleótido expuesta en la SEC ID NO: 364 se diseñó de manera que las CDRs 1 hasta 3 en el dominio variable de cadena ligera consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 354, 355, y 356, respectivamente, y que la región de armazón puede expresar un dominio variable de cadena ligera (SEC ID NO: 365) que comprende la secuencia de un anticuerpo humano. La secuencia de nucleótido se insertó en un vector de expresión de células de mamífero que contiene el dominio constante de cadena ligera de IgGi humano. Los dos vectores de expresión recombinantes fueron introducidos en células de mamífero de conformidad con un método usual para obtener un sobrenadante de cultivo que contiene anticuerpo anti-CAPRIN-1 humanizado #1.

Además, con base en la información de la secuencia de aminoácido del dominio variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de conejo #1, la secuencia de nucleótido expuesta en la SEC ID NO: 367 se diseñó de manera que las CDRs 1 hasta 3 consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 351, 352, y 353, respectivamente, y que la región de armazón puede expresar un dominio variable de cadena pesada (SEC ID NO: 368) que comprende la secuencia de un anticuerpo humano. La secuencia de nucleótido se insertó en un vector de expresión de células de mamífero que contiene el dominio constante de cadena pesada de IgGl humano. De manera similar, la secuencia de nucleótido expuesta en la SEC ID NO: 369 se diseñó de manera que las CDRs 1 hasta 3 en el dominio variable de cadena ligera consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 354, 355, y 356, respectivamente, y que la región de armazón puede expresar un dominio variable de cadena ligera (SEC ID NO: 370) que comprende la secuencia de un anticuerpo humano. La secuencia de nucleótido se insertó en un vector de expresión de células de mamífero que contiene el dominio constante de cadena ligera de IgGl humano. Los dos vectores de expresión recombinantes fueron introducidos en células de mamífero de conformidad con un método usual para obtener un sobrenadante de cultivo que contiene anticuerpo anti-CAPRIN-1 humanizado #2.

Además, con base en la información de la secuencia de aminoácido del dominio variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de conejo #1, la secuencia de nucleótido expuesta en la SEC ID NO: 371 se diseñó de manera que las CDRs 1 hasta 3 consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 351, 352, y 353, respectivamente, y que la región de armazón puede expresar un dominio variable de cadena pesada (SEC ID NO: 372) que comprende la secuencia de un anticuerpo humano. La secuencia de nucleótido se insertó en un vector de expresión de células de mamífero que contiene el dominio constante de cadena pesada de IgGl humano. De manera similar, la secuencia de nucleótido expuesta en la SEC ID NO: 369 se diseñó de manera que las CDRs 1 hasta 3 en el dominio variable de cadena ligera consisten de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 354, 355, y 356, respectivamente, y que la región de armazón puede expresar un dominio variable de cadena ligera (SEC ID NO: 370) que comprende la secuencia de un anticuerpo humano. La secuencia de nucleótido se insertó en un vector de expresión de células de mamífero que contiene el dominio constante de cadena ligera de IgGl humano. Los dos vectores de expresión recombinantes fueron introducidos en células de mamífero de conformidad con un método usual para obtener un sobrenadante de cultivo que contiene anticuerpo anti-CAPRIN-1 humanizado #3.

Especificidad del antígeno, reactividad con células de cáncer, y actividad antitumoral del anticuerpo anti-CAPRIN-1 humanizado Se evaluó la reactividad con CAPRIN-1 de los tres anticuerpos anti-CAPRIN-1 humanizados #1 hasta #3 preparados anteriormente. Como un resultado, la reactividad de estos anticuerpos con la proteína CAPRIN-1, el péptido epítopo expuesto en la SEC ID NO: 430, y líneas de células de cáncer de vesícula biliar fue equivalente con aquella del anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 quimérico de humano-conejo #1. La actividad antitumoral en las líneas de células de cáncer de vesícula biliar de estos tres anticuerpos anti-CAPRIN-1 humanizados también se evaluó. Los resultados demuestran que la actividad antitumoral de cada anticuerpo fue equivalente con aquella del anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 quimérico de humano-conejo #1.

[Ejemplo 15] Análisis de expresión de la proteína CAPRIN-1 en la superficie de células de cáncer de vesícula biliar usando anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 de ratón #23 hasta #29 Como en el Ejemplo 10, la línea de célula de cáncer de vesícula biliar humano TGBC14TKB se investigó sí o no una proteína CAPRIN-1 es expresada en la superficie celular usando anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #23 que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 279 que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 276, 277, y 278, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 283 que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 280, 281, y 282, respectivamente preparada en el documento WO/2013/018894 ; anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #24 que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 279 que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 276, 277, y 278, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 289 que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 286, 287, y 288, respectivamente; anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #25 que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 294 que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 291, 292, y 293, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 298 que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 295, 296, y 297, respectivamente; anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #26 que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 304 que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 301, 302, y 303, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 308 que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 305, 306, y 307, respectivamente preparada en el documento WO/2013/018894 ; anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #27 que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 314 que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 311, 312, y 313, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 318 que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 315, 316, y 317, respectivamente preparada en el documento WO/2013/018891 ,- anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #28 que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 324 que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 321, 322, y 323, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO: 328 que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 325, 326, y 327, respectivamente preparada en el documento O/2013/018889 ; y anticuerpo monoclonal anti- CAPRIN-1 #29 que comprende un dominio variable de cadena pesada expuesta en la SEC ID NO: 334 que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 331, 332, y 333, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera expuesta en la SEC ID NO : 338 que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 335, 336, y 337, respectivamente preparada en el documento WO/2013/018883. Como un resultado, se observó la reactividad con líneas de células de cáncer de vesícula biliar equivalentes a aquellas de los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 de ratón #30 hasta #36 en el Ejemplo 10.

[Ejemplo 16] Actividad antitumoral en células de cáncer de vesícula biliar de anticuerpos anti-CAPRIN-1 quiméricos de humano- atón #23 hasta #29 Líneas celulares que producen establemente anticuerpos anti-CAPRIN-1 quiméricos de humano-ratón #23 hasta #29 respectivamente que tienen los dominios variables de los anticuerpos anti-CAPRIN-1 de ratón #23 hasta #29 descritos en el Ejemplo 15 fueron producidas por un método similar a aquel en el Ejemplo 11 para obtener sobrenadantes de cultivo que contienen anticuerpos anti-CAPRIN-1 quiméricos de humano-ratón #23 hasta #29. Los anticuerpos purificados a partir de los sobrenadantes por un método usual fueron usados para investigación de la actividad antitumoral en células de cáncer de vesícula biliar. Con el fin de evaluar la intensidad de la citotoxicidad en células de cáncer de vesícula biliar que expresan CAPRIN-1, se midió la actividad de ADCC usando anticuerpos anti-CAPRIN-1 quiméricos de humano-ratón #23 hasta #29. La actividad de ADCC en la línea de célula de cáncer de vesícula biliar TGBC14TKB se evaluó por un método similar con aquel en el Ejemplo 12. Como un resultado, cada anticuerpo anti-CAPRIN-1 quimérico de humanóratón mostró 20% o más actividad en la línea de célula de cáncer de vesícula biliar TGBC14TKB, mientras la actividad de un anticuerpo IgGi humano usado como el control negativo fue menos de 9% en las células de cáncer de vesícula biliar.

Aplicabilidad Industrial El anticuerpo de la presente invención es útil para el tratamiento y/o prevención de cáncer de vesícula biliar.

Todas las publicaciones, patentes, y solicitudes de patente citadas en la presente descripción están de este modo incorporadas por referencia en su totalidad.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una composición farmacéutica para tratar y/o prevenir cáncer de vesícula biliar, caracterizada porque comprende, como un ingrediente activo, un anticuerpo o un fragmento del mismo que tiene reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1 que comprende una secuencia de aminoácido expuesta en cualquiera de los números de secuencia incluso a partir de las SEC ID NOs : 2 hasta 30 o una secuencia de aminoácido que tiene una identidad de secuencia de 80% o más con la secuencia de aminoácido, o un fragmento de la proteína CAPRIN-1 que comprende al menos siete residuos de aminoácido consecutivos de la secuencia de aminoácido de la proteína.

2. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el fragmento de la proteína CAPRIN-1 comprende al menos siete residuos de aminoácido consecutivos en la región de las posiciones de residuo de aminoácido de 233 hasta 343, posiciones de residuo de aminoácido de 512 hasta el C-terminal, o posiciones de residuo de aminoácido de 50 hasta 98 de la secuencia de aminoácido expuesta en cualquiera de los números de secuencia incluso a partir de las SEC ID NOs : 2 hasta 30 excluyendo las SEC ID NOs: 6 y 18.

3. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque el fragmento de la proteína CAPRIN-1 comprende al menos siete residuos de aminoácido consecutivos en una secuencia de aminoácido expuesta en la SEC ID NO: 267, SEC ID NO: 429, SEC ID NO: 428, SEC ID NO: 273, SEC ID NO: 266, SEC ID NO: 270, SEC ID NO: 272, SEC ID NO: 269, SEC ID NO: 430, SEC ID NO: 431, o SEC ID NO: 432 o en una secuencia de aminoácido que tiene una identidad de secuencia de 80% o más con cualquiera de las secuencias de aminoácido.

4. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 3, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal.

5. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 4, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de cadena única, o un anticuerpo multiespecífico .

6. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizada porque el anticuerpo o un fragmento de la misma es cualquiera de los siguientes (a) hasta (ao) : (a) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 37, 38, y 39, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3 ) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 41, 42, y 43, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (b) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 47, 48, y 49, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3 ) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 51, 52, y 53, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo,- (c) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 57, 58, y 59, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 61, 62, y 63, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (d) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3 ) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 67, 68, y 69, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3 ) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 71, 72, y 73, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (e) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 77, 78, y 79, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3 ) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 81, 82, y 83, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (f) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 87, 88, y 89, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 91, 92, y 93, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (g) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 97, 98, y 99, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3 ) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 101, 102, y 103, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (h) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 107, 108, y 109, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 111, 112, y 113, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (i) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 117, 118, y 119, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 121, 122, y 123, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (j) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 127, 128, y 129, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 121, 122, y 123, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (k) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 132, 133, y 134, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 136, 137, y 138, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (1) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 142, 143, y 144, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 146, 147, y 148, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (m) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 142, 143, y 144, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 152, 153, y 154, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (n) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 157, 158, y 159, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 161, 162, y 163, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (o) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 167, 168, y 169, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 171, 172, y 173, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (p) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 167, 168, y 169, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 177, 178, y 179, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (q) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 167, 168, y 169, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 182, 183, y 184, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (r) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 167, 168, y 169, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3 ) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 187, 188, y 189, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (s) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 167, 168, y 169, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 192, 193, y 194, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (t) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 197, 198, y 199, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 201, 202, y 203, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (u) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 207, 208, y 209, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 211, 212, y 213, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (v) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 217, 218, y 219, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 221, 222, y 223, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (w) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 227, 228, y 229, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3 ) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 231, 232, y 233, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (x) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 237, 238, y 239, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 241, 242, y 243, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (y) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 247, 248, y 249, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 251, 252, y 253, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (z) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 276, 277, y 278, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 280, 281, y 282, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (aa) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 276, 277, y 278, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 286, 287, y 288, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (ab) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 291, 292, y 293, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 295, 296, y 297, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (ac) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 301, 302, y 303, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 305, 306, y 307, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo,- (ad) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 311, 312, y 313, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 315, 316, y 317, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (ae) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 321, 322, y 323, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 325, 326, y 327, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (af) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 331, 332, y 333, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 335, 336, y 337, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (ag) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 341, 342, y 343, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3 ) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 345, 346, y 347, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (ah) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 351, 352, y 353, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 354, 355, y 356, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (ai) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 351, 352, y 357, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 354, 355, y 356, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (aj) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 373, 374, y 375, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 377, 378, y 379, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (ak) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 383, 384, y 385, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 387, 388, y 389, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (al) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 393, 394, y 395, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 387, 388, y 389, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (am) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 398, 399, y 400, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 402, 403, y 404, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; (an) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 408, 409, respectivamente y 410, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consisten de secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 412, 413, y 414, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo; y (ao) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de com lementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3) que consiste de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs: 418, 419, y 420, respectivamente y un dominio variable de cadena ligera que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) que consiste de las secuencias de aminoácido expuestas en las SEC ID NOs : 422, 423, y 424, respectivamente, o un fragmento del anticuerpo.

7. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 6, caracterizada porque el anticuerpo o un fragmento de la misma es conjugado a un agente antitumoral .

8. Un agente farmacéutico de combinación caracterizado porque comprende la combinación de la composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 7, y una composición farmacéutica que comprende un agente antitumoral.

9. Uso de la composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 7, o el agente farmacéutico de combinación de conformidad con la reivindicación 8, para la manufactura de un medicamento para tratar y/o prevenir cáncer de vesícula biliar.