JP6065590B2 - 癌の治療及び／又は予防用医薬組成物 - Google Patents

Description

本発明は、ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体又はそのフラグメントの、癌の治療及び／又は予防剤などとしての新規な医薬用途に関する。

癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。近年、分子生物学や癌免疫学の進歩によって、癌に特異的に反応する抗体類、細胞障害性Ｔ細胞により認識される癌抗原類、癌抗原をコードする遺伝子類などが同定されており、癌抗原類をターゲットにした特異的癌治療法への期待が高まっている（非特許文献１）。

癌治療法においては、副作用を軽減するため、その抗原として認識されるペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、正常細胞にはほとんど存在せず、癌細胞に特異的に存在していることが望ましい。１９９１年、ベルギー国Ｌｕｄｗｉｇ研究所のＢｏｏｎらは自己癌細胞株と癌反応性Ｔ細胞を用いたｃＤＮＡ発現クローニング法によりＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するヒトメラノーマ抗原ＭＡＧＥ１を単離した（非特許文献２）。その後、癌患者の生体内で自己の癌に反応して産生される抗体が認識する腫瘍抗原を遺伝子の発現クローニングの手法を取り入れて同定する、ＳＥＲＥＸ（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ）法が報告され（非特許文献３及び特許文献１）、この方法により、正常細胞にはほとんど発現がなく、癌に特異的に発現するいくつかの癌抗原が単離されている（非特許文献４〜９）。さらに、その一部をターゲットにして、癌抗原に特異的に反応する免疫細胞を用いた細胞療法や、癌抗原を含むワクチンなどの癌特異的免疫療法の臨床試験が実施されている。

一方、近年、癌細胞上の抗原タンパク質を標的にした、癌を治療するための各種抗体医薬が世の中に台頭してきた。癌特異的治療薬として一定の薬効が得られ注目されているが、標的となる抗原タンパク質の大部分は正常細胞にも発現するものであり、抗体投与の結果、癌細胞だけでなく、抗原が発現する正常細胞も障害されてしまい、その結果生じる副作用が問題になっている。したがって、癌細胞表面に特異的に発現する癌抗原を同定し、それを標的とした抗体を医薬品として使用することができれば、より副作用の少ない抗体医薬による治療が可能になると期待される。

Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ− ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＣＡＰＲＩＮ−１）は、休止期の正常細胞が活性化や細胞分裂を起こす際に発現し、また細胞内でＲＮＡと細胞内ストレス顆粒を形成してｍＲＮＡの輸送、翻訳の制御に関与する細胞内タンパク質として知られていたが、癌細胞の表面に特異的に発現することが見出され、癌治療のための抗体医薬のターゲットとして研究が進められている（特許文献２）。

米国特許第５６９８３９６号 ＷＯ２０１０／０１６５２６

秋吉毅，「癌と化学療法」、１９９７年、第２４巻、ｐ５５１−５１９（癌と化学療法社、日本） Ｂｒｕｇｇｅｎ Ｐ． ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１６４３−１６４７（１９９１） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：１１８１０−１１８１３（１９９５） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７２：９６５−９７１（１９９７） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５８：１０３４−１０４１（１９９８） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２９：６５２−６５８（１９９８） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，１４：７０３−７０８（１９９９） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６：４７６６−４７７２（１９９６） Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ,６：３３−３９：１９９７

本発明の目的は、癌細胞の表面に特異的に発現するＣＡＰＲＩＮ−１を標的とした従来の抗体よりも抗腫瘍活性の優れた抗体を作出し、癌の治療及び／又は予防剤としての用途を提供することである。

本発明は、以下の特徴を有する。

本発明では、配列番号５、６及び７に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号９、１０及び１１に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを提供する。

別の実施形態において、上記抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、又は二重特異抗体である。

本発明では、上記抗体又はそのフラグメントを有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供する。

その実施形態において、上記癌は、乳癌、腎癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、脳腫瘍、胃癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、リンパ腫、線維肉腫、肥満細胞腫又はメラノーマである。

本明細書は本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願2011-171377号の開示内容を包含する。

本発明で用いられるＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体は、癌細胞を障害する。したがって、ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体は癌の治療や予防に有用である。

本発明で用いられるＣＡＰＲＩＮ−１のポリペプチドに対する抗体の抗腫瘍活性は、後述するように、生体内で担癌動物に対する腫瘍増殖の抑制を調べることによって、あるいは、生体外で該ポリペプチドを発現する腫瘍細胞に対して、免疫細胞又は補体を介した細胞障害活性を示すか否かを調べることによって評価することができる。

本発明で用いられるＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体は、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と特異的に結合するモノクローナル抗体である。これらのモノクローナル抗体は、抗腫瘍活性を発揮しうる限りいかなる種類の抗体であってもよく、例えば、ヒト以外の動物抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、ウサギモノクローナル抗体、ニワトリモノクローナル抗体など）、組換え抗体（例えば、合成抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）など)、ヒト抗体、それらの抗体フラグメント(例えば、ＦａｂやＦ（ａｂ’）₂、Ｆｖなど)を含む。これらの抗体及びそのフラグメントは、当業者に公知の方法により調製することが可能である。また、被験者がヒトである場合には、拒絶反応を回避又は抑制するためにヒト抗体又はヒト化抗体であることが望ましい。

前記抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス、例えば、ＩｇＧ，ＩｇＥ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ及びＩｇＹ、又は任意のサブクラス、例えば、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４，ＩｇＡ１，ＩｇＡ２などである。

さらに、前記抗体は、グリコシル化の他に、アセチル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、又はペグ（ＰＥＧ）化などによって修飾されていてもよい。

ここで、「ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と特異的に結合する」とは、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質に特異的に結合し、それ以外のタンパク質と実質的に結合しないことを意味する。

さらにまた、本発明における癌の治療及び／又は予防の対象である被験者は、ヒト、ペット動物、家畜類、競技用動物などの哺乳動物であり、好ましい被験者は、ヒトである。

以下に、本発明に関する抗原の作製、抗体の作製、及び医薬組成物について説明する。

＜抗体作製用抗原の作製＞
本発明で用いられるＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体を取得するための感作抗原として使用されるタンパク質又はその断片は、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリなど、その由来となる動物種には制限されない。ただし、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択することが好ましい。一般的には、哺乳動物由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。例えば、ＣＡＰＲＩＮ−１がヒトＣＡＰＲＩＮ−１の場合、感作抗原としてヒトＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質やその部分ペプチド、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１を発現する細胞などを用いることができる。

ヒトＣＡＰＲＩＮ−１及びそのホモログの塩基配列及びアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）にアクセスし、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７，１９９３；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）を利用することによって入手することができる。

本発明では、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１の塩基配列（配列番号１又は３）又はアミノ酸配列（配列番号２又は４）を基準とした場合、これらのＯＲＦ又は成熟部分の塩基配列又はアミノ酸配列と７０％〜１００％、好ましくは８０％〜１００％、より好ましくは９０％〜１００％、さらに好ましくは９５％〜１００％、例えば、９７％〜１００％、９８％〜１００％、９９％〜１００％又は９９．５％〜１００％の配列同一性を有する配列からなる核酸又はタンパク質がターゲットになる。ここで、「％配列同一性」は、２つの配列を、ギャップを導入するか又はギャップを導入しないで、最大の類似度又は一致度となるようにアラインメント（整列）したとき、アミノ酸（又は塩基）の総数に対する同一アミノ酸（又は塩基）のパーセンテージ（％）を意味する。

ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質の断片は、抗体が認識する最小単位であるエピトープ（抗原決定基）のアミノ酸長から、該タンパク質の全長未満の長さを有する。エピトープは、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、抗原性又は免疫原性を有するポリペプチド断片を指し、その最小単位は、約７〜１２アミノ酸、例えば、８〜１１アミノ酸、からなる。

上記した、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質やその部分ペプチドを含むポリペプチドは、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ―ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法に従って合成することができる（日本生化学会編、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、化学修飾とペプチド合成、東京化学同人（日本）、１９８１年）。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。また、公知の遺伝子工学的手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版，Ａ ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓなど）を用いて、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入し、該宿主細胞中でポリペプチドを生産させることにより、目的とするポリペプチドを得ることができる。

上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法や市販の核酸合成機を用いた常法により、容易に調製することができる。例えば、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子の塩基配列を含むＤＮＡは、ヒト染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した一対のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより調製することができる。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼなど）及びＭｇ^２＋含有ＰＣＲバッファーを用いて、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応行程を１サイクルとして、例えば、３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができるが、これに限定されない。ＰＣＲの手法、条件などについては、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版，Ａ ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（特に第１５章）に記載されている。

また、ＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子の塩基配列やＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質のアミノ酸配列の情報に基づいて、適当なプローブやプライマーを調製し、それを用いてヒトなどのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、所望のＤＮＡを単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質を発現している細胞、器官又は組織から作製することが好ましい。そのような細胞や組織の例は、精巣、白血病、乳癌、リンパ腫、脳腫瘍、肺癌、膵臓癌、大腸癌などの癌又は腫瘍に由来する細胞又は組織である。上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、及び目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９）、Ａｕｓｂｅｌら（上記）などに記載された方法に準じて行うことができる。このようにして得られたＤＮＡから、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質やその部分ペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。

上記宿主細胞としては、上記ポリペプチドを発現可能な細胞であればいかなるものであってもよく、原核細胞の例としては大腸菌など、真核細胞の例としてはサル腎臓細胞ＣＯＳ１、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物細胞、ヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３、マウス胎仔皮膚細胞株ＮＩＨ３Ｔ３、出芽酵母、分裂酵母などの酵母細胞、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。

宿主細胞として原核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、原核細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、マルチクローニングサイト、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子などを有する発現ベクターを用いる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで原核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを原核宿主細胞中で発現させることができる。この際、該ポリペプチドを、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。

宿主細胞として真核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位などを有する真核細胞用発現ベクターを用いる。そのような発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＹＥＳ２などが例示できる。上記と同様に、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで真核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを真核宿主細胞中で発現させることができる。発現ベクターとしてｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１などを用いた場合には、Ｈｉｓタグ（例えば、（Ｈｉｓ）₆〜（Ｈｉｓ）₁₀）、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰなどの各種タグを付加した融合タンパク質として、上記ポリペプチドを発現させることができる。

発現ベクターの宿主細胞への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション、ウイルス感染、リポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合などの周知の方法を用いることができる。

宿主細胞から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられるが、これらに限定されない。

＜抗体の構造＞
抗体は、通常少なくとも２本の重鎖及び２本の軽鎖を含むヘテロ多量体糖タンパク質である。ＩｇＭ以外の免疫グロブリンは、２本の同一の軽（Ｌ）鎖及び２本の同一の重（Ｈ）鎖で構成される約１５０ｋＤａのヘテロ四量体糖タンパク質である。典型的には、それぞれの軽鎖は、１つのジスルフィド共有結合により重鎖に連結されているが、種々の免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は変動する。それぞれの重鎖及び軽鎖は、また鎖内ジスルフィド結合も有する。それぞれの重鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＨ領域）を有し、それにいくつかの定常領域が続く。それぞれ軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ領域）を有し、その反対の端に１つの定常領域を有する。軽鎖の定常領域は、重鎖の最初の定常領域と整列しており、かつ軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列している。抗体の可変ドメインは、特定の領域が相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる特定の可変性を示して抗体に結合特異性を付与する。可変領域の相対的に保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれている。完全な重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ３つのＣＤＲにより連結された４つのＦＲを含む。３つのＣＤＲは、重鎖ではそのＮ末から順にＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２，ＣＤＲＨ３、同様に軽鎖ではＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２，ＣＤＲＬ３と呼ばれている。抗体の抗原への結合特異性には、ＣＤＲＨ３が最も重要である。また、各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって近接した状態で一緒に保持され、他方の鎖からのＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常領域は、抗体が抗原に結合することに直接寄与しないが、種々のエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）への関与、Ｆｃγ受容体への結合を介した食作用、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を介した半減期／クリアランス速度、補体カスケードのＣ１ｑ構成要素を介した補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を示す。

＜抗体の作製＞
本発明における抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体とは、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質の全長又はその断片と免疫学的反応性を有する抗体を意味する。

ここで、「免疫学的反応性」とは、生体内で抗体とＣＡＰＲＩＮ−１抗原とが結合する特性を意味し、このような結合を介して腫瘍を障害（例えば、死滅、抑制又は退縮）する機能、が発揮される。すなわち、本発明で使用される抗体は、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と結合して腫瘍、例えば、乳癌、腎癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、脳腫瘍、胃癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、リンパ腫、線維肉腫、肥満細胞腫又はメラノーマなどを障害することができるならば、その種類を問わない。

以下に、種々のモノクローナル抗体の作製例を示す。

例えば、ＣＡＰＲＩＮ−１を発現する乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３などをマウスに投与して免疫し、同マウスより脾臓を抽出し、細胞を分離の上、該細胞とマウスミエローマ細胞とを融合させ、得られた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、癌細胞増殖抑制作用を持つ抗体を産生するクローンを選択する。癌細胞増殖抑制作用を持つモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを単離し、当該ハイブリドーマを培養し、培養上清から一般的なアフィニティ精製法により抗体を精製することで、調製することが可能である。

モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、例えば、以下のようにしても作製することができる。まず、公知の方法に従って、感作抗原を動物に免疫する。一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水などで適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。

このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付すが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。

前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３Ｕ１（Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１）、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７９）１２３：１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１：１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６：５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８：４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６：２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅＳｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５：１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８：３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７：１３１−１３３）などが好適に使用される。

前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、例えば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３：３−４６）などに準じて行うことができる。

より具体的には、前記細胞融合は、例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）などが使用され、さらに所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシドなどの補助剤を添加使用することもできる。

免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）などの血清補液を併用することもできる。

細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば、平均分子量１０００〜６０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とするハイブリドーマを形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤などを除去する。

このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングを行う。

また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えば、ＥＢウイルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えば、Ｕ２６６（登録番号ＴＩＢ１９６）と融合させ、所望の活性（例えば、細胞増殖抑制活性）を有するヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。

このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。

すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に従って免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。

ここで、ヒト抗体産生マウスとしては、例えば、ＫＭマウス（キリンファーマ／Ｍｅｄａｒｅｘ）及びＸｅｎｏマウス（Ａｍｇｅｎ）が知られている（例えば、国際公開第ＷＯ０２／４３４７８号、同第ＷＯ０２／０９２８１２号など）。このようなマウスをＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質又はその断片で免疫するときには、完全ヒトポリクローナル抗体を血液から得ることができる。また、免疫後のマウスから脾臓細胞を取出し、ミエローマ細胞との融合法によりヒト型モノクローナル抗体を作製することができる。

抗原の調製は、例えば、動物細胞を用いた方法（特表２００７−５３００６８）やバキュロウイルスを用いた方法（例えば、国際公開第ＷＯ９８／４６７７７号など）などに準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミンなどの免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。

さらにまた、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．,Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ， Ｊａｍｅｓ，Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｂｙ ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ ＬＴＤ，１９９０参照）。具体的には、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成する。目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結した後、発現ベクターへ組み込む。又は、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。

前述のように、本発明の抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体は、ヒト以外の動物のモノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、組換え抗体などの様々なモノクローナル抗体であることを特徴とする。

ヒト以外の動物のモノクローナル抗体やヒトモノクローナル抗体は、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質を免疫したヒト以外の動物（例えば、マウス、ヒト抗体産生マウス、ニワトリ、ウサギなど）からの脾細胞とミエローマ細胞との融合によって得られたハイブリドーマを培養することによって作製されうる。

組換え抗体は、前述のように、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、多重特異性抗体などを含む。

キメラ抗体は、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギやニワトリなど）由来の抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域をコードするＤＮＡをそれぞれ、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の定常領域をコードするＤＮＡと連結することによって得られる融合遺伝子を、発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより作製することができる。

具体的には、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体などである。キメラ抗体の作製は、公知の方法を用いて行うことができ、例えば、抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡとヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡとを連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。後述の実施例では、ヒト−マウスキメラ抗体が作製され、抗腫瘍効果が確認された。本モノクローナル抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖可変（ＶＨ）領域と、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変（ＶＬ）領域とを含み、ここで、該ＶＨ領域に配列番号５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ２及び配列番号７のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ３が含まれ、該ＶＬ領域に、配列番号９のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ２及び配列番号１１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ３が含まれる。

ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称される改変抗体である。ヒト化抗体は、免疫動物由来の抗体のＣＤＲを、ヒト抗体の相補性決定領域へ移植することによって構築される。すなわち、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の可変領域をコードするＤＮＡ中のＣＤＲコーディング配列を、それらに対応する、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギやニワトリなど）由来の抗体のＣＤＲコーディング配列と置換したＤＮＡを作製し、それによって得られたＤＮＡをそれぞれ、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の定常領域をコードするＤＮＡと連結して得られる融合遺伝子を発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより作製することができる。

具体的には、例えば、マウス抗体やニワトリ抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ； ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡを、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開第ＥＰ２３９４００号、国際公開第ＷＯ９６／０２５７６号参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ Ｋ． ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３：８５１−８５６）。また、様々なヒト抗体由来のフレームワーク領域に置換してもよい（国際公開第ＷＯ９９／５１７４３号参照）。

ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ Ｋ． ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ,１９９３，５３：８５１−８５６）。

単鎖抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをリンカーを介して直線状に連結された抗体である。単鎖抗体をコードするＤＮＡは、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、リンカーをコードするＤＮＡ、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを結合することによって作製することができる。ここで、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はいずれも、ヒト抗体由来のものであるか、又は、ＣＤＲのみヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギやニワトリなど）由来の抗体のＣＤＲによって置換されたヒト抗体由来のものである。また、リンカーは、１２〜１９アミノ酸からなり、例えば、１５アミノ酸の（Ｇ₄Ｓ）₃（Ｇ． -Ｂ． Ｋｉｍら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２００７， ２０（９）： ４２５−４３２）が挙げられる。

多重特異性抗体は、複数の異なるエピトープと特異的に結合可能な抗体である。例えば、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）の場合には、２つの異なるエピトープと特異的に結合可能である。二重特異性抗体をコードするＤＮＡは、例えば、重鎖可変領域ＡをコードするＤＮＡ、軽鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡ、重鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡ、及び軽鎖可変領域ＡをコードするＤＮＡをこの順序で結合する（ただし、軽鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡと重鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡとは上記のようなリンカーをコードするＤＮＡを介して結合される。）ことによって作製することができる。ここで、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はいずれも、ヒト抗体由来のものであるか、又は、ＣＤＲのみヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギやニワトリなど）由来の抗体のＣＤＲによって置換されたヒト抗体由来のものである。

キメラ抗体やヒト化抗体を作製した後に、可変領域（例えば、ＦＲ）や定常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換などしてもよい。

アミノ酸の置換は、例えば、１５未満、１０未満、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下のアミノ酸、好ましくは１〜５アミノ酸、より好ましくは１又は２アミノ酸、の置換であり、置換抗体は、未置換抗体と機能的に同等であるべきである。置換は、保存的アミノ酸置換が望ましく、これは、電荷、側鎖、極性、芳香族性などの性質の類似するアミノ酸間の置換である。性質の類似したアミノ酸は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン）、無極性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン）、分枝鎖アミノ酸（ロイシン、バリン、イソロイシン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン）などに分類しうる。

抗体修飾物としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの各種分子と結合した抗体を挙げることができる。本発明の抗体修飾物においては、結合される物質は限定されない。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。

ここで「機能的に同等」とは、対象となる抗体が本発明の抗体と同様の生物学的又は生化学的活性、具体的には腫瘍を障害する機能を有すること、ヒトへの適用時に拒絶反応を本質的に起こさないことなどを指す。このような活性としては、例えば、細胞増殖抑制活性、又は結合活性を例示することができる。

あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｇｅｎｅ，１５２:２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ， ＭＪ．， ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１００：４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ． ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：９４４１−９４５６、Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ． ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ，ＨＪ．，（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ．，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８２：４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，８５：２７６３−２７６６）などを用いて、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製することができる。

上記抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体が認識するＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質のエピトープを認識する抗体は、当業者に公知の方法により得ることが可能である。例えば、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体が認識するＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質のエピトープを通常の方法（例えば、エピトープマッピングなど）により決定し、該エピトープに含まれるアミノ酸配列を有するポリペプチドを免疫原として抗体を作製する方法や、通常の方法で作製された抗体のエピトープを決定し、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体とエピトープが同じ抗体を選択する方法などにより得ることができる。

本発明の抗体の親和定数Ｋａ（ｋ_on／ｋ_off）は、好ましくは、少なくとも１０^７Ｍ^−１、少なくとも１０^８Ｍ^−１、少なくとも５×１０^８Ｍ^−１、少なくとも１０^９Ｍ^−１、少なくとも５×１０^９Ｍ^−１、少なくとも１０^１０Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１０Ｍ^−１、少なくとも１０^１１Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１１Ｍ^−１、少なくとも１０^１２Ｍ^−１、又は少なくとも１０^１３Ｍ^−１である。

本発明の抗体は、抗腫瘍剤とコンジュゲートすることができる。抗体と抗腫瘍剤との結合は、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、チオール基などと反応性の基（例えば、コハク酸イミジル基、ホルミル基、２−ピリジルジチオ基、マレイイミジル基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシ基など）をもつスペーサーを介して行うことができる。

抗腫瘍剤の例は、文献などで公知の下記の抗腫瘍剤、すなわち、パクリタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、チオテパ、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、ウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）、アルトレートアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）、ブラタシン、ブラタシノン、カンプトセシン、ブリオスタチン、カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）、クリプトフィシン１、クリプトフィシン８、ドラスタチン、ズオカルマイシン、エレウテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）、スポンジスタチン、クロランブシル、クロロナファジン（ｃｈｌｏＲＮＡｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ダイネマイシン、クロドロネート、エスペラマイシン、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン、アンシタビン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６−アザウリジン（ａｚａｕｒｉｄｉｎｅ）、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）；アンドロゲン類、例えば、カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）、ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）、ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）、エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、エルフォルニチン （ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）、レンチナン、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、アンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｅ）、ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）、ミトキサントロン、モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）、ピラルビシン、ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）、テニュアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎｅ）Ａ、アングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ）、ウレタン、ビンデシン、ダカーバジン、マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ミトブロニトール、ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）、ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）、ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）、ドキセタキセル、クロランブシル、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６−チオグアニン、メルカプトプリン、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、エトポシド、イホスファミド、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）、テニポシド、エダトレキセート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）、ダウノマイシン、アミノプテリン、キセローダ（ｘｅｌｏｄａ）、イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）、イリノテカン、トポイソメラーゼインヒビター、ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、及びそれらの薬学的に許容可能な塩又は誘導体を包含する。

また、本発明の抗体と、抗腫瘍剤を併用投与することで、より高い治療効果を得ることができる。本手法は、ＣＡＰＲＩＮ−１が発現している癌患者に対して、外科的手術前後どちらにおいても適応できる。特に手術後に、従来抗腫瘍剤単独で処置されていたＣＡＰＲＩＮ−１が発現している癌に対して、より高い癌再発防止や生存期間の延長が得られる。

本発明の抗体との併用投与に用いられる抗腫瘍剤の例は、文献などで公知の下記の抗腫瘍剤、すなわち、パクリタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、チオテパ、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、ウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）、アルトレートアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）、ブラタシン、ブラタシノン、カンプトセシン、ブリオスタチン、カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）、クリプトフィシン１、クリプトフィシン８、ドラスタチン、ズオカルマイシン、エレウテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）、スポンジスタチン、クロランブシル、クロロナファジン（ｃｈｌｏＲＮＡｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ダイネマイシン、クロドロネート、エスペラマイシン、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン、アンシタビン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６−アザウリジン（ａｚａｕｒｉｄｉｎｅ）、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）、ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）、ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）、エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、エルフォルニチン （ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）、レンチナン、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、アンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｅ）、ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）、ミトキサントロン、モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）、ピラルビシン、ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）、テニュアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎｅ）Ａ、アングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ）、ウレタン、ビンデシン、ダカーバジン、マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ミトブロニトール、ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）、ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）、ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）、ドキセタキセル、クロランブシル、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６−チオグアニン、メルカプトプリン、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、エトポシド、イホスファミド、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）、テニポシド、エダトレキセート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）、ダウノマイシン、アミノプテリン、キセローダ（ｘｅｌｏｄａ）、イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）、イリノテカン、トポイソメラーゼインヒビター、ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、及びそれらの薬学的に許容可能な（公知の）塩又は（公知の）誘導体を包含する。上記の内、特にシクロホスファミド、パクリタキセル、ドキセタキセル、ビノレルビンが好ましく用いられる。

あるいは、本発明の抗体には、文献などで公知の、^２１１Ａｔ、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^９０Ｙ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１５３Ｓｍ、^２１２Ｂｉ、^３２Ｐ、^１７５Ｌｕ、^１７６Ｌｕなどの放射性同位体を結合することも可能である。放射性同位体は、腫瘍の治療や診断のために有効なものが望ましい。

本発明の抗体は、ＣＡＰＲＩＮ−１と免疫学的反応性を有する抗体、ＣＡＰＲＩＮ−１を特異的に認識する抗体、又は、ＣＡＰＲＩＮ−１と特異的に結合する抗体であって、癌に対する細胞障害活性、又は腫瘍増殖抑制作用、を示す抗体である。該抗体は、それを投与する対象動物において拒絶反応がほとんど又はまったく回避されるような構造をもつ抗体であるべきである。そのよう抗体としては、例えば、対象動物がヒトである場合、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体（例えば、ヒト−マウスキメラ抗体）、単鎖抗体、二重特異性抗体などが挙げられる。これらの抗体は、（１）重鎖及び軽鎖の可変領域がヒト抗体由来のものであるか、（２）重鎖及び軽鎖の可変領域がヒト以外の動物抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）とヒト抗体由来のフレームワーク領域からなるものであるか、又は、（３）重鎖及び軽鎖の可変領域がヒト以外の動物抗体由来のものであり、かつ重鎖及び軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のものである組換え抗体である。好ましい抗体は、（１）又は（２）の抗体である。

これらの組換え抗体は、次のようにして作製することができる。ハイブリドーマなどの抗体産生細胞からヒトＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体（例えば、ヒトモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、ウサギモノクローナル抗体、ニワトリモノクローナル抗体など）をコードするＤＮＡをクローニングし、これを鋳型にして該抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードするＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法などにより作製し、Ｋａｂａｔ ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈＥｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））に基づいて軽鎖及び重鎖の各可変領域の配列又は各ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列を決定する。

さらに、これらの各可変領域をコードするＤＮＡ又は各ＣＤＲをコードするＤＮＡを、遺伝子組換え技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））又はＤＮＡ合成機を用いて作製する。ここで、上記ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、ヒト抗体産生動物（例えば、マウス）にヒトＣＡＰＲＩＮ−１を免疫したのち、該免疫動物から切除した脾細胞とミエローマ細胞とを融合させることによって作製することができる。これとは別に、必要に応じて、遺伝子組換え技術又はＤＮＡ合成機を用いてヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の可変領域及び定常領域をコードするＤＮＡを作製する。

作製された組換えＤＮＡを、１つ又は複数の適当なベクターに組み込み、これを宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入し、（共）発現させることによって組換え抗体を作製することができる（Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ．， ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ．， １９９７ ＷＩＬＥＹ、Ｐ． Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ． Ｄｅａｎ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，２０００ ＯＸＦＯＲＤ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＰＲＥＳＳ；Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ．，１９９３ ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ）。

上記の方法によって作製される本発明の抗体は、例えば、後述の実施例で取得された以下の（ａ）の抗体が挙げられる。

（ａ）配列番号５、６及び７に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号９、１０及び１１に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体（例えば、配列番号８に示すアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１２に示すアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域で構成される抗体）。

ここで、配列番号５、６及び７に示すアミノ酸配列は、マウス抗体重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３であり、また、配列番号９、１０及び１１に示すアミノ酸配列はそれぞれ、マウス抗体軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３である。

また、本発明のヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は多重特異性抗体は、例えば、以下の（ｉ）（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の抗体である。

（ｉ）重鎖の可変領域が配列番号５、６及び７に示すアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号９、１０及び１１に示すアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含む抗体。

（ｉｉ）重鎖の可変領域が配列番号５、６及び７に示すアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含み、かつ、重鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含み、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号９、１０及び１１に示すアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含んでなる抗体。

（ｉｉｉ）重鎖の可変領域が配列番号８に示すアミノ酸配列を含み、かつ、重鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含み、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号１２に示すアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の定常領域がヒト抗体由来に示すアミノ酸配列を含んでなる抗体。

なお、ヒト抗体重鎖及び軽鎖の定常領域及び可変領域の配列は、例えば、ＮＣＢＩ（米国：ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＧｅｎｅなど）から入手可能であり、例えば、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域については、登録番号Ｊ００２２８、ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域については、登録番号Ｊ００２３０、ヒトＩｇＧ３重鎖定常領域については、登録番号Ｘ０３６０４、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域については、登録番号Ｋ０１３１６、ヒト軽鎖κ定常領域については、登録番号Ｖ００５５７、Ｘ６４１３５、Ｘ６４１３３など、ヒト軽鎖λ定常領域については、登録番号Ｘ６４１３２、Ｘ６４１３４などの配列を参照することができる。

上記抗体は、好ましくは、細胞障害活性を有しており、これによって抗腫瘍効果を発揮することができる。

また、上記抗体における重鎖及び軽鎖の可変領域やＣＤＲの特定の配列は、単に例示を目的としたものであり、特定の配列に限定されないことは明らかである。ヒトＣＡＰＲＩＮ−１に対する別のヒト抗体又はヒト以外の動物抗体（例えば、マウス抗体）を産生しうるハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を回収し、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１との免疫学的結合性及び細胞障害活性を指標として目的の抗体であるか否かを判定する。それによって目的のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを識別したのち、上記のとおり、該ハイブリドーマから目的の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを作製し配列決定し、該ＤＮＡを別の抗体の作製のために利用する。

さらに上記抗体は、ＣＡＰＲＩＮ−１を特異的に認識するという特異性を有する限り、上記（ａ）の各抗体の特にフレームワーク領域の配列及び／又は定常領域の配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加があってもよい。ここで数個とは、好ましくは２〜５個、より好ましくは２個又は３個を意味する。

本発明はさらに、本発明の上記抗体をコードするＤＮＡ、上記抗体の重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡ、あるいは、上記抗体の重鎖又は軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡも提供する。そのようなＤＮＡは、例えば、抗体（ａ）の場合、配列番号５、６及び７に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、配列番号９、１０及び１１に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列含む軽鎖可変領域をコードするＤＮＡなどを含む。

これらの配列のＤＮＡによってコードされる相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗体の特異性を決定する領域であるため、抗体のそれ以外の領域（すなわち、定常領域及びフレームワーク領域）をコードする配列は、他の抗体由来の配列であってもよい。ここで他の抗体とは、ヒト以外の生物由来の抗体も含むが、副作用低減の観点からはヒト由来のものが好ましい。すなわち、上記のＤＮＡでは、重鎖及び軽鎖の各フレームワーク領域及び各定常領域をコードする領域がヒト抗体由来の対応アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことが好ましい。

さらに、本発明の抗体をコードするＤＮＡの別の例は、例えば、配列番号８に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、軽鎖可変領域をコードする領域が配列番号１２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡなどである。ここで、配列番号８に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列の例は、配列番号１３に示す塩基配列である。また、配列番号１２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列の例は、配列番号１４に示す塩基配列である。これらのＤＮＡでも、重鎖及び軽鎖の各定常領域をコードする領域がヒト抗体由来の対応アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことが好ましい。

これら抗体のＤＮＡは、例えば、上記の方法又は以下の方法で得ることができる。まず、本発明の抗体に関わるハイブリドーマから、市販のＲＮＡ抽出キットを用いて全ＲＮＡを調製し、ランダムプライマーなどを用いて逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する。次いで既知のマウス抗体重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子の各可変領域において、それぞれ保存されている配列のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲ法によって、抗体をコードするｃＤＮＡを増幅させる。定常領域をコードする配列については、既知の配列をＰＣＲ法で増幅することによって得ることができる。ＤＮＡの塩基配列は、配列決定用プラスミド又はファージに組み込むなどして、常法により決定することができる。

本発明で用いられる抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体によるＣＡＰＲＩＮ−１発現癌細胞に対する抗腫瘍効果は、ＣＡＰＲＩＮ−１発現細胞のエフェクター細胞抗体依存的細胞障害性（ＡＤＣＣ）、及びＣＡＰＲＩＮ−１発現細胞の補体依存的細胞障害性（ＣＤＣ）により起こると考えられる。

また、上記機序による抗腫瘍効果は、癌細胞の細胞表面に発現する抗体が結合する標的分子の数に相関することが知られている（Ｎｉｗａ Ｒ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００５ Ｍａｒ １５；１１（６）：２３２７−２３３６）。癌細胞の細胞表面に発現する標的分子の数は、細胞表面の分子数を測定できる既存の測定キットを用いて調べることが可能である。すなわち、抗体が結合する標的分子の数は、標的分子に対する抗体などを一次抗体として癌細胞に反応させ、予め分子数が知られた検量線ビーズと共に、蛍光標識された抗一次抗体を反応させ、サンプルの平均蛍光強度を測定し、検量線を得て標的分子の数を知ることができる。

したがって、本発明で用いられる抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体の活性評価は、以下実施例に具体的に示されるように、生体外でＣＡＰＲＩＮ−１を発現する癌細胞に対して上記ＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を測定すること、あるいは本発明にある抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体を一次抗体として用いた場合の癌細胞の細胞表面に発現するＣＡＰＲＩＮ−１分子の数を調べることで評価することができる。

本発明で用いられる抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体は、癌細胞上のＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と結合し、上記活性によって、抗腫瘍作用を示すことから、癌の治療又は予防に有用であると考えられる。すなわち本発明は、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体を有効成分とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供する。抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト化抗体にすることが好ましい。

なお、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体と癌細胞表面上のＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質との結合親和性が高い程、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体による、より強い抗腫瘍活性が得られる。したがって、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と高い結合親和性を有する抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体を獲得できれば、より強い抗腫瘍効果が期待でき、癌の治療及び／又は予防を目的とした医薬組成物として適応することが可能になる。高い結合親和性として、前述したように、結合定数（親和定数）Ｋａ（ｋ_on／ｋ_off）が、好ましくは、少なくとも１０^７Ｍ^−１、少なくとも１０^８Ｍ^−１、少なくとも５×１０^８Ｍ^−１、少なくとも１０^９Ｍ^−１、少なくとも５×１０^９Ｍ^−１、少なくとも１０^１０Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１０Ｍ^−１、少なくとも１０^１１Ｍ^−１、少なくとも５×１０^１１Ｍ^−１、少なくとも１０^１２Ｍ^−１、又は、少なくとも１０^１３Ｍ^−１であることが望ましい。

また、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体と結合する癌細胞表面上のＣＡＰＲＩＮ−１分子の数が多い程、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体による、より強い抗腫瘍活性が得られる。抗腫瘍効果を期待するためには、ＣＡＰＲＩＮ−１分子の数は、本発明にある抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体を測定に用いた場合に、該抗体が結合する癌細胞１個当たりのＣＡＰＲＩＮ−１分子の数が１０^４個以上、好ましくは１０^５個以上が望ましい。

＜抗原発現細胞への結合＞
抗体がＣＡＰＲＩＮ−１に結合する能力は、実施例で述べられるような例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、免疫蛍光及びフローサイトメトリー分析などを用いた結合アッセイを利用して特定することができる。

＜免疫組織化学染色＞
ＣＡＰＲＩＮ−１を認識する抗体は、当業者に周知の方法での免疫組織化学により、外科手術の間に患者から得た組織や、自然に又はトランスフェクション後にＣＡＰＲＩＮ−１を発現する細胞系を接種した異種移植組織を担持する動物から得た組織から、パラホルムアルデヒド又はアセトン固定した凍結切片又はパラホルムアルデヒドで固定したパラフィン包埋した組織切片を使用して、ＣＡＰＲＩＮ−１との反応性に関して試験することができる。

免疫組織化学染色のため、ＣＡＰＲＩＮ−１に対して反応性のある抗体を、様々な方法で染色させることができる。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウス抗体、ヤギ抗ニワトリ抗体を反応させることにより、可視化することができる。

＜医薬組成物＞
本発明の癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物の標的は、ＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子を発現する癌（細胞）であれば特に限定されない。

本明細書で使用される「腫瘍」及び「癌」という用語は、悪性新生物を意味し、互換的に使用される。

本発明において対象となる癌としては、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質をコードする遺伝子を発現している癌であり、好ましくは、乳癌、腎癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、脳腫瘍、胃癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、リンパ腫、線維肉腫、肥満細胞腫又はメラノーマである。

これらの特定の癌には、例えば、乳腺癌、複合型乳腺癌、乳腺悪性混合腫瘍、乳管内乳頭状腺癌、肺腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、大細胞癌、神経上皮組織性腫瘍である神経膠腫、脳室上衣腫、神経細胞性腫瘍、胎児型の神経外胚葉性腫瘍、神経鞘腫、神経線維腫、髄膜腫、慢性型リンパ球性白血病、リンパ腫、消化管型リンパ腫、消化器型リンパ腫、小〜中細胞型リンパ腫、盲腸癌、上行結腸癌、下行結腸癌、横行結腸癌、Ｓ状結腸癌、直腸癌、卵巣上皮癌、胚細胞腫瘍、間質細胞腫瘍、膵管癌、浸潤性膵管癌、膵臓癌の腺癌、腺房細胞癌、腺扁平上皮癌、巨細胞腫、膵管内乳頭粘液性腫瘍、粘液性嚢胞腺癌、膵芽腫、漿液性嚢胞腺癌、固体乳頭状癌、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、インスリノーマ、多発性内分泌腺腫症１（Ｗｅｒｍｅｒ症候群）、非機能性島細胞腫、ソマトスタチノーマ、ＶＩＰ産生腫瘍が包含されるが、これらに限定されない。

また、対象となる好ましい被験者は、哺乳動物であり、例えば、霊長類、ペット動物、家畜類、競技用動物などを含む哺乳動物であり、特にヒト、イヌ及びネコが好ましい。

本発明で用いられる抗体を医薬組成物として用いる場合には、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。

注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。

注射用の水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−６０と併用してもよい。

油性液としては、ゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えば、ベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。

投与は、経口又は非経口であり、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身又は局部的に投与することができる。

また、患者の年齢、体重、性別、症状などにより適宜投与方法を選択することができる。抗体又は抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。又は、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重、年齢、性別、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。

本発明の抗体又はそのフラグメントを含む上記の医薬組成物を被験者に投与することによって癌、好ましくは、乳癌、腎癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、脳腫瘍、胃癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、リンパ腫、線維肉腫、肥満細胞腫又はメラノーマを治療及び／又は予防することができる。

さらに、本発明の医薬組成物を、上で例示したような抗腫瘍剤又は抗腫瘍剤を含む医薬組成物と組み合わせて、被験者に併用投与することを含む、癌の治療及び／又は予防方法も本発明に包含される。本発明の抗体又はそのフラグメントと抗腫瘍剤は、同時に、又は、別々に被験者に投与されうる。別々に投与する場合には、いずれの医薬組成物が先であっても又は後であってもよく、それらの投与間隔、投与量、投与経路及び投与回数は、専門医によって適宜選択されうる。同時に投与する別の医薬剤型には、例えば、本発明の抗体又はそのフラグメントと抗腫瘍剤を、薬理学上許容される担体（又は媒体)中で混合し製剤化して得られる医薬組成物も包含されるものとする。また、抗腫瘍剤を含有する上記医薬組成物及び剤型のいずれに対しても、本発明の抗体を含有する医薬組成物及び剤型についての処方、製剤化、投与経路、用量、癌などの説明を適用しうる。

したがって、本発明は、本発明の医薬組成物と、上で例示したような抗腫瘍剤を含む医薬組成物とを含む、癌の治療及び／又は予防のための組み合わせ医薬品も提供する。また、本発明は、本発明の抗体又はそのフラグメントと抗腫瘍剤とを、薬理学上許容される担体とともに含む、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物も提供する。

＜ポリペプチド及びＤＮＡ＞
本発明は更に、上記抗体（ａ）に関わる以下のポリペプチド及びＤＮＡも提供する。

（ｉ）配列番号８及び配列番号１２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、並びに該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、例えば、配列番号１３及び配列番号１４に示す塩基配列を含むＤＮＡ。

（ｉｉ）配列番号５、６及び７に示すアミノ酸配列からなる群から選択される、重鎖ＣＤＲポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡ。

（ｉｉｉ）配列番号９、１０及び１１に示すアミノ酸配列から選択される、軽鎖ＣＤＲポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡ。

これらのポリペプチド及びＤＮＡは、上記のとおり、遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。

＜本発明の要約＞
上で説明した本発明を以下に要約する。

（１）配列番号５、６及び７の相補性決定領域を含む重鎖可変領域と配列番号９、１０及び１１の相補性決定領域を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント。

（２）ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は二重特異性抗体である、（１）に記載の抗体又はそのフラグメント。

（３）抗腫瘍剤とコンジュゲートした、（１）又は（２）に記載の抗体又はそのフラグメント。

（４）配列番号５、６及び７の相補性決定領域を含む重鎖可変領域と配列番号９、１０及び１１の相補性決定領域を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物。

（５）前記癌が乳癌、腎癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、脳腫瘍、胃癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、リンパ腫、線維肉腫、肥満細胞腫又はメラノーマである、（４）に記載の医薬組成物。

（６）（４）又は（５）のいずれかに記載の医薬組成物と、抗腫瘍剤を含む医薬組成物とを含んでなる、癌の治療及び／又は予防のための組み合わせ医薬品。

（７）（１）又は（２）に記載の抗体又はそのフラグメントをコードするＤＮＡ。

（８）（１）〜（３）のいずれかに記載の抗体又はそのフラグメント、（４）又は（５）に記載の医薬組成物、あるいは（６）に記載の組み合わせ医薬品を、被験者に投与することを含む、癌の治療及び／又は予防方法。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの具体例によって制限されないものとする。

＜実施例１ 各組織でのＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子の発現解析＞
ＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子のイヌ及びヒトの正常組織及び各種細胞株における発現をＷＯ２０１０／０１６５２６の実施例１（４）に従ってＲＴ−ＰＣＲ法により調べた。その結果、健常なイヌ組織では精巣に強い発現が見られ、一方イヌ乳癌及び腺癌組織で発現が見られた。さらに、ヒト組織での発現を併せて確認したところ、イヌＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子と同様、正常組織で発現が確認できたのは精巣のみだったが、癌細胞ではヒト乳癌細胞株７種（ＺＲ７５−１、ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７、ＢＴ−２０、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｖ、ＭＲＫ−ｎｕ−１）及び膵臓癌細胞株４種（Ｃａｐａｎ−２、ＭＩＡＰａＣａ−２、Ｐａｎｃ−１、ＢｘＰｃ−３）など、多種類の癌細胞株で発現が検出された。この結果から、ＣＡＰＲＩＮ−１は精巣以外の正常組織では発現が見られず、一方、各種癌細胞株に発現していることが確認された。

＜実施例２ ＣＡＰＲＩＮ−１に対するマウスモノクローナル抗体の作製＞
ＷＯ２０１０／０１６５２６の実施例３で調製した配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質１００μｇを等量のＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバント（シグマ社製）と混合し、これをマウス１匹当たりの抗原溶液とした。抗原溶液を６週齢のＢａｌｂ／ｃｃマウス（日本ＳＬＣ社製）の腹腔内に投与後、１週間毎に７回投与を行い免疫を完了した。最後の免疫から３日後に摘出したそれぞれの脾臓を滅菌した２枚のスライドガラスに挟んで擦り潰し、ＰＢＳ（−）（日水社製）を用いて洗浄し１５００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を除去する操作を３回繰り返して脾臓細胞を得た。得られた脾臓細胞とマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣから購入）とを１０：１の比率にて混和し、そこに３７℃に加温した１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬとＰＥＧ１５００（ベーリンガー社製）８００μＬを混和して調製したＰＥＧ溶液を加えて５分間静置して細胞融合を行った。１７００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去後、Ｇｉｂｃｏ社製のＨＡＴ溶液を２％当量加えた１５％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＨＡＴ選択培地）１５０ｍＬで細胞を懸濁し、９６穴プレート（ヌンク社製）の１ウェル当たり１００μＬずつ、プレート１５枚に播種した。７日間、３７℃、５％ ＣＯ₂の条件で培養することで、脾臓細胞とミエローマ細胞が融合したハイブリドーマを得た。

作製したハイブリドーマが産生する抗体のＣＡＰＲＩＮ−１タンパクに対する結合親和性を指標にハイブリドーマを選抜した。ＷＯ２０１０／０１６５２６の実施例３で調製したＣＡＰＲＩＮ−１タンパク溶液１μｇ／ｍＬを９６穴プレート１ウェル当たりに１００μＬ添加し、４℃にて１８時間静置した。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、０．５％ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）溶液（シグマ社製）を１ウェル当たり４００μＬ添加して室温にて３時間静置した。溶液を除いて、１ウェル当たり４００μＬのＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄後、上記で得られたハイブリドーマの各培養上清を１ウェル当たり１００μＬ添加し、室温にて２時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで各ウェルを３回洗浄した後、ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１ウェル当たり１００μＬ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μＬ添加して１５〜３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μＬ添加して反応を停止させ吸光度計を用いて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、吸光度値が高かった抗体を産生するハイブリドーマを複数個選抜した。

選抜したハイブリドーマを９６穴プレート１ウェル当たりに０．５個となるようにプレートに添加し培養した。１週間後、ウェル中に単一のコロニーを形成しているハイブリドーマが観察された。それらウェルの細胞をさらに培養して、クローニングされたハイブリドーマが産生する抗体のＣＡＰＲＩＮ−１タンパクに対する結合親和性を指標にハイブリドーマを選抜した。ＷＯ２０１０／０１６５２６の実施例３で調製したＣＡＰＲＩＮ−１タンパク溶液１μｇ／ｍＬを９６穴プレート１ウェル当たりに１００μＬ添加し、４℃にて１８時間静置した。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、０．５％ ＢＳＡ溶液を１ウェル当たり４００μＬ添加して室温にて３時間静置した。溶液を除いて、１ウェル当たり４００μＬのＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄後、上記で得られたハイブリドーマの各培養上清を１ウェル当たり１００μＬ添加し、室温にて２時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで各ウェルを３回洗浄後、ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（インビトロジェン社製）を１ウェル当たり１００μＬ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μＬ添加して１５〜３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μＬ添加して反応を停止させ吸光度計を用いて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパクに反応性を示すモノクローナル抗体を産生する１１２個のハイブリドーマ株を得た。

次にそれらモノクローナル抗体の内、ＣＡＰＲＩＮ−１が発現する乳癌細胞の細胞表面に反応性を示すものを選抜した。具体的には、１０^６個のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｖを１．５ｍＬ容のミクロ遠心チューブにて遠心分離し、これに上記各ハイブリドーマの培養上清１００μＬを添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、０．１％ＦＢＳを含むＰＢＳで５００倍希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（インビトロジェン社製）を添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、抗体の代わりに何も処理していない６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの血清をハイブリドーマ培養用培地で５００倍希釈したものを用いて行い、コントロールとした。その結果、コントロールに比べて蛍光強度が強い、すなわち、乳癌細胞の細胞表面に反応するモノクローナル抗体１個（＃１）を選抜した。

＜実施例３ 選抜したモノクローナル抗体の特徴付け＞
実施例２で得られたモノクローナル抗体について、ＷＯ２０１０／０１６５２６の実施例５に記載の方法に従って可変領域をコードする遺伝子配列及びそのアミノ酸配列を解析した。その結果、モノクローナル抗体＃１は配列番号８に示すアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号１２に示すアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域から成るものであった。得られたモノクローナル抗体＃１の重鎖可変領域をコードする遺伝子配列を配列番号１３に、及びアミノ酸配列を配列番号８に、軽鎖可変領域をコードする遺伝子配列を配列番号１４に及びアミノ酸配列を配列番号１２に示す。

すなわち、モノクローナル抗体＃１は配列番号８に示すアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号１２に示すアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域から成り、そのうち、重鎖可変領域中のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号５、配列番号６、配列番号７に示すアミノ酸配列から成り、軽鎖可変領域中のＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号９、配列番号１０、配列番号１１に示すアミノ酸配列から成ることが確認された。

＜実施例４ ヒト−マウスキメラモノクローナル抗体の作製＞
実施例３で得られた、配列番号１３で示す遺伝子配列からなるマウスモノクローナル抗体＃１の重鎖可変領域を含む遺伝子増幅断片の両端を制限酵素処理した後精製し、マウス抗体由来のリーダー配列と配列番号３７を含むヒトＩｇＧ₁のＨ鎖定常領域を既に挿入済みのｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）ベクターへ常法に従って挿入した。また、配列番号１４で示す遺伝子配列からなるマウスモノクローナル抗体＃１の軽鎖可変領域を含む遺伝子増幅断片の両端を制限酵素処理した後、精製し、マウス抗体由来のリーダー配列と配列番号３８を含むヒトＩｇＧ₁のＬ鎖定常領域を既に挿入済みのｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）ベクターへ常法に従って挿入した。

次に、配列番号１３で示されるマウスモノクローナル抗体＃１の重鎖可変領域が挿入された上記組換えベクターと、配列番号１４で示されるマウスモノクローナル抗体＃１の軽鎖可変領域が挿入された上記組換えベクターをＣＨＯ−Ｋ１細胞（理研セルバンクより入手）に導入した。具体的には、１２穴培養プレートの１ウェル当たりに１ｍLの１０％ ＦＢＳを含むＨａｍ’ｓＦ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で培養された２×１０^５個のＣＨＯ−Ｋ１細胞をＰＢＳ（−）で洗浄したのちに、１ウェル当たり１ｍLの１０％ ＦＢＳを含むＨａｍ’ｓＦ１２培地を新たに加えたウェルに３０μLのＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に溶解した上記各ベクター２５０ｎｇとＰｏｌｙｆｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）３０μLとを混合したものを添加した。上記組換えベクターを導入したＣＨＯ−Ｋ１細胞を、２００μｇ／ｍLゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及び２００μｇ／ｍLジェネチシン（ロシュ社製）を添加した１０％ ＦＢＳを含むＨａｍ’ｓＦ１２培地で培養したのち、９６ウェルプレートの１ウェル当たりに０．５個となるように上記組換えベクターを導入したＣＨＯ−Ｋ１細胞を播種して、マウスモノクローナル抗体＃１の可変領域を有するヒト−マウスキメラモノクローナル抗体＃１（＃１）を安定的に産生する細胞株を作製した。

作製した細胞株を１５０ｃｍ^２フラスコを用いて５×１０^５個／ｍLで血清を含まないＯｐｔｉＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）３０ｍLを用いて５日間培養し、ヒト−マウスキメラモノクローナル抗体＃１を含む培養上清を得た。

また、比較抗体として、ＷＯ２０１０／０１６５２６に記載されるマウス由来の抗ＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体で配列番号１５の重鎖可変領域と配列番号１６の軽鎖可変領域から成る比較抗体１、配列番号１７の重鎖可変領域と配列番号１８の軽鎖可変領域から成る比較抗体２、配列番号１９の重鎖可変領域と配列番号２０の軽鎖可変領域から成る比較抗体３、配列番号２１の重鎖可変領域と配列番号２２の軽鎖可変領域から成る比較抗体４、配列番号２３の重鎖可変領域と配列番号２４の軽鎖可変領域から成る比較抗体５、配列番号２５の重鎖可変領域と配列番号２６の軽鎖可変領域から成る比較抗体６、配列番号２７の重鎖可変領域と配列番号２８の軽鎖可変領域から成る比較抗体７、配列番号２９の重鎖可変領域と配列番号３０の軽鎖可変領域から成る比較抗体８、配列番号３１の重鎖可変領域と配列番号３２の軽鎖可変領域から成る比較抗体９、配列番号３３の重鎖可変領域と配列番号３４の軽鎖可変領域から成る比較抗体１０、配列番号３５の重鎖可変領域と配列番号３６の軽鎖可変領域から成る比較抗体１１についても上記と同様にして、ヒト−マウスキメラ比較モノクローナル抗体１〜１１安定的に産生する細胞株を作製し、作製した細胞株を１５０ｃｍ^２フラスコを用いて５×１０^５個／ｍLで血清を含まないＯｐｔｉＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）３０ｍLを用いて５日間培養し、ヒト−マウスキメラ比較抗体１〜１１を含む培養上清を得た。

＜実施例５ 抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃１を用いた各種癌細胞表面でのＣＡＰＲＩＮ−１の発現＞
次にＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子の発現が確認されたヒト乳癌細胞株（ＺＲ７５−１、ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７、ＢＴ−２０、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｖ、ＭＲＫ−ｎｕ−１）、腎癌細胞株（Ｃａｋｉ−１、Ｃａｋｉ−２、Ａ４９８、ＡＣＨＮ）、膀胱癌細胞株（Ｔ２４）、卵巣癌細胞株（ＳＫＯＶ３）、肺癌細胞株（ＱＧ５６、Ａ５４９）、膵臓癌細胞株（Ｃａｐａｎ−２、ＭＩＡＰａＣａ−２）、前立腺癌細胞株（ＰＣ３）、子宮頸癌細胞株（ＳＷ７５６）、線維肉腫細胞株（ＨＴ１０８０）、脳腫瘍細胞株（Ｔ９８Ｇ、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１、ＳＮＢ１９、Ｕ３７３）、胃癌細胞株（ＭＮＫ２８、ＭＮＫ４５）、大腸癌細胞株（ＨＴ２９、Ｌｏｖｏ、ＣａＣｏ２、ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６）、白血病細胞株（ＡＭＬ５）、リンパ腫細胞株（Ｒａｍｏｓ）について、上記実施例４で得られた＃１を含む培養上清を用いて、各細胞の細胞表面上でのＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質の発現を調べた。各細胞株それぞれ５×１０^５細胞を１．５ｍL容のミクロ遠心チューブにて遠心分離した。抗体＃１を含む各細胞培養上清（１００μL）を添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、０．１％ ＦＢＳを含むＰＢＳで希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を添加し、４℃で３０分間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定した。陰性コントロールには二次抗体のみを反応したものを用いた。その結果、抗体＃１を添加した細胞は、陰性コントロールに比べて蛍光強度が３５％以上強かった。このことから、上記ヒト癌細胞株の細胞膜表面上にＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質が発現していることが確認された。なお、上記蛍光強度の増強率は、各細胞における平均蛍光強度（ＭＦＩ値）の増加率にて表され、以下の計算式により算出した。

平均蛍光強度の増加率（蛍光強度の増強率）（％）＝（（抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体を反応させた細胞のＭＦＩ値）−（コントロールＭＦＩ値））÷（コントロールＭＦＩ値）×１００。

＜実施例６ ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体の癌細胞に対する抗腫瘍効果（ＡＤＣＣ活性）＞
上記実施例４で得た、ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体のヒト−マウスキメラモノクローナル抗体＃１が、ＣＡＰＲＩＮ−１を発現する癌細胞を障害することができるかどうかを、ＡＤＣＣ活性を測定することによって検討した。＃１を産生する細胞培養上清をＨｉｔｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製し、ＰＢＳ（−）に置換して０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製）で濾過したものを活性測定用の抗体として用いた。１０^６個のＣＡＰＲＩＮ−１の発現が確認されているヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７、ヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６、ヒト膵臓癌細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２、ヒト腎臓癌細胞株Ｃａｋｉ−２、ヒト肺癌細胞株ＱＧ５６を５０ｍL容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり２×１０^３個ずつ添加して標的細胞とした。これに、上記精製抗体＃１及び上記実施例４で得たヒト−マウスキメラ比較抗体１〜１１をそれぞれ１μｇ添加して、ヒト末梢血リンパ球細胞から定法を用いて分離したヒトＮＫ細胞を含む細胞集団を１穴当たり、２×１０^５個添加して３７℃、５％ ＣＯ₂の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定し、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体による癌細胞に対する細胞障害活性を算出した。陰性コントロールにはアイソタイプコントロール抗体を添加したものを用いた。上記ＮＫ細胞を含んだ細胞は、定法に従って、ヒト末梢血からヒト末梢血単核球細胞分離用の比重分離液Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（シグマアルドリッチ社）を用いて分離したヒト末梢血単核球細胞をＦＩＴＣ蛍光色素が標識された各種抗体（抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２０抗体、抗ヒトＣＤ１９抗体、抗ヒトＣＤ１１ｃ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（ベクトンアンドディッキンソン社））で反応させ、セルソーター（ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ ＳＥ（ベクトンアンドディッキンソン社））を用いて、上記抗体で染まらない細胞集団を分離したものあるいは、ヒトＮＫ細胞分離キット（ミルテニー社製）を用いて分離したものを用いた。癌細胞に対する細胞障害活性の評価の結果、アイソタイプコントロール抗体を用いた場合ならびに比較抗体１〜比較抗体１１を用いた場合の細胞障害活性は、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７、ヒト肺癌細胞株ＱＧ５６、ヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６、ヒト膵臓癌細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２、ヒト腎臓癌細胞株Ｃａｋｉ−２に対してすべて５％未満であったのに対して、抗体＃１抗体は、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７、ヒト肺癌細胞株ＱＧ５６、ヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６、ヒト膵臓癌細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２、ヒト腎臓癌細胞株Ｃａｋｉ−２に対してそれぞれ２１％、１１％、２１％、２７％、２３％の細胞障害活性を示した。同様に、他の癌細胞、乳癌細胞株ＺＲ７５−１、Ｔ４７Ｄ、Ｈｓ５７８Ｔ、ＢＴ−２０、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｖ、ＭＲＫ−ｎｕ−１、グリオーマ細胞株Ｔ９８Ｇ、Ｕ３７３、肺癌細胞株Ａ５４９、腎臓癌細胞株Ｃａｋｉ−１、ＡＣＨＮ、子宮頸癌細胞株ＳＷ７５６、膀胱癌細胞株Ｔ２４、胃癌細胞株ＭＫＮ２８、ＭＫＮ４５、大腸癌細胞株ＳＷ４８０、白血病細胞株ＡＭＬ５及びリンパ腫細胞株Ｒａｍｏｓについて、アイソタイプコントロール抗体を用いた場合ならびに比較抗体１〜比較抗体１１を用いた場合はいずれも４％未満であったのに対し、抗体＃１は１０％以上の細胞障害活性が認められた。以上の結果より、取得したＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体＃１は、ＡＤＣＣ活性によってＣＡＰＲＩＮ−１を発現する癌細胞を障害することが示され、比較抗体１〜比較抗体１１に比べて抗体＃１は、ヒト癌細胞に対して強い細胞障害活性を示すことが明らかになった。

なお、細胞障害活性は、上記のように、本発明で用いられるＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体、リンパ球（ＮＫ細胞を含む集団）細胞及びクロミウム５１を取り込ませた２×１０^３個の各癌細胞株を混合して４時間培養し、培養後培地に放出されたクロミウム５１の量を測定して、以下の計算式により算出した癌細胞株に対する細胞障害活性を示した結果である。

式：細胞障害活性（％）＝ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体及びリンパ球（ＮＫ細胞を含む集団）細胞を加えた際の標的細胞からのクロミウム５１遊離量÷１Ｎ塩酸を加えた標的細胞からのクロミウム５１遊離量×１００。

＜実施例７ マウス生体内における抗ＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体の抗腫瘍効果＞
次に、上記実施例４で得た、ヒト−マウスキメラモノクローナル抗体＃１の担癌マウス生体内における抗腫瘍効果を評価した。使用した抗体は抗体＃１を産生する各細胞の培養上清をカラム精製したものを用いた。同様にして、上記実施例４で作製した抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体のヒト−マウスキメラ比較モノクローナル抗体１〜１１についても担癌マウス生体内における抗腫瘍効果を評価した。

ＣＡＰＲＩＮ−１を発現するヒト由来の癌細胞株を移植した担癌マウスを用いて、＃１の抗体の抗腫瘍効果を検討した。６５匹のＢａｌｂ／ｃヌードマウス（日本ＳＬＣ社製）の背部皮下に、１匹あたり２×１０^６個のヒト膵臓癌細胞株Ｃａｐａｎ−２細胞（ＡＴＣＣより購入）を移植し、腫瘍が直径５ｍｍ程度の大きさになるまで成長させた。前記担癌マウスに＃１の抗体及びヒト−マウスキメラ比較抗体１〜１１をそれぞれ１匹あたり２００μｇ（２００μL）ずつ、１抗体につき５匹に腹腔内投与した。その後、２日間計３回、同量の各抗体を各担癌マウスの腹腔に投与し、毎日腫瘍の大きさを計測し、抗腫瘍効果を観察した。一方、残り５匹の担癌マウスに対して、抗体の代わりにＰＢＳ（−）を投与し、これをコントロール群とした。なお、腫瘍の大きさは、０．５×（長径×短径×短径）の計算式を用いて、体積を算出した。

抗腫瘍効果の観察の結果、ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体＃１を投与した検討群は、抗体投与後２９日目には、同日のコントロール群の腫瘍の大きさを１００％としたときに、６５％にまで腫瘍の増殖が抑えられた。一方、ヒト−マウスキメラ比較抗体１〜１１を投与したマウスは、およそ８５％であった。この結果から、取得したＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体＃１は、ＣＡＰＲＩＮ−１を発現する癌細胞に対して、生体内で抗腫瘍効果を発揮することが示された。また、比較抗体１〜１１に比べて、抗体＃１は生体内でより強い抗腫瘍効果を発揮することが示された。

＜実施例８ 抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃１が認識する各種癌細胞表面でのＣＡＰＲＩＮ−１の分子数＞
ヒト乳癌細胞株（ＺＲ７５−１、ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７、ＢＴ−２０、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｖ、ＭＲＫ−ｎｕ−１）、腎癌細胞株（Ｃａｋｉ−１、Ｃａｋｉ−２、Ａ４９８、ＡＣＨＮ）、膀胱癌細胞株（Ｔ２４）、卵巣癌細胞株（ＳＫＯＶ３）、肺癌細胞株（ＱＧ５６、Ａ５４９）、膵臓癌細胞株（ＭＩＡＰａＣａ−２、Ｃａｐａｎ−２）、前立腺癌細胞株（ＰＣ３）、子宮頸癌細胞株（ＳＷ７５６）、線維肉腫細胞株（ＨＴ１０８０）、脳腫瘍細胞株（Ｔ９８Ｇ、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１、ＳＮＢ１９、Ｕ３７３）、胃癌細胞株（ＭＮＫ２８、ＭＮＫ４５）、大腸癌細胞株（ＨＴ２９、Ｌｏｖｏ、ＣａＣｏ２、ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６）、白血病細胞株（ＡＭＬ５）、リンパ腫細胞株（Ｒａｍｏｓ）について、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃１が認識する各種癌細胞表面でのＣＡＰＲＩＮ−１分子の数を分子数測定キットＱＩＦＩＫＩＴ（ＤＡＫＯ社製）を用いて調べた。同様にして、上記実施例４で作製した抗ＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体である比較抗体１〜比較抗体１１についても各種癌細胞表面でのＣＡＰＲＩＮ−１分子の数を調べた。

添付プロトコールに従い、各細胞株に抗体＃１及び比較抗体１〜比較抗体１１を最終濃度が５μｇ／ｍLとなるようにＰＢＳで希釈し、各細胞株に添加して３０分反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、キットに添付の検量ビーズとともに各細胞株へキットに添付の蛍光標識された二次抗体抗マウスＩｇＧ抗体を添加して氷上で４５分間静置した。各細胞株及び検量ビーズをＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定して平均蛍光強度値（ｍｅａｎ）を得た。また、比較抗体についても同様の測定を行い、ｍｅａｎを得た。陰性コントロールにはアイソタイプコントロール抗体を反応させたものを用い、ｍｅａｎを得た。各平均蛍光強度値（ｍｅａｎ）を用いてキットに添付の方法に従い分子数を算出した。その結果、抗体＃１が認識する各種癌細胞表面でのＣＡＰＲＩＮ−１の分子数は、調べたすべてのヒト癌細胞において、細胞１個当たり１０^５個以上であった。一方比較モノクローナル抗体１〜１１については細胞１個当たり１０^５個より少なかった。

本発明の抗体は、癌の治療及び／又は予防のため有用である。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (7)

1. それぞれ配列番号５、６及び７の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、それぞれ配列番号９、１０及び１１の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメント。
2. ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は多重特異性抗体である、請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。
3. 抗腫瘍剤がコンジュゲートされた、請求項１又は２に記載の抗体又はそのフラグメント。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメントを有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
5. 前記癌が乳癌、腎癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、脳腫瘍、胃癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、リンパ腫、線維肉腫、肥満細胞腫又はメラノーマである、請求項４に記載の医薬組成物。
6. 請求項４又は５に記載の医薬組成物と、抗腫瘍剤を含む医薬組成物とを含んでなる、癌の治療及び／又は予防のための組み合わせ医薬品。
7. 請求項１又は２に記載の抗体又はそのフラグメントをコードするＤＮＡ。