ES2691738T3

ES2691738T3 - Agente farmacéutico para el tratamiento y/o la prevención de cáncer

Info

Publication number: ES2691738T3
Application number: ES11739883.4T
Authority: ES
Inventors: Takayoshi Ido; Fumiyoshi Okano; Yoshinori Narita
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2010-02-04
Filing date: 2011-02-04
Publication date: 2018-11-28
Anticipated expiration: 2031-02-04
Also published as: PL2532367T3; US20120294860A1; JPWO2011096535A1; CA2788720C; KR20120139720A; MX2012008991A; WO2011096535A1; US9180187B2; RU2012137503A; CN102844048A; DK2532367T3; AU2011211700A1; BR112012018943A8; HUE040012T2; EP2532367B1; AU2011211700B2; PT2532367T; EP2532367A4; CA2788720A1; CN109925511A

Abstract

Un medicamento para su uso en un método para el tratamiento y/o la prevención de un cáncer, que comprende un anticuerpo que tiene reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1 que tiene la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las secuencias numeradas pares SEQ ID NO: 2 a 30 y uno o dos o más tipos de agente antitumoral, en donde el anticuerpo y el agente antitumoral o agentes antitumorales se combinan juntos o por separado y en donde el anticuerpo se une específicamente a la región extracelular de una proteína CAPRIN-1 que existe en la superficie de una célula cancerosa y tiene actividad citotóxica celular.

Description

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DESCRIPCION

Agente farmaceutico para el tratamiento y/o la prevencion de cancer Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un medicamento para el tratamiento y/o prevencion de un cancer, caracterizado por la combinacion de un anticuerpo o un fragmento del mismo que tiene reactividad inmunologica con una protelna CAPRIN-1 con un agente antitumoral, y al uso del mismo.

Antecedentes en la tecnica

El cancer es la causa principal de muerte. Las terapias actuales para el cancer comprenden combinaciones de terapia quirurgica principal con terapia de radiacion y quimioterapia. Asimismo, las terapias actuales comprenden la aplicacion de una terapia similar a todos los pacientes que tienen el mismo tipo y el mismo estadio de cancer. En al menos un 40 % de los pacientes, la terapia primaria fracasa y por tanto son sometidos a una serie de otras terapias. Si vuelven a fracasar dichas terapias en estos pacientes, tiene lugar la metastasis del cancer, lo cual tiene como resultado finalmente un aumento de la posibilidad de muerte. Por lo tanto, la terapia de radiacion y quimioterapia actuales no pueden combatir diferentes tipos de canceres ni sirven para pacientes de cancer individuales y la terapia quirurgica en si tambien resulta insuficiente hoy en dla para curar completamente el cancer practicamente en todos los casos.

En todo el mundo han aparecido diversos farmacos de anticuerpo dirigidos a protelnas antlgeno sobre celulas cancerosas para el tratamiento de cancer como una tecnica para superar los problemas descritos de las terapias contra el cancer. Entre los ejemplos concretos se incluyen los siguientes. Se ha demostrado que HERCEPTIN (marca comercial) que comprende como principio activo un anticuerpo monoclonal que se une especlficamente a Her2, cuyas sales fueron aprobadas en 1998 como agente terapeutico para pacientes con cancer de mama recurrente y metastasico, tiene un efecto cllnico tal que HERCEPTIN puede disminuir el Indice de mortalidad de pacientes con cancer de mama metastasico entre los pacientes con cancer de mama metastasico con sobreexpresion de Her2. Asimismo se ha demostrado que HERCEPTIN no causa ningun efecto secundario grave aparte de toxicidad cardlaca en comparacion con quimioterapeutica convencional. Cabe destacar tambien como caracterlstica los efectos terapeuticos del uso combinado de HERCEPTIN con quimoterapeuticos contra cancer de mama que se han demostrado (Bibliografla de patentes 1-3). Sin embargo, la mayorla de las protelnas antigenicas sobre celulas cancerosas a las que se dirigen los farmacos de anticuerpo, como Her2, tambien se expresan en celulas normales, de manera que no solamente las celulas cancerosas sino tambien las celulas normales que expresan antlgenos se danan tambien citotoxicamente a traves de la administration de anticuerpos. Los efectos secundarios resultantes pueden ser causa de preocupacion.

La protelna citoplasmica y asociada a proliferation 1 (CAPRIN-1) se expresa cuando las celulas normales en la fase de reposo se activan o experimentan division celular y es una protelna intracelular conocida por formar granulos de tension intracelular con ARN dentro de las celulas, de manera que participa en el transporte de ARNm y la regulation de traduction. Al mismo tiempo, existen muchos otros nombres que representan CAPRIN-1, como protelna 1 de membrana anclada a GPI o protelna de marcador 1 de superficie de componente de membrana (M11S1), ya que se conocen dichas protelnas por ser protelnas de membrana de la celula. Estos nombres tienen su origen en un informe sobre que la secuencia de genes de CAPRIN-1 es una protelna de membrana que tiene una region de union a GPI y se expresa en celulas de cancer colorrectal (Bibliografla no patente 1). Sin embargo, mas adelante se revelo que la secuencia de genes de CAPRIN-1 que proporciona dicho informe era erronea. Recientemente se ha notificado lo siguiente, es decir la supresion de un solo nucleotido en la secuencia de genes de CAPRIN-1 registrado en el GenBank o similar causa un desplazamiento de marco, de manera que se pierden 80 aminoacidos del termino C, con el resultado de la generation de una aberration (74 aminoacidos) que corresponde a la portion de union a GPI en el informe anterior y, adicionalmente, esta presente otro error 5' de la secuencia de genes, de manera que se perdieron 53 aminoacidos del termino-N (Bibliografla no patente 2). Se ha notificado tambien recientemente que la protelna codificada por la secuencia de genes de CAPRIN-1 registrada en el GenBank o similar no es una protelna de membrana celular (Bibliografla no de patente 2).

Por otra parte, sobre la base del informe de la bibliografla no de patente 1 en cuanto a que CAPRIN-1 es una protelna de membrana celular, las bibliograflas de patente 4 y 5 describen que CAPRIN-1 (como una protelna de membrana celular) con el nombre M11S1 puede utilizarse como diana de una medicina de anticuerpo en la terapia contra el cancer, aunque los ejemplos practicos no describen ningun tratamiento en el que se utilice un anticuerpo contra la protelna. Sin embargo, tal como se notifica en la bibliografla no de patente 2, desde el momento en que se registro la bibliografla de patente 4 hasta la fecha, existe la creencia comun de que CAPRIN-1 no se expresa en la superficie de una celula. El contenido de las bibliograflas de patente 4 y 5 basado solamente en la information incorrecta de que CAPRIN-1 es una protelna de membrana celular no deberlan entenderse claramente como un conocimiento general comun entre las personas especializadas en la materia.

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Bibliograffa de la tecnica anterior

Bibliografla de patente

Bibliografla de patente 1 Publication de patente japonesa (kokai) No. 2006-316040A

Bibliografla de patente 2 Patente estadounidense No. 7485302

Bibliografla de patente 3 Patente estadounidense No. 7449184

Bibliografla de patente 4 Publicacion de patente estadounidense No. 2008/0075722

Bibliografla de patente 5 Publicacion internacional WO2005/100998

Bibliografla no de patente

Bibliografla no de patente 1 J. Biol. Chem., 270: 20717-20723, 1995 Bibliografla no de patente 2 J. Immunol., 172: 2389-2400, 2004

Sumario de la invencion

Problema que se resuelve con la invencion

Los objetivos de la presente invencion son identificar una protelna antlgeno del cancer expresada especlficamente en la superficie de una celula cancerosa, para combinar un anticuerpo dirigido a la protelna antlgeno del cancer con un agente antitumor y proporcionar as! su uso como medicamento para el tratamiento y/o prevention de un cancer.

Medios para resolver el problema

Como resultado de un exhaustivo estudio, los autores de la presente invencion han obtenido ahora un ADNc que codifica una protelna que se une a un anticuerpo que existe en el suero de los perros con cancer de mama a traves del metodo SEREX utilizando tanto genotecas de ADN preparadas de tejidos de testlculo del perro como sueros de perros con cancer de mama. Los autores de la presente invencion han preparado ademas protelnas CAPRIN-1 que tienen secuencias de aminoacidos numeradas pares de SEQ ID NO: 2 a 30 y anticuerpos contra dichas protelnas CAPRIN -1 sobre la base del gen de perro obtenido y los correspondientes genes homologos humano, de ganado, de caballo, de raton y de pollo. Por tanto, los autores de la presente invencion han observado ahora que las protelnas CAPRIN-1 se expresan especlficamente en celulas de canceres, tales como celulas de cancer de mama, tumor cerebral, leucemia, linfoma, cancer de pulmon, cancer de cuello del utero, cancer de vejiga, cancer de esofago, cancer colorrectal, cancer gastrico y cancer renal; y que una portion de la protelna CAPRIN-1 se expresa especlficamente en la superficie de cada celula de cancer. Los autores de la presente invencion han observado por tanto que un anticuerpo o anticuerpos contra la porcion de CAPRIN-1 expresada en la superficie de cada celula cancerosa se combina con un agente antitumoral especlfico, de manera que es posible obtener un significativo efecto terapeutico. Basandose en estos hallazgos, se ha completado la presente invencion, tal como se describe a continuation.

El termino “cancer”, tal como se utiliza en el presente documento se emplea indistintamente con tumor o carcinoma.

La invencion proporciona medicamentos y anticuerpos anti-CAPRIN-1 para su uso en metodos de tratamiento y/o prevencion del cancer, todos tal como se define en las reivindicaciones.

Efecto ventajoso de la invencion

De acuerdo con la presente invencion, se pueden obtener sorprendentes efectos sinergicos de una reduction y regresion del cancer considerable sin detectar efectos secundarios significativos.

Breve descripcion de los dibujos

Fig. 1 muestra los patrones de expresion de genes que codifican protelnas CAPRIN-1 en tejidos normales y llneas celulares de tumor. La Referencia No. 1 indica los patrones de expresion de genes que codifican protelnas CAPRIN-1 y la Referencia No. 2 indica los patrones de expresion de genes GAPDH.

Fig. 2 muestra la citotoxicidad presentada por anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 (No.1 a No.11) que son reactivos con la superficie celular de la llnea celular de cancer de mama MDA-MB-157 que expresa CAPRIN-1. La Referencia No. 3 indica una actividad citotoxica presentada cuando se anadio el anticuerpo monoclonal anti- CAPRIN-1 No.1. La Referencia No. 4 indica una actividad citotoxica presentada cuando se anadio el anticuerpo monoclonal anti-YCAPRIN-1 No. 2. La Referencia No. 5 indica una actividad citotoxica presentada cuando se anadio el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 No. 3. La Referencia No. 6 indica una actividad citotoxica presentada cuando se anadio el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 No. 4. La Referencia No. 7 indica una actividad citotoxica presentada cuando se anadio el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 No. 5. La Referencia No. 8 indica una actividad citotoxica presentada cuando se anadio el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 No. 6. La Referencia No. 9 indica una actividad citotoxica presentada cuando se anadio el anticuerpo monoclonal

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anti-CAPRIN-1 No.7. La Referenda No. 10 indica una actividad citotoxica presentada cuando se anadio el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 No. 8. La Referencia No. 11 indica una actividad citotoxica presentada cuando se anadio el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 No. 9. La Referencia No. 12 indica una actividad citotoxica presentada cuando se anadio el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 No.10, La Referencia No. 13 indica una actividad citotoxica presentada cuando se anadio el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 No. 11. La Referencia No. 14 indica una actividad citotoxica presentada cuando se anadio un anticuerpo monoclonal que es reactivo con la propia protelna CAPRIN-1 pero no es reactivo con la superficie de la celula cancerosa. La Referencia No. 15 indica una actividad citotoxica presentada cuando se anadio PBS en lugar de los anticuerpos. Fig. 3 muestra el efecto anti-tumor obtenido cuando se utilizo ciclofosfamida, un agente antitumoral, en combinacion con un anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 reactivo con la superficie de celulas cancerosas en ratones desnudos, en los que se habla trasplantado una llnea celular de cancer de mama MCF-7 que expresa CAPRIN-1. La Referencia No. 16 indica el tamano de tumor del raton cuando se anadio PBS en lugar de anticuerpo. La Referencia No. 17 indica el tamano de tumor del raton cuando se administro ciclofosfamida. La Referencia No. 18 indica el tamano de tumor del raton cuando se administro el anticuerpo monoclonal anti- CAPRIN-1 No. 2. La Referencia No. 19 indica el tamano de tumor del raton cuando se administraron ciclofosfamida y anticuerpo anti-Her2. La Referencia No. 20 indica el tamano de tumor del raton cuando se administraron ciclofosfamida y el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 No. 2.

Fig. 4 muestra el efecto anti-tumor obtenido cuando se utilizo paclitaxel, un agente antitumoral en combinacion con un anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 que es reactivo con la superficie de celulas cancerosas in ratones desnudos en los que se habla trasplantado la llnea celular de cancer de mama MCF-7 que expresa CAPRIN-1. La Referencia No. 21 indica el tamano de tumor del raton cuando se administro PBS en lugar del anticuerpo. La Referencia No. 22 indica el tamano de tumor del raton cuando se administro paclitaxel. La Referencia No. 23 indica el tamano de tumor del raton cuando se administro el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 No. 2. La Referencia No. 24 indica el tamano de tumor del raton cuando se administraron paclitaxel y anticuerpo anti-Her2. La Referencia No. 25 indica el tamano de tumor del raton cuando se administraron paclitaxel y el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 No. 2.

Fig. 5 muestra el efecto anti-tumoral obtenido cuando se utilizo docetaxel, un agente antitumoral, en combinacion con un anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 reactivo con la superficie de celulas cancerosas en ratones desnudos, en los que se habla trasplantado la llnea celular de cancer de mama MCF-7 que expresa CAPRIN-1. La Referencia No. 26 indica el tamano de tumor del raton cuando se administro PBS en lugar del anticuerpo. La Referencia No. 27 indica el tamano de tumor del raton cuando se administro docetaxel. La Referencia No. 28 indica el tamano de tumor del raton cuando se administro el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 No.2. La Referencia No. 29 indica el tamano de tumor del raton cuando se administraron docetaxel y anticuerpo anti-Her2. La Referencia No. 30 indica el tamano de tumor del raton cuando se administraron docetaxel y el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 No.2.

Fig. 6 muestra el efecto anti-tumoral obtenido cuando se utilizo vinorelbina, un agente antitumoral, en combinacion con un anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 reactivo con la superficie de celulas cancerosas en ratones desnudos, en los que se habla trasplantado la llnea celular de cancer de mama MCF-7 que expresa

CAPRIN-1. La Referencia No. 31 indica el tamano de tumor del raton cuando se anadio PBS en lugar de un

anticuerpo. La Referencia No. 32 indica el tamano de tumor del raton cuando se administro vinorelbina. La Referencia No. 33 indica el tamano de tumor del raton cuando se administro el anticuerpo monoclonal anti- CAPRIN-1 No. 2. La Referencia No. 34 indica el tamano de tumor del raton cuando se administraron vinorelbina y anticuerpo anti-Her2. La Referencia No. 35 indica el tamano de tumor del raton cuando se administraron vinorelbina y el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-I No. 2.

Fig. 7 muestra el efecto anti-tumoral obtenido cuando se utilizo ciclofosfamida, un agente antitumoral, en combinacion con un anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 reactivo con la superficie de celulas cancerosas en ratones desnudos, en los que se habla trasplantado la llnea celular de cancer de mama MCF-7 que expresa CAPRIN-1. La Referencia No. 36 indica el tamano de tumor el raton cuando se administro PBS en lugar de un anticuerpo. La Referencia No. 37 indica el tamano de tumor el raton cuando se administro ciclofosfamida. La

Referencia No. 38 indica el tamano de tumor el raton cuando se administro el anticuerpo monoclonal anti-

CAPRIN-1 No. 9. La Referencia No. 39 indica el tamano de tumor el raton cuando se administro ciclofosfamida y anticuerpo anti-Her2. La Referencia No. 40 indica el tamano de tumor del raton cuando se administraron ciclofosfamida y el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 No. 9.

Fig. 8 muestra el efecto anti-tumoral obtenido cuando se utilizo paclitaxel, un agente antitumoral, en combinacion con un anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 reactivo con la superficie de celulas cancerosas en ratones desnudos, en los que se habla trasplantado la llnea celular de cancer de mama MCF-7 que expresa CAPRIN-1. La Referencia No. 41 indica el tamano de tumor del raton cuando se administro PBS en lugar de un anticuerpo. La Referencia No. 42 indica el tamano de tumor del raton cuando se administro paclitaxel. La Referencia No. 43 indica el tamano de tumor del raton cuando se administro el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 No. 9. La Referencia No. 44 indica el tamano de tumor del raton cuando se administraron paclitaxel y anticuerpo anti-Her2. La Referencia No. 45 indica el tamano de tumor del raton cuando se administraron paclitaxel y el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 No. 9.

Fig. 9 muestra el efecto anti-tumoral obtenido cuando se utilizo docetaxel, un agente antitumoral, en combinacion con un anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 reactivo con la superficie de celulas cancerosas en ratones desnudos, en los que se habla trasplantado la llnea celular de cancer de mama MCF-7 que expresa CAPRIN-1. La Referencia No. 46 indica el tamano de tumor del raton cuando se administro PBS en lugar del anticuerpo. La

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Referenda No. 47 indica el tamano de tumor del raton cuando se administro docetaxel. La Referenda No. 48 indica el tamano de tumor del raton cuando se administro el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 No. 9. La Referencia No. 49 indica el tamano de tumor del raton cuando se administraron docetaxel y anticuerpo anti-Her2. La Referencia No. 50 indica el tamano de tumor del raton cuando se administraron docetaxel y el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 No. 9.

Fig. 10 muestra el efecto anti-tumoral obtenido cuando se utilizo vinorelbina, un agente antitumoral, en combinacion con un anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 reactivo con la superficie de celulas cancerosas en ratones desnudos, en los que se habla trasplantado la llnea celular de cancer de mama MCF-7 MCF-7 que expresa CAPRIN-1. La Referencia No. 51 indica el tamano de tumor del raton cuando se administro PBS en lugar del anticuerpo. La Referencia No. 52 indica el tamano de tumor del raton cuando se administro vinorelbina. La Referencia No. 53 indica el tamano de tumor del raton cuando se administro el anticuerpo monoclonal anti- CAPRIN-1 No. 9. La Referencia No. 54 indica el tamano de tumor del raton cuando se administraron vinorelbina y anticuerpo anti-Her2. La Referencia No. 55 indica el tamano de tumor del raton cuando se administraron vinorelbina y el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 No. 9.

Mejor modo de realizacion de la invencion

Se puede evaluar la actividad anti-tumoral de un anticuerpo contra un polipeptido representado por cualquiera de las secuencias numeradas pares de SEQ ID NO: 2 a 30 utilizadas en la presente invencion examinando la supresion in vivo la supresion del crecimiento de tumor en animales con cancer o examinando si el anticuerpo presenta o no citotoxicidad a traves de inmunocitos o complementos para celulas de tumor que expresan el polipeptido in vitro, tal como se describe mas adelante.

En el contexto, las secuencias de nucleotido de polinucleotidos que codifican protelnas que comprenden las secuencias de aminoacidos numeradas pares (es decir, SEQ ID NO: 2, 4, 6... 28, 30) de SEQ ID NO: 2 a 30 se representan por las secuencias numeradas impares (es decir SEQ ID NO: 1, 3, 5... 27, 29) de SEQ ID NO: 1 a 29.

Las secuencias de aminoacidos que estan representadas por SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, y 14 en el Listado de Secuencias divulgado en el presente documento son las secuencias de aminoacidos de CAPRIN-1 aisladas como polipeptidos, que se unen a anticuerpos que existen especlficamente en el suero de un perro con cancer, a traves del metodo SEREX utilizando una genoteca de ADNc del tejido de los testlculos del perro y el suero de un perro con cancer de mama. Las secuencias de aminoacidos representadas por SEQ ID NO: 2 y 4 son las secuencias de aminoacidos of CAPRIN-1 aisladas como homologos humanos. La secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 16 es la secuencia de aminoacidos de CAPRIN-1 aislada como homologo de ganado. La secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 18 es la secuencia de aminoacido de CAPRIN-1 aislada como un homologo de caballo. Las secuencias de aminoacidos representadas por SEQ ID NO: 20 a 28 son las secuencias de aminoacidos de CAPRIN-1 aisladas como homologos de raton. La secuencia de aminoacido representada por SEQ ID NO: 30 es la secuencia de aminoacido de CAPRIN-1 aislada como un homologo de pollo (vease Ejemplo 1 descrito mas adelante). Se sabe que CAPRIN-1 se expresa cuando se activan o dan lugar a la division celular celulas normales en estado de reposo.

Se pensaba que CAPRIN-1 no se expresa en la superficie de celulas; sin embargo, el estudio realizado por los autores de la invencion ha revelado ahora que una porcion de las protelnas CAPRIN-1 se expresa en la superficie de varias celulas cancerosas. En la presente invencion, se utilizan los anticuerpos que se unen a la porcion de protelna CAPRIN-1 que se va a expresar en la superficie de celulas cancerosas. Un ejemplo de un peptido parcial de la protelna CAPRIN-1, que se expresa en la superficie de celulas cancerosas es un polipeptido que consiste en una secuencia de 7 o mas restos de aminoacido continuos dentro de la region de restos de aminoacido Nos. (aa) 5098 o 233-305 en las secuencias de aminoacidos representadas por las secuencias numeradas pares de SEQ ID NO: 2 a 30 en el listado de secuencias excluyendo SEQ ID NO: 6 y 18. Entre los ejemplos concretos se incluyen las secuencias de aminoacido representadas por SEQ ID NO: 37. Entre los ejemplos de un anticuerpo para su uso en la presente invencion, se incluyen todos los anticuerpos que se unen (especlficamente) a estos peptidos (o que reconocen (especlficamente) estos peptidos o que tienen reactividad inmunologica con estos peptidos) y que presentan actividad anti-tumoral.

El anticuerpo anti-CAPRIN-1 descrito utilizado en la presente invencion puede ser de cualquier tipo de anticuerpo siempre y cuando presente actividad anti-tumoral. Entre los ejemplos de dichos anticuerpos se incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos recombinantes, como anticuerpos sinteticos, anticuerpos multiespeclficos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quimericos y anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos humanos y fragmentos de los mismos como Fab, f(ab')2 y Fv. Estos anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden prepararse a traves de metodos conocidos entre las personas especializadas en la tecnica. En la presente invencion, son deseables los anticuerpos capaces de unirse especlficamente a protelna CAPRIN-1. Preferentemente, son anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos policlonales tambien pueden utilizarse siempre y cuando se puedan producir establemente anticuerpos homogeneos. Asimismo, cuando un sujeto es un ser humano, son deseables anticuerpos humanos o anticuerpos humanizados para evitar o suprimir el rechazo.

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La expresion “que se une especlficamente a protelna CAPRIN-1”, tal como se utiliza en el presente documento se refiere a que se une especlficamente a una protelna CAPRIN-1, pero no se une sustancialmente a otras protelnas distintas a protelna CAPRIN-1.

La actividad anti-tumoral de un anticuerpo que puede utilizarse en la presente invencion puede evaluarse tal como se describe mas adelante examinando in vivo la supresion del crecimiento de tumor en animales con cancer o examinando si presentan o no in vitro una actividad de citotoxicidad, que esta mediada por inmunocitos o complementos, para celulas tumorales que expresan el polipeptido.

Otros ejemplos mas de sujetos para el tratamiento y/o prevencion del cancer en la presente invencion incluyen mamlferos, como seres humanos, animales de companla, animales domesticos y animales de competition. Un sujeto preferente es un ser humano.

A continuation se describe la preparation de antlgenos y anticuerpos medicamentos y similares relativos a la presente invencion.

Las protelnas o fragmentos de las mismas para su uso como antlgenos de sensibilization para obtener anticuerpos anti-CAPRIN-1 utilizados en la presente invencion pueden derivarse de cualquier especie animal sin limitation en particular, como por ejemplo seres humanos, perros, ganado, caballos, ratones, ratas y pollos. Sin embargo, las protelnas o fragmentos de las mismas se seleccionan preferentemente considerando la compatibilidad de las celulas parentales utilizadas para la fusion celular. En general, las protelnas derivadas de mamlferos son preferentes y, en particular, es preferente una protelna derivada de ser humano. Por ejemplo, cuando CAPRIN-1 es humana, es posible utilizar la protelna CAPRIN-1 humana, un peptido parcial de la misma, o las celulas que expresan CAPRIN-1 humana.

Las secuencias de nucleotidos y las secuencias de aminoacidos de CAPRIN-1 humana y sus homologos pueden obtenerse por acceso al GenBank (NCBI, EE.UU) y aplicando un algoritmo como BLAST o FASTA (Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 90: 5873-5877, 1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997).

En la presente divulgation, sobre la base de la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO: 1 o 3) o las secuencias de aminoacido (SEQ ID NO: 2 o 4) de CAPRIN-1 humana, un acido nucleico diana o protelna diana comprende una secuencia que tiene de 70 % a 100 %, preferentemente de 80 % a 100 %, mas preferentemente de 90 % a 100 %, incluso mas preferentemente de 95 % a 100 % (p.ej., 97 % a 100 %, 98 % a 100 %, 99 % a 100 %, o 99,5 % a 100 %) de identidad de secuencia con la secuencia de nucleotidos o la secuencia de aminoacidos del ORF o la portion madura de CAPRIN-1 humana. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion "% de identidad de secuencia" se refiere al porcentaje (%) de aminoacidos (o nucleotidos) identicos en relation con el numero total de aminoacidos (o nucleotidos), cuando se alinean dos secuencias para conseguir la maxima similitud con o sin la introduccion de huecos.

La longitud de un fragmento de protelna CAPRIN-1 oscila entre la longitud del aminoacido de un epltopo (determinante antigenico), que es la unidad minima reconocida por un anticuerpo, y una longitud inferior a la longitud completa de la proteina. El termino “epitopo” se refiere a un fragmento de polipeptido que tiene antigenicidad o inmunogenicidad en mamlferos, preferentemente, en seres humanos y la unidad minima del epitopo consiste en aproximadamente 7 a 12 aminoacidos (continuos) por ejemplo de 8 a 11 aminoacidos (continuos). Entre los ejemplos de secuencia parcial de proteina CAPRIN-1 que se une especlficamente a un anticuerpo se incluye una secuencia parcial que comprende al menos aproximadamente 7 a 12 aminoacidos en las secuencias de aminoacido representadas por la SEQ ID NO: 37.

Los polipeptidos que comprenden la proteina CAPRIN-1 humana mencionada o peptidos parciales de la proteina, puede sintetizarse a traves de un metodo de sintesis quimica, como por ejemplo el metodo Fmoc (metodo fluorenilmetiloxicarbonilo) o el metodo tBoc (metodo t-butiloxicarbonilo) (Editado por la Japanese Biochemical Society, Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimental Lecture Series) 1, Protein Chemistry IV, Chemical Modification y Peptide Synthesis, TOKYO KAGAkU DOZIN (Japon), 1981). Alternativamente, se pueden sintetizar tambien los polipeptidos mencionados a traves de metodos convencionales utilizando diversos sintetizadores de peptidos disponibles en el mercado. Asimismo, aplicando tecnicas de ingenieria genetica conocidas (p.ej. Sambrook et al., Molecular Cloning, 2a Edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3a Edicion, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons), se prepara un polinucleotido que codifica el polipeptido mencionado y despues se incorpora en un vector de expresion, que se introduce posteriormente en una celula hospedadora para producir un polipeptido de interes en la celula hospedadora y despues recuperarlo.

Los poliucleotidos que codifican los polipeptidos anteriores se pueden preparar facilmente a traves de tecnicas de ingenieria genetica conocidas o tecnicas convencionales utilizando un sintetizador de acidos nucleicos disponible en el mercado. Por ejemplo, puede prepararse ADN que comprende la secuencia de nucleotidos SEQ ID NO: 1 por

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PCR utilizando una genoteca de ADNc o ADN cromosomico humano, como matriz y un par de cebadores disenados para ser capaces de ampliar la secuencia de nucleotidos representada por la SEQ ID NO: 1. Las condiciones de PCR pueden determinar apropiadamente. Por ejemplo, las condiciones de PCR comprenden llevar a cabo 30 ciclos de ciclos de reaccion de desnaturalizacion a 94°C durante 30 segundos; recocido a 55°C durante 30 segundos a 1 minuto; y extension a 72°C durante 2 minutes, utilizando una ADN polimerasa termoestable (p.ej., Taq polimerasa o similar) y tampon para PCR con contenido de Mg2+, seguido de reaccion a 72°C durante 7 minutos. Sin embargo, las condiciones de pCr no estan limitadas a los ejemplos anteriores. Las tecnicas, condiciones de PCR y similares, se describen en Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3a edicion, A compendium of Methods from Current Protocols 1995), John Wiley & Sons (en particular, el capltulo 15).

Asimismo, sobre la base de la informacion de la secuencia de nucleotidos y la secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO: 1 a 30 en el Listado de Secuencias descrita en el presente documento, se preparan sondas y cebadores apropiados y, a continuacion, se rastrea una genoteca de ADNc de un ser humano o similar utilizandolos, de manera que se puede aislar el ADN deseado. Preferentemente, se construye una genoteca de ADNc a partir de celulas, organos o tejidos que expresan protelnas que tienen secuencias numeradas pares de SEQ ID NO: 2 a 30, Entre los ejemplos de dichas celulas o tejidos se incluyen celulas o tejidos derivados de testlculos y canceres o tumores como leucemia, cancer de mama, linfoma, tumor cerebral, cancer de pulmon, cancer colorrectal y similares. Los procedimientos como la preparacion de sondas o cebadores, construccion de una genoteca de ADNc, rastreo de una genoteca de ADNc y clonacion de genes diana son conocidos entre las personas especializadas en la materia y se pueden llevar a cabo a traves de los metodos descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning, 2a edicion, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Ausbel et al., (anterior), y similares. Se puede obtener de esta forma ADN que codifica protelna CAPRIN-1 humana o un peptido parcial de la misma a partir del ADN obtenido de esta forma.

Las celulas hospedadoras pueden ser cualquier celula, siempre y cuando puedan expresar el polipeptido mencionado. Entre los ejemplos de celulas procariotas se incluyen, pero sin limitarse a ellas, Escherichia coli y similares. Entre los ejemplos de celulas eucariotas se incluyen, pero sin limitarse a ellas, celulas de mamlfero, como celulas de rinon de mono (COS1) y celulas ce ovario de hamster chino (CHO), llnea celular de rinon fetal humano (HEK293), llnea celular de piel de raton fetal (NIH3T3), celulas de levadura, como levadura en gemacion y levadura de fision, celulas de gusano de seda y Xenopus oocyte.

Cuando se utilizan celulas procariotas como celulas hospedadoras, un vector de expresion utilizado en el presente documento contiene un origen replicable dentro de celulas procariotas, un promotor, un sitio de union a ribosoma, un sitio de clonacion multiple, un terminador, un gen de resistencia a farmaco, un gen complementario auxotrofico, y similares. Entre los ejemplos de vector de expresion de Escherichia coli se incluyen vector a base de pUC, pBluescript II, un sistema de expresion pET, un sistema de expresion pGEX. Se incorpora el ADN que codifica el polipeptido mencionado en dicho vector de expresion, se transforman celulas hospedadoras procariotas con el vector y se cultivan las celulas transformadas as! obtenidas, y de esta forma, se puede expresar el polipeptido codificado por el ADN en celulas hospedadoras procariotas. En ese momento, se puede expresar tambien el polipeptido en una protelna de fusion con otra protelna.

Cuando se utilizan celulas eucariotas como celulas hospedadoras, un vector de expresion utilizado en el presente documento es un vector de expresion para celulas eucariotas, que contiene un promotor, una region de corte y empalme, un sitio de adicion poli(A), y similares. Entre los ejemplos de dicho vector de expresion se incluyen pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, vector EBV, pRS, pcDNA3 y pYES2. De manera similar, se incorpora el ADN que codifica el polipeptido mencionado en dicho vector de expresion, se transforman celulas hospedadoras eucariotas con el vector, se cultivan las celulas transformadas as! obtenidas y de esta forma, se puede expresar el polipeptido codificado por ADN en celulas hospedadoras eucariotas. Cuando se utiliza pIND/V5- His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1, o similar como vector de expresion, se puede expresar el polipeptido mencionado como protelna de fusion a la que se ha anadido una etiqueta entre varias etiquetas como etiqueta His (p.ej., (His)6-(His)10), una etiqueta FLAG, una etiqueta myc, una etiqueta HA y GFP.

Para introducir un vector de expresion en celulas hospedadoras, se puede emplear un metodo conocido, como electroporacion, metodo de fosfato calcico, un metodo de liposoma, un metodo de DEAE dextrano, microinyeccion, infeccion viral, lipofeccion y union a un peptido permeable a la membrana celular.

Se puede aislar el polipeptido de interes y purificarse desde las celulas hospedadoras combinando procedimientos de separacion conocidos. Entre los ejemplos de dichos procedimientos se incluyen, pero sin limitarse a ellos, tratamiento con un agente de desnaturalizacion, como urea o un tensioactivo, ultrasonicacion, digestion enzimatica, precipitacion de protelnas con sal o fraccionamiento y precipitacion con disolvente, dialisis, centrifugacion, ultrafiltracion, filtracion con gel, SDS-PAGE, isoelectroenfoque, cromatografla de intercambio ionico, cromatografla hidrofoba, cromatografla de afinidad y cromatografla de fase inversa.

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Un anticuerpo es una glucoproteina heteromultimera que contiene generalmente al menos dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Los anticuerpos distintos a IgM, un anticuerpo, son glucoproteinas heterotetrameras de 150 kDa compuestas de dos cadenas ligeras identicas (L) y dos cadenas pesadas identicas (H). Normalmente, cada cadena ligera esta conectada a una cadena pesada a traves de un enlace covalente disulfuro, sin embargo, el numero de enlaces disulfuro entre cadenas pesadas de varios isotipos de inmunoglobulina es variado. Cada cadena pesada o cada cadena ligera tambien tiene un enlace disulfuro entre una cadena y otra. Cada cadena pesada tiene un dominio variable (region VH) en un extremo seguido de varias regiones constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (region VL) y tiene una region constante en un extremo opuesto al otro extremo. La region constante de una cadena ligera se alinea con lun cebadora region constante de una cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera se alinea con un dominio variable de cadena pesada. Una region especifica de un dominio variable de anticuerpo presenta una variabilidad especifica que se denomina region determinante de complementariedad (CDR), de manera que imparte especificidad de union al anticuerpo. Una porcion de la region variable, que se conserva relativamente, se denomina region marco (FR). Los dominios variables de cadena pesada y cadena ligera completos contienen por separado cuatro FR ligados a traves de tres CDR. Las tres CDR de una cadena pesada se denominan CDRH1, CDRH2, y CDRH3 en este orden desde el termino N. De manera similar, en el caso de una cadena ligera, las CDRL se denominan CDRL1, CDRL2, y CDRL3. CDRH3 es sobre todo importante para la especificidad de union de un anticuerpo a un antigeno. Asimismo, las CDR de cada cadena se retienen juntas en un estado en el que estan adyacentes unas a otras debido a las regiones FR, que contribuyen a la formacion del sitio de union a antigeno del anticuerpo en cooperation con las CDR de la otra cadena. La region constante no contribuye directamente a la union de un anticuerpo a un antigeno sino que presenta varias funciones efectoras, como su implication en citotoxicidad mediada por celula dependiente de anticuerpo (ADCC), fagocitosis a traves del receptor Fcy, la velocidad de semivida/aclaramiento a traves de un receptor de Fc neonato (FcRn) y toxicidad dependiente de complemento (CDC) a traves de un constituyente C1q de la cascada del complemento.

El termino “anticuerpo anti-CAPRIN-1”, tal como se utiliza en el presente documento se refiere a un anticuerpo que tiene reactividad inmunologica con una proteina CAPRIN-1 de longitud completa o un fragmento de la misma.

Tal como se utiliza en el presente documento “reactividad inmunologica” se refiere a la propiedad de un anticuerpo de unirse in vivo a un antigeno CAPRIN-1. A traves de dicha union in vivo, se presenta la funcion de danar el tumor (p.ej., muerte supresion o degeneration). Especificamente, un anticuerpo utilizado en la presente invention puede ser cualquier tipo de anticuerpo, siempre y cuando se una a una proteina CAPRIN-1 para poder danar citotoxicamente un tumor, como leucemia, linfoma, cancer de mama, tumor cerebral, cancer de pulmon, cancer de esofago, cancer gastrico, cancer renal o cancer colorrectal.

Entre los ejemplos de anticuerpo se incluyen un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante (p.ej., un anticuerpo sintetico, un anticuerpo multiespecifico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimerico, o un anticuerpo monocatenario), un anticuerpo humano y un fragmento de anticuerpo de los mismos (p.ej., Fab, F(ab')2, o Fv). Asimismo, un anticuerpo puede ser una molecula de inmunoglobulina de cualquier clase como IgG, IgE, IgM, IgA, IgD, o IgY, o cualquier subclase como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, o IgA2. Cualquiera de estos anticuerpos o fragmentos de los mismos tiene reactividad inmunologica con una proteina CAPRIN-1 que existe en la superficie de celulas cancerosas y, preferentemente, a un polipeptido de la region extracelular de la misma (preferentemente, se une especificamente a la proteina o el polipeptido) y presenta una actividad citotoxica contra el cancer.

El anticuerpo puede modificarse asimismo, ademas de a traves de glicosilacion, por acetilacion, formilacion, amidacion, fosforilacion, pegilacion (PEG) o similares.

A continuation, se describen varios ejemplos de preparation de anticuerpo.

Cuando el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, por ejemplo, se administra la linea celular de cancer de mama SK-BR-3 que expresa CAPRIN-1 a un raton para su inmunizacion, se extirpa el bazo del raton, se separan celulas y a continuacion se fusionan las celulas y las celulas de mieloma de raton. A partir de las celulas de fusion asi obtenidas (hibridomas), se selecciona un clon que produce un anticuerpo que tiene el efecto de suprimir la proliferation de celulas cancerosas. Se aisla un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que tiene el efecto de suprimir la proliferacion de celulas cancerosas, se cultiva el hibridoma y despues se purifica un anticuerpo desde el sobrenadante de cultivo por purification de afinidad en general de manera que se puede preparar el anticuerpo.

Tambien se puede preparar el hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal tal como se describe a continuacion, por ejemplo. En primer lugar, se inmuniza a un animal con un antigeno de sensibilization de acuerdo con un metodo conocido. Se lleva a cabo un metodo general inyectando un antigeno de sensibilizacion a un mamifero intraperitonealmente o subcutaneamente. Concretamente, se diluye un antigeno de sensibilizacion con PBS (solution tamponada con fosfato), solution salina o similar a una cantidad apropiada, seguido de suspension. A

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continuacion, se mezcla el producto resultante con una cantidad apropiada de un adyuvante general segun sea necesario, como por ejemplo adyuvante completo de Freund. Tras la emulsificacion, se administra la solucion a un mamlfero varias veces cada 4 a 21 dlas. Asimismo, se puede utilizar un vehlculo apropiado tras la inmunizacion con un antlgeno de sensibilizacion.

Se inmuniza a un mamlfero tal como se ha descrito. Una vez confirmada una elevacion del nivel de anticuerpo en suero deseado, se recogen celulas inmunizadas del mamlfero y se someten a fusion celular. Las celulas inmunizadas preferentes son esplenocitos en particular.

Otras celulas utilizadas como celulas parentales para fusionarlas con celulas inmunizadas son celulas de mieloma de mamlfero. Como celulas de mieloma, se utilizan preferentemente varias llneas celulares conocidas como P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8. 653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology y Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. y Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (deSt. Grot,, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313323) y R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133).

Se puede llevar a cabo la fusion de las celulas inmunizadas y las celulas de mieloma de acuerdo con un metodo conocido basicamente, como por ejemplo tecnica de Kohler y Milstein (Kohler, G. y Milstein, C. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46), por ejemplo.

Mas especlficamente, se lleva a cabo la fusion celular, por ejemplo, en presencia de un acelerador de fusion celular en un medio de cultivo nutriente habitual. Como dicho acelerador de fusion, se utiliza polietilen glicol (PEG), virus de Sendai (HVJ) o similares. Si se desea, es posible anadir y utilizar un agente auxiliar como dimetilsulfoxido para potenciar la eficacia de fusion.

La relacion entre las celulas inmunizadas y las celulas de mieloma para su uso en el presente documento puede establecerse de manera arbitraria. Por ejemplo, el numero de celulas inmunitarias que se utiliza preferentemente es de una a diez veces mas el numero de celulas de mieloma. Como medio de cultivo para su uso para la fusion celular mencionada, se puede utilizar un medio de cultivo RPMI1640 adecuado para la proliferacion de la llnea celular de mieloma mencionada, un medio de cultivo MEM y otros medios de cultivo utilizados habitualmente para cultivar este tipo de celula. Asimismo, puede utilizarse llquido que es suplemento para suero como suero bovino fetal (FCS) con ellos.

La fusion celular puede llevarse a cabo mezclando a fondo las cantidades predeterminadas de las celulas inmunizadas y las celulas de mieloma mencionadas en el medio de cultivo mencionado, y se anade una solucion de PEG (por ejemplo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 1000 a 6000) precalentado a aproximadamente 37 °C, normalmente a una concentracion de 30 %-60 % (p/v) y se mezcla formando as! un cultivo que contiene hibridomas de interes. A continuacion, se anade sucesivamente un medio de cultivo adecuado, al cultivo as! obtenido, que se centrifuga despues para eliminar el sobrenadante y se repite este procedimiento para eliminar el agente de fusion celular o similar que no es preferente para el crecimiento de hibridomas.

Se cultivan los hibridomas as! obtenidos para su seleccion en un medio de cultivo de seleccion habitual (p.ej. un medio de cultivo HAT que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). Se continua el cultivo en este medio de cultivo HAT durante un perlodo de tiempo suficiente (normalmente varios dlas a varias semanas) para que las celulas (celulas no fusionadas) distintas a los hibridomas diana mueran. A continuacion, se llevan a cabo el rastreo y la clonacion simple del hibridoma que produce un anticuerpo de interes utilizando el metodo de dilucion limitante.

Se obtienen los hibridomas mencionados inmunizando a un animal no humano con un antlgeno. Ademas de este metodo, pueden obtenerse los hibridomas que producen un anticuerpo humano que tienen la actividad deseada (p.ej., actividad de supresion de la proliferacion celular) por sensibilizacion in vitro de linfocitos humanos, como por ejemplo, linfocitos humanos que han sido infectados con virus EB, con una protelna, una celula que expresa protelna, o un lisado de las mismas, seguido de fusion de los linfocitos sensibilizados de esta forma con celulas de mieloma derivadas de ser humano que tiene la capacidad de dividirse permanentemente, como U266 (No. De registro TIB 196).

Se puede pasar el hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal de interes as! preparado en un medio de cultivo general y se puede almacenar en nitrogeno llquido durante un perlodo de tiempo prolongado.

Concretamente, se puede preparar un hibridoma por inmunizacion a traves de un metodo de inmunizacion general utilizando, como antlgeno de sensibilizacion un antlgeno deseado o una celula que expresa el antlgeno deseado, fusionando la celula inmunizada as! obtenida con una celula parental conocida a traves de un metodo de fusion celular general y, a continuacion, rastreando una celula que produce anticuerpo monoclonal (es decir, un hibridoma) a traves de un metodo de rastreo general.

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Otros ejemplos de un anticuerpo que se puede utilizar en la presente invencion es un anticuerpo policlonal. Se puede obtener un anticuerpo policlonal tal como se describe a continuacion, por ejemplo.

Se inmuniza a un animal pequeno, como un raton, un raton que produce anticuerpo humano, o a un conejo, con una protelna CAPRIN-1 natural, una protelna CAPRIN-1 recombinante expresada en un microorganismo como Escherichia coli en forma de una protelna de fusion con GST o similar, o un peptido parcial de la misma y, a continuacion, se obtiene suero. Se purifica el suero por precipitacion con sulfato de amonio, columna de protelna A, columna de protelna G, cromatografla de intercambio ionico DEAE, columna de afinidad a la que se ha acoplado protelna CApRIN-1 o un peptido sintetico, o similares, para poder preparar as! el anticuerpo policlonal. En los ejemplos descritos mas adelante, se preparo un anticuerpo policlonal de conejo contra el peptido (representado por SEQ ID NO: 37) de una region parcial (en las secuencias de aminoacido de una protelna CAPRIN-1) que se expresa en la superficie de celulas cancerosas y se confirmo el efecto anti-tumoral.

En cuanto a los ratones que producen anticuerpo humano, se conocen un raton (KM (Kirin Farma/Medarex) y un raton Xeno (Amgen) (p.ej., publicaciones de patente internacional WO02/43478 y WO02/092812), por ejemplo. Cuando se inmuniza un raton con una protelna CAPRIN-1 o un fragmento de la misma, se puede obtener un anticuerpo policlonal humano completo desde la sangre. Asimismo, se recogen esplenocitos del raton inmunizado y a continuacion, se puede preparar el anticuerpo monoclonal de tipo humano a traves de un metodo para fusion con celulas de mieloma.

Se puede preparar un antlgeno de acuerdo con un metodo utilizando celulas animales (publicacion de patente japonesa (Kohyo) No. 2007-530068) o baculovirus (p.ej., publicacion de patente internacional WO98/46777), por ejemplo. Cuando un antlgeno tiene una baja inmunogenicidad, se puede unir el antlgeno a una macromolecula que tiene inmunogenicidad, como albumina y despues se lleva a cabo la inmunizacion.

Asimismo, se clona un gen de anticuerpo desde dicho hibridoma y despues se incorpora en un vector apropiado. A continuacion, se introduce el vector en un huesped y despues se puede utilizar el anticuerpo recombinado geneticamente producido aplicando tecnicas de recombinacion genetica (p.ej., vease Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTICUERPOS, publicado en el Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Concretamente, se sintetiza el ADNc de una region variable (region V) de un anticuerpo a partir del ARNm del hibridoma utilizando transcriptasa inversa. Cuando se puede obtener el ADN que codifica la region V de un anticuerpo de interes, se liga este ADN con el ADN que codifica la region constante (region C) de un anticuerpo deseado y, a continuacion, se incorpora el producto de fusion resultante en un vector de expresion. Alternativamente, se puede incorporar el ADN que codifica la region V de un anticuerpo en un vector de expresion que contiene el ADN para la region C de un anticuerpo. En este momento, se puede incorporar el ADN en un vector de expresion de manera que se exprese bajo el control de regiones de control de expresion, como un potenciador y un promotor. A continuacion, se transforman las celulas hospedadoras con el vector de expresion, de manera que se puede expresar el anticuerpo.

El anticuerpo CAPRIN-1 utilizado en la presente invencion es preferentemente un anticuerpo monoclonal. Sin embargo, el anticuerpo anti-CAPRIN-1 de la presente invencion puede ser tambien un anticuerpo policlonal o un anticuerpo recombinante o un anticuerpo geneticamente modificado (p.ej., un anticuerpo quimerico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo monocatenario o un anticuerpo biespeclfico), por ejemplo.

Entre los ejemplos del anticuerpo monoclonal se incluyen anticuerpos monoclonales humanos y anticuerpos monoclonales animales no humanos (p.ej., un anticuerpo monoclonal de raton, un anticuerpo monoclonal de rata, un anticuerpo monoclonal de conejo y un anticuerpo monoclonal de pollo). El anticuerpo monoclonal puede prepararse cultivando el hibridoma obtenido por fusion celular de un esplenocito de un mamlfero no humano (p.ej., un raton o un raton que produce anticuerpo humano) inmunizado con una protelna CAPRIN-1 con una celula de mieloma. En los ejemplos que se describen mas adelante, se prepararon anticuerpos monoclonales de raton y se confirmaron los efectos anti-tumorales.

Estos anticuerpos monoclonales comprenden una region variable de cadena pesada (VH) que comprende las secuencias de aminoacido de SEQ ID NO: 43, 73, 83, 93, 103, 113, o SEQ ID NO: 123 y una region variable de cadena ligera (VL) que comprende las secuencias de aminoacido de SEQ ID NO: 47, 53, 58, 63, 68, 77, 87, 97, 107, 117, o 127, en donde: la region VH comprende CDR1 representadas por las secuencias de aminoacido de SEQ ID NO: 40, 70, 80, 90, 100, 110, o 120, CdR2 representadas por las secuencias de aminoacido de SEQ ID NO: 41, 71, 81, 91, 101, 111, o 121, y CDR3 representadas por las secuencias de aminoacido de SEQ ID NO: 42, 72, 82, 92, 102, 112, o 122; y la region VL comprende CDR1 representadas por las secuencias de aminoacido de SEQ ID NO: 44, 50, 55, 60, 65, 74, 84, 94, 104, 114, o 124, CDR2 representadas por las secuencias de aminoacido de SEQ ID NO: 45, 51, 56, 61, 66, 75, 85, 95, 105, 115, o 125 y CDR3 representadas por las secuencias de aminoacido de SEQ ID NO: 46, 52, 57, 62, 67, 76, 86, 96, 106, 116, o 126.

Se prepara el anticuerpo quimerico combinando las secuencias de diferentes animales. Por ejemplo, el anticuerpo quimerico comprende regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo de raton y regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo humano. Dicho anticuerpo quimerico se puede preparar

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a traves de metodos conocidos. Por ejemplo, se puede obtener el anticuerpo quimerico ligando ADN que codifica una region V de anticuerpo con ADN que codifica una region C de anticuerpo humano, incorporando el ligado resultante en un vector de expresion, introduciendo el vector en un huesped y haciendo que el huesped produzca el anticuerpo.

Entre los ejemplos de anticuerpo policlonal se incluye un anticuerpo obtenido por inmunizacion de un animal que produce anticuerpo humano (p.ej., un raton) con una protelna CAPRIIN-1.

El anticuerpo humanizado es un anticuerpo modificado que se denomina tambien anticuerpo humano reconfigurado. El anticuerpo humanizado puede construirse trasplantando CDR de un anticuerpo desde un animal inmunizado en las regiones determinantes de complementariedad de un anticuerpo humano. Se conocen tambien tecnicas de recombinacion genetica generales.

Concretamente, se sintetiza secuencias de ADN disenadas para tener cada una de ellas las CDR de un anticuerpo de raton ligado a cada una de las regiones marco (FR) de un anticuerpo humano por metodo de PCR a partir de varios oligonucleotidos, que se preparan para que tengan porciones solapadas en sus porciones terminales, por ejemplo. Se puede obtener un anticuerpo humanizado ligando el ADN as! obtenido con un ADN que codifica la region constante de un anticuerpo humano, incorporando el producto de fusion resultante en un vector de expresion, introduciendo el vector en un huesped y causando as! que el huesped produzca el producto genico (vease publicacion de patente europea EP239400 y publicacion de patente internacional WO96/02576). En cuanto a las FR de un anticuerpo humano, que se liga a traves de CDR, se seleccionan FR que permiten la formacion de un sitio de union a antlgeno con buenas regiones determinantes de complementariedad. Si es necesario, para la formacion de un sitio de union a antlgeno que tiene las regiones determinantes de complementariedad apropiadas de un anticuerpo humano reconfigurado, pueden sustituirse los aminoacidos de las regiones marco de una region variable de anticuerpo (Sato, K. et al., Cancer Research, 1993, 53: 851-856). Asimismo, se pueden sustituir los aminoacidos de FR por las regiones marco de varios anticuerpos humanos (vease la publicacion de patente internacional WO99/51743).

Como regiones marco (FR) de un anticuerpo humano que se ligan a traves de CDR, se selecciona FR que permite la formacion de un sitio de union a antlgeno con buenas regiones determinantes de complementariedad. Si es necesario, para la formacion de un sitio de union a antlgeno que tiene las regiones determinantes de complementariedad apropiadas de un anticuerpo humano reconfigurado, se pueden sustituir los aminoacidos de las regiones marco de una region variable de anticuerpo (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856).

Tras la preparacion de un anticuerpo quimerico o un anticuerpo humanizado, se pueden sustituir los aminoacidos en una region variable (p.ej., FR) o una region constante por otros aminoacidos.

La sustitucion de aminoacido es una sustitucion por ejemplo de menos de 15, menos de 10, 8 o menos 7 o menos, de 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos aminoacidos y es preferentemente una sustitucion de 1 a 5 aminoacidos, y mas preferentemente 1 o 2 aminoacidos. Un anticuerpo sustituido debera ser funcionalmente equivalente a un anticuerpo sin sustituir. La sustitucion es deseablemente una sustitucion de aminoacido(s), conservador entre aminoacidos que tienen propiedades analogas como carga electrica, cadena lateral, polaridad y aromaticidad. Los aminoacidos que tienen propiedades analogas pueden clasificarse en aminoacidos basicos (arginina, lisina e histidina), aminoacidos acidos (acido aspartico y tirosina), aminoacidos polares sin carga (glicina, Asparagina, glutamina, serina, treonina, cistelna y tirosina), aminoacidos no polares (leucina, isoleucina, alanina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina), aminoacidos de cadena ramificada (treonina, valina e isoleucina) y aminoacidos aromaticos (fenilalanina, tirosina, triptofano e histidina), por ejemplo.

Los anticuerpos se pueden modificar qulmicamente. Entre los ejemplos de dichos anticuerpos modificados se incluyen anticuerpos unidos a varias moleculas como polietilen glicol (PEG) y compuestos antitumorales (p.ej., agentes antitumorales, como se ilustrara mas adelante). Las sustancias que se unen en el producto de anticuerpo modificado de la presente invencion no estan limitadas. Dicho producto de anticuerpo modificado puede obtenerse sometiendo el anticuerpo as! obtenido a modificacion qulmica. Los metodos para ello ya han sido establecidos en la tecnica.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “equivalente funcionalmente” se refiere a que el anticuerpo objeto tiene una actividad biologica o bioqulmica similar a la del anticuerpo de la presente invencion y, especlficamente, se refiere a que un anticuerpo objeto tiene la funcion de danar un tumor sin causar esencialmente rechazo tras su aplicacion a un ser humano, por ejemplo. Un ejemplo de dicha actividad incluye una actividad de suprimir la proliferacion celular o la actividad de union.

Como metodo muy conocido entre las personas especializadas en la materia para la preparacion de un polipeptido funcionalmente equivalente a un polipeptido, se conoce un metodo para introducir una mutacion en un polipeptido. Por ejemplo, las personas especializadas en la tecnica pueden preparar un anticuerpo funcionalmente equivalente al anticuerpo de la presente invencion introduciendo apropiadamente una mutacion en el anticuerpo utilizando mutagenesis dirigida a sitio (Hashimoto-Gotoh, T. et al., (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ., y Smit,, M. (1983)

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Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer, W. y Fritz, HJ., (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82, 488-492; Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766), por ejemplo.

Un anticuerpo que reconoce un epltopo de una protelna CAPRIN-1 para ser reconocido por el anticuerpo anti- CAPRIN-1 mencionado, es decir, un anticuerpo que se une especlficamente al epltopo, puede obtenerse a traves de metodos conocidos entre las personas especializadas en la tecnica. Por ejemplo, se puede obtener dicho anticuerpo a traves de un metodo que implica determinar un epltopo de protelna CAPRIN-1 reconocido por un anticuerpo anti- CAPRIN-1, a traves de un metodo general (p.ej., mapeado de epltopo) y a continuacion, preparando un anticuerpo mediante el uso de un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos contenida en el epltopo como un inmunogeno, o un metodo que implica determinar un epltopo de dicho anticuerpo preparado a traves de un metodo general y seleccionado despues un anticuerpo que tiene el epltopo identico al de anticuerpo anti-CAPRIN-1. Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “epltopo” se refiere, en un mamlfero, preferentemente en un ser humano, a un fragmento de polipeptido que tiene antigenicidad o inmunogenicidad. La unidad de tamano mlnimo del mismo consiste en aproximadamente 7 a 12 aminoacidos, y preferentemente 8 a 11 aminoacidos.

La constante de afinidad Ka(kon/koff) del anticuerpo utilizado en la presente invencion es preferentemente al menos 107M-1, al menos 108M-1 , al menos 5 x 108M-1, al menos 109M-1, al menos 5 x 109M-1, al menos 101°M'1, al menos 5 x 10’^'’', al menos 1011M-1, al menos 5 x 1011M-1, al menos 1012M-1 o al menos 1013M-1.

El anticuerpo utilizado en la presente invencion puede conjugarse con un agente antitumoral. La conjugacion del anticuerpo con un agente antitumoral puede llevarse a cabo a traves de un espaciador que tiene un grupo reactivo con un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo hidroxi, un grupo tiol o similar (p.ej., un grupo succinato de succinimidilo, un grupo formilo, un grupo 2-piridilditio, un grupo maleimidilo, un grupo alcoxi carbonilo y un grupo hidroxi).

Entre los ejemplos de agente antitumoral que se puede utilizar en la presente invencion se incluyen los siguientes agentes antitumorales, segun la bibliografla y similares, tales como paclitaxel, doxorubicina, daunorubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo, tiotepa, busulfano improsulfano piposulfano benzodopa, carboquona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida, trimetilolmelamina, bullatacina, bullatacinona, camptotecina, briostatina, callistatina, criptoficina1, criptoficina8, dolastatina,

duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictiina, espongistatina, clorambucilo, clornafazina, ciclofosfamida, estramustina ifosfamida, mecloret, amina, mecloret, clorhidrato de oxido de amina, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina trofosfamida, mostaza de uracilo, carmustina clorozotocina, fotemustina lomustina nimustina ranimustina caliqueamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, adriamicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinaC, acido micofenolico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina, denopterin, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina (azauridina), carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, androgenos (p.ej., calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano y testolactona), aminoglutet, imida, mitotano, trilostano, acido frollnico, aceglatona, aldofosfamidaglicosida, acido aminolaevullnico, eniluracilo, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diaziquona, elfornitina, acetato de elliptinio (elliptinium), epotilona, etoglucid, lentinano, lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarubicina, losoxantrona, acido podofillnico, 2-etil hidrazida, procarbazina, razoxano, rizoxina, esquizofilano, espirogermanio, acido tenuazonico, triaziquona, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, mannomustina mitobronitol, mitolactol, pipobroman, gacitosina, docetaxel, clorambucilo, gemcitabina, 6-tioguanina, mercaptopurina, cisplatino, oxaliplatino, carboplatino, vinblastina etoposida, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina vinorelbina, novantrona, teniposida, edatrexato, daunomicina, aminopterina, xeloda, ibandronato, irinotecano, inhibidor de topoisomerasa, difluorometilolnitina (DMFO), acido retinoico, capecitabina y sales farmaceuticamente aceptables (conocidas) o derivados de las mismas (conocidos).

Alternativamente, se puede unir al anticuerpo utilizado en la presente invencion un radio isotopo conocido, segun la bibliografla y similares, como 211At, 131I, 1 5I, 90Y, 186Re, 18 Re, 153SM, 212Bi, 32P, 175Lu o 17 Lu. Un radio isotopo deseado es eficaz para el tratamiento o diagnostico de tumor.

El anticuerpo utilizado en la presente invencion es un anticuerpo que tiene reactividad inmunologica con CAPRIN-1, un anticuerpo que reconoce especlficamente CAPRIN-1 o un anticuerpo que se une especlficamente a CAPRIN-1, que presenta actividad citotoxica celular contra canceres, p.ej., el efecto de supresion del crecimiento de tumor. El anticuerpo debera tener una estructura tal que se evita practicamente o completamente el rechazo en un animal sujeto al que se administra el anticuerpo. Entre los ejemplos de dicho anticuerpo se incluyen, cuando el animal sujeto es un ser humano, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimerico (p.ej. un anticuerpo quimerico humano-raton), un anticuerpo monocatenario y un anticuerpo biespeclfico. Estos anticuerpos son anticuerpos recombinantes en los que las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada son de un anticuerpo humano, anticuerpos recombinantes en los que las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera

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comprenden regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) de un anticuerpo animal no humano, y regiones marco de un anticuerpo humano; o anticuerpos recombinantes en los que las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera son de un anticuerpo animal no humano y las regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada son de un anticuerpo humano. Preferentemente, los anticuerpos son los primeros dos anticuerpos.

Estos anticuerpos recombinantes se pueden preparar del siguiente modo por clonacion de ADN que codifica un anticuerpo monoclonal de CAPRIN-1 anti-humano (p.ej., un anticuerpo monoclonal humano, un anticuerpo monoclonal de raton, un anticuerpo monoclonal de rata, un anticuerpo monoclonal de conejo o un anticuerpo monoclonal de pollo) de una celula que produce anticuerpo como, por ejemplo, un hibridoma, preparando ADN que codifica una region variable de cadena ligera y una region variable de cadena pesada del anticuerpo segun el metodo RT-PCR utilizandolo como matriz y determinando despues la secuencia de cada region variable de cadena ligera y cadena pesada o cada secuencia de CDR1, CDR2 y CDR3 sobre la base del sistema de numeracion EU de Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Healt, Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)).

Asimismo, el ADN que codifica cada una de estas regiones variables o ADN que codifica cada CDR se prepara utilizando tecnicas de recombinacion genetica (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) o un sintetizador de ADN. En este caso, el hibridoma que produce anticuerpo monoclonal humano puede prepararse por inmunizacion de un animal que produce anticuerpo humano (p.ej., un raton) con CAPRIN-1 humana y fusionando despues esplenocitos extirpados del animal inmunizado contra celulas de mieloma. Alternativamente, se preparan ADN que codifican una region variable de cadena pesada o cadena ligera y una region constante de un anticuerpo humano segun sea necesario aplicando tecnicas de recombinacion genetica o un sintetizador de ADN.

En el caso de anticuerpo humanizado, se prepara ADN sustituyendo una secuencia codificante de CDR en un ADN que codifica una region variable de cadena ligera o cadena pesada derivada de un anticuerpo humano con una secuencia codificante de CDR que corresponde a la misma de un anticuerpo derivado de un animal no humano (p.ej., un raton, una rata o un pollo) y ligando despues el ADN as! obtenido con ADN que codifica una region constante de cadena ligera o cadena pesada derivado de un anticuerpo humano. De esta forma, se puede preparar el ADN que codifica anticuerpo humanizado.

En el caso de un anticuerpo quimerico, se puede preparar el ADN que codifica un anticuerpo quimerico ligando el ADN que codifica una region variable de cadena pesada o cadena ligera de un anticuerpo de un animal no humano (p.ej., un raton, una rata y un pollo) con un ADN que codifica una region constante de cadena pesada o cadena ligera de un anticuerpo humano.

En el caso de un anticuerpo monocatenario, este anticuerpo es un anticuerpo preparado ligando linealmente una region variable de cadena pesada con una region variable de cadena ligera a traves de un engarce. De esta forma, se puede preparar el ADN que codifica un anticuerpo monocatenario uniendo el ADN que codifica una region variable de cadena pesada, un ADN que codifica un engarce y un ADN que codifica una region variable de cadena ligera. En este punto, tanto la region variable de cadena pesada como la region variable de cadena ligera son ambas de un anticuerpo humano o solamente se sustituyen CDR con CDR de un anticuerpo de un animal no humano (p.ej., un raton, una rata y un pollo), aunque las otras regiones son de un anticuerpo humano. Asimismo, un engarce comprende de 12 a 19 aminoacidos, tales como (G4S)3 de 15 aminoacidos (G. -B. Kim et al., Protein Engineering Design y Selection 2007, 20 (9): 425-432).

En el caso de un anticuerpo biespeclfico (diacuerpo), dicho anticuerpo es capaz de unirse especlficamente a dos epltopos diferentes. Por ejemplo, se puede preparar ADN que codifica un anticuerpo biespeclfico uniendo ADN que codifica una region variable de cadena pesada A, ADN que codifica una region variable de cadena ligera B, ADN que codifica una region variable de cadena pesada B y ADN que codifica una region variable de cadena ligera A en este orden (en este punto, el ADN que codifica una region variable de cadena libera B se une a ADN que codifica una region variable de cadena pesada B a traves de ADN que codifica el engarce mencionado). En este punto, tanto una region variable de cadena pesada como una region variable de cadena ligera son de un anticuerpo humano o, solamente las CDR estan sustituidas con CDR de un anticuerpo de un animal no humano (p.ej., un raton, una rata o un pollo) aunque las otras regiones son de un anticuerpo humano.

Se incorpora el ADN recombinante preparado en una o en una pluralidad de vectores apropiados, se introducen en las celulas hospedadoras (p.ej., celulas de mamlfero, celulas de levadura o celulas de insecto) y a continuacion, se causa la (co)expresion para poder preparar el anticuerpo recombinante (P. J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Sheferd y C. Dean., Monoclonal Anticuerpos., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; J. W. Goding., Monoclonal Anticuerpos: principles y practice., 1993 ACADEMIC PRESS).

Entre los ejemplos del anticuerpo de la presente invencion preparado a traves del metodo mencionado se incluyen los siguientes anticuerpos (a) a (k):

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(a) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de una region variable de cadena pesada que

comprende las SEQ ID NO: 40, 41 y 42 y CDR1, CDR2 y CDR3 de una region variable de cadena ligera que comprende las SEQ ID NO: 44, 45 y 46 (preferentemente, un anticuerpo que comprende la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 47);

(b) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de una region variable de cadena pesada que

comprende SeQ ID NO: 40, 41 y 42 y CDR1, CDR2 y CDR3 de una region variable de cadena ligera que

comprende SEQ ID NO: 50, 51 y 52 (preferentemente, un anticuerpo que comprende la region variable de

cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 53);

(c) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de una region variable de cadena pesada que

comprende SEQ ID NO: 55, 56 y 57 (preferentemente, un anticuerpo que comprende la region variable de

cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 58);

(d) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de una region variable de cadena pesada que

comprende SEQ ID NO: 60, 61 y 62 (preferentemente, un anticuerpo que comprende la region variable de

cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 63);

(e) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de una region variable de cadena pesada que

comprende SeQ ID NO: 40, 41 y 42 como CDR1, CDR2 y CDR3 de una region variable de cadena pesada y CDR1, CDR2 y CDR3 de una region variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 65, 66 y 67 (preferentemente, un anticuerpo que comprende la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 68);

(f) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de una region variable de cadena pesada que

comprende SEQ ID NO: 70, 71 y 72 y CDR1, CDR2 y CDR3 de una region variable de cadena ligera que

comprende SEQ ID NO: 74, 75 y 76 (preferentemente, un anticuerpo que comprende la region variable de

cadena pesada de SEQ ID NO: 73 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 77);

(g) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de una region variable de cadena pesada que

comprende SeQ ID NO: 80, 81 y 82 y CDR1, CDR2 y CDR3 de una region variable de cadena ligera que

comprende SEQ ID NO: 84, 85 y 86 (preferentemente, un anticuerpo que comprende la region variable de

cadena pesada de SEQ ID NO: 83 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 87);

(h) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de una region variable de cadena pesada que

comprende SeQ ID NO: 90, 91 y 92 y CDR1, CDR2 y CDR3 de una region variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 94, 95 y 96 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 93 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 97);

(i) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de una region variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 100, 101 y 102 y CDR1, CdR2 y CDR3 de una region variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 104, 105 y 106 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 103 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID No: 107);

(j) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de una region variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 110, 111 y 112 y CDR1, CdR2 y CDR3 de una region variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 114, 115 y 116 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 113 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 117); y

(k) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de una region variable de cadena pesada que comprende SeQ ID NO: 120, 121 y 122 y CDR1, CDR2 y CDR3 de una region variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 124, 125 y 126 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 123 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID No: 127).

En este punto, las secuencias de aminoacidos representadas por SEQ ID NO: 40, 41 y 42, SEQ ID NO: 70, 71 y 72, SEQ ID NO: 80, 81 y 82, SEQ ID NO: 90, 91 y 92, SEQ ID NO: 100, 101 y 102, SEQ ID NO: 110, 111, y 112, o SEQ ID NO: 120, 121 y 122 son CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente de una region variable de cadena pesada de anticuerpo de raton. Las secuencias de aminoacidos representadas por SEQ ID NO: 44, 45 y 46, SEQ ID NO: 50, 51 y 52, SEQ ID NO: 55, 56 y 57, SEQ ID NO: 60, 61 y 62, SEQ ID NO: 65, 66 y 67, SEQ ID NO: 74, 75 y 76, SEQ ID NO: 84, 85 y 86, SEQ ID NO: 94, 95 y 96, SEQ ID NO: 104,105 y 106, SEQ ID NO: 114,115 y 116 o SEQ ID NO: 124, 125 y 126 son CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente de una region variable de cadena ligera de anticuerpo de raton. Asimismo, el anticuerpo humanizado, el anticuerpo quimerico, el anticuerpo monocatenario o el anticuerpo biespeclfico de la presente invencion es el siguiente anticuerpo (ilustrado como "anticuerpo (a)"), por ejemplo:

(i) un anticuerpo en donde la region variable de cadena pesada comprende las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO: 40, 41 y 42 y las secuencias de aminoacidos de regiones marco de un anticuerpo humano y la region variable de cadena ligera comprende las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO: 44, 45 y 46 y las secuencias de aminoacidos de regiones marco de un anticuerpo humano (p.ej., el anticuerpo en donde la region variable de cadena pesada comprende las secuencias de aminoacido de SeQ ID NO: 43 y la region variable de cadena ligera comprende las secuencias de aminoacido de SEQ ID NO: 47).

(ii) un anticuerpo en donde la region variable de cadena pesada comprende las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO: 40, 41 y 42 y las secuencias de aminoacidos de regiones marco de un anticuerpo humano y la region constante de cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos de un anticuerpo humano y la region variable de cadena ligera comprende las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO: 44, 45 y 46 y las

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secuencias de aminoacidos de regiones marco de un anticuerpo humano y la region constante de cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos de un anticuerpo humano (p.ej., el anticuerpo en donde la region variable de cadena pesada comprende las secuencias de aminoacido de SEQ ID NO: 43 y la region constante de cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos de un anticuerpo humano, as! como la region variable de cadena ligera comprende las secuencias de aminoacido de SEQ ID NO: 47 y la region constante de cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos de un anticuerpo humano).

En este contexto, las secuencias de regiones constantes y las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo humano se pueden obtener del NCBI (p.ej., EE.UU: GenBank, UniGene), por ejemplo. Por ejemplo, puede hacerse referencia a la secuencia de N° de registro J00228 como region constante de cadena pesada de IgG humana, puede hacerse referencia a la secuencia de registro No. J00230 como region constante de cadena pesada de IgG2 humana, puede hacerse referencia a la secuencia de No. de registro X03604 como region constante de cadena pesada IgG3 humana, puede hacerse referencia a la secuencia de No. de registro K01316 como una region constante de cadena pesada IgG4 humana, puede hacerse referencia a las secuencias de registro No. V00557, X64135, X64133 y similares como regiones de constante k de cadena ligera humanas y puede hacerse referencia a las secuencias de No. de registro X64132, X64134 y similares como regiones de constante A de cadena ligera humana.

Los anticuerpos mencionados tienen preferentemente actividad citotoxica celular y por tanto pueden presentar efectos anti-tumorales.

Asimismo, las secuencias especlficas de las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada o CDR en los anticuerpos mencionados se dan simplemente con fines ilustrativos y por tanto, claramente, no se limitan a dichas secuencias especlficas. Se prepara un hibridoma capaz de producir otro anticuerpo humano o anticuerpo animal no humano (p.ej., un anticuerpo de raton) contra CAPRIN-1 humana, se recoge un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma y a continuacion, se determina si es o no un anticuerpo diana segun las propiedades de union inmunologica con CAPRIN-1 humana y la actividad citotoxica celular como indicadores. Tras la identificacion de un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal diana de esta manera, se prepara el ADN que codifica las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo diana a partir del hibridoma, tal como se ha descrito, se lleva a cabo la secuenciacion y a continuacion, se utiliza el ADN para la preparacion de otro anticuerpo.

Asimismo, en lo que respecta al anticuerpo mencionado de la presente invencion, la secuencia de cada uno de los anticuerpos mencionados (i) a (iv), en particular, la secuencia de la region marco y/o la secuencia de la region constante de cada uno de los anticuerpos puede tener una sustitucion, una supresion o una adicion de uno o varios (preferentemente 1 o 2) aminoacidos, siempre y cuando tenga especificidad para el reconocimiento especlfico de CAPRIN-1. En este punto, el termino “varios” hace referencia a 2 a 15 y preferentemente 2 o 3.

Los anticuerpos utilizados en la presente invencion tambien pueden producirse por tecnicas de recombinacion genetica utilizando ADN que codifica el anticuerpo mencionado de la presente invencion o ADN que codifica la cadena ligera o cadena pesada del anticuerpo mencionado o ADN que codifica la region variable de cadena ligera o cadena pesada del anticuerpo mencionado. Entre los ejemplos de dicho ADN se incluyen, en el caso del anticuerpo (a), ADN que codifica una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de nucleotidos que codifican las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO: 40, 41 y 42 y ADN que codifica una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de nucleotidos que codifica las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO: 44, 45 y 46.

Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) codificadas por las secuencias de ADN son regiones para determinar la especificidad de un anticuerpo. Por tanto, las secuencias que codifican regiones de un anticuerpo distinto a las CDR (especlficamente, una region constante y una region marco) pueden ser de otros anticuerpos. En este punto, entre los ejemplos de dichos “otros anticuerpos” se incluyen anticuerpos de organismos no humanos y son preferentemente de un ser humano con vistas a la reduccion de los efectos secundarios. Por lo tanto, en el caso del ADN mencionado, las regiones que codifican cada una de las regiones marco y cada region de contacto de cadenas pesadas y cadenas ligeras comprenden preferentemente secuencias de nucleotidos que corresponden a la secuencia de aminoacidos de un anticuerpo humano.

Otros ejemplos alternativos de ADN que codifica el anticuerpo utilizado en la presente invencion incluyen, en el caso del anticuerpo (a), ADN que codifica una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de nucleotidos que codifica las secuencias de aminoacido de SEQ ID NO: 43 y ADN que codifica a region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de nucleotidos que codifica las secuencias de aminoacido de SEQ ID NO: 47. En este caso, un ejemplo de la secuencia de nucleotidos que codifica las secuencias de aminoacido de SEQ ID NO: 43 es la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 48. Asimismo, un ejemplo de la secuencia de nucleotidos que codifica las secuencias de aminoacido de SEQ ID NO: 47 es la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 49. En estos ADN, las regiones que codifican cada una de las regiones constantes de cadenas pesadas y cadenas ligeras comprenden preferentemente secuencias de nucleotidos que codifican la correspondiente secuencia de aminoacidos a partir de un anticuerpo humano.

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El ADN de la presente invencion puede obtenerse a traves de los metodos mencionados o el siguiente metodo, por ejemplo. En primer lugar, se prepara ARN total a partir de un hibridoma relacionado con el anticuerpo de la presente invencion utilizando un kit de extraccion de ARN disponible en el mercado y a continuacion se sintetiza ADNc con transcriptasa inversa utilizando cebadores aleatorios y similares. Posteriormente, se amplifica ADNc que codifica un anticuerpo segun un metodo de PCR utilizando como cebadores los oligonucleotidos de secuencias conservadas en cada region variable de genes de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpo de raton conocidos. La secuencia que codifica una region constante puede obtenerse por amplification de una secuencia conocida a traves de un metodo de PCR. La secuencia de nucleotidos de ADN se puede determinar a traves de un metodo convencional como insertion en un plasmido o un fago para secuenciacion.

Como ejemplos de ADN relacionado con los anticuerpos mencionados (a) a (k) se mencionan los siguientes:

(i) Como ADN que codifica a polipeptido que comprende las secuencias de aminoacido de SEQ ID NO: 43, 73, 83, 93, 103, 1l3, 123, 133, 143 o 153, ADN que comprende la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 48, 78, 88, 98, 108, 118, o 128.

(ii) Como ADN que codifica a polipeptido que comprende las secuencias de aminoacido de SEQ ID NO: 47, 53, 58, 63, 68, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147 o 157, ADN que comprende la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 49, 54, 59, 64, 69, 79, 89, 99, 109, 119 o 129.

Se considera que los anticuerpos anti-CAPRIN-1 utilizados en la presente invencion presentan el efecto anti-tumoral contra celulas cancerosas que expresan CAPRIN-1 a traves del siguiente mecanismo:

la citotoxicidad dependiente de anticuerpo de celula efectora (ADCC) de celulas que expresan CAPRIN-1; y la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) de celulas que expresan CAPRIN-1.

Por lo tanto, la actividad de un anticuerpo anti-CAPRIN-1 para su utilization en la presente invencion puede evaluarse midiendo ex vivo, la actividad ADCC o la actividad CDC mencionadas contra celulas cancerosas que expresan protelna CAPRIN-1, tal como se describe especlficamente en los ejemplos a continuacion.

Se puede medir la actividad ADCC utilizando un kit disponible en el mercado para medir la actividad citotoxica, como un kit de Detection de Citotoxicidad (Roche). De acuerdo con dicho metodo, se puede medir la actividad de ACDD a traves de procedimientos que comprenden la reaction de una celula cancerosa diana con un anticuerpo anti- CAPRIN-1 sobre hielo, el cultivo de la celula con una celula efectora (p.ej., PBMC) durante 4 horas y a continuacion, la medicion de la actividad de la enzima de lactato dehidrogenasa (LDH) o la radioactividad de Cr51 liberado en el medio en el sobrenadante de cultivo. Asimismo, se puede medir la actividad CDC a traves de procedimientos que comprenden la reaccion de una celula cancerosa diana con un anticuerpo anti- CAPRIN-1 sobre hielo, el cultivo de la celula con una solution que contiene complementos (p.ej., suero) durante 4 horas y a continuacion, la medicion de la actividad de enzima o la radioactividad de manera similar a lo anterior, en el sobrenadante de cultivo.

Un anticuerpo anti-CAPRIN-1 utilizado en la presente invencion se une a una protelna CAPRIN-1 en una celula cancerosa y presenta efectos anti-tumorales como consecuencia de la actividad mencionada y por tanto es util para el tratamiento o prevention del cancer. Cuando se utiliza el anticuerpo anti-CAPRIN-1 para su administration a un organismo humano (terapia de anticuerpo) es preferentemente un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado para disminuir la inmunogenicidad.

Por otra parte, cuanto mas alta es la afinidad de union entre un anticuerpo anti-CAPRIN-1 y una protelna CAPRIN-1 sobre las superficies de celulas cancerosas, mas fuerte es la actividad anti-tumoral del anticuerpo anti-CAPRIN-1 que puede obtenerse. Por lo tanto, cuando puede adquirirse un anticuerpo anti-CAPRIN-1 que tiene una mayor afinidad de union con una protelna CAPRIN-1 es posible esperar efectos anti-tumorales mas fuertes y dicha aplicacion de anticuerpo como composition farmaceutica con el fin de tratar y/o prevenir el cancer es posible. Dicha alta afinidad de union es deseable del siguiente modo. Tal como se ha descrito, la constante de union (constante de

^ 71 81* 81' 91

afinidad Ka (kon/koff) es preferentemente al menos 10 M- , al menos 10 M- , al menos 5 x 10 M- , al menos 10 M- ,

' Q ' 1 1 10 101 111 111

al menos 5 x 10 M- , al menos 10 M-1, al menos 5 x 10 M- , al menos 10 M- , al menos 5 x 10 M- , al menos 1012 M'1 o al menos 1013 M-1.

Se puede determinar la capacidad de un anticuerpo de unirse a una protelna CAPRIN-1 a traves de un ensayo de union, utilizando ELISA, un metodo de transferencia de Western, inmunofluorescencia y analisis de citometrla de flujo o similar, tal como se describe en los Ejemplos.

Se puede analizar un anticuerpo que reconoce una protelna CAPRIN-1 en cuanto a la reactividad con CAPRIN-1 a traves de un metodo conocido entre las personas especializadas en la tecnica, sobre la base de inmunohistoqulmica utilizando secciones congeladas fijadas en paraformaldehldo o acetona o secciones de tejido incorporado en parafina y fijado en paraformaldehldo (preparadas a partir de muestras de tejido obtenidas de un paciente durante la

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cirugla o muestras de tejido obtenidas de un animal que tiene tejido de heterotrasplante inoculado con un sistema celular que expresa CAPRIN-1 de forma natural o tras la transfeccion).

Puede tenirse un anticuerpo reactivo con CAPRIN-1 a traves de varios metodos para tincion inmunohistoqulmica. Por ejemplo, se puede hacer reaccionar un anticuerpo anti-raton de cabra o un anticuerpo anti-conejo de cabra, conjugado con peroxidasa de rabano rusticano, se puede visualizar el anticuerpo diana.

La presente invention se caracteriza por la combination de un anticuerpo anti-CAPRIN-1 con un agente antitumoral, tal como se ha ilustrado y se define en las reivindicaciones. Se administran un anticuerpo anti-CAPRIN-1 y un agente antitumoral que tienen actividad antitumoral cada uno de ellos en combinacion, a un paciente con cancer de manera que se pueda obtener un efecto antitumoral sinergicamente significativo, concretamente, el efecto de causar una regresion del tumor practicamente completa en un modelo de animal portador de cancer, tal como se describe en los Ejemplos. Dicho efecto anti-tumoral especial se observa cuando se utilizan en combinacion anticuerpo anti- CAPRIN-1 y un agente antitumoral, incluso cuando aumenta el crecimiento del tumor con el tiempo. Este efecto es completamente extraordinario.

En la presente invencion, entre los ejemplos de agente antitumoral que se pueden utilizar en combinacion con un anticuerpo anti-CAPRIN-1 se incluyen quimioterapeuticos que se utilizan, se han utilizado o que se van a utilizar para el tratamiento de diversos tipos de canceres o tumores. Entre los ejemplos de dichos agentes antitumorales se incluyen un farmaco antimetabolico, un agente anticancer antibiotico, un agente anticancer a base de alcaloides vegetales, un inhibidor de topoisomerasa y un agente alquilante antitumoral. Por ejemplo, todos los agentes antitumorales (tal como se ha ilustrado) conocidos en las bibliograflas y similares quedan incluidos en el presente documento. Entre los ejemplos de los mismos se incluyen, pero sin limitarse a ellos, agentes antitumorales que se utilizan en los ejemplos descritos mas adelante, tales como agentes anticancer (p.ej., ciclofosfamida, paclitaxel, docetaxel y vinorelbina), cuyo efecto antitumoral significativo ha sido confirmado. Por lo tanto, en la presente invencion, se pueden utilizar uno o dos o mas farmacos seleccionados entre ciclofosfamida, paclitaxel, docetaxel, vinorelbina y sales farmacologicamente aceptables o derivados de los mismos como agentes antitumorales.

La diana de la composition farmaceutica para tratar y/o prevenir el cancer de la presente invencion no esta limitada en particular siempre y cuando sea una (celula) cancerosa que expresa un gen de CAPRIN-1.

El termino “tumor” y “cancer”, tal como se utilizan en el presente documento se refieren a neoplasma maligno y se utilizan indistintamente.

El medicamente de la presente invencion se caracteriza por que comprende una combinacion de un anticuerpo o un fragmento del mismo que tiene reactividad inmunologica con una protelna CAPRIN-1 y uno o dos o mas tipos de agentes antitumorales, en donde el anticuerpo o fragmento y los agentes antitumorales se combinan juntos o por separado. Concretamente, cuando se combinan estos principios activos juntos, se puede mezclar el anticuerpo o fragmento del mismo mencionado y el agente antitumoral mencionado en un vehlculo (o un excipiente) para su formulation en forma de una composicion farmaceutica. Por otra parte, cuando se combinan por separado estos principios activos, se formulan por separado una composicion farmaceutica que contiene el anticuerpo o fragmento del mismo mencionado como principio activo y una composicion farmaceutica que contiene los agentes antitumorales mencionados como principio activo de manera que se puede producir el medicamento en forma de un kit farmaceutico. Dicha composicion farmaceutica y kit farmaceutico se describe mas concretamente a continuation.

El cancer objeto de la presente invencion es un cancer que expresa genes que codifican protelnas CAPRIN-1 que tienen secuencias de aminoacidos de secuencias numeradas pares SEQ ID NO: 2 a 30, Entre los ejemplos de dichos canceres se incluyen preferentemente cancer de mama, tumor cerebral, leucemia, cancer de pulmon, linfoma, mastocitoma, cancer renal, cancer de cuello del utero, cancer de vejiga, cancer esofagico, cancer gastrico y cancer colorrectal.

Entre los ejemplos de dichos canceres especlficos se incluyen, pero sin limitarse a ellos, adenocarcinoma de mama, adenocarcinoma de mama de tipo compuesto, tumor mixto maligno de glandula mamaria, adenocarcinoma papilar intraductal, adenocarcinoma de pulmon, carcinoma de celula escamosa, un carcinoma de celula pequena, carcinomas de celula grande, glioma, que es tumor de tejido epitelial de esofago neural, ependinoma, neurocitoma, tumor neuroectodermico fetal, schwannoma, neurofibroma, meningioma, leucemia linfocltica cronica, linfoma gastrointestinal, linfoma digestivo, linfoma de celula pequena celula media, cancer de ciego, cancer de colon ascendente, cancer de colon descendente, cancer de colon transverso, cancer de colon sigmoide y cancer rectal.

Por otra parte, los sujetos preferentes son mamlferos, incluyendo primates, animales de companla, animales domesticos, animales para competition y similares y son particularmente preferentes seres humanos, perros y gatos.

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Se pueden formular los principios activos contenidos en el medicamento para tratar y/o prevenir un cancer segun la presente invencion, es decir el anticuerpo o un fragmento del mismo mencionado y el agente antitumoral mencionado a traves de un metodo conocido entre las personas especializadas en la tecnica en forma de una composition farmaceutica preparada mezclandolos o en forma de composition farmaceuticas individuales de los mismos.

Por ejemplo, se puede utilizar la composicion farmaceutica parenteralmente en la forma de una preparation para inyeccion, como una solution aseptica preparada con agua o una solution farmacologicamente aceptable distinta a agua o una suspension. Por ejemplo, se puede formular mezclando en una forma de dosis unitaria requerida segun la practica farmaceutica generalmente aceptada en combination apropiada con un vehlculo o medio farmacologicamente aceptable, especlficamente, agua esteril o solucion salina, aceite vegetal, un emulsionante, una suspension, un agente tensioactivo, un estabilizante, un compuesto aromatizante, un excipiente, un vehlculo, un antiseptico, un aglutinante y similar. Asimismo, la composicion farmaceutica de la presente invencion puede contener una sal farmacologicamente aceptable. Como sal farmacologicamente aceptable, puede utilizarse por ejemplo un acido inorganico como acido clorhldrico o acido fosforico o un acido organico, como acido acetico, acido tartarico o acido mandelico. Asimismo, se puede utilizar una sal formada con un grupo carboxilo libre. Por ejemplo, puede inducirse dicha sal de una base inorganica como por ejemplo sodio, potasio, amonio, calcio, hidroxido de hierro (I) y similar, o una base organica como isopropilamina, trimetilamina, 2-etil-aminoetanol, histidina o procalna.

Puede prescribirse una composicion aseptica para inyeccion de acuerdo con la practica farmaceutica general utilizando un vehlculo como agua destilada para inyeccion.

Entre los ejemplos de una solucion acuosa para inyeccion se incluyen solucion salina, una solucion isotonica que contiene dextrosa u otros adyuvantes, como D-sorbito, D-manosa, D-manitol y cloruro sodico. Estos ejemplos pueden utilizarse en combinacion con un agente solubilizante apropiado como alcohol, especlficamente etanol y polialcohol (p.ej., propilen glicol y polietilen glicol) y un tensioactivo no ionico (p.ej. polisorbato 80 TM y HCO-60).

Entre los ejemplos de un fluido oleoso se incluyen aceite de sesamo y aceite de soja, que se pueden utilizar en combinacion con un agente solubilizante como benzoato de bencilo o alcohol bencllico. Asimismo, se puede combinar tambien con un agente de tampon como tampon fosfato o tampon acetato sodico, un agente lenitivo como clorhidrato de procalna, un estabilizante como alcohol bencllico o fenol y un antioxidante. Generalmente, se puede cargar una ampolla apropiada con la solucion para inyeccion as! preparada.

La administration es administration oral o parenteral. Entre los ejemplos de administration parenteral se incluyen administration transnasal, administracion pulmonar y administracion transdermica. Entre los ejemplos de inyeccion se incluyen inyeccion intravenosa, inyeccion intramuscular, inyeccion intraperitoneal e inyeccion subcutanea, de manera que sea posible la administracion sistemica o local. Asimismo, en el caso de la administracion parenteral, es posible la administracion por infusion, que se realiza de forma gradual o lenta requiriendo mucho tiempo. Los metodos de administracion se pueden seleccionar apropiadamente dependiendo de la edad, el peso corporal, el sexo y los slntomas del paciente, y similares. La composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo se administra preferentemente por via parenteral. Por otra parte, en el caso de una composicion farmaceutica que comprende un agente antitumoral, se selecciona o bien la administracion oral o bien la administracion parenteral dependiendo de los tipos de agentes antitumorales y las indicaciones.

En el caso de la composicion farmaceutica para tratar y/o prevenir un cancer de la presente invencion, la dosis del anticuerpo mencionado puede seleccionarse dentro del intervalo comprendido entre 0,0001 mg y 1000 mg por kg de peso corporal, por ejemplo. Alternativamente, por ejemplo, se puede seleccionar la dosis dentro del intervalo comprendido entre 0,001 mg/cuerpo de un paciente y 100000 mg/cuerpo de un paciente; sin embargo, el intervalo de dosis no siempre se limita a estos valores numericos. Asimismo, la dosis del agente antitumoral mencionado puede seleccionarse del intervalo comprendido entre 1 y 1000 mg/cuerpo de un paciente y preferentemente entre 10 y 500 mg/cuerpo de un paciente, por ejemplo; sin embargo, el intervalo de dosis no siempre se limita a estos valores numericos. Por otra parte, la dosis y el metodo de administracion varlan dependiendo del peso corporal del paciente, la edad, el sexo, los slntomas y similares, pero la persona especializada en la materia lo puede seleccionar apropiadamente.

El tratamiento y/o prevention del cancer utilizando el agente para tratar y/o prevenir un cancer de la presente invencion implica diversas formas ademas de la administracion del agente como la composicion farmaceutica mencionada. Por ejemplo, es posible administrar los principios activos del agente para tratar y/o prevenir un cancer de la presente invencion de forma simultanea o por separado, en orden. En un ejemplo concreto, se pueden administrar los principios activos a intervalos de hasta aproximadamente 3 semanas, es decir, durante aproximadamente 3 semanas tras la administracion del primer principio activo, se puede administrar el segundo principio activo. En este momento, dicha administracion puede realizarse despues de un tratamiento quirurgico, o se

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puede realizar tambien un tratamiento quirurgico entre la administration del primer agente y la administration del segundo agente. Asimismo, se puede administrar el agente para el tratamiento y/o prevention de un cancer de la presente invention de acuerdo con diversos ciclos de administracion. Por ejemplo, cuando se realiza la administracion simultanea de los principios activos del agente para el tratamiento y/o prevencion del cancer de la presente invencion, se administra la composition farmaceutica que comprende ambos principios activos con un ciclo de aproximadamente 2 dlas a aproximadamente 3 semanas. Posteriormente, cuando sea necesario, se puede repetir el ciclo terapeutico tambien de acuerdo con el criterio del facultativo. De manera similar, cuando se pauta la formulation para administrar los principios activos en orden, los perlodos de administracion de los agentes individuales se ajustan para que sean el mismo perlodo. Un intervalo entre ciclos puede oscilar entre 0 y 2 meses. La dosificacion de cada principio activo del agente para el tratamiento y/o prevencion de un cancer de la presente invencion puede establecerse de manera similar a la dosificacion utilizada para la administracion de cada uno de los principios activos de la composicion farmaceutica.

El medicamento para el tratamiento y/o la prevencion de un cancer de la presente invencion puede encontrarse en forma de un kit farmaceutico. El termino “kit farmaceutico”, tal como se utiliza en el presente documento se refiere a un metodo para tratar o prevenir un cancer, un envase para el uso del anticuerpo anti-CAPRIN-1 mencionado o fragmento del mismo y el agente antitumoral mencionado, que son los principios activos en forma de composiciones farmaceuticas individuales. El envase incluye instrucciones para la administracion de cada uno de los principios activos. Cada uno de los principios activos de la composicion farmaceutica mencionada para tratar y/o prevenir un cancer, contenida en el kit farmaceutico puede encontrarse en forma de una composicion farmaceutica que ha sido formulada tal como se ha descrito, de manera que los principios activos se puedan administrar juntos o por separado. Asimismo, un kit farmaceutico contiene las cantidades de principios activos suficientes para dosis unitarias o dosis multiples, de manera que se pueda administrar el principio activo de acuerdo con el metodo de administracion.

Sobre la base del contenido descrito concretamente, la presente divulgation proporciona ademas un metodo para tratar y/o prevenir un cancer que comprende la administracion del medicamento de la presente invencion mencionado a un sujeto del que se sospecha que tiene cancer (incluyendo un sujeto con cancer). En una realization, se administra un anticuerpo o un fragmento del mismo y un agente antitumoral, contenidos en el medicamente mencionado, de forma simultanea o por separado al sujeto mencionado.

Ejemplos

La presente invencion se describira mas concretamente sobre la base de los Ejemplos, si bien el alcance de la presente invencion no queda limitado con dichos ejemplos especlficos.

Ejemplo 1 Identification de nueva protelna antlgeno contra el cancer por metodo SEREX

(1) Preparation de genoteca de ADNc

Se extrajo ARN total de un tejido de testlculo de un perro sano por el metodo guanidinio-fenol-cloroformo acido. Se purifico ARN Poli(A) de acuerdo con los protocolos adjuntados al kit de purification de ARNm Oligotex-dT30 (Takara Shuzo Co., Ltd.) utilizando el kit.

Se sintetizo una genoteca de fagos de ADN de testlculo de perro utilizando el ARNm as! obtenido (5 pig). Para la preparacion de la genoteca de fagos de ADNc, se utilizo un kit de slntesis de ADNc, un kit de slntesis de ZAP-ADNc y un kit de donation ZAP-ADNc gigapack III Gold (STRATAGENE) y se preparo la genoteca de acuerdo con los protocolos adjuntados al kit. El tamano de la genoteca de fagos de ADNc preparada fue de 7,73 x 105 ufp/ml.

(2) Rastreo de genoteca de ADNc utilizando suero

Se llevo a cabo el inmunorrastreo utilizando la genoteca de fagos de ADN de testlculos de perro antes preparada. Concretamente, se infecto Escherichia coli (XL1-Blue MRF') hospedador con el fago de manera que estaban presentes 2210 clones en la placa de agarosa NZY de ^90 x 5 mm. Se cultivaron las celulas a 42 °C durante 3 a 4 horas, para causar la formation de placa. Se cubrio la placa con una membrana de nitrocelulosa (Hybond C Extra: GE Healt,Care Bio-Sciences) impregnada con IPTG (isopropiol-p-D-tiogalactosida) a 37 °C durante 4 horas. Se indujeron las protelnas, se expresaron y se transfirieron a la membrana. Posteriormente, se recupero la membrana, se sumergio y se agito en TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7,5) que contenla 0,5 % de leche desnatada en polvo a 4 °C durante toda la noche, para suprimir la reaction no especlfica. Se hizo reaccionar el filtro con sueros de perro con cancer 500 veces diluidos a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas.

Como suero de los perros con cancer, se utilizaron los sueros recogidos de los perros con cancer de mama. Se almacenaron los sueros a -80 °C y despues se sometieron a pretratamiento inmediatamente antes de su uso. Se llevo a cabo el pretratamiento de los sueros siguiendo el siguiente metodo. Concretamente, se infecto Escherichia

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coli (XL1-Blure MRF') hospedador con fago que expresa A ZAP en el que no se habla insertado ningun gen extrano y a continuacion se cultivo en un medio de placa NZY a 37 °C durante toda la noche. Posteriormente, se anadio un tampon 0,2 M NaHCO3 (pH 8,3) que contenla 0,5 M NaCl a la placa y despues se dejo en reposo la placa a 4 °C durante 15 horas. Se recogieron los sobrenadantes como extractos de Escherichia coli/fago. A continuacion, se paso el extracto de Escherichia coli/fago recogido a traves de una columna NHS (GE Healt,Care Bio-Sciences), para inmovilizar la protelna derivada de Escherichia colifago. Se paso el suero de un perro con cancer a traves de la columna en la que se habla inmovilizado la protelna para reaccion, eliminado as! Escherichia coli y los anticuerpos adsorbidos en el fago desde el suero. Se diluyo cada una de las fracciones de suero que hablan sido pasadas a traves de la columna 500 veces con TBS que contenla 0,5 % de leche desnatada en polvo y se utilizo el producto resultante como material para inmunorrastreo.

Se lavo una membrana a la que se habla transferido el suero as! tratado y la protelna de fusion 4 veces con TBS-T (0,05 % Tween20/TBS). Se hizo reaccionar la membrana con IgG anti-perro de cabra (IgG H+I HRP de perro anti cabra conjugado: BETHYL Laboratories) diluido 5000 veces como anticuerpo secundario con TBS que contenla 0,5 % leche en polvo desnatada a temperatura ambiente durante 1 hora. Se llevo a cabo la deteccion por reaccion

de color de enzima utilizando una solucion de reaccion de NBT/BCIP (Roche). Se recogieron las colonias

correspondientes al sitio positivo de reaccion de color desde la placa de agarosa NZY de 9 90 x 15 mm y despues

se disolvio en 500 pl de tampon SM (100 mM NaCl, 10 mM MgClSO4, 50 mM Tris-HCl, 0,01 % gelatina, pH 7,5).

Hasta la unificacion de las colonias positivas para la reaccion de color, se repitio el rastreo secundario y el rastreo terciario a traves de un metodo similar al mencionado. Por lo tanto, se rastrearon 30940 clones de fago que hablan reaccionado con IgG de suero para aislar 5 clones positivos.

(3) Busqueda de homologla para gen de antlgeno aislado

Se llevo a cabo un procedimiento para la conversion de vectores de fago en vectores de plasmido para los 5 clones positivos aislados a traves del metodo mencionado para someter los clones a analisis de secuencia de nucleotidos. Concretamente, se mezclaron 200 pl de una solucion de Escherichia coli (XL1-Blue MRF') hospedador preparada para dar una absorbancia de DO600 de 1,0, 250 pl de una solucion de fago purificada y 1 pl de fago auxiliar ExAssits (STRATAGENE) y se dejaron reaccionar a 37 °C durante 15 minutos. Despues, se anadieron 3 ml de medio LB, se cultivaron las celulas a 37 °C durante 2,5 a 3 horas y despues, se coloco inmediatamente el producto resultante en un bano de agua a 70 °C para incubacion durante 20 minutos. Se llevo a cabo la centrifugacion 1000 x g a 4 °C durante 15 minutos y despues se recogio el sobrenadante como una solucion de fagemido. Posteriormente, se mezclaron 200 pl de una solucion preparada a partir del Escherichia coli SOLR hospedador de fagemido para dar una absorbancia DO6oo de 1,0 y se mezclaron 10 pl de la solucion de fago purificada, seguido de 15 minutos de reaccion a 37 °C. Se colocaron en placa 50 pl del producto resultante en un medio agar LB que contenla ampicilina (a una concentracion final de 50 pg/ml) y despues se cultivo durante toda la noche a 37 °C. Se recogio una sola colonia de SOLR transformada y despues se cultivo en medio LB que contenla amplicilina (a una concentracion final de 50 pg/ml) a 37 °C. Despues del cultivo, se purifico ADN de plasmido que llevaba un inserto de interes utilizando un kit Miniprep de plasmido Qiagen (QIAGEN).

Se sometio el plasmido purificado al analisis de toda la secuencia del inserto por metodo de cebador en avance utilizando el cebador T3 de SEQ ID NO: 31 y el cebador T7 de SEQ ID NO: 32. Se obtuvieron las secuencias genicas de SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11 y 13 por analisis de secuencia. Mediante el uso de la secuencia de nucleotidos de los genes y las secuencias de aminoacidos de los mismos (SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 y 14), se llevo a cabo la busqueda con el programa de busqueda de homologla BLAST (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) para buscar la homologla con genes conocidos. Como resultado, se revelo que los cinco genes obtenidos eran genes que codifican CAPRIN-1. Las identidades de secuencia entre los cinco genes fueron 100 % a nivel de secuencia de nucleotidos y 99 % a nivel de secuencia de aminoacidos en las regiones que se iban a traducir en protelnas. Las identidades de secuencia de estos genes y el gen que codifica homologo humano fueron 94 % a nivel de secuencia de nucleotido y 98 % a nivel de secuencia de aminoacido en las regiones para traducirse en protelnas. Las secuencias de nucleotido de homologos humanos se representan por las SEQ ID NO: 1 y 3 y las secuencias de aminoacidos del mismo se representan por SEQ ID NO: 2 y 4. Asimismo, las identidades de secuencia de los genes de perro obtenidos y el gen que codifica homologo de ganado fueron 94 % a nivel de secuencia de nucleotidos y 97 % al nivel de la secuencia de aminoacidos en las regiones para su traduccion en protelnas. La secuencia de nucleotidos del homologo de ganado esta representada por SEQ ID NO: 15 y las secuencias de aminoacido del mismo estan representadas por SEQ ID NO: 16. Por otra parte, las identidades de secuencia de los genes que codifican homologo humano y el gen que codifica homologo de ganado fueron 94 % a nivel de secuencia de nucleotidos y 93 % a 97 % al nivel de la secuencia de aminoacidos en las regiones para su traduccion en protelnas. Asimismo, las identidades de secuencia de los genes de perro obtenidos y el gen que codifica homologo de caballo fueron 93 % a nivel de secuencia de nucleotidos y 97 % al nivel de la secuencia de aminoacidos en las regiones para su traduccion en protelnas. La secuencia de nucleotidos del homologo de caballo esta representada por sEq ID NO: 17 y las secuencias de aminoacido de la misma esta representada por SEQ ID NO: 18. Por otra parte, las identidades de secuencia de los genes que codifican homologo humano y el gen que codifica homologo de caballo fueron 93 % a nivel de secuencia de nucleotidos y 96 % al nivel de la secuencia de aminoacidos en las regiones para su traduccion en protelnas. Asimismo, las identidades de secuencia de los genes de perro obtenidas y los genes que codifican homologo de raton fueron 87 % a 89 % a nivel de secuencia de nucleotidos y 95 % a 97 % al nivel de la secuencia de

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aminoacidos en las regiones para su traduccion en protelnas. La secuencia de nucleotidos de homologos de raton estan representadas por SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25 y 27 y las secuencias de aminoacidos de las mismas estan representadas por SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26 y 28. Por otra parte, las identidades de secuencia de los genes que codifican homologo humano y los genes que codifican homologo de raton fueron 89 % a 91 % a nivel de secuencia de nucleotidos y fueron 95 % a 96 % al nivel de la secuencia de aminoacidos en las regiones para su traduccion en protelnas. Asimismo, las identidades de secuencia de los genes de perro obtenidas y el gen que codifica homologo de pollo fueron 82 % a nivel de secuencia de nucleotidos y 87 % al nivel de la secuencia de aminoacidos en las regiones para su traduccion en protelnas. La secuencia de nucleotidos del homologo de pollo esta representada por SEQ ID NO: 29 y las secuencias de aminoacido de la misma esta representadas por SEQ ID NO: 30, Por otra parte, las identidades de secuencia de los genes que codifican homologo humano y el gen que codifica homologo de pollo fueron 81 % a 82 % a nivel de secuencia de nucleotidos y 86 % al nivel de la secuencia de aminoacidos en las regiones para su traduccion en protelnas.

(4) Analisis de expresion de gen en cada tejido

Se examino la expresion de genes obtenidos a traves del metodo mencionado en tejidos normales de perro y ser humano y varias llneas celulares por metodo de RT-PCR. Se llevo a cabo la reaccion de transcripcion inversa del siguiente modo. Concretamente, se extrajo ARN total de 5 mg de cada tejido o 5 a 10 x 106 celulas de la llnea celular utilizando un reactivo TRIZOL (Invitrogen) de acuerdo con los protocolos adjuntados. Se sintetizo ADNc con el ARN total utilizando un sistema de slntesis de primera cadena Superscript para RT-PCR (Invitrogen) de acuerdo con los protocolos adjuntados. Se llevo a cabo la PCR del siguiente modo, utilizando cebadores de SEQ ID NO: 33 y 34 especlficos para los genes obtenidos. Concretamente, se anadieron reactivos y un tampon de acompanamiento a 0,25 pl de la muestra preparada por reaccion de transcripcion inversa a un volumen total de 25 pl para que el producto resultante tuviera contenido en los cebadores mencionados de 2 pM cada uno de dNTPs de 0,2 mM cada uno y 0,65 U ExTaq polimerasa (Takara Shuzo Co., Ltd.). Se llevo a cabo la PCR repitiendo un ciclo de 94 °C durante 30 segundos, 60 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 30 segundos 30 veces utilizando un ciclador termico (BIO RAD). Los cebadores especlficos de gen mencionados fueron capaces de amplificar la region comprendida entre los nucleotidos 206 y 632 en la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 5 (gen CAPRIN-1 de perro) y la region comprendida entre los nucleotidos 698 y 1124 en la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 1 (gen CAPRIN-1 humano). Como control, para fines comparativos, se utilizaron tambien cebadores especlficos de GAPDH de SEQ ID NO: 35 y 36 simultaneamente. Como resultado, tal como se muestra en la Fig. 1, se observo una fuerte expresion en los testlculos de tejidos de perro normales, al mismo tiempo que se observo la expresion en tejidos de cancer de mama y adenocarcinoma de perro. Por otra parte, se llevo a cabo tambien la observacion de la expresion de los homologos humanos desde los genes obtenidos. Como resultado, de manera similar al caso del gen CAPRIN-1 de perro se pudo observar la expresion solamente en los tejidos normales de testlculos. Sin embargo, en el caso de celulas cancerosas, se detecto la expresion en muchos tipos de llneas celulares de cancer, incluyendo cancer de mama, tumor cerebral, leucemia, cancer de pulmon y cancer de esofago. Se observo la expresion en particular en muchas llneas celulares de cancer de mama. Se confirmo segun los resultados que la expresion de CAPRIN-1 no se observaba en tejidos normales distintos a los testlculos, mientras que CAPRIN-1 se expreso en muchas celulas cancerosas y, en particular, en llneas celulares de cancer de mama.

En la Fig. 1, en referencia al numero 1 en cada eje vertical se indican los parones de la expresion de los genes identificados y el numero de referencia 2 indica los patrones de expresion del gen GAPDT como control.

(5) Tincion inmunohistoqulmica

(5)-1 Expresion de CAPRIN-1 en tejidos normales de raton y perro

Se desangraron ratones (Balb/c, hembra) y perros (sabuesos, hembra) con anestesia y anestesia con cetamina/isoflurano. Despues de la laparotomla, se transfirio cada uno de los organos (estomago, hlgado, globo ocular, glandula del timo, musculo, medula osea, utero, intestino delgado, esofago, corazon, rinon, glandula salivar, glandula mamaria del intestino grueso, cerebro, pulmon, piel, glandula suprarrenal, ovario, pancreas, bazo y vejiga) a un disco de 10 cm que contenla PBS. Se corto para abrir cada uno de los organos en PBS y a continuation, se sometio a fijacion por perfusion durante toda la noche en tampon fosfato 0,1 M (pH 7,4) que contenla 4 % de paraformaldehldo (PpfA). Se descarto la solution por perfusion, se aclaro la superficie de tejido de cada organo con PBS, se anadio una solucion de PBS que contenla 10 % de sacarosa a un tubo de centrlfuga de 50 ml, se anadio cada uno de los tejidos al tubo y a continuacion, se agito el tubo utilizando un rotor a 4 °C durante 2 horas. Se reemplazo la solucion por una solucion de PBS que contenla 20 % de sacarosa y despues se dejo en reposo a 4°C hasta que se hundio el tejido. Se reemplazo la solucion por una solucion de PBS que contenla 30 % de sacarosa y despues se dejo en reposo a 4°C hasta que se hundio el tejido. Se separo el tejido y se extirparon las porciones necesarias con un bisturl quirurgico. A continuacion, se anadio un compuesto OCT (Tissue Tek) al tejido para aplicarlo a fondo en la superficie del tejido y despues se coloco el tejido en un criomolde. Se coloco el criomolde en hielo seco para la congelation rapida. A continuacion, se corto el tejido en 10 pm a 20 pm utilizando un criostato (LEICA). Se secaron al aire los cortes en vidrios portaobjetos utilizando un secador de pelo durante 30 minutos para preparar tejido cortado montado en un vidrio portaobjetos. A continuacion, se coloco cada una de las muestras en un bote de tincion rellenado con PBS-T (solucion salina que contenla 0,05 % Tween20) y despues se sometio a

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reemplazamiento con PBS-T repitiendose tres veces cada 5 minutos. Se elimino el exceso de agua en torno a las secciones con toallitas Kimwipes y despues se circundaron las seccionas utilizando un DAKOPEN (DAKO). Como soluciones de bloqueo, se superpuso un reactivo de bloqueo de IgG de raton MOM (VECTASTAIN) y una solucion de PBS-T que contenla 10 % FBS sobre tejido de raton y tejido de perro, respectivamente y despues se dejaron en reposo en una camara de humedad a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuacion, se coloco encima una solucion del anticuerpo monoclonal ant-CAPRIN-1 (anticuerpo monoclonal No. 6; preparado en el Ejemplo 3) de 10 pg/ml ajustado con una solucion de bloqueo que reacciona con superficies de celulas de cancer y comprende la region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 73 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 77 y se dejo en reposo durante toda la noche en una camara de humead a 4 °C. Se llevaron a cabo lavados de10 minutos con PBS-T tres veces y despues se diluyo un anticuerpo anti-IgG marcado con biotina MOM (VECTASTAIN) diluido 250 veces con la solucion de bloqueo y a continuacion se dejo en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora en una camara de humedad. Al cabo de diez (10) minutos de lavado con PBS-T tres veces, se coloco encima un reactivo ABC de avidina-biotina (VECTASTAIN) y se dejo en reposo la muestra en una camara de humedad a temperatura ambiente durante 5 minutos. Al cabo de 10 minutos de lavado con PBST, realizado 3 veces, se coloco encima una solucion de revelado de color DAB (DAB 10 mg + 30 % H2O2 10 pl/0,05 M Tris-HCl (pH 7,6) 50 ml) y despues se dejo en reposo la muestra en una camara de humedad a temperatura ambiente durante 30 minutos. Despues de aclarar con agua destilada, se coloco encima un reactivo de hematoxilina (DAKO) y se dejo en reposo la muestra a temperatura ambiente durante 1 minuto y despues se aclaro con agua destilada. Se sumergio el vidrio portaobjetos en 70 %, 80 %, 90 %, 95 % y despues 100 % de soluciones de etanol en ese orden durante 1 minuto cada una y se dejo en reposo durante toda la noche en xileno. Se separo el vidrio portaobjetos, se sello en medio de montaje Glycergel (DAKO) y despues se observo. Como resultado, se observo ligeramente la expresion de CAPRIN- 1 en las celulas de cada uno de los tejidos de glandula salivar, rinon, colon y estomago, si bien la expresion de los mismos no se observo en las superficies de tejido. Por otra parte, no se observo ninguna expresion en tejidos de otros organos. Por otra parte, se obtuvieron resultados similares en el caso del uso de anticuerpo monoclonal anti- CAPRIN-1 (anticuerpo monoclonal No. 9) que comprende la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 103 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 107.

(5)-2 Expresion de CAPRIN-1 en tejido de cancer de mama de perro

Se prepararon portaobjetos de seccion congelada a traves de un metodo similar al expuesto utilizando 108 muestras de tejido de cancer de mama de perros patologicamente diagnosticados por tener cancer de mama maligno y se llevo a cabo la tincion inmunohistoqulmica utilizando el anticuerpo monoclonal No. 6 preparado en el Ejemplo 3. Como resultado, se observo la expresion de CAPRIN-1 en 100 de las 108 muestras (92,5 %) y se expreso CAPRIN- 1 fuertemente en las superficies de las celulas cancerosas con un grado de atipismo particularmente alto. Por otra parte, se obtuvieron resultados similares en el caso del uso del anticuerpo monoclonal No. 9 preparado en el Ejemplo 3.

(5)-3 Expresion de CAPRIN-1 en tejido de cancer de mama humano

Se llevo a cabo la tincion inmunohistoqulmica utilizando 188 muestras de tejido de cancer de mama en una matriz de tejido de cancer de mama humano incorporado con parafina (BIOMAX). Al cabo de 3 horas de tratamiento de la matriz de tejido de cancer de mama humano a 60 °C, se coloco la matriz en un bote de tincion rellenado con xileno, seguido del reemplazamiento de xileno repitiendose tres veces cada 5 minutos. A continuacion, se realizo un procedimiento similar con etanol y PBS-T en lugar de xileno. Se coloco la matriz de tejido de cancer de mama en un bote de tincion cargado con tampon citrato 10 mM (pH 6.0) que contenla 0,05 % Tween 20. Al cabo de 5 minutos de tratamiento a 125 °C, se dejo en reposo la matriz a temperatura ambiente durante 40 minutos o mas. Se elimino el exceso de agua alrededor de las secciones con toallitas Kimwipes, se rodearon con un clrculo las secciones con un DAKOPEN y se anadio gota a gota peroxidasa en bloque (DAKO) en cantidades apropiadas. Despues de dejarlo en reposo a temperatura ambiente durante 5 minutos, se cloco la matriz en un bote de tincion cargado con PBS-T seguido de pBS-T repitiendose el reemplazamiento tres veces cada 5 minutos. Como solucion de bloque, se coloco una solucion de PBS-T que contenla fBs al 10 % en la matriz y a continuacion, se dejo en reposo la matriz en una camara de humedad a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuacion, se coloco encima una solucion del anticuerpo monoclonal No. 6 (preparado en el Ejemplo 4) de 10 pg/ml ajustada con una solucion de PBS-T que contenla FBS al 5 %, que reacciona con las superficies de celulas cancerosas y se dejo en reposo la matriz durante toda la noche en una camara de humedad a 4 °C. Al cabo de diez (10) minutos de lavado con PBS-T, realizado 3 veces, se anadio gota a gota pollmero conjugado marcado con peroxidasa (DAKO) en cantidades apropiadas y despues se dejo en reposo la matriz en una camara de humedad, a temperatura ambiente durante 30 minutos. Al cabo de (10) minutos de lavado con PBST, realizado 3 veces, se coloco encima una solucion de color DAB (DAKO) y despues se dejo en reposo a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos. Se descarto la solucion colorante, se llevo el lavado de 10 minutos con PBS-T 3 veces y despues se aclaro con agua destilada. Se sumergio el vidrio portaobjetos en 70 %, 80 %, 90 %, 95 % y despues 100 % de soluciones de etanol en este orden durante 1 minuto cada una y se dejo en reposo durante toda la noche en xileno. Se separo el vidrio portaobjetos, se sello en medio de montaje Glycergel (DAKO) y despues se observo. Como resultado, se observo la fuerte expresion de CAPRIN-1 en 138 de un total de 188 muestras de tejido de cancer de mama (73 %). Por otra parte, se obtuvieron resultados similares en el caso de utilizar el anticuerpo monoclonal No. 2 o No. 9 preparado en el Ejemplo 3.

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(5)-4 Expresion de CAPRIN-1 en tumor cerebral maligno humano

Se llevo a cabo la tincion inmunohistoqmmica de acuerdo con un metodo similar al utilizado en (5)-3 anterior con 247 muestras de tejido de tumor cerebral maligno en una matriz de tejido de tumor cerebral maligno humano incorporado en parafina (BIOMAX), utilizando el anticuerpo monoclonal No. 6 preparado en el Ejemplo 3. Como resultado, se observo la fuerte expresion de CAPRIN-1 en 227 de un total de 247 muestras de tejido de tumor cerebral maligno (92 %). Por otra parte, se obtuvieron resultados similares en el caso de utilizar el anticuerpo monoclonal No. 2 y No. 9 preparado en el Ejemplo 3.

(5)-5 Expresion de CAPRIN-1 en ganglio linfatico con metastasis de cancer de mama humano

Se llevo a cabo la tincion inmunohistoquimica de acuerdo con un metodo similar al (5)-3 anterior con 150 muestras de tejido de ganglio linfatico con metastasis de cancer de mama en una matriz de tejido de ganglio linfatico con metastasis de cancer de mama humano incorporado en parafina (BIOMAX), utilizando el anticuerpo monoclonal No. 6 preparado en el Ejemplo 3. Como resultado, se observo la fuerte expresion de CAPR1N-1 en 136 de un total de 150 muestras de tejido de ganglio linfatico con metastasis de cancer de mama (90 %). Concretamente, se revelo que CAPRIN-1 se expresaba fuertemente tambien en tejido de cancer con metastasis de cancer de mama. Por otra parte, se obtuvieron resultados similares en el caso de utilizar el anticuerpo monoclonal No. 2 o No. 9 preparado en el Ejemplo 3.

(5)-6 Expresion de CAPRIN-1 en diversos tejidos de cancer humano

Se llevo a cabo la tincion inmunohistoquimica de acuerdo con un metodo similar al anterior con muestras en varias matrices de tejido de cancer humano incorporadas en parafina (BIOMAX) utilizando el anticuerpo monoclonal No. 6 preparado en el Ejemplo 3. Como resultado, se observo la fuerte expresion de CAPRIN-1 en cancer de esofago, cancer de colon, cancer rectal, cancer de pulmon, cancer renal, cancer de vejiga y cancer de cuello del utero. Por otra parte, se obtuvieron resultados similares en el caso de utilizar el anticuerpo monoclonal No. 2 y No. 9.

Ejemplo 2 Preparacion de nueva proteina de antigeno de cancer humano

(1) Preparacion de proteina recombinante

Sobre la base del gen de SEQ ID NO: 1, se preparo una proteina recombinante desde el gen homologo humano a traves del siguiente metodo. Se realizo la PCR en un volumen total de 50 pl con 1 pl de ADN (cuya expresion habia sido confirmada a traves de un metodo de RT-PCR para el ADNc utilizado en el presente documento entre tejido de cancer de mama o ADNc derivado de celula), dos tipos de cebador (SEQ ID NO: 38 y 39 que comprende secuencias de escision de enzima de restriccion Sac I y Xho I) de 0,4 pM cada una, 0,2 mM dNTP y 1,25 U PrimeSTAR HS polimerasa (Takara Shuzo Co., Ltd.), preparada por adicion de los reactivos y un tampon asociado. Se llevo a cabo la PCR repitiendo un ciclo de 98 °C durante 10 segundos y 68 °C durante 2,5 minutos 30 veces utilizando un ciclador termico (BIO RAD). Los dos cebadores mencionados son capaces de ampliar una region que codifica la secuencia de aminoacidos completa de SEQ ID NO: 2. Despues de la PCR, se sometio el ADN asi amplificado a electroforesis en 1 % de gel de agarosa y despues se purifico un fragmento de aproximadamente 2,1 kbp ADN utilizando un kit de extraccion de gel QIAquick (QIAGEN).

Se ligo el fragmento de ADN asi purificado con un vector de clonacion PCR-Blunt (Invitrogen). Despues de la transformacion de Escherichia coli con el, se recogio el plasmido. Se verifico por secuenciacion que el fragmento de gen asi amplificado tenia la secuencia de interes. Se trato el plasmido que tenia la secuencia pareada con la secuencia de interes con enzimas de restriccion Sac I y Xho I y despues se purifico con un kit de extraccion de gel QIAquick. Se inserto la secuencia de gen de interes en un vector de expresion Escherichia coli pET30a (Novagen) tratado con enzimas de restriccion Sac I y Xho I. Puede producirse una proteina recombinante fusionada con etiqueta His utilizando el vector. Se transformo el plasmido en Escherichia coli para expresion recombinante, BL21(DE3) y se indujo la expresion con 1 mM IPTG, de manera que se expreso la proteina de interes en Escherichia coli.

(2) Purificacion de proteina recombinante

Se cultivo Escherichia coli recombinante que expresa el gen de SEQ ID NO: 1 en medio LB que contenia 30 pg/ml de canamicina a 37 °C hasta que alcanzo una absorbancia a 600 nm en torno a 0,7, se anadio isopropil-p-D-1- tiogalactopiranosida a una concentracion final de 1 mM y se cultivaron las celulas a 37 °C durante 4 horas. Posteriormente, se llevo a cabo la centrifugacion a 4800 rpm durante 10 minutos y se recogieron las celulas. Se suspendio el aglomerado de celulas resultante en solucion salina tamponada con fosfato y se centrifugo a 4800 rpm durante 10 minutos y se lavaron las celulas.

Se suspendieron las celulas en solucion salina tamponada con fosfato y a continuacion se interrumpieron por ultrasonicacion sobre hielo. Se sometio a centrifugacion el lisado resultante de Escherichia coli sometido a ultrasonicacion a 6000 rpm durante 20 minutos y a continuacion se considero el sobrenadante resultante una

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fraccion soluble y se considero el precipitado como una fraccion insoluble.

Se anadio la fraccion soluble a una columna de quelato de nlquel ajustada de acuerdo con el metodo convencional (vehlculo: Sefarosa™ quelante de flujo rapido (GE Healthcare); capacidad de columna de 5 ml; y tampon en equilibrio: 50 mM tampon clorhidrato (pH 80)). Se eliminaron por lavado las fracciones sin adsorber con tampon clorhidrato 50 mM (pH 8,0) en una cantidad de 10 veces mas la capacidad de la columna y tampon fosfato 20 mM (pH 8,0) que contenla 20 mM de imidazol. Inmediatamente despues del lavado, se eluyeron 6 lechos con tampon fosfato 20 mM (pH 8,0) que contenla 100 mM imidazol. Se confirmo la elucion de la protelna de interes por tincion Coomassie en la fraccion de elucion con tampon fosfato 20 mM (pH 8,0) que contenla 100 imidazol y se anadio la fraccion de elucion a una columna de intercambio anionico fuerte (vehlculo: Q Sepharose™ de flujo rapido (GE HealthCare); capacidad de columna 5 ml; y tampon fosfato 20 mM fosfato (pH 8,0) como tampon de equilibrio). Se elimino por lavado una fraccion sin adsorber con tampon fosfato 20 mM (pH 7,0) en una cantidad 10 veces mas la capacidad de la columna y tampon fosfato 20 mM (pH 7,0) que contenla cloruro sodico 200 mM. Inmediatamente despues de lavado, se eluyeron 5 lechos con tampon fosfato 20 mM (pH 7,0) que contenla cloruro sodico 400 mM y se obtuvo la fraccion purificada de la protelna que tenia las secuencias de aminoacido representadas por la SEQ ID NO: 2.

Se dispensaron 200 pl de cada una de las muestras purificadas obtenidas a traves del metodo mencionado en 1 ml de tampon de reaccion (20 mM Tris-HCl, 50 mM, NaCl, 2 mM CaCl2 pH 7,4) seguido de la adicion de 2 pl de enteroquinasa (Novagen). Despues, se dejo en reposo el producto resultante durante toda la noche a temperatura ambiente para su reaccion, de manera que se escindio la etiqueta His y se llevo a cabo la purification utilizando un kit de captura de escision de enteroquinasa (Novagen) de acuerdo con los protocolos adjuntados. A continuation, se sometieron 1,2 ml de la muestra purificada obtenida a traves del metodo expuesto a reemplazamiento de tampon con tampon fosfato fisiologico (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) utilizando ultrafiltracion NANOSEP 10K OMEGA (PALL). Asimismo, se llevo a cabo la filtration esteril utilizando HT Tuffryn Acrodisc 0,22 pm (PALL) y a continuacion, se utilizo el producto resultante para el siguiente experimento.

Ejemplo 3 Preparation de anticuerpo monoclonal de pollo contra CAPRIN-1

Se mezclaron 100 pg de la proteina de antigeno (CAPRIN-1 humana) representada por SEQ ID NO: 2 preparada en el Ejemplo 2 con una cantidad equivalente de adyuvante MPL+TDM (Sigma) y a continuacion se utilizo como una solution de antigeno por raton. Se administro por via intraperitoneal la solution de antigeno a ratones Balb/c de 6 semanas de vida (Japon SLC Inc.) y despues se realizo la administration 3 veces cada semana (24 veces de administration en total) y se completa asi la inmunizacion. Se extirpo cada uno de los bazos el dia 3 despues de la inmunizacion final y se intercalo entre dos vidrios portaobjetos esterilizados y despues se trituro. Se lavo el producto resultante con pBs(-) (Nissui) y despues se centrifugo a 1500 rpm durante 10 minutos para eliminar el sobrenadante. Se repitio este procedimiento 3 veces, de manera que se obtuvieron esplenocitos. Se mezclaron los esplenocitos asi obtenidos y las celulas de mieloma de raton SP2/0 (adquiridas de ATCC) en una relation de 10:1. Se anadio una solucion de PEG preparada mezclando 200 pl de medio RPMI1640 que contenia 10 % de FBS calentado a 37 °C y 800 pl de PEG1500 (Boehringer) a la mezcla, se dejo en reposo 5 minutos para la fusion celular y a continuacion se sometio a centrifugation a 1700 rpm durante 5 minutos. Despues de eliminar el sobrenadante, se suspendieron las celulas en 150 ml de medio RPMI1640 que contenia 15 % de FBS, suplementado con una solucion HAT (Gibco) (2 % equivalente) (medio selectivo HAT) y a, continuacion, se sembro la suspension celular sobre 15 placas de 96 pocillos (Nunc) a 100 pl por pocillo. Se cultivaron las celulas en condiciones de 7 dias a 37 °C en presencia de 5 % CO2, de manera que se obtuvieron los hibridomas preparados por fusion de esplenocitos y celulas de mieloma.

Se seleccionaron hibridomas utilizando como marcador la afinidad de union del anticuerpo producido por los hibridomas producidos para la proteina CAPRIN-1. Se anadio la solucion de protelna CAPRIN-1 (1 pg/ml) preparada en el Ejemplo 1 a una placa de 96 pocillos a 100 pl por pocillo y, a continuacion, se dejo en reposo a 4 °C durante 18 horas. Se lavo cada pocillo 3 veces con PBS-T, se anadieron 400 pl de una solucion de albumina de suero bovino (BSA) al 0,5 % (Sigma) por pocillo y despues se dejo la placa en reposo a temperatura ambiente durante 3 horas. Se separo la solucion y despues se lavaron los pocillos tres veces con 400 pl de PBS-T por pocillo. Se anadio el sobrenadante de cultivo de los hibridomas obtenidos a 100 pl por pocillo y despues se dejo en reposo a temperatura ambiente durante 2 horas. Despues de lavar cada pocillo tres veces con PBS-T, se diluyo el anticuerpo IgG (H+L) anti-raton marcado con HRP (Invitrogen) 5000 veces con PBS a 100 pl por pocillo y se dejo en reposo el producto resultante a temperatura ambiente durante 1 hora. Despues del lavado de los pocillos tres veces con PBS-T, se anadieron 100 pl de una solucion de sustrato de TMB (Thermo) por pocillo y despues se dejo en reposo durante 15 a 30 minutos para la reaccion de revelado del color. Una vez revelado el color, se anadieron 100 pl de acido sulfurico 1N por pocillo para detener la reaccion y a continuacion, se midieron las absorbancias a 450 nm y 595 nm utilizando un espectrometro de absorcion. Como resultado, se seleccionaron varios hibridomas que producen anticuerpos con valores de absorbancia altos.

Se anadieron los hibridomas as! seleccionados a una placa de 96 pocillos, a 0,5 celulas por pocillo y despues se cultivaron. Al cabo de 1 semana, se observaron los hibridomas que hablan formado colonias unicas en los pocillos. Se siguieron cultivando estas celulas en los pocillos y a continuacion, se seleccionaron hibridomas utilizando como

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marcador la afinidad de union de los anticuerpos producidos por los hibridomas clonados con la protelna CAPRIN-1 Se anadio la solucion de protelna CAPRIN-1 (1 pg/ml) preparada en los Ejemplos 1 a una placa de 96 pocillos a 100 pl por pocillo y despues se dejo en reposo a 4 °C durante 18 horas. Se lavo cada pocillo con PBS-T tres veces, se anadieron 400 pl de una solucion de bSa al 0,5 % por pocillo y despues se dejo en reposo el producto resultante a temperatura ambiente durante 3 horas. Se separo la solucion y a continuacion, se lavaron los pocillos tres veces con 400 pl de PBS-T por pocillo. Se anadieron 100 pl de cada sobrenadante de cultivo de los hibridomas obtenidos por pocillo y a continuacion, se dejo en reposo la placa a temperatura ambiente durante 2 horas. Despues de lavar cada pocillo tres veces con PBS, se anadieron 100 pl de un anticuerpo IgG (H+L) anti-raton marcado con HRP (Invitrogen) diluido 5000 veces con PBS por pocillo y despues se dejo en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora. Despues del lavado de los pocillos tres veces con PBS-T, se anadieron 100 pl de solucion de sustrato de TMB (Thermo) por pocillo y despues se dejo en reposo durante 15 a 30 minutos para la reaccion de revelado del color. Tras el revelado del color, se anadieron 100 pl de acido sulfurico 1N por pocillo para detener la reaccion y a continuacion se midieron las absorbancias a 450 nm y 595 nm utilizando un espectrometro de absorcion. Como resultado, se obtuvieron 150 llneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales reactivos con la protelna CAPRIN-1.

A continuacion, se seleccionaron los anticuerpos monoclonales, anticuerpos reactivos con la superficie celular de celulas de cancer de mama que expresan CAPRIN-1. Concretamente, se sometieron 106 celulas de la llnea celular de cancer de mama humano MDA-MB-231V a centrifugacion con un tubo de microcentrlfuga de 1,5 ml y se anadieron 100 pl del sobrenadante de cultivo de cada uno de los hibridomas mencionados al tubo y a continuacion, se dejo en reposo el tubo sobre hielo durante 1 hora. Despues del lavado con PBS, se diluyo un anticuerpo IgG anti- raton de cabra marcado con FITC (Invitrogen) 500 veces con PBS que contenla FBS al 0,1 y a continuacion, se dejo el producto resultante en reposo sobre hielo durante 1 hora. Despues de lavado con PBS, se midio la intensidad fluorescente utilizando un citometro de flujo FACS Calibur (Becton, Dickinson y Company). Mientras tanto, se llevaron a cabo procedimientos similares a los realizados anteriores utilizando el suero (de un raton Balb/c de 6 semanas de vida sin tratar con los anticuerpos) diluido 500 veces con medio para cultivar hibridomas, de manera que se preparo la muestra de control. Como resultado, se seleccionaron 11 anticuerpos monoclonales (No 1 a No. 11) que hablan presentado una intensidad de fluorescencia mas fuerte que la del control y, es decir, que reaccionaron con la superficie celular de celulas de cancer de mama.

Ejemplo 4. Caracterizacion de anticuerpo seleccionado

(1) Clonacion de gen de region variable de anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1

Se extrajo ARNm de cada llnea celular de hibridoma produciendo cada uno de los 11 anticuerpos monoclonales de raton seleccionados en el Ejemplo 3. Se obtuvieron los genes de las regiones variables (VH) de cadena pesada y las regiones variables (VL) de cadena ligera de todos los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 por un metodo de RT-PCR utilizando cebadores especlficos para una secuencia derivada de FR1- de raton y una secuencia derivada de FR4 de raton. Para la determination de secuencia, se clonaron estos genes en un vector pCR2.1 (Invitrogen). Asimismo, se extrajo ARNm de dos llneas celulares de hibridoma derivadas de raton que producen anticuerpos monoclonales reactivos con la superficie de celulas de cancer de mama que expresan CAPRIN-1. Se obtuvieron los genes de la region variable (VH) de cadena pesada y la region variable (VL) de cadena ligera de cada anticuerpo a traves de un metodo de RT-PCR utilizando cebadores especlficos para la secuencia FR1 derivada de raton y la secuencia derivada de FR4 de raton. Para la determinacion de secuencia, se clonaron estos genes en un vector pCR2.1 (Invitrogen).

(1)-1 RT-PCR

Tras la extraction de ARN total de 106 pocillos de cada llnea celular de hibridoma utilizando un kit de aislamiento de ARN puro superior (Roche), se sintetizo ADNc utilizando un kit de slntesis de ADNc de primera cadena PrimeScriptII (Takara). Se llevaron a cabo estos procedimientos de acuerdo con los protocolos adjuntados para cada kit.

Se amplificaron por separado el gen de la region variable de cadena pesada de anticuerpo de raton y el gen de la region variable de cadena ligera de anticuerpo de raton por un metodo de PCR de acuerdo con un metodo convencional utilizando el ADNc as! sintetizado como matriz y KOD-Plus-DNA Polimerasa (TOYOBO).

Para obtener los genes de las regiones VH y VL de anticuerpo de raton, se utilizaron un cebador (SEQ ID NO: 130) especlfico para la secuencia FR1 de cadena pesada de raton, un cebador (SEQ ID NO: 131) especlfico para la secuencia FR4 de cadena pesada de raton, un cebador (SEQ ID NO: 132) especlfico para la secuencia FR1 de cadena ligera de raton, un cebador (SEQ ID NO: 133) especlfico para la secuencia FR4 de cadena ligera de raton.

Se sometio cada uno de los productos de PCR obtenidos a electroforesis con gel de agarosa y se separaron bandas de ADN de la region VH y la region VL. Se purificaron fragmentos de ADN utilizando un kit de purification de gel QIAquick (QIAGEN) de acuerdo con los protocolos adjuntados. Se clono el ADN purificado en un vector pCR2.1 utilizando un kit de clonacion TA (Invitrogen). Se transformo el vector ligado en celulas competentes DH5 (TOYOBO) de acuerdo con un metodo convencional. Se cultivaron 10 clones de cada transformante durante toda la noche en

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medio (1000 |jg/ml de ampicilina) a 37 °C y a continuacion, se purifico el ADN de plasmido utilizando un kit Qiaspin Miniprep (QIAGEN).

(1) -2 Determinacion de secuencia

Se analizaron las secuencias de genes de la region VH y la region VL de cada plasmido obtenido con un cebador directo M13 (SEQ ID NO: 134) y un cebador inverso M13 (SEQ ID NO: 135) sobre un secuenciador de fluorescencia (Secuencia ADN 3130XL; ABI), utilizando un kit de secuenciacion por ciclos Big Dye Terminator Ver3.1 (ABI) de acuerdo con los protocolos adjuntos. Como resultado se determino cada secuencia de genes. Las secuencias de genes fueron identicas entre los 10 clones.

Las secuencias de genes de la region variable de cadena pesada de los anticuerpos monoclonales as! obtenidos estan representadas cada una de ellas por SEQ ID No: 48, 78, 88, 98, 108, 118 y 128 y las secuencias de aminoacido de las regiones variables de cadena pesada cada una de ellas representadas por las SEQ ID NO: 43, 73, 83, 93, 103, 113 y 123. Las secuencias de genes de las regiones variables de cadena ligera de los mismos anticuerpos monoclonales estan representadas cada una de ellas por las SEQ ID NO: 49, 54, 59, 64, 69, 79, 89, 99, 109, 119 y 129 y las secuencias de aminoacidos de la region variable de cadena ligera estan representadas cada una de ellas por SEQ ID NO: 47, 53, 58, 63, 68, 77, 87, 97, 107, 117 y 127.

Concretamente, el anticuerpo monoclonal No.1 comprende la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 47, No. 2 comprende la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 53, No. 3 comprende la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 58, No. 4 comprende la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 63, No. 5 comprende la region variable de cadena pesada de sEq ID NO: 43 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 68, No. 6 comprende la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 73 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 77, No. 7 comprende la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 83 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 87, No. 8 comprende la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 93 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 97, No. 9 comprende la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 103 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 107, No.10 comprende la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 113 y la region variable de cadena ligera de SeQ ID NO: 117 y No. 11 comprende la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 123 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 127.

(2) Expresion de CAPRIN-1 en la superficie de varias celulas cancerosas utilizando anticuerpos anti-CAPRIN-1 No.2 y No.9

A continuacion, se examinaron 7 llneas celulares de cancer de mama (MDA-MB-157, T47D, MRK-nu-1, MDA-MB- 231V, BT20, SK-BR-3 y MDAMB-231T) para la que se habla observado la expresion de gen de CAPRIN-1 y las otras 3 llneas de cancer de mama (MDA-MB-231C, MCF-7 y ZR75-1), 5 llneas celulares de glioma (T98G, SNB19, U251, U87MG y U373), 4 llneas celulares de cancer renal (Caki-1, Caki-2, A498 y ACHN), 2 llneas celulares de cancer gastrico (MNK28 y MKN45), 5 llneas celulares de cancer colorrectal (HT29, LoVo, Caco2, SW480 y HCT116), 3 llneas celulares de cancer de pulmon (A549, QG56 y PC8), 4 llneas celulares de leucemia (AML5, Namalwa, BDCM, RPI1788), una (1) llnea celular de linfoma (Ramos), una (1) llnea celular de cancer de cuello del utero (SW756), una (1) llnea celular de cancer de vejiga (T24) y una (1) llnea celular de cancer esofagico (KYSE180) en cuanto a la expresion de protelna CAPRIN-1 sobre la superficie celular de cada llnea celular utilizando sobrenadantes de cultivo de hibridomas que producen No. 2 y No. 9 obtenidos en el Ejemplo 3. Se centrifugaron 106 celulas de cada llnea celular utilizando un tubo de microcentrifuga de 1,5 ml. Se anadio cada uno de los sobrenadantes de cultivo (100 jl) de hibridomas que producen No. 2 y No. 9 obtenidos en el Ejemplo 3 y a continuacion se dejo en reposo sobre hielo durante 1 hora. Despues del lavado con PBS, se anadieron anticuerpo IgG (H+L) humano anti-cabra marcado con FITC (SouthernBiotech) diluido 500 veces con PBS con contenido de FBS al 0,1 % y anticuerpo IgG (H+L) anti-raton marcado con FITC (Invitrogen) y despues se dejo en reposo el producto resultante sobre hielo durante 1 hora. Despues del lavado con PBS, se midio la intensidad fluorescente utilizando un FACS Calibur (Becton, Dickinson y Company). Al mismo tiempo, se llevo a cabo un procedimiento similar al anterior utilizando un medio para cultivar hibridomas y se utilizo como control negativo. Como resultado, las celulas a las que se hablan anadido los anticuerpos No. 2 y No. 9 presentaron una intensidad de fluorescencia superior al 20 % o mas que la del control. Se revelo a partir de estos resultados que la protelna CAPRIN-1 se expresaba en las superficies de la membrana celular de la llnea celular de cancer humano mencionada. Se expreso el porcentaje de potenciacion de la intensidad de fluorescencia mencionada como porcentaje de aumento en la intensidad de fluorescencia media (nivel MFI) en cada tipo de celula y se calculo a traves de la siguiente formula.

Porcentaje de aumento de la intensidad de fluorescencia media (porcentaje de potenciacion de la intensidad de

fluorescencia) (%) = ((nivel MFI en celulas que han reaccionado con el anticuerpo CAPRIN-1 anti-humano) -

(Nivel MFI del control)) / (nivel MFI de control) x 100.

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(3) Efecto anti-tumoral de anticuerpos anti-CAPRIN-1 sobre celulas cancerosas (actividad ADCC)

Se evaluaron los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 seleccionados No. 1 y No. 11 en cuanto a sus actividades de citotoxicidad contra celulas cancerosas (actividad ADCC). Se cultivaron los hibridomas que produjeron los anticuerpos monoclonales No. 1 y No. 11 utilizando medio SMF de hibridoma (Invitrogen). Se purifico el sobrenadante as! obtenido utilizando flujo rapido de Sefarosa de protelna A Hitrap (GE Health Care) reemplazado con PBS(-) y a continuacion, se filtro a traves de un filtro de 0,22 pm (Millipore). Se utilizaron los filtrados obtenidos como anticuerpos para el ensayo. Se recogio la llnea celular de cancer de mama humano MDA-MB-157 (106 celulas) en un tubo de centrlfuga de 50 ml al que se anadieron 100 pCi de cromo (Cr-51 y se incubo a 37 °C durante 2 horas. A continuacion, se lavaron las celulas 3 veces con medio RPMI1640 que contenla 10 % FBS y despues se dispenso en cada pocillo de una placa de fondo en V de 9 pocillos a 103 celulas por pocillo. Se utilizaron las celulas as! obtenidas como celula diana. Se anadieron los anticuerpos purificados mencionados (1 pg de cada uno) a las celulas. Por separado, se anadieron ademas linfocitos de raton separados del bazo del raton (2 x 105 celulas) a continuacion, se cultivaron en condiciones de 37 °C y 5 % CO2 durante 4 horas. Despues del cultivo, se midio la cantidad de cromo (Cr)-51 liberado desde las celulas de tumor citotoxicamente danadas en un sobrenadante de cultivo, para calcular la actividad ADCC de cada anticuerpo anti-CAPRIN-1 contra celulas cancerosas. Como resultado, todos los anticuerpos monoclonales No. 1 a No. 11 presentaron 20 % o mas de actividad ADCC contra MDA-MB-157. Concretamente por ejemplo, No. 1 presento 22,1 % de actividad citotoxica, No. 2 presento 29,1 % de actividad citotoxica, No. 6 presento 30,2 % de actividad citotoxica y No. 9 presento 32,4 % de actividad citotoxica (vease Fig. 2). Por otra parte, se llevaron a cabo procedimientos similares utilizando los anticuerpos monoclonales (que se prepararon en el Ejemplo 2) reactivos con la propia protelna CAPRIN-1, pero no reactivos con la superficie de celulas cancerosas, no se observo actividad citotoxica (vease Fig. 2). A partir de estos resultados, se demostro que los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 (No.1 a No.11) danaron citotoxicamente celulas cancerosas que expresan CAPRIN-1 por la actividad ADCC. De manera similar, se examinaron los anticuerpos anti-CAPRIN-1 en cuanto a la actividad ADCC contra otras llneas celulares de cancer humano incluyendo llneas celulares de glioma (T98G y U373), llneas celulares de cancer de pulmon (A549 y QG56), llneas celulares de cancer renal (Caki-1 y ACHN), una llnea celular de cancer del cuello del utero (SW756), una llnea celular de cancer de vejiga (T24), una llnea celular de cancer de esofago (KYSE180), llneas celulares de cancer gastrico (MNK28 y MNK45), una llnea celular de cancer colorrectal (SW480), una llnea celular de leucemia (AML5) y una llnea celular de linfoma (Ramos). Como resultado, todos los anticuerpos monoclonales No.1 a No.11 presentaron actividades ADCC superiores a las de los controles isotipo. Concretamente, por ejemplo, No. 9 presento un 12 % o mas (1,3 % en el caso del control isotipo) de actividad contra T98G. No. 9 presento 16 % o mas (3 % en el caso del control isotipo) contra U373, No.9 presento 24 % o more (2.6 % en el caso de control isotipo) actividad contra A549, No. 9 presento 20 % o mas (0,2 % en el caso de control isotipo) de actividad contra QG56, No. 9 presento 23 % o mas (3,0 % en el caso de control isotipo) contra Caki-1, No. 9 presento 14 % o mas (1,5 % en el caso de control isotipo) contra ACHN, No. 9 presento 16 % o mas actividad (2,5 % en el caso de control isotipo) contra SW756, No. 9 presento 18 % o mas de actividad (2,1 % en el caso de control isotipo) contra T24, No. 9 presento 22 % o mas actividad (3.0 % en el caso de control isotipo) contra KYSE180, No.9 presento 15 % o mas actividad (1,7 % en el caso de control isotipo) contra MNK28, No. 9 presento 10 % o mas de actividad (2,3 % en el caso de control isotipo) contra MNK45, No. 9 presento 17 % o mas de actividad (1,3 % en el caso de control isotipo) contra SW480, No. 9 presento 10 % o mas de actividad (3,0 % en el caso de control isotipo) contra AML5 y No. 9 presento 10 % o mas de actividad (4,1 % en el caso de control isotipo) contra Ramos. Se demostro a partir de estos resultados que los anticuerpos anti-CAPRIN-1 obtenidos (No.1 a No.11) danaron citotoxicamente varias celulas cancerosas humanas que expresan CAPRIN-1.

(4) Efecto anti-tumoral de anticuerpos anti-CAPRIN-1 sobre celulas cancerosas (actividad CDC)

Se evaluaron los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 antes seleccionados No.1 a No.11 en cuanto a la actividad citotoxica contra celulas cancerosas (actividad CDC). Se anadio sangre extralda de un conejo a un tubo Eppendorf y se dejo en reposo a temperatura ambiente durante 60 minutos y despues se centrifugo a 3000 rpm durante 5 minutos. De este modo, se preparo suero para el ensayo de la actividad CDC. Se recogieron 105 celulas de celula de cancer de mama humano MDA-MB-231V en un tubo de centrlfuga de 50 ml al que se anadieron 100 pCi de cromo-51 y se incubo a 37 °C durante 2 horas. Se lavaron las celulas 3 veces con medio RPMI que contenla 10 % FBS, suspendido en medio RPMI que contenla el suero de conejo antes preparado a una concentration de 50 % y despues se dispenso en cada uno de los pocillos de una placa de fondo en V de 96 pocillos a 103 por pocillo. Se anadieron los anticuerpos monoclonales No.1 a No.13 obtenidos en el Ejemplo 3 (1 pg de cada uno) a las celulas, que se cultivaron despues en condiciones de 37 °C y 5 % CO2 durante 4 horas. Despues del cultivo, se midio la cantidad de cromo-51 liberado de las celulas de tumor danadas citotoxicamente en un sobrenadante de cultivo y se calculo la actividad CDC de cada anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 contra MDA-MB-231V en un sobrenadante de hibridoma. Como resultado, todos los anticuerpos monoclonales No.1 a No.11 presentaron 30 % o mas de actividad CDC. Por otra parte, no se observo actividad citotoxica cuando se realizaron procedimientos similares utilizando los anticuerpos monoclonales (que se prepararon en el Ejemplo 2) reactivos con la propia CAPRIN-1 pero no reactivos con la superficie de celulas cancerosas. Por lo tanto, se revelo que los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 (No.1 a No.11) pueden danar citotoxicamente celulas de tumor que expresan CAPRIN- 1, tal como se observa tambien a partir de los resultados de la actividad CDC.

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Ejemplo 5 Identificacion de un peptido en una protelna CAPRIN-1 a la que se unen anticuerpos anti-CAPRIN-1 reactivos con la superfine de celulas cancerosas

Se identifico una secuencia parcial de protelna CAPRIN-1 para que la reconocieran los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 obtenidos No.1 a No.11 reactivos con la superficie de celulas cancerosas utilizando cada anticuerpo.

En primer lugar, se anadio DTT (Fluka) a 100 pl de una solucion de protelna CAPRIN-1 recombinante preparada disolviendo la protelna a una concentracion de 1 pg/ml en PBS para que la concentracion final fuera 10 mM seguido de 5 minutos de reaccion a 95 °C. Se redujeron los enlaces de disulfuro con la protelna CAPRIN-1, se anadio yodacetamina (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) a una concentracion final de 20 mM y a continuacion, se realizo la reaccion de alquilacion de un grupo tiol a 37 °C en condiciones de blindaje ligeras durante 30 minutos. Se anadio cada uno de los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 No.1 a No.11 (50 pg cada uno) a 40 pg de la protelna CAPRIN-1 as! reducida y alquilada. Se diluyo cada solucion a un volumen de 1 ml con tampon fosfato 20 mM (pH 7,0) seguido de reaccion a 4 °C durante toda la noche al mismo tiempo que se agitaba y se mezclaba la solucion.

A continuacion, se anadio tripsina (Promega) a una concentracion final de 0,2 pg. Despues de la reaccion a 37 °C durante 1 hora, 2 horas, 4 horas, o 12 horas, se bloqueo cada producto resultante con PBS que contenla 1 % BSA (Sigma) con antelacion y despues se mezclo con perlas de vidrio de protelna A (GE) que se lavaron previamente con PBS y carbonato de calcio 1 mM en tampon NP-40 (tampon fosfato 20 mM (pH 7,4), EDTA 5 mM, NaCl 150 mM, 1 % NP-40), seguido de 30 minutos de reaccion para cada solucion.

Se lavo la mezcla de reaccion con tampon carbonato de amonio 25 mM (pH 8,0) y despues se eluyo un complejo antlgeno-anticuerpo utilizando 100 ml de acido formico al 0,1 %. Se sometio el eluato a analisis cL-EM utilizando QTOF Premier (Waters-MicroMass). Se llevo a cabo el analisis CL-EM de acuerdo con los protocolos adjuntados al aparato.

Como resultado, se identifico el polipeptido de SEQ ID NO: 37 como secuencia CAPRIN-21 parcial, que fue reconocida por cualquiera de los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN No.1 a No.11.

Ejemplo 6 Efecto de agentes antitumoral sobre la expresion de CAPRIN-1 sobre la superficie de celulas cancerosas.

(1) Calculo de concentracion inhibitoria 50 % de agentes antitumorales contra celula cancerosa

Para evaluar el efecto de agentes antitumorales sobre la expresion de CAPRIN -1 sobre la superficie de una celula cancerosa, se calculo la concentracion inhibitoria 50 % de cada agente antitumoral utilizando la celula cancerosa MCF-7. Utilizando la llnea celular de cancer de mama humano MCF-7 se examino el concentracion inhibitoria 50 % de 4 tipos de agentes antitumorales que se utilizan actualmente como remedios contra el cancer de mama (es decir, ciclofosfamida: "Endoxan" (marca comercial registrada, Shionogi & Co., Ltd.), paclitaxel:"Taxol" (marca comercial registrada, Bristol-Myers), docetaxel: "Taxotere" (marca comercial registrada, Sanofi-aventis K.K.), vinorelbina: "Navelbine" (marca comercial registrada, Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.)). Se preparo la llnea celular para 1 x 105 celulas/ml y despues se cultivo en una placa de 6 pocillos en condiciones de 37 °C y 5 % CO2 durante un dla. A continuacion, se trato la celula con cada uno de los agentes antitumorales a concentraciones finales de 0,001 pM, 0,01 pM, 0,1 pM, 1,0 pM y 10 pM, seguido de dos dlas de cultivo en condiciones de 37 °C y 5 % CO2. Una vez separado el medio de cultivo, se lavaron las celulas dos veces con PBS(-) al que se anadio 0,25 % de tripsina-EDTA para desprender las celulas de la placa. Se suspendieron las celulas desprendidas con PBS(-) a un volumen de 100 pl, al que se anadieron 10 pl de solucion de reserva de azul de tripano al 0,4 % y se midio la mezcla para los recuentos de celulas vivas utilizando un hemocitometro. Se calculo la tasa de celulas vivas en el caso de tratar las celulas con cada agente antitumoral (es decir, un quimioterapeutico), en donde el numero de celulas vivas en el caso de no tratar las celulas con cada agente antitumoral fue designado a 100 %. Se estimo la concentracion inhibitoria 50 % aproximadamente sobre la base de los valores obtenidos y se preparo cada agente de tumor para tener una concentracion en torno a la concentracion inhibitoria 50 % determinada y a continuacion, se realizaron otros procedimientos similares a estos para calcular una concentracion inhibitoria 50 % mas especlfica.

A modo de ejemplo, a continuacion se describen los resultados del examen de ciclofosfamida (un agente antitumoral). Se preparo una llnea celular MCF-7 a 1 x 105 celulas/ml y despues se cultivo en una placa de 6 pocillos en condiciones de 37 °C y 5 % CO2 durante un dla. A continuacion, se trataron las celulas con ciclofosfamida a concentraciones finales de 1 x 10-1 pM, 5 x 10-2 pM, 2 x 10-2 pM y 1 x 10-2 pM, seguido de 2 dlas de cultivo en condiciones de 37 °C y 5 % CO2. Despues de separar el medio de cultivo se lavaron las celulas con PBS(-) dos veces, a lo que se anadio 0,5 % de tripsina-EDTA para desprender las celulas de la placa. Se suspendieron las celulas desprendidas en PBS(-) a un volumen 100 pl, al que se anadieron 10 pl de solucion de reserva de azul de tripano al 0,4 % y se midio la mezcla para los recuentos de celulas vivas utilizando un hemocitometro. Como resultado se determino que la concentracion inhibitoria 50 % era 3 x 10-2 pM. Se calcularon los valores IC50 de los agentes antitumorales correspondientes en cada tipo de celulas cancerosas aplicando los mismos procedimientos. En la Tabla 1 se muestran los resultados.

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Tabla 1

Concentracion inhibitoria 50 % de agentes antitumorales contra MCF-7

Ciclofosfamida (pM): 3 x 10'2

Placlitaxel (pM): 1 x 10'2

Docetaxel (pM): 1 x 10'4

Vinorelbina (pM): 2 x 10'2

(2) Efecto de agentes antitumorales sobre la expresion de CAPRIN-1 tras el tratamiento de celula cancerosa con ellos

Se trato una linea de celulas cancerosas MCF-7 con cada uno de los agentes antitumorales a una concentration inhibitoria 50 % calculada en (1) y se examino el comportamiento de expresion de una proteina CAPRIN-2 sobre la superficie celular.

Se examino el comportamiento de expresion de la proteina CAPRIN-1 en la superficie de las celulas de cancer de mama humano MCF-7 tratadas. Se prepararon las celulas a una concentracion de 1 x 105 celulas/ml y despues se cultivaron en una placa de 6 pocillos en condiciones de 37°C y 5 % CO2 durante 1 dia. A continuation, se trataron las celulas con agentes antitumorales a una concentracion inhibitoria 50 % calculada en (1) o con PBS(-) como control y despues se cultivo en condiciones de 37°C y 5 % CO2 durante 2 dias. Despues de separar el medio de cultivo, se lavaron las celulas con PBS(-) dos veces y despues se desprendieron de la placa utilizando un raspador para celulas. A continuacion, se centrifugaron las celulas con un tubo de microcentrifuga de 1,5 ml. Se anadio uno (1) pg (5 pl) de anticuerpo monoclonal de raton anti-CAPRIN-1 No. 9 a las celulas separadas que se suspendieron posteriormente en 95 pl de PBS que contenia 0,1 % de suero de becerro y despues se dejaron en reposo durante 1 hora. Despues de lavaron con pBs, se suspendieron las celulas en PBS que contenia 5 pl de anticuerpo IgG anti- conejo de cabra marcado con FITC (Santa Cruz) y 95 pl de suero bovino fetal al 0,1 % (FBS) y despues se dejo en reposo durante 1 hora. Despues del lavado con PBS, se midio la intensidad de fluorescencia utilizando FACS Caliber (Becton, Dickinson y Company). Mientras tanto, se llevo a cabo el mismo procedimiento utilizando un anticuerpo de control en lugar del anticuerpo monoclonal de raton anti-CAPRIN-1 y se utilizo como control. Como resultado, no se observo ninguna diferencia significativa en la intensidad de fluorescencia a pesar del tratamiento con un agente antitumoral. Concretamente, la intensidad de fluorescencia obtenida en el caso de anadir el anticuerpo anti-CAPRIN-1 a MNCF-7 sin tratar con ningun agente antitumoral indico un 32 % mas alto de potenciacion en comparacion con el caso en el que se anadio el anticuerpo de control. Por otra parte, cuando se trato MCF-7 con el agente antitumoral utilizando el mismo procedimiento, se observo el 32 % de potenciacion de la intensidad de fluorescencia y por tanto este resultado fue el mismo que en el caso en el que no hubo tratamiento con el agente antitumoral. Se relevo a partir de estos resultados que el tratamiento de celulas de cancer de mama con un agente antitumoral no tiene efecto sobre la expresion de CAPRIN-1 en la superficie de celulas de cancer de mama. En este caso el porcentaje de potenciacion de la intensidad de fluorescencia se represento con el porcentaje de aumento de la intensidad de fluorescencia media (nivel MFI) en cada celula y se calculo a traves de la siguiente formula:

Porcentaje de aumento de la intensidad de fluorescencia media (porcentaje de potenciacion de la intensidad de fluorescencia) (%) = ((nivel de MFI de celulas que han reaccionado con anticuerpo CAPRIN-1 anti-humano) - (nivel de FMI de control)) (nivel MFI control) x 100

Ejemplo 7 Terapia de combination In vivo mediante la utilization de anticuerpo anti-CAPRIN-1 y agente antitumoral

(1) Se examino, con el uso de ratones portadores de tumor en los que se habia trasplantado una linea de celulas de cancer de mama humanas MCF-7 que expresa CAPRIN-1 el efecto antitumoral del uso combinado de un anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 y agentes antitumorales. El metodo para examinar el efecto antitumoral utilizando ratones en los que se habia trasplantado MCF-7 y los resultados del mismo se describen a continuacion. Se trasplantaron 106 celulas MCF-7 (adquiridas de ATCC) subcutaneamente en la region dorsal de cada uno de 280 ratones desnudos (Jana SLC Inc.). Se dejo desarrollar a los ratones hasta que cada uno de los tumores alcanzo un tamano de aproximadamente 7 mm de diametro.

A continuacion, tal como se describe concretamente en la siguiente section experimental 1 y la section experimental 2, se dividieron los ratones portadores de tumor en los que se habian trasplantado MCF-7 en 5 grupos, administrandose a un grupo solamente anticuerpo anti-CAPRIN-1, administrandose a un grupo solamente agente antitumoral (de 4 tipos), administrandose a un grupo agente antitumoral y un anticuerpo anti-Her2 (anticuerpo monoclonal ErbB2 anti-humano e raton, isotipo: IgG2b (R&D systems, catalogo No. MAB11291)) en combinacion, administrandose a un grupo un agente antitumoral y anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 en combinacion y administrandose a un grupo control (PBS(-)). Por otra parte, se administro PBMC de raton a todos los grupos de administracion

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(Grupo al que se administro unicamente anticuerpo anti-CAPRIN-1)

Se administro por via intraperitoneal el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 No. 2 a cada uno de 5 ratones portadores de tumor a 5 mg/kg/disparo los dlas 0, 4, 8, 11, 15 y 17 una vez comenzado el experimento. Se administro por via intravenosa PBMC separada de bazo de ratones Balb/c a cada uno de los ratones a 1 x 107 celulas/0,2 ml (RPMI1640) los dlas 0, 8 y 15 tras el comienzo del experimento.

(Grupo al que se administro ciclofosfamida)

Se administro ciclofosfamida por via intraperitoneal a cada uno de los 5 ratones portadores de tumor a 80 mg/kg/disparo los dlas 0 y 4 una vez comenzado el experimento. Se administro por via intravenosa PBMC separada de bazo de ratones Balb/c a cada raton a 1 x 107 celulas/0,2 ml (RPMI1640) los dlas 0,8 y 15 una vez comenzado el experimento.

(Grupo al que se administro paclitaxel)

Se administro por via intraperitoneal Paclitaxel a cada uno de los 5 ratones portadores de tumor a 15 mg/kg/disparo los dlas 0 y 3 una vez comenzado el experimento. Se administro por via intravenosa PBMC separada de bazo de ratones Balb/c a cada raton a 1 x 107 celulas/0,2 ml (RPMI1640) los dlas 0,8 y 15 una vez comenzado el experimento.

(Grupo al que se administro docetaxel)

Se administro por via intraperitoneal docetaxel a cada uno de los 5 ratones portadores de tumor a 10 mg/kg/disparo los dlas 0 y 3 una vez comenzado el experimento. Se administro por via intravenosa PBMC separada de bazo de ratones Balb/c a cada raton a 1 x 107 celulas/0,2 ml (RPMI1640) los dlas 0, 8 y 15 una vez comenzado el experimento.

(Grupo al que se administro vinorelbina)

Se administro por via intraperitoneal vinorelbina a cada uno de los 5 ratones portadores de tumor a 1 mg/kg/disparo el dla 0 una vez comenzado el experimento. Se administro por via intravenosa PBMC separada de bazo de ratones Balb/c a cada raton a 1 x 107 celulas/0,2 ml (RPMI1640) los dlas 0, 8 y 15 una vez comenzado el experimento.

(Grupo al que se administro ciclofosfamida y anti-Her2 anticuerpo)

Se administro por via intraperitoneal ciclofosfamida a cada uno de los 5 ratones portadores de tumor a 80 mg/kg/disparo los dlas 0 y 4 una vez comenzado el experimento y al mismo tiempo se administro intraperitonealmente el anticuerpo anti-Her2 a cada raton a 5 mg/kg/disparo los dlas 0, 4, 8, 11, 15 y 17 una vez comenzado el experimento. Se administro por via intravenosa PBMC separada de bazo de ratones Balb/c a cada raton a 1 x 107 celulas/0,2 ml (RPMI1640) los dlas 0,8 y 15 una vez comenzado el experimento.

(Grupo al que se administro paclitaxel y anti-Her2 anticuerpo)

Se administro por via intraperitoneal paclitaxel a cada uno de los 5 ratones portadores de tumor a 15 mg/kg/disparo los dlas 0 y 3 una vez comenzado el experimento y al mismo tiempo, se administro por via intraperitoneal el anticuerpo anti-Her2 a cada raton a 5 mg/kg/disparo los dlas 0, 4, 8, 11, 15 y 17 una vez comenzado el experimento. Se administro por via intravenosa PBMC separada de bazo de ratones Balb/c a 1 x 107 celulas/0,2 ml (RPMI1640) los dlas 0, 8 y 15 una vez comenzado el experimento.

(Grupo al que se administro docetaxel y anticuerpo anti-Her2)

Se administro por via intraperitoneal docetaxel a cada uno de los 5 ratones portadores de tumor a 10 mg/kg/disparo los dlas 0 y 3 una vez comenzado el experimento y al mismo tiempo, se administro por via intraperitoneal el anticuerpo anti-Her2 a cada raton a 5 mg/kg/disparo los dlas 0, 4, 8, 11, 15 y 17 una vez comenzado el experimento. Se administro por via intravenosa PBMC separada de bazo de ratones Balb/c a 1 x 107 celulas/0,2 ml (RPMI1640) los dlas 0, 8 y 15 una vez comenzado el experimento.

(Grupo al que se administro vinorelbina y anti-Her2)

Se administro por via intraperitoneal vinorelbina a cada uno de los 5 ratones portadores de tumor a 1 mg/kg/disparo el dla 0 una vez comenzado el experimento y al mismo tiempo, se administro por via intraperitoneal el anticuerpo anti-Her2 a cada raton a 5 mg/kg/disparo los dlas 0, 4, 8, 11, 15 y 17 una vez comenzado el experimento. Se administro por via intravenosa PBMC separada de bazo de ratones Balb/c a cada raton a 1 x 107 celulas/0,2 ml

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

(RPMI1640) los dlas 0, 8 y 15 una vez comenzado el experimento.

(Grupo al que se administro ciclofosfamida y anticuerpo anti-CAPRIN-1)

Se administro por via intraperitoneal ciclofosfamida a cada uno de los 5 ratones portadores de tumor a 80 mg/kg/disparo los dlas 0 y 4 una vez comenzado el experimento y al mismo tiempo, se administro por via intraperitoneal el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 No. 2 a cada raton a 5 mg/kg/disparo los dlas 0, 4, 8, 11, 15 y 17 una vez comenzado el experimento. Se administro por via intravenosa PBMC separada de bazo de ratones Balb/c a cada raton a 1 x 107 celulas/0,2 ml (RPMI1640) los dlas 0,8 y 15 una vez comenzado el experimento.

(Grupo al que se administro paclitaxel y anticuerpo anti-CAPRIN-1)

Se administro por via intraperitoneal paclitaxel a cada uno de los 5 ratones portadores de tumor a 15 mg/kg/disparo los dlas 0 y 3 una vez comenzado el experimento y al mismo tiempo, se administro por via intraperitoneal el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 No. 2 a cada raton a 5 mg/kg/disparo los dlas 0, 4, 8, 11, 15 y 17 una vez comenzado el experimento. Se administro por via intravenosa PBMC separada de bazo de ratones Balb/c a cada raton a 1 x 107 celulas/0,2 ml (RPMI1640) los dlas 0,8 y 15 una vez comenzado el experimento.

(Grupo al que se administro docetaxel y anticuerpo anti-CAPRIN-1)

Se administro por via intraperitoneal docetaxel a cada uno de los 5 ratones portadores de tumor a 10 mg/kg/disparo los dlas 0 y 3 una vez comenzado el experimento y al mismo tiempo, se administro por via intraperitoneal el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 No. 2 a cada raton a 5 mg/kg/disparo los dlas 0, 4, 8, 11, 15 y 17 una vez comenzado el experimento. Se administro por via intravenosa PBMC separada de bazo de ratones Balb/c a cada raton a 1 x 107 celulas/0,2 ml (RPMI1640) los dlas 0, 8 y 15 una vez comenzado el experimento.

(Grupo al que se administro vinorelbina y anticuerpo anti-CAPRIN-1)

Se administro por via intraperitoneal vinorelbina a cada uno de los 5 ratones portadores de tumor a 1 mg/kg/disparo el dla 0 una vez comenzado el experimento y al mismo tiempo, se administro por via intraperitoneal el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 No. 2 a cada raton a 5 mg/kg/disparo los dlas 0, 4, 8, 11, 15 y 17 una vez comenzado el experimento. Se administro por via intravenosa PBMC separada de bazo de ratones Balb/c a cada raton a 1 x 107 celulas/0,2 ml (RPMI1640) los dlas 0,8 y 15 una vez comenzado el experimento.

Se utilizaron condiciones experimentales similares a las de la seccion experimental 1 para un grupo al que solamente se administro anticuerpo anti-CAPRIN-1, un grupo al que se administro ciclofosfamida y el anticuerpo anti-CAPRIN-2, un grupo al que se administro paclitaxel y el anticuerpo anti-CAPRIN-1, un grupo al que se administro docetaxel y el anticuerpo anti-CAPRIN-1 y un grupo al que se administro vinorelbina y el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1, con la excepcion de que se administro anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 No. 9 como anticuerpo anti-CAPRIN-1.

Se utilizaron condiciones experimentales similares a las de la seccion experimental 1 para un grupo al que se administro ciclofosfamida, un grupo al que se administro paclitaxel, un grupo al que se administro docetaxel, un grupo al que se administro vinorelbina, un grupo al que se administro ciclofosfamida y un anticuerpo anti-Her2, un grupo al que se administro paclitaxel y un anticuerpo anti-Her2, un grupo al que se administro docetaxel y el anticuerpo anti-Her2 y un grupo al que se administro vinorelbina y el anticuerpo anti-Her2.

Se midieron los tamanos del tumor cada dla y se observo el efecto antitumoral para cada grupo de administracion de cada una de las secciones experimentales mencionadas. Se utilizo un grupo de 5 ratones portadores de tumor al que se habla administrado PBS(-) en lugar de anticuerpo como grupo de control. Por otra parte, se determino el tamano del tumor calculando el volumen utilizando la formula eje mayor x eje menor x eje menor x 0,5.

Como resultado de la observacion del efecto tumoral en la seccion experimental 1, se observo que el tumor habla experimentado una regresion de aproximadamente 79 % en el grupo al que se habla administrado cada uno de los agentes antitumorales, aproximadamente 56 % en el grupo al que se habla administrado solamente el anticuerpo anti-CAPRIN-1 y aproximadamente 74 % en el grupo al que se habla administrado cada uno de los agentes antitumorales y el anticuerpo anti-Her2, cuando el volumen de tumor en el grupo de control, al que se habla administrado PBS(-) el dla 26 una vez comenzado el experimento, fue designado a 100 %. Por otra parte, en el grupo al que se habla administrado cada uno de los agentes antitumorales y el anticuerpo anti-CAPRIN-1, se observo que el tumor habla experimentado una regresion a aproximadamente varias de decenas el % el dla 14 y se observo que habla experimentado una regresion casi completa el dla 22 y a partir de este dla (vease Fig. 3 a Fig. 6).

Asimismo, en la seccion experimental 2, se observo que el tumor habla experimentado una regresion a aproximadamente 68 % en el grupo al que se habla administrado cada uno de los agentes antitumorales,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

aproximadamente 45 % en el grupo al que se habla administrado solamente el anticuerpo anti-CAPRIN-1 y aproximadamente 55 % en el grupo al que se habla administrado cada uno de los agentes antitumorales y el anticuerpo anti-Her2, cuando se designo el volumen de tumor en el grupo de control al que se habla administrado PBS(-), el dla 26 una vez comenzado el experimento a 100 %. Por otra parte, en el grupo al que se habla administrado cada uno de los agentes antitumorales y el anticuerpo anti-CAPRIN-1, se observo que los tumores hablan experimentado una regresion de varias decenas el % el dla 14 y se observo tambien que hablan experimentado una regresion casi completa el dla 22 y a partir de este dla (vease Fig. 7 a Fig. 10).

Susceptibilidad de aplicacion industrial

Los anticuerpos de la presente invencion son utiles para el tratamiento y/o prevencion de canceres

Listado de Secuencias Texto libre

SEQ ID NO: 31: cebador T3 SEQ ID NO: 32: cebador T7 SEQ ID NO: 33 y 34: cebador SEQ ID NO: 35 y 36: cebador GAPDH SEQ ID NO: 38 y 39: cebador SEQ ID NO: 130 a 135: cebador

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> TORAY INDUSTRIES, INC.

<120> Medicamento para tratamiento y/o prevencion de cancer

<130> PH-4658-PCT

<150> JP 2010-023455 <151 >

<160> 135

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1 <211 > 5562 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS <222> (190)..(2319)

<223>

<400> 1

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

1. Un medicamento para su uso en un metodo para el tratamiento y/o la prevencion de un cancer, que comprende un anticuerpo que tiene reactividad inmunologica con una protelna CAPRIN-1 que tiene la secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las secuencias numeradas pares SEQ ID NO: 2 a 30 y uno o dos o mas tipos de agente antitumoral, en donde el anticuerpo y el agente antitumoral o agentes antitumorales se combinan juntos o por separado y en donde el anticuerpo se une especlficamente a la region extracelular de una protelna CAPRIN-1 que existe en la superficie de una celula cancerosa y tiene actividad citotoxica celular.
2. Un anticuerpo que tiene reactividad inmunologica con una protelna CAPRIN-1 que tiene la secuencia de aminoacido de una cualquiera de las secuencias numeradas pares SEQ ID NO: 2 a 30, para su uso en un metodo para el tratamiento y/o la prevencion de un cancer, en donde el metodo comprende la administracion a un sujeto del anticuerpo que tienen reactividad inmunologica con una protelna CAPRIN-1 y uno o dos o mas tipos de agente antitumoral y en donde el anticuerpo se une especlficamente a la region extracelular de una protelna CAPRIN-1 que existe en la superficie de una celula cancerosa y en donde el anticuerpo tiene actividad citotoxica celular.
3. El medicamento o el anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el anticuerpo se une especlficamente a un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacido representada por SEQ ID NO: 37 en la region extracelular de la protelna CAPRIN-1 que existe en la superficie de una celula cancerosa o a un polipeptido que consiste en una secuencia de 7 o mas restos de aminoacido continuos con la region de restos de aminoacidos 50-98 o 233-305 en las secuencias de aminoacidos representadas por la secuencia numeradas pares de SEQ ID NO: 2 a 30, excluyendo las SEQ ID NO: 6 y 18.
4. El medicamento o el anticuerpo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la protelna CAPRIN-1 es de un ser humano.
5. El medicamento o el anticuerpo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el agente antitumoral es un farmaco antimetabolico, un agente anticancer antibiotico, un agente anticancer a base de alcaloide vegetal, un inhibidor de topoisomerasa o un agente alquilante antitumoral.
6. El medicamento o el anticuerpo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el agente antitumoral se selecciona del grupo que consiste en ciclofosfamida, paclitaxel, docetaxel, vinorelbina y sales y derivados de los mismos farmaceuticamente aceptables.
7. El medicamento o el anticuerpo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el cancer es cancer de mama, tumor cerebral, leucemia, linfoma, cancer de pulmon, mastocitoma, cancer renal, cancer de cuello de utero, cancer de vejiga, cancer de esofago, cancer gastrico o cancer colorrectal.
8. El medicamente o el anticuerpo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal o un anticuerpo recombinante.
9. El medicamento o el anticuerpo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo monocatenario o un anticuerpo biespeclfico.
10. El medicamento o el anticuerpo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el metodo comprende la administracion a un sujeto del anticuerpo y un agente antitumoral, simultaneamente o por separado.

imagen1

imagen2

Lineas celulares de cancer humanas

1

2

Tumor cerebral Leucemia Cancer esofagico

---------------------------------- i i Cancer__________

ABCDA BCde pulmon A B

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

Tamano de tumor (mm3)

Fig. 6

imagen8

6 10 14 18 22 26

Dias desde el inicio del analisis (dias)

imagen9

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