MX2012008991A

MX2012008991A - Medicamento para tratar y/o prevenir el cancer.

Info

Publication number: MX2012008991A
Application number: MX2012008991A
Authority: MX
Inventors: Fumiyoshi Okano; Takayoshi Ido; Yoshinori Narita
Original assignee: Toray Industries
Priority date: 2010-02-04
Filing date: 2011-02-04
Publication date: 2012-09-07
Also published as: BR112012018943A8; EP2532367A1; AU2011211700B2; US20120294860A1; EP2532367A4; DK2532367T3; WO2011096535A1; RU2012137503A; KR20120139720A; PT2532367T; CN109925511B; US9180187B2; CA2788720C; CN102844048A; JPWO2011096535A1; AU2011211700A1; RU2624029C2; JP5923984B2; CN109925511A; ES2691738T3

Abstract

Esta invención se refiere a un medicamento para tratar y/o prevenir un cáncer, que comprende una combinación de un anticuerpo contra una proteína CAPRIN-1 de antígeno de cáncer que es específicamente expresada en la superficie de la célula de cáncer, y un agente antitumor, en donde el anticuerpo y el agente antitumor se combinan juntos o de forma separada, y para un uso de este medicamento.

Description

MEDICAMENTO PARA TRATAR Y/O PREVENIR EL CANCER Campo de la Invención La presente invención se refiere a un medicamento para tratar y/o prevenir un cáncer, caracterizado por combinar un anticuerpo o un fragmento del mismo que tiene reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1, con un agente antitumor, y para el uso del mismo.

Antecedentes de la Invención El cáncer es la principal causa de muerte. Las terapias actuales para cáncer comprenden combinaciones de terapia quirúrgica principal con terapia por radiación y quimioterapia. Adicionalmente , las terapias actuales comprenden aplicar una terapia similar a todos los pacientes que tienen el mismo tipo y la misma etapa de un cáncer. Al menos 40% de los pacientes fallan a una terapia primaria y de esta manera se someten a una serie de terapias adicionales. Si los pacientes de nuevo fallan a las terapias, la metástasis de cáncer toma lugar, finalmente resultando en una posibilidad incrementada de muerte. De esta manera, la terapia por radiación actual y la quimioterapia son incapaces de ser compatibles con varios tipos de canceres o pacientes con cáncer individuales, y la terapia quirúrgica por sí misma también es insuficiente actualmente para la cura completa de REF. :233557 cánceres en casi todos los casos.

Varios fármacos de anticuerpo que dirigen las proteínas de antígeno en células cáncer para tratamiento de cánceres han aparecido a lo largo del mundo como una técnica para vencer los problemas descritos arriba de terapias de cáncer. Los ejemplos específicos son como sigue. Se ha demostrado que HERCEPTIN (marca registrada) que comprende como un ingrediente activo un anticuerpo monoclonal específicamente enlaza a Her2 , las sales de las cuales se aprobaron en 1998 como un agente terapéutico para pacientes con cáncer de ,mama metastático, tienen tal efecto clínico que HERCEPTIN puede disminuir el número de muertes de pacientes con cáncer de mama metastático y recurrentes entre pacientes con cáncer de mama metastático que sobre-expresan Her2. También se ha demostrado que HERCEPTIN no provoca ninguno de los efectos colaterales severos diferentes a la toxicidad cardiaca comparada con quimioterapéuticos convencionales. Como otra característica notable, se han demostrado los efectos terapéuticos de un uso combinado de HERCEPTIN como quimioterapéutico contra cáncer de mama (Literaturas de Patente 1-3). Sin embargo, la mayoría de las proteínas antigénicas en células de cáncer para dirigirse por fármacos de anticuerpo tales como Her2 también se expresan en células normales, de manera que no sólo células de cáncer sino también células normales que expresan antígenos también se dañan de forma citotóxica por administración de anticuerpos. Los efectos colaterales resultantes pueden provocar preocupación .

La proteína 1 asociada con la proliferación y citoplasmática (CAPRIN-1) se expresa cuando las células normales en la fase de reposo se activan o son sometidas a división celular, y es una proteína intracelular conocida o para formar gránulos de tensión intracelular con ARN dentro de las células, de manera que está implicado en el transporte de mARJM y la regulación de traducción. Mientras tanto, existen muchos otros nombres que representan CAPRIM-1, tal como proteína 1 de membrana anclada a GPI o proteína 1 de marcador de superficie de componente de membrana (MUSI) , como si las proteínas hubieran sido conocidas para ser proteínas de membrana de célula. Estos nombres originados desde un informe de que la secuencia de gen CAPRIN-1 es una proteína de membrana que tiene una región enlazada a GPI y expresada en las células de cáncer colorectal (Bibliografía 1 no de patente) . Sin embargo, la secuencia de gen CAPRIN-1 proporcionada en este informe más tarde se reveló que era errónea. Lo siguiente se ha informado recientemente; es decir, la eliminación de un nucleótido sencillo en la secuencia de gen CAPRIN-1 registrada en GenBank o similar causa un cambio en la estructura, de manera que se pierden 80 aminoácidos de la terminal C, resultando en la generación de un artefacto (74 aminoácidos) que corresponde a la porción enlazada a GPI en el informe previo, y adicionalmente , también se presenta otro error 5' de la secuencia de gen, de manera que se perdieron 53 aminoácidos de la terminal N (Bibliografía 2 no de patente) . También se ha informado recientemente que la proteína codificada por la secuencia de gen CAPRIN-1 registrada en GenBank o similar no es una proteína de membrana de célula (Bibliografía 2 no de patente) .

Además, en base al informe de la Bibliografía 1 no de patente de que CAPRIN-1 es una proteína de membrana celular, Bibliografías 4 y 5 de patente describen que CAPRIN-1 (como una proteína de membrana celular) bajo el nombre de MUSI puede usarse como un objetivo de una medicina de anticuerpo en terapia de cáncer, aunque los ejemplos de trabajo no describen el tratamiento usando un anticuerpo contra la proteína. Sin embargo, como se informó en la Bibliografía 2 no de patente, comúnmente se ha creído desde el momento de la presentación de la Bibliografía 4 no de patente a la fecha que CAPRIN-1 no está expresada sobre la superficie de la célula. Los contenidos de las Bibliografías 4 y 5 se basan solo en información incorrecta de que CAPRIN-1 es una proteína de membrana celular claramente no deberían entenderse como conocimiento general común para personas expertas en la técnica.

Bibliografía de la técnica previa Bibliografía de patente Bibliografía de Patente 1 Publicación de Patente Japonesa (Kokai) No. 2006-316040A Bibliografía de Patente 2 Patente de E.U.A. No. 7485302 Bibliografía de Patente 3. Patente de E.U.A. No. 7449184 Bibliografía de Patente 4 Publicación de Patente de E.U.A. No. 2008/0075722 Bibliografía de Patente 5 Publicación Internacional WO2005/100998 Bibliografía No de patente Bibliografía no de Patente 1 J. Biol. Chem. , 270: 20717-20723, 1995 Bibliografía no de Patente 2 J. Immunol . , 172: 2389-2400, 2004 Breve Descripción de la Invención Problema a ser resuelto por la invención Los objetivos de la presente invención son identificar una proteína de antígeno de cáncer específicamente expresada en la superficie de una célula de cáncer, para combinar un anticuerpo que dirige la proteína de antígeno de cáncer con un agente antitumor, y de está manera proporcionar el uso como un medicamento para tratar y/o prevenir un cáncer.

Medios para resolver el problema Como resultado de estudios intensos, los inventores actuales ahora han obtenido un cADN que codifica una proteína que enlaza a un anticuerpo existente en sueros de perros con cáncer de mama por el método SEREX utilizando tanto coleccións de cADN preparadas de tejidos de testículos de perro y sueros de perros con cáncer de mama . Los inventores actuales además ahora han preparado proteínas CAPRIN-1 que tienen las secuencias de aminoácidos de numeración uniforme de SEQ ID NOS: 2 a 30 y anticuerpos contra tales proteínas CAPRIN-1 basados en el gen de perro obtenido y los genes homólogos de humano, ganado, caballo, ratón, y pollo correspondientes. De este modo, los inventores actuales ahora han encontrado que: las proteínas CAPRIN-1 se expresan específicamente en las células de cánceres, tales como cáncer de mama, tumor cerebral, leucemia, linfoma, cáncer de pulmón, cáncer cervicouterino, cáncer de vejiga, cáncer de esófago, cáncer colorectal, cáncer gástrico, y células de cáncer en el riñon, y que una porción de la proteína CAPRIN-1 se expresa específicamente sobre la superficie de cada célula de cáncer. Los inventores actuales de esta manera han encontrado ahora que un anticuerpo o anticuerpos contra la porción de CAPRIN-1 expresada en la superficie de cada célula de cáncer se combinan con un agente antitumor específico, de manera que pueden obtenerse efectos terapéuticos de cáncer importantes.

En base a estos descubrimientos, se completó la invención actual como se describe a continuación.

El término "cáncer" como se usa en la presente se usa intercambiablemente con tumor o carcinoma.

La presente invención tiene las siguientes características . (1) un medicamento para tratar y/o prevenir un cáncer, que comprende una combinación de un anticuerpo o un fragmento del mismo que tiene reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1 y uno o dos o más tipos de agentes antitumor, en donde el anticuerpo o fragmento y el agente antitumor o agentes antitumor se combinan juntos o de forma separada. (2) El medicamento de acuerdo con (1) de arriba, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo que tiene reactividad inmunológica con la proteína CAPRIN-1 de arriba es un anticuerpo o un fragmento del mismo, que enlaza específicamente a la región extracelular de una proteína CAPRIN-1 que existe en la superficie de una célula de cáncer. (3) El medicamento de acuerdo con (1) o (2) de arriba, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo que tiene reactividad inmunológica con la proteína CAPRIN-1 de arriba es un anticuerpo o un fragmento del mismo, que enlaza específicamente a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 37 en la región extracelular de la proteína CAPRIN-1 que existe en la superficie de una célula de cáncer, o una secuencia de aminoácidos que tiene 80% o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 37. (4) El medicamento de acuerdo con cualquiera de uno de (1) hasta (3) de arriba, en donde la proteína CAPRIN-1 de arriba es de un humano. (5) El medicamento de acuerdo con cualquiera de uno de (1) hasta (4) de arriba, en donde el agente antitumor de arriba es cualquiera de los agentes antitumor como se describe en la presente. (6) El medicamento de acuerdo con (5) de arriba, en donde el agente antitumor se selecciona del grupo que consiste de ciclofosfamida, paclitaxel, docetaxel, vinorelbina, y sales farmacéuticamente aceptables y derivados de los mismos. (7) El medicamento de acuerdo con cualquiera de uno de (1) hasta (6) de arriba, en donde el cáncer es cáncer de mama, tumor cerebral, leucemia, linfoma, cáncer pulmonar, mastocitoma, cáncer renal, cáncer cervicouterino, cáncer de vejiga, cáncer esofágico, cáncer gástrico, o cáncer colorectal . (8) El medicamento de acuerdo con cualquiera de uno de (1) hasta (7) de arriba, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, o un anticuerpo recombinante . (9) El medicamento de acuerdo con cualquiera de uno de (1) hasta (8) de arriba, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de cadena sencilla, o un anticuerpo biespecífico . (10) Un método para tratar y/o prevenir un cáncer, que comprende administrar el medicamento de cualquiera de uno de (1) hasta (9) de arriba a un sujeto que sospecha que tiene un cáncer . (11) El método de acuerdo con (10) de arriba, que comprende administrar a un sujeto el anticuerpo o un fragmento del mismo y un agente antitumor, que están contenidos en el medicamento de arriba, simultáneamente o separadamente .

Esta descripción incluye todos o parte de los contenidos como se describen en la descripción y/o figuras de la Solicitud de la Patente Japonesa No. 2010-023455, de la que la presente solicitud reivindica la prioridad.

Efectos ventajosos de la invención De acuerdo con la presente invención, los efectos sinérgicos sorprendentes de reducción de cáncer masiva y regresión pueden obtenerse sin detección de efectos colaterales importantes.

Breve Descripción de las Figuras La Fig. 1 muestra los patrones de expresión de genes que codifican proteínas CAPRIN-1 en tejidos normales y líneas de células de tumor. La referencia No. 1 indica los patrones de expresión de genes que codifican las proteínas CAPRIN-1, y la referencia No. 2 indica los patrones de expresión de los genes GAPDH.

La Fig. 2 muestra citotoxicidad mostrada por anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN- 1 (#1 hasta #11) que son reactivos con la superficie celular de la línea de célula de cáncer' de mama MDA-MB-157 que expresa CAPRIN-1. El No. de Referencia 3 indica una actividad citotóxica exhibida cuando se agregó el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #1. El No. de Referencia 4 indica una actividad citotóxica mostrada cuando se agregó el anticuerpo monoclonal anti -CAPRIN- 1 #2. El No. de Referencia 5 indica una actividad citotóxica mostrada cuando se agregó el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #5. El No. de Referencia 6 indica una actividad citotóxica mostrada cuando se agregó el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN- 1 #4. El No. de Referencia 7 indica una actividad citotóxica mostrada cuando se agregó el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #5. El No. de Referencia 8 indica una actividad citotóxica mostrada cuando se agregó el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #6. El No. de Referencia 9 indica una actividad citotóxica mostrada cuando se agregó el anticuerpo monoclonal anti-CAPRI -1 #7. El No. de Referencia 10 indica una actividad citotóxica mostrada cuando se agregó el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN- 1 #8. El No. de Referencia 11 indica una actividad citotóxica mostrada cuando se agregó el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #9. El No. de Referencia 12 indica una actividad citotóxica mostrada cuando se agregó el anticuerpo monoclonal anti -CAPRIN- 1 #10. El No. de Referencia 13 indica una actividad citotóxica mostrada cuando se agregó el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN- 1 #11. El No. de Referencia 14 indica una actividad citotóxica mostrada cuando se agregó un anticuerpo monoclonal que es reactivo con una proteína CAPRIN-1 por sí misma pero no reactivo con la superficie de la célula de cáncer. El No. de Referencia 15 indica una actividad citotóxica mostrada cuando se agregó PBS en lugar de los anticuerpos.

La Fig. 3 muestra el efecto antitumor obtenido cuando ciclofosfamida , un agente antitumor, se usó en combinación con un anticuerpo monoclonal anti -CAPRIN-1 reactivo con la superficie de células de cáncer en ratones sin pelo, en el cual la línea de célula de cáncer de mama MCF-7 que expresa CAPRIN-1 se ha trasplantado. El No. de Referencia 16 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se agregó PBS en lugar del anticuerpo. El No. de Referencia 17 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administró ciclofosfamida . El No. de Referencia 18 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administró el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #2. El No. de Referencia 19 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administraron ciclofosfamida y anticuerpo anti-Her2. El No. de Referencia 20 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administraron ciclofosfamida y el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #2.

La Fig. 4 muestra el efecto antitumor obtenido cuando paclitaxel, un agente antitumor, se usó en combinación con un anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 que es reactivo con la superficie de células de cáncer en ratones sin pelo en el cual la línea de célula de cáncer de mama MCF-7 que expresa CAPRIN-1 se ha trasplantado. El No. de Referencia 21 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administró PBS en lugar del anticuerpo. El No. de Referencia 22 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administró paclitaxel. El No. dé Referencia 23 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administró el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #2. El No. de Referencia 24 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administraron paclitaxel y anticuerpo anti-Her2. El No. de Referencia 25 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administraron paclitaxel y el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #2.

La Fig. 5 muestra el efecto antitumor obtenido cuando docetaxel, un agente antitumor, se usó en combinación con un anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 reactivo con la superficie de células de cáncer en ratones sin pelo, en el cual la línea de célula de cáncer de mama MCF-7 que expresa CAPRIN-1 se ha trasplantado. El No. de Referencia 26 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administró PBS en lugar del anticuerpo. El No. de Referencia 27 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administró docetaxel . El No. de Referencia 28 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administró el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #2. El No. de Referencia 29 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administraron docetaxel y anticuerpo anti-Her2. El No. de Referencia 30 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administraron docetaxel y el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #2.

La Fig. 6 muestra el efecto antitumor obtenido cuando vinorelbina, un agente antitumor, se usó en combinación con un anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 reactivo con la superficie de células de cáncer en ratones sin pelo, en el cual la línea de célula de cáncer de mama MCF-7 que expresa CAPRIN-1 se ha trasplantado. El No. de Referencia 31 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se agregó PBS en lugar de un anticuerpo. El No. de Referencia 32 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administró vinorelbina. El No. de Referencia 33 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administró el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #2. El No. de Referencia 34 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administraron vinorelbina y anticuerpo anti-Her2. El No. de Referencia 35 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administraron vinorelbina y el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #2.

La Fig. 7 muestra el efecto antitumor obtenido cuando ciclofosfamida, un agente antitumor, se usó en combinación con un anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 reactivo con la superficie de células de cáncer en ratones sin pelo, en el cual la línea de célula de cáncer de mama MCF-7 que expresa CAPRIN-1 se ha trasplantado. El No. de Referencia 36 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administró PBS en lugar de un anticuerpo. El No. de Referencia 37 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administró ciclofosfamida . El No. de Referencia 38 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administró el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #9. El No. de Referencia 39 indica el tamaño del tumor el ratón cuando se administraron ciclofosfamida y anticuerpo anti-Her2. El No. de Referencia 40 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administraron ciclofosfamida y el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #9.

La Fig. 8 muestra el efecto antitumor obtenido cuando paclitaxel, un agente antitumor, se usó en combinación con un anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 reactivo con la superficie de células de cáncer en ratones sin pelo, en el cual la línea de célula de cáncer de mama MCF-7 que expresa CAPRIN-1 se ha trasplantado. El No. de Referencia 41 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administró PBS en lugar de un anticuerpo. El No. de Referencia 42 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administró paclitaxel. El No. de Referencia 43 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administró el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #9. El No. de Referencia 44 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administraron paclitaxel y anticuerpo anti-Her2. El No. de Referencia 45 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administraron paclitaxel y el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN- 1 #9.

La Fig. 9 muestra el efecto antitumor obtenido cuando docetaxel, un agente antitumor, se usó en combinación con un anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 reactivo con la superficie de células de cáncer en ratones sin pelo, en el cual la linea de célula de cáncer de mama MCF-7 que expresa CAPRIN-1 se ha trasplantado. El No. de Referencia 46 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administró PBS en lugar del anticuerpo. El No. de Referencia 47 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administró docetaxel. El No. de Referencia 48 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administró el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #9. El No. de Referencia 49 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administraron docetaxel y anticuerpo anti-Her2. El No. de Referencia 50 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administraron docetaxel y el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #9.

La Fig. 10 muestra el efecto antitumor obtenido cuando vinorelbina, un agente antitumor, se usó en combinación con un anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 reactivo con la superficie de células de cáncer en ratones sin pelo, en el cual la línea de célula MCF-7 que expresa CAPRIN-1 se ha trasplantado. El No. de Referencia 51 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administró PBS en lugar del anticuerpo. El No. de Referencia 52 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administró vinorelbina. El No. de Referencia 53 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administró el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #9. El No. de Referencia 54 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administraron vinorelbina y anticuerpo anti-Her2. El No. de Referencia 55 indica el tamaño del tumor del ratón cuando se administraron vinorelbina y el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #9.

Descripción Detallada de la Invención La actividad de antitumor de un anticuerpo contra un polipéptido representado por cualquiera de las secuencias de numeración uniforme SEQ ID NOS: 2 a 30 usadas en la presente invención puede evaluarse examinando in vivo la supresión del crecimiento de un tumor en animales con cáncer, o, examinado si el anticuerpo exhibe o no exhibe citotoxicidad por medio de inmunocitos o complementos para células de tumor que expresan polipéptido in vitro, como se describe más adelante.

En el contexto, las secuencias de nucleótidos de polinucleótidos codificando secuencias que comprenden secuencias de aminoácidos de numeración uniforme (es decir, SEQ ID NOS: 2, 4, 6, ... , 28, 30) de SEQ ID NOS: 2 a 30 están representadas por las secuencias impares (es decir, SEQ ID NOS: 1, 3, 5, ... ,27, 29) de la SEQ ID NOS: 1 a 29.

Las secuencias de aminoácidos que son representadas por SEQ ID NOS: 6, 8, 10, 12, y 14 en el listado de secuencias descrito en la presente son las secuencias de aminoácidos de CAPRIN-1 aislada como polipéptidos , que enlaza a anticuerpos específicamente existentes en suero de un perro con cáncer, a través del método SEREX usando una colección de cADN de tejidos de testículos de ratón y el suero de un perro con cáncer de mama. Las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 2 y 4 son las secuencias de aminoácidos de CAPRIN-1 aisladas como homólogos humanos. La secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 16 es la secuencia de aminoácidos de CAPRIN-1 aislada como un homólogo de ganado. La secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 18 es la secuencia de aminoácidos de CAPRIN-1 aislada como homólogo de caballo. Las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 20 a 28 son las secuencias de aminoácidos de CAPRIN-1 aisladas como homólogos de ratón. La secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 30 es la secuencia de aminoácidos de CAPRIN-1 aislada como homólogo de pollo (vea Ejemplo 1 descrito más adelante). CAPRIN-1 se conoce por ser expresada cuando las células normales en la fase de reposo se reactivan o dan lugar a la división celular.

Se conoció que CAPRIN-1 no está expresada en la superficie de células; sin embargo, el estudio de los inventores ha revelado ahora que una porción de la proteína CAPRIN-1 es expresada en la superficie de varias células de cáncer. En la presente invención, los anticuerpos que enlazan a la porción de la proteína CAPRIN-1 para expresarse en la superficie de células de cáncer preferiblemente se usan. Un ejemplo de un péptido parcial de la proteína CAPRIN-1, que es expresada en la superficie de células de cáncer, es un polipéptido que consiste de una secuencia de 7 o más residuos de aminoácido continuos dentro de la región de residuo de aminoácido Nos. (aa) 50-98 o 233-305 en las secuencias de aminoácido representadas por secuencias impares de SEQ ID NOS : 2 hasta 30 en el listado de secuencias que excluyen SEQ ID NOS: 6 y 18. Los ejemplos específicos incluyen la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 37 y una secuencia de aminoácidos que tiene 80% o más, preferiblemente 85% o más, más preferiblemente 90% o más, y preferiblemente además 95% o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos. Los ejemplos de un anticuerpo para usarse en la presente invención incluyen todos los anticuerpos (específicamente) enlazados a estos péptidos (o (específicamente) que reconocen estos péptidos o que tienen reactividad inmunológica con estos péptidos) y que exhiben actividad antitumor.

El anticuerpo anti-CAPRIN-1 arriba descrito usado en la presente invención puede ser cualquier tipo de anticuerpo mientras pueda exhibir actividad antitumor. Los ejemplos de los anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales , anticuerpos recombinantes , tales como anticuerpos sintéticos, anticuerpos multiespecífieos , anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, y anticuerpos de cadena ligera (scFv) , anticuerpos humanos, y fragmentos de los mismos, tales como Fab, F(ab')2í y Fv. Estos anticuerpos y los fragmentos de los mismos pueden ser preparados por métodos conocidos por personas expertas en la técnica. En la presente invención, se desean anticuerpos capaces de enlazar específicamente a una proteína CAPRIN-1. Preferentemente, son anticuerpos monoclonales. También pueden usarse los anticuerpos policlonales mientras los anticuerpos homogéneos puedan producirse establemente. También, cuando un sujeto es un humano, se desean los anticuerpos humanos o los anticuerpos humanizados para evitar o suprimir el rechazo.

El término "específicamente enlazados a la proteína CAPRIN-1" como se usa en la presente significa que el anticuerpo específicamente enlaza a una proteína CAPRIN-1, pero sustancialmente no enlaza a otras proteínas que no sean la proteína CAPRIN-1.

La actividad de antitumor de un anticuerpo que puede usarse en la presente invención puede evaluarse como se describe abajo examinando in vivo la supresión del crecimiento del tumor en animales con cáncer, o, examinando si exhibe o no exhibe in vi tro una actividad de citotoxicidad, que es mediada por inmunocitos o complementos, para células de tumor expresando el polipéptido.

Además, los ejemplos del sujeto para el tratamiento de cáncer y/o prevención en la presente invención incluyen mamíferos, tales como humanos, mascotas, animales domésticos, y animales para competencias. Un sujeto preferente es un humano .

La preparación de antígenos y anticuerpos, medicamentos y composiciones farmacéuticas relacionadas a la presente invención se describen a continuación.

Preparación de antígenos para la preparación de anticuerpos Las proteínas o fragmentos de las mismas a usarse como antígenos sensibilizadores para obtener anticuerpos anti-CAPRIN-1 usados en la presente invención pueden derivarse de cualquier especie animal sin limitación particular, tales como humanos, perros, ganado, caballos, ratones, ratas, y pollos. Sin embargo, las proteínas o fragmentos de las mismas se seleccionan preferentemente en consideración de la compatibilidad con células parientes usadas para la fusión celular. En general, se prefieren las proteínas derivadas de mamíferos y, en particular, se prefieren las proteínas derivadas de humanos. Por ejemplo, cuando CAPRIN-1 es humana CAPRIN-1, puede usarse la proteína CAPRIN-1 humana, un péptido parcial de la misma, o células que expresen CAPRIN-1 humana .

Las secuencias de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos de CAPRIN-1 humana y homólogos de los mismos pueden obtenerse teniendo acceso a GenBank (NCBI, E.U.A.) y usando un algoritmo tal como BLAST o FASTA (Karlin and Altschul, Proc. Nati. Acad. Sci . E.U.A. , 90: 5873-5877, 1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997).

En la presente invención, en base a la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1 o 3) o la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2 o 4) de CAPRIN-1 humana, un ácido nucleico objetivo o una proteína objetivo comprende una secuencia que tiene 70% a 100%, preferentemente 80% a 100%, más preferentemente 90% a 100%, incluso más preferentemente 95% a 100% (por ejemplo, 97% a 100%, 98% a 100%, 99% a 100%, o 99.5% a 100%) identidad de secuencia con la secuencia de nucleótido o la secuencia de aminoácidos de ORF o la porción madura de CAPRIN-1 humana. Como se usa en la presente, el término "¾ identidad de secuencia" se refiere a un porcentaje (%) de aminoácidos idénticos (o nucleótidos) relativo al número total de aminoácidos (o nucleótidos) , cuando se alinean dos secuencias para alcanzar la similitud más alta con o sin la introducción de espacios.

La longitud de un fragmento de proteína CAPRIN-1 está en un intervalo de la longitud de aminoácido de un epítopo (determinante antigénico) , que es la unidad mínima reconocida por un anticuerpo, a una longitud menor que la longitud total de la proteína. El término "epítopo" se refiere a un fragmento de polipéptido fragmento que tiene antigenicidad o inmunogenicidad en mamíferos, preferentemente en humanos, y la unidad mínima del epítopo consiste cerca de 7 a 12 aminoácidos (continuos) , por ejemplo 8 a 11 aminoácidos (continuos) . Los ejemplos de una secuencia parcial de proteína CAPRIN-1 que enlaza específicamente a un anticuerpo incluye una secuencia parcial que comprende al menos alrededor de 7 hasta 12 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 37 o una secuencia de aminoácidos que tiene 80% o más, preferiblemente 85% o más, más preferiblemente 90% o más, preferiblemente además 95% o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37.

Los polipéptidos que comprenden la proteína CAPRIN-1 mencionada arriba o péptidos parciales de la proteína, pueden sintetizarse por medio de un método de síntesis química, tal como el método Fmoc (método fluorenilmetiloxicarbonilo) o el método tBoc (método t-butiloxicarbonilo) (Editado por The Japanese Biochemical Society, Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimental Lecture Series) 1, Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, TOKYO KAGAKU DOZIN (Japón) , 1981) . Alternativamente, los polipéptidos arriba mencionados también pueden sintetizarse por medio de métodos convencionales usando varios sintetizadores de péptidos comercialmente disponibles. Además, con el uso de técnicas de producción por ingeniería genética conocidas (por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, 2da Edición, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3ra Edición, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995) , John Wiley & Sons) , se prepara un polinucleótido codificando el polipéptido de arriba y entonces se incorpora dentro de un vector de expresión, que subsecuentemente se induce dentro de- una célula hospedera para producir un polipéptido de interés en la célula hospedera, y entonces recuperarlo.

Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de arriba pueden prepararse fácilmente por medio de técnicas de producción por ingeniería genética conocidas o técnicas convencionales usando sintetizador de ácido nucleico comercialmente disponible. Por ejemplo, el ADN que comprende la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 1 puede prepararse por PCR usando un ADN cromosómico humano o colección cADN, como una plantilla, y un par de cebadores designados para ser capaces de amplificar la secuencia de ácido nucleico representada por SEQ ID NO: 1. Las condiciones PCR pueden determinarse apropiadamente. Por ejemplo, las condiciones PCR comprenden conducir 30 ciclos del ciclo de reacción de: desnaturalización en 94°C por 30 segundos; combinación de pares de base a 55°C por 30 segundos a 1 minuto; y extensión en 72°C por 2 minutos, usando una polimerasa ADN termoestable (por ejemplo, polimerasa Taq o polimerasa Pfu) y solución amortiguadora PCR que contiene Mg2+, seguido por reacción en 72°C por 7 minutos. Sin embargo, las condiciones PCR no están limitadas al ejemplo de arriba. Las técnicas PCR, condiciones, y similares se describen en Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3ra Edición, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995) , John Wiley & Sons (particularmente Capítulo 15) .

También, con base a la secuencia de nucleótidos y la información de secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NOS: 1 a 30 en el listado de secuencias descrito en la presente, se preparan las sondas y cebadores apropiados, y entonces una colección de cADN de humano o similar se selecciona usándolos, de manera que el ADN deseado puede aislarse. Una colección de cADN se construye preferentemente de células, órganos o tejidos, que expresan proteínas que tienen secuencias de numeración uniforme de SEQ ID NOS: 2 a 30. Los ejemplos de tales células o tejidos incluyen células o tejidos derivados de testículos, y cánceres o tumores, tales como leucemia, cáncer de mama, linfoma, tumor cerebral, cáncer de pulmón, cáncer colorectal, y similares. Los procedimientos tales como la preparación de sondas o cebadores, la construcción de una colección de cADN, selección de una colección de cADN, y la clonación de genes objetivo son conocidos por una persona experta en la técnica y pueden llevarse a cabo por los métodos descritos en Sambrook et al.; Molecular Cloning, 2a Edición, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Ausbel et al., (arriba), y similares. El ADN codificando una proteína CAPRIN-1 humana o péptido parcial de la misma puede obtenerse del ADN así obtenido.

Las células hospederas pueden ser cualquiera de las células, mientras puedan expresar el polipéptido arriba mencionado. Los ejemplos de células procarióticas incluyen, pero no se limitan a, Escherichia coli y similar. Los ejemplos de células eucarióticas incluyen, pero no se limitan a, células de mamíferos, tales como células de riñon de mono (COSI) y células de ovario de hámster Chino (CHO) , línea de célula de riñon fetal humano (HEK293), línea de célula de piel de ratón fetal (NIH3T3) , células de levadura tales como levadura de gemación y levadura de fisión, células de gusano de seda, y oocito de Xenopus .

Cuando las células procarióticas se usan como células hospederas, un vector de expresión usado en la presente contiene un origen replicable dentro de las células procarióticas, un promotor, un sitio de enlace a ribosoma, un sitio de clonación múltiple, un terminador, un gen de resistencia a fármaco, un gen complementario auxotrófico, y similares. Los ejemplos del vector de expresión Escherichia coli incluyen un vector pUC-based, pBluescript II, un sistema de expresión pET, y un sistema de expresión pGEX. El ADN que codifica el polipéptido de arribase incorpora dentro del vector de expresión, las células hospederas procarióticas se transforman con el vector, así las células transformadas obtenidas se cultivan, y así el polipéptido codificado por el ADN puede expresarse en células hospederas procarióticas. En este tiempo, el polipéptido también puede expresarse como una proteína de fusión con otra proteína.

Cuando las células eucarióticas se usan como células hospederas, un vector de expresión usado en la presente es un vector de expresión para células eucarióticas, que contiene un promotor, una región de empalme, un sitio de poli (A) adición, y similares. Los ejemplos del vector de expresión incluyen pKAl, pCDM8 , pSVK3 , pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, vector EBV, pRS , pcADN3 , y pYES2. De manera similar a la de arriba, el ADN que codifica al polipéptido de arriba se incorpora dentro del vector de expresión, las células hospederas eucarióticas se transforman con el vector, así las células transformadas obtenidas se cultivan, y así el polipéptido codificado por el ADN puede expresarse en células hospederas eucarióticas. Cuando pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-Nl, pEGFP-Cl, o similar se usa como un vector de expresión, el polipéptido de arriba puede expresarse como una proteína de fusión a la que ha sido agregada una etiqueta de entre varias etiquetas tal como una etiqueta His (por ejemplo, (His) 6- (His) i0) , una etiqueta FLAG, una etiqueta myc , una etiqueta HA, y GFP .

Para la introducción de un vector de expresión dentro de las células hospederas, puede emplearse un método conocido, tal como electroporación, un método de fosfato de calcio, un método de liposoma, un método dextrano DEAE, microinyección, infección viral, lipofección, y enlace a un péptido permeable de membrana celular.

El polipéptido de interés puede aislarse y purificarse desde las células hospederas por medio de una combinación de procedimientos de separación conocidos. Los ejemplos de los procedimientos incluyen, pero no se limitan a, tratamiento con un agente de desnaturalización tal como urea o un tensioactivo, ultrasonidos, digestión enzimática, precipitación de proteínas por sales o fraccionamiento y precipitación de solventes, diálisis, centrifugación, ultrafiltración, filtración en gel, SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía hidrofóbica, cromatografía de afinidad, y cromatografía de fase inversa.

Estructura del anticuerpo Un anticuerpo es una glicoproteína heteromultimérica que generalmente contiene al menos dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras . Otros anticuerpos que no son IgM es una glicoproteína heterotetrámera de cerca de 150-kDa compuesta de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Generalmente, cada cadena ligera está conectada a una cadena pesada por medio de un enlace covalente de disulfuro, sin embargo, el número de enlaces de disulfuro entre cadenas pesadas de varios isotipos de inmunoglobulina es variado. También cada cadena pesada o cada cadena ligera tienen un enlace de disulfuro intracadena. Cada cadena pesada tiene un dominio variable (región VH) sobre un extremo seguido por muchas regiones constantes . Cada cadena ligera tiene un dominio variable (región VL) y tiene una región constante sobre un extremo opuesto al otro extremo. La región constante de una cadena ligera se alinea con la primera región constante de una cadena pesada, y un dominio variable de cadena ligera se alinea con un dominio variable de cadena pesada. Una región específica de un domino variable de anticuerpo exhibe variabilidad específica que se refiere como una región de determinación complementaria (CDR, por sus siglas en inglés) , de manera que imparte especificidad de enlace al anticuerpo. Una porción de región variable, que está relativamente conservada, es referida como una región de marco (FR, por sus siglas en inglés) . La cadena pesada completa y los dominios variables de cadena ligera contienen por separado cuatro FRs ligados por medio de tres CDRs . Las tres CDRs en una cadena pesada son referidas como CDRH1, CDRH2, y CDRH3 en este orden desde la terminal N. Similarmente , en el caso de una cadena ligera, las CDRLs son referidas como CDRL1 , CDRL2 , y CDRL3. La CDRH3 es más importante para la especificidad de enlace de un anticuerpo a un antígeno. También, las CDRs de cada cadena se retienen juntas en un estado de ser adyacentes una a la otra debido a las regiones FR, contribuyendo a la formación del sitio de enlace al antígeno del anticuerpo junto con las CDRs de otra cadena. Una región constante no contribuye directamente 1 enlace de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben varias funciones efectoras, tales como la implicación en citotoxicidad de célula dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) , fagocitosis por medio de enlace a un receptor Fcy, la tasa de vida media/liberación por medio de un receptor Fe neonato (FcRn) , y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC, por sus siglas en inglés) por medio de un constituyente Clq de la cascada completa.

Preparación del anticuerpo El término "anticuerpo anti-CAPRIN" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo que tiene reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1 de longitud completa o un fragmento de la misma.

Como se usa en la presente, el término "reactividad inmunológica" se refiere a la propiedad de in vivo enlazando a un anticuerpo a un antígeno CAPRIN-1. A través de tal enlace in vivo, se exhibe la función del tumor perjudicial (por ejemplo, muerte, supresión, o degeneración) . Específicamente, un anticuerpo usado en la presente invención puede ser cualquier tipo de anticuerpo, mientras enlace a una proteína CAPRIN-1 para ser capaz de dañar al tumor, tal como leucemia, linfoma, cáncer, tumor cerebral, cáncer de pulmón, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer renal, o cáncer colorectal .

Los ejemplos de un anticuerpo incluyen un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante (por ejemplo, un anticuerpo sintético, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, o un anticuerpo de cadena sencilla) , un anticuerpo humano, y un fragmento de anticuerpo del mismo (por ejemplo, Fab, F(ab' ) 2, o Fv) . También, un anticuerpo puede ser una molécula de inmunoglobulina de cualquier clase tal como IgG, IgE, IgM, IgA, IgD, o IgY, o cualquier subclase tal como IgGl, IgG2 , IgG3, IgG4 , IgAl, o IgA2. Cualquiera de estos anticuerpos o fragmentos de los mismos tienen reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1 que existe en la superficie de células de cáncer y preferiblemente a un polipéptido de la región extracelular de la misma (preferiblemente, específicamente enlaza a la proteína o el polipéptido) y exhibe una actividad citotóxica contra cáncer.

El anticuerpo además puede ser modificado por, en adición a glicosilación, acetilación, formilación, amidación, fosforilación, pegilación (PEG) , o similares.

Varios ejemplos de preparación de anticuerpos son como se describen a continuación.

Cuando el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, por ejemplo, la línea de célula de cáncer de mama SK-BR-3 expresando CAPRIN-1 se administra a un ratón por inmunización, el bazo es removido del ratón, las células se separan, y entonces las células y las células de mieloma de ratón se fusionan. De entre las células de fusión así obtenidas (hibridomas) , · se selecciona un clon que produce un anticuerpo que tiene el efecto de suprimir la proliferación de células de cáncer. Un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que tiene el efecto de suprimir la proliferación de células de cáncer se aisla, el hibridoma se cultiva, y entonces el anticuerpo se purifica del sobrenadante de cultivo por medio de purificación de afinidad general, de manera que el anticuerpo pueda preparase.

El hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal también puede preparase como se describe a continuación, por ejemplo. Primero, un animal es inmunizado con un antígeno sensibilizador de acuerdo a un método conocido. Se lleva a cabo un método general por medio de inyectando un antígeno sensibilizador a un mamífero intraperitonealmente o subsecuentemente. Específicamente, se diluye un agente sensibilizador con PBS (por sus siglas en inglés de Solución salina amortiguada en fosfato) , solución salina, o similar a una cantidad apropiada, seguido por suspensión. Entonces el resultante se mezcla con una cantidad apropiada de un adyuvante general según sea necesario, tal como el adyuvante completo de Freund. Después de la emulsificación, la solución se administró a un mamífero muchas veces cada 4 a 21 días. Además, un portador apropiado también puede usarse durante la inmunización con un antígeno sensibilizador.

Un mamífero es inmunizado como se describe arriba.

Después de la confirmación de un aumento en un nivel de anticuerpo de suero deseado, las células inmunizadas se recolectan del mamífero y entonces son sujetas a división celular. Preferentemente las células inmunizadas son esplenocitos .

Las células de mieloma de mamífero se usan como las otras células precursoras para fusionarse con las células inmunizadas. Como las células de mieloma, se usan preferentemente varias líneas de células conocidas, tales como P3U1 (P3 -X63Ag8Ul ) , P3 (P3x63Ag8. 653) (J. Immunol . (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (deSt. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp . Med. (1978) 148, 313-323), y R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133).

La fusión de la célula inmunizada y la célula de mieloma pueden llevarse a cabo de acuerdo a básicamente un método conocido como la técnica de Kohler y Milstein (Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol . (1981) 73, 3-46), por ejemplo.

Más específicamente, se lleva a cabo la fusión celular de arriba, por ejemplo, en presencia de un acelerador de fusión celular en un medio de cultivo nutriente usual. Se usa uno como este acelerador de fusión, polietileneglicol (PEG) , virus Sendai (HVJ) , o similar. Si se desea, puede agregarse un agente auxiliar tal como dimetilsulfóxido y utilizarse para potenciar la eficiencia de la fusión.

La relación de las células inmunizadas a las células mieloma a usarse en la presente puede establecerse arbitrariamente. Por ejemplo, el número de células inmunizadas que se usa preferentemente es de uno a diez veces el. número de células de mieloma. Como un medio de cultivo a ser usado para la fusión celular arriba mencionada, un medio de cultivo RPMI1640 idóneo para la proliferación de la línea de célula de mieloma arriba mencionada, un medio de cultivo EM, y otros medios de cultivo generalmente usados para cultivar este tipo de célula pueden usarse. Además, el líquido que es suplemento al suero tal como el suero bovino fetal (FCS, por sus siglas en inglés) puede usarse junto con el mismo.

La fusión celular puede realizarse mezclando a fondo las cantidades predeterminadas de las células inmunizadas arriba y las células mieloma en el medio de cultivo de arriba, y se agrega una solución PEG (por ejemplo, teniendo un peso molecular con un peso que está en un intervalo de entre cerca de 1000 a 6000) precalentada en cerca de 37°C usualmente en una concentración de 30%-60% (p/v) y se mezcla, allí formando un cultivo que contiene hibridomas de interés. Luego, un medio de cultivo idóneo se agrega exitosamente al cultivo obtenido de este modo, que entonces es centrifugado para remover los sobrenadantes, y este procedimiento se repite para remover el agente de fusión celular o similar que no es preferible para el crecimiento de . hibridomas .

Los hibridomas de este modo obtenidos se cultivan para la selección en un medio de cultivo de selección usual (por ejemplo, un medio de cultivo HAT que contenga hipoxantina, aminopterina y timidina) . El cultivo en este medio de cultivo HAT continua por un periodo de tiempo suficiente (usualmente de varios días a varias semanas) de manera que las células (células no fusionadas) diferentes a los hibridomas objetivo mueran. Subsecuentemente, la selección y clonación sencilla del hibridoma que produce un anticuerpo de interés se realizan usando el método de dilución de limitación general.

Los hibridomas de arriba se obtienen inmunizando un animal no humano con un antígeno Además de este método, los hibridomas que producen un anticuerpo humano que tienen una actividad deseada (por ejemplo, la actividad de supresión de la proliferación de células) también pueden obtenerse in vi tro sensibilizando los linfocitos humanos, tales como los linfocitos humanos que han sido infectados con el virus EB, con una proteína, una célula que expresa una proteína, o un lisado de la misma, seguida por la fusión de los linfocitos de este modo sensibilizados células mieloma derivadas de humano que tiene una habilidad para dividir de forma permanente, tales como U266 (no. de registro. TIB196).

El hibridoma preparado de este modo que produce un anticuerpo monoclonal de interés puede pasarse en un medio de cultivo general y puede almacenarse en nitrógeno líquido durante un periodo de tiempo largo.

Específicamente, un hibridoma puede prepararse inmunizando al usar un método de inmunización general, como un antígeno sensibilizador, un antígeno deseado o una célula que exprese el antígeno deseado, fusionando la célula inmunizada obtenida de este modo con una célula precursora conocida por un método de fusión celular general, y después seleccionando para una célula productora de anticuerpo monoclonal (es decir, un hibridoma) por medio de un método de selección general.

Otro ejemplo de un anticuerpo que puede usarse en la presente invención es un anticuerpo policlonal. Un anticuerpo policlonal puede obtenerse como se describe a continuación, por ejemplo.

Un animal pequeño, tal como un ratón, un ratón produciendo anticuerpo humano, o un conejo, se inmuniza con una proteína CAPRIN-1 natural, una proteína CAPRIN-1 recombinante expresada en un microorganismo tal como Escherichia. coli en la forma de una proteína de fusión con GST o similar, o un polipéptido parcial de la misma, y entonces se obtiene suero. El suero se purifica por precipitación de sulfato de amonio, columna de proteína A, columna de proteína G, cromatografía de intercambio de iones DEAE, columna de afinidad para la que se ha acoplado una proteína CAPRIN-1 o un péptido sintético, o similar, de manera que pueda prepararse un anticuerpo policlonal. En los Ejemplos descritos después, un anticuerpo policlonal de conejo contra el péptido (representado por SEQ ID NO: 37) de una región parcial (en la secuencia de aminoácidos de una proteína CAPRIN-1) que es expresada en la superficie de células de cáncer se prepara y se confirma el efecto antitumor .

Como un ratón produciendo anticuerpo humano, se conocen un ratón KM (Kirin Pharma/Medarex) y un ratón Xeno (Amgen) (por ejemplo, Publicaciones de la Patente Internacional WO02/43478 y WO02/092812 ) , por ejemplo. Cuando tal ratón se inmuniza con una proteína CAPRIN-1 o un fragmento de la misma, un anticuerpo policlonal de humano completo puede obtenerse de la sangre. También, se recolectan los esplenocitos del ratón inmunizado y entonces un anticuerpo monoclonal de tipo humano puede preparase por medio de un método para la fusión con células mieloma.

Un antígeno puede prepararse usando un método de células animales (Publicación de la Patente JP (Kohyo) No. 2007-530068) o baculovirus (por ejemplo., Publicación de la Patente Internacional W098/46777) , por ejemplo. Cuando un antígeno tiene inmunogenicidad baja, el antígeno puede estar destinado a una macromolécula que tiene inmunogenicidad, tal como albúmina, y entonces se lleva a cabo la inmunización.

Además, un gen anticuerpo es clonado del hibridoma y entonces se incorpora dentro de un vector apropiado. Entonces el vector se introduce en un hospedero, y después el anticuerpo genéticamente recombinado que se produjo usando las técnicas de recombinación de gen puede usarse (por ejemplo, vea Cari, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL A TIBODIES, Publicada en el Reino Unido por MACMILLA PUBLISHERS LTD, 1990) . Específicamente, la cADN de una región variable (región V) de un anticuerpo se sintetiza del mARN del hibridoma usando transcriptasa inversa. Cuando el ADN que codifica la región V de un anticuerpo de interés puede obtenerse, este ADN está ligado al ADN que codifica la región constante (región C) de un anticuerpo deseado, y después el producto de fusión resultante se incorpora dentro de un vector de expresión. Alternativamente, el ADN que codifica la región V de un anticuerpo puede incorporarse dentro de un vector de expresión que contenga el ADN para la región C de un anticuerpo. En este tiempo, el ADN puede incorporarse dentro de un vector de expresión de manera que se exprese bajo el control de las regiones de control de expresión, como potenciador y promotor. Luego, las células hospederas se transforman con el vector de expresión, de manera que el anticuerpo pueda expresarse.

El anticuerpo anti -CAPRIN- 1 usado en la presente invención es preferiblemente un anticuerpo monoclonal. Sin embargo, el anticuerpo anti -CAPRIN- 1 de la presente invención también puede ser un anticuerpo policlonal, o un anticuerpo recombinante o un anticuerpo modificado genéticamente (por ejemplo, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de cadena sencilla, o un anticuerpo biespecífico) , por ejemplo.

Los ejemplos del anticuerpo monoclonal incluyen anticuerpos monoclonales humanos y anticuerpos monoclonales de animal no humano (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de ratón, un anticuerpo monoclonal de rata, un anticuerpo monoclonal de conejo, y un anticuerpo monoclonal de pollo) . El anticuerpo monoclonal puede prepararse al cultivar un hibridoma obtenido por fusión celular de un esplenocito de un mamífero no humano (por ejemplo, un ratón que produce anticuerpo humano o de ratón) inmunizado con una proteína CAPRIN- 1, con una célula de mieloma. En los Ejemplos descritos después, los anticuerpos monoclonales de ratón se prepararon y se confirmaron los efectos antitumor.

Estos anticuerpos monoclonales comprenden una región variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, 73, 83, 93, 103, 113, o SEQ ID NO: 123 y una región variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ' ID NO: 47, 53, 58, 63, 68, 77, 87, 97, 107, 117, o 127, en donde: la región VH comprende CDR1 representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, 70, 80, 90, 100, 110, o 120, CDR2 representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, 71, 81, 91, 101, 111, o 121, y CDR3 representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, 72, 82, 92, 102, 112, o 122; y la región VL comprende CDR1 representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, 50 ; 55, 60, 65, 74, 84, 94, 104, 114, o 124, CDR2 representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, 51, 56, 61, 66, 75, 85, 95, 105, 115, o 125, y CDR3 representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, 52, 57, 62, 67, 76, 86, 96, 106, 116, O 126.

El anticuerpo quimérico se prepara al combinar secuencias de diferentes animales. Por ejemplo, el anticuerpo quimérico comprende regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo humano y regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo de ratón. Tal anticuerpo quimérico puede prepararse por métodos conocidos. Por ejemplo, el anticuerpo quimérico puede obtenerse al ligar ADN que codifica una región de anticuerpo V a ADN que codifica un región de anticuerpo C humano, que incorpora el ligado resultante en un vector de expresión, introduciendo el vector en un hospedero, y luego provocando el hospedero para producir el anticuerpo.

Los ejemplos de un anticuerpo policlonal incluyen un anticuerpo obtenido inmunizando un animal produciendo anticuerpo humano (por ejemplo, un ratón) con una proteína CAPRIN-l .

El anticuerpo humanizado es un anticuerpo modificado que también es referido como un anticuerpo humano reformado. Un anticuerpo humanizado puede construirse trasplantando CDRs de un anticuerpo de un animal inmunizado en las regiones de determinación complementaria de un anticuerpo humano. También se conocen las técnicas de recombinación de gen general para ello.

Específicamente, las secuencias de ADN designadas a cada una de las CDRs de un anticuerpo de ratón o pollo ligada a cada una de las regiones de marco de trabajo (FRs) de un anticuerpo humano se sintetizan por medio' del método PCR de muchos oligonucleótidos , que se preparan para tener porciones superpuestas en sus porciones finales, por ejemplo. Un anticuerpo humanizado puede obtenerse ligando el ADN obtenido de este modo a ADN codificando la región constante de un anticuerpo humano, incorporando el producto de fusión resultante dentro de un vector de expresión, introduciendo el vector en un hospedero, y así causando que el hospedero produzca el producto de gen (vea Publicación de la Patente Europea No. EP239400 y la Publicación de la Patente Internacional WO96/02576) . Como las FRs de un anticuerpo humano, están ligadas por medio de CDRs, se seleccionan las FRs que permiten la formación de un sitio de enlace al antígeno con buenas regiones de determinación complementarias. Si es necesario, para la formación de un sitio de enlace al antígeno que tiene las regiones de determinación complementaria apropiadas de un anticuerpo humano reformado, los aminoácidos de las regiones de marco de trabajo de una región variable de anticuerpo pueden sustituirse (Sato, K. et al., Cáncer Research, 1993, 53: 851-856) . También, los aminoácidos de las FRs pueden sustituirse por aquellas de las regiones de marco de trabajo de varios anticuerpos humanos (vea Publicación de la Patente Internacional 099/51743) .

Como las regiones de marco de trabajo (FRs) de un anticuerpo humano, que se ligan por medio de CDRs, se seleccionan las FRs que permiten la formación de un sitio de enlace al antígeno con buenas regiones de determinación complementaria. Si es necesario, para la formación de un sitio de enlace al antígeno que tiene las regiones de determinación complementaria apropiadas de un anticuerpo humano reformado, los aminoácidos de las regiones de trabajo de una región variable de anticuerpo pueden sustituirse (Sato K. et al., Cáncer Research 1993, 53: 851-856).

Después de la preparación de un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado, los aminoácidos en una región variable (por ejemplo, FR) o una región constante pueden sustituirse con otros aminoácidos.

La sustitución de aminoácido es una sustitución de, por ejemplo, menos que 15, menos que 10, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos aminoácidos y es preferentemente una sustitución de 1 a 5 aminoácidos, y más preferentemente 1 o 2 aminoácidos. Un anticuerpo sustituido debe ser funcionalmente equivalente a un anticuerpo no sustituido. La sustitución es deseablemente una sustitución de un aminoácido (s) conservador entre aminoácidos que tienen propiedades análogas tales como carga eléctrica, cadena lateral, polaridad, y aromaticidad. Los aminoácidos que tienen propiedades análogas pueden clasificarse en aminoácidos básicos (arginina, lisina, e histidina) , aminoácidos ácidos (ácido aspártico y ácido glutámico) , aminoácidos polares no cargados (glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, cisteína, y tirosina) , aminoácidos no polares (leucina, isoleucina, alanina, valina, prolina, fenilalanina, triptofan, y metionina) , aminoácidos de cadena ramificada (treonina, valina, e isoleucina) , y aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptofan, e histidina), por ejemplo.

Los anticuerpos pueden modificarse químicamente. Los ejemplos de tal anticuerpo modificado incluyen anticuerpos enlazados a varias moléculas tales como polietilen glicol (PEG) y compuestos antitumor (por ejemplo, agentes antitumor como se ejemplifica después) . Las sustancias destinadas en el producto de anticuerpo modificado de la presente invención no están limitadas. El producto de anticuerpo modificado puede obtenerse sometiendo el anticuerpo obtenido de este modo a una modificación química. Los métodos para ello ya se han establecido en la técnica.

Como se usa en la presente, el término "funcionalmente equivalente" se refiere a que un anticuerpo sujeto tiene actividad biológica o bioquímica similar a la del anticuerpo de la presente invención, y específicamente se refiere al anticuerpo objetivo que tiene la función de afectar el tumor sin esencialmente causar rechazo sobre su aplicación a un humano por ejemplo. Un ejemplo de la actividad incluye una actividad para suprimir la proliferación celular o una actividad de enlace.

Como un método bien conocido por los expertos en la técnica para la preparación de un polipéptido funcionalmente equivalente a un polipéptido, se conoce un método para introducir una mutación en un polipéptido. Por ejemplo, las personas expertas en la técnica pueden preparar un anticuerpo funcionalmente equivalente al anticuerpo de la presente invención introduciendo apropiadamente una mutación en el anticuerpo usando mutagénesis dirigida al sitio (Hashimoto-Gotoh, T. et al., (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ. , and Smith, M. (1983) Methods Enzymol . 100, 468-500; Kramer, W. et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer, . and Fritz, HJ., (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA., (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 82, 488-492; Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766), por ejemplo.

Un anticuerpo que reconoce un epítopo de una proteína CAPRIN-1 para reconocerse por el anticuerpo anti -CAPRIN-1 de arriba, esto es un anticuerpo que específicamente enlaza al epítopo, puede obtenerse por métodos conocidos por personas experimentadas en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo puede obtenerse por medio de un método que implica determinar un epítopo de una proteína CAPRIN-1 reconocida por un anticuerpo anti-CAPRIN- 1 , por un método general (por ejemplo, mapeo de epítopo) y después preparando un anticuerpo usando un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos contenida en el epítopo como un inmunógeno, o un método que implica determinar un epítopo del anticuerpo preparado por un método general, y después seleccionando un anticuerpo que tiene el epítopo idéntico con el del anticuerpo anti-CAPRIN-1. Como se usa en la presente, el término "epítopo" se refiere a, en un mamífero y preferentemente en un humano, un fragmento de polipéptido que tiene antigenicidad o inmunogenicidad. La unidad de tamaño mínimo del mismo consiste de cerca de 7 a 12 aminoácidos, y preferentemente 8 a 11 aminoácidos.

La constante de afinidad Ka(kon/koff) del anticuerpo a usarse en la presente invención es preferiblemente al menos 107 M"\ al menos 108 M"1, al menos 5 x 108 M~\ al menos 109 M" 1 , al menos 5 x 109 M"1, al menos 1010 M"1, al menos 5 x 1010 M~ 1, al menos 1011 M"1, al menos 5 x 1011 M"1, al menos 1012 M"1, o al menos 1013 M"1.

El anticuerpo usado en la presente invención puede conjugarse con un agente antitumor. La conjugación del anticuerpo con un agente antitumor puede llevarse a cabo por medio de un espaciador que tiene un grupo reactivo para un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo hidroxi, un grupo tiol o similares (por ejemplo, un grupo succinato de succinimidilo, un grupo formilo, un grupo 2-piridilditio, un grupo maleimidilo, un grupo alcoxi carbonilo, y un grupo hidroxi) .

Los ejemplos de un agente antitumor usados en la presente invención incluyen los siguientes agentes antitumor conocidos como en las literaturas de la técnica previa y similares, tales como paclitaxel, doxorubicina, daunorubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo, tiotepa, busulfano, improsulfano, piposulfano, benzodopa, carbocuona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida, trimetilolomelamina, bulatacina, bulatacinona , camptotecina, brioestatina , caliestatina , criptoficinal , criptoficina8 , dolastatina, duocarmicina, eleuterobina , pancratistatina, sarcodictiina , espongistatina, clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorohidrato de óxido de mecloretamina , melfalano, novem iquina , fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo, carmustina, clorozotocina , fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, caliqueamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, 6 -diazo-5 -oxo-L-norleucina , adriamicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinaC, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas , peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina , estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinoestatina, zorubicina, denopterina, pteropterina , trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina , doxifluridina, enocitabina, floxuridina, andrógenos (por ejemplo, calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol , mepitiostano, y testolactona) , aminoglutetimida, mitotana, trilostano, ácido frolínico, aceglatona, aldofosfamidaglicósido, ácido aminolaevulínico, eniluracilo, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diaziquona, elfornitina, acetato de eliptinio, epotilona, etoglúcido, lentinano, lonidamina, maitansina, ansamitocina , mitoguazona , mitoxantrona , mopidanmol, nitraerina, pentoestatina , fenamet, pirarubicina , losoxantrona, ácido podofilínico, 2-etil hidrazida, procarbazina , razoxano, rizoxina, esquizofilano , espirogermanio, ácido tenuazonico, triazicuona, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol , mitolactol, pipobromano , gacitosina, docetaxel, clorambucilo, gemcitabina, 6-tioguanina, mercaptopurina, cisplatina, oxaliplatina , carboplatina, vinblastina, etopósido, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, novantrona, tenipódiso, edatrexato, daunomicina, aminopterina , xeloda, ibandronato, irinotecano, inhibidor de topoisomerasa, difluorometilolnitina (DMFO) , ácido retinoico, capecitabina, y sales farmacéuticamente aceptables (conocidas) o derivados (conocidos) de los mismos.

Alternativamente, un radio isótopo conocido como en las literaturas de la técnica previa o similares, tales como 211 A-,t , 131-ir, 125TI, 90vY, 186DRqe, 188dR„e, 153SCmm, 212-Br,i·, 32?P, 175TLlu,, o_ 176TL„u pueden enlazarse al anticuerpo usado en la presente invención. Un radioisótopo deseado es efectivo para tratamiento o diagnóstico de tumor.

El anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo que tiene reactividad inmunológica con CAPRIN-1, un anticuerpo que reconoce específicamente CAP IN-1, o un anticuerpo que enlaza específicamente a CAPRIN-1, que exhibe actividad citotóxica celular contra cáncer o el efecto de suprimir el crecimiento del tumor. El anticuerpo debe tener una estructura de manera que el rechazo casi o completamente se evita en un sujeto animal al cual el anticuerpo se administra. Los ejemplos de tal anticuerpo incluyen, cuando un sujetó animal es humano, anticuerpo humano, anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico (por ejemplo, anticuerpo quimérico de humano-ratón) , anticuerpo de cadena sencilla, y anticuerpo biespecífico . Estos anticuerpos son: anticuerpos recombinantes en los cuales las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada son de un anticuerpo humano ; anticuerpos recombinantes en los cuales las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada comprenden regiones que determinan la complementariedad (CDR1, CDR2 , y CDR3 ) de un anticuerpo animal no humano, y, regiones de estructura de un anticuerpo humano; o anticuerpos recombinantes en los cuales las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada son de un anticuerpo animal no humano, y, regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada son de un anticuerpo humano. Los anticuerpos preferibles son los primeros dos anticuerpos.

Estos anticuerpos recombinantes pueden prepararse como sigue al clonar ADN que codifica un anticuerpo monoclonal CAPRIN-1 anti -humano (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humano, un anticuerpo monoclonal de ratón, un anticuerpo monoclonal de rata, un anticuerpo monoclonal de conejo, o un anticuerpo monoclonal de pollo) de una célula que produce anticuerpo tal como, un hibridoma, preparar ADN que codifica una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada del anticuerpo por un método RT-PCR usando esto como una plantilla, y luego determinar la secuencia de cada región variable de cadena ligera y cadena pesada o cada secuencia de CDR1, CDR2 , y CDR3 con base en un sistema de enumeración Kabat EU (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991) ) .

Adicionalmente , el ADN que codifica cada una de estas regiones variables o el ADN que codifica cada CDR se prepara usando técnicas de ADN recombinante (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) o un sintetizador de ADN. Aquí, el hibridoma que produce anticuerpo monoclonal humano de arriba puede prepararse al inmunizar un animal que produce anticuerpo humano (por ejemplo, un ratón) con CAPRIN-1 humano y luego fusionar esplenocitos suprimidos del animal inmunizado para células de mieloma. Alternativamente, los ADN que codifican una . región variable de cadena pesada o cadena ligera y una región constante de un anticuerpo humano se preparan como sea necesario usando técnicas de recombinación de genes o un sintetizador de ADN.

En el caso de anticuerpo humanizado, el ADN se prepara al sustituir una secuencia codificada por CDR en el ADN que codifica una región variable de cadena ligera o cadena pesada derivada de un anticuerpo humano, con una secuencia codificada por CDR correspondiente a esto de un anticuerpo derivado de un animal no humano (por ejemplo, un ratón, una rata, o un pollo) y luego ligar el ADN de esta manera obteniendo al ADN que codifica una región constante de cadena ligera o cadena pesada derivada de un anticuerpo humano. De esta manera, el ADN que codifica anticuerpo humanizado puede prepararse .

En el caso de anticuerpo quimérico, el ADN que codifica un anticuerpo quimérico puede prepararse al ligar el ADN que codifica una región variable de cadena pesada o cadena ligera de un anticuerpo de un animal no humano (por ejemplo, un ratón, una rata, y un pollo) para el ADN que codifica una región constante de cadena pesada o cadena ligera de un anticuerpo humano .

En el caso de anticuerpo de cadena sencilla, este anticuerpo es un anticuerpo preparado al ligar linealmente una región variable de cadena pesada a una región variable de cadena ligera por medio de una ligadura. De esta manera, el ADN que codifica un anticuerpo de cadena sencilla puede prepararse al enlazar el ADN que codifica una región variable de cadena pesada, el ADN que codifica una ligadura, y el ADN que codifica una región variable de cadena ligera. Aquí, una región variable de cadena pesada y' una región variable de cadena ligera son ambas de un anticuerpo humano, o, únicamente CDRs están sustituidas con CDRs de un anticuerpo de un animal no humano (por ejemplo, un ratón, una rata, y un pollo) aunque las otras regiones son de un anticuerpo humano. También, una ligadura comprende 12 hasta 19 aminoácidos, tales como (G4S)3 de 15 aminoácidos (G.-B. Kim et al., Protein Engineering Design and Selection 2007, 20 (9) : 425-432) .

En el caso de anticuerpo biespecífico (diacuerpo) , este anticuerpo es capaz enlazar específicamente a dos epítopos diferentes. Por ejemplo, el ADN que codifica un anticuerpo biespecífico puede prepararse al ligar el ADN que codifica una región variable de cadena pesada A, el ADN que codifica una región variable de cadena ligera B, el ADN que codifica una región variable de cadena pesada B, y el ADN que codifica una región variable de cadena ligera A en este orden (aquí, el ADN que codifica una región variable de cadena ligera B se enlaza al ADN que codifica una región variable de cadena pesada B por medio del ADN que codifica la ligadura de arriba) . Aquí, una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera son ambos de un anticuerpo humano, o, sólo las CDRs están sustituidas con CDRs de un anticuerpo de un animal no humano (por ejemplo, un ratón, una rata, o un pollo) aunque las otras regiones son de un anticuerpo humano .

El ADN recombinante preparado de arriba se incorpora en una o una pluralidad de vectores apropiados, que se introducen en células hospederas (por ejemplo, células mamíferas, células de levadura, o células de insecto) , y luego se provoca (co) expresión, de manera que un anticuerpo recombinante puede prepararse (P. J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES . , 1997 ILEY, P. Shepherd y C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; J. . Goding., Monoclonal Antibodies: principies y practice., 1993 ACADEMIC PRESS).

Los ejemplos del anticuerpo de la presente invención preparado por el método de arriba incluyen los siguientes anticuerpos (a) hasta (k) : (a) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 , y CDR3 de una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NOS: 40, 41, y 42 y CDR1 , CDR2 , y CDR3 de una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NOS: 44, 45, y 46 (preferiblemente, un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 47) ; (b) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 , y CDR3 de una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NOS: 40, 41, y 42 y CDR1 , CDR2 , y CDR3 de una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NOS: 50, 51, y 52 (preferiblemente, un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 53); (c) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 , y CDR3 de una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NOS: 40, 41, y 42 y CDR1, CDR2 , y CDR3 de una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NOS: 55, 56, y 57 (preferiblemente, un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 58); (d) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 , y CDR3 de una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NOS: 40, 41, y 42 y CDR1, CDR2 , y CDR3 de una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NOS: 60, 61, y 62 (preferiblemente, un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 63); (e) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 , y CDR3 de una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NOS: 40, 41, y 42 como CDR1 , CDR2 , y CDR3 de una región variable de cadena pesada y CDR1, CDR2, y CDR3 de una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NOS: 65, 66, y 67 (preferiblemente, un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 68) ; (f) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 , y CDR3 de una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NOS: 70, 71, y 72 y CDR1 , CDR2 , y CDR3 de una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NOS: 74, 75, y 76 (preferiblemente, un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 73 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 77) ; (g) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 , y CDR3 de una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NOS: 80, 81, y 82 y CDR1 , CDR2 , y CDR3 de una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NOS: 84, 85, y 86 (preferiblemente, un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 83 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 87) ; (h) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 , y CDR3 de una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NOS: 90, 91, y 92 y CDR1 , CDR2 , y CDR3 de una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NOS: 94, 95, y 96 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 93 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 97); (i) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 , y CDR3 de una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NOS: 100, 101, y 102 y CDR1 , CDR2 , y CDR3 de una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NOS: 104, 105, y 106 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 103 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 107) ; (j) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 , y CDR3 de una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NOS: 110, 111, y 112. y CDR1, CDR2 , y CDR3 de una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NOS: 114, 115, y 116 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 113 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 117) ; y (k) un anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 , y CDR3 de una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NOS: 120, 121, y 122 y CDR1, CDR2 , y CDR3 de una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NOS: 124, 125, Y 126 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 123 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 127) .

Aquí, las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 40, 41, y 42, SEQ ID NOS: 70, 71, y 72, SEQ ID NO: 80, 81, y 82, SEQ ID NO: 90, 91, y 92, SEQ ID NO: 100, 101, y 102, SEQ ID NO: 110, 111, y 112, o SEQ ID NO: 120, 121, y 122 son CDR1, CDR2 , y CDR3 , respectivamente, de una región variable de cadena pesada de anticuerpo de ratón. Las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 44, 45, y 46, SEQ ID NO: 50, 51, y 52, SEQ ID NO: 55, 56, y 57, SEQ ID NO: 60, 61, y 62, SEQ ID NO: 65, 66, y 67, SEQ ID NO: 74, 75, y 76, SEQ ID NO : 84, 85, y 86, SEQ ID NO: 94, 95, y 96, SEQ ID NO: 104, 105, y 106, SEQ ID NO: 114, 115, y 116, o SEQ ID NO: 124, 125, y 126 son CDR1 , CDR2 , y CDR3 , respectivamente, de una región variable de cadena ligera de anticuerpo de ratón. También, el anticuerpo humanizado, el anticuerpo quimérico, el anticuerpo de cadena sencilla, o el anticuerpo biespecífico de la presente invención es el siguiente anticuerpo (ejemplificado como "anticuerpo (a)") , por ejemplo: (i) un anticuerpo en donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de aminoácido de SEQ ID NOS: 40, 41, y 42 y las secuencias de aminoácido de regiones de estructura de un anticuerpo humano, y, una región variable de cadena ligera comprende las secuencias de aminoácido de SEQ ID NOS: 44, 45, y 46 y las secuencias de aminoácido de regiones de estructura de un anticuerpo humano (por ejemplo, el anticuerpo en donde la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, y, la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47) . (ii) un anticuerpo en donde una región variable de cadena pesada comprende las secuencias de aminoácido de SEQ ID NOS: 40, 41, y 42 y las secuencias de aminoácido de regiones de estructura de un anticuerpo humano, y, una región constante de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano, y, una región variable de cadena ligera comprende las secuencias de aminoácido de SEQ ID NOS: 44, 45, y 46 y las secuencias de aminoácido de regiones de estructura de un anticuerpo humano, y una región constante de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano (por ejemplo, el anticuerpo en donde una región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, y, una región constante de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano, así como, una región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, y, una región constante de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano) .

Además, las secuencias de regiones variables y regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo humano pueden obtenerse de NCBI (por ejemplo, E.U.A. : GenBank, UniGene) , por ejemplo. Por ejemplo, la secuencia del No. de Acceso J00228 puede referirse por una región constante de cadena pesada IgGl humana, la secuencia del No. de Acceso J00230 puede referirse para una región constante de cadena pesada IgG2 humana, la secuencia del No. de Acceso X03604 puede referirse para una región constante de cadena pesada IgG3 humana, la secuencia del No. de Acceso K01316 puede referirse para una región constante de cadena pesada IgG4 humana, las secuencias de los Nos. de Acceso V00557, X64135, X64133, y similares pueden referirse para regiones constantes ? de cadena ligera humana, y las secuencias de los Nos. de Acceso X64132, X64134, y similares pueden referirse para regiones constantes ? de cadena ligera humana.

Los anticuerpos de arriba preferiblemente tienen actividad citotóxica celular y de esta manera pueden exhibir efectos antitumor.

También, las secuencias específicas de regiones variables de cadena ligera y cadena pesada o CDRs en los anticuerpos de arriba se dan simplemente para propósitos ilustrativos, y de esta manera son claramente no limitados para tales secuencias específicas. Un hibridoma capaz de producir otro anticuerpo humano o anticuerpo animal no humano (por ejemplo, un anticuerpo de ratón) contra CAPRIN-1 humana se prepara, un anticuerpo monoclonal que se produce por el hibridoma se recolecta, y luego se determina si o no es un anticuerpo objetivo por propiedad de enlace inmunológica con CAPRIN-1 humana y actividad citotóxica celular como indicadores. Después de la identificación de un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal objetivo de esta manera, el ADN que codifica regiones variables de cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo objetivo se prepara del hibridoma como se describe arriba, se lleva a cabo el procesamiento por secuencia, y luego el ADN se usa para la preparación de otro anticuerpo.

Adicionalmente , el anticuerpo de arriba de la presente invención, la secuencia de los anticuerpos (a) y (b) de arriba, particularmente la secuencia de la región de estructura y/o la secuencia de la región constante de cada uno de los anticuerpos puede tener una sustitución, una eliminación, o una adición de uno o varios (preferiblemente, 1 o 2) aminoácidos, siempre y cuando tenga especificidad para reconocimiento específico de CAPRIN-1. Aquí el término "varios" se refiere a 2 hasta 5, y preferiblemente 2 o 3.

Los anticuerpos usados en la presente invención también pueden producirse por técnicas de recombinación de gen usando ADN que codifica el anticuerpo de arriba de la presente invención, o, el ADN que codifica la cadena ligera o cadena pesada del anticuerpo de arriba, o, el ADN que codifica la región variable de cadena ligera o cadena pesada del anticuerpo de arriba. Los ejemplos de tal ADN incluyen, en el caso de anticuerpo (a) , el ADN que codifica una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de nucleótido que codifican las secuencias de aminoácido de SEQ ID NOS: 40, 41, y 42 y el ADN que codifica una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de nucleótido que codifican las secuencias de aminoácido de SEQ ID NOS: 44, 45, y 46.

Las regiones que determinan la complementariedad (CDRs) codificadas por las secuencias de ADN son regiones para determinar la especificidad de un anticuerpo. De esta manera, regiones que codifican secuencias en un anticuerpo diferente de las CDRs (específicamente, una región constante y una región de estructura) pueden ser de otros anticuerpos. Aquí, los ejemplos de tales "otros anticuerpos" incluyen anticuerpos de organismos no humanos, y preferiblemente son de un humano en vista de reducción de efectos colaterales. De esta manera, en el caso del ADN de arriba, las regiones que codifican cada región de estructura y cada región de contacto de cadenas pesadas y cadenas ligeras preferiblemente comprenden secuencias de nucleótido que codifican secuencias de aminoácido correspondientes de un anticuerpo humano.

Los ejemplos alternativos adicionales del ADN que codifican el anticuerpo usado en la presente invención incluyen, en el caso de anticuerpo (a) , el ADN que codifica una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y el ADN que codifica una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47. Aquí, un ejemplo de la secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 es la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 48. También, un ejemplo de la secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 es la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 49. En estos ADNs , las regiones que codifican cada región constante de cadenas pesadas y cadenas ligeras preferiblemente comprenden secuencias de nucleótido que codifican las secuencias de aminoácido correspondientes de un anticuerpo humano.

El ADN de la presente invención puede obtenerse por los métodos de arriba o el siguiente método, por ejemplo. Primero, el ARN total se prepara de un hibridoma con relación al anticuerpo de la presente invención usando un kit de extracción de ARN comercialmente disponible, y luego cADN se sintetiza con transcriptasa inversa usando cebadores aleatorios, y similares. Posteriormente, el cADN que codifica un anticuerpo se amplifica por un método PCR usando como cebadores los oligonucleótidos de secuencias conservadas en cada región variable de genes de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo de ratón conocidos. La secuencia que codifica una región constante puede obtenerse al amplificar una secuencia conocida por un método PCR. La secuencia de nucleótido de ADN puede determinarse por un método convencional tal como inserción de esto en un plásmido o un fago para procesamiento por secuencia.

Los ejemplos de ADN con relación a los anticuerpos (a) hasta (k) de arriba son como sigue. (i) Ya que ADN codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos' de SEQ ID NO: 43, 73, 83, 93, 103, 113, 123, 133, 143, o 153, ADN que comprende la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 48, 78, 88, 98, 108, 118, o 128. (ii) Ya que ADN codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, 53, 58, 63, 68, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, o 157, ADN que comprende la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 49, 54, 59, 64, 69, 79, 89, 99, 109, 119, o 129.

Los anticuerpos anti -CAPRIN- 1 usados en la presente invención se consideran para exhibir el efecto antitumor contra CAPRIN-l-que expresa células de cáncer a través del siguiente mecanismo: la citotoxicidad dependiente del anticuerpo de célula efectora (ADCC) de CAPRIN- 1 -que expresa células; y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de CAPRIN- 1-que expresa células .

Por lo tanto, la actividad de un anticuerpo anti-CAPRIN-1 para usarse en la presente invención puede evaluarse por, como se describe específicamente en los Ejemplos a continuación, midiendo ex vivo la actividad ADCC o actividad CDC de arriba contra células de cáncer que expresan proteína CAPRIN-1, como se describe específicamente en los Ejemplos a continuación .

La actividad ADCC puede medirse usando un kit comercialmente disponible para medir la actividad citotóxica tal como un Kit de Detección de Citotoxicidad (Roche) . De acuerdo con el método, la actividad ADCC puede medirse por procedimientos que comprenden hacer reaccionar una célula de cáncer objetivo con un anticuerpo anti -CAPRIN- 1 en hielo, cultivar la célula con una célula efectora (por ejemplo, PBMC) durante 4 horas, y luego medir la actividad de enzima de deshidrogenasa de lactato (LDH, por sus siglas en inglés) o radioactividad Cr51 liberada en el medio en el sobrenadante de cultivo. También, la actividad CDC puede medirse por procedimientos que comprenden hacer reaccionar una célula de cáncer objetivo con un anticuerpo anti-CAPRIN-1 en hielo, cultivar la célula con una solución que contiene complementos (por ejemplo, suero) durante 4 horas, y luego medir la actividad de enzima o radioactividad similar a la de arriba en el sobrenadante de cultivo.

Un anticuerpo anti -CAPRIN- 1 para usarse en la presente invención enlaza a una proteína CAPRIN- 1 en una célula de cáncer y exhibe efectos antitumor debido a la actividad de arriba, y de esta manera esto es útil para tratar o prevenir cáncer. Específicamente, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para tratar y/o prevenir cáncer, que comprende un anticuerpo anti -CAPRIN-1 como un ingrediente activo. Cuando el anticuerpo anti-CAPRIN- 1 se usa para administración del mismo a un cuerpo humano (terapia de anticuerpo) , esto es preferiblemente anticuerpo humano o anticuerpo humanizado con objeto de disminuir la inmunogenicidad.

Además, entre más alta sea la afinidad de enlace entre un anticuerpo anti-CAPRIN-1 y una proteína CAPRIN-1 en las superficies celulares de cáncer, más fuerte será la actividad antitumor del anticuerpo anti-CAPRIN-1 que puede obtenerse. Por lo tanto, cuando un anticuerpo anti-CAPRIN-1 que tiene afinidad de enlace alta con una proteína CAPRIN-1 puede adquirirse', los efectos antitumor más fuertes pueden esperarse y tal aplicación de anticuerpo como una composición farmacéutica para el propósito de tratamiento y/o prevención de cáncer se vuelve posible. Tal afinidad de enlace alta es deseable como sigue. Como se describe arriba, la constante de enlace (constante de afinidad) Ka (kon/k0ff) es preferiblemente al menos 107 M"1, al menos 108 M"1, al menos 5 x 108 M"1, al menos 109 M"1, al menos 5 x 109 M"1, al menos 1010 M"1, al menos 5 x 1010 M"1, al menos 1011 M" 1, al menos 5 x 1011 M"1, al menos 1012 M"1 , o, al menos 1013 M"1.

Enlace a célula que expresa antígeno La capacidad de un anticuerpo para enlazar a CAPRIN-1 puede especificarse al enlazar el ensayo usando ELISA, un método Western blot, inmuno-fluorescencia y análisis citométrico de flujo, o similares como se describe en los Ej emplos .

Tinción inmunohistoquímica Un anticuerpo que reconoce CAPRIN-1 puede probarse para reactividad con CAPRIN-1 por un método- para inmunohistoquímica conocido por personas experimentadas en la técnica usando secciones congeladas fijadas a paraformaldehído o acetona o secciones de tejido incrustadas en parafina fijadas en paraformaldehído, que se preparan de muestras de tejido obtenidas de un paciente durante cirugía, o muestras de tejido obtenidas de un animal que tiene tejido de heterotransplante inoculado con una línea de célula que expresa CAPRIN-1, naturalmente o después de transíección .

Un anticuerpo reactivo a CAPRIN-1 puede teñirse por varios métodos para tinción inmunohistoquímica. Por ejemplo, un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de raíz de rábano o anticuerpo anti-conejo de cabra se provoca que experimente reacción, un anticuerpo objetivo puede visualizarse.

Agente antitumor La presente invención es caracterizada por combinar un anticuerpo anti-CAPRIN-1 con un agente antitumor como se ejemplifica arriba. Un anticuerpo anti-CAPRIN-1 y un agente antitumor cada uno tiene actividad antitumor se administran en combinación con un paciente con cáncer, de manera que el efecto antitumor sinergísticamente importante, específicamente el efecto de provocar regresión del tumor casi completa en un modelo animal que porta el cáncer, puede obtenerse como se describe en los Ejemplos. Tal efecto antitumor especial se observa cuando un anticuerpo anti-CAPRIN-1 y un agente antitumor se usan en combinación, aun cuando el crecimiento del tumor gradualmente incrementa con el paso del tiempo. Este efecto es completamente extraordinario.

En la presente invención, los ejemplos de un agente antitumor a usarse en combinación con un anticuerpo anti-CAPRIN-1 incluyen todos los quimioterapéuticos que se usan, se usaron, o usarán para tratar varios tipos de canceres o tumores. Los ejemplos de tal agente antitumor incluyen un fármaco anti-metabólico, un agente anticáncer antibiótico, un agente anticáncer basado en alcaloide de planta, un inhibidor de topoisomerasa, y un agente alquilante antitumor. Por ejemplo, todos los agentes antitumor (como se ejemplifica arriba) conocidos en las literaturas y similares se incluyen en la presente. Los ejemplos de los mismos incluyen, pero no se limitan a, agentes antitumor que se usan en los Ejemplos descritos a continuación, tales como agentes anticáncer (por ejemplo, ciclofosfamida, paclitaxel, docetaxel, y vinorelbina) , los efectos antitumor importantes de los cuales se han confirmado. Por lo tanto, en la presente invención, uno o dos o más fármacos seleccionados de ciclofosfamida, paclitaxel, docetaxel, vinorelbina, y sales f rmacológicamente aceptables o derivados de los mismos pueden usarse como agentes antitumor.

Medicamento para tratar y/o prevenir cáncer Un objetivo de la composición farmacéutica para tratar y/o prevenir cáncer de la presente invención no se limita particularmente, siempre y cuando sea cáncer (célula) que expresa un gen CAPRIN-1.

El término "tumor" y "cáncer" como se usa en la presente se refiere a neoplasma maligno y se usa intercambiablemente.

El medicamento de la presente invención es caracterizado porque comprende una combinación de un anticuerpo o un fragmento del mismo que tiene reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1 y uno o dos o más tipos de agentes antitumor, en donde el anticuerpo o fragmento y los agentes antitumor se combinan juntos o de forma separada. Específicamente, cuando estos ingredientes activos se combinan juntos, el anticuerpo de arriba o un fragmento del mismo y los agentes antitumor de arriba pueden mezclarse juntos en un portador (o un excipiente) para formularse en la forma de una composición farmacéutica. Por otro lado, cuando estos ingredientes activos se combinan separadamente, una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo de arriba o un fragmento del mismo como un ingrediente activo y una composición farmacéutica que contiene los agentes antitumor de arriba como un ingrediente activo se formulan separadamente de manera que un medicamento puede producirse en la forma de un kit farmacéutico. Tal composición farmacéutica y kit farmacéutico son descritos más específicamente a continuación.

El cáncer a someterse a la presente invención es cáncer que expresa genes que codifican proteínas CAPRIN-1 que tienen secuencias de aminoácido de SEQ ID NOS: 2 hasta 30 de numeración uniforme. Los ejemplos de tal cáncer incluyen preferiblemente cáncer de mama, tumor cerebral, leucemia, cáncer de pulmón, linfoma, mastocitoma, cáncer renal, cáncer cervicouterino, cáncer de vejiga, cáncer esofágico, cáncer gástrico, y cáncer colorectal .

Los ejemplos de tal cáncer específico incluyen, pero no se limitan a, adenocarcinoma de mama, adenocarcinoma de mama tipo compuesto, tumor mezclado maligno de la glándula mamaria, adenocarcinoma papilar intraductal, adenocarcinoma pulmonar, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula pequeña, carcinoma de célula grande, glioma que es tumor de tejido epitelial neural, ependimoma, neurocitoma, tumor neuroectodermal fetal, schwanoma, neurofibroma, meningioma, leucemia linfocítica crónica, linfoma, linfoma gastrointestinal, linfoma digestivo, linfoma de célula pequeña hasta célula media, cáncer de ciego, cáncer de colon ascendente, cáncer de colon descendente, cáncer de colon transverso, cáncer de colon sigmoide, y cáncer rectal.

Por lo tanto, los sujetos preferibles son mamíferos incluyendo primates, animales de compañía, animales domésticos, animales para carreras, y similares y son particularmente de forma preferible humanos, perros, y gatos.

Composición farmacéutica Los ingredientes activos contenidos en el medicamento para tratar y/o prevenir un cáncer de la presente invención, esto es el anticuerpo de arriba o un fragmento del mismo y el agente antitumor de arriba, puede formularse por un método conocido por personas experimentadas en la técnica en la forma de una composición farmacéutica preparada al mezclarlos o en la forma de composiciones farmacéuticas individuales de la misma.

Por ejemplo, la composición farmacéutica puede usarse parenteralmente en la forma de una preparación de inyección tal como una solución aséptica preparada con agua o una solución farmacológicamente aceptable diferente de agua o una suspensión. Por ejemplo, puede formularse al mezclarse en una forma de dosificación unitaria requerida por la práctica farmacéutica generalmente aceptada en combinación apropiada con un medio o portador farmacológicamente aceptable, específicamente, agua estéril o solución salina, aceite vegetal, un emulsificador, una suspensión, un tensioactivo, un estabilizador, un compuesto de sabor, un excipiente, un vehículo, un antiséptico, un aglutinante, y similares. También, la composición farmacéutica de la presente invención puede contener una sal farmacológicamente aceptable. Como una sal farmacológicamente aceptable, por ejemplo, puede usarse el ácido inorgánico tal como ácido clorhídrico o ácido fosfórico, o ácido orgánico tal como ácido acético, ácido tartárico, o ácido mandélico. Adicionalmente , puede usarse una sal formada con un grupo carboxilo libre. Por ejemplo, tal sal también puede inducirse de una base inorgánica tal como sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxido de hierro (I) , o similares, o una base orgánico tal como isopropilamina, trimetilamina, 2-etil aminoetanol, histidina, o procaína.

Una composición aséptica para inyección puede prescribirse de acuerdo a la práctica farmacéutica general usando un vehículo tal como agua destilada para inyección.

Los ejemplos de una solución acuosa para inyección incluyen solución salina, una solución isotónica que contiene dextrosa u otros adyuvantes, tales como D-sorbitol, D-manpsa, D-manitol, y cloruro de sodio. Estos ejemplos pueden usarse en combinación con un agente solubilizante apropiado tal como alcohol, específicamente etanol y polialcohol (por ejemplo, propilen glicol y polietilen glicol) , y tensioactivo no iónico (por ejemplo, polisorbato 80 (TM) y HCO-60) .

Los ejemplos del aceite incluyen aceite de ajonjolí y aceite de frijol de soja, que puede usarse en combinación con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo o alcohol bencílico. También, un agente amortiguador tal como solución amortiguadora de fosfato o solución amortiguadora de acetato de sodio, un agente tranquilizante tal como clorhidrato de procaína, un estabilizador tal como alcohol bencílico o fenol, y un antioxidante puede combinarse con el mismo. Una ampolleta apropiada se rellena generalmente con la solución de inyección de esta manera preparada.

La administración es administración oral o parenteral. Los ejemplos de administración parenteral incluyen inyección, administración transnasal, administración pulmonar, y administración transdérmica . Los ejemplos de inyección incluyen inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal , e inyección subcutánea, de manera que es posible la administración sistémica o local. También, es posible en el caso de administración parenteral, la administración por infusión que se realiza gradualmente o lentamente. tomando mucho tiempo. Los métodos de administración pueden seleccionarse apropiadamente dependiendo de la edad, peso corporal, género, síntomas del paciente, y similares. La composición farmacéutica que comprende un anticuerpo se administra preferiblemente de forma parenteral . Por otro lado, en el caso de una composición farmacéutica que comprende un agente antitumor, ya sea administración oral o administración parenteral se selecciona dependiendo de los tipos de agentes antitumor e indicaciones .

En el caso de la composición farmacéutica para tratar y/o prevenir un cáncer de la presente invención, la dosificación del anticuerpo de arriba puede seleccionarse del intervalo entre 0.0001 mg y 1000 mg por kg de pesó corporal, por ejemplo. Alternativamente, por ejemplo, la dosificación puede seleccionarse del intervalo entre 0.001 mg/cuerpo de un paciente y 1000.00 mg/cuerpo de un paciente; sin embargo, el intervalo de dosificación no siempre se limita a estos valores numéricos. Adicionalmente , la dosificación del agente antitumor de arriba puede seleccionarse del intervalo entre 1 y 1000 mg/cuerpo de un paciente y preferiblemente entre 10 y 500 mg/cuerpo de un paciente, por ejemplo; sin embargo, el intervalo de dosificación no siempre se limita a estos valores numéricos. Además, la dosificación y método de administración varían dependiendo del peso corporal, edad, sexo, síntoma del paciente, y similares, pero puede seleccionarse apropiadamente por personas experimentadas en la técnica.

Método de administración El tratamiento y/o prevención de cáncer usando el agente para tratar y/o prevenir un cáncer de la presente invención involucra varias formas además de la administración del agente como la composición farmacéutica de arriba. Por ejemplo, los ingredientes activos del agente para tratar y/o prevenir un cáncer de la presente invención pueden administrarse simultáneamente o puede administrarse separadamente en orden. En un ejemplo específico, los ingredientes activos pueden administrarse en intervalos de hasta alrededor de 3 semanas, esto es, durante alrededor de 3 semanas después de la administración del primer ingrediente activo, el segundo ingrediente activo puede administrarse. En este tiempo, esta administración puede realizarse posterior al tratamiento quirúrgico, o el tratamiento quirúrgico también puede realizarse entre la administración del primer agente y la administración del segundo agente. También, el agente para tratar y/o prevenir un cáncer de la presente invención puede administrarse de acuerdo con una pluralidad de ciclos de administración. Por ejemplo, cuando la administración simultánea de los ingredientes activos del agente para tratar y/o prevenir un cáncer de la presente invención se realizó, la composición farmacéutica que comprende ambos ingredientes activos se administra con un ciclo de alrededor de 2 días hasta alrededor de 3 semanas. Posteriormente, donde sea necesario, el ciclo terapéutico también puede repetirse de acuerdo con el juicio médico. Similarmente , cuando la formulación para administrar los ingredientes activos en orden se planea, los periodos de administración de los agentes individuales se ajustan para ser el mismo periodo. Un intervalo entre los ciclos puede variar desde 0 hasta 2 meses. La dosificación de cada ingrediente activo del agente para tratar y/o prevenir un cáncer de la presente invención puede ajustarse similarmente a la dosificación usada para administración de cada ingrediente activo de la composición farmacéutica.

Kit farmacéutico El medicamento para tratar y/o prevenir un cáncer de la presente invención puede estar en la forma de un kit farmacéutico. El término "kit farmacéutico" como se usa en la presente se refiere a, en un método para tratar o prevenir un cáncer, un paquete para usar el anticuerpo anti -CAPRIN- 1 de arriba o un fragmento del mismo y el agente antitumor de arriba que son ingredientes activos en la forma de composiciones farmacéuticas individuales. El paquete incluye instrucciones para administración de cada ingrediente activo. Cada ingrediente activo de la composición farmacéutica de arriba para tratar y/o prevenir un cáncer, que está contenido en un kit farmacéutico puede estar en la forma de una composición farmacéutica que se ha formulado como se describe arriba de manera que los ingredientes activos pueden administrarse juntos o de forma separada. También, un kit farmacéutico contiene las cantidades de ingredientes activos suficientes para una dosis sencilla o dosis múltiples de manera que cada ingrediente activo puede administrarse de acuerdo con el método de administración de arriba.

Con base en el contenido descrito específicamente arriba, la presente invención proporciona además un método para tratar y/o prevenir un cáncer, que comprende administrar el medicamento de arriba de la presente invención a un sujeto que sospecha que tiene cáncer (incluyendo un sujeto con cáncer) . En una modalidad, un anticuerpo o un fragmento del mismo y un agente antitumor, que están contenidos en el medicamento de arriba, se administran simultáneamente o separadamente al sujeto de arriba.

Ejemplos La presente invención se describe más específicamente con base en los Ejemplos, pero el alcance de la presente invención no se limita por estos ejemplos específicos.

Ejemplo 1 Identificación de proteína de antígeno de cáncer novedosa por método SEREX (1) Preparación de la colección de cADN El ARN total se extrajo de un tejido testículos de un perro saludable por un método de ácido guanídico-fenol-cloroformo. Se purificó PolyA ARN de acuerdo con los protocolos incluidos con un Kit de purificación de mARN Oligotex-dT30 (Takara Shuzo Co. , Ltd.) usando el kit.

Se sintetizó una colección de fago de cADN de testículos de perro usando el mARN de esta manera obtenido (5 ]ig) . Para la preparación de la colección de fago de cADN, un kit de síntesis de cADN, un kit de síntesis de ZAP-cADN, y un kit de clonación de ZAP-cADN gigapack III gold (STRATAGENE) se usaron y la colección se preparó de acuerdo a protocolos incluidos con el kit. El tamaño de la colección de fago cADN de esta manera preparada fue 7.73 x 105 pfu/ml . (2) Selección de colección de cADN usando suero La inmunoselección se llevó a cabo usando- la colección de fago de cADN de testículos de perro preparada arriba. Específicamente, se infectó Escherichia coli hospedera (XL1-Blue RF' ) con el fago de manera que 2210 clones se presentaron en una placa de agarosa F90 x 15 mm NZY. Las células se cultivaron a 42 °C durante 3 hasta 4 horas, a fin de provocar formación de placa. La placa se cubrió con una membrana de nitrocelulosa (Hybond C Extra: GE Healthcare Bio-Science) impregnada con IPTG (isopropil^-D-tiogalactosido) a 37 °C durante 4 horas. Las proteínas se indujeron, expresaron, y luego transfirieron a la membrana. Posteriormente, la membrana se recubrió, sumergió, y agitó en TBS (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM pH 7.5) que contiene leche descremada en polvo al 0.5% a 4°C durante la noche, de manera que la reacción no específica se suprimió.' El filtro se provocó para reaccionar con suero diluido 500 veces de perros con cáncer a temperatura ambiente durante 2 hasta 3 horas.

Como el suero de arriba de perros con cáncer, se usaron sueros recolectados de perros con cáncer de mama. Los sueros se almacenaron a -80°C y luego sometieron a pretratamiento inmediatamente antes del uso. El pretratamiento para sueros se realizó por el siguiente método. Específicamente, se infectó Escherichia coli hospedero (XLl-Blure MRF' ) con fago ? ZAP Express en el cual ningún gen exterior se ha insertado, y luego cultivó en medio de placa NZY a 37°C durante la noche. Posteriormente, una solución amortiguadora de NaHC03 0.2 M (pH 8.3) que contiene NaCl 0.5 M se agregó a la placa y luego la placa se dejó reposar a 4°C durante 15 horas. Los sobrenadantes se recolectaron como extractos de Escherichia coli/fago. Después, el extracto de Escherichia coli/fago recolectado se pasó a través de una columna NHS (GE Healthcare Bio-Science) , a fin de inmovilizar la proteína derivada de Escherichia coli-fago. El suero de un perro con cáncer se pasó a través de la columna a la cual la proteína se ha inmovilizado para reacción, por ello remueve Escherichia coli y los anticuerpos adsorbidos al fago del suero. Cada fracción de suero que ha pasado a través de la columna se diluyó 500 veces con TBS que contiene leche descremada en polvo al 0.5%, y lo resultante se usó como un material de inmunoselección .

Una membrana, a la cual el suero de esta manera tratado y la proteína de fusión se ha manchado, se lavó 4 veces con TBS-T (Tween20/TBS al 0.05%). La membrana se hizo reaccionar con IgG anti-perro de cabra (IgG-h+I anti perro de cabra H P conjugado: BETIL Laboratories) diluida 5000 veces como un anticuerpo secundario con TBS que contiene leche descremada en polvo al 0.5% a temperatura ambiente durante 1 hora. La detección se llevo a cabo por reacción de color de enzima usando una solución de reacción NBT/BCIP (Roche) . Las colonias correspondientes al sitio positivo de reacción al color se recolectaron de la placa de agarosa F90 x 15 mm NZY, y luego disolvieron en 500 µ? de solución amortiguadora SM (NaCl 100 mM, MgClS04 10 mM, Tris-HCl 50 mM, gelatina al 0.01%, pH 7.5). Hasta la unificación de colonias positivas de reacción al color, la selección secundaria y selección terciaria se repitieron por un método similar al de arriba. De esta manera, 30940 clones de fago que han reaccionado con IgG de suero se seleccionaron de manera 5 clones positivos se aislaron . (3) Búsqueda de homología para el gen de antígeno aislado Un procedimiento para conversión de los vectores de fago para vectores de plásmido se realizó para los 5 clones positivos asilados por el método de arriba para el propósito de someter los clones a análisis de secuencia de nucleótido. Específicamente, 200 µ? de una solución de Escherichia coli hospedero (XLl-Blue RF' ) preparados para dar una absorbancia OD60o de 1.0, 250 µ? de una solución de fago purificada, y 1 µ? de fago auxiliar ExAssist (STRATAGENE) se mezclaron y permitieron reaccionar a 37°C durante 15 minutos. Después de que, 3 mi de medio LB se agregó, las células se cultivaron a 37°C durante 2.5 hasta 3 horas, y luego lo resultante' se colocó inmediatamente en baño de agua a 70°C para incubación durante 20 minutos. La centrifugación se llevo a cabo a 4°C, 1000 x g durante 15 minutos, y luego el sobrenadante se recolectó como una solución fagémida. Posteriormente, 200 µ? de una solución preparada de Escherichia coli SOLR hospedero fagémido para dar una absorbancia OD60o de 1.0 y 10 µ? de la solución de fago purificada se mezclaron, seguido por 15 minutos de reacción a 37°C. 50 µ? de lo resultante se colocó en placa en medio de agar LB que contiene ampicilina (en concentración final de 50 g/ml) y luego cultivó durante la noche a 37°C. Una colonia sencilla de SOLR transformado se recolectó y luego cultivó en medio LB que contiene ampicilina (en concentración final de 50 µg/ml) a 37°C. Después del cultivo, el ADN de plásmido que lleva un inserto de interés se purificó usando un kit de Miniprep de plásmido QIAGEN (QIAGEN) .

El plásmido purificado se sometió al análisis de la secuencia completa del inserto por el método andante cebador usando el cebador T3 de SEQ ID NO: 31 y el cebador T7 de SEQ ID NO: 32. Las secuencia del gen de SEQ ID NOS: 5, 7, 9, 11, y 13 se obtuvieron por el análisis de secuencia. Con el uso de las secuencias de nucleótido de los genes y las secuencias de aminoácido de las mismas (SEQ ID NOS: 6, 8, 10, 12, y 14), se condujo la búsqueda BLAST con el programa de búsqueda de homología (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) para buscar homología con genes conocidos. Como un resultado, se reveló que todos los cinco genes obtenidos fueron genes que codifican CAPRIN-1. Las identidades de secuencia entre los cinco genes fueron 100% en el nivel de secuencia de nucleótido y 99% en el nivel de secuencia de aminoácidos en las regiones para traducirse en proteínas. Las identidades de secuencia de estos genes y el gen que codifica el homólogo humano fueron 94% en el nivel de secuencia de nucleótido y 98% en el nivel de secuencia de aminoácidos en las regiones a traducirse en proteínas. Las secuencias de nucleótido de los homólogos humanos son representadas por SEQ ID NOS : 1 y 3 y las secuencias de aminoácido de las mismas son representadas por SEQ ID NOS: 2 y 4. También, las identidades de secuencia de los genes de perro obtenidos y el gen que codifica el homólogo de ganado fueron 94% en el nivel de secuencia de nucleótido y 97% en el nivel de secuencia de aminoácidos en las regiones para traducirse en proteínas. La secuencia de nucleótido del homólogo de ganado es representada por SEQ ID NO: 15 y la secuencia de aminoácidos de la misma es representada por SEQ ID NO: 16. Además, las identidades de secuencia de los genes que codifican el homólogo humano y el gen que codifica el homólogo de ganado fueron 94% en el nivel de secuencia de nucleótido y 93% hasta 97% en el nivel de secuencia de aminoácidos en las regiones a traducirse en proteínas. También, las identidades de secuencia de los genes de perro obtenidos y el gen que codifica el homólogo de caballo fueron 93% en el nivel de secuencia de nucleótido y 97% en el nivel de secuencia de aminoácidos en las regiones para traducirse en proteínas. La secuencia de nucleótido del homólogo de caballo es representada por SEQ ID NO: 17 y la secuencia de aminoácidos de la misma es representada por SEQ ID NO: 18. Además, las identidades de secuencia de los genes que codifican el homólogo humano y el gen que codifica el homólogo de caballo fueron 93% en el nivel de secuencia de nucleótido y 96% en el nivel de secuencia de aminoácidos en las regiones a traducirse en proteínas. También, las identidades de secuencia de los genes de perro obtenidos y los genes que codifican el homólogo de ratón fueron 87% hasta 89% en el nivel de secuencia de nucleótido y 95% hasta 97% en el nivel de secuencia de aminoácidos en las regiones a traducirse en proteínas. Las secuencias de nucleótido de los homólogos de ratón son representadas por SEQ ID NOS: 19, 21, 23, 25, y 27 y las secuencias de aminoácido de las mismas son representadas por SEQ ID NOS: 20, 22, 24, 26, y 28. Además, las identidades de secuencia de los genes que codifican el homólogo humano y los genes que codifican el homólogo de ratón fueron 89% hasta 91% en el nivel de secuencia de nucleótido y fueron 95% hasta 96% en el nivel de secuencia de aminoácidos en las regiones a traducirse en proteínas. También, las identidades de secuencia de los genes de perro obtenidos y el gen que codifica el homólogo de pollo fueron 82% en el nivel de secuencia de nucleótido y 87% en el nivel de secuencia de aminoácidos en las regiones para traducirse en proteínas. La secuencia de nucleótido del homólogo de pollo es representada por SEQ ID NO: 29 y la secuencia de aminoácidos de la misma es representada por SEQ ID NO: 30. Además, las identidades de secuencia de los genes que codifican el homólogo humano y el gen que codifica el homólogo de pollo fueron 81% hasta 82% en el nivel de secuencia de nucleótido y 86% en el nivel de secuencia de aminoácidos en las regiones a traducirse en proteínas. (4) Análisis de expresión de genes en cada tejido La expresión de genes obtenidos por el método anterior se examinó en tejidos normales de perro y humano y varias líneas de células por un método RT-PCR. La reacción de transcripción inversa se realizó como sigue. Específicamente, se extrajo el ARN total de 5 mg de cada tejido o 5 hasta 10 x 106 células de la línea de célula usando un reactivo TRIZOL (Invitrogen) de acuerdo con los protocolos acompañantes. Se sintetizó el cADN con el ARN total usando un Sistema de Síntesis de Primera Hebra Superscript para RT-PCR (Invitrogen) de acuerdo con los protocolos acompañantes. La PCR se realizó como sigue usando cebadores de SEQ ID NOS: 33 y 34 específicos para los genes obtenidos. Específicamente, los reactivos y una solución amortiguadora acompañante se agregaron a 0.25 µ? de la muestra preparada por la reacción de transcripción inversa hasta un volumen total de 25 µ?, de manera que el resultante contiene los cebadores anteriores de 2 µ? cada uno, dNTPs de 0.2 mM cada uno, y 0.65 U de polimerasa ExTaq (Takara Shuzo Co., Ltd.). Se llevó a cabo PCR al repetir un ciclo de 94°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, y 72 °C por 30 segundos 30 veces usando un Thermal Cycler (BIO RAD) . Los cebadores específicos de genes anteriores son capaces de amplificar la regrón en el intervalo desde nucleótidos 206 hasta 632 en la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 5 (gen CAPRIN-1 de perro) y la región en el intervalo desde nucleótidos 698 hasta 1124 en la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO : 1 (gen CAPRIN-1 de humano) . Como un control para comparación, los cebadores específicos de GAPDH de SEQ ID NOS: 35 y 36 también se usaron concurrentemente. Como un resultado, como se muestra en la Fig. 1, se observó fuerte expresión en los testículos entre tejidos de perro normales, aunque se observó expresión en tejidos de cáncer de mama de perro y adenocarcinoma . Por otro lado, también se llevó a cabo la observación de la expresión de los homólogos humanos a partir de los genes obtenidos. Como un resultado, similarmente al caso del gen CAPRIN-1 de perro, puede observarse expresión sólo en testículos entre tejidos normales. Sin embargo, en el caso de células de cáncer, se detectó la expresión en muchos tipos de líneas de células de cáncer, incluyendo líneas de células de cáncer de mama, tumor cerebral, leucemia, cáncer de pulmón, y cáncer de esófago. Se observó expresión particularmente en muchas líneas de células de cáncer de mama. Se confirmó por los resultados que la expresión de CAPRIN-1 no se observa en tejidos normales diferentes a los testículos, aunque CAPRIN-1 se expresó en muchas células de cáncer y particularmente en líneas de células de cáncer de mama.

En la Fig. 1, el número de referencia 1 en cada eje vertical indica los patrones de expresión de genes identificados antes y el número de referencia 2 indica los patrones de expresión del gen GAPDH como un control. (5) Teñido inmunohistoquímico (5) -1 Expresión de CAPRIN-1 en tejidos normales de ratón y perro Se desangraron ratones (Balb/c, hembra) y perros (beagles, hembra) bajo anestesia de éter y anestesia de cetamina/isoflurano . Después de la laparotomía, cada órgano (estómago, hígado, glóbulo ocular, glándula del timo, músculo, médula ósea, útero, intestino delgado, esófago, corazón, riñon, glándula salivar, intestino grueso, glándula mamaria, cerebro, pulmón, piel, glándula adrenal, ovarios, páncreas, bazo, y vejiga) se transfirió a un plato de 10 cm que contiene PBS . Cada órgano se abrió en corte en PBS y luego se sometió a fijado por perfusión durante la noche en solución amortiguadora de fosfato 0.1 M (pH 7.4) que contiene paraformaldehído al 4% (PFA) . La solución de perfusión se descartó, la superficie de tejido de cada órgano se enjuagó con PBS, una solución PBS que contiene sacarosa al 10% se agregó a un tubo centrífugo de 50 mi, cada tejido se agregó al tubo, y luego el tubo se agitó usando un rotor a 4°C por 2 horas. La solución se remplazó por una solución PBS que contiene sacarosa al 20%, y luego se deja reposar a 4°C hasta que el tejido se sumerge. La solución se remplazó por una solución PBS que contiene sacarosa al 30% y luego se deja reposar a 4°C hasta que el tejido se sumerge. El tejido se removió y luego las porciones necesarias se extirparon con un bisturí quirúrgico. A continuación, un compuesto OCT (Tissue Tek) se agregó al tejido de manera que se aplicó a fondo a la superficie del tejido, y luego el tejido se colocó en un criomolde. El criomolde se colocó en hielo seco para congelado rápido. Posteriormente, el tejido se cortó a 10 µ?? hasta 20 µ?t? usando un cryostat (LEICA) . Las rebanadas se secaron al aire en portaobjetos de vidrio usando una secadora de cabello por 30 minutos, para preparar el tejido rebanado montado en un portaobjetos de vidrio. A continuación, cada muestra se colocó en una botella de teñido llenada con PBS-T (solución salina que contiene Tween20 al 0.05%) y luego se sometió a remplazo con PBS-T siendo repetido tres veces cada 5 minutos. El exceso de agua alrededor de las secciones se removió con Kimwipes, y luego las secciones se hicieron en círculo usando un DAKOPEN (DAKO) . Como soluciones de bloqueo, un reactivo de bloqueo Ig de ratón MOM (VECTASTAIN) y una solución PBS-T que contiene FBS al 10% se superpusieron en tejido de ratón y tejido de perro, respectivamente, y luego se deja reposar en una cámara humectante a temperatura ambiente por 1 hora. A continuación, una solución del anticuerpo monoclonal contra CAPRIN-1 (anticuerpo monoclonal #6, preparado en el Ejemplo 3)) de 10 µ /t?1 ajustado con una solución de bloqueo, que reacciona con superficies de célula de cáncer y tiene la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 73 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 77, se colocó y luego se deja reposar durante la noche en una cámara humectante a 4°C. Se realizó 10 minutos de lavado con PBS-T 3 veces, y luego un anticuerpo anti-IgG etiquetado con biotina MOM (VECTASTAIN) diluido 250 veces con la solución de bloqueo se colocó y luego se deja reposar a temperatura ambiente por 1 hora en una cámara humectante. Después se realizó diez (10) minutos de lavado con PBS-T 3 veces, un reactivo ABC avidina-biotina (VECTASTAIN) se colocó, y luego la muestra se dejó reposar en una cámara humectante a temperatura ambiente por 5 minutos. Después de 10 minutos de lavado con PBS-T se realizó 3 veces, una solución de desarrollo de color DAB (DAB 10 mg + H202 al 30% 10 µ?/Tris-HC1 0.05 M (pH 7.6) 50 mi) se colocó, y luego la muestra se dejó reposar en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de enjuagar con agua destilada, un reactivo de hematoxilina (DAKO) se colocó, la muestra se dejó reposar a temperatura ambiente por 1 minuto, y luego se enjuaga con agua destilada. El portaobjetos de vidrio se sumergió en soluciones de etanol al 70%, 80%, 90%, 95%, y luego 100% en tal orden por 1 minuto cada una y luego se deja reposar durante la noche en xileno. El portaobjetos de vidrio se removió, sellado en Medio de Montaje Glycergel (DAKO) , y luego se observa. Como un resultado, la expresión de CAPRIN-1 se observó ligeramente dentro de células de cada tejido de glándula salivaría, riñon, colon, y estómago, pero la expresión de la misma no se observó en superficies celulares. Adicionalmente , no se observó expresión en tejidos de otros órganos. Además, se obtuvieron resultados similares en el caso de usar un anticuerpo monoclonal contra CAPRIN-1 (anticuerpo monoclonal #9) que tiene la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 103 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 107. (5) -2 Expresión de CAPRIN-1 en tejido de cáncer de mama de perro Se prepararon cortes de sección congelados por un método similar al de antes usando 108 especímenes de tejido de cáncer de mama congelado de perros diagnosticados patológicamente como que tiene cáncer de mama maligno, y se realizó teñido inmunohistoquímico " usando el anticuerpo monoclonal #6 preparado en el Ejemplo 3. Como un resultado, la expresión de CAPRIN-1 se observó en 100 de 108 especímenes (92.5%) y CAPRIN-1 se expresó fuertemente en las superficies de células de cáncer con un grado particularmente alto de atipismo. Además, se obtuvieron resultados similares cuando se ha usado el anticuerpo monoclonal #9 preparado en el Ejemplo 3. (5) -3 Expresión de CAPRIN-1 en tejidos de cáncer de mama humanos Se realizó teñido inmunohistoquímico usando 188 especímenes de tejido de cáncer de mama en una matriz de tejido de cáncer de mama humano incrustada en parafina (BIOMAX) . Después de 3 horas de tratamiento de la matriz de tejido del cáncer de mama humano a 60°C, la matriz se colocó en una botella de tinción rellenada con xileno, seguido por remplazo de xileno siendo repetido tres veces cada 5 minutos. A continuación, se . realizó un procedimiento similar con etanol y PBS-T en lugar de xileno. La matriz de tejido de cáncer de mama humano se colocó en una botella de tinción rellenada con solución amortiguadora de citrato 10 mM (pH 6.0) que contiene Tween20 al 0.05%. Después de 5 minutos de tratamiento a 125°C, la matriz se dejó reposar a temperatura ambiente por 40 minutos o más. El exceso de agua alrededor de las secciones se removió con Kimwipes, las secciones se hicieron en círculo con un DAKOPEN, y se agregó Bloque de Peroxidasa (DAKO) gota a gota en cantidades apropiadas. Después de que se deja reposar a temperatura ambiente por 5 minutos, la matriz se colocó en una botella de tinción rellenada con PBS-T, seguido por remplazo PBS-T siendo repetido tres veces cada 5 minutos. Como una solución de bloqueo, una solución PBS-T que contiene FBS al 10% se colocó en la matriz, y luego la matriz se dejó reposar en una cámara humectante a temperatura ambiente por 1 hora. A continuación, una solución del anticuerpo monoclonal #6 (preparado en el Ejemplo 4) de 10 µg/ml ajustado con una solución PBS-T que contiene FBS al 5%, que reacciona con superficies de célula de cáncer y se ha preparado en el Ejemplo 4, se colocó en, y la matriz se dejó reposar durante la noche en una cámara humectante a 4°C. Después de diez (10) minutos de lavado con PBS-T se realizó 3 veces, se agregó Polímero Etiquetado de Peroxidasa Conjugado (DAKO) gota a gota en cantidades apropiadas y luego la matriz se dejó reposar en una cámara humectante a temperatura ambiente por 30 minutos. Después de diez (10) minutos de lavado con PBS-T se realizó 3 veces, una solución de color DAB (DAKO) se colocó y luego se dejó reposar a temperatura ambiente por alrededor de 10 minutos. La solución colorante se descartó, 10 minutos de lavado con PBS-T se realizó 3 veces, y luego se enjuagó con agua destilada. La matriz se sumergió en 70%, 80%, 90%, 95%, y luego 100% de soluciones de etanol en tal orden por 1 minuto cada uno, y luego se deja reposar en xileno durante la noche. El portaobjetos de vidrio se removió, selló en Medio Creciente de Glicergel (DAKO) , y luego se observó. Como un resultado, la expresión fuerte de CAPRIN-1 se observó en 138 de un total de 188 especímenes de tejido de cáncer de mama (73%) . Además, se obtuvieron resultados similares en el caso de usar el anticuerpo monoclonal #2 o #9 preparado en el Ejemplo 3. (5) -4 Expresión de CAPRIN-1 en tumor cerebral maligno humano Se realizó teñido inmunohistoquímico de acuerdo con un método similar a aquel usado en (5) -3 de arriba con 247 especímenes de tejido cerebral de tumor maligno en una matriz de tejido cerebral de tumor maligno humano incrustado en parafina (BIOMAX) , usando el anticuerpo monoclonal #6 preparado en el Ejemplo 3. Como un resultado, la expresión fuerte de CAPRIN-1 se observó en 227 de un total de 247 especímenes de tejido cerebral de tumor maligno (92%) . Además, se obtuvieron resultados similares cuando se ha usado el anticuerpo monoclonal #2 o #9 preparado en el Ejemplo 3. (5) - 5 Expresión de CAPRIN-1 en ganglio linfático con metástatis de cáncer de mama humano Se realizó teñido inmunohistoquímico de acuerdo con un método similar a aquel en (5) -3 de arriba con 150 especímenes de tejido de ganglio linfático con metástasis de cáncer de mama en una matriz de tejido de ganglio linfático con metástasis de cáncer de mama humano incrustado con parafina (BIOMAX) , usando el anticuerpo monoclonal #6 preparado en el Ejemplo 3. Como un resultado, la expresión fuerte de CAPRIN-1 se observó en 136 de un total de 150 especímenes de tejido de ganglio linfático con metástasis de cáncer de mama (90%) . Específicamente, se reveló que CAPRIN-1 se expresó fuertemente también en tejidos de cáncer que tienen metástasis de cáncer de mama. Además, se obtuvieron resultados similares cuando se ha usado el anticuerpo monoclonal #2 o #9 preparado en el Ejemplo 3. (5) -6 Expresión de CAPRIN-1 en varios tejidos de cáncer humano Se realizó teñido inmunohistoquímico de acuerdo con un método similar al de arriba con especímenes en varias matrices de tejido de cáncer humano incrustados con parafina (BIOMAX), usando el anticuerpo monoclonal #6 preparado en el Ejemplo 3. Como un resultado, la expresión fuerte de CAPRIN-1 se observó en cáncer de esófago, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de pulmón, cáncer renal, cáncer de vejiga, y cáncer cervicouterino. Además, se obtuvieron resultados similares cuando se ha usado el anticuerpo monoclonal #2 hasta #9.

Ejemplo 2 Preparación de proteína de antígeno de cáncer humano novedosa (1) Preparación de proteína recombinante Con base en el gen de . SEQ ID NO: 1 obtenido en el Ejemplo 1, una proteína recombinante del gen homólogo humano se preparó por el siguiente método. · PCR se realizó en un volumen total de 50 µ? con 1 µ? de cADN (la expresión de la cual sea confirmado por un método RT-PCR para el cADN usado en la presente de entre tejido de cáncer de mama - o cADN derivados de célula), dos tipos de cebadores (SEQ ID NOS: 38 y 39 que comprenden secuencias de desdoblamiento de la enzima de reacción Sac I y Xho I) de 0.4 µ? cada uno, dNTP 0.2 mM, y 1.25U de polimerasa PrimeSTAR HS (Takara Shuzo Co., Ltd.), preparado al agregar los reactivos y una solución amortiguadora acompañante. Se realizó PCR al repetir un ciclo de 98°C por 10 segundos y 68°C por 2.5 minutos 30 veces usando un Thermal Cycler (BIO RAD) . Los dos cebadores de arriba son capaces de amplificar una región que codifica la secuencia de aminoácido completa de SEQ ID NO: 2. Después de PCR, el ADN de esta manera amplificado se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1%, y luego un fragmento de ADN de alrededor de 2.1 kbp se purificó usando un Kit de Extracción de Gel QIAquick (QIAGEN) .

El fragmento de ADN de esta manera purificado se ligó a un vector de clonación PCR de punta roma (Invitrogen) . Después de la transformación de Escherichia coli con esto, se recolectó el plásmido. Se verificó al procesar por secuencia que el fragmento de gen de esta manera amplificado tiene la secuencia de interés. El plásmido que tiene una secuencia igualada con la secuencia de interés se trató con enzimas de restricción Sac I y Xho I y luego se purificó con un Kit de Extracción de Gel QIAquick. La secuencia de gen de interés se insertó en un vector de expresión Escherichia coli pET30a (Novagen) tratado con enzimas de restricción Sac I y Xho I. Una proteína recombinante fusionada His-tag puede producirse usando el vector. El plásmido se transformó en Escherichia coli para expresión recombinante, BL21(DE3), y luego se indujo expresión con IPTG 1 mM, de manera que la proteína de interés se expresó en Escherichia coli. (2) Purificación de proteína recombinante La Escherichia coli recombinante obtenida arriba que expresa el gen de SEQ ID NO: 1 se cultivó en medio LB que contiene 30 ug/ml de canamicina a 37°C hasta absorbancia en 600 nm que alcanza alrededor de 0.7, se agregó isopropil - -D-l-tiogalactopiranosida a una concentración final de 1 mM, y luego las células se cultivaron a 37°C por 4 horas. Posteriormente, la centrifugación se realizó en 4800 rpm durante 10 minutos y luego las células se recolectaron. El peletizado celular resultante se suspendió en solución amortiguadora salina de fosfato y centrifugó en 4800 rpm durante 10 minutos, y luego se lavaron las células.

Las células se suspendieron en solución amortiguadora salina y luego interrumpieron por ultrasonicación en hielo.

El lisado resultante de la Escherichia coli ultrasonicado se sometió a centrifugación en 6000 rpm durante 20 minutos, y luego el sobrenadante resultante se consideró como una fracción soluble y el precipitado se consideró como una fracción insoluble.

La fracción soluble se agregó a una columna quelada de níquel ajustada de acuerdo con un método convencional (portador: Chelating Sepharose™ Fast Flow (GE Healthcare) ; capacidad de la columna de 5 mi; y solución amortiguadora de equilibrio: solución amortiguadora de clorhidrato 50 mM (pH 8.0)). Las fracciones no adsorbidas se lavaron completamente con solución amortiguadora de clorhidrato 50 mM (pH 8.0) en una cantidad 10 veces la capacidad de columna y solución amortiguadora de fosfato 20 mM (pH 8.0) que contiene imidazol 20 mM. Inmediatamente después del lavado, 6 perlas se eluyeron con solución amortiguadora de fosfato 20 mM (pH 8.0) que contiene imidazol 100 mM. La elución de la proteína de interés se confirmó por tinción Coomassie en la fracción de elución con solución amortiguadora de fosfato 20 mM (pH 8.0) que contiene imidazol 100 mM, y luego la fracción de elución se agregó a una columna de intercambio de aniones fuerte (portador: Q Sepharose™ Fast Flow ' (GE HealthCare) ; capacidad de columna de 5 mi; y solución amortiguadora de fosfato 20 mM (pH 8.0) como una solución amortiguadora de equilibrio). Una fracción no adsorbida se lavó completamente con solución amortiguadora de fosfato 20 mM (pH 7.0) en una cantidad 10 veces la capacidad de columna y solución amortiguadora de fosfato 20 mM (pH 7.0) que contiene cloruro de sodio 200 mM. Inmediatamente después del lavado, 5 perlas se eluyeron con solución amortiguadora de fosfato '20 mM (pH 7.0) que contiene cloruro de sodio 400 mM, y de esta manera se obtuvo la fracción purificada de la proteína que tiene la secuencia de aminoácido representada por SEQ ID NO : 2. 200 µ? de cada muestra purificada obtenida por el método anterior se ofreció en 1 mi de solución amortiguadora de reacción (Tris-Hcl 20 mM, NaCl 50 mM, CaCl2' 2 mM pH 7.4), seguido por adición de 2 µ? de enterocinasa (Novagen) . Después de que, lo resultante se dejó reposar durante la noche a temperatura ambiente por reacción de manera que His-tag se desdobló completamente, y luego la purificación se realizó usando un Kit de Captura de Desdoblamiento de Enterocinasa (Novagen) de acuerdo con los protocolos acompañantes. A continuación, 1.2 mi de la muestra purificada obtenida por el método anterior se sometió al remplazo de solución amortiguadora con solución amortiguadora de fosfato fisiológica (Nissui Pharmaceutical Co . , Ltd.) usando una ultrafiltración NANOSEP 10K OMEGA (PALL) . Además, se realizó filtración estéril usando HT Tuffryn Acrodisc 0.22 µ?? (PALL) y luego lo resultante se usó para el siguiente experimento.

Ejemplo 3 Preparación de anticuerpo monoclonal de pollo contra CAPRIN-1 100 ]ig de la proteína de antígeno (CAPRIN-1 humano) mostrado por SEQ ID. NO: 2 preparado en el Ejemplo 2 se mezcló con una cantidad equivalente de adyuvante MPL+TDM (Sigma) , y luego esto se usó como una solución de antígeno por un ratón. La solución de antígeno se administró intraperitonealmente a ratones Balb/c de 6 semanas de edad (Japan SLC Inc.), y luego la administración se realizó 3 veces cada semana (24 veces de administración en total) , y de esta manera se completó la inmunización. Cada bazo se eliminó en el día 4 después de la inmunización final, e intercaló entre dos portaobjetos de vidrio esterilizados y luego aplastó. Lo resultante se lavó con PBS ( - ) (Nissui) y luego centrifugó en 1500 rpm durante 10 minutos para remover el sobrenadante. Este procedimiento se repitió 3 veces, de manera que se obtuvieron esplenocitos . Las células de mieloma de ratón SP2/0 (adquirido de ATCC) y esplenocitos de esta manera obtenidos se mezclaron en una relación de 10:1. Una solución PEG preparada al mezclar 200 µ? de medio RPMI1640 que contiene FBS al 10% calentado a 37°C y 800 µ? de PEG1500 (Boehringer) se agregó a la mezcla, se deja reposar durante 5 minutos para fusión celular, y luego se sometió a centrifugación en 1700 rpm durante 5 minutos. Después de la eliminación del sobrenadante, las células se suspendieron en 150 mi de medio RPMI1640 que contiene FBS al 15%, complementado con una solución HAT (Gibco) (equivalente al 2%) (medio selectivo HAT) , y luego la suspensión celular se colocó en treinta placas de 96 pozos (Nunc) a 100 µ? por pozo. Las células se cultivaron bajo condiciones de 7 días, a 37°C, bajo C02 al 5%, de manera que se obtuvieron el hibridoma preparado por fusión de esplenocitos y las células de mieloma de pollo.

Los hibridomas se seleccionaron usando como un marcador la afinidad de enlace del anticuerpo producido por los hibridomas preparados para la proteína CAPRIN-1. La solución de proteína CAPRIN-1 (1 µ9/p?1) preparada en el Ejemplo 1 se agregó a una placa de 96 pozos a 100 µ? por pozo y luego se deja reposar a 4°C por 18 horas. Cada pozo se lavó 3 veces con PBS-T, se agregó 400 µ? de una solución de Albúmina de Suero de Bovino al 0.5% (BSA) (Sigma) por pozo, y luego la placa se dejó reposar a temperatura ambiente por 3 horas. La solución se removió, y luego los pozos se lavaron tres veces con 400 µ? de PBS-T por pozo. El sobrenadante de cultivo de los hibridomas antes obtenidos se agregó a 100 µ? por pozo, y luego se deja reposar a temperatura ambiente por 2 horas. Después de lavar cada pozo tres veces con PBS-T, se agregó el anticuerpo IgG anti-ratón etiquetado HRP (H+L) (Invitrogen) diluido 5000 veces con PBS a 100 µ? por pozo y el resultante luego se dejó reposar a temperatura ambiente por 1 hora. Después de lavar los pozos tres veces con PBS-T, 100 µ? de una solución de sustrato TMB (Thermo) se agregó por pozo y luego se deja reposar por 15 hasta 30 minutos para reacción de coloración. Después del desarrollo de color, se agregó 100 µ? de ácido sulfúrico 1N por pozo para detener la reacción, y luego las absorbancias a 450 nm y 595 nm se midieron usando un espectrómetro de absorción. Como un resultado, varios hibridomas que producen anticuerpos con valores de absorbencia altos se seleccionaron.

Los hibridomas de esta manera seleccionados se agregaron a una placa de 96 pozos a 0.5 células por pozo y luego se cultivan. Después de 1 semana, los hibridomas que han formado colonias sencillas en los pozos se observaron. Estas células en los pozos se cultivaron adicionalmente , y luego los hibridomas se seleccionaron usando como un marcador la afinidad de enlace de anticuerpos producidos por los hibridomas clonados a la proteína CAPRIN-1. La solución de proteína CAPRIN-1 (1 µg/ml) preparada en el Ejemplo 1 se agregó a una placa de 96 pozos a 100 µ? por pozo, y luego se deja reposar a 4°C por 18 horas. Cada pozo se lavó con PBS-T tres veces, 400 µ? de una solución de BSA al 0.5% se agregó por pozo, y luego el resultante se dejó reposar a temperatura ambiente por 3 horas. La solución se removió, y luego los pozos se lavaron tres veces con 400 µ? de PBS-T por pozo. Se agregó 100 µ? de cada sobrenadante de cultivo de los hibridomas antes obtenidos por pozo, y luego la placa se dejó reposar a temperatura ambiente por 2 horas. Después de lavar cada pozo tres veces con PBS-T, se agregó 100 µ? de un anticuerpo IgG anti-ratón etiquetado HRP (H+L) (Invitrogen) diluido 5000 veces con PBS por pozo y luego se deja reposar a temperatura ambiente por 1 hora. Después de lavar los pozos tres veces con PBS-T, 100, µ? de una solución de sustrato TMB (Thermo) se agregó por pozo, y luego se deja reposar por 15 hasta 30 minutos para reacción de coloración. Después del desarrollo de color, se agregó 100 µ? de ácido sulfúrico 1N por pozo para detener la reacción y luego las absorbancias a 450 nm y 595 nm se midieron usando un espectrómetro de absorción. Como un resultado, se obtuvieron 150 líneas de células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales que reaccionan a la proteína CAPRIN-1.

A continuación, de aquellos anticuerpos monoclonales, se seleccionaron los anticuerpos que . reaccionan a las superficies celulares de células de cáncer de mama que expresan CAPRIN-1. Específicamente, células 106 de la línea de célula de cáncer de mama humana MDA-MB-231V se sometieron a centrifugación con un tubo microcentrífugo de 1.5 mi, y 100 µ? del sobrenadante de cultivo de cada uno de los hibridomas anteriores se agregó al tubo, y luego el tubo se dejó reposar en hielo por 1 hora. Después de lavar con PBS, un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra etiquetado con FITC (Invitrogen) diluido 50 veces con PBS que contiene FBS al 0.1% se agregó, y luego el resultante se dejó reposar en hielo por 1 hora. Después de lavar con PBS, se midió la intensidad de fluorescencia usando un calibre FACS (Becton, Dickinson y Company) . Mientras tanto, los procedimientos similares a los de arriba se realizaron usando el suero (de un ratón Balb/c de 6 semanas de edad no tratado con el anticuerpos) diluido 500 veces con medio para cultivar hibridomas, de manera que se preparó una muestra de control. Como un resultado, 11 anticuerpos monoclonales (#1 hasta #11) que han exhibido una intensidad de fluorescencia más fuerte que la del control, y esto es, que reacciona con la superficie celular de cáncer de células de mama, se seleccionaron.

Ejemplo 4 Caracterización de anticuerpos seleccionados (1) Clonación de gen de región variable de anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN- 1 Se extrajo el mAR de cada línea de célula de hibridoma que producen cada uno de los 11 anticuerpos monoclonales de ratón seleccionados en el Ejemplo 3. Se obtuvieron los genes de las regiones variables de cadena pesada (VH) y variables de cadena ligera (VL) de todos los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN- 1 por un método RT-PCR que usa cebadores específicos para la secuencia derivada de FR1 de ratón y la secuencia derivada de FR4 de ratón. Para la determinación de secuencia, los genes se clonaron en un vector pCR2.1 (Invitrogen) . Adicionalmente , mAR se extrajo de dos líneas de células de hibridoraa derivadas de ratón que producen anticuerpos monoclonales reactivos con la superficie de CAPRIN-l-que expresa cáncer de células de mama. Los genes de la región variables de cadena pesada (VH) y región variable de cadena ligera (VL) de cada anticuerpo se obtuvieron por un método RT-PCR usando cebadores específicos a la secuencia derivada FR1 de ratón y la secuencia derivada FR4 de ratón. Para determinación de secuencia, estos genes se clonaron en un vector pCR2.1 (Invitrogen) . (1) -1 RT-PCR Después de la extracción del AR total a partir de 106 células de cada línea de célula de hibridoma usando un Kit de Aislado de ARN de Alta Pureza (Roche) , se sintetizó el cADN usando un Kit de Síntesis de cADN de Ia hebra PrimeScriptII (Takara) . Estos procedimientos se realizaron de acuerdo con protocolos enlazados a cada kit.

El gen de la región variable de cadena pesada del anticuerpo de ratón y el gen de la región variable de cadena ligera de anticuerpo de ratón se amplificaron por un método PCR de acuerdo con un método convencional usando el cADN así sintetizado como una plantilla y Polimerasa KOD-Plus-ADN (TOYOBO) .

Para obtener los genes de las regiones VH y VL del anticuerpo de ratón, un cebador (SEQ ID NO: 130) específico para la secuencia FR1 de cadena pesada de ratón, un cebador (SEQ ID NO: 131) específico para la secuencia FR4 de cadena pesada de ratón, un cebador (SEQ ID NO: 132) específico para la secuencia FR1 de cadena ligera de ratón, un cebador (SEQ ID NO: 133) específico para la secuencia FR4 de cadena ligera de ratón se usaron.

Los productos PCR de esta manera obtenidos se sometieron cada uno a electroforesis en gel de agarosa, y se extirparon bandas de ADN de la región VH y la región VL. Se purificaron fragmentos de ADN usando un kit de purificación QIAquick Gel (QIAGEN) de acuerdo con los protocolos acompañantes. El ADN purificado se clonó en un vector pCR2.1 usando un kit de clonación TA (Invitrogen) . El vector ligado se transformó en células competentes DH5 (TOYOBO) de acuerdo con un método convencional. Se cultivaron 10 clones de cada transformante durante la noche en medio (100 µg/ml ampicilina) a 37°C, y luego el ADN plásmido se purificó usando un kit Qiaspin Miniprep (QIAGEN) . (1) -2 Determinación de secuencia Las secuencias de genes de la región VH y la región VL en cada plásmido obtenido antes se analizaron con un cebador delantero M13 (SEQ ID NO: 134) y un cebador inverso M13 (SEQ ID NO: 135) en un procesador de secuencia fluorescente (procesador de secuencia de ADN 3130XL; ABI), usando un kit de ciclo de procesamiento en secuencia Big Dye Terminator Ver3.1 (ABI) de acuerdo con los protocolos acompañantes. Como un resultado, se determinó cada secuencia de gen. Las secuencias fueron idénticas entre los 10 clones.

Las secuencias de gen de las regiones variables de cadena pesada de los anticuerpos monoclonales de esta manera obtenidos son cada uno representados por SEQ ID NOS: 48, 78, 88, 98, 108, 118, y 128, y las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada son cada uno representada por SEQ ID NOS: 43, 73, 83, 93, 103, 113, y 123. Las secuencias del gen de las regiones variables de cadena ligera de los mismos anticuerpos monoclonales son cada una representadas por SEQ ID NOS: 49, 54, 59, 64, 69, 79, 89, 99, 109, 119, y 129, y las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera son cada una representadas por SEQ ID NOS: 47, 53, 58, 63, 68, 77, 87, 97, 107, 117, y 127.

Específicamente, el anticuerpo monoclonal #1 comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 47, #2 comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 53, #3 comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 58, #4 comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 63, #5 comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 68, #6 comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 73 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 77, #7 comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 83 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 87, #8 comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 93 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 97, #9 comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 103 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 107, #10 comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 113 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 117, y #11 comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 123 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 127. (2) Expresión de CAPRIN-1 en la superficie de varias células de cáncer usando anticuerpos anti-CAPRIN-1 #2 y #9 A continuación, 7 líneas de células de cáncer de mama (MDA-MB-157, T47D, MRK-nu-1, MDA-MB-231V, BT20, SK-BR-3, y DA-MB-231T) para las cuales se ha observado la expresión del gen CAPRIN-1, y las otras 3 líneas de células de cáncer de mama (MDA-MB-231C, MCF-7, y ZR75-1) , 5 líneas de células de glioma (T98G, SNB19, U251, U87MG, y U373), 4 líneas de células de cáncer renal (Caki-1, Caki-2, A498, y ACHN) , 2 líneas de células de cáncer gástrico (MNK28 y MK 45) , 5 líneas de células de cáncer colorectal (HT29, LoVo, Caco2 , S 480, y HCT116) , 3 líneas de células de cáncer de pulmón (A549, QG56, y PC8) , 4 líneas de células de leucemia (AML5 , Namalwa, BDCM, RPI1788) , una (1) línea de célula de linfoma (Ramos) , una (1) línea de célula de cáncer cervicouterino (SW756) , una (1) línea de célula de cáncer de vejiga (T24), una (1) línea de célula de cáncer de esófago (KYSE180) , y una línea de célula de linfoma (Ramos) se examinaron para expresión de proteína CAPRIN-1 en las superficies celulares usando los sobrenadantes de cultivo hibridomas que producen #2 y #9 obtenidos en elo Ejemplo 3. Las células 106 de cada línea de célula se centrifugaron en un tubo microcentrífugo 1.5 mi. Cada sobrenadante de cultivo de célula (100 µ?) de hibridomas que producen #2 y #9 obtenidos en el Ejemplo 3 se agregó y luego se deja reposar en hielo por 1 hora. Después de lavar con PBS, un anticuerpo IgG anti humano de cabra (H+L) etiquetado con FITC (SouthernBiotech) diluido 500 veces con PBS que contiene FBS al 0.1% y un anticuerpo IgG antiratón etiquetado FITC (H+L) (Invitrogen) se agregó y luego el resultante se dejó reposar en hielo por 1 hora. Después de lavar con PBS, se midió la intensidad de fluorescencia usando un FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company) . Mientras tanto, un procedimiento similar al de arriba se realizó usando un medio para cultivar hibridomas, y se usó como un control negativo. Como un resultado, las células a las cuales los anticuerpos #2 y #9 se han agregado exhiben intensidad de fluorescencia más fuertes por 20% o más que el de control. Específicamente, cuando se usó el anticuerpo #1, la intensidad de fluorescencia se aumentó hasta 217% en el caso de MDA-MB-157, 326% en el caso de T47D, 125% en el caso de MRK-nu-1, 527% en el caso de MDA-MB-231V, 200% en el caso de BT20, y 327% en el caso de MDA-MB-231T . También, cuando se usó el anticuerpo #2, la intensidad de fluorescencia se aumentó hasta niveles así equivalentes a los niveles cuando se usó el anticuerpo #1. Se reveló por estos resultados que la proteína CAPRIN-1 se expresó en las superficies de membrana celular de las diversas anteriores líneas de células de cáncer humano. El porcentaje de aumento en la intensidad de fluorescencia anterior se expresó como un porcentaje de incremento en la intensidad de fluorescencia media (nivel MFI) en cada tipo de célula y se calcula por la siguiente fórmula .

Porcentaje de incremento en la intensidad de fluorescencia media (porcentaje de aumento en la intensidad de fluorescencia) (%) = ( (nivel MFI en las células que han reaccionado con anticuerpo CAPRIN-1 anti-humano) - (nivel MFI del control)) / (nivel MFI de control) x 100. (3) Efecto antitumor de anticuerpos anti-CAPRIN-1 en células de cáncer (actividad ADCC) Los anticuerpos monoclonales anti -CAPRIN- 1 #1 hasta #11 seleccionados arriba se evaluaron por sus actividades citotóxicas contra células de cáncer (actividad ADCC) . Los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales #1 hasta #11 cada uno se cultivaron usando medio de hibrido a SFM (Invitrogen) . El sobrenadante de esta manera obtenido se purificó usando Hitrap ProteinA Sepharose FF (GE HealthCare) , reemplazado con PBS(-), y luego se filtró a través de filtro 0.22 µ?? (Millipore) . Los filtrados obtenidos se usaron como anticuerpos para ensayo. La línea de célula de cáncer de mama humana MDA-MB-157 (106 células) se recolectó en un tubo centrífugo de 50-ml, al cual 100 µCi cromo (Cr) -51 luego se agregó, e incubó a 37 °C durante 2 horas. Posteriormente, las células se lavaron 3 veces con medio RPMI1640 que contiene FBS al 10%, y luego se colocó en cada pozo de una placa de fondo V de 96 pozos en 103 células por pozo. Las células de esta manera obtenidas se usaron como célula objetiva. Los anticuerpos purificados de arriba (1 µg cada uno) se agregaron a las células. De forma separada, los linfocitos de ratón separados del bazo de ratón se agregaron además (2 x 10s células) y luego se cultivaron bajo condiciones de 37°C y C02 al 5% durante 4 horas. Después del cultivo, se midió la cantidad de cromo (Cr) -51 liberada de células de tumor citotóxicamente dañadas en un sobrenadante de cultivo, de manera que se calculó la actividad ADCC de cada anticuerpo anti -CAPRIN- 1 contra células de cáncer. Como un resultado, todos los anticuerpos monoclonales #1 hasta #11 exhiben 20% o más actividad ADCC contra MDA-MB-157. Específicamente, por ejemplo #1 exhibe 22.1% de actividad citotóxica, #2 exhibe 29.1% de actividad citotóxica, #6 exhibe 30.2% de actividad citotóxica, y #9 muestra 32.4% de actividad citotóxica (ver Fig. 1) . Por otro lado, los procedimientos similares se realizaron usando los anticuerpos monoclonales (que se prepararon en el Ejemplo 2) reactivos con la proteína CAPRIN-1 por sí mismo, pero no reactivo con la superficie de células de cáncer, no se observó actividad citotóxica (ver Fig. 1) . De los resultados de arriba, se demostró que los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 de esta manera obtenidos (#1 hasta #11) citotóxicamente dañan células de cáncer que expresan CAPRIN- 1 por la actividad ADCC. Similarmente , los anticuerpos anti-CAPRIN-1 se examinaron para actividad ADCC contra otras líneas de células de cáncer humanas incluyendo líneas células de glioma (T98G y U373) , líneas de células de cáncer pulmonar (A549 y QG56) , líneas de células de cáncer renal (Caki-1 y ACHN) , una línea células de cáncer cervicouterino (S 756) , una línea de célula de cáncer de vejiga (T24), una línea de célula de cáncer esofágico (KYSE180) , líneas de células de cáncer gástrico (MNK28 y MNK45) , una línea de célula de cáncer colorectal (SW480) , una línea de célula de leucemia (AML5) , y una línea de célula de linfoma (Ramos) . Como un resultado, todos los anticuerpos monoclonales #1 hasta #11 exhiben actividades ADCC superiores que aquellos de controles de isotipo. Específicamente, por ejemplo, #9 exhibe 12% o más (1.3% en el caso del control de isotipo) actividad contra T98G, #9 exhibe 16% o más (3% en el caso de control de isotipo) contra U373, #9 exhibe 24% o más (2.6% en el caso de control de isotipo) actividad contra A549, #9 exhibe 20% o más (0.2% en el caso de control de isotipo) actividad contra QG56, #9 exhibe 23% o más (3.0% en el caso de control de isotipo) contra Caki-1, #9 exhibe 14% o más (1.5% en el caso de control de isotipo) contra ACHN, #9 exhibe 16% o más actividad (2.5% en el caso de control de isotipo) contra SW756, #9 exhibe 18% o más actividad (2.1% en el caso de control de isotipo) contra T24, #9 exhibe 22% o más actividad (3.0% en el caso de control de isotipo) contra KYSE180, #9 exhibe 15% o más actividad (1.7% en el caso de control de isotipo) contra MNK28 , #9 exhibe 10% o más actividad (2.3% en el caso de control de isotipo) contra MNK45, #9 exhibe 17% o más actividad (1.3% en el caso de control de isotipo) contra S 480, #9 exhibe 10% o más actividad (3.0% en el caso de control de isotipo) contra AML5, y #9 exhibe 10% o más actividad (4.1% en el caso de control de isotipo) contra Ramos. Se demostró por los resultados de arriba que los anticuerpos anti -CAPRIN- 1 obtenidos (#1 hasta #11) citotóxicamente dañan varias células de cáncer humanas que expresan CAPRIN-1. (4) efecto antitumor de anticuerpos anti-CAPRIN-1 en células de cáncer (actividad CDC) Los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 seleccionados arriba #1 hasta #11 se evaluaron para su citotoxicidad celular contra células de cáncer (actividad CDC) . La sangre colectada de un conejo se agregó a un tubo Eppendorf, se deja reposar a temperatura ambiente por 60 minutos, y luego se sometió a 5 minutos de centrifugación en 3000 rpm. De esta manera, el suero para medición de actividad CDC se preparó. Se colectaron 105 células de células de cáncer de mama MDA-MB-231V humanas en un tubo centrífugo de 50 mi, 100 µCi de cromo 51 se agregó, y luego se realizó la incubación a 37°C por 2 horas. Las células resultantes se lavaron tres veces con medio RPMI que contiene FBS al 10%, se suspendieron en medio RPMI que contiene el suero de conejo antes preparado 50%, y luego se agrega a una placa de fondo en V de 96 pozos a 103 células por pozo. Cada uno de los anticuerpos monoclonales #1 a #13 obtenidos en el Ejemplo 3 se agregaron (1 µg cada uno) a las células, que entonces se cultivaron bajo condiciones de 37°C y 5% C02 por 4 horas. Después de cultivar, la cantidad de cromo 51 liberado de las células de tumor dañadas en un sobrenadante de cultivo se midió, y luego la actividad CDC de cada anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 contra MDA- B-231V en un sobrenadante de hibridoma se calculó. Como resultado, todos los anticuerpos monoclonales #1 a #11 exhibieron 30% o más actividad CDC. Por otra parte, no se observó actividad citotóxica cuando se realizaron los procedimientos similares usando los anticuerpos monoclonales (los cuales se prepararon en el Ejemplo 2) reactivos con la proteína CAPRIN-1 en si . misma, pero no reactivos con la superficie de células de cáncer. Por lo tanto, se reveló que los anticuerpos monoclonales anti -CAPRIN- 1 (#1 a #11) pueden debilitar citotóxicamente a las células de tumor que expresan CAPRIN- 1, como también se observa en los resultados de la actividad CDC.

Ejemplo 5 Identificación de un péptido en una proteína CAPRIN- 1 para los que los anticuerpos anti-CAPRIN- 1 son reactivos con la superficie del enlace de células de cáncer Se identificó una secuencia parcial de una proteína CAPRIN- 1 para ser reconocida por los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 #1 a #11 arriba obtenidos reactivos con la superficie de células de cáncer usando un anticuerpo.

Primero, se agregó DTT (Fluka) a 100 µ? de una solución de proteína CAPRIN-1 recombinante preparada disolviendo la proteína a una concentración de 1 µg/µl en PBS, de manera que la concentración final fue de 10 mM, seguido por 5 minutos de reacción en 95°C. Los enlaces de disulfuro dentro de la proteína CAP IN-1 se redujeron, se agregó yodocetamida ( ako Puré Chemical Industries, Ltd.) en una concentración final de 20 mM, y entonces se realizó la reacción de alquilación de un grupo tiol en 37°C bajo condiciones de protección contra la luz por 30 minutos. Los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 #1 a #11 se agregaron (50 µg cada uno) a 40 µg de la proteína CAPRIN-1 de esta manera reducida y alquilada. Cada solución se diluyó en un volumen de 1 mi con solución amortiguadora de fosfato 20 mM (pH 7.0), seguido por la reacción en 4°C durante toda la noche mientras se realizaba la agitación y la mezcla de la solución.

A continuación, se agregó tripsina (Promega) a la concentración final de 0.2 µg. Después de la reacción en 37°C por 1 hora, 2 horas, 4 horas, o 12 horas, cada resultante se bloqueó con PBS conteniendo 1% BSA (Sigma) con anticipación, y entonces se mezcló con proteína de perlas de vidrio A (GE) , que previamente se lavaron con PBS, y 1 mM de carbonato de calcio en solución amortiguadora NP-40 (20 mM solución amortiguadora de fosfato (pH 7.4), 5 mM EDTA, 150 mM NaCl , 1% NP-40), seguido por 30 minutos de reacción para cada solución .

La mezcla de reacción se lavó con solución amortiguadora de carbonato de amonio 25mM (pH 8.0), y después el complejo de anticuerpo de antígeno se eluyó usando 100 µ? de 0.1% ácido fórmico. La elusión fue sujeta a análisis LC-MS usando Cebador Q-TOF (Waters-MicroMass) . El análisis LC-MS se condujo de acuerdo con los protocolos adjuntos al aparato.

Como resultado, el polipéptido de SEQ ID NO: 37 se identificó como una secuencia parcial de CAPRIN-1, que fue reconocida por cualquiera de los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 #1 a #11.

Ejemplo 6 Efecto de agentes antitumor sobre expresión de CAPRIN-1 sobre la superficie de células de cáncer (1) Cálculo de 50% de concentración inhibitoria de agentes antitumor contra células de cáncer Para evaluar el efecto de los agentes antitumor sobre la expresión de CAPRIN-1 sobre la superficie de una célula de cáncer, el 50% de concentración inhibitoria de cada agente antitumor se calculó usando la célula de cáncer MCF-7. Al usar la línea de célula de cáncer de mama MCF-7, se examinaron 50% de concentraciones inhibitorias de 4 tipos de agentes antitumor que actualmente se usan como remedios para el cáncer de mama (es decir, ciclofosfamida : "Endoxan" (marca registrada, Shionogi & Co. , Ltd.), paclitaxel: "Taxol" (marca registrada, Bristol-Myers), docetaxel : "Taxotere" (marca registrada, Sanofi-aventis K.K.), vinorelbina: "Navelbine" (marca registrada, Kyowa Hakko Kirin Co . , Ltd.)) . La línea de célula se prepara para 1 x 105 células/ml y después se cultivaron sobre una placa de 6 pozos bajo condiciones de 37°C y 5% C02 por un día. Después, la célula se trató con cada agente antitumor en concentraciones finales de 0.001 µ?, 0.01 µ?, 0.1 µ?, 1.0 µ?, y 10 µ?, seguido por 2 días de cultivo bajo condiciones de 37°C y 5% C02. Después de la remoción del medio de cultivo, la célula se lavó dos veces con PBS ( - ) , a la que después se agregó 0.25% Tripsina-EDTA para separar la célula de la placa. De esta manera la célula separada fue suspendida con PBS ( - ) a un volumen de 100 µ? , a la que se le agregó 10 µ? de solución de reserva de azul tripano al 0.4%, y la mezcla se midió para contar las células vivas usando un hemocitómetro . Se calculó la tasa de células vivas en caso de que la célula no fuera tratada con cada agente antitumor (es decir, un quimioterapéutico) , en donde el número de células vivas en caso de que la célula no fuera tratada con agente antitumor se designó en 100%. 50% de la concentración inhibitoria se estimó aproximadamente con base en los valores obtenidos, y cada agente antitumor se preparó para tener una concentración alrededor de 50% de la concentración inhibitoria determinada, y por lo tanto además se realizaron procedimientos similares para calcular 50% de concentración inhibitoria más espec í f i ca .

Como un ejemplo, los resultados para el examen de ciclofosfamida (un agente antitumor) se describen a continuación. La línea de célula MCF-7 se prepara para 1 x 105 células/mL, y después se cultivó sobre una placa de 6 pozos bajo condiciones de 37°C y C02 al 5% para un día. Después, la célula se trató con ciclofosfamida en concentraciones finales de 1 x 10"1 µ?, 5 x 10~2 µ?, 2 x 10~2 µ? , y 1 x 10"2 µ? , seguido por 2 días de cultivo bajo condiciones de 37°C y C02 5%. Después de la remoción del medio de cultivo, la línea de célula se lavó con PBS ( - ) dos veces, a la que se le agregó Trips ina - EDTA al 0.25% para separar la célula de la placa. La célula separada fue suspendida en PBS(-) a un volumen de 100 µ? , a la que 10 µ? de solución de reserva azul tripatano al 0.4% además se le agregó. La mezcla se midió para contar las células vivas usando un hemoc i tometro . Como resultado, el 50% de concentración inhibitoria se determinó para ser 3 x 10~2 µ?. Los valores IC50 de los agentes antitumor respectivos en cada tipo de células de cáncer se calcularon usando los mismos procedimientos. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1 50% de concentración inhibitoria de agentes antitumor contra MCF-7 (2) Efecto de agentes antitumor sobre expression de CAPRIN-1 bajo tratamiento de células de cáncer con ellos La línea de célula de cáncer MCF-7 se trató con cada agente antitumor en 50% de una concentración inhibitoria que se calculó en (1) de arriba, y se examinó el comportamiento de expresión de una proteína CAPRINrl sobre la superficie celular .

Se examinó el comportamiento de expresión de la proteína CAPRIN-1 sobre la superficie de la célula de cáncer de mama humana MCF-7 arriba tratada. La célula se prepara para una concentración de 1 x 105células/ml , y después se cultivaron sobre una placa de 6 pozos bajo condiciones de 37°C y C02 al 5% por 1 día. Luego, la célula se trató con agentes antitumor en 50% concentración inhibitoria calculada en (1) arriba, o con PBS(-) como un control, y después se cultivó bajo las condiciones de 37°C y CO2 al 5% por 2 días. Después de la remoción del medio de cultivo, la célula se lavó con PBS(-) dos veces y después se separó de la placa usando un raspador. Después de eso, la célula se centrifugó con un tubo microcentrífugo de 1.5 mi. Un (1) µg (5 µ?) del anticuerpo monoclonal #9 anti-CAPRIN-l de ratón se agregó a la célula separada, que después fue suspendida en 95 µ? de PBS que contiene suero de ternera fetal al 0.1% y después se dejó en reposo sobre hielo por 1 hora. Después de lavar con PBS, la célula fue suspendida en PBS que contiene 5 µ? de un anticuerpo IgG anti conejo de cabra etiquetado con FITC (SantaCruz) y 95 µ? de suero bovino fetal al 0.1% (FBS) y después se dejó en reposo sobre hielo por 1 hora. Después de lavar con PBS, se midió la intensidad de fluorescencia usando un calibre FACS (Becton, Dickinson and Company) . Mientras tanto, se realizó el mismo procedimiento como el de arriba usando un anticuerpo de control en lugar del anticuerpo monoclonal anti -CAPRIN- 1 de ratones, y se usó como un control. Como resultado, no se observa una diferencia importante en la intensidad de fluorescencia a pesar del tratamiento con un agente antitumor. Específicamente, la intensidad de fluorescencia obtenida en el caso de agregar anticuerpo anti-CAPRIN-1 a MCF-7 no tratada con cualquier agente antitumor indicó 32% de mejoría más alta cuando se comparó con ese en caso de agregar el anticuerpo de control. Por otra parte, cuando MCF-7 se trató con el agente antitumor usando el mismo procedimiento, se observó el 32% de mejoría en la intensidad de fluorescencia, y de esta manera este resultado fue el mismo como ese en el caso de no tratamiento con el agente antitumor. Por medio de estos resultados se reveló que el tratamiento de células de cáncer de mama con un agente antitumor no tiene efecto sobre la expresión de CAPRIN-l sobre la superficie de las células de cáncer de mama. Aquí, el porcentaje de mejoría en la intensidad de fluorescencia fue representado por el porcentaje de incremento en la intensidad media de fluorescencia (nivel MFI) en cada célula y se calculó por medio de la siguiente fórmula .

El porcentaje de incremento en la intensidad media de fluorescencia (porcentaje de mejoría en la intensidad de fluorescencia) (%) = ( (MFI nivel de células habiendo reaccionado con anticuerpo CAPRIN-1 antihumano - (nivel MFI de control)) ÷ (nivel MFI de control) x 100.

Ejemplo 7 Terapia de combinación In vivo usando anticuerpo anti-CAPRIN-1 y agente antitumor (1) Con el uso de ratones que portan el tumor en el que la línea de célula de cáncer de mama humana MCF-7 que expresa CAPRIN-1 ha sido trasplantada, se examinó el efecto antitumor del uso combinado de un anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 y agentes. Un método para examinar el efecto antitumor usando ratones en los que MCF-7 ha sido trasplantada y los resultados del mismo son como se describen a continuación. Las células 106 MCF-7 (adquiridas en ATCC) se trasplantaron subcutáneamente a la región dorsal de cada uno de los 280 ratones inmunológicamente deficientes (Japan SLC Inc.) . Los ratones se cultivaron hasta que cada tumor alcanzó un tamaño de alrededor de 7 mm en diámetro.

Luego, como se describe específicamente en la siguiente sección experimental 1 y la sección experimental 2, los ratones que portan el tumor en los que MCF-7 ha sido trasplantada se dividieron en 5 grupos, un grupo al que se administró sólo el anticuerpo anti-CAPRIN-1, un grupo al que sólo se administró un agente antitumor (de 4 tipos) , un grupo al que se administraron en combinación un agente antitumor y un anticuerpo anti-Her2 (anticuerpo monoclonal ErbB2 anti humano de ratón, isotipo: IgG2b (sistemas R&D, No. de catálogo MAB11291)), a un grupo al que se administraron en combinación un agente antitumor y un anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1, y un grupo al que se administró (PBS(-) control. Además, se administró PBMC de ratón a todos los grupos de administración.

Sección experimental 1 (Grupo al que solo se administró anticuerpo anti-CAPRIN-1) El anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #2 se administró intraperitonealmente a cada uno de los 5 ratones que portan el tumor en 5 mg/kg/inyección en los días 0, 4, 8, 11, 15, y 17 después de empezar el experimento. PBMC separado del bazo del ratón Balb/c se administró de forma intravenosa a cada ratón en 1 x 107células/0.2 mL (RPMI1640) en los días 0, 8, y 15 después de empezar el experimento.

(Grupo al que se administró ciclofosfamida) Se administró ciclofosfamida intraperitonealmente a cada uno de los 5 ratones que portan el tumor en 80 mg/kg/inyección en los días 0 y 4 después de empezar el experimento. PBMC separado del bazo del ratón Balb/c se administró de forma intravenosa a cada ratón en 1 x 107 células/0.2 mL (RPMI1640) en los días 0, 8, y 15 después de empezar el experimento.

(Grupo al que se administró paclitaxel) Se administró paclitaxel intraperitonealmente a cada uno de los 5 ratones que portan el tumor en 15 mg/kg/inyección en los días 0 y 3 después de empezar el experimento. Se administró PBMC separado, del bazo de ratón Balb/C de forma intravenosa a cada ratón en 1 x 107 células/0.2 mL (RPMI1640) en los días 0, 8, y 15 después de empezar el experimento.

(Grupo al que se administró docetaxel) Se administró docetaxel intraperitonealmente a cada uno de los 5 ratones que portan el tumor en 10 mg/kg/inyección en los días 0 y 3 después de empezar el experimento. Se administró PBMC separado del bazo de ratón Balb/C de forma intravenosa a cada uno de los ratones en 1 x 107 células/0.2 mL (RPMI1640) en los días 0, 8, y 15 después de empezar el experimento .

(Grupo al que se administró vinorelbina) Se administró vinorelbina intraperitonealmente en cada uno de los 5 ratones que portan el tumor en 1 mg/kg/inyección en el día 0 después de empezar el experimento. Se administró PBMC separado del bazo de ratón Balb/C de forma intravenosa a cada uno de los ratones en 1 x 107 células/0.2 mL (RPMI1640) en los días 0, 8, y 15 después de empezar el experimento.

(Grupo al que se administraron ciclofosfamida y anticuerpo anti-Her2) Se administró ciclofosfamida intraperitonealmente en cada uno de los 5 ratones que portan el tumor en 80 mg/kg/inyección en los días 0 y 4 después de empezar el experimento, y al mismo tiempo el anticuerpo anti-Her2 se administró intraperitonealmente a cada uno de los 5 mg/kg/inyección los días 0, 4, 8, 11, 15, y 17 después de empezar el experimento. Se administró PBMC separado del bazo de ratón Balb/C de forma intravenosa a cada ratón en 1 x 107 células/0.2 mL (RPMI1640) en los días 0, 8, y 15 después de empezar el experimento.

(Grupo al que se administraron paclitaxel y anticuerpo anti-Her2) Se administró paclitaxel intraperitonealmente a cada uno de los 5 ratones que portan el tumor en 15 mg/kg/inyección en los días 0 y 3 después de empezar el experimento, y al mismo tiempo, el anticuerpo anti-Her2 se administró intraperitonealmente a cada uno de los 5 mg/kg/inyección en los días 0, 4, 8, 11, 15, y 17 después de empezar el experimento. Se administró PB C separado del bazo de ratón Balb/C de forma intravenosa a cada uno de los ratones en 1 x 107 células/0.2 mL (RPMI1640) en los días 0, 8, y 15 después de empezar el experimento.

(Grupo al que se administraron docetaxel y anticuerpo anti-Her2) Se administró docetaxel intraperitonealmente a cada uno de los 5 ratones que portan el tumor en 10 mg/kg/inyección en los días 0 y 3 después de empezar el experimento, y al mismo tiempo, el anticuerpo anti-Her2 se administró intraperitonealmente a cada uno de los 5 mg/kg/inyección en los días 0, 4, 8, 11, 15, y 17 después de empezar el experimento. Se administró PBMC separado del bazo de ratón Balb/C de forma intravenosa a cada uno de los ratones en 1 x 107 células/0.2 mL (RPMI1640) en los días 0, 8, y 15 después de empezar el experimento.

(Grupo al que se administraron vinorelbina y anti-Her2) Se administró vinorelbina intraperitonealmente a cada uno de los 5 ratones que portan el tumor en 1 mg/kg/inyección en el día 0 después de empezar el experimento, y al mismo tiempo, el anticuerpo anti-Her2 se administró intraperitonealmente a cada ratón en 5 mg/kg/inyección en los días 0, 4, 8, 11, 15, y 17 después de empezar el experimento. Se administró PBMC separado del bazo de ratón Balb/C de forma intravenosa a cada uno de los ratones en 1 x 107 células/0.2 mL (RPMI1640) en los días 0, 8, y 15 después de empezar el experimento.

(Grupo al que se administraron ciclofosfamida y anticuerpo anti-CAPRIN-1) Se administró ciclofosfamida intraperitonealmente a cada uno de los 5 ratones que portan el tumor en 80 mg/kg/inyección en los días 0 y 4 después de empezar el experimento, y al mismo tiempo, el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #2 se administró intraperitonealmente a cada ratón en 5 mg/kg/inyección en los días 0, 4, 8, 11, 15, y 17 después de empezar el experimento. Se administró PBMC separado del bazo de ratón "Balb/C de forma intravenosa a cada uno de los ratones en 1 x 107 células/0.2 mL (RPMI1640) en los días 0, 8, y 15 después de empezar el experimento.

(Grupo al que se administraron paclitaxel y anticuerpo anti-CAPRIN-1) Se administró paclitaxel intraperitonealmente a cada uno de los 5 ratones que portan el tumor en 15 mg/kg/inyección en los días 0 y 3 después de empezar el experimento, y al mismo tiempo, el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #2 se administró intraperitonealmente a cada ratón en 5 mg/kg/inyección en los días 0, 4, 8, 11, 15, y 17 después de empezar el experimento. Se administró PBMC separado del bazo de ratón Balb/C de forma intravenosa a cada uno de los ratones en 1 x 107 células/0.2 mL (RPMI1640) en los días 0, 8, y 15 después de empezar el experimento.

(Grupo al que se administró docetaxel y anticuerpo anti-CAPRIN-1) Se administró docetaxel intraperitonealmente a cada uno de los 5 ratones que portan el tumor en 10 mg/kg/inyección en los días 0 y 3 después de empezar el experimento, y al mismo tiempo, el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #2 se administró intraperitonealmente a cada ratón en 5 mg/kg/inyección en los días 0, 4, 8, 11, 15, y 17 después de empezar el experimento. Se administró PBMC separado del bazo de ratón Balb/C de forma intravenosa a cada uno de los ratones en 1 x 107 células/0.2 mL (RPMI1640) en los días 0, 8, y 15 después de empezar el experimento.

(Grupo al que se administraron vinorelbina y anticuerpo anti-CAPRIN- 1) Se administró vinorelbina intraperitonealmente en cada uno de los 5 ratones que portan el tumor en 1 mg/kg/inyección en el día 0 después de empezar el experimento, y al mismo tiempo, el- anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 #2 se administró intraperitonealmente a cada ratón en 5 mg/kg/inyección en los días 0, 4, 8, 11, 15, y 17 después de empezar el experimento. Se administró PBMC separado del bazo de ratón Balb/C de forma intravenosa a cada uno de los ratones en 1 x 107 células /0.2 mL (RPMI1640) en los días 0, 8, y 15 después de empezar el experimento.

Sección experimental 2 Las condiciones experimentales similares a aquellas de la sección experimental 1 se usaron para un grupo a las que solo se administró un anticuerpo anti -CAPRIN- 1 , un grupo al que se administró ciclofosfamida y el anticuerpo anti-CAPRIN-1, un grupo al que se administraron paclitaxel y el anticuerpo anti-CAPRIN- 1, un grupo al que se administraron docetaxel y el anticuerpo anti-CAPRIN-1 , y un grupo al que se administraron vinorelbina y el anticuerpo anti-CAPRIN-1, excepto que el anticuerpo monoclonal anti -CAPRIN- 1 #9 se administró como el anticuerpo anti-CAPRIN- 1.

Las condiciones experimental similares a aquellas de la sección experimental 1 se usaron para un grupo al que se administró ciclofosfamida , un grupo al que se administró paclitaxel, un grupo al que se administró docetaxel se administró, un grupo al que se administró vinorelbina, un grupo al que se administraron ciclofosfamida y un anticuerpo anti-Her2, un grupo al que se administraron paclitaxel y el anticuerpo anti-Her2, un grupo al que se administraron docetaxel y el anticuerpo anti-Her2, y un grupo al que se administraron vinorelbina y el anticuerpo anti-Her2.

Los tamaños de los tumores se midieron cada día y se observa el efecto antitumor para cada grupo de administración de cada una de las secciones experimentales de arriba. Un grupo de 5 ratones que portan el tumor a los que se administró PBS ( - ) en lugar de un anticuerpo se usó como un grupo de control. Además, el tamaño del tumor se determina calculando el volumen usando la fórmula del eje mayor x eje menor x eje menor x 0.5.

Como resultado de la observación del efecto antitumor, en la sección experimental 1, se encontró que el tumor había regresado a alrededor de 79% en el grupo al que se había administrado cada agente antitumor, alrededor de 56% en el grupo al que sólo se había administrado el anticuerpo anti-CAPRIN-l, y alrededor de 74% en el grupo al que se habían administrado cada agente antitumor y el anticuerpo anti-Her2, cuando el volumen del tumor en el grupo de control, al que se había administrado PBS(-) en el día 26 después de empezar el experimento, fue designado en 100%. Por otro lado, en el grupo al que se habían administrado el agente antitumor y el anticuerpo anti-CAPRIN-1, se encontró que el tumor había regresado a alrededor de varias decenas de % en el día 14 y se encontró que casi habían regresado por completo el día 22 y después de ese día. (vea Fig. 3 a Fig. 6) .

También, en la sección experimental 2, se encontró que el tumor había regresado a alrededor de 68% en el grupo al que solo se había administrado el agente antitumor, alrededor de 45% en el grupo al que sólo se había administrado el anticuerpo anti-CAPRIN-1, y alrededor de 55% en el grupo al que se administraron el agente antitumor y el anticuerpo anti-Her2, cuando el volumen del tumor en el grupo de control, al que se había administrado PBS ( - ) , el día 26 después de empezar el experimento se designó en 100%. Por otro lado, en el grupo al que se habían administrado cada agente antitumor y el anticuerpo anti-CAPRIN-1, se encontró que los tumores habían regresado a varias decenas % el día 14 y también se encontró que casi habían regresado por completo el día 22 y después de ese día (vea Fig. 7a Fig. 10) .

Aplicabilidad Industrial Los anticuerpos de la invención actual son útiles para tratar y/o prevenir el cáncer.

Todas las publicaciones, patentes, y solicitudes de patente citadas en la presente se incorporan en la presenta para referencia en su totalidad.

Texto Libre del Listado de Secuencias SEQ ID NO: 31: T3 cebador SEQ ID NO: 32: T7 cebador SEQ ID NOS: 33 y 34: cebador SEQ ID NOS: 35 y 36: cebador GAPDH SEQ ID NOS: 38 y 39: cebador SEQ ID NOS: 130 hasta 135: cebador Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un medicamento para tratar y/o prevenir un cáncer, caracterizado porque comprende una combinación de un anticuerpo o un fragmento del mismo que tiene reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1, y uno o dos o más tipos de agente antitumor, en donde el anticuerpo o fragmento y el agente antitumor o agentes antitumor se combinan juntos o de forma separada.

2. El medicamento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo o un fragmento del mismo que tiene reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1 es un anticuerpo o un fragmento del mismo, que enlaza específicamente a la región extracelular de una proteína CAPRIN-1 que existe en la superficie de una célula de cáncer.

3. El medicamento de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el anticuerpo o un fragmento del mismo que tiene reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1 es un anticuerpo o un fragmento del mismo, que enlaza específicamente a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 37 en la región extracelular de la proteína CAPRIN-1 que existe en la superficie de una célula de cáncer, o una secuencia de aminoácidos que tiene 80% o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 37.

4. El medicamento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la proteína CAPRIN-1 es de un humano.

5. El medicamento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el agente antitumor de arriba es cualquiera de los agentes antitumor como se describe en la descripción.

6. El medicamento de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el agente antitumor se selecciona del grupo que consiste de ciclofosfamida, paclitaxel, docetaxel, vinorelbina, y sales farmacéuticamente aceptables y derivados de los mismos.

7. El medicamento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el cáncer es cáncer de mama, tumor cerebral, leucemia, linfoma, cáncer pulmonar, mastocitoma, cáncer renal, cáncer cervicouterino, cáncer de vejiga, cáncer esofágico, cáncer gástrico, o cáncer colorectal .

8. El medicamento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, o un anticuerpo recombinante .

9. El medicamento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humano, anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico, anticuerpo de cadena sencilla, o anticuerpo biespecífico .

10. Un método para tratar y/o prevenir un cáncer, caracterizado porque comprende administrar el medicamento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, a un sujeto que se sospecha que tiene un cáncer.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto el anticuerpo o un fragmento del mismo y un agente antitumor, que están contenidos en el medicamento de arriba, simultáneamente o separadamente.