KR101843807B1

KR101843807B1 - 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약품

Info

Publication number: KR101843807B1
Application number: KR1020127022763A
Authority: KR
Inventors: 타카요시 이도; 후미요시 오카노; 요시노리 나리타
Original assignee: 도레이 카부시키가이샤
Priority date: 2010-02-04
Filing date: 2011-02-04
Publication date: 2018-03-30
Anticipated expiration: 2031-02-04
Also published as: BR112012018943A8; EP2532367A1; AU2011211700B2; US20120294860A1; MX2012008991A; EP2532367A4; DK2532367T3; WO2011096535A1; RU2012137503A; KR20120139720A; PT2532367T; CN109925511B; US9180187B2; CA2788720C; CN102844048A; JPWO2011096535A1; AU2011211700A1; RU2624029C2; JP5923984B2; CN109925511A

Abstract

이 발명은 암세포의 표면에 특이적으로 발현되는 암 항원CAPRIN-1 단백질에 대한 항체와 항종양제를 함께 또는 각각 조합해서 포함하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약품 및 그 사용에 관한 것이다.

Description

암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약품{PHARMACEUTICAL AGENT FOR TREATMENT AND/OR PREVENTION OF CANCER}

본 발명은 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 프래그먼트와 항종양제를 조합시킨 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약품 및 그 사용에 관한 것이다.

암은 전체 사망 원인의 제 1 위를 차지하는 질환이며, 현행의 치료는 수술요법을 주체로 방사선요법과 화학요법을 조합시킨 것이다. 또한, 현행의 치료는 같은 종류로 같은 단계의 암을 갖는 모든 환자에 대하여 동일하게 치료한다. 이들의 환자의 적어도 40%는 제 1 차 치료에 실패하고, 따라서 추가적인 일련의 치료를 행하게 된다. 그래서 또한 치료가 실패하면 암이 전이되고, 최종적으로는 사망할 가능성이 증대하고 있다. 즉, 현재의 방사선요법과 화학요법은 여러 가지 암종, 각각의 암 환자에게 맞추는 것이 불가능하고, 외과 수술 그 자체도 대부분의 경우에 있어서 암의 완치에는 불충분한 것이 현상황이다.

상술하는 암 치료의 문제점을 극복하는 기술로서 암세포상의 항원 단백질을 표적으로 한 암을 치료하기 위한 각종 항체 의약이 세상에 대두되어 왔다. 구체예로서 전이성 유방암을 갖는 환자의 치료약으로서 1998년에 판매 승인을 받고 있는 Her2에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 유효 성분으로 하는 HERCEPTIN(등록상표)은 Her2 과잉 발현 전이성 유방암 환자에 있어서 재발·전이 유방암 환자의 사망자 수의 감소라는 임상적인 실효가 증명되어 있고, 종래의 화학요법제와 비교해도 심독성 이외에 위독한 부작용이 없고, 더욱 주목해야 할 점으로서 화학요법제와의 병용에 의한 유방암에 대한 치료 효과가 증명되어 있다(특허문헌 1∼3). 그러나 Her2를 비롯해서 항체 의약 표적이 되는 암세포상의 항원 단백질의 대부분은 정상 세포에도 발현되는 것이며, 항체 투여의 결과 암세포뿐만 아니라 항원이 발현되는 정상 세포도 장해되어버려 그 결과 발생하는 부작용이 문제가 될 가능성이 있다.

Cytoplasmic-and proliferation-associated protein 1(CAPRIN-1)은 휴지기의 정상 세포가 활성화나 세포 분열을 일으킬 때에 발현되고, 또한 세포 내에서 RNA와 세포 내 스트레스 과립을 형성해서 mRNA의 수송, 번역의 제어에 관여하는 것 등이 알려져 있는 세포 내 단백질이다. 반면에 CAPRIN-1에는 여러 가지 별명이 존재하고 있고, 그 일례로서 GPI-anchored membrane protein 1이나 Membrane component surface marker 1 protein (M11S1) 등이 있고, 마치 본 단백질이 세포막 단백질인 것이 알려져 있었던 것 같은 명칭이 있다. 이들의 별명은 원래 CAPRIN-1의 유전자 서열이 GPI 결합 영역을 갖고, 대장암 세포에 발현되는 막단백질인 것으로 하는 보고(비특허문헌 1)로부터 유래되지만 후에 이 보고에서의 CAPRIN-1의 유전자 서열은 오류이며, 현재 GenBank 등에 등록되어 있는 CAPRIN-1의 유전자 서열이 1염기 결손되는 것에 의해 프레임 시프트가 일어남으로써 C말단으로부터 80 아미노산이 결손되고, 그 결과 발생하는 artifact(74 아미노산)가 앞의 보고에서의 GPI 결합 부분이며, 또한 5'측에도 유전자 서열의 에러가 있고, N말단으로부터 53 아미노산이 결손되어 있는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 2). 또한, 현재 GenBank 등에 등록되어 있는 CAPRIN-1의 유전자 서열이 인코딩하는 단백질은 세포막 단백질이 아닌 것이 보고되어 있다(비특허문헌 2).

또한, CAPRIN-1이 세포막 단백질인 것으로 하는 비특허문헌 1의 보고에 의거하여 특허문헌 4 및 5에는 M11S1의 명칭으로 CAPRIN-1이 세포막 단백질 중 하나로서 항체 의약 표적으로서 암 치료에 사용될 수 있는 것이 기재되어 있다(실시예에는 본 단백질에 대한 항체를 사용한 치료에 관한 기재는 일절 없다). 그러나 비특허문헌 2의 보고와 같이 특허문헌 4의 출원 당시부터 현재까지 CAPRIN-1은 세포 표면에는 발현되어 있지 않은 것이 통설로 되어 있고, CAPRIN-1이 세포막 단백질인 것으로 하는 잘못된 정보에만 의거하는 특허문헌 4 및 5의 내용은 당업자의 기술 상식으로서 이해되어서는 안되는 것은 명확하다.

일본국 특허 공개 2006-316040호 공보 미국 특허 제7485302호 미국 특허 제7449184호 미국 특허 공개 제2008/0075722호 국제 공개 제WO 2005/100998호

J. Biol. Chem., 270:20717-20723, 1995 J. Immunol., 172:2389-2400, 2004

본 발명의 목적은 암세포의 표면에 특이적으로 발현되는 암 항원 단백질을 동정하고, 그것을 표적으로 한 항체와 항종양제를 조합시킴으로써 암의 치료 및/또는 예방용 의약품으로서의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 예의 연구의 결과 개의 정소 조직 유래 cDNA 라이브러리와 유방암 환견의 혈청을 사용한 SEREX법에 의해 담암 생체 유래의 혈청 중에 존재하는 항체와 결합하는 단백질을 인코딩하는 cDNA를 취득하고, 취득한 유전자 및 그 인간, 소, 말, 마우스, 닭 상동성 유전자를 기초로 해서 서열 번호 2∼30 중 짝수의 서열 번호로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 CAPRIN-1 단백질 및 그들 CAPRIN-1 단백질에 대한 항체를 제작했다. 그리고 CAPRIN-1 단백질이 유방암, 뇌종양, 백혈병, 림프종, 폐암, 자궁경부암, 방광암, 식도암, 대장암, 위암, 신장암 등의 암의 세포에 특이적으로 발현되어 있는 것, 그리고 CAPRIN-1 단백질의 일부가 그들 암세포의 세포 표면에 특이적으로 발현되어 있는 것, 그리고 그들 CAPRIN-1의 각 암세포의 세포 표면에 발현되는 부분에 대한 항체와 특정한 항종양제를 조합시킴으로써 현저한 암 치료 효과가 얻어지는 것을 발견하여 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

또한, 본 명세서에서는 「암」이라는 용어는 종양이나 암종과 호환적으로 사용된다.

따라서, 본 발명은 이하의 특징을 갖는다.

(1) CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 프래그먼트와, 1종류 또는 2종류 이상의 항종양제를 함께 또는 각각 조합해서 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약품.

(2) (1)에 있어서, 상기 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 프래그먼트가 암세포 표면상에 존재하는 CAPRIN-1 단백질의 세포 외 영역과 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 프래그먼트인 것을 특징으로 하는 의약품.

(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 프래그먼트가 암세포 표면상에 존재하는 CAPRIN-1 단백질의 세포 외 영역 중 서열 번호 37로 나타내어지는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 프래그먼트인 것을 특징으로 하는 의약품.

(4) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 상기 CAPRIN-1 단백질이 인간 유래인 의약품.

(5) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 상기 항종양제가 명세서에 기재된 항종양제인 의약품.

(6) (5)에 있어서, 상기 항종양제가 시클로포스파미드, 파클리탁셀, 도세탁셀, 비노렐빈 및 그들의 약학적으로 허용 가능한 염 및 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 의약품.

(7) (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 상기 암이 유방암, 뇌종양, 백혈병, 림프종, 폐암, 비만 세포종, 신장암, 자궁경부암, 방광암, 식도암, 위암 또는 대장암인 의약품.

(8) (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체가 단일클론 항체, 다중클론 항체, 또는 재조합 항체인 의약품.

(9) (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체가 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 이중 특이성 항체인 의약품.

(10) 상기 (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재된 의약품을 암을 갖는 것으로 의심되는 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 방법.

(11) (10)에 있어서, 상기 의약품에 포함되는 항체 또는 그 프래그먼트 및 항종양제를 동시에 또는 각각 상기 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본국 특허 출원 2010-023455호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.

(발명의 효과)

본 발명에 의해 현저한 부작용을 검출하는 일 없이 광범위한 암의 축소 및 퇴축의 경이적인 상승 효과가 얻어진다.

도 1은 CAPRIN-1 단백질을 인코딩하는 유전자의 정상 조직 및 종양 세포주에서의 발현 패턴을 나타내는 도면이다. 참조 번호 1; CAPRIN-1 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 패턴, 참조 번호 2; GAPDH 유전자의 발현 패턴을 나타낸다.
도 2는 암세포의 세포 표면에 반응하는 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체(#1∼#11)에 의한 CAPRIN-1을 발현하는 유방암 세포주 MDA-MB-157에 대한 세포장해성을 나타내는 도면이다. 참조 번호 3; #1의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체, 참조 번호 4; #2의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체, 참조 번호 5; #5의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체, 참조 번호 6; #4의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체, 참조 번호 7; #5의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체, 참조 번호 8; #6의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체, 참조 번호 9; #7의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체, 참조 번호 10; #8의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체, 참조 번호 11; #9의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체, 참조 번호 12; #10의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체, 참조 번호 13; #11의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 첨가했을 때의 활성, 참조 번호 14; CAPRIN-1 단백 자체에는 반응하지만 암세포의 세포 표면에 반응하지 않는 단일클론 항체를 첨가했을 때의 활성, 참조 번호 15; 항체 대신에 PBS를 첨가했을 때의 활성을 나타낸다.
도 3은 항종양제 시클로포스파미드와 암세포의 세포 표면에 반응하는 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체 병용에 의한 CAPRIN-1을 발현하는 유방암 세포주 MCF-7이 이식된 누드 마우스에 대한 항종양 효과를 나타내는 도면이다. 참조 번호 16; 항체 대신에 PBS를 투여, 참조 번호 17; 시클로포스파미드를 투여, 참조 번호 18; #2의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 투여, 참조 번호 19; 시클로포스파미드와 항Her2 항체를 투여, 참조 번호 20; 시클로포스파미드와 #2의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 투여했을 때의 마우스의 종양의 크기를 나타낸다.
도 4는 항종양제 파클리탁셀과 암세포의 세포 표면에 반응하는 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체 병용에 의한 CAPRIN-1을 발현하는 유방암 세포주 MCF-7이 이식된 누드 마우스에 대한 항종양 효과를 나타내는 도면이다. 참조 번호 21; 항체 대신에 PBS를 투여, 참조 번호 22; 파클리탁셀을 투여, 참조 번호 23; #2의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 투여, 참조 번호 24; 파클리탁셀과 항Her2 항체를 투여, 참조 번호 25; 파클리탁셀과 #2의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 투여했을 때의 마우스의 종양의 크기를 나타낸다.
도 5는 항종양제 도세탁셀과 암세포의 세포 표면에 반응하는 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체 병용에 의한 CAPRIN-1을 발현하는 유방암 세포주 MCF-7이 이식된 누드 마우스에 대한 항종양 효과를 나타내는 도면이다. 참조 번호 26; 항체 대신에 PBS를 투여, 참조 번호 27; 도세탁셀을 투여, 참조 번호 28; #2의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 투여, 참조 번호 29; 도세탁셀과 항Her2 항체를 투여, 참조 번호 30; 도세탁셀과 #2의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 투여했을 때의 마우스의 종양의 크기를 나타낸다.
도 6은 항종양제 비노렐빈과 암세포의 세포 표면에 반응하는 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체 병용에 의한 CAPRIN-1을 발현하는 유방암 세포주 MCF-7이 이식된 누드 마우스에 대한 항종양 효과를 나타내는 도면이다. 참조 번호 31; 항체 대신에 PBS를 투여, 참조 번호 32; 비노렐빈을 투여, 참조 번호 33; #2의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 투여, 참조 번호 34; 비노렐빈과 항Her2 항체를 투여, 참조 번호 35; 비노렐빈과 #2의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 투여된 마우스의 종양의 크기를 나타낸다.
도 7은 항종양제 시클로포스파미드와 암세포의 세포 표면에 반응하는 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체 병용에 의한 CAPRIN-1을 발현하는 유방암 세포주 MCF-7이 이식된 누드 마우스에 대한 항종양 효과를 나타내는 도면이다. 참조 번호 36; 항체 대신에 PBS를 투여, 참조 번호 37; 시클로포스파미드를 투여, 참조 번호 38; #9의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 투여, 참조 번호 39; 시클로포스파미드와 항Her2 항체를 투여, 참조 번호 40; 시클로포스파미드와 #9의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 투여했을 때의 마우스의 종양의 크기를 나타낸다.
도 8은 항종양제 파클리탁셀과 암세포의 세포 표면에 반응하는 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체 병용에 의한 CAPRIN-1을 발현하는 유방암 세포주 MCF-7이 이식된 누드 마우스에 대한 항종양 효과를 나타내는 도면이다. 참조 번호 41; 항체 대신에 PBS를 투여, 참조 번호 42; 파클리탁셀을 투여, 참조 번호 43; #9의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 투여, 참조 번호 44; 파클리탁셀과 항Her2 항체를 투여, 참조 번호 45; 파클리탁셀과 #9의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 투여했을 때의 마우스의 종양의 크기를 나타낸다.
도 9는 항종양제 도세탁셀과 암세포의 세포 표면에 반응하는 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체 병용에 의한 CAPRIN-1을 발현하는 유방암 세포주 MCF-7이 이식된 누드 마우스에 대한 항종양 효과를 나타내는 도면이다. 참조 번호 46; 항체 대신에 PBS를 투여, 참조 번호 47; 도세탁셀을 투여, 참조 번호 48; #9의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 투여, 참조 번호 49; 도세탁셀과 항Her2 항체를 투여, 참조 번호 50; 도세탁셀과 #9의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 투여했을 때의 마우스의 종양의 크기를 나타낸다.
도 10은 항종양제 비노렐빈과 암세포의 세포 표면에 반응하는 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체 병용에 의한 CAPRIN-1을 발현하는 유방암 세포주 MCF-7이 이식된 누드 마우스에 대한 항종양 효과를 나타내는 도면이다. 참조 번호 51; 항체 대신에 PBS를 투여, 참조 번호 52; 비노렐빈을 투여, 참조 번호 53; #9의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 투여, 참조 번호 54; 비노렐빈과 항Her2 항체를 투여, 참조 번호 55; 비노렐빈과 #9의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 투여된 마우스의 종양의 크기를 나타낸다.

본 발명에서 사용되는 서열 번호 2∼30 중 짝수의 서열 번호의 폴리펩티드에 대한 항체의 항종양 활성은 후술하는 바와 같이 생체 내에서 담암 동물에 대한 종양 증식의 억제를 조사함으로써 또는 생체 외에서 상기 폴리펩티드를 발현하는 종양 세포에 대하여 면역 세포 또는 보체를 통한 세포장해 활성을 나타내는지의 여부를 조사함으로써 평가할 수 있다.

또한, 서열 번호 2∼30 중 짝수의 서열 번호(즉, 서열 번호 2, 4, 6··28, 30)의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열은 각각 서열 번호 1∼29 중 홀수의 서열 번호(즉, 서열 번호 1, 3, 5··27, 29)에 나타내어져 있다.

본 발명이 개시하는 서열표의 서열 번호 6, 8, 10, 12 및 14로 나타내어지는 아미노산 서열은 개 정소 조직 유래 cDNA 라이브러리와 유방암 환견의 혈청을 사용한 SEREX법에 의해 담암견 유래의 혈청 중에 특이적으로 존재하는 항체와 결합하는 폴리펩티드로서, 또한 서열 번호 2 및 4로 나타내어지는 아미노산 서열은 그 인간 상동 인자(호몰로그)로서, 서열 번호 16으로 나타내어지는 아미노산 서열은 그 소 상동 인자로서, 서열 번호 18로 나타내어지는 아미노산 서열은 그 말 상동 인자로서, 서열 번호 20∼28로 나타내어지는 아미노산 서열은 그 마우스 상동 인자로서, 서열 번호 30으로 나타내어지는 아미노산 서열은 그 닭 상동 인자로서 단리된 CAPRIN-1의 아미노산 서열이다(후술의 실시예 1 참조). CAPRIN-1은 휴지기의 정상 세포가 활성화나 세포 분열을 일으킬 때에 발현되는 것이 알려져 있다.

CAPRIN-1은 세포 표면에는 발현되지 않는 것이 알려져 있었지만 본 검토에 의해 CAPRIN-1 단백질의 일부가 각종 암세포의 세포 표면에 발현되는 것이 밝혀졌다. 본 발명에서는 CAPRIN-1 단백질 중 암세포의 세포 표면에 발현되는 부분에 결합하는 항체가 바람직하게 사용된다. 암세포의 세포 표면에 발현되는 CAPRIN-1 단백질 중의 부분 펩티드로서 서열표의 서열 번호 2∼30 중 서열 번호 6 및 서열 번호 18을 제외한 짝수 번호로 나타내어지는 아미노산 서열 중의 아미노산 잔기 번호(aa) 50-98 또는 아미노산 잔기 번호(aa) 233-305의 영역 내의 연속하는 7개 이상의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 들 수 있고, 구체적으로는 예를 들면 서열 번호 37로 나타내어지는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 들 수 있고, 본 발명에서 사용되는 항체는 이들 펩티드에 (특이적으로) 결합하거나(또는 이들 펩티드를 (특이적으로) 인식하거나 또는 이들 펩티드와 면역학적 반응성을 갖는다) 또한 항종양 활성을 나타내는 모든 항체가 포함된다.

본 발명에서 사용되는 상기 CAPRIN-1에 대한 항체는 항종양 활성을 발휘할 수 있는 한 어떠한 종류의 항체이어도 좋고, 예를 들면 단일클론 항체, 다중클론 항체, 재조합 항체, 예를 들면 합성 항체, 다중 특이성 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체(scFv) 등 인간 항체, 그들의 항체 프래그먼트, 예를 들면 Fab, F (ab')₂, Fv 등을 포함한다. 이들의 항체 및 그 프래그먼트는 또한 당업자에게 공지의 방법에 의해 조제하는 것이 가능하다. 본 발명에 있어서는 CAPRIN-1 단백질과 특이적으로 결합하는 것이 가능한 항체가 바람직하고, 단일클론 항체인 것이 바람직하지만 균질한 항체를 안정적으로 생산할 수 있는 한 다중클론 항체이어도 좋다. 또한, 피험자가 인간일 경우에는 거절 반응을 회피 또는 억제하기 위해서 인간 항체 또는 인간화 항체인 것이 바람직하다.

여기서 「CAPRIN-1 단백질과 특이적으로 결합한다」란 CAPRIN-1 단백질에 특이적으로 결합하고, 그 이외의 단백질과 실질적으로 결합하지 않는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용할 수 있는 항체의 항종양 활성은 후술하는 바와 같이 생체 내에서 담암 동물에 대한 종양 증식의 억제를 조사함으로써 또는 생체 외에서 상기 폴리펩티드를 발현하는 종양 세포에 대하여 면역 세포 또는 보체를 통한 세포장해 활성을 나타내는지의 여부를 조사함으로써 평가할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서의 암의 치료 및/또는 예방의 대상인 피험자는 인간, 애완 동물, 가축류, 경기용 동물 등의 포유동물이며, 바람직한 피험자는 인간이다.

이하에, 본 발명에 관한 항원의 제작, 항체의 제작 및 의약품 등에 대해서 설명한다.

<항체 제작용 항원의 제작>

본 발명에서 사용되는 CAPRIN-1에 대한 항체를 취득하기 위한 감작 항원으로서 사용되는 단백질 또는 그 단편은 인간, 개, 소, 말, 마우스, 랫트, 닭 등 그 유래가 되는 동물종에 제한되지 않는다. 그러나 세포 융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려해서 선택하는 것이 바람직하고, 일반적으로는 포유동물 유래의 단백질이 바람직하고, 특히 인간 유래의 단백질이 바람직하다. 예를 들면, CAPRIN-1이 인간 CAPRIN-1의 경우 인간 CAPRIN-1 단백질이나 그 부분 펩티드, 인간 CAPRIN-1을 발현하는 세포 등을 사용할 수 있다.

인간 CAPRIN-1 및 그 호몰로그의 염기 서열 및 아미노산 서열은 예를 들면 GenBank(미국 NCBI)에 액세스하여 BLAST, FASTA 등의 알고리즘(Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877, 1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res.25:3389-3402, 1997)을 이용함으로써 입수할 수 있다.

본 발명에서는 인간 CAPRIN-1의 염기 서열(서열 번호 1 또는 3) 또는 아미노산 서열(서열 번호 2 또는 4)을 기준으로 했을 경우 이들의 ORF 또는 성숙 부분의 염기 서열 또는 아미노산 서열과 70%∼100%, 바람직하게는 80%∼100%, 보다 바람직하게는 90%∼100%, 더욱 바람직하게는 95%∼100%, 예를 들면 97%∼100%, 98%∼100%, 99%∼100% 또는 99.5%∼100%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어지는 핵산 또는 단백질이 타겟이 된다. 여기서 「%서열 동일성」은 2개의 서열을 갭을 도입하거나 또는 갭을 도입하지 않고, 최대의 유사도가 되도록 얼라인먼트(정렬)했을 때 아미노산(또는 염기)의 총 수에 대한 동일 아미노산(또는 염기)의 퍼센티지(%)를 의미한다.

CAPRIN-1 단백질의 단편은 항체가 인식하는 최소 단위인 에피토프(항원 결정기)의 아미노산 길이로부터 상기 단백질의 전체 길이 미만의 길이를 갖는다. 에피토프는 포유동물, 바람직하게는 인간에 있어서 항원성 또는 면역원성을 갖는 폴리펩티드 단편을 가리키고, 그 최소 단위는 (연속하는)약 7∼12 아미노산, 예를 들면 8∼11 아미노산으로 이루어진다. 항체와 특이적으로 결합하는 CAPRIN-1 단백질의 부분 서열의 구체예로서는 서열 번호 37로 나타내어지는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열에 있어서 적어도 약 7∼12 아미노산을 포함하는 부분 서열을 들 수 있다.

상기한 인간 CAPRIN-1 단백질이나 그 부분 펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 예를 들면 Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 따라 합성할 수 있다(일본 생화학회 편, 생화학실험 강좌 1, 단백질의 화학IV, 화학수식과 펩티드 합성, 도쿄 화학동인(일본), 1981년). 또한, 각종의 시판된 펩티드 합성기를 이용해서 상법에 의해 합성할 수도 있다. 또한, 공지의 유전자 공학적 수법(Sambrook 외, Molecular Cloning, 제 2 판, Current Protocols in Molecular Biology(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ausubel 외, Short Protocols in Molecular Biology, 제 3 판, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995), John Wiley & Sons등)을 사용해서 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 조제하고, 상기 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 넣어서 숙주 세포에 도입하고, 상기 숙주 세포 중에서 폴리펩티드를 생산시킴으로써 목적으로 하는 폴리펩티드를 얻을 수 있다.

상기 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 공학적 수법이나 시판된 핵산 합성기를 사용한 상법에 의해 용이하게 조제할 수 있다. 예를 들면, 서열 번호 1의 염기 서열을 포함하는 DNA는 인간 염색체 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로서 사용하고, 서열 번호 1에 기재한 염기 서열을 증폭할 수 있도록 설계한 한쌍의 프라이머를 사용해서 PCR을 행함으로써 조제할 수 있다. PCR의 반응 조건은 적당히 설정할 수 있고, 예를 들면 내열성 DNA 폴리메라아제(예를 들면, Taq 폴리메라아제 등) 및 Mg² ⁺ 함유 PCR 버퍼를 사용해서 94℃에서 30초간(변성), 55℃에서 30초∼1분간(어닐링), 72℃에서 2분간(신장)으로 이루어지는 반응행정을 1사이클로 하고, 예를 들면 30사이클 행한 후 72℃에서 7분간 반응시키는 조건 등을 들 수 있지만 이것에 한정되지 않는다. PCR의 수법, 조건 등에 대해서는 예를 들면 Ausubel 외, Short Protocols in Molecular Biology, 제 3 판, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995), John Wiley & Sons(특히, 제 15 장)에 기재되어 있다.

또한, 본 명세서 중의 서열표의 서열 번호 1∼30에 나타내어지는 염기 서열 및 아미노산 서열의 정보에 의거하여 적당한 프로브나 프라이머를 조제하고, 그것을 사용해서 인간 등의 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 소망의 DNA를 단리할 수 있다. cDNA 라이브러리는 서열 번호 2∼30 중 짝수의 서열 번호의 단백질을 발현하고 있는 세포, 기관 또는 조직으로부터 제작하는 것이 바람직하다. 그러한 세포나 조직의 예는 정소, 백혈병, 유방암, 림프종, 뇌종양, 폐암, 대장암 등의 암 또는 종양으로부터 유래되는 세포 또는 조직이다. 상기한 프로브 또는 프라이머의 조제, cDNA 라이브러리의 구축, cDNA 라이브러리의 스크리닝 및 목적 유전자의 클로닝 등의 조작은 당업자에게 기지이며, 예를 들면 Sambrook 외, Molecular Cloning, 제 2 판, Current Protocols in Molecular Biology(1989), Ausbel 외(상기) 등에 기재된 방법에 준해서 행할 수 있다. 이렇게 해서 얻어진 DNA로부터 인간 CAPRIN-1 단백질이나 그 부분 펩티드를 인코딩하는 DNA를 얻을 수 있다.

상기 숙주 세포로서는 상기 폴리펩티드를 발현할 수 있는 세포이면 어떠한 것이어도 좋고, 원핵 세포의 예로서는 대장균 등, 진핵 세포의 예로서는 원숭이 신장 세포 COS1, 차이니즈 햄스터 난소 세포 CHO 등의 포유동물 세포, 인간 태아 신장 세포주 HEK293, 마우스 태자 피부 세포주 NIH3T3, 출아 효모, 분열 효모 등의 효모 세포, 누에 세포, 아프리카 발톱 개구리 난세포 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

숙주 세포로서 원핵 세포를 사용할 경우 발현 벡터로서는 원핵 세포 중에서 복제 가능한 오리진, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 멀티클로닝 사이트, 터미네이터, 약제 내성 유전자, 영양 요구성 상보 유전자 등을 갖는 발현 벡터를 사용한다. 대장균용 발현 벡터로서는 pUC계, pBluescriptII, pET 발현 시스템, pGEX 발현 시스템 등을 예시할 수 있다. 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 넣고, 상기 벡터로 원핵 숙주 세포를 형질 전환한 후 얻어진 형질 전환체를 배양하면 상기 DNA가 인코딩하고 있는 폴리펩티드를 원핵 숙주 세포 중에서 발현시킬 수 있다. 이 때 상기 폴리펩티드를 다른 단백질과의 융합 단백질로서 발현시킬 수도 있다.

숙주 세포로서 진핵 세포를 사용할 경우 발현 벡터로서는 프로모터, 스플라이싱 영역, 폴리(A) 부가 부위 등을 갖는 진핵 세포용 발현 벡터를 사용한다. 그러한 발현 벡터로서는 pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV 벡터, pRS, pcDNA3, pYES2 등을 예시할 수 있다. 상기와 마찬가지로 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 넣고, 상기 벡터로 진핵 숙주 세포를 형질 전환한 후 얻어진 형질 전환체를 배양하면 상기 DNA가 인코딩하고 있는 폴리펩티드를 진핵 숙주 세포 중에서 발현시킬 수 있다. 발현 벡터로서 pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 등을 사용했을 경우에는 His 태그(예를 들면, (His)₆∼(His)₁₀), FLAG 태그, myc 태그, HA 태그, GFP 등 각종 태그를 부가한 융합 단백질로서 상기 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다.

발현 벡터의 숙주 세포로의 도입은 전기 천공법, 인산 칼슘법, 리포좀법, DEAE 덱스트란법, 마이크로 인젝션, 바이러스 감염, 리포펙션, 세포막 투과성 펩티드와의 결합 등의 주지의 방법을 사용할 수 있다.

숙주 세포로부터 목적의 폴리펩티드를 단리 정제하기 위해서는 공지의 분리 조작을 조합해서 행할 수 있다. 예를 들면, 요소 등의 변성제나 계면활성제에 의한 처리, 초음파 처리, 효소 소화, 염석이나 용매 분별 침전법, 투석, 원심 분리, 한외 여과, 겔 여과, SDS-PAGE, 등전점 전기영동, 이온 교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

<항체의 구조>

항체는 통상 적어도 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 헤테로 다량체 당단백질이다. IgM은 별도로 2개의 동일의 경(L)쇄 및 2개의 동일의 중(H)쇄로 구성되는 약 150kDa의 헤테로 4량체 당단백질이다. 전형적으로는 각각의 경쇄는 1개의 디술피드 공유 결합에 의해 중쇄에 연결되어 있지만 여러 가지 면역 글로불린 아이소타입의 중쇄 간의 디술피드 결합의 수는 변동한다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 쇄내 디술피드 결합도 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽의 단에 가변 도메인(VH 영역)을 갖고, 그곳에 몇 개의 정상 영역이 계속된다. 각각 경쇄는 가변 도메인(VL 영역)을 갖고, 그 반대의 단에 1개의 정상 영역을 갖는다. 경쇄의 정상 영역은 중쇄의 최초의 정상 영역과 정렬하고 있고, 또한 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬하고 있다. 항체의 가변 도메인은 특정 영역이 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 특정 가변성을 나타내고 항체에 결합 특이성을 부여한다. 가변 영역의 상대적으로 보존되어 있는 부분은 프레임워크 영역(FR)으로 불리고 있다. 완전한 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 3개의 CDR에 의해 연결된 4개의 FR을 포함한다. 3개의 CDR은 중쇄에서는 그 N말단으로부터 순서대로 CDRH1, CDRH2, CDRH3, 마찬가지로 경쇄에서는 CDRL1, CDRL2, CDRL3이라고 불리고 있다. 항체의 항원으로의 결합 특이성에는 CDRH3이 가장 중요하다. 또한, 각 쇄의 CDR은 FR 영역에 의해 근접한 상태로 함께 유지되고, 다른쪽의 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. 정상 영역은 항체가 항원에 결합하는 것에 직접 기여하지 않지만, 여러 가지 이펙터 기능, 예를 들면 항체 의존성 세포성 세포장해 활성(ADCC)으로의 관여, Fcγ 수용체로의 결합을 통한 식작용, 신생아 Fc 수용체(FcRn)를 통한 반감기/클리어런스 속도, 보체 캐스케이드의 C1q 구성 요소를 통한 보체 의존성 세포장해(CDC)을 나타낸다.

<항체의 제작>

본 발명에 있어서의 항CAPRIN-1 항체란 CAPRIN-1 단백질의 전체 길이 또는 그 단편과 면역학적 반응성을 갖는 항체를 의미한다.

여기서 「면역학적 반응성」이란 생체 내에서 항체와 CAPRIN-1 항원이 결합하는 특성을 의미하고, 이러한 결합을 통해 종양을 장해(예를 들면, 사멸, 억제 또는 퇴축)하는 기능이 발휘된다. 즉, 본 발명에서 사용되는 항체는 CAPRIN-1 단백질과 결합해서 종양, 예를 들면 백혈병, 림프종, 유방암, 뇌종양, 폐암, 식도암, 위암, 신장암, 대장암 등을 장해할 수 있으면 그 종류를 상관하지 않는다.

항체의 예는 단일클론 항체, 다중클론 항체, 재조합 항체, 예를 들면 합성 항체, 다중 특이성 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체 등 인간 항체, 그들의 항체 프래그먼트(예를 들면, Fab, F(ab')₂, Fv) 등을 포함한다. 또한, 항체는 면역 글로불린 분자의 임의의 클래스, 예를 들면 IgG, IgE, IgM, IgA, IgD 및 IgY, 또는 임의의 서브 클래스, 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 등이다. 이들의 항체 또는 그 프래그먼트는 모두 암의 세포 표면상에 존재하는 CAPRIN-1 단백질, 바람직하게는 그 세포 외 영역의 폴리펩티드와 면역학적 반응성을 갖는(바람직하게는 상기 단백질 또는 상기 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는) 것이며, 또한 암에 대한 세포장해 활성을 나타내는 것이다.

항체는 글리코실화 이외에 아세틸화, 포르밀화, 아미드화, 인산화 또는 페그(PEG)화 등에 의해 더 수식되어 있어도 좋다.

이하에 여러 가지 항체의 제작예를 나타낸다.

항체가 단일클론 항체일 때에는 예를 들면 CAPRIN-1을 발현하는 유방암 세포주 SK-BR-3 등을 마우스에 투여해서 면역하고, 동 마우스로부터 비장을 추출하고, 세포를 분리한 후 상기 세포와 마우스 골수종 세포를 융합시키고, 얻어진 융합 세포(하이브리도마) 중으로부터 암세포 증식 억제 작용을 갖는 항체를 산생하는 클론을 선택한다. 암세포 증식 억제 작용을 갖는 단일클론 항체 산생 하이브리도마를 단리하고, 상기 하이브리도마를 배양하고, 배양 상청액으로부터 일반적인 어피니티 정제법에 의해 항체를 정제함으로써 조제하는 것이 가능하다.

단일클론 항체를 산생하는 하이브리도마는 예를 들면 이하와 같이 해서도 제작할 수 있다. 우선 공지의 방법에 따라 감작 항원을 동물에게 면역한다. 일반적 방법으로서 감작 항원을 포유동물의 복강내 또는 피하에 주사함으로써 행해진다. 구체적으로는 감작 항원을 PBS(Phosphate-Buffered Saline)나 생리식염수 등으로 적당량으로 희석, 현탁한 것에 소망에 의해 통상의 아쥬반트, 예를 들면 프로인트 완전 아쥬반트를 적량 혼합하고, 유화 후 포유동물에게 4∼21일마다 수회 투여한다. 또한, 감작 항원 면역 시에 적당한 담체를 사용할 수도 있다.

이렇게 포유동물을 면역하고, 혈청 중에 소망의 항체 레벨이 상승하는 것을 확인한 후에 포유동물로부터 면역 세포를 채취하여 세포 융합을 행하지만 바람직한 면역 세포로서는 특히 지라 세포를 들 수 있다.

상기 면역 세포와 융합되는 다른쪽의 친세포로서 포유동물의 골수종 세포를 사용한다. 이 골수종 세포는 공지의 여러 가지 세포주, 예를 들면 P3U1(P3-X63Ag8U1), P3(P3x63Ag8.653)(J. Immunol.(1979)123, 1548-1550), P3x63Ag 8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81, 1-7), NS-1(Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.(1976)6, 511-519), MPC-11(Margulies. D.H. et al., Cell (1976)8, 405-415), SP2/0(Shulman, M. et al., Nature(1978)276, 269-270), FO(deSt. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods(1980)35, 1-21), S194(Trowbridge, I.S. J.Exp.Med.(1978)148,313-323), R210(Galfre, G. et al., Nature(1979)277, 131-133) 등이 바람직하게 사용된다.

상기 면역 세포와 골수종 세포의 세포 융합은 기본적으로는 공지의 방법, 예를 들면 쾰러와 밀스타인들의 방법(Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol.(1981)73, 3-46) 등에 준해서 행할 수 있다.

보다 구체적으로는 상기 세포 융합은 예를 들면 세포 융합 촉진제의 존재 하에 통상의 영양 배양액 중에서 실시된다. 융합 촉진제로서는 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이 바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 또한 소망에 의해 융합 효율을 향상시키기 위해서 디메틸술폭시드 등의 보조제를 첨가 사용할 수도 있다.

면역 세포와 골수종 세포의 사용 비율은 임의로 설정할 수 있다. 예를 들면, 골수종 세포에 대하여 면역 세포를 1∼10배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포 융합에 사용하는 배양액으로서는 예를 들면 상기 골수종 세포주의 증식에 바람직한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 그 외에 이 종류의 세포 배양에 사용되는 통상의 배양액이 사용 가능하며, 소태아혈청(FCS) 등의 혈청보액을 더 병용할 수도 있다.

세포 융합은 상기 면역 세포와 골수종 세포의 소정량을 상기 배양액 중에서 잘 혼합하고, 미리 37℃정도로 가온한 PEG 용액(예를 들면, 평균 분자량 1000∼6000정도)을 통상 30∼60%(w/v)의 농도로 첨가하고, 혼합함으로써 목적으로 하는 하이브리도마를 형성한다. 이어서, 적당한 배양액을 차차 첨가하고, 원심해서 상청액을 제거하는 조작을 반복함으로써 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포 융합제 등을 제거한다.

이렇게 해서 얻어진 하이브리도마는 통상의 선택 배양액, 예를 들면 HAT 배양액(하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)으로 배양함으로써 선택된다. 상기 HAT 배양액으로의 배양은 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합 세포)가 사멸하는데에 충분한 시간(통상 수일∼수 주일) 계속한다. 이어서, 통상의 한계 희석법을 실시하여 목적으로 하는 항체를 산생하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일클로닝을 행한다.

또한, 인간 이외의 동물에게 항원을 면역해서 상기 하이브리도마를 얻는 것 이외에 인간 림프구, 예를 들면 EB 바이러스에 감염한 인간 림프구를 인비트로(in vitro)에 의해 단백질, 단백질 발현 세포 또는 그 용해물로 감작하고, 감작 림프구를 인간 유래의 영구 분열능을 갖는 골수종 세포, 예를 들면 U266(등록 번호TIB196)과 융합시켜 소망의 활성(예를 들면, 세포 증식 억제 활성)을 갖는 인간 항체를 산생하는 하이브리도마를 얻을 수도 있다.

이렇게 해서 제작되는 단일클론 항체를 산생하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대 배양하는 것이 가능하며, 또한 액체 질소 중에서 장기 보존하는 것이 가능하다.

즉, 소망의 항원이나 소망의 항원을 발현하는 세포를 감작 항원으로서 사용해서 이것을 통상의 면역 방법에 따라 면역하고, 얻어지는 면역 세포를 통상의 세포 융합법에 의해 공지의 친세포와 융합시키고, 통상의 스크리닝법에 의해 단일클론 항체 산생 세포(하이브리도마)를 스크리닝함으로써 제작할 수 있다.

본 발명에서 사용 가능한 항체의 다른 예가 다중클론 항체이다. 다중클론 항체는 예를 들면 이하와 같이 해서 얻을 수 있다.

천연의 CAPRIN-1 단백질 또는 GST 등과의 융합 단백질로서 대장균 등의 미생물에 있어서 발현시킨 재조합 CAPRIN-1 단백질 또는 그 부분 펩티드를 마우스, 인간 항체 산생 마우스, 토끼 등의 소동물에게 면역하여 혈청을 얻는다. 이것을 예를 들면 황산암모늄 침전, 프로틴A, 프로틴G 칼럼, DEAE 이온 교환 크로마토그래피, CAPRIN-1 단백질이나 합성 펩티드를 커플링한 어피니티 칼럼 등에 의해 정제함으로써 조제한다. 후술의 실시예에서는 CAPRIN-1 단백질의 아미노산 서열 중 암세포의 세포 표면에 발현되는 영역의 일부의 펩티드(서열 번호 37로 나타내어진다)에 대한 토끼 다중클론 항체가 제작되고, 항종양 효과가 확인되어 있다.

여기서 인간 항체 산생 마우스로서는 예를 들면 KM 마우스(기린 파마/Medarex) 및 Xeno 마우스(Amgen)가 알려져 있다(예를 들면, 국제 공개 제WO 02/43478호, 동 제WO 02/092812호 등). 이러한 마우스를 CAPRIN-1 단백질 또는 그 단편으로 면역할 때에는 완전 인간 다중클론 항체를 혈액으로부터 얻을 수 있다. 또한, 면역 후의 마우스로부터 비장 세포를 인출하고, 골수종 세포와의 융합법에 의해 인간형 단일클론 항체를 제작할 수 있다.

항원의 조제는 예를 들면 동물 세포를 사용한 방법(일본 특허 공표 2007-530068)이나 바큘로바이러스를 사용한 방법(예를 들면, 국제 공개 제WO 98/46777호등) 등에 준해서 행할 수 있다. 항원의 면역원성이 낮을 경우에는 알부민 등의 면역원성을 갖는 거대 분자와 결합시켜 면역을 행하면 좋다.

또한, 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하여 적당한 벡터에 넣고, 이것을 숙주에 도입하여 유전자 재조합 기술을 사용해서 산생시킨 유전자 재조합형 항체를 사용할 수 있다(예를 들면, Carl, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 참조). 구체적으로는 하이브리도마의 mRNA로부터 역전사 효소를 사용해서 항체의 가변 영역(V 영역)의 cDNA를 합성한다. 목적으로 하는 항체의 V 영역을 인코딩하는 DNA가 얻어지면 이것을 소망의 항체 정상 영역(C 영역)을 인코딩하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현 벡터에 넣는다. 또는 항체의 V 영역을 인코딩하는 DNA를 항체 C 영역의 DNA를 포함하는 발현 벡터에 넣어도 좋다. 발현 제어 영역, 예를 들면 엔한서(enhancer), 프로모터의 제어 하에서 발현되도록 발현 벡터에 넣는다. 이어서, 이 발현 벡터에 의해 숙주 세포를 형질 전환하여 항체를 발현시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항CAPRIN-1 항체는 단일클론 항체인 것이 바람직하다. 그러나 다중클론 항체, 재조합 항체 또는 유전자 개변 항체(예를 들면, 키메라 항체, 인간화 항체, 단쇄 항체, 이중 특이성 항체 등) 등이어도 좋다.

단일클론 항체에는 인간 단일클론 항체, 비인간 동물 단일클론 항체(예를 들면, 마우스 단일클론 항체, 랫트 단일클론 항체, 토끼 단일클론 항체, 닭 단일클론 항체 등) 등이 포함된다. 단일클론 항체는 CAPRIN-1 단백질을 면역한 비인간 포유동물(예를 들면, 마우스, 인간 항체 산생 마우스 등)로부터의 지라 세포와 골수종 세포의 융합에 의해 얻어진 하이브리도마를 배양함으로써 제작될 수 있다. 후술의 실시예에서는 마우스 단일클론 항체가 제작되고, 항종양 효과가 확인되었다.

이들의 단일클론 항체는 서열 번호 43, 서열 번호 73, 서열 번호 83, 서열 번호 93, 서열 번호 103, 서열 번호 113 또는 서열 번호 123의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변(VH) 영역과, 서열 번호 47, 서열 번호 53, 서열 번호 58, 서열 번호 63, 서열 번호 68, 서열 번호 77, 서열 번호 87, 서열 번호 97, 서열 번호 107, 서열 번호 117 또는 서열 번호 127의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하고, 여기서 상기 VH 영역에 서열 번호 40, 서열 번호 70, 서열 번호 80, 서열 번호 90, 서열 번호 100, 서열 번호 110 또는 서열 번호 120의 아미노산 서열로 나타내어지는 CDR1, 서열 번호 41, 서열 번호 71, 서열 번호 81, 서열 번호 91, 서열 번호 101, 서열 번호 111 또는 서열 번호 121의 아미노산 서열로 나타내어지는 CDR2 및 서열 번호 42, 서열 번호 72, 서열 번호 82, 서열 번호 92, 서열 번호 102, 서열 번호 112 또는 서열 번호 122의 아미노산 서열로 나타내어지는 CDR3이 포함되고, 상기 VL 영역에 서열 번호 44, 서열 번호 50, 서열 번호 55, 서열 번호 60, 서열 번호 65, 서열 번호 74, 서열 번호 84, 서열 번호 94, 서열 번호 104, 서열 번호 114 또는 서열 번호 124의 아미노산 서열로 나타내어지는 CDR1, 서열 번호 45, 서열 번호 51, 서열 번호 56, 서열 번호 61, 서열 번호 66, 서열 번호 75, 서열 번호 85, 서열 번호 95, 서열 번호 105, 서열 번호 115 또는 서열 번호 125의 아미노산 서열로 나타내어지는 CDR2 및 서열 번호 46, 서열 번호 52, 서열 번호 57, 서열 번호 62, 서열 번호 67, 서열 번호 76, 서열 번호 86, 서열 번호 96, 서열 번호 106, 서열 번호 116 또는 서열 번호 126의 아미노산 서열로 나타내어지는 CDR3이 포함된다.

키메라 항체는 다른 동물 유래의 서열을 조합해서 제작되는 항체이며, 예를 들면 마우스 항체의 중쇄, 경쇄의 가변 영역과 인간 항체의 중쇄, 경쇄의 정상 영역으로 이루어지는 항체 등이다. 키메라 항체의 제작은 공지의 방법을 사용해서 행할 수 있고, 예를 들면 항체 V 영역을 인코딩하는 DNA와 인간 항체 C 영역을 인코딩하는 DNA를 연결하고, 이것을 발현 벡터에 넣어서 숙주에 도입하여 산생시킴으로써 얻어진다.

다중클론 항체에는 인간 항체 산생 동물(예를 들면, 마우스)에 CAPRIN-1 단백질을 면역해서 얻어지는 항체가 포함된다.

인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 칭해지는 개변 항체이다. 인간화 항체는 면역 동물 유래의 항체의 CDR을 인간 항체의 상보성 결정 영역에 이식함으로써 구축된다. 그 일반적인 유전자 재조합 방법도 알려져 있다.

구체적으로는 마우스 항체의 CDR과 인간 항체의 프레임워크 영역(framework region; FR)을 연결하도록 설계한 DNA 서열을 말단부에 오버랩하는 부분을 갖도록 제작한 몇 개의 올리고뉴클레오티드로부터 PCR법에 의해 합성한다. 얻어진 DNA를 인간 항체 정상 영역을 인코딩하는 DNA와 연결하고, 이어서 발현 벡터에 넣고, 이것을 숙주에 도입하여 산생시킴으로써 얻어진다(유럽 특허출원 공개 제EP239400호, 국제 공개 제WO 96/02576호 참조). CDR을 통해 연결되는 인간 항체의 FR은 상보성 결정 영역이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라 재구성 인간 항체의 상보성 결정 영역이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 항체의 가변 영역에 있어서의 프레임워크 영역의 아미노산을 치환해도 좋다(Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53:851-856). 또한, 여러 가지 인간 항체 유래의 프레임워크 영역으로 치환해도 좋다(국제 공개 제WO 99/51743호 참조).

CDR을 통해 연결되는 인간 항체의 프레임워크 영역은 상보성 결정 영역이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라 재구성 인간 항체의 상보성 결정 영역이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 항체의 가변 영역에 있어서의 프레임워크 영역의 아미노산을 치환해도 좋다(Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53:851-856).

키메라 항체나 인간화 항체를 제작한 후에 가변 영역(예를 들면, FR)이나 정상 영역 중의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환해도 좋다.

아미노산의 치환은 예를 들면 15 미만, 10 미만, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5이하, 4 이하, 3 이하 또는 2 이하의 아미노산, 바람직하게는 1∼5 아미노산, 보다 바람직하게는 1 또는 2 아미노산의 치환이며, 치환 항체는 미치환 항체와 기능적으로 동등해야 한다. 치환은 보존적 아미노산 치환이 바람직하고, 이것은 전하, 측쇄, 극성, 방향족성 등의 성질이 유사한 아미노산 간의 치환이다. 성질이 유사한 아미노산은 예를 들면 염기성 아미노산(아르기닌, 리진, 히스티딘), 산성 아미노산(아스파르트산, 글루탐산), 무전하 극성 아미노산(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신), 무극성 아미노산(류신, 이소류신, 알라닌, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌), 분기쇄 아미노산(트레오닌, 발린, 이소류신), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 히스티딘) 등으로 분류할 수 있다.

항체는 화학적으로 수식되어 있어도 좋고, 그러한 항체 수식물로서는 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG), 항종양성 화합물(예를 들면, 하기에 예시된 항종양제) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 들 수 있다. 본 발명의 항체 수식물에 있어서는 결합되는 물질은 한정되지 않는다. 이러한 항체 수식물을 얻기 위해서는 얻어진 항체에 화학적인 수식을 실시함으로써 얻을 수 있다. 이들의 방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다.

여기서 「기능적으로 동등」이란 대상이 되는 항체가 본 발명의 항체와 마찬가지의 생물학적 또는 생화학적 활성, 구체적으로는 종양을 장해하는 기능을 갖는 것, 인간으로의 적용 시에 거절 반응을 본질적으로 일으키지 않는 것 등을 가리킨다. 이러한 활성으로서는 예를 들면 세포 증식 억제 활성 또는 결합 활성을 예시할 수 있다.

어떤 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 조제하기 위한 당업자에게 잘 알려진 방법으로서는 폴리펩티드에 변이를 도입하는 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 당업자이면 부위 특이적 변이 유발법(Hashimoto-Gotoh, T. et al.,(1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ., and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W. et al.,(1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer, W. and Fritz, HJ.,(1987) Methods Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA.,(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492, Kunkel(1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) 등을 사용해서 본 발명의 항체에 적당히 변이를 도입함으로써 상기 항체와 기능적으로 동등한 항체를 조제할 수 있다.

상기 항CAPRIN-1 항체가 인식하는 CAPRIN-1 단백질의 에피토프를 인식하는, 즉 상기 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 공지의 방법에 의해 얻을 수 있는 것이 가능하다. 예를 들면, 항CAPRIN-1 항체가 인식하는 CAPRIN-1 단백질의 에피토프를 통상의 방법(예를 들면, 에피토프 맵핑 등)에 의해 결정하고, 상기 에피토프에 포함되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 면역원으로 해서 항체를 제작하는 방법이나 통상의 방법으로 제작된 항체의 에피토프를 결정하고, 항CAPRIN-1 항체와 에피토프가 같은 항체를 선택하는 방법 등에 의해 얻을 수 있다. 여기서 「에피토프」는 포유동물, 바람직하게는 인간에 있어서 항원성 또는 면역원성을 갖는 폴리펩티드 단편을 가리키고, 그 최소 단위는 약 7∼12 아미노산, 바람직하게는 8∼11 아미노산으로 이루어진다.

본 발명에서 사용되는 항체의 친화 정수 Ka(k_on/k_off)는 바람직하게는 적어도 10⁷M^-1, 적어도 10⁸M^-1, 적어도 5×10⁸M^-1, 적어도 10⁹M^-1, 적어도 5×10⁹M^-1, 적어도 10¹⁰M^-1, 적어도 5×10¹⁰M^-1, 적어도 10¹¹M^-1, 적어도 5×10¹¹M^-1, 적어도 10¹²M^-1 또는 적어도 10¹³M^-1이다.

본 발명에서 사용되는 항체는 항종양제와 콘주게이트할 수 있다. 항체와 항종양제의 결합은 아미노기, 카르복실기, 히드록시기, 티올기 등과 반응성의 기(예를 들면, 숙신산 이미딜기, 포르밀기, 2-피리딜디티오기, 말레이미딜기, 알콕시카르보닐기, 히드록시기 등)를 갖는 스페이서를 통해 행할 수 있다.

본 발명에서 사용 가능한 항종양제의 예는 문헌 등에서 공지의 하기의 항종양제, 즉 파클리탁셀, 독소루비신, 다우노루비신, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 티오테파, 부설판, 임프로설판, 피포설판, 벤조도파(benzodopa), 카르보쿠온, 메투레도파(meturedopa), 우레도파(uredopa), 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드(triethilenethiophosphoramide), 트리메틸올로멜라민(trimethylolomelamine), 불라타신, 불라타시논, 캄토세신, 브리오스타틴, 칼리스타틴(callystatin), 크립토피신1, 크립토피신8, 돌라스타틴, 듀오카르마이신, 엘루테로빈, 판크라티스타틴, 사르코딕티인(sarcodictyin), 스폰기스타틴, 클로람부실, 클로나파진(chloRNAphazine), 콜로포스파미드(cholophosphamide), 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민옥시드히드로클로라이드, 멜파란, 노벰비킨(novembichin), 페네스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실 머스타드, 카르무스틴, 클로로조토신(chlorozotocin), 포테무스틴(fotemustine), 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴, 칼리키아미신(calicheamicin), 다이네미신, 클로드로네이트, 에스페라미신, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신(authramycin), 아자세린, 블레오마이신(bleomycin), 칵티노마이신(cactinomycin), 카라비신(carabicin), 카르미노마이신, 카르지노필린(carzinophilin), 크로모마이신(chromomycin), 닥티노마이신, 데토르비신(detorbicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(adriamycin), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신(marcellomycin), 마이토마이신(mitomycin)C, 마이코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycins), 페플로마이신, 포트피로마이신(potfiromycin), 퓨로마이신, 쿠엘라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜베르시딘(tubercidin), 우베니멕스, 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin), 데노프테린(denopterin), 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 플루다라빈(fludarabine), 6-메르캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌, 안시타빈, 아자시티딘(azacitidine), 6-아자우리딘(azauridine), 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈(enocitabine), 플록스우리딘(floxuridine); 안드로겐류, 예를 들면 칼루스테론(calusterone), 프로피온산 드로모스타놀론, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤(testolactone), 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄, 프로린산(frolinic acid), 아세글라톤, 알도포스파미드글리코시드, 아미놀레불린산, 에닐우라실, 암사크린(amsacrine), 베스트라부실(bestrabucil), 비산트렌(bisantrene), 에다트락세이트(edatraxate), 데포파민(defofamine), 데메콜신(demecolcine), 디아지쿠온(diaziquone), 엘포르니틴(elfornithine), 아세트산 엘립티늄(elliptinium), 에포틸론(epothilone), 에토글루시드(etoglucid), 렌티난, 로니다민(lonidamine), 메이탄신(maytansine), 안사미토신(ansamitocine), 미토구아존(mitoguazone), 마이토잔트론, 모피단몰(mopidanmol), 니트라에린(nitraerine), 펜토스타틴, 페나메트(phenamet), 피라루비신, 로속산트론(losoxantrone), 포도필린산(podophyllinic acid), 2-에틸히드라지드, 프로카르바진, 라족산(razoxane), 리족신, 시조필란, 스피로게르마늄(spirogermanium), 테누아존산(tenuazonic acid), 트리아지쿠온(triaziquone), 로리딘(roridine)A, 안구이딘(anguidine), 우레탄, 빈데신, 다카바진, 만노무스틴(mannomustine), 미토브로니톨, 미토락톨(mitolactol), 피포브로만(pipobroman), 가시토신(gacytosine), 도세탁셀, 클로람부실, 겜시타빈(gemcitabine), 6-티오구아닌, 메르캅토푸린, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카르보플라틴, 빈블라스틴, 에폭시드, 이포스파미드, 미톡산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 노반트론(novantrone), 테니포사이드, 에다트렉세이트(edatrexate), 다우노마이신, 아미노프테린, 젤로다(xeloda), 이반드로네이트(ibandronate), 이리노테칸, 토포이소머라제 인히비터, 디플루오로메틸오르니틴(DMFO), 레티노산, 카페시타빈(capecitabine) 및 그들의 약학적으로 허용 가능한 (공지의)염 또는 (공지의)유도체를 포함한다.

또는 본 발명에서 사용되는 항체에는 문헌 등에서 공지의 ²¹¹At, ¹³¹I, ¹²⁵I, ⁹⁰Y, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁵³SM, ²¹²Bi, ³²P, ¹⁷⁵Lu, ¹⁷⁶Lu 등의 방사성 동위체를 결합하는 것도 가능하다. 방사성 동위체는 종양의 치료나 진단을 위해서 유효한 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 항체는 CAPRIN-1과 면역학적 반응성을 갖는 항체, 또는 CAPRIN-1을 특이적으로 인식하는 항체, 또는 CAPRIN-1과 특이적으로 결합하는 항체로서, 암에 대한 세포장해 활성 예를 들면 종양 증식 억제 작용을 나타내는 항체이다. 상기 항체는 그것을 투여하는 대상 동물에 있어서 거절 반응이 거의 또는 전혀 회피되는 구조를 갖는 항체이어야 한다. 그러한 항체로서는 예를 들면 대상 동물이 인간일 경우 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체(예를 들면, 인간-마우스 키메라 항체), 단쇄 항체, 이중 특이성 항체 등을 들 수 있다. 이들의 항체는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 인간 항체 유래의 것이거나 또는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 비인간 동물 항체 유래의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)과 인간 항체 유래의 프레임워크 영역으로 이루어지는 것이거나 또는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 비인간 동물 항체 유래의 것이고, 또한 중쇄 및 경쇄의 정상 영역이 인간 항체 유래가 것인 재조합형 항체이다. 바람직한 항체는 앞의 2개의 항체이다.

이들의 재조합형 항체는 이하와 같이 해서 제작할 수 있다. 하이브리도마 등의 항체 산생 세포로부터 인간 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체(예를 들면, 인간 단일클론 항체, 마우스 단일클론 항체, 랫트 단일클론 항체, 토끼 단일클론 항체, 닭 단일클론 항체 등)를 인코딩하는 DNA를 클로닝하고, 이것을 주형으로 해서 상기 항체의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA를 RT-PCR법 등에 의해 제작하고, Kabat EU numbering system(Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md.(1991))에 의거해서 경쇄 및 중쇄의 각 가변 영역의 서열 또는 각 CDR1, CDR2, CDR3의 서열을 결정한다.

또한, 이들의 각 가변 영역을 인코딩하는 DNA 또는 각 CDR을 인코딩하는 DNA를 유전자 재조합 기술(Sambrook 외, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)) 또는 DNA 합성기를 사용해서 제작한다. 여기서 상기 인간 단일클론 항체 산생 하이브리도마는 인간 항체 산생 동물(예를 들면, 마우스)에 인간 CAPRIN-1을 면역한 후 상기 면역 동물로부터 절제한 지라 세포와 골수종 세포를 융합시킴으로써 제작할 수 있다. 이것과는 별도로 필요에 따라 유전자 재조합 기술 또는 DNA 합성기를 사용해서 인간 항체 유래의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역 및 정상 영역을 인코딩하는 DNA를 제작한다.

인간화 항체의 경우에는 인간 항체 유래의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역을 인코딩하는 DNA 중의 CDR 코딩 서열을 그들에 대응하는 인간 이외의 동물(예를 들면, 마우스, 랫트, 닭 등) 유래의 항체의 CDR 코딩 서열과 치환한 DNA를 제작하고, 그것에 의해서 얻어진 DNA를 각각 인간 항체 유래의 경쇄 또는 중쇄의 정상 영역을 인코딩하는 DNA와 연결함으로써 인간화 항체를 인코딩하는 DNA를 제작할 수 있다.

키메라 항체의 경우에는 인간 이외의 동물(예를 들면, 마우스, 랫트, 닭 등) 유래의 항체의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역을 인코딩하는 DNA를 각각 인간 항체 유래의 경쇄 또는 중쇄의 정상 영역을 인코딩하는 DNA와 연결함으로써 키메라 항체를 인코딩하는 DNA를 제작할 수 있다.

단쇄 항체의 경우에는 이 항체는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 링커를 통해 직선상으로 연결된 항체이며, 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA, 링커를 인코딩하는 DNA 및 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA를 결합함으로써 단쇄 항체를 인코딩하는 DNA를 제작할 수 있다. 여기서 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 모두 인간 항체 유래의 것이거나 또는 CDR만 인간 이외의 동물(예를 들면, 마우스, 랫트, 닭 등) 유래의 항체의 CDR에 의해 치환된 인간 항체 유래의 것이다. 또한, 링커는 12∼19 아미노산으로 이루어지고, 예를 들면 15 아미노산의 (G₄S)₃(G.-B. Kim 외, Protein Engineering Design and Selection 2007, 20(9):425-432)을 들 수 있다.

이중 특이성 항체(diabody)의 경우에는 이 항체는 2개의 다른 에피토프와 특이적으로 결합 가능한 항체이며, 예를 들면 중쇄 가변 영역A를 인코딩하는 DNA, 경쇄 가변 영역B를 인코딩하는 DNA, 중쇄 가변 영역B를 인코딩하는 DNA 및 경쇄 가변 영역A를 인코딩하는 DNA를 이 순서로 결합함으로써(단, 경쇄 가변 영역B를 인코딩하는 DNA와 중쇄 가변 영역B를 인코딩하는 DNA는 상기와 같은 링커를 인코딩하는 DNA를 통해 결합된다) 이중 특이성 항체를 인코딩하는 DNA를 제작할 수 있다. 여기서 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 모두 인간 항체 유래의 것이거나 또는 CDR만 인간 이외의 동물(예를 들면, 마우스, 랫트, 닭 등) 유래의 항체의 CDR에 의해 치환된 인간 항체 유래의 것이다.

상기한 바와 같이 해서 제작된 재조합 DNA를 1개 또는 복수의 적당한 벡터에 넣고, 이것을 숙주 세포(예를 들면, 포유동물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 등)에 도입하고, (동시)발현시킴으로써 재조합형 항체를 제작할 수 있다(P.J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; J.W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS).

상기의 방법에 의해 제작되는 본 발명의 항체는 예를 들면 이하의 (a)∼(k)의 항체를 들 수 있다.

(a) 서열 번호 40, 41 및 42를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1∼CDR3과, 서열 번호 44, 45 및 46을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1∼CDR3을 포함하는 항체(바람직하게는 서열 번호 43의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 47의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).

(b) 서열 번호 40, 41 및 42를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1∼CDR3과, 서열 번호 50, 51 및 52를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1∼CDR3을 포함하는 항체(바람직하게는 서열 번호 43의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 53의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).

(c) 서열 번호 40, 41 및 42를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1∼CDR3과, 서열 번호 55, 56 및 57을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1∼CDR3을 포함하는 항체(바람직하게는 서열 번호 43의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 58의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).

(d) 서열 번호 40, 41 및 42를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1∼CDR3과, 서열 번호 60, 61 및 62를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1∼CDR3을 포함하는 항체(바람직하게는 서열 번호 43의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 63의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).

(e) 서열 번호 40, 41 및 42를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1∼CDR3과, 서열 번호 65, 66 및 67을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1∼CDR3을 포함하는 항체(바람직하게는 서열 번호 43의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 68의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).

(f) 서열 번호 70, 71 및 72를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1∼CDR3과, 서열 번호 74, 75 및 76을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1∼CDR3을 포함하는 항체(바람직하게는 서열 번호 73의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 77의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).

(g) 서열 번호 80, 81 및 82를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1∼CDR3과, 서열 번호 84, 85 및 86을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1∼CDR3을 포함하는 항체(바람직하게는 서열 번호 83의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 87의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).

(h) 서열 번호 90, 91 및 92를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1∼CDR3과, 서열 번호 94, 95 및 96을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1∼CDR3을 포함하는 항체(예를 들면, 서열 번호 93의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 97의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).

(i) 서열 번호 100, 101 및 102를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1∼CDR3과, 서열 번호 104, 105 및 106을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1∼CDR3을 포함하는 항체(예를 들면, 서열 번호 103의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 107의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).

(j) 서열 번호 110, 111 및 112를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1∼CDR3과, 서열 번호 114, 115 및 116을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1∼CDR3을 포함하는 항체(예를 들면, 서열 번호 113의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 117의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).

(k) 서열 번호 120, 121 및 122를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1∼CDR3과, 서열 번호 124, 125 및 126을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1∼CDR3을 포함하는 항체(예를 들면, 서열 번호 123의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 127의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).

여기서 서열 번호 40, 41 및 42, 서열 번호 70, 71 및 72, 서열 번호 80, 81 및 82, 서열 번호 90, 91 및 92, 서열 번호 100, 101 및 102, 서열 번호 110, 111 및 112, 서열 번호 120, 121 및 122에 나타내는 아미노산 서열은 각각 마우스 항체 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3이며, 또한 서열 번호 44, 45 및 46, 서열 번호 50, 51 및 52, 서열 번호 55, 56 및 57, 서열 번호 60, 61 및 62, 서열 번호 65, 66 및 67, 서열 번호 74, 75 및 76, 서열 번호 84, 85 및 86, 서열 번호 94, 95 및 96, 서열 번호 104, 105 및 106, 서열 번호 114, 115 및 116, 서열 번호 124, 125 및 126에 나타내는 아미노산 서열은 각각 마우스 항체 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3이다. 또한, 본 발명의 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 이중 특이성 항체는 예를 들면 이하의 항체이다(항체(a)에서 예시한다).

(ⅰ) 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 40, 41 및 42의 아미노산 서열 및 인간 항체 유래의 프레임워크 영역의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 경쇄의 가변 영역이 서열 번호 44, 45 및 46의 아미노산 서열 및 인간 항체 유래의 프레임워크 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항체(예를 들면, 중쇄 가변 영역에 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 경쇄 가변 영역에 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 항체).

(ⅱ) 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 40, 41 및 42의 아미노산 서열 및 인간 항체 유래의 프레임워크 영역의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 중쇄의 정상 영역이 인간 항체 유래의 아미노산 서열을 포함하고, 및 경쇄의 가변 영역이 서열 번호 44, 45 및 46의 아미노산 서열 및 인간 항체 유래의 프레임워크 영역의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 경쇄의 정상 영역이 인간 항체 유래의 아미노산 서열을 포함해서 이루어지는 항체(예를 들면, 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 중쇄의 정상 영역이 인간 항체 유래의 아미노산 서열을 포함하고, 및 경쇄의 가변 영역이 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 경쇄의 정상 영역이 인간 항체 유래의 아미노산 서열을 포함해서 이루어지는 항체).

또한, 인간 항체 중쇄 및 경쇄의 정상 영역 및 가변 영역의 서열은 예를 들면 NCBI(미국: GenBank, UniGene 등)로부터 입수 가능하며, 예를 들면 인간 IgG1 중쇄 정상 영역에 대해서는 등록 번호 J00228, 인간 IgG2 중쇄 정상 영역에 대해서는 등록 번호 J00230, 인간 IgG3 중쇄 정상 영역에 대해서는 등록 번호 X03604, 인간 IgG4 중쇄 정상 영역에 대해서는 등록 번호 K01316, 인간 경쇄 κ 정상 영역에 대해서는 등록 번호 V00557, X64135, X64133 등, 인간 경쇄 λ 정상 영역에 대해서는 등록 번호 X64132, X64134 등의 서열을 참조할 수 있다.

상기 항체는 바람직하게는 세포장해 활성을 갖고 있고, 이것에 의해 항종양 효과를 발휘할 수 있다.

또한, 상기 항체에 있어서의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이나 CDR의 특정 서열은 단지 예시를 목적으로 한 것이며, 특정 서열에 한정되지 않는 것은 명확하다. 인간 CAPRIN-1에 대한 다른 인간 항체 또는 비인간 동물 항체(예를 들면, 마우스 항체)를 산생할 수 있는 하이브리도마를 제작하고, 하이브리도마가 산생하는 단일클론 항체를 회수하여 인간 CAPRIN-1과의 면역학적 결합성 및 세포장해 활성을 지표로서 목적의 항체인지의 여부를 판정한다. 그것에 의해 목적의 단일클론 항체 산생 하이브리도마를 식별한 후 상기한 바와 같이 상기 하이브리도마로부터 목적의 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 인코딩하는 DNA를 제작하여 서열 결정하고, 상기 DNA를 다른 항체의 제작을 위해서 이용한다.

또한, 본 발명의 상기 항체는 CAPRIN-1을 특이적으로 인식한다는 특이성을 갖는 한 상기 (ⅰ)∼(ⅳ)의 각 항체의 특히 프레임워크 영역의 서열 및/또는 정상 영역의 서열에 있어서 1 또는 몇 개(바람직하게는 1 또는 2개)의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가가 있어도 좋다. 여기서 몇 개란 2∼5개, 바람직하게는 2개 또는 3개를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 항체는 본 발명의 상기 항체를 인코딩하는 DNA, 또는 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄를 인코딩하는 DNA, 또는 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역을 인코딩하는 DNA를 이용해서 유전자 재조합 기술에 의해 더 제조할 수도 있다. 그러한 DNA는 예를 들면 항체(a)의 경우 서열 번호 40, 41 및 42의 아미노산 서열을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA, 서열 번호 44, 45 및 46의 아미노산 서열을 인코딩하는 염기 서열 포함하는 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA 등을 포함한다.

이들의 서열의 DNA에 의해 인코딩되는 상보성 결정 영역(CDR)은 항체의 특이성을 결정하는 영역이기 때문에 항체의 그 이외의 영역(즉, 정상 영역 및 프레임워크 영역)을 인코딩하는 서열은 다른 항체 유래의 서열이어도 좋다. 여기서 다른 항체란 인간 이외의 생물 유래의 항체도 포함하지만 부작용 저감의 관점으로부터는 인간 유래의 것이 바람직하다. 즉, 상기의 DNA에서는 중쇄 및 경쇄의 각 프레임워크 영역 및 각 정상 영역을 인코딩하는 영역이 인간 항체 유래의 대응 아미노산 서열을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서 사용되는 항체를 인코딩하는 DNA의 다른 예는 예를 들면 항체(a)의 경우 서열 번호 43의 아미노산 서열을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA, 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 영역이 서열 번호 47의 아미노산 서열을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 DNA 등이다. 여기서 서열 번호 43의 아미노산 서열을 인코딩하는 염기 서열의 예는 서열 번호 48의 염기 서열이다. 또한, 서열 번호 47의 아미노산 서열을 인코딩하는 염기 서열의 예는 서열 번호 49의 염기 서열이다. 이들의 DNA에서도 중쇄 및 경쇄의 각 정상 영역을 인코딩하는 영역이 인간 항체 유래의 대응 아미노산 서열을 인코딩하는 염기 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

상술의 DNA는 예를 들면 상기의 방법 또는 이하의 방법에 의해 얻을 수 있다. 우선 본 발명의 항체에 관한 하이브리도마로부터 시판된 RNA 추출 키트를 사용해서 전체 RNA를 조제하고, 랜덤 프라이머 등을 사용해서 역전사 효소에 의해 cDNA를 합성한다. 이어서, 기지의 마우스 항체 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자의 각 가변 영역에 있어서 각각 보존되어 있는 서열의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용한 PCR법에 의해 항체를 인코딩하는 cDNA를 증폭시킨다. 정상 영역을 인코딩하는 서열에 대해서는 기지의 서열을 PCR법으로 증폭함으로써 얻을 수 있다. DNA의 염기 서열은 서열 결정용 플러스미드 또는 파지에 넣거나 해서 상법에 의해 결정할 수 있다.

상기 항체(a)∼(k)에 관한 DNA의 구체예는 이하와 같다.

(ⅰ) 서열 번호 43, 서열 번호 73, 서열 번호 83, 서열 번호 93, 서열 번호 103, 서열 번호 113, 서열 번호 123, 서열 번호 133, 서열 번호 143 또는 서열 번호 153의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA로서 서열 번호 48, 서열 번호 78, 서열 번호 88, 서열 번호 98, 서열 번호 108, 서열 번호 118 또는 서열 번호 128의 염기 서열을 포함하는 DNA.

(ⅱ) 서열 번호 47, 서열 번호 53, 서열 번호 58, 서열 번호 63, 서열 번호 68, 서열 번호 77, 서열 번호 87, 서열 번호 97, 서열 번호 107, 서열 번호 117, 서열 번호 127, 서열 번호 137, 서열 번호 147 또는 서열 번호 157의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA로서 서열 번호 49, 서열 번호 54, 서열 번호 59, 서열 번호 64, 서열 번호 69, 서열 번호 79, 서열 번호 89, 서열 번호 99, 서열 번호 109, 서열 번호 119 또는 서열 번호 129의 염기 서열을 포함하는 DNA.

본 발명에서 사용되는 항CAPRIN-1 항체에 의한 CAPRIN-1 발현 암세포에 대한 항종양 효과는 이하의 기서에 의해 일어나는 것으로 고려된다.

CAPRIN-1 발현 세포의 이펙터 세포 항체 의존적 세포장해성(ADCC) 및 CAPRIN-1 발현 세포의 보체 의존적 세포장해성(CDC).

따라서, 본 발명에서 사용되는 항CAPRIN-1 항체의 활성 평가는 이하 실시예에 구체적으로 나타내어지는 바와 같이 생체 외에서 CAPRIN-1 단백질을 발현하는 암세포에 대하여 상기 ADCC 활성 또는 CDC 활성을 측정함으로써 평가할 수 있다.

ADCC 활성의 측정은 예를 들면 Cytotoxicity Detection Kit(Roche) 등의 세포장해 활성 측정용의 시판된 키트를 사용해서 행할 수 있다. 이 방법에 의하면 표적 암세포와 항CAPRIN-1 항체를 빙상에서 반응시킨 후 이펙터 세포(예를 들면, PBMC)와 함께 4시간 배양하고, 배양 상청액에 대해서 배지로 방출된 락트산 데히드로게나아제(LDH) 효소 활성 또는 Cr51 방사 활성을 측정하는 것을 포함하는 순서에 의해 행할 수 있다. 또한, CDC 활성의 측정은 표적 암세포와 항CAPRIN-1 항체를 빙상에서 반응시킨 후 보체 용액(예를 들면, 혈청)과 함께 4시간 배양하고, 배양 상청액에 대해서 상기와 마찬가지의 효소 활성 또는 방사 활성을 측정하는 것을 포함하는 순서에 의해 행할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항CAPRIN-1 항체는 암세포상의 CAPRIN-1 단백질과 결합하고, 상기 활성에 의해 항종양 작용을 나타내는 점에서 암의 치료 또는 예방에 유용한 것으로 고려된다. 즉, 본 발명은 항CAPRIN-1 항체를 유효 성분으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물을 제공한다. 항CAPRIN-1 항체를 인체에 투여할 목적(항체 치료)으로 사용할 경우에는 면역원성을 저하시키기 위해서 인간 항체나 인간화 항체로 하는 것이 바람직하다.

또한, 항CAPRIN-1 항체와 암세포 표면상의 CAPRIN-1 단백질의 결합 친화성이 높을수록 항CAPRIN-1 항체에 의한 보다 강한 항종양 활성이 얻어진다. 따라서, CAPRIN-1 단백질과 높은 결합 친화성을 갖는 항CAPRIN-1 항체를 획득할 수 있으면 보다 강한 항종양 효과를 기대할 수 있고, 암의 치료 및/또는 예방을 목적으로 한 의약 조성물로서 적응하는 것이 가능해진다. 높은 결합 친화성으로서 상술한 바와 같이 결합 정수(친화 정수) Ka(k_on/k_off)가 바람직하게는 적어도 10⁷M^-1, 적어도 10⁸M^-1, 적어도 5×10⁸M^-1, 적어도 10⁹M^-1, 적어도 5×10⁹M^-1, 적어도 10¹⁰M^-1, 적어도 5×10¹⁰M^-1, 적어도 10¹¹M^-1, 적어도 5×10¹¹M^-1, 적어도 10¹²M^-1 또는 적어도 10¹³M^-1인 것이 바람직하다.

<항원 발현 세포에의 결합>

항체가 CAPRIN-1 단백질에 결합하는 능력은 실시예에서 설명되는, 예를 들면 ELISA, 웨스턴 블로팅법, 면역 형광 및 플로사이토메트리 분석 등을 사용한 결합 측정법을 이용해서 특정할 수 있다.

<면역 조직 화학 염색>

CAPRIN-1 단백질을 인식하는 항체는 당업자에게 주지의 방법으로의 면역 조직 화학에 의해 외과 수술 동안에 환자로부터 얻은 조직이나 자연히 또는 트랜스펙션 후에 CAPRIN-1을 발현하는 세포계를 접종한 이종이식 조직을 담지하는 동물로부터 얻은 조직으로부터 파라포름알데히드 또는 아세톤 고정한 동결 절편 또는 파라포름알데히드로 고정한 파라핀 포매한 조직 절편을 사용해서 CAPRIN-1과의 반응성에 관해서 시험할 수 있다.

면역 조직 화학 염색을 위해서 CAPRIN-1에 대하여 반응성이 있는 항체를 여러 가지 방법으로 염색시킬 수 있다. 예를 들면, 호스래디쉬 퍼록시다아제 복합 염소 항마우스 항체나 염소 항토끼 항체를 반응시킴으로써 가시화할 수 있다.

<항종양제>

본 발명은 항CAPRIN-1 항체와 상기에서 예시한 항종양제를 조합시키는 것을 특징으로 한다. 항CAPRIN-1 항체와 항종양제는 각각 항종양 활성을 갖지만 이들을 조합해서 암 환자에게 투여함으로써 실시예에서 나타내어지는 바와 같이 상승적으로 현저한 항종양 효과, 즉 담암 동물 모델에 있어서 종양을 거의 완전히 퇴축시키는 효과가 얻어진다. 이러한 각별한 항종양 효과는 종양의 증식이 경시적으로 점증하는 것 같은 항CAPRIN-1 항체 및 항종양제이어도 그들을 병용할 때에 확인되는 점에서 매우 놀라운 것이다.

본 발명에 있어서 항CAPRIN-1 항체와 조합해서 사용되는 항종양제는 각종 암이나 종양의 치료에 사용되고 있는, 사용된, 또는 사용될 것인 화학요법제 전체를 포함한다. 그러한 항종양제는 대사길항약, 항생 물질 항암제, 식물 알칼로이드계 항암제, 토포이소메라아제 조해제, 항종양 알킬화제 등이며, 예를 들면 문헌 등에서 공지의 상기 예시의 항종양제의 모두가 포함된다. 비한정적인 구체적인 예로서 후술의 실시예에서 사용된 항종양제, 즉 시클로포스파미드, 파클리탁셀, 도세탁셀, 비노렐빈등의 항암제를 들 수 있고, 이들의 현저한 항종양 효과가 확인되고 있다. 그 때문에 본 발명에 있어서는 시클로포스파미드, 파클리탁셀, 도세탁셀 및 비노렐빈 및 그들의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 유도체로부터 선택되는 1종류 또는 2종류 이상을 항종양제로서 사용할 수 있다.

<암의 치료 및/또는 예방용의 의약품>

본 발명의 암의 치료 및/또는 예방용 의약품 표적은 CAPRIN-1 유전자가 발현되는 암(세포)이면 특별히 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 「종양」 및 「암」이라는 용어는 악성 신생물을 의미하고, 호환적으로 사용된다.

본 발명의 의약품은 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 프래그먼트와, 1종류 또는 2종류 이상의 항종양제를 함께 또는 각각 조합해서 포함하는 것을 특징으로 한다. 즉, 이들의 유효 성분을 함께 조합시킬 경우 상기 항체 또는 그 프래그먼트와 상기 항종양제를 담체(또는 부형제) 중에 함께 혼합해서 제제화하여 의약 조성물로 할 수 있다. 한편, 이들의 유효 성분을 각각 조합시킬 경우 상기 항체 또는 그 프래그먼트를 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물과, 상기 항종양제를 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물을 별개로 제제화한 후 제약 키트 형태의 의약품으로 할 수 있다. 의약 조성물 및 제약 키트에 대해서는 이하에서 구체적으로 설명된다.

본 발명에 있어서 대상이 되는 암으로서는 서열 번호 2∼30 중 짝수의 서열 번호의 아미노산 서열을 갖는 CAPRIN-1 단백질을 인코딩하는 유전자를 발현하고 있는 암이며, 바람직하게는 유방암, 뇌종양, 백혈병, 폐암, 림프종, 비만 세포종, 신장암, 자궁경부암, 방광암, 식도암, 위암 및 대장암이다.

이들의 특정 암에는 예를 들면 유선암, 복합형 유선암, 유선 악성 혼합 종양, 유관내 유두상선암, 폐선암, 편평상피암, 소세포암, 대세포암, 신경상피조직성 종양인 신경교종, 뇌실상의종, 신경세포성 종양, 태아형의 신경외 배엽성 종양, 신경초종, 신경섬유종, 수막종, 만성형 림프구성 백혈병, 림프종, 소화관형 림프종, 소화기형 림프종, 소∼중 세포형 림프종, 맹장암, 상행 결장암, 하행 결장암, 횡행 결장암, S상 결장암, 직장암 등이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다.

또한, 대상이 되는 피험자는 포유동물이며, 예를 들면 영장류, 애완 동물, 가축류, 경기용 동물 등을 포함하는 포유동물이며, 특히 인간, 개 및 고양이가 바람직하다.

<의약 조성물>

본 발명의 암의 치료 및/또는 예방용 의약품을 구성하는 유효 성분, 즉 상기 항체 또는 그 프래그먼트 및 상기 항종양제는 그들을 함께 혼합한 의약 조성물 또는 그들의 별개의 의약 조성물로서 당업자에게 공지의 방법으로 제제화하는 것이 가능하다.

예를 들면, 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 액의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약리학상 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는 멸균수나 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비이클, 방부제, 결합제 등과 적당히 조합시켜 일반적으로 확인된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화함으로써 제제화하는 것이 고려된다. 또한, 본 발명의 의약 조성물에는 약리학상 허용되는 염을 포함하는 것도 가능하다. 약리학상 허용 가능한 염으로서는 예를 들면 염산 또는 인산 등의 무기산, 또는 아세트산, 주석산, 만델산 등의 유기산을 사용할 수 있다. 또한, 유기 카르복실기와 형성되는 염을 사용할 수 있고, 예를 들면 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 2가의 철의 수산화물 등의 무기염기 및 이소프로필아민, 트리메틸 아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인 등의 유기염기로부터 유도할 수도 있다.

주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비이클을 사용해서 통상의 제제 실시에 따라 처방할 수 있다.

주사용의 수용액으로서는 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 그 밖의 보조 약을 포함하는 등장액, 예를 들면 D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 염화나트륨을 들 수 있고, 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리 알코올, 예를 들면 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트80(TM), HCO-60과 병용해도 좋다.

유성액으로서는 참기름, 대두유를 들 수 있고, 용해 보조제로서 벤조산 벤질, 벤질알코올과 병용해도 좋다. 또한, 완충제, 예를 들면 인산염 완충액, 아세트산 나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면 염산 프로카인, 안정제, 예를 들면 벤질알코올, 페놀, 산화 방지제와 배합해도 좋다. 조제된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전시킨다.

투여는 경구 또는 비경구이며, 비경구 투여로서는 주사제형, 경비 투여제형, 경폐 투여제형, 경피 투여형 등을 들 수 있다. 주사제형의 예로서는 예를 들면 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다. 또한, 비경구 투여의 경우 시간을 들인 천천히 한 인퓨전 투여가 가능하다. 또한, 환자의 연령, 체중, 성별, 증상 등에 따라 적당히 투여 방법을 선택할 수 있다. 항체를 함유하는 의약 조성물에 대해서는 비경구 투여가 바람직하지만, 한편 항종양제를 함유하는 의약 조성물에 대해서는 항종양제의 종류나 적응증에 따라 경구 투여 또는 비경구 투여 중 어느 하나가 선택된다.

본 발명의 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물에 있어서 상기 항체의 투여량으로서는 예를 들면 1회에 대해서 체중 1㎏당 0.0001㎎∼1000㎎의 범위에서 선택하는 것이 가능하다. 또는 예를 들면 환자당 0.001∼100000㎎/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있지만 이들의 수치에 반드시 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 항종양제의 투여량으로서는 예를 들면 환자당 1∼1000㎎/body, 바람직하게는 10∼500㎎/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있지만 이들의 수치에 반드시 제한되는 것은 아니다. 또한, 투여량, 투여 방법은 환자의 체중, 연령, 성별, 증상 등에 따라 변동하지만 당업자이면 적당히 선택하는 것이 가능하다.

<투여 방법>

본 발명의 암의 치료 및/또는 예방제에 의한 암의 치료 및/또는 예방은 상기의 의약 조성물로서 투여하는 것 이외에 여러 가지 형식을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 암의 치료 및/또는 예방제의 각 유효 성분은 동시에 또는 순서에 따라 개별로 투여할 수 있다. 구체예로서 약 3주일까지의 시간 간격 내에서 즉 1번째의 유효 성분을 투여한 직후로부터 약 3주일까지 2번째의 유효 성분을 투여할 수 있다. 그 때 외과적 처치에 계속해서 실시해도 1번째의 약제와 2번째의 약제의 투여 간에 외과적 처치를 실시해도 좋다. 또한, 본 발명의 암의 치료 및/또는 예방제를 복수의 투여 사이클에 따라 투여해도 좋다. 예를 들면, 본 발명의 암의 치료 및/또는 예방제의 각 유효 성분의 동시 투여를 실시했을 경우 양쪽의 유효 성분을 포함하는 의약 조성물을 약 2일∼약 3주일을 1사이클로 해서 투여한다. 그 후에는 상기 치료 사이클을 담당하는 의사의 판단에 따라 필요에 따라서 반복하는 것도 가능하다. 마찬가지로 순서에 따른 처방을 계획할 경우 각각의 약제의 투여 기간이 동일한 기간에 미치도록 조절한다. 사이클간의 간격은 0∼2개월까지 바꿀 수 있다. 본 발명의 암의 치료 및/또는 예방제의 각 유효 성분의 투여량은 의약 조성물에서의 각 유효 성분의 투여량과 마찬가지로 설정할 수 있다.

<제약 키트>

본 발명의 암의 치료 및/또는 예방용의 의약품은 제약 키트의 형태이어도 좋다. 제약 키트란 암을 치료 또는 예방하는 방법에 있어서 유효 성분인 상기 항CAPRIN-1 항체 또는 그 프래그먼트 및 상기 항종양제를 별개의 의약 조성물의 형태로 사용하기 위한 패키지이며, 상기 패키지에는 각 유효 성분을 투여하기 위한 지시서가 포함된다. 제약 키트에 포함되는 암의 치료 및/또는 예방용의 상기 의약 조성물의 각 유효 성분은 각 유효 성분을 함께 또는 각각 투여할수 있도록 각각 상기한 바와 같이 제제화된 의약 조성물의 형태일 수 있다. 또한, 제약 키트에는 각 유효 성분을 상기 투여 방법에 따라 투여할 수 있도록 1개 또는 복수회의 용량에 충분한 양의 유효 성분이 포함된다.

위에서 구체적으로 설명한 내용에 의거하여 본 발명은 본 발명의 상기 의약품을 암을 갖는고 의심되는(암을 갖는 것을 포함한다) 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 방법을 더 제공한다. 또한, 그 실시형태에 있어서 상기 의약품에 포함되는 항체 또는 그 프래그먼트 및 항종양제는 동시에 또는 각각 상기 피험자에게 투여된다.

실시예

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하지만 본 발명의 범위는 이들의 구체예에 의해 제한되지 않는 것으로 한다.

실시예 1 SEREX법에 의한 신규 암 항원 단백의 동정

(1) cDNA 라이브러리의 제작

건강한 개의 정소 조직으로부터 산 구아니디움-페놀-클로로포름법(Acid guanidium-Phenol-Chloroform법)에 의해 전체 RNA를 추출하고, Oligotex-dT30 mRNA purification Kit(타카라슈조사제)를 사용해서 키트 첨부의 프로토콜에 따라 폴리A RNA를 정제했다.

이 얻어진 mRNA(5㎍)를 사용해서 개 정소 cDNA 파지 라이브러리를 합성했다. cDNA 파지 라이브러리의 제작에는 cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Clonig Kit(STRATAGENE사제)를 사용하여 키트 첨부의 프로토콜에 따라 라이브러리를 제작했다. 제작한 cDNA 파지 라이브러리의 사이즈는 7.73×10⁵pfu/㎖이었다.

(2) 혈청에 의한 cDNA 라이브러리의 스크리닝

상기 제작한 개 정소 cDNA 파지 라이브러리를 사용해서 면역 스크리닝을 행했다. 구체적으로는 Φ90×15㎜의 NZY 아가로스 플레이트에 2210클론이 되도록 숙주 대장균(XL1-Blue MRF')에 감염시키고, 42℃에서 3∼4시간 배양하여 용균반(플라크)을 만들게 하고, IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토시드)를 침투시킨 니트로 셀룰로오스 멤브레인(Hybond C Extra: GE Healthcare Bio-Scinece사제)으로 플레이트를 37℃에서 4시간 덮음으로써 단백질을 유도·발현시켜 멤브레인에 단백질을 전사했다. 그 후 멤브레인을 회수하여 0.5% 탈지 분유를 포함하는 TBS(10mM Tris-HCl, 150mM NaCl pH7.5)에 침지하고 4℃에서 밤새 진탕함으로써 비특이 반응을 억제했다. 이 필터를 500배 희석한 환견 혈청과 실온에서 2∼3시간 반응시켰다.

상기 환견 혈청으로서는 유방암의 환견으로부터 채취한 혈청을 사용했다. 이들의 혈청은 -80℃에서 보존하고, 사용 직전에 전처리를 행했다. 혈청 전처리 방법은 이하의 방법에 의한다. 즉, 외래 유전자를 삽입하고 있지 않은 λ ZAP Express 파지를 숙주 대장균(XL1-Blure MRF')에 감염시킨 후 NZY 플레이트 배지 상에서 37℃, 밤새 배양했다. 이어서, 0.5M NaCl을 포함하는 0.2M NaHCO₃ pH8.3의 버퍼를 플레이트에 첨가하고, 4℃에서 15시간 정치 후 상청액을 대장균/파지 추출액으로서 회수했다. 이어서, 회수한 대장균/파지 추출액을 NHS-칼럼(GE Healthcare Bio-Science사제)에 통액해서 대장균·파지 유래의 단백질을 고정화했다. 이 단백 고정화 칼럼에 환견 혈청을 통액·반응시키고, 대장균 및 파지에 흡착하는 항체를 혈청으로부터 제거했다. 칼럼을 그대로 지나친 혈청 획분은 0.5% 탈지 분유를 포함하는 TBS로 500배 희석하고, 이것을 면역 스크리닝 재료로 했다.

이러한 처리 혈청과 상기 융합 단백질을 블롯팅한 멤브레인을 TBS-T(0.05% Tween20/TBS)로 4회 세정을 행한 후 2차 항체로서 0.5% 탈지 분유를 포함하는 TBS로 5000배 희석을 행한 염소 항견 IgG(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated: BETHYL Laboratories사제)를 실온에서 1시간 반응시키고, NBT/BCIP 반응액(Roche사제)을 사용한 효소 발색 반응에 의해 검출하고, 발색 반응 양성 부위에 일치하는 콜로니를 Φ90×15㎜의 NZY 아가로스 플레이트상에서 채취하고, SM 완충액(100mM NaCl, 10mM MgClSO₄, 50mM Tris-HCl, 0.01% 젤라틴 pH7.5) 500㎕에 용해시켰다. 발색 반응 양성 콜로니가 단일화될 때까지 상기와 마찬가지의 방법으로 2차, 3차 스크리닝을 반복하고, 혈청 중의 IgG와 반응하는 30940개의 파지 클론을 스크리닝해서 5개의 양성 클론을 단리했다.

(3) 단리 항원 유전자의 상동성 검색

상기 방법에 의해 단리한 5개의 양성 클론을 염기 서열 해석에 제공하기 위해서 파지 벡터로부터 플러스미드 벡터로 전환하는 조작을 행했다. 구체적으로는 숙주 대장균(XL1-Blue MRF')을 흡광도 OD₆₀₀이 1.0이 되도록 조제한 용액 200㎕와, 정제한 파지 용액 250㎕, 또한 ExAssist helper phage(STRATAGENE사제) 1㎕를 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응 후 LB 배지를 3㎖ 첨가하여 37℃에서 2.5∼3시간 배양을 행하고, 즉시 70℃의 수욕으로 20분간 보온한 후 4℃, 1000×g, 15분간 원심 분리를 행하고, 상청액을 파지미드 용액으로서 회수했다. 이어서, 파지미드 숙주 대장균(SOLR)을 흡광도 OD₆₀₀이 1.0이 되도록 조제한 용액 200㎕와 정제한 파지 용액 10㎕를 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응시키고, 50㎕를 암피실린(최종 농도 50㎍/㎖) 함유 LB 한천 배지에 뿌려 37℃ 밤새 배양했다. 변형한 SOLR의 싱글 콜로니를 채취하고, 암피실린(최종 농도 50㎍/㎖) 함유 LB 배지 37℃에서 배양 후 QIAGEN plasmid Miniprep Kit(퀴아젠사제)를 사용해서 목적의 인서트를 갖는 플러스미드 DNA를 정제했다.

정제한 플러스미드는 서열 번호 31에 기재된 T3 프라이머와 서열 번호 32에 기재된 T7 프라이머를 사용해서 프라이머 워킹법에 의한 인서트 전체 길이 서열의 해석을 행했다. 이 시퀀스 해석에 의해 서열 번호 5, 7, 9, 11, 13에 기재된 유전자 서열을 취득했다. 이 유전자의 염기 서열 및 아미노산 서열(서열 번호 6, 8, 10, 12, 14)을 사용해서 상동성 검색 프로그램 BLAST 서치(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 행하여 기지 유전자와의 상동성 검색을 행한 결과 얻어진 5개의 유전자 모두가 CAPRIN-1을 인코딩하는 유전자인 것이 밝혀졌다. 5개의 유전자 간의 서열 동일성은 단백질로 번역되는 영역에 있어서 염기 서열 100%, 아미노산 서열 99%이었다. 이 유전자의 인간 상동 인자를 인코딩하는 유전자와의 서열 동일성은 단백질로 번역되는 영역에 있어서 염기 서열 94%, 아미노산 서열 98%이었다. 인간 상동 인자의 염기 서열을 서열 번호 1, 3에, 아미노산 서열을 서열 번호 2, 4에 나타낸다. 또한, 취득한 개 유전자의 소 상동 인자를 인코딩하는 유전자와의 서열 동일성은 단백질로 번역되는 영역에 있어서 염기 서열 94%, 아미노산 서열 97%이었다. 소 상동 인자의 염기 서열을 서열 번호 15에, 아미노산 서열을 서열 번호 16에 나타낸다. 또한, 인간 상동 인자를 인코딩하는 유전자와 소 상동 인자를 인코딩하는 유전자의 서열 동일성은 단백질로 번역되는 영역에 있어서 염기 서열 94%, 아미노산 서열 93∼97%이었다. 또한, 취득한 개 유전자의 말 상동 인자를 인코딩하는 유전자와의 서열 동일성은 단백질로 번역되는 영역에 있어서 염기 서열 93%, 아미노산 서열 97%이었다. 말 상동 인자의 염기 서열을 서열 번호 17에, 아미노산 서열을 서열 번호 18에 나타낸다. 또한, 인간 상동 인자를 인코딩하는 유전자와 말 상동 인자를 인코딩하는 유전자의 서열 동일성은 단백질로 번역되는 영역에 있어서 염기 서열 93%, 아미노산 서열 96%이었다. 또한, 취득한 개 유전자의 마우스 상동 인자를 인코딩하는 유전자와의 서열 동일성은 단백질로 번역되는 영역에 있어서 염기 서열 87∼89%, 아미노산 서열 95∼97%이었다. 마우스 상동 인자의 염기 서열을 서열 번호 19, 21, 23, 25, 27에, 아미노산 서열을 서열 번호 20, 22, 24, 26, 28에 나타낸다. 또한, 인간 상동 인자를 인코딩하는 유전자와 마우스 상동 인자를 인코딩하는 유전자의 서열 동일성은 단백질로 번역되는 영역에 있어서 염기 서열 89∼91%, 아미노산 서열 95∼96%이었다. 또한, 취득한 개 유전자의 닭 상동 인자를 인코딩하는 유전자와의 서열 동일성은 단백질로 번역되는 영역에 있어서 염기 서열 82%, 아미노산 서열 87%이었다. 닭 상동 인자의 염기 서열을 서열 번호 29에, 아미노산 서열을 서열 번호 30에 나타낸다. 또한, 인간 상동 인자를 인코딩하는 유전자와 닭 상동 인자를 인코딩하는 유전자의 서열 동일성은 단백질로 번역되는 영역에 있어서 염기 서열 81∼82%, 아미노산 서열 86%이었다.

(4) 각 조직에서의 유전자 발현 해석

상기 방법에 의해 얻어진 유전자에 대하여 개 및 인간의 정상 조직 및 각종 세포주에 있어서의 발현을 RT-PCR법에 의해 조사했다. 역전사 반응은 이하와 같이 행했다. 즉, 각 조직 5㎎ 및 각 세포주 5∼10×10⁶개의 세포로부터 TRIZOL 시약(invitrogen사제)을 사용해서 첨부의 프로토콜에 따라 전체 RNA를 추출했다. 이 전체 RNA를 사용해서 Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(invitrogen사제)에 의해 첨부의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성했다. PCR 반응은 취득한 유전자 특이적인 프라이머(서열 번호 33 및 34에 기재)를 사용해서 이하와 같이 행했다. 즉, 역전사 반응에 의해 조제한 샘플 0.25㎕, 상기 프라이머를 각 2μM, 0.2mM 각 DNTP, 0.65U의 ExTaq 폴리메라아제(타카라슈조사제)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 첨가하여 전체량을 25㎕로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD사제)를 사용해서 94℃-30초, 60℃-30초, 72℃-30초의 사이클을 30회 반복해서 행했다. 또한, 상기 유전자 특이적 프라이머는 서열 번호 5의 염기 서열(개 CAPRIN-1 유전자) 중의 206번∼632번 및 서열 번호 1의 염기 서열(인간 CAPRIN-1 유전자) 중의 698번∼1124번 염기의 영역을 증폭하는 것이었다. 비교 대조를 위하여 GAPDH 특이적인 프라이머(서열 번호 35 및 36에 기재)도 동시에 사용했다. 그 결과 도 1에 나타내는 바와 같이 건강한 개 조직에서는 정소에 강한 발현이 보여지고, 한편 개 유방암 및 선암조직으로 발현이 보여졌다. 또한, 취득한 유전자의 인간 상동 인자의 발현을 함께 확인한 결과 개 CAPRIN-1 유전자와 마찬가지로 정상 조직으로 발현을 확인할 수 있었던 것은 정소뿐이었지만 암세포에서는 유방암, 뇌종양, 백혈병, 폐암, 식도암 세포주등, 다종류의 암세포주에서 발현이 검출되고, 특히 많은 유방암 세포주에서 발현이 확인되었다. 이 결과로부터 CAPRIN-1은 정소 이외의 정상 조직에서는 발현이 보여지지 않고, 한편 많은 암세포에서 발현되어 있고, 특히 유방암 세포주에 발현되어 있는 것이 확인되었다.

또한, 도 1 중 세로축의 참조 번호 1은 상기에서 동정한 유전자의 발현 패턴을, 참조 번호 2는 비교 대조인 GAPDH 유전자의 발현 패턴을 나타낸다.

(5) 면역 조직 화학 염색

(5)-1 마우스 및 개 정상 조직에 있어서의 CAPRIN-1의 발현

마우스(Balb/c, 암컷) 및 개(비글견, 암컷)를 에테르 마취 하 및 케타민/이소프루레인 마취 하에서 방혈시키고, 개복 후 각 장기(위, 간장, 안구, 흉선, 근육, 골수, 자궁, 소장, 식도, 심장, 신장, 타액선, 대장, 유선, 뇌, 폐, 피부, 부신, 난소, 췌장, 비장, 방광)를 각각 PBS가 들어간 10㎝ 접시에 옮겼다. PBS 중에서 각 장기를 절개하고, 4% paraformaldehyde(PFA)를 포함하는 0.1M 인산 완충액(pH7.4)으로 밤새 환류 고정했다. 환류액을 버리고, PBS로 각 장기의 조직 표면을 헹구고, 10% 수크로오스를 포함하는 PBS 용액을 50㎖ 용량의 원심 튜브에 넣고, 그 중에 각 조직을 넣어서 4℃에서 2시간 회전자를 사용해서 진동했다. 20% 수크로오스를 포함하는 PBS 용액으로 교체하고, 4℃에서 조직이 잠길 때까지 정치 후 30% 수크로오스를 포함하는 PBS 용액으로 교체하고, 4℃에서 조직이 잠길 때까지 정치했다. 조직을 인출하여 필요한 부분을 수술용 메스로 잘라냈다. 이어서, OCT콤파운드(Tissue Tek사제)를 가해서 조직 표면에 혼합시킨 후 크라이오몰드에 조직을 배치했다. 드라이아이스 상에 크라이오몰드를 두고 급속 동결시킨 후 크라이오스탯(LEICA사제)을 사용해서 10∼20㎛로 박절하고, 슬라이드 유리째 헤어드라이기로 30분간 바람 건조하여 박절 조직이 놓인 슬라이드 유리를 제작했다. 이어서, PBS-T(0.05% Tween20을 포함하는 생리식염수)를 채운 염색병에 넣어서 5분마다 PBS-T를 교체하는 조작을 3회 행했다. 절편 주위의 여분인 수분을 킴와이프스로 닦아내고, DAKOPEN(DAKO사제)로 두른 후 블로킹액으로서 마우스 조직은 MOM 마우스 Ig 블로킹 시약(VECTASTAIN사제)을 개 조직은 10% FBS를 포함하는 PBS-T 용액을 각각 놓고, 모이스트 챔버 상에서 실온에서 1시간 정치했다. 이어서, 실시예 3에서 제작한 암세포 표면에 반응하는 서열 번호: 73의 중쇄 가변 영역과 서열 번호: 77의 경쇄 가변 영역을 갖는 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체(단일클론 항체 #6)를 블로킹액으로 10㎍/㎖에 조제한 용액을 놓고, 모이스트 챔버 내에서 4℃ 하에서 밤새 정치했다. PBS-T로 10분간 3회 세정을 행한 후 블로킹액으로 250배로 희석한 MOM 바이오틴 표식 항IgG 항체(VECTASTAIN사제)를 놓고, 모이스트 챔버 내에서 실온에서 1시간 정치했다. PBS-T로 10분간 3회 세정을 행한 후 아비딘 비오틴 ABC 시약(VECTASTAIN사제)을 놓고, 모이스트 챔버 내에서 실온에서 5분간 정치했다. PBS-T로 10분간 3회 세정을 행한 후 DAB 발색액(DAB 10㎎+30% H2O2 10㎕/0.05M Tris-HCl(pH7.6)50㎖)을 놓고, 모이스트 챔버 내에서 실온에서 30분간 정치했다. 증류수로 린싱하고, 헤마톡실린 시약(DAKO사제)을 넣고, 실온에서 1분간 정치 후 증류수로 린싱했다. 70%, 80%, 90%, 95%, 100%의 각 에탄올 용액에 순서대로 1분간씩 넣은 후 크실렌 중에서 밤새 정치했다. 슬라이드 유리를 인출하여 Glycergel Mounting Medium(DAKO사제)으로 밀봉 후 관찰을 행했다. 그 결과 CAPRIN-1은 타액선, 신장, 결장, 위의 각 조직에 있어서 세포 내에서 약간 발현이 확인되었지만 세포 표면에서의 발현은 확인되지 않고, 또한 그 외의 장기 유래의 조직에서는 전혀 발현이 확인되지 않았다. 또한, 본 결과는 서열 번호 103의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 107의 경쇄 가변 영역을 갖는 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체(단일클론 항체 #9)을 사용했을 경우도 마찬가지이었다.

(5)-2 개 유방암 조직에 있어서의 CAPRIN-1의 발현

병리진단으로 악성 유방암이라고 진단된 개의 동결된 유방암 조직 108검체를 사용해서 상술과 마찬가지의 방법으로 동결 절편 슬라이드 제작 및 실시예 3에서 제작한 단일클론 항체 #6을 사용한 면역 조직 화학 염색을 행했다. 그 결과 CAPRIN-1은 108검체 중 100검체(92.5%)에서 발현이 확인되고, 특히 이형도가 높은 암세포 표면에 강하게 발현되어 있었다. 또한, 본 결과는 실시예 3에서 제작한 단일클론 항체 #9를 사용했을 경우도 마찬가지이었다.

(5)-3 인간 유방암 조직에 있어서의 CAPRIN-1의 발현

파라핀 포매된 인간 유방암 조직 어레이(BIOMAX사제)의 유방암 조직 188검체를 사용해서 면역 조직 화학 염색을 행했다. 인간 유방암 조직 어레이를 60℃에서 3시간 처리 후 크실렌을 채운 염색병에 넣어서 5분마다 크실렌을 교체하는 조작을 3회 행했다. 이어서, 크실렌 대신에 에탄올 및 PBS-T로 마찬가지의 조작을 행했다. 0.05% Tween20을 포함하는 10mM 시트르산 완충액(pH6.0)을 채운 염색병에 인간 유방암 조직 어레이를 넣고, 125℃에서 5분간 처리 후 실온에서 40분 이상 정치했다. 절편 주위의 여분인 수분을 킴와이프스로 닦아내어 DAKOPEN로 감싸고, Peroxidase Block(DAKO사제)를 적량 적하했다. 실온에서 5분간 정치 후 PBS-T를 채운 염색병에 넣어서 5분마다 PBS-T를 교체하는 조작을 3회 행했다. 블로킹액으로서 10% FBS를 포함하는 PBS-T 용액을 놓고, 모이스트 챔버 내에서 실온에서 1시간 정치했다. 이어서, 실시예 4에서 제작한 암세포 표면에 반응하는 단일클론 항체 #6을 5% FBS를 포함하는 PBS-T 용액으로 10㎍/㎖로 조제한 용액을 놓고, 모이스트 챔버 내에서 4℃에서 밤새 정치하고, PBS-T로 10분간 3회 세정을 행한 후 Peroxidase Labelled Polymer Conjugated(DAKO사제)를 적량 적하하고, 모이스트 챔버 내에서 실온에서 30분간 정치했다. PBS-T로 10분간 3회 세정을 행한 후 DAB 발색액(DAKO사제)을 놓고, 실온에서 10분정도 정치한 후 발색액을 버리고, PBS-T로 10분간 3회 세정을 행한 후 증류수로 린싱하고, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%의 각 에탄올 용액에 순서대로 1분간씩 넣은 후 크실렌 중에서 밤새 정치했다. 슬라이드 유리를 인출하여 Glycergel Mounting Medium(DAKO사제)으로 밀봉 후 관찰을 행했다. 그 결과 CAPRIN-1은 전체 유방암 조직 188검체 중 138검체(73%)에서 강한 발현이 확인되었다. 또한, 본 결과는 실시예 3에서 제작한 단일클론 항체 #2 또는 #9를 사용했을 경우도 마찬가지이었다.

(5)-4 인간 악성 뇌종양에 있어서의 CAPRIN-1의 발현

파라핀 포매된 인간 악성 뇌종양 조직 어레이(BIOMAX사제)의 악성 뇌종양 조직 247검체를 사용해서 상술한 (5)-3과 마찬가지의 방법으로 실시예 3에서 제작한 단일클론 항체 #6을 사용한 면역 조직 화학 염색을 행했다. 그 결과 CAPRIN-1은 전체 악성 뇌종양 조직 247검체 중 227검체(92%)에서 강한 발현이 확인되었다. 또한, 본 결과는 실시예 3에서 제작한 단일클론 항체 #2 또는 #9를 사용했을 경우도 마찬가지이었다.

(5)-5 인간 유방암 전이 림프절에 있어서의 CAPRIN-1의 발현

파라핀 포매된 인간 유방암 전이 림프절 조직 어레이(BIOMAX사제)의 유방암 전이 림프절 조직 150검체를 사용해서 상술한 (5)-3과 마찬가지의 방법으로 실시예 3에서 제작한 단일클론 항체 #6을 사용한 면역 조직 화학 염색을 행했다. 그 결과 CAPRIN-1은 전체 유방암 전이 림프절 조직 150검체 중 136검체(90%)에서 강한 발현이 확인되었다. 즉, 유방암으로부터 전이된 암조직에 있어서도 CAPRIN-1은 강하게 발현되는 것을 알 수 있었다. 또한, 본 결과는 실시예 3에서 제작한 단일클론 항체 #2 또는 #9를 사용했을 경우도 마찬가지이었다.

(5)-6 인간 각종 암조직에 있어서의 CAPRIN-1의 발현

파라핀 포매된 인간 각종 암조직 어레이(BIOMAX사제)의 검체를 사용해서 상술과 마찬가지의 방법에 의해 실시예 3에서 제작한 단일클론 항체 #6을 사용한 면역 조직 화학 염색을 행했다. 그 결과 CAPRIN-1은 식도암, 결장암, 직장암, 폐암, 신장암, 방광암 및 자궁경부암에서 강한 발현이 확인되었다. 또한, 본 결과는 단일클론 항체 #2 또는 #9를 사용했을 경우도 마찬가지이었다.

실시예 2 인간 신규 암 항원 단백의 제작

(1) 재조합 단백질의 제작

서열 번호 1의 유전자를 기초로 이하의 방법으로 인간 상동 유전자의 재조합 단백질을 제작했다. PCR은 유방암 조직·세포 cDNA로부터 RT-PCR법에 의한 발현을 확인할 수 있었던 cDNA를 1㎕, SacI 및 XhoI 제한 효소 절단 서열을 포함하는 2종류의 프라이머(서열 번호 38 및 39에 기재)를 각 0.4μM, 0.2mM dNTP, 1.25U의 PrimeSTAR HS폴리메라아제(타카라슈조사제)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 첨가해서 전체량을 50㎕로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD사제)를 사용해서 98℃-10초, 68℃-2.5분의 사이클을 30회 반복함으로써 행했다. 또한, 상기 2종류의 프라이머는 서열 번호 2의 아미노산 서열 전체 길이를 인코딩하는 영역을 증폭하는 것이었다. PCR후 증폭된 DNA를 1% 아가로스 겔로 전기영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사제)를 사용해서 약 2.1kbp의 DNA 단편을 정제했다.

정제한 DNA 단편을 클로닝 벡터 PCR-Blunt(invitrogen사제)에 라이게이션했다. 이것을 대장균으로 형질 전환 후 플러스미드를 회수하고, 증폭된 유전자 단편이 목적 서열과 일치하는 것을 시퀀스에서 확인했다. 목적 서열과 일치한 플러스미드를 SacI 및 XhoI 제한 효소로 처리하고, QIAquick Gel Extraction Kit로 정제 후 목적 유전자 서열을 SacI, XhoI 제한 효소로 처리한 대장균용 발현 벡터 pET30a (Novagen사제)에 삽입했다. 이 벡터의 사용에 의해 His 태그 융합형의 재조합 단백질을 산생할 수 있다. 이 플러스미드를 발현용 대장균 BL21(DE3)로 형질 전환하고, 1mM IPTG에 의한 발현 유도를 행함으로써 목적 단백질을 대장균 내에서 발현시켰다.

(2) 재조합 단백질의 정제

상기에서 얻어진 서열 번호 1의 유전자가 발현되는 각각의 재조합 대장균을 30㎍/㎖ 가나마이신 함유 LB 배지로 600㎚에서의 흡광도가 0.7 부근이 될 때까지 37℃에서 배양 후 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드 최종 농도가 1mM가 되도록 첨가하고, 37℃에서 4시간 배양했다. 그 후 4800rpm으로 10분간 원심하여 집균했다. 이 균체 펠렛을 인산 완충화 생리식염수에 현탁하고, 또한 4800rpm으로 10분간 원심하여 균체의 세정을 행했다.

이 균체를 인산 완충화 생리식염수에 현탁하고, 빙상에서 초음파 파쇄를 행했다. 대장균 초음파 파쇄액을 6000rpm으로 20분간 원심 분리하고, 얻어진 상청액을 가용성 획분, 침전물을 불용성 획분으로 했다.

가용성 획분을 정법에 따라 조제한 니켈 킬레이트 칼럼(담체: Chelating Sepharose(상표) Fast Flow(GE HealthCare사), 칼럼 용량 5㎖, 평형화 완충액 50mM 염산 완충액(pH8.0))에 첨가했다. 미흡착 획분을 칼럼 용량의 10배량의 50mM 염산 완충액(pH8.0)과 20mM 이미다졸 함유 20mM 인산 완충액(pH8.0)으로 세정 조작을 행한 후 즉시 100mM 이미다졸 함유 20mM 인산 완충액(pH8.0)으로 6베드 용출했다. 쿠마시 염색에 의해 목적 단백질의 용출을 확인한 100mM 이미다졸 함유 20mM 인산 완충액(pH8.0) 용출 획분을 강 음이온 교환 칼럼(담체:Q Sepharose(상표) Fast Flow(GE HealthCare사), 칼럼 용량 5㎖, 평형화 완충액으로서의 20mM 인산 완충액(pH8.0))에 첨가했다. 미흡착 획분을 칼럼 용량의 10배량의 20mM 인산 완충액(pH7.0)과 200mM 염화나트륨 함유 20mM 인산 완충액(pH7.0)으로 세정 조작을 행한 후 즉시 400mM 염화나트륨 함유 20mM 인산 완충액(pH7.0)으로 5베드 용출을 행하여 서열 번호 2에 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 각 단백질의 정제 획분을 얻었다.

상기 방법에 의해 얻어진 각 정제표품 중 200㎕를 1㎖의 반응용 완충액(20mM Tris-Hcl, 50mM NaCl, 2mM CaCl₂ pH7.4)에 분주를 행한 후 엔테로키나아제(Novagen사제)를 2㎕ 첨가한 후 실온에서 밤새 정치, 반응을 행하고, His 태그를 절단하고, Enterokinase Cleavage Capture Kit(Novagen사제)를 사용해서 첨부 프로토콜에 따라 정제를 행했다. 이어서, 상기 방법에 의해 얻어진 정제표품 1.2㎖를 한외 여과NANOSEP 10K OMEGA(PALL사제)를 사용해서 생리용 인산 완충액(닛스이세야쿠사제) 치환한 후 HT Tuffryn Acrodisc 0.22㎛(PALL사제)로 무균 여과를 행하여 이것을 이하의 실험에 사용했다.

실시예 3 CAPRIN-1에 대한 마우스 및 단일클론 항체의 제작

실시예 2에서 조제한 서열 번호 2에 나타내어지는 항원 단백질(인간 CAPRIN-1) 100㎍을 등량의 MPL+TDM 아쥬반트(시그마사제)와 혼합하고, 이것을 마우스 1마리당 항원 용액으로 했다. 항원 용액을 6주령의 Balb/c 마우스(Japan SLC,Inc.제제)의 복강내에 투여 후 1주일마다 3회, 즉 24회 투여를 더 행하여 면역을 완료했다. 최후의 면역으로부터 3일 후에 적출한 각각의 비장을 멸균한 2매의 슬라이드 유리에 끼워서 갈아 으깨고, PBS(-)(닛스이사제)를 사용해서 세정하고 1500rpm으로 10분간 원심해서 상청액을 제거하는 조작을 3회 반복해서 비장 세포를 얻었다. 얻어진 비장 세포와 마우스 골수종 세포 SP2/0(ATCC으로부터 구입)를 10:1의 비율로 혼화하고, 그곳에 37℃로 가온한 10% FBS를 포함하는 RPMI1640 배지 200㎕와 PEG1500(베링거사제) 800㎕를 혼화해서 조제한 PEG 용액을 첨가해서 5분간 정치해서 세포 융합을 행했다. 1700rpm으로 5분간 원심하여 상청액을 제거한 후 Gibco사제의 HAT 용액을 2%당량 첨가한 15% FBS를 포함하는 RPMI1640 배지(HAT 선택 배지) 150㎖로 세포를 현탁하고, 96웰 플레이트(눈크사제)의 1웰당 100㎕씩 플레이트 15매에 파종했다. 7일간 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양함으로써 비장 세포와 골수종 세포가 융합한 하이브리도마를 얻었다.

제작한 하이브리도마가 산생하는 항체의 CAPRIN-1 단백에 대한 결합 친화성을 지표로 하이브리도마를 선발했다. 실시예 1에서 조제한 CAPRIN-1 단백 용액 1㎍/㎖를 96웰 플레이트 1웰당 100㎕ 첨가하고, 4℃에서 18시간 정치했다. 각 웰을 PBS-T로 3회 세정 후 0.5% Bovine Serum Albumin(BSA) 용액(시그마사제)을 1웰당 400㎕ 첨가해서 실온에서 3시간 정치했다. 용액을 버리고, 1웰당 400㎕의 PBS-T로 웰을 3회 세정 후 상기에서 얻어진 하이브리도마의 각 배양 상청액을 1웰당 100㎕ 첨가하고, 실온에서 2시간 정치했다. PBS-T로 각 웰을 3회 세정한 후 PBS로 5000배로 희석한 HRP 표식 항마우스 IgG(H+L) 항체(인비트로젠사제)를 1웰당 100㎕ 첨가해서 실온에서 1시간 정치했다. PBS-T로 웰을 3회 세정한 후 TMB 기질 용액(Thermo사제)을 1웰당 100㎕ 첨가하고 15∼30분간 정치해서 발색 반응을 행했다. 발색 후 1규정 황산을 1웰당 100㎕ 첨가해서 반응을 정지시키고, 흡광도계를 사용해서 450㎚와 595㎚의 흡광도값을 측정했다. 그 결과 흡광도값이 높았던 항체를 산생하는 하이브리도마를 복수개 선발했다.

선발한 하이브리도마를 96웰 플레이트 1웰당 0.5개가 되도록 플레이트에 첨가하여 배양했다. 1주일 후 웰 중에 단일의 콜로니를 형성하고 있는 하이브리도마가 관찰되었다. 그들 웰의 세포를 더 배양해서 클로닝된 하이브리도마가 산생하는 항체의 CAPRIN-1 단백에 대한 결합 친화성을 지표로 하이브리도마를 선발했다. 실시예 1에서 조제한 CAPRIN-1 단백 용액 1㎍/㎖를 96웰 플레이트 1웰당 100㎕ 첨가하고, 4℃에서 18시간 정치했다. 각 웰을 PBS-T로 3회 세정 후 0.5% BSA 용액을 1웰당 400㎕ 첨가해서 실온에서 3시간 정치했다. 용액을 제거하고, 1웰당 400㎕의 PBS-T로 웰을 3회 세정 후 상기에서 얻어진 하이브리도마의 각 배양 상청액을 1웰당 100㎕ 첨가하고, 실온에서 2시간 정치했다. PBS-T로 각 웰을 3회 세정 후 PBS로 5000배로 희석한 HRP 표식 항마우스 IgG(H+L) 항체(인비트로젠사제)를 1웰당 100㎕ 첨가해서 실온에서 1시간 정치했다. PBS-T로 웰을 3회 세정한 후 TMB 기질 용액(Thermo사제)을 1웰당 100㎕ 첨가하고 15∼30분간 정치해서 발색 반응을 행했다. 발색 후 1규정 황산을 1웰당 100㎕ 첨가해서 반응을 정지시키고, 흡광도계를 사용해서 450㎚와 595㎚의 흡광도값을 측정했다. 그 결과 CAPRIN-1 단백에 반응성을 나타내는 단일클론 항체를 산생하는 150개의 하이브리도마주를 얻었다.

이어서, 그들 단일클론 항체 중 CAPRIN-1을 발현하는 유방암 세포의 세포 표면에 반응성을 나타내는 것을 선발했다. 구체적으로는 10⁶개의 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231V를 1.5㎖ 용량의 마이크로 원심 튜브로 원심 분리하고, 이것에 상기 각 하이브리도마의 배양 상청액 100㎕를 첨가해서 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정한 후 0.1% FBS를 포함하는 PBS로 500배 희석한 FITC 표식 염소 항마우스 IgG 항체(인비트로젠사제)를 첨가하고, 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정 후 벡토디킨슨 가부시키가이샤의 FACS 캘리버로 형광 강도를 측정했다. 한편, 상기와 마찬가지의 조작을 항체 대신에 아무것도 처리되어 있지 않은 6주령의 Balb/c 마우스의 혈청을 하이브리도마 배양용 배지로 500배 희석한 것을 사용해서 행하여 컨트롤로 했다. 그 결과 컨트롤에 비해 형광 강도가 강한, 즉 유방암 세포의 세포 표면에 반응하는 단일클론 항체 11개(#1∼#11)를 선발했다.

실시예 4 선발한 항체의 특징지음

(1) 항CAPRIN-1 단일클론 항체의 가변 영역 유전자의 클로닝

실시예 3에서 선발한 11개의 마우스 단일클론 항체를 각각 산생하는 각 하이브리도마주로부터 mRNA를 추출하고, 마우스 FR1 유래 서열 및 마우스 FR4 유래의 서열에 특이적인 프라이머를 사용한 RT-PCR법에 의해 모든 항CAPRIN-1 단일클론 항체의 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역의 유전자를 취득했다. 서열 결정을 위하여 그들 유전자를 pCR 2.1 벡터(인비트로젠사제)에 클로닝했다. 또한, CAPRIN-1을 발현하는 유방암 세포의 세포 표면에 반응하는 단일클론 항체를 산생하는 마우스 유래 하이브리도마주 2주로부터 mRNA를 추출하고, 마우스 FR1 유래 서열 및 마우스 FR4 유래의 서열에 특이적인 프라이머를 사용한 RT-PCR법에 의해 각 항체의 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역의 유전자를 취득했다. 서열 결정을 위하여 그들 유전자를 pCR 2.1 벡터(Invitrogen사제)에 클로닝했다.

(1)-1 RT-PCR

10⁶개의 각 하이브리도마주로부터 High Pure RNA Isolation Kit(Roche사제)를 사용해서 전체 RNA를 추출한 후 PrimeScriptII 1st strand cDNA Synthesis Kit(Takara사제)를 사용해서 cDNA를 합성했다. 이들 조작은 각 키트의 첨부 프로토콜에 따라 행했다.

합성한 cDNA를 주형으로 하고 KOD-Plus-DNA Polymerase(TOYOBO사제)를 사용해서 상법에 따라 PCR법에 의해 마우스 항체 중쇄 유전자 가변 영역 및 마우스 항체 경쇄 유전자 가변 영역을 각각 증폭했다.

마우스 항체의 VH 및 VL 영역의 유전자 취득을 위해서 마우스 중쇄 FR1 서열에 특이적인 프라이머(서열 번호 130), 마우스 중쇄 FR4 서열에 특이적인 프라이머(서열 번호 131), 마우스 경쇄 FR1 서열에 특이적인 프라이머(서열 번호 132) 및 마우스 경쇄 FR4에 특이적인 프라이머(서열 번호 133)를 사용했다.

상기에서 얻어진 각 PCR산물을 사용해서 아가로스 겔로 전기영동을 행하여 VH 영역 및 VL 영역 각각의 DNA 밴드를 잘라냈다. DNA 단편은 QIAquick Gel purification kit(QIAGEN사제)를 사용해서 그 첨부 프로토콜에 따라 행했다. 정제한 각 DNA는 TA클로닝 키트(Invitrogen사제)를 사용해서 pCR 2.1 벡터에 클로닝했다. 연결한 벡터를 DH5·컴피턴트 세포(TOYOBO사제)에 정법에 따라 형질 전환을 행했다. 각 형질 전환체 각각 10클론을 배지(100㎍/㎖ 암피실린)로 37℃ 밤새 배양 후 각 플러스미드 DNA를 Qiaspin Miniprep kit(QIAGEN사제)를 사용해서 정제했다.

(1)-2 서열 결정

상기에서 얻어진 각 플러스미드 중의 VH 영역 및 VL 영역의 유전자 서열 해석은 M13 포워드 프라이머(서열 번호 134) 및 M13 리버스 프라이머(서열 번호 135)을 사용해서 형광 시퀀서(ABI사제 DNA 시퀀서 3130XL)에 의해 ABI사제의 BigDye Terminator Ver 3.1 사이클 시퀀싱 키트를 사용해서 그 첨부 프로토콜에 따라 행했다. 그 결과 각각의 유전자 서열이 결정되었다(각각 10클론으로 일치).

얻어진 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역의 유전자 서열을 각각 서열 번호 48, 서열 번호 78, 서열 번호 88, 서열 번호 98, 서열 번호 108, 서열 번호 118 및 서열 번호 128에 및 그 아미노산 서열을 각각 서열 번호 43, 서열 번호 73, 서열 번호 83, 서열 번호 93, 서열 번호 103, 서열 번호 113 및 서열 번호 123에, 경쇄 가변 영역의 유전자 서열을 각각 서열 번호 49, 서열 번호 54, 서열 번호 59, 서열 번호 64, 서열 번호 69, 서열 번호 79, 서열 번호 89, 서열 번호 99, 서열 번호 109, 서열 번호 119 및 서열 번호 129에 및 그 아미노산 서열을 각각 서열 번호 47, 서열 번호 53, 서열 번호 58, 서열 번호 63, 서열 번호 68, 서열 번호 77, 서열 번호 87, 서열 번호 97, 서열 번호 107, 서열 번호 117 및 서열 번호 127에 나타낸다.

즉, 단일클론 항체 #1은 서열 번호 43의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 47의 경쇄 가변 영역으로 이루어지고, #2는 서열 번호 43의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 53의 경쇄 가변 영역으로 이루어지고, #3은 서열 번호 43의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 58의 경쇄 가변 영역으로 이루어지고, #4는 서열 번호 43의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 63의 경쇄 가변 영역으로 이루어지고, #5는 서열 번호 43의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 68의 경쇄 가변 영역으로 이루어지고, #6은 서열 번호 73의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 77의 경쇄 가변 영역으로 이루어지고, #7은 서열 번호 83의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 87의 경쇄 가변 영역으로 이루어지고, #8은 서열 번호 93의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 97의 경쇄 가변 영역으로 이루어지고, #9는 서열 번호 103의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 107의 경쇄 가변 영역으로 이루어지고, #10은 서열 번호 113의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 117의 경쇄 가변 영역으로 이루어지고, #11은 서열 번호 123의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 127의 경쇄 가변 영역으로 이루어진다.

(2) 항CAPRIN-1 항체 #2 및 #9를 사용한 각종 암세포 표면에서의 CAPRIN-1의 발현

이어서, CAPRIN-1 유전자의 발현이 확인된 유방암 세포주 7종(MDA-MB-157, T47D, MRK-nu-1, MDA-MB-231V, BT 20, SK-BR-3, MDA-MB-231T) 및 그 밖의 유방암 세포주 3종(MDA-MB-231C, MCF-7, ZR75-1), 신경교종 세포주 5종(T98G, SNB 19, U251,U87MG, U373), 신장암 세포주 4종(Caki-1, Caki-2, A498, ACHN), 위암 세포주 2종(MNK28,MKN45), 대장암 세포주 5종(HT29, LoVo, Caco2, SW480, HCT116), 폐암 세포주 3종(A549, QG56, PC8), 백혈병 세포주 4종(AML5, Namalwa, BDCM, RPI1788), 림프종 세포주 1종(Ramos), 자궁경부암 세포주 1종(SW756), 방광암 세포주 1종(T24) 및 식도암 세포주 1종(KYSE180)에 대해서 실시예 3에서 얻어진 #2 및 #9를 산생하는 하이브리도마의 배양 상청액을 사용해서 각 세포의 세포 표면상에서의 CAPRIN-1 단백질의 발현을 조사했다. 각 세포주 각각 10⁶세포를 1.5㎖ 용량의 마이크로 원심 튜브로 원심 분리했다. 실시예 3에서 얻어진 #2 및 #9를 산생하는 하이브리도마의 배양 상청액(100㎕)을 첨가해서 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정한 후 0.1% FBS를 포함하는 PBS로 500배 희석한 FITC 표식 염소 항인간 IgG(H+L) 항체(SouthernBiotech사제) 및 FITC 표식 항마우스 IgG(H+L) 항체(Invitrogen사제)를 첨가하고, 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정 후 벡토디킨슨 가부시키가이샤의 FACS 캘리버로 형광 강도를 측정했다. 한편, 상기와 마찬가지의 조작을 하이브리도마 배양용의 배지를 사용해서 행하고, 음성 컨트롤로 했다. 그 결과 #2 및 #9의 항체를 첨가한 세포는 컨트롤에 비해 모두 형광 강도가 20% 이상 강했다. 이 점에서 상기 인간 암세포주의 세포막 표면상에 CAPRIN-1 단백이 발현되어 있는 것이 확인되었다. 또한, 상기 형광 강도의 증강률은 각 세포에 있어서의 평균 형광 강도(MFI값)의 증가율로 나타내어지고, 이하의 계산식에 의해 산출했다.

평균 형광 강도의 증가율(형광 강도의 증강률)(%)=((항인간 CAPRIN-1 항체를 반응시킨 세포의 MFI값)-(컨트롤 MFI값))÷(컨트롤 MFI값)×100.

(3) CAPRIN-1에 대한 항체의 암세포에 대한 항종양 효과(ADCC 활성)

상기에서 선발한 #1∼#11의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체의 암세포에 대한 세포장해 활성(ADCC 활성)을 평가했다. #1∼#11의 단일클론 항체를 산생하는 각 하이브리도마를 하이브리도마 SFM(인비트로젠사제) 배지를 사용해서 배양하고, 얻어진 상청액을 Hitrap ProteinA SepharoseFF(GE헬스케어사제)를 사용해서 정제하고, PBS(-)로 치환해서 0.22㎛의 필터(밀리포아사제)로 여과한 것을 활성 측정용의 항체로서 사용했다. 10⁶개의 인간 유방암 세포주 MDA-MB-157을 50㎖ 용량의 원심 튜브에 모으고, 100μCi의 크롬(Cr) 51을 첨가해서 37℃에서 2시간 배양했다. 그 후 10% FBS를 포함하는 RPMI1640 배지로 3회 세정하고, 96웰 V저부 플레이트 1웰당 10³개씩 첨가해서 표적 세포로 했다. 이것에 상기 정제 항체를 각각 1㎍ 첨가하고, 마우스 비장으로부터 분리한 마우스 림프구를 2×10⁵개 더 첨가해서 37℃, 5% CO₂의 조건 하에서 4시간 배양했다. 배양 후 장해를 받은 종양 세포로부터 방출되는 배양 상청액 중의 크롬(Cr) 51의 양을 측정하여 항CAPRIN-1 항체에 의한 암세포에 대한 ADCC 활성을 산출했다. 그 결과 #1∼#11의 모든 단일클론 항체가 MDA-MB-157에 대하여 20% 이상의 ADCC 활성을 나타냈다. 구체적으로는 예를 들면 #1은 22.1%, #2는 29.1%, #6은 30.2%, #9는 32.4%의 세포장해 활성이 얻어졌다(도 1 참조). 한편, 실시예 2에서 제작한 CAPRIN-1 단백 자체에는 반응하지만 암세포의 세포 표면에 반응하지 않는 단일클론 항체를 사용해서 마찬가지의 조작을 행했을 경우 세포장해 활성은 확인되지 않았다(도 1 참조). 이상의 결과로부터 취득한 항CAPRIN-1 단일클론 항체(#1∼#11)는 ADCC 활성에 의해 CAPRIN-1을 발현하는 암세포를 장해하는 것이 나타내어졌다. 마찬가지로 해서 다른 인간 암세포인 신경교종 세포주 T98G, U373, 폐암 세포주 A549, QG56, 신장암 세포주 Caki-1, ACHN, 자궁경부암 세포주 SW756, 방광암 세포주 T24, 식도암 세포주 KYSE180, 위암 세포주 MNK28, MNK45, 대장암 세포주 SW480, 백혈병 세포주 AML5 및 림프종 세포주 Ramos에 대한 항CAPRIN-1 항체에 의한 암세포에 대한 ADCC 활성을 산출했다. 그 결과 #1∼#11의 모든 단일클론 항체가 아이소타입 컨트롤에 비해 높은 ADCC 활성을 나타냈다. 구체적으로는 예를 들면 T98G에 대하여 #9는 12% 이상(아이소타입 컨트롤은 1.3%), U373에 대하여 #9는 16% 이상(아이소타입 컨트롤은 3%), A549에 대하여 #9는 24% 이상(아이소타입 컨트롤은 2.6%), QG56에 대하여 #9는 20% 이상(아이소타입 컨트롤은 0.2%), Caki-1에 대하여 #9는 23% 이상(아이소타입 컨트롤은 3.0%), ACHN에 대하여 #9는 14% 이상(아이소타입 컨트롤은 1.5%), SW756에 대하여 #9는 16% 이상(아이소타입 컨트롤은 2.5%), T24에 대하여 #9는 18% 이상(아이소타입 컨트롤은 2.1%), KYSE180에 대하여 #9는 22% 이상(아이소타입 컨트롤은 3.0%), MNK28에 대하여 #9는 15% 이상(아이소타입 컨트롤은 1.7%), MNK45에 대하여 #9는 10% 이상(아이소타입 컨트롤은 2.3%), SW480에 대하여 #9는 17% 이상(아이소타입 컨트롤은 1.3%), AML5에 대하여 #9는 10% 이상(아이소타입 컨트롤은 3.0%) 및 Ramos에 대하여 #9는 10% 이상의 활성을 나타냈다(아이소타입 컨트롤은 4.1%). 이상의 결과로부터 취득한 항CAPRIN-1 항체(#1∼#11)는 CAPRIN-1을 발현하는 각종 인간 암세포를 장해하는 것이 나타내어졌다.

(4) CAPRIN-1에 대한 항체의 암세포에 대한 항종양 효과(CDC 활성)

상기에서 선발한 #1∼#11의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체의 암세포에 대한 세포장해 활성(CDC 활성)을 평가했다. 토끼로부터 채혈한 혈액을 에펜도르프 튜브에 넣고, 실온에서 60분간 정치한 후 3000rpm으로 5분간 원심 분리함으로써 CDC 활성 측정용의 혈청을 조제했다. 인간 유방암 세포인 MDA-MB-231V 10⁵개를 50㎖ 용량의 원심 튜브에 모으고, 100μCi의 크롬51을 첨가해서 37℃에서 2시간 배양한 후 10% FBS를 포함하는 RPMI 배지로 3회 세정했다. 그 후 상기에서 조제한 토끼 혈청을 50% 포함하는 RPMI 배지로 현탁하고, 96웰 V저부 플레이트 1웰당 10³개씩 첨가했다. 이것에 실시예 3에서 얻은 #1∼#13의 단일클론 항체를 각각 1㎍씩 첨가해서 37℃, 5% CO₂의 조건 하에서 4시간 배양했다. 배양 후 장해를 받은 종양 세포로부터 방출되는 배양 상청액 중의 크롬51의 양을 측정하여 하이브리도마 상청액 중의 항CAPRIN-1 단일클론 항체에 의한 MDA-MB-231V에 대한 CDC 활성을 산출했다. 그 결과 #1∼#11의 모든 단일클론 항체가 30% 이상의 CDC 활성을 나타냈다. 한편, 실시예 2에서 제작한 CAPRIN-1 단백 자체에는 반응하지만 암세포의 세포 표면에 반응하지 않는 단일클론 항체를 사용해서 마찬가지의 조작을 행했을 경우 세포장해 활성은 확인되지 않았다. 따라서, CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체(#1∼#11)는 CDC 활성에 의해도 CAPRIN-1을 발현하는 종양 세포를 장해할 수 있는 것이 밝혀졌다.

실시예 5 암세포의 세포 표면에 반응하는 CAPRIN-1에 대한 항체가 결합하는 CAPRIN-1 단백질 중의 펩티드의 동정

상기에서 취득한 암세포의 세포 표면에 반응하는 #1∼#11의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 사용해서 그들이 인식하는 CAPRIN-1 단백질 중의 부분 서열의 동정을 행했다.

우선 PBS로 1㎍/㎕의 농도로 용해한 재조합 CAPRIN-1 단백질 용액 100㎕에 최종 농도가 10mM가 되도록 DTT(Fluka사제)를 첨가하고, 95℃에서 5분간 반응시켜서 CAPRIN-1 단백질 내의 디술피드 결합의 환원을 행하고, 이어서 최종 농도 20mM의 요오드아세트아미드(와코준야쿠사제)를 첨가하여 37℃, 차광 조건 하에서 30분간 티올기의 알킬화 반응을 행했다. 얻어진 환원 알킬화 CAPRIN-1 단백질 40㎍에 #1∼#11의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 각각 50㎍ 첨가하고, 20mM 인산 완충액(pH7.0) 1㎖에 메스실린더로 눈금을 맞추면서 교반 혼합하면서 4℃에서 밤새 반응시켰다.

이어서, 트립신(프로메가사제)을 최종 농도 0.2㎍이 되도록 첨가하고, 37℃에서 1시간, 2시간, 4시간, 12시간 반응시킨 후 미리 1% BSA(시그마사제)를 포함하는 PBS로 블로킹하고, PBS로 세정한 프로틴A-유리 비즈(GE사제)와 1mM 탄산 칼슘, NP-40완충액(20mM 인산 완충액(pH7.4), 5mM EDTA, 150mM NaCl, 1% NP-40) 중에서 혼합하여 각각 30분간 반응시켰다.

반응액을 25mM 탄산 암모늄 완충액(pH8.0)으로 세정한 후 0.1% 포름산 100㎕를 사용해서 항원 항체 복합체를 용출하고, 용출액에 대해서 Q-TOF Premier(Waters-MicroMass사제)를 사용해서 LC-MS 해석을 행했다. 해석은 기기에 부속의 프로토콜에 따랐다.

그 결과 #1∼#11의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체가 모두 인식하는 CAPRIN-1의 부분 서열로서 서열 번호 37의 폴리펩티드가 동정되었다.

실시예 6 항종양제에 의한 암세포 표면상의 CAPRIN-1 발현의 영향

(1) 암세포에 대한 항종양제의 50% 저해 농도의 산출

항종양제에 의한 암세포 표면상의 CAPRIN-1 발현의 영향을 평가하기 위해서 암세포(MCF-7)를 사용해서 항종양제의 50% 저해 농도의 산출을 행했다. 인간 유방암 세포주 MCF-7에 대해서 현재 유방암 치료약으로서 사용되어 있는 항종양제 4종(시클로포스파미드: “엔독산”(등록상표, Shionogi & Co., Ltd.제), 파클리탁셀: “택솔”(등록상표, Bristol-Myers사제), 도세탁셀: “탁소텔”(등록상표, Sanofi-aventis K.K.제), 비노렐빈: “나벨빈”(등록상표, Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.제)의 50% 저해 농도를 조사했다. 세포를 1×10⁵cells/㎖가 되도록 조제하고, 6웰 플레이트에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 1일 배양을 행했다. 이어서, 각 항종양제를 최종 농도 0.001㎛, 0.01㎛, 0.1㎛, 1.0㎛, 10㎛ 각각 처리하고, 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 2일 배양을 행했다. 배양액을 제거한 후 PBS(-)로 2회 세정을 행하여 0.25% Trypsin-EDTA를 첨가해서 세포를 벗겨내고, PBS(-)로 100㎕로 조제한 후 0.4% 트리판 블루 저장 용액을 10㎕ 첨가해서 혼합하고, 혈구계 주판을 사용해서 생세포수를 측정했다. 각 항종양제 미처리의 생세포수를 100%으로 했을 때의 각 화학요법제 처리 시의 생세포의 비율을 산출하고, 본 검토의 결과로부터 50% 저해 농도를 어림셈해서 그 농도 부근의 항종양제를 더 조제하고, 상술과 마찬가지의 조작을 행함으로써 상세한 50% 저해 농도를 산출하는 것으로 했다.

일례로서 항종양제 시클로포스파미드에서의 검토 내용을 기재한다. MCF-7을 1×10⁵cells/㎖가 되도록 조제하고, 6웰 플레이트에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 1일 배양을 행했다. 이어서, 시클로포스파미드를 최종 농도 1×10^-1㎛, 5×10^-2㎛, 2×10^-2㎛, 1×10^-2㎛ 각각 처리하고, 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 2일 배양을 행했다. 배양액을 제거한 후 PBS(-)로 2회 세정을 행하고 0.25% Trypsin-EDTA를 첨가해서 세포를 벗겨내고, PBS(-)로 100㎕로 조제하고, 0.4% 트리판 블루 저장 용액을 10㎕ 첨가해서 혼합하고, 혈구계 주판을 사용해서 생세포수를 측정했다. 본 검토의 결과로부터 50% 저해 농도를 3×10^-2㎛로 했다. 마찬가지의 조작에 의해 각 암세포에 있어서의 각 항종양제의 IC50을 이하에 산정했다(표 1).

(2) 항종양제를 암세포에 작용시켰을 때의 CAPRIN-1 발현에의 영향

(1)에서 산출한 50% 저해 농도의 각 항종양제를 암세포주(MCF-7)에 처리해서 그 세포 표면상의 CAPRIN-1 단백질의 발현 거동에 대해서 조사했다.

인간 유방암 세포주 MCF-7에 처리해서 그 세포 표면상의 CAPRIN-1 단백질의 발현 거동에 대해서 조사했다. 세포를 1×10⁵cells/㎖가 되도록 조제하고, 6웰 플레이트에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 1일 배양했다. 이어서, (1)에서 산출한 50% 저해 농도에 의한 항종양제 및 컨트롤로서 PBS(-)를 각각 처리하고, 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 2일 배양했다. 배양액을 제거한 후 PBS(-)로 2회 세정을 행하고, 셀 스크레이퍼를 사용해서 세포를 벗겨냈다. 이어서, 그들 세포를 1.5㎖의 마이크로 원심 튜브로 원심 분리했다. 이것에 마우스 항CAPRIN-1 단일클론 항체 #9를 1㎍(5㎕) 첨가하고, 또한 95㎕의 0.1% 소태아혈청을 포함하는 PBS로 현탁 후 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정한 후 5㎕의 FITC 표식 염소 항토끼 IgG 항체(산타 크루즈사제) 및 95㎕의 0.1% 소태아혈청(FBS)을 포함하는 PBS로 현탁하고, 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정 후 벡토디킨슨 가부시키가이샤의 FACS 캘리버로 형광 강도를 측정했다. 한편, 상기와 마찬가지의 조작을 마우스 항CAPRIN-1 단일클론 항체 대신에 컨트롤 항체를 사용해서 행하여 컨트롤로 했다. 그 결과 항종양제 처리에 상관없이 경향 강도에 차이는 보여지지 않았다. 즉, 항종양제를 처리하지 않은 MCF-7에 항CAPRIN-1 항체를 첨가했을 경우에 얻어진 형광 강도는 컨트롤 항체를 첨가했을 경우에 비해 32%의 증강을 나타냈다. 한편, 항종양제를 처리한 MCF-7을 사용해서 마찬가지의 검토를 한 결과 항종양제를 처리하지 않았을 경우와 완전히 같은 32%의 형광 강도의 증강을 나타냈다. 이 점에서 유방암 세포에 항종양제를 처리해도 유방암 세포상의 CAPRIN-1의 발현에 조금도 영향을 끼치지 않는 것이 판명되었다. 또한, 상기 형광 강도의 증강률은 각 세포에 있어서의 평균 형광 강도(MFI값)의 증가율로 나타내어지고, 이하의 계산식에 의해 산출했다.

실시예 7 in vivo에 있어서의 항CAPRIN-1 항체와 항종양제의 병용 요법(1) CAPRIN-1을 발현하는 인간 유방암 세포주 MCF-7을 이식한 담암 마우스를 사용해서 항CAPRIN-1 단일클론 항체와 항종양제 병용에 의한 항종양 효과를 검토했다. 이하에 MCF-7을 담암시킨 마우스를 사용한 항종양 효과의 검토 방법, 결과에 대해서 기재한다. 280마리의 누드 마우스(Japan SLC, Inc.제제)의 배부 피하에 1마리당 10⁶개의 MCF-7(ATCC로부터 구입)을 이식하고, 종양이 지름 7㎜정도의 크기가 될 때까지 성장시켰다.

이어서, 이하의 실험구 1 및 실험구 2에서 상술하는 바와 같이 MCF-7을 이식한 담암 마우스는 항CAPRIN-1 항체만 투여하는 군, 항종양제(4종)만 투여하는 군, 항종양제와 항Her2 항체(마우스 항인간 ErbB2 단일클론 항체, 아이소타입: IgG2b(R&D systems사제, 카탈로그 번호: MAB11291))를 병용 투여하는 군, 항종양제와 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 병용 투여하는 군, 최후에 컨트롤(PBS(-)를 투여하는)군의 5개의 군으로 나누고, 또한 모든 투여군에는 마우스 PBMC를 투여했다.

<실험구 1>

(항CAPRIN-1 항체만 투여하는 군)

5마리의 담암 마우스에 대하여 #2의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 1마리당 5㎎/㎏/shot씩 시험 개시 0, 4, 8, 11, 15, 17일에 복강내 투여하고, Balb/c 마우스 비장으로부터 분리한 PBMC를 1마리당 1×10⁷cells/0.2㎖(RPMI1640)씩 시험 개시 0, 8, 15일에 정맥내 투여했다.

(시클로포스파미드 투여군)

5마리의 담암 마우스에 대하여 시클로포스파미드를 1마리당 80㎎/㎏/shot씩 시험 개시 0, 4일에 복강내 투여하고, Balb/c 마우스 비장으로부터 분리한 PBMC를 1마리당 1×10⁷cells/0.2㎖(RPMI1640)씩 시험 개시 0, 8, 15일에 정맥투여했다.

(파클리탁셀 투여군)

5마리의 담암 마우스에 대하여 파클리탁셀을 1마리당 15㎎/㎏/shot씩 시험 개시 0, 3일에 복강내 투여하고, Balb/c 마우스 비장으로부터 분리한 PBMC를 1마리당 1×10⁷cells/0.2㎖(RPMI1640)씩 시험 개시 0, 8, 15일에 정맥내 투여했다.

(도세탁셀 투여군)

5마리의 담암 마우스에 대하여 도세탁셀을 1마리당 10㎎/㎏/shot씩 시험 개시 0, 3일에 복강내 투여하고, Balb/c 마우스 비장으로부터 분리한 PBMC를 1마리당 1×10⁷cells/0.2㎖(RPMI1640)씩 시험 개시 0, 8, 15일에 정맥내 투여했다.

(비노렐빈 투여군)

5마리의 담암 마우스에 대하여 비노렐빈을 1마리당 1㎎/㎏/shot씩 시험 개시 0일에 복강내 투여하고, Balb/c 마우스 비장으로부터 분리한 PBMC를 1마리당 1×10⁷cells/0.2㎖(RPMI1640)씩 시험 개시 0, 8, 15일에 정맥내 투여했다.

(시클로포스파미드와 항Her2 항체의 투여군)

5마리의 담암 마우스에 대하여 시클로포스파미드를 1마리당 80㎎/㎏/shot씩 시험 개시 0, 4일에 복강내 투여하고, 동시에 항Her2 항체를 1마리당 5㎎/㎏/shot씩 시험 개시 0, 4, 8, 11, 15, 17일에 복강내 투여하고, Balb/c 마우스 비장으로부터 분리한 PBMC를 1마리당 1×10⁷cells/0.2㎖(RPMI1640)씩 시험 개시 0, 8, 15일에 정맥내 투여했다.

(파클리탁셀과 항Her2 항체의 투여군)

5마리의 담암 마우스에 대하여 파클리탁셀을 1마리당 15㎎/㎏/shot씩 시험 개시 0, 3일에 복강내 투여하고, 동시에 항Her2 항체를 1마리당 5㎎/㎏/shot씩 시험 개시 0, 4, 8, 11, 15, 17일에 복강내 투여하고, Balb/c 마우스 비장으로부터 분리한 PBMC를 1마리당 1×10⁷cells/0.2㎖(RPMI1640)씩 시험 개시 0, 8, 15일에 정맥내 투여했다.

(도세탁셀과 항Her2 항체의 투여군)

5마리의 담암 마우스에 대하여 도세탁셀을 1마리당 10㎎/㎏/shot씩 시험 개시 0, 3일에 복강내 투여하고, 동시에 항Her2 항체를 1마리당 5㎎/㎏/shot씩 시험 개시 0, 4, 8, 11, 15, 17일에 복강내 투여하고, Balb/c 마우스 비장으로부터 분리한 PBMC를 1마리당 1×10⁷cells/0.2㎖(RPMI1640)씩 시험 개시 0, 8, 15일에 정맥내 투여했다.

(비노렐빈과 항Her2의 투여군)

5마리의 담암 마우스에 대하여 비노렐빈을 1마리당 1㎎/㎏/shot씩 시험 개시 0일에 복강내 투여하고, 동시에 항Her2 항체를 1마리당 5㎎/㎏/shot씩 시험 개시 0, 4, 8, 11, 15, 17일에 복강내 투여하고, Balb/c 마우스 비장으로부터 분리한 PBMC를 1마리당 1×10⁷cells/0.2㎖(RPMI1640)씩 시험 개시 0, 8, 15일에 정맥내 투여했다.

(시클로포스파미드와 항CAPRIN-1 항체의 투여군)

5마리의 담암 마우스에 대하여 시클로포스파미드를 1마리당 80㎎/㎏/shot씩 시험 개시 0, 4일에 복강내 투여하고, 동시에 #2의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 1마리당 5㎎/㎏/shot씩 시험 개시 0, 4, 8, 11, 15, 17일에 복강내 투여하고, Balb/c 마우스 비장으로부터 분리한 PBMC를 1마리당 1×10⁷cells/0.2㎖(RPMI1640)씩 시험 개시 0, 8, 15일에 정맥내 투여했다.

(파클리탁셀과 항CAPRIN-1 항체의 투여군)

5마리의 담암 마우스에 대하여 파클리탁셀을 1마리당 15㎎/㎏/shot씩 시험 개시 0, 3일에 복강내 투여하고, 동시에 #2의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 1마리당 5㎎/㎏/shot씩 시험 개시 0, 4, 8, 11, 15, 17일에 복강내 투여하고, Balb/c 마우스 비장으로부터 분리한 PBMC를 1마리당 1×10⁷cells/0.2㎖(RPMI1640)씩 시험 개시 0, 8, 15일에 정맥내 투여했다.

(도세탁셀과 항CAPRIN-1 항체의 투여군)

5마리의 담암 마우스에 대하여 도세탁셀을 1마리당 10㎎/㎏/shot씩 시험 개시 0, 3일에 복강내 투여하고, 동시에 #2의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 1마리당 5㎎/㎏/shot씩 시험 개시 0, 4, 8, 11, 15, 17일에 복강내 투여하고, Balb/c 마우스 비장으로부터 분리한 PBMC를 1마리당 1×10⁷cells/0.2㎖(RPMI1640)씩 시험 개시 0, 8, 15일에 정맥내 투여했다.

(비노렐빈과 항CAPRIN-1 항체의 투여군)

비노렐빈과 항CAPRIN-1 항체의 5마리의 담암 마우스에 대하여 비노렐빈을 1마리당 1㎎/㎏/shot씩 시험 개시 0일에 복강내 투여하고, 동시에 #2의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 1마리당 5㎎/㎏/shot씩 시험 개시 0, 4, 8, 11, 15, 17일에 복강내 투여하고, Balb/c 마우스 비장으로부터 분리한 PBMC를 1마리당 1×10⁷cells/0.2㎖(RPMI1640)씩 시험 개시 0, 8, 15일에 정맥내 투여했다.

<실험구 2>

항CAPRIN-1 항체만 투여하는 군, 시클로포스파미드와 항CAPRIN-1 항체의 투여군, 파클리탁셀과 항CAPRIN-1 항체의 투여군, 도세탁셀과 항CAPRIN-1 항체의 투여군 및 비노렐빈과 항CAPRIN-1 항체의 투여군에 대해서는 항CAPRIN-1 항체로서 #9의 CAPRIN-1에 대한 단일클론 항체를 투여하는 이외에는 실험구 1과 마찬가지로 설정했다.

시클로포스파미드 투여군, 파클리탁셀 투여군, 도세탁셀 투여군, 비노렐빈 투여군, 시클로포스파미드와 항Her2 항체의 투여군, 파클리탁셀과 항Her2 항체의 투여군, 도세탁셀과 항Her2 항체의 투여군 및 비노렐빈과 항Her2 항체의 투여군에 대해서는 실험구 1과 마찬가지로 설정했다.

상기 각 실험구의 각 투여군에 대해서 매일 종양의 크기를 계측하여 항종양 효과를 관찰했다. 또한, 5마리의 담암 마우스에 대하여 항체 대신에 PBS(-)를 투여한 군에 대해서는 컨트롤군으로 했다. 또한, 종양의 크기는 장경×단경×단경×0.5의 계산식을 사용해서 체적을 산출했다.

항종양 효과의 관찰의 결과 실험구 1에서는 PBS(-)를 투여한 컨트롤군의 시험 개시로부터 26일째의 종양 체적을 100%로 했을 경우에 각 항종양제 투여군에서는 약 79%정도, 항CAPRIN-1 항체만 투여하는 군에서는 약 56%정도, 각 항종양제와 항Her2 항체의 투여군에서는 약 74%까지 퇴축했다. 한편, 각 항종양제와 항CAPRIN-1 항체의 투여군에서는 14일째에는 수십%까지 종양이 퇴축하고, 22일째 이후에는 종양은 거의 완전히 퇴축했다(도 3∼6 참조).

또한, 실험구 2에서는 PBS(-)를 투여한 컨트롤군의 시험 개시로부터 26일째의 종양 체적을 100%로 했을 경우에 각 항종양제 투여군에서는 약 68%정도, 항CAPRIN-1 항체만 투여하는 군에서는 약 45%정도, 각 항종양제와 항Her2 항체의 투여군에서는 약 55%까지 퇴축했다. 한편, 각 항종양제라고 항CAPRIN-1 항체의 투여군에서는 14일째에는 수십%까지 종양이 퇴축하고, 22일째 이후에는 종양은 거의 완전히 퇴축했다(도 7∼도 10 참조).

(산업상 이용가능성)

본 발명은 암의 치료 및/또는 예방에 유용하다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 있어서 넣는 것으로 한다.

서열표 프리텍스트

서열 번호 31: T3 프라이머

서열 번호 32: T7 프라이머

서열 번호 33, 34:프라이머

서열 번호 35, 36: GAPDH 프라이머

서열 번호 38, 39: 프라이머

서열 번호 130∼135: 프라이머

SEQUENCE LISTING <110> TORAY INDUSTRIES, INC. <120> Medicament for Treatment and/or Prevention of Cancer <130> PH-4658-PCT <150> JP 2010-023455 <151> 2010-02-04 <160> 135 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 5562 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (190)..(2319) <223> <400> 1 cagagggctg ctggctggct aagtccctcc cgctcccggc tctcgcctca ctaggagcgg 60 ctctcggtgc agcgggacag ggcgaagcgg cctgcgccca cggagcgcgc gacactgccc 120 ggaagggacc gccacccttg ccccctcagc tgcccactcg tgatttccag cggcctccgc 180 gcgcgcacg atg ccc tcg gcc acc agc cac agc ggg agc ggc agc aag tcg 231 Met Pro Ser Ala Thr Ser His Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser 1 5 10 tcc gga ccg cca ccg ccg tcg ggt tcc tcc ggg agt gag gcg gcc gcg 279 Ser Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala 15 20 25 30 gga gcc ggg gcc gcc gcg ccg gct tct cag cac ccc gca acc ggc acc 327 Gly Ala Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gln His Pro Ala Thr Gly Thr 35 40 45 ggc gct gtc cag acc gag gcc atg aag cag att ctc ggg gtg atc gac 375 Gly Ala Val Gln Thr Glu Ala Met Lys Gln Ile Leu Gly Val Ile Asp 50 55 60 aag aaa ctt cgg aac ctg gag aag aaa aag ggt aag ctt gat gat tac 423 Lys Lys Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr 65 70 75 cag gaa cga atg aac aaa ggg gaa agg ctt aat caa gat cag ctg gat 471 Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gln Asp Gln Leu Asp 80 85 90 gcc gtt tct aag tac cag gaa gtc aca aat aat ttg gag ttt gca aaa 519 Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys 95 100 105 110 gaa tta cag agg agt ttc atg gca cta agt caa gat att cag aaa aca 567 Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gln Lys Thr 115 120 125 ata aag aag aca gca cgt cgg gag cag ctt atg aga gaa gaa gct gaa 615 Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu 130 135 140 cag aaa cgt tta aaa act gta ctt gag cta cag tat gtt ttg gac aaa 663 Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu Gln Tyr Val Leu Asp Lys 145 150 155 ttg gga gat gat gaa gtg cgg act gac ctg aaa caa ggt ttg aat gga 711 Leu Gly Asp Asp Glu Val Arg Thr Asp Leu Lys Gln Gly Leu Asn Gly 160 165 170 gtg cca ata ttg tcc gaa gag gag ttg tca ttg ttg gat gaa ttc tat 759 Val Pro Ile Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe Tyr 175 180 185 190 aag cta gta gac cct gaa cgg gac atg agc ttg agg ttg aat gaa cag 807 Lys Leu Val Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu Gln 195 200 205 tat gaa cat gcc tcc att cac ctg tgg gac ctg ctg gaa ggg aag gaa 855 Tyr Glu His Ala Ser Ile His Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly Lys Glu 210 215 220 aaa cct gta tgt gga acc acc tat aaa gtt cta aag gaa att gtt gag 903 Lys Pro Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Val Leu Lys Glu Ile Val Glu 225 230 235 cgt gtt ttt cag tca aac tac ttt gac agc acc cac aac cac cag aat 951 Arg Val Phe Gln Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His Gln Asn 240 245 250 ggg ctg tgt gag gaa gaa gag gca gcc tca gca cct gca gtt gaa gac 999 Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Ala Val Glu Asp 255 260 265 270 cag gta cct gaa gct gaa cct gag cca gca gaa gag tac act 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aaa cct tta cat agc agt gga atc aat gta aat gca 1719 Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser Gly Ile Asn Val Asn Ala 495 500 505 510 gct cca ttc caa tcc atg caa acg gtg ttc aat atg aat gcc cca gtt 1767 Ala Pro Phe Gln Ser Met Gln Thr Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val 515 520 525 cct cct gtt aat gaa cca gaa act tta aaa cag caa aat cag tac cag 1815 Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gln Gln Asn Gln Tyr Gln 530 535 540 gcc agt tat aac cag agc ttt tct agt cag cct cac caa gta gaa caa 1863 Ala Ser Tyr Asn Gln Ser Phe Ser Ser Gln Pro His Gln Val Glu Gln 545 550 555 aca gag ctt cag caa gaa cag ctt caa aca gtg gtt ggc act tac cat 1911 Thr Glu Leu Gln Gln Glu Gln Leu Gln Thr Val Val Gly Thr Tyr His 560 565 570 ggt tcc cca gac cag tcc cat caa gtg act ggt aac cac cag cag cct 1959 Gly Ser Pro Asp Gln Ser His Gln Val Thr Gly Asn His Gln Gln Pro 575 580 585 590 cct cag cag aac act gga ttt cca cgt agc aat cag ccc tat tac aat 2007 Pro Gln Gln Asn Thr Gly Phe Pro Arg Ser Asn Gln Pro Tyr Tyr Asn 595 600 605 agt cgt ggt gtg tct cgt gga ggc tcc cgt ggt gct aga ggc ttg atg 2055 Ser Arg Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly Leu Met 610 615 620 aat gga tac cgg ggc cct gcc aat gga ttc aga gga gga tat gat ggt 2103 Asn Gly Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly 625 630 635 tac cgc cct tca ttc tct aac act cca aac agt ggt tat aca cag tct 2151 Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Gln Ser 640 645 650 cag ttc agt gct ccc cgg gat tac tct ggc tat caa cgg gat gga tat 2199 Gln Phe Ser Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Gly Tyr Gln Arg Asp Gly Tyr 655 660 665 670 cag cag aat ttc aag cga ggc tct ggg cag agt gga cca cgg gga gcc 2247 Gln Gln Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly Gln Ser Gly Pro Arg Gly Ala 675 680 685 cca cga ggt cgt gga ggg ccc cca aga ccc aac aga ggg atg ccg caa 2295 Pro Arg Gly Arg Gly Gly Pro Pro Arg Pro Asn Arg Gly Met Pro Gln 690 695 700 atg aac act cag caa gtg aat taa tctgattcac aggattatgt ttaatcgcca 2349 Met Asn Thr Gln Gln Val Asn 705 aaaacacact ggccagtgta ccataatatg ttaccagaag agttattatc tatttgttct 2409 ccctttcagg aaacttattg taaagggact gttttcatcc cataaagaca ggactacaat 2469 tgtcagcttt ctattacctg gatatggaag gaaactattt ttactctgca tgttctgtcc 2529 taagcgtcat cttgagcctt gcacatgata ctcagattcc tcacccttgc ttaggagtaa 2589 aacaatatac tttacagggt gataataatc tccatagtta tttgaagtgg cttgaaaaag 2649 gcaagattga cttttatgac attggataaa atctacaaat cagccctcga gttattcaat 2709 gataactgac aaactaaatt atttccctag aaaggaagat gaaaggagtg gagtgtggtt 2769 tggcagaaca actgcatttc acagcttttc cagttaaatt ggagcactga acgttcagat 2829 gcataccaaa ttatgcatgg gtcctaatca cacatataag gctggctacc agctttgaca 2889 cagcactgtt catctggcca aacaactgtg gttaaaaaca catgtaaaat gctttttaac 2949 agctgatact gtataagaca aagccaagat gcaaaattag gctttgattg gcactttttg 3009 aaaaatatgc aacaaatatg ggatgtaatc cggatggccg cttctgtact taatgtgaaa 3069 tatttagata cctttttgaa cacttaacag tttctttgag acaatgactt ttgtaaggat 3129 tggtactatc tatcattcct tatgacatgt acattgtctg tcactaatcc ttggattttg 3189 ctgtattgtc acctaaattg gtacaggtac tgatgaaaat ctctagtgga taatcataac 3249 actctcggtc acatgttttt ccttcagctt gaaagctttt ttttaaaagg aaaagatacc 3309 aaatgcctgc tgctaccacc cttttcaatt gctatctttt gaaaggcacc agtatgtgtt 3369 ttagattgat ttccctgttt cagggaaatc acggacagta gtttcagttc tgatggtata 3429 agcaaaacaa ataaaacgtt tataaaagtt gtatcttgaa acactggtgt tcaacagcta 3489 gcagcttatg tgattcaccc catgccacgt tagtgtcaca aattttatgg tttatctcca 3549 gcaacatttc tctagtactt gcacttatta tcttttgtct aatttaacct taactgaatt 3609 ctccgtttct cctggaggca tttatattca gtgataattc cttcccttag atgcataggg 3669 agagtctcta aatttgatgg aaatggacac ttgagtagtg acttagcctt atgtactctg 3729 ttggaatttg tgctagcagt ttgagcacta gttctgtgtg cctaggaagt taatgctgct 3789 tattgtctca ttctgacttc atggagaatt aatcccacct ttaagcaaag gctactaagt 3849 taatggtatt ttctgtgcag aaattaaatt ttattttcag catttagccc aggaattctt 3909 ccagtaggtg ctcagctatt taaaaacaaa actattctca aacattcatc attagacaac 3969 tggagttttt gctggttttg taacctacca aaatggatag gctgttgaac attccacatt 4029 caaaagtttt gtagggtggt gggaaatggg ggatcttcaa tgtttatttt aaaataaaat 4089 aaaataagtt cttgactttt ctcatgtgtg gttgtggtac atcatattgg aagggttaac 4149 ctgttacttt ggcaaatgag tatttttttg ctagcacctc cccttgcgtg ctttaaatga 4209 catctgcctg ggatgtacca caaccatatg ttacctgtat cttaggggaa tggataaaat 4269 atttgtggtt tactgggtaa tccctagatg atgtatgctt gcagtcctat ataaaactaa 4329 atttgctatc tgtgtagaaa ataatttcat gacatttaca atcaggactg aagtaagttc 4389 ttcacacagt gacctctgaa tcagtttcag agaagggatg ggggagaaaa tgccttctag 4449 gttttgaact tctatgcatt agtgcagatg ttgtgaatgt gtaaaggtgt tcatagtttg 4509 actgtttcta tgtatgtttt ttcaaagaat tgttcctttt tttgaactat aatttttctt 4569 tttttggtta ttttaccatc acagtttaaa tgtatatctt ttatgtctct actcagacca 4629 tatttttaaa ggggtgcctc attatggggc agagaacttt tcaataagtc tcattaagat 4689 ctgaatcttg gttctaagca ttctgtataa tatgtgattg cttgtcctag ctgcagaagg 4749 ccttttgttt ggtcaaatgc atattttagc agagtttcaa ggaaatgatt gtcacacatg 4809 tcactgtagc ctcttggtgt agcaagctca catacaaaat acttttgtat atgcataata 4869 taaatcatct catgtggata tgaaacttct tttttaaaac ttaaaaaggt agaatgttat 4929 tgattacctt gattagggca gttttatttc cagatcctaa taattcctaa aaaatatgga 4989 aaagtttttt ttcaatcatt gtaccttgat attaaaacaa atatccttta agtatttcta 5049 atcagttagc ttctacagtt cttttgtctc cttttatatg cagctcttac gtgggagact 5109 tttccactta aaggagacat agaatgtgtg cttattctca gaaggttcat taactgaggt 5169 gatgagttaa caactagttg agcagtcagc ttcctaagtg ttttaggaca tttgttcatt 5229 atattttccg tcatataact agaggaagtg gaatgcagat aagtgccgaa ttcaaaccct 5289 tcattttatg tttaagctcc tgaatctgca ttccacttgg gttgttttta agcattctaa 5349 attttagttg attataagtt agatttcaca gaatcagtat tgcccttgat cttgtccttt 5409 ttatggagtt aacggggagg aagacccctc aggaaaacga aagtaaattg ttaaggctca 5469 tcttcatacc tttttccatt ttgaatccta caaaaatact gcaaaagact agtgaatgtt 5529 taaaattaca ctagattaaa taatatgaaa gtc 5562 <210> 2 <211> 709 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Ser Ala Thr Ser His Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser Ser Gly 1 5 10 15 Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Gly 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Gln Pro Ser His Ala Thr Glu Gln Arg Pro Gln Lys Glu Pro Ile 450 455 460 Asp Gln Ile Gln Ala Thr Ile Ser Leu Asn Thr Asp Gln Thr Thr Ala 465 470 475 480 Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gln Pro Gln Val Phe Gln Ala Gly 485 490 495 Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser Gly Ile Asn Val Asn Ala Ala Pro 500 505 510 Phe Gln Ser Met Gln Thr Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro 515 520 525 Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gln Gln Asn Gln Tyr Gln Ala Ser 530 535 540 Tyr Asn Gln Ser Phe Ser Ser Gln Pro His Gln Val Glu Gln Thr Glu 545 550 555 560 Leu Gln Gln Glu Gln Leu Gln Thr Val Val Gly Thr Tyr His Gly Ser 565 570 575 Pro Asp Gln Ser His Gln Val Thr Gly Asn His Gln Gln Pro Pro Gln 580 585 590 Gln Asn Thr Gly Phe Pro Arg Ser Asn Gln Pro Tyr Tyr Asn Ser Arg 595 600 605 Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly Leu Met Asn Gly 610 615 620 Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Tyr Arg 625 630 635 640 Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Gln Ser Gln Phe 645 650 655 Ser Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Gly Tyr Gln Arg Asp Gly Tyr Gln Gln 660 665 670 Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly Gln Ser Gly Pro Arg Gly Ala Pro Arg 675 680 685 Gly Arg Gly Gly Pro Pro Arg Pro Asn Arg Gly Met Pro Gln Met Asn 690 695 700 Thr Gln Gln Val Asn 705 <210> 3 <211> 3553 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (190)..(2274) <223> <400> 3 cagagggctg ctggctggct aagtccctcc cgctcccggc tctcgcctca ctaggagcgg 60 ctctcggtgc agcgggacag ggcgaagcgg cctgcgccca cggagcgcgc gacactgccc 120 ggaagggacc gccacccttg ccccctcagc tgcccactcg tgatttccag cggcctccgc 180 gcgcgcacg atg ccc tcg gcc acc agc cac agc ggg agc ggc agc aag tcg 231 Met Pro Ser Ala Thr Ser His Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser 1 5 10 tcc gga ccg cca ccg ccg tcg ggt tcc tcc ggg agt gag gcg gcc gcg 279 Ser Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala 15 20 25 30 gga gcc ggg gcc gcc gcg ccg gct tct cag cac ccc gca acc ggc acc 327 Gly Ala Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gln His Pro Ala Thr Gly Thr 35 40 45 ggc gct gtc cag acc gag gcc atg aag cag att ctc ggg gtg atc gac 375 Gly Ala Val Gln Thr Glu Ala Met Lys Gln Ile Leu Gly Val Ile Asp 50 55 60 aag aaa ctt cgg aac ctg gag aag aaa aag ggt aag ctt gat gat tac 423 Lys Lys Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr 65 70 75 cag gaa cga atg aac aaa ggg gaa agg ctt aat caa gat cag ctg gat 471 Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gln Asp Gln Leu Asp 80 85 90 gcc gtt tct aag tac cag gaa gtc aca aat aat ttg gag ttt gca aaa 519 Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys 95 100 105 110 gaa tta cag agg agt ttc atg gca cta agt caa gat att cag aaa aca 567 Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gln Lys Thr 115 120 125 ata aag aag aca gca cgt cgg gag cag ctt atg aga gaa gaa gct gaa 615 Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu 130 135 140 cag aaa cgt tta aaa act gta ctt gag cta cag tat gtt ttg gac aaa 663 Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu Gln Tyr Val Leu Asp Lys 145 150 155 ttg gga gat gat gaa gtg cgg act gac ctg aaa caa ggt ttg aat gga 711 Leu Gly Asp Asp Glu Val Arg Thr Asp Leu Lys Gln Gly Leu Asn Gly 160 165 170 gtg cca ata ttg tcc gaa gag gag ttg tca ttg ttg gat gaa ttc tat 759 Val Pro Ile Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe Tyr 175 180 185 190 aag cta gta gac cct gaa cgg gac atg agc ttg agg ttg aat gaa cag 807 Lys Leu Val Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu Gln 195 200 205 tat gaa cat gcc tcc att cac ctg tgg gac ctg ctg gaa ggg aag gaa 855 Tyr Glu His Ala Ser Ile His Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly Lys Glu 210 215 220 aaa cct gta tgt gga acc acc tat aaa gtt cta aag gaa att gtt gag 903 Lys Pro Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Val Leu Lys Glu Ile Val Glu 225 230 235 cgt gtt ttt cag tca aac tac ttt gac agc acc cac aac cac cag aat 951 Arg Val Phe Gln Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His Gln Asn 240 245 250 ggg ctg tgt gag gaa gaa gag gca gcc tca gca cct gca gtt gaa gac 999 Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Ala Val Glu Asp 255 260 265 270 cag gta cct gaa gct gaa cct gag cca gca gaa gag tac act gag caa 1047 Gln Val Pro Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu Gln 275 280 285 agt gaa gtt gaa tca aca gag tat gta aat aga cag ttc atg gca gaa 1095 Ser Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gln Phe Met Ala Glu 290 295 300 aca cag ttc acc agt ggt gaa aag gag cag gta gat gag tgg aca gtt 1143 Thr Gln Phe Thr Ser Gly Glu Lys Glu Gln Val Asp Glu Trp Thr Val 305 310 315 gaa acg gtt gag gtg gta aat tca ctc cag cag caa cct cag gct gca 1191 Glu Thr Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gln Gln Gln Pro Gln Ala Ala 320 325 330 tcc cct tca gta cca gag ccc cac tct ttg act cca gtg gct cag gca 1239 Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gln Ala 335 340 345 350 gat ccc ctt gtg aga aga cag cga gta caa gac ctt atg gca caa atg 1287 Asp Pro Leu Val Arg Arg Gln Arg Val Gln Asp Leu Met Ala Gln Met 355 360 365 cag ggt ccc tat aat ttc ata cag gat tca atg ctg gat ttt gaa aat 1335 Gln Gly Pro Tyr Asn Phe Ile Gln Asp Ser Met Leu Asp Phe Glu Asn 370 375 380 cag aca ctt gat cct gcc att gta tct gca cag cct atg aat cca aca 1383 Gln Thr Leu Asp Pro Ala Ile Val Ser Ala Gln Pro Met Asn Pro Thr 385 390 395 caa aac atg gac atg ccc cag ctg gtt tgc cct cca gtt cat tct gaa 1431 Gln Asn Met Asp Met Pro Gln Leu Val Cys Pro Pro Val His Ser Glu 400 405 410 tct aga ctt gct cag cct aat caa gtt cct gta caa cca gaa gcg aca 1479 Ser Arg Leu Ala Gln Pro Asn Gln Val Pro Val Gln Pro Glu Ala Thr 415 420 425 430 cag gtt cct ttg gta tca tcc aca agt gag ggg tac aca gca tct caa 1527 Gln Val Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gln 435 440 445 ccc ttg tac cag cct tct cat gct aca gag caa cga cca cag aag gaa 1575 Pro Leu Tyr Gln Pro Ser His Ala Thr Glu Gln Arg Pro Gln Lys Glu 450 455 460 cca att gat cag att cag gca aca atc tct tta aat aca gac cag act 1623 Pro Ile Asp Gln Ile Gln Ala Thr Ile Ser Leu Asn Thr Asp Gln Thr 465 470 475 aca gca tca tca tcc ctt cct gct gcg tct cag cct caa gta ttt cag 1671 Thr Ala Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gln Pro Gln Val Phe Gln 480 485 490 gct ggg aca agc aaa cct tta cat agc agt gga atc aat gta aat gca 1719 Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser Gly Ile Asn Val Asn Ala 495 500 505 510 gct cca ttc caa tcc atg caa acg gtg ttc aat atg aat gcc cca gtt 1767 Ala Pro Phe Gln Ser Met Gln Thr Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val 515 520 525 cct cct gtt aat gaa cca gaa act tta aaa cag caa aat cag tac cag 1815 Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gln Gln Asn Gln Tyr Gln 530 535 540 gcc agt tat aac cag agc ttt tct agt cag cct cac caa gta gaa caa 1863 Ala Ser Tyr Asn Gln Ser Phe Ser Ser Gln Pro His Gln Val Glu Gln 545 550 555 aca gag ctt cag caa gaa cag ctt caa aca gtg gtt ggc act tac cat 1911 Thr Glu Leu Gln Gln Glu Gln Leu Gln Thr Val Val Gly Thr Tyr His 560 565 570 ggt tcc cca gac cag tcc cat caa gtg act ggt aac cac cag cag cct 1959 Gly Ser Pro Asp Gln Ser His Gln Val Thr Gly Asn His Gln Gln Pro 575 580 585 590 cct cag cag aac act gga ttt cca cgt agc aat cag ccc tat tac aat 2007 Pro Gln Gln Asn Thr Gly Phe Pro Arg Ser Asn Gln Pro Tyr Tyr Asn 595 600 605 agt cgt ggt gtg tct cgt gga ggc tcc cgt ggt gct aga ggc ttg atg 2055 Ser Arg Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly Leu Met 610 615 620 aat gga tac cgg ggc cct gcc aat gga ttc aga gga gga tat gat ggt 2103 Asn Gly Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly 625 630 635 tac cgc cct tca ttc tct aac act cca aac agt ggt tat aca cag tct 2151 Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Gln Ser 640 645 650 cag ttc agt gct ccc cgg gat tac tct ggc tat caa cgg gat gga tat 2199 Gln Phe Ser Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Gly Tyr Gln Arg Asp Gly Tyr 655 660 665 670 cag cag aat ttc aag cga ggc tct ggg cag agt gga cca cgg gga gcc 2247 Gln Gln Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly Gln Ser Gly Pro Arg Gly Ala 675 680 685 cca cga ggt aat att ttg tgg tgg tga tcctagctcc taagtggagc 2294 Pro Arg Gly Asn Ile Leu Trp Trp 690 ttctgttctg gccttggaag agctgttaat agtctgcatg ttaggaatac atttatcctt 2354 tccagacttg ttgctaggga ttaaatgaaa tgctctgttt ctaaaactta atcttggacc 2414 caaattttaa tttttgaatg atttaatttt ccctgttact atataaactg tcttgaaaac 2474 tagaacatat tctcttctca gaaaaagtgt ttttccaact gaaaattatt tttcaggtcc 2534 taaaacctgc taaatgtttt taggaagtac ttactgaaac atttttgtaa gacatttttg 2594 gaatgagatt gaacatttat ataaatttat tattcctctt tcattttttt gaaacatgcc 2654 tattatattt tagggccaga caccctttaa tggccggata agccatagtt aacatttaga 2714 gaaccattta gaagtgatag aactaatgga atttgcaatg ccttttggac ctctattagt 2774 gatataaata tcaagttatt tctgactttt aaacaaaact cccaaattcc taacttattg 2834 agctatactt aaaaaaaatt acaggtttag agagtttttt gtttttcttt tactgttgga 2894 aaactacttc ccattttggc aggaagttaa cctatttaac aattagagct agcatttcat 2954 gtagtctgaa attctaaatg gttctctgat ttgagggagg ttaaacatca aacaggtttc 3014 ctctattggc cataacatgt ataaaatgtg tgttaaggag gaattacaac gtactttgat 3074 ttgaatacta gtagaaactg gccaggaaaa aggtacattt ttctaaaaat taatggatca 3134 cttgggaatt actgacttga ctagaagtat caaaggatgt ttgcatgtga atgtgggtta 3194 tgttctttcc caccttgtag catattcgat gaaagttgag ttaactgata gctaaaaatc 3254 tgttttaaca gcatgtaaaa agttatttta tctgttaaaa gtcattatac agttttgaat 3314 gttatgtagt ttctttttaa cagtttaggt aataaggtct gttttcattc tggtgctttt 3374 attaattttg atagtatgat gttacttact actgaaatgt aagctagagt gtacactaga 3434 atgtaagctc catgagagca ggtaccttgt ctgtcttctc tgctgtatct attcccaacg 3494 cttgatgatg gtgcctggca catagtaggc actcaataaa tatttgttga atgaatgaa 3553 <210> 4 <211> 694 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Pro Ser Ala Thr Ser His Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser Ser Gly 1 5 10 15 Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Gly Ala 20 25 30 Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gln His Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ala 35 40 45 Val Gln Thr Glu Ala Met Lys Gln Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys 50 55 60 Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu 65 70 75 80 Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val 85 90 95 Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu 100 105 110 Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys 115 120 125 Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys 130 135 140 Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu Gln Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly 145 150 155 160 Asp Asp Glu Val Arg Thr Asp Leu Lys Gln Gly Leu Asn Gly Val Pro 165 170 175 Ile Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu 180 185 190 Val Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu Gln Tyr Glu 195 200 205 His Ala Ser Ile His Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lys Pro 210 215 220 Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Val Leu Lys Glu Ile Val Glu Arg Val 225 230 235 240 Phe Gln Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His Gln Asn Gly Leu 245 250 255 Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Ala Val Glu Asp Gln Val 260 265 270 Pro Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu Gln Ser Glu 275 280 285 Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gln Phe Met Ala Glu Thr Gln 290 295 300 Phe Thr Ser Gly Glu Lys Glu Gln Val Asp Glu Trp Thr Val Glu Thr 305 310 315 320 Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gln Gln Gln Pro Gln Ala Ala Ser Pro 325 330 335 Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gln Ala Asp Pro 340 345 350 Leu Val Arg Arg Gln Arg Val Gln Asp Leu Met Ala Gln Met Gln Gly 355 360 365 Pro Tyr Asn Phe Ile Gln Asp Ser Met Leu Asp Phe Glu Asn Gln Thr 370 375 380 Leu Asp Pro Ala Ile Val Ser Ala Gln Pro Met Asn Pro Thr Gln Asn 385 390 395 400 Met Asp Met Pro Gln Leu Val Cys Pro Pro Val His Ser Glu Ser Arg 405 410 415 Leu Ala Gln Pro Asn Gln Val Pro Val Gln Pro Glu Ala Thr Gln Val 420 425 430 Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gln Pro Leu 435 440 445 Tyr Gln Pro Ser His Ala Thr Glu Gln Arg Pro Gln Lys Glu Pro Ile 450 455 460 Asp Gln Ile Gln Ala Thr Ile Ser Leu Asn Thr Asp Gln Thr Thr Ala 465 470 475 480 Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gln Pro Gln Val Phe Gln Ala Gly 485 490 495 Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser Gly Ile Asn Val Asn Ala Ala Pro 500 505 510 Phe Gln Ser Met Gln Thr Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro 515 520 525 Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gln Gln Asn Gln 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105 Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln Leu 5 10 15 20 atg aga gag gaa gcg gaa caa aaa cgt tta aaa act gta ctt gag ctc 153 Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu 25 30 35 cag tat gtt ttg gac aaa ttg gga gat gat gaa gtg aga act gac ctg 201 Gln Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly Asp Asp Glu Val Arg Thr Asp Leu 40 45 50 aag caa ggt ttg aat gga gtg cca ata ttg tct gaa gaa gaa ttg tcg 249 Lys Gln Gly Leu Asn Gly Val Pro Ile Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser 55 60 65 ttg ttg gat gaa ttc tac aaa tta gca gac cct gaa cgg gac atg agc 297 Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu Ala Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser 70 75 80 ttg agg ttg aat gag cag tat gaa cat gct tcc att cac ctg tgg gac 345 Leu Arg Leu Asn Glu Gln Tyr Glu His Ala Ser Ile His Leu Trp Asp 85 90 95 100 ttg ctg gaa gga aag gaa aag tct gta tgt gga aca acc tat aaa gca 393 Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lys Ser Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Ala 105 110 115 cta aag gaa att gtt gag cgt gtt ttc cag tca aat tac ttt gac agc 441 Leu Lys Glu Ile Val Glu Arg Val Phe Gln Ser Asn Tyr Phe Asp Ser 120 125 130 act cac aac cac cag aat ggg cta tgt gag gaa gaa gag gca gcc tca 489 Thr His Asn His Gln Asn Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser 135 140 145 gca cct aca gtt gaa gac cag gta gct gaa gct gag cct gag cca gca 537 Ala Pro Thr Val Glu Asp Gln Val Ala Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala 150 155 160 gaa gaa tac act gaa caa agt gaa gtt gaa tca aca gag tat gta aat 585 Glu Glu Tyr Thr Glu Gln Ser Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn 165 170 175 180 aga caa ttt atg gca gaa aca cag ttc agc agt ggt gaa aag gag cag 633 Arg Gln Phe Met Ala Glu Thr Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Glu Gln 185 190 195 gta gat gag tgg acg gtc gaa aca gtg gag gtg gtg aat tca ctc cag 681 Val Asp Glu Trp Thr Val Glu Thr Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gln 200 205 210 cag caa cct cag gct gcg tct cct tca gta cca gag ccc cac tct ttg 729 Gln Gln Pro Gln Ala Ala Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu 215 220 225 act ccg gtg gct cag gca gat ccc ctt gtg aga aga cag cga gtc cag 777 Thr Pro Val Ala Gln Ala Asp Pro Leu Val Arg Arg Gln Arg Val Gln 230 235 240 gac ctt atg gcg cag atg cag ggg ccc tat aat ttc ata cag gat tca 825 Asp Leu Met Ala Gln Met Gln Gly Pro Tyr Asn Phe Ile Gln Asp Ser 245 250 255 260 atg ctg gat ttt gaa aac cag aca ctc gat cct gcc att gta tct gca 873 Met Leu Asp Phe Glu Asn Gln Thr Leu Asp Pro Ala Ile Val Ser Ala 265 270 275 cag cct atg aat ccg aca caa aac atg gac atg ccc cag ctg gtt tgc 921 Gln Pro Met Asn Pro Thr Gln Asn Met Asp Met Pro Gln Leu Val Cys 280 285 290 cct cca gtt cat tct gaa tct aga ctt gct caa cct aat caa gtt cct 969 Pro Pro Val His Ser Glu Ser Arg Leu Ala Gln Pro Asn Gln Val Pro 295 300 305 gta caa cca gaa gct aca cag gtt cct ttg gtt tca tcc aca agt gag 1017 Val Gln Pro Glu Ala Thr Gln Val Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser Glu 310 315 320 ggg tat aca gca tct caa ccc ttg tac cag cct tct cat gct aca gag 1065 Gly Tyr Thr Ala Ser Gln Pro Leu Tyr Gln Pro Ser His Ala Thr Glu 325 330 335 340 caa cga cca caa aag gaa cca att gac cag att cag gca aca atc tct 1113 Gln Arg Pro Gln Lys Glu Pro Ile Asp Gln Ile Gln Ala Thr Ile Ser 345 350 355 tta aat aca gac cag act aca gcg tca tca tcc ctt ccg gct gct tct 1161 Leu Asn Thr Asp Gln Thr Thr Ala Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser 360 365 370 cag cct cag gta ttc cag gct ggg aca agc aaa cca tta cat agc agt 1209 Gln Pro Gln Val Phe Gln Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser 375 380 385 gga atc aat gta aat gca gct cca ttc caa tcc atg caa acg gtg ttc 1257 Gly Ile Asn Val Asn Ala Ala Pro Phe Gln Ser Met Gln Thr Val Phe 390 395 400 aat atg aat gcc cca gtt cct cct gtt aat gaa cca gaa act ttg aaa 1305 Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys 405 410 415 420 caa caa aat cag tac cag gcc agt tat aac cag agc ttt tct agt cag 1353 Gln Gln Asn Gln Tyr Gln Ala Ser Tyr Asn Gln Ser Phe Ser Ser Gln 425 430 435 cct cac caa gta gaa caa aca gag gga tgc cgc aaa tga acactcagca 1402 Pro His Gln Val Glu Gln Thr Glu Gly Cys Arg Lys 440 445 agtgaattaa tctgattcac aggattatgt ttaaacgcca aaaacacact ggccagtgta 1462 ccataatatg ttaccagaag agttattatc tatttgttct ccctttcagg aaacttattg 1522 taaagggact gttttcatcc cataaagaca ggactacaat tgtcagcttt atattacctg 1582 gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1605 <210> 6 <211> 448 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 6 Met Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr Ala Arg 1 5 10 15 Arg Glu Gln Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu Lys Thr 20 25 30 Val Leu Glu Leu Gln Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly Asp Asp Glu Val 35 40 45 Arg Thr Asp Leu Lys Gln Gly Leu Asn Gly Val Pro Ile Leu Ser Glu 50 55 60 Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu Ala Asp Pro Glu 65 70 75 80 Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu Gln Tyr Glu His Ala Ser Ile 85 90 95 His Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lys Ser Val Cys Gly Thr 100 105 110 Thr Tyr Lys Ala Leu Lys Glu Ile Val Glu Arg Val Phe Gln Ser Asn 115 120 125 Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His Gln Asn Gly Leu Cys Glu Glu Glu 130 135 140 Glu Ala Ala Ser Ala Pro Thr Val Glu Asp Gln Val Ala Glu Ala 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Ala Thr Gly Thr Gly Ala Val Gln Thr Glu Ala Met Lys Gln 50 55 60 atc ctc ggg gtg atc gac aag aaa ctc cgg aac ctg gag aag aaa aag 240 Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys 65 70 75 80 ggc aag ctt gat gat tac cag gaa cga atg aac aaa ggg gaa agg ctt 288 Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu 85 90 95 aat caa gat cag ctg gat gcc gta tct aag tac cag gaa gtc aca aat 336 Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn 100 105 110 aac ttg gag ttt gca aaa gaa tta cag agg agt ttc atg gca tta agt 384 Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser 115 120 125 caa gat att cag aaa aca ata aag aag act gca cgt cgg gag cag ctt 432 Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln Leu 130 135 140 atg aga gag gaa gcg gaa caa aaa cgt tta aaa act gta ctt gag ctc 480 Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu 145 150 155 160 cag tat gtt ttg gac aaa ttg gga gat gat gaa gtg aga act gac ctg 528 Gln Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly Asp Asp Glu Val Arg Thr Asp Leu 165 170 175 aag caa ggt ttg aat gga gtg cca ata ttg tct gaa gaa gaa ttg tcg 576 Lys Gln Gly Leu Asn Gly Val Pro Ile Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser 180 185 190 ttg ttg gat gaa ttc tac aaa tta gca gac cct gaa cgg gac atg agc 624 Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu Ala Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser 195 200 205 ttg agg ttg aat gag cag tat gaa cat gct tcc att cac ctg tgg gac 672 Leu Arg Leu Asn Glu Gln Tyr Glu His Ala Ser Ile His Leu Trp Asp 210 215 220 ttg ctg gaa gga aag gaa aag tct gta tgt gga aca acc tat aaa gca 720 Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lys Ser Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Ala 225 230 235 240 cta aag gaa att gtt gag cgt gtt ttc cag tca aat tac ttt gac agc 768 Leu Lys Glu Ile Val Glu Arg Val Phe Gln Ser Asn Tyr Phe Asp Ser 245 250 255 act cac aac cac cag aat ggg cta tgt gag gaa gaa gag gca gcc tca 816 Thr His Asn His Gln Asn Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser 260 265 270 gca cct aca gtt gaa gac cag gta gct gaa gct gag cct gag cca gca 864 Ala Pro Thr Val Glu Asp Gln Val Ala Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala 275 280 285 gaa gaa tac act gaa caa agt gaa gtt gaa tca aca gag tat gta aat 912 Glu Glu Tyr Thr Glu Gln Ser Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn 290 295 300 aga caa ttt atg gca gaa aca cag ttc agc agt ggt gaa aag gag cag 960 Arg Gln Phe Met Ala Glu Thr Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Glu Gln 305 310 315 320 gta gat gag tgg acg gtc gaa aca gtg gag gtg gtg aat tca ctc cag 1008 Val Asp Glu Trp Thr Val Glu Thr Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gln 325 330 335 cag caa cct cag gct gcg tct cct tca gta cca gag ccc cac tct ttg 1056 Gln Gln Pro Gln Ala Ala Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu 340 345 350 act ccg gtg gct cag gca gat ccc ctt gtg aga aga cag cga gtc cag 1104 Thr Pro Val Ala Gln Ala Asp Pro Leu Val Arg Arg Gln Arg Val Gln 355 360 365 gac ctt atg gcg cag atg cag ggg ccc tat aat ttc ata cag gat tca 1152 Asp Leu Met Ala Gln Met Gln Gly Pro Tyr Asn Phe Ile Gln Asp Ser 370 375 380 atg ctg gat ttt gaa aac cag aca ctc gat cct gcc att gta tct gca 1200 Met Leu Asp Phe Glu Asn Gln Thr Leu Asp Pro Ala Ile Val Ser Ala 385 390 395 400 cag cct atg aat ccg aca caa aac atg gac atg ccc cag ctg gtt tgc 1248 Gln Pro Met Asn Pro Thr Gln Asn Met Asp Met Pro Gln Leu Val Cys 405 410 415 cct cca gtt cat tct gaa tct aga ctt gct caa cct aat caa gtt cct 1296 Pro Pro Val His Ser Glu Ser Arg Leu Ala Gln Pro Asn Gln Val Pro 420 425 430 gta caa cca gaa gct aca cag gtt cct ttg gtt tca tcc aca agt gag 1344 Val Gln Pro Glu Ala Thr Gln Val Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser Glu 435 440 445 ggg tat aca gca tct caa ccc ttg tac cag cct tct cat gct aca gag 1392 Gly Tyr Thr Ala Ser Gln Pro Leu Tyr Gln Pro Ser His Ala Thr Glu 450 455 460 caa cga cca caa aag gaa cca att gac cag att cag gca aca atc tct 1440 Gln Arg Pro Gln Lys Glu Pro Ile Asp Gln Ile Gln Ala Thr Ile Ser 465 470 475 480 tta aat aca gac cag act aca gcg tca tca tcc ctt ccg gct gct tct 1488 Leu Asn Thr Asp Gln Thr Thr Ala Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser 485 490 495 cag cct cag gta ttc cag gct ggg aca agc aaa cca tta cat agc agt 1536 Gln Pro Gln Val Phe Gln Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser 500 505 510 gga atc aat gta aat gca gct cca ttc caa tcc atg caa acg gtg ttc 1584 Gly Ile Asn Val Asn Ala Ala Pro Phe Gln Ser Met Gln Thr Val Phe 515 520 525 aat atg aat gcc cca gtt cct cct gtt aat gaa cca gaa act ttg aaa 1632 Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys 530 535 540 caa caa aat cag tac cag gcc agt tat aac cag agc ttt tct agt cag 1680 Gln Gln Asn Gln Tyr Gln Ala Ser Tyr Asn Gln Ser Phe Ser Ser Gln 545 550 555 560 cct cac caa gta gaa caa aca gac ctt cag caa gaa cag ctt caa aca 1728 Pro His Gln Val Glu Gln Thr Asp Leu Gln Gln Glu Gln Leu Gln Thr 565 570 575 gtg gtt ggc act tac cat ggt tcc cag gac cag ccc cac caa gtg act 1776 Val Val Gly Thr Tyr His Gly Ser Gln Asp Gln Pro His Gln Val Thr 580 585 590 ggt aac cat cag cag cct ccc cag cag aac act gga ttt cca cgt agc 1824 Gly Asn His Gln Gln Pro Pro Gln Gln Asn Thr Gly Phe Pro Arg Ser 595 600 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715 tctgattcac aggattatgt ttaaacgcca aaaacacact ggccagtgta ccataatatg 2214 ttaccagaag agttattatc tatttgttct ccctttcagg aaacttattg taaagggact 2274 gttttcatcc cataaagaca ggactacaat tgtcagcttt atattacctg gatatggaag 2334 gaaactattt ttattctgca tgttcttcct aagcgtcatc ttgagccttg cacatgatac 2394 tcagattcct cacccttgct taggagtaaa acataataca ctttacaggg tgatatctcc 2454 atagttattt gaagtggctt ggaaaaagca agattaactt ctgacattgg ataaaaatca 2514 acaaatcagc cctagagtta ttcaaatggt aattgacaaa aactaaaata tttcccttcg 2574 agaaggagtg gaatgtggtt tggcagaaca actgcatttc acagcttttc cggttaaatt 2634 ggagcactaa acgtttagat gcataccaaa ttatgcatgg gcccttaata taaaaggctg 2694 gctaccagct ttgacacagc actattcatc ctctggccaa acaactgtgg ttaaacaaca 2754 catgtaaatt gctttttaac agctgatact ataataagac aaagccaaaa tgcaaaaatt 2814 gggctttgat tggcactttt tgaaaaatat gcaacaaata tgggatgtaa tctggatggc 2874 cgcttctgta cttaatgtga agtatttaga tacctttttg aacacttaac agtttcttct 2934 gacaatgact tttgtaagga ttggtactat ctatcattcc ttataatgta cattgtctgt 2994 cactaatcct cagatcttgc tgtattgtca cctaaattgg tacaggtact gatgaaaata 3054 tctaatggat aatcataaca ctcttggtca catgtttttc ctgcagcctg aaggttttta 3114 aaagaaaaag atatcaaatg cctgctgcta ccaccctttt aaattgctat cttttgaaaa 3174 gcaccagtat gtgttttaga ttgatttccc tattttaggg aaatgacaga cagtagtttc 3234 agttctgatg gtataagcaa aacaaataaa acatgtttat aaaagttgta tcttgaaaca 3294 ctggtgttca acagctagca gcttatgtgg ttcaccccat gcattgttag tgtttcagat 3354 tttatggtta tctccagcag ctgtttctgt agtacttgca tttatctttt gtctaaccct 3414 aatattctca cggaggcatt tatattcaaa gtggtgatcc cttcacttag acgcataggg 3474 agagtcacaa gtttgatgaa gaggacagtg tagtaattta tatgctgttg gaatttgtgc 3534 tagcagtttg agcactagtt ctgtgtgcct atgaacttaa tgctgcttgt catattccac 3594 tttgacttca tggagaatta atcccatcta ctcagcaaag gctatactaa tactaagtta 3654 atggtatttt ctgtgcagaa attgaatttt gttttattag catttagcta aggaattttt 3714 ccagtaggtg ctcagctact aaagaaaaac aaaaacaaga cacaaaacta ttctcaaaca 3774 ttcattgtta gacaactgga gtttttgctg gttttgtaac ctactaaaat ggataggctg 3834 ttgaacattc cacattcaaa agttttttgt agggtggtgg ggaagggggg gtgtcttcaa 3894 tgtttatttt aaaataaaat aagttcttga cttttctcat gtgtggttgt ggtacatcat 3954 attggaaggg ttatctgttt acttttgcaa atgagtattt ctcttgctag cacctcccgt 4014 tgtgcgcttt aaatgacatc tgcctgggat gtaccacaac catatgttag ctgtatttta 4074 tggggaatag ataaaatatt cgtggtttat tgggtaatcc ctagatgtgt atgcttacaa 4134 tcctatatat aaaactaaat 4154 <210> 8 <211> 717 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 8 Met Pro Ser Ala Thr Ser Leu Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser Ser Gly 1 5 10 15 Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gln 35 40 45 His Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ala Val Gln Thr Glu Ala Met Lys Gln 50 55 60 Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys 65 70 75 80 Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu 85 90 95 Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn 100 105 110 Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gln Arg 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ttc atg gca tta agt 384 Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser 115 120 125 caa gat att cag aaa aca ata aag aag act gca cgt cgg gag cag ctt 432 Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln Leu 130 135 140 atg aga gag gaa gcg gaa caa aaa cgt tta aaa act gta ctt gag ctc 480 Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu 145 150 155 160 cag tat gtt ttg gac aaa ttg gga gat gat gaa gtg aga act gac ctg 528 Gln Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly Asp Asp Glu Val Arg Thr Asp Leu 165 170 175 aag caa ggt ttg aat gga gtg cca ata ttg tct gaa gaa gaa ttg tcg 576 Lys Gln Gly Leu Asn Gly Val Pro Ile Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser 180 185 190 ttg ttg gat gaa ttc tac aaa tta gca gac cct gaa cgg gac atg agc 624 Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu Ala Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser 195 200 205 ttg agg ttg aat gag cag tat gaa cat gct tcc att cac ctg tgg gac 672 Leu Arg Leu Asn Glu Gln Tyr Glu His Ala Ser Ile His Leu Trp Asp 210 215 220 ttg ctg gaa gga aag gaa aag tct gta tgt gga aca acc tat aaa gca 720 Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lys Ser Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Ala 225 230 235 240 cta aag gaa att gtt gag cgt gtt ttc cag tca aat tac ttt gac agc 768 Leu Lys Glu Ile Val Glu Arg Val Phe Gln Ser Asn Tyr Phe Asp Ser 245 250 255 act cac aac cac cag aat ggg cta tgt gag gaa gaa gag gca gcc tca 816 Thr His Asn His Gln Asn Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser 260 265 270 gca cct aca gtt gaa gac cag gta gct gaa gct gag cct gag cca gca 864 Ala Pro Thr Val Glu Asp Gln Val Ala Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala 275 280 285 gaa gaa tac act gaa caa agt gaa gtt gaa tca aca gag tat gta aat 912 Glu Glu Tyr Thr Glu Gln Ser Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn 290 295 300 aga caa ttt atg gca gaa aca cag ttc agc agt ggt gaa aag gag cag 960 Arg Gln Phe Met Ala Glu Thr Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Glu Gln 305 310 315 320 gta gat gag tgg acg gtc gaa aca gtg gag gtg gtg aat tca ctc cag 1008 Val Asp Glu Trp Thr Val Glu Thr Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gln 325 330 335 cag caa cct cag gct gcg tct cct tca gta cca gag ccc cac tct ttg 1056 Gln Gln Pro Gln Ala Ala Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu 340 345 350 act ccg gtg gct cag gca gat ccc ctt gtg aga aga cag cga gtc cag 1104 Thr Pro Val Ala Gln Ala Asp Pro Leu Val Arg Arg Gln Arg Val Gln 355 360 365 gac ctt atg gcg cag atg cag ggg ccc tat aat ttc ata cag gat tca 1152 Asp Leu Met Ala Gln Met Gln Gly Pro Tyr Asn Phe Ile Gln Asp Ser 370 375 380 atg ctg gat ttt gaa aac cag aca ctc gat cct gcc att gta tct gca 1200 Met Leu Asp Phe Glu Asn Gln Thr Leu Asp Pro Ala Ile Val Ser Ala 385 390 395 400 cag cct atg aat ccg aca caa aac atg gac atg ccc cag ctg gtt tgc 1248 Gln Pro Met Asn Pro Thr Gln Asn Met Asp Met Pro Gln Leu Val Cys 405 410 415 cct cca gtt cat tct gaa tct aga ctt gct caa cct aat caa gtt cct 1296 Pro Pro Val His Ser Glu Ser Arg Leu Ala Gln Pro Asn Gln Val Pro 420 425 430 gta caa cca gaa gct aca cag gtt cct ttg gtt tca tcc aca agt gag 1344 Val Gln Pro Glu Ala Thr Gln Val Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser Glu 435 440 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ctatatttaa aaattacagg tttaaggagt 2709 ttctggtttt ttttctctta ccataggaaa actgtttcct gtttggccag gaagtcaacc 2769 tgtgtaataa ttagaagtag catttcatat gatctgaagt tctaaatggt tctctgattt 2829 aagggaagtt aaattgaata ggtttcctct agttattggc cataacatgt ataaaatgta 2889 tattaaggag gaatacaaag tactttgatt tcaatgctag tagaaactgg ccagcaaaaa 2949 ggtgcatttt atttttaaat taatggatca cttgggaatt actgacttga agtatcaaag 3009 gatatttgca tgtgaatgtg ggttatgttc tttctcacct tgtagcatat tctatgaaag 3069 ttgagttgac tggtagctaa aaatctgttt taacagcatg taaaaagtta ttttatctgt 3129 tacaagtcat tatacaattt tgaatgttat gtagtttctt tttaacagtt taggtaacaa 3189 ggtctgtttt tcattctggt gcttttatta attttgatag tatgatgtta cttactactg 3249 aaatgtaagc tagagtgtac actagaatgt aagctccatg agagcaggta ccttgtctgt 3309 cttcactgct gtatctattt ccaacgcctg atgacagtgc ctgacacata gtaggcactc 3369 aataaatact tgttgaatga atgaatgaat gagtactggt ggaatactcc attagctcta 3429 ctcttctttt agctagagaa catgagcaaa tttgcgcatg acaacttcca ggacaggtga 3489 acactgaaga attgacctct taaacctaat 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caa cct aat caa gtt cct 1296 Pro Pro Val His Ser Glu Ser Arg Leu Ala Gln Pro Asn Gln Val Pro 420 425 430 gta caa cca gaa gct aca cag gtt cct ttg gtt tca tcc aca agt gag 1344 Val Gln Pro Glu Ala Thr Gln Val Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser Glu 435 440 445 ggg tat aca gca tct caa ccc ttg tac cag cct tct cat gct aca gag 1392 Gly Tyr Thr Ala Ser Gln Pro Leu Tyr Gln Pro Ser His Ala Thr Glu 450 455 460 caa cga cca caa aag gaa cca att gac cag att cag gca aca atc tct 1440 Gln Arg Pro Gln Lys Glu Pro Ile Asp Gln Ile Gln Ala Thr Ile Ser 465 470 475 480 tta aat aca gac cag act aca gcg tca tca tcc ctt ccg gct gct tct 1488 Leu Asn Thr Asp Gln Thr Thr Ala Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser 485 490 495 cag cct cag gta ttc cag gct ggg aca agc aaa cca tta cat agc agt 1536 Gln Pro Gln Val Phe Gln Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser 500 505 510 gga atc aat gta aat gca gct cca ttc caa tcc atg caa acg gtg ttc 1584 Gly Ile Asn Val Asn Ala Ala Pro Phe Gln Ser Met Gln Thr Val Phe 515 520 525 aat atg aat gcc cca 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Ser Met Gln Thr Val Phe 515 520 525 aat atg aat gcc cca gtt cct cct gtt aat gaa cca gaa act ttg aaa 1632 Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys 530 535 540 caa caa aat cag tac cag gcc agt tat aac cag agc ttt tct agt cag 1680 Gln Gln Asn Gln Tyr Gln Ala Ser Tyr Asn Gln Ser Phe Ser Ser Gln 545 550 555 560 cct cac caa gta gaa caa aca gac ctt cag caa gaa cag ctt caa aca 1728 Pro His Gln Val Glu Gln Thr Asp Leu Gln Gln Glu Gln Leu Gln Thr 565 570 575 gtg gtt ggc act tac cat ggt tcc cag gac cag ccc cac caa gtg act 1776 Val Val Gly Thr Tyr His Gly Ser Gln Asp Gln Pro His Gln Val Thr 580 585 590 ggt aac cat cag cag cct ccc cag cag aac act gga ttt cca cgt agc 1824 Gly Asn His Gln Gln Pro Pro Gln Gln Asn Thr Gly Phe Pro Arg Ser 595 600 605 agt cag ccc tat tac aat agt cgt ggt gtg tct cgt ggt ggt tcc cgt 1872 Ser Gln Pro Tyr Tyr Asn Ser Arg Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser Arg 610 615 620 ggt gct aga ggc tta atg aat gga tac agg ggc cct gcc aat gga ttc 1920 Gly Ala Arg Gly Leu 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Ser Leu Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser Ser Gly 1 5 10 15 Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gln 35 40 45 His Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ala Val Gln Thr Glu Ala Met Lys Gln 50 55 60 Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys 65 70 75 80 Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu 85 90 95 Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn 100 105 110 Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser 115 120 125 Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln Leu 130 135 140 Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu 145 150 155 160 Gln Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly Asp Asp Glu Val Arg Thr Asp Leu 165 170 175 Lys Gln Gly Leu Asn Gly Val Pro Ile Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser 180 185 190 Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu Ala Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser 195 200 205 Leu Arg Leu Asn Glu Gln Tyr Glu His Ala Ser Ile His Leu Trp Asp 210 215 220 Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lys Ser Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Ala 225 230 235 240 Leu Lys Glu Ile Val Glu Arg Val Phe Gln Ser Asn Tyr Phe Asp Ser 245 250 255 Thr His Asn His Gln Asn Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser 260 265 270 Ala Pro Thr Val Glu Asp Gln Val Ala Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala 275 280 285 Glu Glu Tyr Thr Glu Gln Ser Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn 290 295 300 Arg Gln Phe Met Ala Glu Thr Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Glu Gln 305 310 315 320 Val Asp Glu Trp Thr Val Glu Thr Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gln 325 330 335 Gln Gln Pro Gln Ala Ala Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu 340 345 350 Thr Pro Val Ala Gln Ala Asp Pro Leu Val Arg Arg Gln Arg Val Gln 355 360 365 Asp Leu Met Ala Gln Met Gln Gly Pro Tyr Asn Phe Ile Gln Asp Ser 370 375 380 Met Leu Asp Phe Glu Asn Gln Thr Leu Asp Pro Ala Ile Val Ser Ala 385 390 395 400 Gln Pro Met Asn Pro Thr Gln Asn Met Asp Met Pro Gln Leu Val Cys 405 410 415 Pro Pro Val His Ser Glu Ser Arg Leu Ala Gln Pro Asn Gln Val Pro 420 425 430 Val Gln Pro Glu Ala Thr Gln Val Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser Glu 435 440 445 Gly Tyr Thr Ala Ser Gln Pro Leu Tyr Gln Pro Ser His Ala Thr Glu 450 455 460 Gln Arg Pro Gln Lys Glu Pro Ile Asp Gln Ile Gln Ala Thr Ile Ser 465 470 475 480 Leu Asn Thr Asp Gln Thr Thr Ala Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser 485 490 495 Gln Pro Gln Val Phe Gln Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser 500 505 510 Gly Ile Asn Val Asn Ala Ala Pro Phe Gln Ser Met Gln Thr Val Phe 515 520 525 Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys 530 535 540 Gln Gln Asn Gln Tyr Gln Ala Ser Tyr Asn Gln Ser Phe Ser Ser Gln 545 550 555 560 Pro His Gln Val Glu Gln Thr Asp Leu Gln Gln Glu Gln Leu Gln Thr 565 570 575 Val Val Gly Thr Tyr His Gly Ser Gln Asp Gln Pro His Gln Val Thr 580 585 590 Gly Asn His Gln Gln Pro Pro Gln Gln Asn Thr Gly Phe Pro Arg Ser 595 600 605 Ser Gln Pro Tyr Tyr Asn Ser Arg Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser Arg 610 615 620 Gly Ala Arg Gly Leu Met Asn Gly Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly Phe 625 630 635 640 Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro Asn 645 650 655 Ser Gly Tyr Thr Gln Ser Gln Phe Ser Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Gly 660 665 670 Tyr Gln Arg Asp Gly Tyr Gln Gln Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly Gln 675 680 685 Ser Gly Pro Arg Gly Ala Pro Arg Gly Arg Gly Gly Pro Pro Arg Pro 690 695 700 Asn Arg Gly Met Pro Gln Met Asn Thr Gln Gln Val Asn 705 710 715 <210> 15 <211> 3386 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> CDS <222> (82)..(2208) <223> <400> 15 cgcgtctcgc cccgtccacc gattgactcg ccgctcttgt ccttcctccc gctctttctt 60 ctctcccctt acggtttcaa g atg cct tcg gcc acc agc cac agc gga agc 111 Met Pro Ser Ala Thr Ser His Ser Gly Ser 1 5 10 ggc agc aag tcg tcc gga ccg cca ccg ccg tcg ggt tcc tcc ggg aat 159 Gly Ser Lys Ser Ser Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Asn 15 20 25 gag gcg ggg gcc ggg gcc gcc gcg ccg gct tcc caa cac ccc atg acc 207 Glu Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gln His Pro Met Thr 30 35 40 ggc acc ggg gct gtc cag acc gag gcc atg aag cag att ctc ggg gtg 255 Gly Thr Gly Ala Val Gln Thr Glu Ala Met Lys Gln Ile Leu Gly Val 45 50 55 atc gac aag aaa ctt cgg aac ctg gag aag aaa aag ggc aag ctt gat 303 Ile Asp Lys Lys Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp 60 65 70 gat tat cag gaa cga atg aac aaa ggg gaa agg ctt aat caa gat cag 351 Asp Tyr Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gln Asp Gln 75 80 85 90 ctg gat gcc gtg tct aag tac cag gaa gtc aca aat aac ttg gag ttt 399 Leu Asp Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe 95 100 105 gca aaa gaa tta cag agg agt ttc atg gca tta agc caa gat att cag 447 Ala Lys Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gln 110 115 120 aaa aca ata aag aag aca gca cgt cgg gag cag ctt atg aga gag gaa 495 Lys Thr Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln Leu Met Arg Glu Glu 125 130 135 gct gaa cag aaa cgt tta aaa aca gta ctt gag ctg cag tat gtt ttg 543 Ala Glu Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu Gln Tyr Val Leu 140 145 150 gac aaa cta gga gat gat gaa gtg aga act gac ctg aag caa ggt ttg 591 Asp Lys Leu Gly Asp Asp Glu Val Arg Thr Asp Leu Lys Gln Gly Leu 155 160 165 170 aat gga gtg cca ata ttg tct gaa gag gag ttg tcg ttg tta gat gag 639 Asn Gly Val Pro Ile Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu 175 180 185 ttc tac aaa tta gca gac cct gaa cga gac atg agc ttg agg ttg aat 687 Phe Tyr Lys Leu Ala Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn 190 195 200 gag cag tat gaa cat gcc tcc att cac ctg tgg gac ttg ctg gaa gga 735 Glu Gln Tyr Glu His Ala Ser Ile His Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly 205 210 215 aag gaa aaa cct gta tgt gga aca act tat aaa gct cta aag gaa att 783 Lys Glu Lys Pro Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Ala Leu Lys Glu Ile 220 225 230 gtt gag cgt gtt ttc cag tca aac tac ttt gac agc acc cac aac cac 831 Val Glu Arg Val Phe Gln Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His 235 240 245 250 cag aat ggt ctg tgt gag gaa gag gag gca gcc tca gca cct aca gtt 879 Gln Asn Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Thr Val 255 260 265 gaa gac cag gca gct gaa gct gaa cct gag cca gtg gaa gaa tat act 927 Glu Asp Gln Ala Ala Glu Ala Glu Pro Glu Pro Val Glu Glu Tyr Thr 270 275 280 gaa caa aat gag gtt gaa tca aca gag tat gta aat aga caa ttt atg 975 Glu Gln Asn Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gln Phe Met 285 290 295 gca gaa aca cag ttc agc agt ggt gaa aag gag cag gta gat gat tgg 1023 Ala Glu Thr Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Glu Gln Val Asp Asp Trp 300 305 310 aca gtt gaa aca gtt gag gtg gta aat tca ctc cag cag caa cct cag 1071 Thr Val Glu Thr Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gln Gln Gln Pro Gln 315 320 325 330 gct gca tct cct tca gta cca gaa ccc cac tct ttg acc cca gtg gct 1119 Ala Ala Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala 335 340 345 caa gcc gat ccc ctc gtg aga aga cag cga gta cag gac ctt atg gca 1167 Gln Ala Asp Pro Leu Val Arg Arg Gln Arg Val Gln Asp Leu Met Ala 350 355 360 caa atg cag ggg ccc tat aat ttc ata cag gat tca atg ttg gat ttt 1215 Gln Met Gln Gly Pro Tyr Asn Phe Ile Gln Asp Ser Met Leu Asp Phe 365 370 375 gaa aac cag aca ctt gat cct gcc att gta tct gca cag ccg atg aat 1263 Glu Asn Gln Thr Leu Asp Pro Ala Ile Val Ser Ala Gln Pro Met Asn 380 385 390 cca gca cag aac atg gac ata ccc cag ctg gtt tgc cct cca gtt cat 1311 Pro Ala Gln Asn Met Asp Ile Pro Gln Leu Val Cys Pro Pro Val His 395 400 405 410 tct gaa tct aga ctt gct caa cct aat caa gtt tct gta cag cca gaa 1359 Ser Glu Ser Arg Leu Ala Gln Pro Asn Gln Val Ser Val Gln Pro Glu 415 420 425 gct aca cag gtt cct ttg gtt tca tcc aca agt gag gga tat aca gca 1407 Ala Thr Gln Val Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala 430 435 440 tct caa ccc ttg tac caa cct tct cat gct act gac caa cga cca caa 1455 Ser Gln Pro Leu Tyr Gln Pro Ser His Ala Thr Asp Gln Arg Pro Gln 445 450 455 aag gaa ccg att gat cag att cag gcg acg atc tct tta aat aca gac 1503 Lys Glu Pro Ile Asp Gln Ile Gln Ala Thr Ile Ser Leu Asn Thr Asp 460 465 470 cag act aca gca tca tca tcc ctt cct gct gct tct cag cct caa gtg 1551 Gln Thr Thr Ala Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gln Pro Gln Val 475 480 485 490 ttc cag gct ggg aca agc aaa cct tta cat agc agt gga atc aat gta 1599 Phe Gln Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser Gly Ile Asn Val 495 500 505 aat gca gct cca ttc caa tcc atg caa acg gta ttc aat atg aat gcc 1647 Asn Ala Ala Pro Phe Gln Ser Met Gln Thr Val Phe Asn Met Asn Ala 510 515 520 cca gtt cct cct gtt aat gaa cca gaa act tta aaa cag caa aat cag 1695 Pro Val Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gln Gln Asn Gln 525 530 535 tac cag gcc agt tac aac cag agc ttt tcc agt cag cct cac caa gta 1743 Tyr Gln Ala Ser Tyr Asn Gln Ser Phe Ser Ser Gln Pro His Gln Val 540 545 550 gaa caa aca gag ctt cag caa gaa cag ctt caa aca gtg gtt ggc act 1791 Glu Gln Thr Glu Leu Gln Gln Glu Gln Leu Gln Thr Val Val Gly Thr 555 560 565 570 tat cat ggt tct cag gac cag ccc cat caa gtg act ggt aac cac cag 1839 Tyr His Gly Ser Gln Asp Gln Pro His Gln Val Thr Gly Asn His Gln 575 580 585 cag cct cct cag cag aac act gga ttt cca cgt agc aat cag ccc tat 1887 Gln Pro Pro Gln Gln Asn Thr Gly Phe Pro Arg Ser Asn Gln Pro Tyr 590 595 600 tac aac agt cgt ggt gtg tct cgt gga ggt tcc cgt ggt gct aga ggc 1935 Tyr Asn Ser Arg Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly 605 610 615 ttg atg aat gga tac aga gga cct gct aat gga ttc aga gga gga tat 1983 Leu Met Asn Gly Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gly Gly Tyr 620 625 630 gat ggt tac cgc cct tca ttc tct act aac act cca aac agt ggt tat 2031 Asp Gly Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Thr Asn Thr Pro Asn Ser Gly Tyr 635 640 645 650 aca caa tct caa ttc agt gct ccc cgg gac tac tct ggc tat cag cgg 2079 Thr Gln Ser Gln Phe Ser Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Gly Tyr Gln Arg 655 660 665 gat gga tat cag cag aat ttc aag cga ggc tct ggg cag agt gga cca 2127 Asp Gly Tyr Gln Gln Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly Gln Ser Gly Pro 670 675 680 cgg gga gcc cca cga ggt cgt gga ggg ccc cca aga ccc aac aga ggg 2175 Arg Gly Ala Pro Arg Gly Arg Gly Gly Pro Pro Arg Pro Asn Arg Gly 685 690 695 atg ccg caa atg aac act cag caa gtg aat taa tctgattcac aggattatgt 2228 Met Pro Gln Met Asn Thr Gln Gln Val Asn 700 705 ttaatcgcca aaaacacact ggccagtgta ccataatatg ttaccagaag agttattatc 2288 tatttgttct ccctttcagg aaacttattg taaagggact gttttcatcc cataaagaca 2348 ggactacaat tgtcagcttt atattacctg gatatggaag gaaactattt ttactctgca 2408 tgttctgtcc taagcgtcat cttgagcctt gcacatgata ctcagattcc tcacccttgc 2468 ttaggagtaa aacataatat actttaatgg ggtgatatct ccatagttat ttgaagtggc 2528 ttggataaag caagactgac ttctgacatt ggataaaatc tacaaatcag ccctagagtc 2588 attcagtggt aactgacaaa actaaaatat ttcccttgaa aggaagatgg aaggagtgga 2648 gtgtggtttg gcagaacaac tgcatttcac agcttttcca cttaaattgg agcactgaac 2708 atttagatgc ataccgaatt atgcatgggc cctaatcaca cagacaaggc tggtgccagc 2768 cttaggcttg acacggcagt gttcaccctc tggccagacg actgtggttc aagacacatg 2828 taaattgctt tttaacagct gatactgtat aagacaaagc caaaatgcaa aattaggctt 2888 tgattggcac ttttcgaaaa atatgcaaca attaagggat ataatctgga tggccgcttc 2948 tgtacttaat gtgaaatatt tagatacctt tcaaacactt aacagtttct ttgacaatga 3008 gttttgtaag gattggtagt aaatatcatt ccttatgacg tacattgtct gtcactaatc 3068 cttggatctt gctgtattgt cacctaaatt ggtacaggta ctgatgaaaa tctaatggat 3128 aatcataaca ctcttggtta catgtttttc ctgcagcctg aaagttttta taagaaaaag 3188 acatcaaatg cctgctgctg ccaccctttt aaattgctat cttttgaaaa gcaccagtat 3248 gtgttttaga ttgatttccc tattttaggg aaatgacagt cagtagtttc acttctgatg 3308 gtataagcaa acaaataaaa catgtttata aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3368 aaaaaaaaaa aaaaaaaa 3386 <210> 16 <211> 708 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 16 Met Pro Ser Ala Thr Ser His Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser Ser Gly 1 5 10 15 Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Asn Glu Ala Gly Ala Gly Ala 20 25 30 Ala Ala Pro Ala Ser Gln His Pro Met Thr Gly Thr Gly Ala Val Gln 35 40 45 Thr Glu Ala Met Lys Gln Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys Leu Arg 50 55 60 Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met 65 70 75 80 Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys 85 90 95 Tyr Gln Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gln Arg 100 105 110 Ser Phe Met Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr 115 120 125 Ala Arg Arg Glu Gln Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu 130 135 140 Lys Thr Val Leu Glu Leu Gln Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly Asp Asp 145 150 155 160 Glu Val Arg Thr Asp Leu Lys Gln Gly Leu Asn Gly Val Pro Ile Leu 165 170 175 Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu Ala Asp 180 185 190 Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu Gln Tyr Glu His Ala 195 200 205 Ser Ile His Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lys Pro Val Cys 210 215 220 Gly Thr Thr Tyr Lys Ala Leu Lys Glu Ile Val Glu Arg Val Phe Gln 225 230 235 240 Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His Gln Asn Gly Leu Cys Glu 245 250 255 Glu Glu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Thr Val Glu Asp Gln Ala Ala Glu 260 265 270 Ala Glu Pro Glu Pro Val Glu Glu Tyr Thr Glu Gln Asn Glu Val Glu 275 280 285 Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gln Phe Met Ala Glu Thr Gln Phe Ser 290 295 300 Ser Gly Glu Lys Glu Gln Val Asp Asp Trp Thr Val Glu Thr Val Glu 305 310 315 320 Val Val Asn Ser Leu Gln Gln Gln Pro Gln Ala Ala Ser Pro Ser Val 325 330 335 Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gln Ala Asp Pro Leu Val 340 345 350 Arg Arg Gln Arg Val Gln Asp Leu Met Ala Gln Met Gln Gly Pro Tyr 355 360 365 Asn Phe Ile Gln Asp Ser Met Leu Asp Phe Glu Asn Gln Thr Leu Asp 370 375 380 Pro Ala Ile Val Ser Ala Gln Pro Met Asn Pro Ala Gln Asn Met Asp 385 390 395 400 Ile Pro Gln Leu Val Cys Pro Pro Val His Ser Glu Ser Arg Leu Ala 405 410 415 Gln Pro Asn Gln Val Ser Val Gln Pro Glu Ala Thr Gln Val Pro Leu 420 425 430 Val Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gln Pro Leu Tyr Gln 435 440 445 Pro Ser His Ala Thr Asp Gln Arg Pro Gln Lys Glu Pro Ile Asp Gln 450 455 460 Ile Gln Ala Thr Ile Ser Leu Asn Thr Asp Gln Thr Thr Ala Ser Ser 465 470 475 480 Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gln Pro Gln Val Phe Gln Ala Gly Thr Ser 485 490 495 Lys Pro Leu His Ser Ser Gly Ile Asn Val Asn Ala Ala Pro Phe Gln 500 505 510 Ser Met Gln Thr Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro Val Asn 515 520 525 Glu Pro Glu 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aac aaa gga gaa 48 Met Glu Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu 1 5 10 15 agg ctt aat cag gat cag ctg gat gct gtg tct aag tac cag gaa gtc 96 Arg Leu Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val 20 25 30 aca aat aac ttg gag ttt gcg aaa gaa ttg cag agg agt ttc atg gcg 144 Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala 35 40 45 ttg agt cag gat att cag aaa aca ata aag aag acg gca cgt cgg gag 192 Leu Ser Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu 50 55 60 cag ctt atg aga gaa gaa gct gaa cag aaa cgt tta aaa act gta ctt 240 Gln Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu 65 70 75 80 gag ctg cag tat gtt ttg gac aaa ttg gga gat gaa gaa gtg cga act 288 Glu Leu Gln Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly Asp Glu Glu Val Arg Thr 85 90 95 gac ctg aaa caa ggt ttg aat gga gtg cca ata ctc tct gaa gaa gag 336 Asp Leu Lys Gln Gly Leu Asn Gly Val Pro Ile Leu Ser Glu Glu Glu 100 105 110 ttg tcg ctg ttg gat gag ttc tac aag tta gca gac cct gta cgg gac 384 Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu Ala Asp Pro Val Arg Asp 115 120 125 atg agc ttg agg ttg aat gag cag tat gag cat gcc tcc att cac ctg 432 Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu Gln Tyr Glu His Ala Ser Ile His Leu 130 135 140 tgg gac ttg ctg gaa ggg aag gaa aaa tct gtc tgt gga aca acc tat 480 Trp Asp Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lys Ser Val Cys Gly Thr Thr Tyr 145 150 155 160 aaa gct ctg agg gaa att gtt gag cgt gtt ttc cag tcc aac tac ttt 528 Lys Ala Leu Arg Glu Ile Val Glu Arg Val Phe Gln Ser Asn Tyr Phe 165 170 175 gac agc acc cac aac cac cag aat ggg ctc tgt gag gag gaa gag gct 576 Asp Ser Thr His Asn His Gln Asn Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala 180 185 190 acc tca gct cca aca gct gaa gac cag gga gct gaa gct gaa cct gag 624 Thr Ser Ala Pro Thr Ala Glu Asp Gln Gly Ala Glu Ala Glu Pro Glu 195 200 205 cca gca gaa gaa tac act gaa caa agt gaa gtt gaa tca aca gag tat 672 Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu Gln Ser Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr 210 215 220 gta aat aga cag ttt atg gca gaa gcg cag ttc agt ggt gag aag gag 720 Val Asn Arg Gln Phe Met Ala Glu Ala Gln Phe Ser Gly Glu Lys Glu 225 230 235 240 cag gtg gat gag tgg aca gtc gag acg gtc gag gtg gta aat tca ctc 768 Gln Val Asp Glu Trp Thr Val Glu Thr Val Glu Val Val Asn Ser Leu 245 250 255 cag cag caa cct cag gct gca tct cct tca gta ccg gag ccc cac tct 816 Gln Gln Gln Pro Gln Ala Ala Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser 260 265 270 ttg act cca gtg gct cag gca gat ccc ctt gtg aga aga cag cga gta 864 Leu Thr Pro Val Ala Gln Ala Asp Pro Leu Val Arg Arg Gln Arg Val 275 280 285 cag gac ctt atg gcg caa atg cag ggg ccc tat aat ttc ata cag gat 912 Gln Asp Leu Met Ala Gln Met Gln Gly Pro Tyr Asn Phe Ile Gln Asp 290 295 300 tca atg ctg gat ttt gaa aac cag aca ctt gat cct gcc att gta tct 960 Ser Met Leu Asp Phe Glu Asn Gln Thr Leu Asp Pro Ala Ile Val Ser 305 310 315 320 gca cag cct atg aat cca gca cag aat atg gac atg ccc cag ctg gtt 1008 Ala Gln Pro Met Asn Pro Ala Gln Asn Met Asp Met Pro Gln Leu Val 325 330 335 tgc cct cca gtt cat gct gaa tct aga ctt gct caa cct aat caa gtt 1056 Cys Pro Pro Val His Ala Glu Ser Arg Leu Ala Gln Pro Asn Gln Val 340 345 350 cct gta caa cca gaa gct aca cag gtt cct ttg gtt tca tcc aca agt 1104 Pro Val Gln Pro Glu Ala Thr Gln Val Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser 355 360 365 gag ggg tat aca gca tct cag ccc ttg tac cag cct tct cat gct aca 1152 Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gln Pro Leu Tyr Gln Pro Ser His Ala Thr 370 375 380 gag caa cga ccg caa aag gaa ccg act gac cag atc cag gca aca atc 1200 Glu Gln Arg Pro Gln Lys Glu Pro Thr Asp Gln Ile Gln Ala Thr Ile 385 390 395 400 tct tta aat aca gac cag act aca gca tca tca tcc ctt cct gct gct 1248 Ser Leu Asn Thr Asp Gln Thr Thr Ala Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala 405 410 415 tct cag cct cag gtg ttc cag gct ggg aca agc aaa cct tta cac agc 1296 Ser Gln Pro Gln Val Phe Gln Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His Ser 420 425 430 agt ggg atc aat gta aat gca gcg cca ttc cag tcc atg caa acg gtg 1344 Ser Gly Ile Asn Val Asn Ala Ala Pro Phe Gln Ser Met Gln Thr Val 435 440 445 ttc aac atg aat gcc ccg gtt cct cct gtt aat gaa cca gaa act tta 1392 Phe Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu 450 455 460 aaa cag caa aat cag tac cag gcc agc tat aac cag agc ttt tcc agt 1440 Lys Gln Gln Asn Gln Tyr Gln Ala Ser Tyr Asn Gln Ser Phe Ser Ser 465 470 475 480 ccg cct cac caa gta gag cag aca gag ctt ccg caa gag cag ctt cag 1488 Pro Pro His Gln Val Glu Gln Thr Glu Leu Pro Gln Glu Gln Leu Gln 485 490 495 acg gtg gtt ggt act tac cat gct tcc caa gac cag ccc cat caa gtg 1536 Thr Val Val Gly Thr Tyr His Ala Ser Gln Asp Gln Pro His Gln Val 500 505 510 acc ggt aac cac cag cag cct ccc cag cag aac act ggg ttt cca cgt 1584 Thr Gly Asn His Gln Gln Pro Pro Gln Gln Asn Thr Gly Phe Pro Arg 515 520 525 agc agt cag ccc tat tac aac agt cgt ggt gtg tct cgt gga ggc tcc 1632 Ser Ser Gln Pro Tyr Tyr Asn Ser Arg Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser 530 535 540 cgt ggt gct aga ggc ttg atg aat gga tac agg ggc cct gcc aat gga 1680 Arg Gly Ala Arg Gly Leu Met Asn Gly Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly 545 550 555 560 ttc aga gga gga tat gat ggt tac cgc cct tcg ttc tct aac act cca 1728 Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro 565 570 575 aac agc ggt tac aca cag tct cag ttc agt gct ccc cgg gac tac tct 1776 Asn Ser Gly Tyr Thr Gln Ser Gln Phe Ser Ala Pro Arg Asp Tyr Ser 580 585 590 ggc tat cag cgg gat gga tat cag cag aat ttc aag cga ggc tct ggg 1824 Gly Tyr Gln Arg Asp Gly Tyr Gln Gln Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly 595 600 605 cag agt gga ccc cgg gga gcc cca cga ggt cgt gga ggg ccc cca aga 1872 Gln Ser Gly Pro Arg Gly Ala Pro Arg Gly Arg Gly Gly Pro Pro Arg 610 615 620 ccc aac aga ggg atg ccg caa atg aac act cag caa gtg aat taa 1917 Pro Asn Arg Gly Met Pro Gln Met Asn Thr Gln Gln Val Asn 625 630 635 tctgattcac aggattatct ttaatcgcca aaacacactg gccagtgtac cataatatgt 1977 taccagaaga gttattatct atttgttctc cctttcagga aacttattgt aaagggactg 2037 ttttcatccc ataaagacag gactacagtt gtcagcttta tattacctgg atatggaagg 2097 aaactatttt tactctgcat gttctgtcct aagcgtcatc ttgagccttg cacatgatac 2157 tcagattcct ttcccttgct taggagtaaa acataatata ctttatgggg tgataatatc 2217 tccatagtta tttgaagtgg cttggaaaaa gcaagattga cttttgacat tggataaaat 2277 ctacaaatca gccctagagt ttcatggtca ttcacaaaac taaaatattt cccttgaaag 2337 gaagatggaa ggactggagt gtggtttggc agaacaactg catttcacag cttttcctat 2397 taaattggag cactgaatgt taaatgcata ccaaattatg catgggccct taatcacaca 2457 tacatggcta ccagctttga cacagcacta ttcatcctct ggccaaacga ctgtggttaa 2517 aaacacgtgt aaattgcttt ttaacagctg atactgtaaa agacaaagct aaaatgcaaa 2577 attaggcttt cattggcact tttcgaaaaa tatgcaacaa atttgggatg taatctggat 2637 ggccacttct gtacttaatg tgaagtattt agataccttt ttgaacactt aacagtttct 2697 tcgacaatga cttttgtaag gattggtagt atatatcatt ccttatgaca tacattgtct 2757 gttgctaatc cttggatctt gctgtattgt cacctaaatt ggtacaggta ctgatgaaaa 2817 tctctcatgg ataaacctaa cactcttcgt cacatgtttt tcctgcagcc tgaaggtttt 2877 taaaaggaaa agatatcaaa tgcctgctgc taccaccctt ttaaattgct atcttttgaa 2937 aagcaccagt atgtgttttt agattgattt ccctatttta gggaaatgac 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Gly Thr Gly Ala Val Gln 35 40 45 acc gag gcc atg aag cag att ctc ggc gta atc gac aag aaa ctt cgg 370 Thr Glu Ala Met Lys Gln Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys Leu Arg 50 55 60 aac ctg gag aag aaa aag ggt aaa ctt gat gat tac cag gaa cga atg 418 Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met 65 70 75 80 aat aaa ggg gaa agg ctc aat caa gac cag ctg gat gcc gta tct aag 466 Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys 85 90 95 tac cag gaa gtc aca aat aat ttg gag ttt gca aag gaa tta cag agg 514 Tyr Gln Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gln Arg 100 105 110 agt ttc atg gca tta agt caa gat att cag aaa aca ata aag aag aca 562 Ser Phe Met Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr 115 120 125 gca cgt cgg gaa cag ctt atg aga gaa gaa gca gaa cag aag cgc tta 610 Ala Arg Arg Glu Gln Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu 130 135 140 aaa act gta ctt gag tta cag tat gta ttg gat aag ctg gga gat gat 658 Lys Thr Val Leu Glu Leu Gln Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly Asp Asp 145 150 155 160 gat gtg aga aca gat ctg aaa caa ggt ttg agt gga gtg cca ata ttg 706 Asp Val Arg Thr Asp Leu Lys Gln Gly Leu Ser Gly Val Pro Ile Leu 165 170 175 tct gag gag gag ttg tca ttg ctg gat gag ttc tac aag ctc gta gat 754 Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu Val Asp 180 185 190 cct gag cgt gac atg agt tta agg tta aat gag cag tat gaa cat gcc 802 Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu Gln Tyr Glu His Ala 195 200 205 tca att cac ttg tgg gat ttg ctg gaa ggg aaa gaa aag cct gtg tgt 850 Ser Ile His Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lys Pro Val Cys 210 215 220 gga aca acc tat aaa gct cta aag gaa att gtt gag cgt gtt ttc cag 898 Gly Thr Thr Tyr Lys Ala Leu Lys Glu Ile Val Glu Arg Val Phe Gln 225 230 235 240 tca aac tac ttt gat agc act cac aat cat caa aat ggg ttg tgt gag 946 Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His Gln Asn Gly Leu Cys Glu 245 250 255 gag gaa gag gcg gct tca gcg ccc aca gtg gag gac cag gta gct gaa 994 Glu Glu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Thr Val Glu Asp Gln Val Ala Glu 260 265 270 gct gaa cct gag cca gcg gaa gaa tac aca gag caa agt gag gtt gaa 1042 Ala Glu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu Gln Ser Glu Val Glu 275 280 285 tca aca gag tat gtc aat agg cag ttc atg gca gaa aca cag ttc agc 1090 Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gln Phe Met Ala Glu Thr Gln Phe Ser 290 295 300 agt ggt gag aag gag caa gtg gat gag tgg aca gtt gaa aca gtt gag 1138 Ser Gly Glu Lys Glu Gln Val Asp Glu Trp Thr Val Glu Thr Val Glu 305 310 315 320 gtt gta aac tca ctc cag cag caa cct cag gct gcg tcc cct tca gtc 1186 Val Val Asn Ser Leu Gln Gln Gln Pro Gln Ala Ala Ser Pro Ser Val 325 330 335 cca gag ccc cac tct ttg act cca gtg gct cag tca gat cca ctt gtg 1234 Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gln Ser Asp Pro Leu Val 340 345 350 aga agg cag cgt gta caa gat ctt atg gca caa atg caa ggg ccc tat 1282 Arg Arg Gln Arg Val Gln Asp Leu Met Ala Gln Met Gln Gly Pro Tyr 355 360 365 aat ttc ata cag gat tca atg ttg gat ttt gaa aat cag acg ctt gat 1330 Asn Phe Ile Gln Asp Ser Met Leu Asp Phe Glu Asn Gln Thr Leu Asp 370 375 380 cct gcc att gta tcc gca cag cct atg aac cct acc cag aac atg gat 1378 Pro Ala Ile Val Ser Ala Gln Pro Met Asn Pro Thr Gln Asn Met Asp 385 390 395 400 atg cct cag ctg gtt tgc cct cag gtt cat tct gaa tct aga ctt gcc 1426 Met Pro Gln Leu Val Cys Pro Gln Val His Ser Glu Ser Arg Leu Ala 405 410 415 caa tct aat caa gtt cct gta caa cca gaa gcc aca cag gtt cct ttg 1474 Gln Ser Asn Gln Val Pro Val Gln Pro Glu Ala Thr Gln Val Pro Leu 420 425 430 gtt tca tcc aca agt gag ggg tat aca gca tct cag ccc ttg tac cag 1522 Val Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gln Pro Leu Tyr Gln 435 440 445 cca tct cat gct acg gag cag cgg ccg cag aaa gag cca atg gat cag 1570 Pro Ser His Ala Thr Glu Gln Arg Pro Gln Lys Glu Pro Met Asp Gln 450 455 460 att cag gca aca ata tct ttg aat aca gac cag act aca gca tcc tca 1618 Ile Gln Ala Thr Ile Ser Leu Asn Thr Asp Gln Thr Thr Ala Ser Ser 465 470 475 480 tcc ctt cct gct gct tct cag cct caa gtg ttc cag gct ggg aca agt 1666 Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gln Pro Gln Val Phe Gln Ala Gly Thr Ser 485 490 495 aaa cct ttg cac agc agt gga atc aat gta aat gca gct cca ttc cag 1714 Lys Pro Leu His Ser Ser Gly Ile Asn Val Asn Ala Ala Pro Phe Gln 500 505 510 tcc atg caa acg gtg ttc aat atg aat gct cca gtc cct cct gct aat 1762 Ser Met Gln Thr Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro Ala Asn 515 520 525 gaa cca gaa acg tta aaa caa cag agt cag tac cag gcc act tat aac 1810 Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gln Gln Ser Gln Tyr Gln Ala Thr Tyr Asn 530 535 540 cag agt ttt tcc agt cag cct cac caa gtg gaa caa aca gag ctt caa 1858 Gln Ser Phe Ser Ser Gln Pro His Gln Val Glu Gln Thr Glu Leu Gln 545 550 555 560 caa gac caa ctg caa acg gtg gtt ggc act tac cat gga tcc cag gac 1906 Gln Asp Gln Leu Gln Thr Val Val Gly Thr Tyr His Gly Ser Gln Asp 565 570 575 cag cct cat caa gtg cct ggt aac cac cag caa ccc cca cag cag aac 1954 Gln Pro His Gln Val Pro Gly Asn His Gln Gln Pro Pro Gln Gln Asn 580 585 590 act ggc ttt cca cgt agc agt cag cct tat tac aac agt cgt ggg gta 2002 Thr Gly Phe Pro Arg Ser Ser Gln Pro Tyr Tyr Asn Ser Arg Gly Val 595 600 605 tct cga gga ggg tct cgt ggt gcc aga ggc ttg atg aat gga tac agg 2050 Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly Leu Met Asn Gly Tyr Arg 610 615 620 ggc cct gcc aat gga ttt aga gga gga tat gat ggt tac cgc cct tca 2098 Gly Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Tyr Arg Pro Ser 625 630 635 640 ttc tcg aac act cca aac agt ggt tat tca cag tct cag ttc act gct 2146 Phe Ser Asn Thr Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Gln Ser Gln Phe Thr Ala 645 650 655 ccc cgg gac tac tct ggt tac cag cgg gat gga tat cag cag aat ttc 2194 Pro Arg Asp Tyr Ser Gly Tyr Gln Arg Asp Gly Tyr Gln Gln Asn Phe 660 665 670 aag cga ggc tct ggg cag agt gga cca cgg gga gcc cca cga ggt cgt 2242 Lys Arg Gly Ser Gly Gln Ser Gly Pro Arg Gly Ala Pro Arg Gly Arg 675 680 685 gga ggg ccc cca aga ccc aac aga ggg atg ccg caa atg aac act cag 2290 Gly Gly Pro Pro Arg Pro Asn Arg Gly Met Pro Gln Met Asn Thr Gln 690 695 700 caa gtg 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gaa cga atg aat aaa ggg gaa agg ctc aat caa gac cag ctg 411 Tyr Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gln Asp Gln Leu 80 85 90 gat gcc gta tct aag tac cag gaa gtc aca aat aat ttg gag ttt gca 459 Asp Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala 95 100 105 aag gaa tta cag agg agt ttc atg gca tta agt caa gat att cag aaa 507 Lys Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gln Lys 110 115 120 aca ata aag aag aca gca cgt cgg gaa cag ctt atg aga gaa gaa gca 555 Thr Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln Leu Met Arg Glu Glu Ala 125 130 135 gaa cag aag cgc tta aaa act gta ctt gag tta cag tat gta ttg gat 603 Glu Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu Gln Tyr Val Leu Asp 140 145 150 155 aag ctg gga gat gat gat gtg aga aca gat ctg aaa caa ggt ttg agt 651 Lys Leu Gly Asp Asp Asp Val Arg Thr Asp Leu Lys Gln Gly Leu Ser 160 165 170 gga gtg cca ata ttg tct gag gag gag ttg tca ttg ctg gat gag ttc 699 Gly Val Pro Ile Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe 175 180 185 tac aag ctc gta gat cct gag cgt gac atg agt tta agg tta aat gag 747 Tyr Lys Leu Val Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu 190 195 200 cag tat gaa cat gcc tca att cac ttg tgg gat ttg ctg gaa ggg aaa 795 Gln Tyr Glu His Ala Ser Ile His Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly Lys 205 210 215 gaa aag cct gtg tgt gga aca acc tat aaa gct cta aag gaa att gtt 843 Glu Lys Pro Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Ala Leu Lys Glu Ile Val 220 225 230 235 gag cgt gtt ttc cag tca aac tac ttt gat agc act cac aat cat caa 891 Glu Arg Val Phe Gln Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His Gln 240 245 250 aat ggg ttg tgt gag gag gaa gag gcg gct tca gcg ccc aca gtg gag 939 Asn Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Thr Val Glu 255 260 265 gac cag gta gct gaa gct gaa cct gag cca gcg gaa gaa tac aca gag 987 Asp Gln Val Ala Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu 270 275 280 caa agt gag gtt gaa tca aca gag tat gtc aat agg cag ttc atg gca 1035 Gln Ser Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gln Phe Met Ala 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Leu Gln Gln Gln Pro Gln Ala 320 325 330 gcg tcc cct tca gtc cca gag ccc cac tct ttg act cca gtg gct cag 1179 Ala Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gln 335 340 345 tca gat cca ctt gtg aga agg cag cgt gta caa gat ctt atg gca caa 1227 Ser Asp Pro Leu Val Arg Arg Gln Arg Val Gln Asp Leu Met Ala Gln 350 355 360 atg caa ggg ccc tat aat ttc ata cag acg ctt gat cct gcc att gta 1275 Met Gln Gly Pro Tyr Asn Phe Ile Gln Thr Leu Asp Pro Ala Ile Val 365 370 375 tcc gca cag cct atg aac cct acc cag aac atg gat atg cct cag ctg 1323 Ser Ala Gln Pro Met Asn Pro Thr Gln Asn Met Asp Met Pro Gln Leu 380 385 390 395 gtt tgc cct cag gtt cat tct gaa tct aga ctt gcc caa tct aat caa 1371 Val Cys Pro Gln Val His Ser Glu Ser Arg Leu Ala Gln Ser Asn Gln 400 405 410 gtt cct gta caa cca gaa gcc aca cag gtt cct ttg gtt tca tcc aca 1419 Val Pro Val Gln Pro Glu Ala Thr Gln Val Pro Leu Val Ser Ser Thr 415 420 425 agt gag ggg tat aca gca tct cag ccc ttg tac cag cca tct cat gct 1467 Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gln Pro Leu Tyr Gln Pro Ser His Ala 430 435 440 acg gag cag cgg ccg cag aaa gag cca atg gat cag att cag gca aca 1515 Thr Glu Gln Arg Pro Gln Lys Glu Pro Met Asp Gln Ile Gln Ala Thr 445 450 455 ata tct ttg aat aca gac cag act aca gca tcc tca tcc ctt cct gct 1563 Ile Ser Leu Asn Thr Asp Gln Thr Thr Ala Ser Ser Ser Leu Pro Ala 460 465 470 475 gct tct cag cct caa gtg ttc cag gct ggg aca agt aaa cct ttg cac 1611 Ala Ser Gln Pro Gln Val Phe Gln Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His 480 485 490 agc agt gga atc aat gta aat gca gct cca ttc cag tcc atg caa acg 1659 Ser Ser Gly Ile Asn Val Asn Ala Ala Pro Phe Gln Ser Met Gln Thr 495 500 505 gtg ttc aat atg aat gct cca gtc cct cct gct aat gaa cca gaa acg 1707 Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro Ala Asn Glu Pro Glu Thr 510 515 520 tta aaa caa cag agt cag tac cag gcc act tat aac cag agt ttt tcc 1755 Leu Lys Gln Gln Ser Gln Tyr Gln Ala Thr Tyr Asn Gln Ser Phe Ser 525 530 535 agt cag cct cac caa gtg gaa caa aca gag ctt caa caa gac caa ctg 1803 Ser Gln Pro His Gln Val Glu Gln Thr Glu Leu Gln Gln Asp Gln Leu 540 545 550 555 caa acg gtg gtt ggc act tac cat gga tcc cag gac cag cct cat caa 1851 Gln Thr Val Val Gly Thr Tyr His Gly Ser Gln Asp Gln Pro His Gln 560 565 570 gtg cct ggt aac cac cag caa ccc cca cag cag aac act ggc ttt cca 1899 Val Pro Gly Asn His Gln Gln Pro Pro Gln Gln Asn Thr Gly Phe Pro 575 580 585 cgt agc agt cag cct tat tac aac agt cgt ggg gta tct cga gga ggg 1947 Arg Ser Ser Gln Pro Tyr Tyr Asn Ser Arg Gly Val Ser Arg Gly Gly 590 595 600 tct cgt ggt gcc aga ggc ttg atg aat gga tac agg ggc cct gcc aat 1995 Ser Arg Gly Ala Arg Gly Leu Met Asn Gly Tyr Arg Gly Pro Ala Asn 605 610 615 gga ttt aga gga gga tat gat ggt tac cgc cct tca ttc tcg aac act 2043 Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Asn Thr 620 625 630 635 cca aac agt ggt tat tca cag tct cag ttc act gct ccc cgg gac tac 2091 Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Gln Ser Gln Phe Thr Ala Pro Arg Asp Tyr 640 645 650 tct ggt tac cag cgg gat gga tat cag cag aat ttc aag cga ggc tct 2139 Ser Gly Tyr Gln Arg Asp Gly Tyr Gln Gln Asn Phe Lys Arg Gly Ser 655 660 665 ggg cag agt gga cca cgg gga gcc cca cga ggt cgt gga ggg ccc cca 2187 Gly Gln Ser Gly Pro Arg Gly Ala Pro Arg Gly Arg Gly Gly Pro Pro 670 675 680 aga ccc aac aga ggg atg ccg caa atg aac act cag caa gtg aat taa 2235 Arg Pro Asn Arg Gly Met Pro Gln Met Asn Thr Gln Gln Val Asn 685 690 695 tgtgatacac aggattatgt ttaatcgcca aaaacacact ggccagtgta ccataatatg 2295 ttaccagaag agttattatc tatttgttct ccctttcagg aaacttattg taaagggact 2355 gttttcatcc cataaagaca ggactgcaat tgtcagcttt acattacctg gatatggaag 2415 gaaactattt ttattctgca tgttctgtcc taagcgtcat cttgagcctt gcacacaata 2475 caatactcag attcctcacc cttgcttagg agtaaaacat tatatactta tggggtgata 2535 atatctccat agttagttga agtggcttgg aaaaaaaatg caagattgaa tttttgacct 2595 tggataaaat ctacaatcag ccctagaact attcagtggt aattgacaaa gttaaagcat 2655 tttctttgaa aggaagatgg aaggagtgga gtgtggttta gcaaaactgc atttcatagc 2715 tttcccatta aattggagca ccgacagatt 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gcg ccg gct tct cag cat ccg gca acc ggc acc ggc gcc gtc cag 322 Ala Ala Pro Ala Ser Gln His Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ala Val Gln 35 40 45 acc gag gcc atg aag cag att ctc ggc gta atc gac aag aaa ctt cgg 370 Thr Glu Ala Met Lys Gln Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys Leu Arg 50 55 60 aac ctg gag aag aaa aag ggt aaa ctt gat gat tac cag gaa cga atg 418 Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met 65 70 75 80 aat aaa ggg gaa agg ctc aat caa gac cag ctg gat gcc gta tct aag 466 Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys 85 90 95 tac cag gaa gtc aca aat aat ttg gag ttt gca aag gaa tta cag agg 514 Tyr Gln Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gln Arg 100 105 110 agt ttc atg gca tta agt caa gat att cag aaa aca ata aag aag aca 562 Ser Phe Met Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr 115 120 125 gca cgt cgg gaa cag ctt atg aga gaa gaa gca gaa cag aag cgc tta 610 Ala Arg Arg Glu Gln Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu 130 135 140 aaa act gta ctt gag tta cag tat gta ttg gat aag ctg gga gat gat 658 Lys Thr Val Leu Glu Leu Gln Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly Asp Asp 145 150 155 160 gat gtg aga aca gat ctg aaa caa ggt ttg agt gga gtg cca ata ttg 706 Asp Val Arg Thr Asp Leu Lys Gln Gly Leu Ser Gly Val Pro Ile Leu 165 170 175 tct gag gag gag ttg tca ttg ctg gat gag ttc tac aag ctc gta gat 754 Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu Val Asp 180 185 190 cct gag cgt gac atg agt tta agg tta aat gag cag tat gaa cat gcc 802 Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu Gln Tyr Glu His Ala 195 200 205 tca att cac ttg tgg gat ttg ctg gaa ggg aaa gaa aag cct gtg tgt 850 Ser Ile His Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lys Pro Val Cys 210 215 220 gga aca acc tat aaa gct cta aag gaa att gtt gag cgt gtt ttc cag 898 Gly Thr Thr Tyr Lys Ala Leu Lys Glu Ile Val Glu Arg Val Phe Gln 225 230 235 240 tca aac tac ttt gat agc act cac aat cat caa aat ggg ttg tgt gag 946 Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His Gln Asn Gly Leu Cys Glu 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Met Gln Gly Pro Tyr 355 360 365 aat ttc ata cag gat tca atg ttg gat ttt gaa aat cag acg ctt gat 1330 Asn Phe Ile Gln Asp Ser Met Leu Asp Phe Glu Asn Gln Thr Leu Asp 370 375 380 cct gcc att gta tcc gca cag cct atg aac cct acc cag aac atg gat 1378 Pro Ala Ile Val Ser Ala Gln Pro Met Asn Pro Thr Gln Asn Met Asp 385 390 395 400 atg cct cag ctg gtt tgc cct cag gtt cat tct gaa tct aga ctt gcc 1426 Met Pro Gln Leu Val Cys Pro Gln Val His Ser Glu Ser Arg Leu Ala 405 410 415 caa tct aat caa gtt cct gta caa cca gaa gcc aca cag gtt cct ttg 1474 Gln Ser Asn Gln Val Pro Val Gln Pro Glu Ala Thr Gln Val Pro Leu 420 425 430 gtt tca tcc aca agt gag ggg tat aca gca tct cag ccc ttg tac cag 1522 Val Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gln Pro Leu Tyr Gln 435 440 445 cca tct cat gct acg gag cag cgg ccg cag aaa gag cca atg gat cag 1570 Pro Ser His Ala Thr Glu Gln Arg Pro Gln Lys Glu Pro Met Asp Gln 450 455 460 att cag gca aca ata tct ttg aat aca gac cag act aca gca tcc tca 1618 Ile Gln Ala Thr Ile Ser 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Gln Pro His Gln Val Pro Gly Asn His Gln Gln Pro Pro Gln Gln Asn 580 585 590 act ggc ttt cca cgt agc agt cag cct tat tac aac agt cgt ggg gta 2002 Thr Gly Phe Pro Arg Ser Ser Gln Pro Tyr Tyr Asn Ser Arg Gly Val 595 600 605 tct cga gga ggg tct cgt ggt gcc aga ggc ttg atg aat gga tac agg 2050 Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly Leu Met Asn Gly Tyr Arg 610 615 620 ggc cct gcc aat gga ttt aga gga gga tat gat ggt tac cgc cct tca 2098 Gly Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Tyr Arg Pro Ser 625 630 635 640 ttc tcg aac act cca aac agt ggt tat tca cag tct cag ttc act gct 2146 Phe Ser Asn Thr Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Gln Ser Gln Phe Thr Ala 645 650 655 ccc cgg gac tac tct ggt tac cag cgg gat gga tat cag cag aat ttc 2194 Pro Arg Asp Tyr Ser Gly Tyr Gln Arg Asp Gly Tyr Gln Gln Asn Phe 660 665 670 aag cga ggc tct ggg cag agt gga cca cgg gga gcc cca cga ggt aat 2242 Lys Arg Gly Ser Gly Gln Ser Gly Pro Arg Gly Ala Pro Arg Gly Asn 675 680 685 ata ttg tgg tgg tga tcctagctcc tatgtggagc 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ttaaagcaaa aggttaatgg gtcatctggg aaaaatactg 3137 aagtatcaaa ggtatttgca tgtgaatgtg ggttatgttc ttctatccca ccttgtagca 3197 tattctatga aagttgagtt aaatgatagc taaaatatct gtttcaacag catgtaaaaa 3257 gttattttaa ctgttacaag tcattataca attttgaatg ttctgtagtt tctttttaac 3317 agtttaggta caaaggtctg ttttcattct ggtgcttttt attaattttg atagtatgat 3377 gtcacttcct attgaaatgt aagctagcgt gtaccttaga atgtgagctc catgagagca 3437 ggtaccttgt ttgtcttcac tgctgtatct attcccaacg cctcatgaca gtgcctggca 3497 catagtaggc actcaataaa tacttgttga atgaatgaaa aaaaaaaaaa a 3548 <210> 26 <211> 692 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Met Pro Ser Ala Thr Ser His Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser Ser Gly 1 5 10 15 Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Gly Ala 20 25 30 Ala Ala Pro Ala Ser Gln His Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ala Val Gln 35 40 45 Thr Glu Ala Met Lys Gln Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys Leu Arg 50 55 60 Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met 65 70 75 80 Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gln Asp 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gtc aca aat aat ttg gag ttt gca 459 Asp Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala 95 100 105 aag gaa tta cag agg agt ttc atg gca tta agt caa gat att cag aaa 507 Lys Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gln Lys 110 115 120 aca ata aag aag aca gca cgt cgg gaa cag ctt atg aga gaa gaa gca 555 Thr Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln Leu Met Arg Glu Glu Ala 125 130 135 gaa cag aag cgc tta aaa act gta ctt gag tta cag tat gta ttg gat 603 Glu Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu Gln Tyr Val Leu Asp 140 145 150 155 aag ctg gga gat gat gat gtg aga aca gat ctg aaa caa ggt ttg agt 651 Lys Leu Gly Asp Asp Asp Val Arg Thr Asp Leu Lys Gln Gly Leu Ser 160 165 170 gga gtg cca ata ttg tct gag gag gag ttg tca ttg ctg gat gag ttc 699 Gly Val Pro Ile Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe 175 180 185 tac aag ctc gta gat cct gag cgt gac atg agt tta agg tta aat gag 747 Tyr Lys Leu Val Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu 190 195 200 cag tat gaa cat gcc tca att cac ttg tgg gat ttg ctg gaa ggg aaa 795 Gln Tyr Glu His Ala Ser Ile His Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly Lys 205 210 215 gaa aag cct gtg tgt gga aca acc tat aaa gct cta aag gaa att gtt 843 Glu Lys Pro Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Ala Leu Lys Glu Ile Val 220 225 230 235 gag cgt gtt ttc cag tca aac tac ttt gat agc act cac aat cat caa 891 Glu Arg Val Phe Gln Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His Gln 240 245 250 aat ggg ttg tgt gag gag gaa gag gcg gct tca gcg ccc aca gtg gag 939 Asn Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Thr Val Glu 255 260 265 gac cag gta gct gaa gct gaa cct gag cca gcg gaa gaa tac aca gag 987 Asp Gln Val Ala Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu 270 275 280 caa agt gag gtt gaa tca aca gag tat gtc aat agg cag ttc atg gca 1035 Gln Ser Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gln Phe Met Ala 285 290 295 gaa aca cag ttc agc agt ggt gag aag gag caa gtg gat gag tgg aca 1083 Glu Thr Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Glu Gln Val Asp Glu Trp Thr 300 305 310 315 gtt gaa aca gtt gag gtt gta aac tca ctc cag cag caa cct cag gct 1131 Val Glu Thr Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gln Gln Gln Pro Gln Ala 320 325 330 gcg tcc cct tca gtc cca gag ccc cac tct ttg act cca gtg gct cag 1179 Ala Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gln 335 340 345 tca gat cca ctt gtg aga agg cag cgt gta caa gat ctt atg gca caa 1227 Ser Asp Pro Leu Val Arg Arg Gln Arg Val Gln Asp Leu Met Ala Gln 350 355 360 atg caa ggg ccc tat aat ttc ata cag gat tca atg ttg gat ttt gaa 1275 Met Gln Gly Pro Tyr Asn Phe Ile Gln Asp Ser Met Leu Asp Phe Glu 365 370 375 aat cag acg ctt gat cct gcc att gta tcc gca cag cct atg aac cct 1323 Asn Gln Thr Leu Asp Pro Ala Ile Val Ser Ala Gln Pro Met Asn Pro 380 385 390 395 acc cag aac atg gat atg cct cag ctg gtt tgc cct cag gtt cat tct 1371 Thr Gln Asn Met Asp Met Pro Gln Leu Val Cys Pro Gln Val His Ser 400 405 410 gaa tct aga ctt gcc caa tct aat caa gtt cct gta caa cca gaa gcc 1419 Glu Ser Arg Leu Ala Gln Ser Asn Gln Val Pro Val Gln Pro Glu Ala 415 420 425 aca cag gtt cct ttg gtt tca tcc aca agt gag ggg tat aca gca tct 1467 Thr Gln Val Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser 430 435 440 cag ccc ttg tac cag cca tct cat gct acg gag cag cgg ccg cag aaa 1515 Gln Pro Leu Tyr Gln Pro Ser His Ala Thr Glu Gln Arg Pro Gln Lys 445 450 455 gag cca atg gat cag att cag gca aca ata tct ttg aat aca gac cag 1563 Glu Pro Met Asp Gln Ile Gln Ala Thr Ile Ser Leu Asn Thr Asp Gln 460 465 470 475 act aca gca tcc tca tcc ctt cct gct gct tct cag cct caa gtg ttc 1611 Thr Thr Ala Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gln Pro Gln Val Phe 480 485 490 cag gct ggg aca agt aaa cct ttg cac agc agt gga atc aat gta aat 1659 Gln Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser Gly Ile Asn Val Asn 495 500 505 gca gct cca ttc cag tcc atg caa acg gtg ttc aat atg aat gct cca 1707 Ala Ala Pro Phe Gln Ser Met Gln Thr Val Phe Asn Met Asn Ala Pro 510 515 520 gtc cct cct gct aat gaa cca gaa acg tta aaa caa cag agt cag tac 1755 Val Pro Pro Ala Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gln Gln Ser Gln Tyr 525 530 535 cag gcc act tat aac cag agt ttt tcc agt cag cct cac caa gtg gaa 1803 Gln Ala Thr Tyr Asn Gln Ser Phe Ser Ser Gln Pro His Gln Val Glu 540 545 550 555 caa aca gag ctt caa caa gac caa ctg caa acg gtg gtt ggc act tac 1851 Gln Thr Glu Leu Gln Gln Asp Gln Leu Gln Thr Val Val Gly Thr Tyr 560 565 570 cat gga tcc cag gac cag cct cat caa gtg cct ggt aac cac cag caa 1899 His Gly Ser Gln Asp Gln Pro His Gln Val Pro Gly Asn His Gln Gln 575 580 585 ccc cca cag cag aac act ggc ttt cca cgt agc agt cag cct tat tac 1947 Pro Pro Gln Gln Asn Thr Gly Phe Pro Arg Ser Ser Gln Pro Tyr Tyr 590 595 600 aac agt cgt ggg gta tct cga gga ggg tct cgt ggt gcc aga ggc ttg 1995 Asn Ser Arg Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly Leu 605 610 615 atg aat gga tac agg ggc cct gcc aat gga ttt aga gga gga tat gat 2043 Met Asn Gly Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Asp 620 625 630 635 ggt tac cgc cct tca ttc tcg aac act cca aac agt ggt tat tca cag 2091 Gly Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Gln 640 645 650 tct cag ttc act gct ccc cgg gac tac tct ggt tac cag cgg gat gga 2139 Ser Gln Phe Thr Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Gly Tyr Gln Arg Asp Gly 655 660 665 tat cag cag aat ttc aag cga ggc tct ggg cag agt gga cca cgg gga 2187 Tyr Gln Gln Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly Gln Ser Gly Pro Arg Gly 670 675 680 gcc cca cga ggt aat ata ttg tgg tgg tga tcctagctcc tatgtggagc 2237 Ala Pro Arg Gly Asn Ile Leu Trp Trp 685 690 ttctgttctg gccttggaag aactgttcat agtccgcatg taggttacat gttaggaata 2297 catttatctt ttccagactt gttgctaaag attaaatgaa atgctctgtt tctaaaattt 2357 catcttgaat ccaaatttta atttttgaat gactttccct gctgttgtct tcaaaatcag 2417 aacattttct ctgcctcaga aaagcgtttt tccaactgga aatttatttt tcaggtctta 2477 aaacctgcta aatgttttta ggaagtacct actgaaactt tttgtaagac atttttggaa 2537 cgagcttgaa catttatata aatttattac cctctttgat ttttgaaaca tgcatattat 2597 atttaggctg agaagccctt caaatggcca gataagccac agttttagct agagaaccat 2657 ttagaattga cataactaat ctaaacttga acacttttag gaccaatgtt agtgttctaa 2717 ataccaacat atttctgatg tttaaacaga tctcccaaat tcttaggacc ttgatgtcat 2777 taaaatttag aatgacaagc ttaagaggct ttagtttcat ttgtttttca agtaatgaaa 2837 aataatttct tacatgggca gatagttaat ttgttgaaca attacaggta gcatttcatg 2897 taatctgatg ttctaaatgg ttctcttatt gaaggaggtt aaagaattag gtttcttaca 2957 gtttttggct ggccatgaca tgtataaaat gtatattaag gaggaattat aaagtacttt 3017 aatttgaatg ctagtggcaa ttgatcatta agaaagtact ttaaagcaaa aggttaatgg 3077 gtcatctggg aaaaatactg aagtatcaaa ggtatttgca tgtgaatgtg ggttatgttc 3137 ttctatccca ccttgtagca tattctatga aagttgagtt aaatgatagc taaaatatct 3197 gtttcaacag catgtaaaaa gttattttaa ctgttacaag tcattataca attttgaatg 3257 ttctgtagtt tctttttaac agtttaggta caaaggtctg ttttcattct ggtgcttttt 3317 attaattttg atagtatgat gtcacttcct attgaaatgt aagctagcgt gtaccttaga 3377 atgtgagctc catgagagca ggtaccttgt ttgtcttcac tgctgtatct attcccaacg 3437 cctcatgaca gtgcctggca catagtaggc actcaataaa tacttgttga atgaatgaaa 3497 aaaaaaaaaa a 3508 <210> 28 <211> 692 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Met Pro Ser Ala Thr Ser His Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser Ser Gly 1 5 10 15 Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Gly Ala 20 25 30 Ala Ala Pro Ala Ser Gln His Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ala Val Gln 35 40 45 Thr Glu Ala Met Lys Gln Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys Leu Arg 50 55 60 Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu Arg Met 65 70 75 80 Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val Ser Lys 85 90 95 Tyr Gln Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gln Arg 100 105 110 Ser Phe Met Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gln Lys Thr Ile Lys Lys Thr 115 120 125 Ala Arg Arg Glu Gln Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu Gln Lys Arg Leu 130 135 140 Lys Thr Val Leu Glu Leu Gln Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly Asp Asp 145 150 155 160 Asp Val Arg Thr Asp Leu Lys Gln Gly Leu Ser Gly Val Pro Ile Leu 165 170 175 Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu Val Asp 180 185 190 Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu Gln Tyr Glu His Ala 195 200 205 Ser Ile His Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lys Pro Val Cys 210 215 220 Gly Thr Thr Tyr Lys Ala Leu Lys Glu Ile Val Glu Arg Val Phe Gln 225 230 235 240 Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His Gln Asn Gly Leu Cys Glu 245 250 255 Glu Glu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Thr Val Glu Asp Gln Val Ala Glu 260 265 270 Ala Glu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu Gln Ser Glu Val Glu 275 280 285 Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gln Phe Met Ala Glu Thr Gln Phe Ser 290 295 300 Ser Gly Glu Lys Glu Gln Val Asp Glu Trp Thr Val Glu Thr Val Glu 305 310 315 320 Val Val Asn Ser Leu Gln Gln Gln Pro Gln Ala Ala Ser Pro Ser Val 325 330 335 Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gln Ser Asp Pro Leu Val 340 345 350 Arg Arg Gln Arg Val Gln Asp Leu Met Ala Gln Met Gln Gly Pro Tyr 355 360 365 Asn Phe Ile Gln Asp Ser Met Leu Asp Phe Glu Asn Gln Thr Leu Asp 370 375 380 Pro Ala Ile Val Ser Ala Gln Pro Met Asn Pro Thr Gln Asn Met Asp 385 390 395 400 Met Pro Gln Leu Val Cys Pro Gln Val His Ser Glu Ser Arg Leu Ala 405 410 415 Gln Ser Asn Gln Val Pro Val Gln Pro Glu Ala Thr Gln Val Pro Leu 420 425 430 Val Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gln Pro Leu Tyr Gln 435 440 445 Pro Ser His Ala Thr Glu Gln Arg Pro Gln Lys Glu Pro Met Asp Gln 450 455 460 Ile Gln Ala Thr Ile Ser Leu Asn Thr Asp Gln Thr Thr Ala Ser Ser 465 470 475 480 Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gln Pro Gln Val Phe Gln Ala Gly Thr Ser 485 490 495 Lys Pro Leu His Ser Ser Gly Ile Asn Val Asn Ala Ala Pro Phe Gln 500 505 510 Ser Met Gln Thr Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro Ala Asn 515 520 525 Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gln Gln Ser Gln Tyr Gln Ala Thr Tyr Asn 530 535 540 Gln Ser Phe Ser Ser Gln Pro His Gln Val Glu Gln Thr Glu Leu Gln 545 550 555 560 Gln Asp Gln Leu Gln Thr Val Val Gly Thr Tyr His Gly Ser Gln Asp 565 570 575 Gln Pro His Gln Val Pro Gly Asn His Gln Gln Pro Pro Gln Gln Asn 580 585 590 Thr Gly Phe Pro Arg Ser Ser Gln Pro Tyr Tyr Asn Ser Arg Gly Val 595 600 605 Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly Leu Met Asn Gly Tyr Arg 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Asn Val Asn Ala Ala Pro Phe Gln Ser Met Gln Thr Val 500 505 510 ttc aac atg aat gca cct gtt cct cct gtt aat gag cca gaa gcc ctt 1584 Phe Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Ala Leu 515 520 525 aag caa caa aat cag tac cag gcc agt tac aac cag agt ttc tcc aat 1632 Lys Gln Gln Asn Gln Tyr Gln Ala Ser Tyr Asn Gln Ser Phe Ser Asn 530 535 540 cag cca cac caa gta gaa caa tca gat ctt cag caa gaa cag ctc cag 1680 Gln Pro His Gln Val Glu Gln Ser Asp Leu Gln Gln Glu Gln Leu Gln 545 550 555 560 aca gtg gtt ggt act tac cat ggt tct ccg gac cag acc cat caa gtg 1728 Thr Val Val Gly Thr Tyr His Gly Ser Pro Asp Gln Thr His Gln Val 565 570 575 gca gga aac cac cag caa cct ccc cag cag aat act gga ttt cca cgc 1776 Ala Gly Asn His Gln Gln Pro Pro Gln Gln Asn Thr Gly Phe Pro Arg 580 585 590 aac agt cag cct tat tac aac agt cgg gga gtg tct cgt ggt gga tca 1824 Asn Ser Gln Pro Tyr Tyr Asn Ser Arg Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser 595 600 605 cgt ggg act cgt gga ttg atg aat ggt tac agg gga cct gca aat gga 1872 Arg Gly Thr Arg Gly Leu Met Asn Gly Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly 610 615 620 ttt aga gga gga tat gat ggc tac cgt cct tca ttt tcc aac act ccg 1920 Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro 625 630 635 640 aac agt ggt tac acg cag ccc caa ttt aat gct cct cga gat tat tca 1968 Asn Ser Gly Tyr Thr Gln Pro Gln Phe Asn Ala Pro Arg Asp Tyr Ser 645 650 655 aac tac cag cgg gat gga tat cag cag aac ttc aaa cgt ggt tct gga 2016 Asn Tyr Gln Arg Asp Gly Tyr Gln Gln Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly 660 665 670 caa agt ggg cct cgg gga gct cct cga ggt cgt gga ggg ccc cca aga 2064 Gln Ser Gly Pro Arg Gly Ala Pro Arg Gly Arg Gly Gly Pro Pro Arg 675 680 685 cca aac aga ggg atg cct caa atg aac gct cag caa gtg aat taa 2109 Pro Asn Arg Gly Met Pro Gln Met Asn Ala Gln Gln Val Asn 690 695 700 <210> 30 <211> 702 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 30 Met Pro Ser Ala Thr Asn Gly Thr Met Ala Ser Ser Ser Gly Lys Ala 1 5 10 15 Gly Pro Gly Gly Asn Glu Gln Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro 20 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Mus musculus <400> 49 atggaatgga gcggggtctt tatctttctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt cctctctgag 60 gtccagctgc atcagtttgg agctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatatcc 120 tgcaaggctt ctggctacac attcactgac tacaacatgg actgggtgaa gcagagccat 180 ggaaagagcc ttgagtggat tggagatatt aatcctaact atgatagtac tagctacaac 240 cagaagttca agggaaaggc cacattgact gtagacaagt cctccagcac agcctacatg 300 gagctccgca gcctgacatc tgaggacact gcagtctatt actgtgcaag atcgaggagc 360 tatgattacg aaggatttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagcc 420 aaaacaacac ccccatcagt ctat 444 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 50 Leu Trp Ser Val Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 Gly Ala Ser Ile Arg Glu Ser 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 52 Gln His Asn His Gly Ser Phe Leu Pro 1 5 <210> 53 <211> 132 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 53 Ala Val Leu Arg Cys Ser Arg Gly Leu Leu Val Ile Trp Ile Ser Asp 1 5 10 15 Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 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agtcatatgg attccgatat ccagctgacc cagtctccag cctccctatc 60 tgcatctgtg ggagaaactg tcaccatcac atgtcgagca agtgggaata ttcacaatta 120 tttagcatgg tatcagcaga aacagggaaa atctcctcag ctcctggtct ataatgcaaa 180 aaccttagca gatggtgtgc catcaaggtt cagtggcagt ggatcaggaa cacaatattc 240 tctcaagatc aacagcctgc agcctgaaga ttttgggagt tattactgtc aacatttttg 300 gagtacgctc acgttcggag gtggtaccaa gctggagatc aaacaatcgg atc 353 <210> 60 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 60 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr Leu His 1 5 10 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 61 Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 62 Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 63 <211> 94 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 63 Ser Gly Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 10 15 Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu 20 25 30 Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe 35 40 45 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 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<210> 97 <211> 104 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 97 Glu Phe His Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg 1 5 10 15 Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr 20 25 30 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser 35 40 45 Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg 50 55 60 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala 65 70 75 80 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Gly Arg Ser Glu Val 85 90 95 Val Pro Ser Trp Arg Ser Asn Lys 100 <210> 98 <211> 326 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 98 gcatggctca gtcagttgtc ctgcacagct tctggcttca acattaaaga cacctatatg 60 cactgggtga agcagaggcc tgaacagggc ctggagtgga ttggaaggat tgatcctgcg 120 aatggtaata ctaaatatga cccgaagttc cagggcaagg ccactataac agcagacaca 180 tcctccaaca cagcctacct gcagctcagc agcctgacat ctgaggacac tgccgtctat 240 tactgtgcta gaccgattca ttattactac ggtagtagcc ttgcttactg gggccaaggg 300 accacggtca ccgtctcctc aaaaaa 326 <210> 99 <211> 313 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 99 gagtttcatg ctgtgtctct agggcagagg gccaccatat cctgcagagc cagtgaaagt 60 gttgatagtt atggcaatag ttttatgcac tggtaccagc agaaaccagg acagccaccc 120 aaactcctca tctatcgtgc atccaaccta gaatctggga tccctgccag gttcagtggc 180 agtgggtcta ggacagactt caccctcacc attaatcctg tggaggctga tgatgttgca 240 acctattact gtcagcaaag taatgaggat cctggacgtt cggaggtggt accaagctgg 300 agatcaaaca aaa 313 <210> 100 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 100 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 101 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 101 Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 102 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 102 Ala Arg Ala Asn Trp Ala Phe Asp Tyr 1 5 <210> 103 <211> 109 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 103 Pro Arg Ala Ser Leu Gly Val Ser Glu Thr Leu Leu Cys Thr Ser Gly 1 5 10 15 Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly 20 25 30 Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr 35 40 45 Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 50 55 60 Asp Asn Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asn Trp Ala Phe Asp 85 90 95 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Lys 100 105 <210> 104 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 104 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr Leu His 1 5 10 <210> 105 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 105 Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 106 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 106 Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 107 <211> 94 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 107 Ser Gly Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 10 15 Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu 20 25 30 Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe 35 40 45 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val 50 55 60 Glu Thr Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp 65 70 75 80 Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gln 85 90 <210> 108 <211> 329 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 108 ggccgcgtgc tagcctgggg gtctctgaga ctctcctgtg cacttctggg ttcaccttca 60 ctgattacta catgagctgg gtccgccagc ctccaggaaa ggcacttgag tggttgggtt 120 ttattagaaa caaagctaat ggttacacaa cagagtacag tgcatctgtg aagggtcggt 180 tcaccatctc cagagataat tcccaaagca tcctctatct tcaaatgaac accctgagag 240 ctgaggacag tgccacttat tactgtgcaa gggctaactg ggcctttgac tactggggcc 300 aagggaccac ggtcaccgtc tcctcaaaa 329 <210> 109 <211> 284 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 109 tcaggagata gagtcagtct ttcctgcagg gccagtcaaa gtattagcaa ctacctacac 60 tggtatcaac aaaaatcaca tgagtctcca aggcttctca tcaagtatgc ttcccagtcc 120 atctctggga tcccctccag gttcagtggc agtggatcag ggacagattt cactctcagt 180 atcaacagtg tggagactga agattttgga atgtatttct gtcaacagag taacagctgg 240 ccgtacacgt tcggaggagg taccaagctg gagatcaaac agaa 284 <210> 110 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 110 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 111 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 111 Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 112 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 112 Ala Arg Ala Pro Leu Leu Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 113 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 113 Pro Ala Cys Leu Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser 1 5 10 15 Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro 20 25 30 Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly 35 40 45 Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 50 55 60 Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Pro Leu Leu Tyr 85 90 95 Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 100 105 110 <210> 114 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 114 Asn Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 115 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 115 Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 116 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 116 Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg 1 5 <210> 117 <211> 102 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 117 Arg Leu Pro Phe Tyr Ser Leu Glu Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg 1 5 10 15 Ala Ser Lys Asn Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn 20 25 30 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser 35 40 45 Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala 65 70 75 80 Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu Leu Val 85 90 95 Pro Ser Trp Lys Ser Asn 100 <210> 118 <211> 340 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 118 ccggcctgct tgcctggtgg ttctctgaga ctctcctgtg caacttctgg gttcaccttc 60 actgattact acatgagctg ggtccgccag cctccaggaa aggcacttga gtggttgggt 120 tttattagaa acaaagctaa tggttacaca acagagtaca gtgcatctgt gaagggtcgg 180 ttcaccatct ccagagataa ttcccaaagc atcctctatc ttcaaatgaa caccctgaga 240 gctgaggaca gtgccactta ttactgtgca agagcccctc tactttacta tgctatggac 300 tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctaaatta 340 <210> 119 <211> 306 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 119 cgccttcctt tctattctct ggagcagagg gccaccatct catacagggc cagcaaaaat 60 gtcagtacat ctggctatag ttatatgcac tggaaccaac agaaaccagg acagccaccc 120 aaactcctca tctatcttgt atccaaccta gaatctgggg tccctgccag gttcagtggc 180 agtgggtctg ggacagactt caccctcaac atccatcctg tggaggagga ggatgctgca 240 acctattact gtcagcacat tagggagctt acacgttcgg agctggtacc aagctggaaa 300 tcaaac 306 <210> 120 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 120 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 121 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 121 Met Ile Asp Pro Ser Asn Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 122 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 122 Ala Arg Gly Leu Arg His Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 123 <211> 101 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 123 Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His 1 5 10 15 Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile 20 25 30 Asp Pro Ser Asn Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys 35 40 45 Ala Thr Leu Asn Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu 50 55 60 Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly 65 70 75 80 Leu Arg His Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 85 90 95 Thr Val Ser Ser Lys 100 <210> 124 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 124 Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 125 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 125 Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 126 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 126 Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser 1 5 <210> 127 <211> 99 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 127 Thr Ile Leu Trp Arg Glu Gly Pro Phe Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser 1 5 10 15 Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro 20 25 30 Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser 35 40 45 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 50 55 60 Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 65 70 75 80 Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu Glu Val Pro Ser Trp Arg 85 90 95 Ser Asn Lys <210> 128 <211> 304 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 128 gtgtcctgca aggcttcagg ctataccttc accagctact ggatgcactg ggtgaaacag 60 aggcctggac aaggccttga gtggattggc atgattgatc cttccaatag tgaaactagg 120 ttaaatcaga agttcaagga caaggccaca ttgaatgtag acaaatcctc caacacagcc 180 tacatgcagc tcagcagcct gacatctgag gactctgcag tctattactg tgcaagaggg 240 ttacgccact actggtactt cgatgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 300 aaaa 304 <210> 129 <211> 298 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 129 actattctct ggagagaggg ccccttctca tacagggcca gcaaaagtgt cagtacatct 60 ggctatagtt atatgcactg gaaccaacag aaaccaggac agccacccag actcctcatc 120 tatcttgtat ccaacctaga atctggggtc cctgccaggt tcagtggcag tgggtctggg 180 acagacttca ccctcaacat ccatcctgtg gaggaggagg atgctgcaac ctattactgt 240 cagcacatta gggagcttac acgttcggag gaggtaccaa gctggagatc aaacaaaa 298 <210> 130 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 130 aggtsharct gcagsagtcw gg 22 <210> 131 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 131 tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc ccag 34 <210> 132 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 132 tccgatatcc agctgaccca gtctcca 27 <210> 133 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 133 gtttgatctc cagcttggta cchscdccga a 31 <210> 134 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 134 agtcacgacg ttgta 15 <210> 135 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 135 caggaaacag ctatgac 17

Claims

서열번호 2∼30 중 짝수의 서열 번호로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖고 항종양 작용을 갖는 항체 또는 항종양 작용을 갖는 그 항원 결합 프래그먼트와, 1종류 또는 2종류 이상의 항종양제를 함께 또는 각각 조합해서 포함하는 것, 및
상기 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트는, 암세포 표면상에 존재하는 CAPRIN-1 단백질의 세포 외 영역과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 CAPRIN-1 단백질을 발현하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약품.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 항체 또는 그 항원 결합 프래그먼트는 암세포 표면상에 존재하는 CAPRIN-1 단백질의 세포 외 영역 중 서열 번호 37로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 CAPRIN-1 단백질을 발현하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약품.
제 1 항에 있어서,
상기 CAPRIN-1 단백질은 인간 유래인 것을 특징으로 하는 CAPRIN-1 단백질을 발현하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약품.
제 1 항에 있어서,
상기 항종양제는 파클리탁셀, 독소루비신, 다우노루비신, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 티오테파, 부설판, 임프로설판, 피포설판, 벤조도파(benzodopa), 카르보쿠온, 메투레도파(meturedopa), 우레도파(uredopa), 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드(triethilenethiophosphoramide), 트리메틸올로멜라민(trimethylolomelamine), 불라타신, 불라타시논, 캄토세신, 브리오스타틴, 칼리스타틴(callystatin), 크립토피신1, 크립토피신8, 돌라스타틴, 듀오카르마이신, 엘루테로빈, 판크라티스타틴, 사르코딕티인(sarcodictyin), 스폰기스타틴, 클로람부실, 클로나파진(chloRNAphazine), 콜로포스파미드(cholophosphamide), 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민옥시드히드로클로라이드, 멜파란, 노벰비킨(novembichin), 페네스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실 머스타드, 카르무스틴, 클로로조토신(chlorozotocin), 포테무스틴(fotemustine), 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴, 칼리키아미신(calicheamicin), 다이네미신, 클로드로네이트, 에스페라미신, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신(authramycin), 아자세린, 블레오마이신(bleomycin), 칵티노마이신(cactinomycin), 카라비신(carabicin), 카르미노마이신, 카르지노필린(carzinophilin), 크로모마이신(chromomycin), 닥티노마이신, 데토르비신(detorbicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(adriamycin), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신(marcellomycin), 마이토마이신(mitomycin)C, 마이코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycins), 페플로마이신, 포트피로마이신(potfiromycin), 퓨로마이신, 쿠엘라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜베르시딘(tubercidin), 우베니멕스, 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin), 데노프테린(denopterin), 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 플루다라빈(fludarabine), 6-메르캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌, 안시타빈, 아자시티딘(azacitidine), 6-아자우리딘(azauridine), 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈(enocitabine), 플록스우리딘(floxuridine), 칼루스테론(calusterone), 프로피온산 드로모스타놀론, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤(testolactone), 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄, 프로린산(frolinic acid), 아세글라톤, 알도포스파미드글리코시드, 아미놀레불린산, 에닐우라실, 암사크린(amsacrine), 베스트라부실(bestrabucil), 비산트렌(bisantrene), 에다트락세이트(edatraxate), 데포파민(defofamine), 데메콜신(demecolcine), 디아지쿠온(diaziquone), 엘포르니틴(elfornithine), 아세트산 엘립티늄(elliptinium), 에포틸론(epothilone), 에토글루시드(etoglucid), 렌티난, 로니다민(lonidamine), 메이탄신(maytansine), 안사미토신(ansamitocine), 미토구아존(mitoguazone), 마이토잔트론, 모피단몰(mopidanmol), 니트라에린(nitraerine), 펜토스타틴, 페나메트(phenamet), 피라루비신, 로속산트론(losoxantrone), 포도필린산(podophyllinic acid), 2-에틸히드라지드, 프로카르바진, 라족산(razoxane), 리족신, 시조필란, 스피로게르마늄(spirogermanium), 테누아존산(tenuazonic acid), 트리아지쿠온(triaziquone), 로리딘(roridine)A, 안구이딘(anguidine), 우레탄, 빈데신, 다카바진, 만노무스틴(mannomustine), 미토브로니톨, 미토락톨(mitolactol), 피포브로만(pipobroman), 가시토신(gacytosine), 도세탁셀, 클로람부실, 겜시타빈(gemcitabine), 6-티오구아닌, 메르캅토푸린, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카르보플라틴, 빈블라스틴, 에폭시드, 이포스파미드, 미톡산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 노반트론(novantrone), 테니포사이드, 에다트렉세이트(edatrexate), 다우노마이신, 아미노프테린, 젤로다(xeloda), 이반드로네이트(ibandronate), 이리노테칸, 토포이소머라제 인히비터, 디플루오로메틸오르니틴(DMFO), 레티노산, 카페시타빈(capecitabine) 및 그들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 CAPRIN-1 단백질을 발현하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약품.
제 5 항에 있어서,
상기 항종양제는 시클로포스파미드, 파클리탁셀, 도세탁셀, 비노렐빈 및 그들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 CAPRIN-1 단백질을 발현하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약품.
제 1 항에 있어서,
상기 암은 유방암, 뇌종양, 백혈병, 림프종, 폐암, 비만 세포종, 신장암, 자궁경부암, 방광암, 식도암, 위암 또는 대장암인 것을 특징으로 하는 CAPRIN-1 단백질을 발현하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약품.
제 1 항에 있어서,
상기 항체는 단일클론 항체, 다중클론 항체 또는 재조합 항체인 것을 특징으로 하는 CAPRIN-1 단백질을 발현하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약품.
제 1 항에 있어서,
상기 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 이중 특이성 항체인 것을 특징으로 하는 CAPRIN-1 단백질을 발현하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약품.
제 1 항에 있어서,
상기 항원 결합 프래그먼트는 단쇄 항체(scFv), Fab, F(ab')₂ 및 Fv로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 CAPRIN-1 단백질을 발현하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약품.
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