MX2014006733A

MX2014006733A - Anticuerpos para el receptor del factor de crecimiento epidermico 3 (her3) dirigidos al dominio ii del her3.

Info

Publication number: MX2014006733A
Application number: MX2014006733A
Authority: MX
Inventors: Winfried Elis; Seth Ettenberg; Andrew Paul Garner; Christian Carsten Silvester Kunz; Tobias Seitz
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2011-12-05
Filing date: 2012-12-04
Publication date: 2015-05-12
Also published as: US20130273029A1; EP2788382A2; AR089084A1; BR112014013568A8; IN2014CN04373A; BR112014013568A2; EA201491107A1; CN104105709A; SG11201402739YA; TW201328707A; AU2012349736A1; UY34486A; CA2857601A1; JP2015500829A; WO2013084148A3; WO2013084148A2; KR20140103135A; IL232951A0

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos o fragmentos de los mismos que se dirigen a un epítopo de un receptor HER3 que reside en el dominio 2 del receptor HER3, para bloquear la transducción de señales y el crecimiento tumoral tanto dependientes del ligando como independientes del ligando; y a composiciones y métodos de uso de los mismos.

Description

ANTICUERPOS PARA EL RECEPTOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDÉRMICO 3 (HER3) DIRIGIDOS AL DOMINIO II DEL HER3 Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reclama prioridad para la Solicitud Provisional de Patente de los Estados Unidos de Norteamerica Número 61 /566,912 presentada el 5 de diciembre de 201 1 , el contenido de la cuales se incorpora a la presente como referencia en su totalidad.

Campo de la Invención Esta invención se refiere, en términos generales, a anticuerpos o fragmentos de los mismos que reconocen un epítopo de HER3, el cual comprende los residuos dentro del dominio 2 que da como resultado la inhibición de la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando, y el crecimiento tumoral; y a composiciones y métodos de uso de estos anticuerpos o fragmentos de los mismos.

Antecedentes de la Invención El receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 3 (ErbB3, también conocido como HER3) es una cinasa de proteína tirosina receptora y pertenece a la subfamilia de cinasas de proteína tirosina receptoras del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), que también incluye EGFR (HER1 , ErbB1 ), HER2 (ErbB2, Neu), y HER4 (ErbB4) (Plowman y colaboradores (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 87: 4905-4909; Kraus y colaboradores (1989) Proc.

Nati. Acad. Sci. EUA 86: 9193-9197; y Kraus y colaboradores (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90: 2900-2904). Como el receptor del factor de crecimiento epidérmico prototípico, el receptor HER3 transmembrana consiste en un dominio de enlace a ligando extracelular (ECD), un dominio de dimerización dentro del dominio de enlace a ligando extracelular (ECD), un dominio transmembrana, un dominio de tipo cinasa de proteína tirosina intracelular (TKD), y un dominio de fosforilación C-terminal. A diferencia de los otros miembros de la familia HER, el dominio de cinasa de H ER3 exhibe una actividad de cinasa intrínseca muy baja.

Los ligandos de neurregulina 1 (NRG) o neurregulina 2 se enlazan al dominio extracelular de HER3 y activan la senda de señalización mediada por el receptor mediante la promoción de la dimerización con otros compañeros de dimerización, tales como HER2. La heterodimerización da como resultado la activación y trans-fosforilación del dominio intracelular de HER3, y es un medio no solamente para la diversificación de la señal, sino también para la amplificación de la señal. En adición, la heterodimerización de HER3 también se puede presentar en ausencia de ligandos activadores, y esto se denomina comúnmente como activación de HER3 independiente del ligando. Por ejemplo, cuando HER2 se expresa en altos niveles como un resultado de la amplificación genética (por ejemplo, en cáncer de mama, pulmón, ovario o gástrico), se pueden formar dímeros de HER2/HER3 espontáneos. En esta situación , el HER2/HER3 se considera como el dímero de señalización de ErbB más activo y, por consiguiente, es altamente transformante.

Se ha encontrado un aumento de HER3 en varios tipos de cáncer, tales como cánceres de mama, de pulmón, gastromtestinal y pancreático. Es interesante que se ha demostrado una correlación entre la expresión de HER2/H ER3 y el progreso desde una etapa no invasiva hasta una etapa invasiva (Alimandi y colaboradores (1995) Oncogene 10: 1813-1821 ; DeFazio y colaboradores (2000) Cáncer 87: 487-498; Naidu y colaboradores (1988) Br. J . Cáncer 78: 1385-1390). De conform idad con lo anterior, se necesitan agentes que interfieran con la señalización mediada por HER3.

Breve Descripción de la Invención La invención se basa en el descubrimiento de anticuerpos o fragmentos de los mismos que se enlazan a un epítopo (lineal, no lineal, conformacional) del receptor HER3 que comprende los residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 de HER3. De una manera sorprendente, el enlace de los anticuerpos o fragmentos de los mismos a un epítopo dentro del dominio 2 de HER3 bloquea las sendas de señalización de HER3 tanto dependientes del ligando (por ejemplo, neurregulina) como independientes del ligando.

De conformidad con lo anterior, en un aspecto, la invención pertenece a un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que reconoce un epítopo de un receptor HER3, en donde el epítopo comprende los residuos de aminoácidos 208-328 dentro del dominio 2 del receptor HER3, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo reconoce cuando menos ei residuo de aminoácido 268 dentro del dominio 2, y en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo bloquea la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando.

El epítopo se selecciona a partir del grupo que consiste en un epítopo lineal, un epítopo no lineal, y un epítopo conformacional. En una modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlaza a un estado inactivo del receptor HER3. En una modalidad, el ligando de H ER3 que se enlaza al sitio de enlace del ligando fracasa para activar la transducción de señales de HER3. En una modalidad, un ligando de HER3 se puede enlazar de una manera concurrente al sitio de enlace del ligando sobre el receptor H ER3. En una modalidad , el ligando de HER3 se selecciona a partir del grupo que consiste en neurregulina 1 (NRG), neurregulina 2, beta-celulina, factor de crecimiento epidérmico que se enlaza a heparina, y epirregulina. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos descritos en la presente pueden enlazarse al residuo de aminoácido 268 (dentro del dominio 2). En una modalidad, el aminoácido de enlace 268 afecta al enlace en el dominio 2, bloqueando de esta manera el enlace al anticuerpo o al fragmento del anticuerpo. En una modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo tiene una característica seleccionada a partir del grupo que consiste en desestabilizar HER3 de tal manera que sea susceptible a la degradación, acelerar la sub-regulación de HER3 de la superficie celular, inhibir la dimerización con otros receptores HER, y generar un dímero de HER3 no natural que sea susceptible a la degradación proteolítica o que sea incapaz de dimerizarse con otras cinasas de tirosina receptoras. En una modalidad, el enlace del anticuerpo o de un fragmento del mismo al receptor H ER3 en ausencia de un ligando de HER3 reduce la formación independiente del ligando de un complejo de proteína de H ER2-HER3 en una célula que exprese HER2 y HER3. En una modalidad, el receptor H ER3 fracasa para dimerizarse con el receptor HER2 para formar un complejo de proteína de HER2-HER3. En una modalidad, el fracaso para formar un complejo de proteína de HER2-HER3 impide la activación de la transducción de señales. En una modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo inhibe la fosforilación de HER3 como se evalúa mediante un ensayo de fosforilación independiente del ligando de HER3. En una modalidad, el ensayo de fosforilación independiente del ligando de HER3 utiliza células amplificadas por HER2, en donde las células amplificadas por HER2 son las células SK-Br-3 y BT-474. En una modalidad, el enlace del anticuerpo o de un fragmento del mismo al receptor HER3 en la presencia de un ligando de HER3 reduce la formación de un complejo de proteína de HER2-HER3 dependiente del ligando en una célula que exprese HER2 y HER3. En una modalidad, el receptor H ER3 fracasa para dimerizarse con el receptor HER2 en la presencia de un ligando de HER3 para formar un complejo de proteína de HER2-HER3. En una modalidad, el fracaso para formar un complejo de proteína de HER2-H ER3 impide la activación de la transducción de señales. En una modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo inhibe la fosforilación de HER3 como se evalúa mediante el ensayo de fosforilación dependiente del ligando de H ER3. En una modalidad, el ensayo de fosforilación dependiente del ligando de HER3 utiliza células MCF7 estimuladas en la presencia de neurregulina (NRG). En una modalidad, el anticuerpo se selecciona a partir del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, y un anticuerpo sintético.

En otro aspecto, la invención pertenece a un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que reconoce un epítopo de un receptor HER3 dentro del dominio 2 del receptor H ER3, en donde el epítopo comprende los residuos de aminoácidos 208-328 dentro del dominio 2 del receptor HER3, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo reconoce cuando menos el residuo de aminoácido 268 dentro del dominio 2, y en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo tiene una disociación (KD) de cuando menos 1 x 107 M \ 108 M 1 , 109 M 1 , 101° M 1 , 101 1 M 1 , 1012 M 1 , 1013 M 1 , y en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo bloquea la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando. En una modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo inhibe la fosforilación de HER3 como se mide mediante un ensayo de fosforilación in vitro seleccionado a partir del grupo que consiste en fosfo-HER3 y fosfo-Akt. En una modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlaza al mismo epítopo como un anticuerpo descrito en la Tabla 1 . En una modalidad, el anticuerpo aislado o el fragmento del mismo compite cruzadamente con un anticuerpo descrito en la Tabla 1 . En una modalidad, el fragmento de un anticuerpo se selecciona a partir del grupo que consiste en: Fab, F(ab2)\ F(ab)2’, scFv, VHH, VH, VL, dAbs.

En otro aspecto, la invención pertenece a una composición farmaceutica, la cual comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlaza a un receptor HER3 que comprende los residuos de aminoácidos 208-328 dentro del dominio 2 del receptor HER3, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo reconoce cuando menos el residuo de aminoácido 268 dentro del dominio 2, y en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo bloquea la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando. En una modalidad, la composición farmacéutica comprende además un agente terapéutico adicional. En una modalidad, el agente terapéutico adicional se selecciona a partir del grupo que consiste en un inhibidor de HER1 , un inhibidor de HER2, un inhibidor de HER3, un inhibidor de HER4, un inhibidor de mTOR y un inhibidor de cinasa PI3. En una modalidad, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de HER1 seleccionado a partir del grupo que consiste en Matuzumab (EMD72000), Erbitux® / Cetuximab, Vectibix® /Panitumumab, mAb 806, Nimotuzumab, Iressa® / Gefitinib, CI-1033 (PD183805), Lapatinib (GW-572016), Tykerb® / Ditosilato de lapatinib, Tarceva® / Erlotinib HCL (OSI-774), PKI-166, y Tovok®; un inhibidor de HER2 seleccionado a partir del grupo que consiste en Pertuzumab, Trastuzumab, MM-1 1 1 , neratinib, lapatinib o ditosilato de lapatinib / Tykerb®; un inhibidor de HER3 seleccionado a partir del grupo que consiste en MM-121 , M M-1 1 1 , IB4C3, 2DID12 (U3 Pharma AG), AMG888 (Amgen), AV-203 (Aveo), MEH D7945A (Genentech), MOR10703 (Novartis), y moleculas pequeñas que inhiben HER3; y un inhibidor de H ER4. En una modalidad, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de mTOR seleccionado a partir del grupo que consiste en Temsirolimus / Torisel®, ridaforolimus / Deforolimus, AP23573, MK8669, everolimus / Affinitor®. En una modalidad, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de cinasa PI3 seleccionado a partir del grupo que consiste en GDC 0941 , BEZ235, BMK120 y BYL719.

En otro aspecto, la invención pertenece a un método para el tratamiento de un cáncer, el cual comprende seleccionar un sujeto que tenga un cáncer que exprese HER3, administrar al sujeto, una cantidad efectiva de una composición que comprenda un anticuerpo o un fragmento del mismo como se dan a conocer en la Tabla 1 , en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo reconoce un epítopo de un receptor HER3 que comprende los residuos de aminoácidos 208-328 dentro del dominio 2 del receptor H ER3, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo reconoce cuando menos el residuo de aminoácido 268 dentro del dominio 2, y en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo bloquea la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando. En una modalidad, el sujeto es un ser humano y el cáncer se selecciona a partir del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer colo-rectal, cáncer de pulmón, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer gástrico, cáncer pancreático, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, osteosarcoma, carcinoma de celulas escamosas, tumores periféricos de la vaina de los nervios, schwanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer esofágico, cáncer esofágico de Barretts, glioblastoma, sarcoma de células claras del tejido blando, mesotelioma maligno, neurofibromatosis, cáncer renal, melanoma, cáncer de próstata, hiperplasia prostética benigna (BPH), ginecomastia, y endometriosis. En una modalidad, el cáncer es cáncer de mama.

En un aspecto, la invención pertenece a un anticuerpo o a un fragmento del mismo, para utilizarse en el tratamiento de un cáncer mediado por una senda de transducción de señales dependiente del ligando o de transducción de señales independiente del ligando de HER3. En un aspecto, la invención pertenece a un anticuerpo o a un fragmento del mismo, para utilizarse como un medicamento. En un aspecto, la invención pertenece al uso de un anticuerpo o de un fragmento del mismo para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un cáncer mediado por una senda de transducción de señales dependiente del ligando o de transducción de señales independiente del ligando de HER3 seleccionado a partir del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer colo-rectal, cáncer de pulmón, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer gástrico, cáncer pancreático, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, osteosarcoma, carcinoma de células escamosas, tumores periféricos de la vaina de los nervios, schwanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer esofágico, cáncer esofágico de Barretts, glioblastoma, sarcoma de células claras del tejido blando, mesotelioma maligno, neuro-fibromatosis, cáncer renal, melanoma, cáncer de próstata, hiperplasia prostética benigna (BPH), ginecomastia, y endometriosis. Breve Descripción de las Figuras Figura 1 : Curvas SET de MOR12616 y MOR12925 representativas obtenidas con human HER3.

Figura 2: Determinación de enlace de células SK-Br-3 mediante titulación FACS.

Figura 3: Curvas de titulación de ELISA de enlace de dominio de HER3.

Figura 4: Curvas de ELISA de enlace del muíante de HER3.

Figura 5: Competición con el epítopo de HER3 mediante ELISA.

Figura 6: Inhibición de la fosforilación de HER3 y Akt inducida por el ligando.

Figura 7: Inhibición de la fosforilación de HER3 y Akt independiente del ligando en líneas celulares amplificadas por HER2.

Figura 8: Inhibición de la proliferación celular dependiente del ligando (A) e independiente del ligando (B, C).

Figura 9: Datos que muestran la inhibición in vivo del crecimiento tumoral en BxPC3 (A) y BT474 (B).

Descripción Detallada de la Invención Definiciones Con el objeto de que la presente invención pueda ser más fácilmente entendida, primero se definen ciertos terminos. A través de toda la descripción detallada se estipulan definiciones adicionales.

La frase “transducción de señales" o "actividad de señalización", como se utiliza en la presente, se refiere a una relación bioquímica causal iniciada en términos generales por la interacción de proteína-proteína, tal como el enlace de un factor de crecimiento a un receptor, que da como resultado la transmisión de una señal desde una porción de una célula hasta otra porción de una célula. Para HER3, la transmisión involucra la fosforilación específica de uno o más residuos de tirosina, serina, o treonina sobre una o más proteínas en la serie de reacciones que provocan la transducción de señales. Los penúltimos procesos típicamente incluyen eventos nucleares, que dan como resultado un cambio en la expresión genética.

El término “HER3" o "receptor HER3”, también conocido como “ErbB3", como se utiliza en la presente, se refiere a una proteína de HER3 de mamífero, y “her3" o "erbB3" se refiere a un gen her3 de mamífero. La proteína de HER3 preferida es la proteína de HER3 humano presente en la membrana celular de una célula. El gen her3 humano se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,480,968, y en Plowman y colaboradores (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 87: 4905-4909.

El HER3 humano, como se define en el Número de Acceso NP_001973 (humano), está representado más adelante como la SEQ ID NO: 1 . Toda la nomenclatura es para el HER3 inmaduro de longitud completa (aminoácidos 1 a 1342). El HER3 inmaduro se disocia entre las posiciones 19 y 20, lo cual da como resultado la proteína del HER3 maduro (de 20 a 1342 aminoácidos) mrandalqvl gllfslargs evgnsqavcp gtlnglsvtg daenqyqtly klyercevvm gnleivltgh nadlsflqwi revtgyvlva mnefstlplp nlrvvrgtqv ydgkfaifvm Inyntnssha Irqlrltqlt eilsggvyie kndklchmdt idwrdivrdr daeiwkdng rscppchevc kgrcwgpgse dcqtltktic apqenghcfg pnpnqcchde caggcsgpqd tdcfacrhfn dsgacvprcp qplvynkltf qlepnphtky qyggvcvasc phnfvvdqts cvracppdkm evdknglkmc epcgglcpka cegtgsgsrf qtvdssnidg fvnctkilgn Idflitglng dpwhkipald peklnvfrtv reitgylniq swpphmhnfs vfsnlttigg rslynrgfsl limknlnvts Igfrslkeis agriyisanr qlcyhhslnw tkvlrgptee rldikhnrpr rdcvaegkvc dplcssggcw gpgpgqclsc rnysrggvcv thcnflngep refaheaecf schpecqpme gtatcngsgs dtcaqcahfr dgphcvsscp hgvlgakgpi ykypdvqnec rpchenctqg ckgpelqdcl gqtlvligkt hltmaltvia glvvifmmlg gtflywrgrr iqnkramrry lergesiepl dpsekankvl arifketelr klkvlgsgvf gtvhkgvwip egesikipvc ikviedksgr qsfqavtdhm laigsldhah ivrllglcpg sslqlvtqilo plgslldhvr qhrgalgpql llnwgvqiak gmyyleehgm vhrnlaarnv llkspsqvqv adfgvadllp pddkqllyse aktpikwmal esihfgkyth qsdvwsygvt vwelmtfgae pyaglrlaev pdllekgerl aqpqictidv ymvmvkcwmi denirptfke laneftrmar dpprylvikr esgpgiapgp ephgltnkkl eevelepeld Idldleaeed nlatttlgsa Islpvgtlnr prgsqsllsp ssgympmnqg nlgescqesa vsgssercpr pvslhpmprg clasessegh vtgseaelqe kvsmcrsrsr srsprprgds ayhsqrhsll tpvtplsppg leeedvngyv mpdthlkgtp ssregtlssv glssvlgtee ededecyeym nrrrrhspph pprpssleel gyeymdvgsd Isaslgstqs cplhpvpimp tagttpdedy eymnrqrdgg gpggdyaamg acpaseqgye emrafqgpgh qaphvhyarl ktlrsleatd safdnpdywh srlfpkanaq rt (SEQ ID NO: 1 ).

El “complejo de proteína de HER2-H ER3” es un oligómero no covalentemente asociado que contiene el receptor HER2 y el receptor HER3. Este complejo se puede formar cuando una célula que exprese ambos de estos receptores se exponga a un ligando de HER3, por ejemplo, NRG, o cuando HER2 sea activo o se sobre exprese.

La frase “actividad de HER3" o " activación de HER3", como se utiliza en la presente, se refiere a un aumento en la oligomerización (por ejemplo, un aumento en los complejos que contienen HER3), en la fosforilación de HER3, en las reconfiguraciones conformacionales (por ejemplo, aquéllas inducidas por ligandos), y en la señalización corriente abajo mediada por HER3.

El término “estabilización" o "estabilizado”, utilizado en el contexto de HER3, se refiere a un anticuerpo o a un fragmento del mismo que mantiene directamente (asegura, ata, detiene, enlaza preferencialmente, favorece) el estado inactivo o la conformación de HER3 sin bloquear el enlace del ligando al HER3, de tal manera que el enlace del ligando ya no es capaz de activar el HER3.

El término “señalización dependiente del ligando", como se utiliza en la presente, se refiere a la activación de HER3 por medio del ligando. La activación de HER3 es evidenciada por un aumento en la heterodi erización y/o en la fosforilación de H ER3, de tal manera que se activan las sendas de señalización corriente abajo (por ejemplo, PI3K). El anticuerpo o el fragmento del mismo puede reducir de una manera estadísticamente significativa la cantidad de HER3 fosforilado en una célula estimulada expuesta a un anticuerpo o a un fragmento del mismo, en relación con una célula no tratada (control), como se mide utilizando los ensayos descritos en los Ejemplos. La célula que expresa HER3 puede ser una línea celular que se presente naturalmente (por ejemplo, MCF7) o se puede producir de una manera recombinante mediante la introducción de ácidos nucleicos que codifiquen la proteína HER3 en una célula huésped. La estimulación celular se puede presentar ya sea por medio de la adición exógena de un ligando de HER3 activador, o mediante la expresión endógena de un ligando activador.

El anticuerpo o el fragmento del mismo que “reduce la activación de HER3 inducida por neurregulina en una célula” es uno que reduce de una manera estadísticamente significativa la fosforilación de tirosina de HER3 en relación con una célula no tratada (control), como se mide utilizando los ensayos descritos en los Ejemplos. Esto se puede determinar basándose en los niveles de fosfotirosina de HER3 en seguida de la exposición de HER3 al NRG y al anticuerpo de interés. La célula que expresa la proteína de HER3 puede ser una célula o línea celular que se presente naturalmente (por ejem plo, MCF7) o se puede producir de una manera recombinante.

El termino “señalización independiente del ligando", como se utiliza en la presente, se refiere a la actividad de HER3 celular (por ejemplo, la fosforilación), en ausencia de un requerimiento de enlace del ligando. Por ejemplo, la activación de H ER3 independiente del ligando puede ser un resultado de la sobre-expresión de HER2 o las mutaciones activadoras en los componentes del heterodímero de HER3, tales como EGFR y HER2. El anticuerpo o el fragmento del mismo puede reducir de una manera estadísticamente significativa la cantidad de HER3 fosforilado en una célula expuesta a un anticuerpo o a un fragmento del mismo, en relación con una célula no tratada (control). La célula que expresa HER3 puede ser una línea celular que se presente naturalmente (por ejemplo, SK-Br-3) o se puede producir de una manera recombinante mediante la introducción de ácidos nucleicos que codifiquen la proteína de HER3 en una célula huésped.

El término “bloquea", como se utiliza en la presente, se refiere a detener o impedir una interacción o un proceso, por ejemplo, detener la señalización dependiente del ligando o independiente del ligando.

El término “reconocer", como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo o a un fragmento del mismo que se encuentra e interactúa (por ejemplo, se enlaza) con su epítopo en el dominio 2 de HER3. Por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento del mismo que interactúa con cuando menos un residuo de aminoácido dentro del dominio 2 de HER3 (residuos de aminoácidos 208-328 de la SEQ ID NO: 1 ). En otro ejemplo, el anticuerpo o un fragmento del mismo que interactúa con cuando menos Lys 268 dentro del dominio 2 de HER3.

La frase “se enlaza de una manera concurrente", como se utiliza en la presente, se refiere a un ligando de HER3 que puede enlazarse a un sitio de enlace de ligando sobre el receptor HER3 junto con el anticuerpo de HER3 o con un fragmento del mismo. Esto significa que tanto el anticuerpo como el ligando pueden enlazarse al receptor HER3 juntos. Para efectos de ilustración solamente, el ligando de HER3 N RG , puede enlazarse al receptor HER3 junto con el anticuerpo de H ER3. El ensayo para medir el enlace concurrente del ligando y el anticuerpo se describe en la sección de Ejemplos.

El término “fracasa", como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo o a un fragmento del mismo que no hace un evento particular. Por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento del mismo que “fracasa para activar la transducción de señales” es uno que no desencadena la transducción de señales.

El término “anticuerpo", como se utiliza en la presente, se refiere un anticuerpos enteros que interactúan con (por ejemplo, mediante enlace, impedimento estérico, estabilización/ desestabilización, distribución espacial) un epítopo de HER3 e inhiben la transducción de señales. Un "anticuerpo" que se presenta naturalmente es una glicoproteína que comprende cuando menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada está comprendida de una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como VH), y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está comprendida de tres dominios, CH 1 , CH2 y CH3. Cada cadena ligera está comprendida de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como VL), y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está comprendida de un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas como regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas como regiones de estructura (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres regiones determinantes de complementariedad (CDRs) y cuatro regiones de estructura (FRs) arregladas desde el termino amino hasta el término carboxilo en el siguiente orden: FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de enlace que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar el enlace de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, incluyendo diversas células del sistema inmunológico (por ejemplo, las células efectoras), y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico. El término “anticuerpo” incluye, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos camelizados, anticuerpos quiméricos, Fvs de una sola cadena (scFv), Fvs enlazado con disulfuro (sdFv), fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), y anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ld) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ld) para los anticuerpos de la invención), y fragmentos de enlace al epítopo de cualquiera de los anteriores. Los anticuerpos pueden ser de cualquier clase de isotipo (por ejemplo, I g G , I g E , IgM , IgD, IgA e I g Y) , o subclase de isotipo (por ejemplo, I g G 1 , lgG2, lgG3, lgG4, Ig A 1 e I g A2 ) .

Ambas cadenas ligera y pesada se dividen en regiones de homología estructural y funcional. Los términos “constante" y "variable” se utilizan funcionalmente. En este aspecto, se apreciará que los dominios variables de ambas porciones de cadena ligera (VL) y de cadena pesada (VH) determinan el reconocimiento y la especificidad del antígeno. Inversamente, los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y de la cadena pesada (CH 1 , CH2 ó CH3) confieren importantes propiedades biológicas, tales como secreción, movilidad transplacentaria, enlace al receptor de Fe, enlace al complemento, y similares. Por convención, la numeración de los dominios de las regiones constantes aumenta a medida que llegan a hacerse más distales desde el sitio de enlace al antígeno o el término amino del anticuerpo. El término-N es una región variable, y el término-C es una región constante; los dominios CH3 y CL realmente comprenden el término carboxilo de la cadena pesada y ligera, respectivamente.

La frase “fragmento de anticuerpo", como se utiliza en la presente, se refiere a una o más porciones de un anticuerpo que conservan la capacidad para interactuar específicamente (por ejemplo, mediante enlace, Impedimento esterico, estabilización/ desestabilización, distribución espacial) con un epítopo de H ER3 e inhibir la transducción de señales. Los ejemplos de los fragmentos de enlace un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH , CL y CH 1 ; un fragmento F(ab)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de articulación; un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1 ; un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; un fragmento dAb (Ward y colaboradores (1989) Nature 341 : 544-546), el cual consiste en un dominio VH; y una región determinante de complementariedad (CDR) aislada.

Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, se pueden unir, empleando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les haga posible elaborarse como una sola cadena de proteína en donde el par de regiones VL y VH formen moléculas monovalentes (conocidas como Fv de una sola cadena (scFv); véase, por ejemplo, Bird y colaboradores (1988) Science 242: 423-426; y Huston y colaboradores (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85: 5879-5883). También se pretende que estos anticuerpos de una sola cadena sean abarcados dentro del término “fragmento de anticuerpo". Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen empleando téenicas convencionales conocidas por las personas expertas en la materia, y los fragmento se rastrean para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

Los fragmentos de anticuerpos también se pueden incorporar en anticuerpos de un solo dominio, maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (véase, por ejemplo, Hollinger y Hudson, (2005) Nature Biotechnology 23: 1 126-1 136). Los fragmentos de anticuerpos se pueden injertar en andamiajes basados en polipéptidos, tales como Fibronectina tipo II I (Fn3) (véase la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,703, 199, la cual describe monocuerpos de polipéptidos de fibronectina).

Los fragmentos de anticuerpos se pueden incorporar en moléculas de una sola cadena que comprendan un par de segmentos Fv en fila (VH-CH 1 -VH-CH 1 ), los cuales, junto con los polipéptidos de cadena ligera complementaria, forman un par de regiones de enlace al antígeno (Zapata y colaboradores (1995) Protein Eng. 8: 1057-1062; y la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,641 ,870).

El término “epítopo” incluye cualquier determinante de proteína capaz de tener un enlace específico a una inmunoglobulina o de otra manera interactuar con una molécula. Los determinantes epitópicos en términos generales consisten en agrupaciones de moléculas superficiales químicamente activas, tales como cadenas laterales de aminoácidos o de carbohidratos o de azúcar, y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un epítopo puede ser “lineal", "no lineal", o "conformacional”. En una modalidad, el epítopo está dentro del dominio 2 de HER3. En una modalidad , el epítopo es un epítopo lineal dentro del dominio 2 de HER3. En una modalidad, el epítopo es un epítopo no lineal dentro del dominio 2 de HER3. En otra modalidad, el epítopo es un epítopo conformacional que comprende los residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 de HER3. En una modalidad, el epítopo comprende cuando menos un residuo de am inoácido dentro del dominio 2 de HER3 (aminoácidos 208-328 de la SEQ ID NO: 1 ), o un subconjunto de los mismos. En una modalidad , el epítopo comprende cuando menos el aminoácido Lys268 (dentro del dominio 2) de la SEQ ID NO: 1 . Los anticuerpos o fragmentos de los mismos descritos en la presente pueden enlazarse a Lys268 dentro del dominio 2 de HER3.

El término “epítopo lineal” se refiere a un epítopo con todos los puntos de interacción entre la proteína y la molécula interactuante (tal como un anticuerpo) que se presenta linealmente a lo largo de la secuencia de aminoácidos primaria de la proteína (es decir, aminoácidos continuos). Una vez que se determina un epítopo deseado sobre un antígeno, es posible generar anticuerpos para ese epítopo, por ejemplo, empleando las téenicas descritas en la presente invención. De una manera alternativa, durante el proceso de descubrimiento, la generación y caracterización de los anticuerpos puede elucidar información acerca de los epítopos deseables. A partir de esta información, entonces es posible rastrear de una manera competitiva los anticuerpos para enlazarse al mismo epítopo. Un planteamiento para lograr esto es conducir estudios de competición cruzada para encontrar los anticuerpos que se enlacen competitivamente unos con otros, por ejemplo, los anticuerpos compiten por el enlace al antígeno. Se describe un proceso de alta producción para “reservar" los anticuerpos basándose en su competición cruzada, en la Solicitud de Patente Internacional Número WO 2003/48731 . Como será apreciado por un experto en la materia, prácticamente cualquier cosa a la que se pueda enlazar específicamente un anticuerpo podría ser un epítopo. Un epítopo puede comprender los residuos a los que se enlaza el anticuerpo.

El término “epítopo no lineal” se refiere a un epítopo con aminoácidos no contiguos que forman una estructura tridimensional dentro de un dominio particular (por ejemplo, dentro del dominio 1 , dentro del dominio 2, dentro del dominio 3, o dentro del dominio 4). En una modalidad, el epítopo no lineal está dentro del dominio 2. El epítopo no lineal también se puede presentar entre dos o más dominios (por ejemplo, la interfase entre los dominios 3-4). El epítopo no lineal también se refiere a los aminoácidos no contiguos que son un resultado de una estructura tridimensional dentro de un dominio particular.

El término “epítopo conformacional” se refiere a un epítopo en donde los aminoácidos discontinuos llegan a juntarse en una conformación tridimensional que involucra cuando menos dos diferente dominios, tales como el dominio 2 y el dominio 4; o el dominio 3 y el dominio 4. En un epítopo conformacional, los puntos de interacción se presentan a través de los residuos de aminoácidos que están separados unos de otros sobre la proteína. Como será apreciado por un experto en la materia, el espacio que es ocupado por un residuo o por una cadena lateral que crea la forma de una molécula ayuda a determinar lo que es un epítopo.

En términos generales, los anticuerpos específicos para un antígeno objetivo particular reconocerán preferencialmente un epítopo sobre el antígeno objetivo en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.

Las regiones de un polipéptido dado que incluyen un epítopo se pueden identificar utilizando cualquier número de téenicas de mapeo de epítopos, bien conocidas en la materia. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Volumen 66 (Glenn E. Morris, Editor, 1996) Humana Press, Totowa, Nueva Jerscy. Por ejemplo, los epítopos lineales se pueden determinar, por ejemplo, sintetizando de una manera concurrente grandes números de péptidos sobre soportes sólidos, los péptidos correspondientes a porciones de la molécula de la proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con los anticuerpos mientras los péptidos están todavía unidos a los soportes. Estas técnicas se conocen en la materia, y se describen , por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,708,871 ; en Geysen y colaboradores (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 8: 3998-4002; en Geysen y colaboradores (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82; 78-182; y en Geysen y colaboradores (1986) Mol. Immunol. 23: 709-715.

De una manera similar, los epítopos conformacionales se identifican fácilmente mediante la determinación de la conformación espacial de los aminoácidos, tal como mediante, por ejemplo, intercambio de hidrógeno/deuterio, cristalografía de rayos-X, y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Las regiones antigénicas de las proteínas también se pueden identificar utilizando gráficas convencionales de antigenicidad e hidropatía, tales como aquéllas calculadas utilizando, por ejemplo, el programa de software Omiga versión 1.0 disponible en el Oxford Molecular Group. Este programa de computación emplea el método de Hopp/Woods, Hopp y colaboradores (1981 ) Proc. Nati. Acad. Sci EUA 78: 3824-3828; para determinar los perfiles de antigenicidad, y la téenica de Kyte-Doolittle, Kyte y colaboradores (1982) J. Mol. Biol. 157: 105-132; para las gráficas de hidropatía.

Las frases “anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", como se utilizan en la presente, se refieren a polipéptidos, incluyendo anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos biespecíficos, etc. que tienen una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica o que se derivan a partir de la misma fuente genética. Este término también incluye las preparaciones de moléculas de anticuerpos de una sola composición molecular. Una composición de anticuerpo monoclonal exhibe una sola especificidad de enlace y afinidad por un epítopo particular.

La frase “anticuerpo humano”, como se utiliza en la presente, incluye los anticuerpos que tienen regiones variables en donde tanto las regiones de estructura (FR) como la regiones determinantes de complementariedad (CDR) se derivan a partir de secuencias de origen humano. Adicionalmente, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante tambien se deriva a partir de las secuencias humanas, por ejemplo, las secuencias de la línea germinal humana, o las versiones mutadas de las secuencias de la línea germinal humana, o el anticuerpo contiene secuencias de estructura en consenso derivadas a partir del análisis de las secuencias de estructura humanas, por ejemplo, como se describe en Knappik y colaboradores (2000) J Mol Biol 296: 57-86). Las estructuras y localizaciones de los dominios variables de inmunoglobulina, por ejemplo, las regiones determinantes de complementariedad (CDRs), se pueden definir utilizando los esquemas de numeración bien conocidos, por ejemplo, el esquema de numeración de Kabat, el esquema de numeración de Chotia, o una combinación de Kabat y Chotia (véase, por ejemplo, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Ü.S. Department of Health and Human Services (Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos) (1991 ), Editores Kabat y colaboradores; Lazikani y colaboradores (1997) J. Mol. Bio. 273: 927-948); Kabat y colaboradores (1991 ) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edición, N1H Publicación No. 91 -3242 U.S. Department of Health and H uman Services (Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos); Chotia y colaboradores (1987) J.

Mol. Biol. 196: 901 -917; Chotia y colaboradores (1989) Nature 342: 877-883; y Al-Lazikan¡ y colaboradores (1997) J. Mol. Biol. 273: 927-948.

Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias humanas (por ejemplo, las mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo, o una sustitución conservadora para promover la estabilidad en la elaboración).

La frase “anticuerpo monoclonal humano", como se utiliza en la presente, se refiere a los anticuerpos que exhiben una sola especificidad de enlace, los cuales tienen regiones variables en donde tanto las regiones de estructura (FR) como la regiones determinantes de complementariedad (CDR) se derivan a partir de secuencias humanas. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales humanos son producidos por un hibridoma que incluye una célula-B obtenida a partir de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humano y un transgén de cadena ligera fusionado con una célula inmortalizada.

La frase “anticuerpo humano recombinante”, como se utiliza en la presente, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tales como los anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un ratón) que sea transgénico o transcromosómico para los genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de los mismos, los anticuerpos aislados a partir de una celula huésped transformada para expresar el anticuerpo humano, por ejemplo, a partir de un transfectoma, los anticuerpos aislados a partir de una biblioteca recombinante de anticuerpos humanos de combinación, y los anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que involuere el empalme de toda o de una porción de una secuencia genética de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN . Los anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en donde las regiones de estructura (FR) y las regiones determinantes de complementariedad (CDR) se derivan a partir de las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En ciertas modalidades, sin embargo, los anticuerpos humanos recombinantes se pueden someter a mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para las secuencias de inmunoglobulina (Ig) humana, mutagénesis somática in vivo) y, por consiguiente, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son las secuencias que, aunque se deriven a partir de, y estén relacionadas con las secuencias VH y una VL de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de anticuerpos de la línea germinal humana in vivo.

El enlace específico entre dos entidades significa un enlace con una constante en equilibrio (KA) (kact¡vada/kdesactivada) de cuando menos 102M 1, cuando menos 5x102M 1 , cuando menos 103M 1 , cuando menos 5x103M 1, cuando menos 104M 1cuando menos 5x104M \ cuando menos 105M 1, cuando menos 5x105M 1, cuando menos 106M 1, cuando menos 5x106M 1, cuando menos 107M 1, cuando menos 5x107M 1, cuando menos 10®M 1, cuando menos 5X108M 1, cuando menos 109M \ cuando menos 5x109M 1, cuando menos 101°M 1, cuando menos 5x101°M 1, cuando menos 1011M 1, cuando menos 5x1011M 1, cuando menos 1012M 1, cuando menos 5X1012M 1, cuando menos 1013M 1, cuando menos 5x1013 M 1, cuando menos 1014M 1, cuando menos 5x1014M 1, cuando menos 1015M 1, o cuando menos 5x101sM 1.

La frase “se enlaza específicamente (o selectivamente)”, se refiere a una reacción de enlace de un anticuerpo que se enlaza a HER3 y el receptor HER3 en una población heterogenea de proteínas y otros productos biológicos. En adición a la constante en equilibrio (KA) mencionada anteriormente, un anticuerpo que se enlaza a HER3 de la invención típicamente también tiene una constante de índice de disociación (KD) (kdeSact¡vada/kactivada) de menos de 5x102M, menos de 102M, menos de 5x103M, menos de 103M, menos de 5x104M, menos de 104M, menos de 5x10 sM, menos de 105M, menos de 5X106M, menos de 106M, menos de 5x107M, menos de 107M, menos de 5x10 sM, menos de 108M, menos de 5x109M, menos de 109 , menos de 5x101°M, menos de 101°M, menos de 5x1011M, menos de 1011M, menos de 5x1012M, menos de 10 a 12M, menos de 5X10 13M, menos de 1013M, menos de 5x1014M, menos de 1014M, menos de 5x1015M, o menos de 1015M o menos, y se enlaza a HER3 con una afinidad que es cuando menos dos veces mayor que su afinidad para enlazarse a un antígeno no específico (por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA)).

En una modalidad, el anticuerpo o el fragmento del mismo tiene una constante de disociación (Kd) de menos de 3,000 pM, menos de 2,500 pM, menos de 2,000 pM, menos de 1 ,500 pM, menos de 1 ,000 pM, menos de 750 pM, menos de 500 pM, menos de 250 pM, menos de 200 pM, menos de 150 pM, menos de 100 pM, menos de 75 pM , menos de 10 pM, o menos de 1 pM, como se evalúa empleando un metodo descrito en la presente o conocido por un experto en la materia (por ejemplo, un ensayo BIAcore, ELISA, FACS, SET) (Biacore International AB, Uppsala, Suecia).

El término “Kasoc" o "Ka”, como se utiliza en la presente, se refiere al índice de asociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno, mientras que el término “Kdis" o "Kd", como se utiliza en la presente, se refiere al índice de disociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno. El término “KD”, como se utiliza en la presente, se refiere a la constante de disociación, la cual se obtiene a partir de la proporción de Kd a Ka (es decir, Kd/Ka), y se expresa como una concentración molar (M). Los valores KD para los anticuerpos se pueden determinar empleando los métodos bien establecidos en la materia. Un método para determinar la KD de un anticuerpo es utilizando resonancia de plasmón superficial, o utilizando un sistema biosensor, tal como un sistema Biacore®.

El término “afinidad", como se utiliza en la presente, se refiere a la fuerza de interacción entre el anticuerpo y el antígeno en los sitios antigenicos individuales. Dentro de cada sitio antigénico, la región variable del “brazo" del anticuerpo interactúa a través de fuerzas no covalentes débiles con antígeno en numerosos sitios; mientras más interacciones haya, más fuerte será la afinidad.

El término “avidez", como se utiliza en la presente, se refiere a una medida informativa de la estabilidad o fuerza global del complejo de anticuerpo-antígeno. Se controla mediante tres factores principales: afinidad de anticuerpo-epítopo; la valencia tanto del antígeno como del anticuerpo; y la configuración estructural de las partes que interactúan. Por último estos factores definen la especificidad del anticuerpo, es decir, la probabilidad de que el anticuerpo particular se enlace a un epítopo de antígeno preciso.

El término “valencia", como se utiliza en la presente, se refiere al número de sitios de enlace objetivo potenciales en un polipéptido. Cada sitio de enlace objetivo se enlaza específicamente a una molécula objetivo o a un sitio específico (es decir, a un epítopo) sobre una molécula objetivo. Cuando un polipéptido comprende más de un sitio de enlace objetivo, cada sitio de enlace objetivo se puede enlazar específicamente a las mismas o a diferentes moléculas (por ejemplo, se puede enlazar a diferentes moléculas, por ejemplo, a diferentes antígenos, o a diferentes epítopos sobre la misma molécula).

La frase “anticuerpo inhibidor", como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo que se enlaza con HER3 e inhibe la actividad biológica de la señalización de H ER3, por ejemplo, reduce, disminuye y/o inhibe la actividad de señalización inducida por HER3, por ejemplo, en un ensayo de fosfo-HER3 ó fosfo-Akt. Los ejemplos de los ensayos se describen con más detalles en los Ejemplos que se encuentran más adelante. De conformidad con lo anterior, se entenderá que un anticuerpo que “inhibe” una o más de estas propiedades funcionales de HER3 (por ejemplo, actividades bioquímicas, inmunoquímicas, celulares, fisiológicas, u otras actividades biológicas, o similares), como se determine de acuerdo con las metodologías conocidas en este campo y descritas en la presente, se relaciona con una disminución estadísticamente significativa en la actividad particular en relación con la que se ve en ausencia del anticuerpo (por ejemplo, o cuando está presente un anticuerpo de control de una especificidad irrelevante). Un anticuerpo que inhibe la actividad de HER3 efectúa dicha disminución estadísticamente significativa por cuando menos el 10 por ciento del parámetro medido, por cuando menos el 50 por ciento, el 80 por ciento o el 90 por ciento, y en ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención pueden inhibir más del 95 por ciento, del 98 por ciento o del 99 por ciento de la actividad funcional de HER3, como sea evidenciado por una reducción en el nivel de fosforilación celular de HER3.

La frase “anticuerpo aislado” se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tengan diferentes especificidades antigenicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente a HER3 está sustancialmente libre de anticuerpos que se enlacen específicamente con antígenos diferentes de HER3). Un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente a HER3, sin embargo, puede tener reactividad cruzada con otros antígenos. Más aún, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otros materiales celulares y/o productos químicos.

La frase “variante conservadoramente modificada’’ se aplica a las secuencias tanto de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes conservadoramente modificadas se refieren a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o en donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, hasta secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Por consiguiente, en toda posición en donde una alanina sea especificada por un codón, el codón se puede alterar hasta cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Estas variaciones de ácidos nucleicos son “variaciones silenciosas", las cuales son una especie de variaciones conservadoramente modificadas. Toda secuencia de ácido nucleico en la presente que codifique un polipéptido, también describe toda posible variación silenciosa del ácido nucleico. Una persona experta reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG , el cual es ordinariamente el único codón para metionina, y TGG , el cual es ordinariamente el único codón para triptófano) se puede modificar para proporcionar una molécula funcionalmente idéntica. De conformidad con lo anterior, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifique un polipéptido es implícita en cada secuencia descrita.

Para las secuencias de polipéptidos, las “variantes conservadoramente modificadas” incluyen las sustituciones, supresiones o adiciones individuales a una secuencia de polipéptido lo cual da como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan los aminoácidos funcionalmente similares, son bien conocidas en este campo. Las variantes conservadoramente modificadas son en adición a, y no excluyen, las variantes polimórficas, los homólogos inter-especies, y los alelos de la invención. Los siguientes ocho grupos contienen los aminoácidos que son sustituciones conservadoras unos por otros: 1 ) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)). En algunas modalidades, el término "modificaciones conservadoras de secuencias" se utilizan para referirse a las modificaciones de aminoácidos que no afecten o alteren significativamente las características de enlace del anticuerpo que contenga la secuencia de aminoácidos.

Los terminos “compite cruzadamente” y “competición cruzada", se utilizan indistintamente en la presente para significar la capacidad de un anticuerpo o de un fragmento del mismo para interferir con el enlace de otros anticuerpos o fragmentos de los mismos al HER3 en un ensayo de enlace competitivo convencional.

La capacidad o el grado hasta el cual un anticuerpo o un fragmento del mismo es capaz de interferir con el enlace de otro anticuerpo o fragmento del mismo al HER3 y, por consiguiente, si se puede decir que compite cruzadamente de acuerdo con la invención, se puede determinar utilizando ensayos de enlace competitivo convencionales. Un ensayo adecuado involucra el uso de la teenología Biacore (por ejemplo, utilizando el instrumento BIAcore 3000 (Biacore, Uppsala, Suecia)), el cual puede medir el grado de interacciones utilizando la tecnología de resonancia de plasmón superficial. Otro ensayo para medir la competición cruzada utiliza un planteamiento basado en ELISA.

El término “optimizada", como se utiliza en la presente, se refiere a una secuencia de nucleótidos que se ha alterado para codificar una secuencia de aminoácidos utilizando los codones que son preferidos en la célula u organismo productor, en términos generales una célula eucariótica, por ejemplo, una célula de Pichia , una célula de Trichoderma, una célula de ovario de hámster chino (CHO), o una célula humana. La secuencia de nucleótidos optimizada se diseña para conservar completamente, o tanto como sea posible, la secuencia de aminoácidos originalmente codificada por la secuencia de nucleótidos inicial, la cual también se conoce como la secuencia "progenitora".

Los ensayos convencionales para evaluar la capacidad de enlace de los anticuerpos hacia la HER3 de diferentes especies son conocidos en la materia, incluyendo, por ejemplo, ELISAs, Western blots, y RIAs. Los ensayos adecuados se describen con detalle en los Ejemplos. La cinética de enlace (por ejemplo, la afinidad de enlace) de los anticuerpos también se puede evaluar mediante los ensayos convencionales conocidos en la materia, tales como mediante el análisis Biacore o la afinidad relativa de FACS (Scatchard). Los ensayos para evaluar los efectos de los anticuerpos sobre las propiedades funcionales de HER3 (por ejemplo, ensayos de enlace al receptor o modulación de la senda de señalización de HER3) se describen con mayor detalle en los Ejemplos.

Las frases “por ciento idénticas" o "porcentaje de identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Dos secuencias son "sustancialmente idénticas" si dos secuencias tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, 60 por ciento de identidad, opcionalmente 65 por ciento, 70 por ciento, 75 por ciento, 80 por ciento, 85 por ciento, 90 por ciento, 95 por ciento, o 99 por ciento de identidad sobre una región especificada, o, cuando no se especifica, sobre la secuencia entera), cuando se comparan y se alinean para una máxima correspondencia sobre una ventana de comparación, o una región designada como se mide utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias, o mediante alineación manual e inspección visual. Opcionalmente, la identidad existe sobre una región que es de cuando menos aproximadamente 50 nucleótidos (o 10 aminoácidos) de longitud, o más preferiblemente sobre una región que es de 100 a 500 ó 1000 o más nucleótidos (o 20, 50, 200 o más aminoácidos) de longitud.

Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de prueba y de referencia en una computadora, se designan las coordenadas de la subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmos de secuencias. Se pueden utilizar los parámetros del programa por omisión, o se pueden designar parámetros alternativos. Entonces el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencias para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una “ventana de comparación”, como se utiliza en la presente, incluye la referencia a un segmento de cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas a partir del grupo que consiste en 20 a 600, usualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más usualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en donde una secuencia se puede comparar con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas despues de que las dos secuencias se alinean de una manera óptima. Los métodos de alineación de las secuencias para comparación son bien conocidos en la materia. La alineación óptima de las secuencias para comparación se puede conducir, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2: 482c, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, mediante el método de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman, (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. EUA 85: 2444, mediante las ¡mplementacíones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, Wl), o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Brent y colaboradores (2003) Current Protocols in Molecular Biology).

Dos ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencias y la similitud de secuencias, son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, los cuales se describen en Altschul y colaboradores (1977) Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402; y Altschul y colaboradores (1990) J . Mol. Biol. 215: 403-410, respectivamente. El software para llevar a cabo los análisis BLAST está públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo involucra primero identificar los pares de secuencias de alta puntuación (HSPs), mediante la identificación de palabras cortas de una longitud W en la secuencia pedida, las cuales concuerdan o satisfacen alguna puntuación umbral de valor positivo T cuando son alineadas con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T es referido como el umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul y colaboradores, supra). Estos impactos iniciales de la palabra vecina actúan como semillas para iniciar las búsquedas con el fin de encontrar secuencias de alta puntuación (HSPs) más largas que las contengan. Los impactos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia por tanto como se pueda incrementar la puntuación acumulativa de alineación. Las puntuaciones acumulativas se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos concordantes; siempre > 0), y N (puntuación de penalidad para los residuos que no concuerdan; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación con el fin de calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los impactos de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulativa cae fuera por la cantidad X desde su máximo valor alcanzado; la puntuación acumulativa llega hasta cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se llega al final de cualquier secuencia. Los parámetros W, T, y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por omisión una longitud de palabra (W) de 1 1 , una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por omisión una longitud de palabra de 3, y expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89: 10915), alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90: 5873-5787). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se presentaría una concordancia entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos por azar. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia, es menor de aproximadamente 0.2, más preferiblemente menor de aproximadamente 0.01 , y de una manera muy preferible menor de aproximadamente 0.001 .

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos también se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Mcyers y W. Miller ((1988) Comput. Appl. Biosci. 4: 1 1 -17), el cual se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso PAM 120, una penalidad por longitud de hueco de 12, y una penalidad de hueco de 4. En adición, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970, J. Mol. Biol. 48: 444-453), el cual se ha incorporado en el programa Gap del paquete de software GCG (disponible en www.gcg .com), utilizando ya sea una matriz Blossom 62 o bien una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ó 4, y un peso de longitud de 1 , 2, 3, 4, 5, o 6.

De otra forma que no sea el porcentaje de identidad de secuencias mencionado anteriormente, otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos son sustancialmente idénticas, es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico reacciona cruzadamente de una manera inmunológica con los anticuerpos reproducidos contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe a continuación. Por consiguiente, un polipéptido es típicamente sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren solamente por sustituciones conservadoras. Otra indicación de que las dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas, es que las dos moléculas o sus complementos se hibridan una con la otra bajo condiciones restringentes, como se describe a continuación . Todavía otra indicación de que las dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente identicas, es que se pueden utilizar los mismos cebadores para amplificar la secuencia.

La frase “ácido nucleico” se utiliza en la presente de una manera intercambiable con el término “polinucleótido”, y se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos, ya sea en una forma de una sola cadena o de doble cadena. El término abarca los ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o residuos o enlaces de la estructura base modificados, los cuales son sintéticos, se presentan naturalmente, y se presentan no naturalmente, que tienen propiedades de enlace similares a aquéllas del ácido nucleico de referencia, y que se etabolizan de una manera similar a los nucleótidos de referencia. Los ejemplos de estos análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, metil-fosfonatos, metil-fosfonatos quirales, ribonucleótidos de 2-O-metilo, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs).

A menos que se indique de otra manera, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente las variantes conservadoramente modificadas de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados), y las secuencias complementarias, así como la secuencia explícitamente indicada. De una manera específica, como se detalla más adelante, las sustituciones de codones degenerados se pueden lograr mediante la generación de secuencias en donde la tercera posición de uno o más (o todos los) codones seleccionados es sustituida con residuos de base mixta y/o de desoxi-inosina (Batzer y colaboradores (1991 ), Nucleic Acid Res. 19: 5081 ; Ohtsuka y colaboradores (1985) J. Biol. Chem . 260: 2605-2608; y Rossolini y colaboradores (1994) Mol. Cell. Probes 8: 91 -98).

La frase “operativamente enlazado” se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos de polinucleótidos (por ejemplo, ADN). Típicamente, se refiere a la relación funcional de una secuencia reguladora de transcripción con una secuencia transcrita. Por ejemplo, una secuencia promotora o potenciadora se enlaza operativamente con una secuencia de codificación si estimula o modula la transcripción de la secuencia de codificación en una célula huésped apropiada o en otro sistema de expresión. En términos generales, las secuencias reguladoras de transcripción del promotor que se enlazan operativamente con una secuencia transcrita, están físicamente contiguas a la secuencia transcrita, es decir, son de acción c/s. Sin embargo, algunas secuencias reguladoras de transcripción, tales como las potenciadoras, no necesitan estar físicamente contiguas o localizadas en cercana proximidad a las secuencias de codificación cuya transcripción potencian.

Los términos “polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a los polímeros de aminoácidos en donde uno o más residuos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido que se presente naturalmente correspondiente, así como a los polímeros de aminoácidos que se presentan naturalmente y a los polímeros de aminoácidos que no se presentan naturalmente. A menos que se indique de otra manera, una secuencia de polipéptido particular también abarca implícitamente las variantes conservadoramente modificadas de la misma.

El término “sujeto”, como se utiliza en la presente, incluye los animales humanos y no humanos. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mam íferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, reses, pollos, anfibios, y reptiles. Excepto cuando se observe, los términos “paciente" o "sujeto” se utilizan en la presente indistintamente.

El término “agente contra el cáncer”, como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier agente que se pueda utilizar para tratar un trastorno proliferativo celular, tal como cáncer, incluyendo agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, agentes de radioterapia y radioterapéuticos, agentes dirigidos contra los cánceres, y agentes inmunoterapéuticos.

El término “tumor”, como se utiliza en la presente, se refiere al crecimiento y proliferación de células neoplásicas, ya sea malignas o benignas, y a todas las células y tejidos pre-cancerosos y cancerosos.

El término “actividad anti-tumoral”, como se utiliza en la presente, se refiere a una reducción en el índice de proliferación, viabilidad, o actividad metastásica de las células tumorales. Una posible forma de mostrar la actividad anti-tumoral es cuando se muestra una declinación en el índice de crecimiento de las celulas anormales, que se presenta durante la terapia, o la estabilidad o reducción del tamaño del tumor. Esta actividad se puede evaluar utilizando los modelos de tumores in vitro o ¡n vivo aceptados, incluyendo, pero no limitándose a, los modelos de xenomjerto, los modelos MMTV, y otros modelos conocidos en el campo para investigar la actividad anti-tumoral.

El término “malignidad", como se utiliza en la presente, se refiere a un tumor no benigno o a un cáncer.

El término “cáncer”, como se utiliza en la presente, se refiere a una malignidad caracterizada por un crecimiento celular mal regulado o incontrolado. Los cánceres de ejemplo incluyen: carcinomas, sarcomas, leucemias, y linfomas. El término “cáncer” incluye los tumores malignos primarios (por ejemplo, aquéllos cuyas células no han migrado hacia los sitios del cuerpo del sujeto diferentes del sitio del tumor original), y tumores malignos secundarios (por ejemplo, aquéllos que se presentan a partir de metástasis, la migración de las células tumorales hacia sitios secundarios que son diferentes del sitio del tumor original).

Diferentes aspectos de la invención se describen con mayor detalle en las siguientes secciones y subsecciones.

Estructura y Mecanismo de Activación de los Receptores HER Los cuatro receptores HER tienen un dominio de enlace a ligando extracelular, un único dominio transmembrana, y un dominio que contiene cinasa de tirosina citoplásmica. El dominio de cinasa de tirosina intracelular de los receptores H ER está altamente conservado, aunque el dominio de cinasa de HER3 contiene sustituciones de aminoácidos críticos y, por consiguiente, carece de actividad de cinasa (Guy y colaboradores (1994): PNAS 91 , 8132-8136). La dimerización de los receptores HER inducida por el ligando induce la activación de la cinasa, la transfosforilación del receptor sobre los residuos de tirosina en la cola C-terminal, seguida por el reclutamiento y la activación de los efectores de señalización intracelulares (Yarden y Sliwkowski, (2001 ) Nature Rev 2, 127-137; Jorissen y colaboradores (2003) Exp Cell Res 284, 31 -53.

Las estructuras de cristal de los dominios extracelulares de los HERs han proporcionado alguna perspectiva del proceso de activación del receptor inducida por el ligando (Schlessinger, (2002) Cell 1 10, 669-672). El dominio extracelular de cada receptor HER consiste en cuatro subdominios: Los subdominios I y III cooperan en la formación del sitio de enlace al ligando, mientras que el subdominio I I (y tal vez tambien el subdominio IV) participa en la dimerización del receptor por medio de interacciones directas de receptor-receptor. En las estructuras del H ER1 enlazado al ligando, una horquilla-b (denominada como el ciclo de dimerización) en el subdominio II interactúa con el ciclo de dimerización del receptor compañero, mediando la dimerización del receptor (Garrett y colaboradores (2002) Cell 1 10, 763-773; Ogiso y colaboradores (2002) Cell 1 10, 775-787). En contraste, en las estructuras de los HER1 , HER3 y HER4 inactivos, el ciclo de dimerización se ocupa de las interacciones intramoleculares con el subdominio IV, el cual impide la dimerización del receptor en ausencia del ligando (Cho y Leahy, (2002) Science 297, 1330-1333; Ferguson y colaboradores (2003) Mol Cell 12, 541 -552; Bouyan y colaboradores (2005) PNAS102, 15024-15029). La estructura de HER2 es única entre los HERs. En ausencia de un ligando, HER2 tiene una conformación que se parece al estado activado por el ligando de HER1 con un ciclo de dimerización protuberante, disponible para interactuar con otros receptores HER (Cho y colaboradores (2003) Nature 421 , 756-760; Garrett y colaboradores (2003) Mol Cell 1 1 , 495-505). Esto puede explicar la mejor capacidad de heterodimerización del HER2.

Aunque las estructuras de cristal del receptor HER proporcionan un modelo para la homo- y hetero-dimerización del receptor HER, el fondo para la prevalencia de algunos homo- y hetero-dímeros de HER sobre otros (Franklin y colaboradores (2004) Cáncer Cell 5, 317-328), así como la función conformacional de cada dominio en la dimerización y auto-inhibición del receptor (Burgess y colaboradores (2003) Mol Cell 12, 541 -552; Mattoon y colaboradores (2004) PNAS 101 , 923-928) sigue siendo poco claro. Como se describe a continuación, la estructura del cristal de rayos-X de HER3 proporciona más perspectivas.

Estructura de HER3 y Epítopos Anteriormente se ha descrito un epítopo conformacional al que se enlazan los anticuerpos anti-HER3, en la Publicación Internacional del TCP Número PCT/EP201 1 /064407 y en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamerica con Número de Serie 61 /375,408, ambas presentadas el 22 de agosto de 201 1 , y las cuales se incorporan a la presente como referencia en su totalidad. La estructura tridimensional de una forma truncada de HER3 que forma un complejo con un fragmento de anticuerpo de HER3, mostró el epítopo conformacional que comprendía el dominio 2 y el dominio 4 de HER3.

La presente invención proporciona una clase adicional de anticuerpos o fragmentos de los mismos que se enlazan a un epítopo lineal, no lineal, o conformacional dentro del dominio 2 de HER3. Estos anticuerpos o fragmentos de los mismos interactúan con HER3, para inhibir la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando.

Con el fin de examinar la estructura del cristal de los anticuerpos del dominio 2 o de los fragmentos de los mismos enlazados al HER3, se pueden preparar cristales de HER3 mediante la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifique HER3 o una variante del mismo en una célula huésped adecuada, y entonces se cristalizan las proteínas purificadas, en la presencia del Fab dirigido por el HER3 relevante. De preferencia, el polipéptido de HER3 contiene el dominio extracelular (aminoácidos 20 a 640 del polipéptido humano (SEQ ID NO: 1 ) o de una versión truncada del mismo, que comprende de preferencia los aminoácidos 20-640) pero que carece de los dominios transmembrana e intracelulares.

Los polipeptidos de HER3 también se pueden producir como proteínas de fusión, por ejemplo, para ayudar en la extracción y purificación. Los ejemplos de los componentes de la proteína de fusión incluyen glutationa-S-transferasa (GST), histidina (HIS), hexahistidina (6HIS), GAL4 (dominios de enlace de ADN y/o de activación de transcripción), y beta-galactosidasa. También puede ser conveniente incluir un sitio de disociación proteolítica entre el componente de la proteína de fusión y la secuencia de la proteína de interés para permitir la remoción de las secuencias de proteínas de fusión.

Después de la expresión, las proteínas se pueden purificar y/o concentrar, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad de metal inmovilizado, cromatografía de intercam bio de iones, y/o filtración de gel.

Las proteínas se pueden cristalizar utilizando las téenicas descritas en la presente. Comúnmente, en un proceso de cristalización, una gota que contenga la solución de proteína se mezcla con el regulador de cristalización, y se deja equilibrarse en un recipiente sellado. La equilibración se puede lograr mediante las técnicas conocidas, tales como el método de “gota colgante” o de “gota asentada”. En estos métodos, la gota se cuelga por arriba o se asienta a un lado de un depósito mucho más grande de regulador de cristalización, y se alcanza el equilibrio a través de la difusión de vapor. De una manera alternativa, la equilibración se puede presentar mediante otros métodos, por ejemplo, bajo aceite, a través de una membrana semi-permeable, o mediante difusión sin interfase (véase, por ejem plo, Chayen y colaboradores (2008) Nature Methods 5, 147 -153).

Una vez que se han obtenido los cristales, la estructura se puede resolver mediante las téenicas de difracción de rayos-X conocidas. Muchas técnicas utilizan cristales químicamente modificados, tales como aquéllos modificados mediante derivación de átomo pesado hasta las fases aproximadas. En la práctica, un cristal se remoja en una solución que contiene sales de átomo de metal pesado, o compuestos organometálicos, por ejemplo, cloruro de plomo, tiomalato de oro, timerosal, o acetato de uranilo, que pueden difundirse a través del cristal y se enlazan a la superficie de la proteína. Las localizaciones de los átomos de metal pesado enlazados se pueden determinar entonces mediante el análisis de difracción de rayos-X del cristal remojado. Los patrones obtenidos en la difracción de un haz monocromático de rayos-X mediante los átomos (centros de dispersión) del cristal se pueden resolver mediante ecuaciones matemáticas para dar las coordenadas matemáticas. Los datos de difracción se utilizan para calcular un mapa de densidad de electrones de la unidad de repetición del cristal. Otro método para obtener la información de fases es empleando una técnica conocida como reemplazo molecular. En este método, se aplican algoritmos de rotación y traslación a un modelo de búsqueda derivado a partir de una estructura relacionada, lo cual da como resultado una orientación aproximada para la proteína de interés (véase Rossmann, (1990) Acta Crystals A 46, 73-82). Los mapas de densidad de electrones se utilizan para establecer las posiciones de los átomos individuales dentro de la celda unitaria del cristal (Blundel y colaboradores (1976) Protein Crystallography, Academic Press).

Los límites del dominio aproximados del dominio extracelular de HER3 son como sigue; dominio 1 : aminoácidos 20-207; dominio 2: aminoácidos 208-328; dominio 3: aminoácidos 329-498; y dominio 4: aminoácidos 499-642. La estructura tridimensional de HER3 y el anticuerpo permite la identificación de los sitios de enlace objetivo para los moduladores potenciales de HER3. Los sitios de enlace objetivo preferidos son aquéllos involucrados en la activación de HER3. En una modalidad, el sitio de enlace objetivo se localiza dentro del dominio 3 de HER3. Por consiguiente, un anticuerpo o un fragmento del mismo que se enlaza al dominio 3, por ejemplo, puede modular la activación de HER3 medíante la modificación de la posición relativa del dominio en relación consigo mismo o con otros dominios de HER3. Por consiguiente, el enlace de un anticuerpo o de un fragmento del mismo a los residuos de aminoácidos dentro del dominio 3 puede provocar que la proteína adopte una configuración que impida la activación o que impida la dimerización con los componentes dimerizantes (por ejemplo, H ER2).

En algunas modalidades, el anticuerpo o un fragmento del mismo reconocen un estado conformacional específico de HER3, de tal manera que el anticuerpo o un fragmento del mismo impide que HER3 interactúe con un co-receptor (incluyendo, pero no limitándose a, HER1 , HER2 y HER4). En algunas modalidades, el anticuerpo o un fragmento del mismo impide que HER3 interactúe con un co-receptor mediante la estabilización del receptor HER3 en un estado inactivo o cerrado. En algunas modalidades, el anticuerpo o un fragmento del mismo puede estabilizar el receptor HER3 mediante el enlace con residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 de HER3. En algunas modalidades, el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlaza a la proteína del HER3 humano que tiene un epítopo que comprende los residuos de aminoácidos de HER3 dentro del dominio 2 (aminoácidos 208-328 de la SEQ ID NO: 1 ), o un subconjunto de los mismos. En algunas modalidades, el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlaza a los aminoácidos dentro de, o traslapados con, el residuo de aminoácido dentro del dominio 2 (aminoácidos 208-328 de la SEQ ID NO: 1 ). El anticuerpo o un fragmento del mismo descrito en la presente puede enlazarse a Lys 268 dentro del dominio 2 de HER3. En algunas modalidades, el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlaza a un epítopo lineal dentro del dominio 2 de HER3. En algunas modalidades, el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlaza a un epítopo no lineal dentro del dominio 2 de HER3. En algunas modalidades, el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlaza a un epítopo conformacional dentro del dominio 2 de HER3.

En algunas modalidades, el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlaza al epítopo en el dominio 2 de HER3, de tal manera que no está disponible el ciclo de dimerización dentro del dominio 2 de HER3 para la dimerización con un co-receptor. El fracaso para formar homo- o hetero-dímeros da como resultado el fracaso para activar la transducción de señales.

En algunas modalidades, el anticuerpo o un fragmento del mismo se puede enlazar a un epítopo en el dominio 2 ya sea en el estado activo o inactivo de HER3.

En algunas modalidades, el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlaza a un epítopo en el dominio 2 del receptor HER3, en donde el enlace del anticuerpo o de un fragmento del mismo al receptor HER3 permite la dimerización con un co-receptor para formar un complejo inactivo de receptor-receptor. La formación del complejo inactivo de receptor-receptor impide la activación de la transducción de señales independiente del ligando. Por ejemplo, en la transducción de señales independiente del ligando, HER3 puede existir en un estado inactivo; sin embargo la sobre-expresión de HER2 provoca la formación del complejo de HER2-HER3; sin embargo estos complejos resultantes son inactivos e impiden la activación de la transducción de señales independiente del ligando.

En algunas modalidades, los dominios/regiones que contengan residuos que estén en contacto con, o que sean enterrados por, un anticuerpo, se pueden identificar mediante la mutación de residuos específicos en HER3 (por ejemplo, un antígeno de tipo silvestre), y mediante la determinación de si el anticuerpo o el fragmento del mismo puede enlazarse a la proteína mutada o variante de HER3, o mediante la medición de los cambios de afinidad desde el tipo silvestre. Haciendo un número de mutaciones individuales, se pueden identificar los residuos que tengan una función directa en el enlace, o que esten en una proximidad suficientemente cercana al anticuerpo, de tal manera que una m utación pueda afectar el enlace entre el anticuerpo y el antígeno. A partir de un conocimiento de estos aminoácidos, se pueden elucidar los dominios o las regiones del antígeno (HER3) que contengan residuos en contacto con el anticuerpo, o que estén cubiertos por el anticuerpo. La mutagénesis empleando las téenicas conocidas, tales como la exploración de alanina, puede ayudar a definir los epítopos funcionalmente relevantes. También se puede emplear la mutagénesis utilizando un protocolo de exploración de arginina/ácido glutámico (véase, por ejemplo, Nanevicz y colaboradores (1995), J. Biol. Chem. 270(37): 21619-21625 y Zupnick y colaboradores (2006), J . Biol. Chem . 281 (29): 20464-20473). En general, se utilizan arginina y ácidos glutámicos para sustituir (típicamente de una manera individual) un aminoácido en el polipéptido de tipo silvestre, debido a que estos aminoácidos están cargados y son voluminosos y, por consiguiente, tienen el potencial para interrumpir el enlace entre una proteína de enlace al antígeno y un antígeno en la región del antígeno en donde se introduce la mutación. Las argininas que existen en el antígeno de tipo silvestre son reemplazadas con ácido glutámico. Se puede obtener una variedad de estos mutantes individuales, y se pueden analizar los resultados de enlace recolectados, para determinar cuáles residuos afectan el enlace. Se puede crear una serie de antígenos de HER3 mutantes, teniendo cada antígeno mutante una sola mutación. El enlace de cada antígeno de HER3 mutante con diferentes anticuerpos o fragmentos de los mismos de HER3, se puede medir y comparar con la capacidad de del anticuerpo seleccionado o de los fragmentos del mismo para enlazarse con el HER3 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1 ). Los ejemplos de estos mutantes se muestran más adelante en la sección de Ejemplos, por ejemplo, el mutante de Ais Lys 268.

Una alteración (por ejemplo, una reducción o un aumento) en el enlace entre un anticuerpo o un fragmento del mismo y un HER3 mutante o variante, como se utiliza en la presente, significa que hay un cambio en la afinidad de enlace (por ejemplo, como se mide mediante los metodos conocidos, tales como la prueba Biacore, o el ensayo basado en gránulos descrito más adelante en los Ejemplos), en la EC50, y/o un cambio (por ejemplo, una reducción) en la capacidad de enlace total de la proteína de enlace al antígeno (por ejemplo, como es evidenciado por una disminución en Bmax en una gráfica de concentración de la proteína de enlace al antígeno contra la concentración del antígeno). Una alteración significativa en el enlace indica que el residuo mutado está involucrado en el enlace al anticuerpo o al fragmento del mismo.

En algunas modalidades, una reducción significativa en el enlace significa que la afinidad de enlace, la EC50, y/o la capacidad entre un anticuerpo o los fragmentos del mismo y un antígeno de HER3 mutante, se reduce por más del 10 por ciento, por más del 20 por ciento, por más del 40 por ciento, por más del 50 por ciento, por más del 55 por ciento, por más del 60 por ciento, por más del 65 por ciento, por más del 70 por ciento, por más del 75 por ciento, por más del 80 por ciento, por más del 85 por ciento, por más del 90 por ciento o por más del 95 por ciento en relación con el enlace entre el anticuerpo o un fragmento del mismo y un HER3 de tipo silvestre (por ejemplo, SEQ I D NO: 1 ).

En algunas modalidades, el enlace de un anticuerpo o fragmentos del mismo se reduce o se incrementa significativamente para una proteína mutante de HER3 que tenga una o más (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) mutaciones, comparándose con una proteína de tipo silvestre de HER3 (por ejemplo, SEQ I D NO: 1 ).

Aunque las formas variantes son referenciadas con respecto a la secuencia de tipo silvestre mostrada en la SEQ ID NO: 1 , se apreciará que en las variantes alelicas o de empalme de HER3 los aminoácidos podrían ser diferentes. También se contemplan los anticuerpos o fragmentos de los mismos que muestren un enlace significativamente alterado (por ejemplo, un enlace más bajo o más alto) para esas formas alélicas de HER3.

En adición a los aspectos estructurales generales de los anticuerpos, se puede examinar la interacción más específica entre el parátopo y el epítopo a través de planteamientos estructurales. En una modalidad, la estructura de las regiones determinantes de complementariedad contribuye a un parátopo, a través del cual un anticuerpo es capaz de enlazarse a un epítopo. La forma de este parátopo se puede determinar en un número de formas. Se pueden emplear planteamientos tradicionales de examinación estructural, tales como RM N o cristalografía de rayos-X. Estos planteamientos pueden examinar la forma del parátopo solo, o mientras se enlaza al epítopo. De una manera alternativa, se pueden generar modelos moleculares in silico. Se puede generar una estructura a través de la modelación de homología, auxiliada con un paquete comercial, tal como el paquete de modelación Insightll de Accelrys (San Diego, Calif. ) . Dicho de una manera breve, se puede utilizar la secuencia del anticuerpo que se vaya a examinar, para hacer una búsqueda contra una base de datos de las proteínas de estructuras conocidas, tales como el Banco de Datos de Proteínas. Después de identificar las proteínas homólogas con estructuras conocidas, se utilizan estas proteínas homólogas como las plantillas de la modelación. Cada una de las posibles plantillas se puede alinear, por consiguiente, produciendo alineaciones de secuencias basadas en la estructura entre las plantillas. La secuencia del anticuerpo con la estructura desconocida se puede alinear entonces con estas plantillas para generar un modelo molecular para el anticuerpo con la estructura desconocida. Como será apreciado por un experto en la materia, existen muchos métodos alternativos para generar estas estructuras in silico, cualquiera de los cuales se puede utilizar. Por ejemplo, se puede emplear un proceso similar al descrito en Hardman y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Expedida Número 5,958,708 que emplea QUANTA (Poligen Corp. , Waltham, Mass.), y CHARM (Brooks y colaboradores (1983), J. Comp. Chem . 4: 187) (incorporados a la presente en su totalidad como referencia).

No solamente la forma del parátopo es importante en la determinación de si y qué tan bien se enlazará un posible parátopo a un epítopo, pero la interacción misma entre el epítopo y el parátopo es una fuente de gran información en el diseño de los anticuerpos variantes. Como es apreciado por un experto en la materia, existe una variedad de formas en las que se puede estudiar esta interacción . Una manera es utilizar el modelo estructural generado, tal vez como se describe anteriormente, y entonces utilizar un programa, tal como Insightll (Accelrys, San Diego, Calif.), el cual tiene un módulo de atraque, el cual, entre otras cosas, es capaz de llevar a cabo una búsqueda Monte Cario sobre los espacios conformacionales y de orientación entre el parátopo y su epítopo. El resultado es que se puede estimar en dónde y la manera en que el epítopo interactúa con el parátopo. En una modalidad , solamente se utiliza un fragmento o una variante del epítopo para asistir en la determinación de las interacciones relevantes. En una modalidad, se utiliza el epítopo entero en la modelación de la interacción entre el parátopo y el epítopo.

A través del uso de estas estructuras modeladas, se puede predecir cuáles residuos son los más importantes en la interacción entre el epítopo y el parátopo. Por consiguiente, en una modalidad, se puede seleccionar fácilmente cuáles residuos cambiar con el objeto de alterar las características de enlace del anticuerpo. Por ejemplo, puede ser evidente, a partir de los modelos de atraque, que las cadenas laterales de ciertos residuos en el parátopo pueden impedir estéricamente el enlace del epítopo, y por consiguiente, puede ser benéfico alterar estos residuos hasta tener residuos con cadenas laterales más pequeñas. Se puede determinar esto de muchas formas. Por ejemplo, se puede simplemente mirar los dos modelos y estimar las interacciones basándose en los grupos funcionales y en la proximidad. De una manera alternativa, se pueden llevar a cabo emparejamientos repetidos de epítopo y parátopo, como se describe anteriormente, con el objeto de obtener interacciones de energía más favorables. También se pueden determinar estas interacciones para una variedad de variantes del anticuerpo con el fin de determinar formas alternativas en donde el anticuerpo se pueda enlazar al epítopo. También se pueden combinar los diferentes modelos para determinar la manera en que se debería alterar la estructura de los anticuerpos con el objeto de obtener un anticuerpo con las características particulares que se deseen.

Los modelos determinados anteriormente se pueden probar a través de diferentes téenicas. Por ejemplo, la energía de interacción se puede determinar con los programas discutidos anteriormente con el objeto de determinar cuáles de las variantes se examinará adicionalmente. También, se utilizan las interacciones coulúmbicas y de van der Waals para determinar las energías de interacción del epítopo y los parátopos variantes. También se utiliza la mutagénesis dirigida al sitio para ver si los cambios predichos en la estructura del anticuerpo realmente dan como resultado los cambios deseados en las características de enlace. De una manera alternativa, se pueden hacer cambios al epítopo con el fin de verificar que los modelos son correctos o para determinar los temas generales de enlace que puedan presentarse entre el parátopo y el epítopo.

Como será apreciado por un experto en la materia, aunque estos modelos proporcionarán la guía necesaria para hacer los anticuerpos y las variantes de los mismos de las presentes modalidades, todavía puede ser deseable llevar a cabo las pruebas de rutina de los modelos in silico , tal vez a través de estudios in vitro. En adición, como será evidente para un experto en la materia, cualquier modificación también puede tener efectos secundarios adicionales sobre la actividad del anticuerpo. Por ejemplo, aunque cualquier alteración predicha por dar como resultado un mayor enlace, puede inducir un mayor enlace, también puede provocar otros cambios estructurales que podrían reducir o alterar la actividad del anticuerpo. La determinación de si éste es el caso o no, es rutinaria en la materia y se puede lograr de muchas maneras. Por ejemplo, la actividad se puede probar a través de una prueba ELISA. De una manera alternativa, las muestras se pueden probar a través del uso de un aparato de resonancia de plasmón superficial.

Anticuerpos de HER3 La presente invención proporciona anticuerpos que reconocen un epítopo dentro del dominio 2 de HER3. La invención se basa en el hallazgo sorprendente de que una clase de anticuerpos contra HER3, bloquean las sendas de transducción de señales de HER3 tanto dependiente del ligando como independiente del ligando en la Tabla 1 se da a conocer una clase de anticuerpos que se enlazan a un epítopo dentro del dominio 2 de HER3. En una modalidad, los anticuerpos inhiben la señalización de HER3 tanto dependiente del ligando como independiente del ligando. En otra modalidad, los anticuerpos se enlazan a HER3 y no bloquean el enlace del ligando de HER al sitio de enlace de ligando (es decir, tanto el ligando como el anticuerpo pueden enlazarse a HER3 de una manera concurrente).

Tabla 1 Ejemplos de anticuerpos de HER3 que se enlazan a un dominio 2 de HER3 La presente invención proporciona anticuerpos que se enlazan específicamente con una proteína de HER3 (por ejemplo, HER3 humano y/o de cinomolgo), comprendiendo los anticuerpos un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 14, 34, 54, 74, 94, 1 14, 134, 154, 174, 194, 214, 234, 254, 274, 294, 314, 334, 354, 374, 394, 414, 434, 454, 474, 494, 514, y 524.

La presente invención proporciona anticuerpos que se enlazan específicamente con una proteína de HER3 (por ejemplo, HER3 humano y/o de cinomolgo), comprendiendo los anticuerpos un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 15, 35, 55, 75, 95, 1 15, 135, 155, 175, 195, 215, 235, 255, 275, 295, 315, 335, 355, 375, 395, 415, 435, 455, 475, 495, 515, y 535.

La presente invención tambien proporciona anticuerpos que se enlazan específicamente con una proteína de HER3 (por ejemplo, HER3 humano y/o de cinomolgo), comprendiendo estos anticuerpos una CDR VH que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las CDRs VH enlistadas en la Tabla 1. En particular, la invención proporciona anticuerpos que se enlazan específicamente con una proteína de HER3 (por ejemplo, HER3 humano y/o de cinomolgo), comprendiendo estos anticuerpos (o de una manera alternativa, consistiendo en) uno, dos, tres, cuatro, cinco o más CDRs VH que tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las CDRs VH enlistadas en la Tabla 1.

Otros anticuerpos de la invención incluyen aminoácidos que se han mutado, y no obstante, tienen cuando menos el 50 por ciento, 60 por ciento, 70 por ciento, 80 por ciento, 90 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento o 99 por ciento de identidad en las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) con las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) ilustradas en las secuencias descritas en la Tabla 1 . En algunas modalidades, incluye secuencias de aminoácidos mutantes en donde no más de 1 , 2, 3, 4 o 5 aminoácidos se han mutado en las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) cuando se comparan con las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) ilustradas en la secuencia descrita en la Tabla 1 , mientras que todavía mantienen su especificidad para el epítopo del anticuerpo original Otros anticuerpos de la invención incluyen aminoácidos que se han mutado, y no obstante, tienen cuando menos el 50 por ciento, 60 por ciento, 70 por ciento, 80 por ciento, 90 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento o 99 por ciento de identidad en las regiones de estructura con las regiones de estructura ilustradas en las secuencias descritas en la Tabla 1. En algunas modalidades, incluye secuencias de aminoácidos mutantes en donde no más de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, o 7 aminoácidos se han mutado en las regiones de estructura cuando se comparan con las regiones de estructura ilustradas en la secuencia descrita en la Tabla 1 , mientras que todavía mantienen su especificidad para el epítopo del anticuerpo original. La presente invención también proporciona secuencias de ácidos nucleicos que codifican VH , VL, la cadena pesada de longitud completa, y la cadena ligera de longitud completa de los anticuerpos que se enlazan específicamente con una proteína de HER3 (por ejemplo, HER3 humano y/o de cinomolgo).

Otros anticuerpos de la invención incluyen aquéllos en donde los aminoácidos o ácidos nucleicos que codifican los aminoácidos se han mutado, y no obstante, tienen cuando menos el 50 por ciento, 60 por ciento, 70 por ciento, 80 por ciento, 90 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento o 99 por ciento de identidad con las secuencias descritas en la Tabla 1. En algunas modalidades, incluyen las secuencias de aminoácidos mutantes en donde no más de 1 , 2, 3, 4 o 5 aminoácidos se han mutado en las regiones variables cuando se comparan con las regiones variables ilustradas en la secuencia descrita en la Tabla 1 , mientras que conservan sustancialmente la misma actividad terapéutica.

Debido a que cada uno de estos anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden enlazarse a HER3, las secuencias VH, VL, de cadena ligera de longitud completa, y de cadena pesada de longitud completa (las secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos) se pueden "mezclar y emparejar" para crear otros anticuerpos de HER3 de la invención. Estos anticuerpos "mezclados y emparejados" de HER3 se pueden probar utilizando los ensayos de enlace conocidos en la materia (por ejemplo, ELISAs, y otros ensayos descritos en la sección de Ejemplos). Cuando estas cadenas se mezclan y se emparejan, una secuencia VH a partir de un emparejamiento particular de VH/VL debe ser reemplazada con una secuencia VH estructuralmente similar. De la misma manera, una secuencia de cadena pesada de longitud completa a partir de un emparejamiento particular de cadena pesada de longitud com pleta / cadena ligera de longitud completa, debe ser reemplazada con una secuencia de cadena pesada de longitud completa estructuralmente similar. De la misma manera, una secuencia VL a partir de un emparejamiento particular de VH/VL debe ser reemplazada con una secuencia VL estructuralmente similar. De la misma manera, una secuencia de cadena ligera de longitud completa a partir de un emparejamiento particular de cadena pesada de longitud completa / cadena ligera de longitud completa debe ser reemplazada con una secuencia de cadena ligera de longitud completa estructuralmente similar.

De conformidad con lo anterior, en un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento del mismo que tiene: VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 14, 34, 54, 74, 94, 1 14, 134, 154, 174, 194, 214, 234, 254, 274, 294, 314, 334, 354, 374, 394, 414, 434, 454, 474, 494, 514, y 524; y VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 15, 35, 55, 75, 95, 1 15, 135, 155, 175, 195, 215, 235, 255, 275, 295, 315, 335, 355, 375, 395, 415, 435, 455, 475, 495, 515, y 535; en donde el anticuerpo se enlaza específicamente a HER3 (por ejemplo, humano y/o de cinomolgo).

En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 14 y una VL de la SEQ ID NO: 15. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 com prende una VH de la SEQ ID NO: 34 y una VL de la SEQ ID NO: 35. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 54 y una VL de la SEQ ID NO: 55. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a H ER3 comprende la SEQ ID NO: 74 y una VL de la SEQ ID NO: 75. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 94 y una VL de la SEQ ID NO: 95. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 1 14 y una VL de la SEQ ID NO: 1 15. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 134 y una VL de la SEQ ID NO: 135. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 154 y una VL de la SEQ ID NO: 155. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 174 y una VL de la SEQ ID NO: 175. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 194 y una VL de la SEQ ID NO: 195. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 214 y una VL de la SEQ ID NO: 215. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 234 y una VL de la SEQ ID NO: 235. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a H ER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 254 y una VL de la SEQ ID NO: 255. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 274 y una VL de la SEQ ID NO: 275. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 294 y una VL de la SEQ ID NO: 295. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 314 y una VL de la SEQ ID NO: 315. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 334 y una VL de la SEQ ID NO: 335. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 354 y una VL de la SEQ ID NO: 355. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a H ER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 374 y una VL de la SEQ ID NO: 375. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 394 y una VL de la SEQ ID NO: 395. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 414 y una VL de la SEQ ID NO: 415. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 434 y una VL de la SEQ ID NO: 435. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 454 y una VL de la SEQ ID NO: 455. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 474 y una VL de la SEQ ID NO: 475. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 494 y una VL de la SEQ ID NO: 495. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 514 y una VL de la SEQ ID NO: 515. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 534 y una VL de la SEQ ID NO: 535.

En otro aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos de HER3 que comprenden la cadena pesada y la cadena ligera de las CDR1 s, CDR2s y CDR3s como se describen en la Tabla 1 , o combinaciones de los mismos. Las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) se delinean utilizando el sistema de Kabat (Kabat y colaboradores (1991 ) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Qumta Edición, U .S. Department of Health and Human Services (Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos), N 1H Publicación No. 91 -3242; Chotia y colaboradores (1987) J. Mol. Biol. 196: 901 -917; Chotia y colaboradores (1989) Nature 342: 877-883; y Al-Lazikani y colaboradores (1997) J. Mol. Biol. 273, 927-948). De conformidad con lo anterior, en una modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de CDR1 seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2, 22, 42, 62, 82, 102, 122, 142 , 162, 182, 202, 222, 242, 262, 282, 302, 322, 342, 362, 382, 402, 422, 442, 462, 482, 502, y 522; una secuencia de CDR2 seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 3, 23, 43, 63, 83, 103, 123, 143, 163, 183, 203, 223, 243, 263, 283, 303, 323, 343, 363, 383, 403, 423, 443, 463, 483, 503, y 523; y/o una secuencia de CDR3 seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 4, 24, 44, 64, 84, 104, 124, 144, 164, 184, 204, 224, 244, 264, 284, 304, 324, 344, 364, 384, 404, 424, 444, 464, 484, 504, y 524; y una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de CDR1 seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 8, 28, 48, 68, 88, 108, 128, 148, 168, 188, 208, 228, 248, 268, 288, 308, 328, 348, 368, 388, 408, 428, 448, 468, 488, 508, y 528; una secuencia de CDR2 seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 9, 29, 49, 69, 89, 109, 129, 149, 169, 189, 209, 229, 249, 269, 289, 309, 329, 349, 369, 389, 409, 429, 449, 469, 489, 509, y 529; y/o una secuencia de CDR3 seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 10, 30, 50, 70, 90, 1 10, 130, 150, 170, 190, 210, 230, 250, 270, 290, 310, 330, 350, 370, 390, 410, 430, 450, 470, 490, 510, y 530, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlaza al dominio 2 de HER3.

En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una CDR1 de región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 502; una CDR2 de la SEQ ID NO: 503; una CDR3 de la SEQ ID NO: 504; una CDR1 de región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 508; una CDR2 de la SEQ ID NO: 509; y una CDR3 de la SEQ ID NO: 510.

En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una CDR1 de región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 522; una CDR2 de la SEQ ID NO: 523; una CDR3 de la SEQ ID NO: 524; una CDR1 de región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 528; una CDR2 de la SEQ ID NO: 529; y una CDR3 de la SEQ ID NO: 530.

Como se utiliza en la presente, un anticuerpo humano comprende regiones variables de cadena pesada o ligera o de cadenas pesada o ligera de longitud completa que son "el producto de" o "se derivan a partir de" una secuencia de la línea germinal particular si las regiones variables o las cadenas de longitud completa del anticuerpo se obtienen a partir de un sistema que utilice genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Estos sistemas incluyen inmunizar un ratón transgénico portador de genes de inmunoglobulina humana con el antígeno de interés, o rastrear una biblioteca de genes de inmunoglobulina humana exhibida sobre el fago con el antígeno de interés. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "se deriva a partir de" una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana se puede identificar como tal comparando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano con las secuencias de aminoácidos de las inmunoglobulinas de la línea germinal humana, y seleccionar la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana que esté más cercana en la secuencia (es decir, el mayor porcentaje de identidad) a la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "se deriva a partir de" una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana particular puede contener diferencias de aminoácidos comparándose con la secuencia de la línea germinal, debido a, por ejemplo, las mutaciones somáticas que se presentan naturalmente o la introducción intencional de mutaciones dirigidas al sitio. Sin embargo, en las regiones de estructura VH o VL, un anticuerpo humano seleccionado típicamente es cuando menos el 90 por ciento idéntico en la secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana y contiene residuos de aminoácidos que identifican el anticuerpo humano como humano cuando se compara con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de la línea germinal de otras especies (por ejemplo, secuencias de la línea germinal de murino). En ciertos casos, un anticuerpo humano puede ser cuando menos el 50 por ciento, 60 por ciento, 70 por ciento, 80 por ciento, 90 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento o 99 por ciento idéntico en la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal. Típicamente, un anticuerpo humano recombinante exhibirá no más de 10 diferencias de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana en las regiones de estructura VH o VL. En ciertos casos, el anticuerpo humano puede exhibir no más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal.

Los anticuerpos que se dan a conocer en la presente pueden ser derivados de anticuerpos de una sola cadena, diacuerpos, anticuerpos de dominio, nanocuerpos, y unicuerpos. Un "anticuerpo de una sola cadena" (scFv) consiste en una sola cadena de polipéptido que comprende un dominio VL enlazado a un dominio VH , en donde el dominio VL y el dominio VH se emparejan para formar una molécula monovalente. El anticuerpo de una sola cadena se puede preparar de acuerdo con el método conocido en la materia (véase, por ejemplo, Bird y colaboradores (1988) Science 242: 423-426, y Huston y colaboradores (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85: 5879-5883). Un “disbud” consiste en dos cadenas, comprendiendo cada cadena una región variable de cadena pesada conectada con una región variable de cadena ligera sobre la misma cadena del polipéptido, conectadas mediante un enlazador peptídico corto, en donde las dos regiones sobre la misma cadena no se emparejan una con la otra, sino con los dominios complementarios sobre la otra cadena, para formar una molécula biespecífica. Los métodos para la preparación de diacuerpos se conocen en la téenica (véanse, por ejemplo, Holliger y colaboradores (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90: 6444-6448, y Poljak y colaboradores (1994) Structure 2: 1 121 -1 123). Los anticuerpos de dominio (dAbs) son pequeñas unidades de anticuerpos de enlace funcional, correspondientes a las regiones variables de cualquiera de las cadenas pesada o ligera de los anticuerpos. Los anticuerpos de dominio se expresan bien en sistemas bacterianos, de levadura, y de células de mamíferos. Otros detalles de los anticuerpos de dominio y de los métodos de producción de los mismos se conocen en la técnica (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 6,291 , 158; 6,582,915; 6,593,081 ; 6, 172, 197; 6,696,245; las Patentes Europeas Números 0368684 y 0616640; y las Publicaciones Internacionales Números WO05/035572, W004/101790, WO04/ 081026, W004/058821 , W004/003019 y W003/002609. Los nanocuerpos se derivan a partir de las cadenas pesadas de un anticuerpo. Un nanocuerpo típicamente comprende un solo dominio variable y dos dominios constantes (CH2 y CH3), y conserva la capacidad de enlace al antígeno del anticuerpo original. Los nanocuerpos se pueden preparar mediante los métodos conocidos en la téenica (véanse, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,765,087, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,838,254, y la Publicación Internacional Número WO 06/079372). Los unicuerpos consisten en una cadena ligera y una cadena pesada de un anticuerpo de lgG4. Los unicuerpos se pueden hacer mediante la remoción de la región de articulación de los anticuerpos de lgG4. Otros detalles de los unicuerpos y de los métodos para la preparación de los mismos, se pueden encontrar en la Publicación Internacional Número W02007/ 059782.

Anticuerpos homólogos En todavía otra modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo, el cual comprende las secuencias de aminoácidos que son homólogas a las secuencias descritas en la Tabla 1 , y el anticuerpo se enlaza a una proteína de HER3 (por ejemplo, HER3 humana y/o de cinomolgo), y conserva las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos descritos en la Tabla 1 .

Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado (o un fragmento funcional del mismo), el cual comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 80 por ciento, 90 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento o 99 por ciento idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 14, 34, 54, 74, 94, 1 14, 134, 154, 174, 194, 214, 234, 254, 274, 294, 314, 334, 354, 374, 394, 414, 434, 454, 474, 494, 514, y 524; la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 80 por ciento, 90 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento o 99 por ciento idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 14, 34, 54, 74, 94, 1 14, 134, 154, 174, 194, 214, 234, 254, 274, 294, 314, 334, 354, 374, 394, 414, 434, 454, 474, 494, 514, y 524; el anticuerpo se enlaza a HER3 (por ejemplo, HER3 humano y/o de cinomolgo), e inhibe la actividad de señalización de HER3, la cual se puede medir en un ensayo de fosforilación u otra medida de señalización de HER (por ejemplo, los ensayos de fosfo-HER3, los ensayos de fosfo-Akt, proliferación celular, y los ensayos de bloqueo de ligando, como se describen en los Ejemplos). También se incluyen dentro del alcance de la invención las secuencias de nucleótidos progenitores de cadenas pesada y ligera variables; y las secuencias de cadena pesada y ligera de longitud completa optimizadas para la expresión en una célula de mamífero. Otros anticuerpos de la invención incluyen aminoácidos o ácidos nucleicos que se han mutado, y no obstante, tienen cuando menos el 60, 70, 80, 90, 95, 98, o 99 por ciento de identidad con las secuencias descritas anteriormente. En algunas modalidades, se incluyen las secuencias de aminoácidos mutantes en donde no más de 1 , 2, 3, 4 o 5 aminoácidos se han mutado mediante supresión, inserción o sustitución de aminoácidos en las regiones variables cuando se comparan con las regiones variables ilustradas en la secuencia descrita anteriormente.

En otras modalidades, las secuencias de aminoácidos VH y/o VL pueden ser 50 por ciento, 60 por ciento, 70 por ciento, 80 por ciento, 90 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento o 99 por ciento idénticas a las secuencias estipuladas en la Tabla 1 . En otras modalidades, las secuencias de aminoácidos VH y/o VL pueden ser idénticas excepto por una sustitución de aminoácido en no más de 1 , 2, 3, 4, ó 5 posiciones de aminoácidos. Un anticuerpo que tiene las regiones VH y VL que tienen identidad alta (es decir, 80 por ciento o mayor) con las regiones VH y VL de los anticuerpos descritos en la Tabla 1 , se puede obtener mediante mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por reacción en cadena de la polimerasa (PCR)), seguida por la prueba del segundo anticuerpo alterado codificado para la función conservada utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente.

En otras modalidades, las regiones variables de las secuencias de nucleótidos de cadena pesada y/o cadena ligera pueden ser 60 por ciento, 70 por ciento, 80 por ciento, 90 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento o 99 por ciento idénticas a las secuencias estipuladas anteriormente.

Como se utiliza en la presente, el “porcentaje de identidad” entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, el porcentaje de identidad es igual al número de posiciones idénticas / el número total de posiciones x 100), tomando en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que se necesite introducir para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias, se pueden llevar a cabo utilizando un algoritmo matemático, como se describe en el los ejemplos no limitantes más adelante.

Adicionalmente o de una manera alternativa, las secuencias de proteína de la presente invención se pueden utilizar adicionalmente como una “secuencia pedida” para llevar a cabo una búsqueda contra las bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar secuencias relacionadas. Por ejemplo, estas búsquedas se pueden llevar a cabo utilizando el programa BLAST (versión 2.0) de Altschul y colaboradores (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10.

Anticuerpos con modificaciones conservadoras En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención tiene una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de CDR1 , CDR2, y CDR3, y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de CDR1 , CDR2, y CDR3, en donde una o más de estas secuencias de regiones determinantes de complementariedad (CDR) tienen las secuencias de aminoácidos especificadas basándose en los anticuerpos descritos en la presente o en modificaciones conservadoras de los mismos, y en donde los anticuerpos conservan las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos de HER3 de la invención.

De conformidad con lo anterior, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal de HER3 aislado, o un fragmento del mismo, que consiste en una región variable de cadena pesada, la cual comprende las secuencias de las CDR1 , CDR2, y CDR3, y una región variable de cadena ligera, la cual comprende las secuencias de las CDR1 , CDR2, y CDR3, en donde: las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada CDR1 se seleccionan a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2, 22, 42, 62, 82, 102, 122, 142, 162, 182, 202, 222, 242, 262, 282, 302, 322, 342, 362, 382, 402, 422, 442, 462, 482, 502, y 522, y las modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada CDR2 se seleccionan a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 3, 23, 43, 63, 83, 103, 123, 143, 163, 183, 203, 223, 243, 263, 283, 303, 323, 343, 363, 383, 403, 423, 443, 463, 483, 503, y 523, y las modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada CDR3 se seleccionan a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 4, 24, 44, 64, 84, 104, 124, 144, 164, 184 , 204, 224, 244, 264, 284, 304, 324, 344, 364, 384, 404, 424, 444, 464, 484, 504, y 524, y las modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera CDR1 se seleccionan a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 8, 28, 48, 68, 88, 108, 128, 148, 168, 188, 208, 228, 248, 268, 288, 308, 328, 348, 368, 388, 408, 428, 448, 468, 488, 508, y 528, y las modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera CDR2 se seleccionan a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 9, 29, 49, 69, 89, 109, 129, 149, 169, 189, 209, 229, 249, 269, 289, 309, 329, 349, 369, 389, 409, 429, 449, 469, 489, 509, y 529, y las modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera CDR3 se seleccionan a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 10, 30, 50, 70, 90, 1 10, 130, 150, 170, 190 , 210, 230, 250, 270, 290, 310, 330, 350, 370, 390, 410, 430, 450, 470, 490, 510, y 530, y las modificaciones conservadoras de las mismas; el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlaza específicamente a H ER3, e inhibe la actividad de HER3 mediante la inhibición de una senda de señalización de HER3 la cual se puede medir en un ensayo de fosforilación u otra medida de señalización de HER (por ejemplo, los ensayos de fosfo-HER3, los ensayos de fosfo-Akt, proliferación celular, y los ensayos de bloqueo de ligando, como se describen en los Ejemplos).

Anticuerpos que se enlazan al mismo epítopo La presente invención proporciona anticuerpos que interactúan (por ejemplo, mediante enlace, impedimento esferico, estabilización/ desestabilización, distribución espacial) con el mismo epítopo que los anticuerpos de HER3 descritos en la Tabla 1. Por consiguiente, se pueden identificar anticuerpos adicionales basándose en su capacidad para competir cruzadamente (por ejemplo, para inhibir de una manera competitiva el enlace, de una manera estadísticamente significativa) con otros anticuerpos de la invención en los ensayos de enlace de HER3. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir el enlace de los anticuerpos de la presente invención con una proteína de HER3 (por ejemplo, HER3 humano y/o de cinomolgo) demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con ese anticuerpo para enlazarse a HER3; este anticuerpo, de acuerdo con una teoría no limitante, se puede enlazar al mismo epítopo o a un epítopo relacionado (por ejemplo, a un epítopo estructuralmente similar o espacialmente proximal) sobre la proteína de HER3 que el anticuerpo con el que compite. En una cierta modalidad, el anticuerpo que se enlaza al mismo epítopo sobre la proteína relacionada con HER3 que los anticuerpos de la presente invención, es un anticuerpo monoclonal humano. Estos anticuerpos monoclonales humanos se pueden preparar y aislar como se describe en la presente.

En una modalidad, el anticuerpo o los fragmentos del mismo se enlazan al dominio 2 de HER3 para mantener al HER3 en la conformación que impide la exposición de un ciclo de dimerización presente dentro del dominio 2. Esto impide la heterodimerización con otros miembros de la familia, tales como HER1 , HER2, y HER4. Los anticuerpos o los fragmentos de los mismos inhiben la transducción de señales de HER3 tanto dependiente del ligando como independiente del ligando.

En otra modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlaza al dominio 2 de HER3 sin bloquear el enlace concurrente de un ligando de HER3, tal como neurregulina. Aunque no se requiere proporcionar una teoría, es factible que el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlace al dominio 2 de HER3, y mantenga a HER3 en una conformación que no bloquee el sitio de enlace del ligando sobre HER3. Por consiguiente, un ligando de HER3 (por ejemplo, neurregulina) es capaz de enlazarse a HER3 al mismo tiempo que el anticuerpo o un fragmento del mismo.

Los anticuerpos de la invención o los fragmentos de los mismos inhiben la activación de HER3 tanto dependiente del ligando como independiente del ligando sin impedir el enlace del ligando. Esto se considera conveniente por las siguientes razones: (i) El anticuerpo terapéutico tendría utilidad clínica en un amplio espectro de tumores que un anticuerpo cuyo objetivo sea un solo mecanismo de la activación de HER3 (es decir, dependiente del ligando o independiente del ligando), debido a que se manejan distintos tipos de tumores por cada mecanismo. (ii) El anticuerpo terapéutico sería eficaz en tipos de tumores en donde se involucren simultáneamente los mecanismos de la activación de HER3. Un anticuerpo que focaliza un solo mecanismo de la activación de HER3 (es decir, dependiente del ligando o independiente del ligando) podría exhibir poca o ninguna eficacia en este tipo de tumores. (iii) La eficacia de un anticuerpo que inhiba la activación dependiente del ligando de HER3 sin impedir el enlace del ligando podría ser menos probable que afectara adversamente mediante el aumento de las concentraciones del ligando. Esto podría traducirse a cualquiera de una eficacia incrementada en un tipo de tumor manejado por concentraciones muy altas del ligando de H ER3, o bien una resistencia reducida al riesgo del fármaco, en donde la resistencia es mediada por la sobre-regulación de los ligandos de HER3. (iv) Un anticuerpo que inhiba la activación de HER3 mediante la estabilización de la forma inactiva podría ser menos propenso a tener resistencia al fármaco, manejado por mecanismos alternativos de la activación de HER3.

En consecuencia, los anticuerpos de la invención se pueden utilizar para tratar condiciones en donde existan anticuerpos terapéuticos clínicamente inefectivos.

Anticuerpos diseñados y modificados Un anticuerpo de la invención se puede preparar además utilizando un anticuerpo que tenga una o más de las secuencias VH y/o VL mostradas en la presente como material de partida para diseñar un anticuerpo modificado, cuyo anticuerpo modificado puede tener propiedades alteradas en relación con el anticuerpo de partida. Un anticuerpo se puede diseñar mediante la modificación de uno o más residuos dentro de una o ambas reglones variables (es decir, VH y/o VL), por ejemplo, dentro de una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) y/o dentro de una o más regiones de estructura. Adicionalmente o de una manera alternativa, un anticuerpo se puede diseñar mediante la modificación de los residuos dentro de las regiones constantes, por ejemplo, para alterar las funciones efectoras del anticuerpo.

Un tipo de diseño de región variable que se puede llevar a cabo es el injerto de la región determinante de complementariedad (CDR). Los anticuerpos interactúan con los antígenos objetivo predominantemente a traves de los residuos de aminoácidos que se localizan en las seis regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cadena pesada y ligera. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) son más diversas entre los anticuerpos individuales que las secuencias que están fuera de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs). Debido a que las secuencias de regiones determinantes de complementariedad (CDR) son responsables de la mayoría de las interacciones de anticuerpo-antígeno, es posible expresar los anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de los anticuerpos que se presentan naturalmente específicos mediante la construcción de vectores de expresión que incluyan secuencias de regiones determinantes de complementariedad (CDR) a partir del anticuerpo que se presente naturalmente específico injertadas sobre las secuencias de estructura a partir de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (véase, por ejemplo, Riechmann y colaboradores (1998) Nature 332: 323-327; Jones y colaboradores (1986) Nature 321 : 522-525; Queen y colaboradores (1989) Proc. Nati. Acad. , EUA 86: 10029-10033; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,225,539 a Winter, y las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,530, 101 ; 5,585,089; 5,693,762 y 6, 180,370 a Queen y colaboradores).

De conformidad con lo anterior, otra modalidad de la invención pertenece a un anticuerpo monoclonal de HER3 aislado, o a un fragmento del mismo, el cual comprende una región variable de cadena pesada, la cual comprende las secuencias de CDR1 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2, 22, 42, 62, 82, 102, 122, 142, 162, 182, 202, 222, 242, 262, 282, 302, 322, 342, 362, 382, 402, 422, 442, 462, 482, 502, y 522; las secuencias de CDR2 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 3, 23, 43, 63, 83, 103, 123, 143, 163, 183, 203, 223, 243, 263, 283, 303, 323, 343, 363, 383, 403, 423, 443, 463, 483, 503, y 523; las secuencias de CDR3 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 4, 24, 44, 64, 84, 104, 124, 144, 164, 184, 204, 224, 244, 264, 284, 304, 324, 344, 364, 384, 404, 424, 444, 464, 484, 504, y 524, respectivamente; y una región variable de cadena ligera que tiene las secuencias de CDR1 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 8, 28, 48, 68, 88, 108, 128, 148, 168, 188, 208, 228, 248, 268, 288, 308, 328, 348, 368, 388, 408, 428, 448, 468, 488, 508, y 528; las secuencias de CDR2 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 9, 29, 49, 69, 89, 109, 129, 149, 169, 189, 209, 229, 249, 269, 289, 309, 329, 349, 369, 389, 409, 429, 449, 469, 489, 509, y 529; y las secuencias de CDR3 que consisten en un secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 10, 30, 50, 70, 90, 1 10, 130, 150, 170, 190, 210, 230, 250, 270, 290, 310, 330, 350, 370, 390, 410, 430, 450, 470, 490, 510, y 530, respectivamente. Por consiguiente, estos anticuerpos contienen las secuencias de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) VH y VL de los anticuerpos monoclonales, y no obstante, pueden contener diferentes secuencias de estructura a partir de estos anticuerpos. Estas secuencias de estructura se puede obtener a partir de las bases de datos de ADN públicas o de las referencias publicadas que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de la línea germinal. Por ejemplo, las secuencias de ADN de la línea germinal para los genes de región variable de cadena pesada y ligera humanos se pueden encontrar en la base de datos de secuencias de la línea germinal humana “Vase” (disponible en la Internet en www. mrc- cpe.cam.ac.uk/vbase), así como en Kabat y colaboradores (1991 ) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Qumta Edición, U .S. Department of Health and Human Services (Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos), N1H Publicación No. 91 -3242; Chothia y colaboradores (1987) J . Mol. Biol. 196: 901 -917; Chothia y colaboradores (1989) Nature 342: 877-883; y Al-Lazikani y colaboradores (1997) J. Mol. Biol. 273: 927-948; Tomlinson y colaboradores (1992) J. fol. Biol. 227: 776-798; y Cox y colaboradores (1994) Eur. J Immunol. 24: 827-836; el contenido de cada uno de los cuales se incorpora expresamente a la presente como referencia.

Un ejemplo de las secuencias de estructura para utilizarse en los anticuerpos de la invención son aquellos que son estructuralmente similares a las secuencias de estructura utilizadas por los anticuerpos seleccionados de la invención, por ejemplo, las secuencias en consenso y/o las secuencias de estructura utilizadas por los anticuerpos monoclonales de la invención. Las secuencias de CDR 1 , 2 y 3 VH , y las secuencias de CDR1 , 2 y 3 VL, se pueden injertar sobre las regiones de estructura que tengan una secuencia idéntica a la encontrada en el gen de inmunoglobulina de la línea germinal a partir del cual se derive la secuencia de estructura, o las secuencias de regiones determinantes de complementariedad (CDR) se pueden injertar sobre las regiones de estructura que contengan una o más mutaciones comparándose con las secuencias de la línea germinal. Por ejemplo, se ha encontrado que, en ciertas instancias, es benéfico mutar residuos dentro de las regiones de estructura para mantener o mejorar la capacidad de enlace al antígeno del anticuerpo (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,530, 101 ; 5,585,089; 5,693,762 y 6, 180,370 a Queen y colaboradores).

Otro tipo de modificación de región variable es mutar los residuos de aminoácidos dentro de las regiones CDR1 , CDR2 y/o CDR3 VH y/o VL para mejorar de esta manera una o más propiedades de enlace (por ejemplo, la afinidad) del anticuerpo de interés, siendo esto conocido como "maduración de afinidad." Se puede llevar a cabo mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para introducir las mutaciones, y se puede evaluar el efecto sobre el enlace del anticuerpo, o otra propiedad funcional de interés, en ensayos in vitro o in vivo, como se describen en la presente, y como se proporcionan en los Ejemplos. Se pueden introducir modificaciones conservadoras (como se discute anteriormente). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos. Más aún, típicamente no se alteran más de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos dentro de una región determinante de complementariedad (CDR).

De conformidad con lo anterior, en otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos monoclonales de HER3 aislados, o fragmentos de los mismos, que consisten en una región variable de cadena pesada que tiene: una región VH CDR1 que consiste en un secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que tiene las SEQ ID NOs: 2, 22, 42, 62, 82, 102, 122, 142, 162, 182, 202, 222, 242, 262, 282, 302, 322, 342, 362, 382, 402, 422, 442, 462, 482, 502, y 522, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos, comparándose con las SEQ ID NOs: 2, 22, 42, 62, 82, 102, 122, 142, 162, 182, 202, 222, 242, 262, 282, 302, 322, 342, 362, 382, 402, 422, 442, 462, 482, 502, y 522; una región VH CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 3, 23, 43, 63, 83, 103, 123, 143, 163, 183, 203, 223, 243, 263, 283, 303, 323, 343, 363, 383, 403, 423, 443, 463, 483, 503, y 523, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos, comparándose con las SEQ ID NOs: 3, 23, 43, 63, 83, 103, 123, 143, 163, 183, 203, 223, 243, 263, 283, 303, 323, 343, 363, 383, 403, 423, 443, 463, 483, 503, y 523; una región VH CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 4, 24, 44, 64, 84, 104, 124, 144, 164, 184, 204, 224, 244, 264, 284, 304, 324, 344, 364, 384, 404, 424, 444, 464, 484, 504, y 524, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos, comparándose con las SEQ ID NOs: 4, 24, 44, 64, 84, 104, 124, 144, 164, 184, 204, 224, 244, 264, 284, 304, 324, 344, 364, 384, 404, 424, 444, 464, 484, 504, y 524; una región VL CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 8, 28, 48, 68, 88, 108, 128, 148, 168, 188, 208, 228 , 248, 268, 288, 308, 328, 348, 368, 388, 408, 428, 448, 468, 488, 508, y 528, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos, comparándose con las SEQ ID NOs: 8, 28, 48, 68, 88, 108, 128, 148, 168, 188, 208, 228, 248, 268, 288, 308, 328, 348, 368, 388, 408, 428, 448, 468, 488, 508, y 528; una región VL CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 9, 29, 49, 69, 89, 109, 129, 149, 169, 189, 209, 229, 249, 269, 289, 309, 329, 349, 369, 389, 409, 429, 449, 469, 489, 509, y 529, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos, comparándose con las SEQ ID NOs: 9, 29, 49, 69, 89, 109, 129, 149, 169, 189, 209, 229, 249, 269, 289, 309, 329, 349, 369, 389, 409, 429, 449, 469, 489, 509, y 529; y una región VL CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 10, 30, 50, 70, 90, 1 10, 130, 150, 170, 190, 210, 230, 250, 270, 290, 310, 330, 350, 370, 390, 410, 430, 450, 470, 490, 510, y 530, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos, comparándose con las SEQ ID NOs: 10, 30, 50, 70, 90, 1 10, 130, 150, 170, 190, 210, 230, 250, 270, 290, 310, 330, 350, 370, 390, 410, 430, 450, 470, 490, 510, y 530.

Injerto de fragmentos de anticuerpos en estructuras o andamiajes alternativos Se pueden emplear una amplia variedad de estructuras o andamiajes de anticuerpo/inmunoglobulina siempre que el polipeptido resultante incluya cuando menos una región de enlace que se enlace específicamente a HER3. Estas estructuras o andamiajes incluyen los 5 idiotipos principales de las inmunoglobulinas humanas, o fragmentos de los mismos, e incluyen las inmunoglobulinas de otras especies de animales, de preferencia que tengan aspectos humanizados. Los expertos en este campo continúan descubriendo y desarrollando estructuras, andamiajes y fragmentos novedosos.

En un aspecto, la invención pertenece a la generación de anticuerpos no basados en inmunoglobulina utilizando andamiajes que no son de inmunoglobulina sobre los cuales se pueden injertar las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de la invención. Se pueden emplear estructuras y andamiajes que no sean de inmunoglobulina conocidos o futuros, siempre que comprendan una región de enlace específica para la proteína de HER3 objetivo (por ejemplo, HER3 humano y/o de cinomolgo). Las estructuras o andamiajes que no son de ¡nmunoglobulina conocidos incluyen, pero no se limitan a, fibronectina (Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA), anquirina (Molecular Partners AG, Zurich, Suiza), anticuerpos de dominio (Domantis, Ltd . , Cambridge, MA, y Ablynx nv, Zwijnaarde, Bélgica), lipocalina (Pieris Proteolab AG, Freising, Alemania), productos farmacéuticos inmunológicos modulares pequeños (Trubion Pharmaceuticals Inc. , Seattle, WA), maxicuerpos (Avidia, Inc. , Mountain View, CA), Proteína A (Affibody AG, Suecia), y afilina (gamma-cristalina o ubiquitina) (Scil Proteins GmbH, Halle, Alemania).

Los andamiajes de fibronectina se basan en el dominio de fibronectina tipo III (por ejemplo, el décimo módulo de la fibronectina tipo II I (dominio 10 Fn3)). El dominio de fibronectina tipo III tiene 7 u 8 cadenas beta que están distribuidas entre dos hojas beta, que por sí mismas se empacan unas contra otras para formar el núcleo de la proteína, y que además contienen ciclos (análogos a las regiones determinantes de complementariedad (CDRs)) que conectan las cadenas beta unas con otras y se exponen al solvente. Hay cuando menos tres de estos ciclos en cada orilla del emparedado de hojas beta, en donde la orilla es el límite de la proteína perpendicular a la dirección de las cadenas beta (véase la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US 6,818,418). Estos andamiajes basados en fibronectina no son una ¡nmunoglobulina, aunque el pliegue global está estrechamente relacionado con aquél del fragmento de anticuerpo funcional más pequeño, la región variable de la cadena pesada, que comprende la unidad entera de reconocimiento de antígeno en la IgG de camello y de llama. Debido a esta estructura, el anticuerpo que no es de inmunoglobulina imita las propiedades de enlace al antígeno que son de una naturaleza y afinidad similar a aquellas de los anticuerpos. Estos andamiajes se pueden utilizar en una estrategia de selección aleatoria y mezcla en ciclo in vitro, que es similar al proceso de maduración de afinidad de los anticuerpos in vivo. Estas moléculas basadas en fibronectina se pueden utilizar como andamiajes en donde las regiones de ciclo de la molécula pueden ser reemplazadas con las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de la invención utilizando téenicas de clonación convencionales.

La tecnología de anquirina se basa en el uso de proteínas con módulos de repetición derivados de anquirina como andamiajes para soportar las regiones variables, las cuales se pueden utilizar para enlazarse a diferentes objetivos. El módulo de repetición de anquirina es un polipéptido de 33 aminoácidos que consiste en dos hélices-a anti-paralelas y una vuelta-b. El enlace de las regiones variables se optimiza en su mayor parte utilizando la exhibición de ribosomas.

Los avímeros se derivan a partir de la proteína que contiene el dominio A natural, tal como HER3. Estos dominios se utilizan por naturaleza para las interacciones de proteína-proteína, y en el ser humano, más de 250 proteínas se basan estructuralmente en los dominios-A. Los avímeros consisten en un número de diferentes monómeros de “dominio-A” (2-10) enlazados por medio de enlazadores de aminoácidos. Se pueden crear avímeros que pueden enlazarse a un antígeno objetivo empleando la metodología descrita, por ejemplo, en las Publicaciones de Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Números 20040175756; 20050053973; 20050048512; y 20060008844.

Los ligandos de afinidad Affibody son proteínas simples pequeñas compuestas de un haz de tres hélices basado en el andamiaje de uno de los dominios de enlace a IgG de la proteína A. La proteína A es una proteína superficial a partir de la bacteria Staphylococcus aureus. Este dominio de andamiaje consiste en 58 aminoácidos, 13 de los cuales se seleccionan aleatoriamente para generar bibliotecas Affibody con un gran número de variantes de ligandos (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US 5,831 ,012). Las moléculas Affibody imitan a los anticuerpos, tienen un peso molecular de 6 kDa, comparándose con el peso molecular de los anticuerpos, el cual es de 150 kDa. A pesar de su pequeño tamaño, el sitio de enlace de las moléculas Affibody es similar a aquél de un anticuerpo.

Las anticalinas son productos desarrollados por la compañía Pieris ProteoLab AG. Se derivan a partir de las lipocalinas, un grupo ampliamente extendido de proteínas pequeñas y robustas que usualmente están involucradas en el transporte o almacenamiento fisiológico de los compuestos químicamente sensibles o insolubles. Se presentan varias lipocalinas naturales en los tejidos o en los líquidos corporales humanos. La arquitectura de la proteína hace recordar a las ¡nmunoglobulinas, con ciclos hipervariables encima de una estructura rígida. Sin embargo, en contraste con los anticuerpos o con sus fragmentos recombinantes, las lipocalinas están compuestas de una sola cadena de polipeptido con 160 a 180 residuos de aminoácidos, lo cual es apenas marginalmente mayor que un solo dominio de ¡nmunoglobulina. El conjunto de cuatro ciclos, el cual forma la buchaca de enlace, muestra una plasticidad estructural pronunciada y tolera una variedad de cadenas laterales. El sitio de enlace, por consiguiente, se puede reconfigurar en un proceso registrado con el objeto de reconocer las moléculas objetivo prescritas de forma diferente con una alta afinidad y especificidad. Se ha utilizado una proteína de la familia de lipocalina, la proteína de enlace a bilina (BBP) de Pieris Brassicae, para desarrollar anticalinas mediante la mutagenización del conjunto de cuatro ciclos.

Un ejemplo de una solicitud de patente que describe las anticalinas está en la Publicación Internacional del TCP Número WO 199916873.

Las moléculas de afilina son proteínas pequeñas que no son de ¡nmunoglobulina, las cuales están diseñadas para tener afinidades específicas hacia las proteínas y las moléculas pequeñas. Las nuevas moléculas de afilina se pueden seleccionar muy rápidamente a partir de dos bibliotecas, cada una de los cuales se basa en una proteína de andamiaje diferente derivada del ser humano. Las moléculas de afilina no muestran ninguna homología estructural con las proteínas de ¡nmunoglobulina. Actualmente, se emplean dos andamiajes de afilina, uno de los cuales es la gamma-cristalina, una proteína estructural humana del lente del ojo, y el otro es el de las proteínas de la superfamilia de "ubiquitina". Ambos andamiajes humanos son muy pequeños, muestran una alta estabilidad a la temperatura, y son casi resistentes a los cambios de pH y a los agentes desnaturalizantes. Esta alta estabilidad se debe principalmente a la estructura de hoja beta expandida de las proteínas. Los ejemplos de de las proteínas derivadas de gamma-cristalina se describen en la Publicación Internacional Número W0200104144, y los ejemplos de las proteínas "de tipo ubiquitina" se describen en la Publicación Internacional Número WO 2004106368.

Los miméticos de epítopos de proteína (PEM) son moléculas de tipo péptido cíclicas de tamaño mediano (MW 1 -2kDa) que imitan a las estructuras secundarias de horquilla-beta de las proteínas, la principal estructura secundaria involucrada en las interacciones de proteína-proteína.

En algunas modalidades, los Fabs se convierten hasta el formato silencioso de I g G 1 mediante el cambio de la región Fe. Por ejemplo, los anticuerpos de la Tabla 1 se pueden convertir hasta el formato de IgG.

Anticuerpos humanos o humanizados La presente invención proporciona anticuerpos completamente humanos que se enlazan específicamente con una proteína de HER3 (por ejemplo, HER3 humano y/o de cinomolgo/ratón/rata).

Comparándose con los anticuerpos quiméricos o humanizados, los anticuerpos de HER3 humanos o los fragmentos de los mismos, tienen además una antigenicidad reducida cuando se administran a sujetos humanos.

Los anticuerpos de HER3 humanos o los fragmentos de los mismos se pueden generar empleando los métodos que son conocidos en la materia. Por ejemplo, la teenología de "humaneering" (humanodiseño) utilizada para convertir los anticuerpos no humanos en anticuerpos humanos diseñados. La Publicación de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 20050008625 describe un método in vivo para reemplazar una región variable de anticuerpo no humano con una región variable humana en un anticuerpo, mientras que se mantienen las mismas características de enlace o se proporcionan mejores características de enlace en relación con aquéllas del anticuerpo no humano. El método se apoya en el reemplazo guiado por el epítopo de las regiones variables de un anticuerpo de referencia no humano con un anticuerpo completamente humano. El anticuerpo humano resultante en general no está relacionado estructuralmente con el anticuerpo no humano de referencia, pero se enlaza al mismo epítopo sobre el mismo antígeno que el anticuerpo de referencia. Dicho de una manera breve, el planteamiento de reemplazo de complementariedad guiado por el epítopo en serie se hace posible mediante el establecimiento de una competición en las células entre a "competidor" y una biblioteca de diversos híbridos del anticuerpo de referencia ("anticuerpos de prueba") para enlazarse a cantidades limitantes de antígeno en la presencia de un sistema reportero que responde al enlace del anticuerpo de prueba con el antígeno. El competidor puede ser el anticuerpo de referencia o un derivado del mismo, tal como un fragmento Fv de una sola cadena. El competidor también puede ser un ligando natural o artificial del antígeno que se enlaza al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia. Los únicos requerimientos del competidor son que se enlace al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, y que compita con el anticuerpo de referencia por el enlace al antígeno. Los anticuerpos de prueba tienen una región-V de enlace al antígeno en común a partir del anticuerpo de referencia no humano, y la otra región-V se selecciona aleatoriamente a partir de una fuente diversa, tal como una biblioteca de repertorio de los anticuerpos humanos. La región-V común a partir del anticuerpo de referencia sirve como una guía, colocando los anticuerpos de prueba sobre el mismo epítopo en el antígeno, y en la misma orientación, de tal manera que se fuerza la selección hacia la fidelidad más alta de enlace al antígeno con el anticuerpo de referencia.

Se pueden utilizar muchos tipos de sistemas reporteros para detectar las interacciones deseadas entre los anticuerpos de prueba y el antígeno. Por ejemplo, se pueden enlazar fragmentos de reportero complementarios al antígeno y al anticuerpo de prueba, respectivamente, de tal manera que solamente se presente la activación del reportero mediante la complementación de los fragmentos cuando se enlace el anticuerpo de prueba al antígeno. Cuando las fusiones de anticuerpo de prueba- y antígeno-fragmento de reportero se co-expresan con un competidor, la activación del reportero llega a ser dependiente de la capacidad del anticuerpo de prueba para competir con el competidor, la cual es proporcional a la afinidad del anticuerpo de prueba por el antígeno. Otros sistemas reporteros que se pueden utilizar incluyen el reactivador de un sistema de reactivación de reportero auto-inhibido (RAIR), como se da a conocer en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 10/208,730 (Publicación Número 20030198971 ), o el sistema de activación competitiva que se da a conocer en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 10/076,845 (Publicación Número 20030157579).

Con el sistema de reemplazo de complementariedad guiado por el epítopo en serie, se hace la selección para identificar las células que expresen un solo anticuerpo de prueba junto con los componentes de competidor, antígeno, y reportero. En estas células, cada anticuerpo de prueba compite uno a uno con el competidor para enlazarse a una cantidad limitante de antígeno. La actividad del reportero es proporcional a la cantidad de antígeno enlazado al anticuerpo de prueba, la cual a su vez es proporcional a la afinidad del anticuerpo de prueba por el antígeno y la estabilidad del anticuerpo de prueba. Los anticuerpos de prueba se seleccionan inicialmente con base en su actividad en relación con aquélla del anticuerpo de referencia cuando se expresa como el anticuerpo de prueba. El resultado de la primera ronda de selección es un conjunto de anticuerpos "híbridos", cada uno de los cuales está comprendido de la misma región-V no humana a partir del anticuerpo de referencia y una región-V humana a partir de la biblioteca, y cada uno de los cuales se enlaza al mismo epítopo sobre el antígeno que el anticuerpo de referencia. Uno o más de los anticuerpos híbridos seleccionados en la primera ronda tendrán una afinidad por el antígeno comparable con, o mayor que, aquélla del anticuerpo de referencia.

En el segundo paso de reemplazo de la región-V, las regiones-V humanas seleccionadas en el primero paso se utilizan como guía para la selección de los reemplazos humanos para la región-V del anticuerpo de referencia no humano restante con una biblioteca diversa de regiones-V humanas cognadas. Los anticuerpos híbridos seleccionados en la primera ronda también se pueden utilizar como competidores para la segunda ronda de selección. El resultado de la segunda ronda de selección es un conjunto de anticuerpos completamente humanos que difieren estructuralmente del anticuerpo de referencia, pero que compiten con el anticuerpo de referencia para enlazarse al mismo antígeno. Algunos de los anticuerpos humanos seleccionados se enlazan al mismo epítopo sobre el mismo antígeno que el anticuerpo de referencia. Entre estos anticuerpos humanos seleccionados, uno o más se enlaza al mismo epítopo con una afinidad que es comparable a, o mayor que, aquélla del anticuerpo de referencia.

Utilizando uno de los anticuerpos de HER3 de ratón o quimerico, o los fragmentos de los mismos, descritos anteriormente como el anticuerpo de referencia, este método se puede emplear fácilmente para generar anticuerpos humanos que se enlacen al HER3 humano con la misma especificidad de enlace y la misma o mejor afinidad de enlace. En adición, estos anticuerpos de HER3 humano o los fragmentos de los mismos, también se pueden obtener comercialmente en las compañías que producen por costumbre anticuerpos humanos, por ejemplo, en KaloBios, Inc. (Mountain View, CA).

Anticuerpos de camélido Las proteínas de anticuerpos obtenidas a partir de los miembros de la familia del camello y el dromedario ( Camelus bactrianus y Camelus dromedarius), incluyendo los miembros del nuevo mundo, tales como las especies de llama ( Lama paceos, Lama glama y lama vicugna), se han caracterizado con respecto al tamaño, la complejidad estructural, y la antigenicidad para los sujetos humanos. Ciertos anticuerpos de IgG a partir de esta familia de mamíferos, como se encuentran en la naturaleza, carecen de cadenas ligeras y, por consiguiente, son estructuralmente distintos de la estructura cuaternaria típica de cuatro cadenas que tiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, para los anticuerpos de otros animales. Véase la Publicación Internacional del TCP Número PCT/EP93/02214 (Publicación Internacional Número WO 94/04678 publicada el 3 de marzo de 1994).

Una región del anticuerpo de camelido, que es el único dominio variable pequeño identificado como VH H, se puede obtener mediante ingeniería genética para proporcionar una proteína pequeña que tiene una alta afinidad por un objetivo, que da como resultado una proteína derivada de anticuerpo de bajo peso molecular conocida como un “nanocuerpo de camélido”. Véase la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,759,808 expedida el 2 de junio de 1998; véase también Stijlemans y colaboradores (2004) J Biol Chem 279: 1256-1261 ; Dumoulin y colaboradores (2003) Nature 424: 783-788; Pleschberger y colaboradores (2003) Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo y colaboradores (2002) Int J Cáncer 89: 456-62; y Lauwercys y colaboradores (1998) EMBO J 17: 3512-3520. Las bibliotecas diseñadas de anticuerpos de camélido y fragmentos de anticuerpos están comercialmente disponibles, por ejemplo, en Ablynx, Ghent, Bélgica (por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números US200601 15470; Domantis US20070065440, US20090148434). Como con otros anticuerpos de origen no humano, una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de camélido se puede alterar de una manera recombinante para obtener una secuencia que se parezca más cercanamente a una secuencia humana, es decir, el nanocuerpo se puede “humanizar". Por consiguiente, se puede reducir adicionalmente la baja antigenicidad natural de los anticuerpos de camélido para los seres humanos.

El nanocuerpo de camélido tiene un peso molecular de aproximadamente una décima parte de aquél de una molécula de IgG humana, y la proteína tiene un diámetro físico de solamente unos cuantos nanómetros. Una consecuencia del pequeño tamaño es la capacidad de los nanocuerpos de camélido para enlazarse a los sitios antigénicos que son funcionalmente invisibles para las proteínas de anticuerpo más grandes, es decir, los nanocuerpos de camélido son útiles como reactivos para detectar los antígenos que sean de otra manera crípticos, utilizando las téenicas inmunológicas clásicas, y como posibles agentes terapéuticos. Por consiguiente, todavía otra consecuencia del pequeño tamaño es que un nanocuerpo de camélido puede ser inhibidor como un resultado del enlace a un sitio específico en una ranura o hendidura estrecha de una proteína objetivo y, por consiguiente, puede servir en una capacidad que se parezca más cercanamente a la función de un fármaco de bajo peso molecular clásico, que aquélla de un anticuerpo clásico.

El bajo peso molecular y el tamaño compacto además dan como resultado nanocuerpos de camélido que son extremadamente termoestables, estables a pHs extremos y a la digestión proteolítica, y pobremente antigénicos. Otra consecuencia es que los nanocuerpos de camélido se mueven fácilmente desde el sistema circulatorio hacia los tejidos, e incluso cruzan la barrera hematoencefálica y pueden tratar los trastornos que afecten al tejido nervioso. Los nanocuerpos pueden facilitar adicionalmente el transporte de fármacos a través de la barrera hematoencefálica. Véase la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 20040161738 publicada el 19 de agosto de 2004. Estas características, combinadas con la baja antigenicidad para los seres humanos, indican el gran potencial terapéutico. Además, estas moléculas se pueden expresar completamente en las células procarióticas, tales como de E. coli, y se expresan como proteínas de fusión con los bacteriófagos, y son funcionales.

De conformidad con lo anterior, una característica de la presente invención es un anticuerpo o nanocuerpo de camélido que tiene una alta afinidad por HER3. En ciertas modalidades de la presente, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se produce naturalmente en el animal camélido, es decir, es producido por el camélido en seguida de la inmunización con HER3 o con un fragmento peptídico del mismo, utilizando las téenicas descritas en la presente para otros anticuerpos. De una manera alternativa, el nanocuerpo de camélido que se enlaza al HER3 se diseña, es decir, se produce, mediante una selección, por ejemplo, a partir de una biblioteca de fagos que exhiban las proteínas de nanocuerpos de camélido apropiadamente mutagenizadas, utilizando procedimientos de paneo con LRP6 como un objetivo, como se describe en los Ejemplos de la presente. Los nanocuerpos diseñados se pueden hacer además a la medida mediante ingeniería genética para tener una vida media en un sujeto receptor de 45 minutos a dos semanas. En una modalidad específica, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se obtiene mediante el injerto de las secuencias de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de la cadena pesada o ligera de los anticuerpos humanos de la invención, en las secuencias de estructura del nanocuerpo o del anticuerpo de un solo dominio, como se describe, por ejemplo, en la Publicación Internacional del TCP Número PCT/EP93/02214. En una modalidad, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se enlaza a cuando menos el residuo de aminoácido en el dominio 2 de H ER3 seleccionado a partir de los aminoácidos 265-277 y 315. En una modalidad, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se enlaza a cuando menos el residuo de aminoácido Lys 268 en el dominio 2 de HER3.

Moléculas biespecíficas y anticuerpos multivalentes En otro aspecto, la presente invención proporciona moléculas biparatópicas, biespecíficas o multiespecíficas que comprenden un anticuerpo o un fragmento del mismo que se enlaza a un epítopo dentro del dominio 2 de HER3. El anticuerpo o un fragmento del mismo se puede derivar o enlazar a otra molécula funcional, por ejemplo, a otro péptido o proteína (por ejemplo, a otro anticuerpo o ligando para un receptor), para generar una molécula biespecífica que se enlaza a cuando menos dos sitios de enlace diferentes o moléculas objetivo. El anticuerpo o un fragmento del mismo de hecho, se puede derivar o se puede enlazar a más de otra molécula funcional para generar moléculas biparatópicas o multiespecíficas que se enlacen a más de dos sitios de enlace y/o moléculas objetivo diferentes; tales moléculas biparatópicas o multiespecíficas. Para crear una molécula biespecífica, un anticuerpo o un fragmento del mismo se puede enlazar funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente, o de otra manera) a una o más moléculas de enlace diferentes, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido, o mimético de enlace, de tal manera que resulte una molécula biespecífica.

Se pueden proporcionar otros beneficios clínicos mediante el enlace de dos o más antígenos dentro de un anticuerpo (Coloma y colaboradores (1997); Merchant y colaboradores (1998); Alt y colaboradores (1999); Zuo y colaboradores (2000); Lu y colaboradores (2004); Lu y colaboradores (2005); Marvin y colaboradores (2005); Marvin y colaboradores (2006); Shen y colaboradores (2007); Wu y colaboradores (2007); Dimasi y colaboradores (2009); Michaelson y colaboradores (2009)). (Morrison y colaboradores (1997) Nature Biotech. 15: 159-163; Alt y colaboradores (1999) FEBS Letters 454: 90-94; Zuo y colaboradores (2000) Protein Engineering 13: 361 -367; Lu y colaboradores (2004) JBC 279: 2856-2865; Lu y colaboradores (2005) JBC 280: 19665-19672; Marvin y colaboradores (2005) Acta Pharmacologica Sínica 26: 649-658; Marvin y colaboradores (2006) Curr Opin Drug Disc Develop 9: 184-193; Shen y colaboradores (2007) J Immun Methods 218: 65-74; Wu y colaboradores (2007) Nat Biotechnol. 1 1 : 1290-1297; Dimasi y colaboradores (2009) J Mol Biol. 393: 672-692; y Michaelson y colaboradores (2009) mAbs 1 : 128-141 .

Las moléculas biespecíficas se pueden preparar mediante la conjugación de las especificidades de enlace constitutivas, empleando los métodos conocidos en la téenica. Por ejemplo, cada especificidad de enlace de la molécula biespecífica se puede generar por separado, y entonces se conjugan entre sí, por ejemplo, se pueden utilizar una variedad de agentes de acoplamiento o de reticulación para la conjugación covalente. Los ejemplos de los agentes de reticulación incluyen proteína A, carbodi-imida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis-(ácido 2-nitro-benzoico) (DTNB), o-fenilen-dimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato (SPDP), y sulfosuccinimidil-4-(N-maleimido-metil)-ciclohexan-1 -carboxilato (sulfo-SMCC) (véase, por ejemplo, Karpovsky y colaboradores (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu y colaboradores (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82: 8648). Otros métodos incluyen aquéllos descritos en Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78: 1 18-132; Brennan y colaboradores (1985) Science 229: 81 -83), y Glennie y colaboradores (1987) J. Im munol. 139: 2367-2375). Los agentes de conjugación son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles en Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

Con los anticuerpos, se pueden conjugar mediante enlace de sulfhldrilo de las regiones de articulación del término C de las dos cadenas pesadas. En una modalidad particular, la región de articulación se modifica para contener un número non de residuos de sulfhidrilo, por ejemplo, uno, antes de la conjugación.

De una manera alternativa, ambas especificidades de enlace se pueden codificar en el mismo vector, y se pueden expresar y ensamblar en la misma célula huésped. Este método es en particular útil cuando la molécula biespecífica es una proteína de fusión de mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 ó ligando x Fab. Una molécula biespecífica de la invención puede ser una molécula de una sola cadena que comprenda un anticuerpo de una sola cadena y un determinante de enlace, o una molécula biespecífica de una sola cadena que comprenda dos determinantes de enlace. Las moléculas biespecíficas pueden comprender cuando menos dos moléculas de una sola cadena. Los métodos para la preparación de moléculas biespecíficas se describen, por ejemplo, en Las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,260,203; 5,455,030; 4,881 , 175; 5, 132,405; 5,091 ,513; 5,476,786; 5,013,653; 5,258,498; y 5,482,858.

El enlace de las moléculas biespecíficas a sus objetivos específicos se puede confirmar, por ejemplo, mediante el análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), radiommunoensayo (REA), análisis FACS, bioensayo (por ejemplo, inhibición del crecimiento), o ensayo Western Blot. Cada uno de estos ensayos en términos generales detecta la presencia de los complejos de proteína-anticuerpo de un interés particular, mediante el empleo de un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés.

En otro aspecto, la presente invención proporciona compuestos multivalentes que comprenden cuando menos dos fragmentos idénticos o diferentes de los anticuerpos que se enlazan al HER3.

Los fragmentos de anticuerpos pueden estar enlazados entre sí por medio de fusión de proteína o por medio de un enlace covalente o no covalente. Los compuestos tetravalentes se pueden obtener, por ejemplo, mediante la reticulación de los anticuerpos de la invención con un anticuerpo que se enlace a las regiones constantes de los anticuerpos de la invención, por ejemplo, la Fe o la región de articulación. El dominio trimerizante se describe, por ejemplo, en Borean, Patente Europea Número EP 1012280B 1. Los módulos pentamerizantes se describen, por ejemplo, en la Publicación Internacional del TCP Número PCT/EP97/05897.

En una modalidad, un anticuerpo biparatópico/biespecífico se enlaza a los residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 de HER3.

En otra modalidad, la invención pertenece a anticuerpos de doble función, en donde un solo anticuerpo monoclonal se ha modificado de tal manera que el sitio de enlace al antígeno se enlaza a más de un antígeno, tal como un anticuerpo de doble función que se enlaza tanto al HER3 como a otro antígeno (por ejemplo, HER 1 , HER2, y HER4). En otra modalidad, la invención pertenece a un anticuerpo de doble función que se dirige a los antígenos que tengan la misma conformación, por ejemplo, un antígeno que tenga la misma conformación de HER3 en el estado “cerrado" o "inactivo”. Los ejemplos de los antígenos con la misma conformación de HER3 en el estado “cerrado" o "inactivo” incluyen, pero no se limitan a, HER1 y HER4. Por consiguiente, un anticuerpo de doble función se puede enlazar a HER3 y HER1 ; a HER3 y HER4, o a HER 1 y HER4. La especificidad de enlace doble del anticuerpo de doble función se puede traducir además en una actividad doble, o en la inhibición de actividad. (Vease, por ejemplo, Jenny Bostrom y colaboradores (2009) Science: 323; 1610-1614).

Anticuerpos con una vida media prolongada La presente invención proporciona anticuerpos que se enlazan específicamente con un epítopo dentro del dominio 2 de HER3, los cuales tienen una vida media prolongada ¡n vivo.

Muchos factores pueden afectar a la vida media de una proteína in vivo. Como ejemplos tenemos la filtración renal, el metabolismo en el hígado, la degradación mediante las enzimas proteolíticas (proteasas), y las respuestas inmunogénicas (por ejemplo, la neutralización de la proteína mediante los anticuerpos y la absorción mediante los macrófagos y las células dendríticas). Se pueden emplear una variedad de estrategias para prolongar la vida media de los anticuerpos de la presente invención. Por ejemplo, mediante enlace químico a polietilenglicol (PEG), reCODE PEG, andamiaje de anticuerpo, poli-ácido siálico (PSA), almidón de hidroxi-etilo (HES), ligandos de enlace de albúmina, y protectores de carbohidrato; Mediante la fusión genética a las proteínas que se enlazan a las proteínas del suero, tales como albúmina, IgG, FcRn, y transferrina; mediante el acoplamiento (genético o químico) con otras fracciones de enlace que se enlacen a las proteínas del suero, tales como nanocuerpos, Fabs, DARPins, avímeros, Affibodies, y anticalinas; mediante fusión genética con rPEG, albúmina, dominio de albúmina, proteínas de enlace a la albúmina, y Fe; o mediante su incorporación en nanovehículos, formulaciones de liberación lenta, o dispositivos médicos.

Con el fin de prolongar la circulación en suero de los anticuerpos in vivo, las moléculas poliméricas inertes, tales como el PEG de alto peso molecular, se pueden unir a los anticuerpos o a un fragmento de los mismos, con o sin un enlazador multifuncional, ya sea a través de la conjugación específica del sitio del PEG al término N o C de los anticuerpos, o por medio de los grupos épsilon-amino presentes sobre los residuos de lisina. Para la pegilación, un anticuerpo, el anticuerpo, o el fragmento del mismo, típicamente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG), tal como un derivado de éster reactivo o aldehido de PEG, bajo condiciones en donde uno o más grupos PEG lleguen a unirse al anticuerpo o al fragmento del anticuerpo. La pegilación se puede llevar a cabo mediante una reacción de acilación o mediante una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo). Como se utiliza en la presente, el término “polietilenglicol” pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han utilizado para derivar otras proteínas, tales como mono alcoxilo (de 1 a 10 átomos de carbono)- o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En ciertas modalidades, el anticuerpo que se va a pegilar es un anticuerpo aglicosilado. Se utilizará la derivación del polímero lineal o ramificado que dé como resultado una pérdida mínima de la actividad biológica. El grado de la conjugación se puede monitorear estrechamente mediante SDS-PAGE y espectrometría de masas para asegurar la conjugación apropiada de las moléculas de PEG con los anticuerpos. El PEG sin reaccionar se puede separar de los conjugados de anticuerpo-PEG mediante cromatografía por exclusión de tamaños o de intercambio de iones. Los anticuerpos derivados de PEG se pueden probar para determinar su actividad de enlace, así como su eficacia in vivo, empleando los métodos bien conocidos por las personas expertas en la materia, por ejemplo, mediante los inmunoensayos descritos en la presente. Los métodos para pegilar proteínas se conocen en la téenica, y se pueden aplicar a los anticuerpos de la invención. Véase, por ejemplo, la Patente Europea Número EP 0 154 316 por Nishimura y colaboradores, y la Patente Europea Número EP 0 401 384 por Ishikawa y colaboradores Otras tecnologías de pegilación modificadas incluyen la tecnología de reconstitución de ingeniería dirigida químicamente ortogonal (ReCODE PEG), la cual incorpora cadenas laterales químicamente especificadas en las proteínas biosintéticas, por medio de un sistema reconstituido que incluye la sintetasa de tARN y el tARN. Esta tecnología hace posible la incorporación de más de 30 nuevos aminoácidos en las proteínas biosintéticas en E.coli, levadura, y células de mamífero. El tARN incorpora un aminoácido no activo en cualquier lugar en que se coloque un codón ámbar, convirtiendo el ámbar desde un codón de paro hasta uno que señaliza la incorporación del aminoácido químicamente especificado.

La tecnología de pegilación recombinante (rPEG) también se puede utilizar para prolongar la vida media en suero. Esta teenología involucra fusionar geneticamente una cola de proteína no estructurada de 300 a 600 aminoácidos con una proteína farmacéutica existente. Debido a que el peso molecular aparente de esta cadena de proteína no estructurada es aproximadamente 15 veces mayor que su peso molecular real, aumenta mucho la vida media en suero de la proteína. En contraste con la PEGilación tradicional, la cual requiere de conjugación química y re-purificación, el proceso de elaboración se simplifica mucho, y el producto es homogéneo.

La poli-sialilación es otra tecnología, la cual utiliza el polímero natural de poli-ácido siálico (PSA) para prolongar la vida activa y mejorar la estabilidad de los péptidos y proteínas terapéuticas. El poli-ácido siálico (PSA) es un polímero de ácido siálico (un azúcar). Cuando se utiliza para el suministro de fármacos de proteínas y péptidos terapéuticos, el poli-ácido siálico proporciona un micro-medio ambiente protector en la conjugación. Esto aumenta la vida activa de la proteína terapéutica en la circulación, e impide que sea reconocida por el sistema inmunológico. El polímero de poli-ácido siálico (PSA) se encuentra naturalmente en el cuerpo humano. Fue adoptado por ciertas bacterias que evolucionaron durante millones de años para recubrir sus paredes con el mismo. Entonces estas bacterias naturalmente poli-sialiladas fueron capaces, en virtud de la imitación molecular, de recubrir el sistema de defensa del cuerpo. El poli-ácido siálico (PSA), lo último en tecnología de protección de la naturaleza, se puede producir fácilmente a partir de estas bacterias en grandes cantidades y con características físicas previamente determinadas. El poli-ácido siálico (PSA) bacteriano es completamente no inmunogenico, incluso cuando se acopla a las proteínas, debido a que es químicamente idéntico al poli-ácido siálico (PSA) del cuerpo humano.

Otra teenología incluye el uso de derivados de almidón de h id roxi-eti lo (“HES”) enlazado a los anticuerpos. El almidón de hidroxi-etilo (HES) es un polímero natural modificado derivado a partir del almidón de maíz ceroso, y puede ser metabolizado por las enzimas del cuerpo. Las soluciones de almidón de hidroxi-etilo (HES) se administran usualmente para sustituir el volumen sanguíneo deficiente y para mejorar las propiedades Teológicas de la sangre. La HESilación de un anticuerpo hace posible la prolongación de la vida media en la circulación, mediante el aumento de la estabilidad de la molécula, así como mediante la reducción de la eliminación renal, dando como resultado un aumento de la actividad biológica. Mediante la variación de diferentes parámetros, tales como el peso molecular del almidón de hidroxi-etilo (HES), se puede hacer a la medida una amplia gama de conjugados de anticuerpos de almidón de hidroxi-etilo (HES).

También se pueden generar anticuerpos que tengan un aumento de su vida media ¡n vivo mediante la introducción de una o más modificaciones de aminoácidos (es decir, sustituciones, inserciones o supresiones) en un dominio constante de IgG, o un fragmento de enlace a FcRn del mismo (de preferencia un fragmento de dominio Fe o de Fe de articulación). Vease, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO 98/23289; la Publicación Internacional Número WO 97/34631 ; y la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,277,375.

Además, los anticuerpos se pueden conjugar con albúmina con el objeto de hacer que el anticuerpo o el fragmento del anticuerpo sea más estable in vivo o de que tenga una vida media más larga in vivo. Las téenicas son bien conocidas en este campo, véanse, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales Números WO 93/15199, WO 93/15200, y WO 01 /77137; y la Patente Europea Número EP 413,622.

El anticuerpo de HER3 o un fragmento del mismo también se puede fusionar con uno o más de albúmina de suero humano (HSA) polipéptidos, o una porción de los mismos. La albúmina de suero humano (HSA), una proteína de 585 aminoácidos en su forma madura, es responsable de una proporción significativa de la presión osmótica del suero, y también funciona como un vehículo de ligandos endógenos y exógenos. La función de la albúmina como una molécula portadora y su naturaleza inerte, son propiedades deseables para utilizarse como un vehículo y transportador de polipéptidos in vivo. El uso de albúmina como el componente de una proteína de fusión de albúmina como un vehículo para diversas proteínas se ha sugerido en la Publicación Internacional Número WO 93/15199, en la Publicación Internacional Número WO 93/15200, y en la Patente Europea Número EP 413 622. Tambien se ha propuesto el uso de los fragmentos N-terminales de la albúmina de suero humano (HSA) para las fusiones con polipéptidos (Patente Europea Número EP 399 666). De conformidad con lo anterior, mediante la fusión o conjugación genética o química de los anticuerpos o fragmentos de los mismos con la albúmina, se puede estabilizar o prolongar la vida media, y/o se puede conservar la actividad de la molécula durante períodos de tiempo prolongados en solución, in vitro y/o in vivo.

La fusión de la albúmina con otra proteína se puede lograr mediante manipulación genética, de tal manera que el ADN que codifique la albúmina de suero humano (HSA), o un fragmento del mismo, se una al ADN que codifique la proteína. Entonces se transforma o se transfecta un huésped adecuado con las secuencias de nucleótidos fusionadas, arregladas de tal manera sobre un plásmido adecuado, que expresen un polipéptido de fusión. La expresión se puede efectuar in vitro, por ejemplo, a partir de células procarióticas o eucarióticas, o in vivo, por ejemplo, a partir de un organismo transgénico. Se pueden encontrar métodos adicionales pertenecientes a las fusiones de la albúmina de suero humano (HSA), por ejemplo, en las Publicaciones Internacionales Números WO 2001077137 y WO 200306007, incorporadas a la presente como referencia. En una modalidad específica, la expresión de la proteína de fusión se lleva a cabo en líneas celulares de mamífero, por ejemplo, en líneas celulares CHO. El enlace diferencial alterado de un anticuerpo a un receptor a pHs bajos o altos también se contempla dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, la afinidad de un anticuerpo se puede modificar de tal manera que permanezca enlazado a su receptor a un pH bajo, por ejemplo, el pH bajo dentro de un lisosoma, mediante la modificación del anticuerpo para incluir aminoácidos adicionales, tales como una histidina en una región determinante de complementariedad (CDR) del anticuerpo (vease, por ejemplo, Tomoyuki Igawa y colaboradores (2010) Nature Biotechnology; 28, 1203-1207).

Conjugados de anticuerpos La presente invención proporciona anticuerpos o fragmentos de los mismos que se enlazan específicamente a HER3 recombinantemente fusionado o químicamente conjugado (incluyendo las conjugaciones tanto covalentes como no covalentes) a una proteína o polipéptido heterólogo (o fragmento del mismo, de preferencia a un polipéptido de cuando menos 10, de cuando menos 20, de cuando menos 30, de cuando menos 40, de cuando menos 50, de cuando menos 60, de cuando menos 70, de cuando menos 80, de cuando menos 90 ó de cuando menos 100 aminoácidos) para generar proteínas de fusión. En particular, la invención proporciona proteínas de fusión que comprenden un fragmento de anticuerpo descrito en la presente (por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento F(ab)2, un dominio VH, una CDR VH, un dominio VL o una CDR VL), y una proteína, polipéptido, o péptido heterólogo. Los métodos para fusionar o conjugar proteínas, polipéptidos, o péptidos a un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo son conocidos en la materia. Veanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851 , y 5, 1 12,946; las Patentes Europeas Números EP 307,434 y EP 367, 166; las Publicaciones Internacionales Números WO 96/04388 y WO 91 /06570; Ashkenazi y colaboradores (1991 ) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 88: 10535-10539; Zheng y colaboradores (1995) J. Immunol. 154: 5590-5600; y Vil y colaboradores (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89: 1 1337-1 1341 .

Se pueden generar proteínas de fusión adicionales a través de las téenicas de mezcla de genes, mezcla de motivos, mezcla de exones, y/o mezcla de codones (colectivamente referidos como “mezcla de ADN”). La mezcla de ADN se puede emplear para alterar las actividades de los anticuerpos de la invención o los fragmentos de los mismos (por ejemplo, los anticuerpos o los fragmentos de los mismos con afinidades más altas e índices de disociación más bajos). Véanse, en términos generales, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,605,793; 5,81 1 ,238; 5,830,721 ; 5,834,252; y 5,837,458; Patten y colaboradores (1997) Curr. Opinión Biotechnol. 8: 724-33; Harayama, (1998) Trends Biotechnol. 16(2): 76-82; Hansson y colaboradores (1999) J. Mol. B i o 1. 287: 265-76; y Lorenzo y Blasco, (1998) Biotechniques 24(2): 308-313 (cada una de estas patentes y publicaciones se incorpora a la presente como referencia en su totalidad). Los anticuerpos o fragmentos de los mismos, o los anticuerpos codificados o fragmentos de los mismos, se pueden alterar sometiéndolos a mutagénesis aleatoria mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) susceptible a error, inserción aleatoria de nucleótido, o mediante otros métodos antes de la recombinación. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo o un fragmento del mismo que se enlaza específicamente a una proteína de HER3, se puede recombinar con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas.

Más aún, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se pueden fusionar con secuencias marcadoras, tales como un péptido, con el objeto de facilitar la purificación. En las modalidades preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexa-histidina, tal como la marca proporcionada en un vector pQE (QIAGEN , Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 9131 1 ), entre otras, muchas de las cuales están comercialmente disponibles. Como se describe en Gentz y colaboradores (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 86: 821 -824, por ejemplo, la hexa-histidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras marcas de péptidos útiles para la purificación incluyen, pero no se limitan a, la marca de hemaglutinina (“HA”), la cual corresponde a un epítopo derivado a partir de la proteína de hemaglutinina de influenza (Wilson y colaboradores (1984) Cell 37: 767), y la marca “flag”.

En otras modalidades, los anticuerpos de la presente invención o fragmentos de los mismos, se conjugan con un agente de diagnóstico o detectable. Estos anticuerpos pueden ser útiles para monitorear o pronosticar el establecimiento, desarrollo, progreso y/o la gravedad de una enfermedad o de un trastorno como parte de un procedimiento de prueba clínica, tal como determinar la eficacia de una terapia particular. Este diagnóstico y detección se puede llevar a cabo mediante el acoplamiento del anticuerpo con sustancias detectables, incluyendo, pero no limitándose a, diversas enzimas, tales como, pero no limitándose a, peroxidasa de radícula roja, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetil-colinesterasa; grupos protésicos, tales como, pero no limitándose a, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, tales como, pero no limitándose a, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, dicloro-triazinil-amina-fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes, tales como, pero no limitándose a, luminol; biomateriales luminiscentes, tales como, pero no limitándose a, luciferasa, luciferina, y acuorina; materiales radioactivos, tales como, pero no limitándose a, yodo (131 l, 125l, 123l, y 1211 ,), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (115ln, 113l n , 112I n , y 11 11 n , ) , teenecio (99Tc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno ("Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166hlo, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97RU , 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, y 117Tin ; y metales emisores de positrones utilizando diferentes tomografías de emisión de positrones, y iones de metales paramagnéticos no radioactivos.

La presente invención abarca además los usos de los anticuerpos o fragmentos de los mismos conjugados con una fracción terapeutica. Un anticuerpo o un fragmento del mismo, se puede conjugar con una fracción terapéutica, tal como una citotoxina, por ejemplo, un agente citostático o citocida, un agente terapéutico o un ion de metal radioactivo, por ejemplo, emisores-alfa. Una citotoxina o un agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células.

Además, un anticuerpo o un fragmento del mismo se puede conjugar con una fracción terapéutica o una fracción de fármaco que se modifique para dar una respuesta biológica. Las fracciones terapéuticas o las fracciones de fármaco no deben interpretarse como limitadas a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la fracción de fármaco puede ser una proteína, péptido, o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Estas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, toxina de cólera, o toxina de difteria; una proteína, tal como factor de necrosis tumoral, a-interferón, b-interferón, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador de plasminógeno de tejido, un agente apoptótico, un agente anti-angiogénico; o, un modificador de la respuesta biológica, tal como, por ejemplo, una linfocina. En una modalidad, el anticuerpo de HER3 o un fragmento del mismo, se conjuga con una fracción terapéutica, tal como una citotoxina, un fármaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o una radiotoxina. Estos conjugados son referidos en la presente como “inmunoconjugados”. Los ¡nmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas son referidos como “inmunotoxinas”. Una citotoxina o un agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para (por ejemplo, que aniquile a) las células. Los ejemplos incluyen taxón, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, t. colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi-antracina-diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1 -deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina, y los análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos también incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercapto-purina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluoro-uracil-decarbazina), agentes de ablación (por ejemplo, mecloretamina, tiotepa-clorambucil, melfalano, carmustina (BSNU), y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfano, dibromo-manitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cis-dicloro-diamina-platino (II) (DDP) cisplatina, antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina), y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC)), y agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). (Véase, por ejemplo, Seattle Genetics, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US20090304721 ).

Otros ejemplos de las citotoxinas terapéuticas que se pueden conjugar con un anticuerpo de la invención o con un fragmento del mismo, incluyen duocarmicinas, caliqueamicinas, maytansinas y auristatinas, y derivados de las mismas. Un ejemplo de un anticuerpo de caliqueamicina conjugado está comercialmente disponible (MylotargMR; Wyeth-Ayerst).

Las citotoxinas se pueden conjugar con los anticuerpos de la invención o con los fragmentos de los mismos, utilizando la teenología de enlazadores disponible en la materia. Los ejemplos de los tipos de enlazadores que se han utilizado para conjugar una citotoxina a un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, hidrazonas, tioeteres, ésteres, disulfuros y enlazadores que contienen péptidos. Se puede seleccionar un enlazador, es decir, por ejemplo, que sea susceptible a la disociación mediante un bajo pH dentro del compartimiento lisosomal, o que sea susceptible a la disociación mediante las proteasas, tales como las proteasas preferencialmente expresadas en el tejido tumoral, tales como las catepsinas (por ejemplo, las catepsinas B, C, D).

Para una discusión adicional de los tipos de citotoxinas, enlazadores y métodos para conjugar los agentes terapéuticos a los anticuerpos, véanse también Saito y colaboradores (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 199-215; Trail y colaboradores (2003) Cáncer Immunol. Immunother. 52: 328-337; Payne, (2003) Cáncer Cell 3: 207-212; Alien, (2002) Nat. Rev. Cáncer 2: 750-763; Pastan y Kreitman, (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3: 1089-1091 ; Senter y Springer, (2001 ) Adv. Drug Deliv. Rev. 53: 247-264.

Los anticuerpos de la presente invención o los fragmentos de los mismos, tam bién se pueden conjugar con un isótopo radioactivo para generar productos radiofarmacéuticos citotóxicos, también referidos como radiommunoconjugados. Los ejemplos de los isótopos radioactivos que se pueden conjugar con los anticuerpos para utilizarse diagnósticamente o terapéuticamente incluyen, pero no se limitan a, yodo131 , indio1 1 1 , itrio90, y lutecio177. Los métodos para la preparación de los radioinmunoconjugados están establecidos en la materia. Los ejemplos de los radioinmunoconjugados están comercialmente disponibles, incluyendo ZevalinMR (DEC Pharmaceuticals), y BexxarMR (Corixa Pharmaceuticals), y se pueden emplear métodos similares para preparar los radioinmunoconjugados utilizando los anticuerpos de la invención. En ciertas modalidades, el quelato macrocíclico es el ácido 1 ,4,7,10-tetra-azaciclododecan-N,N’,N”,N’”-tetra-acético (DOTA), el cual se puede unir al anticuerpo por medio de una molécula enlazadora. Estas moléculas enlazadoras son comúnmente conocidas en la materia y se describen en Denardo y colaboradores (1998) Clin Cáncer Res. 4(10): 2483-90; Peterson y colaboradores (1999) Bioconjug. Chem. 10(4): 553-7; y Zimmerman y colaboradores (1999) Nucí. Med. Biol. 26(8): 943-50, cada uno incorporado como referencia en su totalidad.

Las téenicas para conjugar las fracciones terapéuticas a los anticuerpos son bien conocidas, véase, por ejemplo, Arnon y colaboradores, “Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cáncer Therapy”, en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Reisfeld y colaboradores (Editores), páginas 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom y colaboradores, “Antibodies for Drug Delivery”, en Controlled Drug Delivery (2a Edición), Robinson y colaboradores (Editores), páginas 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cáncer Therapy: A Review”, en Monoclonal Antibodies 84: Biological and Clinical Applications, Pinchera y colaboradores (Editores), páginas 475-506 (1985); “Analysis, Results, and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody in Cáncer Therapy”, en Monoclonal Antibodies for Cáncer Detection and Therapy, Baldwin y colaboradores (Editores), páginas 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe y colaboradores (1982) Immunol. Rev. 62: 1 19-58.

Los anticuerpos tambien se pueden unir a soportes sólidos, que son particularmente útiles para los inmunoensayos o para la purificación del antígeno objetivo. Estos soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, poli-cloruro de vinilo o polipropileno.

Combinaciones de anticuerpos En otro aspecto, la invención pertenece a anticuerpos de HER3, o a fragmentos de los mismos de la invención, utilizados con otros agentes terapéuticos, tales como otros anticuerpos, inhibidores de molécula pequeña, inhibidores de mTOR, o inhibidores de cinasa PI3. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: Inhibidores de HER1: Los anticuerpos de HER3 o los fragmentos de los mismos se pueden utilizar con inhibidores de HER1 , los cuales incluyen, pero no se limitan a, Matuzumab (EMD72000), Erbitux®/Cetuximab (Imclone), Vectibix®/Panitumumab (Amgen), mAb 806, y Nimotuzumab (TheraCIM), lressa®/Gefitinib (Astrazeneca); CI-1033 (PD183805) (Pfizer), Lapatinib (GW-572016) (GlaxoSmithKline), Tykerb®/Ditosilato de Lapatinib (SmithKline Beecham), Tarceva®/Erlotinib HCL (OSI-774) (OSI Pharma), y PKI-166 (Novartis), y N-[4-[(3-cloro-4-fluoro-fenil)-amino]-7-[[(3"S")-tetrahidro-3-furanil]-oxi]-6-qumazolinil]-4-(dimetil-amino)-2-butenamida, vendida bajo el nombre comercial Tovok® por Boehringer Ingelheim).

Inhibidores de HER2: Los anticuerpos de HER3 o los fragmentos de los mismos, se pueden utilizar con los inhibidores de HER2, los cuales incluyen, pero no se limitan a, Pertuzumab (vendido bajo la marca comercial registrada Omnitarg® por Genentech), Trastuzumab (vendido bajo la marca comercial registrada Herceptin® por Genentech/Roche), MM-1 1 1 , neratinib (tambien conocido como HKI-272, (2 E)- N-[4-[[3-cloro-4-[(pirid i h-2-i I)-metoxi]-fenil]-amino]-3-ciano-7-etoxi-quinolin-6-il]-4-(dimetil-amino)-but-2-enamida, y descrita en la Publicación Internacional del TCP Número WO 05/028443), lapatinib o Ditosilato de Lapatinib (vendido bajo la marca comercial registrada Tykerb® por GlaxoSmithKline.

Inhibidores de HER3: Los anticuerpos de HER3 o los fragmentos de los mismos se pueden utilizar con los inhibidores de HER3, los cuales incluyen, pero no se limitan a, MM-121 , MM-11 1 , IB4C3, 2DID12 (U3 Pharma AG), AMG888 (Amgen), AV-203 (Aveo), MEHD7945A (Genentech), y moléculas pequeñas que inhiben HER3.

Inhibidores de HER4: Los anticuerpos de HER3 o los fragmentos de los mismos, se pueden utilizar con inhibidores de HER4.

Inhibidores de PI3K: Los anticuerpos de HER3 o los fragmentos de los mismos, se pueden utilizar con inhibidores de cinasa PI3, los cuales incluyen, pero no se limitan a, 4-[2-(1 H-indazol-4-il)-6-[[4-(metil-sulfonil)-piperazin-1-il]-metil]-tieno-[3,2-d]-pirimidin-4-¡l]-morfolina (tambien conocida como GDC 0941 y descrita en las Publicaciones Internacionales del TCP Números WO 09/036082 y WO 09/055730), 2-metil-2-[4-[3-metil-2-oxo-8-(qumolin-3-il)-2,3-dihidro-imidazo-[4,5-c]-quinol¡n-1 -il]-fenil]-propionitrilo (también conocido como BEZ 235 ó NVP-BEZ 235, y descrito en la Publicación Internacional del TCP Número WO 06/122806), BMK120 y BYL719.

Inhibidores de mTOR: Los anticuerpos de HER3 o los fragmentos de los mismos, se pueden utilizar con los inhibidores de mTOR, los cuales incluyen, pero no se limitan a, Temsirolimus (vendido bajo el nombre comercial Torisel® por Pfizer), ridaforolimus (formalmente conocido como deferolimus, dimetil-fosfinato de (1 R,2R,4S)-4-[(2R)-2-[(1 R,9S,12S, 15R,16E, 18R, 19R,21 R,23S,24E, 26E,28Z,30S,32S,35R)-1 , 18-dihidroxi-19,30-dimetoxi-15,17,21 ,23,29, 35-hexametil-2,3,10,14,20-pentaoxo-1 1 ,36-dioxa-4-aza-triciclo-[30.3.1.04, 9]-hexatriaconta- 16, 24,26, 28-tetraen-12-il]-propil]-2-metoxi-ciclohexilo, también conocido como Deferolimus, AP23573 y M K8669 (Ariad Pharm .), y descrito en la Publicación Internacional del TCP Número WO 03/064383), everolimus (RAD001 ) (vendido bajo el nombre comercial Afinitor® por Novartis). Se pueden administrar uno o más agentes terapéuticos ya sea simultáneamente o bien antes o después de la administración de un anticuerpo de HER3 o un fragmento del mismo de la presente invención.

Métodos para la producción de los anticuerpos de la invención (i) Ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos La invención proporciona moléculas de ácidos nucleicos sustancialmente purificadas que codifican polipéptidos que comprenden segmentos o dominios de las cadenas del anticuerpo de HER3 descrito anteriormente. Algunos de los ácidos nucleicos de la invención comprenden la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo de HER3 y/o la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de cadena ligera. En una modalidad específica, las moléculas de ácidos nucleicos son aquéllas identificadas en la Tabla 1. Algunas otras moléculas de ácidos nucleicos de la invención comprenden secuencias de nucleótidos que son sustancialmente idénticas (por ejemplo, cuando menos el 80 por ciento, 90 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, o 99 por ciento) a las secuencias de nucleótidos de aquéllas identificadas en la Tabla 1. Cuando se expresan a partir de los vectores de expresión apropiados, los polipéptidos codificados para estos polinucleótidos son capaces de exhibir capacidad de enlace al antígeno de HER3.

En la invención también se proporcionan polinucleótidos que codifican cuando menos una región determinante de complementariedad (CDR) y usualmente todas las tres regiones determinantes de complementariedad (CDRs) a partir de la cadena pesada o ligera del anticuerpo o del fragmento del mismo estipulado anteriormente. Algunos otros polinucleótidos codifican toda o sustancialmente toda la secuencia de la región variable de la cadena pesada y/o de la cadena ligera del anticuerpo o del fragmento del mismo estipulado anteriormente. Debido a la degeneración del código, una variedad de secuencias de ácidos nucleicos codificarán cada una de las secuencias de aminoácidos de inm unoglobulina.

Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención pueden codificar tanto una región variable como una región constante del anticuerpo. Algunas de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención comprenden nucleótidos que codifican una secuencia de región variable de cadena pesada madura que es sustancialmente idéntica (por ejemplo, cuando menos el 80 por ciento, 90 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, o 99 por ciento) a la secuencia de región variable de cadena pesada madura de un anticuerpo de HER3, estipulada en la Tabla 1. Algunas otras secuencias de ácidos nucleicos que comprenden nucleótidos que codifican una secuencia de la región variable de cadena ligera madura que es sustancialmente idéntica (por ejemplo, cuando menos el 80 por ciento, 90 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, o 99 por ciento) a la secuencia de la región variable de cadena ligera madura de un anticuerpo de HER3 estipulado en la Tabla 1.

Las secuencias de polinucleótidos se pueden producir mediante la síntesis de ADN en fase sólida de novo o mediante mutagenesis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de una secuencia existente que codifica el anticuerpo el fragmento del mismo. La síntesis química directa de ácidos nucleicos se puede llevar a cabo mediante los métodos conocidos en la téenica, tales como el método de fosfo-triéster de Narang y colaboradores (1979) Meth. Enzymol. 68: 90; el método de fosfodiéster de Brown y colaboradores (1979) Meth. Enzymol. 68: 109; el método de dietil-fosforamidita de Beaucage y colaboradores (1981 ) Tetra. Lett., 22: 1859; y el método de soporte sólido de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,458,066. La introducción de mutaciones a una secuencia de polinucleótido mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se puede llevar a cabo como se describe, por ejemplo, en PCR Technology: Principies and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Editor), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis y colaboradores (Editores), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila y colaboradores (1991 ) Nucleic Acids Res. 19: 967; y Eckert y colaboradores (1991 ) PCR Methods and Applications 1 : 17.

En la invención también se proporcionan vectores de expresión y células huésped para producir los anticuerpos o los fragmentos de los mismos. Se pueden emplear diferentes vectores de expresión para expresar los polinucleótidos que codifican las cadenas del anticuerpo o los fragmentos del mismo. Se pueden utilizar vectores de expresión tanto basados en virus como no virales, con el fin de producir los anticuerpos en una célula huésped de mamífero. Los vectores y sistemas no virales incluyen plásmidos, vectores episomales, típicamente con un casete de expresión para expresar una proteína o un ARN, y cromosomas artificiales humanos (véase, por ejemplo, Harrington y colaboradores (1997) Nat Genet 15: 345). Por ejemplo, los vectores no virales útiles para la expresión de los polinucleótidos y polipéptidos que se enlazan al HER3 en células de mamífero (por ejemplo, humanas) incluyen pTioHis A, B y C, pcDNA3.1 /His, pEBVHis A, B y C, (Invitrogen, San Diego, CA), vectores M PSV, y otros numerosos vectores conocidos en la materia para expresar otras proteínas. Los vectores virales útiles incluyen los vectores basados en retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus de Herpes, vectores basados en SV40, virus de papiloma, virus HBP Epstein Barr, vectores de virus de vacuna, y virus de Semliki Forest (SFV). Véanse, Brent y colaboradores (1995) supra\ Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49: 807; y Rosenfeld y colaboradores (1992) Cell 68: 143.

La elección del vector de expresión depende de las células huésped pretendidas en las que se vaya a expresar el vector.

Típicamente, los vectores de expresión contienen un promotor y otras secuencias reguladoras (por ejemplo, potenciadoras) que se enlacen operativamente a los polinucleótidos que codifiquen una cadena del anticuerpo o de un fragmento del mismo. En algunas modalidades, se emplea un promotor inducible para prevenir la expresión de las secuencias insertadas, excepto bajo condiciones de inducción. Los promotores inducibles incluyen, por ejemplo, arabinosa, lacZ, el promotor de metalotioneína, o un promotor de choque por calor. Los cultivos de los organismos transformados se pueden expandir bajo condiciones no inductores sin forzar a la población para codificar secuencias cuyos productos de expresión sean mejor tolerados por las células huésped. En adición a los promotores, también se pueden requerir o desear otros elementos reguladores para la expresión eficiente de una cadena del anticuerpo o de un fragmento del mismo. Estos elementos típicamente incluyen un codón de inicio de ATG y el sitio de enlace de ribosoma adyacente, u otras secuencias. En adición, se puede mejorar la eficiencia de la expresión mediante la inclusión de potenciadores apropiados para el sistema celular en uso (véanse, por ejemplo, Scharf y colaboradores (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 125; y Bittner y colaboradores (1987) Meth. Enzymol. , 153: 516). Por ejemplo, se puede utilizar el potenciador de SV40 o el potenciador de CMV para aumentar la expresión en células huésped de mam ífero.

Los vectores de expresión también pueden proporcionar una posición de secuencia de señal de secreción para formar una proteína de fusión con los polipéptidos codificados por las secuencias insertadas del anticuerpo o del fragmento. Más frecuentemente, las secuencias insertadas del anticuerpo o del fragmento se enlazan a las secuencias de señales antes de incluirse en el vector. Los vectores para utilizarse con el fin de recibir las secuencias que codifiquen los dominios variables de cadena ligera y pesada del anticuerpo o del fragmento, algunas veces tambien codifican las regiones constantes o partes de las mismas. Estos vectores permiten la expresión de las regiones variables como proteínas de fusión, conduciendo las regiones constantes de esta manera a la producción de los anticuerpos intactos o fragmentos de los mismos. Típicamente, estas regiones constantes son humanas.

Las células huésped para alojar y expresar las cadenas del anticuerpos o del fragmento, pueden ser ya sea procarióticas o bien eucarióticas. E. coli es un huésped procariótico útil para la clonación y expresión de los polinucleótidos de la presente invención. Otros huéspedes microbianos adecuados para usarse incluyen bacilos, tales como Bacillus subtilis , y otras enterobacteriáceas, tales como Salmonela, Serratia, y diferentes especies de Pseudomonas. En estos huéspedes procarióticos, también se pueden hacer vectores de expresión, los cuales típicamente contienen secuencias de control de expresión compatibles con la célula huésped (por ejemplo, un origen de replicación). En adición, estará presente cualquier número de una variedad de promotores bien conocidos, tales como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp), un sistema promotor de beta-lactamasa, o un sistema promotor a partir del fago lambda. Los promotores típicamente controlan la expresión, opcionalmente con una secuencia operadora, y tienen secuencias de sitio de enlace al ribosoma y similares, para iniciar y realizar la transcripción y la traducción. También se pueden emplear otros microbios, tales como levadura, para expresar los anticuerpos o los fragmentos de los mismos. También se pueden utilizar células de insectos en combinación con los vectores de baculovirus.

En algunas modalidades preferidas, se utilizan células huésped de mamífero para expresar y producir los anticuerpos o los fragmentos de los mismos. Por ejemplo, pueden ser cualquiera de una línea celular de hibridoma que exprese los genes de inmunoglobulina endógenos, o una línea celular de mamífero que aloje u vector de expresión exógeno. Éstas incluyen cualquier célula animal o humana mortal normal o normal o inmortal anormal. Por ejemplo, se han desarrollado un número de líneas de células huésped adecuadas capaces de secretar las inmunoglobulinas intactas, incluyendo las líneas celulares CHO, diferentes líneas celulares Cos, células HeLa, líneas celulares de mieloma, células-B transformadas, e hibridomas. El uso del cultivo celular de tejido de mamífero para expresar polipéptidos se discute en términos generales, por ejemplo, en Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N .Y. , N .Y. , 1987. Los vectores de expresión para las células huésped de mamífero pueden incluir secuencias de control de expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, y un potenciador (véase, por ejemplo, Queen y colaboradores (1986) Immunol. Rev. 89: 49-68), y los sitios de información de procesamiento necesarios, tales como los sitios de enlace de ribosoma, sitios de empalme de ARN , sitios de poliadenilación, y secuencias terminadoras de transcripción. Estos vectores de expresión usualmente contienen promotores derivados a partir de genes de mamífero o a partir de virus de mamífero. Los promotores adecuados pueden ser constitutivos, específicos del tipo de celula, específicos de la etapa, y/o modulables o regulables. Los promotores útiles incluyen, pero no se limitan a, el promotor de metalotioneína, el promotor tardío mayor de adenovirus constitutivo, el promotor de MMTV inducidle por dexametasona, el promotor de SV40, el promotor de MRP pollll, el promotor constitutivo de MPSV, el promotor de CMV inducidle por tetracielina (tal como el promotor de CMV humano inmediato-temprano), el promotor constitutivo de CMV, y las combinaciones de promotor-potenciador conocidas en la materia.

Los métodos para introducir vectores de expresión que contienen las secuencias de polinucleótidos de interés varían dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, comúnmente se utiliza la transfección con cloruro de calcio para las células procarióticas, mientras que se puede utilizar el tratamiento con fosfato de calcio o la electroporación para otros huéspedes celulares. (Véase en general Sambrook y colaboradores, supra). Otros métodos incluyen, por ejemplo, electroporación, tratamiento con fosfato de calcio, transformación mediada por liposomas, inyección y micromyección, métodos balísticos, virosomas, inmunoMposomas, conjugados de policatión : ácido nucleico, ADN desnudo, viriones artificiales, fusión con la proteína estructural VP22 del virus de Herpes (Elliot y O'Hare, (1997) Cell 88: 223), absorción del ADN potenciada por el agente, y transducción ex vivo. Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de las proteínas recombinantes, con frecuencia se deseará una expresión estable. Por ejemplo, se pueden preparar líneas celulares que expresen establemente las cadenas de los anticuerpos o los fragmentos, utilizando los vectores de expresión de la invención que contengan orígenes de replicación viral o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable. En seguida de la introducción del vector, se puede permitir que las celulas crezcan durante 1 a 2 días en un medio enriquecido antes de cambiarse al medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento de las células que expresen con éxito las secuencias introducidas en el medio selectivo. Las células establemente transfectadas resistentes se pueden hacer proliferar utilizando las téenicas de cultivo de tejido apropiadas para el tipo de célula. (ii) Generación de los anticuerpos monoclonales de la invención Los anticuerpos monoclonales (mAbs) se pueden producir mediante una variedad de técnicas, incluyendo la metodología convencional de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la técnica de hibridación de células somáticas convencional de Kohler y Milstein, (1975) Nature 256: 495. Se pueden emplear muchas teenicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos-B.

Un sistema animal para la preparación de hibridomas es el sistema de murino. La producción de hibridoma en el ratón es un procedimiento bien establecido. Los protocolos de inmunización y las técnicas para el aislamiento de los esplenocitos inmunizados para la fusión son conocidos en la materia. También se conocen los componentes de fusión (por ejemplo, las células de mieloma de murino) y los procedimientos de fusión.

Los anticuerpos quiméricos o humanizados de la presente invención se pueden preparar basándose en la secuencia de un anticuerpo monoclonal de murino preparado como se describe anteriormente. El ADN que codifica las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera se puede obtener a partir del hibridoma de murino de interés, y se diseña para contener secuencias de ¡nmunoglobulina que no sean de murino (por ejemplo, humanas), utilizando técnicas convencionales de biología molecular. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables de murino se pueden enlazar a las regiones constantes humanas empleando los métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,816,567 a Cabilly y colaboradores). Para crear un anticuerpo humanizado, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de murino se pueden insertar en una estructura humana empleando los métodos conocidos en la téenica. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5225539 a Winter, y las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5530101 ; 5585089; 5693762 y 6180370 a Queen y colaboradores En cierta modalidad, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales humanos. Estos anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra HER3 se pueden generar utilizando ratones transgénicos o transcromosómicos portadores de partes del sistema inmunológico humano en lugar del sistema de ratón.. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen los ratones referidos en la presente como ratones HuMAb y ratones KM , respectivamente, y son colectivamente referidos en la presente como “ratones de Ig humana”.

El ratón HuMAb® (Medarex, Inc.) contiene miniloci del gen de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina humanas no reconfiguradas de cadena pesada (m y g) y ligera K, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci endógenos de cadena m y k (véase, por ejemplo, Lonberg y colaboradores (1994) Nature 368(6474): 856-859). De conformidad con lo anterior, los ratones exhiben una expresión reducida de IgM o k de ratón, y en respuesta a la inmunización, los transgenes humanos de cadena pesada y ligera introducidos experimentan cambio de clase y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales de IgGx humanos de alta afinidad (Lonberg y colaboradores (1994) supra revisado en Lonberg, (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 1 13: 49-101 ; Lonberg y Huszar, (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, y Harding y Lonberg, (1995) Ann. N . Y. Acad . Sci. 764: 536-546). La preparación y uso de ratones HuMAb, y las modificaciones genómicas portadas por estos ratones, se describe además en Taylor y colaboradores (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen y colaboradores (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon y colaboradores (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 94: 3720-3724; Choi y colaboradores (1993) Nature Genetics 4: 1 17-123; Chen y colaboradores (1993) EMBO J. 12: 821 -830; Tuaillon y colaboradores (1994) J. Immunol. 152: 2912-2920; Taylor y colaboradores (1994) International Immunology 579-591 ; y Fishwild y colaboradores (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 , el contenido de todos los cuales se incorpora específicamente a la presente como referencia en su totalidad . Véanse además, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,545,806; 5,569,825; 5,625, 126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661 ,016; 5,814,318; 5,874,299; y 5,770,429; todas a Lonberg y Kay; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,545,807 a Surani y colaboradores; las Publicaciones Internacionales del TCP Números WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 971 13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas a Lonberg y Kay; y la Publicación Internacional del TCP Número WO 01 /14424 a Korman y colaboradores En otra modalidad, los anticuerpos humanos de la invención se pueden reproducir utilizando un ratón portador de secuencias de inmunoglobulina humana sobre los transgenes y transcromosomas, tales como a ratón portador del transgen de cadena pesada humano y un transcromosoma de cadena ligera humano. Estos ratones, referidos en la presente como "ratones KM", se describen con detalle en la Publicación Internacional del TCP Número WO 02/43478 a Ishida y colaboradores Todavía además, en la materia están disponibles sistemas de animales transgénicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana, y se pueden utilizar para reproducir los anticuerpos que se enlazan al HER3 de la invención. Por ejemplo, se puede utilizar un sistema transgénico alternativo referido como el Xeno-ratón (Abgenix, Inc.). Estos ratones se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,939,598; 6,075, 181 ; 6, 1 14,598; 6, 150,584 y 6, 162,963 a Kucherlapati y colaboradores Más aún, en la materia están disponibles los sistemas de animales transcromosómicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana, y se pueden utilizar para reproducir los anticuerpos que se enlazan al HER3 de la invención. Por ejemplo, se pueden utilizar los ratones portadores de tanto un transcromosoma de cadena pesada humana como un transcromosoma de cadena ligera humana, referidos como "ratones TC"; estos ratones se describen en Tomizuka y colaboradores (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 97: 722-727. Adicionalmente, en la téenica se han descrito reses portadoras de transcromosomas de cadena pesada y ligera humanas (Kuroiwa y colaboradores (2002) Nature Biotechnology 20: 889-894), y se pueden utilizar para reproducir los anticuerpos de HER3 de la invención.

Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también se pueden preparar empleando métodos de exhibición de fagos para rastrear bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana. Estos métodos de exhibición de fagos para aislar anticuerpos humanos están establecidos en la materia o se describen en los Ejemplos más adelante. Véanse, por ejemplo: las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,223,409; 5,403,484; y 5,571 ,698 a Ladner y colaboradores; las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,427,908 y 5,580,717 a Dower y colaboradores; las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,969, 108 y 6, 172, 197 a McCafferty y colaboradores; y las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,885,793; 6,521 ,404; 6,544,731 ; 6,555,313; 6,582,915 y 6,593,081 a Griffiths y colaboradores Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también se pueden preparar utilizando ratones SCID en los cuales se han reconstituido las células inmunitarias humanas, cuyas células inmunitarias humanas se han reconstituido de tal manera que se puede generar una respuesta de anticuerpo humano después de la inmunización. Estos ratones se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,476,996 y 5,698,767 a Wilson y colaboradores (iii) Diseño de Estructura o Fe Los anticuerpos diseñados de la invención incluyen aquellos en donde se han hecho modificaciones a los residuos de estructura dentro de la VH y/o de la VL, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Típicamente estas modificaciones de estructura se hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un planteamiento es “retromutar” uno o más residuos de estructura hasta la secuencia de la línea germinal correspondiente. De una manera más específica, un anticuerpo que se ha sometido a una mutación somática puede contener residuos de estructura que difieran de la secuencia de la línea germinal a partir de la cual se derive el anticuerpo. Estos residuos se pueden identificar comparando las secuencias de estructura del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal a partir de las cuales se derive el anticuerpo. Con el fin de regresar a las secuencias de la región de estructura hasta su configuración de la línea germinal, las mutaciones somáticas se pueden “retromutar” hasta la secuencia de la línea germinal, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio. Se pretende que estos anticuerpos “retromutados” también sean abarcados por la invención.

Otro tipo de modificación de estructura involucra mutar uno o más residuos dentro de la región de estructura, o incluso dentro de una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR), para remover los epítopos de células-T con el fin de reducir de esta manera la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este planteamiento también es referido como “desinmunización” y se describe con mayor detalle en la Publicación de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 20030153043 por Carr y colaboradores En adición o de una manera alternativa a las modificaciones hechas dentro de las regiones de estructura (FR) o de las regiones determinantes de complementariedad (CDR), los anticuerpos de la invención se pueden diseñar para incluir modificaciones dentro de la región Fe, típicamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como vida media en suero, fijación del complemento, enlace al receptor de Fe, y/o citotoxicidad celular dependiente del antígeno. Adicionalmente, un anticuerpo de la invención se puede modificar químicamente (por ejemplo, se pueden unir una o más fracciones químicas al anticuerpo), o se puede modificar para alterar su glicosilación, nuevamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas modalidades se describe con mayor detalle más adelante. La numeración de los residuos en la región Fe es aquélla del índice de la Unión Europea de Kabat.

En una modalidad, la región de articulación de CH 1 se modifica de tal manera que se altere el número de residuos de cisteína en la región de articulación, por ejemplo, que aumente o disminuya. Este planteamiento se describe además en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,677,425 por Bodmer y colaboradores; el número de residuos de cisteína en la región de articulación de CH 1 se altera, por ejemplo, para facilitar el ensamble de las cadenas ligera y pesada o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.

En otra modalidad, la región de articulación Fe de un anticuerpo se muta para disminuir la vida media biológica del anticuerpo. De una manera más específica, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de interfase del dominio CH2-CH3 del fragmento de Fc-articulación, de tal manera que el anticuerpo tenga un enlace deteriorado a la proteína A de Estafilococcilo (SpA) en relación con el enlace de SpA del dominio nativo de Fc-articulación. Este planteamiento se describe con mayor detalle en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6, 165,745 por Ward y colaboradores En todavía otras modalidades, la región Fe se altera, mediante el reemplazo de cuando menos un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos pueden ser reemplazados con un residuo de aminoácido diferente, de tal manera que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector, pero que conserve la capacidad de enlace al antígeno del anticuerpo progenitor. El ligando efector con el que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor de Fe o el componente de complemento C 1 . Este planteamiento se describe con mayor detalle en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,624,821 y 5,648,260, ambas por Winter y colaboradores En otra modalidad, uno o más aminoácidos seleccionados a partir de los residuos de aminoácidos, pueden ser reemplazados con un residuo de aminoácido diferente, de tal manera que el anticuerpo tenga un enlace alterado de C 1 q y/o una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida o abolida. Este planteamiento se describe con mayor detalle en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6, 194,551 por Idusogie y colaboradores En otra modalidad, uno o más residuos de aminoácidos son alterados para alterar de esta manera la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Este planteamiento se describe además en la Publicación Internacional del TCP Número WO 94/29351 por Bodmer y colaboradores En todavía otra modalidad, la región Fe se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor de Fcy, mediante la modificación de uno o más aminoácidos. Este planteamiento se describe además en la Publicación Internacional del TCP Número WO 00/42072 por Presta. Más aún, se han mapeado los sitios de enlace sobre la I g G 1 humana para FcyRI, FcyRIl , FcyRIII y FcRn, y se han descrito las variantes con un mejor enlace (véase Shields y colaboradores (2001 ) J . Biol. Chen. 276: 6591 -6604).

En todavía otra modalidad, se modifica la glicosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede elaborar un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación se puede alterar, por ejemplo, para aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Estas modificaciones de carbohidratos se pueden llevar a cabo, por ejemplo, mediante la alteración de uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden hacer una o más sustituciones de aminoácidos que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación de estructura de la región variable para eliminar de esta manera la glicosilación en ese sitio. Esta aglicosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Este planteamiento se describe con mayor detalle en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,714,350 y 6,350,861 por Co y colaboradores Adicionalmente o de una manera alternativa, se puede hacer un anticuerpo que tenga un tipo de glicosilación alterada, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tenga cantidades reducidas de residuos de fucosilo, o un anticuerpo que tenga un aumento de las estructuras de bisección GIcNac. Se ha demostrado que estos patrones de glicosilación alterados aumentan la capacidad de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) de los anticuerpos. Estas modificaciones de carbohidratos se pueden llevar a cabo, por ejemplo, mediante la expresión del anticuerpo en una célula huésped con una maqumaria de glicosilación alterada. Las células con una maquinaria de glicosilación alterada se han descrito en este campo, y se pueden utilizar como células huésped en donde se expresen los anticuerpos recombinantes de la invención, para producir de esta manera un anticuerpo con glicosilación alterada. Por ejemplo, la Patente Europea Número EP 1 , 176, 195 por Hang y colaboradores, describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica una fucosil-transferasa, de tal manera que los anticuerpos expresados en esta línea celular exhiben hípofucosilación. La Publicación Internacional del TCP Número WO 03/035835 por Presta describen una línea celular CHO variante, las celulas Lecl3, con una capacidad reducida para unir la fucosa a los carbohidratos enlazados con Asn(297), dando también como resultado la hípofucosilación de los anticuerpos expresados en esa célula huésped (véase también Shields y colaboradores (2002) J. B i o I . Chem . 277: 26733-26740). La Publicación Internacional del TCP Número WO 99/54342 por Umana y colaboradores, describe líneas celulares diseñadas para expresar las glicosil-transferasas modificadoras de glicoproteína (por ejemplo, beta(1 ,4)-N acetil-glucosaminil-transferasa III (G n TI 11 ) ) , de tal manera que los anticuerpos expresados en las líneas celulares diseñadas exhiban un aumento de las estructuras de bisección GIcNac, lo cual da como resultado un aumento en la actividad de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) de los anticuerpos (véase también Umana y colaboradores (1999) Nat. Biotech. 17: 176-180).

En otra modalidad, el anticuerpo se modifica para aumentar su vida media biológica. Son posibles diferentes planteamientos. Por ejemplo, se pueden introducir una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describen en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,277,375 a Ward. De una manera alternativa, para aumentar la vida media biológica, el anticuerpo se puede alterar dentro de la región CH 1 o CL para contener un epítopo de enlace al receptor de salvamento tomado a partir de dos ciclos de un dominio CH2 de una región Fe de una IgG, como se describe en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,869,046 y 6, 121 ,022 por Presta y colaboradores (iv) Métodos para diseñar anticuerpos alterados Los anticuerpos de HER3 o los fragmentos de los mismos de la invención, que tienen las secuencias VH y VL o las secuencias de cadena pesada y ligera de longitud completa mostradas en la presente, se pueden utilizar para crear nuevos anticuerpos de HER3 mediante la modificación de las secuencias de cadena pesada y/o de cadena ligera de longitud completa, de las secuencias VH y/o VL, o de las regiones constantes unidas a las mismas. Por consiguiente, en otro aspecto de la invención, se utilizan las características estructurales de un anticuerpo de HER3 o de un fragmento del mismo, para crear anticuerpos de HER3 estructuralmente relacionados que conserven cuando menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tal como el enlace al HER3 humano, y también la inhibición de una o más propiedades funcionales del HER3. Por ejemplo, una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de los anticuerpos de la presente invención, o mutaciones de los mismos, se pueden combinar de una manera recombinante con las regiones de estructura conocidas y/o con otras regiones determinantes de complementariedad (CDRs), para crear anticuerpos de HER3 recombinantemente diseñados adicionales, como se discute anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen aquéllas descritas en la sección anterior. El material de partida para el método de diseño es una o más de las secuencias VH y/o VL proporcionadas en la presente, o una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las mismas. Para crear el anticuerpo diseñado, no es necesario preparar realmente (es decir, expresar como una proteína) un anticuerpo que tenga una o más de las secuencias VH y/o VL proporcionadas en la presente, o una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las mismas. En su lugar, la información contenida en las secuencias se utiliza como el material de partida para crear secuencias de una “segunda generación” derivadas a partir de las secuencias originales, y entonces se preparan las secuencias de la “segunda generación”, y se expresan como una proteína.

De conformidad con lo anterior, en otra modalidad, la invención proporciona un método para la preparación de un anticuerpo que consiste en : una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de CDR1 seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2, 22, 42, 62, 82, 102, 122, 142, 162, 182, 202, 222, 242, 262, 282, 302, 322, 342, 362, 382, 402, 422, 442, 462, 482, 502, y 522; una secuencia de CDR2 seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 3, 23, 43, 63, 83, 103, 123, 143, 163, 183, 203, 223, 243, 263, 283, 303, 323, 343, 363, 383, 403, 423, 443, 463, 483, 503, y 523; y/o una secuencia de CDR3 seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 4, 24, 44, 64, 84, 104, 124, 144, 164, 184, 204, 224, 244, 264, 284, 304, 324, 344, 364, 384, 404, 424, 444, 464, 484, 504, y 524; y una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de CDR1 seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 8, 28, 48, 68, 88, 108, 128, 148, 168, 188, 208, 228, 248, 268, 288, 308, 328, 348, 368, 388, 408, 428, 448, 468, 488, 508, y 528; una secuencia de CDR2 seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 9, 29, 49, 69, 89, 109, 129, 149, 169, 189, 209, 229, 249, 269 , 289, 309, 329, 349, 369, 389, 409, 429, 449, 469, 489, 509, y 529; y/o una secuencia de CDR3 seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 10, 30, 50, 70, 90, 1 10, 130, 150, 170 , 190, 210, 230, 250, 270, 290, 310, 330, 350, 370, 390, 410, 430, 450, 470, 490, 510, y 530; alterar cuando menos un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada y/o de la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera para crear cuando menos una secuencia de anticuerpo alterada; y expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína. La secuencia de anticuerpo alterada también se puede preparar mediante el rastreo de bibliotecas de anticuerpos que tengan las secuencias de CDR3 fijas o determinantes de enlace esencial m ínimo como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamerica Número US2005/ 0255552, y diversidad en las secuencias de CDR1 y CDR2. El rastreo se puede llevar a cabo de acuerdo con cualquier teenología de rastreo apropiada para rastrear anticuerpos a partir de bibliotecas de anticuerpos, tal como la tecnología de exhibición de fagos.

Se pueden emplear las técnicas de biología molecular convencionales para preparar y expresar la secuencia de anticuerpo alterada. El anticuerpo codificado por la secuencia de anticuerpo alterada es uno que conserve una, algunas, o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos o fragmentos de los mismos descritos en la presente, cuyas propiedades funcionales incluyen, pero no se limitan a, específicamente el enlace al HER3 humano y/o de cinomolgo; el anticuerpo se enlaza a HER3 e inhibe la actividad biológica de HER3 mediante la inhibición de la actividad de señalización de HER en un ensayo de fosfo-H ER.

Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados se pueden evaluar utilizando los ensayos convencionales disponibles en la materia y/o descritos en la presente, tales como aquéllos estipulados en los Ejemplos (por ejemplo, ELISAs).

En ciertas modalidades de los métodos de diseño de los anticuerpos de la invención, se pueden introducir mutaciones de una manera aleatoria o selectiva, junto con toda o parte de una secuencia de codificación de un anticuerpo o fragmento, y se pueden rastrear los anticuerpos de HER3 modificados resultantes para determinar su actividad de enlace y/u otras propiedades funcionales, como se describe en la presente. Los métodos de mutación se han descrito en este campo. Por ejemplo, la Publicación Internacional del TCP Número WO 02/092780 por Short describe métodos para crear y rastrear las mutaciones de anticuerpos utilizando m utagénesis de saturación, ensamble de ligamiento sintético, o una combinación de los mismos. De una manera alternativa, la Publicación Internacional del TCP Número WO 03/074679 por Lazar y colaboradores, describe métodos para utilizar métodos de rastreo por computadora para optimizar las propiedades físico-químicas de los anticuerpos. Caracterización de los anticuerpos de la invención Los anticuerpos de la invención se pueden caracterizar mediante diferentes ensayos funcionales. Por ejemplo, se pueden caracterizar por su capacidad para inhibir la actividad biológica mediante la inhibición de la señalización de HER en un ensayo de fosfo-HER, como se describe en la presente, por su afinidad con una proteína de HER3 (por ejemplo, HER3 humano y/o de cinomolgo), por el enlace al epítopo, por su resistencia a la proteólisis, y por su capacidad para bloquear la señalización corriente abajo de HER3. Se pueden emplear diferentes métodos para medir la señalización mediada por HER3. Por ejemplo, la senda de señalización de HER3 se puede monitorear mediante: (i) la medición de fosfo-HER3; (ii) la medición de la fosforilación de HER3 o de otras proteínas de señalización corriente abajo (por ejemplo, Akt); (iii) ensayos de bloqueo de ligando, como se describen en la presente; (iv) formación de heterodímero; (v) firma de expresión genética dependiente de HER3; (vi) internalización del receptor; y (vii) fenotipos celulares impulsados por HER3 (por ejemplo, proliferación).

La capacidad de un anticuerpo para enlazarse al HER3 se puede detectar marcando el anticuerpo de interés directamente, o el anticuerpo se puede desmarcar y se detecta el enlace indirectamente utilizando diferentes formatos de ensayo de emparedado conocidos en la materia.

En algunas modalidades, los anticuerpos de HER3 bloquean o compiten con el enlace de un anticuerpo de HER3 de referencia, con un HER3. Éstos pueden ser los anticuerpos de HER3 completamente humanos descritos anteriormente. También pueden ser otros anticuerpos de HER3 de ratón, quiméricos, o humanizados, que se enlacen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia. La capacidad para bloquear o competir con el enlace del anticuerpo de referencia indica que un anticuerpo de HER3 bajo prueba se enlaza al mismo epítopo o a un epítopo similar a aquél definido por el anticuerpo de referencia, o a un epítopo que está suficientemente próximo al epítopo enlazado por el anticuerpo de HER3 de referencia. Estos anticuerpos tienen probabilidades especiales de compartir las propiedades convenientes identificadas para el anticuerpo de referencia. La capacidad para bloquear o competir con el anticuerpo de referencia se puede determinar, por ejemplo, mediante un ensayo de enlace de competición. Con un ensayo de enlace de competición, el anticuerpo bajo prueba se examina para determinar su capacidad para inhibir el enlace específico del anticuerpo de referencia a un antígeno común, tal como un polipeptido o una proteína de HER3. Un anticuerpo de prueba compite con el anticuerpo de referencia por el enlace específico al antígeno si un exceso del anticuerpo de prueba inhibe sustancialmente el enlace del anticuerpo de referencia. Inhibición sustancial significa que el anticuerpo de prueba reduce el enlace específico del anticuerpo de referencia usualmente por cuando menos el 10 por ciento, el 25 por ciento, el 50 por ciento, el 75 por ciento, o el 90 por ciento.

Hay un número de ensayos de enlace de competición conocidos que se pueden utilizar para evaluar la competición de un anticuerpo de HER3, con el anticuerpo de HER3 de referencia, para enlazarse a un HER3. Éstos incluyen, por ejemplo, radiommunoensayo (RIA) directo o indirecto en fase sólida, inmunoensayo enzimático (EIA) directo o indirecto en fase sólida, ensayo de competición de emparedado (véase Stahli y colaboradores (1983) Methods in Enzymology 9: 242-253); inmunoensayo enzimático (EIA) directo de biotina-avidina en fase sólida (véase Kirkland y colaboradores (1986) J. Immunol. 137: 3614-3619); ensayo de marcado directo en fase sólida, ensayo de emparedado de marcado directo en fase sólida (véase Harlow y Lañe, supra); radioinmunoensayo (RIA) de marcado directo en fase sólida utilizando la marca de 1-125 (véase Morel y colaboradores (1988) Molec. Immunol. 25: 7-15); inmunoensayo enzimático (EIA) directo de biotina-avidina en fase sólida (Cheung y colaboradores (1990) Virology 176: 546-552); y radiommunoensayo (RIA) de marcado directo (Moldenhauer y colaboradores (1990) Scand. J. Immunol. 32: 77-82). Típicamente, este ensayo involucra el uso del antígeno purificado enlazado a una superficie sólida o a células portadoras de cualquiera de los mismos, un anticuerpo que se enlaza al HER3 de prueba no marcado, y un anticuerpo de referencia marcado. La inhibición competitiva se mide mediante la determinación de la cantidad de marca enlazada a la superficie sólida o a las células en la presencia del anticuerpo de prueba. Usualmente, el anticuerpo de prueba está presente en exceso. Los anticuerpos identificados mediante el ensayo de competición (anticuerpos competidores), incluyen los anticuerpos que se enlazan al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, y los anticuerpos que se enlazan a un epítopo adyacente suficientemente próximo al epítopo enlazado por el anticuerpo de referencia para que se presente el impedimento estérico.

Con el fin de determinar si los anticuerpos monoclonales de H ER3 seleccionados se enlazan a epítopos únicos, cada anticuerpo se puede biotinilar utilizando los reactivos comercialmente disponibles (por ejemplo, los reactivos de Pierce, Rockford, IL). Los estudios de competición utilizando anticuerpos monoclonales no marcados y anticuerpos monoclonales biotinilados, se pueden llevar a cabo utilizando placas de ELISA recubiertas con el polipéptido de HER3. El enlace de los anticuerpos monoclonales (mAb) biotinilados se puede detectar con una sonda de estreptavidina-fosfatasa alcalina. Para determinar el isotipo de un anticuerpo que se enlaza al HER3 purificado, se pueden llevar a cabo ELISAs de isotipos. Por ejemplo, los pozos de las placas de microtitulación se pueden recubrir con 1 microgramo/ mililitro de IgG anti-humano durante la noche a 4°C. Después del bloqueo con albúmina de suero bovino (BSA) al 1 por ciento, las placas se hacen reaccionar con 1 microgramo/mililitro o menos del anticuerpo monoclonal de HER3 o de los controles de isotipos purificados, a temperatura ambiente, durante una a dos horas. Los pozos se pueden hacer reaccionar entonces con ya sea la lgG 1 humana o bien con las sondas conjugadas con fosfatasa alcalina específicas de la IgM humana. Entonces se revelan las placas y se analizan de tal manera que se pueda determinar el isotipo del anticuerpo purificado.

Con el fin de demostrar el enlace de los anticuerpos monoclonales de HER3, a las células vivas que expresan un polipéptido de H ER3, se puede utilizar citometría de flujo. Dicho de una manera breve, las líneas celulares que expresen la HER3 (cultivadas bajo condiciones de crecimiento convencionales) se pueden mezclar con diferentes concentraciones de un anticuerpo que se enlaza al HER3 en suero regulado con fosfato (PBS) que contenga albúmina de suero bovino (BSA) al 0.1 por ciento y suero fetal de becerro al 10 por ciento, y se incuban a 4°C durante 1 hora. Después de lavarse, las células se hacen reaccionar con el anticuerpo de IgG anti-humano marcado con fluoresceína bajo las mismas condiciones que el teñido del anticuerpo primario. Las muestras se pueden analizar mediante el instrumento FACScan utilizando las propiedades de dispersión de luz y lateral para dar compuerta a las células individuales. Se puede emplear un ensayo alternativo utilizando microscopía de fluorescencia (en adición a, o en lugar de) el ensayo de citometría de flujo. Las células se pueden teñir exactamente como se describe anteriormente, y se pueden examinar mediante microscopía de fluorescencia. Este método permite hacer la visualización de las células individuales, pero puede una sensibilidad reducida, dependiendo de la densidad del antígeno.

Los anticuerpos de la invención o los fragmentos de los mismos, se pueden probar adicionalmente para determinar su reactividad con un polipéptido de HER3 o un fragmento antigénico, mediante Western blot. Dicho de una manera breve, se pueden preparar polipéptidos o proteínas de fusión de HER3 purificados, o extractos celulares a partir de las células que expresen el HER3, y se someten a electroforesis en gel de dodecil-sulfato de sodio / poliacrilamida. Después de la electroforesis, los antígenos separados se transfieren a membranas de nitrocelulosa, se bloquean con suero fetal de becerro al 10 por ciento, y se sondean con los anticuerpos monoclonales que se vayan a probar. El enlace de la IgG humana se puede detectar utilizando IgG anti-humano / fosfatase alcalina, y se revela con tabletas de sustrato de BCIP/NBT (Sigma Chem . Co. , St. Louis, MO).

Se puede utilizar un número de lecturas para evaluar la eficacia y la especificidad de los anticuerpos de HER3 en ensayos basados en celulas de la formación de heterodímeros inducida por el ligando. La actividad se puede evaluar mediante uno o más de los siguientes: (i) Inhibición de heterodimerización de HER2 inducida por el ligando, con otros miembros de la familia EGF en una línea celular objetivo, por ejemplo, células de cáncer de mama MCF-7. La inmunoprecipitación de los complejos de HER2 a partir de los Usados celulares se puede llevar a cabo con un anticuerpo específico del receptor, y se puede analizar la ausencia/presencia de otros receptores de EGF y sus ligandos biológicamente relevantes dentro del complejo, en seguida de la electroforesis/transferencia Western, mediante el sondeo con anticuerpos para otros receptores de EGF. (ii) Inhibición de la activación de las sendas de señalización mediante los heterodímeros activados por el ligando. La asociación con HER3 parece ser una clave para otros miembros de la familia de receptores de EGF, para provocar la máxima respuesta celular en seguida del enlace del ligando. En el caso del HER3 defectuoso en cinasa, el HER2 proporciona un dominio de cinasa de tirosina funcional para hacer posible que se presente la señalización en seguida del enlace de los ligandos del factor de crecimiento. Por consiguiente, las células que co-expresen HER2 y HER3 se pueden tratar con el ligando, por ejemplo, herregulina, en ausencia y en la presencia del inhibidor, y se monitores el efecto sobre la fosforilación de tirosina de HER3 mediante un número de formas, incluyendo inmunoprecipitación de H ER3 a partir de los Usados celulares tratados y el subsiguiente Western blot utilizando anticuerpos anti-fosfotirosina (véase Agus op. cit. para los detalles). De una manera alternativa, se puede desarrollar un ensayo de alta producción mediante el atrape de HER3 a partir de los Usados solubilizados sobre los pozos de una placa de 96 pozos recubierta con un anticuerpo anti-receptor HER3, y se mide el nivel de fosforilación de tirosina utilizando, por ejemplo, anticuerpos anti-fosfotirosina marcados con europio, como son incorporados por Waddleton y colaboradores (2002) Anal. Biochem. 309: 150-157.

En una extensión más amplia de este planteamiento, se pueden analizar directamente las moléculas efectoras que se sepa que son activadas corriente abajo de los heterodímeros del receptor activados, tales como las cinasas de proteína activadas por mitógeno (MAPK) y Akt, mediante inmunoprecipitación a partir de los Usados tratados, y haciendo la transferencia con los anticuerpos que detecten las formas activadas de estas proteínas, o mediante el análisis de la capacidad de estas proteínas para modificar/activar los sustratos específicos. (iii) Inhibición de la proliferación celular inducida por el ligando. Se sabe que una variedad de líneas celulares co-expresan combinaciones de receptores ErbB, por ejemplo, muchas líneas celulares de cáncer de mama y de próstata. Los ensayos se pueden llevar a cabo en formatos de 24/48/96 pozos, con la lectura basada alrededor de la síntesis del ADN (incorporación de timidina tritiada), incremento en el número de células (teñido de violeta cristal), etc.

Se puede utilizar un número de lecturas para evaluar la eficacia y la especificidad de los anticuerpos de HER3 en ensayos basados en células de la formación de homo- y hetero-dímero independiente del ligando. Por ejemplo, la sobre-expresión de HER2 desencadena la activación del dominio de cinasa independiente del ligando como un resultado de la formación espontánea del dímero. El HER2 sobre-expresado genera ya sea homo- o hetero-dímeros con otras moléculas de HER, tales como HER1 , HER3 y HER4.

La capacidad de los anticuerpos o de los fragmentos de los mismos para bloquear el crecimiento in vivo de los xenomjertos de tumores de líneas celulares tumorales humanas, de las que se sabe que su fenotipo tumorigénico es cuando menos parcialmente dependiente de la activación de la señalización del heterodímero de HER3 mediante el ligando, por ejemplo, las células de cáncer pancreático BxPC3, etc. Ésta se puede evaluar en ratones inmunocomprometidos, ya sea solo o bien en combinación con un agente citotóxico apropiado para la línea celular en cuestión. Los ejemplos de los ensayos funcionales también se describen en la sección de Ejemplos más adelante.

Usos profilácticos y terapéuticos La presente invención proporciona métodos para el tratamiento de una enfermedad o de un trastorno asociado con la senda de señalización de HER3 mediante la administración a un sujeto que lo necesite, de una cantidad efectiva del anticuerpo de la invención o de un fragmento del mismo. En una modalidad específica, la presente invención proporciona un metodo para el tratamiento o la prevención de cánceres (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer colo-rectal, cáncer de pulmón, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer gástrico, cáncer pancreático, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, osteosarcoma, carcinoma de células escamosas, tumores periféricos de la vaina de los nervios, schwanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer esofágico, cáncer esofágico de Barretts, glioblastoma, sarcoma de células claras del tejido blando, mesotelioma maligno, neurofibromatosis, cáncer renal, melanoma, cáncer de próstata, hiperplasia prostática benigna (BPH), ginecomastia y endometriosis), mediante la administración a un sujeto que lo necesite, de una cantidad efectiva de los anticuerpos de la invención o de los fragmentos de los mismos. En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para el tratamiento o la prevención de los cánceres asociados con una senda de señalización de HER3, mediante la administración a un sujeto que lo necesite, de una cantidad efectiva de los anticuerpos de la invención.

En una modalidad específica, la presente invención proporciona métodos para el tratamiento de los cánceres asociados con una senda de señalización de HER3 que incluyen, pero no se limitan a, cáncer de mama, cáncer colo-rectal, cáncer de pulmón, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer gástrico, cáncer pancreático, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, osteosarcoma, carcinoma de células escamosas, tumores periféricos de la vaina de los nervios, schwanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer esofágico, cáncer esofágico de Barretts, glioblastoma, sarcoma de células claras del tejido blando, mesotelioma maligno, neurofibromatosis, cáncer renal, melanoma, cáncer de próstata, hiperplasia prostética benigna (BPH), ginecomastia, y endometriosis.

Los anticuerpos o los fragmentos de los mismos de la invención también se pueden utilizar para tratar o prevenir otros trastornos asociados con la señalización aberrante o defectuosa de HER3, incluyendo, pero no limitándose a, enfermedades respiratorias, osteoporosis, osteoartritis, enfermedad renal poliquística, diabetes, esquizofrenia, enfermedad vascular, enfermedad cardíaca, enfermedades proliferativas no oncogénicas, fibrosis, y enfermedades neurodegenerativas, tales como enfermedad de Alzheimer.

Los agentes adecuados para el tratamiento de combinación con los anticuerpos de HER3 incluyen los agentes de atención convencionales conocidos en la materia que son capaces de modular la senda de señalización de ErbB. Los ejemplos adecuados de los agentes de atención convencionales para HER2 incluyen, pero no se limitan a, Herceptin y Tykerb. Los ejemplos adecuados de los agentes de atención convencionales para EG FR incluyen, pero no se limitan a, Iressa, Tarceva, Erbitux y Vectibix, como se describen anteriormente. Otros agentes que pueden ser adecuados para el tratamiento de combinación con anticuerpos de HER3 incluyen, pero no se limitan a, aquéllos que modulan las cinasas de tirosina receptoras, los receptores acoplados con proteína-G, la senda de transducción de señales de crecimiento/sobrevivencia, los receptores de hormona nuclear, las sendas apoptóticas, el ciclo celular, y la angiogénesis.

Usos de Diagnóstico En un aspecto, la invención abarca los ensayos de diagnóstico para determinar la expresión de la proteína y/o del ácido nucleico de HER3, así como la función de la proteína de HER3, en el contexto de una muestra biológica (por ejemplo, sangre, suero, células, tejido), o a partir de un individuo que padezca cáncer, o es en riesgo de desarrollar cáncer.

Los ensayos de diagnóstico, tales como los ensayos competitivos, se apoyan en la capacidad de un análogo marcado (el "rastreador") para competir con el analito de la muestra de prueba por al número limitado de sitios de enlace en un componente de enlace común. El componente de enlace en términos generales se insolubiliza antes o después de la competición, y entonces el rastreador y el analito enlazados al componente de enlace se separan del rastreador y el analito no enlazados. Esta separación se lleva a cabo mediante decantación (en donde el componente de enlace fue previamente insolubilizado) o mediante centrifugación (en donde el componente de enlace se precipitó después de la reacción competitiva). La cantidad de analito de la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de rastreador enlazado, como se mide por la cantidad de sustancia marcadora. Se preparan las curvas de respuesta a la dosis con cantidades conocidas del analito, y se comparan con los resultados de prueba, con el objeto de determinar cuantitativamente la cantidad de analito presente en la muestra de prueba. Estos ensayos se denominan como sistemas ELISA cuando se utilizan enzimas como los marcadores detectables. En un ensayo de esta forma, el enlace competitivo entre los anticuerpos y los anticuerpos de HER3, da como resultado el HER3 enlazado, de preferencia los epítopos de HER3 de la invención, que es una medida de los anticuerpos en la muestra de suero, más particularmente, de la inhibición de los anticuerpos en la muestra de suero.

Una ventaja significativa del ensayo es que se hace la medición de la inhibición de los anticuerpos directamente (es decir, aquellos que interfieren con el enlace de HER3, de una manera específica, los epítopos). Este ensayo, en particular en la forma de una prueba ELISA, tiene aplicaciones considerables en el medio ambiente clínico y en el rastreo de sangre de rutina.

Otro aspecto de la invención proporciona métodos para determinar la expresión del ácido nucleico de HER3 o la actividad de HER3 en un individuo, para seleccionar de esta manera los agentes terapéuticos o profilácticos apropiados para ese individuo (referidos en la presente como "farmacogenómicos"). Los farmacogenómicos permiten hacer la selección de agentes (por ejemplo, los fármacos) para el tratamiento terapéutico o profiláctico de un individuo basándose en el genotipo del individuo (por ejemplo, el genotipo del individuo examinado para determinar la capacidad del individuo para responder a un agente particular).

Todavía otro aspecto de la invención pertenece al monitoreo de la influencia de los agentes (por ejemplo, los fármacos) sobre la expresión o actividad de HER3 en los estudios clínicos. Composiciones Farmacéuticas Para preparar las composiciones farmacéuticas o estériles que incluyen los anticuerpos o los fragmentos de los mismos, estos anticuerpos o los fragmentos de los mismos se mezclan con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones adicionalmente pueden contener uno o más agentes terapéuticos diferentes que sean adecuados para el tratamiento o la prevención de cáncer (cáncer de mama, cáncer colo-rectal, cáncer de pulmón, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer gástrico, cáncer pancreático, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, osteosarcoma, carcinoma de células escamosas, tumores de vaina de nervios periféricos schwanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer esofágico, cáncer esofágico de Barretts, glioblastoma, sarcoma de células claras del tejido blando, mesotelioma maligno, neurofibromatosis, cáncer renal y melanoma, cáncer de próstata, hiperplasia prostética benigna (BPH), ginecomastia, y endometriosis).

Las formulaciones de agentes terapéuticos y de diagnóstico se pueden preparar mediante la mezcla con vehículos, excipientes, o estabilizantes fisiológicamente aceptables en la forma, por ejemplo, de polvos liofilizados, pastas acuosas, soluciones acuosas, lociones, o suspensiones (véase, por ejemplo, Hardman y colaboradores (2001 ) Goodman y Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nueva York, N .Y. ; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, y Wilkins, Nueva York, N.Y. ; Avis y colaboradores (Editores) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman y colaboradores (Editores) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman y colaboradores (Editores) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner y Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc. , Nueva York, N .Y.).

La selección de un régimen de administración para un producto terapéutico depende de varios factores, incluyendo el índice de rotación del suero o del tejido de la entidad, el nivel de los síntomas, la inmunogenicidad de la entidad, y la accesibilidad de las células objetivo en la matriz biológica. En ciertas modalidades, un régimen de administración maximiza la cantidad de producto terapéutico suministrado al paciente de una manera consistente con un nivel aceptable de efectos secundarios. De conformidad con lo anterior, la cantidad de producto biológico suministrado depende en parte de la entidad particular y de la gravedad de la condición que se esté tratando. Está disponible la guía para seleccionar las dosis apropiadas de anticuerpos, citoqumas, y moleculas pequeñas (véase, por ejemplo, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, Reino Unido; Kresina (Editor) (1991 ) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, Nueva York, N.Y.; Bach (Editor) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, Nueva York, N.Y. ; Baert y colaboradores (2003) New Engl. J. Med. 348: 601 -608; Milgrom y colaboradores (1999) New Engl. J. Med. 341 : 1966-1973; Slamon y colaboradores (2001 ) New Engl. J. Med. 344: 783-792; Beniaminovitz y colaboradores (2000) New Engl. J. Med. 342: 613-619; Ghosh y colaboradores (2003) New Engl. J. Med. 348: 24-32; Lipsky y colaboradores (2000) New Engl. J. Med. 343: 1594-1602).

La determinación de la dosis apropiada es hecha por el clínico, por ejemplo, utilizando parámetros o factores que se sepa o se sospeche en la materia que afectan al tratamiento o que se prediga que afectan al tratamiento. En términos generales, la dosis empieza con una cantidad un poco menor que la dosis óptima, y se incrementa mediante incrementos pequeños posteriormente hasta que se logre el efecto deseado u óptimo en relación con cualesquiera efectos secundarios negativos. Las medidas de diagnóstico importantes incluyen aquéllas de los síntomas, por ejemplo, de la inflamación o del nivel de citoquinas inflamatorias producidas.

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden variar como para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición, y modo de administración particular, sin que sea tóxica para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos, incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o del éster, la sal o amida de las mismas, la vía de administración, el tiempo de administración, el índice de excreción del compuesto particular que se emplee, la duración del tratamiento, otros fármacos, los compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, la condición, la salud general, y la historia médica previa del paciente que sea tratado, y de factores similares conocidos en la téenica médica.

Las composiciones que comprenden los anticuerpos o los fragmentos de los mismos de la invención, se pueden proporcionar mediante infusión continua, o mediante dosis a intervalos, por ejemplo, de un día, una semana, o de 1 a 7 veces por semana. La dosis se puede proporcionar intravenosamente, subcutáneamente, tópicamente, oralmente, nasalmente, rectalmente, intra muscularmente, intracerebralmente, o mediante inhalación. Un protocolo de dosificación específico es uno que involucra la dosis máxima o una frecuencia de dosificación que evite los efectos secundarios indeseables significativos. Una dosis semanal total puede ser de cuando menos 0.05 microgramos/kilogramo de peso corporal, de cuando menos 0.2 microgramos/kilogramo, de cuando menos 0.5 microgramos/kilogramo, de cuando menos 1 microgramo/ kilogramo, de cuando menos 10 microgramos/kilogramo, de cuando menos 100 microgramos/kilogramo, de cuando menos 0.2 miligramos/ kilogramo, de cuando menos 1.0 miligramo/kilogramo, de cuando menos 2.0 miligramos/kilogramo, de cuando menos 10 miligramos/ kilogramo, de cuando menos 25 miligramos/kilogramo, o de cuando menos 50 miligramos/kilogramo (véase, por ejemplo, Yang y colaboradores (2003) New Engl. J. Med. 349: 427-434; Herold y colaboradores (2002) New Engl. J . Med. 346: 1692-1698; Liu y colaboradores (1999) J . Neurol. Neurosurg. Psych. 67: 451 -456; Portielji y colaboradores (2003) Cáncer Immunol. Immunother. 52: 133-144). La dosis deseada de los anticuerpos o fragmentos de los mismos, es aproximadamente la misma que para un anticuerpo o polipéptido, sobre una base de moles/kilogramo de peso corporal. La concentración en plasma deseada de los anticuerpos o fragmentos de los mismos, es aproximadamente la misma que para un anticuerpo, sobre una base de moles/kilogramo de peso corporal. La dosis puede ser de cuando menos 15 microgramos, de cuando menos 20 microgramos, de cuando menos 25 microgramos, de cuando menos 30 microgramos, de cuando menos 35 microgramos, de cuando menos 40 microgramos, de cuando menos 45 microgramos, de cuando menos 50 microgramos, de cuando menos 55 microgramos, de cuando menos 60 microgramos, de cuando menos 65 microgramos, de cuando menos 70 microgramos, de cuando menos 75 microgramos, de cuando menos 80 microgramos, de cuando menos 85 microgramos, de cuando menos 90 m icrogramos, de cuando menos 95 microgramos, o de cuando menos 100 microgramos. Las dosis administradas a un sujeto pueden sumar cuando menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , o 12, o más.

Para los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, la dosificación administrada a un paciente puede ser de 0.0001 miligramos/ kilogramo a 100 miligramos/kilogramo del peso corporal del paciente. La dosificación puede ser de entre 0.0001 miligramos/kilogramo y 20 miligramos/kilogramo, de entre 0.0001 miligramos/kilogramo y 10 miligramos/kilogramo, de entre 0.0001 miligramos/kilogramo y 5 miligramos/kilogramo, de entre 0.0001 y 2 miligramos/kilogramo, de entre 0.0001 y 1 miligramo/kilogramo, de entre 0.0001 miligramos/kilogramo y 0.75 miligramos/kilogramo, de entre 0.0001 miligramos/kilogramo y 0.5 miligramos/kilogramo, de entre 0.0001 miligramos/kilogramo y 0.25 miligramos/kilogramo, de entre 0.0001 y 0.15 miligramos/kilogramo, de entre 0.0001 y 0.10 miligramos/kilogramo, de entre 0.001 y 0.5 miligramos/kilogramo, de entre 0.01 y 0.25 miligramos/kilogramo, o de entre 0.01 y 0.10 miligramos/kilogramo del peso corporal del paciente.

La dosificación de los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, se puede calcular utilizando el peso del paciente en kilogramos (kg) multiplicado por las dosis que se vayan a administrar en miligramos/kilogramo. La dosificación de los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, puede ser de 150 microgramos/kilogramo o menos, de 125 microgramos/kilogramo o menos, de 100 microgramos/kilogramo o menos, de 95 microgramos/ kilogramo o menos, de 90 microgramos/kilogramo o menos, de 85 microgramos/kilogramo o menos, de 80 microgramos/kilogramo o menos, de 75 microgramos/kilogramo o menos, de 70 microgramos/ kilogramo o menos, de 65 microgramos/kilogramo o menos, de 60 microgramos/kilogramo o menos, de 55 microgramos/kilogramo o menos, de 50 microgramos/kilogramo o menos, de 45 microgramos/ kilogramo o menos, de 40 microgramos/kilogramo o menos, de 35 microgramos/kilogramo o menos, de 30 microgramos/kilogramo o menos, de 25 microgramos/kilogramo o menos, de 20 microgramos/ kilogramo o menos, de 15 microgramos/kilogramo o menos, de 10 microgramos/kilogramo o menos, de 5 microgramos/kilogramo o menos, de 2.5 microgramos/kilogramo o menos, de 2 microgramos/ kilogramo o menos, de 1 .5 microgramos/kilogramo o menos, de 1 microgramo/kilogramo o menos, de 0.5 microgramos/kilogramo o menos, o de 0.5 microgramos/kilogramo o menos, del peso corporal del paciente.

La dosis unitaria de los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, puede ser de 0.1 miligramos a 20 miligramos, de 0.1 miligramos a 15 miligramos, de 0.1 miligramos a 12 miligramos, de 0.1 miligramos a 10 miligramos, de 0.1 miligramos a 8 miligramos, de 0.1 miligramos a 7 miligramos, de 0.1 miligramos a 5 miligramos, de 0.1 a 2.5 miligramos, de 0.25 miligramos a 20 miligramos, de 0.25 a 15 miligramos, de 0.25 a 12 miligramos, de 0.25 a 10 miligramos, de 0.25 a 8 miligramos, de 0.25 miligramos a 7 miligramos, de 0.25 miligramos a 5 miligramos, de 0.5 miligramos a 2.5 miligramos, de 1 miligramo a 20 miligramos, de 1 miligramo a 15 miligramos, de 1 miligramo a 12 miligramos, de 1 miligramo a 10 miligramos, de 1 miligramo a 8 miligramos, de 1 miligramo a 7 miligramos, de 1 miligramo a 5 miligramos, o de 1 miligramo a 2.5 miligramos.

La dosificación de los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, puede alcanzar una titulación en suero de cuando menos 0.1 microgramos/mililitro, de cuando menos 0.5 microgramos/mililitro, de cuando menos 1 microgramo/mililitro, de cuando menos 2 microgramos/mililitro, de cuando menos 5 microgramos/mililitro, de cuando menos 6 microgramos/mililitro, de cuando menos 10 microgramos/mililitro, de cuando menos 15 microgramos/mililitro, de cuando menos 20 microgramos/mililitro, de cuando menos 25 microgramos/mililitro, de cuando menos 50 microgramos/mililitro, de cuando menos 100 microgramos/mililitro, de cuando menos 125 microgramos/mililitro, de cuando menos 150 microgramos/mililitro, de cuando menos 175 microgramos/mililitro, de cuando menos 200 microgramos/mililitro, de cuando menos 225 microgramos/mililitro, de cuando menos 250 microgramos/mililitro, de cuando menos 275 microgramos/mililitro, de cuando menos 300 microgramos/mililitro, de cuando menos 325 microgramos/mililitro, de cuando menos 350 microgramos/mililitro, de cuando menos 375 microgramos/mililitro, o de cuando menos 400 microgramos/mililitro, en un sujeto. De una manera alternativa, la dosificación de los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, puede alcanzar una titulación en suero de cuando menos 0.1 microgramos/mililitro, de cuando menos 0.5 microgramos/mililitro, de cuando menos 1 microgramo/mililitro, de cuando menos 2 microgramos/mililitro, de cuando menos 5 microgramos/mililitro, de cuando menos 6 microgramos/mililitro, de cuando menos 10 microgramos/mililitro, de cuando menos 15 microgramos/mililitro, de cuando menos 20 microgramos/mililitro, de cuando menos 25 microgramos/mililitro, de cuando menos 50 microgramos/mililitro, de cuando menos 100 microgramos/mililitro, de cuando menos 125 microgramos/mililitro, de cuando menos 150 microgramos/mililitro, de cuando menos 175 microgramos/mililitro, de cuando menos 200 microgramos/mililitro, de cuando menos 225 microgramos/mililitro, de cuando menos 250 microgramos/mililitro, de cuando menos 275 microgramos/mililitro, de cuando menos 300 microgramos/mililitro, de cuando menos 325 microgramos/mililitro, de cuando menos 350 microgramos/mililitro, de cuando menos 375 microgramos/mililitro, o de cuando menos 400 microgramos/mililitro, en el sujeto.

Las dosis de los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, se pueden repetir, y la administraciones se pueden separar por cuando menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses, o por cuando menos 6 meses.

Una cantidad efectiva para un paciente particular puede variar dependiendo de factores tales como la condición que se trate, la salud global del paciente, el método, la vía, y la dosis de administración, y la gravedad de los efectos secundarios (véase, por ejemplo, Maynard y colaboradores (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Ratón, Fia. ; Dent (2001 ) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch P u b I . , Londres, Reino Unido).

La vía de administración puede ser, por ejemplo, mediante aplicación tópica o cutánea, inyección o infusión intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intra-arterial, intra-cerebro-espinal, intralesional, o mediante sistemas de liberación sostenida o mediante un implante (véase, por ejemplo, Sidman y colaboradores (1983) Biopolymers 22: 547-556; Langer y colaboradores (1981 ) J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277; Langer, (1982) Chem . Tech. 12: 98-105; Epstein y colaboradores (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82: 3688-3692; Hwang y colaboradores (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 77: 4030-4034; las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 6,350,466 y 6,316,024). Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local, tal como lidocaína, para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. En adición, también se puede emplear la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador y la formulación con un agente aerosolizante. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 6,019,968, 5,985,320, 5,985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540, y 4,880,078; y las Publicaciones Internacionales del TCP Números WO 92/19244, Publicación Internacional Número WO 97/32572, Publicación Internacional Número WO 97/44013, y Publicaciones Internacionales Números WO 98/31346 y WO 99/66903, cada una de las cuales se incorpora a la presente como referencia en su totalidad.

Una com posición de la presente invención también se puede administrar por medio de una o más vías de administración utilizando uno o más de una variedad de métodos conocidos en la téenica. Como será apreciado por la persona experta, la vía y/o el modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Las vías de adm inistración seleccionadas para los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, incluyen intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal, u otras vías de administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La administración parenteral puede representar modos de administración diferentes de la administración enteral y tópica, usualmente mediante inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intra-peritoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal. De una manera alternativa, una composición de la invención se puede administrar por una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosal, por ejemplo, intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica. En una modalidad, los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, se administran mediante infusión. En otra modalidad, la proteína multiespecífica de enlace al epítopo de la invención se administra subcutáneamente.

Si los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención se administran en un sistema de liberación controlada o de liberación sostenida, se puede utilizar una bomba para lograr la liberación controlada o sostenida (véase Langer, supra Sefton, (1987) CRC Crit. Ref Biomed. Eng. 14: 20; Buchwald y colaboradores (1980) Surgery 88: 507; Saudek y colaboradores (1989) N. Engl. J. Med. 321 : 574). Se pueden utilizar materiales poliméricos para lograr la liberación controlada o sostenida de las terapias de la invención (véase, por ejemplo, Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (Editores), CRC Pres., Boca Ratón, Fia. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (Editores), Wilcy, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, (1983), J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61 ; véase también Levy y colaboradores, (1985), Science 228: 190; During y colaboradores, (1989), Ann. Neurol. 25: 351 ; Howard y colaboradores, (1989), J. Neurosurg. 7 1 : 105); Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,679,377; 5,916,597; 5,912,015; 5,989,463; 5,128,326; Publicación Internacional del TCP Número WO 99/15154; y la Publicación Internacional del TCP Número WO 99/20253. Los ejemplos de los polímeros utilizados en las formulaciones de liberación sostenida incluyen, pero no se limitan a, poli-(metacrilato de 2-hidroxi-etilo), pol¡-(metacrilato de metilo), poli-(ácido acrílico), poli-(etileno-co-acetato de vinilo), poli-(ácido metacrílico), poli-glicólidos (PLG), poli-anhídridos, poli-(N-vinil-pirrolidona), poli-(alcohol vinílico), poli-acrilamida, poli-(etilenglicol), poli-láctidos (PLA), poli-(láctido-co-glicólidos) (PLGA), y poli-orto-esteres. En una modalidad, el polímero utilizado en una formulación de liberación sostenida es inerte, está libre de impurezas lixiviables, es estable en el almacenamiento, estéril, y biodegradable. Un sistema de liberación controlada o sostenida se puede colocar en proximidad al objetivo profiláctico o terapéutico y, por consiguiente, se requiere solamente una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, supra, volumen 2, páginas 1 15-138 (1984)).

Los sistemas de liberación controlada se discuten en la revisión por Langer ((1990), Science 249: 1527-1533). Se puede emplear cualquier téenica conocida por un experto en la materia para producir formulaciones de liberación sostenida que comprendan uno o más anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención. Véanse, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,526,938, la Publicación Internacional del TCP Número WO 91 /05548, la Publicación Internacional del TCP Número WO 96/20698, Ning y colaboradores, (1996), Radiotherapy & Oncology 39: 179-189, Song y colaboradores (1995) PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50: 372-397, Cleek y colaboradores (1997) Pro. Int'l. Symp. Control. Reí. Bioact. Mater. 24: 853-854, y Lam y colaboradores (1997) Proc. Int'l. Symp. Control Reí. Bioact. Mater. 24: 759-760, cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia en su totalidad.

Si los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención se administran tópicamente, se pueden formular en la forma de un ungüento, crema, parche transdérmico, loción, gel, champú, aspersión, aerosol, solución, emulsión, u otra forma bien conocida por un experto en la materia. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19a Edición, Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). Para las formas de dosificación tópicas no rociables, típicamente se emplean formas viscosas a semi-sólidas o sólidas que comprendan un vehículo o uno o más excipientes compatibles con la aplicación tópica, y que tengan una viscosidad dinámica, en algunas instancias, mayor que la del agua. Las formulaciones adecuadas incluyen, sin limitación, soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, ungüentos, polvos, linimentos, bálsamos, y similares, los cuales, si se desea, se esterilizan o se mezclan con agentes auxiliares (por ejemplo, conservadores, estabilizantes, agentes humectantes, reguladores del pH, o sales) para tener influencia sobre las diferentes propiedades, tales como, por ejemplo, la presión osmótica. Otras formas de dosificación tópicas adecuadas incluyen preparaciones en aerosol rociables en donde el ingrediente activo, en algunas instancias, en combinación con un vehículo inerte sólido o líquido, se empaca en una mezcla con un agente volátil presurizado (por ejemplo, un propelente gaseoso, tal como freón) o en una botella apretable. También se pueden agregar humedecedores o humectantes a las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación si se desea. Los ejemplos de estos ingredientes adicionales son bien conocidos en este campo.

Si las composiciones que comprenden los anticuerpos o los fragmentos de los mismos, se administran intranasalmente, se pueden formular en una forma de aerosol, aspersión, niebla, o en la forma de gotas. En particular, los agentes profilácticos o terapéuticos para usarse de acuerdo con la presente invención se pueden suministrar de una manera conveniente en la forma de una presentación de aspersión en aerosol a partir de paquetes presurizados o de un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado (por ejemplo, dicloro-difluoro-metano, tricloro-fluoro-metano, dicloro-tetrafluoro-etano, dióxido de carbono, u otro gas adecuado). En el caso de un aerosol presurizado, la unida de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos (compuestos, por ejemplo, de gelatina), para utilizarse en un inhalador o insuflador, conteniendo una mezcla en polvo del compuesto y una base de polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.

Los métodos para su co-administración o el tratamiento con un segundo agente terapeutico, por ejemplo, una citoquma, esteroide, agente quimioterapéutico, antibiótico, o radiación, se conocen en la téenica (véase, por ejemplo, Hardman y colaboradores (Editores) (2001 ) Goodman y Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10a Edición, McGraw-Hill, Nueva York, N.Y.; Poole y Peterson (Editores) (2001 ) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams y Wilkins, Fila., Pa.; Chabner y Longo (Editores) (2001 ) Cáncer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams y Wilkins, Fila. , Pa.). Una cantidad efectiva del producto terapéutico puede disminuir los síntomas por cuando menos el 10 por ciento; por cuando menos el 20 por ciento; por cuando menos aproximadamente el 30 por ciento; por cuando menos el 40 por ciento, o por cuando menos el 50 por ciento.

Se pueden administrar terapias adicionales (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos), las cuales se pueden administrar en combinación con los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, con menos de 5 minutos de separación, con menos de 30 minutos de separación, con 1 hora de separación, con aproximadamente 1 hora de separación, con aproximadamente 1 a aproximadamente 2 horas de separación, con aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas de separación, con aproximadamente 3 horas a aproximadamente 4 horas de separación, con aproximadamente 4 horas a aproximadamente 5 horas de separación, con aproximadamente 5 horas a aproximadamente 6 horas de separación, con aproximadamente 6 horas a aproximadamente 7 horas de separación, con aproximadamente 7 horas a aproximadamente 8 horas de separación, con aproximadamente 8 horas a aproximadamente 9 horas de separación, con aproximadamente 9 horas a aproximadamente 10 horas de separación, con aproximadamente 10 horas a aproximadamente 11 horas de separación, con aproximadamente 1 1 horas a aproximadamente 12 horas de separación, con aproximadamente 12 horas a 18 horas de separación, con 18 horas a 24 horas de separación, con 24 horas a 36 hora de separación, con 36 horas a 48 horas de separación, con 48 horas a 52 horas de separación, con 52 horas a 60 horas de separación, con 60 horas a 72 horas de separación, con 72 horas a 84 horas de separación, con 84 horas a 96 horas de separación, o con 96 horas a 120 horas de separación de los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención. Las dos o más terapias se pueden administrar dentro de una misma cita del paciente.

Los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención y las otras terapias se pueden administrar cíclicamente. La terapia cíclica involucra la administración de una primera terapia (por ejemplo, un primer agente profiláctico o terapéutico) durante un período de tiempo, seguida por la administración de una segunda terapia (por ejemplo, un segundo agente profiláctico o terapéutico) durante un período de tiempo, opcionalmente, seguida por la administración de una tercera terapia (por ejemplo, un tercer agente profiláctico o terapéutico) durante un período de tiempo, y así sucesivamente, y repitiendo esta administración en secuencia, es decir, el ciclo, con el objeto de reducir el desarrollo de resistencia a una de las terapias, con el fin de evitar o reducir los efectos secundarios de una de las terapias, y/o para mejorar la eficacia de las terapias.

En ciertas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención se pueden formular para asegurar una distribución apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrofílicos. Con el objeto de asegurar que los compuestos terapeuticos de la invención crucen la barrera hematoencefálica (BBB) (si se desea), se pueden formular, por ejemplo, en liposomas Para conocer los métodos para la elaboración de liposomas, véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,522,81 1 ; 5,374,548; y 5,399,331. Los liposomas pueden comprender una o más fracciones que sean selectivamente transportadas hacia dentro de células u órganos específicos y, por consiguiente, mejoren el suministro dirigido del fármaco (véase, por ejemplo, V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Las fracciones de dirección de ejemplo incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,416,016 a Low y colaboradores); manosidas (Umezawa y colaboradores (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); anticuerpos (Bloeman y colaboradores (1995) FEBS Lett. 357: 140; Owais y colaboradores (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); receptor tensoactívo de proteína A (Briscoe y colaboradores (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134); página 120 (Schreier y colaboradores (1994) J. Biol. Chem . 269: 9090); véase también K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J. J. Killion; I. J . Fidler (1994) Immunomethods 4: 273.

La invención proporciona protocolos para la administración de la composición farmacéutica que comprende los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, solos o en combinación con otras terapias, a un sujeto que lo necesite. Las terapias (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) de las terapias de combinación de la presente invención se pueden administrar de una manera concomitante o en secuencia a un sujeto. La terapia (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) de las terapias de combinación de la presente invención también se pueden administrar cíclicamente. La terapia cíclica involucra la administración de una primera terapia (por ejemplo, un primer agente profiláctico o terapéutico) durante un período de tiempo, seguida por la administración de una segunda terapia (por ejemplo, un segundo agente profiláctico o terapéutico) durante un período de tiempo, y repitiendo esta administración en secuencia, es decir, el ciclo, con el objeto de reducir el desarrollo de resistencia a una de las terapias (por ejemplo, los agentes) con el fin de evitar o reducir los efectos secundarios de una de las terapias (por ejemplo, los agentes), y/o para mejorar, la eficacia de las terapias.

Las terapias (por ejemplo, los agentes profilácticos o terapéuticos) de las terapias de combinación de la invención se pueden administrar a un sujeto de una manera concurrente. El término "de una manera concurrente" no se limita a la administración de las terapias (por ejemplo, los agentes profilácticos o terapéuticos) exactamente al mismo tiempo, sino que en su lugar, esto significa que la composición farmacéutica, la cual comprende los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, se administra a un sujeto en una secuencia y dentro de un intervalo de tiempo, de tal manera que los anticuerpos de la invención puedan actuar junto con las otras terapias, para proporcionar un mayor beneficio que si se administraran de otra manera. Por ejemplo, cada terapia se puede administrar a un sujeto al mismo tiempo o en secuencia en cualquier orden en diferentes puntos del tiempo; sin embargo, si no se administran al mismo tiempo, se deben administrar suficientemente cerca en el tiempo como para proporcionar el efecto terapéutico o profiláctico deseado. Cada terapia se puede administrar a un sujeto por separado, en cualquier forma apropiada, y por cualquier vía adecuada. En diferentes modalidades, las terapias (por ejemplo, los agentes profilácticos o terapéuticos) se administran a un sujeto con menos de 15 minutos, con menos de 30 minutos, con menos de 1 hora de separación, con aproximadamente 1 hora de separación, con aproximadamente 1 hora a aproximadamente 2 horas de separación, con aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas de separación, con aproximadamente 3 horas a aproximadamente 4 horas de separación, con aproximadamente 4 horas a aproximadamente 5 horas de separación, con aproximadamente 5 horas a aproximadamente 6 horas de separación, con aproximadamente 6 horas a aproximadamente 7 horas de separación, con aproximadamente 7 horas a aproximadamente 8 horas de separación, con aproximadamente 8 horas a aproximadamente 9 horas de separación, con aproximadamente 9 horas a aproximadamente 10 horas de separación, con aproximadamente 10 horas a aproximadamente 1 1 horas de separación, con aproximadamente 1 1 horas a aproximadamente 12 horas de separación, con 24 horas de separación, con 48 horas de separación, con 72 horas de separación, o con 1 semana de separación. En otras modalidades, las dos o más terapias (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) se administran dentro de una misma cita del paciente.

Los agentes profilácticos o terapéuticos de las terapias de combinación se pueden administrar a un sujeto en la misma composición farmacéutica. De una manera alternativa, los agentes profilácticos o terapéuticos de las terapias de combinación se pueden administrar de una manera concurrente a un sujeto en composiciones farmacéuticas separadas. Los agentes profilácticos o terapéuticos se pueden administrar a un sujeto por la misma o diferentes vías de administración.

Habiéndose descrito completamente la invención, se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos y reivindicaciones, los cuales son ilustrativos y no pretenden ser adicionalmente limitantes.

EJEMPLOS Ejemplo 1 : Metodos, Materiales y Rastreo de Anticuerpos (i) Líneas celulares Las líneas celulares SK-Br-3, BT-474 y MCF-7 se adquirieron en ATCC y se mantuvieron rutinariamente en un medio de crecimiento complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 por ciento. (ii) Generación de Vectores de HER3 Recombinantes Humano, de Cinomolgo, de Ratón, y de Rata El dominio extracelular de HER3 de murino se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir del ADNc de cerebro de ratón (Clontech), y se verificó la secuencia mediante una comparación con Refseq NM_010153. Rata HER3 ECD se transcribió inversamente a partir del ARNm de células de Rata-2, y se verificó la secuencia mediante una comparación con NM_017218. Se generó la plantilla de ADNc de HER3 de cinomolgo utilizando ARN a partir de diferentes tejidos de cinomolgo (Zyagen Laboratories), y el producto de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) se clonó en pCR®-TOPO-XL (Invitrogen) antes de la secuenciación de ambas cadenas. El HER3 humano se derivó a partir de una biblioteca de ADNc de cerebro fetal humano (Source), y se verificó la secuencia mediante una comparación con NM_001982.

Para generar las proteínas recombinantes marcadas, el HER3 humano, de ratón, de rata, y de cinomolgo se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando polimerasa Pwo Taq (Roche Diagnostics). Los productos amplificados mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se purificaron en gel y se clonaron en un vector de entrada Gateway pDonR201 (Invitrogen) que se había modificado anteriormente para incluir una secuencia líder CD33 N-terminal dentro del marco y un TAG C-terminal, por ejemplo, FLAG TAG. El TAG permite la purificación de las proteínas monomericas por medio de un anticuerpo monoclonal anti-TAG. Los genes objetivo se flanquearon con AttB1 y AttB2, permitiendo la recombinación en los vectores de destino registrados adaptados por Gateway (por ejemplo, pcDNA3.1 ), utilizando la teenología de clonación Gateway® (Invitrogen). Las reacciones de recombinación se llevaron a cabo utilizando una reacción LR Gateway con vectores de destino registrados que contenían un promotor CMV, para crear los vectores de expresión de TAG, aunque se puede utilizar cualquier vector comercialmente disponible.

Se generaron otras proteínas de HER3 recombinantes que se fusionaron con el ECD de HER3 corriente arriba de un sitio de disociación del Factor X C-terminal y la articulación de IgG humana y el dominio Fe, para crear una proteína marcada por Fe. Para lograr esto, las diferentes ECDs del HER3 se amplificaron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y se clonaron en un vector (por ejemplo, pcDNA3.1 ) modificado para contener una fusión C-terminal dentro del marco del sitio del Factor X-Articulación-hFc.

El marco de lectura abierta generado se flanqueó con los sitios AttB1 y AttB2 para su clonación adicional con la teenología de clonación recombinante Gateway® (Invitrogen). Se utilizó una reacción LR Gateway para transferir el HER3-Fc hasta una construcción de expresión de destino que contenía un promotor CMV. Se generaron construcciones de expresión de mutación puntual de HER3 empleando los protocolos convencionales de mutagenesis dirigida al sitio, y se verificaron las secuencias de los vectores resultantes.

Tabla 2 Generación de vectores de expresión de HER3. La numeración de aminoácidos de HER3 se basa en NP_001973 (humano), NP_034283 (ratón), y NP_058914 (rata). (iii) Expresión de Proteínas de HER3 Recombinante Las proteínas recombinantes de HER3 deseadas se expresaron en las líneas celulares derivadas de HEK293 previamente adaptadas al cultivo en suspensión, y se hicieron crecer en un medio sin suero registrado de Novartis. La verificación de la expresión a pequeña escala se emprendió en ensayos de transfección transitoria de placa de 6 pozos con base en lipofección. La producción de proteína a gran escala por medio de transfección transitoria se llevó a cabo en la escala de 10 a 20 litros en el sistema de bio-reactor WaveMR (Wave Biotech). Se utilizó Polietilenimina de ADN (Polisciences) como un portador de plásmido en una proporción de 1 :3 (peso:peso). Los sobrenadantes del cultivo celular se cosecharon a los 7-10 días despues de la transfección, y se concentraron mediante filtración de flujo cruzado y diafiltración antes de la purificación. (iv) Purificación de Proteína Marcada Las proteínas de HER3 marcadas recombinantes (por ejemplo, TAG-HER3) se purificaron recolectando el sobrenadante de cultivo celular y concentrando 10 veces mediante filtración de flujo cruzado con un filtro de corte de 10 kDa (Fresenius). Se preparó una columna de anti-TAG mediante el acoplamiento de un anticuerpo monoclonal anti-TAG a Sepharose 4B activada por CNBr en una proporción final de 10 miligramos de anticuerpo por mililitro de resina. El sobrenadante concentrado se aplicó a una columna de 35 mililitros de anti-Marca a una velocidad de flujo de 1 a 2 mililitros/minuto. Después de lavar la línea de base con PBS, el material enlazado se eluyó con glicina 100 mM (pH de 2.7), se neutralizó, y se filtró para esterilizarse. Las concentraciones de proteína se determinaron midiendo la absorbencia a 280 nanómetros y se convirtieron utilizando un factor de conversión teórica de 0.66 AU/mg. La proteína purificada se caracterizó finalmente mediante SDS-PAGE, secuenciación N-terminal, y LC-MS. (v) Purificación de Marca Fe El sobrenadante de cultivo celular concentrado se aplicó a una columna de Flujo Rápido de Sepharose de 50 mililitros de Proteína A, a una velocidad de flujo de 1 mililitro/minuto. Despues del lavado de la línea base con PBS, la columna se lavó con 10 volúmenes de columna de NaH2P04 10 mM / 30 por ciento (volumen/volumen) de isopropanol, pH de 7.3, seguidos por 5 volúmenes de columna de PBS. Finalmente, el material enlazado se eluyó con Citrato 50 mM / NaCI 140 mM (pH de 2.7), se neutralizó, y se esterilizó mediante filtración. (vi) Paneos de HuCAL PLATINUM® Para la selección de anticuerpos que reconocen el HER3 humano, se emplearon múltiples estrategias de paneo. Los anticuerpos terapéuticos contra la proteína de HER3 humano se generaron mediante la selección de clones que tenían altas afinidades de enlace, utilizando como la fuente de las proteínas variantes de anticuerpos, una biblioteca de exhibición de fagos comercialmente disponible, la biblioteca MorphoSys HuCAL Platinum®. La biblioteca de fagémidos se basa en el concepto HuCAL® (Knappik y colaboradores (2000), J Mol Biol 296: 57-86), y emplea la teenología CysDisplay® para la exhibición de los fragmentos Fab sobre la superficie del fago (Publicación Internacional Número W001 /05950 a Lohning).

Para el aislamiento de los anticuerpos anti-HER3, se llevaron a cabo estrategias de paneo estándares así como RapMAT, utilizando planteamientos de paneo de células enteras en fase sólida, en solución, de células enteras, y diferencial. (vii) Paneo en fase sólida Para identificar los anticuerpos anti-HER3, se llevaron a cabo una variedad de estrategias de paneo en fase sólida utilizando diferentes proteínas de HER3 recombinantes. Para llevar a cabo cada ronda de paneo en fase sólida, las placas Maxisorp (Nunc) se recubrieron con proteína de HER3. Las proteínas marcadas fueron capturadas usando placas previamente recubiertas con anticuerpo anti-Fc (o IgG de cabra o de ratón anti-humano, Jackson Immuno Research), anticuerpo anti-Marca, o mediante adsorción pasiva. Las placas recubiertas se lavaron con PBS y se bloquearon. Las placas recubiertas se lavaron dos veces con PBS antes de la adición de los fagos-anticuerpos HuCAL Platinum® durante 2 horas a temperatura ambiente en un agitador. Los fagos enlazados se eluyeron y se añadieron a TG-1 de E. coli, y se incubaron para la infección de fagos. Posteriormente, las bacterias infectadas se aislaron y se cultivaron sobre placas de agar. Las colonias se rasparon de las placas y los fagos se rescataron y se amplificaron. Cada estrategia de paneo de HER3 comprendió rondas individuales de paneo y contenía antígenos únicos, las concentraciones de antígenos, y la restringencia del lavado. (viii) Paneo en fase de solución Cada ronda de paneo en fase de solución se llevó a cabo utilizando diversas proteínas de HER3 recombinantes biotiniladas en la presencia o en ausencia de neurregulina 1 - b 1 (R & D Systems). Las proteínas se biotinilaron utilizando el kit de biotinilación EZ-link sulfo-NHS-LC (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 800 microlitros de perlas magneticas enlazadas a estreptavidina (Dynabeads, Dynal) se lavaron una vez con PBS y se bloquearon durante la noche con Chemiblocker (Chemicon). Los fagos-anticuerpos HuCAL Platinum® y el HER3 biotinilado apropiado se incubaron en un tubo de reacción. Las perlas magnéticas de estreptavidina se agregaron durante 20 minutos y se recolectaron con un separador de partículas magnéticas (Dynal). Los fagos enlazados se eluyeron a partir de las Dynabeads mediante la adición de regulador que contenía DTT a cada tubo, y se agregaron a E. coli TG-1. La infección del fago se llevó a cabo de una manera idéntica a la descrita en el paneo en fase sólida. Cada estrategia de paneo de HER3 estuvo comprendida de rondas individuales de paneo y contuvo antígenos únicos, las concentraciones de antígenos, y la restringencia del lavado. Con el objeto de aislar los anticuerpos dirigidos hacia un epítopo específico, se llevaron a cabo paneos de competición. En estas estrategias de paneo, el HER3 se incubó y se bloqueó previamente con un anticuerpo de referencia antes de la adición de los fagos-anticuerpos HuCAL Platino®. Como una estrategia alternativa, se utilizaron los anticuerpos de referencia para eluir específicamente los fagos-anticuerpos que formaran complejo con HER3. (ix) Paneo basado en celulas Para los paneos de células, los fagos-anticuerpos HuCAL Platinum® se incubaron con aproximadamente 107 células sobre un aparato giratorio durante 2 horas a temperatura ambiente, seguido por centrifugación. El aglomerado celular fue aislado, y se eluyeron los fagos de las células Se recolectó el sobrenadante y se agregó al cultivo de E. coli TG-1 , continuando con el proceso descrito anteriormente. Se emplearon dos estrategias basadas en células para identificar los anticuerpos anti-HER3: a) Paneo de células enteras: En esta estrategia se usaron una variedad de líneas celulares intactas como los antígenos. b) Paneo diferencial de células enteras: En esta estrategia, los antígenos consistieron secuencialmente en células y proteínas recombinantes de HER3. Los paneos basados en células se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente, mientras que se emplearon los protocolos de paneo en fase sólida cuando se utilizaron las proteínas recombinantes como antígenos. Los lavados se realizaron usando PBS (2-3X) y PBST (2-3X). (x) Generación de biblioteca RapMATMR y paneos Con el fin de aumentar la afinidad de enlace del anticuerpo mientras que se mantenía la diversidad de la biblioteca, se introdujo la producción de la segunda ronda de paneos tanto en fase de solución como en fase sólida, en el proceso RapMATMR, mientras que se introducía la producción de la tercera ronda de las estrategias de paneo de células enteras y de diferencial de células enteras (Prassler y colaboradores (2009) Immunotherapy; 1 : 571 -583). Las bibliotecas RapMATMR se generaron mediante la subclonación de los insertos que codificaban Fab de los fagos seleccionados a traves del paneo en el vector de exhibición pMORPH® 25_bla_LHC, y se digirieron adicionalmente para generar ya sea las bibliotecas H-CDR2 RapMATMR o las bibliotecas L-CDR3 RapMATMR utilizando enzimas de restricción específicas Las inserciones fueron reemplazadas con los casetes de maduración TRIM (Virnekas y colaboradores (1994) Nucleic Acids Research 22: 5600-5607) para H-CDR2 o L-CDR3 de acuerdo con la composición de la reserva. Se estimó que los tamaños de biblioteca estuvieron en el intervalo de entre 8x106 - 1 x108 clones Se produjeron anticuerpos-fagos RapMAT, y se sometieron a dos rondas adicionales de paneo en solución, en fase sólida, o basado en células, empleando los métodos experimentales descritos anteriormente.

Esta extensa estrategia de paneo, que involucra un refinamiento iterativo del diseño de la biblioteca, se desarrolló específicamente para empujar el rastreo alejándose de los anticuerpos competitivos con el ligando puros, mediante la inclusión de los anticuerpos bloqueadores del ligando directamente en los paneos. En segundo lugar, se adaptó el proceso de conversión de FAB a IgG para maximizar la recuperación de los clones candidatos, y para asegurar que se perfilaran todos los enlazadores selectivos en los ensayos funcionales. A partir de 44 paneos iniciales, que proporcionaron más de x clones, solamente tres familias de anticuerpos exhibieron la propiedad deseada de bloquear la transducción de señales tanto dependiente como independiente del ligando. La familia A que se enlaza a los dominios 1 -2 y 2 de Her3 aislados. La familia B que se enlaza a los dominios 3-4 aislados, pero no al 4 solo; y la familia C, que se enlaza al dominio 3.

Ejemplo 2: Expresión transitoria de IgGs anti-HER3 Las celulas HEK293-6E adaptadas en suspensión se cultivaron en un BioWave20. Las células se transfectaron transitoriamente con la mezcla estéril relevante de ADN:PEI y se cultivaron adicionalmente. Después de la transfección, las células se retiraron por filtración de flujo cruzado usando filtros Fresenius. El material libre de células se concentró mediante filtración de flujo cruzado usando un filtro de corte (Fresenius), y el concentrado se esterilizó por filtración a través de un filtro Stericup. El sobrenadante estéril se guardó a 4°C.

Ejemplo 3: Purificación de IgG anti-HER3 La purificación de IgG se hizo en un sistema de cromatografía ÁKTA 100 Explorer Air en una cabina de enfriamiento, usando una columna XK16/20 con 25 mililitros de resina MabSelect SuRe auto-empaquetada (todo de GE Healthcare). Todas las velocidades de flujo fueron de 3.5 mililitros/minuto, excepto la carga, a un límite de presión de 5 bar. La columna se equilibró con 3 volúmenes de columna de suero regulado con fosfato (PBS) antes de cargar el sobrenadante de fermentación filtrado. La columna se lavó con suero regulado con fosfato (PBS). La IgG se eluyó con un gradiente de pH , empezando con citrato / NaCI (pH de 4.5), yendo linealmente hacia abajo hasta citrato / NaCI (pH de 2.5), seguido por un paso constante del mismo regulador de pH de 2.5. Las fracciones que contenían I g G se reunieron e inmediatamente se neutralizaron y se esterilizaron por filtración (Millipore Steriflip, 0.22 mieras). Se midió la D02eo y se calculó la concentración de proteina basándose en los datos de la secuencia. Las fracciones reunidas se probaron separadamente para determinar la aglomeración (SEC-MALS) y la pureza (SDS-PAGE y MS).

Ejemplo 4: Expresión y purificación de anticuerpos HuCAL®-Fab en E. coli La expresión de los fragmentos Fab codificados por pMORPH®X9_Fab_MH en celulas TG-1 se hizo en cultivos de matraz agitado usando el medio YT complementado con cloranfenicol. Los cultivos se agitaron hasta que la D06oonm alcanzó 0.5. La expresión se indujo agregando IPTG (isopropil-3-D-tiogalactopiranosida). Las células se rompieron usando lisozima. Los fragmentos Fab con marca de His6 se aislaron por medio de IMAC (Bio-Rad). El regulador se intercambió a suero regulado con fosfato (PBS) de Dulbecco 1 x (pH de 7.2) usando columnas PD10. Las muestras se esterilizaron por filtración. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante espectrofotometría UV. La pureza de las muestras se analizó en SDS al 15 por ciento-PAGE desnaturalizante reductora. La homogeneidad de las preparaciones de Fab se determinó en estado nativo mediante cromatografía de exclusión de tamaños (HP-SEC) con estándares de calibración.

Ejemplo 5: Mediciones de la afinidad (KD) del anticuerpo de HER3 por medio de titulación de la solución en equilibrio (SET) La determinación de la afinidad en solución se hizo esencialmente como se describió anteriormente (Friguet y colaboradores (1985), J Immunol Methods 77: 305-19). Para mejorar la sensibilidad y exactitud del metodo SET, se transfirió del ELISA clásico hasta la teenología basada en ECL (Haenel y colaboradores (2005), Anal Biochem 339: 182-84).

Para la determinación de la afinidad mediante SET se usó HER3-Marca no marcada (de humano, rata, ratón o mono cinomolgo).

Los datos se evaluaron con el software Xlfit (ID Business Solutions) aplicando modelos de ajuste adaptados particularmente. Para la determinación de la KD de cada IgG se usó el siguiente modelo (modificado de acuerdo con Piehler y colaboradores (Piehler y colaboradores (1997) J Immunol Methods 201 : 189-206).

[IgG]: concentración total de IgG aplicada. x: concentración total de antígeno soluble aplicado (sitios de enlace).

Bmax: señal máxima de IgG sin antígeno.

KD: afinidad.

Ejemplo 6: Determinación del enlace de celula-anticuerpo por medio de FACS El enlace de los anticuerpos al antígeno humano endógeno expresado sobre células de cáncer humanas se evaluó mediante FACS. Para determinar los valores de CE50 del anticuerpo, las células SK-Br-3 se cosecharon con acutasa y se diluyeron a 1 x 106 células/mililitro en regulador FACS (PBS/3% FBS/0.2% NaN3). Se agregaron 1 x 105 células/pozo a cada pozo de una placa de 96 pozos (Nunc), y se centrifugaron a 210 g durante 5 minutos a 4°C antes de remover el sobrenadante. Se agregaron diluciones seriadas de los anticuerpos de prueba (diluidos en pasos de dilución de 1 :4 con regulador FACS) a las células aglomeradas, y se incubaron durante 1 hora sobre hielo. Las células se lavaron y se aglomeraron tres veces con 100 microlitros de regulador FACS. Se agregó a las células la IgG de cabra anti-humano conjugada con PE (Jackson ImmunoResearch), diluida a 1 /200 con regulador FACS, y se incubó sobre hielo durante 1 hora. Se hicieron pasos de lavado adicionales tres veces con 100 microlitros de regulador FACS, seguidos por pasos de centrifugación a 210 g durante 5 minutos a 4°C. Finalmente, las células se volvieron a suspender en 200 microlitros de regulador FACS y los valores de fluorescencia se midieron con FACSArray (BD Biosciences). La cantidad de anticuerpo anti-HER3 enlazado en la superficie celular se determinó midiendo la fluorescencia del canal promedio.

Ejemplo 7: Enlace del dominio y mutante de HER3 Las placas Maxlsorp de 96 pozos (Nunc) se recubrieron durante la noche con 200 nanogramos de la proteína humana recombinante apropiada (HER3-Marca, D1-2-Marca, D2-Marca, D3-4-Marca, D4-Marca, HER3 K267A-Marca, HER3 L268A-Marca, HER3 K267A/L268A y un control irrelevante marcado). Todos los pozos se lavaron luego con suero regulado con fosfato (PBS) / Tween-20 al 0.1 por ciento, se bloquearon con suero regulado con fosfato (PBS) / albúmina de suero bovino (BSA) al 1 por ciento / Tween-20 al 0.1 por ciento, y se lavaron con suero regulado con fosfato (PBS) / Tween-20 al 0.1 por ciento. Se agregaron los anticuerpos anti-HER3 a los pozos relevantes hasta una concentración final de 10 microgramos/ mililitro, y se incubaron a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con suero regulado con fosfato (PBS) / Tween-20 al 0.1 por ciento antes de la adición del anticuerpo de detección enlazado con peroxidasa apropiado diluido a 1/10,000 en suero regulado con fosfato (PBS) / albúmina de suero bovino (BSA) al 1 por ciento / Tween-20 al 0.1 por ciento. Los anticuerpos de detección utilizados fueron de cabra anti-ratón (Pierce, 31432), de conejo anti-cabra (Pierce, 31402), y de cabra anti-humano (Pierce, 31412). Las placas se incubaron a temperatura ambiente antes del lavado con suero regulado con fosfato (PBS) / Tween-20 al 0.1 por ciento. Se agregaron 100 microlitros de la solución de sustrato de TMB (3,3’, 5,5’-tetrametil-bencidina) (BioFx) a todos los pozos antes de detener la reacción con 50 microlitros de H2SO4 al 2.5 por ciento. El grado de enlace del anticuerpo de HER3 a cada proteína recombinante se determinó mediante la medición de la OD 45o utilizando un lector de placas SpectraMax (Molecular Devices). Donde sea apropiado, las curvas de respuesta a la dosis se analizaron utilizando Graphpad Prism.

Ejemplo 8: Competición cruzada de anticuerpo mediante ELISA El anticuerpo A se recubrió en una cantidad constante sobre las placas Maxisorp, y se probó para determinar la competencia del enlace con HER3 con cantidades crecientes del anticuerpo B en solución. Las placas Maxisorp se recubrieron con 24 nanogramos / pozo del anticuerpo A en suero regulado con fosfato (PBS), se incubaron durante la noche a 4°C, y luego se lavaron con PBST. Las placas se bloquearon con el 3 por ciento de BSA/PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo B se tituló en 1 :3 pasos y se incubó en un exceso molar con HER3-Marca biotinilada durante 1 hora a temperatura ambiente en solución. Entonces se agregaron los complejos de HER3/anticuerpo B a la placa recubierta con el anticuerpo A durante 30 minutos, y los complejos enlazados se detectaron mediante la cuantificación de la cantidad de HER3-Marca biotinilada. Las placas bloqueadas se lavaron subsiguientemente con PBST, se agregaron los complejos de HER3/anticuerpo B previamente formados, y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. Las placas subsiguientemente se lavaron con un exceso de PBST, y se incubaron durante 1 hora con estreptavidina-AP diluida a 1 :5000 en albúmina de suero bovino (BSA) al 1 por ciento/Tween 20 al 0.05 por ciento/suero regulado con fosfato (PBS). Las placas se lavaron con PBST, se agregó una solución de AttoPhos (1 :5 diluido en H2O), y se midieron las señales fluorescentes a 535 nanómetros en seguida de la excitación a 430 nanómetros.

Si el anticuerpo A no competía con el anticuerpo B para enlazarse a HER3, entonces se detectaba un alto nivel de HER3. En contraste, para los anticuerpos competitivos o los anticuerpos con epítopos parcialmente traslapados, las señales de HER3 disminuyeron significativamente cuando se compararon con los controles de IgG.

Ejemplo 9: Pruebas celulares in vitro de Fosfo-HER3.

Las celulas MCF-7 se mantuvieron rutinariamente en DMEM/F12, HEPES 15 mM, L-glutamina, suero bovino fetal (FBS) al 10 por ciento, BT474 en DMEM, suero bovino fetal al 10 por ciento y SK-Br-3 en el 5a de McCoy, suero bovino fetal (FBS) al 10 por ciento, L-glutamina 1.5 mM. Las células sub-confluentes se tripsinizaron, se lavaron con suero regulado con fosfato (PBS), y se diluyeron hasta 5 x 105 células/mililitro. Entonces se agregaron 100 microlitros de suspensión celular a cada pozo de una placa de fondo plano de 96 pozos (Nunc), para dar una densidad final de 5 x 104 células/pozo. Las células MCF7 se dejaron adherirse durante aproximadamente 3 horas antes de intercambiar el medio por un medio de inanición que contenía suero bovino fetal (FBS) al 0.5 por ciento. Después, todas las placas se incubaron durante la noche a 37°C antes del tratamiento con la concentración apropiada de anticuerpos de HER3 durante 80 minutos a 37°C. Las celulas MCF7 se trataron con 50 nanogramos/mililitro de NRG 1 durante los 20 minutos finales para estimular la fosforilación de HER3 y AKT mientras que las células BT474/SK-Br-3 no requirieron de ninguna estimulación adicional. Todos los medios se aspiraron suavemente y las células se lavaron con suero regulado con fosfato (PBS) enfriado sobre hielo que contenía CaCI2 1 mM y MgCI2 0.5 mM (Gibco). Las células se Usaron mediante la adición de 50 microlitros de regulador de lisis helado (Tris 20 mM (pH de 8.0) / NaCI 137 mM / glicerol al 10 por ciento / EDTA 2mM / NP-40 al 1 por ciento / ortovanadato de sodio 1 mM / 1x Fosfo-Stop / mini-inhibidores de proteasa Complete 1 x (Roche) / PMSF 0.1 mM), y se incubaron sobre hielo con agitación durante 30 minutos. Después, los Usados se recogieron y se centrifugaron a 1800 g durante 15 minutos a 4°C para remover los desechos celulares.

Se generaron placas de captura de HER3 usando una placa de carbono (Mesoscale Discovery) recubierta durante la noche a 4°C con 20 microlitros del anticuerpo de captura MAB3481 (R&D Systems) diluido a 4 microgramos/mililitro en suero regulado con fosfato (PBS), y se bloquearon subsiguientemente con albúmina de suero bovino al 3 por ciento en regulador de Tris 1 x (Mesoscale Discovery) / Tween-20 al 0.1 por ciento. El HER3 se capturó mediante la adición de la cantidad apropiada del Usado, e incubando la placa a temperatura ambiente durante una hora con agitación antes de aspirar el Usado, y los pozos se lavaron con regulador de Tris 1 x (Mesoscale Discovery) / Tween-20 al 0.1 por ciento. El HER3 fosforilado se detectó utilizando 1 :8000 de anticuerpo anti-pY1 197 (Cell Signaling) preparado en leche al 3 por ciento / 1 x Tris / Tween-20 al 0.1 por ciento, incubando con agitación a temperatura ambiente durante 1 hora. Los pozos se lavaron cuatro veces con 1 x Tris / Tween-20 al 0.1 por ciento, y las proteínas fosforiladas se detectaron mediante una incubación con el anticuerpo Ab de cabra anti-conejo marcado con S-Marca (#R32AB) diluido en el regulador de bloqueo al 3 por ciento durante una hora a temperatura ambiente. Cada pozo se aspiró y se lavó cuatro veces con 1 x Tris / Tween-20 al 0.1 por ciento, antes de agregar 20 microlitros del regulador de Lectura T con tensoactivo (Mesoscale Discovery), y la señal se cuantificó utilizando un Mesoscale Sector Imager.

Ejemplo 10: Ensayos celulares in vitro de fosfo-Akt (S473).

Las celulas MCF7, SK-Br-3 y BT-474 subconfluentes se hicieron crecer en el medio completo, se cosecharon con acutasa (PAA Laboratories), y se volvieron a suspender en el medio de crecimiento apropiado en una concentración final de 5 x 105 células/mililitro. Después se agregaron 100 microlitros de suspensión celular a cada pozo de una placa de fondo plano de 96 pozos (Nunc), para producir una densidad final de 5 x 104 células/pozo. Las células MCF7 se dejaron adherirse durante aproximadamente 3 horas antes intercambiar el medio por un medio de inanición que contenía suero bovino fetal (FBS) al 0.5 por ciento. Todas las placas se incubaron durante la noche a 37°C antes del tratamiento con la concentración apropiada de anticuerpos de HER3 durante 80 minutos a 37°C. Las celulas MCF7 se trataron con 50 nanogramos/mililitro de NRG1 durante los 20 minutos finales para estimular la fosforilación de HER3 y AKT mientras que las células SK-Br-3 no requirieron de estimulación adicional. Todo el medio se aspiró suavemente y las células se lavaron con suero regulado con fosfato (PBS) enfriado sobre hielo que contenía CaCI2 1 mM y MgCI2 0.5 mM (Gibco). Las células se Usaron agregando 50 microlitros del regulador de lisis enfriado sobre hielo (Tris 20 mM (pH de 8.0) / NaCI 137 mM / glicerol al 10 por ciento / EDTA 2 mM / NP-40 al 1 por ciento / ortovanadato de sodio 1 mM / aprotinina (10 microgramos/ mililitro) / leupeptina (10 microgramos/mililitro)), y se incubaron sobre hielo con agitación durante 30 minutos. Después, los Usados se recolectaron y se centrifugaron a 1800 g durante 15 minutos a 4°C para remover todos los desechos celulares. Se agregaron 20 microlitros del Usado a una placa de carbono Phospho-Akt Multi-Spot de 384 pozos (Mesoscale Discovery), que previamente se habían bloqueado con albúmina de suero bovino (BSA) al 3 por ciento / Tris 1x / Tween-20 al 0.1 por ciento. La placa se incubó a temperatura ambiente durante dos horas con agitación antes de aspirar el Usado, y los pozos se lavaron cuatro veces con regulador de Tris 1 x (Mesoscale Discovery) / Tween-20 al 0.1 por ciento. La Akt fosforilada se detectó usando 20 microlitros del anticuerpo SULFO-TAG anti-fosfo-Akt (S473) (Mesoscale Discovery) diluido 50 veces en albúmina de suero bovino (BSA) al 1 por ciento / Tris 1 x / Tween-20 al 0.1 por ciento, incubando con agitación a temperatura ambiente durante 2 horas. Los pozos se lavaron cuatro veces con Tris 1 x / Tween-20 al 0.1 por ciento, antes de agregar 20 microlitros del regulador de Lectura T con tensoactivo (Mesoscale Discovery), y la señal se cuantificó usando un Mesoscale Sector Imager.

Ejemplo 11 : Pruebas de proliferación de la línea celular.

Las celulas SK-Br-3 se cultivaron rutinariamente en un medio de McCoy 5A modificado, complementado con suero bovino fetal al 10 por ciento, y las células BT-474 se cultivaron en DMEM complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 por ciento. Las células subconfluentes se tripsinizaron, se lavaron con suero regulado con fosfato (PBS), se diluyeron a 5 x 104 células/mililitro con el medio de crecimiento, y se sembraron en placas negras de fondo transparente de 96 pozos (Costar 3904) a una densidad de 5,000 células/pozo. Las células se incubaron durante la noche a 37°C antes de agregar la concentración apropiada del anticuerpo de HER3 (concentraciones finales típicas de 10 o 1 microgramo/ mililitro). Las placas se regresaron a la incubadora durante 6 días antes de determinar la viabilidad celular usando el CelITiter-Glo (Promega). A cada pozo se le agregaron 100 microlitros de la solución CelITiter-Glo, y se incubaron a temperatura ambiente con agitación suave durante 10 minutos. La cantidad de luminiscencia se determinó utilizando un lector de placas SpectraMax (Molecular Devices). La magnitud de la inhibición de crecimiento obtenida con cada anticuerpo se calculó comparando los valores de luminiscencia obtenidos con cada anticuerpo de HER3 con un anticuerpo de control estándar de isotipo.

Para las pruebas de proliferación, las células MCF-7 se cultivaron rutinariamente en DM EM / F12 (1 : 1 ) que contenía L-glutamina 4 mM / HEPES 15 mM / FBS al 10 por ciento. Las células subconfluentes se tripsinizaron, se lavaron con suero regulado con fosfato (PBS) y se diluyeron a 1 x105 células/mililitro con DMEM / F12 (1 : 1 ), que contenía L-glutamina 4 mM/ HEPES 15mM / 10 micro-gramos/mililitro de transferrina humana / albúmina de suero bovino (BSA) al 0.2 por ciento. Las células se sembraron en placas negras de fondo transparente de 96 pozos (Costar) a una densidad de 5,000 células/pozo. Entonces se agregó la concentración apropiada del anticuerpo de HER3 (concentraciones finales típicas de 10 o 1 microgramo/mililitro). También se agregaron 10 nanogramos/ mililitro del dominio EGF de NRGI -bI (R&D Systems) a los pozos apropiados para estimular el crecimiento celular. Las placas se regresaron a la incubadora durante 6 días antes de determinar la viabilidad celular usando CelITiter-Glo (Promega). La magnitud de la inhibición de crecimiento obtenida con cada anticuerpo se calculó restando los valores de luminiscencia de fondo (sin neurregulina) y comparando los valores resultantes obtenidos con cada anticuerpo anti-HER3 con un anticuerpo de control estándar del isotipo.

Ejemplo 12: Estudios de eficacia de BxPC3 ¡n vivo Se cultivaron células BxPC3 en un medio RPMI-1640 que contenía suero de bovino fetal al 10 por ciento inactivado por calor sin antibióticos hasta el momento de la implantación.

Se implantaron subcutáneamente a ratones nu/nu Balb/C hembras atímicos (Harían Laboratories), 10 x 106 celulas en una mezcla de solución salina regulada con fosfato al 50 por ciento con Matrigel al 50 por ciento. El volumen de inyección total que contenía células en suspensión fue de 200 litros. Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño de aproximadamente 200 mm3, se inscribió a los animales en el estudio de eficacia. En general, se inscribió un total de 10 animales por grupo en los estudios. Se excluyó a los animales de la inscripción si exhibían características inusuales de crecimiento del tumor antes de la inscripción.

Se dosificó a los animales intravenosamente por medio de inyección en la vena lateral de la cola. Los animales estuvieron en un programa de 20 miligramos/kilogramo, dos veces por semana, por la duración del estudio. El volumen tumoral y los valores de T/C se calcularon como se detalla para los estudios de BT-474.

Ejemplo 13: Estudios de eficacia de BT-474 in vivo Se cultivaron células BT-474 en un medio DMEM que contenía suero de bovino fetal al 10 por ciento inactivado por calor sin antibióticos hasta el momento de la implantación.

Un día antes de la inoculación de las células, se implantó subcutáneamente a ratones nu/nu Balb/C hembras atímicos (Harían Laboratories) con un aglomerado de 17 -estradiol de liberación sostenida (Innovative Research of America) para mantener los niveles de estrógeno en suero. Un día después de la implantación del aglomerado de 173-estradiol, se inyectaron ortotópicamente 5 x 106 células en la 4a almohadilla de grasa mamaria en una suspensión que contenía Matrigel al 50 por ciento libre de rojo de fenol (BD Biosciences) en una solución salina balanceada de Hank. El volumen de inyección total que contenía las células en suspensión fue de 200 litros. 20 días después de la implantación de las células, se inscribieron en el estudio de eficacia los animales con un volumen del tumor de aproximadamente 200 mm3. En general, se inscribió un total de 10 animales por grupo en los estudios de eficacia.

Para los estudios con el agente individual, se dosificó a los animales intravenosamente por medio de inyección en la vena lateral de la cola con la IgG de control o con MOR13759. Los animales estuvieron con un programa de dosificación de 20 mili gramos/kilogramo, dos veces por semana, por la duración del estudio. Por la duración de los estudios, el volumen tumoral se midió mediante calibración dos veces por semana. Se calcularon los valores del porcentaje de tratamiento/control (T/C) usando la siguiente fórmula: % de T/C = 100 x DT/DO si DT >0 en donde: T = volumen medio del tumor del grupo tratado con el fármaco en el día final del estudio; DT = volumen medio del tumor del grupo tratado con el fármaco en el día final del estudio - volumen medio del tumor del grupo tratado con el fármaco en el día inicial de la dosificación; C = volumen medio del tumor del grupo control en el día final del estudio; y AC = volumen medio del tumor del grupo control en el día final del estudio - volumen medio del tumor del grupo tratado con el fármaco en el día inicial de la dosificación.

Se midió el peso corporal dos veces por semana y la dosis se ajustó al peso corporal. El porcentaje de cambio en el peso corporal se calculó como (BWactuai - B W¡nic¡ai)/(B Winic¡ai) x 100. Los datos se presentan como el porcentaje de cambio en el peso corporal a partir del día de inicio del tratamiento.

Todos los datos se expresaron con el promedio + error estándar del promedio (SEM). Se usaron el volumen delta del tumor y el peso corporal para el análisis estadístico. Se llevaron a cabo comparaciones entre los grupos usando un ANOVA unidireccional seguid de un Tukey post hoc. Para todas las evaluaciones estadísticas, el nivel de significancia se ajustó a p < 0.05. Se reporta la significancia comparada con el grupo de control de vehículo. Resultados y Discusión Colectivamente, estos resultados muestran que una clase de anticuerpos se enlazan a los residuos de aminoácidos dentro del dominio 2. El enlace de estos anticuerpos inhibe la señalización tanto dependiente del ligando como independiente del ligando. (i) Determinación de afinidad La afinidad del anticuerpo se determinó mediante titulación en equilibrio en solución (SET) como se describió anteriormente. Los resultados se presentan en forma resumida en la Tabla 3, y las curvas de titulación de ejemplo para MOR12616 y MOR12925 están contenidas en la Figura 1. Los datos indican que se identificó un número de anticuerpos que se enlazaron fuertemente al HER3 humano, de cinomolgo, de rata, y de murino.

Tabla 3 Valores de KD de IgGs anti-HER3 según se determina mediante titulación en equilibrio en solución (SET). Hu ( humano), Cy (cinomolgo), Mu (murino) y ra (rata) (i i) Determinación de CE50 en celulas SK-Br-3 La capacidad de los anticuerpos identificados para enlazarse a las células que expresan HER3 se determinó calculando los valores de CE50 para su enlace a la línea celular amplificada con HER2, SK-Br-3 (véase la Figura 2 y la Tabla 4).

Tabla 4 Valores de ECS0 de FACS de IgG anti-HER3 en las células (iii) Enlace al dominio de HER3 Se caracterizó un subconjunto de anticuerpos anti-HER3 respecto para determinar su capacidad para enlazarse a los diversos dominios extracelulares de HER3 humano en un ensayo ELISA. Para lograr esto, el dominio extracelular de HER3 se dividió en sus cuatro dominios constitutivos y se clonaron, se expresaron y purificaron varias combinaciones de dichos dominios como proteínas independientes como se describió anteriormente. Utilizando esta estrategia, se generan exitosamente los siguientes dominios como proteínas solubles: dominios 1 y 2 (D1 -2), dominio 2 (D2), dominios 3 y 4 (D3-4) y dominio 4 (D4). La integridad de cada dominio aislado se confirmó previamente utilizando un panel de anticuerpos internamente generados como los controles positivos.

Como se muestra en la Figura 3, se observó que tanto MOR12616 como MOR12925 se enlazaron al dominio extracelular de HER3, a la D1 -2 aislada, y a la proteína D2 aislada. No se observó enlace alguno con las proteínas D3-4 o D4. Estos datos de enlace sugieren que esta familia de anticuerpos reconoce un epítopo contenido primordialmente dentro del dominio 2. Para confirmar adicionalmente el epítopo, determinamos el impacto de mutar los residuos dentro de D2 después del enlace del anticuerpo. Como se determina mediante tanto el ELISA de enlace (Figura 4) como la SET (Tabla 5), la mutación de Lisina268 a alanina alteró severamente el enlace del anticuerpo, confirmando, por consiguiente, que el epítopo de enlace está contenido dentro del dominio 2.

Tabla 5 Valores K0 del enlace de IgG anti-HER3 a las formas mutantes de HER3, como se determina mediante titulación en equilibrio en solución (SET). v) ELISA de competición de epítopos Con el fin de reafinar adicionalmente el epítopo de esta clase de anticuerpos anti-HER3, llevamos a cabo estudios de competición de epítopos en un sub-conjunto de anticuerpos contra un número de anticuerpos anti-HER3 registrados cuyos epítopos se habían caracterizado anteriormente. Los experimentos de competición de epítopos consisten en el anticuerpo A (por ejemplo, MOR12925 o MOR12616) que se inmoviliza sobre una placa, y se prueba su capacidad para capturar los complejos de HER3/anticuerpo B a partir de una solución. Si el anticuerpo A no compite con el anticuerpo B para enlazarse a H ER3, entonces se capturan los complejos HER3 a partir de una solución. En contraste, si el anticuerpo A posee un epítopo identico o traslapado al anticuerpo B, entonces no se pueden capturar los complejos de HER3. Empleando este método, también se pueden identificar los competidores aloestéricos. En esta instancia, el enlace del anticuerpo B a HER3 podría inducir un cambio de conformación que enmascara el epítopo del anticuerpo A. Por consiguiente, puede parecer que el anticuerpo A y el anticuerpo B compiten directamente incluso cuando sus residuos de enlace de HER3 pueden ser distales unos de otros.

Los datos de competición de epítopos de ejemplo para MOR12925 y MOR 12616 se ilustran en la Figura 5. Como se puede ver a partir de los datos, tanto MOR12925 como MOR12616 compiten de manera cruzada efectivamente para enlazarse a HER3, demostrando, por consiguiente, que estos anticuerpos altamente relacionados probablemente se enlazan al mismo epítopo de H ER3. También se observó la competición cruzada con un anticuerpo (D2/4) cuyo epítopo ha sido mapeado anteriormente en los residuos contenidos dentro de los dominios 2 y 4. Es interesante que no se observó competición con un anticuerpo (D4) que se enlaza al dominio 4 de HER3 aislado. Estos datos sugieren que tanto MOR12925 como MOR12616 se enlazan a un epítopo contenido dentro del dominio 2, lo cual es consistente con nuestro ELISA de enlace de dominio anterior. Debido a que se ha demostrado que el anticuerpo D2/4 interactúa con los residuos de aminoácidos 265-277, 315 dentro del dominio 2 de HER3, se puede inferir que algunos de estos residuos también pueden ser críticos para el enlace de MOR12925 y MOR12616. (vi) Inhibición de señalización celular Con el fin de aseverar el efecto de los anticuerpos anti-HER3 sobre la actividad de HER3 dependiente del ligando, las células MCF7 se incubaron con IgG antes de la estimulación con neurregulina. Las curvas de inhibición de ejemplo se ilustran en la Figura 6 y se presentan en forma resumida en la Tabla 6. También se estudió el efecto de los anticuerpos anti-HER3 sobre la activación de HER3 mediada por HER2, utilizando las líneas celulares amplificadas por HER2: SK-Br-3 y BT474 (Figura 7 y Tabla 6).

Tabla 6 IC50 de pHER3 y valores de grado de inhibición de IgG anti-HER3 en células MCF7, BT474 y SK-Br-3 Para determinar si la inhibición de la actividad de HER3 impactaba a la Akt de señalización celular corriente abajo, tambien se midió la fosforilación de las células MCF7 estimuladas por NRG y las células SK-Br-3/BT474 amplificadas por HER2 en seguida del tratamiento con los anticuerpos anti-HER3 (véanse Figura 6, Figura 7, y Tabla 7).

TABLA 7 IC50 de pAkt (S473) y valores del grado de inhibición de IgG anti- HER3 en células SK-Br-3, BT-474 y MCF7 En resumen MOR12509, MOR12510, MOR12616, MOR12923, MOR12924, MOR12925, MOR13750, MOR13752, MOR13754, MOR13755, MOR13756, MOR13758, MOR13759, MOR13761, MOR13762, MOR13763, MOR13765, MOR13766, MOR13767, MOR13768, MOR13867, MOR13868, MOR13869, MOR13870, MOR13871, MOR14535 y MOR14536 son cada uno capaces de inhibirla actividad celularde HER3 de una manera tanto dependiente del ligando como independiente del ligando. (vii) Inhibición de la proliferación Debido a que MOR1 2509,MOR125 0, MOR12616 ,MOR12923, MOR12924, MOR12925, MOR13750, MOR13752, MOR13754, MOR13755, MOR13756, MOR13758, MOR13759, MOR13761, MOR13762, MOR13763, MOR13765, MOR13766, MOR13767, MOR13768, MOR 13867, MOR13868, MOR13869, MOR13870, MOR 13871 , MOR14535 y MOR 14536 inhibieron la actividad de HER3 y la señalización corriente abajo, se probaron para determinar su capacidad para bloquear el crecimiento celular dependiente e independiente del ligando in vitro (los datos de ejemplo se muestran en la Figura 8 y se presentan en forma resumida en la Tabla 8). Los anticuerpos anti-HER3 probados fueron inhibidores efectivos de la proliferación celular, confirmando su capacidad para inhibir los fenotipos impulsados por HER3 dependientes e independientes del ligando.

Tabla 8 Inhibición de la proliferación en seguida del tratamiento con IgG anti-HER3 en celulas SK-Br-3, BT-474 y MCF7 (viii) Inhibición del crecimiento tumoral in vivo Con el fin de determinar la actividad in vivo del anticuerpo anti-HER3 descrito, se probó MOR13759 en ambos modelos de tumor BxPC3 y BT-474. El tratamiento repetido con MOR13759 proporcionó una regresión del 29.1 por ciento para el modelo BxPC3 (Figura 9A). El tratamiento del modelo BT474 con MOR13759 dio como resultado una inhibición del crecimiento tumoral (T/C) del 45 por ciento (Figura 9B).

Incorporación como referencia Todas las referencias citadas en la presente solicitud, incluyendo las patentes, solicitudes de patente, artículos, libros de texto, y similares, y las referencias citadas en los mismos, hasta el grado en que estos no hayan sido incorporados, quedan incorporados como referencia en la presente solicitud en su totalidad.

Equivalentes La memoria descriptiva escrita anterior se considera suficiente para permitir que un experto en la téenica practique la invención. La descripción anterior y los ejemplos presentan con detalle ciertas modalidades preferidas de la invención y describen el mejor modo contemplado por los inventores. Se apreciará, sin embargo, que no importa qué tan detallada aparezca la descripción en el texto, la invención se puede practicar en muchas formas y la invención debe ser considerada de conformidad con las reivindicaciones adjuntas y cualesquiera equivalentes de las mismas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que reconoce un epítopo de un receptor HER3, en donde el epítopo comprende los residuos de aminoácidos 208-328 dentro del dominio 2 del receptor HER3, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo reconoce cuando menos el residuo de aminoácido 268 dentro del dominio 2, y en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo bloquea la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando.

2. El anticuerpo aislado o el fragmento del mismo de la reivindicación 1 , en donde el epítopo se selecciona a partir del grupo que consiste en un epítopo lineal, un epítopo no lineal, y un epítopo conformacional.

3. El anticuerpo aislado o el fragmento del mismo de la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlaza a un estado inactivo del receptor HER3.

4. El anticuerpo aislado o el fragmento del mismo de la reivindicación 1 , en donde el enlace del ligando de HER3 al sitio de enlace del ligando fracasa para activar la transducción de señales de HER3.

5. El anticuerpo aislado o el fragmento del mismo de la reivindicación 1 , en donde un ligando de HER3 se puede enlazar de una manera concurrente al sitio de enlace del ligando sobre el receptor HER3.

6. El anticuerpo aislado o el fragmento del mismo de la reivindicación 5, en donde el ligando de HER3 se selecciona a partir del grupo que consiste en neurregulina 1 (NRG), neurregulina 2, beta-celulina, factor de crecimiento epidérmico que se enlaza a heparina, y epirregulina.

7. El anticuerpo aislado o el fragmento del mismo de la reivindicación 1 , en donde cuando menos el residuo de aminoácido 268 (dentro del dominio 2) afecta al enlace en el dominio 2, bloqueando de esta manera el enlace del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo.

8. El anticuerpo aislado o el fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo tiene una característica seleccionada a partir del grupo que consiste en desestabilizar HER3 de tal manera que sea susceptible a la degradación, acelerar la sub-regulación de HER3 de la superficie celular, inhibir la dimerización con otros receptores HER, y generar un dímero de HER3 no natural que sea susceptible a la degradación proteolítica o que sea incapaz de dimerizarse con otras cinasas de tirosina receptoras.

9. El anticuerpo aislado o el fragmento del mismo de la reivindicación 1 , en donde el enlace del anticuerpo o de un fragmento del mismo al receptor HER3 en ausencia de un ligando de HER3, reduce la formación independiente del ligando de un complejo de proteína de HER2-HER3 en una célula que exprese HER2 y HER3.

10. El anticuerpo aislado o el fragmento del mismo de la reivindicación 9, en donde el receptor HER3 fracasa para dimerizarse con el receptor HER2 para formar un complejo de proteína de HER2-HER3.

1 1 . El anticuerpo aislado o el fragmento del mismo de la reivindicación 10, en donde el fracaso para formar un complejo de proteína de HER2-HER3 impide la activación de la transducción de señales.

12. El anticuerpo aislado o el fragmento del mismo de la reivindicación 9, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo inhibe la fosforilación de HER3 como se evalúa mediante un ensayo de fosforilación independiente del ligando de HER3.

13. El anticuerpo aislado o el fragmento del mismo de la reivindicación 12, en donde el ensayo de fosforilación independiente del ligando de HER3 utiliza células amplificadas por HER2, en donde las células amplificadas por HER2 son las células SK-Br-3 y BT-474.

14. El anticuerpo aislado o el fragmento del mismo de la reivindicación 1 , en donde el enlace del anticuerpo o de un fragmento del mismo al receptor HER3 en la presencia de un ligando de HER3, reduce la formación de un complejo de proteína de HER2-HER3 dependiente del ligando en una célula que exprese HER2 y HER3.

15. El anticuerpo aislado o el fragmento del mismo de la reivindicación 12, en donde el receptor HER3 fracasa para dimerizarse con el receptor HER2 en la presencia de un ligando de HER3 para formar un complejo de proteína de HER2-HER3.

16. El anticuerpo aislado o el fragmento del mismo de la reivindicación 13, en donde el fracaso para formar un complejo de proteína de HER2-HER3 impide la activación de la transducción de señales.

17. El anticuerpo aislado o el fragmento del mismo de la reivindicación 14, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo inhibe la fosforilación de HER3 como se evalúa mediante el ensayo de fosforilación dependiente del ligando de HER3.

18. El anticuerpo aislado o el fragmento del mismo de la reivindicación 17, en donde el ensayo de fosforilación dependiente del ligando de HER3 utiliza celulas MCF7 estimuladas en la presencia de neurregulina (NRG).

19. El anticuerpo aislado o el fragmento del mismo de la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo se selecciona a partir del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, y un anticuerpo sintético.

20. Un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que reconoce un epítopo de un receptor HER3 dentro del dominio 2 del receptor HER3, en donde el epítopo comprende los residuos de aminoácidos 208-328 dentro del dominio 2 del receptor HER3, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo reconoce cuando menos el residuo de aminoácido 268 dentro del dominio 2, y en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo tiene una disociación (KD) de cuando menos 1 x 107 M 1 , 108 M 1 , 109 M \ 101° M 1 , 1011 M 1 , 1012 M 1, 1013 M 1 , y en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo bloquea la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando.

21. El anticuerpo aislado o el fragmento del mismo de la reivindicación 20, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo inhibe la fosforilación de HER3 como se mide mediante un ensayo de fosforilación in vitro seleccionado a partir del grupo que consiste en fosfo-HER3 y fosfo-Akt.

22. El anticuerpo aislado o el fragmento del mismo de la reivindicación 20, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlaza al mismo epítopo como un anticuerpo descrito en la Tabla 1 .

23. El anticuerpo aislado o el fragmento del mismo de la reivindicación 20, en donde el anticuerpo aislado o el fragmento del mismo compite cruzadamente con un anticuerpo descrito en la Tabla 1 .

24. El anticuerpo aislado o el fragmento del mismo de la reivindicación 20, en donde el fragmento de un anticuerpo se selecciona a partir del grupo que consiste en; Fab, F(ab2)’, F(ab)2’, scFv, VHH, VH , VL, dAbs.

25. Una composición farmaceutica, la cual comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlaza a un receptor HER3 que comprende los residuos de aminoácidos 208-328 dentro del dominio 2 del receptor HER3, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo reconoce cuando menos el residuo de aminoácido 268 dentro del dominio 2, y en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo bloquea la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando.

26. La composición farmacéutica de la reivindicación 25, la cual comprende además un agente terapéutico adicional.

27. La composición farmacéutica de la reivindicación 26, en donde el agente terapéutico adicional se selecciona a partir del grupo que consiste en un inhibidor de HER1 , un inhibidor de HER2, un inhibidor de HER3, un inhibidor de HER4, un inhibidor de mTOR y un inhibidor de cinasa PI3.

28. La composición farmacéutica de la reivindicación 27, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor de HER1 seleccionado a partir del grupo que consiste en Matuzumab (EMD72000), Erbitux® / Cetuximab, Vectibix® / Panitumumab, mAb 806, Nimotuzumab, Iressa® / Gefitinib, CI-1033 (PD183805), Lapatinib (GW-572016), Tykerb® / Ditosilato de lapatinib, Tarceva® / Erlotinib HCL (OSI-774), PKI-166, y Tovok®; un inhibidor de HER2 seleccionado a partir del grupo que consiste en Pertuzumab, Trastuzumab, MM-1 11 , neratinib, lapatinib o ditosilato de lapatinib / Tykerb®; un inhibidor de HER3 seleccionado a partir del grupo que consiste en MM-121 , MM-1 11 , IB4C3, 2DI D12 (U3 Pharma AG), AMG888 (Amgen), AV-203 (Aveo), MEHD7945A (Genentech), MOR10703 (Novartis), y moléculas pequeñas que inhiben HER3; y un inhibidor de HER4.

29. La composición farmaceutica de la reivindicación 27, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor de mTOR seleccionado a partir del grupo que consiste en Temsirolimus / Torisel®, ridaforolimus / Deforolimus, AP23573, MK8669, everolimus / Affi nitor® .

30. La composición farmacéutica de la reivindicación 27, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor de cinasa PI3 seleccionado a partir del grupo que consiste en GDC 0941 , BEZ235, BM K120 y BYL719.

31 . Un método para el tratamiento de un cáncer, el cual comprende seleccionar un sujeto que tenga un cáncer que exprese HER3, administrar al sujeto, una cantidad efectiva de una composición que comprenda un anticuerpo o un fragmento del mismo como se dan a conocer en la Tabla 1 , en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo reconoce un epítopo de un receptor HER3 que comprende los residuos de aminoácidos 208-328 dentro del dominio 2 del receptor HER3, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo reconoce cuando menos el residuo de aminoácido 268 dentro del dominio 2, y en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo bloquea la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando.

32. El método de la reivindicación 31 , en donde el sujeto es un ser humano, y el cáncer se selecciona a partir del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer colo-rectal, cáncer de pulmón, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer gástrico, cáncer pancreático, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, osteosarcoma, carcinoma de células escamosas, tumores periféricos de la vaina de los nervios, schwanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer esofágico, cáncer esofágico de Barretts, glioblastoma, sarcoma de células claras del tejido blando, mesotelioma maligno, neurofibromatosis, cáncer renal, melanoma, cáncer de próstata, hiperplasia prostética benigna (BPH), ginecomastia, y endometriosis.

33. El método de la reivindicación 31 , en donde el cáncer es cáncer de mama.

34. Un anticuerpo o un fragmento del mismo de las reivindicaciones 1 a 30, para utilizarse en el tratamiento de un cáncer mediado por una senda de transducción de señales dependiente del ligando o de transducción de señales independiente del ligando de HER3.

35. Un anticuerpo o un fragmento del mismo de las reivindicaciones 1 a 30, para utilizarse como un medicamento.

36. El uso de un anticuerpo o de un fragmento del mismo de las reivindicaciones 1 a 30, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un cáncer mediado por una senda de transducción de señales dependiente del ligando o de transducción de señales independiente del ligando de HER3, seleccionado a partir del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer colo-rectal, cáncer de pulmón, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer gástrico, cáncer pancreático, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, osteosarcoma, carcinoma de células escamosas, tumores periféricos de la vaina de los nervios, schwanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer esofágico, cáncer esofágico de Barretts, glioblastoma, sarcoma de células claras del tejido blando, mesotelioma maligno, neurofibromatosis, cáncer renal, melanoma, cáncer de próstata, hiperplasia prostética benigna (BPH), ginecomastia, y endometriosis.