CN104105709A

CN104105709A - 抗her3的结构域ii的表皮生长因子受体3(her3)抗体

Info

Publication number: CN104105709A
Application number: CN201280068798.2A
Authority: CN
Inventors: W·埃利斯; S·埃滕伯格; A·P·加纳; C·C·S·昆茨; T·塞茨
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2011-12-05
Filing date: 2012-12-04
Publication date: 2014-10-15
Also published as: EA201491107A1; TW201328707A; SG11201402739YA; IN2014CN04373A; UY34486A; WO2013084148A2; US20130273029A1; AU2012349736A1; BR112014013568A8; WO2013084148A3; AR089084A1; IL232951A0; MX2014006733A; KR20140103135A; EP2788382A2; JP2015500829A; BR112014013568A2; CA2857601A1

Abstract

本发明涉及识别抗体或其片段，及这类抗体或其片段的组合物和使用这类抗体或其片段的方法，该抗体或其片段靶向位于HER3的结构域2内的HER3受体的表位，该识别导致抑制配体依赖性和非配体依赖性信号转导二者。

Description

抗HER3的结构域II的表皮生长因子受体3(HER3)抗体

相关申请

本申请要求2011年12月5日提交的美国临时申请号61/566,905的优先权，其内容在此以其整体引入作为参考。

技术领域

本发明一般涉及识别包含结构域2内的残基的HER3的表位的抗体或其片段；及这类抗体或其片段的组合物和使用这类抗体或其片段的方法，该识别导致抑制配体依赖性和非配体依赖性信号转导二者，以及肿瘤生长。

背景技术

人表皮生长因子受体3(ErbB3,也称HER3)是受体蛋白酪氨酸激酶并属于受体蛋白酪氨酸激酶的表皮生长因子受体(EGFR)亚家族，该亚家族还包括EGFR(HER1、ErbB1)、HER2(ErbB2、Neu)和HER4(ErbB4)(Plowman等人,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:4905-4909；Kraus等人,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:9193-9197；和Kraus等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:2900-2904)。与原型表皮生长因子受体一样，跨膜受体HER3由胞外配体结合结构域(ECD)、ECD内的二聚化结构域、跨膜结构域、胞内蛋白酪氨酸激酶样结构域(TKD)和C-端磷酸化结构域组成。与其他HER家族成员不同，HER3的激酶结构域显示极低的内在激酶活性。

配体神经调节蛋白1(NRG)或神经调节蛋白2结合HER3的胞外结构域，并通过促进与其他二聚化配偶体(如HER2)的二聚化来激活受体介导的信号传导途径。异源二聚化导致HER3胞内结构域的激活和转磷酸作用，这不仅是信号多样化的手段，而且也是信号放大的手段。此外，HER3异源二聚化也可在缺乏激活配体的情况下发生，这通常称为非配体依赖性HER3激活。例如，在HER2由于基因扩增(例如在乳腺癌、肺癌、卵巢癌或胃癌中)而以高水平表达时，可形成自发的HER2/HER3二聚体。在这种情况下，认为HER2/HER3是活性最高的ErbB信号传递二聚体，并因此是高度转化的。

已经在若干癌症类型中发现了增加的HER3，例如在乳腺癌、肺癌、胃肠癌和胰腺癌中发现。有趣的是，已显示了HER2/HER3的表达和从非侵入期进展至侵入期之间的相关性(Alimandi等人,(1995)Oncogene10:1813-1821；DeFazio等人,(2000)Cancer 87:487-498；Naidu等人,(1988)Br.J.Cancer 78:1385-1390)。因此，需要干扰HER3介导的信号发放的药物。

发明概述

本发明基于与包含HER3的结构域2内的氨基酸残基的HER3受体的(线性、非-线性、构象)表位结合的抗体或其片段的发现。令人惊讶的是，抗体或其片段与HER3的结构域2内的表位的结合阻断配体依赖性(例如神经调节蛋白)和非配体依赖性HER3信号传导途径二者。

因此，在一方面，本发明涉及识别HER3受体的表位的分离的抗体或其片段，其中该表位包含HER3受体的结构域2内的氨基酸残基208-328，其中该抗体或其片段至少识别结构域2中的氨基酸残基268，且其中该抗体或其片段阻断配体依赖性和非配体依赖性信号转导二者。

该表位选自线性表位、非-线性表位和构象表位。在一个实施方案中，该抗体或其片段结合HER3受体的非活性状态。在一个实施方案中，结合配体结合位点的HER3配体不激活HER3信号转导。在一个实施方案中，HER3配体可以同时结合HER3受体上的配体结合位点。在一个实施方案中，该HER3配体选自神经调节蛋白1(NRG)、神经调节蛋白2、β动物纤维素、肝素结合表皮生长因子和表皮调节素(epiregulin)。本文描述的抗体或其片段可以结合氨基酸残基268(在结构域2中)。在一个实施方案中，结合氨基酸268影响结构域2中的结合，由此阻断抗体或其片段的结合。在一个实施方案中，该抗体或其片段具有选自以下的特征：脱稳定化HER3使得它易受降解、加速细胞表面HER3的下调、抑制与其他HER受体的二聚化，及产生易受蛋白酶解降解或不能与其他受体酪氨酸激酶二聚化的非天然HER3二聚体。在一个实施方案中，该抗体或其片段在缺乏HER3配体的情况下与HER3受体的结合减少了表达HER2和HER3的细胞中HER2-HER3蛋白复合物的非配体依赖性形成。在一个实施方案中，HER3受体未能与HER2受体二聚化来形成HER2-HER3蛋白复合物。在一个实施方案中，形成HER2-HER3蛋白复合物的失败阻止了信号转导的激活。在一个实施方案中，通过HER3非配体依赖性磷酸化测定评估该抗体或其片段抑制HER3的磷酸化。在一个实施方案中，该HER3非配体依赖性磷酸化测定使用HER2扩增的细胞，其中该HER2扩增的细胞是SK-Br-3细胞和BT-474。在一个实施方案中，该抗体或其片段在HER3配体的存在下与HER3受体的结合减少了表达HER2和HER3的细胞中HER2-HER3蛋白复合物的配体依赖性形成。在一个实施方案中，该HER3受体未能在HER3配体的存在下与HER2受体二聚化形成HER2-HER3蛋白复合物。在一个实施方案中，形成HER2-HER3蛋白复合物的失败阻止了信号转导的激活。在一个实施方案中，如通过HER3配体依赖性磷酸化测定评估，该抗体或其片段抑制HER3的磷酸化。在一个实施方案中，该HER3配体依赖性磷酸化测定在神经调节蛋白(NRG)的存在下使用经刺激的MCF7细胞。在一个实施方案中，该抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和合成抗体。

在另一方面，本发明涉及识别HER3受体表位(HER3受体的结构域2内)的分离的抗体或其片段，其中该表位包含HER3受体的结构域2内的氨基酸残基208-328，其中该抗体或其片段至少识别结构域2内的氨基酸残基268，且其中该抗体或其片段具有至少1x10⁷M^-1、10⁸M^-1、10⁹M^-1、10¹⁰M^-1、10¹¹M^-1、10¹²M^-1、10¹³M^-1的解离(K_D)，其中该抗体或其片段阻断配体依赖性和非配体依赖性信号转导二者。在一个实施方案中，如通过选自磷酸-HER3和磷酸-Akt的体外磷酸化测定测量，该抗体或其片段抑制HER3的磷酸化。在一个实施方案中，该抗体或其片段结合与表1中所述的抗体相同的表位。在一个实施方案中，该分离的抗体或其片段与表1中所述的抗体交叉竞争。在一个实施方案中，该抗体片段选自Fab、F(ab₂)’、F(ab)₂’、scFv、VHH、VH、VL、dAb。

在另一方面，本发明涉及包含抗体或其片段和可药用载体的药物组合物，其中该抗体或其片段结合包含HER3受体的结构域2内的氨基酸残基208-328的HER3受体，其中该抗体或其片段至少识别结构域2内的氨基酸残基268，且其中该抗体或其片段阻断配体依赖性和非配体依赖性信号转导二者。在一个实施方案中，该药物组合物进一步包含附加治疗剂。在一个实施方案中，该附加治疗剂选自HER1抑制剂、HER2抑制剂、HER3抑制剂、HER4抑制剂、mTOR抑制剂和PI3激酶抑制剂。在一个实施方案中，该附加治疗剂是选自马妥珠单抗(Matuzumab)(EMD72000)、/西妥昔单抗(Cetuximab)、/帕尼单抗(Panitumumab)、mAb806、尼莫珠单抗(Nimotuzumab)、/吉非替尼(Gefitinib)、CI-1033(PD183805)、拉帕替尼(Lapatinib)(GW-572016)、/二甲苯磺酸拉帕替尼(Lapatinib Ditosylate)、/盐酸埃罗替尼(Erlotinib HCL)(OSI-774)、PKI-166和的HER1抑制剂；选自帕妥珠单抗(Pertuzumab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、MM-111、来那替尼(neratinib)、拉帕替尼或二甲苯磺酸拉帕替尼/的HER2抑制剂；选自MM-121、MM-111、IB4C3、2DID12(U3Pharma AG)、AMG888(Amgen)、AV-203(Aveo)、MEHD7945A(Genentech)、MOR10703(Novartis)和抑制HER3的小分子的HER3抑制剂；和HER4抑制剂。在一个实施方案中，该附加治疗剂是选自坦罗莫司(Temsirolimus)/ridaforolimus/雷帕霉素(Deforolimus)、AP23573、MK8669、依维莫司(everolimus)/的mTOR抑制剂。在一个实施方案中，该附加治疗剂是选自GDC 0941、BEZ235、BKM120和BYL719的PI3激酶抑制剂。

在另一方面，本发明涉及治疗癌症的方法，其包括选择患有表达HER3的癌症的个体，对该个体施用有效量的包含表1中公开的抗体或其片段的组合物，其中该抗体或其片段识别HER3受体的包含HER3受体的结构域2内的氨基酸残基208-328的表位，其中该抗体或其片段至少识别结构域2内的氨基酸残基268，且其中该抗体或其片段阻断配体依赖性和非配体依赖性信号转导二者。在一个实施方案中，该个体是人，且该癌症选自乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌、外周神经鞘瘤、神经鞘瘤、头颈癌、膀胱癌、食管癌、Barretts食管癌、成胶质细胞瘤、软组织透明细胞瘤、恶性间皮瘤、神经纤维瘤病、肾癌、黑素瘤、前列腺癌、良性前列腺增生(BPH)、男性乳房发育症和子宫内膜异位。在一个实施方案中，该癌症是乳腺癌。

在一方面，本发明涉及抗体或其片段用于治疗由HER3配体依赖性信号转导途径或非配体依赖性信号转导途径介导的癌症的用途。在一方面，本发明涉及抗体或其片段用作药物。在一方面，本发明涉及抗体或其片段在制备用于治疗由HER3配体依赖性信号转导途径或非配体依赖性信号转导途径介导的癌症的药物中的用途，该癌症选自乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌、外周神经鞘瘤、神经鞘瘤、头颈癌、膀胱癌、食管癌、Barretts食管癌、成胶质细胞瘤、软组织透明细胞瘤、恶性间皮瘤、神经纤维瘤病、肾癌、黑素瘤、前列腺癌、良性前列腺增生(BPH)、男性乳房发育症(gynacomastica)和子宫内膜异位。

附图简述

图1.用人HER3获得的代表性MOR12616和MOR12925SET曲线；

图2.通过FACS滴定进行的SK-Br-3细胞结合测定；

图3.HER3结构域结合ELISA滴度曲线；

图4.HER3突变体结合ELISA曲线；

图5.通过ELISA的HER3表位竞争；

图6.配体诱导的HER3和Akt磷酸化的抑制；

图7.HER2扩增的细胞系中非配体依赖性HER3和Akt磷酸化的抑制；和

图8.(A)配体依赖性和(B、C)非配体依赖性细胞增殖的抑制。

发明详述

定义

为了使本发明更易于理解，首先定义某些术语。在发明详述通篇中示出另外的定义。

本文所用的短语“信号转导”或“信号发放活性”指一般通过蛋白质-蛋白质相互作用(如生长因子与受体的结合)起始的生化因果关系，导致信号从细胞的一部分传递到细胞的另一部分。对HER3而言，该传递涉及在导致信号转导的系列反应中的一种或多种蛋白质上的一个或多个酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基的特异性磷酸化。倒数第二个过程一般包括核事件，导致基因表达的改变。

本文所用的术语“HER3”或“HER3受体”又称“ErbB3”，指哺乳动物HER3蛋白，“her3”或″erbB3″指哺乳动物her3基因。优选的HER3蛋白是存在于细胞的细胞膜中的人HER3蛋白。人her3基因在美国专利号5,480,968和Plowman等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：4905-4909中描述。

检索号NP_001973(人)中定义的人HER3，下文中以SEQ ID NO：1表示。所有的命名表示全长、未成熟的HER3(氨基酸1-1342)。在位置19和20之间切割未成熟的HER3，产生成熟的HER3蛋白(20-1342氨基酸)。

mrandalqvl gllfslargs evgnsqavcp gtlnglsvtg daenqyqtly klyercevvm

gnleivltgh nadlsflqwi revtgyvlva mnefstlplp nlrvvrgtqv ydgkfaifvm

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safdnpdywh srlfpkanaq rt (SEQ ID NO：1) 。

本文所用的术语“HER3配体”指结合并激活HER3的多肽。HER3配体的实例包括但不限于神经调节蛋白1(NRG)和神经调节蛋白2、肝素结合表皮生长因子和表皮调节素。该术语包括天然存在的多肽的生物活性片段和/或变体。

“HER2-HER3蛋白复合物”是含有HER2受体和HER3受体的非共价结合的寡聚物。在表达这两种受体的细胞暴露于HER3配体(如NRG)时，或在HER2有活性/过表达时，可形成此复合物。

本文所用的短语“HER3活性”或“HER3激活”指寡聚化(例如包含HER3的复合物的增加)、HER3磷酸化、构象重排(例如由配体诱导的那些)和HER3介导的下游信号发放的增加。

在HER3的背景中使用的术语“稳定化”或“稳定化的”指直接维持(锁定、束缚、保持、优先结合、利于)HER3的失活态或失活构象而不阻断配体结合HER3，使得配体结合不再能够激活HER3的抗体或其片段。

本文所用的术语“配体依赖性信号发放”指通过配体的HER3激活。通过使下游信号传导途径(例如PI3K)激活的增加的异源二聚化和/或HER3磷酸化证明HER3激活。在用实施例中所述的测定测量时，相对于未处理(对照)细胞，在暴露于抗体或其片段的受刺激的细胞中，抗体或其片段可统计上显著地减少磷酸化HER3的量。表达HER3的细胞可以是天然存在的细胞系(例如MCF7)，或可以是通过在宿主细胞中引入编码HER3蛋白的核酸重组产生的细胞。可通过外源加入激活HER3配体或通过内源表达激活配体来进行细胞刺激。

“减少细胞中由神经调节蛋白诱导的HER3激活”的抗体或其片段是这样的抗体或其片段，在用实施例中所述的测定测量时，相对于未处理(对照)细胞，该抗体或其片段统计上显著地减少HER3酪氨酸磷酸化。这可以基于在将HER3暴露于NRG和目的抗体之后的HER3磷酸化水平测定。表达HER3蛋白的细胞可以是天然存在的细胞或细胞系(例如MCF7)，或可以是重组产生的细胞或细胞系。

本文所用的术语“非配体依赖性信号发放”指不需要配体结合的细胞HER3活性(例如磷酸化)。例如，非配体依赖性HER3激活可以是HER2过表达或在HER3异源二聚体配偶体(如EGFR和HER2)中的激活突变的结果。相对于未处理(对照)细胞，在暴露于抗体或其片段的细胞中，抗体或其片段可统计上显著地减少磷酸化HER3的量。表达HER3的细胞可以是天然存在的细胞系(例如SK-Br-3)，或可以是通过在宿主细胞中引入编码HER3蛋白的核酸重组产生的细胞。

本文所用的术语“阻断”指终止或阻止相互作用或过程，例如，终止配体依赖性或非配体依赖性信号发放。

本文所用的术语“识别”指找到其在HER3的结构域2中的表位并与之相互作用(例如结合)的抗体或其片段。例如，抗体或其片段与HER3的结构域2中至少一个氨基酸残基(SEQ ID NO:1的氨基酸残基208-328)相互作用。在另一实例中，抗体或其片段至少与HER3的结构域2中的Lys268相互作用。

本文所用的短语“同时结合”指可与HER3抗体或其片段一起结合HER3受体上的配体结合部位的HER3配体。这意指抗体和配体二者都可一起结合HER3受体。仅为了说明的目的，HER3配体NRG可与HER3抗体一起结合HER3受体。测量配体和抗体同时结合的测定在实施例章节中描述。

本文所用的术语“未能”指没有进行特定事件的抗体或其片段。例如，“未能激活信号转导”的抗体或其片段是未触发信号转导的抗体或其片段。

本文所用的术语“抗体”指与HER3表位相互作用(例如，通过结合、位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)并抑制信号转导的整个抗体。天然存在的"抗体"是包含通过二硫键相互连接的至少2条重(H)链和2条轻(L)链的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文中简称VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中简称VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的高变区，其中散布更保守的称为构架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一个组分(Clq))的结合。术语“抗体”包括例如单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼(camelised)抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)、二硫化物连接的Fv(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段和抗独特型(抗-Id)抗体(包括例如针对本发明抗体的抗-Id抗体)、及以上任一种的表位结合片段。抗体可以属于任意同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。

轻链和重链都分为具有结构和功能同源性的区域。术语“恒定”和“可变”是在功能上使用的。就此点而言，应当理解，轻(VL)链和重(VH)链部分的可变结构域都决定抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要的生物学特性，如分泌、经胎盘的迁移、Fc受体结合、补体结合，等等。按照惯例，在恒定区结构域变得离抗体的抗原结合部位或氨基端越来越远时，其编号增大。N-端为可变区，C-端为恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。

本文所用的短语“抗体片段”指保留与HER3表位特异性相互作用(例如，通过结合、位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)并抑制信号转导的能力的抗体的一个或多个部分。结合片段的实例包括但不限于Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)₂片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单条臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；dAb片段(Ward等,(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；和分离的互补决定区(CDR)。

此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但可用重组方法，通过合成接头将它们连接，该合成接头使得它们能够制备成单条蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参阅例如Bird等,(1988)Science 242:423-426；和Huston等,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883)。此类单链抗体也旨在涵盖于术语“抗体片段”之内。用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并筛选该片段，以与完整抗体相同的方式使用该片段。

抗体片段也可掺入到单结构域抗体、巨型抗体(maxibody)、微型抗体(minibody)、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和bis-scFv中(参阅例如Hollinger和Hudson,(2005)Nature Biotechnology 23:1126-1136)。抗体片段可移植到基于多肽如III型纤连蛋白(Fn3)的支架中(参阅美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽单抗体)。

抗体片段可掺入到包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，该串联Fv区段与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等,(1995)Protein Eng.8:1057-1062；和美国专利号5,641,870)。

术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或以其他方式与分子相互作用的蛋白质决定簇。表位决定簇一般由分子的化学活性表面基团，如氨基酸或糖类或糖侧链组成，并可具有特异的三维结构特征，以及特异的电荷特征。表位可以是“线性的”、“非线性的”或“构象的”。在一个实施方案中，该表位在HER3的结构域2内。在一个实施方案中，该表位是HER3的结构域2内的线性表位。在一个实施方案中，该表位是HER3的结构域2内的非线性表位。在另一实施方案中，该表位是包含HER3的结构域2内氨基酸残基的构象表位。在一个实施方案中，该表位包含HER3的结构域2内的氨基酸残基(SEQ ID NO:1的氨基酸208-328)中的至少一个，或其子集。在一个实施方案中，该表位至少包含SEQ ID NO:1的氨基酸Lys268(结构域2内)。本文所述的抗体或其片段可以与HER3的结构域2内的Lys268结合。

术语“线性表位”指这样的表位，其蛋白质和相互作用分子(如抗体)之间的所有相互作用点沿蛋白质的一级氨基酸序列线性存在(连续的氨基酸)。一旦确定了抗原上的期望表位，即有可能产生针对该表位的抗体，例如使用本发明中所述的技术。备选地，在发现过程中，抗体的产生和表征可阐明有关期望表位的信息。通过此信息，然后有可能竞争性地筛选结合相同表位的抗体。实现方法是进行交叉竞争研究，以寻找彼此竞争性结合的抗体，例如竞争结合抗原的抗体。国际专利申请号WO 2003/48731中描述了基于抗体的交叉竞争的用于“装箱(binning)”抗体的高通量方法。本领域技术人员应当理解，实际上抗体可特异性结合的任意物质都可是表位。表位可包含抗体结合的那些残基。

术语“非线性表位”指具有形成特定结构域内(例如，结构域1内、结构域2内、结构域3内或结构域4内)的三维结构的不连续氨基酸的表位。在一个实施方案中，该非线性表位在结构域2内。该非线性表位还可以存在于两个或多个结构域(例如结构域3-4之间的界面)之间。非线性表位还指作为特定结构域内的三维结构的不连续氨基酸。

术语“构象表位”指这样的表位，其中不连续的氨基酸在三维构型中聚集在一起，涉及至少2个不同的结构域，例如结构域2和结构域4；结构域3和结构域4。在构象表位中，相互作用点出现在蛋白质上彼此分开的氨基酸残基上。本领域技术人员应当理解，由创造分子形状的残基或侧链所占据的空间有助于决定表位是什么。

一般而言，对特定靶抗原特异的抗体将优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的靶抗原上的表位。

可使用任意数目的本领域熟知的表位作图技术鉴定包括表位的给定多肽的区域。见例如Methods in Molecular Biology,66卷(Glenn E.Morris,编,1996)Humana Press,Totowa,New Jersey中的Epitope MappingProtocols。例如，可通过例如在固相支持物上同时合成大量肽，该肽对应于蛋白质分子的部分，在肽仍然附着于支持物时使肽与抗体反应来测定线性表位。这类技术是本领域已知的，并在例如美国专利号4,708,871；Geysen等人,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8:3998-4002；Geysen等人,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:78-182；Geysen等人,(1986)Mol.Immunol.23:709-715中描述。类似地，例如通过例如，氢/氘交换、X射线晶体学和二维核磁共振，通过测定氨基酸的空间构象容易地鉴定构象表位。见例如Epitope Mapping Protocols,上文。也可用标准抗原性和亲水性图(例如用例如从Oxford Molecular Group获得的Omiga版本1.0软件程序计算的标准抗原性和亲水性图)鉴定蛋白质的抗原性区域。此计算机程序利用Hopp/Woods法(Hopp等人,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci USA78:3824-3828)来测定抗原性谱，利用Kyte-Doolittle技术(Kyte等人,(1982)J.MoI.Biol.157:105-132)测定亲水性图。

本文所用的短语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指具有基本相同的氨基酸序列或来源于相同的遗传来源的多肽，包括抗体、抗体片段、双特异性抗体等。此术语也包括单分子组合物的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物展示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。

本文所用的短语“人抗体”包括具有如下可变区的抗体，其中构架区和CDR区都来自人来源的序列。此外，如果抗体包含恒定区，则该恒定区也来自这样的人序列，例如人种系序列，或人种系序列的突变形式，或含有例如来自Knappik等人,(2000)J Mol Biol 296:57-86)中所述的人框架序列分析的共有构架序列的抗体。免疫球蛋白可变结构域(例如CDR)的结构和位置可用熟知的编号方案定义，例如,Kabat编号方案、Chothia编号方案或Kabat和Chothia的组合(见例如,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,U.S.Department of Health and HumanServices(1991),Kabat等人编；Lazikani等人,(1997)J.Mol.Bio.273:927-948)；Kabat等人,(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第五版,NIH公开号91-3242U.S.Department of Health andHuman Services；Chothia等人,(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人,(1989)Nature 342:877-883；和Al-Lazikani等人,(1997)J.Mol.Biol.273:927-948。

本发明的人抗体可包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如,通过体外的随机或定点诱变或体内的体细胞突变或保守替换而引入的突变，以促进稳定性或生产)。

本文所用的短语“人单克隆抗体”指展示单一结合特异性的抗体，其具有如下可变区，其中构架区和CDR区都来自人序列。在一个实施方案中，通过杂交瘤产生人单克隆抗体，该杂交瘤包括具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的、从转基因非人动物例如转基因小鼠得到的、与永生细胞融合的B细胞。

本文所用的短语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如从人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(例如小鼠)或从其制备的杂交瘤分离的抗体，从转化用于表达人抗体的宿主细胞(例如从转染瘤)分离的抗体，从重组的组合人抗体文库分离的抗体，和通过涉及将人免疫球蛋白基因、序列的全部或部分剪接至其他DNA序列的任意其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有如下可变区，其中构架区和CDR区来自人种系免疫球蛋白序列。但是，在某些实施方案中，可对这样的重组人抗体进行体外诱变(或，当使用人Ig序列的转基因动物时进行体内体细胞诱变)，从而重组抗体的V_H和V_L区的氨基酸序列是这样的序列，该序列尽管来自人种系V_H和V_L序列并与之相关，但可能并不天然存在于体内的人抗体种系库中。

两个实体之间的特异性结合表示以至少10²M^-1、至少5x10²M^-1、至少10³M^-1、至少5x10³M^-1、至少10⁴M^-1、至少5x10⁴M^-1、至少10⁵M^-1、至少5x10⁵M^-1、至少10⁶M^-1、至少5x10⁶M^-1、至少10⁷M^-1、至少5x10⁷M^-1、至少10⁸M^-1、至少5x10⁸M^-1、至少10⁹M^-1、至少5x10⁹M^-1、至少10¹⁰M^-1、至少5x10¹⁰M^-1、至少10¹¹M^-1、至少5x10¹¹M^-1、至少10¹²M^-1、至少5x10¹²M^-1、至少10¹³M^-1、至少5x10¹³M^-1、至少10¹⁴M^-1、至少5x10¹⁴M^-1、至少10¹⁵M^-1、或至少5x10¹⁵M^-1的平衡常数(K_A)(k_on/k_off)结合。

短语“特异性(或选择性)结合”指HER3结合抗体和HER3受体在蛋白质和其他生物产品的异质群体中的结合反应。除上文指出的平衡常数(K_A)外，本发明的HER3结合抗体通常还具有低于5x10^-2M、低于10^-2M、低于5x10^-3M、低于10^-3M、低于5x10^-4M、低于10^-4M、低于5x10^-5M、低于10^-5M、低于5x10^-6M、低于10^-6M、低于5x10^-7M、低于10^-7M、低于5x10^-8M、低于10^-8M、低于5x10^-9M、低于10^-9M、低于5x10^-10M、低于10^-10M、低于5x10^-11M、低于10^-11M、低于5x10^-12M、低于10^-12M、低于5x10^-13M、低于10^-13M、低于5x10^-14M、低于10^-14M、低于5x10^-15M、或低于10^-15M或更低的解离速率常数(K_D)(k_off/k_on)，并且以比其结合非特异性抗原(例如HSA)的亲和力高至少2倍的亲和力结合HER3。

在一个实施方案中，抗体或其片段具有低于3000pM、低于2500pM、低于2000pM、低于1500pM、低于1000pM、低于750pM、低于500pM、低于250pM、低于200pM、低于150pM、低于100pM、低于75pM、低于10pM、低于1pM的解离常数(Kd)，该解离常数用本文描述或本领域技术人员公知的方法评估(例如，BIAcore测定、ELISA、FACS、SET)(Biacore International AB,Uppsala,瑞典)。

本文所用的术语“K_assoc”或“K_a”指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而本文所用的术语“K_dis”或“K_d”指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。本文所用的术语“K_D”指解离常数，其从K_d与K_a的比值(即K_d/K_a)获得并表示为摩尔浓度(M)。可使用本领域熟知的方法测定抗体的K_D值。用于测定抗体K_D的方法是通过使用表面等离振子共振，或使用生物传感器系统如系统。

本文所用的术语“亲和力”指抗体与抗原在单个抗原部位上相互作用的强度。在每一抗原部位中，抗体“臂”的可变区与抗原在许多位点上通过弱的非共价力相互作用；相互作用越多，亲和力越强。

本文所用的术语“亲合力”指抗体-抗原复合物的总体稳定性或强度的信息化量度。它受三个主要因素控制：抗体表位亲和力；抗原与抗体两者的效价；及相互作用部分的结构排列。最终，这些因素决定了抗体的特异性，即特定抗体结合精确抗原表位的可能性。

本文所用的术语“效价”指多肽中潜在靶结合部位的数目。每个靶结合部位特异性结合一个靶分子或靶分子上的特异性部位(即表位)。当多肽包含一个以上靶结合部位时，每个靶结合部位可特异性结合相同或不同的分子(例如可结合不同分子，例如不同的抗原，或相同分子上的不同表位)。

本文所用的短语“抑制抗体”指结合HER3并抑制HER3信号发放的生物活性(例如,在磷酸-HER3或磷酸-Akt测定中例如降低、减少和/或抑制HER3诱导的信号发放活性)的抗体。测定的实例在以下实施例中更详细地描述。因此，应当理解，根据本领域公知和本文所述的方法测定的“抑制”一种或多种这些HER3功能特性(例如生化、免疫化学、细胞、生理或其他生物活性，等等)的抗体涉及相对于在没有抗体时(例如，或当存在无关特异性的对照抗体时)所观察到的特定活性，特定活性的统计上显著的减少。抑制HER3活性的抗体引起这样的统计上显著的减少，即测量参数的至少10％，至少50％、80％或90％的减少，在某些实施方案中，本发明的抗体可抑制超过95％、98％或99％的HER3功能活性，这由细胞HER3磷酸化水平的降低证明。

短语“分离的抗体”指抗体，其基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体(例如，特异性结合HER3的分离的抗体基本不含特异性结合除HER3外的抗原的抗体)。然而，特异性结合HER3的分离的抗体可对其他抗原具有交叉反应性。此外，分离的抗体可基本不含其他细胞物质和/或化学品。

短语“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列，保守修饰的变体指编码相同或基本相同氨基酸序列的那些核酸，或者在该核酸不编码氨基酸序列时，则指基本相同的序列。因为遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任意给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在每一位置上(其中密码子确定丙氨酸)，可将密码子改变成所述任意对应的密码子，而不改变所编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，其为保守修饰变异的一种。本文编码多肽的每一核酸序列也描述了核酸的每一种可能的沉默变异。本领域技术人员将认识到可修饰核酸中的每一密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)，以产生功能上相同的分子。因此，在每一所述序列中暗含了编码多肽的核酸的每一沉默变异。

对于多肽序列，“保守修饰的变体”包括对多肽序列的各替换、缺失或添加，其导致用化学上类似的氨基酸对氨基酸进行替换。提供功能上类似的氨基酸的保守替换表为本领域所熟知。此类保守修饰变体除了并且不排斥本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因。以下8组含有彼此为保守替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参阅例如，Creighton,Proteins(1984))。在一些实施方案中，术语“保守序列修饰”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。

术语“交叉-竞争”和“交叉-竞争的”在此处可互换使用，意指抗体或其片段在标准的竞争性结合测定中干扰其他抗体或其片段与HER3结合的能力。

可使用标准竞争结合测定法来测定抗体或其片段能够干扰另一抗体或其片段与HER3结合的能力或程度，从而确定是否可以将它称为本发明的交叉竞争。一种适宜的测定法涉及使用Biacore技术(例如通过使用BIAcore 3000仪器(Biacore,Uppsala,瑞典))，其可以用表面等离振子共振技术测量相互作用的程度。用于测量交叉竞争的另一测定法使用基于ELISA的方法。

本文所用的术语“优化的”指已经用密码子改变核苷酸序列，以编码氨基酸序列，该密码子是生产细胞或生物，一般是真核细胞，例如毕赤酵母属(Pichia)细胞、木霉属(Trichoderma)细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞中优选的。将优化的核苷酸序列改造，以完全或尽可能多地保留起始核苷酸序列(其也称为“亲本”序列)最初编码的氨基酸序列。

用于评价抗体对多个物种的HER3的结合能力的标准测定是本领域公知的，包括例如ELISA、Western印迹和RIA。适宜的测定在实施例中详细描述。也可通过本领域公知的标准测定评估抗体的结合动力学(例如结合亲和力)，例如通过Biacore分析，或FACS相对亲和力(Scatchard)。在实施例中还详细描述了用于评价抗体对HER3的功能特性的作用的测定(例如，受体结合测定，调节HER3信号通路)。

在两条或更多核酸或多肽序列的背景中，短语“百分比相同的”或“百分比同一性”指相同的两条或更多序列或子序列。在为了比较窗内或指定区域内的最大对应而用以下序列比较算法或通过手工比对和视觉检查测定来比较和比对时，如果两条序列具有特定百分比(即，在特定区域内，或在不指定时，在全长序列内60％同一性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)的相同氨基酸残基或核苷酸，那么两条序列“基本相同”。任选地，同一性存在于长度至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域，或更优选地在长度为100到500或1000或更多核苷酸(或20、50、200或更多氨基酸)的区域。

对于序列比较，通常一条序列作为参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或可指定备选参数。序列比较算法然后基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。

本文所用的“比较窗口”包括参考选自20到600、通常约50到约200，更通常约100到约150的任何一定数量的相邻位置的区段，其中可在两条序列进行最佳比对后将序列与相同数量相邻位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法为本领域所熟知。例如通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法，通过搜索Pearson和Lipman,(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性方法，通过这些算法的计算机化实现(Wisconsin Genetics SoftwarePackage,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过手工比对和视觉检查(参阅，例如Brent等,(2003)Current Protocols in Molecular Biology)进行序列最佳比对用于比较。

适合于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等,(1977)Nuc.AcidsRes.25:3389-3402；和Altschul等,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。用于进行BLAST分析的软件可通过National Center for BiotechnologyInformation公开获得。此算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高得分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字比对时，该短字匹配或满足某一正值阈值得分T。T称为邻近字得分阈值(Altschul等,上文)。这些初始邻近字命中作为起始搜索的种子，以发现含有它们的更长HSP。只要可增加累积比对得分，则沿每一序列的两个方向延伸字命中。对于核苷酸序列，用参数M(对一对匹配残基的奖赏得分；总是大于0)和N(对错配残基的罚分；总是小于0)计算累积得分。对于氨基酸序列，用得分矩阵来计算累积得分。在累积比对得分从其最高达到值跌落X量、累积比对得分因一个或更多负得分残基比对的累积而到达零或以下、或到达任一序列的末端时，停止字命中在每一方向上的延伸。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用默认字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用默认字长3、期望值(E)10和BLOSUM62得分矩阵(参阅Henikoff和Henikoff,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915)比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。

BLAST算法也进行两条序列之间相似性的统计学分析(参阅例如，Karlin和Altschul,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小总和概率(P(N))，其提供两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率低于约0.2，更优选低于约0.01，并最优选低于约0.001，那么认为核酸与参考序列相似。

也可使用已经整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller，(1988)Comput.Appl.Biosci.,4:11-17)的算法，使用PAM120加权残基表、空位长度罚分12和空位罚分4测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。此外，可使用已经整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)中的GAP程序的Needleman和Wunsch(1970)J.Mol,Biol.48:444-453)算法，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，以及空位加权16、14、12、10、8、6或4和长度加权1、2、3、4、5或6来测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。

除了上文指出的序列同一性的百分比，两条核酸序列或多肽基本相同的另一指示是第一条核酸编码的多肽与针对第二条核酸编码的多肽产生的抗体免疫交叉反应，如下文描述。因此，多肽通常与第二条多肽基本相同，例如，其中两条肽仅因保守替换而不同。两条核酸序列基本相同的另一指示是两个分子或其互补序列在严格条件下彼此杂交，如下文描述。两条核酸序列基本相同的又一指示是可使用相同的引物来扩增该序列。

短语“核酸”此处与术语“多核苷酸”可互换使用，并指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。术语涵盖含有已知的核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键的核酸，其为合成的、天然存在的和非天然存在的，其与参考核酸具有相似的结合性质，并且其以与参考核苷酸相似的方式进行代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。

除非另有指出，特定核酸序列也暗中涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子替换)和互补序列，以及明确指出的序列。尤其是，如下文详细描述，可通过产生这样的序列完成简并密码子替换，其中用混和碱基和/或脱氧肌苷残基替换一个或更多所选(或全部)密码子的第三个位置(Batzer等,(1991)Nucleic Acid Res.19:5081；Ohtsuka等,(1985)J.Biol.Chem.260:2605-2608；和Rossolini等,(1994)Mol.Cell.Probes 8:91-98)。

短语“有效连接”指两个和更多个多核苷酸(例如DNA)区段的功能关系。通常，它指转录调节序列与转录序列之间的功能关系。例如，如果启动子或增强子序列刺激或调节编码序列在适当宿主细胞或其他表达系统中的转录，那么该启动子或增强子序列有效连接至编码序列。一般地，有效连接至转录序列的启动子转录调节序列与转录序列在物理空间上邻近，即它们是顺式作用。然而，一些转录调节序列，如增强子不需要与编码序列(增强子增强其转录)在物理空间上邻近或位于其附近。

术语“多肽”和“蛋白质”此处互换使用来指氨基酸残基的聚合物。术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或更多氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，还适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另有指出，特定的多肽序列也暗中涵盖其保守修饰的变体。

本文所用的术语“个体”包括人和非人动物。非人动物包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类、绵羊、狗、奶牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除了指出时，术语“患者”或“个体”此处可互换使用。

本文所用的术语“抗癌剂”指可用于治疗细胞增殖性疾病(如癌症)的任意药物，包括细胞毒性剂、化疗剂、放射疗法和放射治疗剂、靶向抗癌剂和免疫治疗剂。

本文所用的术语“肿瘤”指无论是恶性还是良性的赘生性细胞生长和增殖，及所有癌变前和癌变的细胞和组织。

本文所用的术语“抗肿瘤活性”指肿瘤细胞增殖速率、活力或转移活性的降低。显示抗肿瘤活性的可能方式是显示在治疗期间出现的异常细胞生长速率或肿瘤大小稳定性的下降或降低。这种活性可使用公认的体外或体内肿瘤模型评估，包括但不限于异种移植物模型、同种异体移植物模型、MMTV模型和本领域公知的用于研究抗肿瘤活性的其他已知模型。

本文所用的术语“恶性肿瘤”指非良性肿瘤或癌症。

本文所用的术语“癌症”指表征为失调或失控的细胞生长的恶性肿瘤。示例性癌症包括：癌、肉瘤、白血病和淋巴癌。术语“癌症”包括原发性恶性肿瘤(例如,其中的细胞没有迁移到个体体内的原始肿瘤部位以外的部位的恶性肿瘤)和继发性恶性肿瘤(例如,通过转移产生的恶性肿瘤，肿瘤细胞迁移至与原始肿瘤部位不同的继发部位)。

在以下章节和细分章节中更详细地描述本发明的多种方面。

HER受体的结构和激活机制

所有4种HER受体都具有胞外配体结合结构域、单跨膜结构域和含有细胞质酪氨酸激酶的结构域。HER受体的胞内酪氨酸激酶结构域高度保守，尽管HER3的激酶结构域含有关键氨基酸的替换并因此缺乏激酶活性(Guy等人,(1994):PNAS91,8132-8136)。配体诱导的HER受体的二聚化诱导激酶激活、C-端尾部中的酪氨酸残基上的受体转磷酸作用、及随后的胞内信号发放效应子的募集和激活(Yarden和Sliwkowski,(2001)NatureRev2,127-137；Jorissen等人,(2003)Exp Cell Res284,31-53。

HER的胞外结构域的晶体结构提供了一些配体诱导的受体激活过程的信息(Schlessinger,(2002)Cell110,669-672)。每种HER受体的胞外结构域由4个亚结构域组成：亚结构域I和III合作形成配体结合部位，而亚结构域II(也许还有亚结构域IV)通过直接的受体-受体相互作用参与受体二聚化。在结合配体的HER1结构中，亚结构域II中的β发夹(称为二聚化环)与配偶体受体的二聚化环相互作用，介导受体二聚化(Garrett等人,(2002)Cell110,763-773；Ogiso等人,(2002)Cell110,775-787)。相反，在失活的HER1、HER3和HER4的结构中，二聚化环参与和亚结构域IV的分子内相互作用，这在阻止了没有配体的情况下的受体二聚化(Cho和Leahy,(2002)Science297,1330-1333；Ferguson等人,(2003)Mol Cell12,541-552；Bouyan等人,(2005)PNAS102,15024-15029)。HER2的结构在HER中是独特的。在没有配体的情况下，HER2具有与HER1的配体激活态类似的、具有突出的二聚化环的构象，可以与其他HER受体相互作用(Cho等人,(2003)Nature421,756-760；Garrett等人,(2003)Mol Cell11,495-505)。这可以解释HER2增强的异源二聚化能力。

尽管HER受体晶体结构为HER受体的同源和异源二聚化提供了模型，但一些HER同源和异源二聚体比其他二聚体更普遍的背景(Franklin等人,(2004)Cancer Cell5,317-328)，以及每个结构域在受体二聚化和自身抑制中的作用(Burgess等人,(2003)Mol Cell12,541-552；Mattoon等人,(2004)PNAS101,923-928)仍然不太清楚。

HER3结构和表位

抗HER3抗体结合的构象表位之前已描述于PCT/EP2011/064407和USSN:61/375408中，二者都于2011年8月22日提交，在此以其整体引入作为参考。与HER3抗体片段复合的截短形式的HER3的三维结构显示包含HER3的结构域2和结构域4的构象表位。

本发明提供另一类抗体或其片段，其结合HER3的结构域2内的线性、非线性或构象表位。这些抗体或其片段与HER3相互作用来抑制配体依赖性和非配体依赖性信号转导二者。

为了检查结合HER3的结构域2抗体或其片段的晶体结构，通过在适宜的宿主细胞中表达编码HER3或其变体的核苷酸序列，然后在相关的HER3靶向的Fab的存在下使纯化的蛋白质结晶，可以制备HER3的晶体。优选地，该HER3多肽含有胞外结构域(人多肽(SEQ ID NO:1)的氨基酸20至640或其截短形式，优选包含氨基酸20-640)，但缺乏跨膜结构域和胞内结构域。

也可以将HER3多肽产生为融合蛋白，例如便于提取和纯化。融合蛋白配偶体的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、组氨酸(HIS)、六聚组氨酸(6HIS)、GAL4(DNA结合和/或转录活化结构域)和β-半乳糖苷酶。也可方便地在融合蛋白配偶体和目的蛋白质序列之间加入蛋白酶解切割位点，以允许去除融合蛋白序列。

表达后，可纯化和/或浓缩蛋白质，例如通过固定化金属亲和层析、离子交换层析和/或凝胶过滤。

可用本文描述的技术结晶蛋白质。通常，在结晶过程中，将含有蛋白质溶液的液滴与结晶缓冲液混合，并允许在密封的容器中平衡。可通过公知的技术例如“悬滴”或“坐滴”法实现平衡。在这些方法中，液滴悬挂在多得多的结晶缓冲液库上方或坐落于其旁边，通过蒸汽扩散达到平衡。备选地，可通过其他方法达到平衡，例如在油下面，通过半渗透膜，或通过自由界面扩散(见例如,Chayen等人,(2008)Nature Methods5,147–153)。

一旦得到晶体，即可通过已知的X射线衍射技术解析结构。许多技术使用化学修饰的晶体，如通过重原子衍生为近似相来修饰的晶体。实际上，在含有重金属原子盐或有机金属化合物(例如氯化铅、硫代苹果酸金、硫柳汞或乙酸双氧铀)的溶液中浸泡晶体，该重金属原子盐或有机金属化合物可扩散通过晶体并与蛋白质表面结合。然后可通过对浸泡的晶体的X射线衍射分析测定结合的重金属原子的位置。可通过数学方程解析晶体原子(散射中心)衍射X射线单色光束得到的谱，以得到数学坐标。用衍射数据来计算晶体重复单位的电子密度图。得到相信息的另一种方法是使用称为分子替换的技术。在此方法中，对从相关结构得到的检索模型应用旋转和平移算法，得到目的蛋白质的近似定位(见Rossmann,(1990)Acta Crystals A46,73-82)。用电子密度图来确定各个原子在晶体的晶胞中的位置(Blundel等人,(1976)Protein Crystallography,Academic Press)。

HER3胞外结构域的粗略结构域边界如下：结构域1:氨基酸20-207；结构域2:氨基酸208-328；结构域3:氨基酸329-498；和结构域4:氨基酸499-642。HER3和抗体的三维结构允许鉴定潜在HER3调节物的靶结合部位。优选的靶结合部位是涉及HER3激活的靶结合部位。在一个实施方案中，靶结合部位位于HER3的结构域2内。因此，与结构域2结合的抗体或其片段可例如通过改变结构域相对于其自身或其他HER3结构域的相对位置来调节HER3激活。因此，抗体或其片段与结构域3内的氨基酸残基的结合可导致蛋白质采用阻止激活或阻止二聚化伙伴(例如HER2)二聚化的构象。

在一些实施方案中，抗体或其片段识别HER3的特定构象态，使得抗体或其片段阻止HER3与共同受体(包括但不限于HER1、HER2和HER4)相互作用。在一些实施方案中，抗体或其片段通过稳定处于失活态或封闭态的HER3受体来阻止HER3与共同受体相互作用。在一些实施方案中，抗体或其片段可以通过与HER3的结构域2内的氨基酸残基结合来稳定HER3受体。在一些实施方案中，抗体或其片段与具有包含HER3的结构域2内的HER3氨基酸残基(SEQ ID NO:1的氨基酸208-328)或其子集的表位的人HER3结合。在一些实施方案中，抗体或其片段与结构域2内的氨基酸残基(SEQ ID NO:1的氨基酸残基208-328)或与之重叠的氨基酸结合。本文描述的抗体或其片段可以结合HER3的结构域2内的Lys268。在一些实施方案中，抗体或其片段与HER3的结构域2内的非线性表位结合。在一些实施方案中，抗体或其片段与HER3的结构域2内的构象表位结合。

在一些实施方案中，抗体或其片段与HER3的结构域2内的表位结合，使得HER3的结构域2内的二聚化环不能够与共同受体二聚化。形成均二聚体或杂二聚体的失败导致激活转导的失败。

在一些实施方案中，抗体或其片段可以结合HER3的活性态或失活态中的结构域2中的表位。

在一些实施方案中，抗体或其片段结合HER3受体的结构域2中的表位，其中抗体或其片段与HER3受体的结合允许与共同受体二聚化，以形成失活的受体-受体复合物。失活的受体-受体复合物的形成阻止了非配体依赖性信号转导的激活。例如，在配体依赖性信号转导中，HER3可以失活状态存在，但是，HER2的过表达导致HER2-HER3复合物的形成，然而这些得到的复合物是失活的，并阻止非配体依赖性信号转导的激活。

在一些实施方案中，可以通过突变HER3(例如野生型抗原)中的特定残基并测定抗体或其片段是否可结合突变的HER3蛋白或变体HER3蛋白或测量亲和力相对野生型的变化，来鉴定含有与抗体接触或被抗体遮盖的残基的结构域/区域。通过产生许多单突变，可鉴定在结合中起直接作用的残基，或距离抗体足够近从而使突变可影响抗体和抗原之间的结合的残基。通过这些氨基酸的信息，可阐明含有与抗体接触或被抗体掩蔽的残基的抗原(HER3)结构域/区域。使用诸如丙氨酸扫描的已知技术的诱变可帮助定义功能上相关的表位。也可应用使用精氨酸/谷氨酸扫描方案的诱变(见例如,Nanevicz等人,(1995),J.Biol.Chem.270(37):21619-21625和Zupnick等人,(2006),J.Biol.Chem.281(29):20464-20473)。一般而言，精氨酸和谷氨酸替换(一般单独地)野生型多肽中的氨基酸，因为这些氨基酸是带电荷的且体积大，因此具有在引入突变的抗原区域中破坏抗原结合蛋白和抗原之间的结合的潜力。在野生型抗原中存在的精氨酸替换为谷氨酸。可得到多种这样的单突变体，并分析收集的结合结果来测定哪个残基影响结合。可产生一系列突变体HER3抗原，每个突变体抗原具有单突变。可测量每个突变体HER3抗原与多种HER3抗体或其片段的结合并与选定的抗体或其片段结合野生型HER3(SEQ ID NO:1)的能力比较。这类突变体的实例(例如Lys268Als突变体)示于下面的实施例部分。

本文所用的抗体或其片段和突变体或变体HER3之间的结合的改变(例如减少或增加)意指结合亲和力(例如，通过已知方法如Biacore检测或下文实施例中所述的基于球珠的测定所测量的)、EC₅₀的变化，和/或抗原结合蛋白的总结合能力(例如，通过抗原结合蛋白浓度对抗原浓度的图中的B_max的减少所证明的)的变化(例如减少)。结合的显著改变指示突变的残基涉及与抗体或其片段的结合。

在一些实施方案中，结合的显著减少意指相对于抗体或其片段与野生型HER3(例如，SEQ ID NO:1)之间的结合，抗体或其片段与突变体HER3抗原之间的结合亲和力、EC₅₀和/或能力减少超过10％、超过20％、超过40％、超过50％、超过55％、超过60％、超过65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％、超过90％或超过95％。

在一些实施方案中，与野生型HER3蛋白(例如，SEQ ID NO:1)相比，抗体或其片段对具有一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多)突变的突变体HER3蛋白的结合显著减少或增加。

尽管变体形式是参照SEQ ID NO:1所示的野生型序列，但应理解，在HER3的等位基因变体或剪接变体中氨基酸可不同。也考虑这样的抗体或其片段，其显示对此类HER3的等位基因形式的结合显著改变(例如更低或更高的结合)。

除了抗体的一般结构方面，通过结构方法可研究互补位和表位之间的更特异的相互作用。在一个实施方案中，CDR的结构促成互补位,通过该互补位抗体能够与表位结合。可用多种方式测定此类互补位的形状。可使用传统的结构检查方法，如NMR或X射线晶体学。这些方法可研究单独的互补位的形状，或在互补位与表位结合时的形状。备选地，可在计算机上生成分子模型。可通过用商业软件包(例如来自Accelrys(San Diego,Calif.)的InsightII建模软件包)辅助同源建模来生成结构。简言之，可用待检查的抗体序列针对具有已知结构的蛋白质的数据库(如Protein DataBank)进行检索。在鉴定出具有已知结构的同源蛋白质后，用这些同源蛋白质作为建模模板。可比对每个可能的模板，从而在模板之间产生基于结构的序列比对。然后可将具有未知结构的抗体序列与这些模板比对，以生成具有未知结构的抗体的分子模型。本领域技术人员应当理解，存在许多用于在计算机上生成此类结构的备选方法，可以使用其中任一种。例如，可使用类似Hardman等人所述的方法,其以美国专利号5,958,708发布，应用QUANTA(Polygen Corp.,Waltham,Mass.)和CHARM(Brooks等人,(1983),J.Comp.Chem.4:187)(在此以其整体引入作为参考)。

不仅互补位的形状对确定可能的互补位是否将结合表位以及结合得有多好很重要，而且表位和互补位之间的相互作用自身为设计变体抗体提供了大量信息来源。本领域技术人员应当理解，有多种方式可研究此相互作用。一种方式是使用生成的结构模型(也许如上述)，然后使用例如InsightII(Accelrys,San Diego,Calif.)的程序，该程序具有对接模块，特别是能够在互补位和其表位之间的构象和定向空间上进行Monte Carlo检索。结果是能够估计表位与互补位相互作用的位置和如何相互作用。在一个实施方案中，仅用表位的片段或变体来帮助确定相关的相互作用。在一个实施方案中，在互补位和表位之间的相互作用的建模中使用整个表位。

通过使用这些模型结构，能够预测哪个残基在表位和互补位之间的相互作用中最重要。因此，在一个实施方案中，能够容易地选择改变哪个残基以改变抗体的结合特征。例如，从对接模型中显而易见，互补位中某些残基的侧链可在空间上阻碍表位的结合，因此将这些残基改变为具有较小侧链的残基可以是有利的。可通过许多方式确定这点。例如，可简单地观察2个模型并基于官能团和接近性估计相互作用。备选地，可如上述进行表位和互补位的重复配对，以得到更有利的能量相互作用。也可测定对多种抗体变体的相互作用，以确定抗体可以以何种备选的方式结合表位。也可组合多种模型来确定应当如何改变抗体结构以得到具有期望的特定特征的抗体。

可通过多种技术测试上面确定的模型。例如，可用上文讨论的程序测定相互作用能量，以确定进一步检查哪个变体。此外，用库仑和范德华相互作用来测定表位和变体互补位的相互作用能量。也用定点诱变来观察所预测的抗体结构的改变是否真的导致期望的结合特征的改变。备选地，可对表位进行改变来验证模型是正确的，或测定互补位和表位之间可存在的一般结合主题。

本领域技术人员应当理解，尽管这些模型将提供制备本实施方案的抗体及其变体所必需的指导，但仍然希望对计算机模型进行常规测试，也许通过体外研究。此外，对本领域技术人员显而易见地，任意修饰也可能对抗体的活性具有额外的副作用。例如，尽管预测导致更强结合的任意改变可诱导更强的结合，但它也可导致其他结构改变，该结构改变可能减少或改变抗体活性。确定是否如此是本领域的例行程序，并可用多种方式达到。例如，可通过ELISA测试来测试活性。备选地，可通过使用表面等离振子共振设备来测试样品。

HER3抗体

本发明提供识别HER3的结构域2内的表位的抗体。本发明基于以下惊人的发现：一类抗HER3的抗体抑制配体依赖性和非配体依赖性HER3信号转导途径二者。结合HER3的结构域2内的表位一类抗体公开于表1中。在一个实施方案中，抗体抑制配体依赖性和非配体依赖性HER3信号转导途径二者。在另一实施方案中，抗体结合HER3，并不阻断HER配体与配体结合位点的结合(即，配体和抗体均同时结合HER3)。

表1：结合HER3的结构域2的HER3抗体的实例。

本发明提供特异性结合HER3蛋白(例如，人和/或食蟹猴HER3)的抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO:14、34、54、74、94、114、134、154、174、194、214、234、254、274、294、314、334、354、374、394、414、434、454、474、494、514和524的氨基酸序列的VH结构域。在另一方面，本发明提供HER3蛋白(例如，人和/或食蟹猴HER3)的抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO:15、35、55、75、95、115、135、155、175、195、215、235、255、275、295、315、335、355、375、395、415、435、455、475、495、515和535的氨基酸序列的VL结构域。本发明还提供特异性结合HER3蛋白(例如,人和/或食蟹猴HER3)的抗体，该抗体包含具有表1中列出的任一VH CDR的氨基酸序列的VH CDR。尤其是，本发明提供了特异性结合HER3蛋白(例如,人和/或食蟹猴HER3)的抗体，该抗体包含(或备选地由下述组成)1、2、3、4、5或更多个具有表1中列出的任意VH CDR的氨基酸序列的VH CDR。

本发明的其他抗体包括已突变的氨基酸，但在CDR区中与表1中所述序列所示的CDR区具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，其包括突变的氨基酸序列，其中在与表1所述序列所示的CDR区相比时，CDR区中已突变了不超过1、2、3、4或5个氨基酸，但仍然维持其对原始抗体表位的特异性。

本发明的其他抗体包括已突变的氨基酸，但在构架区中与表1所述序列所示的构架区具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，其包括突变的氨基酸序列，其中在与表1所述序列所示的构架区相比时，构架区中已突变了不超过1、2、3、4、5、6或7个氨基酸，但仍然维持其对原始抗体表位的特异性。本发明还提供核酸序列，其编码特异性结合HER3蛋白(例如，人和/或食蟹猴HER3)的抗体的VH、VL、全长重链和全长轻链。

本发明的其他抗体包括下述抗体，其中氨基酸或编码氨基酸的核酸已突变，但与表1中所述序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，其包括突变的氨基酸序列，其中在与表1所述序列所示的可变区相比时，可变区中已突变了不多于1、2、3、4或5个氨基酸，但保留基本相同的治疗活性。

因为这些抗体或其片段中的每一个都可结合HER3，可“混合和匹配”VH、VL、全长轻链和全长重链序列(氨基酸序列和编码氨基酸序列的核苷酸序列)来产生本发明的其他HER3抗体。可用本领域公知的结合测定(例如ELISA和在实施例章节中描述的其他测定)测试此类“混合和匹配”的HER3抗体。在混合和匹配这些链时，应当用结构相似的VH序列替换来自具体VH/VL配对的VH序列。同样地，应当用结构相似的全长重链序列替换来自具体全长重链/全长轻链配对的全长重链序列。同样地，应当用结构相似的VL序列替换来自具体VH/VL配对的VL序列。同样地，应当用结构相似的全长轻链序列替换来自具体全长重链/全长轻链配对的全长轻链序列。

因此，在一方面，本发明提供分离的单克隆抗体或其片段，其具有：包含选自SEQ ID NO:14、34、54、74、94、114、134、154、174、194、214、234、254、274、294、314、334、354、374、394、414、434、454、474、494、514和524的氨基酸序列的VH；和包含选自SEQ ID NOs:15、35、55、75、95、115、135、155、175、195、215、235、255、275、295、315、335、355、375、395、415、435、455、475、495、515和535的氨基酸序列的VL；其中该抗体特异性结合HER3(例如，人和/或食蟹猴)。

在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ ID NO:14的VH和SEQ ID NO:15的VL。在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ IDNO:34的VH和SEQ ID NO:35的VL。在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ ID NO:54的VH和SEQ ID NO:55的VL。在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ ID NO:74的VH和SEQ ID NO:75的VL。在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ ID NO:94的VH和SEQ ID NO:95的VL。在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQID NO:114的VH和SEQ ID NO:115的VL。在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ ID NO:134的VH和SEQ ID NO:135的VL。在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ ID NO:154的VH和SEQID NO:155的VL。在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ ID NO:174的VH和SEQ ID NO:175的VL。

在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ ID NO:194的VH和SEQ ID NO:195的VL。在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ ID NO:214的VH和SEQ ID NO:215的VL。在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ ID NO:234的VH和SEQ ID NO:235的VL。在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ ID NO:254的VH和SEQID NO:255的VL。

在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ ID NO:274的VH和SEQ ID NO:275的VL。在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ ID NO:294的VH和SEQ ID NO:295的VL。在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ ID NO:314的VH和SEQ ID NO:315的VL。在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ ID NO:334的VH和SEQID NO:335的VL。在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ ID NO:354的VH和SEQ ID NO:355的VL。在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ ID NO:374的VH和SEQ ID NO:375的VL。在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ ID NO:394的VH和SEQ ID NO:395的VL。在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ ID NO:414的VH和SEQ ID NO:415的VL。在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ ID NO:434的VH和SEQ ID NO:435的VL。在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ ID NO:454的VH和SEQ ID NO:455的VL。在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ ID NO:474的VH和SEQID NO:475的VL。在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ ID NO:494的VH和SEQ ID NO:495的VL。在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ ID NO:514的VH和SEQ ID NO:515的VL。在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含SEQ ID NO:534的VH和SEQ ID NO:535的VL。

在另一方面，本发明提供结合HER3抗体，其包含表1所述的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3，或其组合。用Kabat系统(Kabat等人,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Departmentof Health and Human Services,NIH公开号91-3242；Chothia等人,(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人,(1989)Nature342:877-883；和Al-Lazikani等人,(1997)J.Mol.Biol.273,927-948)描述CDR区。因此，在一个实施方案中，该抗体或其片段包含：重链可变区抗体序列，其具有选自SEQ ID NO:2、22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262、282、302、322、342、362、382、402、422、442、462、482、502和522的CDR1序列，选自SEQ ID NO:3、23、43、63、83、103、123、143、163、183、203、223、243、263、283、303、323、343、363、383、403、423、443、463、483、503和523的CDR2序列，和/或选自SEQID NO:4、24、44、64、84、104、124、144、164、184、204、224、244、264、284、304、324、344、364、384、404、424、444、464、484、504和524的CDR3序列；轻链可变区抗体序列，其具有选自SEQ ID NO:8、28、48、68、88、108、128、148、168、188、208、228、248、268、288、308、328、348、368、388、408、428、448、468、488、508和528的CDR1序列，选自SEQ ID NO:9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229、249、269、289、309、329、349、369、389、409、429、449、469、489、509和529的CDR2序列，和/或选自SEQ ID NO:10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250、270、290、310、330、350、370、390、410、430、450、470、490、510和530的CDR3序列；其中该抗体或其片段结合HER3的结构域2。

在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含：SEQ ID NO:502的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:503的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:504的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:508的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:509的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:510的轻链可变区CDR3。

在具体实施方案中，结合HER3的抗体包含：SEQ ID NO:522的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:523的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:524的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:528的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:529的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:530的轻链可变区CDR3。

本文所用的人抗体包含“产生自”或“衍生自”特定种系序列的重链或轻链可变区或全长重链或轻链，如果抗体的可变区或全长链获自使用人种系免疫球蛋白基因的系统的话。此类系统包括用目的抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或用目的抗原筛选在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库。例如可通过比较人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列，并选择与人抗体的序列在序列上最相近(即最高％同一性)的人种系免疫球蛋白序列来鉴定“产生自”或“衍生自”人种系免疫球蛋白序列的人抗体。“产生自”或“衍生自”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体可含有较之种系序列的氨基酸差异，例如由天然存在的体细胞突变或刻意引入定点突变引起的氨基酸差异。然而，在VH或VL构架区中，所选人抗体在氨基酸序列上通常与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少90％的同一性，并含有这样的氨基酸残基，在与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠种系序列)比较时，该氨基酸残基将人抗体鉴定为人的。在某些情况下，人抗体在氨基酸序列上与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％，96％、97％、98％或99％的同一性。通常，重组人抗体与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在VH或VL构架区中具有不多于10个氨基酸的差异。在某些情况下，人抗体与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有不多于5个，或甚至不多于4、3、2或1个氨基酸的差异。

本文公开的抗体可以是单链抗体、双抗体、结构域抗体、纳米抗体和单抗体(unibody)的衍生物。“单链抗体”(scFv)由包含与VH结构域相连的VL结构域的单条多肽链组成，其中VL结构域和VH结构域配对形成单价分子。可根据本领域公知的方法制备单链抗体(见例如,Bird等人,(1988)Science242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。“双抗体”由两条链组成，每条链包含在同一多肽链上通过短肽接头连接的重链可变区和轻链可变区，其中同一链上的两个区域不彼此配对，而是与另一条链上的互补结构域配对形成双特异性分子。制备双抗体的方法是本领域公知的(见例如,Holliger等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448和Poljak等人,(1994)Structure2:1121-1123)。结构域抗体(dAb)是抗体的小的功能性结合单位，对应抗体的重链或轻链的可变区。结构域抗体在细菌、酵母和哺乳动物细胞系统中良好表达。结构域抗体及其产生方法的进一步细节是本领域公知的(见例如,美国专利号6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；6,696,245；欧洲专利0368684&0616640；WO05/035572、WO04/101790、WO04/081026、WO04/058821、WO04/003019和WO03/002609。纳米抗体衍生自抗体的重链。纳米抗体通常包含单个可变结构域和2个恒定结构域(CH2和CH3)，并保留原始抗体的抗原结合能力。可通过本领域公知的方法制备纳米抗体(见例如,美国专利号6,765,087、美国专利号6,838,254、WO06/079372)。单抗体由IgG4抗体的一条轻链和一条重链组成。可通过去除IgG4抗体的铰链区制备单抗体。单抗体及其制备方法的进一步细节可见WO2007/059782。

同源抗体

在另一实施方案中，本发明提供包含与表1中所述的序列同源的氨基酸序列的抗体或其片段，并且该抗体结合HER3蛋白(例如，人和/或食蟹猴HER3)，并保留表1中所述的那些抗体的期望的功能特性。

例如，本发明提供包含重链可变区和轻链可变区的分离的单克隆抗体(或其功能片段)，其中该重链可变区包含与选自SEQ ID NO:14、34、54、74、94、114、134、154、174、194、214、234、254、274、294、314、334、354、374、394、414、434、454、474、494、514和524的氨基酸序列至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列；该轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:14、34、54、74、94、114、134、154、174、194、214、234、254、274、294、314、334、354、374、394、414、434、454、474、494、514和524的氨基酸序列至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的的氨基酸序列；其中该抗体结合HER3(例如，人和/或食蟹猴HER3)，并抑制HER3的信号发放活性,该活性可在磷酸化测定或HER信号发放的其他测量方法(例如，实施例中描述的磷酸-HER3测定、磷酸-Akt测定、细胞增殖和配体阻断测定)中测量。在本发明的范围内也包括可变重链和轻链的亲本核苷酸序列；及为在哺乳细胞中表达而优化的全长重链和轻链序列。本发明的其他抗体包括已突变的氨基酸或核酸，但与上述序列具有至少60、70、80、90、95、98或99％百分比同一性。在一些实施方案中，其包括突变的氨基酸序列，其中在与上述序列所示的可变区相比时，已通过氨基酸缺失、插入或替换突变了可变区中的不超过1、2、3、4或5个氨基酸。

在其他实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以与表1中所示的序列具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在其他实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以相同，只是在不超过1、2、3、4或5个氨基酸位置处具有氨基酸替换。可通过诱变(例如定点诱变或PCR介导诱变)获得这样的抗体，该抗体具有与表1中所述抗体的VH和VL区具有高(即80％或更高)同一性的VH和VL区，然后用本文所述的功能测定法测试所编码的经改变的抗体的保留的功能。

在其他实施方案中，重链和/或轻链可变区核苷酸序列与上文所示的序列具有60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本文所用的两条序列之间的“百分比同一性”是该序列共有的相同位置数的函数(即％同一性等于相同位置数/位置总数x100)，其中考虑空位数和每一空位的长度，需要引入该空位用于两条序列的最佳比对。如下文非限制性实施例中所述，可用数学算法实现两条序列之间序列的比较和百分比同一性的确定。

此外或备选地，本发明的蛋白质序列可进一步用作“查询序列”来针对公共数据库进行搜索，例如以鉴定相关序列。例如，可用Altschul等,(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLAST程序(版本2.0)进行此类搜索。

具有保守修饰的抗体

在某些实施方案中，本发明的抗体具有包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区及包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中一个或更多这些CDR序列具有基于本文所述抗体指明的氨基酸序列或其保守修饰，并且其中该抗体保留本发明HER3抗体的期望的功能特性。

因此，本发明提供分离的HER3单克隆抗体或其片段，其由包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区及包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区组成,其中：重链可变区CDR1氨基酸序列选自SEQ IDNO:2、22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262、282、302、322、342、362、382、402、422、442、462、482、502和522，及其保守修饰；重链可变区CDR2氨基酸序列选自SEQ ID NO:3、23、43、63、83、103、123、143、163、183、203、223、243、263、283、303、323、343、363、383、403、423、443、463、483、503和523，及其保守修饰；重链可变区CDR3氨基酸序列选自SEQ ID NO:4、24、44、64、84、104、124、144、164、184、204、224、244、264、284、304、324、344、364、384、404、424、444、464、484、504和524，及其保守修饰；轻链可变区CDR1氨基酸序列选自SEQ ID NO:8、28、48、68、88、108、128、148、168、188、208、228、248、268、288、308、328、348、368、388、408、428、448、468、488、508和528，及其保守修饰；轻链可变区CDR2氨基酸序列选自SEQ ID NO:9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229、249、269、289、309、329、349、369、389、409、429、449、469、489、509和529，及其保守修饰；轻链可变区CDR3氨基酸序列选自SEQ ID NO:10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250、270、290、310、330、350、370、390、410、430、450、470、490、510和530，及其保守修饰；该抗体或其片段特异性结合HER3，并通过抑制HER3信号传导途经来抑制HER3活性，该活性可在磷酸化测定或HER信号发放的其他测量方法(例如，实施例中所述的磷酸-HER3测定、磷酸-Akt测定、细胞增殖和配体阻断测定)中测量。

结合相同表位的抗体

本发明提供与表位相互作用(例如通过结合、位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的抗体，该表位和与表1中所述的HER3抗体所相互作用的表位相同。因此可基于它们在HER3结合测定中与本发明的其他抗体交叉竞争(例如以统计学上显著的方式竞争性抑制结合)的能力鉴定其他抗体。测试抗体抑制本发明的抗体与HER3蛋白(例如，人和/或食蟹猴HER3)结合的能力证明该测试抗体可与该抗体竞争结合HER3；根据非限制性理论，这种抗体可以和与其竞争的抗体结合HER3蛋白上相同或相关(例如，结构上相似或空间上接近)的表位。在某实施方案中，与本发明抗体结合HER3上相同的表位的抗体是人单克隆抗体。可按本文所述制备并分离此类人单克隆抗体。

在一个实施方案中，该抗体或其片段结合HER3的结构域2来维持HER3处于防止暴露于结构域2中存在的二聚化环的构象。这阻止了与其他家族成员，例如DER1、DER2和DER4的杂二聚化。该抗体或其片段抑制配体依赖性和非配体依赖性HER3信号转导二者。

在另一个实施方案中，该抗体或其片段结合HER3的结构域2但不阻断HER3配体(例如神经调节蛋白)的同时结合。尽管不需要提供理论，该抗体或其片段结合HER3的结构域2，维持HER3处于不阻断HER3上的配体结合位点是可能的。因此，HER3配体(例如,神经调节蛋白)能够与抗体或其片段同时结合HER3。

本发明的抗体或其片段抑制HER3的配体依赖性和非依赖性激活二者而不阻止配体结合。基于以下原因认为这是有利的：

(i)相比靶向单种HER3激活机制(即配体依赖性或非配体依赖性)的抗体，治疗性抗体将在广谱肿瘤中具有临床用途，因为不同的肿瘤类型受各自的机制驱动。

(ii)治疗性抗体将在同时涉及两种HER3激活机制的肿瘤类型中有效。靶向单种HER3激活机制(即配体依赖性或非配体依赖性)的抗体将在这些肿瘤类型中展示低效力或无效力。

(iii)抑制HER3的配体依赖性激活而不阻止配体结合的抗体的效力受增加的配体浓度的不良影响的可能性较低。这将转化为在由极高浓度HER3配体驱动的肿瘤类型中的增加的效力，或在抗性由HER3配体的上调介导时减小的药物抗性倾向。

(iv)通过稳定失活形式来抑制HER3激活的抗体将不易产生由HER3激活的备选机制驱动的药物抗性。

因此，本发明的抗体可用于治疗现有治疗性抗体临床无效的病症。

改造和修饰的抗体

还可用具有一个或更多本文所示VH和/或VL序列的抗体作为起始材料来制备本发明的抗体，以改造修饰的抗体，该修饰的抗体可以具有从起始抗体改变的性质。可通过修饰一个或两个可变区(即VH和/或VL)内，例如一个或更多CDR区内和/或一个或更多构架区内的一个或更多残基来改造抗体。此外或备选地，可通过修饰恒定区内的残基来改造抗体，例如来改变该抗体的效应子功能。

可以进行的一种类型的可变区改造是CDR移植。抗体主要通过定位在六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此，CDR内的氨基酸序列在各抗体之间比CDR外的序列更多样化。因为CDR序列负责多数抗体-抗原相互作用，所以通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在的抗体的性质的重组抗体是可能的，该表达载体包括移植到具有不同性质的不同抗体的构架序列上的CDR序列，该CDR序列来自特定天然存在的抗体(参阅例如，Riechmann等,(1998)Nature332:323-327；Jones等,(1986)Nature321:522-525；Queen等,(1989)Proc.Natl.Acad.,U.S.A.86:10029-10033；Winter的美国专利号5,225,539；和Queen等的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

因此，本发明的另一个实施方案涉及分离的HER3单克隆抗体或其片段，其包含：重链可变区，其分别含有具有选自SEQ ID NO:2、22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262、282、302、322、342、362、382、402、422、442、462、482、502和522的氨基酸序列的CDR1序列；具有选自SEQ ID NO:3、23、43、63、83、103、123、143、163、183、203、223、243、263、283、303、323、343、363、383、403、423、443、463、483、503和523的氨基酸序列的CDR2序列；具有SEQID NO:4、24、44、64、84、104、124、144、164、184、204、224、244、264、284、304、324、344、364、384、404、424、444、464、484、504和524的氨基酸序列的CDR3序列；和轻链可变区，其分别含有具有选自SEQ ID NO:8、28、48、68、88、108、128、148、168、188、208、228、248、268、288、308、328、348、368、388、408、428、448、468、488、508和528的氨基酸序列的CDR1序列；具有选自SEQ ID NO:9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229、249、269、289、309、329、349、369、389、409、429、449、469、489、509和529的氨基酸序列的CDR2序列；及具有选自SEQ ID NO:10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250、270、290、310、330、350、370、390、410、430、450、470、490、510和530的氨基酸序列的CDR3序列。此类抗体含有单克隆抗体的VH和VL CDR序列，但还可以含有来自这些抗体的不同构架序列。可从公共DNA数据库或包括种系抗体基因序列的出版的参考文献中获得此类构架序列。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可见于“Vase”人种系序列数据库(可在互联网www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上获得)，以及Kabat等人,(1991)Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department of Healthand Human Services,NIH公开号91-3242；Chothia等人,(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人,(1989)Nature342:877-883；和Al-Lazikani等人,(1997)J.Mol.Biol.273:927-948；Tomlinson等人,(1992)J.fol.Biol.227:776-798；和Cox等人,(1994)Eur.J Immunol.24:827-836；各自的内容在此明确引入作为参考。

用于本发明的抗体的构架序列的实例是与本发明所选抗体使用的构架序列(例如本发明的单克隆抗体使用的共有序列和/或构架序列)在结构上相似的那些构架序列。VH CDR1、2和3序列及VL CDR1、2和3序列可移植到与见于构架序列所衍生自的种系免疫球蛋白基因中的序列具有相同序列的构架区上，或者该CDR序列可移植到与种系序列相比含有一个或更多突变的构架区上。例如，已经发现在某些情况下突变构架区内的残基来维持或增强抗体的抗原结合能力是有利的(参阅例如，Queen等的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

另一类型的可变区修饰是突变VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基，由此改善目的抗体的一种或更多结合性质(例如，亲和力)，称为“亲和力成熟”。可进行定点诱变或PCR介导的诱变来引入突变，并在如本文所述以及实施例中提供的体外或体内测定中评估对抗体结合或其他目的功能性质的影响。可引入保守修饰(如上文讨论)。该突变可以是氨基酸替换、添加或缺失。此外，通常改变CDR区内的不超过1、2、3、4或5个残基。

因此，在另一实施方案中，本发明提供分离的HER3单克隆抗体或其片段，其由重链可变区组成，该重链可变区具有：由选自SEQ ID NO:2、22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262、282、302、322、342、362、382、402、422、442、462、482、502和522的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2、22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262、282、302、322、342、362、382、402、422、442、462、482、502和522相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列组成的VH CDR1区；具有选自SEQ ID NO:3、23、43、63、83、103、123、143、163、183、203、223、243、263、283、303、323、343、363、383、403、423、443、463、483、503和523的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3、23、43、63、83、103、123、143、163、183、203、223、243、263、283、303、323、343、363、383、403、423、443、463、483、503和523相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列的VH CDR2区；具有选自SEQ ID NO:4、24、44、64、84、104、124、144、164、184、204、224、244、264、284、304、324、344、364、384、404、424、444、464、484、504和524的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4、24、44、64、84、104、124、144、164和370相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列的VH CDR3区；具有选自SEQ ID NO:8、28、48、68、88、108、128、148、168、188、208、228、248、268、288、308、328、348、368、388、408、428、448、468、488、508和528的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8、28、48、68、88、108、128、148、168、188、208、228、248、268、288、308、328、348、368、388、408、428、448、468、488、508和528相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR1区；具有选自SEQ ID NO:9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229、249、269、289、309、329、349、369、389、409、429、449、469、489、509和529的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229、249、269、289、309、329、349、369、389、409、429、449、469、489、509和529相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR2区；及具有选自SEQ IDNO:10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250、270、290、310、330、350、370、390、410、430、450、470、490、510和530的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250、270、290、310、330、350、370、390、410、430、450、470、490、510和530相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR3区。

将抗体片段移植入备选构架或支架

可使用多种抗体/免疫球蛋白构架或支架，只要所得到的多肽包括至少一个特异性结合HER3的结合区。此类构架或支架包括人免疫球蛋白的5个主要独特型或其片段，并包括其他动物物种的免疫球蛋白，优选具有人源化方面的免疫球蛋白。本领域技术人员不断发现和发展新的构架、支架和片段。

在一方面，本发明涉及用其上可移植本发明的CDR的非免疫球蛋白支架产生基于非免疫球蛋白的抗体。可以利用已知或未知的非免疫球蛋白构架和支架，只要它们包含对靶HER3蛋白质(例如，人和/或食蟹猴HER3)特异的结合区。已知的非免疫球蛋白构架或支架包括，但不限于纤连蛋白(Compound Therapeutics,Inc.,Waltham,MA)、锚蛋白(MolecularPartners AG,Zurich,瑞士)、结构域抗体(Domantis,Ltd.,Cambridge,MA,and Ablynx nv,Zwijnaarde,比利时)、脂笼蛋白(Pieris Proteolab AG,Freising,德国)、小模块免疫药物(Trubion Pharmaceuticals Inc.,Seattle,WA)、巨型抗体(Avidia,Inc.,Mountain View,CA)、蛋白A(Affibody AG,瑞典)和affilin(γ-晶体蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH,Halle,德国)。

纤连蛋白支架基于III型纤连蛋白结构域(例如，III型纤连蛋白的第十个模块(¹⁰Fn3结构域))。III型纤连蛋白结构域具有分布在两个β折叠之间的7个或8个β链，该两个β折叠自身彼此包装形成蛋白质的核心，并还含有将β链彼此连接且暴露在溶剂中的环(与CDR类似)。在β折叠夹层每一边缘具有至少三个这样的环，其中该边缘是与β链方向垂直的蛋白质边界(参阅US6,818,418)。这些基于纤连蛋白的支架不是免疫球蛋白，尽管总体折叠与骆驼和骆马IgG中的最小功能抗体片段(包含整个抗原识别单位的重链可变区)十分相近。由于此结构，非免疫球蛋白抗体模拟抗原结合性质，该抗原结合性质与抗体的抗原结合性质在性质和亲和力上相似。这些支架可用于体外环随机化和改组策略，该策略与体内抗体的亲和力成熟过程相似。这些基于纤连蛋白的分子可用作支架，其中使用标准克隆技术用本发明的CDR替换分子的环区。

锚蛋白技术基于用具有锚蛋白来源的重复模块的蛋白质作为携带可变区的支架，该可变区可用于结合不同靶。该锚蛋白重复模块是由两个反向平行的α螺旋和β转角组成的33个氨基酸的多肽。通过使用核糖体展示对可变区的结合进行最大优化。

Avimers衍生自含有天然A结构域的蛋白质，如HER3。这些结构域天然地用于蛋白质-蛋白质相互作用，并且在人中超过250个蛋白质在结构上基于A结构域。Avimers由通过氨基酸接头连接的大量不同的“A结构域”单体(2-10)组成。可用例如美国专利申请公开号20040175756、20050053973、20050048512和20060008844中所述的方法产生可以结合靶抗原的Avimers。

Affibody亲和配体是由基于蛋白A的一个IgG结合域的支架的三螺旋束组成的小的简单蛋白质。蛋白A是来自细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的表面蛋白。该支架结构域由58个氨基酸组成，随机化其中13个来产生具有大量配体变体的affibody文库(参阅例如，US5,831,012)。Affibody分子模拟抗体，与抗体150kDa的分子量相比，它们具有6kDa的分子量。尽管其尺寸小，但affibody分子的结合部位与抗体的结合部位类似。

Anticalins是Pieris ProteoLab AG公司开发的产品。它们衍生自脂笼蛋白，脂笼蛋白是一大类小而坚固的蛋白质，通常涉及化学敏感或不溶解的化合物的生理运输或储藏。若干天然脂笼蛋白在人组织或体液中存在。蛋白质结构表明是在刚性构架上面具有高变环免疫球蛋白。然而，与抗体或其重组片段相比，脂笼蛋白由具有160到180个氨基酸残基的单条多肽链组成，仅比单个免疫球蛋白结构域稍大。构成结合袋的四环组显示明显的结构可塑性并耐受多种侧链。因此结合部位在专有方法中可重塑，以识别具有高亲和力和特异性的不同形状的规定的靶分子。脂笼蛋白家族的一个蛋白质——欧洲粉蝶(Pieris Brassicae)的后胆色素(bilin)结合蛋白(BBP)已经用于通过诱变处理四环组来开发anticalins。描述anticalins的专利申请的一个实例在PCT公开号WO199916873中。

Affilin分子是针对对蛋白质和小分子的特异性亲和力设计的小的非免疫球蛋白蛋白质。可从两个文库中非常快速地选择新的affilin分子，该文库的每一个基于不同的来自人的支架蛋白。Affilin分子与免疫球蛋白蛋白质不显示任何结构同源性。目前，利用两种affilin支架，其中一种是γ晶体蛋白——人结构晶状体蛋白质，另一种是“泛素”超家族蛋白质。两种人支架都非常小，显示高的温度稳定性，并对pH改变和变性剂几乎是有抗性的。该高稳定性主要是由于蛋白质扩展的β折叠结构。γ晶体蛋白来源的蛋白质的实例描述于WO200104144中，“泛素样”蛋白质的实例描述于WO2004106368中。

蛋白质表位模拟物(PEM)是模拟蛋白质β发夹二级结构的中等大小、环形、肽样分子(MW1-2kDa)，蛋白质β发夹二级结构是涉及蛋白质-蛋白质相互作用的主要二级结构。

在一些实施方案中，通过改变Fc区将Fab转变为沉默的IgG1形式。例如，可将表1中的抗体转变为IgG形式。

人抗体或人源化抗体

本发明提供特异性结合HER3蛋白质(例如，人和/或食蟹猴/小鼠/大鼠HER3)的全人抗体。与嵌合抗体或人源化抗体相比，在对人个体施用时，人HER3抗体或其片段具有进一步降低的抗原性。

可用本领域已知的方法产生人HER3抗体或其片段。例如，用人类工程技术来将非人抗体转变成改造的人抗体。美国专利公开号20050008625描述了用抗体中的人可变区替换非人抗体可变区的体内方法，该方法同时维持相同或提供比非人抗体的结合特征更好的结合特征。该方法依赖于用全人抗体对非人参考抗体可变区的表位引导的替换。所得人抗体一般在结构上与参考非人抗体不相关，但与该参考抗体结合相同抗原上的相同表位。简言之，在响应测试抗体结合抗原的报告系统存在下，通过在细胞中在“竞争者”与参考抗体(“测试抗体”)的多种杂合物的文库之间建立结合有限量的抗原的竞争，使得能够进行连续表位引导的互补性替换方法。该竞争者可以是参考抗体或其衍生物，如单链Fv片段。该竞争者也可以是天然的或人造的抗原配体，其与参考抗体结合相同的表位。该竞争者仅有的要求是其结合与参考抗体相同的表位，并且其与参考抗体竞争结合抗原。测试抗体具有来自非人参考抗体的一个共同的抗原结合V区，及从多种来源(如人抗体的所有组成成分文库)随机选择的其他V区。来自参考抗体的共同V区用作引导，将该测试抗体定位于抗原上的相同表位上，并且处于同一方向，从而使选择偏向于对于参考抗体的最高抗原结合保真度。

许多类型的报告系统可用于检测测试抗体与抗原之间期望的相互作用。例如，互补报告子片段可分别连接抗原和测试抗体，使得仅在测试抗体结合抗原时发生通过片段互补的报告子激活。在测试抗体和抗原-报告片段融合物与竞争者共表达时，报告子激活变得依赖于该测试抗体与竞争者竞争的能力，该能力与该测试抗体对抗原的亲和力成比例。可使用的其他报告系统包括如美国专利申请系列号10/208,730(公开号20030198971)中公开的自抑制的报告子再激活系统(RAIR)的再激活子，或在美国专利申请系列号10/076,845(公开号20030157579)中公开的竞争激活系统。

利用连续表位引导的互补替换系统，进行选择以鉴定表达单个测试抗体与竞争者、抗原和报告子组分的细胞。在这些细胞中，每一测试抗体一对一地与竞争者竞争结合有限量的抗原。报告子的活性与结合测试抗体的抗原的量成比例，该抗原量转而与测试抗体对抗原的亲和力和测试抗体的稳定性成比例。在表达为测试抗体时，开始以其相对于参考抗体的活性为基础选择测试抗体。第一轮选择的结果是“杂合”抗体组，其中每一抗体包含来自参考抗体的相同非人V区和来自文库的人V区，并且其中每一抗体与参考抗体结合抗原上的相同表位。在第一轮中选择的一个或更多杂合抗体对抗原的亲和力将与参考抗体对抗原的亲和力相当或更高。

在第二个V区替换步骤中，用在第一步骤中选择的人V区作为选择人替换的指导，该人替换用同族人V区的多样文库替换剩余非人参考抗体V区。第一轮中选择的杂合抗体也可用作第二轮选择的竞争者。第二轮选择的结果是全人抗体组，其在结构上不同于参考抗体，但与参考抗体竞争结合相同的抗原。一些所选人抗体与参考抗体结合相同抗原上的相同表位。在这些所选人抗体中，一个或更多抗体以与参考抗体的亲和力相当或比其高的亲和力结合相同表位。

用上文所述的一种小鼠或嵌合HER3抗体或其片段作为参考抗体，可容易地利用该方法来产生以相同的结合特异性及相同或更好的结合亲和力结合人HER3的人抗体。此外，也可从通常生产人抗体的公司，例如KaloBios,Inc.(Mountain View,CA)通过商业途径获得此类人HER3抗体或其片段。

骆驼(camelid)抗体

从骆驼和单峰骆驼(双峰骆驼(Camelus bactrianus)和Calelusdromaderius)家族的成员，包括新世界成员如美洲驼物种(Lama paccos、大羊驼(Lama glama)和瘦驼(Lama vicugna))中获得的抗体蛋白质已经在关于大小、结构复杂性和对人个体的抗原性方面进行了表征。自然界中发现的来自该哺乳动物家族的某些IgG抗体缺少轻链，并因此在结构上不同于来自其他动物的抗体的具有两条重链和两条轻链的典型四链四级结构。参阅PCT/EP93/02214(1994年3月3日公开的WO94/04678)。

可通过遗传改造获得鉴定为VHH的小的单个可变结构域的骆驼抗体的区域，以产生对靶具有高亲和力的小蛋白质，得到低分子量的抗体衍生蛋白质，称为“骆驼纳米抗体”。参阅1998年6月2日授权的美国专利号5,759,808；还参阅Stijlemans等人,(2004)J Biol Chem279:1256-1261；Dumoulin等人,(2003)Nature424:783-788；Pleschberger等人,(2003)Bioconjugate Chem14:440-448；Cortez-Retamozo等人,(2002)Int JCancer89:456-62；及Lauwereys等人,(1998)EMBO J17:3512-3520。例如从Ablynx,Ghent,比利时可购得骆驼抗体和抗体片段的改造文库。(例如,US20060115470；Domantis(US20070065440、US20090148434)。如同非人来源的其他抗体一样，可重组改变骆驼抗体的氨基酸序列来获得与人序列更像的序列，即纳米抗体可以进行“人源化”。因此，骆驼抗体对人的天然低抗原性可进一步降低。

骆驼纳米抗体具有人IgG分子的分子量的大概十分之一的分子量，并且该蛋白质物理直径仅几纳米。小尺寸的一种结果是骆驼纳米抗体结合对更大的抗体蛋白质而言在功能上不可见的抗原部位，即骆驼纳米抗体可用作使用经典免疫技术检测不到的抗原的检测试剂，并可能用作治疗剂。因此，小尺寸的另一结果是骆驼纳米抗体因此可抑制与靶蛋白质的沟或窄缝中的特性异部位的结合，并因而可具有这样的能力，其比经典抗体更像经典的低分子量药物的功能。

低分子量和紧密尺寸还导致骆驼纳米抗体极其热稳定，对极端pH和蛋白酶解消化稳定，并且抗原性弱。另一结果是骆驼纳米抗体容易从循环系统转移到组织，甚至穿过血脑屏障，可治疗影响神经组织的障碍。纳米抗体可进一步便于药物运输跨过血脑屏障。参阅2004年8月19日公开的美国专利申请20040161738。这些特征与对人的低抗原性组合指示巨大的治疗潜能。另外，这些分子可在原核细胞，如大肠杆菌(E.coli)中充分表达，并用噬菌体表达为融合蛋白，且是有功能的。

因此，本发明的特征是对HER3具有高亲和力的骆驼抗体或纳米抗体。在本文的某些实施方案中，该骆驼抗体或纳米抗体在骆驼动物中天然产生，即使用本文针对其他抗体所述的技术，用HER3或其肽片段免疫骆驼来生产。备选地，改造结合HER3的骆驼纳米抗体，即如本文实施例中所述用HER3作为靶标的淘选方法，通过例如从适当诱变处理的骆驼纳米抗体蛋白质的噬菌体展示文库中选择产生结合HER3的骆驼纳米抗体。可通过遗传改造进一步定制改造的纳米抗体，以在受体个体中具有从45分钟到两周的半衰期。在具体实施方案中，如例如PCT/EP93/02214中所述，通过将本发明的人抗体的重链或轻链的CDR序列移植入纳米抗体或单结构域抗体构架序列来获得骆驼抗体或纳米抗体。在一个实施方案中，骆驼抗体或纳米抗体与选自以下氨基酸残基的至少一个HER3的结构域2中的氨基酸残基结合：265-277和315。在一个实施方案中，骆驼抗体或纳米抗体与至少HER3的结构域2中的氨基酸残基Lys268结合。

双特异性分子和多价抗体

在另一方面，本发明涉及双互补位、双特异性或多特异性分子，其包含结合HER3的结构域2内的表位的抗体或其片段。该抗体或其片段可衍生为或连接至另一功能分子(例如另一肽或蛋白质(例如，另一抗体或受体的配体))，以产生结合至少两个不同结合部位或靶分子的双特异性分子。该抗体或其片段可实际上衍生为或连接至超过一种其他功能分子，以产生结合多于两个不同结合部位和/或靶分子的双互补位或多特异性分子；此类双互补位或多特异性分子。为了产生双特异性分子，抗体或其片段可在功能上连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)一个或更多其他结合分子，如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，使得产生双特异性分子。

通过在一个抗体内结合2个或多个抗原可提供另外的临床益处(Coloma等人,(1997)；Merchant等人,(1998)；Alt等人,(1999)；Zuo等人,(2000)；Lu等人,(2004)；Lu等人,(2005)；Marvin等人,(2005)；Marvin等人,(2006)；Shen等人,(2007)；Wu等人,(2007)；Dimasi等人,(2009)；Michaelson等人,(2009)).(Morrison等人,(1997)Nature Biotech.15:159-163；Alt等人(1999)FEBS Letters454:90-94；Zuo等人,(2000)ProteinEngineering 13:361-367；Lu等人,(2004)JBC 279:2856-2865；Lu等人,(2005)JBC280:19665-19672；Marvin等人,(2005)Acta Pharmacologica Sinica26:649-658；Marvin等人,(2006)Curr Opin Drug Disc Develop9:184-193；Shen等人,(2007)J Immun Methods218:65-74；Wu等人,(2007)NatBiotechnol.11:1290-1297；Dimasi等人,(2009)J Mol Biol.393:672-692；和Michaelson等人,(2009)mAbs1:128-141。

可使用本领域已知的方法，通过缀合成分结合特异性来制备双特异性分子。例如，可分开产生双特异性分子的每一结合特异性，然后相互缀合，例如，可用多种偶联或交联剂来进行共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳化二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、o-亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-羧酸酯(磺基-SMCC)(见例如,Karpovsky等人,(1984)J.Exp.Med.160:1686；Liu等人,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648)。其他方法包括在Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78:118-132；Brennan等人,(1985)Science229:81-83),和Glennie等人,(1987)J.Immunol.139:2367-2375)中描述的那些。缀合剂是SATA和磺基-SMCC，两者均可从Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)获得。

就抗体而言，它们可通过两条重链的C端铰链区的巯基成键而缀合。在具体实施方案中，在缀合之前修饰铰链区以含有奇数个巯基残基，例如1个。

备选地，两种结合特异性可在相同载体中编码，并在相同宿主细胞中表达和装配。在双特异性分子是mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab')₂或配体x Fab融合蛋白时，该方法尤其有用。本发明的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两个单链分子。例如在美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；和美国专利号5,482,858中描述了用于制备双特异性分子的方法。

可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(REA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)、或Western印迹测定来验证双特异性分子与其特异性靶标的结合。这些测定法中的每一种一般通过利用对目的复合物特异的标记试剂(例如抗体)来检测特别重要的蛋白质-抗体复合物的存在。

另一方面，本发明提供多价化合物，其包含结合HER3的抗体的至少两个相同或不同的片段。该抗体片段可通过蛋白质融合或共价或非共价键而连接在一起。例如通过将本发明的抗体的抗体与结合本发明抗体的恒定区(例如Fc或铰链区)的抗体交联来获得四价化合物。例如在Borean专利EP 1012280B1中描述了三聚化结构域。例如在PCT/EP97/05897中描述了五聚化模块。

在一个实施方案中，双互补位/双特异性抗体结合HER3的结构域2中的氨基酸残基。

在另一个实施方案中，本发明涉及双功能抗体，其中修饰单个单克隆抗体，使得抗原结合部位结合多于一个抗原，如结合HER3和另一抗原(例如,HER1、HER2和HER4)二者的双功能抗体。在另一个实施方案中，本发明涉及靶向具有相同构象的抗原(例如与处于“封闭”或“失活”态的HER3具有相同构象的抗原)的双功能抗体。与“封闭”或“失活”态的HER3具有相同构象的抗原的实例包括但不限于HER1和HER4。因此，双功能抗体可结合HER3和HER1二者；HER3和HER4二者；或HER1和HER4二者。双功能抗体的双重结合特异性可进一步转化为双重活性，或双重活性抑制。(见例如,Jenny Bostrom等人,(2009)Science:323；1610-1614)。

具有延长的半衰期的抗体

本发明提供特异性结合HER3的结构域2内的表位的在体内具有延长的半衰期的抗体或其片段。

许多因素可影响蛋白质在体内的半衰期。例如，肾过滤、肝中的新陈代谢、通过蛋白酶解酶(蛋白酶)的降解和免疫原性应答(例如，通过抗体的蛋白质中和以及通过巨噬细胞和树突状细胞的摄取)。多种策略可用于延长本发明的抗体的半衰期。例如，通过化学连接聚乙二醇(PEG)、reCODEPEG、抗体支架、聚唾液酸(PSA)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合配体和糖类保护层；通过与结合血清蛋白质(如白蛋白、IgG、FcRn)的蛋白质遗传融合并转移；通过偶联(遗传上或化学上)到其他结合部分，该结合部分结合血清蛋白质，如纳米抗体、Fab、DARPin、avimer、affibody和anticalin；通过遗传融合rPEG、白蛋白、白蛋白的结构域、白蛋白结合蛋白质和Fc；或通过掺入到纳米载体、缓释制剂或医疗设备中。

为了延长抗体在体内的血清循环，可使用或不使用多功能接头，通过将PEG位点特异性缀合到抗体N端或C端或通过赖氨酸残基上存在的ε氨基将惰性聚合分子(如高分子量PEG)附着到抗体或其片段上。为了聚乙二醇化抗体，抗体或其片段通常与聚乙二醇(PEG)(如PEG的活性酯或醛衍生物)在其中一个或更多PEG基团变得附着到抗体或抗体片段的条件下进行反应。可用反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)通过酰化反应或烷化反应进行聚乙二醇化。本文所用的术语“聚乙二醇”旨在包括PEG的任何形式，其已经用于衍生化其他蛋白质，如单(C1-C10)烷氧基或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是去糖基化的抗体。使用导致生物活性损失最小的线性或分支聚合物衍生化。可通过SDS-PAGE和质谱密切监测缀合的程度，以保证PEG分子与抗体的正确缀合。可通过大小排阻层析或通过离子交换层析从抗体-PEG缀合物中分离未反应的PEG。可使用本领域技术人员熟知的方法，例如通过本文描述的免疫测定来测试PEG衍生的抗体的结合活性以及体内功效。聚乙二醇化蛋白质的方法为本领域已知，并可应用于本发明的抗体。参阅例如，Nishimura等的EP0 154 316和Ishikawa等的EP0 401384。

其他修改的聚乙二醇化技术包括重构化学正交指导的改造技术(ReCODE PEG)，其将化学上指定的侧链通过包括tRNA合成酶和tRNA的重构系统掺入到生物合成蛋白质中。该技术能够在大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞中将多于30个新氨基酸掺入到生物合成蛋白质中。该tRNA将非天然氨基酸掺入到琥珀密码子定位的任何位置，使琥珀密码子从终止密码子转化成发信号使化学上指定的氨基酸掺入的密码子。

重组聚乙二醇化技术(rPEG)也可用于血清半衰期延长。该技术涉及将300-600个氨基酸的无结构蛋白质尾巴遗传融合到现有的药物蛋白质上。因为这种无结构蛋白质链的表观分子量比其实际分子量大约15倍，所以极大增加了该蛋白质的血清半衰期。与需要化学缀合和再纯化的传统聚乙二醇化不同，该制备方法极其简化并且产品是均质的。

多唾液酸化是另一种技术，其用天然聚合物聚唾液酸(PSA)来延长活性期并提高治疗性肽和蛋白质的稳定性。PSA是唾液酸的聚合物(糖)。在用于蛋白质和治疗性肽药物递送时，聚唾液酸为缀合提供保护性微环境。这增加了治疗性蛋白质在循环中的活性期并防止其被免疫系统识别。PSA聚合物天然见于人体中。其被某些细菌采用，该细菌进化了超过数百万年，用该PSA聚合物包被自身的壁。通过分子拟态，这些天然聚唾液酸化细菌然后能够挫败身体的防御系统。PSA是自然界的最终隐形技术，可容易地从此类细菌大量产生并具有预定的物理特征。甚至在与蛋白质偶联时，细菌PSA也是完全非免疫原性的，因为它与人体中的PSA在化学上相同。

另一技术包括使用连接抗体的羟乙基淀粉(“HES”)衍生物。HES是衍生自蜡状玉米淀粉的经修饰的天然聚合物，并可通过身体的酶进行新陈代谢。一般施用HES溶液来替换不足的血液容量并改善血液的流变学性质。抗体的羟乙基淀粉化使得能够通过提高分子的稳定性，以及通过降低肾清除率来延长循环半衰期，导致提高的生物学活性。通过改变不同的参数，如HES的分子量，可定制广泛的HES抗体缀合物。

也可通过向IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选Fc或铰链Fc结构域片段)中引入一个或更多氨基酸修饰(即替换、插入或缺失)来产生具有增加的体内半衰期的抗体。参阅例如，国际公开号WO98/23289；国际公开号WO97/34631；和美国专利号6,277,375。

另外，抗体可缀合到白蛋白上，以使抗体或抗体片段在体内更稳定或在体内具有更长的半衰期。技术为本领域所熟知，参阅例如国际公开号WO93/15199、WO93/15200和WO01/77137；和欧洲专利号EP413,622。

HER3抗体或其片段也可与一种或多种人血清白蛋白(HSA)多肽或其部分融合。成熟形式的HSA为585个氨基酸的蛋白质，负责血清渗透压的大部分，也充当内源和外源配体的载体。白蛋白作为载体分子的功能及其惰性性质是用作体内多肽的载体和转运体的理想性质。在WO93/15199、WO93/15200和EP413 622中已提出白蛋白作为多种蛋白质的载体用作白蛋白融合蛋白的组分的用途。也已提出用HSA的N-端片段与多肽融合(EP399 666)。因此，通过将抗体或其片段与白蛋白遗传或化学融合或缀合，可稳定或延长储存期，和/或在溶液中、体外和/或体内在延长的时期内保持分子活性。

可通过遗传操作实现白蛋白与另一种蛋白质的融合，使得编码HSA的DNA或其片段与编码蛋白质的DNA连接。然后用融合的核苷酸序列转化或转染合适的宿主，该融合的核苷酸序列排列在合适的质粒上以表达融合多肽。可以从例如原核或真核细胞进行体外表达，或从转基因生物进行体内表达。涉及HSA融合的其他方法可见于例如WO2001077137和WO200306007中,在此引入作为参考。在具体实施方案中，在哺乳动物细胞系，例如CHO细胞系中进行融合蛋白的表达。在本发明的范围内也考虑抗体与受体在低或高pH下改变的差异结合。例如，通过在抗体的CDR中包括附加的氨基酸(如组氨酸)来修饰抗体，可对抗体的亲和力进行修饰，使得其在低pH(例如溶酶体内的低pH)下保持与其受体结合(见例如,Tomoyuki Igawa等人(2010)Nature Biotechnology；28,1203-1207)。

抗体缀合物

本发明提供特异性结合HER3的抗体或其片段，该抗体或其片段重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)到异源蛋白质或多肽(或其片段，优选至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个氨基酸的多肽)，以产生融合蛋白。具体而言，本发明提供包含本文所述抗体片段(例如，Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH结构域、VH CDR、VL结构域或VL CDR)和异源蛋白质、多肽或肽的融合蛋白。用于将蛋白质、多肽或肽融合或缀合到抗体或抗体片段上的方法为本领域所知。参阅例如美国专利号5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851和5,112,946；欧洲专利号EP307,434和EP367,166；国际公开号WO96/04388和WO91/06570；Ashkenazi等,(1991),Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:10535-10539；Zheng等,(1995),J.Immunol.154:5590-5600；和Vil等,(1992),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11337-11341。

可通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(共同称为“DNA改组”)的技术产生其他融合蛋白。可利用DNA改组来改变本发明抗体或其片段的活性(例如，具有更高亲和力和更低解离速率的抗体或其片段)。一般参阅美国专利号5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458；Patten等,(1997),Curr.Opinion Biotechnol.8:724-33；Harayama,(1998),Trends Biotechnol.16(2):76-82；Hansson等,(1999),J.Mol.Biol.287:265-76；以及Lorenzo和Blasco,(1998),Biotechniques24(2):308-313(这些专利和出版物中的每一个以其整体引入作为参考)。可在重组之前通过易错PCR、随机核苷酸插入或其他方法进行随机诱变来改变抗体或其片段，或编码的抗体或其片段。编码特异性结合HER3蛋白质的抗体或其片段的多核苷酸可与一种或多种异源分子的一个或多个组分、基序、节段、部分、结构域、片段等重组。

此外，可将抗体或其片段融合到标记序列(如肽)以便于纯化。在优选实施方案中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽，如pQE载体(QIAGEN,Inc.,9259Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311)中提供的标签等，其中许多是市售的。如Gentz等,(1989),Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824中所述，例如，六组氨酸为纯化融合蛋白提供了便利。可用于纯化的其他肽标签包括，但不限于对应于衍生自流行性感冒血凝素蛋白质的表位(Wilson等,(1984),Cell37:767)的血凝素(“HA”)标签和“flag”标签。

在其他实施方案中，本发明的抗体或其片段与诊断剂或检测剂缀合。此类抗体可作为临床测试程序的一部分(如测定特定疗法的功效)，用于对疾病或障碍的起始、发展、进行和/或严重性进行监测或预后。可通过将抗体与可检测物质偶联来实现此类诊断和检测，该可检测物质包括但不限于多种酶，如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；辅基，如但不限于链霉抗生物素蛋白生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光物质，如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质，如但不限于鲁米诺；生物发光物质，如但不限于荧光素酶、萤光素和水母发光蛋白；放射性物质，如但不限于碘(¹³¹I、¹²⁵I、¹²³I和¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹¹⁵In、¹¹³In、¹¹²In和¹¹¹In,)、锝(⁹⁹Tc)、铊(²⁰¹Ti)、镓(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、钯(¹⁰³Pd)、钼(⁹⁹Mo)、氙(¹³³Xe)、氟(¹⁸F)、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁹⁰Y、47Sc、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh、⁹⁷Ru、⁶⁸Ge、⁵⁷Co、⁶⁵Zn、⁸⁵Sr、³²P、¹⁵³Gd、¹⁶⁹Yb、⁵¹Cr、⁵⁴Mn、⁷⁵Se、¹¹³Sn和¹¹⁷Tin；及使用多种正电子发射断层术的正电子发射金属，和非放射性顺磁金属离子。

本发明还包括与治疗性部分缀合的抗体或其片段的用途。抗体或其片段可缀合到治疗性部分，如细胞毒素(例如细胞生长抑制剂或细胞杀伤剂)，治疗剂或放射性金属离子，例如α粒子发射体。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任意物质。

另外，抗体或其片段可缀合到修饰给定生物学应答的治疗性部分或药物部分。治疗性部分或药物部分不解释为限制于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有想要的生物学活性的蛋白质、肽或多肽。此类蛋白质可包括例如，毒素，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、细胞凋亡剂、抗血管生成剂；或生物应答修饰因子，例如淋巴因子。在一个实施方案中，HER3抗体或其片段与治疗性部分(例如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)或放射性毒素)缀合。这类缀合物在本文中称为“免疫缀合物”。包括一种或多种细胞毒素的免疫缀合物称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性剂包括有害于(例如杀死)细胞的任意物质。实例包括taxon、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂也包括，例如，抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖孢苷、5-氟尿嘧啶氮烯咪胺)、烧灼剂(ablating agent)(例如，氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和罗氮芥(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂、蒽环类抗生素(例如，柔红霉素(以前称为诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，更生菌素(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。(见例如,SeattleGenetics US20090304721)。

可与本发明的抗体或其片段缀合的治疗性细胞毒素的其他实例包括duocarmycin、刺孢霉素、美登素(maytansine)和auristatin，及其衍生物。刺孢霉素抗体缀合物的实例可购得(MylotargTm；Wyeth-Ayerst)。

可用本领域现有的接头技术将细胞毒素与本发明的抗体或其片段缀合。已经用于将细胞毒素与抗体缀合的接头类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯类、二硫化物和含肽接头。可选择这样的接头，其例如易于通过溶酶体区室内的低pH切割，或易于通过蛋白酶(如在肿瘤组织中优先表达的蛋白酶，如组织蛋白酶(例如,组织蛋白酶B、C、D))切割。

有关细胞毒素、接头的类型和用于将治疗剂与抗体缀合的方法的进一步讨论也可见Saito等人,(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55:199-215；Trail等人,(2003)Cancer Immunol.Immunother.52:328-337；Payne,(2003)CancerCell3:207-212；Allen,(2002)Nat.Rev.Cancer2:750-763；Pastan和Kreitman,(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs3:1089-1091；Senter和Springer,(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53:247-264。

本发明的抗体或其片段也可与放射性同位素缀合，以产生细胞毒性放射性药物，又称放射性免疫缀合物。可与抗体缀合用于诊断或治疗的放射性同位素的实例包括但不限于，碘^l31、铟¹¹¹、钇⁹⁰和镥¹⁷⁷。用于制备放射性免疫缀合物的方法为本领域公知。放射性免疫缀合物的实例可购得，包括Zevalin^TM(DEC Pharmaceuticals)和Bexxar^TM(Corixa Pharmaceuticals),并且可用类似的方法来用本发明的抗体制备放射性免疫缀合物。在某些实施方案中，大环螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸(DOTA)，其可通过接头分子附着到抗体上。此类接头分子为本领域公知，并描述于Denardo等,(1998),Clin Cancer Res.4(10):2483-90；Peterson等,(1999),Bioconjug.Chem.10(4):553-7；和Zimmerman等,(1999),Nucl.Med.Biol.26(8):943-50中，每一参考文献以其整体引入作为参考。

用于将治疗性部分缀合到抗体上的技术是众所周知的，参阅例如Arnon等,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy”,Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等(编辑),第243-56页(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等,“AntibodiesFor Drug Delivery”,Controlled Drug Delivery(第2版Robinson等(编辑),第623-53页(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,“Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”,Monoclonal Antibodies84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等(编辑),第475-506页(1985)；“Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic UseOf Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”,Monoclonal AntibodiesFor Cancer Detection And Therapy,Baldwin等(编辑),第303-16页(Academic Press1985)；和Thorpe等,(1982),Immunol.Rev.62:119-58。

抗体也可附着到固相支持物上，该固相支持物尤其用于靶抗原的免疫测定或纯化。此类固相支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。

抗体组合

在另一方面，本发明涉及本发明的HER3抗体或其片段与其他治疗剂如另一种抗体、小分子抑制剂、mTOR抑制剂或PI3激酶抑制剂一起使用。实例包括但不限于以下：

HER1抑制剂:HER3抗体或其片段可与HER1抑制剂一起使用，该HER1抑制剂包括但不限于，马妥珠单抗(EMD72000)、/西妥昔单抗(Imclone)、/帕尼单抗(Amgen)、mAb806和尼妥珠单抗(TheraCIM)、/吉非替尼(Astrazeneca)；CI-1033(PD183805)(Pfizer)、拉帕替尼(GW-572016)(GlaxoSmithKline)、/二甲苯磺酸拉帕替尼(SmithKlineBeecham)、/盐酸埃罗替尼(OSI-774)(OSI Pharma)、PKI-166(Novartis)和N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[[(3″S″)-四氢-3-呋喃基]氧]-6-喹唑啉基]-4(二甲氨基)-2-丁烯酰胺(由Boehringer Ingelheim以商标名出售)。

HER2抑制剂:HER3抗体或其片段可与HER2抑制剂一起使用，该HER2抑制剂包括但不限于，帕妥珠单抗(由Genentech以商标出售)、曲妥珠单抗(由Genentech/Roche以商标出售)、MM-111、来那替尼(又称HKI-272，(2E)-N-[4-[[3-氯-4-[(吡啶-2-基)甲氧基]苯基]氨基]-3-氰基-7-乙氧基喹啉-6-基]-4-(二甲氨基)丁-2-烯酰胺，在PCT公开号WO05/028443中描述)、拉帕替尼或二甲苯磺酸拉帕替尼(由GlaxoSmithKline以商标出售)。

HER3抑制剂:HER3抗体或其片段可与HER3抑制剂一起使用，该HER3抑制剂包括但不限于，MM-121、MM-111、IB4C3、2DID12(U3Pharma AG)、AMG888(Amgen)、AV-203(Aveo)、MEHD7945A(Genentech)和抑制HER3的小分子。

HER4抑制剂:HER3抗体或其片段可与HER4抑制剂一起使用。

PI3K抑制剂:HER3抗体或其片段可与PI3激酶抑制剂一起使用，该PI3激酶抑制剂包括但不限于，4-[2-(1H-吲哚-4-基)-6-[[4-(甲磺酰)哌嗪-1-基]甲基]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基]吗啉(又称GDC0941，在PCT公开号WO09/036082和WO09/055730中描述)、2-甲基-2-[4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基]丙腈(又称BEZ235或NVP-BEZ235,在PCT公开号WO06/122806中描述)、BMK120和BYL719。

mTOR抑制剂:HER3抗体或其片段可与mTOR抑制剂一起使用，该mTOR抑制剂包括但不限于，坦罗莫司(由Pfizer以商标名出售)、ridaforolimus(以前称为deferolimus，(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六烷-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基膦酸酯，又称雷帕霉素、AP23573和MK8669(Ariad Pharm.)，在PCT公开号WO 03/064383中描述)、依维莫司(RAD001)(由Novartis以商标名出售)。一种或多种治疗剂可与本发明的HER3抗体或其片段同时施用，或在施用本发明的HER3抗体或其片段之前或之后施用。

产生本发明的抗体的方法

(i)编码抗体的核酸

本发明提供基本纯化的核酸分子，其编码包含上文所述的HER3抗体链的区段或结构域的多肽。本发明的一些核酸包含编码HER3抗体重链可变区的核苷酸序列，和/或编码轻链可变区的核苷酸序列。在具体实施方案中，核酸分子是在表1中鉴定的那些核酸分子。本发明的一些其他核酸分子包含与表1中鉴定的那些核酸分子的核苷酸序列基本相同(例如至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)的核苷酸序列。在从适当的表达载体表达时，由这些多核苷酸编码的多肽能够显示HER3抗原结合能力。

本发明还提供这样的多核苷酸，该多核苷酸编码来自上文所示的抗体或其片段的重链或轻链的至少一个CDR区以及通常所有三个CDR区。一些其他多核苷酸编码上文所示的抗体或其片段的重链和/或轻链的所有或基本上所有可变区序列。由于密码子的简并性，多种核酸序列将编码每一种免疫球蛋白氨基酸序列。

本发明的核酸分子可编码抗体的可变区和恒定区二者。本发明的一些核酸序列包含编码成熟重链可变区序列的核苷酸，该成熟重链可变区序列与表1中所示的HER3抗体的成熟重链可变区序列基本相同(例如，至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)。一些其他核酸序列包含编码成熟轻链可变区序列的核苷酸，该成熟轻链可变区序列与表1中所示的HER3抗体的成熟轻链可变区序列基本相同(例如，至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)。

可通过从头固相DNA合成或通过编码抗体或其片段的现有序列的PCR诱变来产生多核苷酸序列。可通过本领域已知的方法实现核酸的直接化学合成，如Narang等,(1979),Meth.Enzymol.68:90的磷酸三酯法；Brown等,(1979)Meth.Enzymol.68:109的磷酸二酯法；Beaucage等,(1981)Tetra.Lett.,22:1859的二乙基亚磷酰胺法；和美国专利号4,458,066的固相支持物法。可按PCR Technology:Principles and Applications for DNAAmplification,H.A.Erlich(编辑),Freeman Press,NY,NY,1992；PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications,Innis等(编辑),AcademicPress,San Diego,CA,1990；Mattila等,(1991)Nucleic Acids Res.19:967；和Eckert等,(1991)PCR Methods and Applications 1:17中所述进行通过PCR向多核苷酸序列中引入突变。

本发明还提供用于产生抗体或其片段的表达载体和宿主细胞。可用多种表达载体来表达编码HER3抗体链或其片段的多核苷酸。基于病毒的表达载体和非病毒表达载体都可用于在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包括质粒、游离型载体(通常具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒)和人工染色体(参阅例如，Harrington等,(1997)Nat Genet15:345)。例如，用于在哺乳动物(例如人)细胞中表达HER3多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B&C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B&C(Invitrogen,San Diego,CA)、MPSV载体及本领域已知用于表达其他蛋白质的许多其他载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、乳头瘤病毒、HBP EB病毒、痘苗病毒载体和Semliki Forest病毒(SFV)的载体。参阅，Brent等,(1995)上文；Smith,Annu.Rev.Microbiol.49:807；和Rosenfeld等,(1992)Cell68:143。

表达载体的选择依赖于将在其中表达该载体的预期宿主细胞。通常，该表达载体含有有效连接编码抗体链或其片段的多核苷酸的启动子和其他调节序列(例如增强子)。在一些实施方案中，用诱导型启动子来防止插入序列除了在诱导条件下之外的表达。诱导型启动子包括，例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。可在非诱导条件下扩大转化生物的培养，而不偏向编码序列的群体，该编码序列的表达产物能更好地由宿主细胞耐受。除启动子外，还可要求或希望将其他调节元件用于抗体链或其片段的有效表达。这些元件通常包括ATG起始密码子和邻近核糖体结合位点或其他序列。此外，可通过包括适合于所使用的细胞系统的增强子来增强表达的效率(参阅例如，Scharf等,(1994)Results Probl.Cell Differ.20:125；和Bittner等,(1987)Meth.Enzymol.,153:516)。例如，SV40增强子或CMV增强子可用于提高哺乳动物宿主细胞中的表达。

表达载体也可提供分泌信号序列位置，以与所插入的抗体或片段编码的多肽形成融合蛋白。更经常地，在包括进入载体之前，将该插入的抗体或片段序列与信号序列连接。待用于接受编码抗体或片段轻链和重链可变结构域的序列的载体有时也编码恒定区或其部分。此类载体允许可变区表达为与恒定区的融合蛋白，由此导致完整抗体或其片段的产生。通常，此类恒定区是人的恒定区。

用于包含并表达抗体或片段链的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。大肠杆菌是用于克隆和表达本发明的多核苷酸的一种原核宿主。适于使用的其他微生物宿主包括芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)，如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)和多种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，也可以制备表达载体，其通常含有与该宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。此外，将存在任意数目的多种众所周知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统，或来自λ噬菌体的启动子系统。该启动子通常可选地与操纵子序列一起控制表达，并具有核糖体结合位点序列等，用于起始并完成转录和翻译。其他微生物，如酵母也可用于表达抗体或其片段。也可将昆虫细胞与杆状病毒载体组合使用。

在一些优选实施方案中，哺乳动物宿主细胞用于表达和产生抗体或其片段。例如，它们可以是表达内源免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系或包含外源表达载体的哺乳动物细胞系。这些包括任意正常死亡的或正常或非正常永生的动物细胞或人细胞。例如，已经发展了能够分泌完整免疫球蛋白的大量适宜的宿主细胞系，包括CHO细胞系、多种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、经转化的B细胞和杂交瘤。一般在例如Winnacker,FROM GENES TO CLONES,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987中讨论了哺乳动物组织细胞培养物在表达多肽中的用途。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可包括表达控制序列，如复制起点、启动子和增强子(参阅例如，Queen等,(1986)Immunol.Rev.89:49-68)，及必要的加工信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体一般含有衍生自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异型的、阶段特异型的、和/或可调整的或可调节的。有用的启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(如人立即早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。

用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型而不同。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主。(一般参阅Sambrook,等，上文)。其他方法包括，例如电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、生物射弹方法、病毒颗粒、免疫脂质体、聚阳离子:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒体、与疱疹病毒结构蛋白VP22的融合物(Elliot和O'Hare,(1997)Cell88:223)、DNA的活性剂增强摄取和离体转导。对于重组蛋白质的长期、高产率产生，通常将希望稳定表达。例如，可用含有病毒复制起点或内源表达元件和选择标记基因的本发明的表达载体来制备稳定表达抗体链或片段的细胞系。引入载体后，可以使细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转换到选择性培养基。选择标记的目的是赋予对选择的抗性，并且其存在允许成功表达所引入的序列的细胞在选择性培养基中生长。可以用适于该细胞类型的组织培养技术增殖具有抗性的稳定转染的细胞。

(ii)本发明的单克隆抗体的产生

可通过多种技术来产生单克隆抗体(mAb)，包括常规单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein,(1975)Nature 256:495的标准体细胞杂交技术。可利用产生单克隆抗体的许多技术，例如，B淋巴细胞的病毒转化或致癌性转化。

用于制备杂交瘤的动物系统是鼠系统。小鼠中杂交瘤的产生是完善的方法。分离经免疫的脾细胞用于融合的免疫方案和技术为本领域所知。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合步骤也是已知的。

可在按上文所述制备的鼠单克隆抗体的序列基础上制备本发明的嵌合抗体或人源化抗体。可用标准分子生物学技术从目的鼠杂交瘤中获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA，并进行改造以含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可用本领域已知的方法将鼠可变区连接到人恒定区(参阅例如，Cabilly等的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，可用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人构架中。参阅例如，Winter的美国专利号5225539和Queen等的美国专利号5530101、5585089、5693762和6180370。

在某实施方案中，本发明的抗体是人单克隆抗体。可用携带人免疫系统的部分而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生针对HER3的此类人单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括本文分别称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并在此处统称为“人Ig小鼠”。

HuMAb小鼠(Medarex,Inc.)含有编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)，以及失活内源μ和κ链基因座的靶向突变(参阅例如，Lonberg,等,(1994)Nature368(6474):856-859)。因此，该小鼠显示降低表达的小鼠IgM或κ，并且响应免疫时，所引入的人重链和轻链转基因经历种类转换和体细胞突变，以产生高亲和力人IgGκ单克隆抗体(Lonberg,N.等,(1994)上文；综述于Lonberg,(1994)Handbook of Experimental Pharmacology113:49-101；Lonberg和Huszar,(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65-93；及Harding和Lonberg,(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546中)。HuMAb小鼠的制备和用途以及该小鼠所携带的基因组修饰进一步描述于Taylor等,(1992)Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen等,(1993)InternationalImmunology5:647-656；Tuaillon等,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:3720-3724；Choi等,(1993)Nature Genetics4:117-123；Chen等,(1993)EMBO J.12:821-830；Tuaillon等,(1994)J.Immunol.152:2912-2920；Taylor等,(1994)International Immunology579-591；及Fishwild等,(1996)Nature Biotechnology 14:845-851中,所有参考文献的内容在此以其整体明确引入作为参考。进一步参阅均为Lonberg和Kay的美国专利号5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299和5,770,429；Surani等的美国专利号5,545,807；均为Lonberg和Kay的PCT公开号WO92103918、WO93/12227、WO94/25585、WO97113852、WO98/24884和WO99/45962；及Korman等的PCT公开号WO01/14424。

在另一实施方案中，可用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠来产生本发明的人抗体。Ishida等的PCT公开WO02/43478中详细描述了本文称为“KM小鼠”的此类小鼠。

另外，表达人免疫球蛋白基因的备选转基因动物系统在本领域中可得，并可用于制备本发明的HER3抗体。例如，可使用称为Xenomouse(Abgenix,Inc.)的备选转基因系统。例如Kucherlapati等的美国专利号5,939,598、6,075,181、6,114,598、6,150,584和6,162,963中描述了此类小鼠。

此外，表达人免疫球蛋白基因的备选转染色体动物系统在本领域中可得，并可用于制备本发明的HER3抗体。例如，可使用称为“TC小鼠”的携带人重链转染色体和人轻链转染色体二者的小鼠；Tomizuka等,(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:722-727中描述了此类小鼠。此外，携带人重链和轻链转染色体的奶牛在本领域中已有描述(Kuroiwa等,(2002)NatureBiotechnology20:889-894)，并可用于制备本发明的HER3抗体。

也可用用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示法制备本发明的人单克隆抗体。在本领域中建立或在下文实施例中描述了用于分离人抗体的此类噬菌体展示法。参阅例如：Ladner等的美国专利号5,223,409、5,403,484和5,571,698；Dower等的美国专利号5,427,908和5,580,717；McCafferty等的美国专利号5,969,108和6,172,197；及Griffiths等的美国专利号5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915和6,593,081。

也可用SCID小鼠制备本发明的人单克隆抗体，在该SCID小鼠中，已经重构了人免疫细胞，使得可在免疫后产生人抗体应答。例如Wilson等的美国专利号5,476,996和5,698,767中描述了此类小鼠。

(iii)构架或Fc改造

本发明的改造抗体包括其中已对VH和/或VL内的构架残基进行了修饰，例如以改善抗体性质的那些抗体。通常进行这类构架修饰来降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或更多构架残基“回复突变”成相应的种系序列。更具体而言，已经经历了体细胞突变的抗体含有不同于抗体所衍生自的种系序列的构架残基。可通过比较抗体构架序列与该抗体所衍生自的种系序列来鉴定此类残基。为了将构架区序列恢复成它们的种系构型，可以例如通过定点诱变来将体细胞突变“回复突变”到种系序列中。此类“回复突变的”抗体也旨在包括在本发明内。

另一类型的构架修饰涉及突变构架区或甚至一个或更多CDR区内的一个或更多残基，以去除T细胞表位，由此降低抗体的潜在免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，并进一步详细描述于Carr等的美国专利公开号20030153043中。

除在构架或CDR区内进行修饰外或作为备选，可改造本发明的抗体以包括Fc区内的修饰，通常用来改变抗体的一种或更多功能性质，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合、和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，可化学修饰(例如，一个或更多个化学部分可附着到抗体上)或修饰本发明的抗体以改变其糖基化，同样用于改变抗体的一种或更多功能性质。下文中进一步详细描述了这些实施方案中的每一个。Fc区中残基的编号是Kabat的EU指数的编号。

在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，使得改变，例如增加或减少铰链区中半胱氨酸残基的数目。Bodmer等的美国专利号5,677,425中进一步描述了该方法。改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数目，例如用来便于轻链和重链的装配，或提高或降低抗体的稳定性。

在另一实施方案中，突变抗体的Fc铰链区，以降低抗体的生物半衰期。更具体而言，向Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区引入一个或多个氨基酸突变，使得抗体相对于天然的Fc铰链结构域SpA结合具有受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。Ward等的美国专利号6,165,745中进一步详细描述了该方法。

还在其他实施方案中，通过用不同氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，可用不同氨基酸残基替换一个或多个氨基酸，使得抗体对效应子配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。改变对其亲和力的效应子配体可以是例如，Fc受体或补体的C1组分。Winter等的美国专利号5,624,821和5,648,260中都进一步详细描述了该方法。

在另一实施方案中，可用不同氨基酸残基替换选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸，使得抗体具有改变的C1q结合/或降低的或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。Idusogie等的美国专利号6,194,551中进一步详细描述了该方法。

在另一实施方案中，改变一个或多个氨基酸残基，由此改变抗体固定补体的能力。Bodmer等的PCT公开WO94/29351中进一步详细描述了该方法。

还在另一实施方案中，修饰Fc区以提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或通过修饰一个或多个氨基酸来增加抗体对Fcγ受体的亲和力。Presta的PCT公开WO00/42072中进一步详细了描述该方法。此外，已经定位了人IgG1上的FcγRl、FcγRII、FcγRIII和FcRn结合位点，并且已经描述了具有提高的结合的变体(参阅Shields等,(2001)J.Biol.Chen.276:6591-6604)。

还在另一实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可制备去糖基化的抗体(即该抗体缺乏糖基化)。可改变糖基化，例如用来增加抗体对“抗原”的亲和力。可通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现此类糖类修饰。例如，可进行导致一个或更多可变区构架糖基化位点消除的一个或多个氨基酸替换，由此消除该位点处的糖基化。这种去糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。Co等的美国专利号5,714,350和6,350,861中进一步详细描述了该方法。

此外或备选地，可以制备具有改变类型的糖基化的抗体，如具有减少量的岩藻糖残基的低岩藻糖基化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已经证明此类改变的糖基化模式提高抗体的ADCC能力。例如通过在具有改变的糖基化机器的宿主细胞中表达抗体来实现此类糖类修饰。已经在本领域中描述了具有改变的糖基化机器的细胞，并且该细胞可用作在其中表达本发明重组抗体的宿主细胞，由此产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等的EP1,176,195描述了具有功能上破坏的FUT8基因的细胞系，该基因编码岩藻糖基转移酶，使得在这种细胞系中表达的抗体显示低岩藻糖基化。Presta的PCT公开WO03/035835描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其将岩藻糖附着到Asn(297)-连接的糖类上的能力降低，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化(也参阅Shields等,(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等的PCT公开WO99/54342描述了这样的细胞系，该细胞系经改造以表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1,4)-N乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII))，使得在改造的细胞系中表达的抗体显示增加的二等分GlcNac结构，这导致抗体的ADCC活性提高(也参阅Umana等,(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。

在另一实施方案中，修饰抗体以增加其生物半衰期。可使用多种方法。例如，如Ward的美国专利号6,277,375中所述，可引入一个或多个以下突变：T252L、T254S、T256F。备选地，如Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中所述，为了增加生物半衰期，可在CH1或CL区内改变抗体以含有从IgG的Fc区的CH2结构域取得的2个环的救助受体结合表位。

(iv)改造改变的抗体的方法

具有本文显示的VH和VL序列或全长重链和轻链序列的本发明的HER3抗体或其片段可用于通过修饰全长重链和/或轻链序列、VH和/或VL序列、或附着到其上的恒定区来产生新的HER3结合抗体。因此，在本发明的另一方面，用HER3抗体或其片段的结构特征来产生结构上相关的HER3抗体，该抗体保留了本发明的抗体的至少一种功能性质，如结合人HER3，以及抑制HER3的一种或多种功能性质。例如，本发明的抗体的一个或多个CDR区或其突变可与已知的构架区和/或其他CDR重组组合，以产生上文讨论的本发明的其他重组改造的HER3抗体。其他类型的修饰包括在先前部分中描述的那些。用于改造方法的起始材料是本文提供的一个或多个VH和/或VL序列，或其一个或多个CDR区。为了产生改造的抗体，不必实际制备(即表达为蛋白质)具有本文提供的一个或多个VH和/或VL序列，或其一个或多个CDR区的抗体。而是，将序列中包含的信息用作起始材料来产生衍生自初始序列的“第二代”序列，然后制备该“第二代”序列并将其表达为蛋白质。

因此，在另一实施方案中，本发明提供用于制备由重链可变区抗体序列和轻链可变区抗体序列组成的结合HER3的结构域3的抗体的方法；该重链可变区氨基酸序列具有选自SEQ ID NO:2、22、42、62、82、102、122、142、162、182、202、222、242、262、282、302、322、342、362、382、402、422、442、462、482、502和522的CDR1序列、选自SEQ IDNO:3、23、43、63、83、103、123、143、163、183、203、223、243、263、283、303、323、343、363、383、403、423、443、463、483、503和523的CDR2序列和/或选自SEQ ID NO:4、24、44、64、84、104、124、144、164、184、204、224、244、264、284、304、324、344、364、384、404、424、444、464、484、504和524的CDR3序列，该轻链可变区抗体序列具有选自SEQ ID NO:8、28、48、68、88、108、128、148、168、188、208、228、248、268、288、308、328、348、368、388、408、428、448、468、488、508和528的CDR1序列、选自SEQ ID NO:9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229、249、269、289、309、329、349、369、389、409、429、449、469、489、509和529的CDR2序列和/或选自SEQ ID NO:10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210、230、250、270、290、310、330、350、370、390、410、430、450、470、490、510和530的CDR3序列；改变该重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基来产生至少一个改变的抗体序列；并将该改变的抗体序列表达为蛋白质。也可通过筛选抗体文库来制备该改变的抗体序列，该抗体文库具有如US20050255552中描述的固定的CDR3序列或最小必需结合决定簇以及CDR1和CDR2序列上的多样性。可根据适合于从抗体文库中筛选抗体的任意筛选技术(如噬菌体展示技术)进行筛选。

标准分子生物学技术可用于制备和表达改变的抗体序列。由该改变的抗体序列编码的抗体是保留本文所述的抗体或其片段的一种、一些或所有功能性质的抗体，该功能性质包括但不限于：与人和/或食蟹猴HER3特异性结合；抗体在磷酸-HER测定中结合HER3并通过抑制HER信号发放活性来抑制HER3生物活性。

可用本领域中可得的标准测定和/或本文描述的测定，如实施例中所示的那些(例如，ELISA)来评估经改变的抗体的功能性质。

在本发明的改造抗体的方法的某些实施方案中，可沿全部或部分抗体或片段编码序列随机地或选择性地引入突变，并且可按本文所述筛选所得到的经修饰HER3抗体的结合活性和/或其他功能性质。已经在本领域中描述了突变方法。例如，Short的PCT公开WO02/092780描述了使用饱和诱变、合成连接装配或其组合来产生和筛选抗体突变的方法。备选地，Lazar等的PCT公开WO03/074679描述了用计算筛选方法来优化抗体理化性质的方法。

本发明的抗体的表征

可通过多种功能测定表征本发明的抗体。例如，可通过它们在本文所述的磷酸-HER测定中通过抑制HER信号发放来抑制生物活性的能力、它们与HER3蛋白(例如，人和/或食蟹猴HER3)的亲和力、表位结合、它们对蛋白酶解的抗性及它们阻断HER3下游信号发放的能力来表征。可用多种方法测量HER3介导的信号发放。例如，可通过(i)测量磷酸-HER3、(ii)测量HER3或其他下游信号发放蛋白(例如Akt)的磷酸化、(iii)本文所述的配体阻断测定、(iv)异源二聚体形成、(v)HER3依赖性基因表达特征、(vi)受体内化和(vii)HER3驱动的细胞表型(例如增殖)来监测HER信号传导途径。

可通过直接标记目的抗体来检测抗体结合HER3的能力，或可不标记抗体，用本领域已知的多种夹心测定方式间接检测结合。

在一些实施方案中，HER3抗体阻断参考HER3抗体与HER3的结合或与参考HER3抗体竞争结合HER3。它们可以是上文所述的全人HER3抗体。它们也可以是与参考抗体结合相同表位的其他小鼠、嵌合或人源化HER3抗体。阻断参考抗体结合或与参考抗体竞争结合的能力表明所测试的HER3抗体结合与参考抗体所定义的表位相同或相似的表位，或结合与参考HER3抗体所结合表位足够接近的表位。此类抗体尤其可能共享针对参考抗体鉴定出的有利特性。可通过例如竞争结合测定来测定阻断参考抗体或与参考抗体竞争的能力。使用竞争结合测定，检查所测试的抗体抑制参考抗体与共同抗原(例如HER3多肽或蛋白质)的特异性结合的能力。如果过量的测试抗体基本上抑制参考抗体的结合，则测试抗体与参考抗体竞争与抗原的特异性结合。基本上抑制已知测试抗体通常使参考抗体的特异性结合降低至少10％、25％、50％、75％或90％。

许多已知的竞争结合测定可用来评估HER3抗体和参考HER3抗体与HER3的竞争结合。这包括，例如固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(见Stahli等人,(1983)Methods in Enzymology9:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(见Kirkland等人,(1986)J.Immunol.137:3614-3619)；固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(见Harlow&Lane,上文)；使用I-125标记物的固相直接标记RIA(见Morel等人,(1988)Molec.Immunol.25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人,(1990)Virology176:546-552)；及直接标记RIA(Moldenhauer等人,(1990)Scand.J.Immunol.32:77-82)。通常，这种测定涉及使用结合在固相表面或细胞的纯化抗原，该固相表面或细胞携带未标记的测试HER3结合抗体和标记的参考抗体中的任一种。通过在测试抗体的存在下测定与固相表面或细胞结合的标记物的量来测量竞争性抑制。测试抗体通常过量存在。由于存在位阻，通过竞争测定鉴定的抗体(竞争抗体)包括与参考抗体结合的表位相同的表位结合的抗体和与参考抗体结合的表位足够接近的相邻表位结合的抗体。

为了测定所选择的HER3单克隆抗体是否结合唯一的表位，可用市售试剂(例如来自Pierce,Rockford,IL的试剂)对各个抗体进行生物素化。可用HER3多肽包被的ELISA板进行使用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体的竞争研究。可用链霉抗生物素-碱性磷酸酶探针检测生物素化的MAb的结合。为了测定纯化的HER3结合抗体的同种型，可进行同种型ELISA。例如，可用1μg/ml抗人IgG在4℃过夜包被微量滴定板的孔。在用1％BSA封闭后，使板与1μg/ml或更少的单克隆HER3抗体或纯化的同种型对照在环境温度反应1-2小时。然后可使孔与人IgGl或人IgM特异性碱性磷酸酶缀合的探针反应。然后对板显色和分析，从而可确定纯化的抗体的同种型。

为证明单克隆HER3抗体与表达HER3多肽的活细胞的结合，可使用流式细胞术。简言之，可将表达HER3的细胞系(在标准生长条件下培养)与多种浓度的HER3结合抗体在含有0.1％BSA和10％胎牛血清的PBS中混合，并在4℃孵育1小时。洗涤后，在与第一抗体染色相同的条件下使细胞与荧光素标记的抗人IgG抗体反应。可通过FACScan仪器分析样品，使用光散射和侧向散射性能分选单细胞。除了流式细胞术测定以外或代替流式细胞术测定，可使用利用荧光显微术的备选测定。完全按上文所述对细胞进行染色并通过荧光显微镜检查细胞。此方法允许单个细胞的可视化，但取决于抗原密度可具有降低的灵敏性。

可通过Western印迹进一步测试本发明的抗体或其片段与HER3多肽或抗原片段的反应性。简言之，可制备纯化的HER3多肽或融合蛋白，或来自表达HER3的细胞的细胞提取物，然后进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分开的抗原转移至硝酸纤维素膜，用10％胎牛血清封闭，并用待测单克隆抗体探测。可用抗人IgG碱性磷酸酶检测人IgG的结合，并用BCIP/NBT底物片剂(Sigma Chem.Co.,St.Louis,MO)显色。

可用多种读出方式在配体诱导的异源二聚体形成的基于细胞的测定中评估HER3抗体的效力和特异性。可通过以下的一种或多种来评估活性：

(i)靶细胞系(例如MCF-7乳腺癌细胞)中HER2与其他EGF家族成员的配体诱导的异源二聚化的抑制。可用受体特异性抗体从细胞裂解物免疫沉淀HER2复合物，在电泳/Western转移后通过用其他EGF受体的抗体探测，可分析复合物中其他EGF受体及其生物学相关配体的缺乏/存在。

(ii)由配体激活的异源二聚体激活的信号传导途径的抑制。与HER3的结合似乎是EGF家族受体的其他成员在配体结合后引发最大细胞应答的关键。在激酶缺陷的HER3的情况下，HER2提供了功能性酪氨酸激酶结构域，使得能够在生长因子配体结合后发生信号发放。因此，可在缺乏和存在抑制剂的情况下用配体(例如调蛋白)处理共表达HER2和HER3的细胞，并通过许多方式监测对HER3酪氨酸磷酸化的影响，这些方式包括从经处理的细胞裂解物免疫沉淀HER3，随后进行使用抗磷酸酪氨酸抗体的Western印迹(有关细节见Agus上文)。备选地，可通过将来自增溶裂解物的HER3捕获至用抗HER3受体抗体包被的96孔板的孔上，并用例如Waddleton等人,(2002)Anal.Biochem.309:150-157所实施的铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体测量酪氨酸磷酸化水平来发展高通量测定。

在此方法的更广的扩展中，已知在激活的受体异源二聚体下游激活的效应分子(如促分裂原激活蛋白激酶(MAPK)和Akt)可通过从经处理的裂解物免疫沉淀并用检测这些蛋白质的激活形式的抗体进行印迹，或通过分析这些蛋白质修饰/激活特异性底物的能力来直接进行分析。

(iii)配体诱导的细胞增殖的抑制。已知多种细胞系共表达ErbB受体的组合，例如许多乳腺癌和前列腺癌细胞系。可在24/48/96-孔形式中进行测定，读出基于相关DNA合成(氚标记的胸苷掺入)、细胞数的增加(结晶紫染色)等。

可用多种读出方式在非配体依赖性同源和异源二聚体形成的基于细胞的测定中评估HER3抗体的效力和特异性。例如，由于自发的二聚体形成，HER2过表达触发激酶结构域的非配体依赖性激活。过表达的HER2与其他HER分子(如HER1、HER3和HER4)产生同源或异源二聚体。

抗体或其片段阻断人肿瘤细胞系的肿瘤异种移植物的体内生长的能力，已知该细胞系的肿瘤发生表型至少部分依赖于HER3异源二聚体细胞信号发放的配体激活，例如BxPC3胰腺癌细胞等。此能力可在免疫受损的小鼠中单独评估，或与用于所讨论的细胞系的适当的细胞毒性剂组合评估。在下文的实施例章节中也描述了功能测定的实例。

预防和治疗用途

本发明提供通过对有需要的个体施用有效量的本发明的抗体或其片段来治疗与HER3信号传导途径相关的疾病或障碍的方法。在具体实施方案中，本发明提供通过对有需要的个体施用有效量的本发明的抗体或其片段来治疗或预防癌症(例如，乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌、外周神经鞘瘤、神经鞘瘤、头颈癌、膀胱癌、食管癌、Barretts食管癌、成胶质细胞瘤、软组织透明细胞瘤、恶性间皮瘤、神经纤维瘤病、肾癌、黑素瘤、前列腺癌、良性前列腺增生(BPH)、男性乳房发育症和子宫内膜异位)的方法。在一些实施方案中，本发明提供通过对有需要的个体施用有效量的本发明的抗体来治疗或预防与HER3信号传导途径相关的癌症的方法。

在具体实施方案中，本发明供治疗与HER3信号传导途径相关的癌症的方法，该癌症包括但不限于乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌、外周神经鞘瘤、神经鞘瘤、头颈癌、膀胱癌、食管癌、Barretts食管癌、成胶质细胞瘤、软组织透明细胞瘤、恶性间皮瘤、神经纤维瘤病、肾癌、黑素瘤、前列腺癌、良性前列腺增生(BPH)、男性乳房发育症和子宫内膜异位。

也可以用本发明的抗体或其片段来治疗或预防与异常或缺陷的HER3信号发放相关的其他疾病，该疾病包括但不限于呼吸道疾病、骨质疏松症、骨关节炎、多囊性肾病、糖尿病、精神分裂症、血管疾病、心脏疾病、非致癌性增生性疾病、纤维化和神经退行性疾病如阿尔茨海默病。

适合用于与HER3抗体组合治疗的药物包括能够调节ErbB信号传导途径的本领域已知的标准治疗剂。用于HER2的标准治疗剂的适宜的实例包括但不限于赫塞汀(Herceptin)和拉帕替尼(Tykerb)。用于EGFR的标准治疗剂的适宜的实例包括但不限于上述易瑞沙(Iressa)、特罗凯(Tarceva)、爱必妥(Erbitux)和维克替比(Vectibix)。可能适于与HER3抗体组合治疗的其他药物包括但不限于调节受体酪氨酸激酶、G蛋白偶联受体、生长/生存信号转导途径、核激素受体、凋亡通路、细胞周期和血管发生的那些药物。

诊断用途

在一方面，本发明包括用于在生物样品(例如，血液、血清、细胞、组织)的背景中或患有癌症、或处于患上癌症的风险的个体中测定HER3和/或核酸表达以及HER3蛋白质功能的诊断测定。

诊断测定(如竞争性测定)依赖于标记的类似物(“示踪物”)与测试样品分析物竞争共同的结合配偶体上有限数量的结合部位的能力。结合配偶体一般在竞争前或竞争后不溶解，然后结合到结合配偶体上的示踪物和分析物与未结合的示踪物和分析物分开。通过倒出(其中结合配偶体预先不溶解)或通过离心(其中结合配偶体在竞争反应后沉淀)来实现此分开。如通过标记物质的量所测定，测试样品分析物的量与结合的示踪物的量成反比。制备已知量的分析物的剂量应答曲线，并与测试结果进行比较，以定量测定测试样品中存在的分析物的量。在用酶作为可检测标记时，这些测定称为ELISA系统。在这种形式的测定中，抗体与HER3抗体之间的竞争性结合导致结合的HER3，优选本发明的HER3表位是血清样品中的抗体的量度，最尤其是血清样品中的抑制抗体的量度。

测定的显著优势是直接对抑制抗体(即干扰HER3结合，尤其是表位结合的那些抗体)进行测量。这种测定(特别是ELISA测试形式)在临床环境和常规血液筛查中具有相当多的应用。

本发明的另一方面提供用于测定个体中的HER3核酸表达或HER3活性的方法，由此为该个体选择适当的治疗剂或预防剂(此处称为“药物基因组学”)。药物基因组学允许基于个体的基因型来选择活性剂(例如药物)用于个体的治疗性或预防性处理(例如，检查个体的基因型来确定该个体对特定活性剂应答的能力)。

本发明的另一方面涉及在临床试验中监测活性剂(例如药物)对HER3的表达或活性的影响。

药物组合物

为了制备包括抗体或其片段的药物组合物或无菌组合物，将抗体或其片段与可药用载体或赋形剂混合。组合物可另外含有适合用于治疗或预防癌症(乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌、外周神经鞘瘤、神经鞘瘤、头颈癌、膀胱癌、食管癌、Barretts食管癌、成胶质细胞瘤、软组织透明细胞瘤、恶性间皮瘤、神经纤维瘤病、肾癌、黑素瘤、前列腺癌、良性前列腺增生(BPH)、男性乳房发育症和子宫内膜异位)的一种或多种治疗剂。

可通过与生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备治疗剂和诊断剂的制剂，其可处于例如冻干的粉末、浆体、水溶液、乳液或悬浮液的形式(见例如,Hardman等人,(2001)Goodman and Gilman's ThePharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,N.Y.；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,N.Y.；Avis,等人(编)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman,等人(编)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman,等人(编)(1990)Pharmaceutical DosageForms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.)。

治疗剂施用方案的选择取决于若干因素，包括实体的血清或组织周转率、症状水平、实体的免疫原性及靶细胞在生物基质中的可达性。在某些实施方案中，施用方案在符合可接受的副作用的水平上使递送给患者的治疗剂的量最大化。因此，递送的生物剂的量部分取决于具体实体和所治疗病症的严重性。选择合适剂量的抗体、细胞因子和小分子的指导是可得的(见例如,Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(编)(1991)Monoclonal Antibodies,Cytokines andArthritis,Marcel Dekker,New York,N.Y.；Bach(编)(1993)MonoclonalAntibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,N.Y.；Baert等人,(2003)New Engl.J.Med.348:601-608；Milgrom等人,(1999)New Engl.J.Med.341:1966-1973；Slamon等人,(2001)New Engl.J.Med.344:783-792；Beniaminovitz等人,(2000)New Engl.J.Med.342:613-619；Ghosh等人,(2003)New Engl.J.Med.348:24-32；Lipsky等人,(2000)New Engl.J.Med.343:1594-1602)。

由临床医生确定合适的剂量，例如，使用本领域公知或怀疑的影响治疗或预计影响治疗的参数或因素。剂量一般从略低于最佳剂量的量开始，随后小幅增加，直至达到相对于任何负面副作用的理想或最佳的效果。重要的诊断措施包括这些症状，例如炎症或产生的炎性细胞因子的水平的诊断措施。

可改变本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以获得活性成份的量，该量就具体患者、组合物和施用方式而言对达到所希望的治疗应答有效，而对患者无毒性。所选剂量水平将依赖于多种药物代谢动力学因素，包括本发明所利用的具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所利用的具体化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所利用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、待治疗患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康和过往病史，以及医学领域已知的类似因素。

可通过连续输注，或通过按例如1天、1周的间隔或每周1-7次给药来提供包含本发明的抗体或其片段的组合物。可通过静脉内、皮下、局部、口服、鼻、直肠、肌肉内、脑内或通过吸入来提供剂量。具体剂量方案是涉及避免显著不良副作用的最大剂量或剂量频率的剂量方案。每周总剂量可以是至少0.05μg/kg体重、至少0.2μg/kg、至少0.5μg/kg、至少1μg/kg、至少10μg/kg、至少100μg/kg、至少0.2mg/kg、至少1.0mg/kg、至少2.0mg/kg、至少10mg/kg、至少25mg/kg或至少50mg/kg(见例如,Yang等人,(2003)New Engl.J.Med.349:427-434；Herold等人,(2002)New Engl.J.Med.346:1692-1698；Liu等人,(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456；Portielji等人,(2003)Cancer Immunol.Immunother.52:133-144)。抗体或其片段的理想剂量与抗体或多肽的大致相同，在摩尔/kg体重的基础上。抗体或其片段的理想血浆浓度大约在摩尔/kg体重的基础上。剂量可以是至少15μg、至少20μg、至少25μg、至少30μg、至少35μg、至少40μg、至少45μg、至少50μg、至少55μg、至少60μg、至少65μg、至少70μg、至少75μg、至少80μg、至少85μg、至少90μg、至少95μg或至少100μg。对个体施用的剂量可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次、或更多。

对于本发明的抗体或其片段，对患者施用的剂量可以是0.0001mg/kg至100mg/kg患者体重。剂量可在0.0001mg/kg至20mg/kg、0.0001mg/kg至10mg/kg、0.0001mg/kg至5mg/kg、0.0001至2mg/kg、0.0001至1mg/kg、0.0001mg/kg至0.75mg/kg、0.0001mg/kg至0.5mg/kg、0.0001mg/kg至0.25mg/kg、0.0001至0.15mg/kg、0.0001至0.10mg/kg、0.001至0.5mg/kg、0.01至0.25mg/kg或0.01至0.10mg/kg患者体重之间。

可以用以千克(kg)计的患者体重乘以以mg/kg计的待施用剂量来计算本发明的抗体或其片段的剂量。本发明的抗体或其片段的剂量可以是150μg/kg或更低、125μg/kg或更低、100μg/kg或更低、95μg/kg或更低、90μg/kg或更低、85μg/kg或更低、80μg/kg或更低、75μg/kg或更低、70μg/kg或更低、65μg/kg或更低、60μg/kg或更低、55μg/kg或更低、50μg/kg或更低、45μg/kg或更低、40μg/kg或更低、35μg/kg或更低、30μg/kg或更低、25μg/kg或更低、20μg/kg或更低、15μg/kg或更低、10μg/kg或更低、5μg/kg或更低、2.5μg/kg或更低、2μg/kg或更低、1.5μg/kg或更低、1μg/kg或更低、0.5μg/kg或更低、或0.5μg/kg或更低患者体重。

本发明的抗体或其片段的单位剂量可以是0.1mg至20mg、0.1mg至15mg、0.1mg至12mg、0.1mg至10mg、0.1mg至8mg、0.1mg至7mg、0.1mg至5mg、0.1至2.5mg、0.25mg至20mg、0.25至15mg、0.25至12mg、0.25至10mg、0.25至8mg、0.25mg至7m g、0.25mg至5mg、0.5mg至2.5mg、1mg至20mg、1mg至15mg、1mg至12mg、1mg至10mg、1mg至8mg、1mg至7mg、1mg至5mg、或1mg至2.5mg。

本发明的抗体或其片段的剂量可在个体中达到至少0.1μg/ml、至少0.5μg/ml、至少1μg/ml、至少2μg/ml、至少5μg/ml、至少6μg/ml、至少10μg/ml、至少15μg/ml、至少20μg/ml、至少25μg/ml、至少50μg/ml、至少100μg/ml、至少125μg/ml、至少150μg/ml、至少175μg/ml、至少200μg/ml、至少225μg/ml、至少250μg/ml、至少275μg/ml、至少300μg/ml、至少325μg/ml、至少350μg/ml、至少375μg/ml、或至少400μg/ml的血清滴度。备选地，本发明的抗体或其片段的剂量可在个体中达到至少0.1μg/ml、至少0.5μg/ml、至少1μg/ml、至少2μg/ml、至少5μg/ml、至少6μg/ml、至少10μg/ml、至少15μg/ml、至少20μg/ml、至少25μg/ml、至少50μg/ml、至少100μg/ml、至少125μg/ml、至少150μg/ml、至少175μg/ml、至少200μg/ml、至少225μg/ml、至少250μg/ml、至少275μg/ml、至少300μg/ml、至少325μg/ml、至少350μg/ml、至少375μg/ml、或至少400μg/ml的血清滴度。

本发明的抗体或其片段的剂量可重复，并可间隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月施用。

对具体患者有效的量可取决于诸如所治疗的病症、患者的总体健康、施用的方法途径和剂量以及副作用的严重性的因素而变(见例如,Maynard等人,(1996)A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice,InterpharmPress,Boca Raton,Fla.；Dent(2001)Good Laboratory and Good ClinicalPractice,Urch Publ.,London,UK)。

施用途径可以是通过例如，局部或皮肤应用，通过静脉内、腹膜内、脑内、肌肉内、眼内、动脉内、脑脊髓内、病灶内注射或输注，或通过持续释放系统或植入物(见例如,Sidman等人,(1983)Biopolymers 22:547-556；Langer等人,(1981)J.Biomed.Mater.Res.15:167-277；Langer(1982)Chem.Tech.12:98-105；Epstein等人,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688-3692；Hwang等人,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030-4034；美国专利号6,350,466和6,316,024)。必要时，组合物可还包括增溶剂和局部麻醉剂(如利多卡因)来缓解注射部位的疼痛。此外，也可以利用肺施用，例如,通过使用吸入器或喷雾器，及具有烟雾化剂的制剂。见例如,美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078，及PCT公开号WO92/19244、WO97/32572、WO97/44013、WO98/31346和WO99/66903，其各自以其整体引入本文作为参考。

也可用本领域已知的多种方法中的一种或多种经由一种或多种施用途径来施用本发明的组合物。熟练技术人员将理解，施用的途径和/或模式将取决于所希望的结果而变。选择用于本发明的抗体或其片段的施用途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他胃肠外施用途径，例如通过注射或输注。胃肠外施用可代表除了肠和局部施用以外的施用模式，通常通过注射进行，并包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。备选地，本发明的组合物可经由非胃肠外途径，例如局部、表皮或黏膜施用途径施用，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部施用。在一个实施方案中，通过输注来施用本发明的抗体或其片段。在另一实施方案中，皮下施用本发明的多特异性表位结合蛋白。

如果在受控释放系统或持续释放系统中施用本发明的抗体或其片段，则可用泵来实现受控释放或持续释放(见Langer,上文；Sefton,(1987)CRCCrit.Ref Biomed.Eng.14:20；Buchwald等人,(1980),Surgery88:507；Saudek等人,(1989)N.Engl.J.Med.321:574)。可用聚合材料来达到本发明治疗的受控释放或持续释放(见例如,Medical Applications of ControlledRelease,Langer和Wise(编),CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen和Ball(编),Wiley,New York(1984)；Ranger和Peppas,(1983)J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；还见Levy等人,(1985)Science228:190；During等人,(1989)Ann.Neurol.25:351；Howard等人,(1989)J.Neurosurg.71:105)；美国专利号5,679,377；美国专利号5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；PCT公开号WO99/15154；和PCT公开号WO99/20253。在持续释放制剂中使用的聚合物的实例包括但不限于，聚甲基丙烯酸2-羟基乙酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸、乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚甲基丙烯酸、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)和聚原酸酯。在一个实施方案中，在持续释放制剂中使用的聚合物是惰性的、不含可沥滤的杂质、储存时稳定、无菌和可生物降解。受控释放系统或持续释放系统可置于预防性或治疗性靶标的附近，因此仅需要全身剂量的一部分(见例如,Goodson,in Medical Applications of Controlled Release,上文,第2卷,第115-138页(1984))。

在Langer,(1990),Science249:1527-1533的综述中讨论了受控释放系统。可用本领域技术人员已知的任意技术来产生包含本发明的一种或多种抗体或其片段的持续释放制剂。见，例如,美国专利号4,526,938；PCT公开WO 91/05548；PCT公开WO 96/20698；Ning等人,(1996),Radiotherapy&Oncology 39:179-189；Song等人,(1995)PDA Journal of PharmaceuticalScience&Technology50:372-397；Cleek等人,(1997)Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854；及Lam等人,(1997)Proc.Int'l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-760,其各自以其整体引入本文作为参考。

如果局部施用本发明的抗体或其片段，则可将它们配制为软膏剂、霜、透皮贴剂、乳液、凝胶、洗发液、喷雾、气雾剂、溶液、乳剂的形式，或本领域技术人员熟知的其他形式。见例如,Remington's PharmaceuticalSciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms,第19版,Mack Pub.Co.,Easton,Pa.(1995)。对不可喷雾的局部剂型，通常使用黏性至半固体或固体形式，该形式包含与局部施用相容的载体或一种或多种赋形剂，并在某些情况下具有大于水的动态黏度。合适的制剂包括但不限于，溶液、悬浮液、乳剂、霜、软膏剂、散剂、搽剂、药膏等等，如果希望，将该制剂灭菌或与助剂(例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲液或盐)混合以影响多种性能，例如渗透压。其他合适的局部剂型包括可喷雾的气雾剂，其中将活性成分(在某些情况下与固体或液体惰性载体组合)包装在具有加压的挥发物(例如,气体推进剂，例如氟利昂)的混合物中或塑料挤瓶中。如果希望，也可在药物组合物和剂型中加入保湿剂或湿润剂。此类附加成分的实例是本领域熟知的。

如果鼻内施用包含抗体或其片段的组合物，可将它配制为气雾剂形式、喷雾、薄雾或滴剂形式。尤其是，根据本发明使用的预防剂或治疗剂可方便地以加压包装或雾化器的样式的气雾喷雾形式递送，使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)。在加压气雾剂的情况下，可通过提供递送计量的量的阀门确定剂量单位。可配制用于吸入器或吹入器的胶囊和盒(例如由明胶组成)，该胶囊和盒含有化合物和合适的散剂基料如乳糖或淀粉的散剂混合物。

与第二治疗剂(例如，细胞因子、类固醇、化学治疗剂、抗生素或放射)共同施用或治疗的方法是本领域已知的(见例如,Hardman等人,(编)(2001)Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,第10版,McGraw-Hill,New York,N.Y.；Poole和Peterson(编)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,Pa.；Chabner和Longo(编)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,Pa.)。有效量的治疗剂可使症状减少至少10％、至少20％、至少约30％、至少40％或至少50％。

可与本发明的抗体或其片段组合施用的附加疗法(例如预防剂或治疗剂)可以与本发明的抗体或其片段相隔不到5分钟、相隔不到30分钟、相隔1小时、相隔约1小时、相隔约1至约2小时、相隔约2小时至约3小时、相隔约3小时至约4小时、相隔约4小时至约5小时、相隔约5小时至约6小时、相隔约6小时至约7小时、相隔约7小时至约8小时、相隔约8小时至约9小时、相隔约9小时至约10小时、相隔约10小时至约11小时、相隔约11小时至约12小时、相隔约12小时至18小时、相隔18小时至24小时、相隔24小时至36小时、相隔36小时至48小时、相隔48小时至52小时、相隔52小时至60小时、相隔60小时至72小时、相隔72小时至84小时、相隔84小时至96小时或相隔96小时至120小时施用。可在同一次患者就诊内施用2种或多种疗法。

可循环施用本发明的抗体或其片段和其他疗法。循环疗法涉及施用第一疗法(例如，第一预防剂或治疗剂)一段时间，接着施用第二疗法(例如，第二预防剂或治疗剂)一段时间，可选地，接着施用第三疗法(例如，预防剂或治疗剂)一段时间等等，并重复此相继施用，即循环以减少对疗法之一产生抗性，避免或减少疗法之一的副作用，和/或提高疗法的效力。

在某些实施方案中，可配制本发明的抗体或其片段以确保在体内的恰当分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高亲水性化合物。为了确保本发明的治疗性化合物跨过BBB(如果希望)，可将它们配制在例如脂质体中。有关制备脂质体的方法，见例如美国专利号4,522,811、5,374,548和5,399,331。脂质体可包含一个或多个选择性转运至特定细胞或器官的部分，从而增强靶向药物递送(见例如,Ranade,(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(见例如,Low等人的美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(Bloeman等人,(1995)FEBS Lett.357:140；Owais等人,(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等人,(1995)Am.J.Physiol.1233:134)；p 120(Schreier等人,(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；还见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273。

本发明提供对有需要的个体单独施用或与其他疗法组合施用包含本发明的抗体或其片段的药物组合物的方案。可对个体同时或顺次施用本发明的组合治疗的疗法(例如，预防剂或治疗剂)。也可循环施用本发明的组合治疗的疗法(例如，预防剂或治疗剂)。循环疗法涉及施用第一疗法(例如，第一预防剂或治疗剂)一段时间，接着施用第二疗法(例如，第二预防剂或治疗剂)一段时间，并重复此相继施用，即循环以减少对疗法之一(例如药物)产生抗性，避免或减少疗法之一(例如药物)的副作用，和/或提高疗法的效力。

可对个体同时施用本发明的组合疗法的疗法(例如，预防剂或治疗剂)。术语“同时”不限于在精确的同一时间施用疗法(例如，预防剂或治疗剂)，而是指按顺序和在时间间隔内对个体施用包含本发明的抗体或其片段的药物组合物，使得本发明的抗体可与其他疗法一起作用，以提供较之以其他方式施用它们提高的益处。例如，可在同一时间或在不同时点以任意顺序顺次对个体施用各疗法；然而，如果不在同一时间施用，它们应在足够接近的时间内施用，以提供希望的治疗效果或预防效果。可以以任意合适的形式和通过任意合适的途径对受试者分开施用各疗法。在多种实施方案中，以不到15分钟、不到30分钟、相隔不到1小时、相隔约1小时、相隔约1小时至约2小时、相隔约2小时至约3小时、相隔约3小时至约4小时、相隔约4小时至约5小时、相隔约5小时至约6小时、相隔约6小时至约7小时、相隔约7小时至约8小时、相隔约8小时至约9小时、相隔约9小时至约10小时、相隔约10小时至约11小时、相隔约11小时至约12小时、相隔24小时、相隔48小时、相隔72小时或相隔1周对个体施用疗法(例如，预防剂或治疗剂)。在其他实施方案中，在同一次患者就诊内施用两种或多种疗法(例如，预防剂或治疗剂)。

可在同一药物组合物中对个体施用组合疗法的预防剂或治疗剂。备选地，可在分开的药物组合物中对个体同时施用组合疗法的预防剂或治疗剂。可通过相同或不同的施用途径对个体施用预防剂或治疗剂。

现在已充分描述了本发明，通过以下实施例和权利要求进一步说明本发明，实施例和权利要求是说明性的，并非意在进一步限制。

实施例

实施例1:方法、材料和抗体筛选

(i)细胞系

SK-Br-3、BT-474和MCF-7细胞系购自ATCC，并在补充10％胎牛血清(FBS)的培养基中常规培养。

(ii)重组人、食蟹猴、小鼠和大鼠HER3载体的产生

从小鼠脑cDNA(Clontech)PCR扩增鼠HER3胞外结构域并通过与Refseq NM_010153比较验证序列。从Rat-2细胞mRNA逆转录大鼠HER3ECD并通过与NM_017218比较验证序列。用来自多种食蟹猴组织的RNA(Zyagen Laboratories)产生食蟹猴HER3cDNA模板,并将RT-PCR产物克隆进-TOPO-XL(Invitrogen)，然后进行双链测序。人HER3衍生自人胎儿脑cDNA文库(Source)并通过与NM_001982比较验证序列。

为了产生标记的重组蛋白质，用Pwo Taq聚合酶(RocheDiagnostics)PCR扩增人、小鼠、大鼠和食蟹猴HER3。扩增的PCR产物经凝胶纯化并克隆进pDonR201(Invitrogen)Gateway入门载体(entryvector)，该载体先前已修饰为包括符合读框的N-端CD33前导序列和C-端TAG，例如FLAG TAG。TAG允许通过抗TAG单克隆抗体纯化单体蛋白质。靶基因侧翼具有AttB1和AttB2，允许用克隆技术(Invitrogen)来重组进入适合Gateway的专有目的载体(例如,pcDNA3.1)。用Gateway LR反应与含有CMV启动子的专有目的载体进行重组反应，以产生TAG表达载体，尽管也可使用任意市售载体。

产生其他的重组HER3蛋白，其将HER3ECD融合在C-端因子X切割位点和人IgG铰链和Fc结构域的上游来产生Fc标记的蛋白质。为此，PCR扩增多种HER3ECD并将其克隆入载体(例如,pcDNA3.1)，该载体修饰为含有符合阅读框的C-端融合的因子X位点-铰链-hFc。产生的可读框侧翼具有AttB1和AttB2位点，用于进一步用重组克隆技术(Invitrogen)克隆。用LR Gateway反应来将HER3-Fc转移入含有CMV启动子的目的表达构建体。使用标准定点突变方案产生HER3点突变表达构建体并验证所得到的载体序列。

表2：HER3表达载体的产生。HER3氨基酸编号基于NP_001973(人)、NP_034283(小鼠)和NP_058914(大鼠)。

(iii)重组HER3蛋白的表达

在先前适应悬浮培养并在Novartis专有无血清培养基中生长的衍生自HEK293的细胞系中表达希望的HER3重组蛋白。在基于脂质转染的瞬时6孔板转染测定中进行小规模表达验证。通过瞬时转染进行大规模蛋白质产生，并在Wave^TM生物反应器系统(Wave Biotech)中以10-20L的规模进行。以1:3(w:w)的比例用DNA聚乙烯亚胺(Polysciences)作为质粒运载体。在转染后7-10天收获细胞培养物上清，并在纯化之前通过切向流过滤和渗滤浓缩。

(iv)标记蛋白质的纯化

通过收集细胞培养物上清并用10kDa截留滤器(Fresenius)通过切向流过滤浓缩10倍来纯化重组标记的HER3蛋白(例如,TAG-HER3)。通过按10mg抗体/mL树脂的最终比率将抗TAG单克隆抗体与CNBr活化的Sepharose4B偶联来制备抗TAG柱。按1-2mL/分钟的流速将浓缩的上清加至35ml抗Tag柱。在用PBS进行基线洗涤后,用100mM甘氨酸(pH2.7)洗脱结合的物质、中和并无菌过滤。通过测量在280nm处的吸光度并用0.66AU/mg的理论系数进行转化来测定蛋白质浓度。最后通过SDS-PAGE、N-端测序和LC-MS来表征纯化的蛋白质。

(v)Fc Tag纯化

按1ml/分钟的流速将浓缩的细胞培养物上清加至50ml蛋白质ASepharose Fast Flow柱。在用PBS进行基线洗涤后,用10倍柱体积的10mM NaH₂PO₄/30％(v/v)异丙醇pH7.3洗涤柱，接着用5倍柱体积的PBS洗涤。最后，用50mM柠檬酸盐/140mM NaCl(pH2.7)洗脱结合的物质、中和并无菌过滤。

(vi)HuCAL淘选

为了选择识别人HER3的抗体，利用了多种淘选策略。用市售噬菌体展示文库MorphoSys HuCAL文库作为抗体变体蛋白的来源，通过选择具有高结合亲和力的克隆来产生针对人HER3蛋白的治疗性抗体。噬菌粒文库基于的概念(Knappik等人,(2000)J Mol Biol296:57-86)，并利用技术来在噬菌体表面展示Fab(Lohning的WO01/05950)。

为了分离抗HER3抗体，用固相、溶液、全细胞和差异全细胞淘选方法进行标准淘选策略和RapMAT淘选策略。

(vii)固相淘选

为了鉴定抗HER3抗体，用不同的重组HER3蛋白来进行多种固相淘选策略。为了进行每一轮固相淘选，用HER3蛋白包被Maxisorp板(Nunc)。用先前用抗Fc(山羊或小鼠抗人IgG,Jackson Immuno Research)、抗Tag抗体包被的板或通过被动吸附来捕获标记的蛋白质。用PBS洗涤包被的板并封闭。用PBS洗涤包被的平板2次，然后加入HuCAL噬菌体-抗体，在摇床上室温孵育2小时。洗脱结合的噬菌体，加至大肠杆菌TG-1并孵育进行噬菌体感染。随后分离被感染的细菌并涂在琼脂板上。从板上刮下菌落，并拯救和扩增噬菌体。每种HER3淘选策略包含各轮淘选，并含有独特的抗原、抗原浓度和洗涤严格度。

(viii)溶液相淘选

用多种生物素化的重组HER3蛋白在存在或缺乏神经调节蛋白1-β1(R&D Systems)的情况下进行每一轮溶液相淘选。用EZ-连接磺基-NHS-LC生物素化试剂盒(Pierce)根据制造商的说明书生物素化蛋白质。用PBS洗涤800μl链霉抗生物素蛋白连接的磁珠(Dynabeads,Dynal)一次，并用Chemiblocker(Chemicon)封闭过夜。在反应管中孵育HuCAL噬菌体-抗体和合适的生物素化HER3。加入链霉抗生物素蛋白磁珠20分钟，并用磁性颗粒分离器(Dynal)收集磁珠。通过向每个管加入含DTT的缓冲液来从Dynabeads上洗脱结合的噬菌体，并加至大肠杆菌TG-1。用与在固相淘选中描述的方式相同的方式进行噬菌体感染。每种HER3淘选策略包含各轮淘选，并含有独特的抗原、抗原浓度和洗涤严格度。为了分离靶向特定表位的抗体，进行了竞争淘选。在这些淘选策略中，用参考抗体孵育和预封闭HER3，然后加入HuCAL噬菌体-抗体。作为备选策略，用参考抗体来特异性洗脱与HER3复合的噬菌体-抗体。

(ix)基于细胞的淘选

对于细胞淘选，将HuCAL噬菌体-抗体与大约10⁷细胞在旋转器上室温孵育2小时，接着离心。分离细胞沉淀，从细胞上洗脱噬菌体。收集上清并加至大肠杆菌TG-1培养物，接着进行上述过程。利用两种基于细胞的策略来鉴定抗HER3抗体：

a)全细胞淘选：在此策略中，用多种完整的细胞系作为抗原。

b)差异全细胞淘选：在此策略中，抗原相继由细胞和重组HER3蛋白组成。按上文所述进行基于细胞的淘选，而在用重组蛋白作为抗原时，利用固相淘选方案。用PBS(2-3X)和PBST(2-3X)进行洗涤。

(x)RapMAT^TM文库产生和淘选

为了提高抗体结合亲和力同时维持文库的多样性，使溶液和固相淘选的第二轮输出都进入RapMAT^TM过程，而全细胞和差异全细胞淘选策略的第三轮输出进入此过程(Prassler等人,(2009)Immunotherapy；1:571-583)。通过将经由淘选选择的噬菌体的Fab编码插入片段亚克隆入展示载体25_bla_LHC来产生RapMAT^TM文库，并通过用特异性限制酶进一步消化来产生H-CDR2RapMAT^TM文库或和L-CDR3RapMAT^TM文库。根据库组成用TRIM成熟盒(Virnekas等人,(1994)Nucleic Acids Research 22:5600-5607)将插入片段替换为H-CDR2或L-CDR3。文库大小预计在8x10⁶-1x10⁸个克隆的范围内。产生RapMAT抗体-噬菌体并用之前所述的实验方法再进行两轮溶液、固相或基于细胞的淘选。

特别发展了涉及文库设计的迭代细化的此广泛的淘选策略，以通过直接在淘选中包括配体封闭抗体来使筛选从纯配体竞争性抗体偏离。其次，修改了FAB至IgG的转变过程，以最大化候选克隆的回收，并确保所有选择性结合剂都在功能测定中得到分析。从44次初始淘选中，产生了大于x个克隆，只有具有希望的阻断配体依赖性和非依赖性信号转导二者的特性的三个抗体家族。结合Her3的分离的结构域1-2和2的家族A。结合分离的结构域3-4而不是仅结构域4的家族B及结合结构域3的家族C。

实施例2：抗HER3IgG的瞬时表达

在BioWave20中培养适应悬浮的HEK293-6E细胞。用相关的无菌DNA:PEI-MIX瞬时转染细胞并进一步培养。转染后，通过使用Fresenius滤器的切向流过滤来去除细胞。用截留滤器(Fresenius)通过切向流过滤浓缩不含细胞的材料，将浓缩物无菌滤过除菌杯式(stericup)滤器。将无菌上清储存在4℃。

实施例3：抗HER3IgG的纯化

在冷却柜中在100explorer Air色谱系统上进行IgG的纯化，使用具有25mL自填装MabSelect SuRe树脂的XK16/20柱(均为GEHealthcare)。除了上样外，所有流速均为3.5mL/分钟，压力限制为5bar。用3倍柱体积的PBS平衡柱，然后上样经过滤的发酵上清。用PBS洗涤柱。用从柠檬酸盐/NaCl(pH4.5)开始并线性下降至柠檬酸盐/NaCl(pH2.5)的pH梯度洗脱IgG，接着是相同的pH2.5缓冲液的恒定步骤。合并含有IgG的级分，立即中和，并无菌过滤(Millipore Steriflip,0.22um)。测量OD₂₈₀，并基于序列数据计算蛋白质浓度。分别测试合并物(pool)的聚集(SEC-MALS)和纯度(SDS-PAGE和MS)。

实施例4：HuCAL-Fab抗体在大肠杆菌中的表达和纯化

用补充了氯霉素的YT培养基在摇瓶培养物中进行X9_Fab_MH编码的Fab片段在TG-1细胞中的表达。摇动培养物直至OD600nm达到0.5。通过加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)来诱导表达。用溶菌酶破裂细胞。通过IMAC(Bio-Rad)分离His6-标记的Fab片段。用PD10柱将缓冲液更换为1x Dulbecco′s PBS(pH7.2)。无菌过滤样品。通过紫外分光光度法测定蛋白质浓度。在变性、还原的15％SDS-PAGE中分析样品纯度。通过使用校准标准的大小排阻层析(HP-SEC)来测定天然状态下的Fab制备物的同质性。

实施例5：通过溶液平衡滴定(SET)测量HER3抗体亲和力(K_D)

基本上按之前所述(Friguet等人,(1985)J Immunol Methods77:305-19)在溶液中进行亲和力测定。为了提高SET法的灵敏度和准确性，将其从经典的ELISA改变为基于ECL的技术(Haenel等人,(2005)Anal Biochem339:182-84)。

用之前所述的未标记的HER3-Tag(人、大鼠、小鼠或食蟹猴)通过SET进行亲和力测定。

用XLfit软件(ID Business Solutions)，应用自定义拟合模型评估数据。对于每种IgG的K_D测定，使用以下模型(根据Piehler等人(Piehler等人,(1997)J Immunol Methods 201:189-206修改)。

y = \frac{{2 B}_{\max}}{[IgG]} (\frac{[IgG]}{2} - \frac{{(\frac{x + [IgG] + K_{D}}{2} - \sqrt{\frac{{(x + [IgG] + K_{D})}^{2}}{4} - x [IgG]})}^{2}}{2 [IgG]})

[IgG]：应用的总IgG浓度

X：应用的总可溶性抗原浓度(结合部位)

B_max：没有抗原的IgG的最大信号

K_D：亲和力。

实施例6：通过FACS测定抗体细胞结合

通过FACS评估抗体与在人癌细胞上表达的内源人抗原的结合。为了测定抗体EC₅₀值，用accutase收获SK-Br-3细胞并在FACS缓冲液(PBS/3％FBS/0.2％NaN3)中稀释至1x10⁶细胞/mL。向96孔板(Nunc)的每个孔加入1x10⁵细胞/孔并以210g在4℃离心5分钟，然后去除上清。将测试抗体的系列稀释液(用FACS缓冲液在1：4的稀释步骤中稀释)加入沉淀的细胞，并在冰上孵育1小时。用100μL FACS缓冲液洗涤并沉淀细胞3次。将用FACS缓冲液1/200稀释的PE缀合的山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch)加入细胞，并在冰上孵育1小时。用100μLFACS缓冲液进行3次附加的洗涤步骤，接着进行离心步骤，在4℃以210g离心5分钟。最后，在200μL FACS缓冲液中重悬细胞，用FACSArray(BDBiosciences)测量荧光值。通过测量平均通道荧光来评估细胞表面结合的抗HER3抗体的量。

实施例7：HER3结构域和突变体结合

用200ng合适的重组人蛋白质(HER3-标签、D1-2-标签、D2-标签、D3-4-标签、D4-标签、HER3K267A-Tag、HER3L268A-Tag、HER3K267A/L268A和标记的无关对照蛋白质)过夜包被96孔Maxisorp板(Nunc)。然后用PBS/0.1％Tween-20洗涤所有孔，用PBS/1％BSA/0.1％Tween-20封闭，并用PBS/0.1％Tween-20洗涤。将抗HER3抗体加入相关孔至10μg/mL的终浓度，并在室温孵育。用PBS/0.1％Tween-20洗涤板，然后加入1/10000稀释在PBS/1％BSA/0.1％Tween-20中的合适的过氧化物酶连接的检测抗体。使用的检测抗体为山羊抗小鼠(Pierce,31432)、兔抗山羊(Pierce,31402)和山羊抗人(Pierce,31412)。板在室温孵育1小时，然后用PBS/0.1％Tween-20洗涤。将100μl TMB(3,3’,5,5’四甲基联苯胺)底物溶液(BioFx)加入所有孔，然后用50μl2.5％H₂SO₄终止反应。通过用SpectraMax酶标仪(Molecular Devices)测量OD₄₅₀来测定HER3抗体与每种重组蛋白质的结合程度。适当时，用Graphpad Prism分析剂量应答曲线。

实施例8：ELISA交叉竞争抗体

将抗体A按恒定量包被在Maxisorp板上，并测试与溶液中递增量的抗体B竞争结合HER3。用含24ng/孔抗体A的PBS包被Maxisorp板，在4℃过夜孵育，然后用PBST洗涤。用3％BSA/PBS室温封闭平板1小时。在1:3步骤中滴定抗体B，并摩尔过量地在溶液中与生物素化HER3-Tag室温孵育1小时。然后将HER3/抗体B复合物加至抗体A包被的平板30分钟，通过定量生物素化的HER3-Tag的量来检测结合复合物。然后用PBST洗涤封闭的平板，加入HER3/抗体B复合物，并在室温轻轻摇动孵育30分钟。然后用过量PBST洗涤平板，并用1:5000稀释在1％BSA/0.05％Tween20/PBS中的链霉抗生物素蛋白-AP孵育1小时。用PBST洗涤平板，加入AttoPhos溶液(1:5稀释在H₂O中)，在430nm激发后在535nm测量荧光信号。

如果抗体A未与抗体B竞争结合HER3，则检测到高水平的HER3。相反，对于竞争性抗体或具有部分重叠的表位的抗体，在与IgG对照相比时，HER3信号显著降低。

实施例9：磷酸-HER3体外细胞测定

在DMEM/F12、15mM HEPES、L-谷氨酰胺、10％FBS中常规维持MCF-7细胞，在DMEM、10％FBS中常规维持BT474细胞，在McCoy’s5a、10％FBS、1.5mM L-谷氨酰胺中常规维持SK-Br-3细胞。胰酶消化接近汇合的细胞，用PBS洗涤，并稀释至5x10⁵细胞/mL。然后向96孔平底板(Nunc)的每个孔加入100μL细胞悬液，产生5x10⁴细胞/孔的终密度。使MCF7细胞附着约3小时，然后将培养基更换为含有0.5％FBS的饥饿培养基。然后将所有板在37℃过夜孵育，之后用合适浓度的HER3抗体在37℃处理80分钟。最后20分钟用50ng/mL NRG1处理MCF7细胞来刺激HER3和AKT磷酸化，而BT474/SK-Br-3细胞无需附加的刺激。缓慢地吸去所有培养基，用含有1mM CaCl₂和0.5mM MgCl₂(Gibco)的冰冷PBS洗涤细胞。通过加入50μL冰冷的裂解缓冲液(20mM Tris(pH8.0)/137mM NaCl/10％甘油/2mM EDTA/1％NP-40/1mM正钒酸钠/1xPhospho-Stop/1x Complete mini蛋白酶抑制剂(Roche)/0.1mM PMSF)来裂解细胞，在冰上振荡孵育30分钟。然后收集裂解物，并在4℃以1800g离心15分钟来以去除细胞碎片。

用碳板(Mesoscale Discovery)制备HER3捕获板，该碳板用20μL在PBS中稀释的4μg/mL MAB3481捕获抗体(R&D Systems)在4℃包被过夜，随后用含3％牛血清白蛋白的1x Tris缓冲液(MesoscaleDiscovery)/0.1％Tween-20封闭。通过加入适量裂解物并在室温振荡孵育平板1小时来捕获HER3，然后吸去裂解物，用1x Tris缓冲液(MesoscaleDiscovery)/0.1％Tween-20洗涤孔。通过室温震荡孵育1小时，用在3％奶粉/1x Tris/0.1％Tween-20中制备的1:8000的抗pY1197抗体(Cell Signaling)检测磷酸化的HER3。用1x Tris/0.1％Tween-20洗涤孔4次，并通过与在3％封闭缓冲液中稀释的S-Tag标记的山羊抗-兔Ab(#R32AB)室温孵育1小时来检测磷酸化的蛋白质。吸去每个孔，用1x Tris/0.1％Tween-20洗涤4次，然后加入20μL含表面活性剂的阅读缓冲液T(Mesoscale Discovery)，用Mesoscale Sector Imager定量信号。

实施例10：磷酸-Akt(S473)体外细胞测定

用accutase(PAA Laboratories)收获在完全培养基中培养的接近汇合的MCF7、SK-Br-3和BT-474细胞，并在合适的培养基中以5x10⁵细胞/mL的终浓度重悬。然后向96孔平底板(Nunc)的每个孔加入100μL细胞悬液，以产生5x10⁴细胞/孔的最终密度。使MCF7细胞附着约3小时，然后将培养基更换为含有0.5％FBS的饥饿培养基。然后将所有板在37℃孵育过夜，之后用合适浓度的HER3抗体在37℃处理80分钟。最后20分钟用50ng/mL NRG1处理MCF7细胞来刺激HER3和AKT磷酸化，而SK-Br-3细胞无需附加的刺激。缓慢地吸去所有培养基，用含有1mM CaCl₂和0.5mM MgCl₂(Gibco)的冰冷PBS洗涤细胞。通过加入50μL冰冷的裂解缓冲液(20mM Tris(pH8.0)/137mM NaCl/10％甘油/2mM EDTA/1％NP-40/1mM正钒酸钠/抑肽酶(10μg/mL)/亮抑酶肽(10μg/mL))来裂解细胞，在冰上振荡孵育30分钟。然后收集裂解物，并在4℃以1800g离心15分钟来去除细胞碎片。将20μL裂解物加至先前已用3％BSA/1x Tris/0.1％Tween-20封闭的多点384孔磷酸-Akt碳板(Mesoscale Discovery)。将板在室温振荡孵育2小时，然后吸去裂解物，用1x Tris缓冲液(MesoscaleDiscovery)/0.1％Tween-20洗涤孔4次。通过在室温振荡孵育2小时，用在1％BSA/1x Tris/0.1％Tween-20中稀释50倍的20μL SULFO-TAG抗磷酸-Akt(S473)抗体(Mesoscale Discovery)检测磷酸化的Akt。用1xTris/0.1％Tween-20洗涤孔4次，然后加入20μL含表面活性剂的阅读缓冲液T(Mesoscale Discovery)，用Mesoscale Sector Imager定量信号。

实施例11：细胞系增殖测定

在补充10％胎牛血清的修饰的McCoy’s5A培养基中常规培养SK-Br-3细胞，并在补充10％FBS的DMEM中培养BT-474细胞。胰酶消化接近汇合的细胞，用PBS洗涤，用生长培养基稀释为5x10⁴细胞/mL，并以5000细胞/孔的密度接种入96孔透明底黑色板(Costar3904)中。细胞在37℃孵育过夜，然后加入合适浓度的HER3抗体(通常终浓度为10或1μg/mL)。将板放回培养箱，6天后用CellTiter-Glo(Promega)评估细胞活力。向每个孔加入100μL CellTiter-Glo溶液并在室温下温和振荡孵育10分钟。用SpectraMax酶标仪(Molecular Devices)测定发光量。通过将用每种HER3抗体获得的发光值与用标准同种型对照抗体获得的发光值相比较，计算用每种抗体获得的生长抑制的程度。

对于增殖测定，在含有4mM L-谷氨酰胺/15mM HEPES/10％FBS的DMEM/F12(1:1)中常规培养MCF-7细胞。胰酶消化接近汇合的细胞，用PBS洗涤，并用含有4mM L-谷氨酰胺/15mM HEPES/10μg/mL人转铁蛋白/0.2％BSA的DMEM/F12(1:1)稀释为1x10⁵细胞/mL。以5000细胞/孔的密度将细胞接种入96孔透明底黑色板(Costar)中。然后加入合适浓度的HER3抗体(通常终浓度为10或1μg/mL)。还向合适的孔加入10ng/mLNRG1-β1EGF结构域(R&D Systems)来刺激细胞生长。将板放回培养箱，6天后用CellTiter-Glo(Promega)评估细胞活力。通过减去背景(无神经调节蛋白)发光值并将用每种抗HER3抗体获得的值与用标准同种型对照抗体获得的值相比较来计算用每种抗体获得的生长抑制的程度。

实施例12：体内BxPC3效力研究

在含有10％热失活的胎牛血清而不含抗生素的RPMI-1640培养基中培养BxPC3细胞直到植入时。

对雌性无胸腺nu/nu Balb/C小鼠(Harlan Laboratories)皮下植入在50％磷酸缓冲盐溶液和50％基质胶的混合物中的10x10⁶细胞。含有悬浮细胞的总注射体积为200μL。一旦肿瘤达到约200mm³的大小，动物即进入效力研究。一般而言，每组共10只动物进入研究。如果动物在进入研究前显示不寻常的肿瘤生长特征，则将动物从研究中排除。

通过侧向尾静脉注射对动物静脉内给药。动物在研究期间采用20mg/kg、每周两次的方案。按照针对BT-474研究所详述计算肿瘤体积和T/C值。

实施例13：体内BT-474效力研究

在含有10％热失活的胎牛血清而不含抗生素的DMEM中培养BT-474细胞直到植入时。

在细胞接种前1天，对雌性无胸腺nu/nu Balb/C小鼠(HarlanLaboratories)皮下植入持续释放的17β-雌二醇颗粒(Innovative Research ofAmerica)以维持血清雌激素水平。在17β-雌二醇颗粒植入后1天，将悬液中的5x10⁶细胞原位注射进第四乳腺脂肪垫，该悬液含有在Hank平衡盐溶液中的50％无酚红基质胶(BD Biosciences)。含有悬浮细胞的总注射体积为200μL。细胞植入后20天，具有约200mm³的肿瘤体积的动物进入效力研究。一般而言，每组共10只动物进入效力研究。

对于单活性剂研究，通过侧向尾静脉注射用对照IgG或MOR13759对动物进行静脉内给药。动物在研究期间采用20mg/kg、每周两次的给药方案。在研究期间，每周两次通过直径测定来测量肿瘤体积。用以下公式计算百分比治疗/对照(T/C)值：

％T/C＝100×ΔT/ΔC ifΔT>0

其中：

T＝研究最后一天药物治疗组的平均肿瘤体积；

ΔT＝研究最后一天药物治疗组的平均肿瘤体积–给药首日药物治疗组的平均肿瘤体积；

C＝研究最后一天对照组的平均肿瘤体积；和

ΔC＝治疗最后一天对照组的平均肿瘤体积–给药首日对照组的平均肿瘤体积。

每周两次测量体重，根据体重调整剂量。用(BW_当前-BW_初始)/(BW_初始)x100计算体重的％变化。数据表示为从治疗首日开始的百分比体重变化。

将所有数据表示为平均值±平均值的标准差(SEM)。用Δ肿瘤体积和体重进行统计学分析。用单因素ANOVA和事后Tukey进行组间比较。对于所有统计学评价，将显著性水平设在p<0.05。报导了相比载体对照组的显著性。

结果和讨论

共同地，这些结果显示一类结合结构域2内的氨基酸残基的抗体。这些抗体的结合抑制配体依赖性和非配体依赖性信号发放。

(i)亲和力测定

通过上文所述的溶液平衡滴定(SET)来测定抗体亲和力。结果总结在表3中，并且MOR12616和MOR12925的实例滴定曲线包含在图1中。数据表面鉴定出许多紧密结合人HER3、食蟹猴HER3、大鼠HER3和鼠HER3的抗体。

表3：通过溶液平衡滴定(SET)测定的抗HER3IgG的K_D值。Hu(人)、Cy(食蟹猴)、Mu(鼠)和ra(大鼠)。

(ii)SK-Br-3细胞EC₅₀测定

通过计算所鉴定出的抗体结合HER2扩增细胞系SK-Br-3的EC₅₀值来测定它们结合HER3表达细胞的能力(见图2和表4)。

表4：抗HER3IgG在细胞上的FACS EC₅₀值。

(iii)HER3结构域结合

在ELISA测定中表征了抗HER3抗体子集结合人HER3的多种胞外结构域的能力。为此，将HER3的胞外结构域分为其4个组成型结构域，并按上文所述克隆这些结构域的多种组合，表达并纯化为独立的蛋白质。使用此策略，将以下结构域成功产生为可溶性蛋白质：结构域1和2(D1-2)、结构域2(D2)、结构域3和4(D3-4)及结构域4(D4)。之前已用一系列内部产生的抗体作为阳性对照确认了每种分离的结构域的完整性。

如图3中所示，观察到MOR12616和MOR12925均结合HER3胞外结构域、分离的D1-2蛋白质和分离的D2蛋白质。未观察到与D3-4或D4蛋白质结合。此结合数据表明，该抗体家族识别主要包含在结构域2内的表位。为了进一步确认该表位，我们测定了D2内突变残基对于抗体结合的影响。如结合ELISA(图4)和SET(表5)两者所确定的，Lysine²⁶⁸突变为丙氨酸严重破坏了抗体结合，由此确定结合表位包含在结构域2内。

表5：溶液平衡滴定(SET)测定的抗HER3IgG结合HER3突变形式的KD值。

v)表位竞争ELISA

为了进一步细化此类抗HER3抗体的表位，我们对抗体的子集和之前已表征了其表位的许多专有的抗HER3抗体进行了表位竞争研究。表位竞争实验由以下组成：将抗体A(例如MOR12925或MOR12616)固定在平板上，并测试其从溶液中捕获HER3/抗体B复合物的能力。如果抗体A不与抗体B竞争结合HER3，则从溶液中捕获HER3复合物。相反，如果抗体A具有与抗体B相同或重叠的表位，则不能捕获HER3复合物。使用此方法，还可以鉴定出别构竞争者。在这种情况下，抗体B与HER3的结合可以诱导掩蔽抗体A表位的构象变化。因此，抗体A和抗体B表现直接竞争，即使其HER3结合残基可以相距甚远。

MOR12925和MOR12616的实例表位竞争数据显示在图5中。如从数据可见，MOR12925和MOR12616都有效地交叉竞争与HER3结合，从而证明这些高度相关的抗体很可能结合相同的HER3表位。还用之前已将其表位定位于包含在结构域2和4内的残基的抗体(D2/4)观察到了交叉竞争。有趣地，用结合分离的HER3结构域4的抗体(D4)未观察到竞争。此数据表明，MOR12925和MOR12616都结合包含在结构域2内的表位，这与我们之前的结构域结合ELISA一致。由于已证明抗体D2/4与HER3的结构域2内的氨基酸残基265-277、315相互作用，可以推断，这些残基中的一些对MOR12925和MOR12616结合也可以很重要。

(vi)细胞信号发放的抑制

为了确定抗HER3抗体对配体依赖性HER3活性的影响，将MCF7细胞与IgG孵育，然后用神经调节蛋白进行刺激。实例抑制曲线在图6中显示，并总结在表6中。还用HER2扩增细胞系SK-Br-3和BT474研究了抗HER3抗体对HER2介导的HER3激活的影响(图7和表6)。

表6：抗HER3IgG在MCF7、BT474和SK-Br-3细胞中的pHER3IC₅₀和抑制程度值

为了确定HER3活性的抑制是否影响下游细胞信号发放，在用抗HER3抗体处理后还在NRG刺激的MCF7细胞和HER2扩增的SK-Br-3/BT474细胞中测量了Akt磷酸化(见图6、图7和表7)。

表7：抗HER3IgG在SK-Br-3、BT-474和MCF7细胞中的pAkt(S⁴⁷³)IC₅₀和抑制程度值。

总之，MOR12509、MOR12510、MOR12616、MOR12923、MOR12924、MOR12925、MOR13750、MOR13752、MOR13754、MOR13755、MOR13756、MOR13758、MOR13759、MOR13761、MOR13762、MOR13763、MOR13765、MOR13766、MOR13767、MOR13768、MOR13867、MOR13868、MOR13869、MOR13870、MOR13871、MOR14535和MOR14536各自都能够以配体依赖性和非配体依赖性方式抑制细胞HER3活性和下游信号发放。

(vii)增殖的抑制

由于MOR12509、MOR12510、MOR12616、MOR12923、MOR12924、MOR12925、MOR13750、MOR13752、MOR13754、MOR13755、MOR13756、MOR13758、MOR13759、MOR13761、MOR13762、MOR13763、MOR13765、MOR13766、MOR13767、MOR13768、MOR13867、MOR13868、MOR13869、MOR13870、MOR13871、MOR14535和MOR14536抑制HER3活性和下游信号发放，测试了其阻断配体依赖性和非依赖性体外细胞生长的能力(实例数据显示于图8，并总结在表8中)。所测试的抗HER3抗体是有效的细胞增殖抑制剂，从而确认了它们抑制配体依赖性和非依赖性HER3驱动的表型的能力。

表8：用抗HER3IgG处理SK-Br-3、BT-474和MCF7细胞后的增殖抑制

(viii)肿瘤生长的体内抑制

为了测定所述抗HER3抗体的体内活性，在BxPC3和BT-474肿瘤模型二者中测试了MOR13759。重复MOR13759处理产生对于BxPC3模型的29.1％消退(图9A)。MOR13759处理BT474模型产生45％肿瘤生长抑制(T/C)(图9B)。

引入参考文献

本文引用的所有参考文献(包括专利、专利申请、论文、教科书等等)及其中引用的参考文献(还没到列出的程度)在此以其整体引入作为参考。

等同物

我们认为上述说明书足以使本领域技术人员实施本发明。上述描述和实例详述了本发明的某些优选实施方案并描述了发明人设想的最佳模式。然而应当理解，无论上文描述得有多详尽，本发明可以多种方式实施，应根据随附的权利要求及其任意等同物来解释本发明。

Claims

1.识别HER3受体的表位的分离的抗体或其片段，其中表位包含HER3受体的结构域2内的氨基酸残基208-328，其中抗体或其片段至少识别结构域2中的氨基酸残基268，且其中抗体或其片段阻断配体依赖性和非配体依赖性信号转导二者。

2.权利要求1的分离的抗体或其片段，其中表位选自线性表位、非线性表位和构象表位。

3.权利要求1的分离的抗体或其片段，其中抗体或其片段结合HER3受体的非活性状态。

4.权利要求1的分离的抗体或其片段，其中结合配体结合位点的HER3配体不激活HER3信号转导。

5.权利要求1的分离的抗体或其片段，其中HER3配体可以同时结合HER3受体上的配体结合位点。

6.权利要求5的分离的抗体或其片段，其中HER3配体选自神经调节蛋白1(NRG)、神经调节蛋白2、β动物纤维素、肝素结合表皮生长因子和表皮调节素。

7.权利要求1的分离的抗体或其片段，其中至少氨基酸268(结构域2被)影响结构域2中的结合，由此阻断抗体或其片段的结合。

8.分离的抗体或其片段，该抗体或其片段具有选自以下的特征：脱稳定化HER3使得它易受降解、加速细胞表面HER3的下调、抑制与其他HER受体的二聚化，及产生易受蛋白酶解降解或不能与其他受体酪氨酸激酶二聚化的非天然HER3二聚体。

9.权利要求1的分离的抗体或其片段，其中抗体或其片段在缺乏HER3配体的情况下与HER3受体的结合减少了表达HER2和HER3的细胞中HER2-HER3蛋白复合物的非配体依赖性形成。

10.权利要求9的分离的抗体或其片段，其中HER3受体未能与HER2受体二聚化来形成HER2-HER3蛋白复合物。

11.权利要求10的分离的抗体或其片段，其中形成HER2-HER3蛋白复合物的失败阻止了信号转导的激活。

12.权利要求9的分离的抗体或其片段，其中通过HER3非配体依赖性磷酸化测定评估抗体或其片段抑制HER3的磷酸化。

13.权利要求12的分离的抗体或其片段，其中HER3非配体依赖性磷酸化测定使用HER2扩增的细胞，其中HER2扩增的细胞是SK-Br-3细胞和BT-474。

14.权利要求1的分离的抗体或其片段，其中抗体或其片段在HER3配体的存在下与HER3受体的结合减少了表达HER2和HER3的细胞中HER2-HER3蛋白复合物的配体依赖性形成。

15.权利要求12的分离的抗体或其片段，其中HER3受体未能在HER3配体的存在下与HER2受体二聚化形成HER2-HER3蛋白复合物。

16.权利要求13的分离的抗体或其片段，其中形成HER2-HER3蛋白复合物的失败阻止了信号转导的激活。

17.权利要求14的分离的抗体或其片段，其中通过HER3配体依赖性磷酸化测定评估抗体或其片段抑制HER3的磷酸化。

18.权利要求17的分离的抗体或其片段，其中HER3配体依赖性磷酸化测定在神经调节蛋白(NRG)的存在下使用经刺激的MCF7细胞。

19.权利要求1的分离的抗体或其片段，其中抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和合成抗体。

20.识别HER3受体表位的分离的抗体或其片段，所述表位在HER3受体的结构域2内，其中所述表位包含HER3受体的结构域2内的氨基酸残基208-328，其中所述抗体或其片段至少识别结构域2内的氨基酸残基268，其中所述抗体或其片段具有至少1x10⁷M^-1、10⁸M^-1、10⁹M^-1、10¹⁰M^-1、10¹¹M^-1、10¹²M^-1、10¹³M^-1的解离(K_D)，且其中所述抗体或其片段阻断配体依赖性和非配体依赖性信号转导二者。

21.权利要求20的分离的抗体或其片段，其中通过选自磷酸-HER3和磷酸-Akt的体外磷酸化测定测量抗体或其片段抑制HER3的磷酸化。

22.权利要求20的分离的抗体或其片段，其中抗体或其片段结合与表1中所述的抗体相同的表位。

23.权利要求20的分离的抗体或其片段，其中分离的抗体或其片段与表1中所述的抗体交叉竞争。

24.权利要求20的分离的抗体或其片段，其中抗体片段选自Fab、F(ab₂)’、F(ab)₂’、scFv、VHH、VH、VL、dAb。

25.包含抗体或其片段，以及可药用载体的药物组合物，其中抗体或其片段结合包含HER3受体的结构域2内的氨基酸残基208-328的HER3受体，其中该抗体或其片段至少识别结构域2内的氨基酸残基268，且其中该抗体或其片段阻断配体依赖性和非配体依赖性信号转导二者。

26.权利要求25的药物组合物，其进一步包含附加治疗剂。

27.权利要求26的药物组合物，其中附加治疗剂选自HER1抑制剂、HER2抑制剂、HER3抑制剂、HER4抑制剂、mTOR抑制剂和PI3激酶抑制剂。

28.权利要求27的药物组合物，其中附加治疗剂是选自马妥珠单抗(EMD72000)、/西妥昔单抗、/帕尼单抗、mAb 806、尼莫珠单抗、/吉非替尼、CI-1033(PD183805)、拉帕替尼(GW-572016)、/二甲苯磺酸拉帕替尼、/盐酸埃罗替尼(OSI-774)、PKI-166和的HER1抑制剂；选自帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、MM-111、来那替尼、拉帕替尼或二甲苯磺酸拉帕替尼/的HER2抑制剂；选自MM-121、MM-111、IB4C3、2DID12(U3PharmaAG)、AMG888(Amgen)、AV-203(Aveo)、MEHD7945A(Genentech)、MOR10703(Novartis)和抑制HER3的小分子的HER3抑制剂；和HER4抑制剂。

29.权利要求27的药物组合物，其中附加治疗剂是选自坦罗莫司/ridaforolimus/雷帕霉素、AP23573、MK8669、依维莫司/的mTOR抑制剂。

30.权利要求27的药物组合物，其中附加治疗剂是选自GDC0941、BEZ235、BKM120和BYL719的PI3激酶抑制剂。

31.治疗癌症的方法，其包括选择患有表达HER3的癌症的个体，对所述个体施用有效量的包含表1中公开的抗体或其片段的组合物，其中所述抗体或其片段识别HER3受体的包含HER3受体的结构域2内的氨基酸残基208-328的表位，其中所述抗体或其片段至少识别结构域2内的氨基酸残基268，且其中所述抗体或其片段阻断配体依赖性和非配体依赖性信号转导二者。

32.权利要求31的方法，其中个体是人，且癌症选自乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌、外周神经鞘瘤、神经鞘瘤、头颈癌、膀胱癌、食管癌、Barretts食管癌、成胶质细胞瘤、软组织透明细胞瘤、恶性间皮瘤、神经纤维瘤病、肾癌、黑素瘤、前列腺癌、良性前列腺增生(BPH)、男性乳房发育症和子宫内膜异位。

33.权利要求31的方法，其中癌症是乳腺癌。

34.权利要求1-30的抗体或其片段用于治疗由HER3配体依赖性信号转导途径或非配体依赖性信号转导途径介导的癌症的用途。

35.权利要求1-30的抗体或其片段，其用作药物。

36.在权利要求1-30的抗体或其片段在制备用于治疗由HER3配体依赖性信号转导途径或非配体依赖性信号转导途径介导的癌症的药物中的用途，该癌症选自乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌、外周神经鞘瘤、神经鞘瘤、头颈癌、膀胱癌、食管癌、Barretts食管癌、成胶质细胞瘤、软组织透明细胞瘤、恶性间皮瘤、神经纤维瘤病、肾癌、黑素瘤、前列腺癌、良性前列腺增生(BPH)、男性乳房发育症和子宫内膜异位。