MX2013001835A

MX2013001835A - Composiciones y metodos para inhibir la union de celulas madre y celulas progenitoras a tejido linfoide y para regenerar centros germinales en tejido linfaticos.

Info

Publication number: MX2013001835A
Application number: MX2013001835A
Authority: MX
Inventors: Theresa Deisher
Original assignee: Theresa Deisher
Priority date: 2010-08-18
Filing date: 2011-08-18
Publication date: 2013-02-26
Also published as: BR112013003169B1; CA2844109A1; DOP2013000043A; ZA201301800B; NZ607906A; RU2013110492A; JP2014501694A; PH12013500271A1; CN103167870B; CA2844109C; JP6437988B2; SG10201600621VA; KR101833204B1; CN103167870A; AU2011291651B2; ZA201402419B; BR112013003169A2; WO2012024519A4; US20120045435A1; US20170128493A1

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para inhibir la unión de células madre a órganos y tejidos, que incluye el bloqueo de la unión de células madre a centros germinales presentes en el tejido linfático. Se describen composiciones y métodos para regenerar los centros germinales en el tejido linfático. En las composiciones se incluyen adyuvantes, agonistas del receptor de CD40, CD28 y IL-21 y antagonista de CD20.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA INHIBIR LA UNIÓN DE CÉLULAS MADRE Y CÉLULAS PROGENITORAS A TEJIDO LINFOIDE Y PARA REGENERAR CENTROS GERMINALES EN TEJIDOS LINFÁTICOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La materia de la descripción se refiere a métodos y composiciones para modular la unión de células madre a órganos y tejidos y para regenerar centros germinales en tejidos linfáticos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La medicina regenerativa es el proceso de creación de tejidos vivos y funcionales para la reparación o reemplazo de tejidos u órganos perdidos debido a daño o a defectos congénitos. Este campo mantiene la promesa de regenerar tejidos y órganos dañados en el cuerpo mediante la estimulación de órganos previamente irreparables para que sanen por sí mismos.

Un método usado parar regenerar la función del órgano o tejido es la administración de células madre al órgano o tejido afectado. Sin embargo, las células madre no se retienen bien en el órgano objetivo de la regeneración de tejido, incluso cuando las células madre se inyectan directamente en el tejido del órgano lesionado. Los estudios de imagenología en seres humanos y animales han demostrado que la mayoría de las células madre pueden encontrarse dentro del bazo luego de una hora de la inyección de células madre. Los estudios con animales también hap demostrado que la remoción quirúrgica del bazo previa a la terapia con células madre, luego de infarto de miocardio inducido, mejoró la recuperación funcional de los corazones dañados (Blood, Vol 84, No 5 : 1482-1491 , 1994; NATURE 410 :701-705, 2001). También se ha demostrado que la esplenectomía mejora el prendimiento del injerto en pacientes humanos luego del trasplante de médula ósea (Stem Cells Dev 13(1 ):51 -62, 2004; Transplant Proc. 28(2):736-7, 1996; Am J Hematol. 22(3):275-83, 1986). Sin embargo, la esplenectomía también está asociada a la mortalidad quirúrgica, sepsis y complicaciones trombóticas de por vida (Blood Rev. 14(3): 121 -129, 2000; Leukemia.15(3):465-467, 2001 ; Pediatr Transplant 13(2):171-176, 2009) Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar métodos y composiciones que puedan usarse para prevenir la localización de células madre en el bazo y otros tejidos linfoides sin la remoción del bazo.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención satisface esta necesidad proporcionando métodos y composiciones para inhibir la unión de células madre a tejido linfoide, que comprende administrar células madre a un individuo en conjunción con un agente o agentes terapéuticos que inhiben la unión de células madre a tejido linfoide, en particular, a centros germinales en ganglios linfáticos y centros germinales en el bazo. El término 'en conjunción con' significa junto con, antes o después del tratamiento con células madre. 'Tratamiento con células madre' significa el acto de administrar células madre al individuo, movilizando células madre desde los almacenamientos de células madre endógenas del individuo o confiando en la liberación espontánea de células madre de los almacenamientos de células madre endógenas del individuo.

Por ejemplo, los pacientes tratados con células madre para obtener la regeneración de órganos han demostrado reducciones en la mortalidad y mejoras en la función siguiendo la terapia con células madre, aunque los tratamientos con células madre por lo general no le devuelven al paciente su estado funcional previo a la lesión del órgano. Las reducciones en la unión de células madre al bazo y otros linfáticos aumentan el número de células madre circulantes que pueden ser atraídas al órgano lesionado y, de esta manera, aumenta el grado de recuperación funcional inducida por el tratamiento con células madre de ese paciente.

Al administrar los agentes terapéuticos que inhiben la unión de células madre a tejidos linfáticos, es preferible administrar los agentes terapéuticos 1 - 14 días antes del tratamiento, más preferentemente 3 - 7 días y aún más preferentemente 3 - 4 días antes del tratamiento con células madre o movilización de células madre. Al administrar los agentes terapéuticos que inhiben la unión de células madre a tejidos linfáticos en conjunción con células madre liberadas espontáneamente desde los almacenamientos de células madre endógenas del individuo, es preferible administrar los agentes terapéuticos en un período de 1 -60 días, más preferentemente 1 -30 días y aún más preferentemente 1 -14 días.

Los agentes que inhiben la unión de células madre a tejidos linfoides, particularmente a los centros germinales de tejidos linfoides, incluyen radiación, agentes quimioterapéuticos, inmunosupresores y antagonistas de CD45 y antagonistas de CD26. Las células madre encontradas en las fracciones mononucleares de sangre completa o médula ósea, o células madre purificadas de sangre completa o médula ósea, se unen a las regiones de pulpa blanca del bazo, más específicamente a centros germinales en la pulpa blanca del tejido linfático, incluyendo el bazo y aún más específicamente a centros germinales activos en la pulpa blanca del bazo. Los anticuerpos de CD45, particularmente del epítopo identificado por el anticuerpo mqnoclonal anti-CD45 anti-ratón lgG2b de rata 30-F11 , reducen la unión de las células madre a los sitios identificados en el bazo, lo que hace que haya más células madre disponibles para la biodistribución al órgano diana lesionado y potenciando la regeneración de tejidos y la recuperación funcional.

En otra modalidad de la presente invención se administran agentes terapéuticos que reducen, destruyen o extirpan los centros germinales: activos en el tejido linfoide, lo que resulta en la reducción de la unión de células madre al tejido linfático. Otra modalidad de la presente invención describe métodos para reducir el número de centros germinales activos en el bazo para reducir la unión de células madre al bazo, aumentando, de esta manera, el número de células madre circulantes disponibles para la administración o alojamiento en órganos dañados que necesitan reparación. Los agentes que suprimen la respuesta inmunitaria pueden1 reducir el número de centros germinales activos en el bazo y otros tejidos linfáticos. Las categorías generales de los moduladores inmunitarios incluyen agentes que afectan a la síntesis de purinas, los anti-metabolitos, radiación, radiación en el bazo, inmunosupresores, glucocorticoides, agentes anti-beta amiloide, factor anti-rhesus, agentes anti-TNF, anti-eotaxinas, agentes anti receptor de células T (TCR), agentes anti-interferones, agentes anti-interferones alfa, agentes anti-interferones beta, agentes anti-interferones gamma, agentes anti-TGF, agentes anti-TGF alfa, agentes anti-TGF beta, agentes anti-lntegrinas, agentes anti-alfa 4, agentes anti-lnterleucina, agentes anti-lnterleucina 1 , agentes anti-lnterleucina 2, agentes anti-lnterleucina 4, agentes anti-lnterleucina 5, agentes anti-lnterleucina 6, agentes anti-lnterleucina 12, agentes anti-lnterleucina 13, agentes anti-lnterleucina 23, agentes anti-lgE, agentes anti-proteína de adhesión vascular (VAP), agentes anti-B7, agentes anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), agentes anti-BAFF (BLyS), agentes anti-CTLA4, agentes anti-complemento, agentes anti-CD2, agentes anti-CD3, agentes anti-CD4, agentes anti-CD5, agentes anti-CD20, agentes anti-CD23, agentes anti-CD25a, agentes anti-CD40, agentes anti-CD154 (CD40L), agentes anti-CD62L, agentes anti-CD80, agentes anti-CD147, agentes anti-LFA1 , agentes anti-(CD1 1 a), agentes anti-CD18, inhibidores de la síntesis de purina, inhibidores de la síntesis de pirimidina, agentes anti-proliferativos, agentes anti-metabolitos, agentes anti-folato y agentes anti-mTOR.

La deficiencia de la adenosina desaminasa también conducirá a la formación reducida de centros germinales activos, como lo harán los agentes que desencadenan la acumulación de desoxi ATP (J Immunol 171 : 5562-5570, 2003). De manera similar, los agentes que potencian la expresión de o activan a CCR7 conducirán a la formación disminuida de centros germinales activos.

Los agentes quimioterapéuticos también pueden usarse para inhibir la formación de los centros germinales del tejido linfoide o para destruir o extirpar los centros germinales. Ejemplos representativos incluyen agentes alquilantes, anti-metabolitos, alcaloides vegetales, inhibidores de la topoisomerasa, antineoplásicos y trióxido de arsénico.

Ejemplos de agentes alquilantes incluyen cisplatina y carboplatina, así como también oxaliplatina, son agentes alquilantes. Ellos perjudican la función celular formando enlaces covalentes con los grupos amino, carboxilo, sulfhidrilo y fosfato en moléculas biológicamente importantes.

Ejemplos de antimetabolitos azatioprina, mercaptopurina, capecitabina fluorouracilo— que se convierten en los componentes básicos del ADN. Ellos previenen que estas sustancias se incorporen en el ADN durante la fase "S" (del ciclo celular), y que detengan el desarrollo y división normales. Ellos también afectan la síntesis del ARN. Debido a su eficacia, estos fármacos son los fármacos más ampliamente usados como citoestáticos.

Los alcaloides incluyen los alcaloides de la vinca y los taxanos. Los alcaloides de la vinca incluyen vincristina, vinblastina, vinorelbina y vindesina. Los taxanos incluyen taxol, paclitaxel y docetaxel.

Las topoisomerasas son enzimas fundamentales que mantienen la topología del ADN. La inhibición de las topoisomerasas tipo I o tipo II interfiere con ambas, la transcripción y replicación de ADN, al alterar el ADN superenrollado apropiado.

Algunos inhibidores de las topoisomerasa tipo I incluyen camptotecinas: irinotecán y topotecán. Ejemplos de inhibidores de tipo II incluyen amsacrina, etopósido, etopósido fosfato y tenipósido.

Los agentes antineoplásicos incluyen dactinomicina, doxorubicina, epirubicina y bleomicina.

Definiciones Definiciones para describir las modalidades de la invención: El término "agonista", tal como se usa en la presente, se refiere a cualquier entidad que activa un receptor específico o vía de señalización posterior para mediar el/los efecto/s del receptor. Los agonistas pueden incluir, pero de modo no taxativo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, ligandos solubles, moléculas pequeñas, péptidos cíclicos, agentes de entrecruzamiento.

El término "antagonista", tal como se usa en la presente, se refiere a cualquier unidad que interfiere con la unión de una/s estructura/s o con la activación de un receptor específico o vía de señalización posterior esencial para mediar el/los efecto/s del receptor. Los agonistas pueden incluir, pero de modo no taxativo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, ligandos solubles, receptores de fusión Fe, receptores quiméricos, moléculas pequeñas, péptidos cíclicos, péptidos.

El término "inhibidor", tal como se usa en la presente, se refiere a cualquier entidad que disminuya el efecto diana de un ligando específico o su receptor. Los inhibidores pueden ser moléculas pequeñas, agentes antisentido, ácidos nucleicos incluyendo ARNip y micro ARN.

Tejido linfático, ganglios linfáticos, bazo y centros germinales El tejido linfático es una forma especializada de tejido conjuntivo reticular en el sistema linfático que contiene un gran número de linfocitos. Este tipo de tejido conforma el bazo, el timo y las amígdalas, así como los nodulos viscerales, las placas de Peyer y los lacteales que se encuentran todos asociados a las membranas mucosas del tracto gastrointestinal.

Un ganglio linfático es un órgano con forma de bola del sistema inmunitario, distribuido extensamente a lo largo del cuerpo, incluyendo la axila y el estómago/intestinos, y unido mediante vasos linfáticos. Los ganglios linfáticos son guarniciones de células B, células T y otras células inm unitarias. Los ganglios linfáticos se encuentran en todo el cuerpo, y actúan como filtros o trampas para partículas extrañas. El ganglio linfático está rodeado por una cápsula fibrosa, y dentro del ganglio linfático la cápsula fibrosa se extiende para formar trabéculas. La sustancia del ganglio linfático está dividida en la corteza exterior y la médula interior, rodeada por las anteriores, con excepción del hilio, donde la médula se pone en contacto directo con la superficie. La corteza exterior consiste principalmente en células B dispuestas como folículos, que pueden desarrollar un centro germinal cuando se estimulan con un antígeno, y la corteza más profunda consiste principalmente en células T. Hay una zona conocida como la zona subcortical donde las células T (o células que son principalmente de color rojo) interactúan principalmente con las células dendríticas, y donde la red reticular es densa.

El bazo es un órgano intraperitoneal ubicado en el lado izquierdo del abdomen entre el estómago y el diafragma. Este órgano es un sitio regulador fundamental del sistema inmunitario. Es un órgano vascular, que tiene un gran suministro de sangre arterial. Al ingresar al bazo, el flujo de sangre ingresa a una red de vasos sanguíneos dilatados, o "senos", que se encuentran entre grandes masas de linfocitos. Las paredes de los senos contienen fagocitos que son capaces de envolver las células muertas y las partículas extrañas en la sangre y retirarlas de la circulación general. Así como los ganglios linfáticos, el bazo es una importante fuente de anticuerpos, sin embargo, en mayor medida que los ganglios linfáticos, el bazo se encarga de la remoción de glóbulos rojos anormales o gastados normalmente ("moribundos") de la circulación mediante su destrucción.

El bazo contiene ambas, pulpa blanca y pulpa roja. La pulpa roja del bazo contiene macrófagos que normalmente filtran y retiran a los glóbulos rojos (RBC) senescentes o defectuosos y bacterias o glóbulos rojos recubiertos con anticuerpos de la circulación. La pulpa blanca del bazo contiene compartimientos linfoides y es esencial para la vigilancia y respuesta inmunitarias: sintetiza anticuerpos contra los patógenos invasores y libera plaquetas y neutrófilos en respuesta al sangrado o a una infección. Durante el desarrollo, se cree que el bazo tiene múltiples roles, incluyendo el de ser el primer sitio de hematopoyesis (a las seis semanas de gestación). Aunque por mucho tiempo se creyó que el bazo pierde su función hematopoyética durante las primeras etapas , del desarrollo, cuando la médula ósea se hace cargo de la hematopoyesis, investigaciones recientes han identificado al bazo adulto como un sitio de generación de células madre, diferenciación de células madre en diferentes linajes y almacenamiento de células madre (Trends Mol Med 17(6):271 -276, 2005; ). Sin embargo, no se conocen los sitios dentro del bazo donde se acumulan las células madre ni los mecanismos moleculares por los cuales las células madre exógenas se unen al bazo.

Las vainas linfoides periarteriales (VLPA) de la pulpa blanca del bazo están pobladas principalmente por células T, mientras que las porciones linfoides pobladas principalmente por células B. Los centros germinales (CG) son sitios dentro de los ganglios linfáticos o nodulos linfáticos en tejidos linfáticos periféricos, y en la pulpa blanca del bazo donde los linfocitos B maduros, intensos, también conocidos como centrocitos, proliferan, se diferencian, mutan rápidamente a través de hipermutación somática y cambio de clase durante las respuestas de anticuerpos. Los centros germinales son una parte importante de la respuesta ¡nmunitaria humoral de las células B. Se desarrollan dinámicamente luego de la activación de células B mediante el antígeno dependiente de T. Histológicamente, los CG describen partes microscópicamente distinguibles en tejidos linfoides. Las células B activadas migran desde el foco primario hacia el sistema folicular de folículos primario y comienzan la expansión monoclonal en el entorno de las células dendríticas foliculares (CDF).

Luego de varios días de expansión, las células B mutan su ADN codificante de anticuerpo y de esta forma generan una diversidad de clones en el centro germinal. Esto implica sustituciones, eliminaciones e inserciones aleatorias debido a la hipermutación somática. Tras algunos estímulos no identificados de las CDF, las células B en maduración (Centroblastos) migran desde la zona oscura a la zona clara y comienzan a exponer su anticuerpo a su superficie y en esta etapa se denominan Centrocitos. Los Centrocitos se encuentran en un estado de apoptosis activada y compiten por señales de supervivencia de las CDF que presentan el antígeno. Se cree que este proceso de rescate depende de la afinidad del anticuerpo al antígeno. Las células B funcionales, entonces, tienen que interactuar con las células T auxiliares para obtener señales de diferenciación finales. Esto también implica cambio de isotipos, por ejemplo, de IgM a IgG. Se cree que la interacción con células T previene la generación de anticuerpos autorreactivos. Las células B se convierten en, ya sea anticuerpos que dispersan células plasmáticas, o en una célula B de memoria, que se activará en contactos posteriores con el mismo antígeno. Estas también pueden reiniciar todo el proceso de proliferación, mutación y selección, de acuerdo con la hipótesis de reciclado.

Las células B contenidas dentro de la región de la pulpa blanca del bazo pueden dividirse adicionalmente en áreas específicas, identificadas mediante tinción con marcadores moleculares específicos. La zona marginal del bazo contiene células B maduras no circulantes que bordean la pulpa blanca, creando una separación entre la pulpa blanca y la pulpa roja y expresan niveles elevados de CD21 e IgM y CD24 y CD79a, y niveles medibles de CD9 y CD22. La zona del manto rodea los folículos de centro germinal normal y expresa CD21 , CD23 y CD38. La zona folicular sé encuentra contenida dentro de los centros germinales y expresa niveles elevados de IgD y CD23, niveles intermedios de CD21 y CD24, y también pueden identificarse mediante tinción con PNA. El centro germinal se distingue mejor mediante unión a PNA y expresa niveles más elevados de CD54 que la zona folicular. Los centros germinales tienen una población especial de células T auxiliares que parecen distribuirse uniformemente en todos los centros germinales. Los centros germinales están tradicipnalmente asociados a respuestas inmunitarias que requieren células T auxiliares, aunque esto no es absoluto. Los centros germinales se encuentran donde ocurre la mutación génica hipervariable y se generan células B que producen IgG de alta afinidad. Los centros germinales activos tienen macrófagos tangibles y CD21 que expresa células dendríticas. Los centros foliculares también pueden identificarse mediante la expresión de CD45R (B220) [Toxicologic Pathology, 35:366-375, 2007). Los centros foliculares de CD45R se encuentran rodeando los centros germinales que expresan Bcl6 y Bcl2. BioEssays 29: 166-177, 2007; Toxicol Pathol 34(5): 648-655, (2006)].

CD45 es un antígeno común de leucocitos también conocido como PTPRC (receptor tipo C de la proteína tirosina fosfatase), que se encuentra en todas células hematopoyéticas diferenciadas excepto en los eritrocitos y las células plasmáticas. También se expresa en los linfomas, leucemia Iinfocítica crónica, leucemia de células pilosas y leucemia no Iinfocítica aguda. Ha mostrado ser esencial en la señalización del receptor de antígeno de células B y T. La familia de CD45 consta de múltiples miembros que son todos productos de un solo gen complejo. Este gen contiene 34 exones y se empalman, de manera alternativa, tres exones de las transcripciones primarias para generar hasta ocho diferentes ARNm maduros y, luego de la traducción, ocho diferentes productos de proteína. Estos tres exones generan las isoformas RA, RB y RC.

Existen varias isoformas del antígeno CD45. Las isoformas del antígeno CD45 incluyen CD45RA, CD45RB, CD45RC, CD45RAB, CD45RAC, CD45RBC, CD45RO, CD45R (ABC). CD45R está ubicado en células T ingenuas y CD45RO está ubicado en células T de memoria. CD45 también está altamente glicosilado. CD45R es la proteína más larga y migra a 200 kDa cuando se aisla de las células T. Las células B también expresan CD45R con glicosilación más pesada, llevando el peso molecular a 220 kDa, de ahí el nombre B220; isoforma de célula B de 220 kDa. La expresión de B220 no se restringe a las células B y también puede expresarse en células T activadas, en un subconjunto de células dendríticas y otras células que presentan antígeno. Los linfocitos T ingenuos expresan isoformas de CD45 largas y frecuentemente son positivas para CD45RA. Los linfocitos T activados y de memoria expresan la isoforma de CD45 más corta, CD45RO, que carece de exones RA, RB y RC. Esta isoforma más corta facilita la activación de las células T. El dominio citoplásmico de CD45 es uno de los más largos conocidos y tiene una actividad fosfatasa intrínseca que retira un grupo fosfato inhibidor en una tirosina cinasa denominada Lck (en células T) o Lyn/Fyn/Lck (en células B) y la activa. El CD45 puede existir en ambas formas, monomérica y dimérica, y la dimerización puede regular por disminución la actividad fosfatasa de CD45 (Blood v103( 9):3440-3447, 2004).

Como CD45 está expresado en todas las células hematopoyéticas y es el antígeno hematopoyético más extensamente expresado de todos, fue usado para aislar la población de células que también contiene células madre hematopoyéticas en trasplantes y otros modelos de reconstitución con células madre; sin embargo, las células madre mesenquimales, a pesar de que derivan de una población de precursores anteriores de CD45+, por lo general se descubre que son negativas para CD45 (Stem Cells 28:140-151 , 2010). Se ha demostrado que una completa ausencia de todas las isoformas de CD45 en ratones influye en la retención, motilidad y alojamiento de las células madre en la médula ósea y que cumple un rol en la producción de células B funcionales en el bazo a partir de células madre anteriores (J. Exp. Med. 205:2381 -2395, 2008). Notablemente, los ratones con CD45 inactivado, que carecen de todas las isoformas de CD45, tienen una cantidad reducida ; de células progenitores hematopoyéticas cKit+Lin- en la médula ósea, pero aumentada dentro del bazo.

El 30-F1 1 es un lgG2b monoclonal de rata preparado a partir de timo y bazo de ratón. El clon 30-F1 1 reacciona ante ambos aloantígenos (CD45.1 y CD45.2) y todas las isoformas de CD45. El 30-F1 1 y el clon 30-F4 cada uno bloquea la unión del otro a CD45, lo que indica que se unen a los mismos epítopos o a epítopos que se superponen en CD45 (J Immunol 127(3):982-986, 1981). Asimismo, ambos clones se bloquean de forma cruzada con un anticuerpo descrito por Dennert et. ál., sin embargo, el anticuerpo anti-CD45, 55-6.1 , no se bloquea de forma cruzada con 30-F1 1 ni con 30-F4 (Cell Immunol 53:350-364, 1980).

El anticuerpo 30-F1 1 radiomarcado muestra la mayor acumulación en el bazo de ratón (60%), con solo 20% de acumulación en la médula (Blood 93(2):737-745, 1999), y se ha usado en ratones para administrar la radiación hematopoyéticá dirigida. El anticuerpo 30-F11 se ha usado para identificar, junto con el antígeno Sca1 , fracciones de células madre a partir del músculo de ratones, dado que CD45 se expresa en todas las células hematopoyéticas (PNAS 99 1341-1346, 2002). Se ha evaluado al 30-F1 1 radiomarcado y a los fragmentos f(ab)'2 de 30-F11 como un método para administrar radioterapia. La absorción de 30-F1 1 fue más dramática en los bazos de ratones, seguida por el ganglio linfático axilar (Cáncer Res 52(5): 1228-34, 1992).

El polipéptido de CD45 puede producirse mediante los procedimientos publicados. Se conocen en la técnica métodos para preparar anticuerpos monoclonales y policlonales anti-CD45 (véase, por ejemplo, Sambrook et ál., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); y Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Inc., Boca Ratón, Fia., 1982), los cuales se incorporan a la presente mediante esta referencia). Como será evidente para un experto en la técnica, los anticuerpos policlonales pueden generarse a partir de una variedad de animales de sangre caliente, tales como caballos, vacas, cabras, ovejas, perros, pollos, conejos, ratones y ratas. Se conoce la producción de anticuerpos humanizados. Véase · Riechmann L, Clark M, Waldmann H, Winter G (1988). "Reshaping human antibodies for therapy". Nature 332 (6162): 332:323. .Queen C, Schneider WP, Selick HE, Payne PW, Landolfi NF, Duncan JF, Avdalovic NM, Levitt M, Junghans RP, Waldmann TA. (Dec 1989). "A humanized antibody that binds to the ¡nterleukin 2 receptor". Proc Nati Acad Sci U S A. 86 (24): 10029-33. .Norderhaug L, Olafsen T, Michaelsen TE, Sandlie I. (May 1997). "Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells.". J Immunol Methods 204 (1): 77-87.

Métodos y agentes para prevenir la unión de células madre a tejido linfático Otras modalidades particulares proporcionan un método para moderar la unión de células madre a un bazo mediante la exposición del bazo a una solución de antagonistas del antígeno de cúmulo de diferenciación 45 (CD45). La solución del antagonista del antígeno CD45 puede configurarse o formularse para que se una al epítopo de 30-F11. La solución de antagonistas del antígeno CD45 puede formularse para que promueva la regeneración terapéutica, mejorando la administración de células madre a tejidos u órganos dañados. La solución que contiene el anticuerpo del antígeno CD45 puede formularse para que se una al epítopo de 30-F11 y a un equivalente humano del epítopo de 30-F1 1.

La presente invención describe métodos para reducir la unión de células madre al tejido linfático, tales como los ganglios linfáticos y el bazo, y usos de estos métodos para tratar pacientes humanos. La invención describe el sitio específico dentro del bazo donde las células madres circulantes se unen en el bazo, y métodos para aumentar o disminuir la unión de células madres a este sitio. Los análisis de inmunofluorescencia e histológicos de secciones gruesas del bazo demostraron que las células madre que circulan en la vasculatura se unen a centros germinales activos en el bazo, cuando se administran ya sea in vivo o ex vivo, como se muestra en los ejemplos 1 ,2,3 y 4. Un método para disminuir la cantidad de células madre que se unen al bazo es mediante la administración de agentes que bloquean la unión de las células madre administradas a la diana molecular en los centros germinales activos del bazo. De acuerdo con el proceso de la presente invención, el anticuerpo 30-F1 1 se une al antígeno CD45 de ratón y bloquea la unión de las células madre a lós centros germinales activos del bazo de ratón. Los anticuerpos anti-CD45 anti-humanos que pueden ser equivalentes al CD45 anti-ratón lgG2b de rata 30-F1 1 incluyen YAML568 que reconoce el epítopo P de CD45 humano (J Nucí ed 47:1335-1341 , 2006; In: Leucocyte Typing III: White Cell Differentiation Antigens pp811-814, 1987; Transplantation 40:538-544, 1985), clon anti-CD45 HI30 o anticuerpos anti-CD45 antihumanos YTH-24 e YTH-54.

Otra modalidad de la presente invención es el uso de antagonistas de CD26, tales como anticuerpos de CD26, para inhibir la unión de células madre a los centros germinales. Como CD26 se expresa mediante las células madre y es el antígeno presente en las células madre que se adhiere al tejido linfático, en particular, a los centros germinales en el tejido linfático. Al bloquear el CD26 en las células madre, las células madre no pueden unirse a los tejidos linfáticos.

Agentes que inhiben, regulan por disminución la formación de centros germinales o destruyen o extirpan los centros germinales Otra modalidad de la presente invención es inhibir la unión de células madre a tejidos linfáticos mediante la inhibición o regulación por disminución de la proliferación de centros germinales o destrucción o extirpación de los centros germinales. Los centros germinales (CG) se desarrollan dinámicamente luego de la activación de células B mediante el antígeno dependiente de T. El antígeno de células T que activa a las células B y de esta maneta induce la proliferación de centros germinales es CD40L (también conocido como CD154) que se une al receptor de CD40 presente en las células B. Esta unión de CD40L al receptor de CD40 no solo activa a las células B, sino que también induce la proliferación de los centros germinales. Por lo tanto, otra modalidad de la presente invención comprende administrarle a un individuo un agente que inhibe la unión de CD40L a CD40. Los, ejemplos de dichos agentes son los anticuerpos antagonísticos de CD40 o CD40L.

Otra proteína importante para el desarrollo de centros germinales es la 'proteína asociada a la molécula de activación de la señalización de los linfocitos' (SAP). (Hai Qui, et al., Nature, 455: 764-769 (2008). Por lo tanto, un anticuerpo contra SAP inhibiría la formación de centros germinales y, por lo tanto, inhibiría la unión de células madre a tejidos linfáticos.

El IL-21 es otro polipéptido importante para la diferenciación y proliferación de células B del centro germinal a través de un mecanismo intrínseco de las células B. La ausencia de la señalización de IL-21 afecta profundamente la respuesta de las células B al antígeno de proteína, reduciendo la formación de células plasmáticas esplénicas y de la médula ósea y la persistencia y función de los CG, lo que influye en su proliferación, transición a células B de memoria y maduración de la afinidad. [Zotos, D., ef ál. JEM 207: 365-378 (2010)]. Por lo tanto, al administrarle antagonistas tales como los anticuerpos de IL-21 a alguien, los centros germinales pueden regularse por disminución y se puede inhibir su formación. Esto inhibiría la unión de células madre al tejido linfático y al bazo debido a la ausencia de centros germinales en el tejido linfático.

Los agentes quimioterapéuticos pueden inhibir la unión de células madre a los centros germinales de los tejidos linfoides, incluyendo ganglios linfáticos, placas de Peyer y la pulpa blanca del bazo. Además, los agentes que suprimen la respuesta inmunitaria pueden reducir el número de centros germinales activos en el bazo. Dichos agentes incluyen: Azatioprina, (IMURAN®, Prometheus Laboratories, San Diego, CA) administrado en 3 - 5mg/kg, diariamente, preferentemente 3 - 4 días antes de la administración de las células madre. La azatioprina interfiere con la síntesis de las purinas (adenina y guanina), la cual es necesaria para la síntesis del ADN. Las células de rápido crecimiento, incluyendo las células T y las células B se ven particularmente afectadas por la inhibición de la síntesis de purina.

Corticosteroides, tales como dexametasona, prednisolona, metilprednisolona, fosfato sódico de dexametasona y betametasona. Los comprimidos de dexametasona (Merck) y las inyecciones de fosfato sódico de dexametasona pueden administrarse 1 - 14 días antes del tratamiento con células madre, más preferentemente 3 - 7 días y aun más preferentemente 3 - 4 días antes del tratamiento con células madre. La cantidad total de dexametasona administrada es una cantidad suficiente para regular por disminución los centros germinales en el tejido linfático, de manera que las células madre no puedan unirse al tejido linfático. La cantidad total de dexametasona durante el período de tiempo puede variar de 2mg a 3g, preferentemente 27mg en total. La dosis diaria de dexametasona puede variar de 0.75mg a 700rhg por día, preferentemente 7mg por día. La dexametasona, como los otros esteroides glucocorticoides, inhibe la formación y proliferación de centros germinalesien el tejido linfático. Ácido micofenólico (cápsulas de liberación retardada yfortic®, Novartis Pharmaceuticals Corporation East Hanover, Nueva Jersey, 720 mg administrado dos veces al día (dosis diaria total 1440 mg) con estómago vacío, una hora antes o dos horas después de la ingesta de alimentos), preferentemente 3-4 días antes de la administración de células madre. (CelICept® Roche Labs, Nutley, NJ, micofenolato de mofetilo) Comprimidos y cápsula, suspensión oral, clorhidrato de micofenolato de mofetilo) para inyección intravenosa, el éster 2-morfolinoetil del ácido micofenólico (MPA), administrado IV 1g dos veces al día oralmente 1.5g administrado dos veces al día, preferentemente 3-4 días antes de la administración de células madre. Inhibe la inosina monofosfato deshidrogenasa, la enzima que controla la velocidad de síntesis de guanina monofosfato en la vía de novo de la síntesis de purina usada en la proliferación de linfocitos B y T. El micofenolato es potente y puede usarse en lugar de la azatioprina anti-proliferativa más antigua. Se usa frecuentemente como parte de un régimen de inmunosupresores de tres compuestos, que también incluye un inhibidor de calcineurina (ciclosporina o tacrolimus) y prednisolona.

Leflunomida, Sanofi-Aventis U.S. LLC, Bridgewater, NJ 100 mg por día durante tres días, 3-4 días antes de la administración de las células madre. La leflunomida es un inhibidor de la síntesis de pirimidina que pertenece a la clase de fármacos FARME (fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad), lo cuales con muy heterogéneos, química y farmacológicamente. La leflunomida es un fármaco inmunomodulador que inhibe la dihidroorotato deshidrogenasa (una enzima que participa en la síntesis de novo de pirimidina) (abreviatura DHODH).

Teriflunomida, el metabolito activo de leflunomida, Sanofi-Aventis U.S. LLC, Bridgewater, NJ 100 mg por día durante tres días, preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Metotrexato - es un fármaco antimetabolito y antifolato. Actúa mediante la inhibición del metabolismo del ácido fólico. Se administra oralmente o intramuscularmente en dosis de 15 a 30 mg diarios durante hasta cinco días, preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. Mylan Pharmaceuticals, Morgantown, Virginia Occidental.

Macrólidos inmunosupresores: Tacrolimus reduce la producción de interleucina-2 (IL-2) mediante las células T. en forma de cápsula o inyección, 0.10-0.15 mg/kg/día, preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. (Astellas Pharma US, Inc. Deerfield, IL).

Ciclosporina - Ciclosporín se cree que se une a la proteína citosólica ciclofilina (inmunofilina) de linfocitos inmunocompetentes, especialmente linfocitos T. Comercializada como Sandimmune®, en forma de cápsulas, solución oral o inyección, y dosis de 14 - 18 mg/kg/día, preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. (Novartis Pharmaceuticals Corporation, East Hanover, Nueva Jersey).

Pimecrolimus (Elidel) es un derivado de la macrolactama ascomicínica. Se ha demostrado in vitro que el pimecrolimus se une a la macrofilina-12 e inhibe a la calcineurina. Por lo tanto, el pimecrolimus inhibe la activación de las células T mediante la inhibición de la síntesis y la liberación de citocinas de las células T. El pimecrolimus también previene la liberación de citocinas y mediadores inflamatorios de los mastocitos. El pimecrolimus se usa como una crema tópica 1% durante hasta 6 semanas, preferentemente antes de la terapia con células madre.

Gusperimus es un derivado de la espergualina, un antibiótico antitumoral, e inhibe la maduración estimulada por interleucina-2 de las células T en las fases S y G2/M y la polarización de las células T en células T efectoras Th1 secretoras de IFN-gamma, que resulta en la inhibición de crecimiento de células T CD4 ingenuas activadas. Se administra SC, 0.5mg/kg/día durante 21 días consecutivos, preferentemente completado 3-4 días antes de la administración de las células madre. Nippon Kayaku Co.,Ltd.

Everolimus (RAD-001), administrado oralmente en una dosis de 10mg/día, preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.; Novartis, East Hanover, NJ, con los nombres comerciales Zortress (EUA).

Talidomida Talidomida puede reducir los niveles de TNFa, (THALOMID®, Celgene Corporation, Summit, NJ). La dosificación aceptable es 100 - 300 mg/día, preferentemente a la hora de acostarse, 1 hora luego de la cena, preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Lenalidomida es un derivado de talidomida 50,000 veces más potente que talidomida en la inhibición del factor de necrosis tumoral alfa, y tiene reacciones adversas al fármaco menos graves. Celgene Corporation, Summit, NJ) 25 mg una vez al día oralmente en los Días 1 -21 , preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Anakinra es una versión no glicosilada, recombinante de IL-1 RA humano (RA por antagonista del receptor) Kineret® Biovitrum, Estocolmo, Suiza, administrado como concentrado de inyección que contiene 100 mg cada dosis unitaria, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Infliximab (nombre comercial REMICADE®) es un anticuerpo monoclonal contra el factor de necrosis tumoral alfa (TNFa). Centocor Ortho Biotech, Horsham, PA administrado mediante infusión intravenosa en una dosis de desde 3 mg/kg hasta 10 mg/kg, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Golimumab (CNTO 148) es un anticuerpo monoclonal humano y se comercializa con el nombre comercial Simponi. Golimumab se dirige a TNF-alfa. Centocor Ortho Biotech, Horsham, PA administrado mediante inyección subcutánea de 50 mgs en 0.5 mis, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Adalimumab (HUMIRA, Abbott Laboratories, North Chicago, IL) es un inhibidor de TNF, adalimumab se une al TNFa, evitando que se activen los receptores de TNF; adalimumab se construyó a partir de un anticuerpo monoclonal totalmente humano, comercializado en ambas formas, en jeringas precargadas con 0.8 mL y también en dispositivos de lápiz precargados con 40mg de adalimumab. Para regular por disminución los centros germinales antes de la administración de las células madre de al menos 40mg de adalimumab deberán administrarse dentro de 7-14 días y preferentemente 3-7 días antes de la administración de las células madre. Preferentemente, dos dosis de 40mg de adalimumab deberán administrarse dentro de 7-14 días y preferentemente 3-7 días antes de la administración de las células madre.

Certolizumab pegol es un anticuerpo monoclonal dirigido contra el factor de necrosis tumoral alfa. Más precisamente, es un fragmento Fab' PEGilado de un anticuerpo monoclonal humanizado inhibidor del TNF. Se administra como dos inyecciones subcutáneas de 200 mg, inyecciones, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. (UCB Inc., Atlanta, Georgia).

Temsirolimus (Pfizer Corp.) es un inhibidor específico de mTOR (blanco de la rapamicina en mamíferos) e interfiere con la síntesis de proteínas que regulan la proliferación, crecimiento y supervivencia de las células tumorales. La dosis recomendada de temsirolimus son 25 mg inyectados IV durante 30-60 minutos, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Zotarolimus es un derivado semi-sintético de la rapamicina, Abbot Laboratories, North Chicago, IL) Biolimus A9 Biosensors International, Singapur.

Eculizumab (nombre comercial Soliris) es un anticuerpo monoclonal dirigido contra la proteína de complemento C5. Este anticuerpo bloquea la escisión de C5 y detiene el proceso de destrucción celular mediado por el complemento. Soliris se administra como una infusión IV administrada en dosis de 600-mg o 900-mg, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. (Alexion PharmaceuticalsCheshire, CT) Mepolizumab (nombre comercial propuesto Bosatria) es un anticuerpo monoclonal humanizado que reconoce a la interleucina-5 (IL-5) administrado como una infusión de 750 mg, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. GlaxoSmithKIine, King of Prussia, PA.

Omalizumab (nombre comercial Xolair, Genentech/Novartis) es un anticuerpo humanizado. Omalizumab es un anticuerpo monoclonal IgGl k humanizado derivado de ADN recombinante que se une selectivamente a la inmunoglobulina E (IgE) humana. Xolair (Omalizumab) 150 a 375 mg se administran SC, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Nerelimomab (BAYX) es un anticuerpo anti-TNF de ratón y puede administrarse a 10mg/kg, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Faralimomab es un anticuerpo anti-TNF de ratón y puede administrarse a 0mg/kg, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Elsilimomab (también conocido como B-E8) es un anticuerpo monoclonal de ratón y un fármaco inmunosupresor. De acuerdo con la presente invención, puede administrarse en una dosis de 10mg/kg dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Lebrikizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado que está diseñado para que se una específicamente a IL-13 y puede administrarse a 10mg/kg dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. Genentech, South San Francisco, California.

Ustekinumab (nombre experimental CNTO 1275, denominación comercial Stelara, Centocor) es un anticuerpo monoclonal humano. Se dirige contra la interleucina 12 e interleucina 23, proteínas de origen natural que regulan el sistema inmunitario y las enfermedades inflamatorias mediadas por mecanismos inmunes. 2 inyecciones, con separación de un mes, de ya sea 90 o 45 miligramos, o una sola inyección de 45 mg, completado dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Muromonab-CD3 (nombre comercial Orthoclone OKT3, comercializado por Janssen-Cilag) es un anticuerpo monoclonal dirigido al receptor de CD3, una proteína de membrana en la superficie de las células T. Se administran 5mg/día en un solo bolo, inyección intravenosa durante 10 a 14 días. La administración deberá completarse dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. Los niños que pesen menos de 30 Ib deberán recibir 2.5 mg/día (Ortho Biotech, Raritan, NJ).

Otelixizumab es un anticuerpo monoclonal que se dirige a la cadena epsilon de CD3. Se administran 5mg/día en una sola inyección intravenosa de bolo durante 10 a 14 días. La administración deberá completarse dentro de 7-14 días y 3-4 días antes de la administración de las células madre. Los niños que pesen menos de 30 Ib deberán recibir 2.5 mg/día. El anticuerpo está en desarrollo por Tolerx, Inc. en colaboración con GlaxoSmithKIine y lo fabrica Abbott Laboratories.

Teplizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado con Fe modificada genéticamente, también conocido como MGA031 y hOKT3y1 (Ala-Ala). Es un anticuerpo anti-CD3. Puede administrarse de acuerdo con la presente invención en una dosis de 5mg/día en una sola inyección intravenosa de bolo durante 10 a 14 días. La administración deberá completarse dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. Los niños que pesen menos de 30 Ib deberán recibir 2.5 mg/día (Eli Lilly, Indianápolis, IN.

Visilizumab (nombre comercial tentativo Nuvion, PDL BioPharma Inc.) es un anticuerpo monoclonal humanizado que se dirige a CD3 en células T activadas. Puede administrarse de acuerdo con la presente invención en una dosis de 5mg/día en una sola inyección intravenosa de bolo durante 10 a 14 días. La administración deberá completarse dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. Los niños que pesen menos de 30 Ib deberán recibir 2.5 mg/día.

Clenoliximab es un anticuerpo monoclonal contra CD4. Puede administrarse de acuerdo con la presente invención en una dosis de 5mg/día en una sola inyección intravenosa de bolo durante 10 a 14 días. La administración deberá completarse dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Keliximab es un anticuerpo monoclonal que se une a los leucocitos a través de la proteína CD4. Se administra en una dosis de 3mg/kg, infusión, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Zanolimumab (nombre comercial esperado HuMax-CD4) es un anticuerpo monoclonal humano que se dirige a CD4 y se administra en una dosis de 20mg/kg/día, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. (Genmab, A/S COPENHAGEN/TenX Biopharma, Inc., Filadelfia, PA).

Efalizumab (nombre comercial Raptiva, Genentech, Merck Serano) es un anticuerpo monoclonal humanizado recombinante. Efalizumab se une a la subunidad CD11a del antígeno 1 asociado a la función del linfocito. De acuerdo con la presente invención, puede administrarse una vez a la semana mediante inyección subcutánea en una dosis de 20mg/kg, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Erlizumab, también conocido como rhuMAb, es un anticuerpo monoclonal humanizado recombinante desarrollado por Genentech en sociedad con Roche. De acuerdo con la presente invención, puede administrarse una vez a la semana mediante inyección subcutánea en una dosis de 20mg/kg, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. El fármaco funciona bloqueando un factor de crecimiento en los vasos sanguíneos. Específicamente, erlizumab se dirige a CD18 y a una integrina LFA-1.

Afutuzumab es un anticuerpo monoclonal anti-CD20. De acuerdo con la presente invención, puede administrarse una vez a la semana mediante inyección subcutánea en una dosis de 20mg/kg, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. (Hoffmann-La Roche Inc.) Ocrelizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado anti-CD20. Se dirige a linfocitos B maduros. Se encuentra en desarrollo por Hoffmann- filial de La Roche, Genentech, y Biogen Idee. De acuerdo con la presente invención, se administra en una dosis de 200 mg & 600 mg dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Pascolizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado anti-IL-4. De acuerdo con la presente invención, puede administrarse una vez a la semana mediante inyección subcutánea en una dosis de 20mg/kg, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Lumiliximab es un anticuerpo monoclonal que se dirige a CD23. De acuerdo con la presente invención, se puede administrar en dosis de 50 mg/m2, a 450 mg/m2, a 500 mg/m2 dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. El fármaco es un anticuerpo quimérico de Macaca ¡rus y Homo sapiens. (Biogen IDEC) Teneliximab es un anticuerpo monoclonal quimérico que se une a la proteína inmunoestimulante CD40. De acuerdo con la presente invención, puede administrarse una vez a la semana mediante inyección subcutánea en una dosis de 20mg/kg, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Toralizumab (IDEC 131) es un anticuerpo monoclonal humanizado. De acuerdo con la presente invención, puede administrarse una vez a la semana mediante inyección subcutánea en una dosis de 20mg/kg, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. (IDEC Pharmaceuticals Corporation) Aselizumab es un anti-CD62L administrado mediante infusión I.V. en dosis que varían de 0.5-mg/kg, 1.0-mg/kg, y 2.0-mg/kg dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Galiximab es un anticuerpo monoclonal anti-CD80 (Biogen Idee) administrado en una dosis de 500mg/m2 IV dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. Es un anticuerpo quimérico de Macaca irus y Homo sapiens.

Gavilimomab es un anticuerpo monoclonal de ratón (también conocido como ABX-CBL, desarrollado por Abgenix. Se une al antígeno CD147. De acuerdo con la presente invención, puede administrarse mediante infusión I.V. en una dosis de 20mg/kg, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

BG9588, un anti-CD40L humanizado administrado a 20 mg/kg dentro de 7-14 días y 3-4 días antes de la administración de las células madre. La administración de anticuerpos de CD154, también llamados ligando CD40 o CD40L, es una proteína que se expresa principalmente en células T activadas y es miembro de la superfamilia de moléculas del TNF. Se une a CD40 en las células presentadoras de antígenos (CPA), lo que conduce a muchos efectos dependiendo del tipo de célula diana. En general, CD40L cumple el rol de una molécula coestimulatoria e induce la activación en las CPA en asociación con la estimulación del receptor de células T mediante las moléculas del CMH en las CPA. En total, CD40L tiene tres compañeros de unión: CD40, integrina a5ß1 y a???ß3.

(Hu5c8) 5c8, un anticuerpo monoclonal que se une a CD154 (ligando CD40), que bloquea de esta manera la interacción entre CD40 y CD154, administrado a 20 mg/kg dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Belimumab (nombre registrado Benlysta anteriormente conocido como LymphoStat-B), es un anticuerpo monoclonal completamente humano que específicamente reconoce e inhibe la actividad biológica del estimulador de linfocitos B (BLyS), también conocido como factor de activación de las células B de la familia del TNF (BAFF) Human Genome Sciences. De acuerdo con la presente invención, puede administrarse en una dosis de 10mg/kg dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Ipilimumab (también conocido como MDX-010 o MDX-101) es un anticuerpo monoclonal humano anti-CTLA-4 (células T citotóxicas asociadas a linfocitos) en desarrollo por Bristol-Myers Squibb. De acuerdo con la presente invención, se administran 10mg/kg del fármaco activo dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Tremelimumab (anteriormente ticilimumab, CP-675,206) es un anticuerpo monoclonal lgG2 completamente humano producido por Pfizer. Se une a la proteína CTLA-4, que se expresa en la superficie de los linfocitos T activados. Tremelimumab bloquea la unión de los ligandos B7.1 y B7.2 de las células presentadoras de antígenos a CTLA-4, lo que resulta en la inhibición de la regulación por disminución mediada por B7-CTLA-4 de la activación de las células T; posteriormente, B7.1 o B7.2 pueden interactuar con otra proteína del receptor de la superficie de células T, CD28, lo que resulta en una activación de células T mediada por B7-CD28 que no se opone a la inhibición mediada porB7-CTLA-4. Tremelimumab se administra mediante infusión IV a 3 mg/kg, 6 mg/kg, 10 mg/kg, 15mg/kg dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Bertilimumab es un anticuerpo monoclonal humano que se une a la eotaxina- 1. (iCo Therapeutics Inc.Vancouver, B.C.). De acuerdo con la presente invención, se administra en una dosis de 10mg/kg dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Lerdelimumab (CAT-152) es un anti-TGF beta-2 desarrollado por Cambridge Antibody Technology. De acuerdo con la presente invención, puede administrarse en una dosis de 10mg/kg dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. etelimumab (CAT-192) es un anticuerpo monoclonal lgG4 humano desarrollado por Cambridge Antibody Technology que neutraliza a TGF beta 1. De acuerdo con la presente invención, puede administrarse en una dosis de 10mg/kg preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Natalizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado contra la molécula de adhesión celular, a4-integrina. Se comercializa por Biogen Idee conjuntamente con Élan como Tysabri, y anteriormente se denominaba Antegren. Natalizumab se administra en una dosis de 300 mg mediante infusión intravenosa durante aproximadamente una hora, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Tocilizumab o atlizumab, desarrollado por Hoffmann-La Roche y Chugai con los nombres comerciales Actemra y RoActemra, es un anticuerpo monoclonal humanizado contra el receptor de interleucina-6 (IL-6R). De acuerdo con la presente invención, puede administrarse mediante infusiones intravenosas a 8 mg/kg dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Odulimomab es un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra la cadena alfa del antígeno 1 asociado a la función del linfocito de proteína, que participa en las reacciones inmunitarias. Se administran a 10 mg/kg del fármaco activo dentro de 7-14 días y 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Basiliximab (nombre comercial Simulect) es un anticuerpo monoclonal de ratón-humano quimérico de una cadena (CD25) del receptor de IL-2 de las células T. La dosis es 20 mg dos veces dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Daclizumab (nombre comercial Zenapax) es un anticuerpo monoclonal humanizado terapéutico de la subunidad alfa del receptor de IL-2 de las células T. Roche Pharmaceuticals, Hoffmann - La Roche Inc, 340 Kingsland Street, Nutley, Nueva Jersey. Se administran 10 mg/kg del fármaco activo dentro de 7-14 días y 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Inolimomab es un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra la cadena alfa del receptor de interleucina-2. OPi (anteriormente Orphan Pharma International). Se administran 10 mg/kg del fármaco activo dentro de 7-14 días y 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Zolimomab aritox es un anticuerpo monoclonal de ratón y es un anticuerpo anti-CD5 que está unido a la cadena A de la proteína ricina (lo que se refleja por el aritox en el nombre del fármaco). De acuerdo con la presente invención, puede administrarse en una dosis de 10mg/kg dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Atorolimumab es un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra el factor Rhesus. De acuerdo con la presente invención, puede administrarse en una dosis de 10mg/kg dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Cedelizumab es un anticuerpo monoclonal anti-CD4. De acuerdo con la presente invención, puede administrarse en una dosis de 10mg/kg dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Dorlixizumab es un anticuerpo monoclonal quimérico/humanizado y un fármaco inmunosupresor. Se administra en una dosis de 10 mg/kg del fármaco activo dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Fontolizumab (nombre comercial HuZAF) es un anticuerpo monoclonal humanizado anti-interferón gamma. De acuerdo con la presente invención, puede administrarse en una dosis I.V. de fontolizumab dada como 4.0 mg/kg o 10.0 mg/kg dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. (PDL Biopharma) Gantenerumab es un anticuerpo monoclonal anti-beta amiloide (Roche). Se administra en una dosis de 10 mg/kg del fármaco activo dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Gomiliximab es un anticuerpo monoclonal que se dirige al receptor de IgE de baja afinidad (FceRII o CD23). De acuerdo con la presente invención, puede administrarse en una dosis de 10mg/kg dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Maslimomab es un anticuerpo monoclonal de ratón que se dirige al receptor de células T. De acuerdo con la presente invención, puede administrarse en una dosis de 10mg/kg dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Morolimumab es un anticuerpo monoclonal humano contra el factor Rhesus humano. De acuerdo con la presente invención, puede administrarse en una dosis de 10mg/kg dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Pexelizumab es un fragmento variable de cadena simple de un anticuerpo monoclonal dirigido contra el componente 5 del sistema del complemento. De acuerdo con la presente invención, puede administrarse en una dosis de 10mg/kg dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Reslizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado anti-IL-5. De acuerdo con la presente invención, puede administrarse como una infusión en una dosis preferida de reslizumab de 3.0 mg/kg, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. (Ception Therapeutics Inc).

Rovelizumab, también conocido como LeukArrest y Hu23F2G, es un anticuerpo monoclonal humanizado anti-CD11/CD18 que suprime los leucocitos. De acuerdo con la presente invención, puede administrarse en una dosis de 10mg/kg dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Siplizumab (MEDI-507) es un anticuerpo monoclonal anti-CD2 con una lgG1 kappa humana, dirigido a CD2. El agente ha demostrado potentes efectos ¡mmunomodulatorios, suprimiendo selectivamente la función de las células T y NK. Siplizumab se une a CD2, un receptor específico hallado en las células T y NK, desencadenando de esta manera una respuesta inmunitaria del hospedador, lo que da como resultado la lisis de las células CD2+, supresión selectiva del sistema inmunitario y control del crecimiento de las células T activadas. De acuerdo con la presente invención, Siplizumab puede administrarse en una dosis preferida de 0.04 mg/kg i.v. y 5 o 7 mg/kg s.c. dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. ( edimmune) Talizumab (TNX-901) es un anticuerpo monoclonal humanizado en desarrollo por Tanox en Houston, Texas. Fue diseñado para dirigirse a la ¡nmunoglobulina E (o IgE) y linfocitos B que expresan IgE específicamente, sin unirse a la IgE ya unida por los receptores de IgE en los mastocitos y basófilos. De acuerdo con ía presente invención, puede administrarse en una dosis de 10mg/kg dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Omalizumab es un anticuerpo monoclonal anti-lgE, desarrollado por Tanox, Novartis y Genentech. De acuerdo con la presente invención, puede administrarse en una dosis de 10mg/kg dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Telimomab aritox es un anticuerpo monoclonal de ratón. El anticuerpo está unido a la cadena A de la proteína ricina (lo que se refleja por el aritox en el nombre del fármaco). De acuerdo con la presente invención, puede administrarse en una dosis de 10mg/kg dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Vapaliximab es un anticuerpo monoclonal quimérico anti-VAP-1. De acuerdo con la presente invención, puede administrarse en una dosis de 10mg/kg dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Vepalimomab es un anticuerpo monoclonal de ratón anti-VAPI. De acuerdo con la presente invención, puede administrarse en una dosis de 10mg/kg dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Abatacept (comercializado como Orencia) es una proteína de fusión compuesta por una inmunoglobulina fusionada al dominio extracelular de CTLA-4, una molécula capaz de unir a B7, previniendo de esta forma la activación completa de las células T. Abatacept deberá administrarse como una infusión intravenosa de 30 minutos de acuerdo con el cronograma de dosis especificado en función del peso. Las dosis serán preferentemente de 500mg para < 60 kg; 750 mg para 60 kg-100 kg; y 1 gramo para > 100 kg dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Belatacept (Bristol-Myers-Squibb) es una proteína de fusión compuesta por el fragmento Fe de una inmunoglobulina lgG1 humana unida al dominio extracelular de CTLA-4, la cual es una molécula fundamental para la coestimulación de las células T, bloqueando de manera selectiva el proceso de la activación de las células T. Fue desarrollado por. Difiere de abatacept (Orencia) en solo 2 aminoácidos. De acuerdo con la presente invención, puede administrarse como una infusión intravenosa de 30 minutos de acuerdo con el cronograma de dosis especificado en función del peso en dosis preferibles de 500mg para < 60 kg; 750 mg para 60 kg-100 kg; y 1 gramo para > 100 kg administrado dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Etanercept (nombre comercial Enbrel, Amgen, Thousand Oaks, CA) es un fármaco que trata enfermedades autoinmunitarias al interferir con el factor de necrosis tumoral (TNF, una parte del sistema inmunitario) actuando como un inhibidor del TNF. Etanercept puede administrarse subcutáneamente (s.c.) en una dosis de 25 mg o 50 mg, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Pegsunercept es un factor de necrosis tumoral soluble pegilado. De acuerdo con la presente invención, puede administrarse en una dosis preferible de 9 mg/kg s.c. dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Aflibercept es una proteína compuesta de segmentos de dominios extracelulares de los receptores del factor de crecimiento endotelial vascular humano 1 (VEGFR1) y 2 (VEGFR2) fusionados a la región constante (Fe) de la lgG1 humana con actividad antiangiogénica potencial y está en desarrollo por Sanofi-Aventis juntamente con Regeneran Pharmaceuticals. Aflibercept (Trampa de VEGF), un agente anti-angiogénico, es una proteína de fusión específicamente diseñada para unir todas las formas del Factor de Crecimiento Endotelial Vascular A (denominado VEGF- A). Además, aflibercept se une al Factor de Crecimiento Placentario (PLGF), que también participa en la angiogénesis tumoral. Aflibercept puede administrarse mediante inyección o infusión IV en dosis preferibles de 2 miligramos por kilogramo (mg/kg) o 4 mg/kg, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Alefacept es una proteína de fusión: combina parte de un anticuerpo con una proteína que bloquea el crecimiento de algunos tipos de células T. AMEVIVE® (alefacept) es una proteína de fusión dimérica inmunosupresora que consiste en la porción extracelular de unión a CD2 del antígeno asociado a la función de leucocito humano 3 (LFA-3) unido a la porción Fe (bisagra, dominios CH2 y CH3) de la lgG1 humana. La dosificación preferida es, ya sea 7.5 mg IV o 15 mg IM, preferentemente administrados dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. Astellas Pharma US, Inc. Deerfield, IL 60015.

Rilonacept también conocido como trampa de IL-1 (comercializado con el nombre comercial Arcalyst), es una proteína de fusión dimérica que consiste en el dominio extracelular del receptor de interleucina-1 humana y el dominio FC de la lgG1 humana que se une y neutraliza a IL-1 h. El tratamiento debería iniciarse con una dosis de carga inicial de 320 mg administrada como dos inyecciones subcutáneas de 2 mL, de 160 mg cada una, administradas el mismo día en dos sitios diferentes, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. Pacientes pediátricos de 12 a 17 años: El tratamiento debería iniciarse con una dosis de carga inicial de 4.4mg/kg, hasta un máximo de 320 mg, administrada como una o dos inyecciones subcutáneas con un volumen máximo para una sola inyección de 2mL, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. Producido por Regeneran.

Dacetuzumab (también conocido como SGN-40 o huS2C6) es un anticuerpo monoclonal humanizado anti-CD40. El antígeno CD40 se encuentra altamente expresado en la mayoría de las neoplasias hematológicas de linaje B incluyendo mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin y leucemia linfocítica crónica. CD40 también se encuentra en muchos tipos de tumores sólidos, incluyendo cáncer de vejiga, renal y de ovario y en las células que cumplen un rol en los trastornos inmunologicos. Se administra en una dosis preferida de 10 mg/kg del fármaco activo dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. Seattle Genetics, Inc.

HCD122 es un anticuerpo monoclonal anti-CD40 antagonista completamente humano. CD40 es un receptor de superficie celular que cumple un rol esencial en las respuestas inmunitarias, así como también en el crecimiento celular y señalización de supervivencia, a través de su activación por el ligando CD40 (CD40L). Comúnmente, se encuentra sobreexpresado y activado en neoplasias de células B. De acuerdo con la presente invención, puede administrarse en una dosis de 10mg/kg del fármaco activo, dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. Se encuentra en desarrollo por XOMA/NOVARTIS ONCOLOGY.

Rituximab, vendido con los nombres comerciales Rituxan y MabThera, Genentech, Inc., San Francisco, CA, es un anticuerpo monoclonal quimérico contra la proteína CD20, que se encuentra principalmente en la superficie de las células B. Por lo tanto, puede destruir células B. CD20 se encuentra ampliamente expresado en las células B, desde el desarrollo temprano de células pre-B y continúa hasta la diferenciación, pero está ausente en las células plasmáticas diferenciadas terminalmente. Rituxan se suministra a una concentración de 10 mg/mL, ya sea en viales de uso único de 100 mg (10 mL) o de 500 mg (50 mL). Puede administrarse como una infusión a una velocidad de 50 mg/hr. En ausencia de toxicidad de infusión, se aumenta la velocidad de infusión en incrementos de 50 mg/hr cada 30 minutos, hasta un máximo de 400 mg/hr administrada preferentemente dentro de 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. La dosis preferida recomendada es 375 mg/m2 como una infusión IV administrada preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre.

Rituximab también puede administrarse como un Componente de Zevalin® mediante infusión de rituximab en una dosis preferible de 250 mg/m2 dentro de las 4 horas antes de la administración de Zevalin marcado con lndio-111 -(ln-11 1-) y dentro de las 4 horas antes de la administración de Zevalin marcado con ltrio-90- (Y-90-), esto debería realizarse dentro de los 7-14 días y preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. Rituxan también puede administrarse en combinación con metotrexato, preferentemente 3-4 días antes de la administración de las células madre. Biogen Idee Inc. y Genentech USA, Inc.

Ibritumomab tiuxetan, vendido con el nombre comercial Zevalin, es una radioimmunoterapia de anticuerpo monoclonal que se dirige a las células B.; El fármaco usa el anticuerpo lgG1 de ratón monoclonal ibritumomab en conjunción con el quelante tiuxetan, al que se le agrega un isótopo radioactivo (ya sea itrio-90 o indio-111). Tiuxetan es una versión modificada de DTPA cuya cadena principal de carbono contiene un isotiocianatobencilo y un grupo metilo.

La deficiencia de la adenosina desaminasa también conducirá a la formación reducida de centros germinales activos, como lo harán los agentes que desencadena la acumulación de desoxi ATP (J Immunol 171 : 5562-5570, 2003). De manera similar, los agentes que potencian la expresión de o activan a CCR7 conducirán a la formación disminuida de centros germinales activos.

Células madre: Definición, aislamiento, administración y usos terapéuticos El término "célula madre", dentro del alcance de la presente invención, incluye cualquier célula capaz de diferenciarse en un tejido deseado. Dichas células incluyen células madre pluripotentes, células madre embrionarias, células madre multipotentes adultas y células progenitoras y precursoras. Una "célula madre" es una célula del embrión, feto o adulto que tiene, en determinadas condiciones, la capacidad de reproducirse por sí misma durante períodos largos o, en el caso de células madre de adulto, a lo largo de la vida del organismo. Esto también puede dar lugar a células especializadas que componen los tejidos y órganos del cuerpo.

Una "célula madre pluripotente" tiene la capacidad de dar lugar a tipos de células que se desarrollan a partir de las tres capas germinales (mesodermo, endodermo y ectodermo) de donde surgen todas las células del cuerpo. Las fuentes naturales conocidas de células madre pluripotentes humanas son aquellas aisladas y cultivadas a partir de embriones humanos tempranos a partir de tejido fetal que estaba destinado a ser parte de las gónadas.

Una "célula madre embrionaria" deriva de un grupo de células denominado la masa celular interna, que es parte del embrión temprano (4 a 5 días) denominado el blastocito. Una vez retiradas del blastocito, las células de la masa celular interna pueden cultivarse en célula madre embrionarias.

Una "célula madre adulta" es una célula no diferenciada (no especializada) que ocurre en tejido. diferenciado (especializado), se renueva a sí misma y se vuelve especializada para proporcionar todos los tipos de células especializadas del tejido en el que está ubicada cuando se transfiere al tejido apropiado. Las células madre adultas son capaces de realizar copias idénticas de ellas mismas durante toda la vida del organismo. A esta propiedad se la conoce como "autorrenovación". Las células madre adultas frecuentemente se dividen para generar células progenitoras o precursoras, las cuales luego se diferencian o se desarrollan en tipos de células "maduras" que tienen formas características y funciones especializadas, por ej., contracción de células musculares o señalización de células nerviosas. Las fuentes de células madre adultas incluyen, de modo no taxativo, la médula ósea, la sangre, la córnea y la retina del ojo, el cerebro, el músculo esquelético.^ la pulpa dental, el hígado, la piel, el revestimiento del tracto gastrointestinal y el páncreas.

La administración de células madre a un individuo incluye ambas, la administración de células madre exógenas, así como también la movilización de células madre endógenas, así como también mejora la biodisponibilidad de células madre endógenas liberadas espontáneamente.

Las células madre de la médula ósea son el tipo de células madre adultas más estudiado. Actualmente, son usadas clínicamente para restaurar varios componentes de la sangre e inmunitarios a la médula ósea mediante el trasplante. Se identifican actualmente dos tipos principales de células madre halladas en la médula ósea: células madre hematopoyéticas (HSC o células CD34+) que típicamente se considera que forman células de la sangre e inmunitarias, y células madre estromales (mesenquimales)(MSC) que típicamente se considera que forman hueso, cartílago, músculo y grasa. Sin embargo, ambos tipos de células madre derivadas de la médula ósea recientemente han demostrado amplia plasticidad y multipotencia en su habilidad de formar los mismos tejidos. La médula, ubicada en la cavidad medular de los huesos, es el principal sitio de hematopoyesis en seres humanos adultos. Produce alrededor de seis mil millones de células por kilogramo de peso corporal por día. La medula hematopoyéticamente activa (roja) se revierte luego del nacimiento hasta la adolescencia tardía, después de lo cual se enfoca en las vértebras cervicales, cintura escapular y pélvica, costillas y esternón. Las células grasas reemplazan a las células hematopoyéticas en los huesos de las manos, los pies, las piernas y los brazos (médula amarilla). La grasa ocupa alrededor del cincuenta por ciento del espacio de la médula roja en el adulto y además, la metamorfosis grasa continúa lentamente con la edad. En individuos muy ancianos, puede ocurrir una transformación gelatinosa de grasa en un material mucoide (médula blanca). La médula amarilla puede volver a ser médula hematopoyéticamente activa si existe demanda prolongada, tal como con anemia hemolítica. Por lo tanto, la hematopoyesis puede expandirse al aumentar el volumen de médula roja y disminuyendo el tiempo de desarrollo (tránsito) de célula progenitora a célula madura.

El estroma de la médula consiste principalmente en una red de senos que se originan en el endostio a partir de capilares corticales y termina en vasos colectores que ingresan a la circulación venosa sistémica. La pared trilaminar del seno está compuesta por células endoteliales; una membrana basal delgada subdesarrollada, y células reticulares adventicias que son fibroblastos capaces de transformarse en adipocitos. Las células endoteliales y reticulares son fuentes de citocinas hematopoyéticas. La hematopoyesis se realiza en los espacios entre los senos y está controlada por un complejo conjunto de citocinas estimuladoras e inhibidoras, contactos célula a célula y los efectos de los componentes de la matriz extracelular en células próximas. En este ambiente único, las células madre linfohematopoyéticas se diferencian en todos los tipos de células sanguíneas. Se producen y liberan células maduras para mantener los niveles sanguíneos de estado estacionario. El sistema puede satisfacer las demandas aumentadas de células adicionales como resultado de la pérdida de sangre, hemolisis, inflamación, citopenias inmunes y otras causas.

Una célula "progenitora o precursora" es parcialmente especializada; se autorrenueva y también da lugar a células diferenciadas. Los investigadores frecuentemente distinguen las células progenitoras/precursoras de las células madre adultas en que, cuando una célula madre se divide, una de las dos células madre nuevas es frecuentemente una célula madre capaz de reproducirse a sí misma de nuevo. En contraste, cuando una célula progenitora/precursora se divide, puede formar más células progenitoras/precursoras o puede formar dos células especializadas. Las células progenitoras/precursoras pueden reemplazar a las células que están dañadas o muertas, manteniendo de esta manera la integridad y funciones de un tejido, tal como del hígado o el cerebro.

Se conocen medios para el aislamiento y cultivo de células madre útiles en la presente invención. La sangre del cordón umbilical es una fuente abundante de células madre hematopoyéticas. Las células madre obtenidas de la sangre del cordón umbilical y aquellas obtenidas de la médula ósea o de la sangre periférica, parecen ser muy similares para su uso en trasplantes. La placenta es una fuente excelente, fácilmente disponible, para células madre mesenquimales. Además, las células madre mesenquimales han demostrado que derivan de células del tejido adiposo y células estromales de la médula ósea, y se especula que están presentes en otros tejidos. El líquido y tejido amniótico es otra excelente fuente de células madre. Aunque hay diferencias cualitativas y cuantitativas dramáticas en los órganos de los que pueden derivar las células madre adultas, las diferencias iniciales entre las células pueden ser relativamente superficiales y equilibradas por el rango similar de plasticidad que exhiben. Por ejemplo, las células madre adultas, tanto hematopoyéticas como mesenquimales, en las condiciones apropiadas pueden convertirse en células miocárdicas. Recién comienza una delineación del rango completo de potencial para las células madre. Las células madre pueden aislarse y diferenciarse usando métodos conocidos. Por ejemplo, en ratones, se aislan las células de la médula ósea sacrificando al ratón, cortando los huesos de la pierna con una tijera y retirando las células madre. Las células madre también pueden aislarse de las células de la médula ósea mediante cribado de las células de la médula ósea con anticuerpo que unen células no deseadas, tales como CD4+ y CD8+ (células T), CD45+ (células panB), GR-1 (granulocitos). Para un ejemplo de este protocolo véase, Inaba et ál., J. Exp. Med. 176:1693-1702(1992).

La figura 1 muestra una vista ; típica de capas . que resultante la, centrifugación eri¡gradiente de sangre, completa. 1 jnuestra lajs^ plaquetas; ^ células MNC y céjulas madre; 3 el ficpl; y 4 sedimento RBC y, células maolS! En los seres humanos, las células madre hematopoyéticas CD34+ pueden obtenerse a partir de una variedad de fuentes, incluyendo la sangre del cordón umbilical, la médula ósea y la sangre periférica movilizada. La purificación de las células CD34+ puede lograrse mediante procedimientos de afinidad de anticuerpos. Se describe un procedimiento de aislamiento de columna de afinidad para aislar las células CD34+ en Ho et ál., Stem Cells 13 (suppl. 3): 100-105(1995). Véase también, Brenner, Journal of Hematotherapy 2: 7-17 (1993). Se conocen métodos para aislar, purificar y expender culturalmente las células madre mesenquimales. También se conocen antígenos específicos para MSC (véase, patente estadounidense N° 5,486,359 y 5,837,539).

Las células madre se caracterizan por tener la capacidad de renovarse a sí mismas a través de la división celular mitótica y diferenciarse en un grupo diverso de tipos de células especializadas. Existen células madre dentro de un rango de potencias. Las células madre totipotenciales son células tales como un óvulo fertilizado que puede generar todos los tejidos necesarios para el desarrollo de un organismo completo. Las células madre pluripotenciales son células que pueden originar células madres para las 3 capas germinales e incluyen células tales como las células madre embrionarias, células madre espermatogónicas (Cell. 119(7):1001-1012, 2009; NATURE 440:1199-1203, 2006), o células madre pluripotenciales inducidas que, cuando se inyectan en el embrión tetrapliode pueden originar un organismo entero (Stem Cell Rev. 2010), pero no los tejidos extraembrionarios que se necesitan, tales como la placenta. Las células madre tipo embrionarias muy pequeñas son células que se encuentran dentro de la médula ósea, la sangre, el corazón y otros tejidos del adulto que pueden originar células de células de los tres linajes de capa germinal, sin embargo, aún no se ha demostrado en ensayos de complementacion tetraploide que generen un organismo completo, por lo tanto, no queda claro si son realmente células madre pluripotenciales en las que la impronta somática evita su actividad en la complementacion tetraploide o si son células madre multipotenciales extremadamente plásticas más restringidas (DEVELOPMENTAL DYNAMICS 236:3309-3320, 2007). Las células madre multipotenciales son células tales como las células madre hematopoyéticas (HSC) (J Exp Med. 207(6):1127-1 130, 2010), las células madre adiposas (ASC) (Stem Cells Dev. 2010 [Epub ahead of print]) (6) o células madre mesenquimales (MSC) (StemBook, Cambridge (MA): Harvard Stem Cell Institute; 2008-2009) que pueden originar una variedad de células en funcionamiento dentro de los linajes restringidos.

Las células madre pueden estar caracterizadas además por el grado en el cual se pueden diferenciar y se distinguen por su potencia. "Potencia" especifica el potencial de diferenciación (el potencial para diferenciar en diferentes tipos celulares) de la célula madre.

Las células madre totipotenciales (también conocidas como omnipotentes) pueden diferenciarse en tipos celulares extraembrionarios y embrionarios. Tales células pueden construir un organismo completo y viable. Estas células son producidas a partir de la fusión de un óvulo y una célula espermática. Las células producidas por las pocas primeras divisiones del óvulo fertilizado también son totipotenciales.

Las células madre pluripotenciales son las descendientes de las células totipotenciales y se pueden diferenciar en casi todas las células, es decir, células derivadas de cualquiera de las tres capas germinales.

Las células madre multipotenciales se pueden diferenciar en un número de células, pero solo en aquellas pertenecientes a una familia de células estrechamente vinculadas a ellas.

Las células madre oligopotentes se pueden diferenciar solo en unas pocas células, tales como en células madre linfoides o mieloides.

Las células unipotenciales pueden producir solo un tipo de célula, su propio tipo, pero tienen la propiedad de autorrenovación que las distingue de las células que no son madre (por ejemplo, células madre de los músculos).

Los dos tipos más amplios de células madre de mamífero son: las células madres embrionarias que se aislan de la masa celular interna de los blastocitos y las células madre adultas que se encuentran en tejidos adultos.

Las células madre adultas son células no diferenciadas, halladas en todo el organismo luego del desarrollo embrionario, que se multiplican por división celular para remplazar las células moribundas y regenerar los tejidos dañados. También conocidas como células madre somáticas, pueden hallarse en animales y seres humanos jóvenes así como también adultos. Los tipos de células madre adultas incluyen células madre hematopoyéticas, células madre de mamífero, células mesenquinales, células madre endoteliales, células madre neuronales, células madre adultas olfativas, células madre derivadas del tejido adiposo, células madre de la cresta neural y células madre testicu lares.

Las células progenitoras tienen tendencia a diferenciarse en un tipo específico de célula. Sin embargo, en contraste con las células madre, son de por sí mucho más específicas: son forzadas a diferenciarse en su célula "diana". La diferencia más importante entre las células madre y las células progenitoras es que las células madre pueden multiplicarse de manera indefinida, mientras que las células progenitoras pueden solo dividirse un número limitado de veces. Todavía hay desacuerdos con respecto a la definición exacta y el concepto aún está evolucionando.

Los términos "célula progenitora" y "célula madre" a veces son equivalentes.

Se ha demostrado que las células madre halladas dentro de la fracción mononuclear de sangre completa, la médula ósea, tejido adiposo, sangre del cordón umbilical y otros tejidos, así como también las células madre aisladas de estas fracciones mononucleares proporcionan un beneficio para los pacientes humanos. Una célula sanguínea mononuclear periférica (PBMC) es cualquier hematocito que tiene un núcleo redondo. Por ejemplo, un linfocito, monocito o un macrófago. Estos hematocitos son un componente importante en el sistema inmunitario para luchar contra la infección y adaptarse a intrusos. La población de linfocitos consiste en células T (positivos para CD4 y CD8 -75%), células B y células NK (-25% combinadas). Los PBMC se extraen con frecuencia de la sangre completa utilizando ficol, un polisacárido hidrofílico que separa las capas de la sangre, con los monocitos y los linfocitos formando una capa leucocitaria bajo una capa de plasma. Esta capa leucocitaria contiene los PBMS. De manera adicional, los PBMC pueden extraerse de la sangre completa utilizando una lisis hipotónica que lisará preferentemente los glóbulos rojos. Este método resulta en neutrófilos y otras células polimorfonucleares (PMN) que son importantes en la obtención de la defensa inmunológica innata. Las fracciones de PBMC de los aspirados de médula ósea se han utilizado para tratar pacientes luego de un infarto de miocardio y han demostrado reducir la mortalidad subsiguiente y mejorar ligeramente la función cardíaca en estos pacientes (Eur Heart J 27:2775-2783, 2006). Mientras que la mortalidad se ve significativamente reducida por estos tipos de tratamientos, la función cardíaca solo se ve ligeramente mejorada. Estudios de imagenología nuclear en estos pacientes han demostrado que la mayoría, hasta un 97% de las células madre fraccionadas mononucleares inyectadas de manera intracoronaria no permanecen en el corazón, sino que pueden hallarse predominantemente en el bazo y el hígado en los 60 a 90 minutos luego de la inyección (Circulation 11 1 :2198-2202, 2005). Otros estudios de imagenología asimismo han demostrado que las células madre halladas dentro de la fracción mononuclear de la sangre completa, médula ósea, tejido adiposo, sangre del cordón umbilical, placenta, líquido amniótico y otros tejidos, así como también células madre aisladas de estas fracciones mononucleares, se acumulan en el bazo en varias especies diferentes (STEM CELLS 24:2279-2283, 2006; J Nucí Med 45:512-518, 2004; J Nucí Med 47:1212-1219, 2006; J Nucí Med 47:1295-1301 , 2006).

Estudios en animales han demostrado que la administración de cantidades más altas de células mononucleares de la médula ósea lleva a una mejora en la reparación cardíaca y la recuperación funcional (Circulation 114:2163-2169, 2006). Sin embargo, para el paciente clínico, esto requeriría la aspiración de grandes cantidades de médula ósea, hasta 200 mis, con anestesia general, lo que es considerado altamente inconveniente para pacientes que recientemente hubieran sufrido un infarto o cuya función cardíaca es reducida. Los investigadores también han intentado concentrar las células madre que están inyectando con el fin de obtener un mejor direccionamiento y retención en el órgano. Mientras que el enriquecimiento del número de células CD34+ inyectadas ha conducido a una acumulación mayor de células CD34+ en el corazón luego de la inyección intracoronaria, este método para mejorar la administración de células madre está pensado para ser subóptimo porque no se conoce en el momento qué células madre en particular contenidas dentro de la fracción celular mononuclear son necesarias para la regeneración de tejidos (Circulation 11 1 :2198-2202, 2005). Además, se ha demostrado que las células madre mesenquimales humanas (MSC) purificadas aumentan el prendimiento del injerto de células madre CD34+ sanguíneas de cordón umbilical humano (Hematology VOL 14 NO 3:125-132, 2009).

Las células madre pueden ser autólogas o de un donante no relacionado. Las células madre pueden estar contenidas dentro de la fracción; de células mononucleares de la médula ósea, sangre completa, sangre del cordón umbilical, tejido adiposo u otras fuentes, o pueden ser purificadas por la selección de CD34, CD133, CD105, CD117, SSEA1 -4, tinción por exclusión u otros antígenos de células madre específicos. Las células madre pueden aislarse de sangre compléta, la médula ósea, la sangre del cordón umbilical, el tejido adiposo, raspado de tejidos de la mucosa olfativa y otras fuentes de células madre que pueden ser disociadas en suspensiones de célula única, tal como tejido del cordón umbilical, mediante centrifugación en gradiente de densidad usando Ficoll-Hypaque u otros gradientes disponibles comercialmente. Las células madre pueden ser recuperadas de la fracción de células mononucleares que resulta de tales procedimientos. De manera alternativa, las células madre pueden hallarse dentro de otras fracciones luego de la centrifugación en gradiente de intensidad (Stem Cells and Development 2011 Bhartiya et. ál.) Por ejemplo, se puede diluir sangre de cordón umbilical 1 :1 en PBS, superponerse cuidadosamente en Histopaque 1077 (Sigma) y centrifugarse a 1500 rpms a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las capas resultantes, como se ilustra en la Figura 1 , pueden ser procesadas adicionalmente para el aislamiento de células madre. La capa 1 es la capa plaquetaria, la capa 2 es la capa leucocitaria que contiene células mononucleares, la capa 3 es la capa Ficol y la capa 4 es la capa sedimentaria de glóbulos rojos. Las capas 1 , 2 y 3 pueden recogerse, diluirse con medios adecuados tales como DMEM F12 con o sin FBS y centrifugarse nuevamente para obtener el sedimento celular. La capa 4 puede diluirse con medios adecuados tales como DMEM F12 y centrifugarse a 800 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente en una centrifugadora de mesa estándar. Las células madre pueden ser predominantemente recuperadas de la capa 2 (capa leucocitaria) y la capa 4 (sedimento RBC).

Las células madre pueden ser caracterizadas además y aisladas por antígenos específicos expresados en su superficie usando distribuidores de células tales como el ARIA de BD, usando columnas magnéticas tales como las disponibles de Miltenyi, usando cuentas magnéticas e imanes DYNAL y otros métodos de separación basados en anticuerpos/antígenos conocidos para los expertos en la técnica. Las células madre también pueden ser identificadas y aisladas por su capacidad de unirse a otras células como se describe en esta memoria.

Las células madre pluripotenciales pueden ser caracterizadas por la expresión del antígeno embrionario de etapa específica (SSEA), los factores de transcripción Oct4 y Nanog y otros marcadores. Las células madre hematopoyéticas se caracterizan por la expresión de marcadores tales como CD34, CD133, ckit, Sca1 , y son también positivas para CD45. La abreviatura CD se refiere a una familia de antígenos y significa "cúmulo de diferenciación".

Las células madre hematopoyéticas (HSC) son células madre multipotenciales que pueden originar todos los tipos de hematocitos, incluyendo los linajes mieloides (monocitos y macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, eritrocitos, megacariocito/plaquetas, células dendríticas) y linfoides (células T, células B, células NK). El tejido hematopoyético contiene células con capacidades de regeneración a corto y largo plazo y progenitores multipotentes, oligopotentes y unipotentes comprometidos. Las HSC constituyen 1 :10.000 de células en el tejido mieloide. Las HSC expresan los siguientes antígenos: CD34, CD90 (Thy1), CD45, CD41 , CD105, CD1 17 (c-kit), SCF (ligando de kit), Ly6A/E (sca-1), CD127, CD44, CD33, CD38, CD14, CD106, CD84, CD90, Flk-1 , CD164, Notchl , CD338 (ABCG2), CD202b, CD184, AC133 (=CD133) y CXCR4.

Las células madre mesenquimales, o MSC, son células madre multipotentes que pueden diferenciarse en una variedad de tipos de células, que incluye: osteoblastos (células óseas), condrocitos (células cartilaginosas) y adipositos (células grasas). Las células madre mesenquimales se caracterizan por la expresión de CD45, CD90, CD105, CD34, CD31 , CD29, CD106, CD44, CD51 , CD166, Ly6A/E (sca-1), CD117, CD71 , CD10, CD49d, CD49e, TNAP, PTP LAR, antígeno W5C5, antígeno W3D5, antígeno W4A5 y CXCR4.

Las células madre endoteliales (o células precursoras o progenitores endoteliales) son células madres multipotentes. Estas constituyen uno de los tres tipos de células madre que se hallan en la médula ósea y expresan los siguientes antígenos: CD45, CD31 , CD34, CD105, CD146, CD106, CD54, CD117, CD102, CD120a, CD120b, CD14, CD29, CD49d, CD49e, CD49f , CD62P, CD62L y CXCR4.

Las células madre neurales (NSC) son células multipotentes con capacidad de autorrenovación que generan los fenotipos principales del sistema nervioso. Las células madre y progenitoras neurales han sido aisladas del tejido estriado, incluyendo la zona subventricular, una de las áreas neurogénicas de tejido cerebral de ratones adultos y de varias áreas del cerebro adulto, incluyendo áreas no neurogénicas, tales como la médula espinal, y de varias especies, incluyendo la humana. Las NSC expresan los siguientes antígenos: CD29, CD146, Notchl , Ki67, CD24, CD49f, Vimentin, CD81 y CXCR4. Las células progenitoras neurales expresan los siguientes antígenos: antígeno 57D2, antígeno W4A5 y CXCR4.

Las células madre embrionarias, espermatogónicas, testiculares y pluripotentes, tales como las de iPS, SCNT, ANT-OAR, expresan los siguientes antígenos: CD24, CD9, Nanog, Smad, Runx2, c myc, CD30, GSC, Oct3/4, Sox2, SSEA 1 (CD15), SSEA 4, CD324, CD29, Tra-1 -60, Tra-1-81 , CD338 (ABCG2), CD49f, FoxD3, Stat3, Hox11 y CXCR4.

Las VSEL son positivas para SSEA1 , Oct4, Nanog, Rex1 y otros marcadores de células madre pluripotentes, y para CD133, CD34, AP, cMet, LIF-R y CXCR4. (J Am Coll Cardiol 53(1 ):10-20, 2009; Stem Cell Rev 4:89-99, 2008). De manera adicional, de manera rutinaria se identifica que las células madre novedosas se caracterizan por marcadores distintos, tales como las células madre Hox11 +, halladas en el bazo del adulto (Horm Metab Res 40: 137 - 146, 2008). Se ha identificado una célula madre fetal en el bazo del adulto que tiene la capacidad de regenerar células del islote pancreático, sin embargo, esta célula está presente en la fracción negativa de CD45 del bazo (Mol Cell Proteomics 4(10): 1459-1470, 2005). Las células esplénicas Hox11+, mientras que son negativas para CD45, expresan OCT3/4, SOX2, KLF4, c-MYC y NANOG, lo que las hace potencialmente equivalentes a las células madre embrionarias y las células madre pluripotentes inducidas (iPS) (Int J Biochem Cell Biol. 2009 Dic 18.

Usos terapéuticos de las células madre La terapia con células madre se está investigando y perfeccionando para el tratamiento de muchas enfermedades. Las afecciones que podrían beneficiarse de la terapia con células madre incluyen: enfermedades oculares, enfermedades neurales, enfermedades gastrointestinales, enfermedades musculoesqueléticas, enfermedades metabólicas, enfermedades endocrinas, enfermedades vasculares, enfermedades pulmonares, enfermedades cardíacas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades mediadas por el sistema inmunológico, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades cardiovasculares y todas las enfermedades que se beneficiarían de la terapia regenerativa. La información sobre ensayos clínicos en el sitio web del NIH www.clinicaltrials.gov enumera más de 3000 investigaciones relacionadas con las células madre. Las enfermedades bajo evaluación incluyen: vasculitis, afecciones reumáticas que utilizan células progenitoras endoteliales, neovascularización terapéutica mediante implante de células mononucleares autólogas en pacientes con enfermedades del tejido conjuntivo, administraciones repetidas del factor estimulante de colonias de granulocitos para la movilización de células madre sanguíneas en pacientes con parálisis supranuclear progresiva, atrofia sistémica múltiple y degeneración corticobasal; neoplasias hematológicas, leucemias, linfomas, cánceres, osteopetrosis, anemia aplásica y citopenias, anemia depranocítica y talasemia, insuficiencia de células madre Timbares, cáncer de mama, infarto de miocardio agudo (véase la patente estadounidense N° 7,862,810, aislamiento y cultivo de células madre cardíacas que son c-kit positivas), enfermedad arterial coronaria (véase la patente estadounidense 7,470,538, aislamiento y administración por inyección en la arteria coronaria de células enriquecidas con CD1337CD347CXCR4" aisladas de la sangre del cordón umbilical), enfermedad vascular periférica, insuficiencia cardíaca, diabetes mellitus tipo I (véase la publicación de solicitud de patente estadounidense N° 2011000830, Human Adipose Derived Insulin Making Mesenchymal Stem Cells For Treating Diabetes Mellitus), diabetes mellitus tipo 2, apoplejía, lesión de médula espinal, neuroblastoma, esclerosis múltiple (véase la publicación de solicitud de patente estadounidense N° 20100166712, administración autóloga de precursores neurales derivados de células madre mesenquimales para tratar la esclerosis múltiple), esclerosis sistémica, lupus eritematoso, sanación de heridas crónicas, quemaduras, curación de fracturas, reparación de cartílagos, tumores del SNC, osteoartritis, insuficiencia renal, enfermedad de Parkinson (véase la publicación de solicitud de patente estadounidense N° 20100010087, Methods for Inducing Stem Cell Mlgration and Specialization with EC-18), mielomas, pie diabético, cirrosis biliar y hepática, cardiomiopatía dilatada, anemia, retinitis pigmentosa, enfermedad de Crohn, neuropatía diabética, mastocitosis, cáncer de ovario, epilepsia, miastenia grave, enfermedades autoinmunitarias, enfermedad granulomatosa, osteonecrosis, insuficiencia hepática, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, lipodistrofia, enfermedades desmielinizantes, defectos cartilaginosos, enfermedades de la retina, nefritis lúpica, enfermedad de Alzheimer, lesión cerebral traumática, sarcoma, miositis, hiperglucemia, degeneración macular, colitis ulcerosa, degeneración muscular y otros. Las limitaciones de estas terapias con células madre incluyen una incapacidad de administrar de manera óptima e injertar células madre, ya sea en un órgano dañado específico o en centros hematopoyéticos en la médula ósea y el bazo.

Administración de células madres exógenas Las células madre pueden administrarse a un paciente mediante varias vías. Por ejemplo, las células madre, en un excipiente adecuado que optimice la viabilidad de las células madre y elimine la acumulación de células, pueden administrarse por vía intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intrapericárdica, intraocular, trasvascular, transendocárdica, transepicárdica, transeptal, epicárdica, por la vena transcoronaria, por revascularización transmiocárdica percutánea, intratecal, intraorgánica, intranasal, intraventricular o intraepidural con aguja, catéter u otro método mínimamente invasivo. Las células madre también pueden administrarse mediante estas vías en una mezcla "matriz" o mezcla en suspensión diseñada para ayudar a conservar las células madre en el sitio de la inyección, por ejemplo, colágeno, fibrinógeno, fibronectina, laminina, alginato, agarosa, metilcelulosa, liposomal, nanopartículas, micela, burbuja de albúmina, ácido graso u otra formulación en suspensión semisólida.

Los sistemas de administración basados en catéter que pueden utilizarse para administrar células madre incluyen catéteres de inyección con globo para angioplastia, catéteres para administración percutánea en las arterias coronarias, inflaciones que detienen el flujo en catéteres con globo con guías de alambre, catéteres de tipo Swan Ganz, catéteres de tipo Hickman, catéteres de tipo Foley, catéteres venosos centrales, catéteres en "rabo de cerdo", sistemas SmartPort™, catéteres guiados por imanes con punta de metal, tales como el sistema de navegación magnética Gentle Touch desarrollado por Stereotaxis Inc o el sistema Mitralign, el sistema Accucinch, y mediante catéteres que inyectan directamente en el órgano, tales como el HELIX™, el MyoCathTM, Myostar™ guiado de NOGA R, el Stiletto™, o el Delivery System™ intravascular guiado por ultrasonido (IVUS) de TransAccess, o catéteres que administran por vía arterial tales como OpenSail™, Concertó™, el catéter de inyección con microjeringa de Mercator y Maverick™, o mediante terapias de dispositivo implantable tales como dispositivos de asistencia ventricular para el ventrículo izquierdo (LVAD), dispositivos de asistencia biventricular (BiVAD), el OptimizerTM, catéteres de administración de células tales como los descritos en US 2009/0299269.

Las células madre también pueden ser administradas a un paciente usando métodos quirúrgicos invasivos y luego inyectados directamente en el órgano o aplicados al órgano. Las aplicaciones para aplicar la composición de células madre a un órgano incluyen matrices de colágeno, composiciones matrices extracelulares, microhebras biopoliméricas elaboradas con fibrina u otro material matriz extracelular, parches que contienen matriz extracelular y materiales biodegradables, parches de fibrina, parches basados en agarosa o alginato, estructuras compuestas por materiales matrices extracelulares y material fisiológicamente inerte biodegradable que podría incluir componentes tales como dextranos, recubrimiento de células madre con antígenos de órgano específico o moléculas de unión, remanentes de matrices extracelulares, también conocidas como estructuras u órganos descelularízados de donantes de órganos digeridos ex vivo u órganos de cadáveres y lentes de contacto, entre otros.

Movilización de células madres exógenas Otro método de tratar pacientes con células madre implica movilizar las células madre de su propio cuerpo para que salgan de los órganos, tales como la médula ósea e ingresen en la circulación. Por ejemplo, los agentes terapéuticos como el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF; Filgrastim), que se vende como Neupogen o en formas de acción más prolongada como Neulasta, el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CFS; Sargramostim), que se vende como Leukine, AMD3100, que se vende como Mozobil/Plerixafor por la empresa Genzyme causan que aumente la cantidad de células madre dentro de la circulación. Neupogen viene en viales de uso único o en jeringas de uso único que contienen 300 o 480 microgramos de Filgrastim. El excipiente está compuesto por acetato, sorbitol, polisorbato 80, sodio y agua para inyección. Neupogen de usa de forma clínica como una dosis dos veces al día, una dosis diaria subcutánea o un tratamiento subcutáneo crónico. Neupogen está aprobado para acelerar la recuperación de los conteos de neutrófilos en pacientes con cáncer que reciben quimioterapia mielosupresora, en pacientes con leucemia mieloide aguda que reciben quimioterapia de consolidación o inducción, en pacientes con cáncer que reciben trasplante de médula ósea, en pacientes con neutropenia crónica grave y en pacientes que sometidos a terapia y recolección de células progenitoras de la sangre periférica. Neupogen se administra típicamente a diario entre 3 a 69 microgramos por kilogramo de peso corporal, comenzando 4 días después de la quimioterapia con una duración de tratamiento de 2 a 20 días. Según el prospecto de Neupogen, el G-CSF regula la producción de neutrófilos dentro de la médula ósea y afecta la proliferación, diferenciación y la activación funcional de la célula madura seleccionada de progenitores neutrófilos, (incluyendo una capacidad fagocítica mejorada, cebado del metabolismo celular asociado a la explosión respiratoria, destrucción dependiente de anticuerpos 7 y la expresión aumentada de algunas funciones asociadas a los antígenos de la superficie celular. También se ha demostrado que el G-CSF moviliza las células madre en la circulación mediante: su acción para reducir la expresión de CXCL12 en el estroma de la médula ósea y para reducir la expresión de CXCR4, lo que lleva a un corte en el extremo N de CXCR4 (1), mediante la reducción de la expresión de VCAM en la médula ósea (2), se ha demostrado que el G-CSF aumenta CXCL2, el ligando afín para CXCR2. Dada su aprobación para la terapia clínica, también se ha demostrado que G-CSF aumenta la cantidad de células madre de tipo embrionario muy pequeñas en la circulación.

Según el prospecto, LEUKINE está indicado para la movilización de células progenitoras hematopoyéticas en la sangre periférica para la recolección mediante leucoféresis. La movilización permite la recolección de cantidades mayores de células progenitores que tienen la capacidad de injertarse en comparación con la recolección sin movilización. Luego de la quimioterapia mieloablativa, el trasplante de una cantidad mayor de células progenitores puede hacer que el prendimiento del injerto sea más rápido, lo que puede resultar en que la necesidad de cuidados paliativos sea menor. La reconstitución mieloide se acelera aún más mediante la administración de LEUKINE luego del trasplante de células progenitores de sangre periférica. La dosis recomendada de LEUKINE son 250 microgramos por metro cuadrado de superficie corporal por día, administrado como una infusión intravenosa de 24 horas o una vez al día por vía subcutánea. El tiempo de tratamiento óptimo con LEUKINE es aparentemente de 5 días para la movilización de células madre en la circulación. También se ha demostrado que leukine es eficaz en combinación con el G-CSF en pacientes que tuvieron una movilidad pobre en respuesta al G-CSF solo.

Mobozil tiene el nombre químico I, 1 '-[1 ,4-fenilenebis (metilen)]-bis-1 , 4,8,11-tetraazaciclotetradecano. Tiene la fórmula molecular C28H54N8. Mobozil es un inhibidor del receptor de quimiocionas, CXCR4, y bloquea la unión de su ligando afín, SDF-1 (CXCL12). Mobozil causa que la cantidad de células madre circulantes aumente interrumpiendo la unión de CXCR4 expresado en células madre a SDF-1 (CXCL12), expresado por las células estromales y otras células de la médula ósea. La movilización óptima luego del tratamiento con Mobozil depende de la activación complementaria. El uso de Mobozil como inyección subcutánea en combinación con Neupogen está aprobado con el fin de movilizar células madre hematopoyéticas hacia la sangre periférica para la recolección y subsiguiente trasplante autólogo en pacientes con llnfoma no Hodgkin (NHL) y mieloma múltiple (MM). Mobozil se vende como un vial de uso único que contiene 1.2 mL de una solución de 20 mg/mL. Los pacientes se tratan con Mobozil según el siguiente programa de dosificación recomendado, como se detalla en el prospecto: iniciar el tratamiento con Mozobil luego de que el paciente haya recibido el G-CSF una vez al día durante 4 días; repetir la dosis de Mozobil hasta 4 días consecutivos; seleccionar la dosis en función de los 0.24 mg/kg de peso corporal real; administrar por medio de inyección subcutánea aproximadamente 11 horas antes de la iniciación de la aféresis. Se ha demostrado que la combinación del G-CSF y Mobozil moviliza más células madre primitivas en la circulación que el uso de G-CSF solo.

Otros agentes de los que se conoce que movilizan las células madres, incluyendo las células madre hematopoyéticas, en la circulación, incluyen el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), la eritropoyetina, la hormona paratiroide, el ligando Flt3 y el factor de células madre (FCM). Otros agentes de los que se sabe que o de los que se esperaría que resulten en una movilización aumentada de las células madre y progenitoras en la circulación incluyen agentes que aumentan la proliferación de células madre, tales como los factores estimulantes de colonias, agentes que aumentan la producción endógena del G-CSF, tales como beta-glucanos de Maitake, agentes que pueden reducir la expresión de SDF-1 o CXCR4, incluyendo los agonistas que regulan por disminución de CXCR4, agentes que reducen la afinidad de unión de SDF-1 o CXCR4, agentes que atenúan la señalización de CXCR4, agentes que bloquean la bioacumulación de células madre fuera de la circulación, agentes que mejoran el egreso de células madre en la circulación, tales como la activación del complemento o aumento del esfingosina-1 -fosfato en el plasma, agentes que regulan por aumento la expresión de CXCR2 en la médula ósea o su ligando afín CXCL2, agentes que reducen la expresión de VCAM en la médula ósea, tales como la ciclofosfamida quimioterapéutica, agonistas del receptor del ácido retinoico, inhibidores de moléculas pequeñas de VLA-4, tales como BI05192 u otros bloqueadores de VLA4, activadores de la metaloproteinasa o carboxipeptidasa que degradarían el CXCL12 expresado en la médula ósea, o regímenes quimioterapéuticos seleccionados, o regímenes que agregan ciclofosfamida o el etópósido inhibidor de la topoisomerasa al tratamiento con G-CSF, ingestión de fucoidán por la quimiocina CXCL2 y ácido colomínico, entre otros.

Células madre endógenas de liberación espontánea Otro método para tratar pacientes con células madre implica evitar que las células madre endógenas liberadas de manera espontánea queden atrapadas en los tejidos linfáticos. Las células madre y progenitoras se liberan de manera espontánea en el torrente sanguíneo diariamente. Los experimentos que utilizan ratones parabióticos han demostrado que el bazo intercambia fácilmente células madre y progenitoras con la circulación. De manera adicional, se ha demostrado que los estados de enfermedad hacen que los niveles de células madre y progenitoras circulantes sean mayores, por ejemplo, la hipercolesterolemia, ataque cardíaco, infarto de miocardio con elevación del segmento ST o enfermedad de las arterias coronarias, ligación o isquemia transitoria, permanencia en altura moderada, hiperparatiroidismo primario y daño en el epitelio pigmentario retinal, entre otros. Evitar que las células madre que se liberan de forma espontánea o las inducidas por enfermedad queden atrapadas en los tejidos linfáticos hará que haya más células madre disponibles para la regeneración de tejidos u órganos dañados.

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA REGENERAR CENTROS GERMINALES EN TEJIDOS LINFÁTICOS La presente invención satisface esta necesidad de proporcionar métodos y composiciones para regenerar, rejuvenecer y aumentar la cantidad de centros germinales en los tejidos linfáticos luego de la radiación o la quimioterapia. Los agentes terapéuticos que rejuvenecen o regeneran los centros germinales en tejidos linfáticos según la presente invención incluyen los activadores inmunitarios, moléculas coestimulantes, adyuvantes inmunitarios y combinaciones de estos.

En una modalidad de la presente invención, los centros germinales en los tejidos linfáticos son regenerados por la administración de adyuvantes. Los ejemplos de tales adyuvantes incluyen patrones moleculares asociados a patógenos, liposomas, lipopolisacáridos, jaulas moleculares para antígeno, componentes de paredes celulares bacterianas, ácidos nucleicos endocitosados, tales como ARN de cadena doble (ARNdc), ADN de cadena simple (ADNcs) y ADN que contiene dinucleótidos CpG no metilados, sales minerales tales como hidróxido de aluminio (alum), fosfato de aluminio, fosfato de calcio, hidróxido de aluminio, fosfato de potasio y aluminio, fosfato de hidrógeno, sodio y aluminio, y sulfato de hidroxifosfato de aluminio. Otros adyuvantes incluyen emulsiones de aceite en agua, tales como el escualeno, montanide ISA720 (escualeno) o ISA 51 (Drakeol), MF59 (Novartis) y SBAS2. Otra clase adyuvante que puede utilizarse según la presente invención son los adyuvantes particulados, tales como los virosomas, saponinas y lípidos, incluyendo los derivados microbianos, tales como los motivos CpG del lípido A monofosforilo, inmunidad estimulada por BCG llamada BCG-CWS (Mycobacterium bovis) .

Liposacáridos y mitógenos tales como Concanavalin A., componentes de las paredes celulares bacterianas, arqueosomas (glicerolípidos de éter de la arequeobacteria Methanobrevibacter smithii), el agonista de TLR4 GLA, adyuvante lipídico glucopiranosil LPS y BCG (Immune Design), los agonistas de TLR2 BCG, péptidoglicano, y bacterias gram positivas, el agonista de TLR5, flagelina, los antígenos de los huevos de schistosoma (SEA) y monocitogenes de listeria (LM). Otros adyuvantes incluyen agonistas y activadores del receptor tipo Toll que incluyen oligonucleótidos CpG de longitudes de hasta 100 bases, más preferentemente de longitudes de 20 bases, agonistas de TLR1 , tales como Pam3Cys, agonistas de TLR2, tales como Pam3Cys; agonistas de TLR3, tales como ARNdc y poli l:C, agonistas de TLR7, tales como los imidazoquinolenos, por ejemplo, Imiquimod (R-839) y Resiquimod (R-848), agonistas de TLR8, tales como Resiquimod (R-848); y agonistas de TLR9, tales como poli l:C y CpG. También están incluidos en la presente invención el uso de adyuvantes derivados de plantas, beta-glucano, QS21 basado en saponina y concanavalina A.

Otra modalidad de la presente invención está compuesta por métodos para aumentar la cantidad de centros germinales activos en el bazo para mejorar el prendimiento de los trasplantes de células madre y la recuperación hematológica en pacientes sometidos a terapia para el cáncer, terapia no mieloablativa o terapia mieloablativa, incluyendo la quimioterapia, radiación y tratamientos combinados. El aumento en la cantidad de centros germinales activos lleva a una mejora en la unión y prendimiento de las células madre en el bazo y, como consecuencia, a una recuperación hematopoyética más rápida luego de regímenes de acondicionamiento quimioterapéutico y tratamientos para el cáncer. Además del tratamiento del cáncer y leucemias, la terapia no mieloablativa se utiliza para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias (Pediatr Clin North Am. 57(1):239-71 , 2010), incluyendo la diabetes de tipo I (JAMA. 297(14):1568-1576, 2007), lupus y esclerosis múltiple (www.clinicaltrials.gov). La presente invención proporciona métodos para mejorar la recuperación hematopoyética en pacientes con cáncer o con enfermedades autoinmunitarias sometidos a acondicionamiento mieloablativo o no mieloablativo mediante el aumento de la cantidad de centros germinales esplénicos y, de esta manera, aumentar la unión, prendimiento y proliferación de células madre trasplantadas. Por ejemplo, los pacientes sometidos a tratamiento con células madre luego de regímenes de acondicionamiento mieloablativos o no mieloablativos corren riesgo de infección y muerte durante el tiempo que se requiere para el prendimiento del injerto de células madre administradas y la regeneración hematopoyética. La aceleración y el aumento del prendimiento del injerto de células madre mediante el aumento de la cantidad de centros germinales disponibles para la unión de células madre en el bazo puede reducir el tiempo que se requiere para la recuperación hematopoyética y, por lo tanto, disminuir el riesgo de infección y muerte en estos pacientes.

Las células madre pueden ser autólogas o de un donante no relacionado. Las células madre pueden estar contenidas dentro de la fracción de células mononucleares de la médula ósea, sangre completa, sangre del cordón umbilical, tejido adiposo u otras fuentes, o pueden ser purificadas por la selección de CD34, CD133, CD105, CD117, SSEA1-4, tinción por exclusión u otros antígenos de células madre específicos.

Los centros germinales esplénicos pueden aumentarse de manera específica mediante tratamientos que activan el receptor de CD40 (Blood.104:4088-4096, 2004; J. Clin. Invest. 112:1506-1520 2003) (50) (51). El receptor funcional es un trímero o multímero de CD40 con componentes de TNFR1 o TNFR2. Los ejemplos de tratamientos que activan el receptor de CD40 incluyen: Los anticuerpos agonistas de CD40 activan el receptor de CD40, las conformaciones adecuadas de solCD40L pueden activar el receptor de CD40, y los agentes que aumentan la expresión del receptor de CD40 mediante la alteración de los índices de transcripción tal como mediante el factor de transcripción AT-hook AKNA, la estabilidad de ARNm o estabilidad proteica también puede producir una actividad y señalización aumentadas. De manera alternativa, los miembros de las familias TRAF y TTRAP interactúan con el receptor de CD40 y median su señalización, produciendo una mejora en la cantidad de centros germinales activos. Los agentes que activan la ciclo-oxigenasa 2 de células B del centro germinal activo o del receptor EP2, replican la unión del receptor de CD40 y puede llevar a mejorar la formación de centros germinales activos. Otros medios para activar la formación y persistencia de centros germinales incluyen la inhibición o pérdida de CCR7 (J. Leukoc.Biol. 85: 409-417, 2009). Otros medios para activar la formación y persistencia de centros germinales incluyen la inhibición o pérdida de CCR7 (J. Leukoc.Biol. 85: 409-417, 2009).

Otra modalidad de la presente invención está compuesta por la administración de moléculas inmunoestimulantes que fomenten la regeneración de los centros germinales en el tejido linfático. Las moléculas inmunoestimulantes pueden ser anticuerpos, proteínas de fusión, ligandos solubles, moléculas pequeñas, reguladores de la transcripción, estabilizadores proteicos o de ARNm y otros restos inmunoestimulantes. Por ejemplo, la vía coestimulante de CD28 puede ser activada por proteínas B7 solubles y un anticuerpo tal como con el compuesto 1412 de TeGenero.

TGN1412 es un anticuerpo monoclonal humanizado diseñado como un agonista del receptor de CD28 en linfocitos T, que estimula la producción y activación de linfocitos T. Boerhinger Ingelheim elaboró el TGN1412.

Las moléculas y vías coestimulantes adicionales incluyen el ligando OX40/OX40, el ligando 4-1 BB/4-1 BB, la familia B7/CD28; B7-1/CD80, CD28, B7-2/CD86, CTLA-4, B7-H1/PD-L1 , ICOS, B7-H2, PD-1 , B7-H3, PD-L2/B7-DC, B7-H4, PDCD6, BTLA, la superfamilia TNF de moléculas coestimulantes; 4-1 BB/TNFRSF9/CD137, ligando 4-1 BB /TNFSF9, BAFF/BLyS/TNFSF13B, BAFF R TNFRSF13C, CD27/TNFRSF7, el ligando CD27/TNFSF7, CD30/TNFRSF8, el ligando CD30 TNFSF8, CD40/TNFRSF5, el ligando CD40/TNFSF5, GITR/TNFRSF18, ligando GITR/TNFSF18, HVE /TNFRSF14, LIGHT/TNFSF14, OX40 TNFRSF4, ligando OX40 TNFSF4 y TACI/TNFRSF13B, la familia SLAM; 2B4/CD244/SLAMF4, BLAME/SLAMF8, CD2, CD2F-10/SLAMF9, CD48/SLAMF2, CD58/LFA-3, CD84/SLAMF5, CD229/SLAMF3, CRACC/SLAMF7, NTB-A SLAMF6 y SLAM/CD150 y otras moléculas coestimulantes; CD2, CD53, CD82/Kai-1 , CD90/Thy1 , CD96, CD160, Ikaros, alfa integrina 4/CD49d, alfa integrina 4 beta 1 , alfa integrina 4 beta 7/LPAM-1 , LAG-3, LMIR1/CD300A, CRTAM, DAP12, Dectin-1/CLEC7A, DPPIV/CD26, EphB6, TCL1A, TIM-1/KIM-1/HAVCR, TIM-4, TSLP, TSLP R, HLA-DR y efrinas.

Otros agentes que pueden mejorar la regeneración de los centros germinales son agentes que se conoce que causan la explosión de citoquinas, como el Anti-CD20 (Rituximab).

Otros agentes que activan la inmunidad pueden incluir agonistas del receptor de IL21 , con anticuerpos agonistas.

Otros adyuvantes utilizados preclínicamente o clínicamente incluyen: Los ácidos nucleicos endocitosados como el ARN de doble cadena (ARNdc), el ADN de cadena simple (ADNcs) y el ADN que contiene dinucleotidos CpG no meti lados.

Los adenovirus y componentes de adenovirus, tales como los adenovirus de tipo 5 (Ad5).

Los agonistas y activadores de los receptores tipo el gen inducible por ácido retinoico (RIG)-1 (RLR).

Activadores o agonistas de P2X1 , P2X4, o P2X7.

Agonistas y activadores de receptores tipo el dominio de oligomerización unido a nucleótidos (NLR).

Advx, liposomas, microesferas de quitosano y bromuro de amonio dimetil-dioctildecilo (DDA).

La mayoría de los adyuvantes humanos más nuevos en desarrollo son ISCOMS, QS21 , AS02 y AS04.

AS04 es un lípido monofosforilo desacilado A MPL más aluminio.

Los oligonucleótidos CpG pueden ser de longitudes hasta las 100 bases, más preferentemente de longitudes de 20 bases.

OKT3 Anti-CD3 puede también administrarse por vía intravenosa (iv) para inducir la regeneración de células germinales dentro de los tejidos linfáticos.

La presente invención también está compuesta por la administración de dos o más agentes terapéuticos para generar centros germinales dentro de los tejidos linfáticos. En otra modalidad de la presente invención, las células madre se administran en conjunción con el agente terapéutico que regenera los centros germinales.

Dosificación de adyuvantes El fosfato de potasio y aluminio puede ser administrado en una dosis de alrededor de 0.17 mgs.

El fosfato de aluminio puede ser administrado en una dosis de alrededor de 1.5 mgs.

El hidróxido de aluminio puede ser administrado en una dosis de alrededor de 0.15 mgs a alrededor de 0.3 mgs. Las sales de aluminio por lo general pueden ser administradas en dosis tan altas como 0.85 mgs.

El hidroxifosfato de aluminio puede ser administrado en una dosis de alrededor de 0.225 mgs.

Como combinación, el hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio pueden administrarse en una dosis combinada de alrededor de 0.45 mgs.

Dosificación de emulsiones de aceite SBAS-2 es una emulsión de aceite en agua de MPL y QS21.

Las emulsiones de aceite en agua tales como montanide ISA720 (escualeno) o ISA 51 (Drakeol).

El escualeno es un adyuvante MF59 utilizado por Novartis y dosificado al 1.95% o dos partes por cien o a 4 gramos por 100 mis para una inyección de 0.5 a 1 mi para una actividad adyuvante.

El adyuvante MF59 contiene (Lipovant; 4-5% p/v escualeno, 0.5% p/v Tween 80, 0.5% Span 85, y opcionalmente, cantidades variables de muramiio; tripéptido fosfatidil-etanolamina (MTP-PE), que activa los receptores sensores no TLR (conocidos como NOD-LRR).

Dosificación de derivados microbianos 1 a 8 X 108 unidades formadoras de colonias de inmunidad estimulada por BCG llamada BCG-CWS (Mycobacterium bovis) por vial para adultos, la mitad de esta dosis para los niños.

Los arqueosomas (glicerolípidos de éter de la arqueobacteria Methanobrevibacter smithii) se dosifican en 0.1 a 500 microgramos por gramo de corporal y más preferentemente a 38 microgramos por mg de peso corporal.

Dosificación de agonistas y activadores de receptores tipo Toll Los oligonucleótidos CpG de longitudes de hasta 100 bases, más preferentemente de longitudes de 20 bases, dosificados en 1 , 10, 100, 500 microgramos por 20-25 gramos de peso corporal. La dosis preferida es de 10 µg por 20-25 mgs de peso corporal.

La vía coestimulante de CD28 puede ser activada por proteínas B7 solubles y un anticuerpo tal como con el compuesto 1412 de TeGenero. TGN1412 es un anticuerpo monoclonal humanizado diseñado como un agonista del receptor de CD28 en linfocitos T, que estimula la producción y activación de linfocitos T. Boerhinger Ingelheim elaboró el TGN1412. A los efectos de la activación inmunitaria para regenerar los centros germinales linfáticos, una dosis preferida de TGN1412 sería menor de 0.1 mg/kg de peso corporal administrada en una infusión de 3-6 minutos. Las dosis eficaces de TGN1412 para la regeneración de centros germinales serían de entre 0.001 mgs/kg a 0.1 mg/kg, preferentemente de 0.01 mgs/kg.

Otros agentes que pueden mejorar la regeneración de centros germinales son agentes que se conoce que causan la explosión de citoquinas, tales como el anti-CD20 (Rituximab), dosificado en 50 mg/mm2 o 150 mg/mm2 pero por debajo de 375 mg/mm2; el OKT3 Anti-CD3 administrado por vía intravenosa (i.v.) en una dosis preferida de menos de 5 mg/día durante 10 a 14 días; los anticuerpos anti-CD52 (CAMPATH) administrados a 30 mgs en una infusión de 2 horas, proporcionada tres veces por semana durante hasta 12 semanas.

Los agentes adicionales que activan la inmunidad pueden incluir agonistas del receptor de IL21 , con anticuerpos agonistas dosificados entre 0.001 mgs/kg y 50 mgs/kg, preferentemente entre 0.01 y 0.1 mgs/kg. Los agonistas de ligandos proteicos pueden dosificarse diariamente entre 0.0001 mgs/kg hasta 50 mgs/kg por hasta 28 días después de los tratamientos mieloablativos o no mieloablativos. Los agonistas de ligandos proteicos en general serán útiles a 1/10 de la dosis de un anticuerpo terapéutico dependiendo del peso molecular y la biodistribución del agonista.

Los activadores inmunitarios de moléculas pequeñas pueden ser administrados oralmente entre 1 mg y 1000 mgs diariamente, en una dosis oral simple, o a intervalos específicos que pueden incluir cada 2 horas, cada 4-6 horas o períodos de intervalo más largos.

AS04 es el lípido A monofosforilo desacilado MPL más aluminio dosificado a 50 microgramos en una dosis de 0.5 mi de Fendrix (GSK) en combinación con 0.5 mgs de fosfato de aluminio.

Los oligonucleótidos CpG de longitudes de hasta 100 bases, más preferentemente de longitudes de 20 bases, dosificados en 1 , 10, 100, 500 microgramos por 20-25 gramos de peso corporal más alum. La dosis preferida es de 10 g por 20-25 mgs de peso corporal.

Administración La administración de los agentes terapéuticos que inducen la regeneración de centros germinales dentro de los tejidos linfáticos puede ser mediante cualquier método incluyendo la vía intravenosa, intra-arterial, oral, intramuscular, en aerosol, inhalable, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intrapericárdica, intraocular, transvascular, trasendocárdica, transepicárdica, transeptal, epicárdica, mediante la vena transcoronaria, mediante revascularización de transmiocardio percutánea, intratecal, intraorgánlca, intranasal, intraventricular o intraepidural por medio de aguja, catéter u otro método mínimamente invasivo.

Los ejemplos a continuación ilustran los resultados experimentales de métodos y composiciones para regular o moderar la cantidad de sitios de unión disponibles para participar en la unión de células madre.

Ejemplo 1 Las fracciones mononucleares de sangre entera y la médula ósea enriquecidas con células madre se unen a regiones de células B en los bordes de la pulpa blanca del bazo cuando se administran a un ratón aloqeneico Las fracciones de células mononucleares de sangre entera y la médula ósea de un ratón macho 129S1/SvlmJ se aislaron usando Histopaque y se combinaron. Las células se incubaron a 37°C, C02 al 5% durante 4 días para permitir que las células somáticas diferenciadas murieran, concentrando de esta manera la fracción de células madre entre las células mononucleares. Las células resultantes se etiquetaron luego con naranja celltracker (CTO Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Aproximadamente 10 millones de células etiquetadas se administraron por inyección retro-orbital a un miembro receptor de la carnada, y 90 minutos después el ratón se desangró y se tomó sangre de este, la vasculatura se limpió de glóbulos rojos y el bazo se cosechó. El bazo se fijó durante la noche en PFA al 1% y luego se colocó en una agarosa de punto de fusión bajo y de baja temperatura gelificante y se seccionó a 200 micrones de grosor por sección. La unión de las células madre MNC al bazo se visualizó usando inmunofluorescencia. La fracción marcada de células madre que contiene MNC se unió a las regiones de células B en los bordes en la pulpa blanca del bazo. El examen ¡nmunofluorescente de la fracción MNC de la sangre completa tomada durante las extracciones de sangre demostraron que aproximadamente 40,000 de las 10 millones de las células etiquetadas inyectadas seguían hallándose en la circulación 90 minutos luego de la inyección.

Resultados y conclusiones: Las células MNC enriquecidas con células madre marcadas con CTO se unieron a la periferia de la región de la pulpa blanca. La unión de las células es histológicamente evidente en las regiones de células B. Esto demuestra que las fracciones mononucleares de sangre entera y la medula ósea enriquecidas con células madre se unen a regiones de células B en los bordes de la pulpa blanca del bazo cuando se administran a un ratón alogeneico.

Ejemplo 2 Células de CD34+. CD105+ v CD1 17+ purificadas se unen a la misma región esplénica que las fracciones que contienen células madre MNC marcadas.

Las fracciones de células mononucleares de sangre completa y, la médula ósea de un ratón macho se aislaron usando Histopaque y se combinaron. Las células MNC marcadas con verde celltracker (CTG, Invitrogen) se incubaron luego con anticuerpos marcados con biotina contra CD34, ckit y CD105 y se purificaron utilizando columnas de separación magnética Miltenyi según las recomendaciones del fabricante. Una porción de las MNC asiladas se marcó por separado con CTO. Un millón de MNC marcadas con CTO se incubaron conjuntamente con 205,000 células madre purificadas marcadas con CTG en secciones de bazo frescas con un grosor de 100-200 micrones durante 12-18 horas a 4o C. Las secciones del bazo se lavaron detalladamente para eliminar las células no unidas, se fijaron por una hora en PFA al 1% y luego se colocaron en preparados húmedos para realizar la imagenología de fluorescencia. Se utilizó software MetaMorph para capturar y superponer la unión roja (MNC) y verde (célula madre) resultante.

Resultados y conclusiones: la población de células madre purificadas se unió a la misma región esplénica que las fracciones MNC. Esto indica que las células madre purificadas de CD34+, CD105+ y CD1 17+ se unen a la misma región esplénica que las fracciones que contienen células madre MNC marcadas.

Ejemplo 3 Las células madre fraccionadas mononucleares de sangre completa y médula ósea se unen a áreas positivas de PNA en los centros germinales en el bazo.

Se aislan células mononucleares (MNC) de sangre completa y médula ósea de ratones adultos utilizando Histopaque. Las células mononucleares resultantes se manchan con tintes rastreadoras de células, tales como naranja, verde o azul CelITracker, Dil o naranja o azul de calceína según las recomendaciones del fabricante. PNA marcado con FITC (10 ugs), IgD (10 µgs) o anti-CD21 (10 gs) se utilizaron para identificar regiones de células B específicas en la pulpa blanca del bazo. PNA marca los centros germinales, IgD marca las zonas foliculares y anti-CD21 marca las zonas marginales y del manto. Anti-CD3 (200 ng a 1 µg) marcado con FITC se utiliza para identificar las regiones de las células T en la pulpa blanca del bazo. Luego de un lavado exhaustivo, las células y anticuerpos unidos se fijan en las secciones del bazo utilizando PFA al 1% durante 1 hora a 4°C. Se observaron secciones en preparados húmedos y se tomaron fotos usando software MetaMorph.

Resultados y conclusiones: Las MNC marcadas con CTO se unieron luego de una incubación de 15 horas a 4°C a los centros germinales PNA+ activos. Se observó que la unión de las MNC marcadas con CTO se co-localizó con IgD o anti-CD21. Esto indica que las células madre fraccionadas mononucleares de sangre completa y de la médula ósea se unen a áreas positivas para PNA, negativas para IgD, negativas para CD21 , en los centros germinales en el bazo.

Ejemplo 4 Células madre de CD34+. CD105+. CD117+ aisladas de fracciones de células mononucleares de sangre completa y de la médula ósea se unen a centros germinales PNA+ de la pulpa blanca del bazo.

Se combinaron fracciones de células mononucleares de sangre completa y médula ósea de ratón marcadas con CTO, y luego se incubaron con anticuerpos anti-CD34, anti-CD117 y anti-CD105 biotinilados y luego las células unidas a los anticuerpos se aislaron utilizando columnas de separación celular magnéticas Miltenyi según las instrucciones del fabricante. Las cantidades de células madre de CD34+ CD105+ CD117+ recuperadas fueron de 0.3% a 3% de la fracción de MNC de partida.

Las células de CD34+ CD105+ CD117+ resultantes se incubaron en conjunto durante 15 horas con 10 pgs de PNA en secciones de bazo de ratón frescas. Se agregaron células seleccionadas de manera positiva a 100,000 células por sección de bazo (A), 50,000 (B), 25,000 (C), o 10,000 (D) células por sección de bazo. De manera similar a las incubaciones de MNC, las células madre purificadas se unieron a los centros germinales positivos de PNA de la pulpa blanca del bazo. Las células madre se unieron de una manera que dependió de la concentración. Las células se unen a nichos separados en los centros germinales, y las cantidades de células agregadas mayores a aproximadamente 100,000 resultan en una señal de unión más fuerte más que en la expansión a nichos adicionales (ver ejemplo 2).

Resultados y conclusiones- Estos resultados indican que las células madre de CD34+, CD105+, CD1 17+ aisladas de fracciones de células mononucleares de la médula ósea y de sangre completa se unen a centros germinales PNA+ de la pulpa blanca del bazo.

Ejemplo 5 La unión de células madre en la fracción MNC está bloqueada por el anticuerpo anti-CD45.

La unión de células madre y MNC a las secciones del bazo se ve bloqueada por un anti-CD445 anti-ratón lgG2b monoclonal de rata (800 nanogramos a 4 microgramos), pero no por anticuerpos anti-CD45R(10 microgramos) o anti-CD3 (1 microgramo). El anticuerpo anti-CD45 anti-ratón de rata, 30-F1 1 , (Santa Cruz Biotechnology) o el anticuerpo anti-CD3, 17A2 (Santa Cruz Biotechnology) se diluyó a 1 :50 o 1 :10 y se incubó en conjunto con 250,000 MNC marcadas con CTO durante 1 hora. La unión de MNC se contó visualmente como el número de nichos de unión y el tamaño de los nichos. Las secciones frescas del bazo de control de CTO-MNC tenían entre 3-6 nichos de unión a MNC de tamaño medio a grande por sección. El anticuerpo anti-CD3 no tuvo ningún impacto en la cantidad o el tamaño de los nichos de unión a MNC. El anticuerpo anti-CD45, 30-F11 a una dilución de 1 :50 redujo tanto la cantidad como el tamaño de los nichos de unión a MNC a la mitad. El anticuerpo anti-CD45, 30-F11 , a una dilución de 1 :10 abolió por completo la unión de CTO-MNC a secciones de bazo frescas.

En otro experimento, MNC marcadas se incubaron en secciones del bazo durante una hora en presencia del anti-CD45, 30-F1 1 (4 microgramos) o el anti-CD3 PC3/188A (1 microgramo). (Santa Cruz Biotechnology).

En otro experimento, MNC marcadas con naranja celltracker (CTO) se incubaron durante 15 horas a 4°C con anticuerpos para CD45R o 30-F1 1 anti-CD45. El anticuerpo para CD45R (Miltenyi Biotec) diluido a 1 :10 (5 gs) no bloqueó la unión de CTO-MNC a secciones de bazo de ratón frescas. En contraste, el anticuerpo anti-CD45, 30-F11 , (Santa Cruz) a 1 :10 (4 µgs) redujo la unión de MNC marcadas con CTO a secciones del bazo frescas. CD45R se une a las células B de la zona folicular pero no a los centros germinales activos.

Una incubación a 1 :10 en conjunto con el anti-CD45 30F-11 redujo la unión de las MNC marcadas con CTO a la sección de bazo fresca en aproximadamente un 75%.

Resultados y conclusiones: Estos datos indican que la unión de células madre en la fracción de MNC al bazo se ve bloqueada por el anticuerpo anti-CD45.

Ejemplo 6 El epítopo CD45 se une al anticuerpo anti-CD45 anti-ratón lgG2b de rata 30- F1 1. 30-F1 1 se une a todas las isoformas del CD45 de ratón.

La unión exacta del epítopo 30-F11 nunca se ha mapeado. Se generó 30-F1 1 mediante la inmunización con bazo de ratón y células de timo. El dominio extracelular de la isoforma 1 del CD45 de ratón está compuesto por los aminoácidos del 24 a 564. A la isoforma 2 le faltan los aminoácidos 31 a 73, mientras que a la isoforma 3 le faltan los aminoácidos 31 a 169. Como está constatado que 30-F11 se une a todas las isoformas del CD45 de ratón, el epítopo de unión, por lo tanto, debería estar entre los aminoácidos 170 a 564 en la isoforma 1. Las regiones antigénicas de las proteínas pueden predecirse usando los algoritmos de hidrofobicidad (Kyte Doolittle) y de accesibilidad hallados en el sitio web de SwisProt. Es bastante probable que las regiones antigénicas se encuentren en áreas de baja hidrofobicidad y alta accesibilidad. Los residuos de aminoácidos cerca de 501 al 521 en la secuencia humana tienen una predicción de baja hidrofobicidad, lo que indica que esta área de la proteína es un sitio antigénico potencial. Esta región también se conserva bastante bien de ratón a humano. (Véase Okumura M., et ál. 1996 August 15; 157(4): 1569-75).

Ejemplo 7 Los adyuvantes inmunitarios mejoran la formación de centros germinales y aumentan la unión de fracciones de células madre mononucleares al bazo Los centros germinales activos se obtuvieron en ratones normales mediante la inmunización intencional usando el adyuvante incompleto de Freund o Ribi. A los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal (IP) 0.5 mis de adyuvante incompleto de Freund (FIA) mezclado a 1 :1 con PBS o con 0.5 mis de adyuvante de Ribi en el día 0. En el día 7 o el día 14 luego de la inmunización, los ratones se trataron con heparina con 100 U de heparina intraperitoneal durante 30 minutos antes de la anestesia de avertina. Los ratones se desangraron por sangrado ocular retroorbital, obteniendo un total de 1.5 a 1.8 mis de sangre completa agregada a 200 µ? 5U/ml de heparina en un tubo cónico de 15 mi. Luego, la aorta abdominal y la vena cava se cortaron y la sangre restante se drenó toda la sangre del sistema vascular mediante infusión de introducción lenta de 10 mis 5U/mL de heparina mediante la vena cava torácica ascendente. El bazo se quitó y se colocó en los medios de cultivo y posteriormente se colocó en agarosa suave y se seccionó para obtener secciones uniformes de 200 micrones de grosor. La médula ósea del fémur y el esternón se quitó de los huesos con solución salina tamponada de Hanks y se aislaron fracciones de células madre mononucleares, tanto para la sangre completa como la médula usando Histopaque y se combinaron. Se utilizó PNA marcado con FITC (10 Mgs) para identificar los centros germinales en la sección del bazo mediante incubación a 4 °C durante la noche. Luego de la incubación durante la noche con PNA, sin lavado, se agregaron fracciones de célula madre mononucleares marcadas con CTO a las secciones durante 1 hora a 4 °C. Luego de un lavado exhaustivo, las células unidas y el PNA marcado se fijan en las secciones del bazo utilizando PFA al 1% durante 1 hora a 4°C. Se observó la fluorescencia en secciones en preparados húmedos y se tomaron fotos usando software MetaMorph.

La unión de PNA 7 días luego de la inmunización fue similar en' los ratones tratados con FIA y RIBI, ambos casi doblaron la unión de los controles. Sin embargo, los ratones tratados con FIA estaban más saludables que los ratones tratados con RIBI, de manera que todos los experimentos posteriores se realizaron con FIA. Si se compara el día 7 con el día 14 luego del tratamiento con FIA, el brillo del PNA era mayor en el día 7, sin embargo, en el día 14 los centros germinales activos parecieron estar más organizados y compactos. En comparación con el control, la inmunización con FIA duplica el número de centros germinales activos en los bazos de los ratones. La adición de fracciones de células madre mononucleares marcados con CTO, aisladas de los ratones de control, a los bazos demostró que la formación de centros germinales activos mejorada observada en los ratones tratados con FIA asimismo resultó en una unión de las células madre mononucleares a los bazos significativamente mayor. La unión de células madre mononucleares en el día 7 se vio aumentada aproximadamente 3-5 veces sobre la unión a los bazos de control, mientras que la unión de las fracciones de células madre mononucleares se aumentó hasta, y en algunos casos fue mayor que, 10 veces más que la unión a los bazos de control.

Resultados y conclusiones: Estos datos indican que los adyuvantes inmunitarios mejoran la formación de centros germinales y aumentan la unión de fracciones de células madre mononucleares al bazo.

Ejemplo 8 La inhibición de la formación de centros germinales activos reduce la unión de células madre ex vivo al bazo.

Se trataron ratones con 1 mg de dexametasona solubilizada en etanol (1 parte) y PBS (9 partes) mediante inyección intraperitoneal 7 días antes de la cosecha de su bazo y células madre para el análisis ex vivo de la unión de células madre a secciones esplénicas. Los ratones de control se trataron con etanol (1 parte) y PBS (9 partes) solo, en un volumen total de 1 mi. En el día 7, los ratones se cosecharon y procesaron como se detalló en el Ejemplo 7. Las fracciones de células madre mononucleares de los ratones de control se utilizaron para los estudios de unión de las secciones del bazo tanto de control como las tratadas con dexametasona. La unión de las células madre mononucleares en el día 7 se redujo en un 30-40% luego de un tratamiento único con 1 mg de dexametasona administrado 7 días antes de la experimentación.

Un tratamiento único con 1 mg de dexametasona 7 días antes de la cosecha redujo los pesos del bazo en un promedio de 22%, redujo el promedio de la cantidad de MNC circulantes en un 34% y redujo los centros germinales marcados con PNA en hasta un 24%, sin embargo, el porcentaje de células madre dentro de las fracciones de MNC de la sangre completa o la médula ósea no se redujo y, de hecho, aumentó en un promedio del 32% en comparación con el control.

Resultados y conclusiones: Estos datos indican que los inmunosupresores reducen la cantidad de células que se unen a fracciones de células mononucleares en los bazos de los ratones tratados.

Ejemplo 9 La inhibición de la formación de centros germinales activos reduce la unión de células madre in vivo al bazo.

Un ratón de control que no había sido sometido a tratamiento se trató con 100 U de heparina intraperitoneal durante 30 minutos antes de la anestesia de!avertina. El ratón se desangró por sangrado ocular retroorbital, obteniendo un total de 1.5 a 1.8 mis de sangre completa agregada a 200 µ? 5U/ml de heparina en un tubo cónico de 15 mi. Luego, la aorta abdominal y la vena cava se cortaron y se drenó toda la sangre restante del sistema vascular mediante inyección de introducción lenta de 10 mis 5U/mL de heparina mediante la vena cava torácica ascendente. La médula ósea del fémur y el esternón se quitó de los huesos con solución salina tamponada de Hanks y se aislaron fracciones de células madre mononucleares tanto para la sangre completa como la médula usando Histopaque y se combinaron. Las fracciones de células madre mononucleares se volvieron a suspender en medios de cultivo (DME más FBS al 10%) y se incubaron a 37 grados C con C02 al 5% durante la noche. A la mañana siguiente, las células madre mononucleares se marcaron con verde celltracker (CTG) según la instrucción del fabricante.

Inmediatamente después de teñir las células madre mononucleares de control que no habían sido sometidas a tratamiento (MNC) con CTG, a cada ratón receptor se le inyectó CTG MNC aproximadamente 6M en 100 uls mediante el seno retroorbital en el día 7. Cinco ratones de control habían recibido inyecciones intraperitoneales de 100 uls de etanol y 900 uls de PBS en el día 0 y el día 4; 3 ratones habían sido tratados ip con 1 mg de dexametasona en el día 0 y el día 4; y dos ratones habían sido tratados ip con 1 mg de dexametasona en el día 0, el día 2 y el día 5. Una hora después los ratones se desangraron por medio de sangrado ocular retroorbital. Luego, la aorta abdominal y la vena cava se cortaron y se drenó toda la sangre restante del sistema vascular mediante inyección de introducción lenta de 10 mis 5U/mL de heparina mediante la vena cava torácica ascendente. Los bazos se tomaron y se mantuvieron en hielo en RPMI sin rojo de fenol más BSA al 1%. La médula ósea del fémur y el esternón se quitó de los huesos con solución salina tamponada de Hanks y se aislaron fracciones de células madre mononucleares tanto para la sangre completa como la médula usando Histopaque y se combinaron.

Los bazos se desasociaron en suspensiones de célula única y el grado de secuestro de las MNC CTG inyectadas se determinó usando citometría de flujo. La dexametasona (total de 2 mgs) redujo la cantidad de la acumulación total de células MNC CTG en el bazo en un 33-43%, mientras que 3 mgs de dosis total de dexametasona redujo la acumulación total de células MNC CTG en el bazo en aproximadamente un 70%.

Resultados y conclusiones: Estos datos indican que en el día 7 el tratamiento inmunosupresor reduce las cantidades de células madre MNC inyectadas de manera exógena que quedan atrapadas en el bazo.

Ejemplo 10 La inhibición de la formación de centros germinales activos reduce la unión de células madre al bazo.

(Profético) Voluntarios humanos se trataron de manera profiláctica con supresores inmunológicos generales comercialmente disponibles, tales como la prednisona, según protocolos clínicos establecidos, usando dosis elegidas para limitar o evitar completamente todos los efectos secundarios de los agentes. Otro grupo voluntario humano se trata con anticuerpos antagonistas de CD40, tales como mAb anti-CD40 HCD-122 en dosis de entre 5 y 100 mg/kg.

Antes de o en el día final de la supresión inmunológica profiláctica autóloga, las células madre se aislaron en la fracción de células mononucleares de 50 mis de médula ósea de la cresta ilíaca o de productos de la aféresis de sangre completa. La fracción de MNC resultante que contiene las células madre se marcó con 2-[18F]-fluoro-2-desoxi-D-glucosa (18F-FDG) para imagenología 3D -PET posterior o con un marcador de imagenología nuclear adecuado para la imagenología SPECT posterior. Las fracciones que contienen células madre MNC marcadas, con entre 2 y 10 millones de células madre, se inyectan por vía intravenosa y su biodistribucion se determina por imagenología PET o SPECT durante 60-90 minutos y hasta 48 horas luego de la administración. Las células madre entre las MNC se acumulan predominantemente en los bazos de voluntarios normales dentro de los 90 minutos siguientes a la inyección. En contraste, los voluntarios a los que se suprimió la inmunidad y los tratados con HCD-122 tuvieron una acumulación esplénica reducida de fracciones de células madre MNC.

Ejemplo 11 La inhibición o reducción de la formación de centros germinales activos mejora la administración de células madre al corazón v promueve la recuperación funcional en ratones.

(Profético) A ratones PN y 129S1/SvlmJ de 3 meses y 12 meses se les inyectó por vía intravenosa (i.v.; 250 mg/inyección en los días 0, 2 y 4) mAb anti-CD40L (PharMingen) o Ig de hámster de control (Pierce, Rockford, IL). Se recogieron células madre fraccionadas mononucleares de la médula ósea y de sangre completa de ratones de la misma camada, marcadas con tintes rastreadores de células como CTO, y luego las células madre se purificaron usando anticuerpos anti-CD34 biotinilado, anti-CD105, anti-SSEA1 y anti-CD1 17 con columnas de separación magnética Miltenyi. A los ratones del experimento se les inyectó retroorbitalmente o por vía intravenosa entre 100,000 y 1 M de células madre purificadas en el día 5. 15 o 24 horas más tarde, los ratones se desangraron y la sangre se recogió, el sistema vascular se limpió de los glóbulos rojos residuales y los bazos se recogieron para realizar imagenología fluorescente de la acumulación de células madre. La acumulación de células madres es evidente en los centros germinales PNA+ con ratones PN tratados con IG de control, demostrando cantidades significativamente más altas de centros germinales activos y una unión de células madre elevada en consecuencia que en los ratones 129S1. Los ratones 129S1 tratados con mAb anti-CD40L tienen pocos o ningún centro germinal activo evidente y presentan una unión de células madre insignificante o nula. Los ratones PN tratados con mAb anti-CD40L muestran cantidades reducidas de centros germinales activos en comparación con ratones PN tratados con Ig y, consecuentemente, reducciones paralelas en la unión de células madre.

Para estudiar la regeneración cardíaca en estos ratones, a ratones PN y 129S1/SvlmJ de 3 meses y 12 meses se les inyectó por vía intravenosa (i.v.; 250 mg/inyección en los días 0, 2 y 4) mAb anti-CD40L (PharMingen) o Ig de hámster de control (Pierce, Rockford, IL). En el día 4, los ratones se anestesiaron, se llevó a cabo una ecocardiog rafia para determinar los valores iniciales de la función y volumen cardíacos, y luego la arteria coronaria descendente anterior izquierda se ligó de forma permanente por medio de toracotomía al infarto aproximadamente 70% de la pared libre ventricular izquierda.

Se recogieron células madre fraccionadas mononucleares de la médula ósea y de sangre completa de ratones de la misma camada, y luego las células madre se purificaron usando anticuerpos anti-CD34, anti-CD105, anti-SSEA1 y anti-CD117 biotinilados con columnas de separación magnética Miltenyi. A los ratones del experimento se les inyectó retroorbitalmente o por vía intravenosa entre 100,000 y 1 M de células madre purificadas en el día 7, tres días después de la ligación permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda. Se llevó a cabo una ecocardiog rafia en serie en los ratones en el día 14, día 21 y día 28.

Los ratones tratados con Ig de control que no recibieron inyecciones de células madre mostraron un deterioro cardíaco funcional significativo y un aumento en los volúmenes diastólicos finales, los volúmenes sistólicos finales y un aumento del grosor de las pareces no infartadas, con 50-100% de los ratones sucumbiendo a la insuficiencia cardíaca antes del día 28. Los ratones 129S1 tratados con Ig de control que recibieron inyecciones de células madre mostraron una reducción en las muertes por insuficiencia cardíaca y mejoraron sutilmente la función cardíaca en comparación con los que no recibieron inyecciones de células madre. Los ratones PN tratados con Ig de control que recibieron inyecciones de células madre no mostraron una supervivencia o función mejorada en comparación con los ratones1 129S1. En contraste, los ratones 129S1 a los que se les inyectó células madres tratados con mAb anti-CD40L mostraron una mejora significativa en la supervivencia y la función cardíaca en comparación a todos los otros grupos de ratones, mientras que los ratones PN a los que se les inyectó células madres tratados con mAb anti-CD40L presentaron una mejora en la supervivencia y la función cardíaca en comparación con los ratones PN a los que se les inyectó células madre tratados con Ig de control.

Ejemplo 12 La inhibición o reducción de la formación de centros germinales activos mejora la administración de células madre al corazón y promueve la recuperación funcional en humanos (Profético) Para este estudio se eligen pacientes con infarto de miocardio agudo con elevación del segmento ST a los que se los trató con éxito mediante intervención coronaria percutánea con implantación de stent en la fase aguda del infarto. Los pacientes se tratan con el mAb anti-CD40L Replizumab a 5, 10, 20 o 100 mg/kg en el día 1 mediante infusión IV durante 30 minutos. 3 a 15 días después del infarto de miocardio, se recuperaron células mononucleares de 50 mL de la médula ósea aspirada por Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Suecía). El proceso entero, desde la aspiración de la médula ósea hasta el producto final, se llevó a cabo según las buenas prácticas de fabricación.

La función cardíaca se sigue por imágenes de resonancia magnética y los resultados adicionales incluyen la muerte, infarto de miocardio recurrente y la posterior revascularización o hospitalización (supervivencia libre de eventos). En comparación con los pacientes con placebo, los pacientes tratados con células madre tienen históricamente un año de reducciones en los índices de supervivencia libre de eventos del 80% en comparación con el 55-60%. Los pacientes tratados con células madre y anti-CD40L tienen una supervivencia libre de eventos mejorada en comparación con los pacientes que solo fueron tratados con células madre. De manera adicional, los pacientes tratados con células madre anti-CD40L muestran reducciones adicionales en los volúmenes ventriculares en comparación con pacientes a los que solo se trató con células madre y parámetros de eyección cardíaca mejorados.

Ejemplo 13 Identificación y aislamiento del compañero de unión de células madre fraccionadas mononucleares en bazo de ratón Las fracciones de células mononucleares de la médula ósea y sangre completa de un ratón macho 129S1/SvlmJ se aislaron usando Histopaque, se combinaron y se etiquetaron con CTO según las instrucciones del fabricante. Los bazos se disociaron en suspensiones de célula única y se marcaron con CTB. Se obtuvieron células madre mediante el cultivo de MNC durante 7 días en medios de cultivo seguido de 7 días en medios de cultivo sin FBS complementado con 120 ng/ml de factor de células madre y 25% de suero de caballo y mediante la cosecha de células no adherentes. Típicamente, hasta un 40% de las células no adherentes expresan CD34, CD105, SSEA1 y/o CD117. Las células madre se marcaron con CTO.

Se incubaron esplenocitos marcados con CTB en una plataforma de oscilación a 37 grados C, C02 al 5% en una relación de 1 :1 (10 millones de esplenocitos marcados con CTB y MNC 10 M en 500 ul de volumen de PBS) con MNC marcadas con CTO o una relación de 100:1 (10 millones de esplenocitos marcados con CTB y 100,000 células madre marcadas con CTO en un volumen de 500 ul de PBS). Se tomaron alícuotas en un citómetro de flujo Beckman Coulter Gallios capturando la fluorescencia FL2 y FL9. La unión de células-células fue aparente como un aumento dependiente del tiempo en las señales co-positivas CTB+CTO+ en el cuadrante superior derecho (UR) del escategrama. El UR de fondo fue de 0.15%. La unión máxima de esplenocitos y células madre fue de 2.6% UR a los 50 minutos y la unión máxima de esplenocitos y MNC fue de 5% UR a los 30 minutos.

Resultados y conclusiones: Estos datos indican que la célula del bazo implicada en la unión de células madre al bazo puede ser identificada y aislada usando citometría de flujo.

Si bien la modalidad preferida de la invención se ha ilustrado y descrito, como se mencionó anteriormente, pueden realizarse varios cambios sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Por consiguiente, el alcance de la invención no está limitado por la descripción de la modalidad preferida. Por el contrario, la invención debería ser determinada en su totalidad por la referencia a las reivindicaciones que siguen.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para inhibir la unión de las células madre al tejido linfoide que comprende: administrar las células madre en conjunción con un agente terapéutico que inhibe la unión de las células madre con dicho tejido linfoide.

2. El método de la reivindicación 1 , donde el tejido linfoide está compuesto por el bazo, las placas de Peyer y los nodos linfáticos.

3. El método de la reivindicación 1 , donde el agente terapéutico inhibe la unión de las células madre a los centros germinales dentro del tejido linfoide.

4. El método de la reivindicación 3, donde los centros germinales están presentes en un tejido linfático seleccionado del grupo que consiste en el bazo, las placas de Peyer y tejido del ganglio linfático.

5. El método de la reivindicación 3, donde el centro germinal está activo.

6. El método de la reivindicación 1 , donde el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en: agentes que interfieren con la síntesis de purinas, los anti-metabolitos, radiación en el bazo, agentes quimioterapéuticos, ¡nmunosupresores, glucocorticoides, agentes anti-beta amiloides, factor anti-rhesus, agentes anti-TNF, anti-eotaxinas, agentes anti receptor de células T (TCR), agentes anti-interferones, agentes anti-interferones alfa, agentes anti-interferones beta, agentes anti-interferones gamma, agentes anti-TGF, agentes anti-TGF alfa, agentes anti-TGF beta, agentes anti- Integrinas, agentes anti-alfa 4, agentes anti-lnterleucina, agentes anti-lnterleucina 1 , agentes anti-lnterleucina 2, agentes anti-lnterleucina 4, agentes anti-lnterleucina 5, agentes anti-lnterleucina 6, agentes anti-lnterleucina 12, agentes anti-lnterleucina 13, agentes anti-lnterleucina 23, agentes anti-lgE, agentes anti-proteína de adhesión vascular (VAP), agentes anti-B7, agentes anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), agentes anti-BAFF (BLyS), agentes anti-CTLA4, agentes anti-complemento, agentes anti-CD2, agentes anti-CD3, agentes anti-CD4, agentes anti-CD5, agentes anti-CD20, agentes anti-CD23, agentes anti-CD25a, agentes anti-CD40, agentes anti-CD154 (CD40L), agentes anti-CD62L, agentes anti-CD80, agentes anti-CD147, agentes anti-LFA1 , agentes anti-(CD11 a), agentes anti-CD18, inhibidores de la síntesis de purina, inhibidores de la síntesis de pirimidina, agentes anti-proliferativos, agentes anti-metabolitos, agentes anti-folato y agentes anti-mTOR.

7. El método de la reivindicación 1 , donde los agentes terapéuticos se seleccionan del grupo que consiste en: azatioprina, ácido micofenólico, leflunomida, teriflunomida, metotrexato, tacrolimus, ciclosporina, pimecrolimus, abetimus, gusperimus, talidomida, lenalidomida, anakinra, sirolimus, deforolimus, everolimus, temsirolimus, zotarolimus, biolimus A9, eculizumab, infliximab, adalimumab, certolizumab pegol, afelimomab, golimumab, mepolizumab, omalizumab, nerelimomab, faralimomab, elsilimomab, lebrikizumab, ustekinumab, muromonab-CD3, otelixizumab, teplizumab, visilizumab, clenoliximab, keliximab, zanolimumab, efalizumab, eriizumab, afutuzumab, ocrelizumab, pascolizumab, lumiliximab, teneliximab, toralizumab, aselizumab, galiximab, gavilimomab, ruplizumab, belimumab, ipilimumab, tremelimumab, bertilimumab, lerdelimumab, metelimumab, natalizumab, tocilizumab, odulimomab, basiliximab, daclizumab, inolimomab, zolimomab aritox, átorolimumab, cedelizumab, dorlixizumab, fontolizumab, gantenerumab, gomiliximab, maslimomab, morolimumab, pexelizumab, reslizumab, rovelizumab, siplizumab, talizumab, telimomab aritox, vapaliximab, vepalimomab, abatacept, belatacept, etanercept, pegsunercept, aflibercept, alefacept, rilonacept, inhibidores de linfotoxina alfa y beta, dacetuzumab SGN-40, HCD-12.

8. El método de la reivindicación 1 , donde la unión de las células madre al tejido linfoide está inhibida por la administración de un agente terapéutico que regula por disminución o bloquea a un antígeno CD45.

9. El método de la reivindicación 1 , donde el agente terapéutico es la radiación.

10. El método de la reivindicación 1 , donde las células madre son ya sea células madre endógenas o células madre exógenas.

11. El método de la reivindicación 1 , donde el agente terapéutico es un agente quimioterapéutico.

12. El método de la reivindicación 1 , donde las células madre se administran para tratar una enfermedad seleccionado del grupo que consiste en: neoplasias hematológicas, leucemias, linfomas, cánceres, osteopetrosis, anemia aplásica y citopenias, anemia depranocítica y talasemia, insuficiencia de células madre limbares, cáncer de mama, infarto de miocardio agudo, enfermedad arterial coronaria, enfermedad vascular periférica, insuficiencia cardíaca, diabetes mellitus tipo I, diabetes mellitus tipo 2, apoplejía, lesión de médula espinal, neuroblastoma, esclerosis múltiple, esclerosis sistémica, lupus eritematoso, curación de heridas crónicas, quemaduras, curación de fracturas, reparación de cartílagos, tumores del SNC, osteoartritis, insuficiencia renal, enfermedad de Parkinson, mielomas, pie diabético, cirrosis biliar y hepática, cardiomiopatía dilatada, anemia, retinitis pigmentosa, enfermedad de Crohn, neuropatía diabética, mastocitosis, cáncer de ovario, epilepsia, miastenia grave, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades granulomatosas, osteonecrosis, insuficiencia hepática, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, lipodistrofia, enfermedades diesmilinizantes, defectos cartilaginosos, enfermedades de la retina, nefritis lúpica, enfermedad de Alzheimer, lesión cerebral traumática, sarcoma, miositis, hiperglucemia, degeneración macular, colitis ulcerosa y degeneración muscular.

13. Un método para inhibir la unión de células madre a los tejidos linfáticos en un individuo que comprende inhibir la formación de centros germinales presentes en los tejidos linfáticos o destruir o extirpar los centros germinales en el tejido linfático.

14. El método de la reivindicación 13, donde se le administra al individuo un agente terapéutico que inhibe la formación de células germinales o promueve la destrucción o extirpación de células germinales donde el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en agentes que interfieren con la síntesis de purinas, los anti-metabolitos, radiación, inmunosupresores, glucocorticoides, agentes anti-beta amiloide, factor anti-rhesus, agentes anti-TNF, anti-eotaxinas, agentes anti receptor de células T (TCR), agentes anti-interferones, agentes anti-interferones alfa, agentes anti-interferones beta, agentes anti-interferones gamma, agentes anti-TGF, agentes anti-TGF alfa, agentes anti-TGF beta, agentes anti-lntegrinas, agentes antialfa 4, agentes anti-Interleucina, agentes anti-Interleucina 1 , agentes anti-Interleucina 2, agentes anti-Interleucina 4, agentes anti-Interleucina 5, agentes anti-Interleucina 6, agentes anti-Interleucina 12, agentes anti-Interleucina 13, agentes anti-Interleucina 23, agentes anti-lgE, agentes anti-proteína de adhesión vascular (VAP), agentes anti-B7, agentes anti-factor de crecimiento endoteliaí vascular (VEGF), agentes anti-BAFF (BLyS), agentes anti-CTLA4, agentes anti-complemento, agentes antl-GD2, agentes anti-CD3, agentes anti-CD4, agentes anti-CD5, agentes anti-CD20, agentes anti-CD23, agentes anti-CD25a, agentes anti-CD40, agentes anti-CD154 (CD40L), agentes anti-CD62L, agentes anti-CD80, agentes anti-CD1 7, agentes anti-LFA1 , agentes anti-(CD11a), agentes anti-CD18, inhibidores de la síntesis de purina, inhibidores de la síntesis de pirimidina, agentes anti-proliferativos, agentes anti-metabolitos, agentes anti-folato y agentes anti-mTOR.

15. El método de la reivindicación 13, donde el agente terapéutico es un agente quimioterapéutico.

16. Un método para regenerar los centros germinales en el tejido linfático, donde dichos centros germinales han sido dañados por un agente químico, un agente biológico o por radiación, que comprende administrar uno o más agentes que estimulan la regeneración de los centros germinales.