CN103167870B - 抑制干细胞和祖细胞与淋巴样组织结合和用于使淋巴组织中的生发中心再生的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抑制干细胞与器官和组织结合的组合物和方法，所述抑制包括阻断干细胞与存在于淋巴组织中的生发中心结合。公开了用于使淋巴组织中的生发中心再生的组合物和方法。所述组合物中包含佐剂，CD40、CD28以及IL‑21受体的激动剂，以及CD20的拮抗剂；所述干细胞不是人类胚胎干细胞。

Description

抑制干细胞和祖细胞与淋巴样组织结合和用于使淋巴组织中 的生发中心再生的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年8月18日提交的美国临时专利申请序号61/374,943、2011年2月10日提交的美国临时专利申请序号61/441,485、2011年3月4日提交的美国临时专利申请序号61,449,372的优先权。所有上述申请均在此以引用的方式全部并入本文中。

技术领域

本公开的主题涉及调节干细胞与器官和组织的结合和用于使淋巴组织中的生发中心再生的方法和组合物。

背景技术

再生医学是生成活的功能性组织以修复或代替由于损伤或先天性缺陷而丧失的组织或器官功能的方法。通过刺激先前不可修复的器官自愈，本领域有望使身体内受损伤的组织和器官再生。

用于使组织或器官功能再生的一种方法是将干细胞递送至受影响的器官或组织。然而，即使当干细胞被直接注入损伤的器官的组织，干细胞也不会被很好地保留在用于组织再生的靶标器官中。在人和动物中的成像研究证明了在注射干细胞之后一小时内，在脾脏中可以发现所递送的大部分干细胞。动物研究还证明：在诱发心肌梗塞后、在进行干细胞治疗之前手术去除脾脏改善了损伤的心脏的功能恢复(Blood,第84卷,第5期:1482-1491,1994；NATURE 410:701-705,2001)。还显示脾脏切除术改善了骨髓移植之后在人类患者中的移入(Stem Cells Dev 13(1):51-62,2004；Transplant Proc.28(2):736-7,1996；Am JHematol.22(3):275-83,1986)。然而，脾脏切除术还与手术死亡率、败血症和终身血栓性并发症相关(Blood Rev.14(3):121-129,2000；Leukemia.15(3):465-467,2001；PediatrTransplant 13(2):171-176,2009)。

因此，有必要开发不去除脾脏就可以用于防止干细胞在脾脏和其它淋巴样组织中局部化的方法和组合物。

发明内容

概述

本发明通过提供用于抑制干细胞与淋巴样组织结合的方法和组合物满足了这个需求，所述方法包括连同抑制干细胞与淋巴样组织、特别是淋巴结中的生发中心和脾脏中的生发中心结合的一种或多种治疗剂将干细胞施用至个体。术语‘连同’意指与干细胞处理一起、之前或之后。‘干细胞处理’意指以下行为：将干细胞施用至个体、从个体的内源性干细胞储备中动员干细胞或依靠干细胞从个体的内源性干细胞储备中的自发释放。

例如，用干细胞处理以引起器官再生的患者在干细胞治疗之后已经证明了死亡率降低和功能改善，虽然干细胞处理通常无法使患者恢复至他们的器官损害之前的功能状态。减少干细胞与脾脏和其它淋巴管的结合增加了能够被吸引到所损害的器官的循环干细胞的数目，并且从而增加了通过所述患者的干细胞处理而诱导的功能恢复程度。

在施用抑制干细胞与淋巴组织的结合的治疗剂中，优选在处理之前1-14天、更优选在用干细胞处理或调动干细胞之前3-7天并且最优选3-4天施用治疗剂。在连同从个体的内源性干细胞储备中自发释放的干细胞施用抑制干细胞与淋巴组织结合的治疗剂中，优选在1-60天、更优选1-30天并且最优选1-14天的一段时期内施用治疗剂。

抑制干细胞与淋巴样组织、特别是淋巴样组织的生发中心结合的试剂包括辐射、化学治疗剂、免疫抑制剂以及CD45拮抗剂和CD26拮抗剂。在来自全血或骨髓的单核部分内发现的干细胞或来自全血或骨髓的纯化干细胞与脾脏中的白髓区、更尤其是包括脾脏的淋巴组织的白髓中的生发中心，并且甚至更尤其是脾脏的白髓中的活跃生发中心结合。CD45、特别是30-F11大鼠IgG2b抗小鼠抗CD45单克隆抗体识别的表位的抗体降低干细胞与脾脏中的所鉴别部位的结合，从而使更多干细胞可用于生物分布到所靶向的损害的器官并且增强组织再生和功能恢复。

在本发明的另一个实施方案中，施用减少、破坏或消融淋巴样组织中的活跃生发中心的治疗剂，因此使干细胞与淋巴组织的结合减少。本发明的另一个实施方案描述了减少脾脏中的活跃生发中心的数目以减少干细胞与脾脏的结合，从而增加可用于递送或归属至需要修复的损伤的器官的循环干细胞的数目的方法。抑制免疫应答的试剂可以减少脾脏和其它淋巴组织中的活跃生发中心的数目。免疫调节剂的一般类别包括干扰嘌呤合成的试剂、抗代谢物、辐射、对脾脏的辐射、免疫抑制剂、糖皮质激素、抗β淀粉样试剂、抗恒河猴因子、抗TNF试剂、抗嗜酸细胞活化趋化因子、抗T细胞受体(TCR)试剂、抗干扰素试剂、抗干扰素α试剂、抗干扰素β试剂、抗干扰素γ试剂、抗TGF试剂、抗TGFα试剂、抗TGFβ试剂、抗整联蛋白试剂、抗α4试剂、抗白细胞介素试剂、抗白细胞介素1试剂、抗白细胞介素2试剂、抗白细胞介素4试剂、抗白细胞介素5试剂、抗白细胞介素6试剂、抗白细胞介素12试剂、抗白细胞介素13试剂、抗白细胞介素23试剂、抗IgE试剂、抗血管粘附蛋白(VAP)试剂、抗B7试剂、抗血管内皮生长因子(VEGF)试剂、抗BAFF(BLyS)试剂、抗CTLA4试剂、抗补体试剂、抗CD2试剂、抗CD3试剂、抗CD4试剂、抗CD5试剂、抗CD20试剂、抗CD23试剂、抗CD25a试剂、抗CD40试剂、抗CD154(CD40L)试剂、抗CD62L试剂、抗CD80试剂、抗CD147试剂、抗LFA1试剂、抗(CD11a)试剂、抗CD18试剂、嘌呤合成抑制剂、嘧啶合成抑制剂、抗增殖试剂、抗代谢试剂、抗叶酸试剂以及抗mTOR试剂。

如同触发去氧ATP累积的试剂一般，腺苷脱氨酶缺乏也会导致活跃生发中心的形成减少(J Immunol 171:5562-5570,2003)。类似地，增强CCR7表达或活化CCR7的试剂会导致活跃生发中心的形成减小。

还可以使用化学治疗剂来抑制淋巴样组织的生发中心的形成或破坏或消融生发中心。代表性实例包括烷化剂、抗代谢物、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂、抗肿瘤药以及三氧化二砷。

烷化剂的实例包括顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)，连同奥沙利铂(oxaliplatin)，它们是烷化剂。它们通过与生物学上重要的分子中的氨基、羧基、硫氢基以及磷酸基形成共价键来削弱细胞功能。

抗代谢物的实例是硫唑嘌呤、巯嘌呤、卡培他滨(capecitabine)、氟尿嘧啶—它们成为DNA的结构单元。它们在(细胞周期的)“S”期阻止这些物质并入DNA，从而终止正常的发育和分裂。它们也影响RNA合成。由于它们的有效性，这些药物是使用最广泛的细胞抑制剂。

生物碱包括长春花生物碱和紫杉烷。长春花生物碱包括长春新碱(vincristin)、长春碱(vinblastin)、长春瑞滨(vinorelbine)和长春地辛(vindesine)。紫杉烷包括紫杉醇(taxol)、紫杉酚(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel)。

拓扑异构酶是保持DNA的拓扑结构必需的酶。抑制I型或II型拓扑异构酶通过扰乱正确的DNA超螺旋来干扰DNA转录和复制。一些I型拓扑异构酶抑制剂包括喜树碱(camptothecin)：伊立替康(irinotecan)和拓扑替康(topotecan)。II型抑制剂的实例包括安吖啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷以及替尼泊苷(teniposide)。

抗肿瘤剂包括更生霉素(dactinomycin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)以及博莱霉素(bleomycin)。

定义

用于描述本发明实施方案的定义：

本文中使用的术语激动剂意指活化特异性受体或对介导受体的作用必需的下游信号传导途径的任何实体。激动剂可以包括但不限于抗体、抗体片段、可溶性配体、小分子、环肽、交联剂。

本文中使用的术语拮抗剂意指干扰受体的反结构(counter structure)的结合或干扰特异性受体或对介导受体的作用必需的下游信号传导途径激活的任何实体。拮抗剂可以包括但不限于抗体、抗体片段、可溶性配体、Fc融合受体、嵌合受体、小分子、环肽、肽。

本文中使用的术语抑制剂意指减小特异性配体或其受体的目标作用的任何实体。抑制剂可以是小分子、反义试剂、包括siRNA和微小RNA(microRNA)的核酸。

淋巴组织、淋巴结、脾脏以及生发中心

淋巴组织是淋巴系统中的含有大量淋巴细胞的特化形式的网状结缔组织。这种组织类型组成脾脏、胸腺以及扁桃体，连同内脏结、派伊尔氏淋巴集结(peyer's patches)以及全部与胃肠道粘膜相关的乳糜管。

淋巴结是免疫系统的小球形器官，广泛分布在包括腋窝和胃/内脏的整个身体中并且由淋巴管连接。淋巴结是B细胞、T细胞以及其它免疫细胞的驻地(garrison)。淋巴结遍布全身，并且起外来颗粒的过滤器或截留器的作用。淋巴结由纤维囊围绕，在淋巴结内纤维囊延伸形成小梁。淋巴结本体(substance)分为外皮质和除了在门处全部由前者包围的内髓质，在门中髓质与表面直接接触。外皮质主要由布置为滤泡(follicles)的B细胞组成，当用抗原激发时，滤泡可以发育成生发中心，并且更深处的皮质主要由T细胞组成。有一个称为皮质下区的区，其中T细胞(或主要是红细胞)主要与树突细胞相互作用，并且其中网状网络是密集的。

脾脏是位于腹部左侧、在胃与膈之间的腹膜内器官。这个器官是免疫系统的主要调空部位。它是具有大量动脉血供应的血管器官(vascular organ)。进入脾脏时，血流进入扩张的血管的网状组织或“窦”(位于大量的淋巴细胞之间)中。窦壁中含有能够吞噬血液中的死细胞和外来颗粒并且从全身循环中去除它们的吞噬细胞。类似淋巴结，脾脏是抗体的重要来源，然而，它比淋巴结的程度更大，脾脏通过破坏异常或正常损耗(“死亡”)的红细胞而与将它们从循环中去除有关。

脾脏含有白髓与红髓。脾脏的红髓持有正常地从循环中过滤并且去除衰老或缺陷红细胞(RBC)和被抗体包覆的细菌或红细胞的巨噬细胞。脾脏的白髓含有淋巴样区室(lymphoid compartments)并且对免疫监视和应答是关键的：它合成针对入侵病原体的抗体并且响应于流血或感染而释放血小板和嗜中性粒细胞。认为脾脏在发育期间具有多种作用，包括作为造血的第一部位(在妊娠期第六周时)。虽然长期以来认为脾脏在发育早期骨髓造血接替时丧失了它的造血功能，但是近期的研究已将成人脾脏鉴别为干细胞产生、干细胞分化成不同谱系以及干细胞储存的部位(Trends Mol Med 11(6):271-276,2005)。然而，外源性干细胞在脾脏内累积的部位和外源性干细胞与脾脏结合的分子机制还是未知的。

脾脏白髓的动脉周淋巴样鞘(PALS)主要由T细胞群居，而淋巴部分主要由B细胞群居。生发中心(GC)是在外周淋巴组织中的淋巴结或淋巴小结内和在脾脏的白髓中的部位，其中密集的成熟B淋巴细胞(或者称为中心细胞)快速地增殖、分化、通过体细胞超突变进行突变并且在抗体应答期间进行类别转换(class switch)。生发中心是B细胞体液免疫应答的重要部分。它们在B细胞被T依赖性抗原活化之后动态发育。在组织学上，GC描述了淋巴组织中的显微镜下可分辨的部分。活化的B细胞从初级聚集中心迁移到初级滤泡滤泡系统(primary follicles follicular system)中并且在滤泡树突细胞(FDC)的环境中开始单克隆扩增。

扩增几天之后，B细胞使它们的编码抗体的DNA突变，并且因此在生发中心中产生多种克隆。这涉及由体细胞超突变引起的随机取代、缺失以及插入。在一些来自FDC的未鉴别出的刺激下，成熟B细胞(中心母细胞)从暗区迁移至亮区并且开始将它们的抗体暴露至它们的表面，并且在这个阶段被称为中心细胞。中心细胞处于活化的细胞凋亡状态并且从呈递抗原的FDC竞争存活信号。这个救援过程被认为是取决于抗体对抗原的亲和力。功能性B细胞然后与辅助性T细胞相互作用以得到最后的分化信号。这也涉及例如从IgM至IgG的同种型转换。与T细胞的相互作用被认为是防止自反应性抗体的产生。B细胞成为传播抗体的浆细胞或在随后与相同抗原接触中活化的记忆B细胞。根据循环假设，它们还可以重新开始增殖、突变以及选择的整个过程。

可以将脾脏白髓区内含有的B细胞进一步划分到特定的区域中，这通过用特定的分子标记物染色加以鉴别。脾脏的边缘区含有非循环成熟B细胞，所述细胞与白髓结界，从而在白髓和红髓之间形成间隔，并且表达高水平的CD21和IgM和CD24以及CD79a，和可测量水平的CD9和CD22。外套区围绕正常的生发中心滤泡并且表达CD21、CD23以及CD38。滤泡区包含在生发中心内并且表达高水平的IgD和CD23、中等水平的CD21和CD24，并且也可以通过PNA染色来鉴别。生发中心通过PNA结合加以最好的辨别并且表达比滤泡区更高水平的CD54。生发中心具有特别的辅助性T细胞群体，它们似乎在所有生发中心中均匀分布。生发中心在传统上与需要T辅助性细胞的免疫应答相关，尽管这不是绝对的。生发中心是高变基因突变发生和产生高亲和力IgG的B细胞产生之处。活跃的生发中心具有有形(tangible)巨噬细胞和表达CD21的树突细胞。滤泡中心也可以通过CD45R(B220)的表达来鉴别[Toxicologic Pathology,35:366-375,2007)。发现CD45R滤泡中心包围表达Bcl6和Bcl2的生发中心。BioEssays 29:166-177,2007；Toxicol Pathol 34(5):648-655,(2006)]

CD45是一种常见的白细胞抗原，也称为PTPRC(蛋白酪氨酸磷酸酶，受体C型)，在除了红细胞和浆细胞的所有分化造血细胞上发现。它也在淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病、多毛细胞白血病以及急性非淋巴细胞性白血病中表达。已经显示它在B细胞和T细胞抗原受体信号传导中是必需的。CD45家族由多个成员组成，这些成员都是单个复合体基因的产物。这个基因含有34个外显子，初级转录产物的三个外显子可选择性地拼接，以产生多达八种不同的成熟mRNA，和翻译之后八种不同的蛋白质产物。这三个外显子产生了RA、RB和RC同工型。

存在不同的CD45抗原同工型。CD45抗原同工型包括CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RAB、CD45RAC、CD45RBC、CD45RO、CD45R(ABC)。CD45RA位于天然T细胞上，并且CD45RO位于记忆T细胞上。CD45也是高度糖基化的。CD45R是最长的蛋白质并且当从T细胞分离时以200kDa迁移。B细胞也表达具有较大程度的糖基化的CD45R，使分子量达到220kDa，由此得名B220，即220kDa的B细胞同工型。B220表达不限于B细胞并且也可以在活化的T细胞、树突细胞的子集以及其它抗原递呈细胞上表达。天然T淋巴细胞表达大量的CD45同工型并且通常对CD45RA是阳性的。活化和记忆T淋巴细胞表达最短的CD45同工型，即CD45RO，它没有RA、RB以及RC外显子。这种最短的同工型有助于T细胞活化。CD45的细胞质结构域是已知最大的之一，并且它具有去除称为Lck(在T细胞中)或Lyn/Fyn/Lck(在B细胞中)的酪氨酸激酶上的抑制性磷酸基并且将酪氨酸激酶活化的固有磷酸酶活性。CD45可以以单体与二聚体形式存在，并且二聚化可以下调CD45磷酸酶活性(Blood,第103卷(9):3440-3447,2004)。

因为CD45在所有造血细胞上表达并且是所有造血抗原中表达最广泛的，所以它已经在移植和干细胞重建的其它模型中用于分离也含有造血干细胞的细胞群体，然而，间质干细胞虽然来源于CD45+早期前体的群体，但通常发现是CD45阴性的(Stem Cells 28:140-151,2010)。已经在小鼠中证明了完全不存在所有CD45同工型会影响干细胞保留、活动力和归属至骨髓中，并且在从早期干细胞在脾脏中产生功能性B细胞中起作用(J.Exp.Med.205:2381-2395,2008)。有趣的是，缺少所有CD45同工型的CD45敲除小鼠骨髓中的cKit+Lin造血祖细胞数目降低，但是脾脏内的数目增加。

30-F11是针对小鼠来源的胸腺和脾脏培养的大鼠单克隆IgG2b。克隆30-F11均对CD45的同种抗原(CD45.1和CD45.2)和所有同工型作出反应。30-F11和克隆30-F4各自阻断对方与CD45结合，这表明它们与CD45上的相同或重叠表位结合(J Immunol 127(3):982-986,1981)。同样，这两个克隆均与Dennert等描述的抗体交叉阻断，然而，抗CD45抗体55-6.1不与30-F11或30-F4交叉阻断(Cell Immunol 53:350-364,1980)。

放射性标记的30-F11抗体在小鼠脾脏中显示最高的累积(60％)，而在骨髓中只有20％累积(Blood 93(2):737-745,1999)，并且已经用于在小鼠中用于递送靶向造血照射。30-F11抗体已经连同Sca1抗原一起用于从小鼠肌肉鉴别干细胞部分，因为CD45在所有造血细胞上表达(PNAS 99 1341-1346,2002)。放射性标记的30-F11和30-F11的f(ab)’2片段已经被评定为一种递送放射治疗的方法。30-F11摄取在小鼠脾脏中最显著，之是腋窝淋巴结(Cancer Res 52(5):1228-34,1992)。

CD45多肽可以通过公开的操作来产生。制备抗CD45多克隆和单克隆抗体的方法在本领域中是众所周知的(参见，例如Sambrook等,Molecular Cloning:A LaboratoryManual，第二版(Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)和Hurrell,J.G.R.,Ed.,MonoclonalHybridoma Antibodies:Techniques and Applications(CRC Press,Inc.,Boca Raton,Fla.,1982)，所述文献是以引用方式并入本文)。对本领域一般技术人员显而易见的是，可以从多种温血动物(如马、牛、山羊、绵羊、犬、鸡、兔、小鼠以及大鼠)产生多克隆抗体。人源化抗体的产生是众所周知的。参见，Riechmann L,Clark M,Waldmann H,Winter G(1988)."Reshaping human antibodies for therapy".Nature 332(6162):332:323；Queen C,Schneider WP,Selick HE,Payne PW,Landolfi NF,Duncan JF,Avdalovic NM,Levitt M,Junghans RP,Waldmann TA.(1989年12月)."A humanized antibody that binds to theinterleukin 2 receptor.".Proc Natl Acad Sci USA.86(24):10029-33；Norderhaug L,Olafsen T,Michaelsen TE,Sandlie I.(1997年5月)."Versatile vectors fortransient and stable expression of recombinant antibody molecules inmammalian cells.".J Immunol Methods 204(1):77-87。

防止干细胞与淋巴组织结合的方法和试剂

其它特定实施方案提供通过使脾脏暴露于一簇分化45(CD45)抗原的拮抗剂的溶液来缓和干细胞与脾脏结合的方法。可以配置或配制CD45抗原的拮抗剂的溶液从而结合30-F11表位。可以配制CD45抗原的拮抗剂的溶液以通过增加向损伤的组织或器官递送干细胞来促进治疗性再生。可以配制含有CD45抗原的抗体的溶液，从而结合30-F11表位和30F-11表位的人类等价物。

本发明描述了减少干细胞与淋巴组织(如淋巴结和脾脏)结合的方法和这些方法治疗人类患者的用途。本发明描述了循环干细胞在脾脏中结合的脾脏内的特定部位和增加或减少干细胞结合这个部位的方法。对新鲜厚脾脏切片进行免疫荧光和组织学分析证明了如实施例1、2、3以及4所示，当体内或离体施用时，在血管系统中循环的干细胞结合脾脏中的活跃生发中心。减少与脾脏结合的干细胞的量的一种方法是递送阻断所施用的干细胞与脾脏的活跃生发中心上的分子靶标结合的试剂。根据本发明的方法，抗体30-F11结合小鼠CD45抗原并且阻断干细胞与小鼠脾脏的生发中心结合。可能与30-F11大鼠IgG2b抗小鼠CD45等价的抗人类抗CD45抗体包括：识别人类CD45的表位P的YAML568(J Nucl Med 47:1335-1341,2006；在Leucocyte Typing III:White Cell Differentiation Antigens811-814页，1987中；Transplantation 40:538-544,1985)、抗CD45克隆HI30或YTH-24以及YTH-54抗人类抗CD45抗体。

本发明的另一个实施方案是使用CD26的拮抗剂如CD26的抗体来抑制干细胞结合生发中心。因为CD26由干细胞表达并且是附着在淋巴组织、特别是淋巴组织中的生发中心上的干细胞上存在的抗原。通过阻断干细胞上的CD26，干细胞不能结合淋巴组织。

抑制、下调生发中心形成或破坏或消融生发中心的试剂

本发明的另一个实施方案是通过抑制或下调生发中心的增殖来抑制干细胞与淋巴组织结合或是破坏或消融生发中心。生发中心(GC)在B细胞被T依赖性抗原活化之后动态发育。活化B细胞并且因此诱导生发中心增殖的T细胞抗原是与B细胞上存在的CD40受体结合的CD40L(也称为CD154)。CD40L与CD40受体的这种结合不仅活化B细胞还诱导生发中心增殖。因此，本发明的另一个实施方案包括向个体施用抑制CD40L与CD40结合的试剂。所述试剂的实例是CD40或CD40L的拮抗性抗体。

对生发中心发育重要的另一种蛋白质是‘信号传导淋巴细胞激活化分子相关的蛋白质’(SAP)(Hai Qui等,Nature,455:764-769(2008)。因此，针对SAP的抗体将抑制生发中心的形成并且因此抑制干细胞与淋巴组织结合。

IL-21是对生发中心B细胞通过B细胞-固有的机制分化和增殖来说重要的另一种多肽。不存在IL-21信号传导显著地影响B细胞对蛋白质抗原的应答，从而减少脾脏和骨髓浆细胞的形成和GC持久性和功能，影响它们的增殖，转变为记忆B细胞和亲和力成熟[Zotos,D.等,JEM 207:365-378(2010)]。因此，通过向某个人施用拮抗剂如IL-21的抗体，可以下调生发中心并且抑制它们的形成。由于缺少淋巴组织中的生发中心，这将抑制干细胞与淋巴组织和脾脏结合。

化学治疗剂可以抑制干细胞与淋巴样组织(包括淋巴结、派伊尔氏淋巴集结以及脾脏白髓)的生发中心的结合。同样，抑制免疫应答的试剂可以减少脾脏中的活跃生发中心的数目。所述治疗剂选自由以下组成的组：硫唑嘌呤(azathioprine)、麦考酚酸(mycophenolic acid)、来氟米特(leflunomide)、特立氟胺(teriflunomide)、甲氨蝶呤、他克莫司(tacrolimus)、环孢素(ciclosporin)、吡美莫司(pimecrolimus)、阿贝莫司(abetimus)、胍立莫司(gusperimus)、沙利度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)、阿那白滞素(anakinra)、西罗莫司(sirolimus)、地磷莫司(deforolimus)、依维莫司(everolimus)、坦罗莫司(temsirolimus)、唑罗莫司(zotarolimus)、比欧莫司A9(biolimusA9)、依库珠单抗(eculizumab)、英利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、阿非莫单抗(afelimomab)、戈利木单抗(golimumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、奈瑞莫单抗(nerelimomab)、法拉莫单抗(faralimomab)、艾西莫单抗(elsilimomab)、来金珠单抗(lebrikizumab)、优特克单抗(ustekinumab)、莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3)、奥昔珠单抗(otelixizumab)、替利珠单抗(teplizumab)、维西珠单抗(visilizumab)、克立昔单抗(clenoliximab)、凯利昔单抗(keliximab)、扎木单抗(zanolimumab)、依法珠单抗(efalizumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、阿托珠单抗(afutuzumab)、奥瑞株单抗(ocrelizumab)、帕考珠单抗(pascolizumab)、鲁昔单抗(lumiliximab)、替奈昔单抗(teneliximab)、托利珠单抗(toralizumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、加利昔单抗(galiximab)、加维莫单抗(gavilimomab)、卢利珠单抗(ruplizumab)、贝利木单抗(belimumab)、易普利单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、柏替木单抗(bertilimumab)、乐德木单抗(lerdelimumab)、美替木单抗(metelimumab)、那他珠单抗(natalizumab)、托珠单抗(tocilizumab)、奥度莫单抗(odulimomab)、巴利昔单抗(basiliximab)、达利珠单抗(daclizumab)、伊诺莫单抗(inolimomab)、阿佐莫单抗(zolimomab aritox)、阿托木单抗(atorolimumab)、西利珠单抗(cedelizumab)、达利株单抗(dorlixizumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、罗氏单抗(gantenerumab)、高米昔单抗(gomiliximab)、马司莫单抗(maslimomab)、莫罗木单抗(morolimumab)、培克珠单抗(pexelizumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、西利珠单抗(siplizumab)、他利珠单抗(talizumab)、阿替莫单抗(telimomab aritox)、伐利昔单抗(vapaliximab)、维帕莫单抗(vepalimomab)、阿巴西普(abatacept)、贝拉西普(belatacept)、依那西普(etanercept)、培那西普(pegsunercept)、阿柏西普(aflibercept)、阿来西普(alefacept)、利隆西普(rilonacept)、淋巴毒素α和β抑制剂、达西珠单抗(dacetuzumab)SGN-40、HCD-12、西他列汀(sitagliptin)、维达列汀(vildagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)、利拉利汀(linagliptin)、度格列汀(dutogliptin)、地格列汀(denagliptin)、吉格列汀(gemigliptin)、阿格列汀(alogliptin)、RO4876904、GRC 8200、KRP-104、ASP1941、小檗碱(Berberine)、IP10.C8、抑二肽素A(Diprotin A)。这些试剂包括：

硫唑嘌呤(Azathioprine)Prometheus Laboratories,San Diego,CA)，优选在施用干细胞之前3-4天，每天施用3-5mg/kg。硫唑嘌呤干扰DNA合成所需的嘌呤(腺嘌呤和鸟嘌呤)的合成。快速生长的细胞(包括T细胞和B细胞)尤其受嘌呤合成抑制的影响。

皮质类固醇，如地塞米松(dexamethasone)、泼尼松龙(prednisolone)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、地塞米松磷酸钠以及倍他米松(betamethsaone)。地塞米松片(Merck)和地塞米松磷酸钠注射液可以在用干细胞处理之前1-14天、更优选在用干细胞处理之前3-7天并且最优选3-4天给予。施用的地塞米松的总量是足以下调淋巴组织中的生发中心，以便使干细胞不能与淋巴组织结合的量。这段时间中地塞米松的总量可以在2mg至3g范围内，优选总计27mg。地塞米松的日剂量可以在每天0.75mg至700mg范围内，优选每天7mg。类似其它糖皮质激素类固醇，地塞米松抑制淋巴组织中的生发中心的形成和增殖。

麦考酚酸(Mycophenolic acid)延迟释放胶囊，NovartisPharmaceuticals Corporation East Hanover,New Jersey，720mg，每天空腹施用两次(总日剂量1440mg)，摄食一小时之前或两小时之后)，优选在施用干细胞之前3-4天。Roche Labs,Nutley,NJ，马替麦考酚酯)片剂和胶囊、口服混悬液、马替麦考酚酯盐酸盐)用于静脉内注射，麦考酚酸(MPA)的2-吗啉乙基酯，IV施用1g每天两次，口服施用1.5g每天两次，优选在施用干细胞之前3-4天。它抑制肌苷单磷酸脱氢酶，所述酶控制在B和T淋巴细胞增殖中使用的嘌呤从头合成途径中的单磷酸鸟嘌呤的合成速率。麦考酚酯是有效的并且可以代替更早的抗增殖性硫唑嘌呤来使用。它通常用作免疫抑制剂的三化合物方案(还包括钙神经素抑制剂(环孢素(ciclosporin)或他克莫司(tacrolimus))和泼尼松龙)的一部分。

来氟米特(Leflunomide)(Sanofi-Aventis U.S.LLC,Bridgewater,NJ)，100mg每天，持续三天，在施用干细胞之前3-4天。来氟米特是属于DMARD(改善疾病的抗风湿药物)类药物的嘧啶合成抑制剂，这类药物在化学和药理学上是非常异质的。来氟米特是抑制二氢乳清酸脱氢酶(涉及嘧啶从头合成的酶)(缩写为DHODH)的免疫调节药物。

特立氟胺(Teriflunomide)是来氟米特的活性代谢物(Sanofi-Aventis U.S.LLC,Bridgewater,NJ)，每天100mg，持续三天，优选在施用干细胞之前3-4天。

甲氨蝶呤(Methotrexate)是抗代谢物和抗叶酸药物。它通过抑制叶酸代谢起作用。优选在施用干细胞之前3-4天，它以15至30mg每天的剂量口服或肌肉内施用，持续至多五天。Mylan Pharmaceuticals,Morgantown,West Virginia。免疫抑制剂大环内酯：

他克莫司(Tacrolimus)减少T细胞的白细胞介素-2(IL-2)的产生，呈胶囊或注射液形式，0.10-0.15mg/kg/天，优选在施用干细胞之前3-4天。(Astellas Pharma US,Inc.Deerfield,IL)。

环孢素(Ciclosporin)—认为环孢素结合免疫活性淋巴细胞、尤其是T淋巴细胞的胞质蛋白亲环素(亲免素)。作为销售，呈胶囊、口服溶液或注射液的形式，优选在施用干细胞之前3-4天，以14-18mg/kg/天给药。(Novartis PharmaceuticalsCorporation,East Hanover,New Jersey)。

吡美莫司(Pimecrolimus)(Elidel)是子囊霉素巨内酰胺衍生物。已经在体外示出吡美莫司结合巨菲蛋白-12并且抑制钙神经素。因此吡美莫司通过抑制细胞因子从T细胞的合成和释放来抑制T细胞激活。吡美莫司还阻止炎性细胞因子和介质从肥大细胞释放。优选在干细胞治疗之前，吡美莫司作为局部1％乳膏剂来使用，持续至多6周。

胍立莫司(Gusperimus)是抗肿瘤抗生素司加林(spergualin)的衍生物，并且抑制白细胞介素-2刺激的T细胞成熟为S和G2/M期和T细胞极化成IFN-γ-分泌Th1效应子T细胞，从而导致对激活的天然CD4T细胞生长的抑制。它SC施用，0.5mg/kg/天，持续21天，优选在施用干细胞之前3-4天完成。Nippon Kayaku Co.,Ltd。

依维莫司(Everolimus)(RAD-001)，优选在施用干细胞之前3-4天以10mg/天的剂量口服施用。Novartis,East Hanover,NJ，商品名为Zortress(USA)。

沙利度胺(Thalidomide)—沙利度胺可以降低TNFα的水平，Celgene Corporation,Summit,NJ)。可接受的剂量为100-300mg/天，优选在晚餐后1小时的就寝时间，优选在施用干细胞之前3-4天。

来那度胺(Lenalidomide)是沙利度胺的衍生物，抑制肿瘤坏死因子-α的效力比沙利度胺强50,000倍，并且严重不良药物反应较小。Celgene Corporation,Summit,NJ)，优选在施用干细胞之前3-4天，在第1-21天每天口服一次25mg。

阿那白滞素(Anakinra)是人类IL-1RA(RA指受体拮抗剂)的重组、非糖基化形式Biovitrum,Stockholm,Sweden)，在施用干细胞之前7-14天内，并且优选3-4天内，作为每单一剂量含有100mg的注射液浓缩液递送。

英利昔单抗(Infliximab)(商品名是针对肿瘤坏死因子α(TNFα)的单克隆抗体。Centocor Ortho Biotech,Horsham,PA，在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内，通过静脉内输注以3mg/kg至多达10mg/kg的剂量施用。

戈利木单抗(Golimumab)(CNTO 148)是人类单克隆抗体，并且以商标名Simponi销售。戈利木单抗靶向TNF-α。Centocor Ortho Biotech,Horsham,PA，在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内，作为50mg在0.5ml中的皮下注射液施用。

阿达木单抗(Adalimumab)(HUMIRA，Abbott Laboratories,North Chicago,IL)是TNF抑制剂，阿达木单抗结合TNFα，阻止它激活TNF受体；阿达木单抗由全人类单克隆抗体构建，以预装0.8mL的注射器以及预装各含有40mg阿达木单抗的笔装置销售。为了在施用干细胞之前下调生发中心，应该在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-7天内施用至少40mg阿达木单抗。优选地，应该在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-7天内施用两个40mg剂量的阿达木单抗。

赛妥珠单抗(Certolizumab pegol)是针对肿瘤坏死因子α的单克隆抗体。更精确地说，它是人源化TNF抑制剂单克隆抗体的PEG化Fab'片段。它在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内作为两个200mg注射液的皮下注射施用。(UCB Inc.,Atlanta,Georgia)。

坦罗莫司(Temsirolimus)(Pfizer Corp.)是mTOR(雷帕霉素(rapamycin)的哺乳动物靶标)的特异性抑制剂，并且干扰调控肿瘤细胞的增殖、生长和存活的蛋白质的合成。在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内，坦罗莫司的推荐剂量是25mg IV输注30-60分钟。

唑罗莫司(Zotarolimus)是雷帕霉素的半合成衍生物，Abbot Laboratories,North Chicago,IL)。

比欧莫司(Biolimus)A9：Biosensors International,Singapore

依库珠单抗(Eculizumab)(商品名Soliris)是针对补体蛋白C5的单克隆抗体。这种抗体阻断C5裂解并且中断补体介导的细胞破坏过程。在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内，Soliris作为以600mg或900mg剂量施用的IV输注施用。(AlexionPharmaceuticalsCheshire,CT)

美泊利单抗(Mepolizumab)(建议商品名Bosatria)是识别白细胞介素-5(IL-5)的人源化单克隆抗体，在施用干细胞之前7-14天内并且优选地3-4天内，作为750mg的输注液施用。GlaxoSmithKline,King of Prussia,PA。

奥马珠单抗(Omalizumab)(商品名Xolair，Genentech/Novartis)是人源化抗体。奥马珠单抗是重组DNA源性人源化IgG1k单克隆抗体，它选择性结合人免疫球蛋白E(IgE)。在施用干细胞之前7-14天内并且优选地3-4天内，以150至375mg的剂量皮下注射施用。

奈瑞莫单抗(Nerelimomab)(BAYX)是小鼠抗TNF抗体，并且可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选地3-4天内以10mg/kg施用。

法拉莫单抗(Faralimomab)是小鼠抗TNF抗体，并且可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选地3-4天内以10mg/kg施用。

艾西莫单抗(Elsilimomab)(也称为B-E8)是小鼠单克隆抗体和免疫抑制药物。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以10mg/kg的剂量施用。

来金珠单抗(Lebrikizumab)是设计成特异性结合IL-13的人源化单克隆抗体，可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以10mg/kg施用。Genentech,South SanFrancisco,California。

优特克单抗(Ustekinumab)(实验名CNTO 1275，专利商品名Stelara，Centocor)是人类单克隆抗体。它针对白细胞介素12和白细胞介素23，即调控免疫系统和免疫介导的发炎性病症的天然存在蛋白质。在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内完成2个间隔一个月的90或45毫克注射液或单个45mg注射液，。

莫罗单抗(Muromonab)-CD3(商品名Orthoclone OKT3，由Janssen-Cilag销售)是靶向CD3受体(在T细胞表面上的膜蛋白)的单克隆抗体。它以5mg/天通过单次静脉内团射施用，持续10至14天。应该在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内完成施用。体重小于30lb的儿童应该接受2.5mg/天。(Ortho Biotech,Raritan,NJ)。

奥昔珠单抗(Otelixizumab)是靶向CD3的ε链的单克隆抗体。它以5mg/天通过单次静脉注内团注施用，持续10至14天。应该在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内完成施用。体重小于30lb的儿童应该接受2.5mg/天。所述抗体由Tolerx,Inc.和GlaxoSmithKline合作开发并且正在由Abbott Laboratories制造。

替利珠单抗(Teplizumab)是人源化Fc工程改造的单克隆抗体，也称为MGA031和hOKT3γ1(Ala-Ala)。它是抗CD3抗体。它可以根据本发明以5mg/天的剂量通过单次静脉内团注施用，持续10至14天。应该在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内完成施用。体重小于30lb的儿童应该接受2.5mg/天(Eli Lilly,Indianapolis,IN。

维西珠单抗(Visilizumab)(暂定商品名Nuvion，PDL BioPharma Inc.)是靶向激活的T细胞上的CD3的人源化单克隆抗体。它可以根据本发明以5mg/天的剂量通过单次静脉内团注施用，持续10至14天。应该在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4内天完成施用。体重小于30lb的儿童应该接受2.5mg/天。

克立昔单抗(Clenoliximab)是针对CD4的单克隆抗体。它可以根据本发明以5mg/天的剂量通过单次静脉内团注施用，持续10至14天。应该在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内完成施用。

凯利昔单抗(Keliximab)是经由蛋白CD4结合至白血球的单克隆抗体。它在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以3mg/kg的输注剂量施用。

扎木单抗(Zanolimumab)(预期商品名HuMax-CD4)是靶向CD4的人单克隆抗体，并且在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以20mg/kg/天的剂量施用。(Genmab、A/SCOPENHAGEN/TenX Biopharma,Inc.,Philadelphia,PA)。

依法珠单抗(Efalizumab)(商品名Raptiva，Genentech、Merck Serono)是重组人源化单克隆抗体。依法珠单抗与淋巴细胞功能相关的抗原1的CD11a亚单元结合。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以20mg/kg的剂量皮下注射施用，每周一次。

厄利珠单抗(Erlizumab)(也称为rhuMAb)是Genentech与Roche合伙开发的重组人源化单克隆抗体。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以20mg/kg的剂量皮下注射施用，每周一次。所述药物通过阻断血管中的生长因子起作用。具体来讲，厄利珠单抗靶向CD18和LFA-1整联蛋白。

阿托珠单抗(Afutuzumab)是抗CD20单克隆抗体。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以20mg/kg的剂量皮下注射施用，每周一次。(Hoffmann-La Roche Inc.)

奥瑞株单抗(Ocrelizumab)是人源化抗CD20单克隆抗体。它靶向成熟B淋巴细胞。它正由Hoffmann-La Roche的子公司Genentech和Biogen Idec开发。根据本发明，它在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以200mg和600mg的剂量给予。

帕考珠单抗(Pascolizumab)是抗IL-4人源化单克隆抗体。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以20mg/kg的剂量皮下注射施用，每周一次。

鲁昔单抗(Lumiliximab)是靶向CD23的单克隆抗体。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以50mg/m2至450mg/m2至500mg/m2的给予。所述药物是来自猕猴(Macaca irus)和智人(Homo sapiens)的嵌合抗体。(Biogen IDEC)

替奈昔单抗(Teneliximab)是与免疫刺激蛋白CD40结合的嵌合单克隆抗体。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以20mg/kg的剂量皮下注射施用，每周一次。

托利珠单抗(Toralizumab)(IDEC 131)是人源化单克隆抗体。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以20mg/kg的剂量皮下注射施用，每周一次。(IDEC Pharmaceuticals Corporation)

阿塞珠单抗(Aselizumab)是在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内通过I.V.输注以在0.5mg/kg、1.0mg/kg以及2.0mg/kg范围内的剂量施用的抗CD62L。

加利昔单抗(Galiximab)是在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天以500mg/m2的剂量IV施用的抗CD80(Biogen Idec)单克隆抗体。它是来自猕猴和智人的嵌合抗体。

加维莫单抗(Gavilimomab)是由Abgenix开发的小鼠单克隆抗体(也称为ABX-CBL。它结合抗原CD147。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以20mg/kg的剂量通过I.V.输注施用。

BG9588(人源化抗CD40L)在施用干细胞之前7-14天和3-4天内以20mg/kg施用。施用CD154(也称为CD40配体或CD40L)的抗体，CD154是主要在激活的T细胞上表达的蛋白质并且是分子的TNF超家族的成员。它结合在抗原呈递细胞(APC)上的CD40，这引起取决于靶标细胞类型的许多作用。一般来讲，CD40L起共刺激分子的作用并且结合APC上的MHC分子引起的T细胞受体刺激作用诱导APC的激活。CD40L总共有三个结合伙伴：CD40、α5β1整联蛋白以及αIIbβ3。

(Hu5c8)5c8是结合CD154(CD40配体)，因此阻断CD40与CD154之间的相互作用的单克隆抗体，在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以20mg/kg施用。

贝利木单抗(Belimumab)(注册名Benlysta，先前称为LymphoStat-B)是特异性识别并且抑制B淋巴细胞刺因子(BLyS)(也称为TNF家族的B细胞激活因子(BAFF))的生物活性的全人类单克隆抗体(Human Genome Sciences)。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以10mg/kg的剂量施用。

易普利单抗(Ipilimumab)(也称为MDX-010或MDX-101)是由Bristol-MyersSquibb开发的抗CTLA-4(细胞毒性T细胞淋巴细胞相关的)人类单克隆抗体。根据本发明，它在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以10mg/kg活性药物施用。

曲美木单抗(Tremelimumab)(原先为替西木单抗(ticilimumab)，CP-675,206)是由Pfizer生产的全人类IgG2单克隆抗体。它结合蛋白CTLA-4，CTLA-4在激活的T淋巴细胞表面上表达。曲美木单抗阻断抗原呈递细胞配体B7.1和B7.2与CTLA-4的结合，从而引起对T细胞激活的B7-CTLA-4介导的下调的抑制；随后，B7.1或B7.2可以与另一种T细胞表面受体蛋白(CD28)相互作用，从而引起由B7-CTLA-4介导的抑制对抗的B7-CD28介导的T细胞激活。曲美木单抗在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内通过IV输注以3mg/kg、6mg/kg、10mg/kg、15mg/kg施用。

柏替木单抗(Bertilimumab)是结合嗜酸细胞激活趋化因子-1的人单克隆抗体。(iCo Therapeutics Inc.Vancouver,B.C.)。根据本发明，它在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以10mg/kg的剂量施用。

乐德木单抗(Lerdelimumab)(CAT-152)是由Cambridge Antibody Technology开发的抗TGFβ-2。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以10mg/kg的剂量施用。

美替木单抗(Metelimumab)(CAT-192)是由Cambridge Antibody Technology开发的人类IgG4单克隆抗体，它中和TGFβ1。根据本发明，优选在施用干细胞之前3-4天，它可以以10mg/kg的剂量施用。那他珠单抗(natalizumab)是针对细胞粘附分子α4-整联蛋白的人源化单克隆抗体。它作为Tysabri由Biogen Idec和Elan共同销售，并且早先的名称为安特进(Antegren)。那他珠单抗在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以经大约一小时静脉内输注的300mg剂量施用。

托珠单抗(Tocilizumab)或阿替株单抗(atlizumab)(由Hoffmann-La Roche和Chugai开发，商品名为Actemra和RoActemra)是针对白细胞介素-6受体(IL-6R)的人源化单克隆抗体。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以8mg/kg通过静脉内输注施用。

奥度莫单抗(Odulimomab)是针对在免疫应答中涉及的蛋白质淋巴细胞功能相关的抗原1的α链的小鼠单克隆抗体。它在施用干细胞之前7-14天和3-4天内以10mg/kg活性药物施用。

巴利昔单抗(Basiliximab)(商品名Simulect)是针对T细胞IL-2受体的α链(CD25)的嵌合小鼠-人类单克隆抗体。剂量为在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内20mg，两次。

达利珠单抗(Daclizumab)(商品名Zenapax)是针对T细胞IL-2受体的α亚单元的治疗性人源化单克隆抗体。Roche Pharmaceuticals,Hoffmann-La Roche Inc,340Kingsland Street,Nutley,New Jersey。它在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天以10mg/kg活性药物施用。

伊诺莫单抗(Inolimomab)是靶向白细胞介素-2受体的α链的小鼠单克隆抗体。OPi(原先为Orphan Pharma International)。它在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以10mg/kg活性药物施用。

阿佐莫单抗(Zolimomab aritox)是小鼠单克隆抗体并且是与篦麻毒素蛋白的A链连接(通过药物名称中的阿托(aritox)反映出)的抗CD5抗体。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以10mg/kg的剂量施用。

阿托木单抗(Atorolimumab)是针对恒河猴因子的小鼠单克隆抗体。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以10mg/kg的剂量施用。

西利珠单抗(Cedelizumab)是抗CD4单克隆抗体。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以10mg/kg的剂量施用。

达利株单抗(Dorlixizumab)是嵌合/人源化单克隆抗体和免疫抑制药物。它在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以10mg/kg活性药物的剂量施用。

芳妥珠单抗(Fontolizumab)(商品名HuZAF)是抗干扰素γ人源化单克隆抗体。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以按照4.0mg/kg或10.0mg/kg给予的芳妥珠单抗的I.V.剂量施用。(PDL Biopharma)

罗氏单抗(Gantenerumab)是抗β淀粉样单克隆抗体(Roche)。它在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天以10mg/kg活性药物的剂量施用。

高米昔单抗(Gomiliximab)是靶向低亲和力IgE受体(FcεRII或CD23)的单克隆抗体。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以10mg/kg的剂量施用。

马司莫单抗(Maslimomab)是靶向T细胞受体的小鼠单克隆抗体。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以10mg/kg的剂量施用。

莫罗木单抗(Morolimumab)是针对人类恒河猴因子的人类单克隆抗体。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以10mg/kg的剂量施用。

培克珠单抗(Pexelizumab)是靶向补体系统的组分5的单克隆抗体的单链可变片段。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以10mg/kg的剂量施用。

瑞利珠单抗(Reslizumab)是抗IL-5人源化单克隆抗体。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以3.0mg/kg瑞利珠单抗的优选剂量通过输注施用。(Ception Therapeutics Inc)。

罗维珠单抗(Rovelizumab)(也称为LeukArrest和Hu23F2G)是抑制白血球的抗CD11/CD18人源化单克隆抗体。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以10mg/kg的剂量施用。

西利珠单抗(Siplizumab)(MEDI-507)是具有针对CD2的人类IgG1κ的抗CD2单克隆抗体。所述试剂显示有效的免疫调节作用，选择性抑制T和NK细胞的功能。西利珠单抗结合CD2，即在T细胞和NK细胞中发现的特异性受体，从而触发引起CD2+细胞溶解的宿主免疫应答，免疫系统的选择性抑制以及对激活的T细胞生长的控制。根据本发明，西利珠单抗可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以0.04mg/kg i.v.和5或7mg/kg的优选剂量皮下注射施用。(Medimmune)

他利珠单抗(Talizumab)(TNX-901)是由Houston,Texas的Tanox开发的人源化单克隆抗体。它被设计成特别地靶向免疫球蛋白E(或IgE)和表达IgE的B淋巴细胞，而不结合已经被肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的IgE受体结合的IgE。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以10mg/kg的剂量施用。

奥马珠单抗(Omalizumab)是由Tanox、Novartis以及Genentech开发的抗IgE单克隆抗体。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以10mg/kg的剂量施用。

阿替莫单抗(Telimomab aritox)是小鼠单克隆抗体。所述抗体与篦麻毒素蛋白的A链连接(这通过药物名称中的阿托反映出)。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以10mg/kg的剂量施用。

伐利昔单抗(Vapaliximab)是抗VAP-1嵌合单克隆抗体。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以10mg/kg的剂量施用。

维帕莫单抗(Vepalimomab)是抗VAPI小鼠单克隆抗体。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以10mg/kg的剂量施用。

阿巴西普(Abatacept)(作为Orencia销售)是主要由与CTLA-4(一种能够结合B7从而阻止T细胞完全激活的分子)的胞外结构域融合的免疫球蛋白组成的融合蛋白。阿巴西普应该根据基于体重的规定给药方案按照30分钟的静脉内输注来施用。在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内，剂量应优选为：对于<60kg，500mg；对于60kg-100kg，750mg以及对于>100kg，1克。

贝拉西普(Belatacept)(Bristol-Myers-Squibb)是主要由与CTLA-4(一种对T细胞共刺激关键的分子，选择性地阻断T细胞激活过程)的胞外结构域连接的人类IgG1免疫球蛋白的Fc片段组成的融合蛋白。它与阿巴西普(Orencia)只有2个氨基酸不同。根据本发明，它可以根据基于体重的规定给药方案按照30分钟的静脉内输注在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以以下优选剂量施用：对于<60kg，500mg；对于60kg-100kg，750mg以及对于>100kg，1克。

依那西普(Etanercept)(商品名Enbrel、Amgen、Thousand Oaks,CA)是一种通过充当TNF抑制剂干扰肿瘤坏死因子(TNF，免疫系统的一部分)来治疗自身免疫疾病的药物。依那西普可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以25mg或50mg的剂量皮下注射(s.c.)施用。

培那西普(Pegsunercept)是聚乙二醇化的可溶性肿瘤坏死因子受体。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以9mg/kg s.c.的优选剂量皮下注射施用。

阿柏西普(Aflibercept)是包含与具有潜在的抗血管生成活性的人类IgG1的恒定区(Fc)融合的人血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)和2(VEGFR2)的胞外结构域区段的蛋白质，并且正由Sanofi-Aventis和Regeneron Pharmaceuticals共同开发。阿柏西普(VEGFTrap)是一种抗血管生成剂，是被特别设计成结合血管内皮生长因子-A(称为VEGF-A)的所有形式的融合蛋白。此外，阿柏西普结合胎盘生长因子(PLGF)，PLGF也牵涉在肿瘤血管生成中。阿柏西普可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选地3-4天内以2毫克每公斤(mg/kg)或4mg/kg的优选剂量通过注射或IV输注施用。

阿来西普(Alefacept)是融合蛋白：它将抗体的一部分与阻断一些类型的T细胞生长的蛋白质相组合。(阿来西普)是免疫抑制性二聚融合蛋白，它由与人类IgG1的Fc(铰链、CH2以及CH3结构域)部分连接的人类白细胞功能抗原-3(LFA-3)的胞外CD2结合部分组成。优选剂量是7.5mg IV或15mg IM，优选在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天施用。Astellas Pharma US,Inc.Deerfield,IL 60015。

利隆西普(Rilonacept)也称为IL-1Trap(以商品名Arcalyst销售)，它是由人类白细胞介素-1受体的胞外结构域和结合并且中和IL-1h的人类IgG1的Fc结构域组成的二聚融合蛋白。处理应该由320mg负荷剂量启始，分两次(2mL)皮下注射160mg递送，每次在同一天在两个不同部位给予，在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内。年龄12至17岁的儿科患者：处理应该用4.4mg/kg的负荷剂量开始，直至多达320mg的最大量，作为一次或两次皮下注射递送，最大单次注射体积为2mL，在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内。由Regeneron生产。

达西珠单抗(Dacetuzumab)(也称为SGN-40或huS2C6)是抗CD40人源化单克隆抗体。CD40抗原在大部分B谱系血液学恶性肿瘤(包括多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)以及慢性淋巴细胞性白血病)上高度表达。CD40也在许多类型的实体肿瘤(包括膀胱癌、肾癌以及卵巢癌)和在免疫病症中起作用的细胞上发现。它在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以10mg/kg活性药物的优选剂量施用。Seattle Genetics,Inc.

HCD122是全人类拮抗剂抗CD40单克隆抗体。CD40是通过被CD40配体(CD40L)激活在免疫应答及细胞生长和存活信号传导中起关键作用的细胞表面受体。它通常在B细胞恶性肿瘤中过表达并且激活。根据本发明，它可以在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内以10mg/kg活性药物的剂量施用。它正在由XOMA/NOVARTIS ONCOLOGY开发。

利妥昔单抗(Rituximab)(以商品名Rituxan和MabThera销售，Genentech,Inc.,San Francisco,CA)是针对蛋白CD20的嵌合单克隆抗体，主要在B细胞表面上发现。因此它可以破坏B细胞。CD20在B细胞(从早期的前B细胞到所分化的晚期细胞)上广泛表达，但是在末期分化的浆细胞上不存在。Rituxan是在100mg(10mL)或500mg(50mL)的单次使用的小瓶中以10mg/mL的浓度提供的。它可以作为输注以50mg/hr的速率施用。在不存在输注毒性下，以每30分钟50mg/hr的增量增加输注速率，直到最大为400mg/hr，优选在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天施用。优选的推荐剂量是作为IV输注375mg/m²，优选在施用干细胞之前3-4天施用。

利妥昔单抗也可以作为的组分施用，以250mg/m2的优选剂量在施用铟-111-(In-111-)Zevalin之前4小时内和在施用钇-90-(Y-90-)Zevalin之前4小时内通过输注利妥昔单抗施用，这应该在施用干细胞之前7-14天内并且优选3-4天内进行。Rituxan也可以与甲氨蝶呤组合施用，优选在施用干细胞之前3-4天。Biogen Idec Inc.和GenentechUSA,Inc。

替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)(以商品名Zevalin销售)是靶向B细胞的单克隆抗体放射免疫治疗。所述药物使用单克隆小鼠IgG1抗体异贝莫单抗(ibritumomab)联合螯合剂替坦(tiuxetan)，其中添加了放射性同位素(钇-90或铟-111)。替坦是修饰形式的DTPA，它的碳骨架含有异硫氰基苄基和甲基。

如同触发去氧ATP累积的试剂，腺苷脱氨酶缺乏也会导致活跃生发中心形成减少(J Immunol 171:5562-5570,2003)。类似地，增强CCR7表达或激活CCR7的试剂将导致活跃生发中心形成减小。

干细胞：定义、分离、递送以及治疗用途

在本发明范围内的术语干细胞包括能够分化成所希望的组织的任何细胞。所述细胞包括多能干细胞、胚胎干细胞、多效成体干细胞和祖细胞以及前体细胞。“干细胞”是来自非人类胚胎、非人类胎儿或成人的在某些条件下长期或在成体干细胞的情况下贯穿有机体的生命具有自我复制能力的细胞。它也可以产生构成身体组织和器官的特化细胞。所述胚胎干细胞不是人类胚胎干细胞。

“多能干细胞”具有产生从三个胚层(中胚层、内胚层以及外胚层)发育的细胞类型的能力，身体的所有细胞均从这三个胚层产生。

“胚胎干细胞”来源于一组称为内细胞团的细胞，内细胞团是称为胚囊的早期(4至5天)胚胎的一部分。一旦从胚囊去除，可以将内细胞团的细胞培养成胚胎干细胞。所述胚胎干细胞不是人类胚胎干细胞。

“成体干细胞”是在分化(特化)组织中出现的未分化(非特化)细胞，它自我更新并且当转移至适当的组织时特化产生它所在的组织中的所有特化细胞类型。成体干细胞在有机体生存期中能够产生自身的相同复本。这种特性被称为“自我更新”。成体干细胞通常分裂产生祖细胞或前体细胞，然后分化或发育成具有特征形状和专化功能(例如，肌细胞收缩或神经细胞信号传导)的“成熟”细胞类型。成体干细胞的来源包括但不限于骨髓、血液、眼睛的角膜和视网膜、大脑、骨骼肌、牙髓、肝脏、皮肤、胃肠道和胰腺的内层。

对个体递送或施用干细胞包括递送或施用外源性干细胞以及调动内源性干细胞，以及提高自发释放的内源性干细胞的生物利用性。

来自骨髓的干细胞是研究最多的成体干细胞类型。目前，它们在临床上经由移植被用作修复骨髓的各种血液和免疫组分。目前鉴别出在骨髓中发现的两种主要类型的干细胞：造血干细胞(HSC或CD34+细胞)，典型地认为它们形成血液和免疫细胞，和基质(间质)干细胞(MSC)，典型地认为它们形成骨骼、软骨、肌肉以及脂肪。然而，最近证明了两种类型的源于骨髓的干细胞在形成相同组织的能力方面有广泛的可塑性和多能性。骨髓(位于骨骼的骨髓腔中)是成人中的造血作用的主要部位。它每天产生每公斤体重约六十亿细胞。造血活性(红)骨髓在出生之后退行直到青春晚期，此后它集中在下颅骨椎骨(lower skullvertebrae)、肩部和骨盆带、肋骨以及胸骨中。脂肪细胞取代手、足、腿以及手臂的骨骼中的造血细胞(黄骨髓)。成人中脂肪占据红骨髓空间的约50％，随着衰老进一步的脂肪变态缓慢地继续。在极年长的个体中，可能出现脂肪向粘液样材料的凝胶状转化(白骨髓)。如果存在长期的需求，如在溶血性贫血情况下，黄骨髓可以复原成造血活性骨髓。因此造血作用可以通过增加红骨髓的体积并且降低祖细胞发育(转变)为成熟细胞的时间来扩展。

骨髓基质主要由窦网络组成，窦起源于皮质毛细管的骨内膜，并且终止于进入体静脉循环的集合血管。三层的窦壁主要由内皮细胞、发育不完全的薄基膜以及外膜网状细胞(是能够转化成脂肪细胞的成纤维细胞)组成。内皮和网状细胞是造血细胞因子的来源。造血作用在窦间空间中发生并且由一系列复杂的刺激和抑制细胞因子、细胞与细胞的接触以及在邻近细胞上的胞外基质组分的作用来控制。在这种独特的环境中，淋巴造血干细胞分化成所有的血细胞类型。产生并且释放成熟细胞，从而维持稳态的血细胞水平。所述系统可以满足由于失血、溶血、炎症、免疫细胞减少症以及其它病因而造成的对额外细胞的增加的需求。

“祖细胞或前体细胞”是部分特化的；它自我更新并且也产生分化细胞。当干细胞分裂时，两个新细胞中的一个往往是能够再次自我复制的干细胞，因此研究者常以此来区分前体/祖细胞与成体干细胞。相比之下，当祖/前体细胞分裂时，它可以形成更多的祖/前体细胞或它可以形成两个特化细胞。祖/前体细胞可以取代损伤或死亡的细胞，因此保持组织如肝脏或大脑的完整性和功能。

在本发明中有用的分离和培养干细胞的方法是众所周知的。脐带血是造血干细胞的丰富来源。对于移植使用来说，自脐带血获得的干细胞和自骨髓或外周血获得的干细胞似乎是非常相似的。胎盘是间质干细胞的优良易得的来源。此外，已经显示间质干细胞可来源于脂肪组织和骨髓基质细胞，并且推测它们存在于其它组织中。羊水和组织是干细胞的另一种优良来源。虽然可以得到成体干细胞的器官在性质和量上有显著的差异，但是细胞之间的原始差异可能是相对表面的并且可以由它们显现的相似可塑性范围来平衡。例如，成体造血干细胞和成体间质干细胞在适当的条件下可以成为心肌细胞。对成体干细胞整个潜力范围的描述才刚刚开始。可以使用已知的方法来分离和分化干细胞。例如，在小鼠中，通过处死小鼠，用一把剪刀切断腿骨并且将干细胞冲洗出来分离骨髓细胞。也可以通过用结合不需要的细胞的抗体(如CD4+和CD8+(T细胞)、CD45+(泛B细胞)、GR-1(粒细胞))淘选骨髓细胞来从骨髓细胞中分离干细胞。这种方案的一个实例参见，Inaba等,J.Exp.Med.176:1693-1702(1992)。

图1示出由全血的梯度离心产生的层的典型视图。1示出血小板；2具有MNC和干细胞的血沉棕黄层；3蔗聚糖；以及4RBC沉淀和干细胞。

在人体中，可以从包括脐带血、骨髓以及调动的外周血的多种来源中获得CD34+造血干细胞。CD34+细胞的纯化可以通过抗体亲和程序来实现。Ho等,Stem Cells 13(增刊3):100-105(1995)描述了用于分离CD34+细胞的亲和柱分离程序。另参见，Brenner,Journalof Hematotherapy 2:7-17(1993)。用于分离、纯化以及培养扩增间质干细胞的方法是已知的。MSC的特异性抗原也是已知的(参见，美国专利号5,486,359和5,837,539)。

干细胞的特征在于通过有丝细胞分裂自我更新和分化成种种范围的特化细胞类型的能力。存在一系列潜能的干细胞。全能干细胞是可以产生完整有机体发育所需的所有组织的细胞，如受精卵。多能干细胞是可以产生所有3个胚层的干细胞的细胞，并且包括如胚胎干细胞(所述胚胎干细胞不是人类胚胎干细胞)、精原干细胞的细胞(Cell.119(7):1001-1012,2009；NATURE 440:1199-1203,2006)，或注入四倍体胚胎时可以产生完整有机体(Stem Cell Rev.2010)，但是不产生需要的胚胎外组织(如胎盘)的诱导的多能干细胞。非常小的胚胎样干细胞是在成人骨髓、血液、心脏以及其它组织中发现的细胞，它们可以产生来自所有3种胚层谱系的细胞的细胞，然而，还没有显示它们在四倍体互补测定中产生完整的有机体，因此，不清楚它们是否是真正的多能干细胞，体印迹阻止它们在四倍体互补中的激活，或它们是否受更多的限制而又是极其可塑的多效干细胞(DEVELOPMENTALDYNAMICS 236:3309-3320,2007)。多效干细胞是可以在限定的谱系内产生多种功能细胞的细胞，如造血干细胞(HSC)(J Exp Med.207(6):1127-1130,2010)、脂肪干细胞(ASC)(StemCells Dev.2010[电子版在印刷版之前])(6)或间质干细胞(MSC)(StemBook,Cambridge(MA):Harvard Stem Cell Institute；2008-2009)。

干细胞进一步的特征可以在于它们可以分化的程度，并且通过它们的潜能加以区分。潜能说明干细胞的分化潜力(分化成不同细胞类型的潜力)。

全能(a.k.a万能)干细胞可以分化成胚胎和胚胎外细胞类型。所述细胞可以构建完整的活有机体。这些细胞由卵细胞和精细胞的融合产生。受精卵的前几次分裂产生的细胞也是全能的。

多能干细胞是全能细胞的子代，并且可以分化成几乎所有的细胞，即来源于任何这三个胚层的细胞。

多效干细胞可以分化成许多细胞，但只是密切相关的细胞家族的那些细胞。

寡能干细胞可以分化成少数细胞，如淋巴或髓细胞样干细胞。

单能细胞只能产生一种细胞类型，即它们自身，但是具有自我更新的特性，这使它们与非干细胞区分开来(例如肌肉干细胞)。

两种广泛类型的哺乳动物干细胞是：从胚囊内细胞团分离的胚胎干细胞(所述胚胎干细胞不是人类胚胎干细胞)和在成人组织中发现的成体干细胞。

成体干细胞是通过细胞分裂增殖以补充死亡细胞并且使损伤组织再生的未分化细胞，它们可以在胚胎发育之后的整个身体中发现。它们也称为体干细胞，可以在幼年以及成人动物和人类中发现。成体干细胞的类型包括造血干细胞、乳腺干细胞、间质细胞、内皮干细胞、神经干细胞、嗅成体干细胞、脂肪源性干细胞、神经嵴干细胞以及睾丸干细胞。

祖细胞具有分化成特定细胞类型的倾向。然而，与干细胞相比，它们已经是更专一的：它们受迫分化成其“目标”细胞。干细胞和祖细胞之间的最重要差异是干细胞可以无限地复制，而祖细胞只能分裂有限的次数。关于准确的定义仍有论争并且这个概念仍在发展中。

术语“祖细胞”和“干细胞”有时是等同的。

已经证明在全血、骨髓、脂肪组织、脐带血以及其它组织的单核部分内发现的干细胞以及从这些单核部分分离的干细胞对人类患者提供益处。外周血单核细胞(PBMC)是具有圆形核的任何血细胞。例如：淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞。这些血细胞是在免疫系统中对抗感染和适应入侵者的关键组分。淋巴细胞群体由T细胞(CD4和CD8阳性，约75％)、B细胞以及NK细胞(组合起来约25％)组成。PBMC往往是使用蔗聚糖(一种使血液分层的亲水性多糖)从全血中提取的，而单核细胞和淋巴细胞在血浆层下形成血沉棕黄层。这种血沉棕黄层含有PBMC。此外，可以使用优先溶解红细胞的低渗溶解液从全血中提取PBMC。这种方法产生嗜中性粒细胞和其它多形核(PMN)细胞，这些细胞在获得的先天免疫防御中是重要的。已经使用骨髓吸出物的PBMC部分来治疗心肌梗塞后的患者，并且已经证明所述部分降低随后的死亡率并且轻微改善这些患者的心脏功能(Eur Heart J 27:2775-2783,2006)。虽然这些类型的治疗显著降低死亡率，但心脏功能只有轻微的改善。对这些患者进行核成像研究显示，在注射后60至90分钟内，大部分(多达97％)的冠状动脉内注射的单核部分干细胞不保留在心脏中，而是主要可以在脾脏和肝脏中发现(Circulation 111:2198-2202,2005)。其它成像研究同样证明了在全血、骨髓、脂肪组织、脐带血、胎盘、羊水以及其它组织内发现的干细胞以及从这些单核部分分离的干细胞在许多不同物种的脾脏中累积(STEM CELLS 24:2279-2283,2006；J Nucl Med 45:512-518,2004；J Nucl Med 47:1212-1219,2006；J NuclMed 47:1295-1301,2006)。

动物研究证明，施用更高数目的骨髓单核细胞引起改善的心脏修复和功能恢复(Circulation 114:2163-2169,2006)。然而，对于临床患者来说，这需要在全身麻醉下吸出大量的骨髓(多达200ml)，并且认为这对于心脏功能仍受压制的新近梗塞后患者来说是高度不可取的。为了获得更好的器官靶向和保留作用，有研究者尝试将注射的干细胞浓缩。虽然富集注射的CD34+细胞的数目使冠状动脉内注射之后的心脏中的CD34+细胞有更高的累积，但是认为这种增加干细胞递送的方法不是最佳的，因为不知道此时单核细胞部分内含有的哪些特定干细胞是组织再生所必需的(Circulation 111:2198-2202,2005)。此外，已经显示纯化的人间质干细胞(MSC)增加人脐带血CD34+干细胞的移入(Hematology VOL14NO 3:125-132,2009)。

干细胞可以是自体的或来自无关的供体。干细胞可以包含在来自骨髓、全血、脐带血、脂肪组织或其它来源的单核细胞部分内，或它们可以通过选择CD34、CD133、CD105、CD117、SSEA1-4、染料排斥(dye exclusion)或其它特异性干细胞抗原来纯化。干细胞可以使用Ficoll-Hypaque或其它市售梯度通过密度梯度离心从全血、骨髓、脐带血、脂肪组织、来自嗅粘膜的组织刮片以及可以解离到单细胞悬浮液中的其它干细胞来源(如脐带组织)分离。可以从由所述程序产生的单核细胞部分回收干细胞。或者，可以在密度梯度离心之后的其它部分内发现干细胞(Stem Cells and Development 2011 Bhartiya等)。例如，可以在PBS中将脐带血1:1稀释，小心地覆盖在Histopaque 1077(Sigma)上并且在室温下以1500rpm离心30分钟。可以进一步处理所得的如图1中描述的层，用于干细胞分离。层1是血小板层，层2是含有单核细胞的血沉棕黄层，层3是蔗聚糖层，并且层4是红细胞沉淀层。可以收集层1、2以及3，用适当的介质如有或没有FBS的DMEM F12稀释并且再次离心以获得细胞沉淀。可以用适当的介质如DMEM F12稀释层4并且在室温下在标准台式离心机中以800rpm离心15分钟。干细胞主要可以从层2(血沉棕黄层)和层4(RBC沉淀)中回收。

使用如来自BD的ARIA的细胞分类器，使用如自Miltenyi获得的那些的磁性柱，使用磁性珠粒和DYNAL磁体以及本领域技术人员已知的其它基于抗体/抗原的分离方法，可以通过在表面上表达的特定抗原进一步表征和分离干细胞。也可以通过干细胞与如本公开描述的其它细胞结合的能力来鉴别和分离干细胞。

多能干细胞的特征可以在于表达特定阶段胚胎抗原(SSEA)、转录因子Oct4和Nanog以及其它标记物。造血干细胞的特征在于表达如CD34、CD133、ckit、Sca1的标记物并且也是CD45阳性的。缩写CD是指抗原家族并且意指“分化簇”。

造血干细胞(HSC)是产生所有血细胞类型的多效干细胞，这些血细胞类型包括髓细胞样(单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞)和淋巴样谱系(T细胞、B细胞、NK细胞)。造血组织含有具有长期和短期再生能力的细胞和专用多效、寡能以及单能祖细胞。HSC构成骨髓样组织中细胞的1:10.000。HSC表达以下抗原：CD34、CD90(Thy1)、CD45、CD41、CD105、CD117(c-kit)、SCF(kit配体)、Ly6A/E(sca-1)、CD127、CD44、CD33、CD38、CD14、CD106、CD84、CD90、Flk-1、CD164、Notch1、CD338(ABCG2)、CD202b、CD184、AC133(＝CD133)以及CXCR4。

间质干细胞或MSC是可以分化成多种细胞类型的多效干细胞，这些细胞类型包括：成骨细胞(骨细胞)、软骨细胞(chondrocytes、cartilage cell)以及脂肪细胞(adipocytes、fat cell)。间质干细胞的特征在于表达：CD45、CD90、CD105、CD34、CD31、CD29、CD106、CD44、CD51、CD166、Ly6A/E(sca-1)、CD117、CD71、CD10、CD49d、CD49e、TNAP、PTPLAR、W5C5抗原、W3D5抗原、W4A5抗原以及CXCR4。

内皮干细胞(或内皮祖细胞或前体细胞)是多效干细胞。它们是在骨髓中发现的三种干细胞类型之一并且表达以下抗原：CD45、CD31、CD34、CD105、CD146、CD106、CD54、CD117、CD102、CD120a、CD120b、CD14、CD29、CD49d、CD49e、CD49f、CD62P、CD62L以及CXCR4。

神经干细胞(NSC)是产生神经系统的主要表型的自我更新、多效细胞。已经从纹状体组织(包括成年小鼠脑组织的室下区，即神经原区之一)和成人大脑的各种区域(包括非神经原区域，如脊髓)以及包括人类的多种物种分离出神经祖细胞和干细胞。NSC表达以下抗原：CD29、CD146、Notch1、Ki67、CD24、CD49f、波形蛋白、CD81以及CXCR4。神经祖细胞表达以下抗原：57D2抗原、W4A5抗原以及CXCR4。

如来自iPS、SCNT、ANT-OAR的胚胎干细胞(所述胚胎干细胞不是人类胚胎干细胞)、精原干细胞、睾丸干细胞以及多能干细胞表达以下抗原：CD24、CD9、Nanog、Smad、Runx2、cmyc、CD30、GSC、Oct3/4、Sox2、SSEA 1(CD15)、SSEA 4、CD324、CD29、Tra-1-60、Tra-1-81、CD338(ABCG2)、CD49f、FoxD3、Stat3、Hox11以及CXCR4。

VSEL对SSEA1、Oct4、Nanog、Rex1以及其它多能干细胞标记物并且对CD133、CD34、AP、cMet、LIF-R以及CXCR4呈阳性的。(J Am Coll Cardiol 53(1):10-20,2009；Stem CellRev 4:89-99,2008)。此外，通常鉴别出特征在于相异的标记物的新型干细胞，如在成人脾脏中发现的Hox11+干细胞。(Horm Metab Res 40:137-146,2008)。已经鉴别出在成人脾脏中仍然存在的胎儿干细胞，它能够再生出胰岛细胞，然而，这种细胞存在于脾脏的CD45阴性部分中(Mol Cell Proteomics 4(10):1459-1470,2005)。Hox11+脾细胞虽然对CD45呈阴性，但它确实表达OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC以及NANOG，使它们可能与胚胎干细胞(所述胚胎干细胞不是人类胚胎干细胞)和诱导的多能干细胞(iPS)等价(Int J Biochem CellBiol.2009Dec 18。

干细胞的治疗用途

干细胞治疗正在研究中并且被完善用于治疗许多疾病。可以受益于干细胞治疗的病状包括：眼疾、神经疾病、GI疾病、肌肉骨胳疾病、代谢疾病、内分泌疾病、血管疾病、肺病、心脏病、心血管疾病、免疫介导的疾病、自身免疫介导的疾病、心血管疾病以及再生治疗具有益处的所有疾病。NIH网站www.clinicaltrials.gov上包含的临床试验信息列出超过3000个干细胞研究。在评价中的疾病包括：脉管炎、使用内皮祖细胞的风湿病、通过在患有结缔组织疾病的患者中植入自体单核细胞的治疗性新生血管形成、在患有进行性核上性麻痹的患者中重复施用粒细胞集落刺激因子用于血液干细胞调动、皮质基底节变性以及多系统萎缩症；血液系统恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、癌症、骨硬化病、再生障碍性贫血和血细胞减少症、镰状细胞病和地中海贫血、缘干细胞缺陷、乳腺癌、急性心肌梗塞(参见美国专利号7,862,810，isolating and culturing cardiac stem cells that are c-kitpositive)、冠状动脉疾病(参见美国专利号7,470,538，isolating and administering byinfusion into the coronary artery enriched CD133⁺/CD34⁺/CXCR4^- cells isolatedfrom umbilical cord blood)、周围血管疾病、心力衰竭、I型糖尿病(参见美国专利申请公布号2011000830，Human Adipose Derived Insulin Making Mesenchymal Stem CellsFor Treating Diabetes Mellitus)、2型糖尿病、中风、脊髓损伤、成神经细胞瘤、多发性硬化(参见美国专利申请公布号20100166712，administering autologous mesenchymalstem cell-derived neural precursors to treat MS)、系统性硬化、红斑狼疮、慢性伤口愈合、灼伤、骨折愈合、软骨修复、中枢神经系统肿瘤、骨关节炎、肾衰竭、帕金森氏病(Parkinson’s Disease)(参见美国专利申请公布号20100010087，Methods for InducingStem Cell Migration and Specialization with EC-18)、骨髓瘤、糖尿病的足、肝脏和胆汁性肝硬化、扩张型心肌病、贫血、视网膜色素变性、克罗恩氏病(Crohn’s Disease)、糖尿病神经病变、肥大细胞增生病、卵巢癌、癫痫、重症肌无力、自身免疫疾病、肉芽肿病、骨坏死、肝脏衰竭、PMD疾病、脂肪营养不良(lypodystrophy)、脱髓鞘疾病、软骨缺陷、视网膜疾病、狼疮性肾炎、阿尔茨海默氏病、外伤性脑损伤、肉瘤、肌炎、高血糖、黄斑变性、溃疡性结肠炎、肌肉退化以及其它。这些干细胞治疗的限制包括：无论是向特定的损伤器官或向骨髓和脾脏中的造血中心均不能最佳地递送和移入干细胞。

外源性干细胞的递送

可以通过许多途径向患者递送干细胞。例如，干细胞(在使干细胞活力最佳化并且消除细胞凝集的适当赋形剂中)可以通过经由针头、导管或其它微侵袭性方法以以下方式施用：静脉内、动脉内、肌肉内、真皮内、皮下、腹膜内、心包内、眼内、经血管、经心内膜、经心外膜、经中隔、心外膜、通过冠状静脉、通过经皮经心肌血管再生(percutaneoustransmyocardial revascularization)、鞘内、器官内、鼻内、心室内、或硬膜内。干细胞也可以通过这些途径在设计成帮助干细胞保留在注射部位的‘基质’混合物或混悬液混合物中施用，这些混合物包括例如胶原、纤维蛋白原、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、海藻酸盐、琼脂糖、甲基纤维素、脂质体、纳米粒子、胶束、白蛋白泡、脂肪酸或其它半固体混悬液制剂。

可以用于递送干细胞的基于导管的递送系统包括标准球囊血管成形术输注导管(standard balloon angioplasty infusion catheters)、经皮冠状动脉递送导管、跨线气囊导管的截流膨胀(stop flow inflations of over-the-wire balloon catheters)、斯-甘二氏(Swan Ganz)型导管、希克曼(Hickman)型导管、福利(Foley)型导管、中心静脉导管、猪尾型导管、SmartPort^TM系统、金属头磁导导管(metal-tipped magnet guidedcatheters)，如Stereotaxis Inc或Mitralign开发的Gentle Touch Magnetic NavigationSystem、Accucinch System，以及直接注入器官中的导管如HELIX^TM、MyoCath^TM、NOGA R-引导的Myostar^TM、Stiletto^TM、或血管内超声(IVUS)引导的TransAccess Delivery System^TM，或经由动脉途径递送的导管如OpenSail^TM、Concerto^TM、来自Mercator的微注射器输注导管以及Maverick^TM，或经由可植入装置治疗，如左心室辅助装置(LVAD)、两心室辅助装置(BiVAD)、Optimizer^TM、如在US 2009/0299269中描述的细胞递送导管。

干细胞也可以使用侵袭性手术手段施用至患者并且然后直接注射到器官中或应用于器官。对器官应用干细胞组合物的应用尤其包括胶原基质、胞外基质组合物、由纤维蛋白或其它胞外基质材料制成的生物聚合物微线、含有胞外基质和生物可降解材料的贴片、纤维蛋白贴片、基于海藻酸盐(alginateor)琼脂糖的贴片、主要由胞外基质材料和可以包含如葡聚糖的组分的生物可降解的生理学上惰性材料组成的支架、具有器官特异性抗原或结合分子的涂层干细胞、残余胞外基质(也称为支架或脱细胞器官，来自离体消化的器官供体或遗体器官)和接触镜等。

内源性干细胞的调动

用干细胞治疗患者的另一种方法包括调动他们自身的干细胞从器官(如骨髓)离开并且进入循环。例如，治疗剂如作为Neupogen销售的粒细胞集落刺激因子(G-CSF；非格司亭(Filgrastim))或作用时间更长的形式如Neulasta，作为Leukine销售的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CFS；Sargramostim)，由Genzyme Corporation作为Mozobil/Plerixafor销售的AMD3100，引起循环内干细胞数目增加。Neupogen作为含有300或480微克非格司亭的单次使用小瓶或单次使用注射器提供。赋形剂主要由乙酸盐、山梨糖醇、聚山梨醇酯80、钠和注射用水组成。Neupogen在临床上作为静脉内每天两次的剂量、皮下每天一次的剂量或慢性皮下治疗使用。已经批准Neupogen用于加速接受骨髓抑制化学治疗的癌症患者、接受诱导或巩固化学治疗的急性骨髓性白血病患者、接受骨髓移植的癌症患者、严重慢性中性粒细胞减少患者以及进行外周血祖细胞采集和治疗的患者中的嗜中性粒细胞计数的恢复。Neupogen典型地在化学治疗4天之后开始在每天基础上以每天每公斤体重3与69微克之间进行施用，持续治疗2至20天。根据Neupogen的包装说明书，G-CSF调控骨髓内的嗜中性粒细胞的产生并且影响嗜中性粒细胞祖细胞增殖、分化以及选择的终末细胞功能激活(包括吞噬能力增加，与呼吸爆发相关的细胞代谢激发、抗体依赖性杀伤，和与细胞表面抗原相关的一些功能的表达增加)。还显示G-CSF通过以下方式调动干细胞进入循环：它降低CXCL12在骨髓基质上的表达和降低CXCR4表达的作用，通过导致CXCR4的N末端的截断(1)，通过降低VCAM在骨髓中的表达(2)。已经显示G-CSF增加CXCL2(CXCR2的同源配体)。因为批准用于临床治疗，还显示G-CSF增加循环中的非常小的胚胎样干细胞的数目。

根据包装说明书，LEUKINE被指示用于将造血祖细胞调动到外周血液中，以便通过白细胞去除术采集。与不经过调动的采集相比，调动允许采集增加数目的能够用于移入的祖细胞。在清髓性化学治疗之后，移植增加数目的祖细胞可以引起更快速的移入，这可以导致减少的对支持性护理的需要。在外周血祖细胞移植之后施用LEUKINE进一步加速了髓细胞的再造。LEUKINE的推荐剂量是每天每平方米身体表面积250微克，作为24小时静脉内输注或每天一次的皮下施用。对于调动干细胞进入循环，用LEUKINE的最佳处理时间显然是5天。在单独响应于G-CSF，为不良调动者的患者中，还显示Leukine与G-CSF组合是有效的。

Mobozil化学名称为1,1'-[1,4-亚苯基二(亚甲基)]-二-1,4,8,11-四氮杂环十四烷。它的分子式为C28H54N8。Mobozil是趋化因子受体CXCR4的抑制剂，并且阻断它的同源配体SDF-1(CXCL12)的结合。Mobozil通过破坏干细胞表达的CXCR4与骨髓的基质和其它细胞表达的SDF-1(CXCL12)的结合导致循环干细胞的数目增加。Mobozil处理之后的最佳调动依赖于补体激活。已经批准Mobozil的皮下注射液与Neupogen组合使用，以便将造血干细胞调动到外周血液中用于采集，并且随后自体移植在患有非霍奇金淋巴瘤(NHL)和多发性骨髓瘤(MM)的患者中。Mozobil是作为含有1.2mL的20mg/mL溶液的单次使用小瓶销售的。根据如包装说明书中详述的以下推荐时程表用Mozobil治疗患者：在患者每天接受一次G-CSF持续4天之后启始Mozobil治疗；重复Mozobil给药至多达连续4天；基于0.24mg/kg实际体重选择剂量；在启始血浆分离(apheresis)之前大约11小时通过皮下注射施用。已经显示G-CSF与Mobozil的组合比单独使用G-CSF向循环中调动更多的原始干细胞。

已知调动干细胞(包括造血干细胞)进入循环的其它试剂包括肝细胞生长因子(hepatocytre growth factor)(HGF)、促红细胞生成素、甲状旁腺激素、Flt3-配体、干细胞因子(SCF)。已知或预期导致增加干细胞和祖细胞的调动进入循环的的其它试剂尤其包括：增加干细胞增殖的试剂，如集落刺激因子；增加内源性G-CSF产生的试剂，如灰树花(Maitake)β-葡聚糖；降低SDF-1或CXCR4表达的试剂，包括CXCR4下调激动剂；降低SDF-1或CXCR4的结合亲和力的试剂；减小CXCR4的信号传导的试剂；阻断干细胞离开循环的生物累积的试剂；增加干细胞进入循环，如激活补体或增加血浆鞘氨醇-1-磷酸的试剂；上调CXCR2在骨髓中或其同源配体CXCL2的表达的试剂；降低骨髓中的VCAM表达的试剂，如化学治疗剂环磷酰胺，维甲酸受体激动剂、VLA-4的小分子抑制剂(如BIO5192)或VLA4的其它阻断剂、降解骨髓表达的CXCL12的金属蛋白酶或羧肽酶激活剂，或选择的化学治疗方案，或向G-CSF处理中添加环磷酰胺或拓扑异构酶抑制剂依托泊苷的方案，摄入岩藻聚糖，通过趋化因子CXCL2和多聚乙酰神经氨酸。

自发释放的内源性干细胞

用干细胞治疗患者的另一种方法包括防止自发释放的内源性干细胞隔离在淋巴组织中。干细胞和祖细胞每天自发释放到血流中。使用连体小鼠(parabiotic mice)的实验证明脾脏容易以循环交换干细胞和祖细胞。此外，已经证明疾病状况引起循环干细胞和祖细胞的水平增加，所述疾病尤其例如，高胆固醇血症、心脏病发作、STEMI或CAD、动脉结扎或短暂性脑缺血、在中等海拔逗留、原发性甲状旁腺功能亢进以及视网膜色素上皮细胞损伤。防止自发释放的或疾病诱导的干细胞封存于淋巴组织中会使更多的干细胞可用于损伤的组织或器官的再生。

用于使淋巴组织中的生发中心再生的组合物和方法

本发明通过提供在辐射或化学治疗之后使淋巴组织中的生发中心的数目再生、复原以及增加的方法和组合物满足了这个需求。根据本发明的使淋巴组织中的生发中心复原或再生的治疗剂包括免疫激活剂、共刺激分子、免疫佐剂以及其组合。

在本发明的一个实施方案中，通过施用佐剂使淋巴组织中的生发中心再生。所述佐剂的实例包括病原体相关的分子样式(molecular patterns)、脂质体、脂多糖、用于抗原的分子笼、细菌细胞壁组分、内吞的核酸如双链RNA(dsRNA)、单链DNA(ssDNA)以及含有未甲基化的CpG二核苷酸的DNA、矿物盐如氢氧化铝(明矾)、磷酸铝、磷酸钙、氢氧化铝、磷酸铝钾、磷酸氢铝钠以及羟基磷酸铝硫酸盐(aluminum hydroxyphosphate sulfate)。其它佐剂包括水包油乳液如角鲨烯、蒙太德(montanide)ISA720(角鲨烯)或ISA51(Drakeol)、MF59(Novartis)以及SBAS2。可以根据本发明使用的另一类佐剂是颗粒佐剂如病毒体、皂甙以及脂质，包括微生物衍生物如单磷酰脂质A CpG基元，称为BCG-CWS(牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis))的BCG激发的免疫。

脂多糖和丝裂素如刀豆蛋白(Concanavalin)A、细菌细胞壁的组分、古细菌脂质体(archaeosomes)(古细菌史氏甲烷短杆菌(archaeon Methanobrevibacter smithii)的醚甘油酯)、TLR4激动剂GLA吡喃葡萄糖基脂质佐剂、LPS和BCG(Immune Design)、TLR2激动剂BCG、肽聚糖和革兰氏阳性细菌、TLR5激动剂鞭毛蛋白、血吸虫卵抗原(SEA)、单核细胞李斯特菌(listeria monocytogenes)(LM)。其它佐剂包括钟样受体激动剂和激活剂，包括长度至多100个碱基(最优选20个碱基的长度)的CpG寡核苷酸，TLR1激动剂如Pam3Cys，TLR2激动剂如Pam3Cys；TLR3激动剂如dsRNA和聚I:C；TLR7激动剂如咪唑喹啉，例如咪喹莫特(Imiquimod)(R-839)和雷西莫特(Resiquimod)(R-848)；TLR8激动剂如雷西莫特(R-848)；和TLR9激动剂如聚I:C和CpG。本发明还包括使用植物衍生物佐剂β-葡聚糖、基于皂甙的QS21以及刀豆蛋白A。

本发明的另一个实施方案包括增加脾脏中的活跃生发中心的数目从而增强进行癌症治疗、非清髓性治疗或清髓性治疗，包括化学治疗、辐射以及组合治疗的患者中的干细胞移植移入和血液恢复。活跃生发中心数目增加引起化学治疗调节的方案和癌症治疗之后脾脏中的干细胞结合和移入增强和随后造血恢复的速率加速。除了治疗癌症和白血病之外，非清髓性治疗用于治疗自身免疫疾病(Pediatr Clin North Am.57(1):239-71,2010)，包括I型糖尿病(JAMA.297(14):1568-1576,2007)、狼疮以及多发性硬化(www.clinicaltrials.gov)。本发明提供通过增加脾脏生发中心的数目并且从而增加移植的干细胞结合、移入以及增殖来增强进行清髓性或非清髓性调节的癌症或自身免疫患者的造血恢复的方法。例如，在清髓性或非清髓性调节方案之后进行干细胞治疗的患者在所施用的干细胞移入和造血再生所需要的时间期间有感染和死亡的风险。通过增加脾脏中的可用于干细胞结合的生发中心的数目来加速和增加干细胞移入可以降低造血恢复所需要的时间，并且从而减小这些患者感染和死亡的风险。

干细胞可以是自体的或来自无关的供体。干细胞可以包含在来自骨髓、全血、脐带血、脂肪组织或其它来源的单核细胞部分内，或它们可以通过选择CD34、CD133、CD105、CD117、SSEA1-4、染料排斥或其它特异性干细胞抗原来纯化。

脾脏生发中心可以通过激活CD40受体的处理来特异性地增加(Blood.104:4088-4096,2004；J.Clin.Invest.112:1506-1520 2003)(50)(51)。所述功能性受体是具有TNFR1或TNFR2组分的CD40三聚体或多聚体。激活CD40受体的处理的实例包括：CD40的激动性抗体激活CD40受体，solCD40L的适当构象可以激活CD40受体，并且通过改变转录速率如经由AT-钩转录因子AKNA、mRNA稳定性或蛋白质稳定性来增加CD40受体表达的试剂也可以引起活性和信号传导增加。或者，TRAF和TTRAP家族成员与CD40受体相互作用并且介导它的信号传导，从而引起活跃生发中心数目增加。激活生发中心B细胞环加氧酶2或EP2受体的试剂复制CD40受体接合并且可以引起活跃生发中心的形成增加。激活生发中心的形成和持久性的其它手段包括抑制或失去CCR7(J.Leukoc.Biol.85:409-417,2009)。激活生发中心的形成和持久性的其它手段包括抑制或失去CCR7(J.Leukoc.Biol.85:409-417,2009)。

在本发明的另一个实施方案中包括施用免疫刺激分子以促进淋巴组织中的生发中心的再生。免疫刺激分子可以是抗体、融合蛋白、可溶性配体、小分子、转录调空剂、mRNA或蛋白质稳定剂以及其它免疫刺激部分。例如，可以用可溶性B7蛋白和如具有TeGenero1412化合物的抗体来激活共刺激CD28途径。

TGN1412是设计为T淋巴细胞上的CD28受体的激动剂的人源化单株抗体，它刺激T淋巴细胞的产生和激活。TGN1412由Boerhinger Ingelheim制造。

其它共刺激分子和途径包括OX40/OX40配体、4-1BB/4-1BB配体、B7/CD28家族；B7-1/CD80、CD28、B7-2/CD86、CTLA-4、B7-H1/PD-L1、ICOS、B7-H2、PD-1、B7-H3、PD-L2/B7-DC、B7-H4、PDCD6、BTLA、共刺激TNF超家族分子；4-1BB/TNFRSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40配体/TNFSF5、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4和TACI/TNFRSF13B、SLAM家族；2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6和SLAM/CD150以及其它共刺激分子；CD2、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、Ikaros、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、LAG-3、LMIR1/CD300A、CRTAM、DAP12、树突细胞相关凝集素-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TCL1A、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、HLA-DR以及促红细胞生成素肝细胞受体配体。

可以增强生发中心再生的其它试剂是已知引起细胞因子爆发的试剂，如抗CD20(利妥昔单抗)。

其它免疫激活剂可以包括IL21受体激动剂，即激动性抗体。

临床前或临床上使用的其它佐剂包括：

内吞核酸如双链RNA(dsRNA)、单链DNA(ssDNA)和含有未甲基化的CpG二核苷酸的DNA。

腺病毒和腺病毒组分如5型腺病毒(Ad5)。

维甲酸诱导型基因(RIG)-1-样受体(RLR)的激动剂和激活剂。

P2X1、P2X4或P2X7激活剂或激动剂。

结合核苷酸的寡聚化结构域样受体(NLR)的激动剂和激活剂。

Advax、脂质体、壳聚糖微球以及二甲基-二(十八烷基)溴化铵(DDA)。

开发中的最新人用佐剂是ISCOMS、QS21、AS02以及AS04。

ASO₄是去乙醯化单磷酰脂质A MPL加铝。

CpG寡核苷酸可以是长度至多100个碱基，最优选20个碱基长度的寡核苷酸。

也可以静脉内(i.v.)施用抗CD3OKT3以诱导淋巴组织内的生发细胞的再生。

本发明还包括施用两种或两种以上的治疗剂以在淋巴组织内产生生发中心。在本发明的另一个实施方案中，连同使生发中心再生的治疗剂施用干细胞。

佐剂的给药

磷酸铝钾可以以约0.17mg的剂量施用。

磷酸铝可以以约1.5mg的剂量施用。

氢氧化铝可以以约0.15mg至约0.3mg的剂量施用。铝盐一般来讲可以以高达0.85mg的剂量施用。

羟基磷酸铝可以以约0.225mg的剂量施用。

作为组合的氢氧化铝和磷酸铝可以以约0.45mg的组合剂量施用。

油乳液的给药

SBAS-2是MPL和QS21的水包油乳液。

水包油乳液如蒙泰得ISA720(角鲨烯)或ISA 51(Drakeol)。

角鲨烯在Novartis使用的MF59佐剂中，并且对于用于佐剂活性的0.5至1ml的注射液以每一百1.95％或2份或每100ml 4克来给药。

MF59佐剂含有(力保健(Lipovant)；4-5％w/v角鲨烯、0.5％w/v吐温80、0.5％司盘85以及任选不同量的胞壁酰基三肽磷脂酰基-乙醇胺(MTP-PE)，它激活称为NOD-LRR的非-TLR感觉受体)。

微生物衍生物的给药

称为BCG-CWS(牛分枝杆菌)的BCG-激发的免疫：成人每小瓶1至8×10⁸个集落形成单位(CFU)，儿童剂量减半。

古细菌脂质体(古细菌史氏甲烷短杆菌的醚甘油酯)以每克体重0.1至500微克并且最优选每mg体重38微克给药。

钟样受体激动剂和激活剂的给药

长度至多100个碱基，最优选20个碱基长的CpG寡核苷酸以每20-25克体重1、10、100、500微克给药。优选的剂量是每20-25mg体重10μg。

可以用可溶性B7蛋白和如具有TeGenero 1412化合物的抗体来激活共刺激CD28途径。TGN1412是设计为T淋巴细胞上的CD28受体的激动剂的人源化单株抗体，它刺激T淋巴细胞的产生和激活。TGN1412由Boerhinger Ingelheim制造。出于免疫激活以再生淋巴生发中心的目的，TGN1412的优选剂量为经3-6分钟输注给予，小于0.1mg/kg体重。用于生发中心再生的TGN1412的有效剂量在0.001mg/kg至0.1mg/kg之间，优选0.01mg/kg。

可以增强生发中心再生的其它试剂是已知引起细胞因子爆发的试剂如抗CD20(利妥昔单抗)，它以50mg/mm2或150mg/mm2但低于375mg/mm2给药；抗CD3OKT3，它以小于5mg/天的优选剂量静脉内(i.v.)施用，持续10至14天；抗CD52(CAMPATH)抗体，它以30mg经2小时输注施用，每周给予三次，持续多达12周。

其它免疫激活剂可以包括IL21受体的激动剂(激动性抗体)，在0.001mg/kg至50mg/kg之间，优选在0.01和0.1mg/kg之间给药。蛋白配体激动剂可以是在清髓性或非清髓性处理之后每天在0.0001mg/kg至多达50mg/kg之间给予，持续多达28天。一般来讲，取决于激动剂的分子量和生物分布，蛋白配体激动剂在抗体治疗剂的剂量的1/10便是有效的。

小分子免疫激活剂可以以单一口服剂量在每天1mg至1000mg之间，或以特定的间隔经口递送，所述间隔可以包括每2小时、每4-6小时或更长的间隔时期。

ASO₄是去乙醯化单磷酰脂质A MPL加铝，它以50微克在0.5ml剂量的Fendrix(GSK)中与0.5mg磷酸铝组合给予。

长度至多100个碱基，最优选20个碱基长的CpG寡核苷酸以每20-25克体重1、10、100、500微克加明矾给药。优选剂量是每20-25mg体重10μg。

施用

诱导淋巴组织内的生发中心再生的治疗剂的施用可以通过包括以下的任何方法进行：经由针头、导管或其它微侵袭性方法静脉内、动脉内、经口、肌肉内、雾化、吸入、真皮内、皮下、腹膜内、心包内、眼内、经血管、经心内膜、经心外膜、经中隔、心外膜、通过冠状静脉、经皮经心肌血管再生、鞘内、器官内、鼻内、心室内或硬膜内。

附图说明

图1示出由全血的梯度离心产生的层的典型视图。

具体实施方式

以下实施例说明调控或缓和可用于参与干细胞结合的结合部位的数目的方法和组合物的实验成果。

实施例1

当施用至异基因小鼠时富含干细胞的骨髓和全血单核部分与脾脏的白髓边缘的B 细胞区结合

使用Histopaque从雄性129S1/SvlmJ小鼠分离骨髓和全血单核细胞部分并且合并。将细胞在37℃、5％CO2下孵育4天以使分化的体细胞消亡，从而浓缩单核细胞中的干细胞部分。然后，根据制造商的说明书将所得的细胞用细胞示踪橙(CTO Invitrogen)标记。通过眼球后注射对受体仔畜施用大约1千万标记的细胞，并且90分钟后对小鼠放血并收集血液，冲洗血管系统的残余红细胞并且采集脾脏。将脾脏在1％PFA中固定过夜，并且然后埋入低熔点、低胶凝化温度的琼脂糖中并且以每片200微米的厚度进行切片。使用免疫荧光将MNC干细胞与脾脏的结合可视化。含有干细胞部分的标记的MNC与脾脏的白髓边缘的B细胞区结合。来自放血期间收集的全血的MNC部分的荧光免疫检查证明了注射之后90分钟，1千万注射的标记细胞中有大约40,000个在循环中被不断发现。

结果和结论：富含CTO标记的干细胞的MNC细胞与白髓区外周结合。所述细胞的结合在B细胞区上是组织学上明显的。这显示当施用至异基因小鼠时，富含干细胞的骨髓和全血单核部分与脾脏的白髓边缘的B细胞区结合

实施例2

CD34+、CD105+以及CD117+纯化的干细胞与含有标记的MNC干细胞的部分结合相同 的脾脏区

使用Histopaque从雄性小鼠分离骨髓和全血单核细胞部分并且合并。然后将用细胞示踪绿(CTG,Invitrogen)标记的MNC细胞与生物素标记的CD34、ckit以及CD105的抗体一起孵育并且根据制造商的推荐使用Miltenyi磁性分离柱纯化。将一部分分离的MNC用CTO单独标记。将一百万CTO标记的MNC与205,000CTG标记的纯化干细胞在4℃下在100-200微米厚的新鲜脾脏切片上共同孵育12-18小时。彻底洗涤脾脏切片以去除未结合的细胞，在1％PFA中固定一小时并且然后湿片(wet mounted)用于荧光成像。使用MetaMorph软件捕获并且叠加所得的红色(MNC)和绿色(干细胞)结合。

结果和结论：纯化的干细胞群体与相同的脾脏区结合为MNC组分。这指示CD34+CD105+和CD117+纯化的干细胞与相同的脾脏区结合为含有标记的MNC干细胞的部分。

实施例3

骨髓和全血单核部分干细胞与脾脏生发中心中的PNA阳性区域结合

使用Histopaque从成年小鼠分离骨髓和全血单核细胞(MNC)。根据制造商的推荐用细胞示踪染料如细胞示踪橙、绿或蓝、DiI或钙黄绿素橙或蓝将所得的单核细胞染色。使用FITC标记的PNA(10ug)、IgD(10μg)或抗CD21(10μg)来鉴别脾脏白髓中的特异性B细胞区。PNA标记生发中心，IgD标记滤泡区，并且抗CD21标记边缘区和外套区(mantle zones)。FITC标记的抗CD3(200ng至1μg)用于鉴别脾脏白髓中的T细胞区。彻底洗涤之后，在4℃下使用1％PFA将结合的细胞和抗体在脾脏切片上固定1小时。观察湿片切片的荧光并且使用MetaMorph软件拍摄照片。

结果和结论：在4℃下孵育15小时之后，CTO标记的MNC与活跃PNA+生发中心结合。没有观察到CTO标记的MNC结合与IgD或抗CD21共同局部化(colocalized)。这指示骨髓和全血单核部分干细胞与脾脏生发中心中的PNA阳性IgD阴性CD21阴性区域结合。

实施例4

从全血和骨髓单核细胞部分分离的CD34+、CD105+、CD117+干细胞与脾脏白髓的 PNA+生发中心结合

将来自小鼠全血和骨髓的单核细胞部分合并，用CTO标记并且然后用生物素化抗CD34、抗CD117以及抗CD105孵育，并且然后根据制造商的说明书使用Miltenyi磁性细胞分离柱分离抗体结合的细胞。回收的CD34+CD105+CD117+干细胞的数目在起始MNC部分的0.3％至3％范围内。

将所得的CD34+CD105+CD117+细胞与10μg PNA一起在新鲜小鼠脾脏切片上共同孵育15小时。以每个脾脏切片100,000(A)、50,000(B)、25,000(C)或10,000(D)个细胞添加阳性选择的细胞。类似于MNC孵育，纯化的干细胞与脾脏白髓的PNA阳性生发中心结合。干细胞以浓度依赖性方式结合。细胞与生发中心中的不连续小生境结合，并且大于约100,000的大量添加的细胞产生更强的结合信号，而不是扩展到额外小生境(参见实施例2)。

结果和结论-这些结果指示从全血和骨髓单核细胞部分分离的CD34+、CD105+、CD117+干细胞与脾脏白髓的PNA+生发中心结合。

实施例5

在MNC部分中的干细胞的结合被抗CD45抗体阻断

MNC和干细胞与脾脏切片的结合被大鼠单克隆IgG2b抗小鼠抗CD45(800纳克至4微克)阻断，但是不被抗CD45R(10微克)或抗CD3抗体(1微克)阻断。将30-F11大鼠抗小鼠抗CD45抗体(Santa Cruz Biotechnology)或17A2抗CD3抗体(Santa Cruz Biotechnology)按1:50或1:10稀释并且与250,000CTO标记的MNC共同孵育一小时。将MNC结合按结合小生境的数目和小生境的尺寸通过目测计数。CTO-MNC对照新鲜脾脏切片的每个切片具有中等尺寸至大尺寸的3-6个MNC结合小生境。抗CD3抗体不影响MNC结合小生境的数目或尺寸。按1:50稀释的抗CD45 30-F11抗体使MNC结合小生境的数目和尺寸均降低一半。按1:10稀释的抗CD45 30-F11抗体完全消除了CTO-MNC与新鲜脾脏切片的结合。

在另一个实验中，将标记的MNC在30-F11抗CD45(4微克)或PC3/188A抗CD3(1微克)(Santa Cruz Biotechnology)存在下在脾脏切片上孵育1小时。

在另一个实验中，将细胞示踪橙(CTO)标记的MNC的抗体与CD45R或30-F11抗CD45一起在4℃下孵育15小时。1:10稀释的(5μg)CD45R抗体(Miltenyi Biotec)不阻断CTO-MNC与新鲜小鼠脾脏切片结合。相比之下，1:10的(4μg)30-F11抗CD45抗体(Santa Cruz)降低CTO标记的MNC与新鲜脾脏切片结合。CD45R结合滤泡区B细胞但是不结合活跃生发中心。

与30F-11抗CD45的1:10共同孵育使CTO标记的MNC与新鲜脾脏切片的结合降低大约75％。

结果和结论：这些数据指示，MNC部分中的干细胞与脾脏的结合被抗CD45抗体阻断。

实施例6

CD45表位被30-F11大鼠IgG2b抗小鼠抗CD45抗体结合。30-F11结合小鼠CD45的所 有同工型

30-F11表位的精确结合从未被绘制出(mapped)。30-F11通过用小鼠脾脏和胸腺细胞免疫产生。小鼠CD45同工型1的胞外结构域包含氨基酸24至564。同工型2丢失氨基酸31至73，而同工型3丢失氨基酸31至169。由于据报导30-F11结合小鼠CD45的所有同工型，结合表位因此应该在同工型1中的氨基酸170至564之间。蛋白质的抗原区可以使用SwisProt网站上发现的疏水性(Kyte Doolittle)和可及性(accessibility)算法来预测。抗原区最可能在低疏水性和高可及性的区域中发现。在人类序列中接近501至521的氨基酸残基具有低疏水性预测值，这指示蛋白质的这个区域是潜在的抗原部位。这个区从小鼠到人类也是相当守恒的。(参见Okumura M.等,1996Aug 15；157(4):1569-75)。

实施例7

免疫佐剂增加生发中心形成并且增加单核干细胞部分与脾脏的结合

在正常小鼠中通过使用不完全弗氏佐剂(Incomplete Freund’s Adjuvant)或Ribi进行有目的的免疫来引出活跃生发中心。在第0天用按1:1混合有PBS或0.5ml RIBI佐剂的0.5ml不完全弗氏佐剂(FIA)腹膜内(IP)注射小鼠。在免疫之后第7天或第14天，在阿佛丁(avertin)麻醉之前将小鼠用100U腹膜内肝素肝素化30分钟。通过眼球后眼睛出血对小鼠放血，总共获得1.5至1.8ml全血，将它添加在15ml锥形管中的200μl 5U/ml肝素中。然后，切断腹主动脉和腔静脉并且通过经由升胸腔腔静脉(ascending thoracic vena cava)缓慢推注10ml 5U/mL肝素将残余血液完全从血管系统中冲洗出来。将脾脏移出并且放入生长培养基中，并且随后埋入软琼脂糖中并且切片以获得200微米厚的均匀切片。用汉克斯(Hanks)缓冲盐溶液将胸骨骨髓和股骨骨髓从骨骼中冲洗出来，并且使用Histopaque分离全血和骨髓中的单核干细胞部分并且合并。使用FITC标记的PNA(10μg)通过在4℃下孵育过夜来鉴别脾脏切片上的生发中心。在与PNA一起孵育过夜之后，无需冲洗，将CTO标记的单核干细胞部分在4℃下添加至切片，持续1小时。彻底洗涤之后，在4℃下使用1％PFA将结合的细胞和标记的PNA在脾脏切片上固定1小时。观察湿片切片的荧光并且使用MetaMorph软件拍摄照片。

免疫7天之后的PNA结合在FIA和RIBI处理的小鼠中是相似的，两者几乎都是对照的结合的两倍。然而，FIA处理的小鼠比RIBI处理的小鼠更健康，因此所有后续实验均用FIA进行。比较FIA处理之后的第7天和第14天，PNA亮度在第7天更高，然而，第14天的活跃生发中心似乎被更紧密组织并且更紧凑。与对照相比，FIA免疫使小鼠脾脏中的活跃生发中心的数目加倍。向脾脏中添加CTO标记的单核干细胞部分(从对照小鼠分离)证明了在FIA处理的小鼠中观察到的活跃生发中心的形成增加也引起单核干细胞与脾脏的结合显著更大。与结合对照脾脏相比，第7天的单核干细胞结合增加了大约3-5倍，而单核干细胞部分结合比与对照脾脏的结合增加多达并且在一些情况下超过10倍。

结果和结论：这些数据指示免疫佐剂增强生发中心形成并且增加单核干细胞部分与脾脏的结合。

实施例8

活跃生发中心形成的抑制减少离体干细胞与脾脏的结合

在采集小鼠脾脏和干细胞用于干细胞与脾脏切片结合的离体分析之前7天，通过腹膜内注射用溶解在乙醇(1份)和PBS(9份)中的1mg地塞米松处理小鼠。对照小鼠只用总体积为1ml的乙醇(1份)和PBS(9份)处理。在第7天，采集并且如实施例7中所详述处理小鼠。使用来自对照小鼠的单核干细胞部分用于对对照和地塞米松处理的脾脏切片进行结合研究。在实验前7天，用单次的1mg地塞米松处理之后，单核干细胞结合在第7天减少30-40％。

在采集之前7天的单次1mg地塞米松处理使脾脏重量平均减少22％，使平均循环MNC数目减少34％并且使PNA标记的生发中心减少多达24％，然而，来自全血或骨髓的MNC部分内的干细胞百分率不减少，并且实际上比对照平均增加32％。

结果和结论：这些数据指示免疫抑制剂降低所处理的小鼠脾脏中的单核细胞部分结合细胞的数目。

实施例9

活跃生发中心形成的抑制减少体内干细胞与脾脏结合

在阿佛丁麻醉之前，将原生对照小鼠用100U腹膜内肝素肝素化30分钟。通过眼球后眼睛出血对小鼠放血，从而总共获得1.5至1.8ml全血，将它添加在15ml锥形管中的200μl5U/ml肝素中。然后，切断腹主动脉和腔静脉并且通过经由升胸腔腔静脉缓慢输注10ml 5U/mL肝素将残余血液完全从血管系统中冲洗出来。用汉克斯缓冲盐溶液将胸骨骨髓和股骨骨髓从骨骼中冲洗出来，并且使用Histopaque分离全血和骨髓中的单核干细胞部分并且合并。将单核干细胞部分再悬浮在生长培养基(DMEM加10％FBS)中并且在37℃、5％CO2下孵育过夜。次日早晨根据制造商的说明书用细胞示踪绿(CTG)标记单核干细胞。

在第7天，用CTG将原生对照单核干细胞(MNC)染色之后，立即用在100ul中的大约6M CTG MNC通过眼球后窦注射受体小鼠。五只对照小鼠在第0天和第4天接受100ul乙醇和900ul PBS的腹膜内注射；3只小鼠在第0天和第4天用1mg地塞米松腹膜注射处理；并且两只小鼠在第0天、第2天以及第5天用1mg地塞米松腹膜注射处理。一小时后，通过眼球后眼睛出血对小鼠放血。然后，切断腹主动脉和腔静脉，并且通过经由升胸腔腔静脉缓慢推注10ml5U/mL肝素将残余血液完全从血管中系统冲洗出来。取脾脏并且保持在没有酚红加1％BSA的RPMI中的冰上。用汉克斯缓冲盐溶液将胸骨骨髓和股骨骨髓从骨骼中冲洗出来，并且使用Histopaque分离全血和骨髓中的单核干细胞部分。

将脾脏解离成单细胞悬浮液并且使用流式细胞术测定脾脏中的注射的MNC CTG隔离的程度。地塞米松(总共2mg)使脾脏中的MNC CTG总细胞数目累积降低33-43％，而总共3mg地塞米松的剂量使脾脏中的MNC CTG总细胞数目累积降低大约70％。

结果和结论：这些数据指示7天免疫抑制剂处理降低在脾脏中隔离的外源注射的MNC干细胞的数目。

实施例10

活跃生发中心形成的抑制减少干细胞与脾脏结合

(预示性的)

按照确定的临床方案，使用被选择以限制或完全避免所述试剂的所有副作用的剂量，用市售的普通免疫抑制剂如泼尼松(prednisone)预防性地治疗人类志愿者。用剂量介于5和100mg/kg之间的CD40的拮抗性抗体(如HCD-122抗CD40mAb)治疗另一个人类志愿者组。

在预防性免疫抑制最后一天之前或当天，分离来自50ml髂嵴(ileac crest)骨髓或来自全血分离产物的单核细胞部分中的自体干细胞。用2-[18F]-氟2-脱氧-D-葡萄糖(18F-FDG)标记所得的包含干细胞的MNC部分，用于随后的3D-PET成像，或用适当的核成像标签标记，用于随后的SPECT成像。静脉内注射含有标记的MNC干细胞的部分(具有介于2百万和1千万之间的干细胞)并且在施用60-90分钟以及多达48小时之后通过PET或SPECT成像测定它们的生物分布。注射之后90分钟内，在MNC中的干细胞主要累积在正常志愿者的脾脏中。相比之下，免疫抑制的和HCD-122治疗的志愿者的MNC干细胞部分的脾脏累积降低。

实施例11

抑制或降低活跃生发中心形成在小鼠中增加对心脏的干细胞递送并且促进功能 恢复

(预示性的)

用抗CD40L mAb(PharMingen)或对照仓鼠Ig(Pierce,Rockford,IL)对3个月和12个月龄PN和129S1/SvlmJ小鼠进行静脉内注射(i.v.；在第0、2以及4天，250mg/注射)。从原生仔畜小鼠收集全血和骨髓单核部分干细胞，用细胞示踪染料如CTO标记，并且然后用Miltenyi磁性分离柱使用生物素化抗CD34、抗CD105、抗SSEA1以及抗CD117抗体纯化干细胞。在第5天用介于100,000与1M之间的纯化干细胞在眼球后或静脉内注射实验小鼠。15至24小时后，对小鼠放血并且收集血液，清洗血管系统中的残余红细胞并且收集脾脏用于干细胞累积的荧光成像。在活跃PNA+生发中心中的干细胞累积是明显的，对照IG处理的PN小鼠的证明了比129S1小鼠显著更高的活跃生发中心数目和必然的升高的干细胞结合。抗CD40L mAb处理的129S1小鼠具有少量的(如果有)明显的活跃生发中心和可忽略的至没有干细胞结合。抗CD40L mAb处理的PN小鼠显示与对照Ig处理的PN小鼠相比活跃生发中心数目降低，并且因此，干细胞结合关联降低。

为了研究在这些小鼠中的心脏再生，用抗CD40L mAb(PharMingen)或对照仓鼠Ig(Pierce,Rockford,IL)对3个月和12个月龄PN和129S1/SvlmJ小鼠进行静脉内注射(i.v.；在第0、2以及4天，250mg/注射)。在第4天，将小鼠麻醉，进行超声心动图用于基线心脏功能和体积，并且然后经由开胸术将LAD冠状动脉永久结扎以使大约70％的左心室游离壁梗塞。

从原生仔畜小鼠收集全血和骨髓单核部分干细胞，并且用Miltenyi磁性分离柱使用生物素化抗CD34、抗CD105、抗SSEA1以及抗CD117抗体纯化干细胞。在永久结扎LAD三天之后，在第7天用介于100,000与1M之间的纯化干细胞在眼球后或静脉内注射实验小鼠。在第14天、第21天以及第28天，对小鼠进行串行超声心动图。

未有接受干细胞注射的Ig对照处理的小鼠显示显著的心脏功能下降和增加的舒张末期容积、收缩末期容积以及增加的非梗塞壁厚，其中50-100％的小鼠在第28天之前死于心力衰竭。接受干细胞注射的Ig对照处理的129S1小鼠与未有接受干细胞注射的那些相比，显示心力衰竭死亡减少和心脏功能轻微改善。接受干细胞注射的Ig对照处理的PN小鼠与129S1小鼠相比未显示出存活率或功能改善。相比之下，抗CD40L mAb处理的干细胞注射的129S1小鼠与所有其它组的小鼠相比，显示存活率和心脏功能有显著的改善，而抗CD40LmAb处理的干细胞注射的PN小鼠与对照Ig处理的干细胞注射的PN小鼠相比，存活率和心脏功能有改善。

实施例12

抑制或降低活跃生发中心形成在人体中增加对心脏的干细胞递送并且促进功能 恢复

(预示性的)

通过经皮冠状动脉介入在梗塞的急性期中用支架植入成功处理的急性ST段抬高MI患者适合于所述研究。在第1天通过30分钟IV输注用5、10、20或100mg/kg的抗CD40L mAb瑞利株单抗(Replizumab)治疗患者。

在MI之后3至15天，从通过Ficoll-Hypaque(Pharmacia,Uppsala,Sweden)吸出的50mL骨髓中回收单核细胞。从骨髓吸出到最终产物的整个过程均根据良好生产规范指导原则(Good Manufacturing Practice guidelines)进行。

心脏功能之后是MRI和其它成果，包括死亡、复发MI以及随后的血管再生或住院治疗(无事件生存率)。与安慰剂患者相比，干细胞治疗的患者在历史上具有一年的80％对55-60％的无事件存活率降低。与只用干细胞治疗的患者相比，抗CD40L和干细胞治疗的患者具有改善的无事件存活率。此外，抗CD40L干细胞治疗的患者与只用干细胞治疗的患者相比显示心室容积进一步降低和心脏射血参数改善。

实施例13

在小鼠脾脏中的单核部分干细胞结合伙伴的鉴别和分离

根据制造商的说明书，使用Histopaque分离雄性129S1/SvlmJ小鼠的骨髓和全血单核细胞部分，合并并且用CTO标记。将脾脏解离到单细胞悬浮液中并且用CTB标记。通过以下过程获得干细胞：将MNC在生长培养基中培养7天，之后在补充有120ng/ml干细胞因子和25％马血清的无FBS的生长培养基中培养7天，并且采集非贴壁细胞。一般地，多达40％的非贴壁细胞表达CD34、CD105、SSEA1和/或CD117。用CTO标记干细胞。

将CTB标记的脾细胞与CTO标记的MNC以1:1的比率(在500ul体积的PBS中1千万CTB标记的脾细胞和10M MNC)或100:1的比率(在500ul体积的PBS中，1千万CTB标记的脾细胞和100,000CTO标记的干细胞)在37℃、5％CO2在振荡器上孵育。取等分试样在BeckmanCoulter Gallios流式细胞仪上运行，从而捕获FL2和FL9荧光。在散点图的右上方(UR)象限中，随着CTB+CTO+共同阳性信号的时间依赖性增加，细胞-细胞结合是明显的。背景UR是0.15％。脾细胞和干细胞的最大结合是在50分钟2.6％UR，脾细胞和MNC的最大结合是在30分钟5％UR。

结果和结论：这些数据指示涉及在干细胞与脾脏的结合中的脾细胞可以使用流式细胞术来鉴别和分离。

尽管如上所述已经说明并描述了本发明的优选实施方案，可以进行许多改变而不脱离本发明的精神和范围。因此，本发明的范围不受优选实施方案的公开内容的限制。反而，本发明应该完全由对随后的权利要求书的引用来决定。

Claims (7)

1.干细胞连同一免疫调节剂在制备递送干细胞至一损伤或损害的靶标组织或器官并抑制所述干细胞与脾脏、派伊尔氏淋巴集结、淋巴结或其他淋巴样组织结合的药物中的应用，其中所述免疫调节剂抑制所述干细胞与所述脾脏、派伊尔氏淋巴集结、淋巴结或其他淋巴样组织内的生发中心的结合，因而增加了能够被吸引到所述损伤或损害的靶标组织或器官的循环干细胞的数目；其中所述免疫调节剂选自由以下组成的组：抗CD45抗体、地塞米松、泼尼松、及抗CD40L抗体；

其中所述药物用于治疗选自由以下组成的组的疾病：骨硬化病、缘干细胞缺陷、急性心肌梗塞、冠状动脉疾病、周围血管疾病、心力衰竭、I型糖尿病、2型糖尿病、中风、脊髓损伤、红斑狼疮、慢性伤口愈合、灼伤、骨折愈合、软骨修复、骨关节炎、肾衰竭、帕金森氏病、骨髓瘤、糖尿病足、肝硬化、扩张型心肌病、糖尿病神经病变、肥大细胞增生病、癫痫、自身免疫疾病、肉芽肿病、骨坏死、肝脏衰竭、PMD病、脂肪营养不良、脱髓鞘病、软骨缺陷、视网膜疾病、狼疮性肾炎、阿尔茨海默氏病、外伤性脑损伤、肌炎、高血糖、溃疡性结肠炎以及肌肉退化；

其中所述干细胞不是人类胚胎干细胞。

2.如权利要求1所述的应用，其中所述生发中心存在于选自由脾脏、派伊尔氏淋巴集结以及淋巴结组织组成的组的淋巴组织中。

3.如权利要求1所述的应用，其中所述生发中心是活跃的。

4.如权利要求1所述的应用，其中所述免疫调节剂是地塞米松。

5.如权利要求1所述的应用，其中所述干细胞是外源性或内源性干细胞。

6.如权利要求1所述的应用，其中所述自身免疫疾病包括多发性硬化、系统性硬化、克罗恩氏病和重症肌无力。

7.如权利要求1所述的应用，其中所述视网膜疾病包括视网膜色素变性和黄斑变性。