MX2012011234A

MX2012011234A - Anticuerpos contra csf-1r.

Info

Publication number: MX2012011234A
Application number: MX2012011234A
Authority: MX
Inventors: Jacqueline Francoise Doody; Yanxia Li
Original assignee: Imclone Llc
Priority date: 2010-04-01
Filing date: 2011-03-28
Publication date: 2012-11-30
Also published as: LT2552966T; ME02806B; CN102834414A; PT2552966T; ZA201206926B; HUE036379T2; TW201138824A; NZ602621A; AR080698A1; EA201270732A1; CY1119324T1; JO3291B1; AU2011232850B2; SI2552966T1; JP2013529183A; PL2552966T3; CN102834414B; RS56219B1; EP3156419A1; TWI402078B

Abstract

La presente invención se refiere a un anticuerpo humano que se une al CSF-1R humano con alta afinidad. Anticuerpos de la presente invención tienen ventajas significantes sobre los anticuerpos conocidos en la técnica por ser multifuncionales: inhibir la señalización de CSF-1R, internalizar e inducir la degradación de CSF-IR y estimular ADCC en la célula que incluye tumores, macrófagos y monocitos. También muestran ser efectivos en el tratamiento de leucemia, cáncer de mama, endometrial y de próstata solos o en combinación con docetaxel, paclitaxel, Herceptin(r) o doxorubicina.

Description

ANTICUERPOS CONTRA CSF-1R Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional Estadounidense No. 61/319,896 la cual se presentó el 1 de Abril de 2010.

Esta invención se dirige a los campos de inmunología y tratamiento de cáncer. Más específicamente, la presente invención se dirige a anticuerpos humanos que se unen al Receptor Humano del Factor 1 de Estimulación de Colonias (CSF-1R).

El Receptor del Factor-1 de Estimulación de Colonias (CSF- 1R), también conocido como M-CSFR o CD-115, (variante Humana CSF-1R; SEC ID NO:15) (CSF-1R Humano; SEC ID NO:16; Acceso Uniprot #P07333), codificado por el gene c-fms, es un receptor de tírosina cinasa expresado selectivamente en linajes de células de macrófago y granulocito en individuos normales y en células tumorales en cáncer. Existen dos ligandos conocidos, Factor-1 de Estimulación de Colonias (CSF-1) (CSF-1 Humano; SEC ID NO: 17)(Acceso Uniprot #P09603), también conocido como M-CSF, y IL-34 (IL-34 Humano; SEC ID NO: 18)(Acceso Uniprot #Q6ZMJ4), que se une al dominio extracelular de CSF-1 R. Después del enlace de CSF-1 o IL-34, se dimeriza el CSF-1 R, conduciendo a trans-fosforilación del receptor y fosforilación y activación de moléculas de señalización corriente abajo tales como MAPK y Akt. La fosforilación de CSF-1R resulta en: (1) la proliferación y diferenciación de macrófagos a partir de células troncales progenitoras hematopoyéticas y (2) supervivencia y migración de macrófagos a varios órganos y tejidos en el cuerpo, particularmente el estroma tumoral. El CSF-1R también puede ser expresado en la superficie de células tumorales.

Los anticuerpos a CSF-1R murina no son reactivos cruzados en humanos y consecuentemente podrían ser terapéuticos inefectivos para tratar cáncer en humanos.

Anticuerpos humanos a CSF-1R se describen en la Publicación de PCT WO2009/026303 (Brasel, et al.). Tales anticuerpos no inducen la actividad de Citotoxicidad Mediada por Células Dependientes del Anticuerpo (ADCC) contra células unidas por los anticuerpos. La ADCC ocurre cuando el anticuerpo se une a una célula que expresa el antígeno (célula objetivo), haciendo la región Fe del anticuerpo disponible para unión al receptor Fe en células asesinas naturales, monocitos, neutrófilos y células dendríticas (célula efectora). Anticuerpos descritos en Brasel, son incapaces de llevar la célula objetivo y célula efectora juntas para iniciar la eliminación de la célula objetivo.

Los anticuerpos a los ligandos no son reactivos cruzados. Por lo tanto los anticuerpos a CSF-1 no inhiben el enlace de IL-34 a CSF-1R y los anticuerpos a IL-34 no inhiben el enlace de CSF-1 a CSF-1R. El enlace de ligando al receptor puede tener un efecto en crecimiento de cáncer. Adicionalmente, anticuerpos al ligando no se internalizan, ni inducen la degradación de CSF-1R, ni estimulan la actividad de ADCC contra las células.

Existe una necesidad de anticuerpos multifuncionales los cuales bloquean el enlace de ligandos a CSF-1R y también inducen actividad de ADCC contra células unidas por los anticuerpos.

Anticuerpos de la presente invención son ventajosos sobre anticuerpos conocidos debido a que tienen una multitud de funciones. Anticuerpos de la invención bloquean el enlace de CSF-1 y IL-34 al receptor, de este modo previniendo la dimerización del receptor y la fosforilación resultante de los residuos de tirosina intracelulares, funciones las cuales son críticas en la prevención del crecimiento del tumor inducido por macrófago. Anticuerpos de la invención internalizan e inducen degradación de CSF-1R. De manera importante, además del bloqueo de enlace al ligando, anticuerpos de la invención mejoran la actividad de ADCC estimulando la eliminación de células tumorales y macrófagos y monocitos asociados con el tumor. Anticuerpos de la invención también afectan de manera simultánea la actividad del macrófago, una actividad la cual juega un papel principal en el progreso del tumor. Debido a que la multitud de funciones terapéuticas las cuales tienen, los anticuerpos de la presente invención tienen una ventaja significante sobre los anticuerpos conocidos en la técnica.

Breve descripción detallada de la invención Un aspecto de la presente invención es un anticuerpo, o fragmento del mismo, que se une específicamente a la variante humana CSF-1R (SEC ID NO:15), que comprende una CDRH1 que comprende la secuencia SYGMH (SEC ID NO:1), una CDRH2 que comprende la secuencia VIWYDGSNKYYADSVKG (SEC ID NO:2), una CDRH3 que comprende la secuencia GDYEVDYGMDV (SEC ID NO:3), una CDRL1 que comprende la secuencia RASQGISNALA (SEC ID NO:4), una CDRL2 que comprende la secuencia DASSLES (SEC ID NO:5), y una CDRL3 que comprende la secuencia QQFNSYPWT (SEC ID NO:6). Otro aspecto de la presente invención es un anticuerpo, o fragmento del mismo, que se une específicamente a CSF-1R humano (SEC ID NO:16), que comprende una CDRH1 que comprende la secuencia SYGMH (SEC ID NO:1), una CDRH2 que comprende la secuencia VIWYDGSNKYYADSVKG (SEC ID NO:2), una CDRH3 que comprende la secuencia GDYEVDYGMDV (SEC ID NO:3), una CDRL1 que comprende la secuencia RASQGISNALA (SEC ID NO:4), una CDRL2 que comprende la secuencia DASSLES (SEC ID NO:5), y una CDRL3 que comprende la secuencia QQFNSYPWT (SEC ID NO:6). Un aspecto de la presente invención es un anticuerpo, o fragmento del mismo, que se une específicamente a CSF-1R humano (SEC ID NO:15), que comprende una CDRH1 que comprende la secuencia SYGMH (SEC ID NO:1), una CDRH2 que comprende la secuencia VIWYDGSNKYYADSVKG (SEC ID NO:2), una CDRH3 que comprende la secuencia GDYEVDYGMDV (SEC ID NO:3), una CDRL1 que comprende la secuencia RASQGISNALA (SEC ID NO:4), una CDRL2 que comprende la secuencia DASSLES (SEC ID NO:5), y una CDRL3 que comprende la secuencia QQFNSYPWT (SEC ID NO:6). Anticuerpos de la presente invención pueden además comprender una sustitución de aminoácido dentro de una de las secuencias de CDR. En otro aspecto, las CDR mencionadas antes no tienen una sustitución de aminoácido en una de las secuencias de CDR.

Otro aspecto de la presente invención es un anticuerpo, o fragmento del mismo, que se une al CSF-1R, y comprende una VH que comprende la secuencia de aminoácido: QDQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQA PGEGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCARGDYEVDYGMDVWGQGTTVTVAS (SEC ID NO:7), o una VL que comprende la secuencia de aminoácido: AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNALAWYQQKPGKA PKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYP WTFGQGTKVEIK (SEC ID NO:8).

Otro aspecto de la presente invención es un anticuerpo, o fragmento del mismo, que se une al CSF-1R, y comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 10 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 9. En aún otro aspecto de la presente invención, un anticuerpo comprende dos cadenas ligeras cada una comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 10 y dos cadenas pesadas cada una comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 9.

Fragmentos de enlace a CSF-1R de tales anticuerpos son parte de la invención.

La invención también proporciona DNA aislado y polinucleótidos/ácidos polinucleicos que codifican los anticuerpos o fragmentos de los mismos descritos anteriormente, vectores de expresión que comprenden los polinucleótidos, y células hospederas que comprenden los polinucleótidos. La invención además proporciona métodos para purificar los anticuerpos o fragmentos de los mismos. La invención además proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, polinucleótidos, vectores o células hospederas de la presente invención solos o con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, de la presente invención junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Adicionalmente, la presente invención se dirige a métodos para inhibir el crecimiento de una célula cancerígena, y métodos para tratar leucemia, carcinomas de mama y próstata, en mamíferos, administrando una cantidad efectiva de un anticuerpo. Otro aspecto de la presente invención se dirige a métodos para inhibir el crecimiento de una célula cancerígena, y métodos para tratar leucemia, carcinomas endometrial, de mama y próstata, en mamíferos, administrando una cantidad efectiva de un anticuerpo. Aún otro aspecto de la presente invención se dirige a métodos para inhibir el crecimiento de una célula cancerígena, y métodos para tratar leucemia, carcinomas endometrial, de mama y próstata, así como también cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer hepatocelular, cáncer renal, mieloma múltiple, y linfoma de hodgkin. Anticuerpos de la presente invención pueden ser usados para tratar enfermedades neoplásicas, que incluyen tumores sólidos, y para el tratamiento de carcinomas de mama y próstata. En otro aspecto, anticuerpos de la presente invención pueden ser usados para tratar enfermedades neoplásicas, que incluyen tumores sólidos, y para el tratamiento de carcinomas de mama, endometrial y próstata. En otro aspecto, anticuerpos de la presente invención pueden ser usados para tratar enfermedades neoplásicas, que incluyen tumores sólidos, y para el tratamiento de carcinomas de mama, endometrial, próstata, ovario, colorrectal, hepatocelular y renal.

Un aspecto de la presente invención es el anticuerpo, o fragmentos de los mismos, para uso en terapia, o para uso en tratamiento o para uso como un medicamento. En aún otro aspecto, los anticuerpos previamente descritos o fragmentos de los mismos son para uso en el tratamiento de cáncer. La presente invención puede ser usada en el tratamiento de cánceres que incluyen pero no se limitan a leucemia, cáncer de mama y cáncer de próstata. En un aspecto, la presente invención puede ser usada en el tratamiento de cánceres que incluyen pero no se limitan a leucemia, cáncer de mama, cáncer endometrial y cáncer de próstata. En otro aspecto, la presente invención puede ser usada en el tratamiento de cánceres que incluyen pero no se limitan a leucemia, cáncer de mama, cáncer endometrial, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer hepatocelular, cáncer renal, mieloma múltiple, y linfoma de hodgkin.

La presente invención también incluye el anticuerpo, o fragmento del mismo, de la presente invención para uso en el tratamiento de cáncer que incluye proporcionar o administrar una cantidad efectiva de otro tratamiento anti-cancerigeno en donde el tratamiento anti-cancerígeno incluye pero no se limita a un agente anti- angiogénesis, un agente quimioterapéutíco, o un agente anti-neoplásico. Además, agentes anti-neoplásicos incluyen pero no se limitan a docetaxel, paclitaxel, Herceptin® y doxorubicina. El tratamiento anticancerígeno se administra al paciente en adición al anticuerpo o fragmento actualmente descrito. El anticuerpo o fragmento del mismo se administra antes, durante, sustancialmente de manera simultánea con, o después de comenzar la terapia con otro tratamiento anti-cancerígeno u otro agente anti-neoplásico.

La presente invención también se proporciona para uso de un anticuerpo de la invención para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de cáncer. En un aspecto el cáncer es leucemia, cáncer de mama, o cáncer de próstata. En un aspecto el cáncer es leucemia, cáncer de mama, cáncer endometrial, o cáncer de próstata. En otro aspecto de la presente invención el cáncer es leucemia, cáncer de mama, cáncer endometrial, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer hepatocelular, cáncer renal, mieloma múltiple, o linfoma de hodgkin. El uso del anticuerpo incluye proporcionar o administrar una cantidad efectiva de otro tratamiento anti-cancerígeno en donde el tratamiento anti-cancerígeno incluye pero no se limita a un agente anti-angíogénesis, un agente quimioterapéutíco, o un agente antí-neoplásíco. Además, agentes anti-neoplásicos incluyen pero no se limitan a docetaxel, paclitaxel, Herceptin® y doxorubicina. El tratamiento anti-cancerígeno se administra al paciente en adición al anticuerpo o fragmento actualmente descrito. El anticuerpo o fragmento del mismo se administra antes, durante, sustancialmente de manera simultánea con, o después de comenzar la terapia con otro tratamiento anti-cancerígeno u otro agente anti-neoplásico.

La invención además se proporciona para un método de tratamiento de cáncer en un mamífero, que comprende administrar al mamífero en necesidad del mismo una cantidad efectiva del anticuerpo o fragmento del mismo de la presente invención. El cáncer se selecciona del grupo que consiste de leucemia, cáncer de mama, cáncer endometrial, y cáncer de próstata. En otro aspecto, el cáncer se selecciona del grupo que consiste de leucemia, cáncer de mama, cáncer endometrial, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer hepatocelular, cáncer renal, cáncer pancreático, mieloma múltiple, y linfoma de hodgkin. Adicionalmente, el método puede comprender además administrar otro tratamiento anti-cancerígeno al mamífero. El tratamiento anti-cancerígeno se selecciona del grupo que consiste de un agente anti-angiogénesis, un agente quimioterapéutico, y un agente anti-neoplásico. El agente anti-neoplásico se puede seleccionar del grupo que consiste de docetaxel, paclitaxel, Herceptin® y doxorubicina.

La invención además proporciona métodos para usar los anticuerpos, o composiciones, para tratar un mamífero en necesidad del mismo, por ejemplo, para inhibir la angiogénesis o metástasis ósea, o para inhibir el crecimiento hiperproliferativo o del tumor o para tratar enfermedades inflamatorias. La invención además proporciona anticuerpos, o composiciones, para uso en tratamiento de un mamífero en necesidad del mismo, por ejemplo, para inhibir la angiogénesis o metástasis ósea, o inhibir el crecimiento hiperproliferativo o del tumor o enfermedades inflamatorias.

La presente invención también se dirige a un producto o composición farmacéutica que contiene el anticuerpo actualmente descrito, o fragmento del mismo. Además del producto o composición farmacéutica también puede incluir un agente farmacéutico adicional, agente anti-neoplásico, o agente anti-cancerígeno o tratamiento, que incluyen pero no se limita a docetaxel, paclitaxel, Herceptin® o doxorubicina, dados en combinación con el anticuerpo actualmente descrito simultáneos, separados o secuenciales en terapia.

La invención proporciona usar niveles de CSF-1 en muestras de sangre, suero, plasma, células tumorales o células tumorales de circulación como un indicador del tratamiento exitoso con anticuerpos CSF-1R de la presente invención, o fragmentos de los mismos, en pacientes si el cáncer ha expresado CSF-1R en la superficie de macrófagos asociados al tumor. La invención también proporciona un método para tratar cáncer en un paciente, que comprende las etapas: (1) medir el nivel de CSF-1 en una muestra tomada del paciente en donde la muestra se selecciona del grupo que consiste de sangre, suero, plasma, células tumorales y células tumorales de circulación, y (2) administrar al paciente el anticuerpo o fragmento del mismo de la presente invención si los niveles de CSF-1 son superiores que los niveles de CSF-1 encontrados en una población de control.

La invención proporciona usar niveles de IL-34 en muestras de sangre, suero, plasma, células tumorales o células tumorales de circulación como un indicador del tratamiento exitoso con anticuerpos CSF-1R de la presente invención, o fragmentos de los mismos, en pacientes. La invención también proporciona un método para tratar cáncer en un paciente, que comprende las etapas: (1) medir el nivel de IL-34 en una muestra tomada del paciente en donde la muestra se selecciona del grupo que consiste de sangre, suero, plasma, células tumorales y células tumorales de circulación, y (2) administrar al paciente el anticuerpo o fragmento del mismo de la presente invención si los niveles IL-34 son superiores que los niveles IL-34 encontrados en una población de control.

Un aspecto de la presente invención es un método para determinar si un sujeto que tiene un cáncer es un candidato para un régimen de tratamiento de cáncer a base de anticuerpo anti-CSF-IR, en donde el anticuerpo es el anticuerpo de la presente invención que comprende: (1) determinar ex vivo o in vitro el nivel de CSF-1 en una muestra del sujeto, en donde la muestra se selecciona del grupo que consiste de sangre, suero, plasma, células tumorales y células tumorales de circulación; y (2) en donde un incremento en el nivel de CSF-1, ya comparado con el nivel de CSF-1 en un individuo que no sufre de cáncer, es indicativo que el sujeto es un candidato para el régimen de tratamiento de cáncer a base de anticuerpo anti-CSF-1R.

Otro aspecto de la presente invención es un método para determinar si un sujeto que tiene un cáncer es un candidato para un régimen de tratamiento de cáncer a base de anticuerpo anti-CSF-IR, en donde el anticuerpo es el anticuerpo de la presente invención, que comprende: (1) determinar ex vivo o in vitro el nivel de IL-34 en una muestra del sujeto, en donde la muestra se selecciona del grupo que consiste de sangre, suero, plasma, células tumorales y células tumorales de circulación; y (2) en donde un incremento en el nivel de IL-34, ya comparado con el nivel de IL-34 en un individuo que no sufre de cáncer, es indicativo que el sujeto es un candidato para el régimen de tratamiento de cáncer a base de anticuerpo anti-CSF-1R.

La invención también proporciona anticuerpos los cuales se unen específicamente a CSF-1R. Los anticuerpos tienen al menos una propiedad seleccionada de (a) inhibir el enlace de CSF-1 o IL-34 a CSF-1R; (b) inhibir la activación de CSF-1R; (c) reducir la fosforilación de CSF-1R; (d) reducir la activación de MAP ; (e) reducir la activación de Akt; (f) reducir la cantidad de CSF-1 R; y (g) inducir la ADCC. Una modalidad preferida de la presente invención posee las propiedades (a) hasta (g).

Un aspecto de la presente invención es un anticuerpo, o fragmento del mismo, que se une específicamente a la variante humana CSF-1 R (SEC ID NO:15) o CSF-1 R humano (SEC ID NO:16), e inhibe la señalización de CSF-1R, internaliza e induce la degradación de CSF-1R, y estimula la actividad de Citotoxicidad Mediada por Células Dependientes del Anticuerpo (ADCC) contra una variedad de células que incluyen tumores, macrófagos y monocitos. Las SEC ID NO:15 y SEC ID NO:16 difieren por un aminoácido en la posición 54 la cual cae fuera de la región de enlace.

Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas de polipéptidos, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cadenas individuales pueden doblarse en dominios que tienen tamaños similares (110-125 aminoácidos) y estructuras, pero diferentes funciones.

La cadena ligera puede comprender un dominio variable (abreviado en la presente como VL) y/o un dominio constante (abreviado en la presente como CL). Las cadenas ligeras de anticuerpos humanos (inmunoglobulinas) son ya sea cadenas ligeras kappa (K) o cadenas ligeras lambda (?). La expresión VL, como se usa en la presente, se pretende para incluir tanto las regiones variables de cadenas ligeras tipo kappa (VK) como de cadenas ligeras tipo lambda (??). La cadena pesada también puede comprender un dominio variable (abreviado en la presente como VH) y/o, dependiendo de la clase o isotipo de anticuerpo, tres o cuatro dominios constantes (CH1, CH2, CH3 y CH4) (abreviados en la presente colectivamente como CH). En humanos, los isotipos son IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, con IgA y IgG además subdivididos en subclases o subtipos (lgA1-2 y lgG1-4). La presente invención incluye anticuerpos de cualquiera de las clases o subclases mencionadas anteriormente. IgG 1 humano es el isotipo preferido para los anticuerpos de la presente invención.

Tres regiones, llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDR) o hipervariables, se encuentran en cada una de las VL y VH, las cuales son soportadas por regiones menos variables llamadas estructuras (abreviado en la presente como FR). Los aminoácidos son asignados a una región o dominio CDR particular de conformidad con la convención abat (Kabat, ef al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971); Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991).). Cada VH y VL está compuesta de tres CDR y cuatro FR, arregladas del término amino al término carboxi en el siguiente orden: FR1 -CDR1 -FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. La porción de un anticuerpo que consiste de dominios VL y VH es designada Fv (Fragmento variable) y constituye el sitio de enlace al antígeno. La cadena única Fv (scFv) es un fragmento de anticuerpo que contiene un dominio VL y un dominio VH en una cadena de polipéptido, en donde el N-término de un dominio y el C-término del otro dominio están unidos por un enlazador flexible.

Un "anticuerpo aislado" es un anticuerpo que (1) ha sido parcialmente, sustancialmente, o completamente purificado de una mezcla de componentes; (2) ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural; (3) es monoclonal; (4) está libre de otras proteínas de las mismas especies; (5) es expresado por una célula de una diferente especie; o (6) no se origina en la naturaleza. Componentes, como se usa en la presente, excluyen el anticuerpo de la presente invención. Componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales los cuales podrían interferir con usos diagnósticos o terapéuticos por el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos. Ejemplos de anticuerpos aislados incluyen un anticuerpo que ha sido purificado de afinidad, un anticuerpo que ha sido elaborado por un hibridoma u otra línea celular in vitro, y un anticuerpo humano derivado de un ratón transgénico.

El término "anticuerpo monoclonal," como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población son sustancialmente idénticos excepto para mutaciones posibles que se originan naturalmente o variaciones menores post-traduccionales que pueden estar presentes. Anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un sitio antigénico único (también conocido como determinante o epítope). Además, contrario a preparaciones convencionales de anticuerpo (policlonal) las cuales típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes, cada anticuerpo monoclonal es dirigido contra un determinante único en el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo a ser obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no será interpretado como que requiere producción del anticuerpo por cualquier método particular.

El término "anticuerpo humano," como se usa en la presente, incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes que corresponden a secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (como se describe en Kabat ef al., supra). Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDR. El anticuerpo humano puede tener al menos una posición reemplazada con un residuo de aminoácido, por ejemplo, un residuo de aminoácido que mejora la actividad el cual es codificado por la secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana. Sin embargo, el término "anticuerpo humano", como se usa en la presente, no está propuesto para incluir anticuerpos en los cuales las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otras especies de mamífero, tales como un ratón, han sido injertadas son secuencias de estructura humana. Métodos para producir un "anticuerpo humano", como se usa en la presente no están propuestos para incluir anticuerpos producidos en un ser humano.

La frase "anticuerpo humano recombinante" incluye anticuerpos humanos que son preparados, expresados, creados o aislados por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedera, anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpo humano combinatorial, recombinante, anticuerpos aislados de un animal que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana, o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por otros medios que involucran empalme de secuencias de gene de inmunoglobulina humana a otras secuencias de DNA. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana.

Fe (Fragmento, región crista lizable) es la designación para la porción o fragmento de un anticuerpo que consiste de dominios constantes de cadena pesada apareados. Un anticuerpo IgG, por ejemplo, el Fe consiste de dominios CH2 y CH3 de cadena pesada. El Fe de un anticuerpo IgA o IgM además comprende un dominio CH4. El Fe está asociado con el enlace al receptor Fe, activación de citotoxicidad mediada por células dependientes del anticuerpo (ADCC) y/o citotoxicidad mediada por células (CMC). Para anticuerpos tales como IgA e IgM, los cuales son complejos de proteínas múltiples similares a IgG, la formación de complejos requiere dominios constantes de Fe.

De este modo, anticuerpos de la invención incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos aislados, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos recombinantes, anticuerpos monoclonales, fragmentos de digestión, porciones especificadas y variantes de los mismos, que incluyen imitadores de anticuerpo o que comprenden porciones de anticuerpos que imitan la estructura y/o función de un anticuerpo o fragmento especificado o porción del mismo; cada uno contiene al menos una CDR. Fragmentos funcionales incluyen fragmentos de enlace al antígeno que se unen a un antígeno CSF-1R. Por ejemplo, fragmentos de anticuerpo capaces de unirse a CSF-1R, o una porción del mismo, y los cuales están abarcados por la presente invención incluyen fragmentos bivalentes tales como (Fab')2 con fragmentos monovalentes, intactos de enlaces disulfuro intercadena tales como Fab (Fragmento, enlace al antígeno) los cuales se refieren a los fragmentos del anticuerpo que consisten de dominios VL-CL y VH- CH1 y no retienen la región de articulación de cadena pesada (por ejemplo, por digestión de papaína), Fabs los cuales retienen la región de articulación de cadena pesada, Facb (por ejemplo, por digestión de plasmina), F(ab')2, Fab' los cuales carecen de enlaces disulfuro, pFc' (por ejemplo, por digestión de pepsina o plasmina), Fd (por ejemplo, por digestión de pepsina, reducción parcial y reagregación) y Fv o scFv (por ejemplo, por técnicas de biología molecular). Fragmentos de anticuerpo también están propuestos para incluir, por ejemplo, anticuerpos de dominio suprimido, anticuerpos lineales, anticuerpos de cadena única, scFv, anticuerpos de dominio único, anticuerpos de cadena única multivalentes, anticuerpos multi-específicos formados de fragmentos de anticuerpo que incluyen diacuerpos, triacuerpos, y similares que se unen específicamente con antígenos.

La región de articulación separa las porciones Fab y Fe del anticuerpo, proporcionando movilidad de Fabs relativos entre sí y relativos a Fe, así como también que incluyen enlaces dísulfuro múltiples para enlace covalente de las dos cadenas pesadas.

Formatos de anticuerpo han sido desarrollados los cuales retienen la especificidad de enlace, pero tienen otras características que pueden ser deseables, que incluyen por ejemplo, biespecificidad, multivalencia (más de dos sitios de enlace), y tamaño compacto (por ejemplo, dominios de enlace solos). Los anticuerpos de la presente invención son específicos para CSF-1R. La especificad de anticuerpo se refiere a un reconocimiento selectivo del anticuerpo para un epítope particular de un antígeno. Los anticuerpos de la presente invención, por ejemplo, pueden ser monoespecíficos o biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos (BsAbs) son anticuerpos que tienen dos diferentes especificidades o sitios de enlace al antígeno. Donde un anticuerpo tiene más de una especificidad, los epitopes reconocidos pueden ser asociados con un antígeno único o con más de un antígeno. De este modo, la presente invención proporciona anticuerpos biespecíficos que se unen a dos diferentes antígenos, con al menos una especificidad para CSF-1R. Como se declara anteriormente, tales anticuerpos incluyen algunos fragmentos de los mismos.

La especificidad de los presentes anticuerpos o fragmentos de los mismos, para CSF-1R se puede determinar con base en la afinidad y/o avidez. La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con un anticuerpo (KD), mide la intensidad de enlace entre un determinante antigénico y un sitio de enlace al anticuerpo.

Los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, de la invención se unen a un epítope de CSF-1R localizado en los segmentos del dominio extracelular (posteriormente referido simplemente como "dominios" o "ECD"). El término "epítope" como se usa en la presente se refiere a sitios tri-dimensionales, discretos en un antígeno que son reconocidos por los anticuerpos de la invención. Los epitopes son las regiones inmunológicamente activas en un antígeno complejo, las regiones que actualmente se unen a un receptor de células B, y que son actualmente unidas por las moléculas de anticuerpo resultantes que son producidas por las células . Los antígenos en general contienen al menos un epítope y usualmente más de un epítope. Epítopes en antígenos de proteínas pueden ser lineales o no lineales. Epítopes lineales son aquellos comprendidos de secuencias de aminoácido contiguas en la secuencia de aminoácido de una proteína. Epítopes lineales pueden o no pueden requerir repliegue conformacional para formar la estructura tridimensional nativa y provocar una respuesta inmune que produce anticuerpos con especificidad de enlace al antígeno. Epítopes no lineales están comprendidos de residuos de aminoácido no contiguos. De este modo, epítopes no lineales siempre requieren algún grado de repliegue de proteína para llevar los aminoácidos requisitos en la proximidad de uno de otro para formar la estructura tri-dimensional nativa y provocar una respuesta inmune que produce anticuerpos con especificidad de enlace al antígeno.

Anticuerpos de la presente invención también incluyen aquellos para los cuales las características de enlace han sido mejoradas por mutación directa, métodos de maduración de afinidad, despliegue de fago, o lanzadera de cadena. La afinidad y especificidad pueden ser modificadas o mejoradas mutando CDR y/o residuos FW y seleccionando sitios de enlace al antígeno que tienen las características deseadas (véase por ejemplo, Yang et al., J. Mol. Biol . , 254: 392-403(1995)). Las CDRs son mutadas en una variedad de formas. Una forma es aleatorizar residuos individuales, o combinaciones de residuos, de manera que en una población de, de otro modo sitios de enlace al antígeno idénticos, subseries de dos a veinte aminoácidos se encuentran en posiciones particulares. Alternativamente, las mutaciones pueden ser inducidas sobre un rango de residuos por métodos de PCR propensos a error (véase por ejemplo, Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-96 (1992)). En otro ejemplo, vectores de despliegue de fago que contienen genes de región variable de cadena pesada y ligera pueden ser propagados en cepas mutadoras de E. coli (véase por ejemplo, Low ef al., J. Mol. Biol., 250: 359-68 (1996)). Estos métodos de mutagénesis son ilustrativos de los muchos métodos conocidos por uno de habilidad en la técnica.

Una forma conveniente para generar variantes sustitucionales es maduración de afinidad usando despliegue de fago. Brevemente, varios sitios de región CDR son mutados para generar todas las sustituciones de aminoácido posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpo de este modo generadas son desplegadas en una forma monovalente de partículas de fago filamentosas como fusiones al producto del gene III de M13 empacado dentro de cada partícula. Las variantes desplegadas de fago son entonces seleccionadas por su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de enlace (KD), especificidad, EC50) como se describe en la presente. Para identificar sitios de región CDR candidatos para modificación, puede realizarse mutagénesis de barrido de alanina para identificar residuos de región CDR que contribuyen significantemente para el enlace al antígeno. Alternativamente, o además, la mutagénesis aleatoria puede ser realizada en una o más secuencias de CDR en una o más posiciones de residuos, ya sea mientras la CDR está operablemente ligada a la región variable o mientras la CDR es independiente de otra secuencia de región variable y después la CDR alterada regresa a una región variable usando tecnología de DNA recombinante. Una vez que tales anticuerpos variantes son generados y expresados, el panel de variantes es sometido a selección como se describe en la presente, y anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes pueden ser seleccionados para desarrollo adicional.

Además de los anticuerpos específicamente descritos en la presente, otros anticuerpos modificados "sustancialmente homólogos" pueden ser fácilmente diseñados y manufacturados utilizando varias técnicas de DNA recombinante bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, las regiones de estructura pueden variar de las secuencias nativas al nivel de estructura primaria por varias sustituciones de aminoácido, adiciones y supresiones terminales e intermedias, y similares. Más aún, una variedad de diferentes regiones de armazón humanas pueden ser usadas individualmente o en combinación como una base para las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invención. En general, modificaciones de los genes pueden ser fácilmente realizadas por una variedad de técnicas bien conocidas, tales como mutagénesis dirigida al sitio.

La presente invención incluye secuencias de ácido nucleico que codifican una cadena pesada de anticuerpo anti-CSF-1R, que comprende cualquiera de las regiones de VH o una porción del mismo, o cualquiera de las CDR de VH, que incluyen cualesquiera variantes de las mismas, como se describe en la presente. La invención también incluye moléculas de ácido nucleico que codifican una cadena ligera de anticuerpo anti-CSF-1R que comprende cualquiera de las regiones de VL, o una porción de la misma o cualquiera de las CDR de VL, que incluyen cualesquiera variantes de las mismas como se describe en la presente. La invención también incluye las secuencias de ácido nucleico del Anticuerpo 1, SEC ID NOs 13 y 14 para cadena pesada y cadena ligera respectivamente. Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos que comprenden las mismas regiones CDR del Anticuerpo 1, y/o la misma región variable de cadena ligera y/o región variable de cadena pesada del Anticuerpo 1.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser producidos por métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen el método inmunológico descrito por Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volumen 13 (Burdon et al. eds., Elsevier Science Publishers, Amsterdam) en Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas (Campbell ed., 1984); así como también por el método de DNA recombinante descrito por Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989). Los anticuerpos también se pueden obtener de bibliotecas que portan combinaciones de dominios de VH y VL en la forma de scFv o Fab. Los dominios de VH y VL pueden ser codificados por nucleótidos que son sintéticos, parcialmente sintéticos o naturalmente derivados. La presente invención puede ser elaborada por bibliotecas de despliegue de fago que portan fragmentos humanos de anticuerpo. Otras fuentes de anticuerpos humanos son ratones transgénicos diseñados por ingeniería para expresar genes de inmunoglobulina humana.

Una modalidad para la preparación de anticuerpos es la expresión del ácido nucleico que codifica el anticuerpo de conformidad con la invención en un animal transgénico que tiene una porción sustancial del genoma que produce anticuerpo humano insertado y es considerado deficiente en la producción de anticuerpos endógenos. Animales transgénicos incluyen pero no se limitan a ratones, cabras y conejos. Los anticuerpos de la presente invención son elaborados con ratones transgénicos. Una modalidad adicional de la invención incluye expresión del gene que codifica el anticuerpo en, por ejemplo, la glándula mamaria del animal para secreción del polipéptido durante la lactancia.

Un método común para producir anticuerpos "humanizados" es injertar secuencias CDR de un MAb (producido inmunizando un hospedero roedor) sobre un armazón Ig humano, y transfección de los genes quiméricos en las células de Ovario de Hámster Chino (CHO) las cuales en cambio producen un anticuerpo funcional que es secretado por las células CHO.

Se entiende que los residuos de aminoácido que son determinantes primarias de enlace de anticuerpos de dominio único pueden estar dentro de las CDR definidas por Kabat o Chothia, pero pueden incluir otros residuos como también, tales como, por ejemplo, residuos que de otro modo podrían ser enterrados en la interfaz VH-VL de un heterodímero VH-VL.

La proteína usada para identificar anticuerpos de enlace a CSF-1R de la invención es preferiblemente CSF-1R y, más preferiblemente, es el dominio extracelular de CSF-1R. El dominio extracelular de CSF-1R puede estar libre o conjugado a otra molécula. Los anticuerpos de esta invención pueden ser fusionados a residuos de aminoácido adicionales. Tales residuos de aminoácido pueden ser una etiqueta peptídica, quizás para facilitar el aislamiento o una porción FC de IgG para optimizar la dimerización. Otros residuos de aminoácido para encausar los anticuerpos a órganos o tejidos específicos también están contemplados.

Fragmentos de anticuerpo pueden ser producidos desdoblando un anticuerpo completo, o expresando DNA que codifica el fragmento. Fragmentos de anticuerpos pueden ser preparados por métodos descritos por Lamoyi ef al., J. Immunol. Methods 56: 235-243 (1983) y por Parham, J. Immunol. 131: 2895-2902 (1983). Tales fragmentos pueden contener uno o ambos fragmentos Fab o el fragmento F(ab')2. Tales fragmentos también pueden contener anticuerpos de región variable de fragmento de cadena única, es decir, scFv, diacuerpos, u otros fragmentos de anticuerpo. Métodos para producir tales equivalentes funcionales se describen en: Publicación de Solicitud de Patente Europea No. EP 239,400 (Winter); Publicación de PCT WO 89/09622 (Hann, et al.) Publicación de Solicitud de Patente Europea No. EP 338,745 (Owens, et al.); y Publicación de Solicitud de Patente Europea No. EP 332,424 (Beldler, et al.). A través de esta especificación, el término "anticuerpo" de la invención incluye cualesquiera fragmentos del mismo, sean o no específicamente declarados.

Células hospederas preferidas para transformación de vectores y expresión de los anticuerpos de la presente invención son células de mamífero, por ejemplo, células NSO (células de mieloma de ratón no secretantes (0)), 293, SP20 y células CHO y otras líneas de células de origen linfoide tales como linfoma, mieloma o células de hibridoma. Otros hospederos eucarioticos, tales como levaduras, pueden ser alternativamente usados.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser aislados o purificados por cualquier método conocido en la técnica, que incluyen precipitación por sulfato de amonio o sulfato de sodio seguido por diálisis contra salina, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o inmuno-afinidad, así como también filtración en gel o electroforesis de zona. Un método de purificación preferido para los anticuerpos de la invención actual es cromatografía de afinidad de Proteína-A.

Los anticuerpos humanos que codifican el DNA pueden ser preparados recombinando regiones constantes y regiones variables humanas que codifican el DNA recombinante, distintas de las CDRs, derivadas sustancialmente o exclusivamente de las regiones de anticuerpos humanos correspondientes y CDR que codifican el DNA derivado de un humano.

Fuentes adecuadas de DNA que codifican fragmentos de anticuerpos incluyen cualesquiera células, tales como células del bazo e hibridomas que expresan el anticuerpo de longitud completa. Los fragmentos pueden ser usados los mismos como equivalentes de anticuerpo, o pueden ser recombinados en equivalentes, como de describe anteriormente. La recombinación de DNA y otras técnicas descritas en la presente se pueden llevar a cabo por métodos conocidos. Otra fuente de DNA es biblioteca de despliegue de fago de anticuerpos, como se conoce en la técnica.

Adicionalmente, la presente invención proporciona vectores de expresión que contienen las secuencias de polinucleótidos previamente descritas operablemente ligadas a una secuencia de control tal como una secuencia de expresión, un promotor y/o una secuencia intensificadora. Una variedad de vectores de expresión para la síntesis eficiente de polipéptidos de anticuerpos en sistemas procarióticos, tales como sistemas eucarióticos y bacterias, que incluyen pero no se limita a, sistemas de cultivo de células de mamífero y levadura han sido desarrollados. Los vectores de la presente invención pueden comprender segmentos de secuencias de DNA cromosomales, no cromosomales y sintéticas.

Cualquier vector de expresión adecuado puede ser usado. Por ejemplo, vectores de clonación procarióticos incluyen plásmidos de E. coli, tales como colE1, pCR1, pBR322, pMB9, pUC, pKSM, y RP4. Vectores procarióticos también incluyen derivados de DNA fago tales como M13 y otros fagos de DNA de hebra única filamentosos. Un ejemplo de un vector útil en levadura es el plásmido de 2 µ. Vectores adecuados para expresión en células de mamífero incluyen derivados bien conocidos de SV-40, CMV, adenovirus, secuencias de DNA derivadas de retrovirus, y vectores lanzadera derivados de combinación de vectores de mamífero funcionales, tales como aquellos descritos anteriormente, y plásmidos funcionales y DNA fago. Vectores de expresión eucarióticos adicionales son conocidos en la técnica {por ejemplo, P.J. Southern y P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-41 (1982); Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1: 854-64 (1981); Kaufmann y Sharp, J. Mol. Biol. 159: 601-21 (1982); Scahill et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 80: 4654-59 (1983); Urlaub y Chasin, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77: 4216-20) (1980).

Los vectores de expresión útiles en la presente invención contienen al menos una secuencia de control de expresión que está operativamente ligada a la secuencia de DNA o fragmento a ser expresado. La secuencia de control se inserte en el vector para controlar y regular la expresión de la secuencia de DNA clonada. Ejemplos de secuencias de control de expresión útiles son el sistema lac, el sistema trp, el sistema tac, el sistema trc, regiones promotoras y operadoras principales del fago lambda, la región de control de la proteína recubierta fd, los promotores glicolíticos de levadura, por ejemplo, el promotor para 3-fosfoglicerato cinasa, los promotores de fosfatasa de ácido de levadura, por ejemplo, Pho5, los promotores de los factores alfa-apareamiento de levadura, y promotores derivados de polioma, adenovirus, retrovirus, y virus de simio, por ejemplo, los promotores temprano y tardío o SV40, y otras secuencias conocidas por controlar la expresión de genes de células procarióticas o eucarióticas y sus virus o combinaciones de los mismos.

Donde se desea expresar un constructo de gene en levadura, un gene de selección adecuado para uso en levadura es el gene trp 1 presente en el plásmido de levadura YRp7. El gene trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptofano, por ejemplo, ATCC No. 44076. La presencia de la lesión trp1 en el genoma de célula de hospedero de levadura entonces proporciona un ambiente efectivo para detectar la transformación por crecimiento en la ausencia de triptofano. De manera similar, cepas de levadura deficientes de Leu2 (ATCC 20,622 ó 38,626) son contempladas por plásmidos conocidos que portan el gene Leu2.

La presente invención también proporciona células hospederas recombinantes que contienen los vectores recombinantes previamente descritos. Anticuerpos de la presente invención pueden ser expresados en líneas celulares distintas que en los hibridomas. Ácidos nucleicos, los cuales comprenden una secuencia que codifica un polipéptido de conformidad con la invención, pueden ser usados para transformación de una célula de hospedero de mamífero adecuada.

Líneas celulares de preferencia particular son seleccionadas con base en los altos niveles de expresión, expresión constitutiva de la proteína de interés y contaminación mínima de las proteínas del hospedero. Las líneas de células de mamífero disponibles como hospederos para expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas de células inmortalizadas, tales como pero no limitados a, células COS-7, células de Ovario de Hámster Chino (CHO), células de Riñon de Hámster Bebé (BHK) y muchas otras que incluyen líneas de células de origen linfoide tales como linfoma, mieloma, o células de hibridoma. Células eucarióticas adicionales adecuadas incluyen levaduras y otros hongos. Hospederos procarióticos útiles incluyen, por ejemplo, E. coli, tales como E. coli SG-936, E. coli HB 101, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli DHI, y E. coli MRCI, Pseudomonas, Bacillus, tales como Bacillus subtilis, y Streptomyces.

Estas células hospederas recombinantes pueden ser usadas para producir un anticuerpo, o fragmento del mismo, cultivando las células bajo condiciones que permiten la expresión del anticuerpo o fragmento del mismo y purificando el anticuerpo o fragmento del mismo a partir de la célula hospedera o medio que rodea la célula hospedera. El objetivo del anticuerpo o fragmento expresado para secreción en las células hospederas recombinantes puede ser facilitado insertando una secuencia que codifica el péptido líder secretor o señal en el extremo 5' del gene que codifica el anticuerpo de interés. Estos elementos peptídicos líderes secretores pueden ser derivados de ya sea secuencias procarióticas o eucarióticas. Por consiguiente, péptidos líderes secretores adecuados son usados, siendo aminoácidos unidos al extremo N-terminal de un polipéptido para dirigir el movimiento del polipéptido fuera del citosol de la célula hospedera y secreción en el medio.

Las células hospederas transformadas son cultivadas por métodos conocidos en la técnica en un medio líquido que contiene fuentes asimilables de carbono (carbohidratos tales como glucosa o lactosa), nitrógeno (aminoácidos, péptidos, proteínas o sus productos de degradación tales como peptonas, sales de amonio, o similares), y sales inorgánicas (sulfatos, fosfatos y/o carbonatos de sodio, potasio, magnesio y calcio). El medio además contiene, por ejemplo, sustancias que promueven el crecimiento, tales como microelementos, por ejemplo hierro, zinc, manganeso y similares.

Un método para tratar el crecimiento del tumor en un mamífero administrando al mamífero una cantidad efectiva de un anticuerpo también se proporciona por la presente invención. Condiciones adecuadas para ser tratadas de conformidad con la presente invención involucran células que expresan preferiblemente CSF-1 . Aunque no se pretende estar ligado por cualquier mecanismo particular, los presentes métodos proporcionan tratamiento del crecimiento de células de cáncer que incluyen por ejemplo, aquellas en las cuales el crecimiento neoplásico, metástasis ósea, rechazo al transplante de órgano o un trastorno inmune tal como una enfermedad autoinmune los cuales son estimulados por CSF-1R.

"Tratamiento" o "trata", en el contexto de la presente invención se refiere a un tratamiento terapéutico que incluye inhibir, reducir, disminuir o invertir el progreso de la condición subyacente o cambio fisiológico indeseado asociado con una enfermedad o trastorno, aliviar los síntomas clínicos de una condición o prevenir la aparición de síntomas clínicos de la condición. Resultados clínicos benéficos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de los síntomas, disminución de la extensión de una enfermedad o trastorno, estabilización de una enfermedad o trastorno (es decir, donde la enfermedad o trastorno no empeoran), retardar o disminuir el progreso de una enfermedad o condición, alivio o paliación de la enfermedad o trastorno, y remisión (sea parcial o total) de la enfermedad o trastorno, sea detectable o indetectable. El tratamiento también puede significar prolongar la supervivencia comparada con la supervivencia esperada si no recibe tratamiento. Aquéllos en necesidad de tratamiento incluyen aquéllos ya con la enfermedad. En una modalidad, la presente invención puede ser usada como un medicamento.

En los métodos de la presente invención, una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la invención se administra a un mamífero o paciente en necesidad del mismo. Adicionalmente, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-CSF-1R de la invención. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" o "dosis efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y por periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo puede variar de conformidad con factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o porción del anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Otros factores incluyen administración, sitio objetivo, estado fisiológico del paciente, si el paciente es humano o un animal, otras medicaciones administradas, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Aunque anticuerpos humanos de la invención son particularmente útiles para administración a humanos, pueden ser administrados a otros mamíferos también. El término mamífero como se usa en la presente se pretende para incluir, pero no se limita a, humanos, animales de laboratorio, mascotas domésticas y animales de granja. Una cantidad terapéuticamente efectiva es también una en la cual cualesquiera efectos tóxicos o perjudiciales del anticuerpo o porción del anticuerpo son sobre-ponderados por los efectos terapéuticamente benéficos.

Los regímenes de dosificación pueden ser ajustados para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Las dosificaciones de tratamiento pueden ser tituladas usando métodos de rutina conocidos por aquellos expertos en la técnica para optimizar la seguridad y eficacia. Los programas de dosificación típicamente variarán de una dosificación de bolo único o infusión continua a administraciones múltiples por día (por ejemplo, cada 4-6 horas), o como se indica por el especialista que trata y la condición del paciente. Un intervalo no limitante, ejemplar para una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la invención es 0.1-50 mg/kg, más preferiblemente 3-35 mg/kg, y más preferiblemente 5-20 mg/kg. Cantidades y frecuencias dosificantes serán determinadas por los especialistas que tratan al paciente y pueden incluir dosis de menos de 1 mg/kg a más de 100 mg/kg dadas diariamente, tres veces por semana, semanalmente, una vez cada dos semanas, o menos frecuente. Se debe notar, sin embargo, que la presente invención no está limitada a cualquier dosis particular.

Los anticuerpos Anti-CSF-1R pueden ser administrados en combinación con uno o más de otros tratamientos anti-cancerígenos que incluyen pero no se limitan a un agente anti-angiogénesis, un agente quimioterapéutico, y un agente anti-neoplásico. Cualquier agente anticancerígeno adecuado puede ser usado, tal como un agente quimioterapéutico, radiación, anticuerpo o combinaciones de los mismos.

Agentes anti-cancerígenos incluyen pero no se limitan a agentes anti-neoplásicos, anticuerpos, adyuvantes, y profármacos. Los agentes anti-neoplásicos los cuales son actualmente conocidos en la técnica, o son evaluados, pueden ser agrupados en una variedad de clases que incluyen, por ejemplo, inhibidores mitóticos, agentes de alquilación, anti-metabolitos, antibióticos intercalantes, inhibidores del factor de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de topoisomerasa, agentes anti-supervivencia, modificadores de la respuesta biológica, anti-hormonas y agentes anti-angiogénesis. Ejemplos de agentes de alquilación incluyen, pero no se limitan a, cisplatino, ciclofosfamida, melfalan, y dacarbazina. Ejemplos de anti-metabolitos incluyen, pero no se limitan a, doxorubicina, daunorubicina, paclitaxel, gemcitabina, ALIMTA® e inhibidores de topoisomerasa irínotecano (CPT-11), aminocamptotecina, camptotecina, DX-8951f, topotecano (topoisomerasa I), etopósido (VP-16), y tenipósido (VM-26) (topoisomerasa II). Cuando el agente anti-neoplásico es radiación, la fuente de radiación puede ser ya sea externa (terapia de radiación de haz externo -EBRT) o interna (braquiterapia -BT) al paciente siendo tratado. La dosis del agente anti-neoplásico administrada depende de numerosos factores, que incluyen, por ejemplo, el tipo de agente, el tipo y severidad del tumor a ser tratado, y la ruta de administración del agente. Se debe enfatizar, sin embargo, que la presente invención no está limitada a cualquier dosis particular. En un aspecto, docetaxel es un agente anti-neoplásico preferido de la invención. En otros aspectos de la invención paclitaxel, Herceptin® y doxorubicina son los agentes anti-neoplásicos preferidos.

Anticuerpos anti-CSF-1R de la invención pueden ser administrados con anticuerpos que neutralizan otros receptores involucrados en el crecimiento del tumor o angiogénesis. En una modalidad de la invención, un anticuerpo anti-CSF-1R se usa en combinación con un antagonista del receptor que se une específicamente a Her2. Otro ejemplo de tal receptor es VEGFR. Un anticuerpo anti-CSF-1R puede ser usado en combinación con un antagonista del VEGFR. Un anticuerpo CSF-1R también puede ser administrado en combinación con uno o más adyuvantes adecuados, tales como, por ejemplo, citocinas (IL-10, IL-4 y IL-13, por ejemplo) u otros estimuladores inmunes, tales como, pero no limitados a, quimiocina, antígenos asociados al tumor y péptidos.

En la presente invención, cualquier método o ruta adecuados pueden ser usados para administrar anticuerpos anti-CSF-1R de la invención, y opcionalmente, para co-administrar agentes anti-neoplásicos y/o antagonistas de otros receptores. En una terapia de combinación de la presente invención, el anticuerpo anti-CSF-1R puede ser administrado antes, durante, sustancialmente simultáneo con, o después de comenzar la terapia con otro agente, que incluye pero no se limita a docetaxel, paclitaxel, Herceptin® o doxorubicina, así como también cualquier combinación de los mismos. Los regímenes de agente anti-neoplásicos utilizados de conformidad con la invención, incluyen cualquier régimen que se cree óptimamente adecuado para el tratamiento de la condición neoplásica del paciente. Diferentes males pueden requerir el uso de anticuerpos anti-tumorales específicos y agentes anti-neoplásicos específicos, los cuales serán determinados en un paciente con base en el paciente. Las rutas de administración incluyen, por ejemplo, administración oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. La dosis de antagonista administrado depende de numerosos factores, que incluyen, por ejemplo, el tipo de antagonistas, el tipo y severidad del tumor a ser tratado y la ruta de administración de los antagonistas. Se debe enfatizar, sin embargo, que la presente invención no está limitada a cualquier método o ruta particular de administración.

Los anticuerpos anti-CSF-1R de la invención, donde se usa en un mamífero con el propósito de profilaxis o tratamiento, son preferiblemente formulados como composiciones farmacéuticas. Tales composiciones farmacéuticas y procesos para preparar las mismas son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Remenigton: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro A., et al., eds., 19th a., Mack Publishing Co., 1995).

En otro aspecto de la invención, anticuerpos de la invención pueden ser administrados en conjunto con, o químicamente o biosintéticamente ligados a, agentes anti-cancerígenos, agentes anti-neoplásicos o anti-angiogénicos o agentes que producen señal detectable. Agentes anti-tumorales ligados a un anticuerpo incluyen cualesquiera agentes los cuales destruyen o dañan la neovasculatura o un tumor o macrófagos a los cuales el anticuerpo se ha unido o en el ambiente de la célula a la cual el anticuerpo se ha unido. La presente invención puede ser un anticuerpo anti-CSF-1R administrado como un conjugado, que incluye pero no se limita a un ¡nmunoconjugado, el cual se une específicamente al receptor y suministra una toxina después de la internalización del ligando-toxina. El conjugado de anticuerpo-agente puede ser directamente ligado entre sí o vía un enlazador, peptídico o no peptídico. Por ejemplo, un agente anti-tumoral o agente anti-macrófago es un agente tóxico tal como un agente anti-neoplásico o un radioisótopo. Agentes anti-neoplásicos adecuados, que incluyen agentes quimioterapéuticos, son conocidos por aquellos expertos en la técnica y se discuten infra. La invención además contempla anticuerpos anti-CSF-1R ligados a porciones objetivo o reporteras, que incluyen por medio del ejemplo solamente agentes anti-neoplásicos, otros anticuerpos o reporteros, tales como isótopos radioetiquetados, en un sistema diagnóstico donde un agente que produce señal detectable es conjugado al anticuerpo.

De conformidad con la invención, un método para inhibir la angiogénesis comprende administrar una composición que contiene un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención a un mamífero por un tiempo y en una cantidad efectiva para inhibir la angiogénesis. De manera similar, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo pueden ser usados en métodos para inhibir la metástasis del tumor en un mamífero administrando una composición que contiene un anticuerpo de la invención a un mamífero por un tiempo y en una cantidad efectiva para inhibir la metástasis de un tumor.

De conformidad con la invención, un método para inhibir la infiltración de macrófago en el estroma del tumor y estimular el crecimiento del tumor comprende administrar una composición que contiene un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención a un mamífero por un tiempo y en una cantidad efectiva para inhibir los efectos de macrófagos en el crecimiento del tumor. De manera similar, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo pueden ser usados en métodos para aliviar la erosión ósea alrededor de metástasis del tumor en un mamífero administrando una composición que contiene un anticuerpo de la invención a un mamífero por un tiempo y en una cantidad efectiva para inhibir la erosión ósea.

La invención contempla el uso del ligando CSF-1R (CSF-1 o IL-34) como un biomarcador en la sangre, suero, plasma, células tumorales o células tumorales de circulación, de pacientes con cáncer quienes responden al tratamiento cuando el cáncer ha expresado CSF-1R en la superficie de macrófagos asociados al tumor. La invención además contempla el método de predecir tratamiento exitoso de un paciente con el anticuerpo o fragmento de la presente invención midiendo los niveles de CSF-1 en sangre en una muestra en donde la muestra se selecciona del grupo que consiste de suero, plasma, células tumorales o células tumorales de circulación. Otro aspecto de la invención es un método para tratar cáncer en un paciente, que comprende las etapas: (1) medir el nivel de CSF-1 en una muestra tomada del paciente en donde la muestra se selecciona del grupo que consiste de sangre, suero, plasma, células tumorales y células tumorales de circulación, y (2) administrar al paciente el anticuerpo, o fragmento del mismo, de la presente invención si los niveles de CSF-1 son superiores que los niveles de CSF-1 encontrados en una población de control. La invención además contempla el método de predecir tratamiento exitoso de un paciente con el anticuerpo o fragmento de la presente invención midiendo los niveles de IL-34 en sangre en una muestra en donde la muestra se selecciona del grupo que consiste de suero, plasma, células tumorales o células tumorales de circulación. Otro aspecto de la invención es un método para tratar cáncer en un paciente, que comprende las etapas: (1) medir el nivel de IL-34 en una muestra tomada del paciente en donde la muestra se selecciona del grupo que consiste de sangre, suero, plasma, células tumorales y células tumorales de circulación, y (2) administrar al paciente el anticuerpo, o fragmento del mismo, de la presente invención si los niveles IL-34 son superiores que los niveles IL-34 encontrados en una población de control.

La presente invención también contempla un método para determinar si un sujeto que tiene un cáncer es un candidato para un régimen de tratamiento de cáncer a base de anticuerpo anti-CSF-IR, en donde el anticuerpo es el anticuerpo de la presente invención que comprende: (1) determinar ex vivo o in vitro el nivel de CSF-1 en una muestra del sujeto, en donde la muestra se selecciona del grupo que consiste de sangre, suero, plasma, células tumorales y células tumorales de circulación; y (2) en donde un incremento en el nivel de CSF-1, ya comparado con el nivel de CSF-1 en un individuo que no sufre de cáncer, es indicativo que el sujeto es un candidato para el régimen de tratamiento de cáncer a base de anticuerpo anti-CSF-1R.

La presente invención además contempla un método para determinar si un sujeto que tiene un cáncer es un candidato para un régimen de tratamiento de cáncer a base de anticuerpo anti-CSF-IR, en donde el anticuerpo es el anticuerpo de la presente invención, que comprende: (1) determinar ex vivo o in vitro el nivel de IL-34 en una muestra del sujeto, en donde la muestra se selecciona del grupo que consiste de sangre, suero, plasma, células tumorales y células tumorales de circulación; y (2) en donde un incremento en el nivel de IL-34, ya comparado con el nivel de IL-34 en un individuo que no sufre de cáncer, es indicativo que el sujeto es un candidato para el régimen de tratamiento de cáncer a base de anticuerpo anti-CSF-1R.

La presente invención también contempla un método para determinar si un sujeto que tiene un cáncer es un candidato para un régimen de tratamiento de cáncer a base de anticuerpo anti-CSF-IR, en donde el anticuerpo es el anticuerpo de la presente invención que comprende: (1) determinar ex vivo o in vitro el nivel de CSF-1, o IL-34, o ambos, en una muestra del sujeto, en donde la muestra se selecciona del grupo que consiste de sangre, suero, plasma, células tumorales y células tumorales de circulación; y (2) en donde un incremento en el nivel de CSF-1, o IL-34, o ambos, ya comparado con el nivel de CSF-1, o IL-34, o ambos, en un individuo que no sufre de cáncer, es indicativo que el sujeto es un candidato para el régimen de tratamiento de cáncer a base de anticuerpo anti-CSF-1 R.

Se pueden medir niveles de CSF-1 o IL-34 en una variedad de métodos que incluyen kits comercialmente disponibles (R&D Systems por CSF-1 y USCN de Life Sciences, Inc. por IL-34). En una de estas técnicas, se agregaron ya sea estándares o muestras de CSF-1 o IL-34 a una placa revestida con anticuerpos a CSF-1 o IL-34 humano para permitir el enlace de CSF-1 o IL-34 a los anticuerpos. Después del lavado de CSF-1 o IL-34 sin enlazar u otras proteínas, se agrega un anticuerpo secundario que reconoce el anticuerpo anti-CSF-1 o IL-34 respectivamente. El anticuerpo secundario se acopla a peroxidasa de rábano picante que emite un color azulado cuando se agrega el sustrato a las cavidades. La intensidad del color correlaciona la cantidad de CSF-1 o IL-34 encontrado en la placa.

Puesto que el CSF-1 e IL-34 son naturalmente originados en un cuerpo humano saludable, una líneas base CSF-1 y una IL-34 pueden necesitar ser determinadas en una población de control. La población de control puede incluir un grupo de individuos que no han sido diagnosticados de tener una condición cancerígena o signos de infección. Por lo tanto, la población control puede establecer un intervalo de niveles CSF-1 e IL-34 los cuales son normales o línea base para individuos saludables. Por ejemplo, niveles de CSF-1 son del 68% o 77% mayor en suero de pacientes con cáncer de mama o colorrectal, respectivamente, que en suero de grupos de control (Lawicki et al., Clin. Chim. Acta 317: 112-116 (2006); Mroczho eí al., Clin. Chim. Act 380: 208-212 (2007)). En un aspecto de la invención, los niveles del ligando de CSF-1 R son al menos 50% mayor en muestras de paciente con cáncer que en muestras de la población del control. El intervalo de niveles CSF-1 y/o IL-35 en la población de control puede ser comparado al nivel de CSF-1 y/o IL-34 identificado a partir de la muestras o muestras del paciente para determinar sin el nivel de CSF-1 y/o IL-34 del paciente es mayor que el intervalo de línea base de la población de control.

En un aspecto, los anticuerpos de la presente invención son para uso en el tratamiento de cáncer en donde las células cancerígenas están secretadas por ligando. En otro aspecto, los anticuerpos de la presente invención son para uso en el tratamiento de cáncer en donde las células cancerígenas son secretadas por CSF-1. En aún otro aspecto, los anticuerpos de la presente invención son para uso en el tratamiento de cáncer en donde las células son secretadas por IL-34.

La presente invención también incluye kits para inhibir crecimiento y/o angiogénesis del tumor que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-CSF-1R humano. Los kits pueden además comprender el anticuerpo o fragmento del mismo y un agente adicional que induce agentes anti-cancerígenos adicionales, agentes anti-neoplásicos o tratamientos, que incluyen pero no se limitan a docetaxel, paclitaxel, Herceptin® o doxorubicina. Alternativamente, o en adición a, los kits pueden contener cualquier agonista adecuado de, por ejemplo, otro receptor del factor de crecimiento en tumorigénesis o angiogénesis discutido infra. Los kits de la presente invención pueden además comprender un adyuvante.

Por lo tanto, los presentes anticuerpos del receptor asi se pueden usar in vivo e in vitro para métodos de investigación, diagnóstico, profiláctico o tratamiento, los cuales son bien conocidos en la técnica. Variaciones en los principios de invención descritos en la presentes se pueden elaborar por uno de experiencia en la técnica y se pretende que estas modificaciones sean incluidas dentro del alcance de la presente invención.

Se entenderá y esperará que las variaciones en los principios de la invención descrita en la presente se puedan elaborar por uno de experiencia en la técnica y se pretende que estas modificaciones sean incluidas dentro del alcance de la presente invención.

Ejemplos Los siguientes ejemplos además ilustran la invención, pero no deben ser interpretados como limitantes del alcance de la invención en cualquier forma; deben no ser interpretados como limitante del alcance amplio de la invención. Descripciones detalladas de los métodos convencionales, tal como aquellos empleados en la construcción de vectores y plásmidos, la inserción de genes que codifican polipéptidos en estos vectores y plásmidos, la introducción de plásmidos en células hospederas, y la expresión y determinación de los mismos genes y productos del gene se pueden obtener de numerosas publicaciones, que incluyen Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) y Coligan, J. et al., Current Protocols in Immunology, Wiley & Sons, Incorporated (2007).

Expresión y Purificación de Anticuerpos Anti-CSF-1R Humanos Para cada anticuerpo, se diseñó por ingeniería una secuencia de nucleótido de cadena pesada adecuada, por ejemplo SEC ID NO. 13 para el anticuerpo I en un plásmido de expresión adecuada, por ejemplo pGSHC, y se diseñó por ingeniería una secuencia de nucleótido de cadena ligera adecuada, por ejemplo SEC ID NO. 14 para el anticuerpo 1 en un plásmido de expresión adecuada, tal como pGSLC, por un método adecuado tal como clonación PCR. Para establecer una línea celular estable, se co-transfectó en una línea celular hospedera adecuada, tal como células NSO o NSO, con plásmidos de cadena pesada i ligera linearizados por electroporación y cultivo en medio adecuado tal como Medio Eagle Modificado por Dulbecco libre de glutamina con suero de temara fetal dializado y suplementado con glutamina sintasa. Los clones elegidos para expresión del anticuerpo por un ensayo inmunosorbente similar a la enzima (ELISA) y se selecciona el mayor productor para cultivo en matraces giratorios. Se purificaron los anticuerpos por un método adecuado tal como cromatografía de afinidad de proteína A.

La Tabla 1 proporciona las secuencias de aminoácido y SEC ID Nos. de los CDRs variados del Anticuerpo 1 de la presente invención.

Todas las secuencias se determinaron usando la convención Kabat. La Tabla 2 proporciona las SEC ID Nos: de las secuencias variadas relacionadas a la presente invención. También se incluyen dentro del alcance de la presente invención secuencias de ácido polinucleico que codifican las secuencias de aminoácido descritas posteriormente.

Tabla 1: Secuencia de Aminoácido de Región Variable de CDRs Cadena Pesada y Ligera del Anticuerpo 1 Tabla 2. Secuencias de Aminoácido SEC ID Nos del Anticuerpo 1 Ensayo de Enlace del Ensayo Inmunosorbente unido a la Enzima (ELISA) Para el ensayo de enlace a CSF-1R, se recubrió una placa de 96 cavidades con proteína de fusión CSF-1R-Fc humana recombinante soluble (R&D Systems)(1 pg/ml X 100 µ?) en placa sellada, y se incubó durante la noche a 4°C. Las cavidades se lavaron 3 veces con PBS (Salina Amortiguada de Fosfato) que contiene TWEEN-20® (PBS/T) al 0.2%, entonces las cavidades se bloquearon por 1 hora a temperatura ambiente (20-25°C)(TA) con PBS que contiene albúmina de suero bovino (BSA) al 3%. Se aspiró la mezcla de BSA-PBS y las placas se lavaron 3 veces con PBS/T. Se elaboraron diluciones seriales del Anticuerpo 1 o IgG control (partiendo a 3 µ?/??? y diluyendo 3 veces) y se agregó 100 µ? a las cavidades por 1 hora a TA. Se lavaron las cavidades 3 veces con PBS/T. Después del lavado, la placa se incubó con 100 µ? de conjugado HRP específico al fragmento F(ab')2 antihumano (Jackson ImmunoResearch) en PBS (dilución 1:5000) a temperatura ambiente por 1 hora. Las placas se lavaron 5 veces con PBS/T y después se incubaron con 100 µ? de una preparación 1:1 de sustrato de peroxidasa TMB y solución B de peroxidasa (KLP) por 15 minutos a TA. Se detuvo la reacción colorimétrica con la adición de 100 µ? de H2S04 0.1M. Los datos recolectados usando un lector de microplaca fijado a 450 nm. Se analizaron los datos de absorbancia con el software GraphPad Prism para calcular el ED50. El ED50, o la dosis efectiva máxima media, es la dosis necesaria para lograr un enlace máximo del 50%.

El ED50 del anticuerpo 1 a CSF-1R humano es 8.7 x 10-11M, reportado como 0.09 nM. El anticuerpo 1 exhibe fuerte enlace a CSF-1R.

Ensayo de Bloqueo del Ensayo Inmunosorbente unido a la Enzima (ELISA) ELISA para Mostrar Anticuerpos que Bloquean la Interacción CSF-1/CSF-1R Se recubrieron unas placas de microtitulador de 96 cavidades con (0.5 g/ml x 100 µ?) de CSF- (R&D Systems) a 4°C durante la noche. Las cavidades se lavaron 3 veces con PBS/T, después se bloquearon con 100 µ? de BSA/PBS al 3% por 1 hora a TA. Se lavaron nuevamente 3 veces con PBS/T. Se diluyó la proteína de fusión rh-CSF-1R-Fc humana soluble (R&D Systems) a una concentración final de 0.250 µ?/??? en PBS. Concurrentemente, se diluyó el anticuerpo 1 en PBS a una concentración final de 200 nM. Se diluyó serialmente el Anticuerpo 1 en incrementos 1:3 a partir de 200 nM inicial hacia abajo a 3x10"12M. Se combinó 100 µ? de la rh-CSF-1R-Fc con 100 µ? de cada dilución del Anticuerpo 1 por 30 minutos a TA. Se incubó 100 µ? de mezclas Anticuerpo 1:CSF-1R-Fc por una hora a TA en las cavidades recubiertas con CSF-1. Después de 1 hora de incubación a TA, se lavaron 3 veces con PBS/T y se agregó una dilución 1:5000 del anticuerpo conjugado IgG-Fc-HRP anti-humano a las placas por 1 hora a TA. Las placas se lavaron 5 veces con PBS/T y entonces se incubaron con 100 µ? de una preparación 1:1 de sustrato de peroxidasa TMB y solución B de peroxidasa (KLP) por 15 minutos a TA. Se detuvo la reacción colorimétrica con la adición de 100 µ? de H2S04 0.1M. Se recolectaron los datos usando un lector de microplaca fijado a 450 nm. Se analizaron los datos de absorbancia con el software GraphPad Prism para calcular el IC50. El IC50, o la concentración inhibitoria máxima media, es la concentración del anticuerpo que provoco 50% de inhibición del ligando enlazado al receptor.

El IC5o del Anticuerpo 1 enlazado a CSF-1R humano es 8.1X10 M, reportado como 0.81 nM. El Anticuerpo 1 inhibe CSF-1 enlazado a CSF-1R, con ello se previene la activación de CSF-1R por el ligando CSF-1.

ELISA para Mostrar Anticuerpos que Bloquean la Interacción IL-34/CSF-1R Se recubrieron unas placas microtituladoras de 96 cavidades con (0.5 Mg/ml x 100 µ?) de IL-34 (R&D Systems) a 4°C durante la noche. Se lavaron las cavidades 3 veces con PBS/T, entonces se bloquearon con 100 µ? de BSA/PBS al 3% por 1 hora a TA. Se lavaron nuevamente con PBS/T 3 veces. Se diluyó la proteína de fusión rh-CSF-1R-Fc humana soluble (R&D Systems) a una concentración final de 0.250 pg/ml en PBS. Concurrentemente, se diluyó el Anticuerpo 1 en PBS a una concentración final de 200 nM. Se diluyó serialmente el Anticuerpo 1 en incrementos 1:3 a partir de 200 nM inicial hacia abajo a 3x10"1 M. Se combinó 100 µ? de la rh:CSF-1 R-Fc con 100 µ? de cada dilución del Anticuerpo 1 por 30 minutos a TA. Se incubó 100 µ? de mezclas Anticuerpo 1-CSF-1R-Fc por 1 hora a TA en las cavidades recubiertas con IL-34. Después de 1 hora de incubación a TA, se lavaron 3 veces con PBS/T y se agregó una dilución 1:5000 del anticuerpo conjugado IgG-Fc-HRP anti-humano a las placas por 1 hora a TA. Se lavaron las placas 5 veces con PBS/T y después se incubaron con 100 µ? de una preparación 1:1 de sustrato de peroxidasa TMB y solución B de peroxidasa (KLP) por 15 minutos a TA. Se detuvo la reacción colorimétrica con la adición de 100 µ? de H2S04 0.1M. Se recolectaron los datos usando un lector de microplaca fijado a 450 nm. Se analizaron los datos de absorbancia con el software GraphPad Prism para calcular el IC5o. El IC50, o la concentración inhibitoria máxima media, es la concentración del anticuerpo que provocó 50% de inhibición del ligando enlazado al receptor.

El IC50 del Anticuerpo 1 enlazado a CSF-1R humano es 7.0x10"10M, reportado como 0.71 nM. El Anticuerpo 1 inhibe IL-34 enlazado a CSF-1R, con ello se previene la activación de CSF-1R por el ligando IL-34.

Análisis de Cinética de Enlace por Análisis de Resonancia de Plasmón de Superficie/Biacore® Se midieron las cinéticas de enlace del Anticuerpo 1 a CSF-1 R-Fc a 25°C en un Biosensor 200 SRP Biacore® (GE Healthcare). Se inmovilizó la proteína de fusión CSF-1R-Fc soluble (concentración de 10 pg/ml y pH 5), que varía de 395 a 1200 unidades de respuesta, en un chip CM5 usando el protocolo de acoplamiento de amina estándar. Se usó HBS-EP (HEPES 0.01 M (pH 7.4), NaCI 0.15 mM y EDTA 3 mM, Tensoactivo P20 a 0.005% v/v) como un amortiguador de corrida durante las mediciones de afinidad de enlace. Se inyectaron los análisis de interacción de desempeño como los anticuerpos en solución a una concentración que varia de 1.5-100 nM sobre la superficie preparada del chip sensor CM5. Se inyectaron los anticuerpos durante 3 minutos para enlazar y permitir la disociación por 15 minutos. Se realizó la regeneración de la proteína inmovilizada por una inyección 10 µ?/min de HCL 20 mM. Se usó el software BIAevaluation versión 4.1 para determinar el Ka (kasoc) y K<¡ (kd¡SOc) de la formación del complejo por ajustes globales simultáneos de los datos a un modelo Langmuir 1:1. Se calculó la constante de asociación de equilibrio (KA) a partir de la relación de 1/KD medida en Moles (1/M). Se calculó la constante de disociación de equilibrio (KD) a partir de la relación constantes de velocidad Kd/Ka medidas en Moles (M).

Los valores Ka, Kd y KD promedio para análisis Biacore ® múltiples para el Anticuerpo 1 con CSF-1R humano se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3: Cinéticas de Enlace del Anticuerpo a CSF-1R Humano Recombinante El Anticuerpo 1 demostró una afinidad de enlace alta a CSF- 1R.

Fosforilación de CSF-1R Detectado por Manchado Western Se sembraron células NIH3T3 establemente transfectadas con células CSF-1R en una placa de 12 cavidades a una densidad de 5x105 células/cavidad en cavidad de 1 mi de Medio Eagles Modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene suero de bovino fetal al 10% (FBS) y 1 mg/ml de geneticina por 5 horas. Se lavaron las monocapas dos veces con PBS y se cultivaron durante la noche en 0.9 ml/cavidad de DMEM con FBS al 1%. Se elaboraron diluciones seriales del Anticuerpo 1 en DMEM (partiendo a 1 µg/ml y diluyéndolo 3 veces) y se agregó 100 µ? a las cavidades por 2 horas a 37°C. Se estimularon las células con 100 ng/ml de ligando CSF-1 o IL-34 por 10 minutos y después se colocaron en hielo y se lavaron con PBS enfriado con hielo. Se sometieron a lisis las células en 100 µ? de Hepes 50 mM (pH 7.5, NaCI 150 mM, Tritón X-100 al 0.5%, Na3V04 1 mM, NaPPi 10 mM, NaF 50 mM) y tableta de inhibidores de proteasa (Roche) en hielo por 10 minutos. Se clarificaron las células Usadas por centrifugación a 4°C. Se cargó 20 µ? del lisado en un gel de electroforesis desnaturalizado y manchado en una membrana de nitrocelulosa. Se detectó CSF-1 R fosforilado con tirosina en el manchado usando un anticuerpo anti-fosfo CSF-1R a 1 g/ml (Señalización Celular). Se determinó la señalización CSF-1R probando el manchado con ya sea anti-fosfo MAPK (dilución 1:500) o Akt anti-fosfo (1:1000) (Señalización Celular). Para asegurar carga igual de los carriles, se exploraron manchados con anticuerpos anti-CSF-1R (1 µg/ml; R&D Systems) o anticuerpos anti-actina (1:2000; Sigma). Se incubaron todos los anticuerpos primarios con balanceo por 1 hora a TA; seguido por el anticuerpo secundario correspondiente conjugado con HRP, también con balanceo por 1 hora a TA. Se visualizaron las bandas con un reactivo quimioluminiscente (GE Healthcare).

Las células NIH-3T3 establemente transfectadas con CSF-1R mostraron fosforilación rápida de CSF-1R cuando se estimularon con ya sea CSF-1 o IL-34. La presencia del Anticuerpo 1 inhibió la fosforilación de CSF-1R, aún cuando los niveles de los Anticuerpos están a 1 nM, indicando que el enlace del Anticuerpo 1 a CSF-1R previene la activación del receptor por ya sea CSF-1 o IL-34. La inhibición de fosforilación de CSF-1R también conduce a disminuir la fosforilación de las moléculas de señalización usadas por cualquiera de las trayectorias CSF-1 o IL-34. Tanto Akt como MAPK, los cuales son corriente arriba de CSF1-R, han disminuido los niveles de fosforilación cuando las células se incuban con 100 nM a 1 nM de los Anticuerpos 1. Por lo tanto, el Anticuerpo 1 previene la activación de CSF-1R y la activación de la cascada cinasa que continua la estimulación de CSF-1R. No existe diferencia en los niveles de proteína de actina y CSF-1R entre carriles, como es evidente por la señal quimioluminiscente igual en cada carril observado cuando los manchados se examinan con los anticuerpos contra estas moléculas. Por lo tanto, la inhibición de fosforilación CSF-1R no es debido a dificultades técnicas con carga desigual de muestras de proteína pero una representación verdadera de señalización disminuida.

Ensayos de Internalización y Degradación Internalización inducida por el Anticuerpo 1 del Receptor CSF-1R Se sembraron en placas las células NIH-3T3-CSF-1 R en porta-objetos en cámaras de 8 cavidades (Nunc) y se incubaron a 37°C hasta que las células cubrieron el 50% del área de superficie de las cavidades. Se dejaron enfriar los porta-objetos a 4°C antes de iniciar el experimento en una mezcla agua:suspensión congelada. Se incubaron las células con 5 µg/ml del Anticuerpo 1 e inmediatamente se transfirieron a 37°C por 15 minutos durante 4 horas para permitir que se produzca la internalización. Se continuó la incubación en juegos separados de porta-objetos en la mezcla agua:suspensión congelada por 15 minutos durante 4 horas con 5 pg/ml del Anticuerpo 1 como un control. La incubación a 4°C previene la internalización del receptor CSF-1, por lo tanto cualquier señal observada dentro de la célula es un producto artificial. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con PBS frío antes de fijar las células con paraformaldehído al 1% enfriado con hielo durante 15 minutos. Después del lavado tres veces con PBS frío, las células permeabilizadas en PBS que contiene saponina al 0.5% y BSA al 1% durante 5 minutos y después se lavaron nuevamente en PBS que contiene BSA al 1%. Se etiquetaron con IgG anti-humano Cy3 de cabra (dilución a 1:5000) por 1 hora al Anticuerpo 1 fluorescentemente etiquetado. Se realizaron tres lavados finales con PBS antes de montarlas en GelMount (Biomeda) y se cubren los portaobjetos con cubre-objetos. El Anticuerpo 1 fluorescentemente etiquetado puede ser visualizado por medio de microscopio para determinar la localización celular bajo las condiciones variadas descritas anteriormente.

En la inspección por microscopio, el Anticuerpo 1 se observó en la periférica de la célula a 4°C antes del inicio del experimento. Se cambiaron las células a 37°C permitiendo rápida internalización del complejo Anticuerpo 1/CSF-1R, usualmente observada dentro de 15 minutos. Después de 1 ó 2 horas de incubación con Anticuerpo 1, todos los complejos anticuerpo/CSF-1 R son perinucleares con muy poca visualización en la membrana del plasma, indicando que el Anticuerpo 1 enlazado a CSF-1R induce al receptor a internalizarse rápidamente y permanece dentro de la célula. Las células se mantienen a 4°C por hasta 2 horas mostrando solamente teñido periférico de la célula, sin internalizacion del Anticuerpo 1. Así, la internalizacion del anticuerpo/CSF-1 R es un proceso dependiente de ATP que ocurre dentro de 15 minutos de la adición del anticuerpo a las células.

Degradación inducida por el Anticuerpo 1 del Receptor CSF-1R Se sembraron células NIH-3T3-CSF-1 R a 5x105 células/cavidad en una placa de 12 cavidades en 1 mi de medio DMEM que contiene FBS al 10% y 1 mg/ml de geniticina. Después de la incubación celular a 37°C por 5 horas, se agregó ya sea 100 ng/ml de CSF-1 ó 15 pg/ml del Anticuerpo 1 a las placas. Se conoce CSF-1 por inducir internalización y degradación de CSF-1R, con ello actúa como un control positivo para el experimento. Se dejó reposar CSF-1 en las células por 1 y 5 horas antes de recolectar las células. En las otras cavidades, se incubaron por 24 y 48 horas con el Anticuerpo 1 antes de recolectar las células. Se aspiró el medio, se lisaron las células y se corrieron los lisados clarificados en geles (como se describió anteriormente). Se examinaron las proteínas transferidas con anticuerpos anti-CSF-1R para determinar la cantidad del receptor para cada condición. Se examinaron los mismos manchados con anticuerpos anti-actina para normalizar los niveles de proteína. Se cuantificaron los niveles de CSF-1R y actina usando el programa Multi-Gauge para medir la densidad de banda en el manchado Western. El nivel de proteina CSF-1R total relativo es representado por la densidad de banda de CSF-1R total dividido por la densidad de banda de actina correspondiente.

La incubación de CSF-1 con células NIH-3T3-CSF-1 R conduce a degradación de CSF-1R dentro de 1 hora del tratamiento y los niveles de CSF-1R divididos en dos durante 5 horas. La degradación de CSF-1R cuando se incuba con el Anticuerpo 1 no es pronunciada; el Anticuerpo 1 disminuye los niveles de CSF-1R a un cuarto. Después de 48 horas, los niveles de degradación permanecen iguales, indicando que la velocidad de degradación permanece constante. Por lo tanto, el Anticuerpo 1 enlazado a CSF-1R conduce a la degradación del receptor en las células.

Citotoxidad Mediada por la Célula Dependiente del Anticuerpo (ADCC) para el Anticuerpo 1 Además de la inhibición de CSF-1 enlazado a CSF 1R e inducir la internalización y degradación de CSF-1R, el Anticuerpo 1 también inhibe CSF-1R provocando una respuesta ADCC.

Se sembraron células de leucemia humana NKM-1 a 2x105 células en 25 µ? de medio RPMI que contiene FBS IgG Ultra-bajo al 10% y 3 ng/ml de IL-2 humano en una placa de 96 cavidades. Se elaboraron diluciones seriales 1:3 de 1 µg/ml del Anticuerpo 1 en ya sea un armazón lgG1 o lgG2, se agregaron 25 µ?/cavidad. Después de unos 15 minutos de incubación, se sembraron 25 µ? de 3x108 células/ml de células NK humanas (Lonza) y se incubaron por cuatro horas adicionales a 37°C. Se agregó 10 µ? de Amortiguador de Lisis a partir de un kit aCella-TOX (Cell Technology) y se llevó a TA por 15 minutos. Se agregó 125 µ? de FBS IgG bajo y las placas se centrifugaron por 1 minutos a 750 xg. En Optiplates (Perkin Elmer), se agregó 50 µ? del Diluyente para Ensayo de la Enzima del kit aCella-TOX y cuidadosamente se transfirió 50 µ? del sobrenadante celular a Optiplates. Se preparó el reactivo para ensayo y reactivos de detección de la enzima de acuerdo a las instrucciones del kit, se agregó 100 µ? del reactivo para ensayo de la enzima inmediatamente seguido por 50 µ? del reactivo de detección a Optiplates. Se leyeron las placas en el luminómetro 20 minutos después que se agregaron los reactivos.

La actividad ADCC se incrementó en una forma dependiente de la dosis del Anticuerpo 1 con 9% de células NKM-1 eliminadas cuando las concentraciones del Anticuerpo 1 alcanzaron 1 g/ml. En contraste, cuando el Anticuerpo 1 se clonó en un armazón lgG2 no hubo cambios en la actividad ADCC con cantidades incrementadas del Anticuerpo 1. Por lo tanto, el Anticuerpo 1, una molécula I gG 1 , induce ADCC de células a las cuales se enlaza.

Mapeo del Epítope Publicaciones previas han determinado que CSF-1 se enlaza a los tres primeros dominios Ig de CSF-1R. Wang et al., Mol. Cell. Biol. 13: 5348 (1993). El Anticuerpo 1 se enlaza a CSF-1R e inhibe CSF-1 enlazado a CSF-1R humano, así puede enlazarse a o cerca de los tres primeros dominios Ig de CSF-1R. Para determinar cuál Anticuerpo 1 de los epítopes de enlaza a la molécula CSF-1R, los primeros tres dominios Ig de ratón y humano son intercambiados (véase Tabla 4). El Anticuerpo 1 no reconoce el CSF-1R de ratón, por lo tanto, si un dominio Ig de ratón se inserta en una región enlazante crítica del CSF-1R humano, puede no ocurrir el enlace de los anticuerpos.

Se insertan las modificaciones de los primeros tres dominios Ig en una armazón CSF-1R humano que contiene los dos restantes dominios Ig más C-terminal del dominio extracelular. Se fusionaron estos constructos a la porción Fe de una molécula IgG para facilidad en producción de proteína y estabilidad de las moléculas.

Tabla 4: Dominios Ig de CSF-1R Definidos La quimera 1 así contiene dominio 1 Ig de ratón, dominio 2 Ig humano y dominio 3 Ig humano (m,h,h), dominios 4 y 5 Ig humanos fusionados a una etiqueta Fe. La quimera 2 a quimera 7 son como siguen: m,m,h (quimera 2), m,m,m (quimera 3), h,m,h (quimera 4), h,m,m (quimera 5), h,h,m (quimera 6) y m,h,m (quimera 7) fusionada a los últimos dos dominios Ig de CSF-1R humano y entonces la etiqueta Fe.

El Anticuerpo 1 enlazado a las proteínas CSF-1R quiméricas se determina enlazando ELISAs y Biacore® como se describe anteriormente. Brevemente, las placas recubiertas con 100 µ? de 200 ng/ml de proteínas de humano, ratón o quimera 1-7 durante la noche. Después del lavado y bloqueo de las placas, se agregó el Anticuerpo 1 en replicas a concentración de 100 nM. Se agregaron anticuerpos secundarios Fab anti-humanos conjugados a HRP a una concentración de 1:10,000 para detectar el Anticuerpo 1 enlazado a las moléculas CSF-1R.

Como se espera, el Anticuerpo 1 enlazado a CSF-1R humano pero no de ratón en los ensayos de enlace ELISA. El Anticuerpo 1 enlazado débilmente a las quimeras que contienen los primero y segundo dominios Ig humanos, pero no aquellos que contienen el primero o segundo dominio Ig de ratón. El Anticuerpo 1 enlazado fuertemente a la quimera que contiene tanto el primero así como el segundo dominio Ig de CSF-1R humano. Todos los otros constructos no se enlazan al Anticuerpo 1. Por lo tanto, el Anticuerpo 1 se enlaza a dominios Ig uno y dos, pero requiere ambos dominios para enlazar fuertemente el anticuerpo a CSF-1R humano cuando se evalúa en un ensayo de enlace. Los datos Biacore® recapitulan los datos de ELISA. Cualquier constructo quimérico que no contiene un segundo dominio Ig Humano no se enlaza al Anticuerpo 1 aún cuando los niveles de anticuerpo están a 1 µ?, indicando que se requiere el segundo dominio Ig para enlazar el Anticuerpo 1. El enlace del Anticuerpo 1 además se mejora cuando el primer dominio Ig también fue de origen humano. Por lo tanto, el Anticuerpo 1 principalmente se enlaza al segundo dominio Ig de CSF-1R pero tiene algunos contactos benéficos con el primer dominio ig- Ensayos de Diferenciación y Proliferación Diferenciación de Macrófago por CSF-1R Se sembraron monocitos (Lonza) a una densidad de 4x105 células/ml en cada cámara de un porta-objeto de 8 cámaras en 900 µ? de medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 que contiene FBS al 10% y 100 ng/ml de hCSF-1. Se elaboraron diluciones seriales del Anticuerpo 1 en RPMI (partiendo de 1 g/ml y diluido 3 veces) y se agregó 100 µ? a las cavidades. Se incubaron a 37°C, cambiando el medio cada tres días hasta que los monocitos son visiblemente observados por adherirse a la placa y alargarse, lo cual es característico de diferenciación de macrófago.

Los monocitos tratados con concentraciones a 2 nM o mayores del Anticuerpo 1 en la presencia de CSF-1 fallan al diferenciarse en macrófagos, reteniendo su morfología redondeada característica de monocitos. La inducción de CSF-1 de monocito a diferenciación de macrófago puede ser inhibida con el Anticuerpo 1 con un IC50 de 0.25 nM. Además, pueden morir durante el tratamiento, incapaces de sobrevivir sin estimulación continua con CSF-1.

Diferenciación de Macrófago por IL-34 Se sembraron monocitos (Lonza) a una densidad de 4x105 células/ml en cada cámara de un porta-objeto de 8 cámaras en 900 µ? de medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 que contiene FBS al 10% y 100 ng/ml de hlL-34. Se elaboraron diluciones seriales del Anticuerpo 1 en RPMI (partiendo de 1 µg/ml y diluyéndolo 3 veces) y se agregó 100 µ? a las cavidades. Se incubaron a 37°C, cambiando el medio cada tres días hasta que los monocitos son visiblemente observados por adherirse a la placa y alargarse, lo cual es característico de diferenciación de macrófago.

Los monocitos se trataron con concentraciones a 2 nM o mayores del Anticuerpo 1 en la presencia de IL-34 que falla al diferenciarse en macrófagos, reteniendo su morfología redondeada característica de monocitos. La inducción de IL-34 de monocito a diferenciación de macrófago puede ser inhibida con el Anticuerpo 1 con un IC50 de 0.3 nM. Además, muchos mueren durante el tratamiento, incapaces de sobrevivir sin estimulación continua con CSF-1.

Proliferación de Monocito por CSF-1 Se sembraron monocitos (Lonza) a una densidad de 3000 células/cavidad en una placa de 96 cavidades en la presencia de medio RPMI 1640 que contiene FBS al 10% y 100 ng/ml de CSF-1. Al siguiente día, se intercambió el medio y se agregó el Anticuerpo 1 serialmente diluido de 20 nM a 0.01 nM (diluciones 1:3 veces). Se intercambió el medio por medio fresco que contiene FBS al 10%, 100 ng/ml de CSF-1 y el anticuerpo de tres días posteriores y las células se dejaron crecer por 5 días adicionales. En la adición de 100 µ? de amortiguador Luminiscente CelITiter Glo y sustrato (Promega), las células se sacudieron por 10 minutos la luminiscencia se leyó como un indicador de viabilidad.

El IC50 del Anticuerpo 1 que inhibe el 50% del crecimiento de monocito es 1.4x10'10 M, reportado como 0.1 nM. El IC50 para inducción de CSF-1 del crecimiento de monocito en la presencia del Anticuerpo 1 indica que el Anticuerpo 1 inhibe la proliferación de monocitos en cultivo.

Proliferación de Monocito por IL-34 Se sembraron monocitos (Lonza) a una densidad de 3000 células/cavidad en una placa de 96 cavidades en la presencia de medio RPMI 1640 que contiene FBS al 10% y 100 ng/ml de IL-34. Al siguiente día, se intercambió el medio y se agregó el Anticuerpo 1 serialmente diluido de 20 nM a 0.01 nM (diluciones 1:3 veces). Se intercambió el medio por medio fresco que contiene FBS al 10%, 100 ng/ml de IL-34 y el anticuerpo de tres días posteriores y las células se dejaron crecer por 5 días adicionales. En la adición de 100 µ? de amortiguador Luminiscente CelITiter Glo y sustrato (Promega), las células se sacudieron por 10 minutos la luminiscencia se leyó como un indicador de viabilidad.

El IC50 del Anticuerpo 1 que inhibe el 50% del crecimiento de monocito es 0.5 nM. El IC50 para inducción de IL-34 del crecimiento de monocito en la presencia del Anticuerpo 1 indica que el Anticuerpo 1 inhibe la proliferación de monocitos en cultivo.

Ensayo de Proliferación para Líneas Celulares de Tumor con CSF-1 Se sembraron células de leucemia NKM-1 a 4x104 células/ml en 100 µ? de medio RPMI 1640 que contiene FBS al 1% en placas de 96 cavidades durante la noche. Se agregó 20 ng/ml de CSF-1 a las células en medio RPMI 1640 que contiene FBS al 1% y Anticuerpo 1 de 20 nM a 0.01 nM serialmente diluido (diluciones 1:3 veces). Se incubaron por 3 días adicionales e 37°C. En adición de 100 µ? al amortiguador Luminiscente CelITiter Glo y sustrato (Promega), las células se sacudieron por 10 minutos antes de leer la luminiscencia (como un indicador de viabilidad).

El IC50 para crecimiento de NKM-1 en la presencia del Anticuerpo 1 es 7.6x10"11 M, reportado como 0.07 nM. Esto indica que el Anticuerpo 1 inhibe la proliferación de células NKM-1 en el cultivo.

Modelos de Tumor in vivo en donde CSF-1 R es Expresado en la Superficie del Tumor Supervivencia Prolongada de Ratones que Portan Leucemia Humana NKM-1 Tratados con el Anticuerpo 1 Se irradiaron ratones Nu/nu subletalmente con 200 rads/ratón 24 horas antes de la inyección intravenosa con 2.5x106 células de leucemia NKM. Unas 24 horas posteriores adicionales, los ratones se dividieron aleatoriamente en 4 grupos que recibieron ya sea 60 mg/kg de IgG humano, 60 mg/kg, 20 mg/kg o 5 mg/kg del Anticuerpo 1 dos veces a la semana. Los ratones se monitorearon diariamente para supervivencia. Se determinaron los valores P por la prueba Mantel Cox ordenada por log.

Tabla 5: Supervivencia Incrementada de Ratones Tratados con el Anticuerpo 1 que Porta Células de Leucemia NKM-1 N/A = No aplicable Se calcularon los volúmenes de tumor por la fórmula Volumen = [( Pi/6) 1 xw2], en donde Pi igual a 3.14, w representa amplitud y 1 representa longitud. Porcentaje de Control o %T/C = 100* (Volumen de Tratamiento)/(Volumen de Control). Se adscribió la significancia estadística si el valor p fue menor que o igual a 0.05.

El Anticuerpo 1 incrementa la supervivencia de ratones que portan las células de leucemia NKM-1 como se observa en la Tabla 5.

Modelos de Tumor in vivo en donde CSF-1R es Expresado en la Superficie de Macrofagos Asociados al Tumor El Anticuerpo 1 anti-CSF-1R es un anticuerpo completamente humano que reconoce la forma humana de CSF-1R pero no la forma de murino del receptor. Por lo tanto, se requiere un anticuerpo anti-ratón para conducir la prueba de estudios in vivo del concepto en donde CSF-1R es expresado en el macrófago. Estos estudios dirigen el papel de macrofagos de ratón en el crecimiento de tumores humanos en modelos de injerto heterólogo en ratones. Un anticuerpo anti-ratón puede afectar los macrofagos de ratón pero no el tumor, permitiendo la capacidad para medir el efecto de macrofagos estromales en crecimiento del tumor. Se conducen los siguientes experimentos con el Anticuerpo 2, un anticuerpo CSF-1R de rata antiratón.

Eficacia del mAb CSF-1R anti-Ratón en el Modelo de Injerto Heterólogo AN3CA de Carcinoma Endometrial Humano Se inyectaron subcutáneamente ratones Nu/nu (hembras, 7- 8 semanas de edad) con 5x106 células AN3CA en el lado izquierdo. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 200 mm3, los ratones se dividieron al azar en grupos de 12 ratones/tratamiento.

Se preparó el Anticuerpo 2 e IgG de Rata en salina a una concentración de 6 mg/ml y se administró subcutáneamente tres veces por semana a 40 mg/kg. Al día 15 se registraron los volúmenes de tumor y se calculó el %T/C. Se analizaron los volúmenes de tumor usando RM ANOVA. Se calculó un %T/C del 66% para el grupo de tratamiento con el Anticuerpo 2 contra el grupo control de IgG de Rata. Estos resultados mostraron significante inhibición de tumor (p = 0.045) en animales tratados con el Anticuerpo 2.

Eficacia del mAb CSF-1R Anti-Ratón en Modelo de Injerto Heterólogo HCC1954 de Carcinoma de Mama Humano Se inyectaron subcutáneamente ratones Nu/nu (hembras, 7-8 semanas de edad, Charles River Laboratories) con 5x107 células HCC1954/ratón. Cuando los tumores alcanzaron 300 mm3 en tamaño, los ratones se dividieron al azar por tamaño de tumor, asignando 12 animales a cada grupo de tratamiento. Se preparó IgG de Rata y el Anticuerpo 2 en salina a una concentración de 6 mg/ml y se administró subcutáneamente tres veces por semana. Los animales con IgG de rata se dosificaron a 40 mg/kg y los animales con el Anticuerpo 2 se dosificaron con ya sea 40 mg/kg o 10 mg/kg en cada inyección. Se registraron las mediciones del tumor dos veces a la semana; 37 días después de la primera inyección calculando el %T/C. Se analizaron los volúmenes del tumor usando RM ANOVA.

Como se muestra en la Tabla 6, se calculó un %T/C de 77% para el grupo de tratamiento que recibió 10 mg/kg y %T/C de 56% para el grupo de tratamiento que recibió 40 mg/kg en el día 37 como la relación de los volúmenes de tumor relativo contra el grupo de control de salina. Los resultados muestran significante inhibición de tumor (p = 0.0014) en animales tratados con 40 mg/kg del Anticuerpo 2.

Efecto Antitumoral de un mAb CSF-1R anti-Ratón en Modelo de Injerto Heterólogo de Próstata Humano DU145 Se inyectaron subcutáneamente ratones Nu/nu (machos, 7-8 semanas de edad) con 15x106 células DU145/ratón en el lado izquierdo. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 250 mm3, los ratones se dividieron al azar en grupos de 12 ratones/tratamiento.

Se preparó el Anticuerpo 2 e IgG de Rata en salina a una concentración de 6 mg/ml y se administraron subcutáneamente tres veces por semana a 40 y 10 mg/kg. Al día 21 se registraron los volúmenes de tumor y se calculó el %T/C para los 10 mg/kg y 40 mg/kg. Se analizaron los volúmenes de tumor usando RM ANOVA.

Como se muestra en la Tabla 6, se calculó un %T/C de 50 y 43 para los grupos de tratamiento 10 mg/kg y 40 mg/kg respectivamente contra el grupo de control IgG de Rata. Estos resultados mostraron significante inhibición de tumor (p = <0.0001 para ambas concentraciones) en animales tratados con el Anticuerpo 2.

Tabla 6: Inhibición de Injertos Heterólogos de Tumor Humano por el Anticuerpo 2 Infiltración de Macrofago Reducida en Tumores de Próstata DU145 y Mama HCC1954 Tratados con un mAb CSF-1R Anti-Ratón Se removieron tumores de los animales en los estudios animales de HCC1954 (mama) y DU145 (próstata) descritos anteriormente. Se cortaron tumores a lo largo del eje más largo y se colocaron en 10% de formalina durante la noche a 4°C mientras se balancea. Después de 24 horas, se lavó 2 veces en PBS durante 20 minutos, después se agregaron soluciones de concentraciones progresivamente superiores de etanol, hasta que el tumor está en 100% de etanol. Se intercambió el etanol por xileno por varias incubaciones en 100% de xileno e incrustó el tumor en parafina. Se seccionaron bloques de parafina a 4 µ?? y colocaron en laminillas de vidrio. Se desparafinizó y rehidrató el tejido por incubaciones progresivas en xileno seguidas por concentraciones incrementadas de agua en etanol. Se calentaron laminillas de tumor en solución de recuperación de objetivo (Dako) por 3 minutos en microondas antes del bloqueo endógeno de peroxidasas con 3% de H202 por 10 minutos a TA. Se bloqueó el enlace de proteína no específico con Bloque de Proteína (Dako) por 10 minutos antes de agregar anticuerpo específico del macrófago anti-ratón de rata, F4/80 (2 g/mL; Serotec) conjugado a biotina e incubó durante la noche a 4°C. Se incubó en Estreptavidina-HRP (dilución 1:1000; Jackson ImmunoResearch) por 45 minutos a TA y se lavó 3 veces. Se desarrolló en DAB (Dako) por instrucciones del kit, se detuvo la reacción con dos lavados en agua. Se sometió a contrateñido brevemente con Hematoxilina de ayer (10 minutos; Dako) seguido por un lavado con agua, sumergiendo en alcohol ácido, un segundo lavado con agua y añi! usando agua de amoníaco. Se deshidrató, separó y cubrió con laminilla usando un medio de montaje permanente. Se analizaron 5 imágenes de tres animales para cada grupo de tratamiento. Usando software ImagePro, se determinó el número de macrófagos/área para cada grupo de tratamiento.

Tabla 7: Infiltración de Macrofagos en Tumores Tratados con Anticuerpo 2 mAb CSF-1R Anti-Ratón N/A=No Aplicable Como se observa en la Tabla 7, los números de macrofagos son reducidos en ambos modelos de tumores, especialmente a lo largo de la periferia. De este modo, tratamientos de Anticuerpo 2 conducen a una reducción en infiltración del macrófago de los tumores, indicando que el anticuerpo CSF-1R anti-ratón es responsable de suprimir la población de macrofagos en estos tumores.

Significancia de Macrofagos y Niveles de CSF-1 en el Progreso del Tumor Además de mama y próstata, la inhibición del crecimiento del tumor, asi como también el tratamiento de muchos cánceres puede ser benéficamente afectado por la administración del Anticuerpo 1.

Algunos tipos de tumor tales como cánceres renales expresan CSF-1R en su superficie celular y podrían ser directamente inhibidos del crecimiento con el tratamiento del Anticuerpo 1 (Soares, et al., Modern Pathol. 22: 744-752 (2009)). Otros tipos de tumores tales como linfoma Hodgkin y mieloma múltiple, los cuales tienen una población grande de macrófagos asociados al tumor podrían beneficiarse del tratamiento con el Anticuerpo 1, donde el Anticuerpo 1 podría eliminar los macrófagos que están induciendo el crecimiento del tumor (Steidl, et al. New Engl. J. ed. 362: 875-885 (2010); Zheng, et al., Blood 114: 3625-3628 (2009)). Adicionalmente, tumores que secretan CSF-1 son sensibles a tratamiento anti-CSF-1 o CSF-1R, tal como cáncer colorrectal (Aharinejad, et al., Cáncer Res. 62: 5317-5324 (2002)) y podrían ser apropiados para el tratamiento de Anticuerpo 1. Sin embargo, cáncer de ovario, carcinoma hepatocelular y carcinomas de células renales, cuya expresión de CSF-1 se correlaciona con escasa prognosis, podrían todos ser candidatos para el tratamiento con Anticuerpo 1 (Toy, et al., Gyn. Oncol. 80: 194-200 (2001); Zhang, er al., Gyn. Oncol. 107: 526-531 (2007); Zhu, er al., J. Clin. Oncol. 26: 2707-2716 (2008); Gerharz, et al., Urol. 58: 821-827 (2001)).

Tumores que no Expresan CSF-1R que Poseen Macrófagos Asociados al Tumor se Hicieron Crecer Inhibidos por Anticuerpos Anti-CSF-1R solamente si Secretan CSF-1 Se sembraron líneas de células de tumor HCC1954 (mama), DU145 (próstata) y Pc3 (próstata) a 5x105 células/mL por 48 horas en medio de crecimiento que contiene 1% de FBS. Se recolectó, clarificó y analizó el medio usando un Kit de Ensayo M-CSF Humano R&D Quantikine (R&D Systems). Se determinaron los niveles de CSF-1 al tiempo 0 y 48 h como pg/mL.

A 0 horas, como se esperaba, no hubo CSF-1 discernible en el medio. Sin embargo, dentro de 48 horas, las células HCC1954 secretaron 3613 pg/mL de CSF-1 mientras las células DU145 producen 4019 pg/mL Por el contrario, el medio de células Pc3 solamente contiene 39 pg/mL de CSF-1.

La Línea de Células de Próstata Pc3 se hace Crecer en Ratones para Verificar si Carecen de Expresión CSF-1, Correlacionado con Resistencia a Tratamiento Anti-CSF-1R Se inyectaron 5x106 células de próstata Pc3 subcutáneamente en ratones sin pelo (macho, 7-8 semanas de edad) y se dejaron alcanzar los tumores 300 mm3 antes de subdividirlos en grupos de tratamiento de 12 ratones cada uno. Los animales se dosificaron con ya sea 40 mg/kg de IgG de Rata, 40 mg/kg de Anticuerpo 2 ó 10 mg/kg de Anticuerpo 2 tres veces por semana hasta que los tumores de control alcanzaron 2000 mm3. Se midieron los volúmenes del tumor y calculó el % de T/C para cada grupo de tratamiento al día 18 como la relación de los volúmenes del tumor relativos contra el grupo de control IgG de Rata. Se analizaron los volúmenes del tumor usando ANOVA RM.

Tabla 8: Correlación de CSF-1 y Resistencia al Tratamiento Anti-CSF-1R No existe diferencia en el crecimiento entre los grupos de control tratados con IgG de Rata contra los grupos tratados con el Anticuerpo 2, indicando que niveles CSF-1 elevados pueden ser un biomarcador para tratamiento con anticuerpos anti-CSF-1R.

La secreción CSF-1 se Correlaciona con la Sensibilidad de Tratamiento Anti-CSF-1R cuando el CSF-1R se Expresa en la Superficie de Macrófagos Asociados con el Tumor Células inyectadas, como se detalla en las Tablas 9 y 10 abajo, subcutáneamente en ratones sin pelo y se dejaron alcanzar los tumores 300 mm3 antes de subdividirlos en grupos de tratamiento de 12 ratones cada uno. Los animales son dosificados de conformidad con el régimen de tratamiento detallado en las Tablas 9 y 10 abajo, tres veces por semana hasta que los tumores de control alcanzaron 2000 mm3. Se miden los volúmenes del tumor y calcula el % de T/C para cada grupo de tratamiento como la relación de los volúmenes del tumor relativo contra el grupo de control IgG de Rata. Se analizan los volúmenes del tumor usando ANOVA RM.

Tabla 9: Sensibilidad en Modelos de Tumor que Secretan CSF-1 Tabla 10: Sensibilidad en Modelos de Tumor que No Secretan CSF-1 Tumores que secretan CSF-1 (Tabla 9) todos responden a tratamiento anti-CSF-1R con Anticuerpo 2 mientras aquellos tumores que no secretan CSF-1 (Tabla 10) no responden o solamente pobremente a Anticuerpo 2 anti-CSF-1R. La secreción CSF-1 se correlaciona con la sensibilidad de tratamientos anti-CSF-1R en modelos de tumor en donde el CSF-1R es expresado en la superficie de macrófagos asociados con el tumor. Por consiguiente, niveles elevados de CSF-1 funcionan como un indicador de sensibilidad potencial o biomarcador cuando el CSF-1R es expresado en la superficie de macrófagos asociados con el tumor.

El CSF-1R también puede ser expresado en la superficie de células tumorales. La secreción de CSF-1 no está correlacionada con la sensibilidad de tratamientos anti-CSF-1R para expresión de la superficie de células del tumor CSF-1R.

Niveles de IL-34 en Tumores y Muestras de Suero del Paciente Además de CSF-1, el IL-34 también se puede unir a CSF-1R, induciendo fosforilación del receptor, y activando moléculas de señalización corriente abajo, las cuales conducen a diferenciación de macrófago y supervivencia. Tanto CSF-1 como IL-34 se unen a los dominios de IgG en la región extracelular de CSF-1R (Lin, et al., Science, 320: 807-11 (2008)) y ambos ligandos pueden ser inhibidos de enlazarse a CSF-1 R por el Anticuerpo 1 (IC50= 0.81 nM y IC50=0.71 nM para inhibición de enlace de CSF-1 e IL-34 por el Anticuerpo 1, respectivamente como se discute supra). El tratamiento de células NIH- 3T3 establemente transfectadas con CSF-1R con el Anticuerpo 1 inhibe la fosforilación de CSF-1R por IL-34 (como se discute supra). Además, la inducción de IL-34 de monocitos a diferenciación de macrófago y proliferación de macrófago puede ser inhibida con el Anticuerpo 1 con IC50 de 0.3 nM y 0.5nM, respectivamente (como se discute supra), lo cual es comparable con los resultados vistos con CSF-1. Por lo tanto, la actividad de IL-34 y su inhibición por el Anticuerpo 1 son similares a aquellas vistas con CSF-1.

Los niveles de IL-34 son elevados en muchas células tumorales que incluyen líneas de células de tumor de mama, próstata y endometrial. Adicionalmente, una subpoblación de pacientes de próstata y mama tienen niveles de proteína IL-34 altos en su suero. Por consiguiente, puesto que el IL-34 funciona casi idénticamente para CSF-1 y secreción de CSF-1, se correlaciona con la sensibilidad de tratamientos anti anti-CSF-1 R, los niveles elevados de IL-34 también funcionan como un indicador de sensibilidad o biomarcador.

Estudios de Combinación de Tumor de Mama Se inyectaron ratones Nu/nu (hembras, 7-8 semanas de edad) subcutáneamente con 1x107 células de mama HCC-1954/ratón y se dejaron los tumores alcanzar 300 mm3 antes del tratamiento. Se aleatorizaron ratones en grupos de 12 y se trataron como sigue: Tabla 11: Estudios de Combinación en Mama TIW=Tres veces por semana; Q7Dx2=una vez cada siete días, dos veces; Q7Dx3=una vez cada siete días, tres veces.

Se midieron los volúmenes del tumor y calculó el % de T/C para cada grupo de tratamiento como la relación de los volúmenes del tumor relativos contra el grupo de control. Se analizaron los volúmenes del tumor usando ANOVA R .

En todos los estudios mostrados en la Tabla 11, el Anticuerpo 2, Herceptin®, Doxorubicina y Paclitaxel inhiben el crecimiento del tumor como agentes únicos. Sin embargo, combinar el Anticuerpo 2 con un agente dirigido al tumor tiene un efecto aditivo indicando que una combinación de un anticuerpo anti-CSF-1R con agentes quimioterapéuticos u otros que afectan el tumor será más eficaz que estos agentes solos.

Estudios de Combinación de Tumor de Próstata Se inyectaron ratones Nu/nu (macho, 7-8 semanas de edad) subcutáneamente con 1.5x107 células de próstata DU145/ratón y se dejaron los tumores alcanzar 300 mm3 antes del tratamiento. Se aleatorizaron ratones en grupos de 10 y trataron como sigue: Tabla 12: Estudio de Combinación de Próstata TIW=Tres veces por semana; Q7Dx3=una vez cada siete días, tres veces.

Se midieron los volúmenes del tumor y calculó el % de T/C para cada tratamiento como la relación de los volúmenes del tumor relativo contra el grupo de control. Se analizaron los volúmenes del tumor usando ANOVA RM.

Combinar el Anticuerpo 2 con docetaxel tiene un efecto aditivo indicando que la combinación con quimioterapéuticos en cáncer de próstata será más eficaz que los reactivos quimioterapéuticos solos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo, o fragmento del mismo, que se une específicamente a la variante humana CSF-1R (SEC ID NO. 15), caracterizado porque comprende una CDRH1 que comprende la secuencia SYGMH (SEC ID NO:1), una CDRH2 que comprende la secuencia VIWYDGSNKYYADSVKG (SEC ID NO:2), una CDRH3 que comprende la secuencia GDYEVDYGMDV (SEC ID NO:3), una CDRL1 que comprende la secuencia RASQGISNALA (SEC ID NO:4), una CDRL2 que comprende la secuencia DASSLES (SEC ID NO:5), y una CDRL3 que comprende la secuencia QQFNSYPWT (SEC ID NO:6).

2. Un anticuerpo, o fragmento del mismo, que se une específicamente a CSF-1R humano (SEC ID NO. 16), caracterizado porque comprende una CDRH1 que comprende la secuencia SYGMH (SEC ID NO:1), una CDRH2 que comprende la secuencia VIWYDGSNKYYADSVKG (SEC ID NO:2), una CDRH3 que comprende la secuencia GDYEVDYGMDV (SEC ID NO:3), una CDRL1 que comprende la secuencia RASQGISNALA (SEC ID NO:4), una CDRL2 que comprende la secuencia DASSLES (SEC ID NO:5), y una CDRL3 que comprende la secuencia QQFNSYPWT (SEC ID NO:6).

3. El anticuerpo, o fragmento del mismo, de conformidad con las Reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque comprende una VL que comprende la secuencia de aminoácido: AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNALAWYQQKPGKA PKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYP WTFGQGTKVEIK (SEC ID NO:8), y una VH que comprende la secuencia de aminoácido: QDQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGEGLEWV AVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR GDYEVDYGMDVWGQGTTVTVAS (SEC ID NO:7).

4. El anticuerpo, o fragmento del mismo, de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1-3, caracterizado porque comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:9 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:10.

5. El anticuerpo, o fragmento del mismo, de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1-4, caracterizado porque comprende dos cadenas pesadas, cada una comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:9 y dos cadenas ligeras, cada una comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:10.

6. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el anticuerpo o fragmento de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1-5, junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

7. Una composición farmacéutica de conformidad con la Reivindicación 6, caracterizada porque además comprende un agente farmacéutico adicional.

8. El anticuerpo o fragmento de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1-5, para uso en terapia.

9. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1-5, para uso en el tratamiento de cáncer.

10. El anticuerpo o fragmento del mismo para uso de conformidad con la Reivindicación 9, en donde el cáncer es leucemia, cáncer de mama, cáncer endometrial, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer hepatocelular, cáncer renal, mieloma múltiple, o linfoma de hodgkin.

11. El anticuerpo o fragmento del mismo para uso de conformidad con la Reivindicación 10, en donde el cáncer es leucemia, cáncer de mama, cáncer endometrial, o cáncer de próstata.

12. El anticuerpo o fragmento del mismo para uso de conformidad con la Reivindicación 11, en donde el cáncer es leucemia, cáncer de mama, o cáncer de próstata.

13. El anticuerpo o fragmento del mismo para uso de conformidad con las Reivindicaciones 8-12, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo se administra antes, durante, sustancialmente de manera simultánea con, o después de comenzar la terapia con otro tratamiento anti-cancerígeno.

14. El anticuerpo o fragmento del mismo para uso de conformidad con la Reivindicación 13, en donde el tratamiento anticancerígeno se selecciona del grupo que consiste de un agente anti-angiogénesis, un agente quimioterapéutico, y un agente anti-neoplásico.

15. El anticuerpo o fragmento del mismo para uso de conformidad con la Reivindicación 14, en donde el agente anti-neoplásico se selecciona del grupo que consiste de docetaxel, paclitaxel, Herceptin® y doxorubicina.

16. Un método para tratar cáncer en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero en necesidad del mismo una cantidad efectiva del anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con las Reivindicaciones 1-5, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste de leucemia, cáncer de mama, cáncer endometrial, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer hepatocelular, cáncer renal, mieloma múltiple, y linfoma de hodgkin.

17. El método de conformidad con la Reivindicación 16, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de leucemia, cáncer de mama, cáncer endometrial, y cáncer de próstata.

18. El método de conformidad con la Reivindicación 17, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de leucemia, cáncer de mama, y cáncer de próstata.

19. El método de conformidad con la Reivindicación 16, caracterizado porque además comprende administrar otro tratamiento anti-cancerígeno al mamífero en donde el tratamiento anti-cancerígeno se selecciona del grupo que consiste de un agente anti-angiogénesis, un agente quimioterapéutico, y un agente anti-neoplásico.

20. El método de conformidad con la Reivindicación 19, caracterizado porque el agente anti-neoplásico se selecciona del grupo que consiste de docetaxel, paclitaxel, Herceptin® y doxorubicina.

21. Un método para tratar cáncer en un paciente, caracterizado porque comprende las etapas: (1) medir el nivel de CSF-1 en una muestra tomada del paciente en donde la muestra se selecciona del grupo que consiste de sangre, suero, plasma, células tumorales y células tumorales de circulación, y (2) administrar al paciente el anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1-5 si los niveles de CSF-1 son superiores que los niveles de CSF-1 encontrados en una población de control.

22. Un método para tratar cáncer en un paciente, caracterizado porque comprende las etapas: (1) medir el nivel de IL-34 en una muestra tomada del paciente en donde la muestra se selecciona del grupo que consiste de sangre, suero, plasma, células tumorales y células tumorales de circulación, y (2) administrar al paciente el anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las Reivindicaciones 1-5 si los niveles IL-34 son superiores que los niveles IL-34 encontrados en una población de control.

23. Un método para determinar si un sujeto que tiene un cáncer es un candidato para un régimen de tratamiento de cáncer a base de anticuerpo anti-CSF-IR, caracterizado porque el anticuerpo es el anticuerpo de conformidad con las Reivindicaciones 1-5, que comprende: determinar ex vivo o in vitro el nivel de CSF-1 en una muestra del sujeto, en donde la muestra se selecciona del grupo que consiste de sangre, suero, plasma, células tumorales y células tumorales de circulación, en donde un incremento en el nivel de CSF-1, ya comparado con el nivel de CSF-1 en un individuo que no sufre de cáncer, es indicativo que el sujeto es un candidato para el régimen de tratamiento de cáncer a base de anticuerpo anti-CSF-1R.

24. Un método para determinar si un sujeto que tiene un cáncer es un candidato para un régimen de tratamiento de cáncer a base de anticuerpo anti-CSF-IR, caracterizado porque el anticuerpo es el anticuerpo de conformidad con las Reivindicaciones 1-5, que comprende: determinar ex vivo o in vitro el nivel de IL-34 en una muestra del sujeto, en donde la muestra se selecciona del grupo que consiste de sangre, suero, plasma, células tumorales y células tumorales de circulación, en donde un incremento en el nivel de IL-34, ya comparado con el nivel de IL-34 en un individuo que no sufre de cáncer, es indicativo que el sujeto es un candidato para el régimen de tratamiento de cáncer a base de anticuerpo anti-CSF-1R.