MX2011005773A - Planta con resistencia a nematodos especificos de raiz. - Google Patents

Abstract

Vectores de expresión que comprenden promotores específicos de raíz en asociación operativa con los polinucleótidos que están regulados por disminución en el sincitio de plantas infectadas con nematodos, para uso en los método de producir plantas transgénicas con aumento de resistencia a la infestación de nematodos. Plantas y semillas transgénicas resistentes a nematodos y semillas que comprenden dichos vectores de expresión.

Description

PLANTA CON RESISTENCIA A NEMATODOS ESPECÍFICOS DE RAÍZ CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a la mejora de la productividad agrícola mediante el uso de plantas semillas transgénicas resistentes a nematodos y los métodos de obtener dichas plantas y semillas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los nematodos son gusanos redondos microscópicos que se alimentan de las raíces, hojas y tallos de más de 2.000 cultivos en hileras, vegetales, frutas y plantas ornamentales, causando una pérdida de cultivos de aproximadamente $100 mil millones a nivel mundial. Diversas especies de nematodos parasitarios infectan las plantas de cultivo, que incluyen los nematodos de nudos radiculares (RKN), nematodos formadores de quistes y lesiones. Los nematodos de nudos radiculares, que se caracterizan por causar la formación de agallas radiculares en los sitios de alimentación, tienen un rango de huéspedes relativamente amplio y, por lo tanto, son parasíticos en una gran cantidad de especies de cultivo. Las especies de nematodos formadores de quistes y lesiones tienen un rango de huéspedes más limitado, pero aún así causan considerables pérdidas en los cultivos propensos.

Los nematodos parasíticos se encuentran presentes en todo el territorio de Estados Unidos, y las mayores concentraciones ocurren en las regiones cálidas y húmedas del Sur y Oeste y en los suelos arenosos. El nematodo de quiste de la soja {Heterodera glycines), la plaga más importante de las plantas de soja, se descubrió por primera vez en Estados Unidos, en Carolina del Norte en 1954. Algunas áreas están tan densamente infestadas por el nematodo de quiste de la soja (SCN) que la producción de soja ya no es económicamente posible sin medidas de control. A pesar de que la soja es el cultivo de mayor importancia económica atacado por el SCN, este parásita alrededor de cincuenta huéspedes en total, incluso cultivos de campo, vegetales, ornamentales y malezas.

Los signos del daño causado por los nematodos incluyen atrofia y coloración amarillenta de las hojas, y marchitamiento de las hojas durante períodos de calor. Sin embargo, la infestación por nematodos puede causar importantes pérdidas de rendimiento sin que haya síntomas obvios de la enfermedad sobre el nivel de suelo. Las causas principales de la reducción del rendimiento se deben al daño en la raíces debajo del nivel del suelo. Las raíces infectadas por SCN se achican o se atrofian. La infestación por nematodos también puede disminuir la cantidad de nodulos fijadores de nitrógeno en las raíces y puede hacer que las raíces se vuelvan más propensas al ataque de otros patógenos vegetales que se del suelo.

El ciclo de vida del nematodo tiene tres etapas principales: huevo, juvenil y adulto. El ciclo de vida varía según la especie de nematodo. El ciclo de vida del SCN es similar a los ciclos de vida de otros nematodos parasíticos de planta. El ciclo de vida del SCN generalmente se puede completar de 24 a 30 días en condiciones óptimas, mientras que otras especies pueden demorar hasta un año, o más, en completar su ciclo de vida. Cuando los niveles de temperatura y humedad se vuelven favorables en la primavera, los juveniles con forma de gusanos rompen el cascarón en el suelo. Sólo los nematodos en la etapa de desarrollo juvenil pueden infectar las raíces de la soja, Luego de penetrar las raíces de la soja, los SCN juveniles se mueven a través de la raíz hasta entrar en contacto con el tejido vascular, en este momento dejan de migrar y comienzan a alimentarse. Con un estilete, el nematodo inyecta secreciones que modifican ciertas células de la raíz y las transforman en sitios de alimentación especializados. Las células de la raíz se transforman morfológicamente en grandes sincitios con múltiples núcleos (o células gigantes en el caso de RKN), que se utilizan como fuente de nutrientes para los nematodos. De este modo, los nematodos que se alimentan de manera activa captan nutrientes esenciales de la planta, causando pérdida del rendimiento. A medida que los nematodos hembra se alimentan, se hinchan y finalmente se vuelven tan grandes que sus cuerpos atraviesan el tejido radicular y quedan expuestos en la superficie de la raíz.

Luego de un período de alimentación, los nematodos SCN macho, que no se hinchan en su adultez, migran fuera de la raíz hacia el suelo y fertilizan a las hembras adultas de gran tamaño. Luego los machos mueren, mientras que las hembras permanecen unidas al sistema radicular y continúan alimentándose. Los huevos de las hembras hinchadas comienzan a desarrollarse, inicialmente en un saco de huevo o masa fuera del cuerpo y luego dentro de la cavidad corporal del nematodo. Finalmente, toda la cavidad corporal de la hembra adulta se llena con huevos y el nematodo muere. El cuerpo lleno de huevos de la hembra muerta se denomina quiste. Con el tiempo, los quistes se desprenden y se hallan sueltos en el suelo. Las paredes del quiste se vuelven muy resistentes, y de esta manera brindan excelente protección para los aproximadamente 200 a 400 huevos que se encuentran en su interior. Los huevos de SCN sobreviven dentro del quiste hasta que ocurren las condiciones adecuadas para su eclosión. A pesar de que muchos huevos pueden romperse dentro del primer año, varios también sobrevivirán dentro de los quistes protectores durante varios años.

Un nematodo puede moverse por sí mismo en el suelo sólo unas pocas pulgadas por año. Sin embargo, la infestación por nematodos se puede propagar grandes distancias de diversas maneras. Cualquier cosa que pueda mover suelo infestado es capaz de propagar la infestación, incluso maquinaria, vehículos y herramientas agrícolas, viento, agua, animales y trabajadores agrícolas. Las partículas del suelo que tienen tamaño de semillas a menudo contaminan las semillas cosechadas. En consecuencia, la infestación por nematodos se puede propagar cuando se plantan semillas contaminadas de campos infestados en campos no infestados. Incluso hay pruebas que indican que ciertas especies de nematodos se pueden propagar mediante aves. Sólo se pueden evitar algunas de estas causas.

Las prácticas tradicionales para controlar la infestación por nematodos incluyen: mantener niveles adecuados de nutrientes y pH en el suelo en campos infestados por nematodos; controlar otras enfermedades de las plantas, así como también plagas de insectos y malezas; utilizar prácticas de saneamiento tales como labranza, plantación y cultivo de campos infestados por nematodos sólo luego de trabajar en campos no infestados; limpiar completamente el equipo con vapor o agua a alta presión luego de trabajar en campos infestados; no utilizar semillas cultivadas en campos infestados para plantar campos no infestados a menos que se hayan limpiado las semillas de manera adecuada; rotar los campos infestados y alternar cultivos huésped con cultivos no huésped; utilizar nematicidas; y plantar variedades de plantas resistentes.

Se han propuesto métodos para la transformación genética de plantas a fin de conferir mayor tolerancia a los nematodos parasíticos de plantas. Por ejemplo, diversos métodos involucran la transformación de plantas con ARN bicatenario capaz de inhibir genes de nematodos esenciales. Otros métodos de biotecnología agrícola proponen sobreexpresar genes que codifican proteínas que son tóxicas para los nematodos. Las patentes estadounidenses No. 5.589.622 y 5.824.876 tienen como objetivo la identificación de genes de planta que se expresan específicamente en el sitio de alimentación de la planta o de manera adyacente a éste luego de la unión del nematodo.

El documento US 2009/0089896 describe un promotor de un gen tipo Mtn21 que es inducido en el sincitio de la soja infectada con SCN. El documento WO 2008/077892 describe un promotor de un gen tipo peroxidasa que es inducido en el sincitio de la soja infectada con SCN. El documento WO 2008/071726 describe un promotor de un gen tipo trehalose-6-fosfato fosfatasa que es inducido en el sincitio de la soja infectada con SCN. El documento WO 2008/095887 describe un promotor de un gen tipo Mtn3 que es inducido en el sincitio de la soja infectada con SCN. El documento WO 2008/095888 describe el promotor de un gen tipo At5g12170 que es inducido en el sincitio de la soja infectada con SCN.

Diversas publicaciones de patentes describen en forma anticipada y reivindican genéricamente plantas transgénicas que comprenden alguno o más de miles de genes vegetales y que tienen características agronómicas mejoradas. Los ejemplos de dichas publicaciones incluyen los documentos US 2004/0031072, US 2006/0107345, US 2004/0034888, US 2004/0019927, US 2004/0045049, US 2004/0019927, US 2006/0272060, WO 2005/51 12608, US 2006/0150283 y US 2007/0214517. La resistencia a los patógenos, que incluye la resistencia a los nematodos, se describe como una potencial característica agronómica mejorada de las plantas transgénicas descriptas en estas publicaciones. Sin embargo, ninguna de estas publicaciones asocia específicamente ningún gen con mejor resistencia a los nematodos en las plantas transgénicas que contienen el gene.

Las proteínas ricas en serina-arginina (ricas en SR) son reguladores clave de la expresión del gen de planta, varios miembros de la familia del gen contribuyen al empalme constitutivo del ARN, exportación nuclear, mantenimiento de la estabilidad del ARNm y la traducción de la proteína. Las proteínas SR también están involucradas en el empalme de ARNm alternativo, donde ellas se unen a secuencias de ARN específicas y guían la formación de complejos del espliceosoma en sitios de empalme débil. Las familias del gen rico en SR están moderadamente presentes en las plantas, diversos subgrupos se incluyen en aproximadamente cinco categorías basadas en motivos.

El gen tipo 1 1 1 B inducido por Avr9 es un factor de transcripción con homología de secuencia a 1 1 B ACRE (inducido rápidamente por Avr9/Cf-9) de Nicotiana tabacum y DREB1A/CBF3 de Arabidopsis. En el tabaco el gen de 1 1 1 B ACRE es un activador de la transcripción relacionado con la patogénesis que es inducido rápidamente en las líneas que expresan el gen de resistencia Cf-9 en respuesta a Avr9 expresado por Cladosporíum fulvum, un hongo biotrófico. En otras especies, los genes CBF3/DREB1 están involucrados en la activación de la respuesta al estrés abiótico. La patente U.S. No.7.345.217 describe la SEQ ID NO: 1408, un gen tipo 1 1 1 B inducido por Avr9 que pretende ser un homólogo de un ADN de Arabidopsis thaliana designado G912. La patente U.S. N. 0 7.345.217 describe genéricamente numerosas categorías de potenciales utilidades para los miles de genes allí descriptos, y una de estas categorías se identifica como resistencia a la enfermedad, que incluye resistencia a los nematodos. Sin embargo, las únicas utilidades específicas propuestas en la patente U.S. N. 0 7.345.217 para G912 y sus homólogos son tolerancia mejorada al estrés por frío, heladas, sequía y sal.

Los factores de transcripción de la hélice-bucle-hélice básica (bHLH) y de unión al elemento que responde a la deshidratación (DREB) también son moléculas regulatorias clave en las plantas. Las funciones fisiológicas de algunos genes de bHLH se han demostrado en forma experimental en las plantas. Los genes R y TT8 son conocidos para regular la acumulación de antocianina en el maíz y Arabidopsis, y otros genes de bHLH interactúan con los fotocromos y regulan la respuesta a la luz. Otros genes de bHLH regulan la señalización de las hormonas. El papel fisiológico de la mayoría de los genes de bHLH vegetales es desconocido, sin embargo existe poca conservación de secuencia entre los miembros de la familia del gen bHLH fuera del dominio distintivo de bHLH del núcleo.

Las proteínas tipo Dirigent pertenecen a una familia grande y diversa del gen que se halla en todos los principales grupos de plantas de cultivo analizadas hasta la fecha. Los genes que codifican el Dirigient se agrupan en 5 subfamilias filogenéticas, Dir-A a Dir-E. Se ha demostrado que la subfamilia de Dir-A, en conjunto con las oxidasas fenólicas para dirigir el ensamblaje estereospecífico de las ligninas (componentes de la pared celular) y lignanos (antioxidantes y compuestos de defensa vegetales) en una variedad de especies de planta. La expresión de PsDIRI , un gen de Dir-A de Pisum sativa, confiere resistencia a múltiples patógenos fúngicos en la cañóla transgénica. Los genes de la subfamilia Dir-A son inducidos por una amplia variedad de estreses, tales como una herida mecánica, infección con herbívoros y hongos. Las funciones bioquímicas específicas de los genes de los subgrupos de las proteínas Dir-B, Dir-C, Dir-D y Dir-E (tipo Dir) no están tan bien caracterizadas, a pesar de que se demostró que los genes de la subfamilia Dir-C son inducidos por el tratamiento con ácido jasmónico, ácido salicílico y alimentación con larva de la mosca Hessian no virulentas.

Hasta la fecha, ninguna planta modificada genéticamente que comprende un transgén capaz de conferir resistencia a los nematodos ha sido desregulada en ningún país. Por consiguiente aún se necesita identificar composiciones seguras y efectivas y métodos para controlar los nematodos parasíticos de planta usando biotecnología agrícola.

SÍNTESIS DE LA INVENCIÓN Los presentes inventores han descubierto que la expresión de un transgén que comprende un polinucleótido que codifica una proteína rica en serina-arginina, proteína tipo 1 1 1 B inducida por AVR9, una proteína de bHLH o una proteína tipo Dirigent en las raíces puede producir plantas resistentes a la infección con SCN. Conforme a ello, la presente invención proporciona plantas y semillas transgénicas, y métodos para superar o al menos aliviar, la infestación con nematodos de los cultivos agrícolas valiosos.

En una forma de realización, la invención proporciona un vector de expresión aislado que comprende un promotor específico de raíz en asociación operativa con un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: a) un polinucleótido que codifica una proteína rica en serina-arginina; b) un polinucleótido que codifica una proteína tipo 11 1 B inducida por AVR9; c) un polinucleótido que codifica una proteína hélice-bucle-hélice básica; y d) un polinucleótido que codifica una proteína tipo dirigent.

En otra forma de realización, la invención proporciona un método de obtener una planta transgénica resistente a los nematodos, el método comprende las etapas de: a) proporcionar un vector de expresión recombinante que comprende un promotor específico de raíz en asociación operativa con un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: i) un polinucleótido que codifica una proteína rica en serina-arginina; ii) un polinucleótido que codifica una proteína tipo 11 1 B inducida por AVR9; iii) un polinucleótido que codifica una proteína hélice-bucle-hélice básica; y iv) un polinucleótido que codifica una proteína tipo dirigent; b) transformar una célula vegetal con el vector de expresión recombinante; c) regenerar plantas transgénicas de la célula vegetal transformada; y d) seleccionar plantas transgénicas que demuestran aumento de resistencia a la infección con nematodos parasíticos de planta cuando se comparan con las plantas tipo silvestre que no comprenden el vector de expresión recombinante.

En otra forma de realización más, la invención proporciona una planta transgénica resistente a nematodos que comprende un vector de expresión recombinante que comprende un promotor específico de raíz en asociación operativa con un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: a) un polinucleótido que codifica una proteína rica en serina-arginina; b) un polinucleótido que codifica una proteína tipo 11 1 B inducida por AVR9; c) un polinucleótido que codifica una proteína hélice-bucle-hélice básica; y d) un polinucleótido que codifica una proteína tipo dirigent.

En otra forma de realización, la invención proporciona una semilla que es genéticamente pura para un transgén que comprende un vector de expresión recombinante que comprende un promotor específico de raíz en asociación operativa con un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: a) un polinucleótido que codifica una proteína rica en serina-arginina; b) un polinucleótido que codifica una proteína tipo 11 1 B inducida por AVR9; c) un polinucleótido que codifica una proteína hélice-bucie-hélice básica; y d) un polinucleótido que codifica una proteína tipo dirigent.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1 a-1 b muestran la tabla de las SEQ ID NOs asignadas a los correspondientes genes y promotores. Las SEQ ID Nros 1 , 37, 39 y 49 corresponden a las secuencias de nucleótidos de G. max de longitud completa para los polinucleótidos que codifican una proteína rica en serina/argínina (SEQ ID NO:1 ), proteína 1 11 b inducida por Avr9 (SEQ ID NO:37), proteína bHLH (SEQ ID NO:39) y proteína tipo Dirigent (SEQ ID NO:49), respectivamente. Las secuencias promotoras inducidas en el sincitio se dan en la SEQ ID NO:57 (promotor tipo TPP de A. thaliana), SEQ ID NO:58 (promotor tipo MtN3 de G. max) y SEQ ID NO:59 (promotor del locus At5g12170 de A. thaliana). El promotor de ubiquitina constitutivo denominado PcUbi4-2, del P. crispum se da en la SEQ ID NO:60.

Las figuras 2a-2c muestran un alineamiento de aminoácidos de ejemplos de proteínas rica en serina/arginina realizado mediante el conjunto del programa de computación Vector NTI v10.3.0 (penalización de apertura de brecha = 10, penalización de extensión de la brecha = 0.05, penalización de separación de la brecha = 8).

La figura 3 muestra un alineamiento de aminoácidos de los ejemplos de proteínas de hélice-bucle-hélice básica realizado mediante el conjunto del programa de computación Vector NTI v10.3.0 (penalización de apertura de brecha = 10, penalización de extensión de la brecha = 0.05, penalización de separación de la brecha = 8).

La figura 4 muestra un alineamiento de aminoácidos de los ejemplos de proteínas tipo Dirigent realizado mediante el conjunto del programa de computación Vector NTI v10.3.0 (penalización de apertura de brecha = 10, penalización de extensión de la brecha = 0.05, penalización de separación de la brecha = 8).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FORMAS DE REALIZACIÓN PREFERIDAS La presente invención se puede comprender más fácilmente con referencia a la siguiente descripción detallada y los ejemplos incluidas en la presente. A lo largo de la presente memoria descriptiva, se hace referencia a varias publicaciones. Las descripciones de todas estas publicaciones y las referencias citadas en dichas publicaciones se incorporan en su totalidad a la presente mediante la referencia a esta solicitud, a fin de describir de manera más completa el estado del arte al cual pertenece esta invención.

Se considera que la terminología usada en la presente es solo al fin de describir formas de realización específicas y no se considera una limitación. Como se utiliza en la presente, "un" o "una" puede significar uno o más, de acuerdo con el contexto en que se usa. En consecuencia, por ejemplo, la referencia a "una célula" puede significar que al menos se puede usar una célula.

Como se usa en la presente, la palabra "o" significa cualquier miembro de una lista en particular y también incluye cualquier combinación de los miembros de esa lista.

Como se usa en la presente, una "planta transgénica" es una planta que ha sido alterada usando tecnología de ADN recombinante para contener un ácido nucleico aislado que de otro modo no estaría presente en la planta. Como se usa en la presente, el término "planta", incluye una planta entera, células vegetales y partes de la planta. Las partes de planta incluyen pero sin limitación tallos, raíces, brotes, óvulos, estambres, hojas, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, gametofitos, esporofitos, polen, microsporas y similares. La planta transgénica de la invención puede ser estéril masculina o fértil masculina y también puede incluir transgenes diferentes de los que componen los polinucleótidos aislados descriptos en la presente.

Tal como se define en la presente, la expresión "ácido nucleico" y "polinucleótido" son indistintos y se refieren a ARN o ADN que es lineal o ramificado, de cadena simple o doble, o un híbrido de estos. El término también abarca los híbridos de ARN/ADN. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una que está sustancialmente libre de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico (es decir, las secuencias que codifican otros polipéptidos). Por ejemplo, un ácido nucleico clonado se considera aislado. Un ácido nucleico también se considera aislado si ha sido alterado por la intervención humana, o colocado en un locus o una ubicación que no es su sitio natural, o si se introduce en una célula por transformación. Además, una molécula de ácido nucleico aislado, tal como una molécula de ADNc, puede estar libre de algún otro material celular con el que está asociado naturalmente, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente. Si bien opcionalmente puede abarcar una secuencia no traducida en ambos extremos 3' y 5' de la región codificadora de un gen, se puede preferir eliminar las secuencias que flanquean naturalmente la región codificadora en su replicón natural.

El término "gen" se utiliza ampliamente para referirse a cualquier segmento de ácido nucleico asociado con una función biológica. De este modo, los genes incluyen intrones y exones como en la secuencia genómica o sólo las secuencias codificadoras como en ADNc y/o las secuencias reguladoras necesarias para su expresión. Por ejemplo, gen se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa ARNm o ARN funcional, o que codifica una proteína específica y que incluye secuencias reguladoras.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan de manera indistinta en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos consecutivos.

La expresión "ligado operativamente" o "en asociación operativa con", son intercambiables y como se utiliza en la presente, se refiere a la asociación de polinucleótidos aislados en un fragmento de ácido nucleico único de manera que la función de un polinucleótido aislado o es afectada por el otro polinucleótido aislado. Por ejemplo, se cree que un ADN regulador está "ligado operativamente" a un ADN que expresa un ARN o que codifica un polipéptido si los dos ADN están situados de manera que el ADN regulador afecte la expresión del ADN codificador.

El término "promotor", como se utiliza en la presente, se refiere a una secuencia de ADN que, cuando se liga a una secuencia de nucleótidos de interés, es capaz de controlar la transcripción de la secuencia de nucleótidos de interés en ARNm. Un promotor típicamente, aunque no necesariamente, está ubicado 5' (por ejemplo, corriente arriba) de un nucleótido de interés (por ejemplo, cerca del sitio de inicio de la transcripción de un gen estructural) cuya transcripción en ARNm controla y provee un sitio para la unión específica mediante ARN polimerasa y otros factores de transcripción para el inicio de la transcripción.

La expresión "elemento regulador de la transcripción", como se utiliza en la presente, se refiere a un polinucleótido que es capaz de regular la transcripción de un polinucleótido ligado operativamente. Éste incluye pero no se limita a promotores, potenciadores, intrones, UTR 5' y UTR 3'.

Como se usa en la presente, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha estado ligada. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN circular de cadena doble al cual se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se pueden utilizar de manera indistinta debido a que el plásmido es la forma de vector más utilizada. Un vector puede ser un vector binario o un T-ADN que comprende el borde izquierdo y el borde derecho y puede incluir un gen de interés en el medio. La expresión "vector de expresión", es intercambiable con el término "transgén" como se utiliza en la presente, significa un vector capaz de dirigir la expresión de un nucleótido en particular en una célula huésped adecuada. La expresión del nucleótido puede ser sobreexpresión. Un vector de expresión comprende un elemento de ácido nucleico regulador ligado operativamente a un ácido nucleico de interés, que está -opcionalmente- ligado operativamente a una señal de terminación y/u otro elemento regulador.

El término "homólogos", como se utiliza en la presente, se refiere a un gen relacionado con un segundo gen por descendencia de una secuencia de ADN ancestral en común. El término "homólogos" se puede aplicar a la relación entre genes separados por el evento de especiación (por ejemplo, ortólogos) o a la relación entre genes separados por el evento de duplicación genética (por ejemplo, parálogos).

Como se usa en la presente, el término "ortólogos" se refiere a genes de diferentes especies pero que han evolucionado de un gen ancestral en común por especiación. Los ortólogos retienen la misma función en el curso de su evolución. Los ortólogos codifican proteínas que tienen funciones iguales o similares. Tal como se utiliza en la presente, el término "parálogos" se refiere a genes que están relacionados por duplicación dentro de un genoma. Los parálogos generalmente tienen diferentes funciones o nuevas funciones, pero estas funciones pueden estar relacionadas.

El término "región conservada" o "dominio conservado", como se utiliza en la presente, se refiere a una región en secuencias de polipéptidos o polinucleótidos heterólogos, donde hay un grado relativamente alto de identidad de secuencia entre las diferentes secuencias. La "región conservada" se puede identificar, por ejemplo, a partir del alineamiento de secuencia múltiple utilizando el algoritmo Clustal W.

El término "célula" o "célula vegetal", como se utiliza en la presente, se refiere a una sola célula y también incluye una población de células. La población puede ser una población pura que comprende un tipo de célula. De manera similar, la población puede comprender más de un tipo de célula. Una célula vegetal dentro del significado de la invención puede ser aislada (por ejemplo, en cultivo de suspensión) o estar comprendida en un tejido vegetal, órgano de planta o planta en cualquier etapa de desarrollo.

El término "línea genéticamente pura, como se utiliza en la presente, se refiere a una variedad de planta con un rasgo en particular si es genéticamente homocigota para ese rasgo hasta el punto en que, cuando la variedad de línea genéticamente pura se autopoliniza, no se observa una cantidad significativa de segregación independiente del rasgo entre la progenie.

El término "segregante nulo", como se utiliza en la presente, se refiere a una progenie (o líneas derivadas de la progenie) de una planta transgénica que no contiene el transgén debido a la segregación Mendeliana.

El término "tipo silvestre", como se utiliza en la presente, se refiere a una célula vegetal, semilla, componente vegetal, tejido vegetal, órgano de planta o planta entera que no ha sido modificada genéticamente o tratada en el sentido experimental.

El término "planta de control", como se utiliza en la presente, se refiere a una célula vegetal, un explante, semilla, componente vegetal, tejido vegetal, órgano de planta o planta entera utilizada para comparar con plantas transgénicas o genéticamente modificadas, con el propósito de identificar un fenotipo mejorado o un rasgo deseado en la planta transgénica o genéticamente modificada. Una "planta de control" puede en algunos casos puede ser una línea de planta transgénica que comprende un vector vacío o gen marcador, pero que no contiene el polinucleótido recombinante de interés que se encuentra presente en la planta transgénica o genéticamente modificada que se evalúa. Una planta de control puede ser una planta de la misma línea o variedad que la planta transgénica o genéticamente modificada que se analiza, o puede ser de otra línea o variedad, tal como una planta conocida por tener un fenotipo específico, característica o genotipo conocido. Una planta de control adecuada incluirá una planta no alterada genéticamente o no transgénica de la línea progenitora utilizada para generar una planta transgénica de la presente.

El término "sitio de sincitios", como se utiliza en la presente, se refiere al sitio de alimentación formado en las raíces de las plantas luego de la infestación por nematodos. El sitio se utiliza como fuente de nutrientes para los nematodos. Un sincitio es el sitio de alimentación de los nematodos de quiste, y las células gigantes son los sitios de alimentación de los nematodos de nudo radicular.

En una forma de realización, la invención proporciona un vector de expresión aislado que comprende un promotor específico de raíz en asociación operativa con un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: a) un polinucleótido que codifica una proteína rica en serina-arginina; b) un polinucleótido que codifica una proteína tipo 11 1 B inducida por AVR9; c) un polinucleótido que codifica una proteína hélice-bucle-hélice básica; y d) un polinucleótido que codifica una proteína tipo dirigent.

Cualquier promotor específico de raíz se puede emplear en el vector de expresión de la invención. Los ejemplos de promotores específicos de raíz incluyen sin limitación, el promotor derivado del gen de nicotianamina síntasa del maíz (US 20030131377) y el promotor del RCC3 de arroz (US 1 1/075.113). De particular utilidad en la presente invención son los promotores específicos de raíz inducidos en los sitios de alimentación de los nematodos (es decir, sincitio). Con preferencia, se pueden emplear el promotor inducible tipo Mtn3 descrito en el documento WO 2008/095887, el promotor tipo Mtn21 inducible por nematodo descrito en el documento US 2009/0089896, el promotor tipo peroxidasa inducible por nematodo descrito en el documento WO 2008/077892, el promotor tipo trehalosa-6-fosfato fosfatasa inducible por el nematodo descrito en el documento WO 2008/071726 y el promotor tipo At5g12170 inducible por el nematodo descrito en el documento WO 2008/095888 en el vector de expresión de la invención inducible en el nematodo.

Cualquier polinucleótido que codifica una proteína rica en serina-arginina se puede emplear en el vector de expresión aislado de la invención. Con preferencia, el polinucleótido codifica una proteína rica en serina-arginína seleccionada del grupo que consiste en un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 253 de la SEQ ID NO: 2; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 249 de la SEQ ID NO: 4; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 247 de la SEQ ID NO: 6; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 249 de la SEQ ID NO: 8; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 249 de la SEQ ID NO: 10; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 245 de la SEQ ID NO: 12; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 240 de la SEQ ID NO: 14; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 261 de la SEQ ID NO: 16; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 280 de la SEQ ID NO: 18; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 248 de la SEQ ID NO: 20; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 252 de la SEQ ID NO: 22; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 265 de la SEQ ID NO: 24; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 263 de la SEQ ID NO: 26; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 220 de la SEQ ID NO: 28; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 220 de la SEQ ID NO: 30; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 263 de la SEQ ID NO: 32; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 218 de la SEQ ID NO: 34; y un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 245 de la SEQ ID NO: 36. Con más preferencia, el polinucleótido codifica una proteína rica en serina-arginina que comprende los aminoácidos 1 a 253 de la SEQ ID NO: 2.

Cualquier polinucleótido que codifica una proteína 1 1 1 B estimulada por AVR9 se puede emplear en el vector de expresión aislado de la invención. Con preferencia, la proteína 1 1 1 B estimulada por AVR9 comprende los aminoácidos 1 a 226 de la SEQ ID NO: 38.

Cualquier polinucleótido que codifica una proteína hélice-bucle-hélice básica se puede emplear en el vector de expresión aislado de la invención. Con preferencia, la proteína hélice-bucle-hélice básica se selecciona del grupo que consiste en un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 231 de la SEQ ID NO: 40; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 226 de la SEQ ID NO: 42; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 232 de la SEQ ID NO: 44; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 233 de la SEQ ID NO: 46; y un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 260 de la SEQ ID NO: 48. Con más preferencia, la proteína hélice-bucle-hélice básica comprende los aminoácidos 1 a 231 de la SEQ ID NO: 40.

Cualquier polinucleótido que codifica una proteína tipo dirigent se puede emplear en el vector de expresión aislado de la invención. Con preferencia, la proteína tipo dirigent se selecciona del grupo que consiste en un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 191 de la SEQ ID NO: 50; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 191 de la SEQ ID NO: 52; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 189 de la SEQ ID NO: 54; y un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 189 de la SEQ ID NO: 56. Con más preferencia, la proteína tipo dirigent comprende los aminoácidos 1 a 191 de la SEQ ID NO: 50.

En otra forma de realización, el vector de expresión aislado e la invención se emplea en un método de obtener una planta transgénica resistente a los nematodos, el método que comprende las etapas de a) proporcionar el vector de expresión recombinante descrito anteriormente b) transformar una célula vegetal con ele vector de expresión recombinante; c) regenerar plantas transgénicas de la célula vegetal transformada; y d) seleccionar plantas transgénicas que demuestran aumento de resistencia a la infección con nematodos parasíticos de planta cuando se comparan con las plantas tipo silvestre que no comprenden el vector de expresión recombinante.

Una variedad de métodos para introducir polinucleótidos en el genoma de las plantas y para la regeneración de plantas a partir de tejidos vegetales o células vegetales se conocen, por ejemplo, Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Ratón, Florida), capítulo 6/7, pp. 71-1 19 (1993); White FF (1993) Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; Transgenic Plants, vol. 1 , Engineering and Utilization, Ed.: Kung y Wu R, Academic Press, 15-38; Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer; Transgénica Plants, vol. 1 , Engineering and Utilization, Ed.: Kung y R. Wu, Academic Press, pp. 128-143; Potrykus (1991 ) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225; Halford NG, Shewry PR (2000) Br Med Bull 56(1 ):62-73.

Los métodos de transformación pueden incluir métodos directos e indirectos de transformación. Los métodos directos adecuados incluyen absorción de ADN inducida por polietilenglicol, transformación mediada por liposoma (documento US 4.536.475), métodos biolisticos que utilizan pistola de genes (Fromm ME et al., Bio/Technology. 8(9):833-9, 1990; Gordon-Kamm et al. Plant Cell 2:603, 1990), electroporación, incubación de embriones secos en solución que comprende ADN y microinyección. En el caso de estos métodos directos de transformación, no es necesario que los plásmidos utilizados cumplan con ningún requisito en particular. Se pueden utilizar plásmidos simples, tales como aquellos de la serie pUC, pBR322, serie M13mp, pACYC184, y similares. Si se deben regenerar plantas intactas a partir de células transformadas, preferentemente se ubica un gen marcador seleccionable adicional en el plásmido. Las técnicas directas de transformación son igualmente adecuadas para plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas.

La transformación también se puede llevar a cabo mediante infección bacteriana por medio de Agrobacterium (por ejemplo, EP 0 1 16 718), infección viral por medio de vectores virales (documentos EP 0 067 553; US 4.407.956; WO 95/34668; WO 93/03161 ) o por medio de polen (documentos EP 0 270 356; WO 85/01856; US 4.684.61 1 ). Las técnicas de transformación basadas en Agrobacterium (especialmente para plantas dicotiledóneas) son bien conocidas en el arte. La cepa de Agrobacterium (por ejemplo, Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes) comprende un plásmido (plásmido Ti o Ri) y un elemento T-ADN que se transfiere a la planta luego de la infección con Agrobacterium. El T-ADN (ADN transferido) se integra en el genoma de la célula vegetal. El T-ADN puede estar localizado en el plásmido Ri o Ti o se encuentra comprendido de forma separada en el denominado vector binario. Los métodos para la transformación mediada por Agrobacterium se describen, por ejemplo, en Horsch RB et al. (1985) Science 225:1229. La transformación de las plantas por Agrobacterium se describe en, por ejemplo, White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, Transgénica Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, editado por S. D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15 - 38; Jenes B et al. Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, editado por S. D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 128-143; Potrykus (1991 ) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205- 225.

Los nucleótidos descriptos en la presente se pueden transformar directamente en el genoma del plástido. La expresión del plástido, en el que los genes se insertan por recombinación homologa en los varios miles de copias del genoma del plástido circular presente en cada célula vegetal, aprovecha la ventaja de la enorme cantidad de copias respecto de los genes expresados en el núcleo para permitir mayores niveles de expresión. En una forma de realización, los nucleótidos se insertan en un vector dirigido al plástido y se transforma en el genoma del plástido de un huésped de planta deseado. Se obtienen plantas homoplásmicas para los genomas del plástido que contienen las secuencias de nucleótidos y con preferencia son capaces de alta expresión de los nucleótidos. La tecnología de transformación del plástido se describe extensamente en las patentes U. S. Nros 5.451.513, 5.545.817, 5.545.818 y 5.877.462 en WO 95/16783 y WO 97/32977, y en McBride et al. (1994) PNAS 91 , 7301-7305.

El método descrito anteriormente produce otra forma de realización de la invención, una planta transgénica resistente a nematodos que comprende un vector de expresión recombinante que comprende un promotor específico de raíz en asociación operativa con un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: a) un polinucleótido que codifica una proteína rica en serina-arginina; b) un polinucleótido que codifica una proteína tipo 11 1 B inducida por AVR9; c) un polinucleótido que codifica una proteína hélice-bucle-hélice básica; y d) un polinucleótido que codifica una proteína tipo dirigent. Las plantas transgénicas de la invención se pueden usar para controlar la infestación de un cultivo por un nematodo parasítico de planta.

La invención también proporciona un método de mejoramiento genético de plantas, por ejemplo, para preparar una planta transgénica fértil cruzada. Las plantas transgénicas de la invención se pueden cruzar con plantas transgénicas similares o con plantas transgénicas que carecen de los ácidos nucleicos de la invención o con plantas no transgénicas, usando métodos conocidos de mejoramiento genético de plantas, para preparar semillas. Por otra parte, la planta transgénica de la presente invención puede comprender, y/o cruzarse con otra planta transgénica que comprende uno o más ácidos nucleicos, de este modo se crea una "pila" de transgenes en la planta y/o su progenie. La semilla luego se planta para obtener una planta transgénica fértil cruzada que comprende el vector de expresión de la invención. La planta transgénica fértil cruzada puede tener el vector de expresión heredado a través de un progenitor hembra o a través de un progenitor masculino. La segunda planta puede ser una planta endogámica. La planta transgénica fértil cruzada puede ser un híbrido.

El "apilamiento génico" también se puede obtener por la transferencia de dos o más genes en el núcleo celular por transformación de la planta. Se pueden introducir múltiples genes en el núcleo celular durante la transformación tanto en forma secuencial como al unísono. De acuerdo con la invención, se pueden apilar múltiples genes que codifican las proteínas, rica en serina-arginina, tipo 1 1 1 B inducida por AVR9, bHLH y tipo Dirigent para proporcionar mejor resistencia a los nematodos. Estas combinaciones apiladas se pueden crear por cualquier método que incluye pero sin limitación, reproducción cruzada de las plantas por métodos convencionales o por trasformacion genética. Si los rasgos se apilan por trasformacion genética, las proteínas, rica en serina-arginina, tipo 1 1 1 B inducida por AVR9, bHLH y tipo Dirigent se pueden combinar de cualquier manera. Por ejemplo si se introducen dos genes, las dos secuencias deben estar contenidas en casetes de transformación separados o en el mismo cásete de transformación. La expresión de las secuencias puede ser dirigida por promotores iguales o diferentes.

Las plantas transgénicas descriptas anteriormente producen aún otra forma de realización de la invención, una semilla que es genéticamente pura para un transgén que comprende el vector de expresión recombinante que comprende a promotor específico de raíz en asociación operativa con un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: a) un polinucleótido que codifica una proteína rica en serina-arginina; b) un polinucleótido que codifica una proteína tipo 1 1 1 B inducida por AVR9; c) un polinucleótido que codifica una proteína hélice-bucle-hélice básica; y d) un polinucleótido que codifica una proteína tipo dirigent. Las semillas transgénicas de la invención se pueden usar para controlar la infestación de un cultivo por un nematodo parasítico de planta.

Las plantas de cultivo y los correspondientes nematodos parasíticos se listan en un índice de enfermedades de plantas de los Estados Unidos (U.S. Dept. of Agriculture Handbook N.° 165, 1960); Distribution of Plant-Parasitic Nematode Species in North America (Society of Nematologists, 1985); y Fungi on Plants and Plant Products in the United States (American Phytopathological Society, 1989). Por ejemplo, los nematodos parasíticos de plantas que son blanco de la presente invención incluyen sin limitación, nematodos de quiste y nematodos de nudos radiculares. Los nematodos parasíticos de plantas específicos que son blanco de la presente invención incluyen sin limitación, Heterodera glycines, Heterodera schachtii, Heterodera avenae, Heterodera oryzae, Heterodera cajani, Heterodera trifolii, Globodera pallida, G. rostochiensis, or Globodera tabacum, Meloidogyne incógnita, M. arenaria, M. hapla, M. javanica, M. naasi, M. exigua, Ditylenchus dipsaci, Ditylenchus angustus, Radopholus similis, Radopholus citrophilus, Helicotylenchus multicinctus, Pratylenchus coffeae, Pratylenchus brachyurus, Pratylenchus vulnus, Paratylenchus curvitatus, Paratylenchus zeae, Rotylenchulus reniformis, Paratrichodorus anemones, Paratrichodorus minor, Paratrichodorus christiei, Anguina tritici, Bidera avenae, Subanguina radicicola, Hoplolaimus seinhorsti, Hoplolaimus Columbus, Hoplolaimus galeatus, Tylenchulus semipenetrans, Hemicycliophora arenaria, Rhadinaphelenchus cocophilus, Belonolaimus longicaudatus, Trichodorus primitivus, Nacobbus aberrans, Aphelenchoides besseyi, Hemicriconemoides kanayaensis, Tylenchorhynchus claytoni, Xiphinema americanum, Cacopaurus pestis, Heterodera zeae, Heterodera filipjevi, y similares.

Las plantas que se pueden volver resistentes a los nematodos de acuerdo con la invención incluyen plantas monocotiledóneas y plantas dicotiledóneas. Las plantas resistentes a nematodos producidas de acuerdo con la invención incluyen sin limitación, maíz, trigo, arroz, cebada, avena, centeno, sorgo, banana, y centeno. La planta puede ser de un género seleccionado del grupo que consiste en arveja, alfalfa, soja, zanahoria, apio, tomate, papa, algodón, tabaco, pimiento, colza oleaginosa, remolacha, repollo, coliflor, brócoli, lechuga A. thaliana, y similares.

La invención se ilustra adicionalmente con los siguientes ejemplos, que no se interpretan de ningún modo como imposición de limitaciones sobre el alcance de esta.

Ejemplo 1 : Construcción del vector Usando un método bioinformático, se identificaron cuatro genes de soja, TA52573_3847 (SEQ ID NO:3), AVR9-inducido_1 1 1 B (SEQ ID NO:37), GmbHLH_47172355 (SEQ ID NO:39), y GmDirigent_59580836 (SEQ ID NO:49) como regulados por disminución en el sincitio de las raíces infectadas con SCN, en comparación con el tejido de raíz no infectado. Como se describe en la presente, el gen designado TA52573_3847 SEQ ID NO:3 codifica una proteína rica en serina-arginina. El gen Gm rico en serina-arginina (SEQ ID NO: 1 ) empleado en los vectores de expresión aislados que se describen a continuación codifica una proteína que tiene 93% de identidad de secuencia a A52573_3847 (SEQ ID NO:3).

El promotor de ubiquitina constitutivo del perejil (WO 2003/102198; SEQ ID NO: 60, designado PcUbi4), promotor tipo MtN3 inducible por nematodo de soja (WO 2008/095887, SEQ ID NO: 58), promotor tipo TPP inducible por nematodo de Arabidopsis (WO 2008/071726, SEQ ID NO:57) y el superpromotor constitutivo (ver US 5955.646) se usaron para obtener los constructos descriptos en la siguiente Tabla 1.

Tabla 1 Los vectores de expresión también comprendían la forma mutada del gen de selección de acetohidroxiácido sintasa (AHAS) descripto en WO 2008/124495, que confiere resistencia al herbicida ARSENAL (Imazapyr, BASF Corporation, Mount Olive, NJ). La expresión de AHAS2 fue dirigida por el promotor de ubiquitina del perejil (SEQ ID NO:60).

Ejemplo 2: Bioensayo BioNematodo Se realizó un bioensayo para evaluar la resistencia a nematodos conferida por los polinucleótidos descriptos en la presente mediante un sistema de ensayo de planta enraizada descrito en la solicitud en trámite de propiedad común USSN 12/001 ,234. Se generaron raíces transgénicas después de la transformación con los vectores binarios descriptos en el Ejemplo 1 . Las líneas de raíz transgénica se cultivaron e inocularon con superficie descontaminada race 3 al nivel de nematodo de quiste de soja (SCN) juveniles de segunda etapa (J2) al nivel de 500 J2/pocillo. Cuatro semanas después de la inoculación de los nematodos, se cuentan los quistes de cada pocilio. Para cada constructo de transformación, se calcula el número de quistes por línea para determinar el recuento de quistes promedio y el error estándar para el constructo. Los valores de recuento de quistes para cada constructo de transformación se comparan con los valores del recuento de quistes de un control de vector vacío analizado en paralelo para determinar si el constructo analizado produce una reducción del recuento de quistes. Los cultivos de explantes enraizados transformados con los vectores RBM024, RBM036, RBM019, RBM031 , RTP1 124, RTP1 125, RTP1 126, RTP1 127 y RTP1090 exhibieron una tendencia general de reducción de cantidades de quistes y del índice de hembras respecto de la variedad sensible conocida, Williams82. Las raíces transgénicas que expresan el gen GmDirigent_59580836 regulado por el promotor constitutivo PcUbi4 (vector RTP1086) no mostró reducción del recuento de quistes respecto de las líneas control. Algunas líneas de raíz que expresan en forma constitutiva el gen Gm rico en Serina-Arginina con el promotor PcUbi4 desarrollaron parches marrón oscuros. La localización de los parches marrón oscuros varió entre las líneas de raíces transgénicas, en algunos casos se limitan a células individuales dispersas, o zonas de emergencia de raíz laterales o que se extienden por completo a lo largo de las raíces más viejas. Las raíces transgénicas que sobreexpresan el gen de AVR9-inducido_1 1 1 B regulado por el promotor constitutivo PcUbi4 (RBM019) o el promotor constitutivo Super (RTP1 124) desarrolló raíces más gruesas y más cortas y reducción de la cantidad de raíces laterales respecto de la líneas control.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Un método para obtener una planta transgénica resistente a los nematodos, caracterizado porque comprende las etapas de: a) proporcionar un vector de expresión recombinante que comprende usar un promotor específico de raíz en asociación operativa con un polinucleótido que codifica un proteína tipo 111 B inducida por AVR9 que comprende los aminoácidos 1 a 226 de la SEQ ID NO:38¡ b) transformar una célula vegetal con el vector de expresión recombinante; c) regenerar plantas transgénicas de la célula de planta transformada; y d) seleccionar plantas transgénicas que demuestran aumento de resistencia a la infección con nematodos parasíticos cuando se comparan con las plantas tipo silvestre que no comprenden el vector de expresión recombinante. Una planta transgénica resistente a nematodos caracterizada porque comprende un vector de expresión recombinante que comprende un promotor específico de raíz en asociación operativa con un polinucleótido que codifica una proteína rica en serina-arginina que comprende los aminoácidos 1 a 226 de la SEQ ID NO:38. Una semilla caracterizada porque es genéticamente pura para un transgén que comprende un vector de expresión recombinante que comprende un promotor específico de raíz en asociación operativa con un polinucleótido que codifica una proteína tipo 1 1 1 B inducida por AVR9 que comprende los aminoácidos 1 a 226 de la SEQ ID NO:38; RESUMEN Vectores de expresión que comprenden promotores específicos de raíz en asociación operativa con los polinucleótidos que están regulados por disminución en el sincitio de plantas infectadas con nematodos, para uso en los método de producir plantas transgénicas con aumento de resistencia a la infestación de nematodos. Plantas y semillas transgénicas resistentes a nematodos y semillas que comprenden dichos vectores de expresión.