ES2396412T3 - Resistencia a nematodos específicos de raíces de plantas - Google Patents

Abstract

Método de preparación de una planta transgénica resistente a nematodos, comprendiendo el método lasetapas de: a) proporcionar un vector de expresión recombinante que comprende un promotor específico de raíz enasociación operativa con un polinucleótido que codifica para una proteína de tipo AVR9-5 elicited_111B quecomprende los aminoácidos 1 a 226 de SEQ ID NO: 38; b) transformar una célula vegetal con el vector de expresión recombinante; c) regenerar plantas transgénicas a partir de la célula vegetal transformada; y d) seleccionar plantas transgénicas que demuestran una resistencia aumentada a la infección pornematodos parásitos de plantas en comparación con plantas de tipo natural que no comprenden el vectorde expresión recombinante.

Description

Resistencia a nematodos específicos de raíces de plantas

Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente provisional estadounidense con número de serie 61/201.471, presentada el 11 de diciembre de 2008, cuyo contenido completo se incorpora en el presente documento como referencia.

Campo de la invención

La invención se refiere a la mejora de la productividad agrícola a través del uso de semillas y plantas transgénicas resistentes a nematodos, y a métodos de preparación de tales plantas y semillas.

Antecedentes de la invención

Los nematodos son gusanos redondos microscópicos que se alimentan de las raíces, las hojas y los tallos de más de 2.000 cultivos en hileras, vegetales, frutas y plantas ornamentales, provocando unas pérdidas estimadas en cultivos de 100.000 millones de $ en todo el mundo. Una variedad de especies de nematodos parásitos infecta a plantas de cultivo, incluyendo nematodos del nódulo de la raíz (NNR), nematodos que forman quistes y nematodos que forman lesiones. Los nematodos del nódulo de la raíz, que se caracterizan por provocar la formación de agallas en las raíces en sitios de alimentación, tienen un espectro de huésped relativamente amplio y por tanto son parásitos en un gran número de especies de cultivo. Las especies de nematodos que forman quistes y de nematodos que forman lesiones tienen un espectro de huésped más limitado, pero todavía provocan pérdidas considerables en cultivos susceptibles.

Los nematodos parásitos están presentes por todos los Estados Unidos, produciéndose las mayores concentraciones en las regiones templadas, húmedas del sur y el oeste y en suelos arenosos. El nematodo del quiste de la soja (Heterodera glycines), la plaga más grave de las plantas de soja, se descubrió por primera vez en los Estados Unidos en Carolina del Norte en 1954. Algunas zonas están tan fuertemente infestadas por el nematodo del quiste de la soja (NQS) que la producción de soja ya no es económicamente posible sin medidas de control. Aunque la soja es el principal cultivo económico atacado por NQS, NQS parasitiza unos cincuenta huéspedes en total, incluyendo cultivos de campo, vegetales, plantas ornamentales y malas hierbas.

Los signos del daño por nematodos incluyen crecimiento reducido y amarilleamiento de las hojas, y marchitamiento de las plantas durante los periodos cálidos. La infestación por nematodos, sin embargo, puede provocar pérdidas de rendimiento significativas sin ningún síntoma de enfermedad aéreo obvio. Las causas principales de la reducción del rendimiento se deben a daño en la raíz subterránea. Las raíces infectadas por NQS padecen enanismo o crecimiento reducido. La infestación por nematodos también puede disminuir el número de nódulos fijadores de nitrógeno en las raíces, y puede hacer que las raíces sean más susceptibles a ataques por otros nematodos de plantas transmitidos por el suelo.

El ciclo de vida de los nematodos tiene tres estadios principales: huevo, juvenil y adulto. El ciclo de vida varía entre especies de nematodos. El ciclo de vida de NQS es similar a los ciclos de vida de otros nematodos parásitos de plantas. El ciclo de vida de NQS puede completarse habitualmente en de 24 a 30 días en condiciones óptimas, mientras que otras especies pueden tardar tanto como un año, o más, en completar el ciclo de vida. Cuando los niveles de humedad y temperatura se vuelven favorables en la primavera, los juveniles con forma de gusano eclosionan de los huevos en el suelo. Sólo los nematodos en el estadio de desarrollo juvenil pueden infectar raíces de soja.

Tras penetrar en las raíces de soja, los juveniles de NQS se mueven a través de la raíz hasta que entran en contacto con el tejido vascular, momento en el que dejan de migrar y comienzan a alimentarse. Con un estilete, el nematodo inyecta secreciones que modifican determinadas células de la raíz y las transforman en sitios de alimentación especializados. Las células de la raíz se transforman morfológicamente en sincitios multinucleados grandes (o células gigantes en el caso de NNR), que se usan como fuente de nutrientes para los nematodos. Por tanto, los nematodos que se alimentan de manera activa roban nutrientes esenciales de la planta dando como resultado pérdida de rendimiento. A medida de los nematodos hembra se alimentan, se hinchan y finalmente se hacen tan grandes que sus cuerpos rompen el tejido de la raíz y quedan expuestos en la superficie de la raíz.

Tras un periodo de alimentación, los NQS macho migran fuera de la raíz hacia el suelo y fertilizan las hembras adultas agrandadas. Los machos mueren entonces, mientras que las hembras permanecen unidas al sistema radicular y siguen alimentándose. Los huevos en las hembras hinchadas comienzan a desarrollarse, inicialmente en una masa o saco de huevos fuera del cuerpo, y entonces posteriormente dentro de la cavidad corporal del nematodo. Finalmente, toda la cavidad corporal de la hembra adulta se llena de huevos, y el nematodo muere. Es el cuerpo de la hembra muerta lleno de huevos lo que se denomina quiste. Finalmente, los quistes se desprenden y se

encuentran libres en el suelo. Las paredes del quiste se vuelven muy duras, proporcionando una excelente protección para los de aproximadamente 200 a 400 huevos contenidos dentro. Los huevos de NQS sobreviven dentro del quiste hasta que se producen las condiciones de eclosión apropiadas. Aunque muchos de los huevos pueden eclosionar en el plazo del primer año, muchos también sobrevivirán dentro de los quistes protectores durante varios años.

Un nematodo puede moverse a través del suelo sólo unas cuantas pulgadas al año con sus propias fuerzas. Sin embargo, la infestación por nematodos puede propagarse distancias sustanciales de una variedad de modos. Cualquier cosa que pueda moverse por suelos infestados puede propagar la infestación, incluyendo maquinaria agrícola, vehículos y herramientas, viento, agua, animales y trabajadores agrícolas. Partículas del suelo del tamaño de las semillas a menudo contaminan las semillas recogidas. En consecuencia, la infestación por nematodos puede propagarse cuando se plantan semillas contaminadas de campos infestados en campos no infestados. Incluso hay pruebas de que determinadas especies de nematodos pueden propagarse mediante aves. Sólo algunas de estas causas pueden prevenirse.

Las prácticas tradicionales para manejar la infestación por nematodos incluyen: mantener niveles apropiados de pH del suelo y nutrientes del suelo en tierra infestada por nematodos; controlar otras enfermedades de plantas, así como plagas de malas hierbas e insectos; usar prácticas de saneamiento tales como arado, plantación y cultivo de campos infestados por nematodos sólo tras trabajar en campos no infestados; limpiar el equipo meticulosamente con agua a alta presión o vapor tras trabajar en campos infestados; no usar semillas hechas crecer en tierra infestada para plantar campos no infestados a menos que la semilla se haya limpiado apropiadamente; rotar los campos infestados y alternar cultivos huésped con cultivos no huésped; usar nematicidas; y plantar variedades de plantas resistentes.

Se han propuesto métodos para la transformación genética de plantas con el fin de conferir un aumento de resistencia a nematodos parásitos de plantas. Por ejemplo, varios enfoques implican la transformación de plantas con ARN bicatenario que puede inhibir genes de nematodos esenciales. Otros enfoques de biotecnología agrícola proponen sobreexpresar genes que codifican para proteínas que son tóxicas para nematodos. Las patentes estadounidenses n.os 5.589.622 y 5.824.876 se refieren a la identificación de genes de plantas expresados específicamente en o adyacentes al sitio de alimentación de la planta tras la unión del nematodo.

El documento US 2009/0089896 da a conocer un promotor de un gen de tipo Mtn21 que se induce en sincitios de soja infectada por NQS. El documento WO 2008/077892 da a conocer un promotor de un gen de tipo peroxidasa que se induce en sincitios de soja infectada por NQS. El documento WO 2008/071726 da a conocer un promotor de un gen de tipo trehalosa-6-fosfato fosfatasa que se induce en sincitios de soja infectada por NQS. El documento WO 2008/095887 da a conocer un promotor de un gen de tipo Mtn3 que se induce en sincitios de soja infectada por NQS. El documento WO 2008/095888 da a conocer el promotor de un gen de tipo At5g12170 que se induce en sincitios de soja infectada por NQS.

Varias publicaciones de patente dan a conocer proféticamente y reivindican genéricamente plantas transgénicas que comprenden uno cualquiera o más de miles de genes de plantas y que tienen características agronómicas mejoradas. Los ejemplos de tales publicaciones incluyen los documentos US2004/0031072, US2006/0107345, US2004/0034888, US2004/0019927, US2004/0045049, US2004/0019927, US2006/0272060, W02005/5112608, US2006/0150283 y US2007/0214517. Se da a conocer la resistencia a patógenos, incluyendo la resistencia a nematodos, como una característica agronómica mejorada potencial de las plantas transgénicas descritas en estas publicaciones. Sin embargo, ninguna de estas publicaciones asocia específicamente ningún gen dado a conocer con resistencia a nematodos mejorada en plantas transgénicas que contienen el gen.

Las proteínas ricas en serina-arginina (ricas en SR) son reguladores clave de la expresión de genes de plantas, contribuyendo diversos miembros de la familia de genes al corte y empalme constitutivo de ARN, a la exportación nuclear, al mantenimiento de la estabilidad del ARNm y a la traducción de proteínas. Las proteínas SR están también implicadas en el corte y empalme de ARN alternativo, en el que se unen a secuencias de ARN específico y guían la formación de complejos de espliceosoma en sitios de corte y empalme débiles. Las familias de genes ricos en SR tienen poblaciones moderadas en plantas, encontrándose diversos subgrupos en aproximadamente cinco categorias basadas en motivos.

El gen de tipo AVR9-elicited_111 B es un factor de transcripción con homología de secuencia a 111 B ACRE (Avr9/Cf-9 rapidly elicited) de Nicotiana tabacum y DREB1A/CBF3 de Arabidopsis. En tabaco, el gen 111B ACRE es un activador transcripcional relacionado con patogénesis que se induce rápidamente en líneas que expresan el gen de resistencia Cf-9 en respuesta a Avr9 expresado por Cladosporium fulvum, un hongo biotrópico. En otras especies, los genes CBF3/DREB1 están implicados en la activación de la respuesta al estrés abiótico. La patente estadounidense n.º 7.345.217 da a conocer SEQ ID NO: 1408, un gen de tipo AVR9-elicited_111 B que se supone que es un homólogo de un ADN de Arabidopsis thaliana denominado G912. La patente estadounidense n.º

7.345.217 da a conocer genéricamente numerosas categorías de posibles utilidades para los miles de genes dados a conocer en la misma, y una de esas categorías se identifica como resistencia a enfermedades, incluyendo

resistencia a nematodos. Sin embargo, las únicas utilidades específicas propuestas en la patente estadounidense n.º

7.345.217 para G912 y sus homólogos son tolerancias mejoradas al frío, las heladas, la sequía y el estrés salino.

Los factores de transcripción hélice-bucle-hélice básica (bHLH) y de unión al elemento de respuesta a la deshidratación (DREB) son también moléculas reguladoras clave en plantas. Las funciones fisiológicas de algunos genes bHLH se han demostrado experimentalmente en plantas. Se sabe que los genes R y TT8 regulan la acumulación de antocianina en maíz y Arabidopsis, y otros genes bHLH interaccionan con fitocromo y regulan la respuesta a la luz. Otros genes bHLH regulan la señalización por hormonas. El papel fisiológico de la mayoría de los genes bHLH de plantas es desconocido, sin embargo, hay poca conservación de secuencia entre miembros de la familia de genes bHLH fuera del dominio de firma bHLH central.

Las proteínas de tipo dirigente pertenecen a una familia génica grande, diversa que se encuentra en todos los grupos de plantas terrestres principales analizados hasta la fecha. Los genes que codifican para dirigente se agrupan en 5 subfamilias filogenéticas, Dir-A hasta Dir-E. Se ha mostrado que la subfamilia Dir-A, conjuntamente con oxidasas fenólicas, dirige el ensamblaje estereospecífico de ligninas (componentes de la pared celular) y lignanos (antioxidantes de plantas y compuestos de defensa) en una gama de especies de plantas. La expresión de PsDIR1, un gen Dir-A de Pisum sativa, confiere resistencia a múltiples patógenos fúngicos en canola transgénica. Los genes de la subfamilia Dir-A se inducen mediante una amplia variedad de estreses, tales como heridas mecánicas, herbivorismo e infección fúngica. Las funciones bioquímicas específicas de genes de los subgrupos de proteínas Dir-B, Dir-C, Dir-D y Dir-E (tipo Dir) no están tan bien caracterizadas, aunque se mostró que genes de la subfamilia Dir-C se inducían mediante tratamiento con ácido jasmónico, ácido salicílico y alimentación por larvas de moscas de Hesse avirulentas.

Hasta la fecha, ninguna planta modificada genéticamente que comprenda un transgén que puede conferir resistencia a nematodos se ha desregulado en ningún país. Por consiguiente, sigue existiendo una necesidad de identificar composiciones seguras y eficaces y métodos para controlar nematodos parásitos de plantas usando biotecnología agrícola.

Sumario de la invención

Los presentes inventores han descubierto que la expresión de un transgén que comprende un polinucleótido que codifica para una proteína rica en serina-arginina, una proteína de tipo AVR9-elicited_111 B, una proteína bHLH o una proteína de tipo dirigente en raíces puede hacer que plantas de soja sean resistentes a la infección por NQS. Por consiguiente, la descripción proporciona plantas transgénicas y semillas, y métodos para superar, o al menos aliviar, la infestación por nematodos de cultivos agrícolas valiosos.

La descripción proporciona un vector de expresión aislado que comprende un promotor específico de raíz en asociación operativa con un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: a) un polinucleótido que codifica para una proteína rica en serina-arginina; b) un polinucleótido que codifica para una proteína de tipo AVR9elicited_111 B; c) un polinucleótido que codifica para una proteína hélice-bucle-hélice básica; y d) un polinucleótido que codifica para una proteína de tipo dirigente.

La invención proporciona un método de preparación de una planta transgénica resistente a nematodos, comprendiendo el método las etapas de: a) proporcionar un vector de expresión recombinante que comprende un promotor específico de raíz en asociación operativa con un polinucleótido que codifica para una proteína de tipo AVR9-elicited_111 B que comprende los aminoácidos 1 a 226 de SEQ ID NO: 38; transformar una célula vegetal con el vector de expresión recombinante; c) regenerar plantas transgénicas a partir de la célula vegetal transformada; y d) seleccionar plantas transgénicas que demuestran una resistencia aumentada a la infección por nematodos parásitos de plantas en comparación con plantas de tipo natural que no comprenden el vector de expresión recombinante.

Aún en otra realización, la invención proporciona una planta transgénica resistente a nematodos que comprende un vector de expresión recombinante que comprende un promotor específico de raíz en asociación operativa con un polinucleótido que codifica para una proteína rica en serina-arginina que comprende aminoácidos 1 a 226 de SEQ ID NO: 38;

En otra realización, la invención proporciona una semilla que es una línea pura para un transgén que comprende un vector de expresión recombinante que comprende un promotor específico de raíz en asociación operativa con un polinucleótido que codifica para una proteína de tipo AVR9-elicited_111 B que comprende los aminoácidos 1 a 226 de SEQ ID NO: 38.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1a-1b muestran la tabla de SEQ ID NO asignadas a genes y promotores correspondientes. SEQ ID NO

1, 37, 39 y 49 corresponden a secuencias de nucleótidos de G. max. de longitud completa para polinucleótidos que codifican para proteína rica en serina/arginina (SEQ ID NO: 1), proteína AVR9-elicited_111 B (SEQ ID NO: 37), proteína bHLH (SEQ ID NO: 39) y proteína de tipo dirigente (SEQ ID NO: 49), respectivamente. Se facilitan secuencias promotoras inducidas por sincitios en SEQ ID NO: 57 (promotor de tipo TPP de A. thaliana), SEQ ID NO: 58 (promotor de tipo MtN3 de G. max) y SEQ ID NO: 59 (promotor del locus At5g12170 de A. thaliana). El promotor de ubiquitina constitutivo denominado PcUbi4-2, de P. crispum, se facilita en SEQ ID NO: 60.

Las figuras 2a-2c muestran una alineación de aminoácidos de proteínas ricas en serina/arginina a modo de ejemplo realizada usando el paquete de software Vector NTI v10.3.0 (penalización por apertura de huecos = 10, penalización por extensión de huecos = 0,05, penalización por separación de huecos = 8).

La figura 3 muestra una alineación de aminoácidos de proteínas hélice-bucle-hélice básicas a modo de ejemplo realizadas usando el paquete de software Vector NTI v10.3.0 (penalización por apertura de huecos = 10, penalización por extensión de huecos = 0,05, penalización por separación de huecos = 8).

La figura 4 muestra una alineación de aminoácidos de proteínas de tipo dirigente a modo de ejemplo realizada usando el paquete de software Vector NTI v10.3.0 (penalización por apertura de huecos = 10, penalización por extensión de huecos = 0,05, penalización por separación de huecos = 8).

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La presente invención puede entenderse más fácilmente mediante referencia a la siguiente descripción detallada y los ejemplos incluidos en la misma. A lo largo de toda esta solicitud, se hace referencia a diversas publicaciones. Las descripciones de todas estas publicaciones y las referencias citadas dentro de estas publicaciones se incorporan por el presente documento en su totalidad mediante referencia en esta solicitud con el fin de describir más completamente el estado de la técnica a la que se refiere esta invención. La terminología usada en el presente documento es para el fin de describir realizaciones específicas sólo y no pretende ser limitativa. Tal como se usa en el presente documento, “un/uno” o “una” puede significar uno más, dependiendo del contexto en el que se usa. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “una célula” puede significar que puede usarse al menos una célula. Tal como se usa en el presente documento, la palabra “o” significa un miembro cualquiera de una lista particular e incluye también cualquier combinación de miembros de esa lista.

Tal como se define en el presente documento, una “planta transgénica” es una planta que se ha alterado usando tecnología de ADN recombinante para que contenga un ácido nucleico aislado que de lo contrario no estaría presente en la planta. Tal como se usa en el presente documento, el término “planta” incluye una planta completa, células vegetales y partes de plantas. Las partes de plantas incluyen, pero no se limitan a, tallos, raíces, óvulos, estambres, hojas, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, gametofitos, esporofitos, polen, microsporas, y similares. La planta transgénica tal como se da a conocer en el presente documento puede ser estéril masculina o fértil masculina, y puede incluir además transgenes distintos de los que comprenden los polinucleótidos aislados descritos en el presente documento.

Tal como se define en el presente documento, el término “ácido nucleico” y “polinucleótido” son intercambiables y se refieren a ARN o ADN que es lineal o ramificado, mono o bicatenario, o un híbrido de los mismos. El término también abarca híbridos de ARN/ADN. Una molécula de ácido nucleico “aislada” es una que está sustancialmente separada de las otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico (es decir, secuencias que codifican para otros polipéptidos). Por ejemplo, un ácido nucleico clonado se considera aislado. Un ácido nucleico también se considera aislado si se ha alterado por la intervención humana, o colocado en un locus o ubicación que no es su sitio natural, o si se introduce en una célula mediante transformación. Además, una molécula de ácido nucleico aislada, tal como una molécula de ADNc, puede estar libre de algunos de los otros materiales celulares con los que está asociada de manera natural, o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Aunque puede abarcar opcionalmente una secuencia no traducida ubicada en ambos extremos 3’ y 5’ de la región codificante de un gen, puede ser preferible eliminar las secuencias que flanquean de manera natural la región codificante en su replicón que se produce de manera natural.

El término “gen” se usa de manera amplia para referirse a cualquier segmento de ácido nucleico asociado con una función biológica. Por tanto, los genes incluyen intrones y exones como en una secuencia genómica, o sólo las secuencias codificantes como en ADNc y/o las secuencias reguladoras requeridas para su expresión. Por ejemplo, gen se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa ARNm o ARN funcional, o que codifica para una proteína específica, y que incluye secuencias reguladoras.

Los términos “polipéptido” y “proteína” se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácido consecutivos.

Los términos “operativamente unido” y “en asociación operativa con” son intercambiables y tal como se usan en el presente documento se refieren a la asociación de polinucleótidos aislados en un único fragmento de ácido nucleico de modo que la función de un polinucleótido aislado se ve afectada por el otro polinucleótido aislado. Por ejemplo, un ADN regulador se dice que está “operativamente unido a” un ADN que expresa un ARN o que codifica para un polipéptido si los dos ADN están situados de manera que el ADN regulador afecta a la expresión del ADN codificante.

El término “promotor” tal como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de ADN que, cuando está ligada a una secuencia de nucleótidos de interés, puede controlar la transcripción de la secuencia de nucleótidos de interés en ARNm. Un promotor está normalmente, aunque no necesariamente, ubicado en 5’ (por ejemplo, en el sentido de 5’) con respecto a un nucleótido de interés (por ejemplo, de manera proximal al sitio de iniciación de la transcripción de un gen estructural) cuya transcripción en ARNm controla, y proporciona un sitio para la unión específica por ARN polimerasa y otros factores de transcripción para la iniciación de la transcripción.

El término “elemento regulador de la transcripción” tal como se usa en el presente documento se refiere a un polinucleótido que puede regular la transcripción de un polinucleótido operativamente unido. Incluye, pero no se limita a, promotores, potenciadores, intrones, UTR en 5’ y UTR en 3’.

Tal como se usa en el presente documento, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. En la presente memoria descriptiva, “plásmido” y “vector” pueden usarse de manera intercambiable ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada. Un vector puede ser un vector binario o un ADN-T que comprende el borde izquierdo y el borde derecho y puede incluir un gen de interés entremedias. El término “vector de expresión” es intercambiable con el término “transgén” tal como se usa en el presente documento y significa un vector que puede dirigir la expresión de un nucleótido particular en una célula huésped apropiada. La expresión del nucleótido puede ser sobreexpresión. Un vector de expresión comprende un elemento de ácido nucleico regulador operativamente unido a un ácido nucleico de interés, que opcionalmente está operativamente unido a una señal de terminación y/u otro elemento regulador.

El término “homólogos” tal como se usa en el presente documento se refiere a un gen relacionado con un segundo gen por descendencia de una secuencia de ADN ancestral común. El término “homólogo” puede aplicarse a la relación entre genes separados por el acontecimiento de especialización (por ejemplo, ortólogos) o a la relación entre genes separados por el acontecimiento de duplicación genética (por ejemplo, parálogos).

Tal como se usa en el presente documento, el término “ortólogos” se refiere a genes de especies diferentes, pero que han evolucionado a partir de un gen ancestral común por especialización. Los ortólogos conservan la misma función en el transcurso de la evolución. Los ortólogos codifican para proteínas que tienen funciones iguales o similares. Tal como se usa en el presente documento, el término “parálogos” se refiere a genes que están relacionados por duplicación dentro de un genoma. Los parálogos tienen habitualmente funciones diferentes o nuevas funciones, aunque estas funciones pueden estar relacionadas.

El término “región conservada” o “dominio conservado” tal como se usa en el presente documento se refiere a una región en secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas heterólogas en las que hay un grado relativamente alto de identidad de secuencia entre las distintas secuencias. La “región conservada” puede identificarse, por ejemplo, a partir de la alineación de secuencias múltiples usando el algoritmo Clustal W.

El término “célula” o “célula vegetal” tal como se usa en el presente documento se refiere a una única célula, y también incluye una población de células. La población puede ser una población pura que comprende un tipo de células. Asimismo, la población puede comprender más de un tipo de células. Una célula vegetal puede estar aislada (por ejemplo, en cultivo en suspensión) o comprendida en un tejido vegetal, órgano vegetal o planta en cualquier estadio de desarrollo.

El término “línea pura” tal como se usa en el presente documento se refiere a una variedad de planta para un rasgo particular si es genéticamente homocigota para ese rasgo hasta el grado de que, cuando la variedad de línea pura se autopoliniza, no se observa una cantidad significativa de segregación independiente del rasgo entre la progenie.

El término “segregante nulo” tal como se usa en el presente documento se refiere a una progenie (o líneas derivadas de la progenie) de una planta transgénica que no contiene el transgén debido a segregación mendeliana.

El término “tipo natural” tal como se usa en el presente documento se refiere a una célula vegetal, semilla, componente vegetal, tejido vegetal, órgano vegetal o planta completa que no se ha tratado o modificado genéticamente en un sentido experimental.

El término “planta control” tal como se usa en el presente documento se refiere a una célula vegetal, un explante, una semilla, un componente vegetal, un tejido vegetal, un órgano vegetal o una planta completa usada para comparar frente a la planta modificada genéticamente o transgénica para el fin de identificar un fenotipo potenciado

o un rasgo deseable en la planta modificada genéticamente o transgénica. Una “planta control” puede ser en algunos casos una línea vegetal transgénica que comprende un vector vacío o marcador génico, pero que no contiene el polinucleótido recombinante de interés que está presente en la planta modificada genéticamente o transgénica que está evaluándose. Una planta control puede ser una planta de la misma línea o variedad que la planta modificada genéticamente o transgénica que está sometiéndose a prueba, o puede ser otra línea o variedad, tal como una planta que se sabe que tiene un fenotipo específico, característico o genotipo conocido. Una planta control adecuada incluiría una planta no transgénica o no alterada genéticamente de la línea original usada para generar una planta transgénica en el presente documento.

El término “sitio de sincitios” tal como se usa en el presente documento se refiere al sitio de alimentación formado en raíces de plantas tras la infestación por nematodos. El sitio de usa como fuente de nutrientes para los nematodos. Un sincitio es el sitio de alimentación para nematodos de quistes y las células gigantes son los sitios de alimentación de los nematodos del nódulo de la raíz.

Se da a conocer además un vector de expresión aislado que comprende un promotor específico de raíz en asociación operativa con un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: a) un polinucleótido que codifica para una proteína rica en serina-arginina; b) un polinucleótido que codifica para una proteína de tipo AVR9elicited_111 B; c) un polinucleótido que codifica para una proteína hélice-bucle-hélice básica; y d) un polinucleótido que codifica para una proteína de tipo dirigente.

Puede emplearse cualquier promotor específico de raíz en el vector de expresión de la invención. Los promotores específicos de raíz a modo de ejemplo incluyen, sin limitación, el promotor derivado del gen de nicotianamina sintetasa de maíz (documento US 20030131377) y el promotor RCC3 de arroz (documento US 11/075.113). De particular utilidad son promotores específicos de raíz inducidos en sitios de alimentación de nematodos (es decir, sincitios). Preferiblemente, pueden emplearse el promotor inducible por nematodos de tipo Mtn3 dado a conocer en el documento WO 2008/095887, el promotor de tipo Mtn21 inducible por nematodos dado a conocer en el documento US 2009/0089896, el promotor de tipo peroxidasa inducible por nematodos dado a conocer en el documento WO 2008/077892, el promotor de tipo trehalosa-6-fosfato fosfatasa inducible por nematodos dado a conocer en el documento WO 2008/071726 y el promotor de tipo At5g12170 inducible por nematodos dado a conocer en el documento WO 2008/095888 en el vector de expresión dado a conocer.

Puede emplearse cualquier polinucleótido que codifica para una proteína rica en serina-arginina en el vector expresión aislado de la invención. Preferiblemente, el polinucleótido codifica para una proteína rica en serinaarginina seleccionada del grupo que consiste en un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 253 de SEQ ID NO: 2; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 249 de SEQ ID NO: 4; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 247 de SEQ ID NO: 6; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 249 de SEQ ID NO: 8; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 249 de SEQ ID NO: 10; un polipéptido que comprende aminoácidos 1 a 245 de SEQ ID NO: 12; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 240 de SEQ ID NO: 14; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 261 de SEQ ID NO: 16; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 280 de SEQ ID NO: 18; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 248 de SEQ ID NO: 20; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 252 de SEQ ID NO: 22; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 265 de SEQ ID NO: 24; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 263 de SEQ ID NO: 26; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 220 de SEQ ID NO: 28; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 220 de SEQ ID NO: 30; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 263 de SEQ ID NO: 32; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 218 de SEQ ID NO: 34; y un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 245 de SEQ ID NO: 36. Más preferiblemente, el polinucleótido codifica para una proteína rica en serina-arginina que comprende los aminoácidos 1 a 253 de SEQ ID NO: 2.

Puede emplearse cualquier polinucleótido que codifica para una proteína AVR9-elicited_111 B en el vector de expresión aislado de la invención. Preferiblemente, la proteína AVR9-elicited_111 B comprende los aminoácidos 1 a 226 de SEQ ID NO: 38.

Puede emplearse cualquier polinucleótido que codifica para una proteína hélice-bucle-hélice básica en el vector de expresión aislado. Preferiblemente, la proteína hélice-bucle-hélice básica se selecciona del grupo que consiste en un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 231 de SEQ ID NO: 40; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 226 de SEQ ID NO: 42; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 232 de SEQ ID NO: 44; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 233 de SEQ ID NO: 46; y un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 260 de SEQ ID NO: 48. Más preferiblemente, la proteína hélice-bucle-hélice básica comprende los aminoácidos 1 a 231 de SEQ ID NO: 40.

Puede emplearse cualquier polinucleótido que codifica para una proteína de tipo dirigente en el vector de expresión aislado. Preferiblemente, la proteína de tipo dirigente se selecciona del grupo que consiste en un polipéptido que

comprende los aminoácidos 1 a 191 de SEQ ID NO: 50; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 191 de SEQ ID NO: 52; un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 189 de SEQ ID NO: 54; y un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 189 de SEQ ID NO: 56. Más preferiblemente, la proteína de tipo dirigente comprende los aminoácidos 1 a 191 de SEQ ID NO: 50.

El vector de expresión aislado se emplea en un método de preparación de una planta transgénica resistente a nematodos, comprendiendo el método las etapas de: a) proporcionar el vector de expresión recombinante descrito anteriormente b) transformar una célula vegetal con el vector de expresión recombinante; c) regenerar plantas transgénicas a partir de la célula vegetal transformada; y d) seleccionar plantas transgénicas que demuestran una resistencia aumentada a la infección por nematodos parásitos de plantas en comparación con plantas de tipo natural que no comprenden el vector de expresión recombinante.

Se conocen una variedad de métodos para introducir polinucleótidos en el genoma de plantas y para la regeneración de plantas a partir de tejidos vegetales o células vegetales en, por ejemplo, Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), capítulo 6/7, págs. 71-119 (1993); White FF (1993) Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung y Wu R, Academic Press, 15-38; Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer; Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung y R. Wu, Academic Press, págs. 128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225; Halford NG, Shewry PR (2000) Br Med Bull 56(1):62-73.

Los métodos de transformación pueden incluir métodos de transformación directos e indirectos. Los métodos directos adecuados incluyen captación de ADN inducida por polietilenglicol, transformación mediada por liposomas (documento US 4.536.475), métodos biolísticos usando la pistola génica (Fromm ME et al., Bio/Technology. 8(9):833-9, 1990; Gordon-Kamm et al. Plant Cell 2:603, 1990), electroporación, incubación de embriones secos en disolución que comprende ADN y microinyección. En el caso de estos métodos de transformación directos, los plásmidos usados no necesitan cumplir ningún requisito particular. Pueden usarse plásmidos sencillos, tales como los de la serie pUC, pBR322, serie M13mp, pACYC184 y similares. Si van a regenerarse plantas intactas a partir de las células transformadas, se ubica preferiblemente en el plásmido un gen marcador seleccionable adicional. Las técnicas de transformación directas son igualmente adecuadas para plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas.

La transformación puede llevarse a cabo también mediante infección bacteriana por medio de Agrobacterium (por ejemplo documento EP 0 116 718), infección viral por medio de vectores virales (documento EP 0 067 553; documento US 4.407.956; documento WO 95/34668; documento WO 93/03161) o por medio de polen (documento EP 0 270 356; documento WO 85/01856; documento US 4.684.611). Se conocen bien en la técnica técnicas de transformación basadas en Agrobacterium (especialmente para plantas dicotiledóneas). La cepa de Agrobacterium (por ejemplo, Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes) comprende un plásmido (plásmido Ti o Ri) y un elemento de ADN-T que se transfiere a la planta tras la infección con Agrobacterium. El ADN-T (ADN transferido) se integra en el genoma de la célula vegetal. El ADN-T puede estar localizado en el plásmido Ri o Ti o está comprendido por separado en un denominado vector binario. Se describen métodos para la transformación mediada por Agrobacterium, por ejemplo, en Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229. Se describe la transformación de plantas mediante agrobacterias en, por ejemplo, White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, editado por S.D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, págs. 15 - 38; Jenes B et al. Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, editado por S.D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, págs. 128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225.

Los nucleótidos descritos en el presente documento pueden transformarse directamente en el genoma del plástido. La expresión de plástidos, en los que se insertan genes mediante recombinación homóloga en los varios miles de copias del genoma del plástido circular presente en cada célula vegetal, se aprovecha de la enorme ventaja en números de copias con respecto a genes de expresión nuclear para permitir altos niveles de expresión. En un aspecto, los nucleótidos se insertan en un vector que selecciona como diana un plástido y se transforman en el genoma del plástido de un huésped vegetal deseado. Se obtienen plantas homoplásmicas para genomas de plástidos que contienen las secuencias de nucleótidos, y preferentemente pueden producir una alta expresión de los nucleótidos. La tecnología de transformación de plástidos se describe de manera extensa por ejemplo en las patentes estadounidenses n.os 5.451.513, 5.545.817, 5.545.818 y 5.877.462, en los documentos WO 95/16783 y WO 97/32977, y en McBride et al. (1994) PNAS 91, 7301-7305.

El método descrito anteriormente produce otra realización de la invención, una planta transgénica resistente a nematodos que comprende un vector de expresión recombinante que comprende un promotor específico de raíz en asociación operativa con un polinucleótido que codifica para una proteína de tipo AVR9-elicited_111 B que comprende los aminoácidos 1 a 226 de SEQ ID NO: 38. Las plantas transgénicas de la invención pueden usarse para controlar la infestación de un cultivo por un nematodo parásito de plantas.

Se da a conocer además un método de mejora genética de plantas, por ejemplo, para preparar una planta transgénica fértil cruzada. Las plantas transgénicas tal como se dan a conocer en el presente documento pueden

cruzarse con plantas transgénicas similares o con plantas transgénicas que carecen de los ácidos nucleicos de la invención o con plantas no transgénicas, usando métodos conocidos de mejora genética de plantas, para preparar semillas. Además, la planta transgénica tal como se da a conocer en el presente documento puede comprender, y/o puede cruzarse con, otra planta transgénica que comprende uno o más ácidos nucleicos, creando por tanto una “pila” de transgenes en la planta y/o su progenie. La semilla se planta entonces para obtener una planta transgénica fértil cruzada que comprende el vector de expresión. La planta transgénica fértil cruzada puede tener el vector de expresión heredado a través de un antecesor femenino o a través de un antecesor masculino. La segunda planta puede ser una planta consanguínea. La planta transgénica fértil cruzada puede ser un híbrido.

También puede lograrse el “apilamiento de genes” transfiriendo dos o más genes al núcleo celular mediante transformación de plantas. Pueden introducirse múltiples genes en el núcleo celular durante la transformación o bien secuencialmente o bien al unísono. Según la invención, pueden apilarse múltiples genes que codifican para proteínas ricas en serina-arginina, de tipo AVR9-elicited_111 B, bHLH y de tipo dirigente para proporcionar resistencia a nematodos potenciada. Estas combinaciones apiladas pueden crearse mediante cualquier método incluyendo pero sin limitarse a fecundación cruzada de plantas mediante métodos convencionales o mediante transformación genética. Si los rasgos se apilan mediante transformación genética, los genes de proteínas ricas en serina-arginina, de tipo AVR9-elicited_111 B, bHLH y de tipo dirigente pueden combinarse de cualquier manera. Por ejemplo, si van a introducirse dos genes, las dos secuencias pueden estar contenidas en casetes de transformación separados o en el mismo casete de transformación. La expresión de las secuencias puede dirigirse mediante promotores iguales o diferentes.

Las plantas transgénicas descritas anteriormente producen aún otra realización de la invención, una semilla que es una línea pura para un transgén que comprende el vector de expresión recombinante que comprende un promotor específico de raíz en asociación operativa con un polinucleótido que codifica para una proteína de tipo AVR9elicited_111 B que comprende los aminoácidos 1 a 226 de SEQ ID NO: 38. Las semillas transgénicas tal como se dan a conocer en el presente documento pueden usarse para controlar la infestación de un cultivo por un nematodo parásito de plantas.

Se enumeran plantas de cultivo y nematodos parásitos correspondientes en Index of Plant Diseases in the United States (Manual del Departamento de Agricultura de los EE.UU. n.º 165, 1960); Distribution of Plant-Parasitic Nematode Species in North America (Society of Nematologists, 1985); y Fungi on Plants and Plant Products in the United States (American Phytopathological Society, 1989). Por ejemplo, los nematodos parásitos de plantas que se seleccionan como diana incluyen, sin limitación, nematodos de quistes y nematodos del nódulo de la raíz. Los nematodos parásitos de plantas específicos que se seleccionan como diana incluyen, sin limitación, Heterodera glycines, Heterodera schachtii, Heterodera avenae, Heterodera oryzae, Heterodera cajani, Heterodera trifolii, Globodera pallida, G. rostochiensis o Globodera tabacum, Meloidogyne incognita, M. arenaria, M. hapla, M. javanica,

M. naasi, M. exigua, Ditylenchus dipsaci, Ditylenchus angustus, Radopholus similis, Radopholus citrophilus, Helicotylenchus multicinctus, Pratylenchus coffeae, Pratylenchus brachyurus, Pratylenchus vulnus, Paratylenchus curvitatus, Paratylenchus zeae, Rotylenchulus reniformis, Paratrichodorus anemones, Paratrichodorus minor, Paratrichodorus christiei, Anguina tritici, Bidera avenae, Subanguina radicicola, Hoplolaimus seinhorsti, Hoplolaimus Columbus, Hoplolaimus galeatus, Tylenchulus semipenetrans, Hemicycliophora arenaria, Rhadinaphelenchus cocophilus, Belonolaimus longicaudatus, Trichodorus primitivus, Nacobbus aberrans, Aphelenchoides besseyi, Hemicriconemoides kanayaensis, Tylenchorhynchus claytoni, Xiphinema americanum, Cacopaurus pestis, Heterodera zeae, Heterodera filipjevi y similares.

Las plantas que pueden hacerse resistentes a nematodos incluyen plantas monocotiledóneas y plantas dicotiledóneas. Las plantas resistentes a nematodos producidas incluyen, sin limitación, maíz, trigo, arroz, cebada, avena, centeno, sorgo, banana y raigrás. La planta puede ser de un género seleccionado del grupo que consiste en guisante, alfalfa, soja, zanahoria, apio, tomate, patata, algodón, tabaco, pimiento, colza, remolacha, repollo, coliflor, brócoli, lechuga, A. thaliana, y similares.

La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse de ningún modo que imponen limitaciones al alcance de la misma.

Ejemplo 1: Construcción de vectores

Usando un enfoque de bioinformática, se identificó que cuatro genes de soja, TA52573_3847 (SEQ ID NO: 3), AVR9-elicited_111B (SEQ ID NO: 37), GmbHLH_47172355 (SEQ ID NO: 39) y GmDirigent_59580836 (SEQ ID NO: 49) estaban regulados por disminución en sincitios de raíces de soja infectadas por NQS, en comparación con tejido radicular no infectado. Tal como se describe en el presente documento, el gen designado TA52573_3847 SEQ ID NO: 3 codifica para una proteína rica en serina-arginina. El gen GmSerine-Arginine-rich (SEQ ID NO: 1) empleado en los vectores de expresión aislados descritos a continuación codifica para una proteína que tiene una identidad de secuencia del 93% con TA52573_3847 (SEQ ID NO: 3).

Se usaron el promotor de ubiquitina constitutivo de perejil (documento WO 2003/102198; SEQ ID NO: 60, designado

PcUbi4), el promotor de tipo MtN3 inducible por nematodos de soja (documento WO 2008/095887, SEQ ID NO: 58), el promotor de tipo TPP inducible por nematodos de Arabidopsis (documento WO 2008/071726, SEQ ID NO: 57) y el promotor Super constitutivo (véase el documento US 5955.646) en la preparación de los constructos descritos en la tabla 1 a continuación.

Tabla 1

Nombre del vector

Promotor Nombre del gen SEQ ID NO: de genes

RBM024

PcUbi4 GmSerine-Arginine-rich SEQ ID NO: 1

RBM036

De tipo MtN3 GmSerine-Arginine-rich SEQ ID NO: 1

RBM019

PcUbi4 AVR9-elicited_111B SEQ ID NO: 37

RBM031

De tipo MtN3 AVR9-elicited_111B SEQ ID NO: 37

RTP1124

Super AVR9-elicited_111B SEQ ID NO: 37

RTP1125

De tipo TPP AVR9-elicited_111B SEQ ID NO: 37

RTP1126

PcUbi4 GmbHLH_47172355 SEQ ID NO: 39

RTP1127

De tipo MtN3 GmbHLH_47172355 SEQ ID NO: 39

RTP1086

PcUbi4 GmDirigent_59580836 SEQ ID NO: 49

RTP1090

De tipo MtN3 GmDirigent_59580836 SEQ ID NO: 49

Los vectores de expresión también comprendían la forma mutada del gen de selección de acetohidroxiácido sintasa (AHAS) descrito en el documento WO 2008/124495, que confiere resistencia al herbicida ARSENAL (imazapir, BASF Corporation, Mount Olive, NJ). La expresión de AHAS2 se dirigió mediante el promotor de ubiquitina de perejil (SEQ ID NO: 60).

Ejemplo 2: Bioensayo de nematodos

Se realizó un bioensayo para evaluar la resistencia a nematodos conferida por los polinucleótidos descritos en el presente documento usando un sistema de ensayo de plantas enraizadas dado a conocer en la solicitud de patente en tramitación junto con la presente de propiedad conjunta 12/001.234. Se generan raíces transgénicas tras la transformación con los vectores binarios descritos en el ejemplo 1. Se subcultivan múltiples líneas de raíces transgénicas y se inoculan con juveniles en segundo estadio (J2) de NQS de raza 3 con la superficie descontaminada al nivel de aproximadamente 500 J2/pocillo. Cuatro semanas después de la inoculación de nematodos, se cuenta el número de quistes en cada pocillo. Para cada constructo de transformación, se calcula el número de quistes por línea para determinar el recuento de quistes promedio y el error estándar para el constructo. Se comparan los valores de recuento de quistes para cada constructo de transformación con los valores de recuento de quistes de un control de vector vacío sometido a prueba en paralelo para determinar si el constructo sometido a prueba da como resultado una reducción en el recuento de quistes. Cultivos de explantes enraizados transformados con los vectores RBM024, RBM036, RBM019, RBM031, RTP1124, RTP1125, RTP1126, RTP1127 y RTP1090 presentaban una tendencia general de una reducción de los números de quistes e índice de hembras en relación con la variedad susceptible conocida, Williams82. Raíces transgénicas que expresaban el gen GmDirigent_59580836 regulado por el promotor PcUbi4 constitutivo (vector RTP1086) no mostraban reducción de los recuentos de quistes en relación con líneas control. Algunas líneas de raíz que expresaban de manera constitutiva el gen GmSerine-Arginine-rich con el promotor PcUbi4 desarrollaron parches de color marrón oscuro. La localización de los parches de color marrón oscuro variaba entre líneas de raíces transgénicas, limitándose en algunos casos a células individuales dispersadas, o zonas de surgimiento de raíces laterales o extendiéndose completamente a lo largo de la longitud de raíces más antiguas. Raíces transgénicas que sobreexpresaban el gen AVR9-elicited_111 B regulado por el promotor PcUbi4 constitutivo (RBM019) o el promotor Super constitutivo (RTP1124) desarrollaron raíces más gruesas y más cortas y números reducidos de raíces laterales en relación con líneas control.

Lista de secuencias

<110> BASF Plant Science GmbH

<120> RESISTENCIA A NEMATODOS ESPECÍFICOS DE RAÍCES DE PLANTAS

<130> PF61259 - 15242 5 <140> Documento USSN 61/201.471

<141>

<160> 60

<170> Patente ln versión 3.4

<210> 1 10 <211> 762

<212> ADN

<213> Glycine max

<400> 1

15 <210> 2

<211> 253

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 2

<210> 3

<211> 750 <212> ADN

<213> Glycine max

<400> 3

<210> 4

<211> 249

<212> PRT

<213> Glycine max 10 <400> 4

<210> 5

<211> 744

<212> ADN

<213> Glycine max

<400> 5

<210> 6

<211> 247

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 6

<210> 7

<211> 750

<212> ADN

<213> desconocido

<220>

<223> Secuencia sintética

<400> 7

10 <210> 8

<211> 249

<212> PRT

<213> Desconocido

<220> 15 <223> Secuencia sintética

<400> 8

<210> 9

<211> 750

<212> ADN

<213> Populus tremula x Populus tremuloides

<400> 9

<210> 10

<211> 249

<212> PRT

<213> Populus tremula x Populus tremuloides

<400> 10

<210> 11

<211> 738

<212> ADN

<213> Populus trichocarpa

<400> 11

<210> 12

<211> 245

<212> PRT

<213> Populus trichocarpa

<400> 12

<210> 13

<211> 723

<212> ADN

<213> Brassica napus

<400> 13

<210> 14

<211> 240

<212> PRT 10 <213> Brassica napus

<400> 14

<210> 15

<211> 786

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 15

<210> 16

<211> 261

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 16

<210> 17

<211> 843

<212> ADN

<213> Solanum tuberosum

<400> 17

<210> 18

<211> 280

<212> PRT

<213> Solanum tuberosum

<400> 18

<210> 19

<211> 747

<212> ADN

<213> Solanum tuberosum

<400> 19

<210> 20

<211> 248 10 <212> PRT

<213> Solanum tuberosum

<400> 20

<210> 21

<211> 759

<212> ADN

<213> Solanum lycopersicon

<400> 21

<210> 22

<211> 252

<212> PRT

<213> Solanum lycopersicon

<400> 22

<210> 23

<211> 798

<212> ADN

<213> Nicotiana benthamiana

<400> 23

<210> 24

<211> 265

<212> PRT

<213> Nicotiana benthamiana

<400> 24

<210> 25

<211> 792

<212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

<400> 25

<210> 26

<211> 263

<212>

PRT 10 <213> Nicotiana tabacum

<400> 26

<210> 27

<211> 663

<212> ADN

<213> Medicago truncatula

<400> 27

<210> 28

<211> 220

<212> PRT

<213> Medicago truncatula

<400> 28

<210> 29

<211> 663

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 29

<210> 30

<211> 220

<212>

PRT 10 <213> Arabidopsis thaliana

<400> 30

<210> 31

<211> 792

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 31

<210> 32

<211>

263 10 <212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 32

<210> 33

<211> 657

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 33

<210> 34

<211>

218 10 <212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 34

<210> 35

<211> 738

<212> ADN

<213> Vitis vinifera

<400> 35

<210> 36

<211>

245 10 <212> PRT

<213> Vitis vinifera

<400> 36

<210> 37

<211> 681

<212> ADN

<213> Glycine max

<400> 37

<210> 38

<211> 226

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 38

<210> 39

<211> 696 <212> ADN

<213> Glycine max

<400> 39

<210> 40

<211> 231

<212> PRT

<213>

Glycine max 10 <400> 40

<210> 41

<211> 679

<212> ADN

<213> Lotus japonicus

<400> 41

<210> 42

<211> 226

<212> PRT

<213> Lotus japonicus

<400> 42

<210> 43

<211> 699

<212> ADN

<213> Vigna unguiculata

<400> 43

<210> 44

<211> 232

<212> PRT

<213>

Vigna unguiculata 10 <400> 44

<210> 45

<211> 702

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Secuencia sintética

<400> 45

<210> 46

<211> 233

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Secuencia sintética

<400> 46

<210> 47

<211> 783

<212> ADN

<213> Medicago truncatula

<400> 47

<210> 48

<211> 260

<212> PRT 10 <213> Medicago truncatula

<400> 48

<210> 49

<211> 576

<212> ADN

<213> Glycine max

<400> 49

<210> 50

<211> 191

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 50

<210> 51

<211> 576

<212> ADN

<213> Glycine max

<400> 51

<210> 52

<211> 191

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 52

<210> 53

<211> 570

<212> ADN

<213> Vigna unguiculata

<400> 53

<210> 54

<211> 189

<212> PRT

<213> Vigna unguiculata

<400> 54

<210> 55

<211> 570

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Secuencia sintética

<400> 55

<210> 56

<211> 189

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> Secuencia sintética

<400> 56

<210> 57

<211> 1999

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> promotor

<222> (1)..(1999)

<400> 57

<210> 58

<211> 609

<212> ADN

<213> Glycine max

<220>

<221> promotor

<222> (1)..(609)

<400> 58

<210> 59

<211> 1476

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana 15 <220>

<221> promotor

<222> (1)..(1476)

<400> 59

<210> 60

<211> 325

<212> ADN

<213> Petroselinum crispum

<400> 60

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método de preparación de una planta transgénica resistente a nematodos, comprendiendo el método las etapas de:

   a) proporcionar un vector de expresión recombinante que comprende un promotor específico de raíz en 5 asociación operativa con un polinucleótido que codifica para una proteína de tipo AVR9-elicited_111B que comprende los aminoácidos 1 a 226 de SEQ ID NO: 38;

   b) transformar una célula vegetal con el vector de expresión recombinante;

   c) regenerar plantas transgénicas a partir de la célula vegetal transformada; y

   d) seleccionar plantas transgénicas que demuestran una resistencia aumentada a la infección por 10 nematodos parásitos de plantas en comparación con plantas de tipo natural que no comprenden el vector de expresión recombinante.
2. 2. Planta transgénica resistente a nematodos que comprende un vector de expresión recombinante que comprende un promotor específico de raíz en asociación operativa con un polinucleótido que codifica para una proteína rica en serina-arginina que comprende los aminoácidos 1 a 226 de SEQ ID NO: 38.

   15 3. Semilla que es una línea pura para un transgén que comprende un vector de expresión recombinante que comprende un promotor específico de raíz en asociación operativa con un polinucleótido que codifica para una proteína de tipo AVR9-elicited_111B que comprende los aminoácidos 1 a 226 de SEQ ID NO: 38.