MX2011001453A

MX2011001453A - Composicion farmaceutica para el tratamiento y prevencion de canceres.

Info

Publication number: MX2011001453A
Application number: MX2011001453A
Authority: MX
Inventors: Shinichi Kobayashi; Takanori Saito; Takayoshi Ido; Fumyoshi Okano
Original assignee: Toray Industries
Priority date: 2008-08-05
Filing date: 2009-08-05
Publication date: 2011-04-14
Also published as: US20110256144A1; RU2498819C2; WO2010016526A1; KR20160085372A; PL2322221T3; CA2733223A1; PT2322221E; KR101638490B1; US20180312603A1; US9416192B2; ES2502940T3; BRPI0911926A2; CA2733223C; AU2009278386A1; US9982059B2; MX341883B; EP2322221A4; US20160208014A1; JP5930004B2; JPWO2010016526A1

Abstract

Se describe una composición farmacéutica para tratar y/o prevenir cáncer. La composición farmacéutica comprende, como un ingrediente activo, un anticuerpo capaz de reaccionar de manera inmunológica con la proteína CAPRIN-1 o un fragmento de la misma que comprende siete o más residuos contiguos de aminoácido o un fragmento del anticuerpo.

Description

COMPOSICION FARMACEUTICA PARA EL TRATAMIENTO Y PREVENCION DE CANCERES Campo de la Invención La presente invención se refiere a un nuevo uso médico de anticuerpos a CAPRIN-1 o fragmentos de los mismos, por ejemplo, como agentes terapéuticos y/o preventivos para cáncer .

Antecedentes de la Invención El cáncer es la causa principal de muerte.

Actualmente el tratamiento realizado para cánceres principalmente terapia quirúrgica, que se puede combinar con terapia de radiación o quimioterapia. A pesar del desarrollo de nuevos métodos quirúrgicos y del descubrimiento de nuevos agentes anti-cáncer, en años recientes, los resultados del tratamiento de cánceres no han mejorado en su mayor parte en la actualidad excepto por algunos cánceres. A través de un reciente progreso de la biología molecular e inmunología de cáncer, se han identificado anticuerpos que son específicamente reactivos con cánceres, antígenos de cáncer reconocidos por células T citotóxicas, así como los genes que codifican para los antígenos de cáncer, y se han formulado esperanzas para inmunoterapias específicas que tienen como objetivo antígenos de cáncer (Tsuyoshi AKIYOSHI, "Gan To Kagaku-Ryoho (Cáncer ADN Chemotherapy) " , . 24, páginas 551- REF: 217529 519 (Jp) (Cáncer ADN Chemotherapy Publishers, Inc., Japón)).

En los métodos de tratamiento de cáncer, a fin de reducir los efectos secundarios, es deseable que los péptidos, polipéptidos o proteínas reconocidas como antígenos de cáncer estén ausentes en casi todas las células normales pero específicamente presente en las células de cáncer. En 1991, Boon et al del Ludwig Institute en Bélgica aislaron el antígeno MAGE 1 de melanoma humano reconocido por células T CD8 -positivas por el método de clonación de expresión de A Dcusando una línea de células de cáncer autólogo y células T reactivas a cáncer (Bruggen P. et al., Science, 254:1643-1647 (1991) ) . Posteriormente, se reportó el método SEREX (identificación serológica de antígenos por clonación de expresión recombinante) en donde usando la técnica de clonación de expresión génica se pueden identificar antígenos tumorales reconocidos por anticuerpos producidos a través de la respuesta a un cáncer autólogo en el cuerpo de un paciente con cáncer (Proc. Nati. Acad. Sci . EUA, 92:11810-11813 (1995); y Patente de los Estados Unidos No. 5,698,396). Por el método SEREX, se aislaron algunos antígenos de cáncer, que sustancialmente no se expresan en las células normales sino que se expresan específicamente en las células de cáncer. (Int. J. Cáncer, 72: 965-971 (1997); Cáncer Res., 58: 1034-1041 (1998); Int. J. Cáncer, 29: 652-658 (1998); Int. J. Oncol., 14: 703-708 (1999); Cáncer Res., 56: 4766-4772 (1996); y Hum. Mol. Genet 6: 33-39, 1997). Adicionalmente , se han llevado a cabo ensayos clínicos de terapias celulares que usan inmunocitos que reacciona de manera específica con antígenos de cáncer, que son algunos de los antígenos aislado de cáncer, e inmunoterapias específicas a cáncer que usan vacunas que comprenden los antígenos de cáncer o similares.

Entre tanto, en años recientes, han estado en existencia una variedad de medicinas de anticuerpos para tratamiento de cáncer que tienen como objetivo proteínas de antígeno en las células de cáncer. Estas medicinas usadas como agentes terapéuticos específicos de cáncer, exhiben eficiencia de fármaco a un cierto grado, y de este modo están ganando atención. Sin embargo, la mayoría de las proteínas de antígenos diana también se expresan en células normales. Como resultado de la administración de anticuerpos, se pueden dañar no solo las células de cáncer, sino también las células normales en las cuales se ha expresado un antígeno diana, provocando de este modo un efecto secundario (o adverso) , que llega a ser problemático. Por lo tanto, se espera que, si llega a ser posible identificar antígenos de cáncer que se expresen de manera específica en la superficie de una célula de cáncer y se usen anticuerpos que tengan como objetivo o diana estos antígenos como medicamentos, entonces se puede lograr el tratamiento con medicinas de anticuerpos que provoquen menos efectos secundarios.

La proteína 1 citoplásmica y asociada a proliferación (CAPRIN-1) es una proteína intracelular que se expresa cuando las células normales en fase de reposo se activan o se someten a división celular. También se sabe que CAPRIN-1 está comprendida en la regulación del trasporte y traducción de los ARNm a través de la formación de gránulos de esfuerzo citoplásmico con ARN en una célula. La CAPRIN-1 tiene diferentes nombres, tal como proteína 1 de membrana anclada a GPI y proteína del marcador 1 superficial de componente de membrana (MUSI) , puest^ que esta proteína se conoce que es una proteína de membrana. Estos diferentes nombres se derivan del reporte (J. Biol . Chem., 270: 20717-20723, 1995) que la secuencia génica de CAPRIN-1 tiene originalmente una región de unión a GPI y la CAPRIN-1 es una proteína de membrana expresada en células de cáncer de colon. Posteriormente se reportó que la secuencia génica de CAPRIN-1 descrita en este reporte no fue correcta; es decir, tomó lugar un cambio de cuadro por la supresión de un nucleótido individual de la secuencia génica de CAPRIN-1, actualmente registrada con el GenBank o similar, de modo que suprimieron 80 aminoácidos del C-terminal y el artefacto resultante (74 aminoácidos) fue la porción de unión a GPI en el reporte; y también estuvo presente otro error en el lado 5' de la secuencia génica, dando por resultado este modo la supresión de 53 aminoácidos del N-terminal (J. Immunol., 172: 2389- 2400, 2004). Adicionalmente, se ha reportado que la proteína codificada por la secuencia génica de CAPRIN-1 actualmente registrada con el GenBank o similar no fue una proteína de membrana celular (J. Immunol., 172: 2389-2400, 2004).

Además, en base al reporte de J. Biol. Chem., 270: 20717-20723, 1995 que CAPRIN-1 es una proteína de membrana celular, US2008/0075722 y O2005/100998 describen que CAPRIN-1 bajo el nombre de MUSI se puede usar para terapia de cáncer como un objetivo o diana de medicinas de anticuerpo para terapia de cáncer y como una de las proteínas de membrana celular; sin embargo, los ejemplos no contienen descripción de la terapia de cáncer usando un anticuerpo contra la proteína. Sin embargo, como se reporta en J. Immunol., 172: 2389-2400, 2004, fue una creencia común, desde el momento de la presentación de US2008/0075722 hasta ahora, que CAPRIN-1 no se expresa la superficie de la célula, y de esta manera, es obvio que los contenidos de US2008/0075722 y WO2005/100998 basado solo en la mala información que CAPRIN-1 es una proteína de membrana celular, no se deben de entender como conocimiento técnico común de las personas expertas en la técnica.

Breve Descripción de la Invención Problema que se va a Solucionar por la Invención Un objeto de la presente invención es identificar proteínas de antígeno de cáncer expresadas específicamente en la superficie de células de cáncer y proporcionar el uso de anticuerpos que tienen como objetivo estas proteínas como agentes terapéuticos y/o preventivos (o profilácticos) para cáncer .

Medios para Solucionar el Problema Como resultado de estudios intensivos, los presentes inventores ahora han obtenido ANDcque codifica para una proteína que se une a un anticuerpo presente en el suero de un organismo que tiene un tumor por el método SEREX usando bibliotecas de ANDcderivadas de tejido testicular y suero de perros con cáncer de mama. Con el uso de los genes caninos obtenidos y genes homólogos a éstos de humano, bovino, caballo, ratón y pollo, ahora se han preparado proteínas CAPRIN-1 que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en los números pares de SEQ ID NOS: 2 a 30 (es decir, SEQ ID NOS: 2 a 30 de números pares) y anticuerpos contra las proteínas CAPRIN-1. Además, los presentes inventores han encontrado ahora que CAPRIN-1 se expresa de manera específica en las células de cáncer de mama, tumor de cerebro, leucemia, linfoma, cáncer de pulmón, cáncer esofágico, cáncer de colon, cáncer gástrico, y cáncer de riñon, y que las porciones de las proteínas CAPRIN-1 se expresan de manera específica la superficie de esta células de cáncer. Adicionalmente, los presentes inventores han encontrado que los anticuerpos contra las porciones de CAPRIN-1 expresadas en las superficies de células de cáncer pueden dañar (o deteriorar) las células de cáncer que expresan CAPRIN-1. Estos hallazgos han conducido a la consumación de la presente invención.

Por lo tanto, la presente invención tiene las características como se describe a continuación.

La presente invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de un cáncer, que comprende, como un ingrediente activo, un anticuerpo o un fragmento del mismo, que tiene una reactividad inmuno.lógica con una proteína CAPRIN-1 que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de la SEQ ID NOS: 2 a 30 de números pares o una secuencia de aminoácidos que tiene 80 % o más, de manera preferente 85 % o más, de manera más preferente 90 % o más, y de manera adicionalmente preferente 95 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NOS: 2 a 30 de números pares, o con un fragmento de la proteína CAPRIN-1 que comprende 7 o más aminoácidos consecutivos .

En una modalidad de la presente invención, el cáncer es cáncer de mama, tumor de cerebro, leucemia, linfoma, cáncer de pulmón, cáncer esofágico, cáncer de colon, cáncer gástrico (o estómago), o cáncer de riñon.

En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o policlonal.

En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de cadena individual o un anticuerpo biespecífico .

En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo que tiene una reactividad inmunológica con un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 136 o una secuencia de aminoácidos que tiene 80 % o más, de manera preferente 85 % o más, de manera más preferente 90 % o más, y adicionalmente de manera preferente 95 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos, o con un fragmento de polipéptido.

En otra modalidad de la presente invención, la composición farmacéutica para tratamiento y/o prevención de un cáncer que comprende el anticuerpo como un ingrediente activo, el anticuerpo anterior es cualquiera de los anticuerpos (a) a (k) descritos más adelante y tiene una reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1. (a) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 40, 41, y 42 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 44, 45, y 46. (b) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 40, 41, y 42 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 50( 51, y 52. (c) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 40, 41, y 42 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 55, 56, y 57. (d) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 40, 41, y 42 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 60, 61, y 62. (e) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 40, 41, y 42 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 65, 66, y 67. (f) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 70, 71, y 72 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 74, 75, y 76. (g) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 80, 81, y 82 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 84, 85, y 86. (h) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS : 90, 91, y 92 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 94, 95, y 96. (i) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 100, 101, y 102 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 104, 105, y 106. (j) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 110, 111, y 112 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 114, 115, y 116. (k) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 120, 121, y 122 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 124, 125, y 126.

Efectos de la Invención Los anticuerpos contra CAP IN-1 usados en la presente invención dañan (o deterioran) células de cáncer.

Por lo tanto, estos anticuerpos contra CAPRIN-1 son útiles para el tratamiento o prevención de cánceres.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra patrones de expresión de genes que codifican para proteínas CAPRIN-1 en tejido normales y líneas de células tumorales. En esta Figura, la referencia no. 1 muestra el patrón de expresión de cada gen codificador de CAPRIN-1, y la referencia no. 2 muestra el patrón de expresión del gen de GAPDH.

La Figura 2 muestra la actividad citotóxica de un anticuerpo a CAPRIN-l (o un anticuerpo an i-CAPRIN-1) contra la línea de células de cáncer de mama que expresan el gen de CAPRIN-1 (T47D) . En esta Figura, la referencia no. 3 muestra la actividad después de la adición del anticuerpo anti-CAPRIN-1, la referencia no. 4 muestra la actividad después de la adición de anticuerpo de control, y la referencia no. 5 muestra la actividad en la ausencia de cualquier anticuerpo.

La Figura 3 muestra la actividad citotóxica de un anticuerpo a CAPRIN-1 (o anticuerpo anti -CAPRIN-1) contra la línea de células de cáncer de mama que expresa el gen de CAPRIN-1 (MDA-MB-157) . En esta Figura, la referencia no. 6 muestra la actividad después de la adición del anticuerpo anti-CAPRIN-1, la referencia no. 7 muestra la actividad después de la adición del anticuerpo de control y la referencia no. 8 muestra la actividad en la ausencia de cualquier anticuerpo.

La Figura 4 muestra la citotoxicidad contra la línea de células de cáncer de mama 'MDA-MB-157 que expresa CAPRIN-1, en donde la citotoxicidad se exhibe por los anticuerpos monoclonales a CAPRIN-1 (es decir, los anticuerpos monoclonales #1 a #11) , que son reactivos con la superficie de la célula de cáncer. Específicamente, esta Figura muestra los niveles de actividad después de la adición del anticuerpo monoclonal #1 a CAPRIN-1 (referencia no. 9), el anticuerpo monoclonal #2 a CAPRIN-1 (referencia no. 10) , el anticuerpo monoclonal #3 a CAPRIN-1 (referencia no. 11) , el anticuerpo monoclonal #4 monoclonal a CAPRIN-1 (referencia no. 12) , el anticuerpo monoclonal #5 a CAPRIN-1 (referencia no. 13), el anticuerpo monoclonal #6 a CAPRIN-1 (referencia no. 14) , el anticuerpo monoclonal #7 a CAPRIN-1 (referencia no. 15) , el anticuerpo monoclonal #8 a CAPRIN-1 (referencia no. 16) , el anticuerpo monoclonal #9 a CAPRIN-1 (referencia no. 17), el anticuerpo monoclonal #10 a CAPRIN-1 (referencia no. 18), y el anticuerpo monoclonal #11 a CAPRIN-1 (referencia no. 19) , el nivel de actividad después de la adición de un anticuerpo monoclonal reactivo con la proteína CAPRIN-1, en sí misma, pero no con la superficie de la célula de cáncer (referencia no. 20) , y el nivel de actividad después de la adición de PBS en lugar de cada anticuerpo (referencia no. 21) .

Las Figuras 5a a 5c muestran el efecto antitumoral de los anticuerpos monoclonales a CAPRIN-1 (es decir, los anticuerpos monoclonales #1 a #11) reactivos con la superficie de una célula de cáncer en ratones Balb/c en los cuales se trasplantó la línea de células de carcinoma de ratón CT26 que expresan CAPRIN-1. Estas Figuras muestran los tamaños de tumor de ratón después de la administración del anticuerpo monoclonal #1 a CAPRIN-1 (referencia no . 22) , el anticuerpo monoclona1 #2 a CAPRIN-1 (referencia no . 23) , el anticuerpo monoclonal #3 a CAPRIN- 1 (referencia no . 24) , el anticuerpo monoclonal #4 a CAPRIN- 1 (referencia no . 25) , el anticuerpo monoclonal #5 a CAPRIN- 1 (referencia no . 26) , el anticuerpo monoclonal #6 a CAPRIN-1 (referencia no. 27) , el anticuerpo monoclonal #7 a CAPRIN-1 (referencia no . 28) , el anticuerpo monoclonal #8 a CAPRIN-1 (referencia no . 29) , el anticuerpo monoclonal #9 a CAPRIN- 1 (referencia no . 30) , el anticuerpo monoclonal #10 a CAPRIN-1 (referencia no. 31) y el anticuerpo monoclonal #11 a CAPRIN-1 (referencia no. 32) , el tamaño de tumor de ratón después de la administración de un anticuerpo monoclonal reactivo con una proteina CAPRIN-1, misma, pero no con la superficie de la célula de cáncer (referencia no. 33), y el tamaño de tumor de ratón después de la administración de PBS en lugar de cada anticuerpo (referencia no. 34) .

Las Figuras 6a a 6c muestran el efecto antitumoral de los anticuerpos monoclonales a CAPRIN-l (es decir, los anticuerpos monoclonales #1 a #11) reactivos con' la superficie de una célula de cáncer, en ratones Balb/c en los cuales se trasplantó la línea de células NIE de carcinoma de ratón que expresan CAPRIN-1. Estas Figuras muestran los tamaños de tumor de ratón después de la administración del anticuerpo monoclonal #1 a CAPRIN- 1 (referencia no . 35) , el anticuerpo monoclonal #2 a CAPRIN- 1 (referencia no . 36) , el anticuerpo monoclonal #3 a CAPRIN- 1 (referencia no . 37) , el anticuerpo monoclonal #4 a CAPRIN- 1 (referencia no . 38) , el anticuerpo monoclonal #5 a CAPRIN- 1 (referencia no . 39) , el anticuerpo monoclonal #6 a CAPRIN- 1 (referencia no . 40) , el anticuerpo monoclonal #7 contra CAPRIN-1 (referencia no . 41) , el anticuerpo monoclonal #8 contra CAPRIN-1 (referencia no. 42) , el anticuerpo monoclonal #9 contra CAPRIN-1 (referencia no. 43) , el anticuerpo monoclonal #10 a CAPRIN-1 (referencia no. 44) , y el anticuerpo monoclonal #11 contra CAPRIN-1 (referencia no. 45) , el tamaño de tumor de ratón después de la administración de un anticuerpo monoclonal reactivo con una proteína CAPRIN-1 misma pero no con la superficie de la célula de cáncer (referencia no. 46) , y el tamaño de tumor de ratón después de la administración de PBS en lugar de cada anticuerpo (referencia no. 47) .

Descripción Detallada de la Invención Como se describe más adelante, la actividad antitumoral de los anticuerpos al polipéptido mostrado en cualquiera de las SEQ ID NOS: 2 a 30 de números pares, usado en la presente invención, se puede valuar al examinar in vivo la inhibición del crecimiento tumoral en un animal que tiene un tumor, o al examinar in vitro sí o no se exhibe actividad citotóxica mediada por inmunocitos o por complemento contra células tumorales que expresan el polipéptido.

Además, las secuencias de nucleótidos de los polipéptidos que codifican para las proteínas que consisten de las secuencias de aminoácidos mostradas en los SEQ ID NOS: 2 a 30 de números pares (es decir, SEQ ID NOS: 2, 4, 6...28, y 30) se muestran en la SEQ ID NOS: 1 a 29 de número impares (es decir, SEQ ID NOS: 1, 3, 5...27, y 29), respectivamente.

Las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NOS: 6, 8, 10, 12 y 14 en el listado de secuencias descrito de acuerdo a la presente invención son las secuencias de aminoácidos de las proteínas CAPRIN-1, que se aislaron, por el método SEREX usando bibliotecas de ANDcderivadas de tejido testicular canino y sueros de perros con cáncer de mama, como polipéptidos capaces de unirse a los anticuerpos que existen específicamente en los sueros de perros que tiene tumor; las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NOS: 2 y 4 son las secuencias de aminoácidos de las proteínas CAPRIN-l aisladas como homólogos humanos de los polipéptidos de perro; la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 16 es la secuencia de aminoácido de la proteína CAPRIN-1 aislada como un homólogo bovino del polipéptido de perro; la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 18 es la secuencia de aminoácidos de la proteína «-CAPRIN-1 aislada como un homólogo equino del polipéptido de perro; las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NOS: 20 a 28 (de números pares) son las secuencias de aminoácidos de las proteínas CAPRIN-1 aisladas como homólogos murinos de los polipéptidos de perro; y la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 30 es la secuencia de aminoácidos de la proteína CAPRIN-1 aislada como un homólogo de pollo del polipéptido de perro (ver Ejemplo 1 descrito más adelante) . Se conoce que CAPRIN-1 se expresa cuando toma lugar la activación o división celular de células normales en la fase de reposo.

Se conoce que CAPRIN-1 no se expresó en la superficie de células. Sin embargo, como resultado del examen con respecto a la presente invención, ahora se ha revelado que ciertas porciones de la proteína CAPRIN-1 se expresa de las superficies de varias células de cáncer. De acuerdo a la presente invención, se usa de manera preferente un anticuerpo que se une a una porción dentro de la proteína CAPRIN-1 expresada en las superficies de células de cáncer. los ejemplos de los péptidos parciales dentro de la proteína CAPRIN-1 expresada en la superficie de células de cáncer, incluyen polipéptidos que consisten de una secuencia de 7 o más aminoácidos consecutivos en la región de los residuos de aminoácido Nos. (o los aminoácidos (aa) ) 50-98 o los residuos de aminoácido Nos. (aa) 233-305 en una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de los SEQ ID NOS: 2 a 30 de números pares, excluyendo SEQ ID NOS: 6 y 18, en el Listado de Secuencias. Los ejemplos específicos de esto incluyen la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 37 o 136 (de manera preferente, la región de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 137 o 138 en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 136) , o una secuencia de aminoácidos que tiene 80 % o más, de manera preferente 85 % o más, de manera más preferente 90 % o más, y además de manera preferente 95 % o más de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos. Los anticuerpos de la presente invención incluyen todos los anticuerpos capaces de unirse a los péptidos anteriores y que tienen actividad antitumoral.

Los anticuerpos a, CAP IN-1 útiles en la presente invención como se describe anteriormente pueden ser cualquier tipo de los mismos, en tanto que puedan exhibir actividad antitumoral. Los ejemplos de los mismos incluyen anticuerpos monoclonales , anticuerpo policlonales , anticuerpos sintéticos, anticuerpos multiespecíficos , anticuerpo humanos, anticuerpo humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadena individual (scFV) , y fragmentos de los mismos tal como Fab y F(ab' )2- Estos anticuerpos y fragmentos de los mismos se pueden preparar por métodos conocidos por la persona experta en la técnica. La presente invención, son deseables anticuerpos capaces de unirse de manera específica a una proteína CAPRIN-1. Estos anticuerpos son de manera preferente anticuerpos monoclonales ,- sin embargo, en tanto que se pueden producir de manera estable a anticuerpos homogéneos, también se pueden usar anticuerpos policlonales . Además, si el sujeto es un humano, es deseable un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado a fin de evitar o inhibir el inmunorechazo .

El texto "que se une de manera específica a una proteína CAPRIN-1" como se usa en la presente significa que un anticuerpo de interés se une de manera específica a la proteína CAPRIN-1 y no se une de manera sustancial a otras proteínas .

Como se describe más adelante, la actividad antitumoral de un anticuerpo usando en la presente invención se puede evaluar al examinar in vivo la inhibición del crecimiento tumoral en animal que tiene un tumor o al examinar in vitro sí o no se exhibe actividad citotóxica mediada por inmunocitos o por complemento contra células tumorales que expresan el polipéptido.

Además, los sujetos en necesidad de tratamiento y/o de prevención de cáncer de acuerdo a la presente invención son mamíferos tal como humanos, animales de compañía, animales de ganado o animales deportivos. El sujeto preferido es un humano.

Ahora se explicará a continuación la producción de antígenos, la producción de anticuerpos, y composiciones farmacéuticas, relacionadas a la presente invención.

Producción de Antígenos Usados para Producción de Anticuerpos Las proteínas o fragmentos de las mismas, usadas como antígenos sensibilizadores para obtener anticuerpos a CAPRIN-1, usados en la presente invención, no se limitan en términos de sus orígenes tal como animales que incluye, por ejemplo, humanos, canino, bovinos, caballos, ratones, ratas, y pollos. Sin embargo, de manera preferente estas proteínas o fragmentos de las mismas se seleccionan en vista de la compatibilidad con las células de origen usadas para la fusión celular. Las proteínas derivadas de mamíferos en general son preferibles y de manera particular se prefieren proteínas derivadas de humano. Por ejemplo, si la CAPRIN-1 es una CAPRIN-1 humana, se puede usar una proteína CAPRIN-1 de humano, un péptido parcial de la misma, o células capaces de expresar CAPRIN-1 de humano.

Las secuencias de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos de CAPRIN-1 humana y homólogos de la misma se pueden obtener por ejemplo al tener acceso al GenBank (NCBI, EUA) y al usar el algoritmo BLAST o FASTA (Karlin y Altschul, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 90:5873-5877,1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997).

De acuerdo con la presente invención, cuando la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: l o 3) o la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2 o 4) de CAPRIN-1 humana se usa como una secuencia base, los objetivos o dianas son ácidos nucleicos o proteínas que consisten cada uno de una secuencia que tiene 70 % a 100 %, de manera preferente 80 % a 100 %, de manera más preferente 90 % a 100 %, y de manera adicionalmente preferente 95 % a 100 % (por ejemplo, 97 % a 100 %, 98 % a 100 %, 99 % a 100 %, o 99.5 % a 100 %) de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos o la secuencia de aminoácidos del ORP o porción madura de la secuencia base de nucleótidos o secuencia base de aminoácidos. El término "% de identidad de secuencia" como se usa en la presente significa un porcentaje (%) del número de aminoácidos idénticos (o nucleótidos) al número total de aminoácidos (o nucleótidos) en el caso que se alineen dos secuencias tal que se pueda lograr similitud máxima con o sin introducción de separaciones.

Los fragmentos de una proteína CAPRIN-1 tienen longitudes que varían desde la longitud de aminoácidos de un epítopo (o un determinante antigénico) , que es la unidad más pequeña de un antígeno reconocida por un anticuerpo, a menos de la longitud completa de la proteína. El epítopo se refiere a un fragmento de polipéptido que tiene antigenicidad o inmunogenicidad en mamíferos y de manera preferente en humanos. La unidad más pequeña del fragmento de polipéptido consiste de aproximadamente 7 a 12 aminoácidos, y por ejemplo de, 8 a 11 aminoácidos. Un ejemplo específico de esto es la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 137, o SEQ ID NO: 138, o una secuencia de aminoácidos que tiene 80 % o más, de manera preferente 85 % o más, de manera más preferente 90 % o más, y de manera adicionalmente preferente 95 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos.

Los polipéptidos que comprenden la proteína CAPRIN- 1 humana, mencionada anteriormente, y péptidos parciales de la misma, se pueden sintetizar de acuerdo a métodos de síntesis química tal como el método Fmoc (método de fluorenilmetiloxicarbonilo) o el método de tBoc (método de t-butiloxicarbonilo) (the Japanese Biochemical Society (ed.), "Biochemical Experimentation Course {Seikagaku Jikken Koza) 1", Protein Chemistry IV, Chemical Modification ADN Peptide Synthesis, Kagaku-dojin Publishing Company, Inc. (Japón), 1981) . También, se pueden sintetizar por métodos generales usando una variedad de sintetizadores peptídicos comercialmente disponibles. Además, los polipéptidos de interés se pueden obtener al preparar polinucleótidos que codifican para los polipéptidos anteriores usando métodos conocidos de ingeniería genética (Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd edition, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, etc.), que incorporan cada uno de los polipéptidos en un vector de expresión e introducen el vector en una célula hospedadora, permitiendo de este modo que la célula hospedadora produzca el polipéptido. De esta manera, se pueden obtener los polipéptidos deseados.

Los polinucleótidos que codifican para los polipéptidos mencionados anteriormente se pueden preparar fácilmente por técnicas conocidas de ingeniería genética o por métodos generales usando sintetizadores comercialmente disponibles de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 se puede preparar por PCR usando una biblioteca de ADN o ANDcde cromosomas humanos como una plantilla y un par de cebadores diseñados para permitir la amplificación de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1. Se pueden determinar apropiadamente las condiciones de PCR. Por ejemplo, estas condiciones pueden comprender llevar a cabo 30 ciclos de los pasos de reacción (como un ciclo) que consiste de: 94 °C, 30 segundos (desnaturalización) ; 55°C, 30 segundos a 1 minuto (fijación); y 72°C,r 2 minutos (alargamiento) usando una ADN-polimerasa termoestable (por ejemplo Taq polimerasa) en un amortiguador de PCR que contiene Mg2+, seguido por reacción a 72°C durante 7 minutos después del término de los 30 ciclos. Sin embargo, la presente invención no se limita a las condiciones de PCR ejemplificadas anteriormente. Las técnicas y condiciones de PCR se describen, por ejemplo, en Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd edition, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995) , John Wiley & Sons (Capítulo 15, en particular) .

Además, se puede aislar el ADN deseado al preparar sondas y cebadores apropiados en base a la información acerca de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos mostradas en SEQ ID NOS: 1 a 30 en el Listado de Secuencias descrito en la presente, y al examinar una biblioteca de ANDcde humano o similar con el uso de estas sondas y cebadores. De manera preferente, la biblioteca de ANDcse produce de una célula, órgano, o tejido en el cual se exprese la proteína con cualquiera de la SEQ ID NOS : 2 a 30 de números pares. Los ejemplos de la célula o tejido incluyen células o tejidos de testículos y cánceres o tumores, tal como leucemia, cáncer de mama, linfoma, tumor de cerebro, cáncer de pulmón, y cáncer de colon. Las operaciones tal como preparación de sonda o cebadores, construcción de bibliotecas de cADN, examen de bibliotecas de cADN, y clonación de genes de interés, como se describe anteriormente, se conocen por la persona experta en la técnica, y se puede llevar a cabo de acuerdo por ejemplo a los métodos descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning, the 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989) y Ausbel et al. (ibid.) . Los ADN que codifican para la proteína CAPRIN-1 humana y péptidos parciales de la misma se pueden obtener de los ADN obtenidos de esta manera.

Las células hospedadoras descritas anteriormente pueden ser cualquier célula, en tanto que puedan expresar los polipéptidos descritos anteriormente. Un ejemplo de célula hospedadora procariótica incluye, pero no se limita a, Escherichia coli. Los ejemplos de células hospedadoras eucarióticas incluyen, pero no se limitan a, células mamíferas tal como célula de riñon de mono (COSI) , célula de ovario de hámster chino (CHO) , línea de células de riñon embriónico humano (HEK293) , y línea de células de piel embriónica de ratón (NIH3T3) , células de levadura tal como levadura de germinación y células de levadura en división, células de gusano de seda y células de huevos de Xenopus .

Cuando se usan las células procarióticas como células hospedadoras, se puede usar un vector de expresión que tiene un origen replicable en células procarióticas, un promotor, un sitio de unión a ribosoma, un sitio de multiclonación, un terminador, un gen de resistencia a fármacos, un gen complementario auxotrófico, o similares. Como vectores de expresión para Escherichia. coli, se pueden ejemplificar vectores de pUC, pBluescriptII, sistemas de expresión de pET, sistemas de expresión de pGEX, y similares. Un ADN que codifica para el polipéptido anterior se incorpora en este vector de expresión, una célula hospedadora procariótica se transforma con el vector, y entonces la célula transformada obtenida de este modo se cultiva, de modo que se puede expresar el polipéptido codificado por el ADN en la célula hospedadora procariótica. En este momento, el polipéptido también se puede expresar como una proteína de fusión con otra proteína.

Cuando se usan células eucarióticas como las células hospedadoras , se pueden usar vectores de expresión para células eucarióticas que tienen un promotor, una región de empalme, un sitio de adición poli (A) , o similares. Los ejemplos de estos vectores de expresión incluyen pKAl, pCDM8 , pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, vector EBV, pRS, pcAD 3 , y pYES2. Por procedimientos similares a aquellos mencionados anteriormente, un ADN que codifica para el polipéptido mencionado anteriormente se incorpora en este vector de expresión, se transforma una célula hospedadora eucariótica con el vector, y entonces se cultiva la célula transformada, obtenida de este modo, de modo que el polipéptido codificado por el ADN anterior se puede expresar en la célula hospedadora eucariótica. Cuando se usa pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-Nl, pEGFP-Cl, o similares como un vector de expresión, se puede expresar el polipéptido anterior como una protelna de fusión con una marca tal como la marca His (por ejemplo, (His)6 a (His)i0) , marca FLAG, marca myc, marca HA, o GFP.

Para la introducción de un vector de expresión en una célula hospedadora, se pueden emplear métodos bien conocidos, tal como electroporación, un método de fosfato de calcio, un método de liposoma, un método de DEAE-dextrano, microinyección, infección viral, lipofección, y unión con un péptido permeable a membrana celular.

El aislamiento y purificación de un polipéptido de interés de las células hospedadoras se puede realizar usando técnicas conocidas de aislamiento, en combinación. Los ejemplos de estas técnicas conocidas incluyen, pero no se limitan a, tratamiento usando un agente desnaturalizante tal como urea o un agente tensioactivo, tratamiento con ultrasonido, digestión enzimática, salación, fraccionamiento y precipitación con solvente, diálisis, centrifugación, ultrafiltración, filtración en gel, SDS-PAGE, electroforesis de enfoque isoeléctrico, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, cromatografía de afinidad, y cromatografía de fase inversa.

Estructura del Anticuerpo En general, los anticuerpos son glicoproteínas heteromultiméricas que comprenden cada una al menos dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Entre tanto, los anticuerpos excepto por IgM son glicoproteínas heterotetraméricas (aproximadamente 150 kDa) cada una que comprende dos cadenas ligera (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Típicamente, cada cadena ligera está conectada a una cadena pesada mediante un enlace individual covalente de disulfuro. Sin embargo, el número de enlace de disulfuro entre las cadenas pesadas varía entre diferentes isotipos de inmunoglobulina . Cada una de la cadena pesada de cadena ligera tiene también enlaces intracadena de disulfuro. Cada cadena pesada tiene un dominio variable (región VH) en un extremo de la misma, al cual se unen en serie algunas regiones constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (región VL) en un extremo de la misma y tiene una región constante individual en el extremo opuesto de la misma. La región constante de una cadena ligera se alinea con la primera región constante de una cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera se alinea con el dominio variable de cadena pesada. Una región específica de un dominio variable de anticuerpo, que se llama "región determinante de complementariedad (CDR)", exhibe variabilidad específica para impartir especificidad de unión a un anticuerpo. Una porción relativamente conservada en una región variable se llama una "región menos variable (FR) " . Un dominio variable de cadena pesada o cadena ligera, completo comprende 4 FR conectadas entre sí mediante 3 CDR. Cada CDR se llama "CDRH1" , "CDRH2" , y "CDRH3", respectivamente, en el orden desde el N-terminal en una cadena pesada. De manera similar, para una cadena ligera, se llaman "CDRL1" , "CDRL2" , y "CDRL3" , respectivamente. CDRH3 juega el papel más importante en términos de la especificidad de unión de anticuerpo-antígeno . Además, las CDR en cada cadena se retienen por regiones FR en el estado que están cercanas entre sí, y contribuyen a la formación de sitios de unión de anticuerpo-antígeno con la CDR en una cadena correspondiente. Las regiones constantes no contribuyen directamente a la unión de anticuerpo-antígeno. Sin embargo, exhiben varias funciones efectoras tal como asociación con citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) , fagocitosis a través de la unión a un receptor de Fcy, vida media/velocidad de depuración mediante un receptor Fe neonatal (FcRn) , y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) mediante un componente Clq en la cascada de complemento.

Producción de Anticuerpos El término "anticuerpo anti-CAPRIN-1" usado en la presente invención se refiere a un anticuerpo que tiene una reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1 de longitud completa o un fragmento de la misma.

El término "reactividad inmunológica" usado en la presente indica las características de un anticuerpo que se une in vivo a un antígeno de CAPRIN-1. La función dañadora de tumor (por ejemplo, muerte, inhibición o regresión) se puede expresar como resultado de esta unión. De manera específica, se puede usar cualquier tipo de anticuerpo, en la presente invención, en tanto que el anticuerpo pueda unirse a una proteína CAPRIN-1 para dañar un tumor o un cáncer tal como leucemia, linfoma, cáncer de mama, tumor de cerebro, cáncer de pulmón, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer de riñón, o cáncer de colon.

Los ejemplos de estos anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales , anticuerpos sintéticos, anticuerpos multiespecífieos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadena individual, y fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Fab y F(ab' >2) . Además, los ejemplos de clases arbitrarias de inmunoglobulina de estos anticuerpos incluyen IgG, IgE, IgM, igA, IgD e IgY, y los ejemplos de subclases arbitrarias de inmunoglobulina incluyen IgGl, IgG2, IgG3 , IgG , IgAl e IgA2.

Adicionalmente los anticuerpos se pueden modificar mediante acetilación, formilación, amidación, fosforilación, o pegilación (PEG) , además de glicosilación .

A continuación se describen ejemplos de producción para una variedad de anticuerpos .

En un caso en el cual un anticuerpo de interés es un anticuerpo monoclonal, se administra una línea de células SK-BR-3 de cáncer de mama que expresa CAPRIN-1 o similar a ratones para inmunización, seguido por extracción de bazos de los ratones . Las células se separan de cada bazo y entonces se fusionan con células de mieloma de ratón. De las células de fusión (hibridoma) obtenidas se seleccionan clones capaces de producir un anticuerpo que tiene acción de inhibición de crecimiento de células de cáncer. Se aisla y se cultiva un hibridoma que produce anticuerpos monoclonales que tiene acción de inhibición de crecimiento de células de cáncer. Se puede preparar un anticuerpo de interés mediante la purificación del sobrenadante de cultivo por un método general de purificación por afinidad.

También, por e emplo, de la manera descrita más adelante, se puede producir un hibridoma productor de anticuerpos monoclonales. Primero, se inmuniza un animal con un antígeno sensibilizador mediante un método conocido. En un método general, se lleva a cabo la inmunización al inyectar de manera intraperitoneal o subcutánea un antígeno sensibilizador en un mamífero. De manera específica, se diluye un antígeno sensibilizador con, o se suspende en, PBS (Solución Salina Amortiguada con Fosfato) , solución salina fisiológica o similar a una cantidad resultante apropiada. Si se desea, con esta se mezcla una cantidad apropiada de un adyuvante convencional (por ejemplo, adyuvante completo de Freund) . Después de que toma lugar el emulsionamiento, lo resultante se administra a un mamífero varias veces cada 4 a 21 días. Además, se puede usar un portador adecuado para inmunización con un antxgeno sensibilizador.

Como se describe anteriormente, después de la inmunización de un mamífero y la confirmación de un incremento en el nivel deseado de anticuerpos en suero, se recolectan los inmunocitos del animal y se someten a fusión celular. Los ejemplos particularmente preferibles de inmunocitos son los esplenocitos .

Se usan células de mieloma mamíferos como las células pertinentes de origen sometidas a fusión con los inmunocitos anteriores. Para estas células de mieloma, se usan de manera preferente los varios ejemplos siguientes de líneas de células conocidas: P3U1 (P3-X63Ag8Ul) , P3 (P3X63Ag8.653) (J. Immunol (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology ADN Inmunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. y Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976). 6, 511-519), MPC-11 (Margulies . D.H. et al, Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S.J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), y R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979)277, 131-133).

Básicamente, la fusión celular de inmunocitos y células de mieloma, descrita anteriormente se puede llevar a cabo de acuerdo a un método conocido tal como el método de Kohler y Milstein et al. (Kohler, G. y Milstein, C. Methods Enzymol. (1981)73, 3-46).

De manera más específica, la fusión celular descrita anteriormente se lleva a cabo en la presencia de un promotor de la fusión celular en una solución convencional de cultivo que contiene nutrientes, a manera de ejemplo. Los ejemplos de un promotor de fusión que se va a usar incluyen polietilenglicol (PEG) y virus Sendai (HVJ: virus hemaglutinante de Japón) . Si se desea, adicionalmente se puede adicionar un adyuvante tal como dimetilsulfóxido para la mejora de la eficiencia de fusión.

Se puede determinar de manera arbitraria la proporción de inmunocitos usados a aquella de células de mieloma. Por ejemplo, la relación de inmunocitos a células de mieloma es de manera preferente 1:1 a 10:1. Los ejemplos de una solución de cultivo que se puede usar para la fusión celular descrita anteriormente incluyen solución de cultivo RPMI1640 y una solución de cultivo MEM adecuada para el crecimiento de las líneas anteriores de celulares de mieloma, así como otras soluciones convencionales de cultivo usadas para esta clase de cultivo celular. Adicionalmente, se puede usar un reemplazo de suero tal como suero de becerro fetal (FCS) en combinación con esto.

Para la fusión celular, los inmunocitos y células del mieloma, anteriores, se mezclan de manera suficiente a cantidades predeterminadas en la solución de cultivo. A esto se adiciona una solución de PEG (por ejemplo, peso molecular promedio: aproximadamente 1000 a 6000) que se ha calentado en lo anterior a aproximadamente 37°C a una concentración en general de 30 % a 60 % (p/v) , seguido por mezclado. Esto da por resultado la formación de hibridomas de interés . De manera subsiguiente, los pasos operativos de la adición secuencial de una solución apropiada de cultivo y de la remoción del sobrenadante mediante centrifugación se llevan a cabo de manera repetida para remover los agentes de fusión celular y similares que no son preferibles para el crecimiento de hibridomas.

Los hibridomas obtenidos de este modo se cultivan en una solución convencional de cultivo de selección tal como una solución de cultivo HAT (una solución de cultivo que comprende hipoxantina, aminopterina y timidina) para selección. El cultivo en esta solución de cultivo HAT se lleva a cabo de manera continua durante un período suficiente de tiempo (en general varios días o varias semanas) para la muerte de células (células ño fusionadas) diferente de los hibridomas de interés. Entonces, se emplea un método convencional de dilución limitante para examinar los hibridomas que producen anticuerpos de interés y para llevar a cabo clonación individualmente.

Adicionalmente, también es posible obtener hibridomas productores de anticuerpos humanos que tienen la actividad deseada (por ejemplo, actividad de inhibición de crecimiento celular) de la siguiente manera, así como para obtener los hibridomas anteriores mediante inmunización de animales no humanos con antígenos. Los linfocitos humanos (por ejemplo, linfocitos humanos infectados con virus de EB) se sintetizan in vitro con una proteína, células que expresan proteína, o un lisado de esto y los linfocitos sensibilizados se fusionan con células de miéloma derivadas de humano que tienen la capacidad de dividirse de manera permanente (por ejemplo, U266) (registro no. TIB196) .

Los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales , producidos como antes, se pueden sub-cultivar en una solución convencional de cultivo. Además, se pueden conservar en nitrógeno líquido durante un periodo prolongado de tiempo .

De manera específica, se lleva a cabo la inmunización usando un antígeno deseado o células que expresan un antígeno deseado como los antígenos sensibilizadores de acuerdo a un método convencional de inmunización. Los inmunocitos obtenidos se fusionan con células conocidas, de origen, por un método convencional de fusión celular. Entonces, se examinan las células (hibridomas) productoras de anticuerpos monoclonales mediante un método convencional de examen. De esta manera, se puede llevar a cabo la producción de anticuerpos.

Otros ejemplos de anticuerpos que se pueden usar en la presente invención incluyen anticuerpos policlonales . Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos policlonales de la manera descrita más adelante.

Se obtiene suero al inmunizar animales pequeños tal como ratones, ratones productores de anticuerpos humanos, o conejos con una proteína CAPRIN-1 que se presenta de forma natural, una proteína CAPRIN-1 recombinante que se ha expresado como una proteína fusionada con GST o similar en un microorganismo, tal como Escherichia coli, o un péptido parcial del mismo. El suero se purifica mediante precipitación con sulfato de amonio, cromatografía en columna de proteína A/proteína G, cromatografía de intercambio iónico DEAE, cromatografía de columna de afinidad con una columna a la cual se acopla una proteína / CAPRIN-1 o un péptido sintético, o una técnica similar para la preparación de anticuerpos policlonales. En los ejemplos descritos más adelante, se produjo un anticuerpo policlonal de conejo, y se confirmaron los efectos antitumorales del mismo, este anticuerpo que es contra un péptido parcial (con la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 37) de un dominio en una secuencia de aminoácidos de la proteína CAPRIN-1 que se expresa en superficies de células cáncer.

Un ratón productor de anticuerpos humanos, conocido, usado en la presente, es, por ejemplo, un ratón KM (Kirin Pharma/Medarex) o un XenoMouse (Amgen) (por ejemplo, O02/43478 y W002/092812) . Cuando estos ratones se inmunizan proteínas CAPRIN-1 o fragmentos de las mismas, de la sangre se pueden obtener anticuerpos policlonales , humanos, completos. Además, se pueden producir anticuerpos monoclonales humanos por un método de fusionar esplenocitos recolectados de ratones inmunizados con células de mieloma.

Se puede llevar a cabo la preparación de antígeno de acuerdo con un método tal como un método que usa células animales (publicación de patente JP (Kohyo) No. 2007-530068) o un método que usa un baculovirus (por ejemplo, W098/46777) . Si es baja la inmunogenicidad de un antígeno, se une un antígeno a una macromolécula que tiene inmunogenicidad, tal como albúmina. Entonces, el antígeno se puede usar para inmunización.

Además, es posible usar un anticuerpo recombinante génico producido al clonar un gen de anticuerpo de un hibridoma, incorporando el clon en un vector adecuado, introduciendo el vector en un hospedador, y usando una técnica recombinante génica. (Ver, por ejemplo, Cari, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Publicado en el Reino Unido por MAC ILLAN PUBLISHERS LTD, 1990) . Específicamente, se sintetiza A Dcde una región variable (región V) de un anticuerpo a partir de ARNm de un hibridoma con el uso de una transcriptasa inversa. Después de que se obtiene el ADN que codifica para una región V de un anticuerpo de interés, este ADN se liga al ADN deseado que codificación para una región constante (región C) de anticuerpo. Lo resultante es incorpora en un vector de expresión. De manera alternativa, se puede incorporar el ADN que codifica para una región V de anticuerpo en un vector de expresión que comprende ADN de una región C de anticuerpo. Este ADN se incorpora en un vector de expresión de una manera tal que se expresa bajo el control de una región de control de expresión tal como un intensificador o un promotor. Entonces, las células hospedadoras se transforman con ese vector de expresión, permitiendo de ese modo que se exprese el anticuerpo.

Los anticuerpos anti-CAPRIN-1 de la presente invención son preferentemente anticuerpos monoclonales . Sin embargo, pueden ser anticuerpos policlonales, anticuerpos modificadores de -gen (tal como anticuerpos quiméricos y anticuerpo humanizados), y similares.

Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos monoclonales humanos y anticuerpos monoclonales de animales no humanos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de ratón, anticuerpos monoclonales de rata, anticuerpos monoclonales de conejo, anticuerpos monoclonales de pollos) . Se pueden producir anticuerpos monoclonales al cultivar hibridomas obtenidos mediante la fusión de células de mieloma y esplenocitos de mamíferos no humanos (por ejemplo, ratones productores de anticuerpos de ratón o humanos) inmunizados con proteínas CAPRIN-1. En los ejemplos descritos más adelante, se produjeron anticuerpos monoclonales de ratón y se confirmaron los efectos antitumorales de los mismos. Este anticuerpo monoclonal comprende una región variable de cadena pesada (VH) , que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 113, O SEQ ID NO: 123 y una variable (VL) de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 117, O SEQ ID NO: 127. Aquí, la región VH comprende: CDR1 representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 110 o SEQ ID NO: 120; CDR2 representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 111, O SEQ ID NO: 121, y CDR3 representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 102, SEQ . ID NO: 112, O SEQ ID NO: 122. La región VL comprende: CDR1 representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 74, SEC ID NO: 84, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 114, o SEQ ID NO: 124; CDR2 representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 115, o SEC ID NO: 125, y CDR3 representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 116, o SEQ ID NO: 126.

Un anticuerpo quimérico es un anticuerpo producido al combinar secuencias de diferentes animales. Un ejemplo de esto es un anticuerpo que consiste de regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo de ratón y regiones constantes de cadena pesada y de cadena ligera de un anticuerpo humano. Este anticuerpo quimérico se puede producir por un método conocido. Por ejemplo, se puede obtener al ligar ADN que codifica para una región V de anticuerpo al ADN que codifica para una región C de anticuerpo humano, incorporando lo resultante en un vector de expresión, e introduciendo el vector en un hospedador para la producción de anticuerpos.

Los anticuerpos policlonales incluyen anticuerpos obtenidos al inmunizar animales productores de anticuerpos humanos (por ejemplo, ratones) con proteínas CAPRIN-1.

Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo modificado, y algunas veces se refiere como un "anticuerpo humano reformado" . Se conoce que se construye un anticuerpo humanizado al trasplantar CDR de un anticuerpo humanizado derivado de animal en regiones determinantes de complementariedad de un anticuerpo humano. También, se conoce para esto una técnica recombinación, génica, general.

De manera específica, una secuencia de ADN diseñada de una manera que permite que la CDR de anticuerpo de ratón se liguen a regiones menos variables (FR) de anticuerpo humano, se sintetiza por el método de PCR usando varios oligonucleótidos preparados de una manera tal que los oligonucleótidos tienen porciones que se traslapan entre sí en un extremo de cada uno. Se puede obtener un anticuerpo humanizado al ligar el ADN obtenido anteriormente al ADN que codifica para una región constante de anticuerpo humano, incorporando lo resultante en un vector de expresión, e introduciendo el vector en un hospedador para la producción de anticuerpos (ver EP-A-239400 y WO96/02576) . Las FR de anticuerpos humano ligadas entre sí mediante CDR se seleccionan en la suposición que las regiones determinantes de complementariedad puede formar un buen sitio de unión a antígeno. Si es necesario, los aminoácidos en las regiones menores variables de una región variable de anticuerpo se pueden sustituir de una manera tal que las regiones determinantes de complementariedad en un anticuerpo humano reformado forman un sitio apropiado de unión al antígeno (Sato, K. et al., Cáncer Research 1993, 53:851-856). Además, las regiones menos variables se pueden sustituir con regiones menores variables de un diferente anticuerpo humano (ver W099/51743) .

Las regiones menos variables de anticuerpo humano ligadas entre sí mediante CDR se seleccionan en la suposición que las regiones determinantes de complementariedad pueden formar buenos sitios de unión al antígeno. Si es necesario, los aminoácidos en las regiones menos variables de una región variable de anticuerpo se pueden sustituir de una manera tal que las regiones determinantes de complementariedad en el anticuerpos humano reformado formen apropiados sitios de unión al antígeno (Sato, K. et al., Cáncer Research 1993, 53 : 851-856) .

Después de que se produce un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado, se pueden sustituir los aminoácidos en una región variable (por ejemplo, FR) o una región constante, por ejemplo, con diferentes aminoácidos.

Aquí, la sustitución de aminoácidos es una sustitución, por ejemplo, de menos de 15, menos de 10, no más de 8, no más de 7 , no más de 6, no más de 5 , no más de 4, no más de 3, o no más de 2 aminoácidos, de manera preferente de 1 a 5 aminoácidos, de manera más preferente 1 o 2 aminoácidos. Un anticuerpo sustituido debe ser funcionalmente equivalente a un anticuerpo no sustituido. La sustitución es de manera preferible a una sustitución conservadora de aminoácidos, que es una sustitución entre aminoácidos que tienen características similares en términos de carga, cadenas laterales, polaridad, aromaticidad y similares. Por ejemplo, se pueden clasificar aminoácidos característicamente similares en los siguientes tipos: aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina) , aminoácidos ácidos (ácido aspártico y ácido glutámico) , aminoácidos polares no cargados (glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, cisteína y tirosina) ; aminoácidos no polares (leucina, isoleucina, alanina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina) , aminoácidos de cadena ramificada (treonina, valina, isoleucina) ; y aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptófano e histidina) .

Un ejemplo de un modificador de anticuerpo es un anticuerpo unido a una molécula tal como polietilenglicol (PEG) . Con respecto a los modificadores de anticuerpo de la presente invención, no se limitan a sustancias que se unen a un anticuerpo. Este modificador de anticuerpo se puede obtener al modificar químicamente un anticuerpo obtenido. Un método de esta modificación se ha establecido ya en el campo relacionado a la presente invención.

La expresión "funcionalmente equivalente" usada en la presente indica una situación en la cual un anticuerpo de interés tiene actividad biológica o bioquímica similar a aquella de un anticuerpo de la presente invención. De manera específica, este anticuerpo tiene la función de dañar tumores y no provoca esencialmente reacción de rechazo cuando se aplica a humanos. Un ejemplo de esta actividad es una actividad de inhibición de crecimiento celular o actividad de unión.

Un método conocido para preparar un polipéptido funcionalmente equivalente a un polipéptido determinado que es bien conocido para la persona experta en la técnica es un método que comprende introducir una mutación en un polipéptido. Por ejemplo, una persona experta en la técnica puede introducir de manera adecuada una mutación en un anticuerpo de la presente invención usando un método de mutagénesis específica del sitio (Hashimoto-Gotoh, T. et al., (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ., y Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer, W. y Fritz, HJ. , (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA., (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 82, 488-492; o Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) o un método similar. De esta manera, se puede preparar un anticuerpo funcionalmente equivalente al anticuerpo de la presente invención.

Un anticuerpo, mencionado anteriormente, capaz de reconocer un epítopo de una proteína CAPRIN-1 reconocida por un anticuerpo anti-CAPRIN-1 se puede obtener por un método conocido por las personas expertas en la técnica. Por ejemplo, se puede obtener por: un método que comprende determinar un epítopo de un proteína CAPRIN-1 reconocida por un anticuerpo anti-CAPRIN-1 por un método general (por ejemplo, correlación de epítopo) y producción de un anticuerpo usando un polipéptido que tiene una secuencia aminoácidos contenida en el epítopo como un inmunógeno; o un método que comprende determinar un epítopo de un anticuerpo producido por un método general y al seleccionar un anticuerpo que tiene un epítopo idéntico a un epítopo de un anticuerpo anti-CAPRIN-1. Aquí, el término "epítopo" se refiere a un fragmento de polipéptido que tiene antigenicidad o inmunogenicidad en mamíferos y, de manera preferente en humanos. La unidad más pequeña de esto consiste de aproximadamente de 7 a 12 aminoácidos y de manera preferente de 8 a 11 aminoácidos.

La constante de afinidad Ka (kasociaCion/Kdisociaci6n) de un anticuerpo de la presente invención es de manera preferente al menos 107 M"1, al menos 108 M"1, al menos 5 x 108 M"1, al menos 109 M"1 , al menos 5 x 109 M"1, al menos 1010 M'1, al menos 5 x 1010 M"1, al menos en 1011 M"1, al menos 5 x 1011 M" \ al menos 1012 M"1, o al menos 1013 M"1.

Un anticuerpo de la presente invención se puede conjugar con un agente antitumoral. La unión entre un anticuerpo y un agente antitumoral puede llevar a cabo mediante un separador que tiene un grupo reactivo a un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo hidroxi, un grupo tiol, o similares (por ejemplo, un grupo de imidil succinato, un grupo formilo, un grupo 2-piridilditio, un grupo maleimidilo, un grupo alcoxicarbonilo, o un grupo hidroxi) .

Los ejemplos de agentes antitumorales incluyen los siguientes agentes antitumorales conocidos en las referencias o similares: paclitaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo, tiotepa, busulfan, improsulfan, piposulfan, benzodopa, carboquona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofos-foramida, trimetilolomelamina, bulatacin, bulatacinona, camptotecina, briostatina, calistatina, criptoficina 1, criptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictiina, espongistatina, clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosf mida, mostaza de uracilo, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, caliqueamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromoraicina, dactinomicina, detorbicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, Adriamicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potfiroraicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, andrógenos tal como calusterona, propionato de drornostañolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona, aminoglutetimida, mitotano, trilostano, ácido frolínico, aceglatona, glicósido de aldofosfamida, ácido aminolevulínico, eniluracilo, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diaziquona, elfornitina, acetato de eliptinio, epotilona, etoglucid, lentinano, lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarubicina, losoxantrona, ácido podofilínico, 2-etilhidrazida, procarbazina, razoxano, rizoxina, esquizofilan, espirogermanio, ácido tenuazónico, triaziquona, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mi obronitol , mitolactol, pipobroman, gacitosina, docetaxel, clorambucilo, gemcitabina, 6-tioguanina, mercaptopurina, cisplatina, oxaliplatino, carboplatino, vinblastina, etopósido, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, novantrona, tenipósido, edatrexato, daunomicina, aminopterina, xeloda, ibandronato, irinotecan, inhibidor de topoisomerasa, difluorometilornitina (DMFO) , ácido retinoico, capecitabina, y sales o derivados farmacológicamente aceptables de los mismos.

De manera alternativa, también es posible unir un isótopo radiactivo tal como 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 175Lu o 176Lu conocido en las referencias y similares a un anticuerpo de la presente invención. Es deseable que estos isótopos radiactivos sean efectivos para el tratamiento tumoral o diagnosis tumoral.

Un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo que tiene una reactividad inmunológica con CAPRIN-1 o un anticuerpo capaz de reconocer de manera específica CAPRIN-1. Este anticuerpo debe ser un anticuerpo que tiene una estructura que permite que un animal al cual se administra el anticuerpo evite completamente o casi completamente una reacción de rechazo. Si el animal es un humano, los ejemplos del anticuerpo anterior incluyen anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos quiméricos de humano-ratón) , anticuerpos de cadena individual, y anticuerpos biespecificos . Este anticuerpo es un anticuerpo recombinante que tiene regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera, derivadas de anticuerpo humano, un anticuerpo recombinante que tiene regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera que consisten cada una de regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) derivadas de anticuerpo de animal no humano, y regiones menos variables derivadas de anticuerpo humano, o un anticuerpo recombinante que tiene regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera derivadas de animal no humano y regiones constantes de cadena pesada y de cadena ligera derivas de anticuerpo humano. Los dos primeros anticuerpos son preferibles.

El anticuerpo recombinante anterior se puede producir de la manera descrita más adelante. El ADN que codifica para un anticuerpo monoclonal contra CAPRIN-1 humana (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humano, un anticuerpo monoclonal de ratón, un anticuerpo monoclonal de rata, un anticuerpo monoclonal de conejo, o un anticuerpo monoclonal de pollo) se clona de una célula productora de anticuerpos, tal como un hibridoma. Los ADN que codifican para una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada del anticuerpo se producen por un método de RT-PCR o similar usando el clon obtenido como una plantilla. De esta manera, las secuencias de una región variable de cadena ligera y de una región variable de cadena pesada o las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 se determinan por el sistema de numeración de Kabat EU (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5- Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991) ) .

Adicionalmente, estos ADN que codificación para regiones variables o ADN que codifican para CDR se producen por una técnica recombinante génica (Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) o un sintetizador de ADN. Aquí, se puede producir el hibridoma anterior, productor de anticuerpos monoclonales humanos, al inmunizar un animal productor de anticuerpos humanos (por ejemplo, un ratón) con CAPRIN-l humana y al fusionar esplenocitos del bazo removido del animal con células de mieloma. Además de lo anterior, si es necesario, las ADN que codifican para las regiones variables de cadena ligera o de cadena pesada derivadas del anticuerpo humano, y las regiones constantes, se producen por una técnica recombinante génica o un sintetizador de ADN.

En el caso de un anticuerpo humanizado, se produce el ADN en el cual las secuencias codificadoras de CDR en un ADN que codifica para una región variables de cadena ligera o de cadena pesada derivada de anticuerpo humano, se han sustituidos con las correspondientes secuencias codificadoras de CDR de un anticuerpo de un animal no humano (por ejemplo, un ratón, una rata o un pollo) . El ADN obtenido como antes se liga al ADN que codifica para una región constante de una cadena ligera o una cadena pesada derivada de anticuerpo humano. De esta manera, se puede producir ADN que codifica para un anticuerpo humanizado.

En el caso de un anticuerpo quimérico, el ADN que codifica para una región variable de cadena ligera o de cadena pesada de anticuerpo de un animal no humano (por ejemplo, un ratón, una rata o un pollo) se liga al ADN que codifica para una región constante de cadena ligera o de cadena pesada derivada de anticuerpo humano. De esta manera, se puede producir ADN que cosifica para un anticuerpo quimérico.

Un anticuerpo de cadena individual es un anticuerpo en el cual una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera se ligan linealmente entre sí mediante un ligador. Se puede producir ADN que codifica para un anticuerpo de cadena individual al unir ADN que codifica para una región variable de cadena pesada, ADN que codifica para un ligador, y un ADN que codifica para una región variable de cadena ligera. Aquí, una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera son aquellas de un anticuerpo humano o aquellas de un anticuerpo humano en el cual las CDR se han sustituido solo con CDR de un anticuerpo de un animal no humano (por ejemplo, un ratón, una rata o un pollo) . Además, el ligador consiste de 12 a 19 aminoácidos. Un ejemplo de esto es (G4S)3 que consiste de 15 aminoácidos (G.B Kim et al., Protein Engineering Design y Selection 2007, 20 (9) : 425-432) .

Un anticuerpo biespecífico (diacuerpo) es un anticuerpo capaz de unirse específicamente a dos epítopos diferentes en los cuales, por ejemplo, el ADN que codifica para una región A variable de cadena pesada, el ADN que codifica para una región B variable de cadena ligera, el ADN que codifica para una región B variable de cadena pesada, y el ADN que codifica para una región A variable de cadena ligera se unen entre sí en este orden (con la condición que el ADN que codifica para una región B variable de cadena ligera y el ADN que codifica para región B variable de cadena pesada se unen entre sí mediante ADN que codifica para un ligador descrito anteriormente) . De esta manera, se puede producir ADN que codifica para un anticuerpo biespecífico. Aquí, tanto una región variable de cadena pesada como una región variable de cadena ligera son aquellas de un anticuerpo humano o aquellas de un anticuerpo humano en el cual se han sustituidos solo las CDR con las CDR de un anticuerpo de un animal no humano (por ejemplo, un ratón, una rata o un pollo) .

El ADN recombinante producido como antes se incorpora en uno o una pluralidad de vector apropiados . Cada vector se introduce en una célula hospedadoras (por ejemplo, una célula mamlfera, una célula levadura, o una célula insectil) para (co) expresión. De esta manera, se puede producir un anticuerpo recombinante ((P. J. Delves . , ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES . , 1997 WILEY, P. Shepherd y C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD U IVERSITY PRESS; J. W. Goding, Monoclonal Antibodies: Principies ADN Practice., 1993 ACADEMIC PRESS).

Los ejemplos de un anticuerpo de la presente invención producido por el método anterior incluyen los siguientes anticuerpos (a) a (k) . (a) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 40, 41 y 42 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 44, 45, y 46 (y de manera preferente un anticuerpo compuesto de una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 47) . (b) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 40, 41 y 42 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 50, 51, y 52 (y de manera preferente un anticuerpo compuesto de una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 53) . (c) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 40, 41 y 42 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 55, 56, y 57 (y de manera preferente un anticuerpo compuesto de una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 58) . (d) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 40, 41 y 42 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 60, 61, y 62 (y de manera preferente un anticuerpo compuesto de una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 63) . (e) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 40, 41 y 42 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 65, 66, y 67 (y de manera preferente un anticuerpo compuesto de una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 68) . (f) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 70, 71 y 72 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 74, 75, y 76 (y de manera preferente un anticuerpo compuesto de una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 73 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 77) . (g) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 80, 81 y 82 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 84, 85, y 86 (y de manera preferente un anticuerpo compuesto de una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 83 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 87) . (h) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 90, 91 y 92 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 94, 95, y 96 (y de manera preferente un anticuerpo compuesto de una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 93 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 97) . (i) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 100, 101 y 102 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 104, 105, y 106 (y de manera preferente un anticuerpo compuesto de una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 103 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 107) . (j) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 110, 111 y 112 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 114, 115, y 116 (y de manera preferente un anticuerpo compuesto de una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 113 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 117) . (k) Un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 120, 121 y 122 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 124, 125, y 126 (y de manera preferente un anticuerpo compuesto de una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 123 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 127) .

Aquí, las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 40, 41 y 42, las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 70, 71 y 72, las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 80, 81, y 82, las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 90, 91 y 92, las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 100, 101 y 102, las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 110, 111 y 112 , o las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 120, 121, y 122 corresponden a CDRl, CDR2 y CDR3 de regiones variables de cadena pesada de anticuerpo de ratón, respectivamente. Además, las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 44, 45 y 46, la secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 50, 51, y 52, las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 55, 56 y 57 , las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 60, 61, y 62, las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 65, 66 y 67, las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 74, 75 y 76, las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 84, 85 y 86, las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 94, 95 y 96, las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 104, 105, y 106, las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 114, 115 y 116, o las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 124, 125, y 126 corresponden a CDRl, CDR2 y CDR3 de regiones variables de cadena ligera de anticuerpo de ratón, respectivamente.

Además, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de cadena individual, o un anticuerpo biespecífico de la presente invención es, por ejemplo, los siguientes anticuerpos (i) o (ii) (un ejemplo del anticuerpo (a) se describe más adelante) . (i) Un anticuerpo que comprende: una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, 41 y 42 y una secuencia de aminoácidos de una región menos variables derivada de anticuerpos humano, y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, 45 y 46 y las secuencias de aminoácidos de regiones menos variables derivadas de anticuerpo humano (y de manera preferente un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 en una región variable de cadena pesada y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 en una región variable de cadena ligera) . (ii) Un anticuerpo que comprende: una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, 41 y 42 y las secuencias de aminoácidos de regiones menos variables derivadas de anticuerpo humano; una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de anticuerpo humano; una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, 45 y 46 y las secuencias de aminoácidos de regiones menos variables derivadas de anticuerpo humano; y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de derivada de anticuerpo humano (y de manera preferente un anticuerpo que comprende: una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de derivada de anticuerpo humano, una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de derivada de anticuerpo humano) .

Además, las secuencias de regiones variables y constantes de cadena pesada y de cadena ligera de anticuerpo humano se pueden, por ejemplo, NCBI (E.U.A.: GenBank, UniGene, etc.). Por ejemplo, se pueden usar las siguientes secuencias como secuencias de referencia para las correspondientes regiones: la secuencia con registro no. J00228 para una región constante de cadena pesada de IgGl humana, la secuencia con registro no. J00230 para región constante de cadena pesada de IgG2 humana, la secuencia con registro no. X03604 para una región constante de cadena pesada de IgG3 humana, la secuencia con registro no. K01316 para una región constante de cadena pesada de IgG4 human, la secuencia con registro no. V00557, X64135 o X64133 para una región constante de cadena ligera ? humana; y la secuencia con el registro no. X64132 o X64134 para una región constante de cadena ligera ? humana.

Los anticuerpos anteriores tienen de manera preferente actividad citotóxica, exhibiendo de este modo efectos antitumorales .

Además, las secuencias específicas anteriores de las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera y la CDR en un anticuerpo se describen específicamente para ejemplificación. Es obvio que la presente invención no se limita a secuencias particulares . Se produce un hibridoma capaz de producir un diferente anticuerpo humano o un anticuerpo de animal no humano (por ejemplo, un anticuerpo de ratón) contra CAPRIN-1 humana. Se recolecta un anticuerpo moloclonal producido por el hibridoma. Entonces, se determina si o no el anticuerpo obtenido es un anticuerpo de interés, usando como indicadores, la actividad de unión inmunológica y la actividad citotóxica con respecto a CAPRIN-1 humana. De esta manera, se identifica un hibridoma de interés productor de anticuerpos monoclonales . Posteriormente, como se describe anteriormente, los ADN que codifican para regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera de un anticuerpo de interés se producen del hibridoma para determinación de secuencia . Los ADN se usan para producción de diferentes anticuerpos .

Además, el anticuerpo anterior de la presente invención puede ser cualquiera de los anticuerpos (i) a (iv) anteriores que tienen una sustitución, supresión o adición de uno o varios (y de manera preferente, 1 o 2) aminoácidos, de manera particular en una secuencia de región menos variables y/o una secuencia de región constante, en tanto que tenga la propiedad específica de reconocer de manera específica CAPRIN-1. Aquí, el término "varios aminoácidos" indica de 2-5 y de manera preferente dos o tres aminoácidos.

Además, de acuerdo a la presente invención, también se proporciona ADN que codifica para el anticuerpo anterior de la presente invención, ADN que codifica para una cadena pesada o una cadena ligera del anticuerpo, o ADN que codifica para una región variables de cadena pesada o de cadena ligera del anticuerpo. Por ejemplo, en el caso del anticuerpo (a) , los ejemplos este ADN incluyen: ADN que codifica para una región variable de cadena pesada que comprende secuencias de nucleótidos que codifican para las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, 41, y 42, y ADN que codifica para una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de nucleótidos que codifican para las secuencias aminoácidos de SEQ ID NO: 44, 45 y 46.

Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) codificadas por los ADN de las secuencias anteriores son regiones que determinan la especificidad del anticuerpo. Por lo tanto, las secuencias que codifican para las otras regiones (es decir, regiones constantes y regiones menos variables) en un anticuerpo pueden ser secuencias de un anticuerpo diferente. Aquí, los diferentes anticuerpos incluyen anticuerpos de organismos no humanos. Sin embargo, en vista de la reducción, de efectos secundarios, se prefieren anticuerpos derivados de humanos. Es decir, en el caso anterior, las regiones de ADN que codifican para regiones menos variables y las regiones constantes de cadenas pesada y ligera, comprenden de manera preferente secuencias de nucleótidos que codifican para secuencias pertinentes de aminoácidos de un anticuerpo humano.

Además, los diferentes ejemplos de ADN que codifican para un anticuerpo de la presente invención, tal como anticuerpo (a) , incluye un ADN que codifica para una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y ADN en el cual una región que codifica para una región variable de cadena ligera comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47. Aquí, un ejemplo de una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 es la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 48. Además, un ejemplo de una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 es la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 49. También, los ADN anteriores que codifican para regiones constantes de cadena pesada y de cadena ligera comprenden de manera preferente secuencias de nucleótidos que codifican para las correspondientes secuencias de aminoácidos derivadas de anticuerpo humano.

El ADN de la presente invención se puede obtener, por ejemplo, por los métodos mencionados anteriores o por los siguientes métodos. Primero, se prepara ARN total a partir de un hibridoma para un anticuerpo de la presente invención usando un equipo convencionalmente disponible de extracción de RNA. Entonces, se sintetiza ANDccon una transcriptasa inversa usando cebadores aleatorios y similares. Entonces, el ANDcque codifica para un anticuerpo se amplifica por un método de PCR usando como cebadores, oligonucleótidos que tienen secuencia conservadas en regiones variables de genes conocidos de cadena pesada y de cadena ligera de anticuerpo de ratón. Las secuencias que codifican para regiones constantes se pueden obtener al amplificar secuencias conocidas por un método de PCR. La secuencia de nucleótidos del ADN se puede determinar por un método general que comprende, por ejemplo, la incorporación en un plásmido o fago para la determinación de la secuencia.

Se piensa que los efectos antitumorales de un anticuerpo anti-CAPRlN-l usado en la presente invención en células de cáncer que expresan CAPRIN-1, se exhiben a través de mecanismos de las citotoxicidades descritas más adelante.

Las citotoxicidades son citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) mediada por células efectoras contra células que expresan CAPRIN-1 y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) contra células que expresan CAPRIN-1.

Por consiguiente, se puede evaluar la actividad de un anticuerpo anti-CAPRIN-1 usado en la presente invención mediante la determinación ex vivo de la actividad de ADCC o la actividad de CDC a células de cáncer que expresan CAPRIN-1 como se describe específicamente en los ejemplos mencionados más adelante.

Un anticuerpo anti-CAPRIN-1 usado en la presente invención se une a una protelna CAPRIN-1 en una célula de cáncer y exhibe efectos antitumorales en base a la actividad anterior. Por lo tanto, se cree que este anticuerpo es útil para el tratamiento o prevención de cáncer. Específicamente, de acuerdo con la presente invención, se proporciona la composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de cáncer que comprende, como un ingrediente activo, un anticuerpo anti-CAPRIN-1. Cuando se usa un anticuerpo anti-CAPRIN-1 para el propósito de administrar un anticuerpo a humanos (tratamiento de anticuerpo) , se usa de manera preferente en la forma de un anticuerpo humano a un anticuerpo humanizado a fin de reducir la inmunogenicidad.

Además, conforme la afinidad de unión entre un anticuerpo anti-CAPRIN-1 y una proteína CAPRIN-1 en la superficie de una célula de cáncer, llega a ser más alta, se puede exhibir una más fuerte actividad antitumoral por un anticuerpo anti-CAPRIN-1. Por lo tanto, si se puede obtener un anticuerpo anti-CAPRIN-1 que tiene alta afinidad de unión a una proteína CAPRIN-1, se espera que se exhiba aún más fuerte efectos antitumorales . Por consiguiente, llega a ser posible usar este anticuerpo como una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de cáncer. Como se describe anteriormente, para alta afinidad de unión, la constante de afinidad, Ka (kasociaci6n/kdisociación) es de manera preferente al menos 107 NT1, al menos 108 M"1, al menos 5 x 108 M"1, al menos 109 M"1, al menos 5 x 109 "1, al menos 1010 M"1, al menos 5 x 1010 M"1, al menos 1011 M"1, al menos 5 x 1011 M"1, al menos 1012 M"1, o al menos 1013 M"1.

Unión a Células que Expresan el Antígeno La capacidad de un anticuerpo para unirse a CAPRIN-1 se puede especificar mediante el ensayo a unión usando, por ejemplo, ELISA, un método de transferencia Western, inmunofluorescencia, o análisis por citometría de flujo como se describe en los ejemplos.

Tinción Inmunohistoquimica Un anticuerpo que reconoce CAPRIN-1 se puede probar en términos de reactividad con CAPRIN-1 por un método inmunohistoquimico conocido por la persona experta en la técnica usando una sección de tejido congelado, fijada con paraformaldehído O acetona o una sección de tejido, incrustadas en parafina, fijada con paraformaldehído . Esta sección se prepara a partir de un tejido obtenido de un paciente durante la cirugía o un animal que tiene tejido de xenoinjerto que se ha inoculado con una línea de células naturales o de células transfectadas que expresan CAPRIN-l.

Para tinción inmunohistoquímica, se puede teñir un anticuerpo reactivo a CAPRIN-l mediante una variedad de métodos. Por ejemplo, se puede visualizar al hacer reaccionar con un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano o un anticuerpo anti-conejo de cabra. Composición Farmacéutica Un objetivo de la composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de cáncer de la presente invención no se limita de manera particular en tanto que el objetivo o diana sea un cáncer (célula) que expresa al gen de CAPRIN-l.

Tanto el término "tumor" y "cáncer" se usan en la presente para referirse a neoplasma maligno, y de esta manera se usan de una manera indistinta.

Un cáncer que puede ser un objetivo o diana en la presente invención es un cáncer que expresa un gen que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 2 a 30 de números pares o una secuencia parcial que consiste de 7 o más aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos . Los ejemplos preferibles de esto incluyen cáncer de mama, tumor de cerebro, leucemia, cáncer de pulmón, linfoma, mastocitoma, cáncer esofágico y cáncer de colon.

Los ejemplos de estos cánceres específicos incluyen, pero no se limitan a, adenocarcinoma de mama, adenocarcinoma de mama tipo compuesto, tumor mamario maligno mezclado, adenocarcinoma papilar intraductal, adenocarcinoma de pulmón, cáncer de células escamosa, cáncer de células pequeñas, cáncer de células grandes, glioma que es un tumor de tejido neuroepitelial, ependimoma, tumor neuronal, tumor neuroectodérmico embrional, schwannoma, neurofibroma, meningioma, leucemia linfocítica crónica, linfoma, linfoma gastrointestinal, linfoma digestivo, linfoma de células pequeñas a células medianas, cáncer cecal, cáncer de colon ascendente, cáncer de colon descendente, cáncer de colon transversal, cáncer de colon sigmoide, y cáncer rectal.

Además, el animal de la presente invención es un mamífero. Los ejemplos de esto incluyen mamíferos tal como primates, animales de compañía, animales de ganadería, y animales deportivos. Son particularmente preferibles humanos, perros y gatos .

Cuando se usa un anticuerpo, usado en la presente invención, como una composición farmacéutica, se pueden formular por un método conocido por las personas expertas en la técnica. Por ejemplo, se puede usar de manera parenteral en la forma de una inyección parenteral de: una solución aséptica que comprende agua o una solución no de agua farmacológicamente aceptable; o un líquido de suspensión. Por ejemplo, en un. posible caso, se puede formular con el uso combinado de un portador o medio farmacológicamente aceptable y específicamente agua esterilizada, solución salina fisiológica, aceite vegetal, un emulsionador, una suspensión, un agente tensioactivo, un estabilizador, un agente saborizante, un excipiente, un vehículo, un conservador, o un aglutinante de una manera apropiada al mezclar en una forma de dosis unitaria requerida para una formulación farmacéutica aceptable en general. La cantidad de un ingrediente activo en una formulación se determina tal que se puede lograr una dosis apropiada dentro del intervalo indicado.

Una composición aséptica para propósitos de inyección se puede formular de acuerdo con la práctica general de formulación usando un vehículo tal como agua destilada para propósitos de inyección.

Los ejemplos de una solución acuosa para propósitos de inyección incluyen solución salina fisiológica y soluciones isotónicas que comprenden glucosa y otros adyuvantes tal como D-sorbitol, D-manosa, D-manitol, y cloruro de sodio. Esta solución se puede usar con una ayuda apropiada de disolución. Los ejemplos de esta ayuda de disolución incluyen alcoholes tal como etanol y polialcohol, propilenglicol, polietilenglicol, y agentes tensioactivos no iónicos tal como polisorbato 80MR y HCO-60.

Los ejemplos del líquido aceitoso incluyen aceite de ajonjolí y aceite de soya. Este líquido aceitoso se puede usar en combinación con una ayuda de disolución tal como benzoato de bencilo o alcohol bencílico. Además, se puede mezclar con un agente amortiguador tal como solución de amortiguador de fosfato, una solución de amortiguador de acetato de sodio, un agente ablandador tal como clorhidrato de procaína, un estabilizador tal como alcohol bencílico, fenol, o un antioxidante. En general, en una ampolleta adecuada se introduce una solución formulada de inyección.

La composición farmacéutica anterior se administra de manera oral o de forma parenteral. De manera preferente, se administra de manera parenteral. Los ejemplos específicos de formas de dosis incluyen agentes inyectables, agentes intranasalmente administrados, agentes transpulmonarmente administrados, y agentes percutaneamente administrados. Por ejemplo, los agentes inyectables se pueden administrar de manera sistémica o local mediante inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, o inyección subcutánea.

Además, el método de administración se puede determinar de manera apropiada dependiendo de la edad, peso, género y síntomas del paciente. Una dosis individual de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un polinucleótido que codifica para un anticuerpo, se puede seleccionar dentro de un intervalo de, por ejemplo, 0.0001 mg a 1000 mg por kilogramo de peso corporal. De manera alternativa, la dosis se puede seleccionar dentro de un intervalo de, por ejemplo, 0.001 a 100000 mg por peso del paciente; sin embargo, no se limita necesariamente a esto. La dosis y el método de administración se cambian dependiendo de la edad, peso, género y síntomas del paciente. Sin embargo, las personas expertas en la técnica pueden seleccionar de manera apropiada la dosis y el método.

Polipéptido y ADN De acuerdo a la presente invención, se proporcionan adicionalmente los siguientes polipéptidos y ADN para los anticuerpos (a) a (k) descritos anteriormente. (i) Un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 113, y SEQ ID NO: 123, y ADN que codifican para el polipéptido. (ii) Un polipéptido comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 117, y SEQ ID NO: 127, y ADN que codifican para el polipéptido. (iii) ADN que comprende las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO : 78, SEQ ID NO : 88, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 118, y SEQ ID NO: 128. (iv) ADN que comprende las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 64, SEQ ID N4 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO : 109, SEQ ID NO: 119, y SEQ ID NO: 129. (v) Un polipéptido de CDR de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 40, 41, y 42, secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 70, 71, y 72, secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 80, 81, y 82, secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 90, 91, y 92, secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 100, 101, y 102, secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 110, 111, y 112, y secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 120, 121, y 122, y ADN que codifican para el polipéptido. (vi) Un polipéptido de CDR de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 44, 45, y 46, secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 50, 51, y 52, secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 55, 56, y 57, secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 60, 61, y 62, secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 65, 66, y 67, secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 74, 75, y 76, secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 84, 85, y 86, secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 94, 95, y 96, secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS : 104, 105, y 106, secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 114, 115, y 116, y secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 124, 125, y 126, y ADN que codifican para el polipéptido.

Estos polipéptidos de ADN se pueden producir por ' una técnica recombinante génica como se describe anteriormente .

Ej emplos La presente invención se describe más adelante en mayor detalle con referencia a los siguientes ejemplos, aunque el alcance de la presente invención no se limita a esto.

Ejemplo 1: Identificación de nueva proteína de antígeno de cáncer por método SEREX (1) Construcción de Biblioteca de cADN Se extrajo ARN total de un tejido testicular de un perro saludable por un método de guanido ácido-Fenol-Cloroformo y luego se purificó poliA- ARN de acuerdo a protocolos incluidos con el equipo de purificación de ARNm Oligotex-dT30 (Takara Shuzo Co., Ltd.).

Una biblioteca de fagos de ANDcde testículo canino se sintetizó usando el ARNm (5 µg) obtenido de esta manera. La biblioteca de fagos de ANDcse construyó usando un Equipo de Síntesis de cADN, un Equipo de Síntesis de ZAP-cADN, y un Equipo de Clonación ???-ANDcGigapackIII Gold (Stratagene) de acuerdo a los protocolos incluidos con los equipos . El tamaño de la biblioteca de fagos de cADN, construida de esta manera fue de 7.73 x 105 pfu/ral . (2) Examen de Biblioteca de A Dcüsando Suero Se realzó el inmunoexamen usando la biblioteca de fagos de A Dcde testículo canino, construida anteriormente. Específicamente, se infectó el hospedador Escherichia coli (XLl-Blue MRF' ) con el fago en una placa de agarosa NZY (F90 x 15 mm) para obtener 2210 clones. Se cultivaron células de E. coli a 42°C durante 3 a 4 horas para formar placas. La placa se cubrió con una membrana de nitrocelulosa (Hybond C Extra: GE Healthcare Bio-Science) impregnada con IPTG (isopropil^-D-tiogalactosido) a 37°C durante 4 horas, de modo que se indujo la proteína, se expresó, y luego se transfirió a la membrana. De manera subsiguiente, la membrana se recolectó y luego se sumergió en TBS (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, y pH 7.5) que contiene leche descremada en polvo al 0.5 %, seguido por agitación durante la noche a 4°C, suprimiendo de este modo una reacción no específica. El filtro se hizo reaccionar con un suero diluido 500 veces de un paciente canino a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas .

Como el suero anterior de un paciente canino, se usó un suero recolectado de un paciente canino con cáncer de mama. Estos sueros se almacenaron a -80°C y luego se sometieron a pre-tratamiento inmediatamente antes del uso. Un método para el pretratamiento de suero es como sigue. Específicamente, se infectó el hospedador Escherichia coli (XLl-Blue MRF' ) con un fago ? ZAP Express en el cual no se ha insertado gen extraño y luego se cultivó durante la noche en un medio de placa NZY a 37°C. Subsiguientemente, a la placa se adicionó amortiguador (NaHC03 0.2 y pH 8.3) que contiene NaCl 0.5 M, la placa se dejó reposar a 4°C durante 15 horas, y luego se recolectó un sobrenadante como un extracto de Escherichia coli/fago. Entonces, el extracto de Escherichia coli/fago recolectado de esta manera se aplicó a una columna NHS (GE Healthcare Bio-Science) , de modo que se inmovilizó una proteína derivada de Escherichia coli- fago . El suero de un paciente canino se aplicó a la columna con la proteína inmovilizada para la reacción y luego Escherichia coli y un anticuerpo adsorbido al fago se removieron del suero. La fracción del suero que ha pasado a través de la columna se diluyó 500 veces con TBS que contiene leche descremada en polvo al 0.5 %. Lo resultante se usó como un material de inmunoexatnen.

Una membrana sobre la cual se ha transferido el suero tratado y la proteína de fusión anterior, se lavó 4 veces con TBS-T (0.05 % Tween20/TBS) y luego se hizo reaccionar con IgG anti-perro de cabra (anti-Perro de Cabra conjugado con IgG-h+I HRP (BETHYL Laboratories)) diluida 5000 veces con TBS que contiene leche descremada en polvo al 0.5 % como un anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente. Se realizó la detección mediante una reacción de coloración enzimática usando una solución de reacción de NBT/BCIP (Roche) . Las colonias que correspondieron a sitios positivos para una reacción de coloración se recolectaron de la placa de agarosa NZY (F90 x 15 mm) y luego se lisaron en 500 µ? de un amortiguador SM (NaCl 100 mM, MgClS04 10 mM, Tris-HCl 50 mM, 0.01 % de gelatina, y pH 7.5). Hasta que unificaron las colonias positivas a la reacción de coloración, se repitió el examen secundario y el examen terciario de modo que se examinaron 30,940 clones de fago que reacciona con IgG de suero por un método similar a lo anterior. De este modo, se aislaron 5 clones positivos. (3) Búsqueda de Homología para Gen de Antígeno Aislado Para análisis de secuencia de nucleótidos de los 5 clones positivos aislados por el método anterior, se realizó un procedimiento para la conversión de vectores de fago a vectores de plásmido. Específicamente, se prepararon 200 µ? de una solución que contiene el hospedador Escherichia coli (XLl-Blue MRF' ) de modo que la absorbancia OD60o fue de 1.0. La solución se mezcló con 250 µ? de una solución purificada de fago y luego con 1 µ? de un fago auxiliar ExAssist (Stratagene) , seguido por 15 minutos de reacción a 37°C. Se adicionaron tres (3) mi de medio LB y luego el cultivo se realizó a 37°C durante 2.5 a 3 horas. Inmediatamente después del cultivo, la temperatura de la solución se mantuvo a 70°C por baño de agua durante 20 minutos, se realizó la centrifugación a 4°C y 1000 x g durante 15 minutos, y luego el sobrenadante se recolectó como una solución de fagomido. Subsiguientemente, se prepararon 200 µ? de una solución que contiene el hospedador de fagomido Escherichia coli (SOLR) de modo que la absorbancia ODSoo ue de 1.0. La solución se mezcla con 10 µ? de una solución purificada de fago, seguido por 15 minutos de reacción a 37°C. La solución (50 µ?) se sembró en medio de agar LB que contiene ampicilina (concentración final de 50 g ml) y luego se cultivó durante la noche a 37°C. La colonia individual de SOLR transformada se recolectó y luego se cultivó en medio LB que contiene ampicilina (concentración final: 50 µg/ml) a 37°C. Un ADN de plásmido que contiene la inserción de interés se purificó usando un equipo Miniprep de plásmido QIAGEN (QIAGEN) .

El plásmido purificado se sometió a análisis de la secuencia de inserción de longitud completa por un método de desplazamiento de cebador usando el cebador T3 de SEQ ID NO: 31 y el cebador T7 de SEQ ID NO: 32. Como resultado del análisis de secuencia, se obtuvieron las secuencias génicas de SEQ ID NOS: 5, 7, 9, 11, y 13. Se realizó un programa de búsqueda de homología, búsqueda BLAST (http://wTvw.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), usando las secuencias de nucleótidos de los genes y las correspondientes secuencias de aminoácidos (SEQ ID NOS : 6, 8, 10, 12, y 14) . Como resultado de esta búsqueda de analogía con genes conocidos, se reveló que los 5 genes obtenidos codificaron para CAPRIN-1. Con respecto a las regiones que se tradujeron a proteínas, la identidad de secuencia entre los 5 genes fue de 100 % en términos de la secuencia de nucleótidos y 99 % en términos de la secuencia de aminoácidos. También, con respecto a las regiones que se tradujeron a proteínas, la identidad de secuencia entre los genes y los genes que codifican para factores humanos homólogos a esto (homólogos humanos) fue de 94 % en términos de la secuencia de nucleótidos y en el 98 % en términos de la secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos de los homólogos humanos se muestran en SEQ ID NOS: 1 y 3 y la secuencias de aminoácidos de los mismos se muestran en SEQ ID NOS: 2 y 4. También, con respectó a las regiones que se van a traducir a proteínas, la identidad de secuencia entre los genes caninos obtenidos de este modo y un gen que codifica para un homólogo de ganado fue de 94 % en términos de la secuencia de nucleótidos y de 97 % en términos de la secuencia de aminoácidos. La secuencia de nucleótidos del homólogo de ganado se muestra en SEQ ID NO: 15 y la secuencia de aminoácidos del mismo se muestra en SEQ ID NO: 16. Además, con respecto a las regiones que se van a traducir a proteínas, la identidad de secuencia entre los genes que codifican para los homólogos humanos y el gen que codifica para el homólogo de ganado fue de 94 % en términos de secuencia de nucleótidos y varió de 93 % a 97 % en términos de la secuencia de aminoácidos. También, con respecto a las regiones que se van a traducir a proteínas, la identidad de secuencia entre los genes caninos obtenidos y un gen que codifica para un homólogo canino fue de 93 % en términos de la secuencia de nucleótidos y de 97 % en términos de la secuencia de aminoácidos. La secuencia de nucleótidos del homólogo equino se muestra en SEQ ID NO: 17 y la secuencia de aminoácidos del mismo se muestra en SEQ ID NO: 18. Además, con respecto a las regiones que se van a traducir a proteínas, la identidad de secuencia entre los genes que codifican para los homólogos humanos y el gen que codifica para el homólogo equino fue de 93 % en términos de la secuencia de nucleótidos y 96 % en términos de la secuencia de aminoácidos. También, con respecto a regiones que se van a producir a proteínas, la identidad de secuencia entre los genes caninos obtenidos y los genes que codifican para homólogos humanos varió de 87 ¾ a 89 ¾ en términos de la secuencia de nucleótidos y varió de 95 % a 97 % en términos de la secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos de los homólogos de ratón se muestran en SEQ ID NOS: 19, 21, 23, 25, y 27 y las secuencias de aminoácidos de los mismos se muestran en SEQ ID NOS: 20, 22, 24, 26, y 28. Además, con respecto a las regiones que se van a traducir a proteínas, la identidad de secuencia entre los genes que codifican para los homólogos humanos y los genes que codifican para los homólogos de ratón varió de 89 a 91 % en términos de la secuencia de nucleótidos y varió de 95 % a 96 % en términos de la secuencia de aminoácidos. También, con respecto a regiones que se van a traducir a proteínas, la identidad de secuencia entre los genes caninos obtenidos y un gen que codifica para un homólogo de pollo fue de 82 % en términos de la secuencia de nucleótidos y de 87 % en términos de la secuencia de aminoácidos. La secuencia de nucleótidos del homólogo de pollo se muestra en SEQ ID NO: 29 y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra en SEQ ID NO: 30. Además, con respecto a regiones que se van a traducir a proteínas, la identidad de secuencia entre los genes que codifican para los homólogos humanos y el gen que codifica para el homólogo de pollo varió de 81 I a 82 ¾ en términos de la secuencia de nucleótidos y fue de 86 % en términos de la secuencia de aminoácidos . (4) Análisis de Expresión Génica en Cada Tejido Mediante un método de RT-PCR se examinó la expresión de los genes obtenidos por el método anterior en tejidos normales caninos y humanos y varias líneas de células. Se realizó una reacción de transcripción inversa como sigue. Específicamente, se extrajo ARN total de cada tejido (de 50 mg a 100 mg) y cada línea celular (de 5 a 10 x 106 células) usando un reactivo TRIZOL (Invitrogen) de acuerdo a los protocolos anexos al mismo. Se sintetizó ANDcusando el AR total y el sistema de síntesis Superscript First-StrADN para RT-PCR (Invitrogen) de acuerdo a los protocolos incluidos con este. Se realizó la PCR como sigue usando cebadores específicos a los genes obtenidos (SEQ ID NOS: 33 y 34) . Específicamente, se realizó la PCR al repetir 30 veces un ciclo de 94°C/30 segundos, 60°C/30 segundos, y 72°C/30 segundos usando un Thermal Cycler (BIO RAD) y una solución de reacción ajustada a una cantidad total de 25 µ? a través de la adición de cada reactivo y un amortiguador unido (0.25 µ? de una muestra preparada por reacción de transcripción inversa, los cebadores anteriores (2 µ? cada uno), dNTP (0.2 mM cada uno), y 0.65 U de polimerasa ExTaq (Takara Shuzo) ) . Además, los cebadores específicos del gen, mencionados anteriormente, se usaron para amplificar la región entre el nucleótido número 206 y el nucleótido número 632 en la secuencia de nucleótidos (gen canino de CAPRIN-1) de SEQ ID NO: 5 y la región entre el nucleótido número 698 y el nucleótido número 1124 en la secuencia de nucleótidos (gen humano de CAPRIN-1) de SEQ ID NO: 1. Para control de comparación, al mismo tiempo se usaron cebadores específicos de GAPDH (SEQ ID NOS: 35 y 36). Como resultado, como se muestra en la Figura 1, se observó una fuerte expresión en testículos en el caso de tejidos caninos saludables, en tanto que se observó la expresión en tejidos caninos de adenocarcinoma y de cáncer de mama. Adicionalmente, también se confirmó la expresión de homólogos humanos homólogos a los genes obtenidos. Como resultado, de manera similar al caso de genes caninos de CAPRIN-1 se puede confirmar la expresión solo en los testículos en el caso de tejidos normales. Sin embargo, en el caso de células de cáncer, se detectó la expresión en muchos tipos de líneas de células de cáncer, tal como líneas de células de cáncer de mama, tumor de cerebro, leucemia, cáncer de pulmón, y cáncer esofágico. Se confirmó la expresión en un número particularmente grande de líneas de células de cáncer de mama. En base a los resultados, se confirmó que la expresión de CAPRIN-1 no se observó en tejidos normales diferente de aquellos de los testículos en tanto que se expresó CAPRIN-1 en muchas células de cáncer y particularmente en líneas de células de cáncer de mama.

Además, en la Figura 1, la Referencia No. 1 a lo largo del eje longitudinal indica el patrón de expresión de cada uno de los genes identificados anteriormente y la Referencia No. 2 a lo largo del mismo indica el patrón de expresión del gen de GAPDH para control de comparación. (5) Preparación de Anticuerpo Policlonal Contra Péptido Derivado de CAPRIN-1.

Para obtener un anticuerpo que se une a CAPRIN-1, se sintetizó el péptido derivado de CAPRIN (Arg-Asn-Leu-Glu-Lys-Lys-Lys-Gly-Lys-Leu-Asp-Asp-Tyr-Gln (SEQ ID NO: 37)). El péptido (1 mg) como un antígeno se mezcló con una solución de adyuvante incompleto de Freund (IFA) en una cantidad equivalente al péptido. La mezcla se administró de manera subcutánea a un conejo 4 veces cada 2 semanas. De manera subsiguiente, se recolectó sangre, de modo que se obtuvo un antisuero que contiene un anticuerpo policlonal. Adicionalraente, el antisuero se purificó usando un soporte de proteína G (GE Healthcare Bio-Sciences) y luego se obtuvo un anticuerpo policlonal contra el péptido derivado de CAPRIN-1. Además, un anticuerpo obtenido al purificar suero de conejos a los cuales no se ha administrado antígeno con el uso de un soporte de proteína G de la manera descrita anteriormente se designó como un anticuerpo de control. (6) Análisis de Expresión de Proteína de Antígeno de Células de Cáncer Entonces, se examinó sí o no la proteína CAPRIN-1 se expresó en las superficies de células de 7 tipos de líneas de células de cáncer de mama (MDA-MB-157, T47D, MRK-nu-1, MDA-MB-23 IV, BT20, SK-BR-3, y MDA-MB- 231T) en las cuales se ha confirmado fuertemente la expresión del gen de CAPRIN- 1. Cada línea de células de cáncer de mama de humano en las cuales se ha confirmado la expresión del gen (106 células) como se describe anteriormente se centrifugó en un tubo de raicrocentrífuga de 1.5-ml. El anticuerpo policlonal contra el péptido derivado de CAPRIN-1 (2 µ?) (5µ1) preparado en (5) anterior se adicionó a esto. Lo resultante se suspendió adicionalmente en PBS que contiene 0.1 % de suero bovino fetal (95 µ?) y luego se dejó reposar en hielo durante 1 hora. Después de lavar con PBS, lo resultante se suspendió en PBS que contiene un anticuerpo anti-IgG de conejo, de cabra, marcado con FITC (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) (5 µ?) y 0.1 % de suero bovino fetal (FBS) (95 µ?) y luego se dejó reposar en hielo durante 1 hora. Después de lavaron con PBS, se midió la intensidad de fluorescencia usando FACSCalibur (Becton, Dickinson ADN Company) . En tanto, un procedimiento similar a lo anterior se realizó usando el anticuerpo de control preparado en (5) anterior en lugar del anticuerpo policlonal contra un péptido derivado de CAPRIN-1, de modo que se preparó un control. Como resultado, se encontró que la intensidad de fluorescencia es al menos 30 % más fuerte en todas las células a las cuales se ha adicionado el anticuerpo anti-CAPRiN-l humana que en aquella en células de control. Específicamente, se confirmaron los siguientes incrementos en la intensidad de fluorescencia: MDA-MB-157: 184 %; T47D: 221 %; MRK-nu-1: 115 % ; MDA-MB-231V: 82 %; BT20: 32 ¾ ; SK-BR-3: 279 %; y MDA-MB-23I : 80 %. En base a lo anterior, se confirmó que se expresó la proteina CAPRIN-1 en todas las superficies celulares de la línea anterior de células de cáncer humano. Además, la velocidad de incremento en la intensidad de fluorescencia se representa por la velocidad de incremento en la intensidad fluorescente media (valor de MFI) en las células. Se calculó por la siguiente ecuación.

Velocidad de incremento en intensidad fluorescente media (velocidad de incremento en intensidad de fluorescencia) (%) = ( (valor de MFI de células hechas reaccionar con un anticuerpo anti-CAPRIN-1 humana) - (valor de MFI de control) ) / (valor de MFI de control) x 100 (7) Tinción Inmunohistoquímica (7)-l La expresión de CAPRIN-1 en tejidos normales de ratón y de perro.

Se desangraron ratones (Balb/c, hembras) y perros (perros beagle, hembras) bajo anestesia de éter y anestesia de cetamina/isoflurano . Después de la laparotomía, los órganos (estómago, hígado, glóbulo ocular, glándula timo, músculo, médula ósea, útero, intestino delgado, esófago, corazón, riñon, glándula salival, intestino grueso (colon) , glándula mamaria, cerebro, pulmón, piel, glándula suprarrenal, ovario, páncreas, bazo y vejiga, se transfirieron cada uno a una caja de 10 cm que contiene PBS . Cada órgano se cortó abierto en PBS y luego se sometió a fijación por perfusión durante la noche con amortiguador de fosfato 0.1 M (pH 7.4) que contiene 4 % de paraformaldehído (PFA) . El producto de la perfusión se descartó, la superficie del tejido de cada órgano se enjuagó con PBS, y luego se disolvió en una solución de PBS que contiene 10 % de sacarosa a un tubo de centrífuga de 50-ml. Cada tejido entonces se colocó en cada tubo y luego se agitó usando un rotor a 4°C durante 2 horas. Cada solución se sustituyó con una solución de PBS que contiene 20 % de sacarosa y luego se dejó reposar a 4°C hasta que precipitaron los tejidos. Cada solución se sustituyó con una solución de PBS que contiene 30 % de sacarosa y luego se dejó reposar a 4°C hasta que precipitaron los tejidos. Cada tejido se removió y se escindió una porción necesaria con un escalpelo quirúrgico. Entonces, se aplicó un compuesto de OCT (Tissue Tek) y se extendió sobre cada superficie de tejido, y luego los tejido se colocaron en Cryomold. Se colocó Cryomold en hielo seco para congelación rápida. Los tejidos se cortaron en secciones de 10 a 20 µp? de grueso usando cryostat (LEICA) y luego las secciones cortadas de tejido se secaron al aire en portaobjetos de vidrio durante 30 minutos usando una secadora de pelo, de modo que se prepararon los portaobjetos de vidrio en los cuales se han colocado las secciones cortadas de tejido. Entonces, cada portaobjeto de vidrio se colocó en una botella de tensión rellena con PBS-T (solución salina que contiene 0.05 % de Tween 20), de modo que se realizó 3 veces un procedimiento que comprende intercambio con PBS-T cada 5 minutos . El agua en exceso alrededor de cada espécimen se removió usando Kimwipes y luego cada sección se rodeo usando DAKOPEN (DAKO) . Como soluciones bloqueadoras , se aplicó un reactivo bloqueador de Ig de ratón MOM (VECTASTAIN) sobre el tejido de ratón y sobre el tejido canino se colocó una solución de PBS-T que contiene 10 % de FBS . Los resultantes se dejaron reposar en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 1 hora. Entonces, se preparó una solución que contiene un anticuerpo monoclonal (anticuerpo monoclonal #6) contra CAPRIN-1 que tiene la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 73 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 77 y se hizo reaccionar con las superficies de células de cáncer preparadas en el Ejemplo 4, anticuerpo que se ajustó a una concentración de 10 µg/ml en la solución bloqueadora. La solución se aplicó en cada portaobjeto de vidrio y luego se dejó reposar dentro de una cámara húmeda a 4°C durante la noche. Después de 3 lavadas, cada 10 minutos, con PBS-T, sobre cada portaobjeto de vidrio se aplicó un anticuerpo anti-IgG marcado con biotina MOM (VECTASTAIN) diluido 250 veces con la solución bloqueadora y luego se dejó reposar dentro de una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de 3 lavadas, cada 10 minutos, con PBS-T, se aplicó un reactivo de avidina-biotina ABC (VECTASTAIN) y luego se dejó reposar dentro de una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de 3 lavadas, cada 10 minutos, con PBS-T, se aplicó una solución de tinción de DAB (DAB 10 mg + 30 % d H202 10 µ1/0.05 M Tris-HCl (pH 7.6) 50 mi) luego los portaobjetos de vidrio se dejaron reposar dentro de una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los portaobjetos de vidrio se enjugaron con agua destilada y luego se aplicó un reactivo de hematoxilina (DAKO) . Después de dejar reposar a temperatura ambiente durante 1 minuto, los portaobjetos de vidrio se enjuagaron con agua destiladas. Los portaobjetos de vidrio se sumergieron en soluciones de etanol al 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, y 100 % en este orden durante 1 minuto cada uno y luego se dejaron reposar en xileno durante la noche. Los portaobjetos de vidrio se removieron, se deslizó la cubierta con Medio de Montaje Glycergel (DAKO) , y luego se observó. Como resultado, se observó la expresión de CAPRIN-1 a un grado ligero dentro de las células en todos los tejidos de glándula salival, riñón, colon y estómago, pero nunca se observó la expresión de CAPRIN-1 sobre la superficie celular. También, no se observó para nada la expresión de CAPRIN-1 en tejidos de otros órganos. Además, se obtuvieron resultados similares cuando se usó el anticuerpo monoclonal contra CAPRIN-1 que tiene la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 103 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 107 (anticuerpo monoclonal # 9) . (7) -2 Expresión de CAPRIN-1 en tejido canino en cáncer de mama Con el uso de 108 especímenes congelados de tejido canino de cáncer de mama, de perros diagnosticados por diagnosis patológica como que tienen cáncer maligno de mama, se prepararon cortes de sección congelada por un método similar a lo anterior y se realizó la tinción inmunohistoquímica usando el anticuerpo monoclonal #6 preparado en el Ejemplo 4. Como resultado, se confirmó la expresión de CAPRIN-1 en 100 de entre los 108 especímenes (92.5 %) . CAPRIN-1 se expresó de manera particularmente fuerte en las superficies de células altamente atípicas de cáncer. Además, se obtuvieron resultados similares cuando se usó el anticuerpo monoclonal #9 producido en el Ejemplo 4. (7) -3 Expresión de CAPRIN-1 en tejido humano de cáncer de mama Se realizó la tinción inmunohistoquímica usando 188 especímenes de tejido de cáncer de mama de un arreglo de tejido de cáncer de mama de humano, incrustado en parafina (BIOMAX) . Después de 3 horas de tratamiento a 60°C, el arreglo de tejido de cáncer de mama de humano se adicionó a una botella de tinción rellena con xileno y luego se realizó 3 veces el reemplazo de xileno cada 5 minutos. Entonces, se realizó un procedimiento similar usando etanol y PBS-T en lugar de xileno. El arreglo de tejido de cáncer de mama de humano se adicionó a una botella de tinción rellena con amortiguador de citrato 10 mM (pH 6.0) que contiene 0.05 % de Tween 20, se trató durante 5 minutos a 125°C, y luego se dejó reposar a temperatura ambiente durante 40 minutos o más. Se removió el exceso de agua alrededor de cada espécimen usando Kimwipes, cada sección se rodeó usando DAKOPEN, y luego se adicionó gota a gota una cantidad apropiada de Bloque de Peroxidasa (DAKO) . Lo resultante se dejó reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego se adicionó a una botella de tinción rellena con PBS-T. Se realizó 3 veces el reemplazo de PBS-T cada 5 minutos. Como una solución bloqueadora, se aplicó una solución de PBS-T que contiene 10 % de FBS y luego se dejó reposar dentro de una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 1 hora. Entonces, se preparó una solución que contiene el anticuerpo monoclonal #6 que reacciona con las superficies de células de cáncer preparadas en el Ejemplo 4 a una concentración de 10 pg/ml ajustada usando una solución de PBS-T que contiene 5 % de FBS. La solución se aplicó y luego se dejó reposar durante la noche dentro de una cámara húmeda a 4°C. Después de 3 lavadas, cada 10 minutos, con PBS-T, se adicionó gota a gota una cantidad apropiada de Peroxidasa Marcada, Conjugadas con Polímero (DAKO) , y luego, los portaobjetos de vidrio se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos dentro de una cámara húmeda. Después de 3 lavadas cada 10 minutos, con PBS-T, se aplicó una solución de tinción de DAB (DAKO) y luego se dejó reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos. La solución de tinción de DAB se descartó y luego se realizó de 10 minutos de lavado con PBS-T durante 3 minutos. Los portaobjetos de vidrio se enjuagaron con agua destilada y luego se sumergieron en soluciones de etanol al 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, y 100 % en ese orden durante 1 minuto cada una y luego se dejó reposar en xileno durante la noche. Los portaobjetos de vidrio se removieron, se deslizó la cubierta con Medio de Montaje Glycergel (DAKO) , y luego se observó. Como resultado, se observó una fuerte expresión de CAPRIN-1 para 138 (73 %) de entre los 188 especímenes totales de tejido de cáncer de mama. Además, se obtuvieron resultados similares cuando se usó el anticuerpo monoclonal #9 preparado en el Ejemplo 4. (7) -4 Expresión de CAPRIN-1 en Tumor Maligno de Cerebro Humano Con el uso de 247 especímenes de tejido de tumor maligno de cerebro de arreglos, incrustados en parafina de tejido de tumor maligno de cerebro humano (BIOMAX) , se realizó la tinción inmunohistoquímica por un método similar a aquel en (7) -3 anterior usando el anticuerpo monoclonal #6 preparado en el Ejemplo 4. Como resultado, se observó una fuerte expresión de CAPRIN-1 en 227 (92 %) de entre los 247 especímenes totales de tejido de tumor maligno de cerebro. Además, se obtuvieron resultados similares cuando se usó el anticuerpo monoclonal #9 preparado en el Ejemplo 4. (7) -5 Expresión de CAPRIN-1 en Nodulo Linfático Metastático de Cáncer de Mama de Humano Con el uso de 150 especímenes de tejido de nodulos linfáticos, metastático, de cáncer de mama de humano de arreglos incrustados en parafina de tejido de nodulo linfático metastático de cáncer de mama de humano (BIOMAX) , se realizó la tinción inmunohistoquímica por un método similar a aquel en (7) -3 anterior usando el anticuerpo monoclonal #6 preparado en el Ejemplo 4. Como resultado, se observó una fuerte expresión de CAPRIN-1 en 136 (90 %) de entre los 150 especímenes totales de tejido de nodulos linfáticos metastáticos de cáncer de mama de humano. Específicamente, se reveló que se expresa también fuertemente CAPRIN-1 en un tejido de cáncer que se ha metastatizado de cáncer de mama. Además, se obtuvieron resultados similares cuando se usó el anticuerpo monoclonal #9 preparado en el Ejemplo 4.

Ejemplo 2: Efectos Antitumorales (Actividad de ADCC) de Anticuerpo Contra CAPRIN-1 en Células de Cáncer Entonces, se examinó sí o no un anticuerpo contra CAPRIN-1 será capaz de dañar células tumorales que expresan CAPRIN-1. Se llevó a cabo la evaluación usando el anticuerpo policlonal contra un péptido derivado de CAPRIN-1 de humano, preparado en el Ejemplo 1. Dos tipos de líneas de células de cáncer de mama de humano (T47D y MDA-MB-157) (106 células cada uno) , en las cuales se ha confirmado la expresión de CAPRIN-1, se recolectaron de manera separada en un tubo de centrífuga de 50-ml. Se adicionó cromo 51 (100 iCi) a esto, seguido por incubación a 37°C durante 2 horas. Posteriormente, las células se lavaron 3 veces con un medio RPMI1640 que contiene 10 % de suero de becerro fetal y se adicionó a las concavidades (103 células por concavidad) en placas de fondo V de 96 concavidades. El anticuerpo policlonal anterior contra un péptido derivado de CAPRIN-1 de humano se adicionó a esto (1 por concavidad) .

Adicionalmente, a esto se adicionaron linfocitos separados de sangre periférica de conejo (2 x 105 células por concavidad) , seguido por cultivo bajo condiciones de 37°C y 5 % de C02 durante 4 horas. Después del cultivo, se determinó el nivel de cromo (Cr) 51 liberado de células tumorales dañadas en cada sobrenadante de cultivo. Entonces, se calculó la actividad de ADCC del anticuerpo policlonal contra un péptido derivado de CAPRIN-1 humana a células de cáncer. Como resultado, se confirmaron (ver Figuras 2 y 3) las actividades de ADCC contra T47D (15.4 %) y MDA-MB-157 (17.3 %) . Entre tanto, no se observó sustancialmente actividad en un caso en el cual se realizó un procedimiento similar a lo anterior usando el anticuerpo de control preparado de sangre periférica de un conejo que no se ha inmunizado con un antígeno (Ejemplo 1 (5) ) o un caso en el cual no se adicionó anticuerpo (ver Figuras 2 y 3) . Por consiguiente, se reveló que se pueden dañar células tumorales que expresan CAPRIN-1 al inducir actividad de ADCC con el uso de un anticuerpo contra CAPRIN-1.

Además, para la actividad citotóxica, un anticuerpo contra CAPRIN-1 usado en la presente invención, linfocitos de ratón, y 103 células que incorporan cromo 51 de una línea de células de leucemia, se mezclaron conjuntamente y se cultivaron durante 4 horas. Posteriormente, se determinó el nivel de cromo 51 liberado en el medio. Entonces, se calculó la actividad citotóxica a la línea de células de leucemia por la siguiente ecuación*.

*Ecuación: Actividad citotóxica (%) = [(el nivel de cromo 51 liberado de T47D o MDA-MB-157 al cual se adicionaron un anticuerpo contra CAPRIN-1 y linfocitos de ratón) /(el nivel de cromo 51 liberado de células objetivo a las cuales se adicionó ácido clorhídrico 1N) ) ] x 100 Ejemplo 3: Preparación de Nuevas Proteínas de Antígeno de Cáncer Humano (1) Preparación de Proteína Recombinante Se preparó una proteína recombinante de un gen homólogo humano por el siguiente método basado en el gen de SEQ ID NO: 1 obtenido en el Ejemplo 1. Se realizó la PCR al repetir 30 veces un ciclo de 98°C/10 segundos y 68°C/2.5 minutos usando un Thermal Cycler (BIO RAD) y una solución de reacción ajustada a una cantidad total de 50 µ? a través de la adición de cada reactivo y un amortiguador unido (1 µ? de ANDc (que fue de una variedad de ANDcderivadas de tejido/células, preparados en el Ejemplo 1 y se observó su expresión por RT-PCR) , 2 tipos de cebadores (0.4 µ? cada uno; SEQ ID NOS: 38 y 39) que contienen secuencias de escisión de enzimas de restricción SacI y Xhol, dNTP 0.2 mM, polimerasa PrimeSTAR HS 1.25 U (Takara Shuzo) ) . Los 2 tipos anteriores de cebadores se usaron para amplificar la región que codifica para la secuencia de aminoácidos de longitud completa de SEQ ID NO: 2. Después de la PCR, el ADN amplificado de este modo se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1 ¾ y luego se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 2.1 kbp usando un Equipo de Extracción en gel QIAquick (QIAGEN) .

El fragmento de ADN, purificado, se ligó a una vector de clonación pCR-Blunt (Invitrogen) . El vector se transformó en Escherichia coli y luego se recolectó el plásmido. Se confirmó en base a la secuencia que el fragmento génico amplificado correspondió a la secuencia objetivo. El plásmido que correspondió a la secuencia de interés se trató con las enzimas de restricción y SacI y Xhol y luego lo resultante se purificó usando un Equipo de Extracción en Gel QIAquick. Entonces, la secuencia génica de interés se insertó en un vector de expresión pET30a (Novagen) para Escherichia coli tratada con las enzimas de restricción SacI y Xhol . Usando el vector se puede producir una proteína recombinante fusionada a la marca His. El plásmido se transformó en Escherichia coli BL21 (DE3) para la expresión y luego se realizó la inducción de la expresión usando IPTG 1 mM, de modo que la proteína objetivo se expresó dentro de Escherichia coli. (2) Purificación de Proteina Recombinante Cada Escherichia coli recombinante, obtenida anteriormente, que expresa SEQ ID NO: 1 se cultivó a 37°C en medio LB que contiene 30 ug/ml de canamicina hasta que la absorbancia a 600 nra alcanzó aproximadamente 0.7. Entonces se adicionó isopropil- -D-l-tiogalactopiranosido a una concentración final de 1 mM, seguido por 4 horas de cultivo a 37 °C. De manera subsiguiente, se recolectaron células por 10 minutos de centrifugación a 4800 rpm. El sedimento celular se suspendió en solución salina amortiguada con fosfato y luego se centrifugó a 4800 rpm durante 10 minutos para lavar las células.

Las células se suspendieron en solución salina amortiguada con fosfato y luego se sometieron a tratamiento con ultrasonido en hielo. El lisado de Escherichia coli, tratado de este modo por ultrasonido se centrifugó a 6000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante obtenido de este modo se usó como una fracción soluble y el precipitado obtenido de este modo se usó como una fracción insoluble.

La fracción soluble se adicionó a una columna de quelato de níquel (portador: Sefarosa Queladora (Marca Comercial) Flujo rápido (GE Healthcare) , capacidad de columna: 5 mL, amortiguador de ácido clorhídrico 50 mM (pH 8.0) como amortiguador equilibrado)) preparada de acuerdo a un método convencional . La fracción no adsorbida se lavó con amortiguador de ácido clorhídrico 50 mM (pH 8.0) en una cantidad 10 veces la capacidad de la columna y amortiguador de fosfato 20 mM (pH 8.0) que contiene imidazol 20 mM. Inmediatamente después del lavado, se eluyeron 6 lechos con amortiguador de fosfato 20 mM (pH 8.0) que contiene imidazol 100 mM. Una fracción de elución de amortiguador de fosfato 20 mM (pH 8.0) que contiene imidazol 100 mM (para lo cual mediante tinción Coomassie se ha confirmado la elución de la proteína de interés) se adicionó a una columna de fuerte intercambio aniónico (portador: Sefarosa Q (Marca Comercial) Flujo Rápido (GE Healthcare) , capacidad de columna: 5 mL, y amortiguador de fosfato 20 mM (pH 8.0), amortiguador equilibrado) . La fracción no absorbida se lavó con amortiguador de fosfato 20 mM (pH 7.0) en una cantidad 10 veces la capacidad de la columna y amortiguador de fosfato 20 mM (pH 7.0) que contiene cloruro de sodio 200 mM. Inmediatamente después del lavado, se eluyeron 5 lechos usando amortiguador de fosfato 20 mM (pH 7.0) que contiene cloruro de sodio 400 mM. De esta manera, se obtuvieron fracciones purificadas de proteínas cada una que tiene la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 2. 200 µ? de cada preparación purificada obtenida por el método anterior se distribuyeron en 1 mi de amortiguador de reacción (Tris-HCl 20 mM, NaCl 50 mM, CaCl2 2 mM pH 7.4) y luego se adicionaron 2 µ? de enterocinasa (Novagen) . La preparación se dejó reposar a temperatura ambiente durante la noche para reacción, se escindió la marca, His, y luego se realizó la purificación de acuerdo a los protocolos anexos usando un Equipo de Captura de Escisión de Enterocinasa (Novagen) . Entonces, 1.2 mi de cada preparación purificada obtenida por el método anterior se sustituyó con amortiguador fisiológico de fosfato (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) usando ultrafiltración NANOSEP 10K OMEGA (PALL) . Se realizó la filtración esterilizada usando HT Tuffryn Acrodisc 0.22-µp\ (PALL) y luego los resultantes se usaron para los siguientes experimentos .

Ejemplo 4: Preparación de Anticuerpo Monoclonal Contra CAPRIN-1 La proteína de antígeno (CAPRIN-1 humana) (100 µg) mostrada en SEQ ID NO: 2 preparada en el Ejemplo 3 se mezcló con un adyuvante MPL+TDM (Sigma) en una cantidad equivalente a aquella de la proteína de antígeno. La mezcla se usó como una solución de antígeno por ratón. La solución de antígeno se administró de manera intraperitoneal a ratones Balb/c de 6 semanas de edad (Japan SLC Inc.) y luego se administró adicionalmente 3 veces o 24 veces cada semana para término. de inmunización. Se removió el vaso en el día 3 después de la inmunización final y luego se molió entre dos portaobjetos esterilizados, de vidrio. Cada resultante se lavó con PBS (-) (Nissui) y luego se centrifugó a 1500 rpm durante 10 minutos, de modo que se repitió 3 veces un procedimiento para remover los sobrenadantes. De este modo, se obtuvieron células del bazo. Las células obtenidas de este modo, del bazo, se mezclaron con las células SP2/0 de mieloma de ratón (compradas de ATCC) a una relación de 10:1. La solución de PEG preparada al mezclar 200 µ? de medio RPMI1640 que contiene 10 % de FBS se calentó a 37°C y se adicionaron 800 µ? de PEG1500 (Boehringer) a las células. La solución se dejó reposar durante 5 minutos para fusión celular. Se realizó la centrifugación a 1700 rpm durante 5 minutos para remover los sobrenadantes. Las células se suspendieron en 150 mi del medio RPMI1640 (medio selectivo HAT) que contiene 15 % de FBS, al cual se han adicionado 2 % equivalente de solución HAT (Gibco) y luego se sembró en 15 placas de 96 concavidades (Nunc) a 100 µ? por concavidad. Las células se cultivaron durante 7 días bajo condiciones de 37°C y 5 % de C02, de modo que se obtuvieron hibridomas que resultan de la fusión de células de bazo a células de mieloma.

Se seleccionaron hibridomas usando como un indicador la afinidad de unión del anticuerpo producido por los hibridomas preparados de este modo para la proteína CAPRIN-1. La solución de proteína CAPRIN-1 (1 ug/ml) preparado en el Ejemplo 3 se adicionó a 100 µ? por concavidad de placas de 96 concavidades y luego se dejó reposar a 4°C durante 18 horas. Cada concavidad se lavó 3 veces con PBS-T, se adicionó solución de Albúmina de Suero Bovino (BSA) al 0.5 % (Sigma) a 400 µ? por concavidad, luego las placas se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución se removió y luego cada concavidad se lavó 3 veces con 400 µ? de PBS-T. Cada sobrenadante de cultivo de los hibridomas obtenidos anteriormente se adicionó a 100 µ? por concavidad y luego se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada concavidad se lavó 3 veces con PBS-T, un anticuerpo anti-IgG de ratón (H+L) marcado con HRP (Invitrogen) diluido 5000 veces con PBS se adicionó a 100 µ? por concavidad y luego se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada concavidad se lavó 3 veces con PBS-T, se adicionó una solución de substrato TMB (Thermo) a 100 µ? por concavidad y luego se dejó reposar durante 15-30 minutos, de modo que se realizó una reacción de color. Después del desarrollo del color, se adicionó ácido sulfúrico 1N a 100 µ? por concavidad para retener la reacción. Se midió la absorbancia a 450 nm y la absorbancia 595 nm usando un espectrómetro de absorción. Como resultado, se seleccionaron una pluralidad de hibridomas que producen anticuerpos con altas absorbancias .

Los hibridomas seleccionados de este modo se adicionaron a 0.5 hibridomas por concavidad de placas de 96 concavidades y luego se cultivaron. Después de una semana, se observaron hibridomas que forman colonias individuales en las concavidades . Adicionalmente se cultivaron células en estas concavidades. Se seleccionaron hibridomas usando como un indicador la afinidad de unión (el anticuerpo producido por los hibridomas clonados) para la proteína CAPRIN-1. La solución de proteína CAPRIN-1 (1 ug/ml) preparado en el Ejemplo 3 se adicionó a 100 µ? por concavidad en placas de 96 concavidades y luego se dejó reposar a 4°C durante 18 horas. Cada concavidad se lavó 3 veces con PBS-T, se adicionó una solución de BSA al 0.5 % a 400 µ? por concavidad, y luego se dejó reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución se removió y luego cada concavidad se lavó 3 veces con 400 µ? de PBS-T. Cada sobrenadante de cultivo de los hibridomas obtenidos anteriormente se adicionó a 100 µ? por concavidad y luego se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada concavidad se lavó 3 veces con PBS-T, un anticuerpo anti-IgG de ratón (H+L) marcado con HRP (Invitrogen) diluido 5000 veces con PBS se adicionó a 100 µ? por concavidad y luego se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada concavidad se lavó 3 veces con PBS-T, se adicionó una solución de substrato T B (Thermo) a 100 µ? por concavidad y luego se dejó reposar durante 15-30 minutos, de modo que se realizó una reacción de color. Después del desarrollo de color, se adicionó ácido sulfúrico 1N a 100 µ? por concavidad para retener la reacción. Se midieron la absorbancia a 450 nm y la absorbancia 595 nm usando un espectrómetro de absorción. Como resultado, se obtuvieron 150 líneas de células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales que ejercen actividad con la proteína CAPRIN-1.

Entonces, de entre estos anticuerpos monoclonales, se seleccionaron anticuerpos monoclonales que ejercen reactividad con las superficies de células de cáncer de mama que expresan CAPRIN-1. Específicamente, 106 células de la línea de células MDA-MB-23IV de cáncer de mama de humano se sometieron a centrifugación con un tubo de microcentrífuga de 1.5-ml. El sobrenadante (100 µ?) de cada hibridoma anterior se adicionó y luego se dejó reposar en hielo durante 1 hora. Después de lavar con PBS, se adicionó un anticuerpo anti-IgG de ratón, de cabra marcado con FITC (Invitrogen) diluido 500 veces con PBS que contiene 0.1 % de FBS y luego se dejó reposar en hielo durante 1 hora. Después de lavar con PBS, se midió la intensidad de fluorescencia usando FACSCalibur (Becton, Dickinson ADN Company) . Entre tanto, se realizó un procedimiento similar. A lo anterior usando suero no tratado de ratones Balb/c de 6 semanas de edad diluido 500 veces con un medio de cultivo de hibridoma en lugar del anticuerpo de modo que se preparó un control. Como resultado, se seleccionaron 11 anticuerpos monoclonales (#1 a #11) que tienen una intensidad de fluorescencia más fuerte que aquella del control; es decir, que reaccionan con las superficies de las células de cáncer de mama.

Ejemplo 5: Caracterización de Anticuerpos Seleccionados (1) Clonación de un Gen de Región Variable de Anticuerpo Monoclonal anti-CAPRIN-1 Se extrajeron los ARNm de líneas de células de hibridoma que producen los 11 anticuerpo monoclonales seleccionados en el Ejemplo 4. El gen de región variable (VH) de cadena pesada y el gen de región variable (VL) de cadena ligera para cada anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 se obtuvo por RT-PCR usando cebadores específicos a una secuencia derivada de FR1 de ratón y una secuencia derivada de FR4 de ratón. Para la secuenciación, los genes se clonaron de manera separada en vectores pCR2.1 (Invitrogen) . (1) -1 RT-PCR Se preparó ARNm de cada línea de células de hibridoma (106 células) usando un equipo de micropurificación de ARNm (GE Healthcare) . Cada ARNm obtenido se sometió a transcripción inversa usando un equipo de síntesis de primera hebra SuperScriptII (Invitrogen) para síntesis de cADN. Los procedimientos anteriores se llevaron a cabo de acuerdo a los protocolos anexos a los equipos .

Cada ANDcobtenido se usó para la amplificación del gen de anticuerpo por PCR.

A fin de obtener el gen de la región VH, se usaron un cebador específico a una secuencia de FRl de cadena pesada de ratón (SEQ ID NO: 130) y un cebador específico a una secuencia de FR4 de cadena pesada de ratón (SEQ ID NO: 131) . Además, a fin de obtener el gen de la región VL, se usaron un cebador específico a una secuencia de FRl de cadena ligera de ratón (SEQ ID NO: 132) y un cebador específico a una secuencia de FR4 de cadena ligera de ratón (SEQ ID NO: 133) . Estos cebadores se diseñaron con referencia a Jones, S. T. y Bending, M. M. Bio/Technology 9, 88-89 (1991) . Para PCR, se usó Ex-taq (Takara Bio Inc.). Cada muestra de ANDcse mezcló con un amortiguador 10 x EX Taq (5 µ?) , mezcla de dNTPs (2.5 mM) (4 µ?) , cebadores (1.0 µ?) (2 µ? cada uno), y Ex Taq (5?"/µ1) (0.25 µ?) . El volumen total de ajustó a 50 µ? con agua esterilizada. Se llevó a cabo la PCR bajo condiciones que comprenden, después del tratamiento a 94 °C durante 2 minutos, 30 ciclos de una combinación de desnaturalización a 94°C durante 1 minuto, fijación a 58°C durante 30 segundos, y reacción de alargamiento a 2°C durante 1 minuto. (1) -2 Clonación Cada producto de PCR obtenido anteriormente se sometió a electroforesis en gel de agarosa, seguido por escisión de bandas de ADN de la región VH y la región VL. Se amplificó el ADN usando un equipo de purificación en gel QlAquick (QIAGEN) de acuerdo a los protocolos anexos al equipo. Cada ADN purificado se clonó en un vector pCR2.1 usando un equipo de clonación TA (Invitrogen) . Cada vector ligado a ADN se transformó en células competentes de DH5a (TOYOBO) de acuerdo a un método convencional. Cada transformante (10 clones) se cultivó durante la noche en un medio (100 g/ml de ampicilina) a 37°C. El ADN de plásmido obtenido se purificó usando un equipo Qiaspin Miniprep (QIAGEN) . (l)-3 Secuenciación El análisis de la secuencias génicas de la región VH y de la región VL en cada plásmido obtenido anteriormente se llevó a cabo usando un cebador directo M13 (SEQ ID NO: 134) y un cebador inverso M13 (SEQ ID NO: 135) con un secuenciador fluorescente (ABI; secuenciador de ADN 3130XL) y un equipo de secuenciación en ciclos BigDye terminater Ver. 3.1 (ABI) de acuerdo con los protocolos anexos al equipo. Como resultado, se determinó cada secuencia génica (idéntica en 10 clones) .

Las secuencias de aminoácidos, obtenidas, de las regiones variables de cadena pesada de anticuerpo monoclonal se muestran en SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 113, y SEQ ID NO: 123. Las secuencias . de aminoácidos, obtenidas, de las regiones variables de cadena ligera se muestran en SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 117, y SEQ ID NO: 127.

De manera específica, un anticuerpo monoclonal #1 comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 47. Un anticuerpo monoclonal #2 comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 53. Un anticuerpo monoclonal #3 comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 58. Un anticuerpo monoclonal #4 comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 63. Un anticuerpo monoclonal #5 comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 68. Un anticuerpo monoclonal #6 comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 73 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 77. Un anticuerpo monoclonal #7 comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 83 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 87. Un anticuerpo monoclonal #8 comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 93 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 97. Un anticuerpo monoclonal #9 comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 103 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 107.

Un anticuerpo monoclonal #10 comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 113 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 117. Un anticuerpo monoclonal #11 comprende la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 123 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 127. (2) Expresión de CAPRIN-1 en las superficies celulares de diferentes células provocada con el uso de los anticuerpos monoclonales obtenidos Entonces, se examinó sí se expresó la proteína CAPRIN-1 o no, en las superficies celulares de 7 tipos de líneas de células de cáncer de mama (MDA-MB-157, T47D, MRK-nu-1, MDA-MB-231V, BT20, SK-BR-3, y DA-MB-231T) en las cuales se ha confirmado la expresión génica de CAPRIN-1, 3 tipos de otras líneas de células de cáncer de mama (MDA-MB-231C, MCF-7, y ZR75-1) , 6 tipos de líneas de células de glioma (T98G, SNB19, U251, y U87G) , 3 tipos de líneas de células de cáncer de riñon (Caki-1, Caki2, y A498) , 1 tipo de líneas de cáncer gástrico (MKN45) , 1 tipo de línea de células de cáncer de colon (Caco2) , 3 tipos de líneas de células de cáncer de (A549, QG56, y PC8) , 3 tipos de líneas de células de leucemia (Namalwa, BDCM, y RPI1788) . Cada línea de células (106 células) se centrifugó en un tubo de microcentrífuga de 1.5-ml . Los sobrenadantes de hibridoma (100 µ? cada uno) que contienen lo anticuerpo monoclonales #1 a #10 contra CAPRIN-1 preparados en el Ejemplo 4 que reacciona a la superficie de células de cáncer se adicionaron de manera separada a esto y luego se dejaron reposar en hielo durante 1 hora. Después de lavar con PBS, casa resultante se suspendió en un anticuerpo anti-IgG de ratón, de cabra, marcado con FITC (Invitrogen Corporation) diluido 500 veces con PBS que contiene 0.1 % de FBS y luego se dejó reposar en hielo durante 1 hora. Después de lavar con PBS, se midió la intensidad fluorescente usando FACSalibu (Becton, Dickinson ADN Company) . Entre tanto, se realizó un procedimiento similar a lo anterior usando, como un control, el anticuerpo de control preparado en (5) anterior en lugar de los sobrenadantes de hibridoma que contienen anticuerpos monoclonales #1 a #11 contra CAPRIN-1, de modo que se preparó un control. Como resultado, se encontró que la intensidad de fluorescencia es al menos 30 % más fuerte en todas las células en las cuales se han adicionado los anticuerpos monoclonales #1 a #11 que en aquella en las células de control. De manera específica, se confirmaron los siguientes incrementos en la intensidad de fluorescencia, por ejemplo, cuando se usó el anticuerpo monoclonal #9: MDA-MB-157 : 211 %; T47D: 145 %; MRK-nu-1: 123 %; MDA-MB-231V: 251 %; BT20: 168 %; y MDA-MB-231T : 94 %. En base a lo anterior, se confirmó que la proteína CAPRIN-1 se expresión en la superficie celular de las líneas anteriores de células de cáncer de humano. Además, la velocidad de incremento en la intensidad de fluorescencia se representa por la velocidad de incremento en la intensidad media de fluorescencia (valor de MFI) en las células. Se calculó por la siguiente ecuación.

Velocidad de incremento en intensidad media de fluorescencia (velocidad de incremento en intensidad de fluorescencia) (%) = ( (valor de MFI de células hechas reaccionar con un anticuerpo anti-CAPRIN-1 humana) - (valor de MFI de control) ) / (valor de MFI de control) x 100 (3) Efectos Antitumorales (Actividad de ADCC) de Anticuerpos Contra CAPRIN-1 en Células de Cáncer.

Los anticuerpos monoclonales #1 a #11 seleccionados anteriormente contra CAPRIN-l se valuaron en términos de la actividad citotóxica (actividad de ADCC) a células de cáncer. Los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales #1 a #11 se cultivaron usando un medio SFM de hibridoma (Invitrogen) . Cada sobrenadante obtenido se purificó usando Proteína A-Sefarosa FF Hitrap (GE Healthcare) , seguido por sustitución con PBS (-) y purificación con un filtro de 0.22-µp? (Millipore) . Cada resultante se usó como un anticuerpo para la determinación de la actividad. La linea de células MDA-MB-157 de cáncer de mama de humano (106 células) se recolectó en un tubo de centrífuga de 50-ml. A esto se adicionó cromo 51 (100 µ??) , seguido por incubación a 37°C durante 2 horas. Posteriormente, las células se lavaron 3 veces con un medio RPMI1640 que contiene FBS al 10 %. Las placas se adicionaron a las concavidades (103 células por concavidad) en placas de fondo en V de 96 concavidades . De esta manera, se prepararon células objetivo. Los anticuerpos purificados anteriormente se adicionaron a esto (1 \ig por concavidad) . Adicionalmente, a esto se adicionaron linfocitos de ratón separados del bazo de ratón (2 x 105 células) , seguido por cultivo bajo condiciones de 37°C y 5 % de C02 durante 4 horas. Después del cultivo, se determinó el nivel de cromo (Cr) 51 liberado de las células tumorales dañadas en cada sobrenadante de cultivo. Entonces, se calculó la actividad de ADCC de cada anticuerpo policlonal contra un péptido derivado de CAP IN-1 de humano a células de cáncer. Como resultado, todos los anticuerpos monoclonales #1 a #11 exhibieron actividad de ADCC contra MDA-MB-157 (20 % o más) . De manera específica, por ejemplo, se obtuvieron los siguientes resultados de actividad citotóxica: #1: 22.1 %; #2: 29.1 %; #6: 30.2 %; y #9: 32.4 % (ver Figura 4). Entre tanto, no se confirmó la actividad citotóxica en un caso en el cual se realizó un procedimiento similar a lo anterior usando el anticuerpo monoclonal reactivo a una proteína CAPRIN-l misma pero no ha superficies de células de cáncer preparadas en el E emplo 4 (ver Figura 4) . Los resultados anteriores mostraron que los anticuerpos monoclonales (#1 a #11) anti-CAPRIN-1 obtenidos, dañaron células de cáncer que expresan CAPRIN-1 al exhibir actividad de ADCC. (4) Efectos Antitumorales (Actividad de CDC) de Anticuerpos Contra CAPRIN-1 en Células de Cáncer Los anticuerpos monoclonales #1 a #11 seleccionados anteriormente contra CAPRIN-1 se valuaron en términos de la actividad citotóxica (actividad de CDC) a células de cáncer. La sangre recolectada de conejos por muestreo de sangre se adicionó a un tubo Eppendorf y entonces se dejó reposar a temperatura ambiente durante 60 minutos, seguido por centrifugación a 3000 rpm durante 5. De esta manera, se preparó suero para determinación de la actividad de CDC. La línea de células MDA-MB-231V de cáncer de mama humano (105 células) se recolectó en un tubo de centrífuga de 50 mi. A esto se adicionó cromo 51 (100 i) , seguido por incubación a 37°C durante 2 horas. Posteriormente, se lavaron 3 veces las células con un medio RPMI que contiene 10 % de FBS y luego se suspendieron en RPMI que contiene 50 % de suero de conejo preparado anteriormente. Las células se adicionaron a concavidades (103 células por concavidad) en placas de fondo V de 96 concavidades. Los anticuerpos #1 a #11 obtenidos en el (3) anterior se adicionaron de manera separada a concavidades (1 µg por concavidad) , seguido por cultivo bajo condiciones de 37°C y 5 % de C02 durante 4 horas. Después del cultivo se determinó el nivel de cromo (Cr) 51 liberado de células tumorales dañadas en cada sobrenadante de cultivo. Se calculó la actividad de CDC contra MDA-MB-231V exhibida por el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 en cada sobrenadante de hibridoma .. Como resultado, todos los anticuerpos monoclonales #1 a #11 exhibieron actividad de CDC (30 % o más) . Entre tanto, no se confirmó actividad citotóxica en un caso en el cual se realizó un procedimiento similar a lo anterior usando el anticuerpo monoclonal reactivo a una proteína CAPRIN-1 misma pero no a superficies de células de cáncer preparadas en el Ejemplo 4 (ver Figura 4) . Por consiguiente, se ha revelado que los anticuerpos monoclonales contra CAPRIN-1 (#1 a #11) pueden dañar células tumorales que expresan CAPRIN-1 al exhibir también actividad de CDC.

Ejemplo 6: Efectos Antitumorales in vivo de Anticuerpos Monoclonales anti-CAPRIN-1 en Ratones.

Entonces, se valuaron los efectos antitumorales in vivo de los anticuerpos monoclonales #1 a #11 obtenidos contra CAPRIN-1 en ratones que tienen tumor. Se obtuvieron anticuerpos usados en este ejemplo al someter el sobrenadante de cada hibridoma a purificación en columna de la manera descrita anteriormente .

Se examinaron los efectos antitumorales de los anticuerpos monoclonales #1 a #11 contra CAPRIN-1 usando ratones que tienen tumor en los cuales se ha trasplantado una línea de células de cáncer derivadas de ratón que expresan CAPRIN-1. Se trasplantaron subcutáneamente células CT26 (compradas de ATCC) en las porciones dorsales de 70 ratones Balb/c (Japan SLC, Inc.)(106 células por ratón). Cada tumor se dejó crecer hasta que el diámetro del mismo llegó a ser aproximadamente 7 mm. Los ratones que tienen tumor (60 de entre 70) se sometieron a administración intraperitoneal de anticuerpos monoclonales #1 a #11 contra CAPRIN-1 y un tipo del anticuerpo monoclonal (reactivo a la proteína CAPRIN-1 misma pero no a la superficie de células de cáncer) preparado en el Ejemplo 4 (5 ratones por anticuerpo) a una dosis de 300 g (300 µ?) por ratón. Posteriormente, cada anticuerpo se administró de manera intraperitoneal a la misma dosis a los ratones pertinentes que tienen tumor tres veces en total durante 2 días . El tamaño del tumor se midió cada día para observación de los efectos antitumorales . Los 10 ratones restantes que tienen tumor se sometieron a la administración de PBS (-) en lugar de un anticuerpo. El grupo de estos ratones se designó como un grupo de control. Como resultado de la observación de los efectos antitumorales, en el caso del grupo de prueba al cual se han administrado los anticuerpos monoclonales #1 a #11 contra CAPRIN-1 se presentó regresión tumoral a un grado tal que el volumen tumoral al inicio de la administración del anticuerpo (100 %) disminuyó a 50 % en el Día 4, aproximadamente 10 % en el Día 6, y varios porcientos por el Día 8. La regresión tumoral sustancialmente completa tomó lugar desde los Días 11 a 14 (ver Figura 5) . Por otra parte, en el grupo de control, el volumen tumoral se incrementó a aproximadamente 260 %, 350 %, 550 %, y 800 % del volumen original por los Días 4, 6, 8, y 11, respectivamente (ver Figura 5) . Además, en el grupo de ratones a los cuales se ha administrado el anticuerpo de control (correlación a la proteína CAPRiN-l misma pero no a la superficie de células de cáncer) no se pueden exhibir efectos antitumorales y el crecimiento tumoral se presentó como en el grupo de control . Los resultados indican que los anticuerpos monoclonales obtenidos #1 a #11 contra CAPRIN-1 exhiben fuertes efectos antitumorales in vivo en células de cáncer que expresan CAPRIN-1. Además, el tamaño del tumor se obtuvo al calcular el volumen tumoral por la siguiente fórmula: diámetro largo x diámetro corto x 0.5.

Adicionalmente, se administraron los anticuerpos monoclonales #1 a #11 contra CAPRIN-1 de la manera descrita anteriormente a ratones que tienen tumor (Balb/c) en los cuales se han trasplantado células de cáncer NIE de ratón (compradas de ATCC) . Esto dio por resultado regresión tumoral completa en el Día 15 después de la administración del anticuerpo. Por otra parte, en el grupo de control, el volumen tumoral se incrementó tan alto como aproximadamente 950 % del volumen original (ver Figura 6) .

Ejemplo 7: Identificación de un Péptido en Proteína CAPRIN-1, a la Cual se Une un Anticuerpo Contra CAPRIN-1 que Reacciona a la Superficie de Células de Cáncer Con el uso de los anticuerpos monoclonales #1 a #11 contra CAPRIN-1, que reacciona con la superficie de células de cáncer (obtenidas anteriormente) , se identificaron secuencias parciales en la proteína CAPRIN-1 que se van a reconocer por estos anticuerpos monoclonales .

Primero, se adicionó DTT (Fluka) a 100 µ? de una solución preparada al disolver una proteína CAPRIN-1 recombinante a una concentración de 1 ug/µ? con PBS a una concentración final de 10 mM, seguido por 5 minutos de reacción a 95°C, de modo que se realizó la reducción de enlace de disulfuro dentro de la proteína CAPRIN-1. Entonces, ses adicionó yodoacetamida ( ako Puré Chemical Industries, Ltd.) con una concentración final de 20 mM y luego se realizó una reacción de alquilación para grupos tiol a 37 °C durante 30 minutos bajo condiciones de sombreado. Se adicionaron cincuenta (50) g de cada uno de los anticuerpos monoclonales #1 a #11 contra CAPRIN-1 a 40 \ig de la proteína CAPRIN-1 reducida-alquilada, obtenida de esta manera, el volumen de la mezcla se ajustó a 1 mL con amortiguador de fosfato 20 mM (pH 7.0), y entonces la mezcla se dejó reaccionar durante la noche a 4°C en tanto que se agite mezcla cada mezcla.

Entonces, se adicionó tripsina, (Promega) a una concentración final de 0.2 g. Después de 1 hora, 2 horas, 4 horas, y luego 12 horas de reacción a 37°C, los resultantes se mezclaron con cuentas de proteína A-vidrio (GE) , que se sometieron por adelantado a bloqueo con PBS que contiene 1 % de BSA (Sigma) y luego al lavado con PBS, en carbonato de calcio 1 m y amortiguador NP-40 (amortiguador de fosfato 20 mM (pH 7.4), EDTA 5 mM, NaCl 150 mM, y NP-40 al 1 %) , seguido por 30 minutos de reacción.

La mezcla de reacción se lavaron cada uno con amortiguador de carbonato de amonio 25 mM (pH 8.0) y luego los complejos antígeno-anticuerpos se eluyeron usando 100 µ? de ácido fórmico al 0.1 %. Se llevó a cabo el análisis de LC-MS para productos eluidos usando Q-TOF Premier (Waters-MicroMass) de acuerdo a los protocolos anexos al instrumento.

Como resultado, se identificó el polipéptido de SEQ ID NO: 136 como una secuencia parcial de CAPRIN-1, que se reconoció por todos los anticuerpos monoclonales #1 a #11 contra CAPRIN-1. Además, el péptido de SEQ ID NO: 137 se identificó como una secuencia parcial en el polipéptido de SEQ ID NO: 136 anterior, péptido que se reconoció por los anticuerpos monoclonales #2 a #5, #6 a #8, y #10. Además se reveló que los anticuerpos monoclonales #2 a #5 reconocieron el péptido de SEQ ID NO: 138 que fue un péptido de secuencia parcial del péptido de SEQ IS NO: 137.

Aplicabilidad Industrial Los anticuerpos de la presente invención son útiles para el tratamiento y/o prevención de cánceres.

La descripción incluye todo o parte de los contenidos como se describe en la descripción y/o figuras de la solicitud de patente japonesa No. 2009-087285, a la cual reivindica la prioridad a la presente solicitud. Además, todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente se incorporan en la presente como referencia en su totalidad.

Texto Libre del Listado de Secuencias Cebadores: SEQ ID NOS: 31 a 39 y 130 a 135. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de un cáncer, caracterizada porque comprende, como un ingrediente activo, un anticuerpo o fragmento del mismo que tiene una reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1 que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NOS: 2 a 30 de número par o una secuencia de aminoácidos que tiene 80 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos, o con un fragmento de la proteína CAPRIN-1 que comprende 7 o más aminoácidos consecutivos.

2. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende, como un ingrediente activo, un anticuerpo o fragmento del mismo que tiene reactividad inmunológica con un fragmento de la proteína CAPRIN-1 que es un polipéptido que consiste de una secuencia de 7 o más aminoácidos consecutivos en la región de los residuos de aminoácido Nos. 50-98 o los residuos de aminoácido Nos. 233-305 en una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NOS: 2 a 30 de número par, excluyendo SEQ ID NOS : 6 y 18, o un polipéptido que comprende el polipéptido como una secuencia parcial.

3. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende, como un ingrediente activo, un anticuerpo o fragmento del mismo que tiene una reactividad inmunológica con un polipéptido parcial de CAPRIN-1 que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 136 o una secuencia de aminoácidos que tiene 80 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos, o un fragmento del polipéptido parcial que comprende 7 o más aminoácidos consecutivos .

4. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el cáncer es cáncer de mama, tumor de cerebro, leucemia, linfoma, cáncer de pulmón, cáncer esofágico, o cáncer de colon.

5. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o policlonal.

6. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de cadena individual, o un anticuerpo biespecífico .

7. Un anticuerpo caracterizado porque tiene una reactividad inmunológica con un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 136 o una secuencia de aminoácidos que tiene 80 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos.

8. Un anticuerpo, caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 40, 41 y 42 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 44, 45 y 46, y que tiene una reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1.

9. Un anticuerpo, caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 40, 41 y 42 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 50, 51 y 52, y que tiene una reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1.

10. Un anticuerpo, caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 40, 41 y 42 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 55, 56 y 57, y que tiene una reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1.

11. Un anticuerpo, caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 40, 41 y 42 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 60, 61 y 62, y que tiene una reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1.

12. Un anticuerpo, caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 40, 41 y 42 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS : 65, 66 y 67, y que tiene una reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1.

13. Un anticuerpo, caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 70, 71 y 72 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 74, 75 y 76, y que tiene una reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1.

14. Un anticuerpo, caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 80, 81 y 82 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 84, 85 y 86, y que tiene una reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1.

15. Un anticuerpo, caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 90, 91 y 92 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 94, 95 y 96, y que tiene una reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1.

16. Un anticuerpo, caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 100, 101 y 102 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 104, 105 y 106, y que tiene una reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1.

17. Un anticuerpo, caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 110, 111 y 112 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 114, 115 y 116, y que tiene una reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1.

18. Un anticuerpo, caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 120, 121 y 122 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 124, 125 y 126, y que tiene una reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1.

19. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 18, caracterizado porque es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de cadena individual, o un anticuerpo biespecífico .

20. Una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de cáncer, caracterizada porque comprende, como un ingrediente activo, el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 19, o un fragmento del mismo.

21. Uso de un anticuerpo o fragmento del mismo en la manufactura de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de un cáncer, donde un anticuerpo o fragmento del mismo que tiene una reactividad inmunológica con una proteína CAPRIN-1 que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID NOS: 2 a 30 de números pares o una secuencia de aminoácidos que tiene 80 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos, o con un fragmento de la proteína CAPRIN-1 que comprende 7 o más aminoácidos consecutivos . 22 Uso de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 19 en la manufactura de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer.