MX2010011721A

MX2010011721A - Nuevas variantes de alfa-amilasa quimericas.

Info

Publication number: MX2010011721A
Application number: MX2010011721A
Authority: MX
Inventors: Scott D Power; Andrew Shaw
Original assignee: Danisco Inc
Priority date: 2008-04-30
Filing date: 2009-04-23
Publication date: 2010-11-30
Also published as: EP2283136A2; CN102016044B; WO2009134670A3; BRPI0910547A2; US9303254B2; US20140106409A1; CN102016044A; JP2011520432A; JP5702714B2; US20110097778A1; WO2009134670A2; CA2722889A1

Abstract

Se proveen alfa-amilasas quiméricas que tienen las características de alta termoestabilidad y buen rendimiento en degradación de almidón, especialmente procesos de licuefacción a alta temperatura. Las alfa-amilasas son quimeras de enzimas AmyL y AmyS, y son útiles en procesos de degradación de almidón. Se proveen métodos para hacer las enzimas quiméricas, y métodos de mediante el uso de las alfa-amilasas quiméricas para licuefacción, limpieza de residuo de almidón de una superficie, y tratamiento de material tejido para remover revestimientos. Se proveen kits para poner en práctica los métodos. También se proveen polinucleótidos que codifican las amilasas quiméricas, vectores y hospederos de expresión.

Description

NUEVAS VARIANTES DE ALFA-AMILASA QUIMERICAS Campo de la Invención Esta invención se refiere generalmente a enzimas -amilasas para usarse en procesos industriales, tales como aplicaciones de licuefacción, horneado y limpieza. De manera más específica, se refiere a a-amilasas quiméricas con actividad mejorada en aplicaciones de alta temperatura, y/o que proveen rendimiento mejorado para degradación de almidón .

Antecedentes de la Invención Para muchos procesos industriales que usan almidones, es deseable tener enzimas amilolíticas que puedan funcionar a alta temperatura para romper rápidamente el almidón para reducir la viscosidad. Ejemplos de esas enzimas son conocidos en la técnica. Por ejemplo, las a-amilasas de Bacillus licheniformis o Bacillus stearother ophilus, AmyL y AmyS, respectivamente, facilitan la licuefacción de almidones a alta temperatura. En ausencia de calcio añadido, AmyL y variantes de AmyL tienen termoestabilidad mayor que amilasa AmyS, y por lo tanto son preferidas para la producción de glucosa y fructosa (v.gr. , HFCS) . AmyS y variantes de AmyS son preferidas en procesos de producción de etanol debido a Ref. 214122 que tienen actividad específica más alta sobre el almidón de maíz a alta temperatura que AmyL o sus variantes. Por lo tanto, AmyS tiene una tasa inicial más rápida de reducción de viscosidad del sustrato, que es un atributo altamente deseable en procesos de licuefacción de almidón. Sin embargo, AmyS tiene una característica no deseable en que su actividad catalítica da por resultado una viscosidad final más alta al final del proceso que aquella obtenida con AmyL o sus variantes. La viscosidad final más alta es probablemente el resultado de la termoestabilidad más baja, es decir, AmyS es simplemente inactivada más rápidamente por la alta temperatura del proceso de licuefacción.

Se han estudiado métodos para incrementar la termoestabilidad de las enzimas. La termoestabilidad de AmyQ (amilasa de B. amyloliquefaciens) fue incrementada por la deleción de dos aminoácidos, R176-Glyl77, (numeración relativa a secuencia de aminoácidos de AmyQ) como se muestra por Suzuki et al. (1989) (J. Biol . Chem. 264:18933), que están ausentes de la secuencia de AmyL. La termoestabilidad de amilasas de tipo AmyS puede ser incrementada por la deleción de dos residuos de aminoácidos, R179-G180, (numeración de AmyS) de un lazo (F178 a A184) como se muestra en Igarashi et al. 1998 (Biochem. Biophys . Res. Comm. 248:772). Sin embargo, una enzima AmyS mutada con esta deleción tiene una actividad específica más baja para hidrólisis de almidón de maíz a alta temperatura que la enzima original, lo que niega una de las ventajas principales de las amilasas AmyS, como se muestra en Shiau et al. (2003) (Appl . Environ. Micro. 69:2383).

Como se describió antes, se sabe en la técnica que, en ausencia de calcio añadido, amilasa AmyL de tipo silvestre es más termoestable que la amilasa AmyS. Además, se conoce en la técnica que la AmyQ, una a-amilasa de Bacill s amyloliquefaciens que es altamente homologa tanto a AmyS como a AmyL, es menos termoestable que cualquiera de AmyS o AmyL. Suzuki et al (1989) demostraron que para híbridos derivados de AmyL-AmyQ, la porción N-terminal de las enzimas AmyL se requirió para obtener estabilidad alta.

Breve Descripción de la Invención En la presente se proveen polipéptidos quiméricos hechos preferiblemente de a-amilasas AmyL y AmyS. Las amilasas quiméricas novedosas son útiles en que una sola enzima provee la termoestabil idad relativamente más alta vista en amilasas de tipo AmyL, y la actividad específica relativamente más alta vista en amilasas de t ipo AmyS .

Por consiguiente, provista aquí son enzimas amilasas mejoradas que proveen propiedades de rendimiento alterado, por ejemplo en términos de su capacidad para reducir viscosidad bajo condiciones de licuefacción a alta temperatura. Las amilasas quiméricas despliegan actividad específica mejorada o la capacidad para proveer una rápida reducción de la viscosidad pico en licuefacción de almidón, como se observa generalmente con amilasas de tipo AmyS . Además, las a-amilasas quiméricas tienen buena termoestabilidad, y por lo tanto, pueden proveer una viscosidad final baja como se ve típicamente con enzimas de tipo AmyL. Los polipéptidos con termoestabilidad mejorada, amilasas termoestables con actividad específica incrementada, y composiciones que comprenden los polipéptidos y enzimas, así como métodos para usar las enzimas o composiciones novedosas se proveen en la presente. También se proveen ácidos nucleicos que codifican las enzimas quiméricas, que incluyen vectores de expresión, y células hospederas que expresan las amilasas quiméricas.

Las a-amilasas quiméricas proveen un beneficio en que una sola enzima quimérica puede proveer muchas de las ventajas provistas en dos enzimas separadas. Los beneficios de producción para el fabricante y beneficios económicos tanto para el usuario final como el fabricante pueden fluir de la disponibilidad de las amilasas quiméricas descritas aquí .

Las oí-amilasas quiméricas son particularmente útiles en procesos de producción de etanol y otros procesos de degradación de almidón a alta temperatura, tales como procesos de licuefacción para producción de jarabe o para fermentación, aplicaciones de limpieza (v.gr . , lavado, lavado de vajilla), horneado, o eliminación de apresto de materiales tejidos. Las enzimas son relativamente termoestables , y tienen buena actividad a través de una gama de condiciones de pH, concentraciones de iones calcio, y condiciones de óxido-reducción.

En un aspecto, se proveen polipéptidos quiméricos que comprenden un dominio amino-terminal y un dominio carboxi-terminal . El dominio amino-terminal comprende aproximadamente 180 o más residuos de aminoácidos contiguos de una amilasa AmyL. Preferiblemente, la porción amino-terminal comprende una porción N-terminal de la amilasa AmyL. El dominio carboxi-terminal de los polipéptidos quiméricos comprende una porción carboxi-terminal de una amilasa AmyS . Los polipéptidos quiméricos tienen una longitud global de aproximadamente 480-515 residuos de aminoácidos. Los polipéptidos quiméricos provistos en la presente no tienen la secuencia de aminoácidos primaria ya sea de la amilasa AmyL o la amilasa AmyS, ni de ningún otro polipéptido conocido. Los polipéptidos quiméricos tienen termoestabilidad incrementada en relación con por lo menos la amilasa AmyS. La termoestabilidad que es equivalente a, o incluso mejor que, la de la AmyL se observa en algunas modalidades.

En otro aspecto, se proveen a-amilasas quiméricas termoestables . Las amilasas quiméricas comprenden una porción N-terminal y una porción C-terminal la porción N-terminal comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción N-terminal de una amilasa AmyL. La porción C-terminal de las amilasas quiméricas comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción C-terminal de una amilasa AmyS. Las a-amilasas quiméricas generalmente tienen una actividad específica mayor que la de la amilasa AmyL. Las amilasas quiméricas también tienen mayor termoestabilidad a 95°C que la amilasa AmyS. La secuencia de aminoácidos primaria de las amilasas quiméricas es aproximadamente 475-520 residuos de aminoácidos de longitud.

En la presente se proveen composiciones que comprenden uno o más polipéptidos quiméricos o a-amilasas quiméricas termoestables como se describió anteriormente, o una combinación de las mismas. Las composiciones además pueden comprenden uno o más polipéptidos o enzimas adicionales. También se proveen composiciones liofilizadas de grado alimenticio que comprenden las composiciones.

En otro aspecto, se - proveen polinucleótidos que codifican un polipéptido quimérico o -amilasa termoestable como se proveyó anteriormente, vectores que comprenden los polinucleótidos, y células hospederas que comprenden los vectores o polinucleótidos. En una modalidad, el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 1-17, pero que no tiene la secuencia precisa de SEQ ID NO: 1 ó 2.

También se proveen métodos para hacer y usar los polipéptidos quiméricos, a-amilasas termoestables y las composiciones descritas en la presente. Los métodos de uso provistos en la presente contemplan la posibilidad de usar una o más enzimas adicionales, qué incluyen una o más amilasas adicionales con las mismas. En un aspecto, se proveen métodos para producir una composición que comprende un polipéptido quimérico o una a-amilasa termoestable . Los métodos comprenden utilizar una célula hospedera seleccionada del grupo que consiste de Bacillus licheniformis, B. subtilis, y B. stearothermophilus, para un proceso de fermentación en donde una proteína es expresada, la proteína comprende: (a) un polipéptido quimérico que tiene una longitud de aproximadamente 480-515 residuos de aminoácidos, y que comprenden un dominio amino-terminal que comprende aproximadamente 180 o más residuos de aminoácidos contiguos de una porción N-terminal de una amilasa AmyL, y una dominio carboxi-terminal comprende una porción carboxi-terminal de una amilasa AmyS; el polipéptido quimérico que tiene termoestabilidad incrementada en relación con por lo menos la amilasa AmyS, o (b) una a-amilasa quimérica termoestable de aproximadamente 475-520 residuos de aminoácidos de longitud, y que comprende una porción N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción N-terminal de una amilasa AmyL, y una porción C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción C-terminal de una amilasa AmyS, la a-amilasa quimérica tiene una actividad específica mayor que la amilasa AmyL y mayor termoestabilidad a 95°C que la amilasa AmyS. Los métodos comprenden purificar por lo menos parcialmente la proteína expresada, para producir la composición.

Se provee un método para licuar una suspensión de almidón que comprende: hacer una suspensión que comprende un almidón, calentar la suspensión a una temperatura aceptable para licuefacción, añadir a la suspensión una composición que comprende uno o más de un polipéptido quimérico o -amilasa quimérica termoestable como se provee en la presente, o una combinación de las mismas. La incubación de la suspensión con la composición durante un tiempo, y a una temperatura, suficientes para licuar la suspensión de almidón completa el método. El método se puede usar como parte del proceso para producir alcohol de combustible.

También se provee un método para limpiar una superficie para remover un residuo de almidón no preferido o no deseable. El método comprende los pasos de proveer una superficie que tiene residuo de almidón que ha de ser removido, poner en contacto la superficie con una composición que comprende un polipéptido quimérico, a-amilasa quimérica termoestable como se describe en la presente, o una combinación de los mismos, durante un tiempo y a una temperatura suficientess para dar por resultado la remoción del residuo de almidón.

También se provee un método de tratamiento de un material tejido que previamente ha sido sometido a contacto con un revestimiento que comprende almidón o un derivado de almidón. El método comprende poner en contacto el material tejido con un líquido que comprende una a-amilasa quimérica como se provee anteriormente, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para remover sustancialmente el revestimiento del material tejido.

Kits para facilitar la licuefacción de una suspensión de almidón, el kit comprende por lo menos uno de: (a) un polipéptido quimérico que tiene una longitud de aproximadamente 480-515 residuos de aminoácidos, y que comprende un dominio amino-terminal que comprende aproximadamente 180 o más residuos de aminoácidos contiguos de una porción N-terminal de una amilasa AmyL, y un dominio carboxi -terminal comprende una porción carboxi-terminal de una amilasa AmyS; el polipéptido quimérico tiene termoestabilidad incrementada en relaión con por lo menos la AmyS control, o (b) una -amilasa quimérica termoestable de aproximadamente 475-520 residuos de aminoácidos de longitud, y que comprende una porción N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción N-terminal de una amilasa AmyL, y una porción C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción C-terminal de una amilasa AmyS, la a-amilasa quimérica tiene una actividad específica mayor que la amilasa AmyL y mayor termoestabilidad a 95°C que la amilasa AmyS. El kit también comprende instrucciones para el uso del kit en la licuefacción de una suspensión de almidón.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1 es un diagrama del plásmido usado para la expresión de varios híbridos y amilasas. Los elementos de plásmido son los siguientes: Bla, el gen de beta lactamasa que codifica para marcador de resistencia a ampicilina/ carbenicilina; región promotora de AprE, promotor de AprE de B. subtilis (proteasa alcalina) que tiene una región de homología al cromosoma de los hospederos de Bacillus que permite integrarse en el genoma del hospedero; péptido de AprE, la secuencia de señal de AprE de B. subtilis ; Híbrido 186, la región codificante para el gen de interés, tal como el híbrido 186; LAT Term, el terminador de amilasa nativa LAT (amilasa termoestable de licheniformis) de B. licheniformis ; CAT, el gen de cloranfenicol acetil transferasa para resistencia al antibiótico cloranfenicol ; ORI, el origen de replicación para E. coli. Nótese que este plásmido carece de un origen de replicación para Bacillus .

La figura 2 muestra los resultados del rendimiento de a-amilasas quiméricas en una determinación selectiva de termoestabilidad a 95°C, en comparación con un control, control de AmyS . Las -amilasas quiméricas compuestas de una porción amino terminal de AmyL y una porción carboxi-terminal de AmyS. Las quimeras probadas incluyeron 186, 187, 200, 202, 228, 249, 254 y 259. El número de tres dígitos, en donde se usa a nombre de una a-amilasa quimérica en la presente, indica la posición del último residuo de aminoácido de la secuencia de AmyL, con el resto de la quimera derivada de la secuencia de AmyS. La enzima de control ("control de AmyS") (SEQ ID NO: 3) usada es una AmyS variante con una deleción de R179-G180 [descrita en WO2005/111203] . Las enzimas se mantuvieron a temperatura deseada (95°C) y las muestras fueron removidas en los puntos de tiempo indicados para prueba. Las condiciones de prueba incluyeron pH 5.6 50 mM de regulador de pH de malato, .2.6 mM de CaCl2, y 50 mM de NaCl . La gráfica muestra la actividad catalítica relativa que permanece (como un porcentaje) en el eje de y, con el tiempo (min) en el eje x, mediante el uso del sustrato de oligosacárido sintético MEGAZYME CERALPHA, como se describe en la presente. La descripción detallada de las condiciones y pruebas de incubación se proveen en la sección de métodos.

La figura 3 muestra la termoestabilidad de a-amilasas quiméricas adicionales a 95°C. La gráfica, como en la figura 2, muestra la actividad de amilasa restante (como un porcentaje) en el eje de y, con el tiempo (min) en el eje de x. Las condiciones de reacción fueron las mismas que en la figura 1. Las quimeras probadas incluyen 200SB, 202SB y 228SB. "SB" como se usa en la presente, indica que un puente de sal estabilizador fue creado por introducción de mutaciones S187D y S188T. El control fue la AmyS control (SEQ ID NO: 3) .

La figura 4 muestra la termoestabilidad de a-amilasas quiméricas adicionales a 95°C.,La gráfica es como en las figuras 2 y 3. Las condiciones de reacción fueron las mismas que en las figuras 2 y 3. Las muestras probadas incluyen la AmyS control, y las quimeras 249SB, 254SB y 259SB.

La figura 5 muestra la actividad específica de varias a-amilasas quiméricas a 75°C. La prueba de detección de azúcar reductor de DNS, que se describe más adelante (véase la sección de métodos para detalles) , se usó para determinar las velocidades de reacción para quimeras 186, 228 y 228SB en comparación con la enzima de control de AmyL y AmyS. La actividad específica se reporta como mg de glucosa producida por segundo por mg de enzima en la reacción. Todas las tres enzimas quiméricas probadas mostraron mayor actividad específica que la enzima AmyL a la temperatura elevada, 75°C, probada.

La figura 6 muestra los cambios en viscosidad de substrato de harina de maíz sobre la incubación con varias amilasas híbridas. Los híbridos 186, 202SB, 228SB y 228 se compararon con la AmyS control para su capacidad para reducir la viscosidad como se midió por un agitador superior electrónico EUROSTAR/IKA Labortechnik control-vise P7 con salida de lectura de par de torsión.

Las figuras 7A-7E, muestran las secuencias de aminoácidos de SEQ ID 1 a 17. Etiquetas de secuencias de aminoácidos: Para todas las secuencias de aminoácidos híbridas, la secuencia de AmyL se muestra en texto plano, la región de secuencia de AmyS se muestra en negrillas, y la secuencia de puente de sal se muestra subrayada.

Las figuras 8A-8I, muestran las secuencias de nucleótidos de SEQ ID 18 a 34. Etiquetas de secuencias de nucleótidos: Para todas las secuencias de nucleótidos híbridas, la secuencia de AmyL se muestra en texto plano, la región de secuencia de AmyS se muestra en negrillas, y la secuencia de puente de sal se muestra subrayada. La figura 81 es SEQ ID No. 34, secuencia de nucleótidos de gen que codifica proteína 259Sbhíbrida .

Descripción Detallada de la Invención Se proveen cc-amilasas quiméricas que tienen ventajas benéficas sobre las a-amilasas actualmente disponibles. Las o-amilasas quiméricas comprenden una porción N-terminal de una amilasa AmyL y una porción C-terminal de una amilasa AmyS. Las a-amilasas quiméricas presentan termoestabilidad mejorada en relación con las enzimas AmyS, y actividad o capacidad específica mejorada para reducir la viscosidad pico en relación con las enzimas AmyL. Por lo tanto, estas propiedades permiten que los polipéptidos quiméricos y amilasas termoestables se usen en licuefacción de almidón a alta temperatura, por ejemplo para la producción de productos de fermentación tales como alcohol y especialmente etanol . Dan por resultado una viscosidad pico en relación con las amilasas AmyL usadas solas, y viscosidades finales bajas en relación con las amilasas AmyS usadas solas. Las enzimas quiméricas provistas en la presente también son útiles en el rompimiento o remoción de almidón, amilasa, amilopeptina u otros sustratos de oc-amilasa en procedimientos de alta temperatura tales como horneado, así como en el tratamiento de materiales tejidos para remover agentes de apresto a base de almidón o procedimientos de limpieza/lavado. Las enzimas quiméricas provistas en la presente también se pueden usar juntas una con otra y/o junto con una o más de otras enzimas, por ejemplo en una mezcla.

Preferiblemente, otras enzimas usadas son activas bajo las mismas condiciones de reacción o similares a aquellas usadas para las oc-amilasas quiméricas. Esto provee más flexibilidad al usuario final, así como ciertas ventajas de procesamiento y económicas. Las condiciones de procesamiento tales como pH, temperatura, resistencia iónica, así como la presencia de cofactores requeridos, se pueden establecer para permitir la actividad de las a-amilasas y cualesquiera otras enzimas presentes. Esas condiciones de procesamiento pueden facilitar el uso de procesos continuos o semicontinuos , en vez de los procesos intermitentes costosos y que consumen tiempo. Otros aspectos provistos en ciertas modalidades de las a-amilasas quiméricas son actividad específica incrementada, y la capacidad para reducir la viscosidad pico o la viscosidad final de una suspensión de almidón, así como o mejor que cualquiera de las enzimas AmyL y AmyS.

A. Definiciones y Abreviaturas De conformidad con esta descripción detallada, se aplican las siguientes abreviaturas y definiciones. Cabe notar que, como se usa en la presente, las formas singulares "un" , "una" , "el" y "la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto determine claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una enzima" incluye una pluralidad de esas enzimas, y la referencia a "la formulación" incluye referencia a una o más formulaciones y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la técnica, etc.

El término "aproximadamente" con respecto a un valor o intervalo numérico indica que el valor numérico puede ser 10% mayor o menor que el valor establecido. En otras modalidades, "aproximadamente" indica que un valor numérico puede ser 5% mayor o menor que el valor establecido. El experto en la técnica apreciará que el término "aproximadamente", cuando se usa junto con un número o intervalo de residuos de aminoácidos o pares de bases, o la longitud de un polipéptido en residuos de aminoácidos, o la longitud de un polinucleótido en pares de bases, abarca únicamente valores enteros.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que entenderá comúnmente un experto en la técnica. Los siguientes términos se proveen a continuación. 1.1 Definiciones "Amilasa" significa una enzima que, entre otras cosas, es' capaz de catalizar la degradación de almidón, amilosa, amilopectina , y similares. Generalmente, las oc-amilasas (EC 3.2.1.1; a-D- (1?4) -glucan glucanohidrolasa) se definen como enzima de endo-acción que digieren enlaces oc-D-( 1?4 ) O-glicosidicos en un polisacárido que contiene tres o más unidades de glucosa enlazadas a oc-D-(l?4). Las a-amilasas liberan grupos reductores en la configuración a. Actúan sobre almidón, glucógeno y poli-y oligosacáridos relacionados de una manera aleatoria. Por el contrario, las enzima amiliolíticas de exo-acción secuencialmente digieren la molécula de sustrato del extremo no reductor. Las glucano 1,4- a-maltohidrolasas ( -amilasas maltogénicas EC 3.2.1.133) producen -maltosa como el producto final, mientras que las ß-amilasas (EC 3.2.1.2) producen ß-maltosa. Las ß-amilasas, a-glucosidasas (EC 3.2.1.20; a-D-glucósido glucohidrolasa) , glucoamilasa (EC 3.2.1.3; a-D- ( 1?4 ) -glucano glucohidrolasa) y amilasas específicas del producto pueden producir malto-oligosacáridos de una longitud específica de sus sustratos respectivos. Las glucoamilasas liberan residuos de glucosilo de los extremos no reductores de moléculas de amilosa y amilopectina . Las glucoamilasas también catalizan la hidrólisis de enlaces a- 1,6 y a-1,3, aunque a una velocidad mucho más lenta que los enlaces a-1,4.

Un "polipéptido quimérico" o "quimera" significa una proteína que contiene secuencias de más de un polipéptido. Un polipéptido o a-amilasa quimérica puede ser quimérica en el sentido que contiene una porción, región o dominio de una molécula fusionada a una o más porciones, regiones o dominios de una o más de otras moléculas. A manera de ejemplo, un polipéptido quimérico o una a-amilasa quimérica puede comprender una secuencia para una proteína oc-amilasa madura enlazada a la secuencia para el péptido de señal de otra a-amilasa. El experto apreciará que los polipéptidos y a-amilasas quiméricas no necesitan consistir de fusiones reales de las secuencias de proteína, sino mas bien los polinucleótidos con las secuencias codificantes correspondientes también se pueden usar para expresar polipéptidos o a-amilasas quiméricas que comprenden la amino secuencia de aminoácidos que una proteína de fusión real o hipotética hecha de o "derivada de" otras amilasas. Por lo tanto, por ejemplo, una a-amilasa quimérica o un polipéptido quimérico en la presente puede comprender una porción amino-terminal de una primera amilasa y una porción carboxi-terminal de una segunda amilasa, o el polipéptido o a-amilasa quimérica podría ser expresado a partir de un polinucleótido que codifica una proteína de la misma secuencia. En el caso de una a-amilasa quimérica, la actividad catalítica de una a-amilasa debe estar presente en la molécula resultante. "Moléculas quiméricas" como se usa en la presente, pueden ser ya sea polinucleótidos o polipéptidos, y no ocurren naturalmente. Una a-amilasa de tipo silvestre ocurre naturalmente. Las amilasas quiméricas difieren de una a- amilasa de tipo silvestre en los residuos de aminoácidos de la proteína madura, es decir, en la secuencia de aminoácidos primaria de la molécula activa sin una secuencia de señal.

"Actividad", con respecto a las enzimas, significa "actividad catalítica" y abarca cualquier medida aceptable de actividad de enzima, tal como la velocidad de actividad, la cantidad de actividad o la actividad específica. La actividad catalítica se refiere a la capacidad para catalizar una reacción química específica, tal como la hidrólisis de un enlace químico específico. Como lo apreciará un experto en la técnica, la actividad catalítica de una enzima solo acelera la velocidad de una reacción química de otra manera lenta. Debido a que la enzima solo actúa como un catalizador, no es producida ni consumida por la reacción misma. El experto en la técnica también apreciará que no todos los polipéptidos tienen una actividad catalítica, "actividad específica" es una medida de actividad de una enzima por unida de proteína o enzima total. Por lo tanto, actividad específica se puede expresar por peso unitario (v.gr. , por gramo, o por miligramo) o volumen unitario (v.gr., por mililitro de enzima) . Además, la actividad específica puede incluir una medida de pureza de la enzima, o puede proveer una indicación de pureza, por ejemplo, en donde un estándar de actividad se conoce o está disponible para comparación.

"Variantes" se refiere a polipéptidos y ácidos nucleicos. El término "variante" algunas veces se puede usar como sinónimo del término "mutante" . Las variantes incluyen inserciones, sustituciones, deleciones, transversiones, truncaciones y/o inversiones en uno o más lugares en una secuencia de aminoácidos o nucleótidos. Los ácidos nucleicos variantes pueden incluir secuencias que son complementarias a secuencias que son capaces de hibridar a las secuencias de nucleótidos presentadas en la presente. Por ejemplo, una secuencia variante es complementaria a secuencias capaces de hibridar bajo condiciones astringentes, v.gr. , 50°C y 0.2X SSC (IX SSC=0.15M NaCl , 0.015M de citrato de sodio, pH 7.0), a las secuencias de nucleótido presentadas en la presente. De manera más particular, el término variante abarca secuencias que son complementarias a secuencias que son capaces de hibridar bajo condiciones altamente astringentes, v.gr., 65°C y 0. IX SSC, a las secuencias de nucleótidos presentadas en la presente. En varias modalidades, una variante es por lo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o incluso 99% idéntica a una secuencia expresamente provista en la presente.

Como se usa en la presente, el término "expresión" se refiere al proceso por el cual un polipéptido es producido con base en la secuencia de ácido nucleico de un gen o secuencia artificial. El proceso incluye tanto transcripción como traducción. "producto de expresión" se refiere generalmente a una proteína hecha por traducción, ya sea in vivo o in vitro. De manera similar, si un gen es expresado, el producto genético (usualmente proteína, pero algunas veces AR ) es producido en una célula, tal como una célula hospedera que comprende el gen.

"Microorganismos", como se usa en la presente, incluye cualquier especie de bacteria, levadura u hongo.

"Aislado" con respecto a proteína, o secuencias de ácido nucleico significa que la secuencia es por lo menos sustancialmente libre de por lo menos otro componente con el que la secuencia esta naturalmente asociada y encontrada en la naturaleza. En el ejemplo de secuencia de ácido nucleico, por aislado se entiende aislado de secuencias genómicas .

"Purificado" significa que el material esta en un estado relativamente puro, v.gr., por lo menos aproximadamente 90% puro, por lo menos aproximadamente 95% puro, o por lo menos aproximadamente 98% puro. "Parcialmente purificado" abarca grados de pureza menores, siempre que la proteína o ácido nucleico sea "aislado" como se usa en la presente .

"Termoestable" significa que la enzima retiene actividad medible después de ser expuesta a temperaturas elevadas. Una medida de la termoestabilidad de una enzima, tal como una oc-amilasa, es su vida media (ti/2) en donde la mitad de la actividad de la enzima se pierde por la vida media. El valor de vida media se calcula bajo condiciones definidas al medir la actividad de amilasa residual. En algunas modalidades, otras medidas de termoestabilidad pueden ser más útiles o más prácticas, y se pueden medir y expresar, por ejemplo, como por ciento de actividad que queda después de un tiempo de exposición especificado a una temperatura de interés. En otra definición, termoestabilidad se expresa como la temperatura de fusión, o Tm, es decir, el punto medio de la transición de F<?U en el cual F es proteína doblada y U es desdoblada. Cualquier mutación que cause un incremento en Tm se dice que es una mutación de estabilización. "Termoestabilidad mayor" o "termoestabilidad incrementada" se usan intercambiablemente en la presente. Cualquier mutación que incrementa Tm o ti/2 incrementa la termoestabilidad del polipéptido o enzima asociada. En algunos casos, en vez de determinar una Tm o tx/2, se usan otras medidas de estabilidad. Tm no siempre puede ser determinada correctamente debido a que la transición de doblada a desdoblada puede ser irreversible. En tales casos, la estabilidad se puede definir como Tx, la temperatura a la cual x por ciento de proteína permanece funcional después de un tiempo especificado. Si en una aplicación particular se sabe que una enzima debe permanecer activa por aproximadamente una hora, una comparación útil entre enzimas puede ser una Tx para 60 minutos para asegurarse de que una cantidad aceptable de actividad permanezca después de 60 minutos a una temperatura por lo menos aquella requerida en la práctica. En donde la desnaturalización irreversible es un problema, es útil probar bajo condiciones similares a aquellas en las cuales la enzima se aplicara posteriormente, v.gr. , condiciones de temperatura, H, o la presencia de oxidantes, detergentes o quelatadores se deben considerar.

Generalmente, después de la exposición de una enzima a una temperatura de interés durante un tiempo deseado, la enzima se probará bajo condiciones de prueba estándares, que incluyen temperatura. Las enzimas termoestables también pueden ser enzimas termoactivas , es decir, pueden presentar actividad cuando se prueban a temperaturas altas. Como se usa en la presente, enzimas termoestables pueden ser resistentes a la desnaturalización con calor y activas a altas temperaturas. " oc-Amilasas quiméricas termoestables" son oc -amilasas quiméricas como se define en la presente con termoestabilidad incrementada en relación con por lo menos una amilasa de la cual se deriva la quimera. Las amilasas quiméricas termoestables preferiblemente tienen una termoestabilidad que es mayor que la de la amilasa menos termoestable de la cual se deriva la quimera y aproximadamente la de la amilasa más termoestable de la cual se deriva la quimera.

"Intervalo de pH" significa la capacidad de la enzima para presentar actividad catalítica de condiciones ácidas a básicas. Procesos comunes en los cuales las cc-amilasas se usan pueden incluir condiciones de pH que abarcan 5 o más unidades de pH. Como se usa en la presente, "pH estable" se refiere a la capacidad de la enzima para retener actividad medible en un intervalo amplio de pH, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, o incluso más unidades de pH. Además de la estabilidad al pH, las a-amilasas quiméricas descritas en la presente también pueden proveer un pH óptimo, en donde la actividad es máxima a un cierto pH o intervalo de pH, bajo condiciones de temperatura, tiempo, concentración de sustrato y concentración de ion de calcio que de otra manera se mantienen constantes.

Como se usa en la presente, "Secuencia de aminoácidos" algunas veces se usa como sinónimo del término "polipéptido" y/o del término "proteína". En algunos casos el término "secuencias de aminoácidos" es sinónimo del término "péptido"; en algunos casos, el término "secuencias de aminoácidos" es sinónimo del término "enzima" . En otros casos, que serán claros del contexto, la "secuencia de aminoácidos" se referirá a la secuencia real ("secuencia primaria") de cadenas laterales de aminoácidos o "residuos" en la estructura de base de un polipéptido. Por ejemplo, el listado de secuencias provisto con la presente provee las secuencias de aminoácidos para varios polipéptidos o dominios de polipéptidos .

Como se usa en la presente, "secuencia de nucleótidos" o "secuencia de ácidos nucleicos" se refiere a una secuencia de oligonucleótidos o secuencia de polinucleótidos ("polinucleótidos") y variantes, homólogos, fragmentos y derivados de los mismos. La secuencia de nucleótidos puede ser de origen genómico, sintético o recombinante y puede ser de doble cadena o de cadena sencilla, ya sea que represente la cadena de sentido o antisentido. Como se usa en la presente, el término "secuencia de nucleótidos" ' incluye ADN genómico, ADNc, ADN sintético y ARN. Igual que con los polipéptidos, el término "secuencia de nucleótidos" también se usa a veces en la discusión de la secuencia real de nucleótidos o bases a lo largo de una estructura de base de polinucleótidos, es decir, la secuencia primaria.

"Homólogo" significa una entidad que tiene un cierto grado de identidad u "homología" con las secuencias de aminoácidos de estudio y las secuencias de nucleótidos de estudio. Típicamente, homólogos comprenderán los mismos residuos de sitio activo que la secuencia de aminoácidos presente. Los homólogos también retienen actividad de a-amilasa, aunque el homólogo puede tener diferentes propiedades enzimáticas a las de la proteína de estudio. Una "secuencia homologa" incluye un polinucleótido o un polipéptido que tiene un cierto porcentaje de identidad, v.gr., por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95% o 99%, con otra secuencia.

"Por ciento de identidad" o "por ciento de identidad de secuencia" significa que un porcentaje dado de bases o residuos de aminoácidos en una secuencia o proteína de estudio son exactamente los mismos que la base o residuo presentes en una -secuencia o proteína de referencia, por ejemplo cuando se comparan las dos secuencias de polipéptidos en una alineación. Las secuencias de aminoácidos pueden ser similares, pero no son "idénticas" en donde un aminoácido es sustituido, deletado o insertado en la secuencia de estudio en relación con la secuencia de referencia. Para proteínas, el por ciento de identidad de secuencia preferiblemente se mide entre secuencias que .están en un estado similar con respecto a modificación post traduccional . Típicamente, la "secuencia madura" de la proteína de estudio, es decir, aquella secuencia que queda después de procesar o remover una secuencia de señal, se compara con una secuencia madura de la proteína de referencia. En otros casos, una secuencia precursora de una secuencia de polipéptido de estudio se puede comparar con el precursor de la secuencia de referencia .

Como se usa en la presente, "hibridación" incluye el proceso por el cual una cadena de ácido nucleico se une con una cadena complementaria a través de apareamiento de bases, así como el proceso de amplificación como se lleva a cabo en tecnología en reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Un ácido nucleico que codifica una cc-amilasa quimérica puede existir como ADN o ARN de cadena sencilla o doble cadena, un hetero dúplex de ARN/ADN, o un copolímero de AR /ADN. Como se usa en la presente, "copolímero" se refiere a una cadena de ácido nucleico sencilla que comprende tanto ribonucleótidos como desoxiribonucleótidos . La a-amilasa que codifica ácido nucleico puede ser "optimizada" para incrementar la expresión de un organismo específico al ajustar el ácido nucleico para contener aquellos codones que se utilizan preferencialmente en la traducción a proteínas nativas en el organismo.

Como se usa en la presente, un compuesto "sintético" es producido por síntesis química o enzimática. Los compuestos sintéticos incluyen, pero no se limitan a ácidos nucleicos que codifican a-amilasas quiméricas, preferiblemente hechas con uso de codón óptimo para organismos hospederos de elección para expresión. Un polipéptido o ácido nucleico sintético también se puede preparar mediante el uso de técnicas in vitro tales como transcripción o traducción in vitro, o PCR y similares.

Como se usa en la presente, "célula transformada" incluye células, que incluyen tanto células bacterianas como de hongos, que han sido transformadas mediante el uso de técnicas de ADN recombinante . La transformación típicamente ocurre por inserción de una o más secuencias de nucleótidos en una célula. La secuencia de nucleótidos insertada puede ser una secuencia de nucleótidos heteróloga, es decir, es una secuencia que no está naturalmente presente en la célula que ha de ser transformada, tal como un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión o un polipéptido quimérico.

Como se usa en la presente, "operablemente enlazado" significa que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su forma pretendida. Por ejemplo, una secuencia reguladora puede ser "operablemente enlazada" a una secuencia codificante de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se logre bajo condiciones compatibles con la secuencia reguladora.

Como se usa en la presente "biológicamente activo" se refiere a una secuencia que tiene una función estructural, reguladora o bioquímica similar a la de la secuencia que ocurre naturalmente, aunque no necesariamente al mismo grado. Por ejemplo, una -amilasa biológicamente activa es un polipéptido con actividad de oc-amilasa medible.

"Potencial genotóxico" , como se usa en la presente, se refiere al potencial para compuestos, v.gr., polipéptido, amilasas o composiciones que los comprenden, para ser "genotóxicos" en estudios in vitro o in vivo. "Genotóxico" es un término amplio que se refiere a cualquier cambio deletéreo en el material genético e independientemente del mecanismo por el cual es inducido el cambio. Compuestos genotóxicos, en ausencia de otros datos, son generalmente supuestos por cuerpos reguladores e investigadores para hacer carcinógenos de trans-especie, que implican un peligro para los humanos. Por consiguiente, esos compuestos no necesitan ser sometidos a estudios de carcinogenicidad a largo plazo. Sin embargo, si un compuesto de este tipo se pretende administrar crónicamente a humanos, puede ser necesario un estudio de toxicidad crónica (de hasta un año) para detectar efectos tumorigénicos tempranos. Un enfoque de batería de pruebas in vi tro e in vivo se puede usar para probar genotoxicidad. La batería está diseñada preferiblemente para reducir el riesgo de resultados falso negativos para compuestos con potencial genotóxico. La evaluación del potencial genotoxico de un compuesto es preferiblemente conducido como una interrogante objetiva independiente. Esa evaluación preferiblemente toma en cuenta la totalidad de los hallazgos y el valor intrínseco y limitaciones tanto de pruebas in vi tro como in vivo. Un solo resultado positivo en cualquier prueba para genotoxicidad no necesariamente significa que el compuesto de prueba posee un peligro genotóxico para humanos. El potencial genotóxico es preferiblemente evaluado de conformidad con lineamientos oficiales, tales como la "ICH Guideline on Specific Aspects of Regulatory Genotoxity Test" ("lineamientos de ICH sobre aspectos específicos de pruebas de genotoxicidad reguladora") . Los lineamientos sobre prueba de toxicidad genética provista por FDA's Center for Food Safety and Applied Nutrition (58 FR 16536, Marzo 29,1993) también se considera que es aplicable para la determinación de potencial genotóxico en la presente.

Como se usa en la presente, el término "almidón" se refiere a cualquier material compuesto de los carbohidratos de polisacárido complejos de las plantas. Los almidones generalmente comprenden amilosa y amilopectina con la fórmula (C6H10O5)x, en donde x puede ser cualquier entero. El término "almidón granular" se refiere a almidón en bruto, es decir, crudo, v.gr., almidón que no ha sido gelatinizado . "Derivado de almidón", como se usa en la presente, se refiere a cualquier almidón modificado o derivado, v.gr., cualquier almidón alterado por tratamiento físico o químico para dar propiedades alternadas para el procesamiento de alimentos u otro uso. Estos cambios pueden incluir propiedades gelificantes alteradas, propiedades de flujo del almidón seco o una solución preparada a partir del mismo, color, claridad, estabilidad de una suspensión o pasta, y similar. Por ejemplo, como se usa en productos de confitería, el almidón modificado con ácido resulta del tratamiento con ácido que reduce la viscosidad de una suspensión o pasta hecha a partir del mismo. Derivados químicos de almidón tales como éteres y esteres, muestran propiedades tales como gelatinización reducida en agua caliente y mayor estabilidad a ácidos y álcalis (almidón "inhibido"). Ejemplos de derivado de almidón incluyen almidones cocidos con dextrina, almidones tratados con ácidos, almidones tratados con material alcalino, almidón blanqueado, almidón oxidado, almidón tratado con enzimas, fosfato de mono-almidón, fosfato de di-almidón, fosfato de almidón fosfatado, fosfato de di almidón acetilado, acetato de almidón, adipato de di almidón acetilado, almidón hidroxipropílico, fosfato de di almidón hidroxipropílico y octenilsuccinato de almidón sódico, así como varias sales o esteres, particularmente ésteres de ácido graso de los anteriores .

Como se usa en la presente el término "sacarificación" se refiere a la conversión enzimática de almidón a glucosa.

El término "licuefacción" se refiere a la etapa en la conversión de almidón en la cual el almidón gelatinizado es hidrolizado para dar dextrinas solubles de peso molecular bajo. El término "grado de polimerización" (GP) se refiere al número (n) de unidades anhidroglucopiranosa en un sacárido dado. Ejemplos de GP1 son los monosacáridos glucosa y fructosa. Ejemplos de GP2 son los disacáridos maltosa y sacarosa. Un "proceso de licuefacción comparable", como se usa en la presente, se refiere a un control procesado para licuefacción. Los procesos de licuefacción son conducidos bajo condiciones controladas, v.gr., el proceso de licuefacción comprende condiciones especificadas de temperatura, pH, concentración de ion de calcio, y concentración de sustrato. Los procesos de licuefacción comparables proveen un medio para comparar diferentes enzimas o mezclas de enzimas en su capacidad para licuar un almidón mediante el control de tanto como sea posible excepto las diferencias en enzimas. Como se usa en la presente, "facilitación de licuefacción" o "facilitación de un proceso de licuefacción" abarca cualquier grado de mejora en la licuefacción de una suspensión de almidón, tal como hacer un proceso de licuefacción más eficiente, más efectivo, más económico o más fácil "sencillos" . El término incluye reducir el número o cantidad de enzimas requeridas, reducir la viscosidad pico o final de la suspensión de almidón, incrementar la velocidad o grado de degradación de almidón, o la producción de fragmentos de cualquier GP en particular o de dextrinas limites. La facilitación de licuefacción también incluye reducir los requerimientos de energía netos, al mejorar la utilización de sustrato, o mejorar otras condiciones tales como la concentración de ion de calcio o tolerancia de cambios en ion de calcio, capacidad para usar diferentes fuentes de almidón (es decir, sustratos) , tipos o concentraciones, capacidad para operar a niveles de pH preferidos o intervalos de pH preferidos, cantidad y calidad del producto resultante, y similares.

Como se usa en la presente el término "contenido de sólidos secos" (SS) se refiere a la cantidad total de sólidos en una suspensión, sobre una base de peso seco. El contenido de sólidos secos y la base de peso seco se expresan usualmente como el peso del presente material como un porcentaje de peso del material seco total. El término "suspensión" se refiere a una mezcla que contiene sólidos insolubles en un líquido, típicamente agua o un solvente similar. Almidón o harina es frecuentemente suspendido en una solución a base de agua para formar una suspensión para probar amilasas, o para procesos de licuefacción.

El término "ED" o "equivalente de dextrosa" , se define como el porcentaje de reducción de azúcar como una fracción de carbohidrato total.

Como se usa aquí, los términos "fermentación" o "proceso de fermentación" se refieren a la ruptura de sustancias orgánicas y re-ensamble en otras sustancias, y como se usa en la presente puede abarcar cualquier proceso de "fermentación industrial," "fermentación bioquímica" o "fermentación de alimento". "Fermentación industrial" generalmente se refiere a condiciones de crecimiento altamente oxigenadas y aeróbicas, mientras que la "fermentación bioquímica" generalmente se refiere a un proceso estrictamente anaeróbico. Los sustratos de carbohidrato son requeridos como una fuente de energía para la vasta mayoría de procesos de fermentación industrial para producir una variedad de agentes farmacéuticos y precursores, así como ingredientes de alimentos. En donde una fermentación es especificada en la presente para usarse en la producción de alcohol, v.gr., etanol, tal como para la producción de combustible, es generalmente un proceso limitado en oxígeno, privado de oxígeno, o incluso completamente anaerobio. Los bio-combustibles son combustibles de recursos renovables, por ejemplo etanol derivado de fermentación de un sustrato de carbohidrato. "Fermentaciones de alimento" incluyen procesos de fermentación para hacer bebidas alcohólicas (v.gr. , cerveza, vino) , pan, y otros productos alimenticios fermentados. Las fermentaciones de alimento preferidas son aquellas que dan por resultado la producción de alcohol o ácidos de alimentos de sustratos de carbohidratos.

"Auxiliares de procesamiento de alimento", como se usa en la presente se refiere a sustancias usadas como auxiliares de fabricación para incrementar el atractivo o utilidad de un alimento o componente alimenticio, que incluye agentes clarificadores, agentes de turbidez, catalizadores, floculantes, auxiliares de filtro, e inhibidores de cristalización, etc. Los auxiliares de procesamiento de alimento son generalmente definidos por cuerpos reguladores tales como la Food and Drug Administration en los Estados Unidos, Food Standards Australia New Zealand, o la Commission Regulation of the European Economic Community (EEC) . Véase por ejemplo 21 C.F.R. § §170.3 (o) "Definiciones" que describen los efectos funcionales físicos o técnicos para los cuales ingredientes de alimentos para humanos indirectos se pueen añadir a los alimentos en los Estados Unidos. La definición provista en la presente, que incluye aquellos para "auxiliares de procesamiento" son adoptados de la National Academy of Sciences/National Research Council National Survey of Food Industries, reportados a la Food and Drug Administration bajo el .contrato titulado "A Comprehensive Survey of Industry on the Use of Food Chemicals Generally Recognized as Safe" (Septiembre de 1972) , que es incorporada por referencia en su totalidad. Copias de ese reporte están disponibles del National Technical Information Service (NTIS) , 5285 Port Royal Rd. , Springfield, VA 22161, o en los National Archives and Records Administration (NARA) .

Como se usa en la presente, "estructuras estabilizadoras " se refieren a estructuras primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria que hacen a una proteína más estable, particularmente más termoestable como se definió anteriormente. Las proteínas son "estables" si bajo un conjunto dado de condiciones permanecen apropiadamente o adecuadamente dobladas. Las estructuras estabilizadoras de conformidad con la presente son formadas por una o más mutaciones estabilizadoras . Algunos medios de proteínas estabilizadoras no se consideran "estructuras estabilizadoras" para propósitos en la presente. Por lo tanto, formas básicas de lograr estabilidad mejorada son tan diversas como el uso de concentraciones de iones incrementadas o disminuidas, solventes inorgánicos, el uso de concentraciones de proteína más altas o más bajas, adición de proteínas auxiliares, optimización de temperaturas de almacenamiento o remoción de proteasas del medio.1 Por ejemplo, proteínas de unión a calcio y muchas enzimas que usan calcio como un co-factor son normalmente más estables a concentraciones de calcio más altas. Para los propósitos de la presente, sin embargo, "las estructuras estabilizadoras" no abarcan factores ambientales y similares, sino más bien son estructuras químicas que están dentro o que resultan de la secuencia primaria o de orden superior, y alteran la estabilidad de la proteína.

"Bloqueo de hélice" es una estrategia de estabilización que es conocida en la técnica y útil en la presente. "Motivos de bloqueo de hélice" son estructuras estabilizadoras que comprenden patrones específicos de unión de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas encontradas en, o cerca de, los extremos de hélices en proteínas y péptidos. Los patrones de secuencia de consenso de esos motivos, junto con los resultados de modelado molecular simple, se han usado para formular reglas útiles de para terminación de hélice. Véase, v.gr., Aurora y Rose, "Helix capping" Protein Science, 7(l):21-38 (1998, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Véase también Presta and Rose, "Helix signáis in proteins . " Science, 240:1632-1641 (1988).

"Puente de sal", como se usa en la presente, se refiere a enlaces de hidrógeno entre residuos de aminoácidos opuestamente cargados (v.gr., Asp-Arg) en la secuencia primaria de un polipéptido. Puentes de sal contribuyen a la estabilidad de una proteína cuando las cargas son 6-8 Angstroms o menos en alejamiento una de otra. Por lo tanto, los residuos cargados pueden ser ampliamente separados en la secuencia de aminoácidos primaria siempre que, cuando se doblan, los residuos cargados están dentro de la proximidad requerida para la interacción de las cargas. Los puentes de sal típicamente funcionan mejor cuando se combinan con otros puentes de sal. Por lo tanto, una disposición de residuos de carga, v.gr. +, -, +, -, funciona mejor que uno o más pares de residuos cargados que son remotos uno de otro en la estructura. Por ejemplo, proteínas extremofílicas , es decir proteínas de extremófilos , tales como proteínas termoestables , a menudo tienen muchos puentes de sal. Un puente de sal introducido funciona mejor si los residuos implicados tienen sólo libertad limitada en la proteína doblada .

B. Abreviaturas Las siguientes abreviaturas se aplican a menos que se indique otra cosa: AmyL a-amilasa de Bacillus licheniformis AmyQ a-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens AmyS a-amilasa Bacillus stearothermophilus AAU unidades alfa-amilasa ATCC Depósito Norteamericano de Cultivos Tipo ADNc ADN complementario C.F.R. Código de Regulaciones Federales CFU Unidades formadoras de colonia ED Equivalente de dextrosa DEAE dietilaminoetanol ADN ácido desoxirribonucleico DNS ácido 3 , 5 -dinitrosalicílico GPn grado de polimerización con n subunidades Ss sólidos secos EC Comisión de Enzimas para Clasificación de Enzimas CEE Comunidad Económica Europea EDTA ácido etilendiaminotetraacético EGTA ácido etilenglicoltetraacético FDA Administración de Alimentos y Fármacos FAO Organización para Alimentos y Fármacos de las Naciones Unidas GLP Buenas Prácticas de Laboratorio GMP Buenas Prácticas de Fabricación GRAS Generalmente Reconocido como Seguro HFCS jarabe de maíz de alto contenido de fructosa HPLC Cromatografía de Líquidos de Alto Rendimiento HS Azúcares superiores (GPn, en donde n > 3) JECFA Comité Conjunto de Expertos de la FAO/WHO sobre Aditivos Alimenticios Kb kilobases kJ kiloJoule LAT a-amilasa de B. licheniformis LU unidades de licuefacción ARNm ácido ribonucleico mensajero mg miligramos mi mililitros tm tonelada métrica (1000 kg) N Normal NTIS Servicio de Información Técnica Nacional PCR reacción en cadena de polimerasa PEG polietileneglicol Ppm partes por millones RO Osmosis inversa RT-PCR reacción en cadena de polimerasa-transcriptasa inversa SB Puente de sal SDS-PAGE Electroforesis de gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida SGA Amilasa de grano superior SKBU/g ds Unidad de a-amilasa por gramo de sólidos secos. Una unidad de ot-amilasa dextriniza 1.0 g de sustrato de dextrina límite por hora bajo las condiciones de la prueba IX SSC 0.15 M de NaCl , 0.015 M de citrato de sodio, pH 7.0 OMS Organización Mundial de la Salud p/v peso/volumen p/p peso/peso \ig microgramos µ? microlitros C. a-Amilasas Quiméricas En un primero de varios aspectos, se proveen los polipéptidos quiméricos que tienen una longitud de aproximadamente 480-515 residuos de aminoácidos. Los polipéptidos quiméricos tienen un dominio amino-terminal que comprende aproximadamente 180 o más residuos de aminoácidos contiguos de una porción N-terminal de una amilasa AmyL, y un dominio' carboxi -terminal comprende una porción carboxi-terminal de una amilasa AmyS . Los polipéptidos quiméricos no tienen la secuencia de aminoácidos primaria ya sea de la amilasa AmyL o la amilasa AmyS, sin embargo, los polipéptidos quiméricos tienen termoestabilidad incrementada en relación con por lo menos la amilasa AmyS.

Las secuencias de amilasa conocidas no son abarcadas por los polipéptidos quiméricos o amilasas quiméricas termoestables como se describe en la presente. Por ejemplo, las secuencias descritas en J". Biochem. Mol. Biol . 40: 315-324 (2006) de Sajedi et al. son específicamente excluidas. Las secuencias de a-amilasa provistas en las bases de datos públicas de los Laboratorios de Biología Molecular Europeos (EMBL) o el Centro Nacional para Información de Biotecnología (NCBI) más de un año antes de la fecha de presentación de esta descripción también son expresamente excluidas como secuencias para los polipéptidos quiméricos y las amilasas termoestables se provee en la presente. En una modalidad, el polipéptido quimérico o amilasa termoestable no tiene la secuencia de cualquier otra a-amilasa conocida, tal como aquellas descritas en las patentes de E.U.A. Nos: 6,939,703 de Van Der Laan y Aehle, 6,143,708 de Svendsen et al, o 5,830,837 de Bisgard-Frantzen et al.

Los polipéptidos quiméricos generalmente comprenden la actividad catalítica de una a-amilasa. En uso común, la alfa-amilasa ataca los enlaces de alfa-1,4 aleatorios de un sustrato tal como amilosa y/o amilopectina de almidón, lo que lo convierte a dextrinas. En el proceso de hacer eso, la a-amilasa reduce la viscosidad e incrementa la equivalencia de dextrosa (ED) . La enzima alfa-amilasa es por lo tanto frecuentemente usada para licuar y dextrinizar almidón, típicamente en suspensiones para la producción de jarabes o antes de fermentación de carbohidratos complejos. También se usan para remoción de almidón, v.gr., procedimientos, de limpieza, así como en aplicaciones ed horneado y otras aplicaciones.

Los polipéptidos quiméricos demuestran características de rendimiento alteradas en relación con otras a-amilasas tales como AmyL o AmyS. Esas características pueden incluir estabilidad alterada, intervalo de pH, estabilidad a la oxidación, y termoestabilidad . En particular, en varias modalidades, los polipéptidos quiméricos proveen mejor estabilidad a altas temperaturas (es decir, 70-120°C) . También pueden tener propiedades ventajosas en su requerimiento de calcio, resistencia a cambios en concentración de iones calcio, y/o tolerancia incrementada a extremos de pH (es decir, pH 4.0 a 6.0, o pH 8.0 a 1 1.0) para actividad.

Muchas amilasas termoestables conocidas pueden degradar almidón a temperaturas de aproximadamente 55 °C a aproximadamente 80°C o más. Un polipéptido quimérico como se provee en la presente puede retener actividad de a-amilasa después de exposición a temperaturas de hasta aproximadamente 95°C o más. Por lo tanto, los polipéptidos quiméricos y amilasas termoestables quiméricas, como se provee en la presente, son ventajosas para usarse en licuefacción a alta temperatura, así como en otros procesos que utilizan o requieren temperaturas elevadas, tales como cocción, horneado o similares.

En una modalidad, los polipéptidos quiméricos comprenden por lo menos un residuo de aminoácido sustituido en el dominio N-terminal, en relación con la amilasa AmyL, es decir la porción de la quimera que corresponde a los aminoácidos contiguos de la porción N-terminal de la quimera tiene una sustitución en relación con la secuencia encontrada en la porción N-terminal de amilasa AmyL. Esa substitución preferiblemente sirve para proveer una estructura estabilizadora, o por lo menos una parte de una estructura estábilizadora que ' mejora la termoestabilidad del polipéptido. Varias estructuras estabilizadoras pueden ser conocidas por los expertos en la técnica generalmente con respecto a termoestabilidad de proteínas. Cualesquiera de esas estructuras serán suficientes en varias modalidades del polipéptido ' quimérico. Como se definió antes, "estructuras estabilizadoras" son estructuras primarias, secundarias, terciarias, o cuaternarias que hacen a una proteína más estable, particularmente más termoestable como se definió anteriormente .

Las estructuras estabilizadoras de conformidad con la presente son formadas por una o más mutaciones estabilizadoras que forman estructuras químicas que están dentro, o que resultan de, la secuencia primaria o de orden superior, y alteran la estabilidad de la proteína.

Las proteínas realizan transición entre estados doblado y desdoblado. Las estructuras estabilizadoras cambian el equilibrio entre proteínas dobladas y desdobladas hacia el estado doblado (es decir, hacia la izquierda en el equilibrio: proteína doblada < — > proteína desdoblada) . En la técnica se sabe cómo cambiar este equilibrio adicionalmente a la izquierda, es decir para hacer una proteína más estable. Las modificaciones que desestabilizan la forma desdoblada y/o estabilizan la forma doblada son igualmente deseables como estructuras estabilizadoras. Los métodos para determinar qué estructuras serán estabilizadoras en una proteína particular son conocidos en la técnica. Un enfoque para añadir la estructura estabilizadora incluye el uso de residuos de aminoácidos que miembros más estables de la misma familia de proteínas ya usan en esa posición. Por lo tanto, un estudio de múltiples alineaciones de secuencias de proteínas de diferentes orígenes es útil.

El bloqueo de hélice, como se definió antes es una estrategia para generar estructuras estabilizadoras que se conoce en la técnica y útil en la presente. Los motivos de bloqueo de hélice son estructuras estabilizadoras que comprenden patrones específicos de enlace de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas encontradas en, o cerca de, los extremos de hélices en proteínas y péptidos. El bloqueo de hélice ha sido considerado un puente que enlaza la conformación de estructura secundaria a estructura super-secundaria. En una a-hélice, los primeros cuatro grupos >N--H y los últimos cuatro grupos >C=0 necesariamente carecen de enlaces de hidrógeno intrahelicoidales . En vez de ello, los grupos son a menudo bloqueados por parejas de enlace de hidrógeno alternativas. Distintos motivos de bloqueo han sido identificados, algunos en el N-terminal de la hélice y otros en el C-terminal. Los patrones de secuencia de consenso de esos motivos, junto con resultados de modelado molecular simple, se han usado para formular reglas generales útiles para terminación de hélice. Véase, v.gr., Aurora y Rose, "Helix capping" Protein Science, 7(l):21-38 (1998, Cold Spring Harbor Laboratory Press) . Véase también Presta y Rose, "Helix signáis in proteins . " Science, 240:1632-1641 (1988).

La estabilización entrópica cada vez mayor (v.gr., al sustituir Gly -> X, o X -> Pro, en donde X es cualquier residuo de aminoácido) es otra estrategia para generar estructuras estabilizadoras. Otras estrategias incluyen añadir uno o más puentes de disulfuro, llenar cavidades dentro de la estructura tridimensional, especialmente cuando se combina con estabilización entrópica, v.gr., Gly -> Ala, añadir uno o más puentes de sal, particularmente puentes de sal de superficie, eliminar moléculas de agua enterradas (v.gr., al sustituir Ala -> Ser), mejorar enlace de hidrógeno, mejorar estructura de hélice (v.gr., "propensión de hélice") en porciones o dominios helicoidales, mejorar estructura de cadena (v.gr., "propensión de cadena") en dominios que forman cadenas. Preferiblemente, las estructuras estabilizadoras son introducidas a través de la sustitución o mutación de uno o más residuos de aminoácidos de superficie, sin embargo, sustitución o mutación de residuos de aminoácidos enterrados dentro de una estructura de proteína de nivel superior, o en el interior de una proteína doblada también puede ser útil para estabilización. Las estructuras estabilizadoras tales como aquellas descritas anteriormente y otras conocidas en la técnica pueden ser incorporadas racionalmente en secuencias de proteína conocidas mediante el uso de una o más mutaciones de punto de estabilización ("mutaciones estabilizadoras").

Las estructuras estabilizadoras en general proveen una disminución en la energía libre de Gibbs (ñG) de la proteína doblada en relación con la proteína desdoblada (por lo tanto cambia el equilibrio termodinámico entre la proteína doblada y la desdoblada hacia la forma doblada) . Las estructuras estabilizadoras en la presente también proveen energía a la estructura, o requieren una cierta cantidad de energía para romperse. Por ejemplo, la estabilización entré-pica requiere aproximadamente 2-5 kJ/M para alterar, mientras el bloqueo de hélice requiere un intervalo de aproximadamente 1-8 kJ/M (promedio de aproximadamente 4 kJ/M) . Los enlaces de hidrógeno proveen 1-6 kJ/M, la interacción hidrofóbica provee una ganancia de aproximadamente 100 J/M para cada Ángstrom cuadrado de esa interacción. Un puente de sal puede proveer hasta 5 kJ/M, y un puente de cisterna (es decir, puente de disulfuro) provee -10 a 10 kJ/M.

En una modalidad, la estructura estabilizadora es un puente de sal formado, por lo menos en parte, por el residuo de aminoácido sustituido. Como se define en la presente, los puentes de sal comprenden enlaces de hidrógeno entre residuos de aminoácidos opuestamente cargados en la secuencia primaria de un polipéptido. Los puentes de sal con cargas de residuos que son 6-8 Angstroms, o menos, en alejamiento uno de otro en un polipéptido doblado, son preferidos en la presente. Por lo tanto, los residuos cargados pueden ser ampliamente separados en la secuencia de aminoácidos primaria siempre que, cuando son doblados, los residuos cargados están dentro de la proximidad requerida para interacción de las cargas. Los puentes de sal funcionan mejor en combinación con otros puentes de sal. Disposiciones de residuo cargado, v.gr. +, -, +, -, funcionan mejor que sólo uno o dos pares de residuos cargados que están lejos unos de otros en la estructura. Preferiblemente, por lo tanto, más de un puente . de sal es introducido. Algunos polipéptidos y amilasas provistas de conformidad con la presente tienen muchos puentes de sal. En una modalidad, los residuos de aminoácidos implicados en puente de sal introducido tienen sólo libertad limitada en la proteína doblada.

El residuo de aminoácido sustituido corresponde a la posición 187 en la amilasa AmyL, en una modalidad. En ciertas modalidades, un residuo de Asp y un residuo de Thr son sustituidos en el polipéptido quimérico para residuos de Ser consecutivos (es decir, Ser Ser) en la amilasa AmyL (Aspl90 y Thrl91 son las posiciones cognadas en AmyS) . De manera sorprendente, se encontró que esas sustituciones, v.gr., S187D-S188T, sustancialmente incrementan la termoestabilidad de los polipéptidos quiméricos en el contexto de los híbridos o quimeras AmyL-AmyS como se provee en la presente. Como se describe en forma más completa en los ejemplos de trabajo provistos con la presente, otros investigadores han reportado anteriormente que cualquier sustitución S187D en otros contextos (v.gr., en una secuencia de tipo AmyL) da por resultado una pérdida de, o disminución en, termoestabilidad. Otras sustituciones, tales como otros residuos ácidos pueden sustituir en la quimera a otros residuos naturalmente presentes en una amilasa Mail particular. En una modalidad, la amilasa AmyL en la cual se basan los aminoácidos contiguos N-terminales tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. La amilasa AmyS tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 en otras modalidades. En modalidades actualmente preferidas, el AmyL y AmyS tienen las secuencias provistas como SEQ ID NOs : 1 y 2, respectivamente.

Los polipéptidos quiméricos provistos en la presente tienen, en varias modalidades, por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 1-17. Independientemente de la identidad de secuencia, el experto en la técnica apreciará que los polipéptidos quiméricos provistos de conformidad con la presente pueden no tener la secuencia de aminoácidos precisa o exacta de SEQ ID NO: 1 ó 2. En una modalidad, el polipéptido quimérico tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a una de SEQ ID NOs : 1-17, y específicamente tiene un residuo de Asp sustituido en el polipéptido quimérico para un residuo de Ser en la posición 187 e la amilasa AmyL (numeración correspondiente a la secuencia de aminoácidos en AmyL) .

Como se describió antes, los polipéptidos quiméricos provistos aquí preferiblemente comprenden la actividad catalítica de una a-amilasa. La amilasa preferiblemente retiene por lo menos aproximadamente 50% de su actividad después de incubación a 95 °C durante aproximadamente 20, 30, 40, 50 ó 60 o más minutes. En una modalidad, el polipéptido quimérico tiene una actividad de amilasa que retiene por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o más de su actividad después de incubación a 95°C durante aproximadamente 60 minutos, o incluso por lo menos aproximadamente 80% de su actividad después de incubación a 95°C durante aproximadamente 60, 65, ó 70 minutos, o incluso aproximadamente 75, 80, 85 o más minutos. En una modalidad, una disminución en actividad, si acaso la hay, no es mayor que la disminución correspondiente en una amilasa AmyL de la cual la secuencia quimérica se obtiene en parte, incluso después de incubación durante 90 o más minutos a 95 °C. Por lo tanto, en algunas modalidades, no hay pérdida significativa o medible en actividad para ese período .

En una modalidad, los polipéptidos quiméricos provistos comprenden una actividad catalítica de una a-amilasa que tiene actividad específica mayor que la amilasa AmyL de la cual se derivó, por lo menos en parte, la porción amino-terminal .

En otro aspecto, en la presente se proveen a- amilasas quiméricas termoestables . Las amilasas quiméricas tienen muchas propiedades en común con los polipéptidos quiméricos provistos anteriormente.

Las amilasas termoestables quiméricas tienen una porción N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción N-terminal de una amilasa AmyL, y una porción C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción C-terminal de una amilasa AmyS . Las amilasas termoestables quiméricas tienen una actividad específica mayor que la amilasa AmyL y mayor termoestabilidad a 95°C que la amilasa AmyS. Las amilasas termoestables tienen una secuencia de aminoácidos primaria que es aproximadamente 475-520 residuos de longitud.

Las amilasas termoestables quiméricas proveen un número de beneficios aplicados, o beneficios de rendimiento. Por ejemplo, en una modalidad, las amilasas termoestables se caracterizan porque cuando se usan en un proceso de licuefacción para una suspensión de almidón, las amilasas quiméricas reducen la viscosidad pico de la suspensión de almidón como lo hace la amilasa AmyS en un proceso de licuefacción comparable. Las amilasas termoestables quiméricas también reducen la viscosidad final de la suspensión de almidón como lo hace la amilasa AmyL en un proceso de licuefacción comparable. Para los propósitos de la presente, un "proceso de licuefacción comparable" significa que los procesos son conducidos bajo condiciones controladas, v.gr., el proceso de licuefacción comprende condiciones especificadas de temperatura, pH, concentración de iones de calcio, y concentración del sustrato ÷ La termoestabilidad es frecuentemente expresada en la presente como la cantidad de tiempo que la amilasa retiene la actividad después de la incubación a 95 °C. En una modalidad, la amilasa quimérica retiene por lo menos 50% de su actividad después de incubación a 95 °C durante aproximadamente 30, 40, 50 o incluso 60 o más minutos. En otra, retiene por lo menos aproximadamente 60, 70 o incluso 80% de su actividad después de incubación a 95°C durante aproximadamente 60 o más minutos.

En una modalidad, la amilasa AmyL tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 y la amilasa AmyS tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2. La amilasa quimérica tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 1-17, pero no es la amilasa de SEQ ID NO: 1 ó 2, como se describió anteriormente para los polipéptidos quiméricos.

Las amilasas quiméricas además comprenden por lo menos un residuo de aminoácido sustituido en el dominio N- terminal, en relación con la amilasa AmyL, para proveer por lo menos una parte de una estructura estabilizadora que incrementa la termoestabilidad del polipéptido. Las estructuras estabilizadoras se discuten para polipéptidos quiméricos y esa discusión se aplica igualmente a amilasas termoestables quiméricas. La estructura estabilizadora es preferiblemente un puente de sal formado, por lo menos en parte, por el residuo de aminoácido sustituido, también como se discutió anteriormente. Igual que con los polipéptidos quiméricos, los residuos de aminoácidos sustituidos corresponden a una o ambas posiciones 187 y 188 en la amilasa AmyL o amilasa AmyS, y muy particularmente comprenden un residuo de Asp y/o un residuo de Thr sustituido en el polipéptido quimérico para un residuo de Ser, o si tanto un residuo de Asp como un residuo de Thr, para dos residuos de Ser consecutivos en la amilasa AmyL.

D. Composiciones que comprenden a-amilasas quiméricas También se provee una variedad de composiciones que comprenden uno o más polipéptidos quiméricos que tienen la actividad catalítica de una oí-amilasa, o amilasas termoestables quiméricas. Las composiciones incluyen por ejemplo, concentrados de enzima, mezclas de enzima, enzimas purificadas, productos de enzima parcialmente purificada, aditivos de alimentos, y productos de limpieza que contienen la a-amilasa quimérica.

Esas composiciones tienen una variedad de usos. Las composiciones también pueden proveer más de un polipéptido quimérico o amilasa, u otras amilasas, o una combinación de las mismas. Las composiciones pueden ser altamente purificadas o sólo parcialmente purificadas. Son estandardizadas en términos de unidades de actividad en ciertas modalidades. Las composiciones se pueden proveer en una variedad de formas físicas que incluyen líquidos de varias concentraciones y pureza, geles, tortas, semisólidos, o sólidos. Las composiciones están sujetas a cualquier forma física siempre que la actividad medible permanezca en la composición final. Por lo tanto, las composiciones pueden ser convenientemente liofilizadas , concentradas, congeladas, secadas por aspersión o procesadas de otra manera en una variedad de maneras conocidas o útiles. Las composiciones se pueden proveer en tamaños estándares para ciertas aplicaciones comerciales, o empacadas en forma personalizada.

En una modalidad, la composición incluye una amilasa quimérica como se describe o ilustra en la presente. Se proveen composiciones particulares que comprenden una o más de : (a) un polipéptido quimérico, tal como se describió anteriormente, que tiene una longitud de aproximadamente 480-515 residuos de aminoácidos, y que tiene un dominio amino-terminal que comprende aproximadamente 180 o más residuos de aminoácidos contiguos de una porción N-terminal de una amilasa AmyL, y un dominio carboxi-terminal que comprende una porción carboxi -terminal de una amilasa AmyS, el polipéptido quimérico tiene termoestabilidad incrementada en relación con por lo menos la amilasa AmyS, (b) una a-amilasa quimérica termoestable de aproximadamente 475-520 residuos de aminoácidos de longitud, que tiene una porción N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción N-terminal de una amilasa AmyL, y una porción C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción C-terminal de una amilasa AmyS, la a-amilasa quimérica que tiene una actividad específica mayor que la amilasa AmyL y también que tiene mayor termoestabilidad a 95°C que la amilasa AmyS; y (c) cualquier combinación de (a) un polipéptido quimérico y (b) una amilasa quimérica termoestable.

Las composiciones además pueden comprender uno o más polipéptidos adicionales. El experto en la técnica apreciará que uno o más polipéptidos adicionales pueden comprender cualquier actividad de enzima conocida. Por lo tanto, cualquiera de una variedad de enzimas adicionales se puede añadir para proveer utilidad o conveniencia adicional a las composiciones. En varias modalidades, la enzima adicional puede comprender una o más de ß-amilasas bacterianas, v.gr., BBA, a-amilasas fúngicas, v.gr., Clarase® L, o glucoamilasa, isoamilasas, isomerasas, proteasas, tales como proteasas fúngicas y bacterianas, celulasas, lignasas, hemicelulasas , lipasas, fosfolipasas , y cutinasas. Composiciones que comprenden una o más -amilasas quiméricas como se describe en la presente, junto con una combinación de cualquiera o más de las anteriores, son contempladas para usarse en la presente. Como se describió antes, las proteasas fúngicas incluyen, por ejemplo, cualesquiera actividades de enzima degradadoras de proteína obtenidas de Aspergillus spp. , tales como A. niger, A. awamori , A. oryzae; Mucor spp., v.gr., M. miehei; Rhizopüs spp., y similares, ß-amilasas (EC 3.2.1.2) son amilasas maltogénicas de exo-acción, que catalizan la hidrólisis de enlaces 1 , 4 - -glucosídicos en amilopectina y polímeros de glucosa relacionados, por lo que se libera maltosa. Las ß-amilasas han sido aisladas de varias plantas y microorganismos. Véase Fogarty et al., en PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, Vol . 15, pp. 112-115 (1979). Estas -amilasas tienen temperaturas óptimas en el intervalo de 40°C a 65°C y pH óptimo en el intervalo de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 7.0. Las ß-amilasas contempladas incluyen, pero no se limitan a, ß-amilasas de cebada Spezyme® BBA 1500, Spezyme® DBA, Optimalt™ ME, Optimalt™ BBA (Genencor International, Inc.) ; y Novozym™ WBA (Novozymes AJS) .

Las composiciones en una modalidad son preparadas o formuladas para usarse como un aditivo de alimento o como un auxiliar de procesamiento adecuado para usarse en procesamientos de alimentos. , También se provee una composición liofilizada de grado alimenticio que comprende un polipéptido quimérico o amilasa quimérica termoestable , como se describe en la presente. Esas composiciones son útiles para aplicaciones de cocción y horneado, así como cualesquiera aplicaciones a alta temperatura en donde las propiedades del almidón necesitan ser alteradas, en términos de GP.

Cuando se preparan o se formulan para usarse como un aditivo de alimentos o para usarse en procesamientos de alimentos, las composiciones deben cumplir o exceder ciertos requerimientos reguladores. Estos requerimientos sirven como una guía para el experto en la técnica en la preparación de composiciones. Por consiguiente, el experto en la técnica apreciará que aunque los requerimientos reguladores pueden diferir en varios países, generalmente la composición será muy baja en contenido de metal pesado, así como bajo en plomo y arsénico. De manera específica, el contenido de metal pesado total preferiblemente no excede aproximadamente 40 ppm, y muy preferiblemente es menor que aproximadamente 30 ppm. El contenido de plomo de las composiciones no excede aproximadamente 10 ppm, y muy preferiblemente es menor que aproximadamente 5 ó 3 ppm. El contenido de arsénico de la composición es menor que aproximadamente 3 ppm. Las composiciones también son negativas para micotoxina y contenido antibacteriano, cuando se prueban con métodos estándares .

Las composiciones también son limpias con respecto a su contenido microbiológico, preferiblemente son producidas bajo estándares de GMP o GLP a un mínimo cuando se pretenden para uso de aditivos de alimentos o como auxiliares de procesamiento de alimentos. En particular, el conteo viable total no excederá aproximadamente 5 x 104 CFU por gramo de composición. Las composiciones preferiblemente tendrán un conteo de coliformes que no excede aproximadamente 40 CFU por gramo de composición. Muy preferiblemente el conteo de coliformes no excederá aproximadamente 30 CFU por gramo. Además, las composiciones no tienen Salmonella o Shigella detectables, como se mide por métodos microbiológicos estándares. En donde las amilasas quiméricas son producidas en células hospederas, las composiciones tendrán menos de 1 CFU del organismo por gramo.

Además, las composiciones poseen un estándar de seguridad satisfactorio en términos de toxicidad y similares. En una modalidad, las composiciones no muestran potencial genotóxico en pruebas in vitro adecuadas. Las composiciones tampoco muestran efectos tóxicos en estudios de dosificación aguda y/o sub-crónica en animales.

Para los propósitos de aditivo para alimento o auxiliares de procesamiento de alimento, la producción es preferiblemente estándar, para muchas enzimas de alimentos comercialmente usadas. Por lo tanto, GMPs se usan a lo largo del proceso de producción, lo que satisface los requerimientos y especificaciones para enzimas de alimentos establecidas por ejemplo, por la FDA, o autoridades internacionales, v.gr., Food Chemicals Codex (4a edición, 1996) , el Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA) en el Compendium of Food Additives Specifications , Vol . 1, Anexo 1 Addendum 9 (2001) (y Addenda relevantes más tempranos) . Por ejemplo, las composiciones que comprenden la a-amilasa quimérica son producidas mediante el uso de un proceso tal como fermentación intermitente en alimentación, v.gr., una fermentación intermitente en alimentación sumergida, en un organismo que es generalmente reconocido como seguro, o que tiene una larga historia de uso para esos propósitos, por ejemplo para la producción de preparaciones de enzima de grado alimenticio.

Para algunos propósitos de la presente, los organismos adecuados incluyen bacterias Gram-positivas del género Bacillus que incluyen, por ejemplo, B. stearothermophilus, B. subtilis, B. licheniformis, B. brevis, y B. amyloliquefaciens. Otros que incluyen B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. lentus, B. thuringiensis, y B. alkalophilus también pueden ser útiles. Otras bacterias Gram-positivas que pueden ser útiles para la producción de algunas de las composiciones descritas e la presente incluyen Streptomyces lividans, y S. murinus . Bacterias Gram-negativas, que incluyen Escherichia coli o una especie de Pseudomonas, también se pueden usar para producir ciertas de las composiciones provistas aquí.

En la presente también se proveen composiciones que comprenden polipéptidos quiméricos y a-amilasas quiméricas termoestables que son útiles para facilitar la remoción de un sustrato para la enzima (v.gr., almidón) de una variedad de materiales que no contienen almidón (por lo tanto, sin sustrato), tales como textiles, papel, vidrio, plástico, metal, lienzos, porcelana, y similares. Debido a que esos materiales son frecuentemente removidos durante procesos de lavado o limpieza, las composiciones en una modalidad incluyen uno o más jabones, detergentes, agentes de limpieza, oxidantes o quelatador.

En una modalidad, la composición es una usada como detergente para lavandería, en otra es un detergente para lavado de vajilla. Las composiciones, para estos y otros propósitos descritos en la presente, pueden ser formulados como geles. Una variedad de esos geles se conoce en la técnica y se proveen ciertas ventajas, por ejemplo, con respecto a tiempo de contacto y condiciones para que la enzima funcione sobre el sustrato que ha de ser removido, además de un uso atractivo y conveniente para los consumidores o usuarios. La inclusión de agentes de limpieza estándares, así como detergentes, jabones, oxidantes, y/o quelatadores requiere que la actividad de -amilasa sea un poco tolerante de las condiciones encontradas no sólo en el uso final, y preferiblemente en las condiciones más concentradas o extremas encontradas en el producto mismo.

E. Caracterización de las Amilasas Quiméricas Las proteínas y enzimas tales como los polipéptidos quiméricos y a-amilasas termoestabless provistos en la presente pueden ser caracterizados por una variedad de métodos y técnicas conocidas en el campo. Las secuencias de ácido nucleico y polipéptido primario son medios útiles para comparar y analizar las amilasas que se proveen en la presente. El modelado estructural tridimensional, y/o cristalización física también son útiles. La determinación de actividad específica es frecuentemente usada para caracterizar enzimas. La actividad de las enzimas bajo una variedad de condiciones de sustrato, temperatura, pH, concentración de calcio, y otros factores se puede evaluar mediante el uso de pruebas estándares conocidas por el experto en este campo, o al diseñar nuevas pruebas a base de técnicas conocidas de evaluación de amilasas. La determinación de propiedades cinéticas de la enzima, que incluyen constantes cinéticas, tales como VmáX o Km, bajo condiciones especificadas, también es útil para caracterizar las amilasas quiméricas que se proveen en la presente. Métodos para determinar el pH óptimo para estabilidad o para prueba son conocidos en la técnica, como son los métodos para determinar la concentración de iones de calcio óptima para actividad máxima y condiciones para estabilidad máxima durante el almacenamiento de los polipéptidos quiméricos y amilasas termoestables .

La caracterización de la expresión de los polipéptidos quiméricos y -amilasas termoestabless en una célula hospedera pueden ser características útiles, por ejemplo en la determinación del potencial comercial de un proceso para hacer las proteínas y enzimas quiméricas. Para evaluar la expresión de los polipéptidos quiméricos y -amilasas quiméricas termoestables en una célula hospedera, se puede medir la cantidad de proteína expresada, la presencia o cantidad de ARNm correspondiente, o la actividad de la enzima (v.gr. , al monitorear la conversión de un sustrato a un producto) . Las pruebas adecuadas incluyen Northern y Southern blotting, RT-PCR (reacción en cadena de polimerasa- transcriptasa inversa) , e hibridación in situ, mediante el uso de una sonda de hibridación apropiadamente marcada. La medición de la cantidad de expresión de los polipéptidos quiméricos y a-amilasas quiméricas termoestables producidas en una célula hospedera particular, el régimen de expresión, o la recuperación máxima son todos ellos ejemplos de características útiles relacionadas con expresión de los polipéptidos .quiméricos y a-amilasas quiméricas termoestables provistas en la presente.

Debido a que los polipéptidos quiméricos y o¡-amilasas quiméricas termoestables tienen propiedades alteradas con respecto a termoestabilidad y actividad específica, en ciertas modalidades también tienen estabilidad alterada a oxidantes, detergentes, o quelatadores , en comparación con una -amilasa, tal como una enzima AmyL o AmyS . Por lo tanto, puede ser útil probar los polipéptidos quiméricos y -amilasas quiméricas termoestables que también proveen esas propiedades para encontrar a-amilasas más útiles. Por ejemplo, estabilidad incrementada a oxidantes, detergentes, agentes quelatadores, o incluso jabones, pueden ser ventajosos en composiciones para procedimientos de limpieza, tales como lavado, lavado de vajilla, eliminación de apresto en textiles, o remoción de manchas. El experto en la técnica apreciará que la caracterización de enzimas con respecto a su estabilidad o tolerancia de agente de limpieza, v.gr., detergentes, oxidantes, quelatadores, o jabones, se puede hacer al exponer ya sea el polipéptido a la condición deseada, que incluye el agente de limpieza, después probar la actividad bajo condiciones estándares, o al evaluar la actividad bajo la condición deseada, que incluye el agente de limpieza. El primero provee información acerca de la estabilidad del polipéptido a las condiciones adversas. El último provee información acerca de la capacidad de la enzima para tener actividad catalítica bajo las condiciones adversas.

Los polipéptidos quiméricos y a-amilasas quiméricas terraoestables descritas en la presente también pueden presentar vida media extendida a una temperatura dada, en relación con las enzimas AmyS o AmyL . En varias modalidades, la vida media puede ser incrementada por aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, o más, particularmente a temperaturas elevadas de aproximadamente 55 °C a aproximadamente 95°C o más, particularmente a aproximadamente 80°C o superior. Como se describió antes, los polipéptidos quiméricos y amilasas quiméricas termoestables con estabilidad incrementada a 95°C o superior, en relación con las a-amilasas de las cuales se deriva la quimera, particularmente la AmyS, son particularmente útiles.

En una modalidad, los polipéptidos quiméricos y oc-amilasas quiméricas termoestables provistas en la presente tienen la misma estabilidad de pH que una amilasa de la cual se deriva la quimera, tal como amilasa de tipo AmyL o de tipo AmyS. En otro aspecto, los polipéptidos quiméricos y amilasas termoestables presentan un mayor intervalo de estabilidad a cambios de pH, o intervalos óptimos o estables de pH son cambiados a un área deseada para el propósito comercial final de la enzima. Por ejemplo, en una modalidad, los polipéptidos quiméricos y amilasas termoestables pueden degradar almidón a aproximadamente pH 4.5 a aproximadamente pH 10.5. Los polipéptidos quiméricos y amilasas termoestables pueden tener una vida media más larga o actividad mayor (según la prueba) en relación con AmyL o AmyS bajo condiciones idénticas. El polipéptido de a-amilasa quimérica también puede tener una vida media de aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% o más larga bajo condiciones de pH idénticas. En otra modalidad, la a-amilasa quimérica puede tener actividad específica más alta, en comparación con una AmyL o AmyS bajo condiciones de pH idénticas. Los polipéptidos quiméricos y o-amilasas provistos pueden tener cualquier combinación de características deseables listadas en la presente.

F. Polinucleótidos que Codifican las oc-Amilasas Quiméricas En otro de sus diversos aspectos, se proveen polinucleótidos que codifican un polipéptido quimérico como se describe en la presente. Debido a que los polipéptidos codificados no se encuentran en la naturaleza, los polipéptidos se deben hacer por la mano del hombre, v.gr., sintetizados o quizás creados a través de un programa de mutagénesis dirigida y de terminación selectiva. De manera específica, los polinucleótidos codifican cualquiera de.: (a) Un polipéptido quimérico que tiene una longitud de aproximadamente 480-515 residuos de aminoácidos, y que tiene un dominio amino-terminal que comprende aproximadamente 180 a más residuos de aminoácidos contiguos de una porción N-terminal de amilasa AmyL, y un dominio carboxi -terminal que comprende una porción carboxi-terminal de una amilasa Amys ; el polipéptido quimérico tiene termoestabilidad incrementada en relación con por lo menos la amilasa AmyS, o. (b) una a-amilasa quimérica termoestable de aproximadamente 475-520 residuos de aminoácidos de longitud, y que tiene una porción N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción N-terminal de una amilasa AmyL, y una porción C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción C-terminal de una amilasa AmyS, la oc-amilasa quimérica tiene una actividad específica mayor que la amilasa AmyL, y termoestabilidad mayor a 95°C que la amilasa AmyS.

En una modalidad, el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 1-17. En varias modalidades, el polipéptido codificado tiene por lo menos aproximadamente 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 1- 17; sin embargo, el polipéptido no tiene la secuencia exacta de SEQ ID NOS : 1 ó 2.

Los polinucleotidos actualmente preferidos son ilustrados en el estado de secuencia como SEQ ID NOS: 18-34, que codifica, respectivamente, los polipéptidos que tienen secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 1-17. Como lo apreciará el experto en la técnica, es posible la variación entre polinucleotidos sin cambios significativos a una secuencia de aminoácidos codificada. En particular, es posible la variación de codón sustancial debido a la redundancia en el código genético (v.gr., "pares de bases tambaleantes"), y debido a preferencias de uso de codón entre diferentes organismos. Por consiguiente, en varias modalidades, los polinucleotidos útiles en la presente tienen secuencias que son 60% o más idénticas a los polinucleotidos de SEQ ID NOS: 18-34. Más preferidos son los polinucleotidos que tienen secuencias con 65, 70, 75 o 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NOS: 18-34. Los polinucleotidos con más de 80% de identidad, por ejemplo 85, o 90% de identidad también son preferidos para usarse en la presente. De manera similar, los polinucleotidos tienen por lo menos aproximadamente 90, 91, 92, 93, 94, 95, .96, 97, 98, o 99% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 18-34 también son útiles en la presente. La discusión anterior para todos los polinucleotidos está sujeta a la condición de que en ningún caso un polipéptido codificado debe tener la secuencia exacta de SEQ ID NOS: 1 ó 2, y el polinucleótido debe tener 100% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NO: 18 ó 19. El experto en la técnica apreciará que para usarse en la construcción o fabricación de las amilasas quiméricas novedosas, los polinucleótidos que tienen secuencias 100% idénticas a SEQ ID NO: 18 y 19 pueden ser útiles, como lo pueden hacer los polinucleótidos que codifican una secuencia de aminoácidos que es SEQ ID NO: 1 ó 2, sin embargo, estos polinucleótidos no codifican una amilasa quimérica novedosa para los propósitos de la presente.

En una modalidad, el polinucleótido es un ADN genómico, mientras que en otra modalidad, el polinucleótido es un ANDc . Debido a la degeneración del código genético, hay múltiples polinucleótidos provistos de conformidad con esta descripción que pueden codificar el mismo polipéptido. Los polinucleótidos también incluyen ARNm que codifican un polipéptido quimérico o cc-amilasa termoestable como se provee en la presente.

En una modalidad actualmente preferida, el polinucleótido que codifica al polipéptido quimérico o a-amilasa quimérica es optimizado para expresión del polipéptido quimérico en una célula hospedera a partir de un microorganismo o una planta al adaptar las composiciones del polinucleótido para favorecer aquellos codones usados preferencialmente en la célula hospedera. Técnicas para optimizar el uso de codón son conocidas en el campo. Tablas de uso de codones para varios organismos están disponibles en recursos estándares tales como textos o manuales de práctica para biotecnología.

También se proveen vectores que comprenden los polinucleótidos que codifican los polipéptidos y oc-amilasa quiméricos. Cualquier vector para mantener un polinucleótido, que produzca cantidades de un polinucleótido, que manipule una secuencia de polinucleótido o para expresar un polinucleótido in vitro o en una célula hospedera se contemplan para usarse en la presente. Ejemplos de vectores adecuados se proveen en manuales y textos de biotecnología estándares, v.gr., Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001) .

En una modalidad, los vectores preferidos son útiles para la expresión del polipéptido codificado o una célula hospedera, especialmente en una célula microbiana, tal como una célula bacteriana, o en una célula vegetal. Vectores de expresión pueden ser adaptados para expresión transitoria de las ct-amilasas quiméricas, por ejemplo, para confirmar propiedades catalíticas y otras propiedades antes de la escalación. Vectores de expresión para usarse a largo plazo, y producción a gran escala están preferiblemente adaptados para expresión estable, por ejemplo por integración en el cromosoma de la célula hospedera, o por incorporación estable de una secuencia de polinucleótido auto replicable. En una modalidad, el vector, con un constructo de ADN es transferido a una célula hospedera por un vector de expresión que comprende secuencias reguladoras operablemente enlazadas a una secuencia codificante para el polipéptido quimérico o a-amilasa quimérica.

Los vectores actualmente preferidos incluyen vectores pBR332, y pUC, tales como pUC18, y particularmente modificaciones y derivados de los mismos. Esos vectores son vectores generalmente bien conocidos adaptados para usarse en sistemas microbianos. En una modalidad, el vector es pJHlOlt, un derivado de pBR322 que es adaptado para integrarse en B.subtilis, y que contiene el sitio de multiclonación de pUC18, y varias secuencias de Bacillus útiles. Véase, v.gr. , Ferrari et al., J Bacteriology, 154:1513-1515, incorporada aquí por referencia para todos los propósitos. El uso del vector pJHlOlt en la construcción de híbridos que expresan las oc-amilasas quiméricas se ilustran en la presente (véase Métodos, bajo Ejemplos, más adelante) . La modificación de la estructura de base del vector se puede usar para facilitar mutagénesis dirigida al sitio, por ejemplo para producir quimeras que tienen puentes de sal o similares.

También se proveen células microbianas, que incluyen células de levadura, hongos o bacterias, que comprenden el vector que comprende el polinucleótido que codifica los polipéptidos quiméricos o oc-amilasas quiméricas. En una modalidad, el vector es un vector de expresión adecuado para la expresión del polipéptido codificado en la célula hospedera. En una modalidad, se provee una célula vegetal, la célula comprende un vector de expresión de planta. Los vectores para expresión en varias células hospederas son conocidos en la técnica y esos vectores, como se apreciará, contienen secuencias reguladoras requeridas tales como promotores, y similares, para facilitar la expresión del polinucleótido codificado. Promotores ilustrativos para usarse en Basillus incluyen los promotores de los genes de amilasa en AmyL, AmyQ, AmyM, o AmyS, así como los promotores de los genes xylA y xylB en B. subtilis . En una modalidad, el vector de expresión contiene uno o más promotores fuertes, ya sea constitutivos o inducibles para expresar o sobreexpresar el polipéptido codificado. En otra modalidad, el polinucleótido incluye secuencias para modificación de post traducción del péptido, tal como transportar el polipéptido expresado hacia el exterior de la célula, o a un compartimiento específico dentro de la célula hospedera, para facilitar la producción, aislamiento o purificación del polipéptido de la célula hospedera. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden incluir una o más secuencias de tal manera que el polipéptido quimérico o a-amilasa quimérica es inicialmente producida con un polipéptido heterólogo fijado a un extremo, tal como un polipéptido de señal de 23. licheniformis para promover la secreción de la proteína expresada a partir de una célula hospedera bacteriana. El polinucleótido también puede incluir secuencias de tal manera que la amilasa quimérica sea inicialmente producida con una "secuencia de purificación" , es decir, una secuencia para facilitar la purificación de la proteína expresada, en donde la "secuencia de purificación" es digerida o removida durante la purificación.

En donde la célula hospedera es una planta, se contempla que en una modalidad la planta es una planta de cultivo que se usa para la producción de almidón. Los polipéptidos quiméricos o oc-amilasas quiméricas pueden ser sobre producidos en la planta. El polipéptido quimérico o oc-amilasa quimérica puede ser sobre producido y compartimentalizado con aquella parte de la planta usada para almacenamiento de almidón, v.gr . , la semilla. Por lo tanto, la planta puede ser cosechada, el almidón puede ser aislado y la actividad de la oc-amilasa quimérica será co-purificada con el almidón. Esta modalidad es particularmente útil en donde la planta se usa para fermentación de alcohol, especialmente para etanol para combustible.

En una modalidad, la célula hospedera es de un organismo aceptable para la producción de auxiliares de procesamiento de alimento o aditivos para alimento. Actualmente, las células hospederas que son de Bacillus licheniformis, Bacillus subtillis o Bacillus stearot ermophilus son preferidas. Los plásmidos adecuados para usarse en células bacterianas que incluyen vectores para la auto- replicación en Basillus son conocidos en la técnica. En una modalidad ilustrada en la presente, la célula hospedera es B. subtilis SC6 ¿ 1 que comprende un promotor inducible por xilosa que controla un gen de competencia. Por consiguiente, las células en presencia de xilosa son competentes para unirse o absorber ADN, tales como los polinucleótidos , vectores y otros constructos provistos en la presente .

Métodos para hacer y usar los polipéptidos quiméricos y oc-amilasas quiméricas Todos los métodos para hacer y/o usar los polipéptidos quiméricos y cc-amilasas quiméricas termoestables pueden estar junto con una o más de otras enzimas de cualquier clasificación, o tipo, o actividad, como se describió anteriormente en el contexto de polipéptidos quiméricos, amilasas termoestables y las composiciones provistas en la presente. De conformidad con otro aspecto de la descripción, en la presente se proveen métodos para producir los polipéptidos de amilasa quimérica. En una modalidad, el método provisto produce por lo menos un polipéptido quimérico o una a-amilasa termoestable como se describió anteriormente en la presente. El método utiliza una célula hospedera seleccionada del grupo que consiste de Bacillus licheniformis, B. subtilis, y B. stearothermophilus, para un proceso de fermentación en donde una proteína es expresada. La proteína comprende: Un polipéptido quimérico que tiene una longitud de aproximadamente 480-515 residuos de aminoácidos, y que tiene un dominio amino-terminal que comprende aproximadamente 180 o mas residuos de aminoácido contiguos de una porción N-terminal de una amilasa AmyL, y un dominio carboxi -terminal que comprende una porción carboxi-terminal de una amilasa AmyS; el polipéptido quimérico tiene termoestabilidad incrementada en relación con por lo menos la amilasa AmyS, o una a-amilasa quimérica termoestable de aproximadamente 475-520 residuos de aminoácidos de longitud, que tiene una porción N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción N-terminal de una amilasa AmyL, y una porción C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción C-terminal de una amilasa AmyS, la a-amilasa quimérica tiene una actividad específica mayor que loa amilasa AmyL, y termoestabilidad mayor a 95°C que la amilasa AmyS. Después de que la proteína es expresada, el método provee un paso de purificar por lo menos parcialmente el polipéptido expresado, para producir así la composición.

El proceso de fermentación puede ser de cualquier tipo, aunque procesos de fermentación intermitentes en alimentación, tales como fermentación intermitente en alimentación sumergida, son útiles en la presente. Los métodos provistos comprenden además el paso de purificar adicionalmente el polipéptido quimérico en ciertas modalidades, para hacer una composición purificada que no muestra evidencia de potencial genotóxico en pruebas in vitro; y no muestra evidencia de efectos tóxicos en estudios de dosificación aguda y sub-crónica en animales. Esas composiciones son útiles como auxiliares de procesamiento de alimentos, o en algunos casos, como aditivos para alimentos directos .

El método produce una composición purificada o parcialmente purificada que comprende no más que 40 ppm de total de metales pesados, no más que 5 ppm de arsénico, no más que 10 ppm de plomo, no más que 5 x 104 total de organismos viables (CFU/g) , no más que 30 coliformes (CFU/g) , y sin Salmonella detectable, micotoxinas o actividad antibacteriana por pruebas estándares.

En varias modalidades, los métodos también son útiles para hacer composiciones parcialmente purificadas o purificadas que comprenden más de una actividad de oc-amilasa, y en algunas modalidades comprenden además por lo menos otra actividad de enzima.

También se proveen métodos que usan las composiciones que comprenden las a-amilasas quiméricas. Métodos de licuefacción de un carbohidrato complejo se proveen de manera específica. Un método de licuefacción de una suspensión de almidón que comprende: hacer una suspensión que comprende almidón, calentar la suspensión a una temperatura aceptable para licuefacción, añadir a la suspensión una composición que comprende uno o más de: (a) un polipéptido quimérico que tiene una · longitud de aproximadamente 480-515 residuos de aminoácidos, que tiene un dominio amino-terminal que comprende aproximadamente 180 o más residuos de aminoácidos contiguos de una porción N-terminal de una amilasa AmyL, y un dominio carboxi-terminal que comprende una porción carboxi-terminal de una amilasa AmyS; el polipéptido quimérico tiene termoestabilidad incrementada en relación con por lo menos la amilasa AmyS, (b) una cc-amilasa quimérica termoestable de aproximadamente 475-520 residuos de aminoácidos de longitud, que tiene una porción N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción N-terminal de una amilasa AmyL, y una porción C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción C-terminal de una amilasa AmyS, la a- amilasa quimérica tiene una actividad específica mayor que la amilasa AmyL, y termoestabilidad mayor a 95 °C que la amilasa, AmyS, o (c) una combinación de las mismas, e incubar la suspensión con la composición durante un tiempo y a una temperatura suficientes para licuar la suspensión de almidón.

Como se usa en la presente, "licuar" no significa que cada enlace de sustrato disponible sea cortado, más bien significa que el carbohidrato complejo es por lo menos parcialmente hidrolizado, como se evidencia por una reducción medible en viscosidad final, un incremento en ED de la suspensión u otra medida de un incremento en grupos reductores, dextrinas o unidades a-maltosa.

En una modalidad del método de la reivindicación, el sustrato es en almidón o un carbohidrato que comprende amilosa, o amilopectina . El método preferiblemente utiliza una suspensión que comprende aproximadamente 15-40% de almidón sobre una base de peso. La suspensión comprende aproximadamente 20-40% de almidón sobre una base de peso seco en una modalidad, en otra, la suspensión comprende entre aproximadamente 30 y aproximadamente 36 ó 37.5% de almidón. Cantidades inferiores de almidón se pueden usar, pero pueden limitarse en términos de consideraciones económicas. La viscosidad máxima, y factores relacionados, tales como entradas de energía requeridas para mezclado pueden limitar la cantidad máxima de almidón que se ha de usar en la suspensión. El experto en la técnica apreciará las consideraciones prácticas para hacer la suspensión de almidón .

En una modalidad, la adición de la composición reduce la viscosidad pico de la suspensión tanto como la adición de una amilasa AmyS usada en una licuefacción comparable, y reduce la viscosidad final de la suspensión tanto como la adición de una amilasa AmyL usada en una licuefacción comparable.

La temperatura del método de licuefacción puede variar de temperatura ambiente a por arriba de 100°C, pero muy preferiblemente es de aproximadamente 50°C a aproximadamente 95°C. En una modalidad, la temperatura es por lo menos aproximadamente 80°C a aproximadamente 100°C. La licuefacción puede tener una curva de temperatura compleja con el tiempo, por ejemplo, la reacción puede empezar a una temperatura baja y ser incrementada por métodos conocidos en la técnica a la temperatura final deseada. La temperatura también puede ser reducida después de una cantidad de tiempo específica, o después de que se ha alcanzado un punto final deseado en términos de viscosidad, valor de ED, u otra medida de licuefacción. El experto en la técnica por lo tanto apreciará que el método no necesita tener una temperatura específica para una duración particular, siempre que la actividad de la amilasa pueda funcionar a la temperatura y bajo las condiciones provistas. Otras condiciones que pueden impactar la actividad incluyen el pH y la concentración de iones calcio, además de la presencia o ausencia de uno o más de detergentes, oxidantes o quelatadores .

En una modalidad, la licuefacción es parte de la fermentación. La fermentación se usa para producir un producto alimenticio, un aditivo alimenticio, un combustible o un aditivo de combustible en algunas modalidades. En modalidades preferidas, la fermentación es para un combustible o aditivo de combustible que es un alcohol, preferiblemente etanol u otro alcohol inferior (v.gr., menor que aproximadamente C6-C8) .

En otra modalidad, la viscosidad máxima (o pico) de la suspensión es reducida a por lo menos aquella producida por la AmyS usada sola. En varias modalidades, la viscosidad final es por lo menos aquella lograda por la AmyL usada sola, y es 2-, 3-, 5-, 10-, 15-, 18-, 20-, 21-, 22-, 24-, 25-, 26-, 27-, 28-, 29-, o incluso 30 veces menor que la viscosidad máxima durante el proceso. El experto en la técnica apreciará que mientras más reducida es la viscosidad, más almidón es licuado, mayor será la producción de dextrinas (o mayor será el ED del almidón licuado resultante) .

Otro aspecto contempla el uso de enzimas adicionales con los polipéptidos quiméricos, amilasas quiméricas y composiciones provistas en la presente para licuefacción y procesamiento subsecuente de la suspensión. Por lo tanto, dos o más a-amilasas se pueden usar solas o en combinación con otras enzimas descritas en la presente. Por ejemplo, una tercera enzima puede ser otra oc-amilasa, v.gr., una a-amilasa de levadura, u otra a-amilasa, ya sea cc-amilasas de Bacillus o a-amilasas que no son de Bacillus . La licuefacción mejorada por actividad de hidrólisis incrementada durante el proceso de licuefacción incrementa la eficiencia después de los pasos de procesamiento (véase, v.gr., O 98/22613). Por ejemplo, un resultado puede ser un requerimiento disminuido para glucoamilasa durante el paso de sacarificación.

Enzimas adicionales, tales como ß-amilasas, pueden usarse con o en los polipéptidos , amilasas o composiciones. Las ß-amilasas adecuadas para usarse en la presente incluyen, pero no se limitan a, ß-amilasas de Spezyme® BBA 1500, Spezyme® DBA, Optimalt™ ME, Optimalt™ BBA (Genencor International, Inc.), y Novozym™ BA (Novozymes A/S) de cebada .

Otra enzima contemplada para usarse en la composición es una glucoamilasa (EC 3.2.1.3.). Las glucoamilasas son ' derivadas . de un microorganismo o una planta. Por ejemplo, las glucoamilasas pueden ser de origen de hongo o bacteriano. Las glucoamilasas bacterianas ilustrativas son glucoamilasas de Aspergillus, en particular glucoamilasa de A. niger Gl o G2 (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5): 1097-1102), o variantes de la misma, tal como se describe en los documentos WO 92/00381 y WO 00/04136; glucoamilasa de A. awamory (WO 84/02921) ; Glucoamilasa de A. oryzae (Agrie. Biol Chem. (1991), 55(4): 941-949), o variantes o fragmentos de las mismas. La glucoamilasa ventajosamente está presente en una cantidad no mayor que, o incluso menor que, 0.5 unidades de actividad de glucoamilasa (AGU) /g DS (es decir, unidades de actividad de glucoamilasa por gramo de sólidos secos) . La glucoamilasa se deriva de Aspergillus sp . , Talaromyces sp., Pachykytospora sp . , o Trametes sp. , y ejemplos ilustrativos de éstos son Aspergillus niger, Talaromyces emersonii , Trametes cingulata, o Pachykytospora papyracea. En una modalidad, el proceso también comprende el uso de un dominio de unión a carbohidrato del tipo descrito, por ejemplo, en el documento WO 98/22613.

Otras variantes de glucoamilasa de Aspergillus contempladas incluyen variantes para incrementar la estabilidad térmica: G137A y G139A (Chen et al. (1996), Prot . Eng. 9: 499-505); D257E y D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Eng. 8: 575-582); N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301: 275-281); enlace de disulfuro, (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35: 8698-8704); e introducción de residuos Pro en las posiciones A435 y S436 (Li et al. (1997) Protein Eng. 10: 1199-1204). Otras glucoamilasas contempladas incluyen glucoamilasas de Talaromyces, en particular derivadas de T emersonii (WO 99/28448), T. leycettanus (patente de E.U.A. No. RE 32, 153), T duponti, o T thermophilus (patente de E.U.A. No. 4,587,215). Las glucoamilasas bacterianas contempladas incluyen glucoamilasas del genero Clostridium, en particular C. thermoamylolyticum (EP 135138) y C. thermohydrosulfuricum (WO 86/01831). Las glucoamilasas adecuadas incluyen las glucoamilasas derivadas de Aspergillus orysae, tales como una glucoamilasa que tiene 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, o incluso 90% de homología a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 en WO 00/04136. También adecuadas son las glucoamilasas comerciales, tales como AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER y AMG™ E (Novozymes) ; OPTIDEX® 300 (Genencor International, Inc.); AMIGASE™ y AMIGASE™ PLUS (de DSM) ; G-ZYMEt G900 (Enzyme Bio-Systems) ; y G-ZYME® G990 ZR (glucoamilasas de A. niger y contenido de proteasa bajo) . Las glucoamilasas se pueden añadir en una cantidad de 0.02-2.0 AGU/g DS o 0.1-1.0 AGU/g DS, v.gr., 0.2 AGU/g DS .

Otra enzima que se puede añadir opcionalmente es una enzima desramificadora, tal como una isoamilasa (EC 3.2.1.68) o una pululanasa (EC 3.2.1.41). Las isoamilasa hidroliza enlaces de ramificación glucosilicos a-l,6-D- en amilopectina y dextrinas ß-limite y se pueden distinguir de las polulanasas por la incapacidad de la isoamilasa para atacar pululano y por la acción limitada de la isoamilasa sobre dextrinas a-limite. Las enzimas desramificantes se pueden añadir en cantidades efectivas bien conocidas por los expertos en la técnica.

Los polipéptidos , amilasas y composiciones provistas en la presente se pueden usar en procesos de horneado. Se pueden añadir solas o en combinación con otras enzimas para cualquiera de una variedad de propósitos. Se pueden añadir con otras amilasas, v.gr., una amilasa antirancidez para evitar o retardar la rancidez, es decir, firmeza de la miga de productos horneados. La cantidad de amilasa anti-rancidez típicamente estará en el intervalo de 0.01-10 mg de proteína de enzima por kilogramo de harina, v.gr., 0.5 mg/Kg ss. Las amilasas anti-rancidez adicionales se pueden usar en combinación con los polipéptidos quiméricos, amilasa y composiciones provistas en la presente incluyen una endo-amilasa, v.gr. , una endo-amilasa bacteriana de Bacillus . La amilasa adicional es una a-amilasa maltogénica (EC 3.2.1.133), v.gr., de Bacillus en una modalidad, Novamil® es una a-amilasa maltogénica ilustrativa de la cepa NCIB 11837 de B . stearothermophilus y se describe en Christophersen et al., Starch 50: 39-45 (1997). Otros ejemplos de endo-amilasas anti-rancidez incluyen a-amilasas bacterianas derivadas de Bacillus, tales como B. licheniformis o B. amyloliquefaciens . La amilasa antirancidez puede ser una exo-amilasa, tal como ß-amilasa, v.gr., de fuentes vegetales, tales como soya o de fuentes microbianas, tales como Bacillus .

Las fosfolipasas también se pueden usar junto con los polipéptidos quiméricos, amilasas y composiciones descritas en la presente en ciertas modalidades para aplicaciones de horneado. La fosfolipasa puede tener actividad de Ax o A2 para remover un ácido graso de los fosfolípidos , y formar un lisofosfolípido . Puede o no tener actividad de lipasa, es decir, actividad sobre sustratos de triglicérido . La fosfolipasa típicamente tiene un óptimo de temperatura en el intervalo de 30-90°C, v.gr., 30-70°C. Las fosfolipasas añadidas pueden ser de origen animal, por ejemplo de páncreas, v.gr., páncreas de bovino o porcino, veneno de serpiente o veneno de abeja. Alternativamente, la fosfolipasa puede ser de origen microbiano, v.gr., de hongos filamentosos, levaduras o bacterias, tales como el género o especie. Fuentes ilustrativas de fosfolipasas incluyen Aspergillus, A. niger; Dictyostelium, D. discoideum; Mucor, M. javanicus, M. mucedo, M. subtilissimus; Neurospora, N. crassa; Rhizomucor, R. pusillus; Rhizopus, R. arrhizus, R. japonicus, R. stolonifer; Sclerotinia, S. libertiana; Trichophyton, T. rubrum; Whetzelinia, W. sclerotiorum; Bacillus, B. megaterium, B. subtilis; Citrobacter, C. freundii; Enterobacter, E. aerogenes, E. cloacae; Edwardsiella, E. tarda; Etwinia, E. herbicola; Escherichia, E. coli; Klebsiella, K. pneumoniae; Proteus, P. vulgaris; Providencia, P. stuartii ; Salmonella, S. typhim rium; Serratia, S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella, S. flexneri ; Streptomyces, S. violeceoruber; Yersinia, Y. enterocolitica; Fusariu , F. oxysporu , (por ejemplo , cepa DSM 2672) .

La fosfolipasa se añade en una cantidad que mejora la suavidad del pan durante el periodo inicial después del horneado, particularmente Las primeras 24 horas. La cantidad de fosfolipasa típicamente estará en el intervalo de aproximadamente 0.01-10 mg de proteína de enzima por kilogramo de harina, v.gr., 0.1-5 mg/Kg. La actividad de fosfolipasa generalmente estará en el intervalo de aproximadamente 20-1000 Unidades de Lipasa (LU)/Kg de harina, en donde una Unidad de Lipasa se define como la cantidad de enzima requerida para liberar un micromol de ácido butírico por minuto a 30°C, pH 7.0, con goma arábiga como emulsionante y tributirina como sustrato.

Opcionalmente , una enzima adicional se puede usar junto con la amilasa anti-rancidez y la fosfolipasa. La enzima adicional puede ser una segunda amilasa, tal como una amiloglucosidasa una ß-amilasa, una ciclodextrina glucotransferasa, o la enzima adicional puede ser una' peptidasa, en particular una exopeptidasa, a transglutaminasa , una lipasa, una celulasa, una hemicelulasa, en particular una pentosanasa, tal como xilanasa, una proteasa, a proteína disulfuro isomerasa, v.gr., una proteína disulfuro isomerasa como se describe en WO 95/00636, por ejemplo, una glicosiltransferasa , una enzima ramificante (enzima ramificante de 1 , 4 -a-glucano) , una 4 -Oí-glucanotransferasa (dextrina glicosiltransferasa) o una oxidorreductasa , v.gr., una peroxidasa, una lacasa, una glucosa oxidasa, un piranosa oxidasa, una lipooxigenasa , una L-aminoácido oxidasa, o una carbohidrato oxidasa. La enzima (s) adicional puede ser de cualquier origen, que incluye de mamífero y de planta, y particularmente de origen microbiano (bacteriano, de levadura o de hongo) y se puede obtener por técnicas convencionalmente usadas en el campo .

La xilanasa es típicamente de origen microbiano, v.gr., derivada de una bacteria u hongo, tal como una cepa de Aspergillus, en particular de A. aculeatus, A. niger (cf. WO 91/19782), A. awamori (v.gr., WO 91/18977), o A. tubigensis (v.gr., WO 92/01793); de una cepa de Trichoderma, v.gr., T. reesei, o de una cepa de Humicola, v.gr., H. insolens (v.gr., WO 92/17573). Pentopan® y Novozym 384® son preparaciones de xilanasa comercialmente disponibles producidas a partir de Trichoderma reesei. La amiloglucosidasa puede ser una amologlucosidasa de A. niger (tal como AMG®) . Otros productos de amilasa útiles incluyen Grindamyl® A 1000 o A 5000 (disponible de Grindsted Products, Dinamarca) y Amylase® H o Amylase® P (disponible de Gist-Brocades , Los Países Bajos) . La glucosa oxidasa puede ser una glucosa oxidasa de hongo, en particular una glucosa oxidasa de Aspergillus niger (tal como Gluzyme®) . Una proteasa ilustrativa es Neutrase®. Una lipasa ilustrativa se puede derivar de cepas de Thermomyces (Humicola) , Rhizomucor, Candida, Aspergillus, Rhizopus o Pseudomonas , en particular de Thermomyces lanuginosus (Humicola lanuginosa) , Rhizomucor miehei, Candida antárctica, Aspergillus niger, Rhizopus delemar o Rhizopus arrhizus , o Pseudomonas cepacia. En modalidades específicas, la lipasa puede ser Lipasa A o Lipasa B derivada de Candida antárctica como se describe en WO 88/02775, por ejemplo, o la lipasa puede ser derivada de Rhizomucor miehei como se describe en EP 238, 023, por ejemplo, o lipasa como se describe en Humicola Lanuginosa descrita en el documento EP 305,216, por ejemplo, o Pseudomonas cepacia como se describe, por ejemplo, en EP 214,761 y WO 89/01032.

En la presente se proveen métodos para limpieza de una superficie para remover un residuo de almidón no preferido o no deseado. Los métodos comprenden los pasos de proveer una superficie que tiene un residuo de almidón que ha de ser removido, poner en contacto la superficie con una composición que comprende uno o más polipéptidos quiméricos o cc-amilasas quiméricas, durante un tiempo y a una temperatura suficientess , y bajo condiciones permisivas para dar por resultado la remoción del residuo de almidón. La superficie puede ser sobre cualquier material; por ejemplo, puede ser un plato, plata, vidrio, etc, o puede ser sobre ropa o tela. También puede ser, por ejemplo, una superficie de aparador o superficie de trabajo, o un recipiente comercial de cualquier tipo que debe ser periódicamente o regularmente limpiado.

En una modalidad, la composición comprende, por lo menos otra enzima, por ejemplo una o más de una proteasa, una lipasa, una amilasa adicional, o una combinación de las mismas. En otra modalidad, un paso de enjuague o remoción volumétrica de residuo se implementa antes del paso de contacto. Este paso remueve almidón volumétrico del proceso de limpieza para permitir que la enzima funcione sobre el sustrato restante, y más difícil de remover. El método de limpieza puede ser conducido a cualquier temperatura, pero preferiblemente la temperatura durante el paso de contacto alcanza por lo menos 50-100°C. En una modalidad, el método comprende un paso de esterilizar la superficie o tratar con vapor la superficie después de que el residuo es removido.

La composición además comprende por lo menos un detergente, oxidante, quelatador o una combinación de los mismos en varias modalidades.

En modalidades en donde la composición comprende una o más enzimas adicionales, aunque la composición puede comprender cualquier actividad de enzima útil, las siguientes modalidades pueden ofrecer ventajas particulares .

La composición puede comprender 2,6- ß-D-fructano hidrolasa, una o más oc-amilasas, y una o más de otras enzimas de limpieza, tales como una proteasa, una lipasa, una cutinasa, una carbohidrasa , una celulasa, una pectinasa, una mananasa, una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa, una lacasa, y/o una peroxidasa, y/o combinaciones de las mismas. En general, las propiedades de las enzimas escogidas posiblemente son compatibles con el detergente seleccionado (v.gr. , pH-óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y * no enzimáticos, etc), y la enzima(s) son preferiblemente provistas en cantidades efectivas.

Las proteasas de cualquier fuente son adecuadas para usarse en la presente, las cuales incluyen aquellas de origen animal, vegetal, o microbiano. Las enzimas químicamente modificadas o genéticamente manipuladas también son adecuadas. La proteasa puede tener cualquier tipo de actividad o sitio activo conocido, v.gr., actividades exo- o endo-proteol íticas de la proteasa de la serina, proteasa de tipo metalo o alcalino o ácido, según las condiciones de uso. Las proteasas alcalinas son preferidas en ciertas modalidades, como son proteasas similares a tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son subtilisinas , especialmente aquellas derivadas de Bacillus spp. , v.gr., subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309 (véase v.gr., patente de E.U.A. No. 6,287,841), subtilisina 147, y subtilisina 168 (véase v.gr., WO 89/06279) . Ejemplos de proteasas similares a tripsinas son tripsinas (v.gr., de origen de porcino o bovino), y proteasas de Fusarium (véase v.gr., WO 89/06270 y WO 94/25583). Ejemplos de proteasas útiles también incluyen, pero no se limitan a las variantes descritas en los documentos WO 92/19729 y WO 98/20115. Enzimas proteasa comercialmente disponibles adecuadas incluyen Alcalase®, Savinase®, Primase™, Duralase™, Esperase®, y Kannase™ (Novo Nordisk AJS) ; Maxatase®, Maxacal™, Maxapem™, Properase™, Purafect®, Purafect OxP™, FN2™ , y FN3™ (Genencor International, Inc.).

Las lipasas de cualquier tipo se pueden usar junto con las composiciones provistas en la presente. Las lipasas ilustrativas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Las enzimas químicamente modificadas y genéticamente manipuladas también son útiles en la presente. Ejemplos de lipasas útiles incluyen, pero no se limitan a, lipasas de Humicola (sinónimo Thermomyces) , v.gr., H. lanuginosa (T. lanuginosus) (véase, v.gr. , EP 258068 y EP 305216) y H. insolens (véase, v.gr., WO 96/13580); una lipasa de Pseudomonas (v.gr., de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligen.es; véase, v.gr., EP 218 272), P. cepacia (véase, v.gr., EP 331 376), P. stutzeri (véase, v.gr., GB 1,372,034), P. fluorescens, cepa SD 705 de Pseudomonas sp . (véase, v.gr., WO 95/06720 y WO 96/27002), P. wisconsinensis (véase, v.gr., WO 96/12012); una Bacillus lipasa (v.gr., de B. subtilis; véase, v.gr., Dartois et al. Biochemica Biophysica Acta, 1131: 253-360 (1993)), B. stearothermophilus (véase, v.gr., JP 64/744992), o B . pumilus (véase, v.gr., WO 91/16422). Las variantes de lipasa adicionales contempladas para usarse en las formulaciones incluyen aquellas descritas, por ejemplo, en WO 92/05249, WO 94/01541, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, EP 407225, y EP 260105. Algunas enzimas de lipasa comercialmente disponibles incluyen Lipolase® y Lipolase® Ultra (Novo Nordisk A/S) .

Las poliesterasas útiles en la presente incluyen pero no se limitan a aquellas descritas en WO 01/34899 (Genencor International, Inc.) y WO 01/14629 (Genencor International, Inc.), y se pueden incluir en cualquier combinación con otras enzimas descritas en la presente.

Las composiciones también se pueden combinar con otras a-amilasas que incluyen amilasas comercialmente disponibles, tales como, pero sin limitarse a Duramyl®, Termamyl™, Fungamyl® y BAN™ (Novo Nordisk AJS) , así como Rapidase®, y Purastar® (Genencor International, Inc.).

Las celulasas de cualquier tipo u origen, tales como aquellas de origen bacteriano o fúngico se pueden añadir a, o usar con, las composiciones, como pueden ser las enzimas químicamente modificadas o genéticamente manipuladas. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola , Fusarium, Thielavia, y Acremonium. Por ejemplo, las celulasas fúngicas producidas de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum descritas en las patentes de E.U.A. NOS. 4,435,307; 5,648,263; 5,691,178; 5 ,776 ,757 ; y WO 89/09259. Celulasas ilustrativas tienen beneficio para cuidado del color de textiles. Ejemplos de esas celulasas se describen, por ejemplo, en los documentos EP 0495257; EP 531 372; WO 99/25846 (Genencor International, Inc.), WO 96/34108 (Genencor International, Inc.), WO 96/11262; WO 96/29397; y WO 98/08940. Otros ejemplos son variantes de celulasa, tales como aquellas descritas en los documentos WO 94/07998; WO 98/12307; WO 95/24471; PCT/DK98/00299 ; EP 531 315; Patentes de E.U.A. Nos. 5,457,046; 5,686,593; y 5,763,254. Celulasas comercialmente disponibles incluyen Celluzyme® y Carezyme® (Novo Nordisk A/S) ; Clazinase™ y Puradax® HA (Genencor International, Inc.); y KAC-500(B)™ (Kao Corporation) .

Las peroxidasas y oxidasas también son adecuadas para usarse en o con las composiciones provistas en la presente, incluyen enzimas de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Las enzimas químicamente modificadas y genéticamente manipuladas también son muy adecuadas para usarse en la presente. Ejemplos de peroxidasas útiles incluyen per oxidasas de Coprinus v.gr., de C. cinereus, y variantes de las mismas como aquellas descritas en los documentos WO 93/24618, WO 95/10602, y O 98/15257. Las peroxidasas comercialmente disponibles incluyen Guardzyme™ (Novo Nordisk A/S), por ejemplo.

En la presente también se proveen métodos de tratamiento de un material tejido mediante el uso de oc-amilasas quiméricas descritas en la presente. Los métodos de tratamiento de materiales tejidos, tales como telas, con amilasas son conocidos en la técnica. Los métodos provistos pueden proveer la sensación y/o apariencia de un material tejido, tal como un textil o una tela. Los métodos comprenden poner en contacto el material tejido con un líquido que comprende polipéptidos quiméricos o a-amilasas termoestables . En una modalidad, el material tejido es una tela o textil. En otra modalidad, el material tejido es tratado con el líquido bajo presión. El líquido es generalmente una solución acuosa.

Los métodos se aplican típicamente durante o después de un proceso dé trama, v.gr., la trama de una tela o textil. Alternativamente, el método se puede usar durante una etapa de eliminación de apresto, o durante uno o más pasos adicionales del procesamiento del material tejido. Los métodos son útiles por que durante el proceso de trama para muchos materiales, tales como telas y textiles, el material (v.gr., los hilos que han de ser tejidos) es expuesto a esfuerzo mecánico considerable. Antes del proceso de trama, particularmente en hilos comerciales, los materiales que han de ser tejidos a menudo son revestidos con un "apresto" que comprende almidón o derivados de almidón, para incrementar su resistencia a la tensión y para evitar rompimiento. Los polipéptidos quiméricos y amilasas termoestables provistos en la presente se pueden aplicar durante o después de la trama para remover el almidón o derivado de almidón de apresto.

Los polipéptidos quiméricos y a-amilasas quiméricas provistas en la presente se pueden usar solos o con otros reactivos químicos eliminadores de apresto, tales como detergentes y/o enzimas eliminadoras de apresto para eliminar apresto en materiales tejidos tales como telas, que incluyen telas de algodón y telas que contienen algodón .

Los polipéptidos quiméricos y oc-amilasas quiméricas provistas en la presente, también tienen aplicación para métodos de acabado enzimático, han sido desarrollados para telas, por ejemplo, en la fabricación de pantalones de mezclilla. La acción de enzimas amilolíticas puede proveer suavidad a la tela y hacer algodón más accesible a los pasos de acabado enzimático subsecuentes (v.gr., para lograr una apariencia de deslavado) .

Los kits para poner en práctica los métodos anteriores de licuefacción de una suspensión de almidón, limpieza de un residuo de almidón de una superficie y para tratar un material tejido para remover revestimiento que comprende almidón o un derivado de almidón también se programa en la presente. Los kits incluyen por lo menos un polipéptido quimérico o oc-amilasa quimérica como se provee en la presente, o una composición provista en la presente, junto con instrucciones para poner en práctica los métodos correspondientes .

Todas las referencias citadas en la presente se incorporan por referencia en su totalidad aquí para todos los propósitos. Los ejemplos de trabajo provistos a continuación se proveen para describir e ilustrar adicionalmente ciertos aspectos de cc-amilasas quiméricas, y por lo tanto no deben considerarse como 1 imitantes .

Ej emplos Métodos Construcción de Cepa Híbrida Todas las secuencias de nucleótidos quiméricas son ordenadas como genes sintéticos de longitud completa de DNA 2.0 (Menlo Park, CA) . Todos los plásmidos fueron digeridos con endonucleasas de restricción EcoRI y BamHI . Los fragmentos de gen fueron extraídos en gel mediante el uso del kit de extracción Qiagen Gel Extraction Kit, de conformidad con el protocolo del fabricante. De manera similar, el vector de B . subtilis integrante, pJHlOlt, fue digerido con endonucleasas de restricción EcoRI y BamHI . Después de separación en gel de agarosa, la estructura de base de plásmido de -5 Kb se extrajo con gel y se limpio con el kit de extracción Qiagen Gel Extraction Kit. El plásmido pJHlOlt es un derivado del plásmido pBR322, originalmente aislado de E. coli, con el fragmento EcoRI /Hindl I I remplazado por el sitio de mult iclonación pUC 18 fragmento EcoRI /Hindl I I , y el fragmento Hindl I I /BamHI remplazado por la secuencia de terminador de gen de proteasa alcalina (apr) de Bacillus amyloliquefaciens, y que contenía también el fragmento Hpall/Sau3a del plásmido de Bacillus natural de pC194 que portaba el gen de cloranfenicol acetil transferasa (CAT) (de extremos romos) en el sitio PvuII. (Ferrari, FA, Nguyen A, Lang D, and Hoch JA (1983) Construction and Properties of an Integrable Plasmid for Bacillus subtilis J. Bacteriology, 154: 1513-1515).

Todos los genes quiméricos fueron ligados en pJHlOlt en los sitios EcoRI -Hindl I I mediante el uso de kit de ligación de ADN Mighty Mix de Takara (Madison, WI) . 5 µ? de la mezcla de ligación fueron transformados a células competentes químicas de E. coli Invitrogen Oneshot ToplO de conformidad con el protocolo del fabricante. Placas de carbencilina de LA + 50 ppm se usaron para selección de transformantes.

Los transformantes fueron determinados selectivamente para determinar si el gen quimérico estaba presente mediante extracción de ADN de plásmido de los clones mediante el uso del kit Qiagen Miniprep Kit. El plásmido después fue digerido con EcoRI-BamHI para ver si una banda de 2.2Kb estaba presente que indicara que el vector contenía el gen híbrido. Para verificación final, el ADN de miniprep fue extraído y secuenciado por Segueteen (Mountain View, CA) mediante el uso de los siguientes iniciadores de secuencia: Fred550-F 5' aaccgcggttgaagtcgatccc 3' (SEQ ID NO: 35) Fred610-R 5' cccggaaaatgaaaatgtgtcc 3' (SEQ ID NO: 36) Etil 1130-F 5' cgcacgttaatgaccaatactc 3' (SEQ ID NO: 37) Etil 1 190-R 5' gcttggccgggctcggtgtcat 3' (SEQ ID NO: 38) Los constructos se denominaron pJH101-AprFrl86Et , pJH101-AprFrl87Et , etc (véase Fig. 1) para referirse a la a-amilasa quimérica codificada en los mismos. ADN de plásmido que contiene el constructo quimérico fue transformado a células competentes de B. subtilis SC6.1 congeladas (también llamadas BG3594comK, genotipo DaprB, OnprE, degUHy32, oppA, OspoIIE3501, amyE : :xylRPxylAcomK-phleo) al añadir 5-10 µ? de plásmido a 200 µ? de células competentes seguido por 37% de incubación a 250 rpm durante una hora. Las células de SC6.1 B. subtilis tienen un gen de competencia (comK) que es colocado bajo un promotor inducible por xilosa, por lo que la xilosa se usó para inducir competencia para unión y adsorción de ADN. La reacción de transformación se colocó sobre LA + 5 ppm de cloranfenicol más 1% de almidón insoluble y se incubó a 37°C durante la noche.

Los transformantes que mostraron un aclaramiento (o halo) en el agar alrededor de la colonia fueron seleccionados y amplificados al aplicar mediante estrías sobre LA + 25 ppm de cloranfenicol más 1% de almidón insoluble. La formación de un halo en el agar alrededor de la colonia refleja la capacidad de las células transformadas para producir una enzima amilasa que degrada el almidón insoluble en el medio de agar. Las placas fueron incubadas a 37°C durante la noche. Las colonias con un Halo más grande se seleccionaron para crecer en matraces con agitación. Para el propósito de expresión de proteína, una sola colonia fresca se inoculó en 5ml LB + 25 ppm de cloranfenicól y se incubo a 37°C, 250 rpm, durante 6 a 8 horas. 30 µ? del pre-cultivo se añadieron a un matraz de 250 mi llenado con 30 mi de medio de cultivo (descrito más adelante) complementado con 25 ppm de cloranfenicol y 5 mM de CaCl2. Los matraces con agitación fueron incubados durante 60-65 horas a 37°C, con mezclado a 250 rpm. Los cultivos se cosecharon por centrifugación a 5000 rpm durante 20 minutos en tubos cónicos. Los sobrenadantes de cultivo enriquecidos en amilasa recombinante , se usaron para pruebas .

Los medios de cultivo fueron medios de cultivo semi-definidos enriquecidos con base en regulador de pH MOPs con urea como la fuente de nitrógeno principal, glucosa como la fuente de carbono principal y complementados con 1% de Soytone para crecimiento robusto.

Para construcción de quimeras con una mutación de puentes de sal, el vector de estructura de base original, pJH101-AprFr200Et (y 202, 228, 249, 254, 259), se usó como una plantilla para una reacción de mutagénesis dirigida al sitio mediante el uso del kit Stratagene QuikChange Site-Directed Mutagénesis. 50 ng de ADN de plantilla se usó para PCR junto con los siguientes cebadores: SS 187DT-200etc fwd 5'-gcttgggattgggaagttgacacagaaaacggcaactatg -3' (SEQ ID NO: 39) S S 187DT-200etc rev 5 ' -catagttgccgttttctgtgtcaacttcccaatcccaagc- 3 ' (SEQ 1D NO: 40) Las condiciones del termociclador fueron IX a 95°C durante un minuto, 18X a 95°C durante 50 segundos, 60°C durante 50 segundos, 68°C durante 8.5 minutos, seguido por IX a 68°C durante 7 minutos y mantenido a 4°C. Después de PCR, todas las reacciones se incubaron a 37°C, durante la noche, después de la adición de 1 µ? de Dpnl . 1.5 µ? de la reacción digerida fue transformada en Invitrogen Oneshot Top 10 de células competentes químicas de E. coli de acuerdo con los protocolos del fabricante. Las reacciones se colocaron en placas sobre LA +50 ppm de carbenicilina . Para extraer ADN de plásmido para secuenciación, se cultivaron transformantes en 5 mL LA + 50 ppm de carbenicilina a 37°C, 250 rpm, durante la noche. El ADN de plásmidos se extrajo mediante el uso de Qiagen Miniprep Kit de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN del plásmido fue secuenciado por Sequetech (Mountain. View, CA) mediante el uso de los cebadores de secuenciación listados a continuación: Fred550-F 5' aaccgcggttgaagtcgatccc 3' (SEQ ID NO: 35) Fred610-R 5' cccggaaaatgaaaatgtgtcc 3' (SEQ ID NO: 36) Etil 1 130-F 5' cgcacgttaatgaccaatactc 3' (SEQ ID NO: 37) Etil 1 190-R 5' gcttggccgggctcggtgtcat 3' (SEQ ID NO: 38) Después de determinar qué aislados tenían la secuencia correcta, 10 µ? de ADN de plásmido fue transformada a 100 µ? de células competentes de B. subtilis SC6.1 congeladas. Los transformantes se hicieron crecer como se describió anteriormente.

Prueba de Termoestabilidad Enzimática En esta prueba, la termoestabilidad de las amilasas se determinó mediante el uso de un termociclador de PCR. La actividad residual de las amilasas se midió después de incubación a una temperatura de fraguado tal como 95°C después de muestrear durante un intervalo de tiempo estándar tal como 60 minutos para obtener la curva de inactivación a esa temperatura. Para cada punto de tiempo, 110 µ? de muestra se colocó en un tubo de PCR de pared delgada y se mantuvo a 25°C durante 4 minutos en el termociclador después de que los tubos se sellaron. La temperatura se aumentó a, v.gr., 95°C. La regulación de tiempo se inició cuando se alcanzó la temperatura objetivo. Durante los intervalos de tiempo apropiados, los tubos fueron removidos y colocados sobre hielo. Las muestras se probaron para actividad de alfa-amilasa endo residual mediante el uso de la prueba de Megazyme Ceralpha como se describe más adelante.

Prueba de Megazyme Ceralpha: esta prueba es una modificación de los protocolos publicados para kit de Megazyme endo alfa-amilasa K-CERA 08/05 (Método de AOAC 2002.01) (Megazyme International, Irlanda). Viales de reactivos que contienen el sustrato, que es p-nitrofenil maltoheptaósido bloqueado en extremo no reductor (BPNPG7, 54.5 mg) y alfa glucosidasa termoestable (125 U a pH 6.0) . Para cada prueba,, los contenidos enteros de un vial se disolvieron en 10.0 mi de agua destilada. 30 mi de regulador de pH de prueba (50 mM de malato de Na, 2.6 mM de CaCl2, 50 mM de NaCl , 0.002% de Tritón X-100, pH 6.7) se añadió a la solución del vial y alícuotas de 10 mi de esta se congelaron para uso posterior. 0.79 mi de solución de sustrato en regulador de pH se añadió a un cuvette (tubo de laboratorio) (preferiblemente cubierto) . El cuvette se colocó en el soporte y se obtuvo una lectura de control. Muestras de diez µ? de enzima se añadieron después al cuvette para iniciar la prueba .

La absorbancia por minuto se midió a 400 en operación o 410 nm y los valores corregidos para dilución y concentración de proteína. El % de actividad que queda es reportado para cada enzima quimérica después de normalización a 100% para la AmyS control.

Determinación de Actividad Específica por Prueba de Azúcar Reductor de DNS En esta prueba, la actividad específica relativa de las enzimas quiméricas con respecto a enzimas no quiméricas se determinó al medir la liberación de glucosa de sustrato de almidón de papa mediante el uso del método de detección de azúcar reductor de DNS descrito más adelante.

Reactivos Usados Regulador de pH: acetato de sodio 200 mM + CaCl2 2.5 mM y Tween 20 al 0.002% Solución de DNS: 8 g NaOH se disolvieron en 300 mi de agua y 5 g de ácido 3-5 Dinitro salicílico se añadió a esta solución y se disolvió, con calentamiento si es necesario. 150 g de tartrato de sodio-potasio se añadió después a esta solución y el volumen total se llevó hasta 500 mi .

Sustrato: 4% de solución de almidón de papa (5.33 g de almidón de papa se disolvió a 100 mi de agua) . Para una solución de sustrato de trabajo, 1 parte de regulador de pH se añadió a 3 partes de solución de almidón. La solución de sustrato se hizo fresca cada día.

Procedimiento: Una alícuota de 110 µ? de sustrato se añadió a tubos de PCR de 200 µ? . Los tubos se colocaron en el termociclador de PCR. El programa se inició al mantener primero los tubos a 4°C durante algunos minutos. Durante este tiempo, 10 µ? de enzima, apropiadamente diluida con regulador de pH que contenía 0.002% de Tween 20, se añadió a los tubos. Los tubos se mezclaron rápidamente y tan pronto como el termociclador alcanzó la temperatura de reacción deseada de 95°C, la reacción en el punto de tiempo 0 fue detenida por la adición de 10 µ? de NaOH 1%. En cada punto de tiempo, un tubo de reacción fue removido y extinguido con 10 µ? de NaOH al 1%. Cuando todas las reacciones se complementaron, 32.5 µ? de cada mezcla de reacción se colocó en otro tubo de PCR de 200 µ? que contenía 75 µ? de agua. 100 µ? de solución de DNS se añadió a cada tubo y los contenidos se mezclaron uniformemente. Los tubos se incubaron a 99°C durante 5 minutos en el termociclador de PCR. Después de la incubación, los tubos se enfriaron, 150 µ? de cada mezcla de reacción se colocó en un pozo de placa de microtitulación, y la absorbancia se midió a 543 nm. La glucosa se usó como un estándar. Los valores de actividad específica se expresan como mg de glucosa/seg por mg de enzima. 4) Prueba de Medición de Viscosidad (Procedimiento de Hervidor de Vidrio/Viscosímetro) En esta prueba, la reducción de viscosidad de solución de sustrato de almidón de maíz a pH 5.8 por amilasas se midió en un hervidor de vidrio/viscosímetro. La suspensión de sustrato almidón de maíz se hizo fresca en modo intermitente con 36% de sólidos secos de harina de maíz en agua destilada y se ajustó a pH 5.8 mediante el uso de ácido sulfúrico. La suspensión fue pre-incubada durante 1 hora a 60°C en un vaso de precipitado de plástico grande. Para medición de viscosidad, el recipiente de reacción se calentó a 110°C con un baño de aceite con un revestimiento térmico alrededor del recipiente de reacción mientras se calentaba a temperatura. La suspensión se vació en el recipiente de reacción con agitación a una velocidad de rotación de 100 rpm. Muestras de enzima alfa amilasa diluidas se añadieron directamente al recipiente de reacción para dosificar la suspensión con 1.33 U/g SS. El revestimiento térmico fue removido del recipiente de reacción y el recipiente se mantuvo a 85°C para la duración del experimento. La temperatura interna y viscosidad se midió mediante el uso de un agitador superior electrónico EUROSTAR/IKA. Labortechnik control-vise P7 con salida de lectura de par de torsión cada 30 segundos durante los primeros 10 minutos, después cada 4 minutos para un total de 62 minutos.

E emplo 1 Creación de Amilasas Quiméricas Novedosas de Secuencias AmyL y AmyS Se hizo un esfuerzo para hacer quimeras de AmyL y AmyS para combinar los atributos preferidos de enzimas de tipo AmyL (AmyL y variantes de las mismas) con las de las enzimas de tipo AmyS (AmyS y variantes de las mismas) en enzimas individuales. Idealmente, las enzimas quiméricas resultantes tendrían las mejores propiedades de cada enzima -v.gr., termoestabilidad similar a la de las enzimas de tipo AmyL, combinadas con la actividad específica alta de enzimas de tipo AmyS para sustratos de almidón a alta temperatura. Esas enzimas serían útiles en licuefacción de almidón, tal como para la producción de etanol, ya que la actividad catalítica obtenida de las mismas conduciría idealmente a una velocidad inicial rápida de reducción de viscosidad y viscosidad final baja.

Una serie de moléculas quiméricas fueron construidas de AmyL y AmyS (SEQ ID NOs : 4-17) . Las quimeras comprendían una porción N-terminal derivada de AmyL (SEQ ID NO: 1), y una porción C-terminal derivada de AmyS (SEQ ID NO: 2) . La porción N-terminal de las quimeras comprendía un mínimo de 186 residuos de aminoácidos del extremo N-terminal de la secuencia de polipéptido madura de AmyL (SEQ ID NO: 1) y un máximo de aproximadamente 260 de esos residuos de aminoácidos. El resto de la quimera (es decir, la porción C- terminal) comprendía residuos de aminoácidos de la porción C- terminal de la secuencia de polipéptido madura de AmyS (SEQ ID NO : 2) . Un máximo de 297-326 residuos de aminoácidos de la región C-terminal de AmyS (SEQ ID NO: 2) , y un mínimo de 224-253 de esos residuos de aminoácidos. La porción C-terminal de las quimeras incluyó los residuos de aminoácidos K-T-T correspondientes a las posiciones 484-486 de la secuencia de AmyS madura (SEQ ID NO: 2). Las quimeras son generalmente nombradas por el último residuo de la secuencia derivada de AmyL. Véase Hybrid Strain Construction, bajo "Methods", anteriormente, y la figura 1, para descripción de procesos de clonación .

Las siguientes a-amilasas quiméricas fueron construidas para usarse en la presente en los ejemplos de trabajo: Las quimeras de primera generación incluyeron: 186, 187, 200, 202, 228, 249, 254 y 259.

Las quimeras de segunda generación incluyeron: 200SB, 202SB y 228SB.

Las quimeras de tercera generación incluyeron: 249SB, 254SB y 259SB.

Ejemplo 2 Determinación Selectiva de Termoestabilidad de a-Amilasas Quiméricas de Primera Generación Derivadas de Enzimas AmyL y AmyS Las quimeras de primera generación consistieron de mutantes de entrecruzamiento individuales en donde la porción N-terminal de la amilasa quimérica derivó de AmyL y la porción C-terminal derivó de AmyS como se describió anteriormente. Las amilasas quiméricas determinadas selectivamente para termoestabilidad fueron 186, 187, 200, 202, 228, 249, 254 y 259. Las amilasas quiméricas se probaron a 95 °C durante el curso de tiempo. Las muestras se removieron en los puntos de tiempo indicados y la actividad se midió. Para cada quimera, el por ciento de actividad es graficada versus el número de minutos la enzima se mantuvo a 95 °C, en regulador de pH de malato 50 mM, pH 5.6 con CaCl2 2.6 mM y NaCl 50 mM. Las condiciones de prueba fueron como se describe en la sección de métodos anterior. Para cada enzima, la actividad restante se calculó como un porcentaje de la actividad de la enzima que no había sido incubada a 95 °C. La enzima de control fue control de AmyS (SEQ ID NO: 3) .

Resultados y Discusión. Los resultados se muestran en la figura 2. Con base en lo que se conocía o se creía anteriormente acerca de la termoestabilidad de AmyL y AmyS, en las quimeras de entrecruzamiento individuales las expectativas fueron que mientras más grande es el número de residuos de aminoácidos de AmyL, mayor será la termoestabilidad de la quimera. Sin embargo, como se puede ver a partir de la figura 2, se descubrió inesperadamente que la a-amilasa quimérica con el menor número de residuos de aminoácidos derivados de AmyL fue la más termoestable . De manera interesante, la amilasa quimérica que contiene los primeros 187 residuos derivados de AmyL no fue altamente termoestable , a pesar de la diferencia de un solo residuo de aminoácido - que en la posición 187.

Ejemplo 3 Determinación Selectiva de Termoestabilidad de a-Amilasas Quiméricas de Segunda Generación Derivadas de Enzimas AmyL y AmyS Incorporación de Estructuras Estabilizadoras Los daros de estabilidad del ejemplo 2 mostraron que entre las a-amilasas quiméricas probadas, la quimera que contiene sólo los primeros 186 residuos de aminoácidos de la secuencia de AmyL tuvieron alta termoestabilidad, aunque las otras oí-amilasas quiméricas, que contenían más de la secuencia de AmyL, no fueron termoestables , que incluyeron la quimera 187, que difirió de la quimera 186 sólo en la posición 187. Los datos sugirieron que el reemplazo del residuo de Asp con un residuo de Ser en la posición 187 estaba directamente relacionado con la falta de termoestabilidad de la quimera 187, y posiblemente relacionada con la falta de termoestabilidad de cada una de las amilasas quiméricas que contenían más de 186 residuos de aminoácidos de AmyL.

Esto es altamente sorprendente dado que otro trabajo ha reportado que la mutación S187D en amilasas derivadas de AmyL reduce la termoestabilidad de la amilasa. Por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 6,939,703 de Van Der Laan y Aehle describe que, aunque los mutantes S187D tuvieron una actividad específica más alta bajo ciertas condiciones de prueba, la amilasa S187D tuvo una vide media sustancialmente más corta a 93°C que la amilasa de tipo silvestre . de B. 1 ichenifor is en todas las concentraciones de iones de calcio probadas. La patente de E.U.A. No. 6,143,708 de Svendson et al. también describe que las mutantes S187D de amilasa de B. 1icheniformis tuvieron actividad específica incrementada, sin embargo también reportan termoestabilidad sustancialmente reducida a 70°C ya sea a pH 4.5 ó 6.2 a través de un intervalo de concentraciones de iones de calcio.

En el contexto de las amilasas quiméricas que son el tema de esta descripción, por lo tanto fue completamente inesperado que la alteración de Ser a Asp en la posición 187 incrementara la termoestabilidad. Para probar esta hipótesis, las mutaciones S187D y S188T fueron introducidas en un número de las -amilasas quiméricas que no eran altamente termoestable en la determinación selectiva de las quimeras de primera generación. Las -amilasas quiméricas probadas incluyeron 200SB, 202SB y 228SB. Como en el ejemplo 2, la termoestabilidad de cada enzima quimérica a 95°C se comparó con la de la AmyS control. Las pruebas y cálculo de actividad restante fueron como en el ejemplo 2.

Resultados y Discusión. Los resultados de la determinación selectiva de termoestabilidad se muestran en la figura 3 para el primer conjunto de moléculas quiméricas. De manera sorprendente, la alteración de dos residuos de aminoácidos de hecho se encontró que mejoraba la estabilidad de las quimeras. Sin estar limitados a una teoría en particular de operación, se consideró que las mutaciones S187D y S188T pueden ayudar a formar un puente de sal que estabiliza el sitio activo, o la estructura terciaria global de la enzima, por lo que se incrementa la termoestabilidad. Aunque la mutación S187D en el contexto de otra secuencia de aminoácidos de AmyL es desestabilizadora con respecto a desafíos térmicos, en el contexto de las amilasas quiméricas en la presente, es evidente que el residuo de Asp presente en los mutantes S187D interactúa con uno o más residuos de aminoácidos de la porción AmyS de la molécula para obtener estabilidad incrementada. Por lo tanto, v.gr., las amilasas quiméricas con 200, 202, e incluso 228 residuos de la secuencia de AmyL tuvieron buena termoestabilidad siempre que se incluyera un puente de sal o otra estructura estabilizadora .

Ejemplo 4 Determinación Selectiva de Termoestabilidad de ot-Amylasas Quiméricas de Tercera Generación Derivadas de Enzimas AmyL y AmyS; Incorporación de Puentes de Sal que Estabilizan Quimeras con Secuencias de AmyL más Largas Con base en las observaciones de los ejemplos 2 y 3 en las quimeras de primera y segunda generación, se creía que las quimeras con porciones más largas de AmyL, y concomitantemente menos secuencia de AmyS se pudo producir. Las quimeras se produjeron hasta con 259 residuos de aminoácidos en la porción N-terminal derivada de un AmyL, para determinar si las amilasas quiméricas se pudieron producir tanto con termoestabilidad incrementada como alta actividad específica.

Las a-amilasas quiméricas probadas incluyeron 249SB, 254SB y 259SB. La termoestabilidad de cada enzima quimérica se probó a 95 °C, y se comparó con la de la AmyS control, como en los ejemplos anteriores. Las pruebas y cálculo de actividad restante también se realizaron como en los ejemplos anteriores.

Resultados y Discusión. Los resultados de la determinación selectiva de termoestabilidad para el segundo conjunto de amilasas quiméricas se muestran en la figura 4. Como se puede ver, cada una de las amilasas quiméricas muestran excelente termoestabilidad bajo las condiciones probadas. Estas enzimas quiméricas de tercera generación tuvieron 30-40% más secuencia de AmyL que las enzimas de primera generación, que no demostraron buena termoestabilidad, lo que muestra que la incorporación racional de estructuras estabilizadoras estratégicamente colocadas, particularmente puentes de sal permitieron hacer -amilasas quiméricas con las propiedades benéficas tanto de AmyL como AmyS. Estas enzimas por lo tanto serán útiles para todas las aplicaciones en donde las amilasas termoestables se usan actualmente, tal como degradación de almidón, HFCS producción, eliminación de apresto, y limpieza. Debido a su actividad específica incrementada y termoestabilidad alta, serán particularmente útiles en procesos de licuefacción de almidón ya que proveen viscosidad pico reducida, así como viscosidad final baja de la suspensión de almidón.

Ejemplo 5 Actividad Epecífica de a-Amilasas Quiméricas Derivadas de Enzimas AmyL y AmyS Las a-amilasas quiméricas probadas para actividad específica fueron 186, 228 y 228SB. La evaluación incluyó la proteína AmyL (SEQ ID NO: 1) así como la AmyS control (SEQ ID NO: 3) . La actividad específica de las cinco enzimas se determinó a 75 °C mediante el uso de almidón de papa como la prueba de sustrato y azúcar reductor de DNS para medir las velocidades de reacción relativas.

Resultados y Discusión. Los resultados de comparación de actividad específica se muestran en la figura 5 como mg/ml de glucosa producidos por segundo por mg/ml de enzima. Todas las tres amilasas quiméricas mostraron actividad específica significativamente más alta hacia el sustrato en comparación con la amilasa AmyL a esta temperatura elevada.

Ejemplo 6 Cambios de Viscosidad con Amilasas Híbridas En este ejemplo, se condujeron experimentos para medir la reducción de viscosidad en un viscosímetro para varias amilasas quiméricas: 186, 228, 202SB y 228SB, y para la AmyS control (SEQ ID NO: 3), a pH 5.8 mediante el uso de prueba de medición de viscosidad como se describe, mediante el uso de un agitador superior electrónico EUROSTAR/IKA Labortechnik Control-Vise P7 con salida de lectura de par de torsión .

Resultados y Discusión. La figura 6 muestra que la reducción de viscosidad para el sustrato de maíz entero se observa para algunas de las quimeras de amilasa probadas. Consistente con los resultados observados para estabilidad de proteína (figura 2), híbrido 186 realizada comparablemente con la AmyS control en la viscosidad final. La quimera 228 no tuvo efecto sobre la reducción de viscosidad bajo estas condiciones, consistente con su estabilidad deficiente a alta temperatura (figura 2) . Las quimeras con puente de sal 202SB y 228SB mostraron reducción de viscosidad en esta prueba. En el caso de quimera con puente de sal 228SB, la viscosidad pico fue la misma que para la AmyS control, y la viscosidad final fue menor que la observada para la AmyS control (figura 6), que muestra claramente un beneficio en rendimiento.

Será evidente para los expertos en la técnica que las -amilasas quiméricas y los métodos para hacer y usar esas amilasas quiméricas se pueden variar o . modificar sin apartarse del alcance o esencia o de esta descripción. Por lo tanto, esas variaciones y modificaciones se incluyen dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones.

1. Un polipéptido quimérico que tiene una longitud de aproximadamente 480-515 residuos de aminoácidos, caracterizado porque tiene (a) un dominio amino-terminal que comprende 180 o más residuos de aminoácidos contiguos de una porción N-terminal de una amilasa AmyL, y (b) un dominio carboxi-terminal que comprende una porción carboxi-terminal de una amilasa AmyS; con la condición de que el polipéptido quimérico no es una amilasa AmyL o amilasa AmyS de tipo silvestre, y en donde el polipéptido quimérico tiene termoestabilidad incrementada en por lo menos relación con la amilasa AmyS.

2. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende por lo menos un residuo de aminoácido sustituido en el dominio amino-terminal, en relación con la amilasa AmyL, para proveer por lo menos una parte de una estructura estabilizadora que incrementa la termoestabilidad del polipéptido.

3. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la estructura estabilizadora es un puente de sal formado, por lo menos en parte, por el residuo de aminoácido sustituido.

4. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el residuo de aminoácido sustituido corresponde a la posición 187 ó 188, o ambos, en la amilasa AmyL o AmyS . .

5. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque un residuo de Asp y un residuo de Thr son sustituidos en el polipéptido quimérico para dos residuos de Ser consecutivos en la amilasa AmyL.

6. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la amilasa AmyL tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

7. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la amilasa AmyS tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

8. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 1-17, con la condición de que el polipéptido quimérico no es SEQ ID NOS: 1 ó 2.

9. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque un residuo de Asp y un residuo de Thr son sustituidos en el polipéptido quimérico para dos residuos de Ser consecutivos en la posición 187 en la amilasa AmyL.

10. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una actividad catalítica de una a-amilasa que retiene por lo menos 50% de su actividad después de incubación a 95 °C durante 30 minutos.

11. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque retiene por lo menos aproximadamente 60% de su actividad catalítica después de incubación a 95°C durante 60 minutos.

12. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque retiene por lo menos aproximadamente 80% de su actividad catalítica después de incubación a 95°C durante 60 minutos.

13. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una actividad catalítica de una a-amilasa que tiene actividad específica mayor que la amilasa AmyL.

14. Una a-amilasa quimérica termoestable caracterizada porque comprende una porción N-terminal y una porción C-terminal; la porción N-terminal comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción N-terminal de una amilasa AmyL, y la porción C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción C- terminal de una amilasa AmyS; en donde la -amilasa quimérica tiene una actividad específica mayor que la amilasa AmyL, y mayor termoestabilidad a 95°C que la amilasa AmyS, y que tiene una secuencia de aminoácidos primaria que es aproximadamente 475-520 residuos de longitud.

15. La amilasa quimérica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque, cuando se usa en un proceso de licuefacción para una suspensión de almidón, tiene reducción de viscosidad pico aproximadamente equivalente de la suspensión de almidón como amilasa AmyS en un proceso de licuefacción comparable, y reduce la viscosidad final de la suspensión de almidón así como la amilasa AmyL en un proceso de licuefacción comparable.

16. La amilasa quimérica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque retiene por lo menos 50% de su actividad específica después de incubación a 95°C durante 30 minutos.

17. La amilasa quimérica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque retiene por lo menos 80% de su actividad específica después de incubación a 95°C .durante 60 minutos.

18. La amilasa quimérica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la amilasa AmyL tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 y la amilasa AmyS tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2.

19. La amilasa quimérica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 1-17, con la condición de que la amilasa quimérica no sea SEQ ID NO: 1 ó 2.

20. La amilasa quimérica de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque comprende por lo menos un residuo de aminoácido sustituido en el dominio N-terminal, en relación con la amilasa AmyL, para proveer por lo menos una parte de una estructura estabilizadora que incrementa la termoestabilidad del polipéptido.

21. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la estructura estabilizadora es un puente de sal formado, por lo menos en parte, por el residuo de aminoácido sustituido.

22. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el residuo de aminoácido sustituido corresponde a la posición 187 ó 188 o ambos en la amilasa AmyL o AmyS .

23. El polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque un residuo de Asp y un residuo de Thr son sustituidos en el polipéptido quimérico para dos residuos de Ser consecutivos en la amilasa AmyL.

24. Una composición caracterizada porque comprende uno o más de : un polipéptido quimérico tiene una longitud de aproximadamente 480-515 residuos de aminoácidos, que tiene un dominio amino-terminal que comprende aproximadamente 180 o más residuos de aminoácidos contiguos de una porción N-terminal de una amilasa AmyL, y un dominio carboxi -terminal que comprende una porción carboxi-terminal de una amilasa AmyS; el polipéptido quimérico que tiene termoestabilidad incrementada en relación con por lo menos la amilasa AmyS; o una a-amilasa quimérica termoestable aproximadamente 475-520 residuos de aminoácidos de longitud, que tiene una porción N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción N-terminal de una amilasa AmyL, y una porción C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción C-terminal de una amilasa AmyS, la -amilasa quimérica tiene una actividad específica mayor que la amilasa AmyL y mayor termoestabilidad a 95°C que la amilasa AmyS; o una combinación de las mismas.

25. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque comprende uno o más polipéptidos adicionales.

26. La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque uno o más polipéptidos adicionales es una enzima.

27. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque incluye uno o más detergentes o agentes de limpieza.

28. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque se formula para usarse en alimento o procesos de alimento.

29. Una composición liofilizada de grado alimenticio caracterizada porque comprende la composición de conformidad con la reivindicación 24.

30. Un polinucleótido caracterizado porque codifica : un polipéptido quimérico que tiene una longitud de aproximadamente 480-515 residuos de aminoácidos, y que tiene un dominio amino-terminal que comprende aproximadamente 180 o más residuos, de aminoácidos contiguos de una porción N-terminal e una amilasa AmyL, y un dominio carboxi-terminal que comprende una porción carboxi-terminal de una amilasa AmyS; el polipéptido quimérico tiene termoestabilidad incrementada en relación con por lo menos la amilasa AmyS; o una a-amilasa quimérica termoestable de aproximadamente 475-520 residuos de aminoácidos de longitud, y que tiene una porción N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción N-terminal de una amilasa AmyL, y una porción C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción C- terminal de una amilasa AmyS, la a-amilasa quimérica tiene una actividad específica mayor que la amilasa AmyL, y mayor termoestabilidad a 95°C que la amilasa AmyS.

31. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque codifica un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 1-17, con la condición de que el polipéptido no sea SEQ ID NO: 1 ó 2.

32. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el uso de codón es optimizado para expresión del polipéptido quimérico en un microorganismo o una planta.

33. un vector caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 32.

34. Una célula bacteriana caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 33, en donde el vector es un vector expresión.

35. Una célula hospedera caracterizada porque expresa el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 30.

36. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque es una bacteria o una planta .

37. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque es de un organismo aceptable para la producción de auxiliares de procesamiento de alimento.

38. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque es un Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis o Bacillus stearothermophilus .

39. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque es una planta y la planta se usa para producción de etanol.

40. Un método para producir una composición que comprende un polipéptido quimérico o una -amilasa termoestable , caracterizado porque comprende: utilizar una célula hospedera seleccionada del grupo que consiste de Bacillus licheniformis, B. subtilis y B. stearothermophilus, para un proceso de fermentación en donde una proteína es expresada, la proteína comprende: (a) un polipéptido quimérico que tiene una longitud de aproximadamente 480-515 residuos de aminoácidos, que tiene un dominio amino-terminal que comprende aproximadamente 180 o más residuos de aminoácidos contiguos de una porción N-terminal de una amilasa AmyL, y un dominio carboxi-terminal que comprende una porción carboxi-terminal de una amilasa AmyS; el polipéptido quimérico tiene termoestabilidad incrementada en relación con por lo menos la amilasa AmyS; o •(b) una a-amilasa quimérica termoestable de aproximadamente 475-520 residuos de aminoácidos de longitud, que tiene una porción N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción N-terminal de una amilasa AmyL, y una porción C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción C-terminal de una amilasa AmyS, la a-amilasa quimérica tiene una actividad específica mayor que la amilasa AmyL y mayor termoestabilidad a 95°C que la amilasa AmyS, y purificar por lo menos parcialmente el polipéptido expresado, por lo que se produce la composición.

41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el proceso de fermentación es un proceso de fermentación intermitente en alimentación.

42. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque comprende el paso de purificar adicionalmente el polipéptido expresado para hacer una composición purificada que ' no tiene potencial genotóxico en pruebas in vitro; y sin efectos tóxicos en estudios de dosificación agudos y sub-crónicos en animales.

43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la composición purificada comprende no más de 40 ppm de metales pesados en total, no más de 5 ppm de arsénico, no más de 10 ppm de plomo, no más de 5 x 104 de organismos viables en total (CFU/g) , no más de 30 coliformes (CFU/g) , y sin Salmonella detectable, micotoxinas o actividad antibacteriana por pruebas estándares.

44. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la composición comprende más de una actividad de oí-amilasa.

45. Un método de licuar una suspensión de almidón caracterizado porque comprende: hacer una suspensión que comprende un almidón, calentar la suspensión a una . temperatura aceptable para licuefacción, añadir a la suspensión, una composición que comprende uno o más de : un polipéptido quimérico que tiene una longitud de aproximadamente 480-515 residuos de aminoácidos, que tiene un dominio amino-terminal que comprende aproximadamente 180 o más residuos de aminoácidos contiguos de una porción N-terminal de una amilasa AmyL, y un dominio carboxi -terminal que comprende una porción carboxi -terminal de una amilasa AmyS; el polipéptido quimérico tiene termoestabilidad incrementada en relación con por lo menos la amilasa AmyS; o una a-amilOasa quimérica termoestable de aproximadamente 475-520 residuos de aminoácidos de longitud, que tiene una porción N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción N-terminal de una amilasa AmyL, y una porción C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción C-terminal de una amilasa AmyS, la a-amilasa quimérica tiene una actividad específica mayor que la amilasa AmyL, y mayor termoestabilidad a 95°C que la amilasa AmyS, o una combinación de las mismas, e incubar la suspensión con la composición durante un tiempo y a una temperatura suficientes para licuar la suspensión de almidón.

46. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la adición de la composición reduce la viscosidad pico de la suspensión así como la adición de una amilasa AmyS usada en. una licuefacción comparable, y reduce la viscosidad final de la suspensión así como la adición de una amilasa AmyL usada en una licuefacción comparable .

47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la temperatura es por lo menos de aproximadamente 80 °C a aproximadamente 100°C.

48. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la suspensión comprende aproximadamente 15-40% almidón sobre una base de peso seco.

49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la licuefacción es parte de una fermentación .

50. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque la fermentación se usa para producir un producto alimenticio, un aditivo de alimento, un combustible, o un aditivo de combustible.

51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el combustible o aditivo de combustible es un alcohol.

52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el alcohol es etanol.

53. Un método de limpieza de una superficie para remover residuo de almidón, caracterizado porque comprende los pasos de proveer una superficie que tiene residuo de almidón que ha de ser removido, poner en contacto la superficie con una composición de conformidad con la reivindicación 24, durante un tiempo y a una temperatura suficientes para obtener la remoción del residuo de almidón.

54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque la composición comprende una o más de una proteasa, una lipasa, una amilasa adicional, o una combinación de las mismas.

55. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque comprende un paso de enjuague o remoción volumétrica de residuo antes del paso de contacto.

56. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado .porque la temperatura durante el paso de contacto alcanza por lo menos 50-100°C.

57. Un método de tratamiento de un material tejido que ha sido previamente sometido a contacto con un revestimiento que comprende almidón o un derivado de almidón, caracterizado porque comprende poner en contacto el material tejido con una solución que comprende una composición de conformidad con la reivindicación 24 durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para remover sustancialmente el revestimiento del material tejido.

58. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el material tejido es una tela.

59. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el paso de contacto se realiza a una presión que es mayor que la presión atmosférica ambiental.

60. Un kit para facilitar la licuefacción de suspensión de almidón, caracterizado porque comprende por lo menos uno de : un polipéptido quimérico que tiene una longitud de aproximadamente 480-515 residuos de aminoácidos, y que comprende un dominio amino-terminal que comprende aproximadamente 180 o más residuos de aminoácidos contiguos de una porción N-terminal de una amilasa AmyL, y un dominio carboxi -terminal que comprende una porción carboxi-terminal de una amilasa AmyS; el polipéptido quimérico tiene termoestabilidad incrementada en relación con por lo menos la amilasa AmyS; o una a-amilasa quimérica termoestable de aproximadamente 475-520 residuos de aminoácidos de longitud, y que comprende una porción N-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción N-terminal de una amilasa AmyL, y una porción C-terminal que comprende una secuencia de aminoácidos contigua de una porción C-terminal de una amilasa AmyS, la a-amilasa quimérica tiene una actividad específica mayor que la amilasa AmyL y mayor termoestabilidad a 95°C que la amilasa AmyS, e instrucciones para el uso del kit en la licuefacción de una suspensión de almidón.