CN111094576A - 用于增加芽胞杆菌属中蛋白质产生的经修饰的5′-非翻译区(utr)序列 - Google Patents

Abstract

本公开总体上是能够产生增加量的工业相关目的蛋白的经修饰的芽孢杆菌属菌株及其宿主细胞。本公开的其他实施例涉及分离的多核苷酸、其载体、其DNA(表达)构建体、经修饰的芽孢杆菌属(子代)细胞、以及制造和使用它们的方法，所述分离的多核苷酸包含经修饰的枯草芽孢杆菌aprE 5′‑非翻译区(5′‑UTR)核酸序列。

Description

用于增加芽胞杆菌属中蛋白质产生的经修饰的5′-非翻译区 (UTR)序列

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年9月13日提交的美国临时专利号62/558304的权益，将该临时专利通过引用以其全文特此并入。

技术领域

本公开总体上涉及细菌学、微生物学、遗传学、分子生物学、酶学、工业蛋白质生产等领域。更特别地，本公开的某些实施例涉及能够产生增加量的工业相关目的蛋白的经修饰的芽孢杆菌属(Bacillus)菌株及其宿主细胞。本公开的其他实施例涉及分离的多核苷酸、其载体、其DNA(表达)构建体、经修饰的芽孢杆菌属(子代)细胞、以及制造和使用它们的方法，所述分离的多核苷酸包含经修饰的枯草芽孢杆菌aprE 5′-非翻译区(5′-UTR)核酸序列。

序列表的引用

命名为“20180823_NB41250WOPCT_SequenceListing_ST25.txt”的文本文件序列表的电子提交的内容创建于2018年8月23日，并且大小为38KB，将其通过引用以其全文特此并入。

背景技术

革兰氏阳性细菌如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)等由于其优异的发酵特性和高产率(例如，高达25克/升培养物；Van Dijl和Hecker,2013年)经常被用作用于产生工业相关蛋白质的微生物工厂。例如，枯草芽孢杆菌因其产生食品、纺织品、洗衣、医疗器械清洁、制药工业等所必需的α-淀粉酶(Jensen等人,2000；Raul等人,2014)和蛋白酶(Brode等人,1996)而为人熟知(Westers等人,2004)。由于这些非致病性革兰氏阳性细菌产生完全不含毒性副产物(例如脂多糖；LPS，也称为内毒素)的蛋白质，因此它们已经获得了欧洲食品安全局的“安全资格认定”(QPS)状态，并且其许多产品获得了美国食品和药品管理局的“通常认为安全”(GRAS)状态(Olempska-Beer等人,2006；Earl等人,2008；Caspers等人,2010)。

因此，微生物宿主细胞中蛋白质(例如，酶、抗体、受体等)的产生在生物技术领域中是特别有意义的。同样，用于产生和分泌一种或多种目的蛋白的芽孢杆菌属宿主细胞的优化具有高度相关性，特别是在如下工业生物技术环境中，其中当蛋白质以大的工业产量生产时所述蛋白质产率的微小改善具有重大意义。更特别地，地衣芽孢杆菌是具有高工业重要性的芽孢杆菌属物种宿主细胞，因此，对于构建新的和改善的地衣芽孢杆菌产生菌株，高度希望具有遗传修饰和工程化地衣芽孢杆菌宿主细胞以获得增强的/增加的蛋白质表达/产生的能力。

因此，本文所示出的公开涉及对于获得和构建具有增加的蛋白质产生能力等的芽孢杆菌属宿主细胞(例如蛋白质产生宿主细胞、细胞工厂)的高度希望和未满足的需求。

发明内容

本公开总体上涉及能够产生增加量的工业相关目的蛋白的经修饰的芽孢杆菌属菌株及其宿主细胞。更特别地，本公开的某些实施例涉及分离的多核苷酸，其包含源自野生型枯草芽孢杆菌aprE5′-非翻译区(WT-5′-UTR)核酸序列SEQ ID NO:1的经修饰的枯草芽孢杆菌aprE 5′-非翻译区(mod-5′-UTR)核酸序列。在某些实施例中，所述mod-5′-UTR包含SEQID NO:2。在其他实施例中，所述mod-5′-UTR进一步包含位于所述mod-5′-UTR的5′并有效地连接到所述mod-5′-UTR的上游(5′)启动子区核酸序列。

在另一个实施例中，所述mod-5′-UTR进一步包含编码目的蛋白的下游(3′)可读框(ORF)核酸序列，其中所述ORF序列位于所述mod-5′-UTR的3′并有效地连接到所述mod-5′-UTR。在某些其他实施例中，所述分离的多核苷酸按5′至3′方向包含式(I)：

(I)：[Pro][mod-5′-UTR][ORF]；

其中[Pro]是在芽孢杆菌属物种细胞中有效的启动子区核酸序列，[mod-5′-UTR]是经修饰的枯草芽孢杆菌aprE 5′非翻译区(mod-5′-UTR)核酸序列，并且[ORF]是编码目的蛋白(POI)的可读框核酸序列，其中所述[Pro]、[mod-5′-UTR]和[ORF]核酸序列是有效地连接的。在其他实施例中，载体或DNA表达构建体包含本公开的分离的多核苷酸。在又其他的实施例中，重组芽孢杆菌属物种细胞包含本公开的分离的多核苷酸。在某些实施例中，所述芽孢杆菌属物种是地衣芽孢杆菌细胞。

在另一个实施例中，本公开涉及分离的多核苷酸，其包含源自野生型芽孢杆菌属物种5′-UTR(WT-5′-UTR)序列的经修饰的芽孢杆菌属物种5′-UTR(mod-5′-UTR)核酸序列，所述分离的经修饰的多核苷酸包含按5′至3′方向以有效组合的式(II)的核酸序列：

(II)：[TIS][mod-5′UTR][tss密码子]

其中[TIS]是转录起始位点(TIS)，[mod-5′-UTR]包含经修饰的枯草芽孢杆菌5′-UTR核酸序列，并且[tss密码子]是三(3)核苷酸翻译起始位点(tss)密码子。在某些实施例中，所述[mod-5′-UTR]序列包含SEQ ID NO:2。在另一个实施例中，所述多核苷酸进一步包含(a)位于所述[TIS]的上游(5′)并有效地连接到所述[TIS]的核酸启动子序列，所述启动子序列在枯孢杆菌属物种细胞中是有效的，以及(b)位于所述tss密码子的下游(3′)并有效地连接到所述tss密码子的ORF核酸序列，其中所述ORF序列编码POI。在其他实施例中，载体或DNA表达构建体包含本公开的分离的多核苷酸。在特定的实施例中，重组芽孢杆菌属物种细胞包含式(II)的多核苷酸。在某些其他实施例中，所述芽孢杆菌属物种细胞是地衣芽孢杆菌细胞。

在另一个实施例中，本公开涉及分离的多核苷酸，其包含按5′至3′方向并且以有效组合的式(III)的核酸序列，

(III)：[5′-HR][TIS][mod-5′-UTR][tss密码子][3′-HR]，

其中[TIS]是转录起始位点(TIS)，[mod-5′-UTR]包含经修饰的枯草芽孢杆菌5′-UTR核酸序列，[tss密码子]是三(3)核苷酸翻译起始位点(tss)密码子，[5′-HR]是5′-核酸序列同源区并且[3′-HR]是3′-核酸序列同源区，其中所述5′-HR和3′-HR分别与紧邻所述[TIS]序列的上游(5′)和紧邻所述[tss密码子]序列的下游(3′)的基因组(染色体)区域(基因座)具有足够的同源性，以实现通过同源重组将引入的多核苷酸构建体整合到经修饰的芽孢杆菌属细胞基因组中。在某些实施例中，载体或DNA表达构建体包含式(III)的多核苷酸。在特定实施例中，芽孢杆菌属物种细胞包含所述多核苷酸。在特定实施例中，所述芽孢杆菌属物种细胞是地衣芽孢杆菌细胞。

在又其他实施例中，本公开的可读框(ORF)核酸序列编码目的蛋白(POI)，其中所述POI选自由以下组成的组：乙酰酯酶、芳基酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶(arabinase)、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、糖基水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶及其组合。

在又其他的实施例中，本公开涉及分离的多核苷酸，其包含源自野生型芽孢杆菌属物种5′-UTR(WT-5′-UTR)序列的经修饰的5′-UTR(mod-5′-UTR)核酸序列，所述分离的多核苷酸包含按5′至3′方向并且以有效组合的式(IV)的核酸序列：

(IV)：[TIS][5′-UTR-ΔxN][tss密码子]，

其中[TIS]是转录起始位点(TIS)，[tss密码子]是三(3)核苷酸翻译起始位点(tss)密码子并且[5′-UTR-ΔxN]是源自野生型芽孢杆菌属物种5′-UTR核酸序列的经修饰的芽孢杆菌属物种5′UTR核酸序列，其中所述mod-5′-UTR核酸序列[5′-UTR-ΔxN]在所述WT-5′-UTR核酸序列的远(3′)端处包含“x”个核苷酸(“N”)的缺失(-Δ)。

在另一个实施例中，本公开涉及分离的多核苷酸，其包含源自野生型芽孢杆菌属物种5′-UTR(WT-5′-UTR)序列的经修饰的5′-UTR(mod-5′-UTR)核酸序列，所述分离的多核苷酸包含按5′至3′方向并且以有效组合的式(V)的核酸序列：

(V)：[TIS][5′-UTR +ΔxN][tss密码子]，

其中[TIS]是转录起始位点，[tss密码子]是三(3)核苷酸翻译起始位点(tss)密码子并且[5′-UTR +ΔxN]是源自野生型芽孢杆菌属物种5′-UTR核酸序列的经修饰的芽孢杆菌属物种5′-UTR核酸序列，其中所述mod-5′-UTR核酸序列[5′-UTR +ΔxN]在所述野生型芽孢杆菌属物种5′-UTR核酸序列的远(3′)端处包含“x”个核苷酸(“N”)的添加(+Δ)。

在其他实施例中，本公开涉及经修饰的芽孢杆菌属物种(子代)细胞，当将其培养在适于产生异源目的蛋白(POI)的培养基中时产生增加量的异源POI，所述经修饰的芽孢杆菌属细胞包含引入的表达构建体，所述表达构建体包含按5′至3′方向并且以有效组合的式(I)的核酸序列，

(I)：[Pro][mod-5′-UTR][ORF]；

其中[Pro]是在芽孢杆菌属物种细胞中有效的启动子区核酸序列，[mod-5′-UTR]是经修饰的枯草芽孢杆菌非翻译区(mod-5′-UTR)核酸序列，并且[ORF]是编码目的蛋白(POI)的可读框核酸序列，其中所述[Pro]、[mod-5′-UTR]和[ORF]核酸序列是有效地连接的。其中，当在相似条件下培养时，相对于产生相同POI的未经修饰的芽胞杆菌属(亲本)细胞，所述经修饰的芽孢杆菌属(子代)细胞产生增加量的异源POI。在某些实施例中，所述mod-5′-UTR包含SEQ ID NO:2。在其他实施例中，所述细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在其他实施例中，所述ORF序列编码选自由以下组成的组的POI：乙酰酯酶、芳基酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、糖基水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶及其组合。

在某些其他实施例中，本公开涉及在经修饰的芽孢杆菌属细胞中产生增加量的异源目的蛋白(POI)的方法，所述方法包括：(a)向亲本芽孢杆菌属物种细胞中引入表达构建体，所述表达构建体包含按5′至3′方向并且以有效组合的核酸序列[Pro][mod-5′-UTR][ORF]，其中[Pro]是在芽孢杆菌属物种细胞中有效的启动子区核酸序列，[mod-5′-UTR]是具有SEQ ID NO:2的mod-5′-UTR核酸序列，并且[ORF]是编码目的蛋白(POI)的可读框核酸序列，以及(b)在适于产生异源POI的培养基中培养步骤(a)的经修饰的芽孢杆菌属物种细胞，其中相对于步骤(b)的相同培养基中培养的芽孢杆菌属对照细胞，所述经修饰的芽孢杆菌属(子代)细胞产生增加量的POI，其中所述芽孢杆菌属对照细胞包含引入的表达构建体，所述表达构建体包含按5′至3′方向并且以有效组合的核酸序列[Pro][WT-5′-UTR][ORF]，其中所述[Pro]和[ORF]核酸序列与步骤(a)中的[Pro]和[ORF]序列相同且所述[WT-5′-UTR]包含SEQ ID NO:1。在特定的实施例中，所述芽孢杆菌属细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另一个实施例中，所述ORF序列编码选自由以下组成的组的POI：乙酰酯酶、芳基酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、糖基水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶及其组合。

在又其他的实施例中，本公开涉及在经修饰的芽孢杆菌属细胞中产生增加量的内源目的蛋白(POI)的方法，所述方法包括：(a)获得产生内源POI的亲本芽孢杆菌属细胞，(b)向步骤(a)的细胞中引入多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体包含按5′至3′方向并且以有效组合的式(VI)的核酸序列，

(VI)：[5′-HR][mod-5′-UTR][3′-HR]，

其中[mod-5′-UTR]包含SEQ ID NO:2，[5′-HR]是与编码内源POI的内源GOI的内源野生型5′-UTR(WT-5′-UTR)序列的上游(5′)紧邻的基因组基因座具有同源性的5′-核酸序列同源区，并且[3′-HR]是与编码内源POI的内源GOI的内源WT-5′-UTR序列的下游(3′)紧邻的基因组基因座具有同源性的3′-核酸序列同源区，其中5′-HR和3′-HR与所述基因组基因座具有足够的同源性，以实现通过同源重组将引入的mod-5′-UTR多核苷酸构建体整合到经修饰的芽孢杆菌属细胞的基因组中，从而用SEQ ID NO:2的mod-5′-UTR取代内源WT-5′-UTR，以及(c)在适于产生所述内源POI的培养基中培养步骤(b)的经修饰的芽孢杆菌属物种细胞，其中当在相似条件下培养时，相对于步骤(a)的亲本细胞，步骤(c)的经修饰的细胞产生增加量的内源POI。

附图说明

图1展示了启动子-WT 5’UTR-起始密码子核酸序列(顶部序列，标记为“1”)相比于启动子-mod 5’UTR-起始密码子核酸序列(底部序列，标记为“2”)的核酸序列比较。对于这两个序列，-35区是加下划线的，-10区是加框的，转录起始位点用“+1”标记，5’UTR序列是粗体字符，并且核糖体结合位点(RBS)是粗体斜体。竖线指示这两个序列之间的同一性。序列“1”是含有枯草芽孢杆菌aprE基因的WT-5’UTR的原始序列。序列“2”含有经修饰的aprE 5’UTR(mod-5’UTR)，用-1A(Δ腺嘌呤)改变RBS和起始密码子(ATG)之间的间隔。

生物学序列简述

SEQ ID NO:1是野生型枯草芽孢杆菌aprE 5′UTR的核酸序列(下文中，“WT-5′-UTR”)。

SEQ ID NO:2是经修饰的枯草芽孢杆菌aprE 5′UTR的核酸序列(下文中，“mod-5′-UTR”)。

SEQ ID NO:3是编码包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的comK转录因子蛋白质的人工核酸序列。

SEQ ID NO:4是包含“WT-5'-UTR”表达构建体的人工核酸序列。

SEQ ID NO:5是包含“mod-5'-UTR”表达构建体的人工核酸序列。

SEQ ID NO:6是与地衣芽孢杆菌细胞的5′catH基因序列具有序列同源性的人工5′同源臂(即，5′-HR)核酸序列。

SEQ ID NO:7是包含catH基因的人工核酸序列。

SEQ ID NO:8是包含spoVGrrnIp杂合启动子的人工核酸序列。

SEQ ID NO:9是编码地衣芽孢杆菌α-淀粉酶蛋白质信号序列的核酸序列。

SEQ ID NO:10是编码SEQ ID NO:13的嗜热脂肪土芽孢杆菌(G.stearothermophilus)变体α-淀粉酶蛋白质的人工核酸序列。

SEQ ID NO:11是包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶终止子序列的核酸序列。

SEQ ID NO:12是与地衣芽孢杆菌细胞的3′catH基因序列具有序列同源性的人工3′同源臂(即，3′-HR)核酸序列。

SEQ ID NO:13是变体嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO:14是人工核酸序列--菌落PCR“WT-5′UTR”构建体

SEQ ID NO:15是人工核酸序列--菌落PCR(-1A 5′UTR)“mod-5′UTR”构建体

SEQ ID NO:16是人工引物核酸序列。

SEQ ID NO:17是人工引物核酸序列。

SEQ ID NO:18是人工引物核酸序列。

SEQ ID NO:19是人工引物核酸序列。

SEQ ID NO:20是人工引物核酸序列。

SEQ ID NO:21是由SEQ ID NO:3编码的comK蛋白质的氨基酸序列。

具体实施方式

本公开总体上涉及用于产生和构建具有增加的蛋白质产生能力等的芽孢杆菌属(宿主)细胞(例如蛋白质产生宿主细胞、细胞工厂)的组合物和方法。本公开的某些实施例涉及分离的多核苷酸(包含经修饰的枯草芽孢杆菌aprE 5′-非翻译区(5′-UTR)核酸序列)、其载体、其DNA(表达)构建体、经修饰的芽孢杆菌属(子代)细胞、以及制造和使用它们的方法。在其他实施例中，本公开涉及包含经修饰的枯草芽孢杆菌aprE 5′-非翻译区(5′-UTR)核酸序列的分离的多核苷酸。在某些实施例中，本公开的经修饰的5′-UTR进一步包含上游(5′)启动子区核酸序列(其位于5′并有效地连接到所述经修饰的5′-UTR)和/或下游(3′)可读框(ORF)核酸序列(编码目的蛋白)(其位于3′并有效地连接到所述经修饰的5′-UTR)。

在另一个实施例中，本公开涉及分离的多核苷酸，其按5′至3′方向包含式(I)：

(I)：[Pro][mod-5′-UTR][ORF]；

其中[Pro]是在芽孢杆菌属物种细胞中有效的启动子区核酸序列，[mod-5′-UTR]是经修饰的5′-UTR核酸序列，并且[ORF]是编码目的蛋白(POI)的可读框核酸序列，其中所述[Pro]、[5′-UTR]和[ORF]核酸序列是有效地连接的。在其他实施例中，本公开涉及包含本公开的分离的多核苷酸的载体和DNA构建体。

在其他实施例中，本公开的ORF序列编码选自由以下组成的组的POI：乙酰酯酶、芳基酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、糖基水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶及其组合。

在其他实施例中，本公开涉及经修饰的芽孢杆菌属物种(子代)细胞，其在适于产生异源POI的培养基中培养时产生增加量的异源目的蛋白(POI)，所述经修饰的芽孢杆菌属细胞包含引入的包含式(I)的核酸序列的表达构建体，其中，当在相似条件下培养时，相对于产生相同POI的未经修饰的芽胞杆菌属(亲本)细胞，所述经修饰的芽孢杆菌属(子代)细胞产生增加量的异源POI。

I.定义

鉴于本公开的芽孢杆菌属菌株和宿主细胞(包括但不限于(亲本)芽孢杆菌属细胞、经修饰的芽孢杆菌属(子代)细胞)、如本文所述的其组合物和制造和使用它们的方法，定义了以下术语和短语。

除非本文另有指示，否则本文描述的一种或多种芽孢杆菌属菌株(即，宿主细胞)可通过通常用于分子生物学、微生物学、蛋白质纯化、蛋白质和DNA测序以及各种重组DNA的方法/技术的常规技术制备和使用。

除非本文另有定义，否则本文所使用的全部科技术语都具有如本领域普通技术人员通常理解的相同含义。

本文提供的任何定义将在说明书的上下文中作为整体进行解释。除非上下文另有明确指示，如本文所使用的，单数“一个/一种”(a/an)和“该/所述”(the)包括复数。除非另有指示，否则核酸序列从左至右以5′至3′方向书写；并且氨基酸序列从左至右以氨基至羧基方向书写。本文使用的每一数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同此类较窄数值范围在本文中全部明确写出一样。

如本文与数值结合所用的，术语“约”是指数值的+/-0.5的范围，除非所述术语在上下文中另有具体定义。例如，短语“约6的pH值”是指pH值为5.5至6.5，除非所述pH值另有具体定义。

虽然类似于或等同于本文描述的那些的任何方法和材料也可以用于本发明组合物和方法的实践或测试中，但现在将对代表性示例方法和材料进行描述。在本文中引用的所有公开物和专利均通过引用以其整体特此结合。

进一步注意的是，权利要求书可以撰写以排除任何可选择的要素。因此，此陈述旨在作为使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”、“排除”、“不包括”等或使用“否定型”限定的前提基础(或其条件是)。

如将对于本领域技术人员显而易见的是，在阅读本公开时，本文描述和展示的单独实施例中的每一个具有离散的组分和特征，这些组分和特征可以在不偏离本文所述的本发明组合物和方法的范围或精神的情况下容易地与任何其他若干个实施例的任何一个的特征分离或组合。可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可行的任何其他顺序来进行任何叙述的方法。

如本文使用的，“芽孢杆菌属”包括如本领域技术人员已知的“芽孢杆菌”属内的所有物种，包括但不限于：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。应认识到，芽孢杆菌属不断进行分类学重组。因此，该属旨在包括已重新分类的物种，包括但不限于：例如嗜热脂肪芽孢杆菌(现在命名为“嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”)或多黏芽孢杆菌(B.polymyxa)(现在是“多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)”)的此类生物体。在胁迫环境条件下的抗性内生孢子的产生被认为是芽孢杆菌属的定义性特性，尽管这个特征也适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线性杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。

如本文所使用的，短语“非翻译区”可以缩写为“UTR”。

如本文所使用的，短语“五端非翻译区(five prime untranslated region)”或“5′非翻译区”可以缩写为如“5′-UTR”或“5′UTR”，并且短语“三端非翻译区(three primeuntranslated region)”或“3′非翻译区”可以缩写为如“3′-UTR”或“3′UTR”。

如本文所使用的，“野生型”枯草芽孢杆菌“aprE 5′UTR”包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列，在本文中称为“WT-5′UTR”序列。

如本文所使用的，“经修饰的”枯草芽孢杆菌“aprE 5′UTR”或“经修饰的aprE 5′UTR”可以互换地使用，并且在本文中缩写为“mod-5′UTR”。

如本文所使用的，本公开的“mod-5′-UTR”与“WT-5′-UTR”(即，WT-5′-UTR包含SEQID NO:1)不同，因为mod-5′-UTR包含(i)SEQ ID NO:1的至少最3′腺嘌呤(A)核苷酸的缺失或(ii)在SEQ ID NO:1的3′腺嘌呤(A)核苷酸后的至少一个核苷酸的添加。

例如，在最3′腺嘌呤核苷酸位置处包含缺失(例如，参见SEQ ID NO:1)的mod-5′-UTR通常可以用随后的命名法“^-1:mod-5′-UTR”表示，在两个最3′核苷酸处包含缺失(例如在SEQ ID NO:1中的腺嘌呤和鸟嘌呤)的mod-5′-UTR通常可以用随后的命名法“-2:mod-5′-UTR”表示等。

同样，在最3′核苷酸位置处包含核苷酸的添加(例如，在SEQ ID NO:1中向腺嘌呤(A)添加3′的核苷酸)的mod-5′-UTR通常可以用随后的命名法“⁺1:mod-5′-UTR”表示，在最3′核苷酸位置处包含两个核苷酸的添加(例如，在SEQ ID NO:1中向腺嘌呤(A)添加3′的两个核苷酸)的mod-5′-UTR通常可以用随后的命名法“⁺2:mod-5′-UTR”表示等。

因此，如本文所使用的“^-1A:mod-5′-UTR”包含SEQ ID NO:2的核酸序列。WT-5′UTR核酸序列(SEQ ID NO:1)相比于^-1A:mod-5′-UTR核酸序列(SEQ ID NO:2)(例如，参见图1)的比较，显示了相对于所述WT-5′UTR序列，^-1A:mod-5′-UTR序列包含最后的(3′)核苷酸(例如，腺嘌呤(A))的缺失。

如本文所使用的，“转录起始位点”，此处缩写为“TIS”，通常涉及转录起始处的碱基对(即起始位点)。按照惯例，在转录单元的DNA序列中的转录起始位点(TIS)通常编号为“+1”。向转录方向(即3′；下游)延伸的碱基被指定为正“(+)”数，且向相反方向(即5′；上游)延伸的碱基对被指定为负“(-)”数。

如本文所使用的，短语“转录起始位点”和“转录起始位点密码子”可以互换使用，并且是指三(3)核苷酸翻译起始位点(tss)密码子。例如，原核“tss密码子”包括但不限于“AUG”、“GUG”、“UGG”等。在寻找蛋白质编码基因时，生物信息学程序/工具可以容易地获得用于鉴定可替代的(使用频率较低)起始密码子。

如本文所使用的，“遗传修饰的细胞”、“经修饰的细胞”、“经修饰的芽孢杆菌属细胞”、“经修饰的细胞”等被互换使用，并且是指包含至少一个遗传修饰的重组芽孢杆菌属细胞，该遗传修饰不存在于经修饰的地衣芽孢杆菌(子代)细胞所来源的未经修饰的芽孢杆菌属(子代)细胞中。

如本文所使用的，术语“修饰”、“遗传修饰”、“遗传改变”、“遗传操作”等被互换使用并且包括但不限于：(a)引入、取代、或去除基因(或其可读框ORF)中的一个或多个核苷酸，或者引入、取代、或去除基因(或其ORF)的转录或翻译所需要的调控元件中的一个或多个核苷酸，(b)基因破坏，(c)基因转换，(d)基因缺失，(e)下调基因，(f)上调基因，(g)特异性诱变，和/或(h)随机诱变本公开的任何一个或多个核酸序列或基因。

如本文所使用的，“基因的破坏”、“基因破坏”、“基因的灭活”和“基因灭活”互换地使用，并且广泛地是指基本上防止宿主细胞产生功能性基因产物(例如，蛋白质)的任何遗传修饰。基因破坏的示例性方法包括基因的任何部分的完全或部分(包括多肽编码序列(例如ORF)、启动子序列、增强子序列或另外的调控元件序列)的缺失、或它们的诱变，其中诱变涵盖取代、插入、缺失、倒位、及其任何组合和变化，所述诱变破坏/灭活一个或多个靶基因并基本上减少或阻止功能基因产物(即蛋白质)的产生。

如本文所使用的，术语基因表达的“下调”和基因表达的“上调”包括导致给定的基因的较低(下调)或较高(上调)表达的任何方法。例如，基因的下调可以通过RNA诱导的基因沉默、控制元件例如(例如如启动子、核糖体结合位点(RBS)/夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列、非翻译区(UTR))的遗传修饰、密码子变化等来实现。

如本文所使用的，“宿主细胞”是指具有作为新引入的DNA序列(例如如，载体/DNA构建体)的宿主或表达载体的能力的细胞。在某些实施例中，本公开的宿主细胞是芽孢杆菌属的成员。

如本文所定义的，术语“增加的表达”、“增强的表达”、“增加的目的蛋白(POI)的表达”、“增加的产生”、“增加的POI的产生”等是指“经修饰的”芽孢杆菌属(子代)细胞，其源自未经修饰的芽孢杆菌属(子代)细胞，其中所述“增加”是在相似条件下培养(生长、发酵)时，相对(相比于)于表达/产生相同的POI的“未经修饰的”芽孢杆菌属(子代)细胞而言的。

如本文所使用的，术语“表达”是指源自本公开的核酸分子的正义(信使RNA、mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达也可指将mRNA翻译成多肽。因此，术语“表达”包括涉及多肽的生产的任何步骤，这些步骤包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、分泌等。

如本文所定义的，组合术语“表达/产生”(如在短语如“相对于(未经修饰的)亲本细胞，经修饰的细胞表达/产生增加量的目的蛋白”中使用的)，术语(“表达/产生”)意指包括涉及在本公开的芽孢杆菌属(宿主)细胞中表达和产生目的蛋白的任何步骤。

如本文所使用的，“增加”蛋白质产生或“增加的”蛋白质产生意指产生的蛋白质(例如，目的蛋白)的量增加。蛋白质可以在所述细胞内产生，或分泌(或转运)到培养基中。在某些实施例中，目的蛋白被产生(分泌)到培养基中。如与未经修饰的(亲本)细胞相比，增加的蛋白质产生可以被检测为蛋白质或酶活性(例如像蛋白酶活性、淀粉酶活性、纤维素酶活性、半纤维素酶活性等)、或产生的总的细胞外蛋白质的更高的最大水平。

如本文所使用的，“核酸”是指核苷酸或多核苷酸序列、及其片段或部分，以及可能是双链或单链的基因组或合成来源的DNA、cDNA、和RNA，无论其代表正义或反义链。应该理解，由于遗传密码的简并性，许多核苷酸序列可以编码给定的蛋白质。应该理解本文所述的多核苷酸(或核酸分子)包括“基因”、“可读框”(ORF)、“载体”或“质粒”。

因此，术语“基因”是指编码氨基酸具体序列的多核苷酸，其包括所有或部分蛋白质编码序列，并且可以包括调控(非转录的)DNA序列，如启动子序列，该启动子序列决定例如基因在其下表达的条件。基因的转录区可以包括非翻译区(UTR)(包括内含子、5′-非翻译区(5′-UTR)和3′-非翻译区(3′-UTR)、以及蛋白质编码序列。

如本文所使用的，术语“编码序列”是指直接确定其(编码的)蛋白质产物氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界一般由通常以“ATG”起始密码子开始的可读框确定。编码序列通常包括DNA、cDNA和重组核苷酸序列。

如本文所使用的，术语“可读框”(下文称为“ORF”)意指包含不间断阅读框的核酸或核酸序列(无论是天然存在的、非天然存在的、或合成的)，不间断阅读框由以下组成：(i)起始密码子、(ii)一系列代表氨基酸的两(2)个或更多个密码子、和(iii)终止密码子，所述ORF以5'至3'方向阅读(或翻译)。

如本文所使用的术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的核酸序列。通常，编码序列位于启动子序列3'(下游)。启动子能以其整体来自天然基因，或者由来自自然界中发现的不同启动子的不同元件构成，或包含合成的核酸区段。本领域技术人员应该理解，不同启动子可以在不同细胞类型中、或在不同发育阶段、或响应于不同环境条件或生理条件来指导基因表达。引起基因在大多数细胞类型中表达的启动子大多数时候通常被称为“组成型启动子”。进一步认识到，由于在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切边界，不同长度的DNA片段可具有相同的启动子活性。在某些实施例中，本公开的启动子核酸序列包含在芽孢杆菌属细胞中起作用的启动子序列，该启动子序列包括但不限于低活性、中活性或高活性的组成型启动子、诱导型启动子、串联型启动子、合成型启动子、串联合成型启动子等。

如本文所使用的，术语“有效地连接”是指核酸序列在单个核酸片段上的缔合，使得一个核酸片段的功能受到另一个的影响。例如，当能够实现该编码序列的表达(即编码序列在启动子的转录控制下)时，启动子与该编码序列(例如ORF)有效地连接。编码序列可以在正义或反义方向上有效地连接到调控序列上。

当核酸置于与另一个核酸序列的功能关系时，所述核酸与另一个核酸序列“有效地连接”。例如，如果编码分泌性前导子(即信号肽、信号序列)的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白质，那么所述编码分泌性前导子的DNA有效地连接到所述多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么所述启动子或增强子有效地连接到所述序列；或者如果核糖体结合位点被定位以便促进翻译，那么所述核糖体结合位点有效地连接到编码序列。通常，“有效地连接”意指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌性前导子的情况下，是连续的并且处于阅读相中。然而，增强子不必需是连续的。通过在方便的限制位点处连接来实现连接。如果这样的位点不存在，则按照常规实践使用这些合成的寡核苷酸衔接子或接头。

例如，在某些实施例中，本公开的分离的多核苷酸包含源自野生型枯草芽孢杆菌aprE 5′-UTR核酸序列(即，WT-5′-UTR；SEQ ID NO:1)的经修饰的aprE 5′-UTR(mod-5′-UTR)核酸序列(例如，参见图1)。

如本文所使用的，控制与目的基因的蛋白质编码序列连接的目的基因(或其ORF)的表达的功能性启动子序列是指控制芽孢杆菌属细胞中编码序列的转录和翻译的启动子序列。在某些实施例中，使用的功能性启动子序列是与在自然界中分离的野生型(天然的)基因相关的天然启动子核酸序列。在其他实施例中，使用的功能性启动子序列是异源启动子核酸序列，其不与在自然界中分离的野生型(天然的)基因相关，其中异源启动子是组成型启动子或诱导型启动子。

如本文所定义的，“适合的调控序列”是指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、内部或下游(3′非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或者翻译的核苷酸序列。调控序列可以包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。

如本文所定义的，术语“引入”，如短语中所使用的，如“向细菌细胞中引入”或“向芽孢杆菌属细胞中引入”至少一种多核苷酸可读框(ORF)、或其基因、或其载体/DNA构建体，包括本领域已知用于将多核苷酸引入细胞的方法，这些方法包括但不限于原生质体融合、自然或人工转化(例如，氯化钙、电穿孔)、转导、转染、缀合等(例如，参见Ferrari等人,1989)。

如本文所用，“转化的”意指已经通过使用重组DNA技术转化的细胞。转化典型地通过将一个或多个核苷酸序列(例如，多核苷酸、ORF或基因)插入细胞中而发生。所插入的核苷酸序列可以是异源的核苷酸序列(即在待转化的细胞中不是天然存在的序列)。例如，在某些实施例中，亲本芽孢杆菌属细胞是通过向亲本细胞中引入一种或多种本公开的DNA构建体而修饰的(例如转化的)。

如本文所使用的，“转化”是指将外源DNA引入宿主细胞中，使得DNA保持为染色体整合体或自我复制的染色体外载体。

如本文所使用的，“转化DNA”、“转化序列”、和“DNA构建体”是指用于将序列引入宿主细胞或生物体的DNA。转化DNA是用于将序列引入宿主细胞或生物体的DNA。通过PCR或通过任何其他适合的技术可以在体外产生DNA。在一些实施例中，转化DNA包含输入序列，而在其他优选的实施例中，其进一步包含同源区(HR)侧翼的输入序列。在还另外的实施例中，转化DNA包含其他非同源序列，添加到末端(即，填充序列或侧翼)。末端可以闭合，这样使得转化DNA形成闭环，例如像，插入载体中。

如本文所使用的，“同源区”(缩写为“HR”)诸如本文公开的“5′-HR”或“3′-HR”是指核酸序列，其与芽孢杆菌属染色体中的序列同源。更特别地，根据本公开，同源区(HR)是上游或下游区，所述上游或下游区与被缺失、破坏、灭活的、下调等的基因或基因的一部分的直接侧翼编码区具有约80％与100％之间的序列同一性、约90％与100％之间的序列同一性、或约95％与100％之间的序列同一性。这些HR序列指导在芽孢杆菌属染色体中，DNA构建体被整合哪里，并且指导哪一部分芽孢杆菌属染色体被输入序列替代。因此，在某些实施例中，输入序列每侧侧翼有同源区(HR)。在其他实施例中，输入序列和HR包括在每侧侧翼有填充序列的单元。在一些实施例中，同源区(HR序列)仅存在于单侧(3′或5′)，而在其他实施例中，序列的每侧均有侧翼序列。因此，每个同源区的序列与芽孢杆菌属染色体中的序列同源。

如本文所使用的，术语“填充序列”是指侧翼5′-HR和/或3′-HR同源区(例如，载体序列)的任何额外的DNA。

因此，尽管不意味着限制本公开，但同源区(HR)可包括约1碱基对(bp)至200千碱基(kb)。优选地，同源区(HR)包括约1bp与10.0kb之间；1bp与5.0kb之间；1bp与2.5kb之间；1bp与1.0kb之间、和0.25kb与2.5kb之间。同源区还可以包括约10.0kb、5.0kb、2.5kb、2.0kb、1.5kb、1.0kb、0.5kb、0.25kb和0.1kb。例如，在一些实施例中，选择性标记(例如，lysA基因、serA基因、pyrF基因等)的5′端和3′端由同源区(5′-HR/3′-HR)侧翼，其中所述同源区包含紧邻侧翼于基因的编码区的核酸序列。

如本文所使用的，术语“可选择性标记”和“选择性标记”是指能够在宿主细胞中表达的核酸(例如，基因或ORF)，其允许容易地选择包含所述可选择性标记载体/DNA构建体的那些宿主细胞。因此，术语“可选择性标记”是指提供宿主细胞已经摄取了输入性目的DNA构建体指示的基因(或ORF)。

如本文所定义的，宿主细胞“基因组”、细菌(宿主)细胞“基因组”、或芽孢杆菌属(宿主)细胞“基因组”包括染色体基因和染色体外基因。

如本文所使用的，术语“质粒”、“载体”和“盒”是指染色体外元件，其通常携带典型地不是细胞的中心代谢的一部分的基因，并且通常处于环状双链DNA分子的形式。此类元件可以是来源于任何来源的单链或双链DNA或RNA的线性或环状自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中许多核苷酸序列已连接或重组到单一结构中，该单一结构能够将针对选定基因产物的启动子片段和DNA序列连同适当3'未翻译序列引入到细胞中。

如本文所使用的，术语“载体”是指可以在细胞中复制(传播)并且可以携带新基因(或者ORF、或者DNA区段)到细胞中的任何核酸。因此，该术语是指设计用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。载体包括为“附加体”的病毒、噬菌体、前病毒、质粒、噬菌粒、转座子、和人造染色体如YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)、PLAC(植物人工染色体)等(即，其自主复制或可以整合到宿主生物体的染色体中)。

如本文所使用的，术语“表达盒”、“DNA表达盒”和“表达载体”是指重组或合成产生的具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件的核酸(DNA)构建体(即，这些是载体或载体元件，如上所述)。重组表达盒可以整合在质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分包括，除了其他序列之外，待转录的核酸序列和启动子。在一些实施例中，DNA构建体还包括一系列允许靶细胞中特定核酸转录的特定核酸元件。

如本文所使用的，“靶向载体”是载体，所述载体包括与所述靶向载体转化的宿主细胞的染色体中的区同源的多核苷酸序列并且可以驱动该区的同源重组。例如，靶向载体可用于通过同源重组将突变引入宿主细胞染色体中或者从宿主细胞染色体中去除。在某些实施例中，这些靶向载体被有效地用于将(亲本)芽孢杆菌属细胞中的一个或多个基因失活为其经修饰的芽孢杆菌属(子代)细胞。例如，在某些实施例中，靶向载体被用于失活芽孢杆菌属基因、芽孢杆菌属启动子序列、芽孢杆菌属5′-UTR序列、芽孢杆菌属3′-UTR序列等，及其组合。在一些实施例中，靶向载体包含其他非同源序列，例如添加到末端(即，填充序列或侧翼序列)。末端可以闭合，这样使得靶向载体形成闭环，例如像，插入载体中。适当载体的选择和/或构建完全在本领域技术人员的知识内。

如本文所使用的，术语“质粒”是指用作克隆载体的环状双链(ds)DNA构建体，并且其在许多细菌和一些真核生物中形成额外的染色体自复制遗传元件。在一些实施例中，质粒被合并入宿主细胞的基因组中。

如本文所使用的，术语“目的蛋白”或“POI”是指期望在芽孢杆菌属细胞(特别是经修饰的芽孢杆菌属)中表达的目的多肽，其中所述POI优选地以增加的水平表达(即，相对于“未经修饰的”芽孢杆菌属(亲本)细胞)。因此，如本文所使用的，POI可以是酶、底物结合蛋白质、表面活性蛋白质、结构蛋白质、受体蛋白质等。在某些实施例中，相对于未经修饰的芽孢杆菌属(亲本)细胞，本公开的经修饰的细胞产生增加量的异源目的蛋白或内源目的蛋白。在特别地实施例中，由本公开的经修饰的细胞产生的目的蛋白的增加量是相对于亲本细胞，至少0.5％增加、至少1.0％增加、至少5.0％增加、或超过5.0％增加。在某些实施例中，增加的量是通过测定编码的POI的酶活性、mRNA的变化、光密度测量、蛋白质结合测定等来确定的。

如本文所定义的，“目的基因”或“GOI”是指编码POI的核酸序列(例如，多核苷酸、基因或ORF)。编码“目的蛋白”的“目的基因”可以是天然存在的基因、突变的基因或合成的基因。

如本文所使用的，术语“多肽”和“蛋白质”可互换地使用，并且是指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文中使用，用于氨基酸残基的常规单(1)字母或三(3)字母代码。多肽可以是线性的或支化的，它可以包含经修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。术语多肽还涵盖天然修饰的或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、或任何其他操作或修饰，如与标记组分缀合。该定义内还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。

在某些实施例中，本公开的基因编码商业上相关的工业目的蛋白，例如酶(例如乙酰酯酶、芳基酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、糖基水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、DNA酶、转移酶、转运蛋白质、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其组合)。

如本文所使用的，“变体”多肽是指通过取代、添加或缺失一个或多个氨基酸，通常通过重组DNA技术衍生自亲本(或参考)多肽的多肽。变体多肽与亲本多肽可以相差小数量的氨基酸残基，并且可以通过它们与亲本(参比)多肽在一级氨基酸序列同源性/同一性的水平来定义。

优选地，变体多肽与亲本(参比)多肽序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同一性。如本文所使用的，“变体”多核苷酸是指编码变体多肽的多核苷酸，其中“变体多核苷酸”与亲本多核苷酸具有特定程度的序列同源性/同一性，或与亲本多核苷酸(或其补体)在严格的杂交条件下杂交。优选地，变体多核苷酸与亲本(参比)多核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％核苷酸序列同一性。

如本文所使用的，“突变”是指核酸序列中的任何变化或改变。存在若干种类型的突变，包括点突变、缺失突变、沉默突变、框位移突变、剪接突变等。可以特异性地进行突变(例如，经由定点诱变)或随机地进行突变(例如，经由化学试剂、通过修复减去的细菌菌株)。

如本文所使用的，在多肽或其序列的上下文中，术语“取代”意指一个氨基酸被另一个氨基酸替代(即，取代)。

如本文所定义的，“内源基因”是指位于生物体基因组的其天然位置中的基因。

如本文所定义的，“异源”基因、“非内源”基因、或“外源”基因是指通常不在宿主生物体中被发现，但通过基因转移引入宿主生物体中的基因(或ORF)。

如本文所定义的，“异源核酸构建体”或“异源核酸序列”具有不是其被表达的细胞的天然的序列的一部分。

术语“衍生的”涵盖术语“起源的”、“获得的”“可获得的”和“创建的”，并且通常表示一种指定的材料或组合物在另一种指定的材料或组合物中找到它的起源或具有可以参考另一种指定材料或组合物描述的特征。

如本文所使用的，术语“同源性”涉及同源多核苷酸或多肽。如果两个或更多个多核苷酸或两个或更多个多肽是同源的，则这意味着同源多核苷酸或多肽具有至少60％、更优选至少70％、甚至更优选至少85％、还更优选至少90％、更优选至少95％、并且最优选至少98％的“同一性的程度”。两个多核苷酸或多肽序列是否具有如本文所定义的同源程度足够高的同一性，可以通过使用本领域已知的计算机程序和技术比对两个序列来适合地研究(参见，例如，Smith和Waterman,1981；Needleman和Wunsch,1970；Pearson和Lipman,1988；程序如在Wisconsin Genetics Software Package[威斯康星州遗传学软件包]中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA(Genetics Computer Group,Madison,WI[遗传学计算机组，麦迪逊，威斯康星州])和Devereux等人,1984)。

如本文所使用的，术语“百分比(％)同一性”是指当使用序列比对程序进行比对时，编码多肽或多肽的氨基酸序列的核酸序列之间的核酸或氨基酸序列同一性的水平。

如本文所使用的，“比生产力”是在给定时间段内生产的蛋白质的总量/细胞/时间。

如本文所定义的，术语“纯化的”或“分离的”或“富集的”意指生物分子(例如，多肽或多核苷酸)通过将其与它在自然界中相关联的天然存在的成分中的一些或所有分离而被从其天然状态改变。这种分离或纯化可以通过本领域公认的分离技术如离子交换层析、亲和层析、疏水分离、透析、蛋白酶处理、硫酸铵沉淀或其他蛋白质盐沉淀、离心、尺寸排阻层析、过滤、微量过滤、凝胶电泳或梯度分离进行，以去除最终组合物中所不希望的全细胞、细胞碎片、杂质、外来蛋白质或酶。随后可以进一步向纯化或分离的生物分子组合物中添加成分，该成分提供了额外的益处，例如是活化剂、抗抑制剂、期望的离子、控制pH的化合物或其他酶或化学品。

如本文所使用的，术语“ComK多肽”定义为comK基因的产物；该基因是转录因子，在感受态发展之前作为最终的自动调控控制开关；涉及激活参与DNA结合和摄取以及重组的晚期感受态基因的表达(Liu和Zuber,1998,Hamoen等人,1998)。在本公开的某些实施例中，芽孢杆菌属细胞包含引入的编码comK转录因子的质粒。示例性comK核酸和多肽序列分别在SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:21中示出。

如本文所使用的，“同源基因”是指来自不同的、但通常相关的物种的基因对，这些基因彼此对应并且彼此相同或非常相似。所述术语涵盖通过物种形成(即，新物种的发育)(例如，直系同源基因)分离的基因、以及通过遗传重复分离的基因(例如，旁系同源基因)。

如本文所使用的，“直系同源物”和“直系同源基因”是指通过物种形成从共同祖先基因(即，同源基因)演化的不同物种中的基因。通常，直系同源物在进化过程中保持相同的功能。直系同源物的鉴定可用于新测序基因组中基因功能的可靠预测。

如本文所使用的，“旁系同源物”和“旁系同源基因”是指与基因组内重复相关的基因。虽然直系同源物在进化过程中保持相同的功能，但旁系同源物发展新功能，即使一些功能通常与原始功能相关。旁系同源基因的实例包括但不限于编码胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、和凝血酶的基因，上述酶都是丝氨酸蛋白酶并且在同一物种内一起发生。

如本文所使用的，“类似的序列”是其中基因的功能与衍生自地衣芽孢杆菌细胞的基因基本上相同的序列。另外，类似的基因与地衣芽孢杆菌细胞的序列包括至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。类似的序列由已知的序列比对方法确定。通常使用的比对方法是BLAST，尽管存在也可用于比对序列的其他方法。

如本文所使用的，术语“杂交”是指通过碱基配对将核酸链与互补链连接的过程，如本领域已知的。如果两个序列在中至高严格杂交和洗涤条件下彼此特异性杂交，则认为核酸序列可与参考核酸序列“选择性杂交”。杂交条件是基于核酸结合复合物或探针的解链温度(T_m)。例如，“最大严格”典型地发生在约T_m ^-5℃(低于探针的T^m 5℃)；“高严格”发生在低于T_m约5℃-10℃；“中等严格”发生在低于探针的T_m约10℃-20℃；并且“低严格”发生在低于T_m约20℃-25℃。在功能上，最大严格条件可以用于鉴定与杂交探针具有严格同一性或近乎严格同一性的序列；而中或低严格杂交可用于鉴定或检测多核苷酸序列同源物。中等和高严格杂交条件是本领域公知的。高严格条件的实例包括以下杂交：在约42℃下，在50％甲酰胺、5X SSC、5X登哈特溶液、0.5％SDS和100pg/ml变性载体DNA中进行，随后在室温(RT)下在2X SSC和0.5％SDS中洗涤两次，并在42℃下在另外的0.1X SSC和0.5％SDS下再洗涤两次。中严格条件的实例包括在37℃下在包含20％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5x登哈特溶液、10％葡聚糖硫酸盐和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精子DNA的溶液中过夜孵育，然后在约37℃-50℃下以1x SSC洗涤滤器来进行。如果需要，本领域技术人员知道如何调控温度、离子强度等以适应因素如探针长度等等。

如本文所使用的，“重组体”包括提及细胞或载体，其已经通过引入异源核酸序列而被修饰，或者所述细胞衍生自已如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在细胞的天然形式(非重组)内相同形式的未发现的基因或表达以其他方式异常表达的、低表达的或根本不表达的天然基因(由于故意的人为干预)。“重组(recombination、recombining)”或产生“重组的(recombined)”核酸通常是两个或更多个核酸片段的组装，其中组装产生嵌合基因。

II.用于增加芽胞杆菌属宿主细胞中蛋白质产生的经修饰的5’-UTR序列

本公开总体上涉及用于产生和构建具有增加的蛋白质产生能力等的芽孢杆菌属(宿主)细胞(例如蛋白质产生宿主细胞、细胞工厂)的组合物和方法。本公开的某些实施例因此涉及分离的多核苷酸(包含经修饰的枯草芽孢杆菌aprE 5′-非翻译区(mod-5′-UTR)核酸序列)、其载体、其DNA(表达)构建体、其经修饰的芽孢杆菌属(子代)细胞、以及制造和使用它们的方法。

例如，本领域通常理解的，信使RNA(mRNA)翻译“起始”所有生物体的基因组中的所有蛋白质编码基因是至关重要的。更特别地，“起始”，而不是“延伸”，通常是翻译中的限速步骤，并且根据mRNA的5′UTR序列以非常不同的效率进行(Jacques&Dreyfus,1990)。例如，在原核生物(即真细菌和古细菌两者)中，mRNA中的夏因-达尔加诺(SD)序列被称为翻译的起始元素(Shine和Dalgarno,1974；Shine和Dalgarno,1975)。SD序列(通常为“GGAGG”)位于起始密码子上游(5’)的大约10个核苷酸处。SD序列在16S rRNA的3′端与互补序列“CCUCC”配对。在16S rRNA中，互补序列(CCUCC)被称为3′尾部的抗SD序列，该区是单链。SD和抗SD序列之间的相互作用(SD相互作用)通过在起始密码子周围锚定小(30S)核糖体亚基以形成“起始前复合物”来增强起始(Dontsova等人,1991)，其中SD相互作用对于翻译的有效起始的重要性已经对真细菌(例如芽孢杆菌属物种)和古细菌(Jacob等人,1987)两者在实验上得到了证实。

因此，如上简述，本公开的申请人已经鉴定出与SD序列(即RBS)和翻译起始位点[tss]密码子(ATG/AUG)位置之间的mRNA核苷酸间隔相关的令人惊讶和意想不到的结果。不希望受任何特定理论、机制或作用方式的束缚，申请人考虑并在本文中示出了改变SD序列(RBS)相对于起始密码子(ATG/AUG)的位置的结果，当这样的序列被引入芽孢杆菌属细胞中并在芽孢杆菌属细胞中表达时，显著增加了目的蛋白的产生。

更特别地，本公开的实例1涉及经修饰的5′-非翻译区(5′-UTR)核酸序列的设计/构建。例如，构建了包含野生型枯草芽孢杆菌aprE 5′UTR序列(WT-5′-UTR；SEQ ID NO:1)或经修饰的5′-UTR序列(^-1A:mod-5′-UTR；SEQ ID NO:2，参见图1)的表达盒并被引入到亲本芽孢杆菌属细胞中，其中WT-5′-UTR和^-1A:mod-5′-UTR被有效地连接到上游(5′)启动子和编码目的蛋白(即α淀粉酶)的下游(3′)可读框。

如实例2所示，使用标准方法测量包含WT-5′-UTR的芽孢杆菌属(子代)细胞和包含^-1A:mod-5′-UTR的芽孢杆菌属(子代)细胞的相对α淀粉酶产量，其中包含^-1A:mod-5′-UTR表达构建体的子代细胞产生的α淀粉酶比包含WT-5′UTR表达构建体的子代细胞多20％。更特别地，在每OD₅₅₀单位的基础上，包含^-1A:mod-5′-UTR构建体的子代细胞产生的α淀粉酶比包含WT-5′UTR表达构建体的子代细胞多40％(例如，参见表1)。

因此，在某些实施例中，本公开涉及包含经修饰的枯草芽孢杆菌aprE 5′-非翻译区(mod-5′-UTR)核酸序列的分离的多核苷酸。在某些其他实施例中，本公开的经修饰的5′-UTR(mod-5′-UTR)进一步包含上游(5′)启动子区核酸序列(其位于5′并有效地连接到所述经修饰的5′-UTR)和/或下游(3′)可读框(ORF)核酸序列(编码目的蛋白)(其位于3′并有效地连接到所述经修饰的5′-UTR)。

在其他实施例中，本公开涉及按5′至3′方向包含式(I)的分离的多核苷酸：

(I)：[Pro][mod-5′-UTR][ORF]；

其中[Pro]是在芽孢杆菌属物种细胞中有效的启动子区核酸序列，[mod-5′-UTR]是经修饰的枯草芽孢杆菌aprE 5′非翻译区(mod-5′-UTR)核酸序列，并且[ORF]是编码目的蛋白(POI)的可读框核酸序列，其中所述[Pro]、[mod-5′-UTR]和[ORF]核酸序列是有效地连接的。在其他实施例中，本公开涉及包含本公开的分离的多核苷酸的载体和DNA构建体。

在其他实施例中，本公开涉及经修饰的芽孢杆菌属物种(子代)细胞，其在适于产生异源POI的培养基中培养时产生增加量的异源目的蛋白(POI)，所述经修饰的芽孢杆菌属细胞包含引入的包含式(I)的核酸序列的表达构建体，其中，当在相似条件下培养时，相对于产生相同POI的未经修饰的芽胞杆菌属(亲本)细胞，所述经修饰的芽孢杆菌属(子代)细胞产生增加量的异源POI。

在其他实施例中，本公开涉及包含此类mod-5′-UTR核酸序列的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含mod-5′-UTR核酸序列(包含按5′至3′方向并且在有效地组合中的)，所述核酸序列示于式(II)：

(II)：[TIS][mod-5′UTR][tss密码子]

其中[TIS]是转录起始位点(TIS)，[mod-5′-UTR]包含经修饰的枯草芽孢杆菌aprE5′-UTR核酸序列，并且[tss密码子]是三(3)核苷酸翻译起始位点(tss)密码子。

在某些其他实施例中，此类本文公开的“经修饰的”aprE 5′-UTR(mod-5′-UTR)核酸序列涉及分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含按5′至3′方向并且以有效组合的式(III)的核酸序列，

(III)：[5′-HR][TIS][mod-5′-UTR][tss密码子][3′-HR]，

其中[TIS]是转录起始位点(TIS)，[mod-5′-UTR]包含经修饰的枯草芽孢杆菌aprE5′-UTR核酸序列，[tss密码子]是三(3)核苷酸翻译起始位点(tss)密码子，[5′-HR]是5′-核酸序列同源区并且[3′-HR]是3′-核酸序列同源区，其中所述5′-HR和3′-HR分别与紧邻所述[TIS]序列的上游(5′)和紧邻所述[tss密码子]序列的下游(3′)的基因组(染色体)区域(基因座)具有足够的同源性，以实现通过同源重组将引入的多核苷酸构建体整合到经修饰的芽孢杆菌属细胞基因组中。

例如，在某些实施例中，本公开涉及经修饰的芽孢杆菌属(子代)细胞，当在相似条件下培养时，相对于产生相同POI的未经修饰的芽胞杆菌属(亲本)细胞，所述经修饰的芽孢杆菌属(子代)细胞产生增加量的异源POI。因此，在某些实施例中，通过将式(III)的多核苷酸构建体等引入(例如转化)到亲本芽孢杆菌属细胞中修饰亲本芽孢杆菌属物种，其中从中衍生的经修饰的(子代)芽孢杆菌属细胞包含将经修饰的5′UTR(例如mod-5′UTR；SEQ IDNO:2)整合到靶向(染色体)基因组基因座中，其由5′-HR和3′-HR提供。

本公开的另一个实施例涉及分离的多核苷酸，其包含源自野生型芽孢杆菌属物种5′-UTR序列的mod-5′-UTR核酸序列，所述分离的多核苷酸包含按5′至3′方向并且以有效组合的式(IV)的核酸序列：

(IV)：[TIS][5′-UTR^-ΔxN][tss密码子]，

其中[TIS]是转录起始位点，[tss密码子]是三(3)核苷酸翻译起始位点(tss)密码子并且[5′-UTR^-ΔxN]是源自野生型芽孢杆菌属物种5′-UTR核酸序列的经修饰的芽孢杆菌属物种5′-UTR核酸序列，其中所述mod-5′-UTR核酸序列[5′-UTR^-ΔxN]在所述野生型芽孢杆菌属物种5′-UTR核酸序列的远(3′)端处包含“x”个核苷酸(“N”)的缺失(^-Δ)。例如，包含在野生型芽孢杆菌属物种5′-UTR核酸序列的远(3′)端处的单个核苷酸缺失的mod-5′-UTR核酸序列可以表示为“[5′-UTR^-Δ1N]”，包含在野生型芽孢杆菌属物种5′-UTR核酸序列的远(3′)端两个核苷酸缺失的mod-5′-UTR核酸序列可以表示为“[5′-UTR^-Δ2N]”等。

同样，在某些其他实施例中，本公开涉及包含源自野生型芽孢杆菌属物种5′-UTR序列的mod-5′-UTR核酸序列的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含按5′至3′方向并且以有效组合的式(V)的核酸序列：

(V)：[TIS][5′-UTR ⁺ΔxN][tss密码子]，

其中[TIS]是转录起始位点，[tss密码子]是三(3)核苷酸翻译起始位点(tss)密码子并且[5′-UTR ⁺ΔxN]是源自野生型芽孢杆菌属物种5′-UTR核酸序列的经修饰的芽孢杆菌属物种5′-UTR核酸序列，其中所述mod-5′-UTR核酸序列[5′-UTR ⁺ΔxN]在所述野生型芽孢杆菌属物种5′-UTR核酸序列的远(3′)端处包含“x”个核苷酸(“N”)的添加(⁺Δ)。例如，包含在野生型芽孢杆菌属物种5′-UTR核酸序列的远(3′)端单个核苷酸添加的mod-5′-UTR核酸序列可以表示为“[5′-UTR ⁺Δ1N]”，包含在野生型芽孢杆菌属物种5′-UTR核酸序列的远(3′)端两个核苷酸添加的mod-5′-UTR核酸序列可以表示为“[5′-UTR ⁺Δ2N]”等。

因此，在某些实施例中，如式(IV)或(V)所示，构建了一个或多个本公开的分离的多核苷酸，其中所述mod-5′-UTR是以产生逐渐更短的(3′)端(即，如“-ΔxN”增加)或逐渐更长的(3′)端(如“⁺ΔxN”增加)设计/构建的。例如，-1核苷酸位置的缺失提供了在核糖体结合位点(RBS)(位于所述5′-UTR序列内)和转录起始位点密码子(tss密码子)之间的间隔(例如，参见图1)中一(1)个bp的减少。

因此，如上所示，本公开的某些实施例涉及此类经修饰的芽孢杆菌属(子代)细胞，当在相似条件下培养时，相对于产生相同POI的未经修饰的芽胞杆菌属(亲本)细胞，所述经修饰的芽孢杆菌属(子代)细胞产生增加量的异源或内源POI。因此，本公开的某些其他实施例中涉及野生型(天然的)核酸序列、变体核酸序列、经修饰的核酸序列、此类核酸序列的分析、和其中某些核酸序列特征(包括但不限于，转录起始位点(TIS)序列、翻译起始位点(tss)密码子、可读框(ORF)、5′-UTR、3′-UTR、启动子、启动子区等)的识别。

例如，如上文定义部分所述，转录起始位点(TIS)是指转录起始处(即起始位点)的碱基对。本领域技术人员能够容易地通过对DNA序列的可视化分析鉴定与特定基因(ORF)序列相关的此类TIS序列，而且更特别地，使用生物信息学程序和工具来分析用于各种基因调控元件的一个或多个输入序列，诸如TIS序列、启动子区、UTR等。翻译起始位点(tss)(如前所述)是指三(3)核苷酸翻译起始位点(tss)密码子。示例性原核tss密码子(按照发生的频率的顺序，由高到低)包括“AUG”、“GUG”、“UGG”。例如，本领域技术人员能够使用正则表达式搜索与目的生物体中已知的Σ因子结合位点相同或接近相同的匹配来鉴定启动子(例如，使用Haldenwang等人的数据，1995)。一旦鉴定了推定的启动子，就可以分配推定的TIS序列。

用于鉴定核酸序列特征(诸如启动子等)的另外的生物信息学工具包括但不限于启动子猎人(PromoterHunter)(Klucar等人，2010)、启动子预测者(PromPredict)(Bansal,2009)、BacPP(de Avila等人，2011)、BPROM(Salamov,2011)以及PRODORIC工具，该工具可以预测许多与DNA序列结合的蛋白质，并为每个预测的启动子分配加权概率评分(Munch等人，2003)。此外，深度学习神经网络能够通过训练来自已知的给定生物体的启动子来有效地预测启动子序列(Kh等人，PLOSone，2017年2月3日)。一旦TIS被鉴定，5’UTR可以被推断为所述TSS的序列3’并包括TIS，直到和排除TSS的第一个核苷酸。一旦推定的5’UTR被鉴定，可以如本文所述对5’UTR进行进一步修饰。

III.分子生物学

如上所示，本公开的某些实施例涉及(重组)遗传修饰的源自亲本芽孢杆菌属细胞的芽孢杆菌属细胞。在某些实施例中，本公开的芽孢杆菌属细胞是遗传修饰的，用于增加一种或多种目的蛋白的表达/产生。在特定的实施例中，本公开的芽孢杆菌属细胞是遗传修饰的，以从包含本公开的mod-5′-UTR的DNA构建体编码目的蛋白的目的基因。在又其他的实施例中，将亲本芽孢杆菌属的细胞遗传修饰以失活一种或多种(内源)染色体基因和/或修饰以修复一种或多种失活的(内源)染色体基因。

因此，本公开的某些实施例总体上涉及用于产生和构建具有增加的蛋白质产生能力的芽孢杆菌属宿主细胞(例如蛋白质产生宿主细胞、细胞工厂)的组合物和方法。因此，公开的某些实施例涉及用于本公开的遗传修饰的细胞的方法，其中所述修饰包含(a)引入、取代、或去除基因(或其ORF)中的一个或多个核苷酸，或者引入、取代、或去除基因或其ORF的转录或翻译所需要的调控元件中的一个或多个核苷酸，(b)基因破坏，(c)基因转换，(d)基因缺失，(e)下调基因，(f)位点特异性诱变，和/或(g)随机诱变。

例如，在某些实施例中，通过使用本领域熟知的方法(例如，插入、破坏、替换、或缺失)减少或消除基因的表达来构建本公开的经修饰的芽孢杆菌属细胞。待修饰或灭活的基因的部分可以是，例如，编码区或编码区表达所需的调控元件。此类调控或控制序列的实例可以是启动子序列或其功能部分(即，足以影响核酸序列表达的部分)。用于修饰的其他控制序列包括但不限于前导序列、前肽序列、信号序列、转录终止子、转录激活子等。

在某些其他实施例中，通过基因缺失构建经修饰的芽孢杆菌属细胞以消除或减少至少一种基因的表达。基因缺失技术能够部分或完全去除一个或多个基因，从而消除它们的表达、或表达非功能性(或活性降低的)蛋白质产物。在此类方法中，一个或多个基因的缺失可以通过同源重组(例如使用质粒/载体)来完成，所述质粒/载体已构建成连续含有基因侧翼的5'和3'区(即5′-HR和3′-HR)。可以将连续的5'和3'区引入芽孢杆菌属细胞中，例如，在温度敏感的质粒(如pE194)上，在允许温度下与第二可选择性标记结合以允许质粒在细胞中建立。然后将细胞移至非允许温度，以选择在同源侧翼区之一处具有整合到染色体中的质粒的细胞。通过选择第二可选择性标记来实现质粒整合的选择。整合后，通过将细胞移至允许温度持续若干代而不进行选择来在刺激第二同源侧翼区的重组事件。将细胞铺板以获得单菌落，并检查菌落是否损失两种可选择性标记(参见例如，Perego,1993)。因此，本领域的技术人员可以容易地鉴定在所述基因的编码序列和/或所述基因的非编码区的核苷酸区(适于全部或部分缺失)。

在其他实施例中，通过引入、取代、或去除基因或其转录或翻译所需的调控元件中的一个或多个核苷酸来构建本公开的经修饰的芽孢杆菌属细胞。例如，可以插入或去除核苷酸，以便导致引入终止密码子的、去除起始密码子、或移码可读框。可以根据本领域已知的方法，通过定点诱变或PCR产生的诱变来完成这种修饰(例如参见，Botstein和Shortle,1985；Lo等人,1985；Higuchi等人,1988；Shimada,1996；Ho等人,1989；Horton等人,1989以及Sarkar和Sommer,1990)。因此，在某些实施例中，通过完全或部分缺失灭活本公开的基因。

在另一个实施例中，通过基因转换的过程构建经修饰的芽孢杆菌属细胞(例如，参见Iglesias和Trautner,1983)。例如，在基因转换方法中，对应于一个或多个基因的核酸序列在体外诱变以产生缺陷核酸序列，然后将所述核酸序列转化到亲本芽孢杆菌属细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，缺陷核酸序列替换内源基因。可能是需要的，缺陷基因或基因片段也编码可用于选择含有缺陷基因的转化体的标记。例如，可以将缺陷基因与可选择性标记结合引入非复制或温度敏感的质粒上。通过在不允许质粒复制的条件下选择标记来实现质粒整合的选择。选择导致基因替换的第二次重组事件是通过检查菌落损失可选择性标记和获得突变基因来实现的(Perego,1993)。可替代地，缺陷核酸序列可以含有基因的一个或多个核苷酸的插入、取代、或缺失，如下所述。

在其他实施例中，通过建立的反义技术使用与基因的核酸序列互补的核苷酸序列来构建经修饰的芽孢杆菌属细胞(Parish和Stoker,1997)。更特别地，可以通过引入与基因的核酸序列互补的核苷酸序列来减少(下调)或消除芽孢杆菌属细胞的基因的表达，所述核苷酸序列可以在细胞中转录并且能够与细胞中产生的mRNA杂交。在允许互补的反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，由此降低或消除了所翻译的蛋白质的量。此类反义方法包括但不限于RNA干扰(RNAi)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、反义寡核苷酸、Cas9介导的基因沉默等，所有这些都是本领域技术人员熟知的。

在其他实施例中，经由CRISPR-Cas9编辑产生/构建经修饰的芽孢杆菌属细胞。例如，编码目的蛋白的基因可以被核酸指导的内切核酸酶的方式破坏(或缺失或下调)，所述方式通过将指导RNA(例如，Cas9)和Cpf1或指导DNA(例如，NgAgo)结合发现其靶DNA，这将内切核酸酶募集到DNA上的靶序列上，其中所述内切核酸酶可以在DNA中产生单链或双链断裂。这种靶向DNA断裂成为DNA修复的底物，并且可以与提供的编辑模板重组以破坏或缺失该基因。例如，编码核酸指导的内切核酸酶(出于此目的，来自化脓链球菌的Cas9)的基因或编码Cas9核酸酶的密码子优化的基因有效地连接到在芽孢杆菌属细胞中有活性的启动子和在芽孢杆菌属细胞中有活性的终止子，从而产生芽孢杆菌Cas9表达盒。同样地，本领域技术人员容易鉴定目的基因特有的一个或多个靶位点。例如，为了构造编码gRNA(指向目的基因内的靶位点)的DNA构建体，可变的靶向结构域(VT)将包含靶位点的核苷酸，所述核苷酸为(PAM)前间区序列邻近基序(例如酿脓链球菌Cas9为NGG)的5′，所述核苷酸与编码化脓链球菌Cas9的Cas9内切核酸酶识别结构域(CER)的DNA融合。组合编码VT结构域的DNA和编码CER结构域的DNA，从而产生编码gRNA的DNA。因此，通过将编码gRNA的DNA有效连接到在芽孢杆菌属细胞中有活性的启动子和在芽孢杆菌属细胞中有活性的终止子来产生gRNA的芽孢杆菌属的表达盒。

在某些实施例中，由内切核酸酶诱导的DNA断裂用输入序列修复/替换。例如，为了精确修复由上述Cas9表达盒和gRNA表达盒产生的DNA断裂，提供核苷酸编辑模板，使得细胞的DNA修复机器可以利用编辑模板。例如，靶基因的约500bp 5'可以与靶基因的约500bp 3'融合以产生编辑模板，所述模板由芽孢杆菌宿主的机器用于修复由RGEN产生的DNA断裂。

可以使用许多不同的方法(例如，原生质体融合、电穿孔、自然感受态或诱导感受态)将Cas9表达盒、gRNA表达盒、和编辑模板共同递送至细胞。通过用正向和反向引物扩增基因座，通过PCR扩增靶基因座来筛选转化的细胞。这些引物可以扩增野生型基因座或已经由RGEN编辑的经修饰基因座。然后使用测序引物对这些片段进行测序以鉴定编辑的菌落。

在又其他实施例中，使用本领域已知的方法(包括但不限于化学诱变(参见例如，Hopwood,1970)和转座(参见例如，Youngman等人,1983))，通过随机或特异性诱变构建经修饰的芽孢杆菌属细胞。可以通过对亲本细胞进行诱变并筛选其中基因表达已经减少或消除的突变细胞来进行基因的修饰。诱变可以是特异性的或随机的，可以通过例如使用适合的物理或化学诱变剂进行、通过使用适合的寡核苷酸进行、或通过将所述DNA序列经受PCR产生的诱变来进行。此外，诱变可通过使用这些诱变方法的任意组合来进行。

适用于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、N-甲基-N'-亚硝基胍(NTG)、邻甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲磺酸(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。当使用这些试剂时，通常通过如下方法来进行诱变：在适合的条件下在选择的诱变剂的存在下孵育待诱变的亲本细胞，并选择表现出基因表达降低或无基因表达的突变细胞。

在某些其他实施例中，经修饰的芽孢杆菌属细胞包含内源(染色体)基因的缺失。在某些其他实施例中，经修饰的芽孢杆菌属细胞包含内源(染色体)基因的破坏。在其他实施例中，经修饰的芽孢杆菌属细胞包含内源(染色体)基因的下调。

PCT公开号WO 2003/083125公开了用于修饰芽孢杆菌属细胞的方法，如使用PCR融合来产生芽孢杆菌属缺失菌株和DNA构建体以绕过大肠杆菌。

PCT公开号WO 2002/14490公开了用于修饰芽孢杆菌属细胞的方法，所述方法包括(1)构建和转化整合的质粒(pComK)，(2)随机诱变编码序列、信号序列和前肽序列，(3)同源重组，(4)通过向转化DNA添加非同源侧翼增加转化效率，(5)优化双交叉整合，(6)定向诱变和(7)无标记缺失。

本领域技术人员充分意识到用于将多核苷酸序列引入细菌细胞(例如，大肠杆菌和芽孢杆菌属物种)中的适合方法(例如，Ferrari等人,1989；Saunders等人,1984；Hoch等人,1967；Mann等人,1986；Holubova,1985；Chang等人,1979；Vorobjeva等人,1980；Smith等人,1986；Fisher等人,1981和McDonald,1984)。实际上，包括原生质体转化和中板集合、转导、和原生质体融合在内的转化方法是已知的并且适合用于本公开。转化方法特别优选地是将本公开的DNA构建体引入宿主细胞。

除了通常使用的方法之外，在一些实施例中，直接转化芽孢杆菌属宿主细胞(即，在引入宿主细胞之前，中间细胞不用于扩增或以其他方式处理DNA构建体)。将DNA构建体引入宿主细胞包括本领域已知的将DNA插入宿主细胞而不插入质粒或载体中的那些物理和化学方法。此类方法包括但不限于氯化钙沉淀、电穿孔、裸DNA、脂质体等。在另外的实施例中，DNA构建体与质粒一起共转化而不插入该质粒。在另外的实施例中，通过本领域已知的方法，将选择性标记从经修饰的芽孢杆菌属菌株中缺失或基本上切除(例如，Stahl等人,1984和Palmeros等人,2000)。在一些实施例中，来自宿主染色体的载体的分辨离开染色体中的侧翼区域，同时去除了固有的染色体区域。

用于在芽孢杆菌属细胞中表达基因、其可读框(ORF)和/或其变体序列的启动子和启动子序列区通常是本领域技术人员已知的。通常选择本公开的启动子序列，使得它们在芽孢杆菌属细胞(例如，地衣芽孢杆菌细胞)中起作用。用于驱动芽孢杆菌属细胞中基因表达的启动子包括但不限于枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)启动子(Stahl等人,1984)、枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶启动子(Yang等人,1983)、解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶启动子(Tarkinen等人,1983)、来自枯草芽孢杆菌的中性蛋白酶(nprE)启动子(Yang等人,1984)、突变体aprE启动子(PCT公开号WO 2001/51643)或来自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或其他相关的芽孢杆菌属的任何其他启动子。在PCT公开号WO 2003/089604中描述了用于在芽孢杆菌属细胞中筛选和产生具有一系列活性(启动子强度)的启动子文库的方法。

IV.培养用于产生目的蛋白的芽孢杆菌属细胞

在某些实施例中，本公开提供了与未经修饰的(亲本)细胞相比(即，相对于、相比于)，用于增加经修饰的芽孢杆菌属细胞的蛋白质生产力的方法和组合物。因此，在某些实施例中，本公开提供了产生目的蛋白(POI)的方法，所述方法包括发酵/培养经修饰的芽孢杆菌属细胞，其中经修饰的细胞将POI分泌到培养基中或将POI保留在细胞内部。本领域熟知的发酵方法可用于发酵本公开的经修饰的和未经修饰的芽孢杆菌属细胞。

例如，在一些实施例中，将细胞在分批或连续发酵条件下培养。经典的分批发酵是封闭的系统，其中在发酵开始时设定培养基的组成，并且该组成在发酵期间不改变。在发酵开始时，用一种或多种所需生物体接种培养基。在这种方法中，允许发酵发生而不向系统添加任何组分。通常，分批发酵符合关于添加碳源的“分批”的资格，并且经常对控制因素(例如pH和氧浓度)进行尝试。分批系统的代谢物和生物质组成不断变化直到发酵停止时。在典型分批培养中，细胞可以通过静态停滞期进展到高生长对数期，最后进入生长速率减少或停止的稳定期。如果不经处理，处于稳定期的细胞最终死亡。通常，在对数期的细胞负责产物的大量生产。

标准分批系统的合适的变体是“补料分批发酵”系统。在典型的分批系统的这种变化中，随着发酵的进展，将底物以增量添加。当分解代谢物抑制可能抑制细胞的代谢时并且在培养基中希望具有有限量的底物的情况下，补料分批系统是有用的。在补料分批系统中实际底物浓度的测量是困难的，并且因此基于可测量因素(例如pH、溶解的氧和废气(例如CO₂)的分压)的变化对其进行估计。分批和补料分批发酵是常用的并且在本领域中是已知的。

连续发酵是开放的系统，在所述系统中，将定义的发酵培养基连续添加到生物反应器中，同时去除等量的条件培养基以用于处理。连续发酵通常将培养物保持在恒定的高密度，其中细胞主要处于对数期生长。连续发酵允许对一种或多种影响细胞生长和/或产物浓度的因素进行调节。例如，在一个实施例中，将限制营养素(例如碳源或氮源)保持在固定的速率，并且允许调控所有其他参数。在其他系统中，影响生长的许多因素可以不断改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统努力保持稳定态的生长条件。因此，由于转移培养基而引起的细胞损失应当与发酵中的细胞生长速率相平衡。调节用于连续发酵过程的营养素和生长因子的方法以及最大化产物形成速率的技术在工业微生物学领域中是熟知的。

因此，在某些实施例中，可以通过常规程序从培养基中回收由转化的(修饰的)宿主细胞产生的POI，所述常规程序包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，或者如果需要，破坏细胞并从细胞部分和碎片中去除上清液。通常经过澄清后，上清液或滤液的蛋白质组分通过盐(例如硫酸铵)沉淀。然后沉淀的蛋白质被溶解，并且可以通过各种色谱法进行纯化，例如离子交换色谱法、凝胶过滤。

V.经修饰的(宿主)细胞产生的目的蛋白

本公开的目的蛋白(POI)可以是任何内源或异源蛋白质，并且它可以是这种POI的变体。蛋白质可以包含一个或多个二硫键，或者是其功能形式是单体或多聚体的蛋白质，即蛋白质具有四级结构并且由多个相同(同源的)或不相同的(异源的)亚基构成，其中POI或其变体POI优选是具有目的特性的POI。

因此，在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞表达内源POI、异源POI或其一种或多种的组合。

在某些实施例中，相对于(未经修饰的)亲本芽孢杆菌属细胞，本公开的经修饰的芽孢杆菌属细胞展示POI的增加的比生产力(Qp)。例如，比生产力(Qp)的检测是用于评估蛋白质生产的适合的方法。比生产力(Qp)可以使用以下公式确定：

“Qp＝gP/gDCW·hr”

其中，“gP”是罐中产生的蛋白质的克数，“gDCW”是罐中的干细胞重量(DCW)的克数，并且“hr”是从接种时间开始的几小时内的发酵时间，其包括生产时间以及生长时间。

因此，在某些其他实施例中，与未经修饰的(亲本)细胞相比，本公开的经修饰的芽孢杆菌属细胞包含至少约1％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、或至少约10％或更多的比生产力(Qp)增加。

在某些实施例中，POI或其变体POI选自由以下组成的组：乙酰酯酶、芳基酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、糖基水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶及其组合。

因此，在某些实施例中，POI或其变体POI是选自酶学委员会编号(EC)编号EC 1、EC2、EC 3、EC 4、EC 5或EC 6的酶。

例如，在某些实施例中，POI是包括但不限于选自以下的EC 1(氧化还原酶)酶的氧化还原酶：EC 1.10.3.2(例如，漆酶)、EC 1.10.3.3(例如，L-抗坏血酸氧化酶)、EC 1.1.1.1(例如，醇脱氢酶)、EC 1.11.1.10(例如，氯化物过氧化物酶)、EC 1.11.1.17(例如，过氧化物酶)、EC 1.1.1.27(例如，L-乳酸脱氢酶)、EC 1.1.1.47(例如，葡萄糖1-脱氢酶)、EC1.1.3.X(例如，葡萄糖氧化酶)、EC 1.1.3.10(例如，吡喃糖氧化酶)、EC 1.13.11.X(例如，加双氧酶)、EC 1.13.11.12(例如，亚油酸13S-脂氧合酶(lineolate 13S-lipozygenase))、EC 1.1.3.13(例如，醇氧化酶)、EC 1.14.14.1(例如，单加氧酶)、EC 1.14.18.1(例如，单酚单加氧酶(monophenol monooxigenase))、EC 1.15.1.1(例如，超氧化物歧化酶)、EC1.1.5.9(先前，EC 1.1.99.10，例如，葡萄糖脱氢酶)、EC 1.1.99.18(例如，纤维二糖脱氢酶)、EC 1.1.99.29(例如，吡喃糖脱氢酶)、EC 1.2.1.X(例如，脂肪酸还原酶)、EC 1.2.1.10(例如，乙醛脱氢酶)、EC 1.5.3.X(例如，果糖基胺还原酶)、EC 1.8.1.X(例如，二硫还原酶)和EC 1.8.3.2(例如，硫醇氧化酶)。

在某些实施例中，POI是包括但不限于EC 2(转移酶)酶的转移酶，所述EC 2(转移酶)酶选自EC 2.3.2.13(例如，转谷氨酰胺酶)、EC 2.4.1.X(例如，己糖基转移酶)、EC2.4.1.40(例如，交替蔗糖酶(alternasucrase))、EC 2.4.1.18(例如，1,4α-葡聚糖分支酶)、EC 2.4.1.19(例如，环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶)、EC 2.4.1.2(例如，糊精葡聚糖酶)、EC 2.4.1.20(例如，纤维二糖磷酸化酶)、EC 2.4.1.25(例如，4-α-葡聚糖转移酶)、EC2.4.1.333(例如，1,2-β-低聚葡糖磷酸转移酶)、EC 2.4.1.4(例如，淀粉蔗糖酶)、EC2.4.1.5(例如，葡聚糖蔗糖酶)、EC 2.4.1.69(例如，半乳糖苷2-α-L-岩藻糖基转移酶)、EC2.4.1.9(例如，菊粉蔗糖酶(inulosucrase))、EC 2.7.1.17(例如，木酮糖激酶)、EC2.7.7.89(原名EC 3.1.4.15，例如，[谷氨酰氨合成酶]-腺苷-L-酪氨酸磷酸化酶)、EC2.7.9.4(例如，α葡聚糖激酶)和EC 2.7.9.5(例如，磷酸葡聚糖激酶)。

在其他实施例中，POI是包括但不限于选自以下的EC 3(水解酶)酶的水解酶：EC3.1.X.X(例如，酯酶)、EC 3.1.1.1(例如，果胶酶)、EC 3.1.1.14(例如，叶绿素酶)、EC3.1.1.20(例如，丹宁酸酶)、EC 3.1.1.23(例如，甘油酯酰基水解酶)、EC 3.1.1.26(例如，半乳糖脂酶)、EC 3.1.1.32(例如，磷脂酶A1)、EC 3.1.1.4(例如，磷脂酶A2)、EC 3.1.1.6(例如，乙酰酯酶)、EC 3.1.1.72(例如，乙酰木聚糖酯酶)、EC 3.1.1.73(例如，阿魏酸酯酶)、EC 3.1.1.74(例如，角质酶)、EC 3.1.1.86(例如，多聚鼠李半乳糖醛酸乙酰酯酶)、EC3.1.1.87(例如，fumosin B1酯酶)、EC 3.1.26.5(例如，核糖核酸酶P)、EC 3.1.3.X(例如，磷酸单酯水解酶)、EC 3.1.30.1(例如，曲霉属核酸酶S1)、EC 3.1.30.2(例如，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)核酸酶)、EC 3.1.3.1(例如，碱性磷酸酶)、EC 3.1.3.2(例如，酸性磷酸酶)、EC 3.1.3.8(例如，3-植酸酶)、EC 3.1.4.1(例如，磷酸二酯酶I)、EC 3.1.4.11(例如，磷酸肌醇磷脂酶C)、EC 3.1.4.3(例如，磷脂酶C)、EC 3.1.4.4(例如，磷脂酶D)、EC3.1.6.1(例如，芳基硫酸酯酶(arylsufatase))、EC 3.1.8.2(例如，二异丙基-氟磷酸酯酶)、EC 3.2.1.10(例如，寡聚-1,6-葡萄糖苷酶)、EC 3.2.1.101(例如，甘露聚糖内切-1,6-α-甘露糖苷酶)、EC 3.2.1.11(例如，α-1,6-葡聚糖-6-葡聚糖水解酶)、EC 3.2.1.131(例如，木聚糖α-1,2-葡糖醛酸糖苷酶)、EC 3.2.1.132(例如，壳聚糖N-乙酰氨基葡萄糖水解酶)、EC 3.2.1.139(例如，α-葡萄糖醛酸酶)、EC 3.2.1.14(例如，几丁质酶)、EC 3.2.1.151(例如，木葡聚糖-特异性内切-β-1,4-葡聚糖酶)、EC 3.2.1.155(例如，木葡聚糖-特异性内切-β-1,4-葡聚糖酶)、EC 3.2.1.164(例如，半乳糖内切-1,6-β-半乳糖苷酶)、EC 3.2.1.17(例如，溶解酵素)、EC 3.2.1.171(例如，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶)、EC 3.2.1.174(例如，鼠李半乳糖醛酸聚糖鼠李水解酶)、EC 3.2.1.2(例如，β-淀粉酶)、EC 3.2.1.20(例如，α-葡萄糖苷酶)、EC 3.2.1.22(例如，α-半乳糖苷酶)、EC 3.2.1.25(例如，β-甘露糖苷酶)、EC 3.2.1.26(例如，β-呋喃果糖苷酶)、EC 3.2.1.37(例如，木聚糖1,4-β-木糖苷酶)、EC3.2.1.39(例如，葡聚糖内切-1,3-β-D-葡萄糖苷酶)、EC 3.2.1.40(例如，α-L-鼠李糖苷酶)、EC 3.2.1.51(例如，α-L-岩藻糖苷酶)、EC 3.2.1.52(例如，β-N-乙酰己糖胺酶)、EC3.2.1.55(例如，α-N-阿拉伯呋喃糖酶)、EC 3.2.1.58(例如，葡聚糖1,3-β-葡萄糖苷酶)、EC3.2.1.59(例如，葡聚糖内切-1,3-α-葡萄糖苷酶)、EC 3.2.1.67(例如，半乳糖1,4-α-葡萄糖醛酸酶)、EC 3.2.1.68(例如，异淀粉酶)、EC 3.2.1.7(例如，1-β-D-果聚糖果聚糖水解酶)、EC 3.2.1.74(例如，葡聚糖1,4-β-葡萄糖苷酶)、EC 3.2.1.75(例如，葡聚糖内切-1,6-β-葡萄糖苷酶)、EC 3.2.1.77(例如，甘露聚糖1,2-(1,3)-α-甘露糖苷酶)、EC 3.2.1.80(例如，果聚糖β-果糖苷酶)、EC 3.2.1.82(例如，外切-聚-α-半乳糖醛酸酶)、EC 3.2.1.83(例如，κ-卡拉胶酶)、EC 3.2.1.89(例如，阿拉伯半乳聚糖内切-1,4-β-半乳糖苷酶)、EC3.2.1.91(例如，纤维素1,4-β-纤维二糖糖苷)、EC 3.2.1.96(例如，甘露糖-糖蛋白内切-β-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶)、EC 3.2.1.99(例如，阿拉伯聚糖内切-1,5-α-L-树胶醛醣(arabinan endo-1,5-alpha-L-arabinanase))、EC 3.4.X.X(例如，肽酶)、EC 3.4.11.X(例如，氨基肽酶)、EC 3.4.11.1(例如，亮氨酰氨基肽酶)、EC 3.4.11.18(例如，甲硫氨酰基氨基肽酶)、EC 3.4.13.9(例如，Xaa-Pro二肽酶)、EC 3.4.14.5(例如，二肽-肽酶IV)、EC3.4.16.X(例如，丝氨酸型羧基肽酶)、EC 3.4.16.5(例如，羧肽酶C)、EC 3.4.19.3(例如，焦谷氨酰-肽酶I)、EC 3.4.21.X(例如，丝氨酸肽链内切酶)、EC 3.4.21.1(例如，糜蛋白酶)、EC 3.4.21.19(例如，谷酰基内切肽酶)、EC 3.4.21.26(例如，脯氨酰寡聚肽酶)、EC3.4.21.4(例如，胰蛋白酶)、EC 3.4.21.5(例如，凝血酶)、EC 3.4.21.63(例如，水稻素(oryzin))、EC 3.4.21.65(例如，嗜热霉菌素(thermomycolin))、EC 3.4.21.80(例如，链霉菌素(streptogrisin)A)、EC 3.4.22.X(例如，半胱氨酸内肽酶)、EC 3.4.22.14(例如，猕猴桃蛋白酶)、EC 3.4.22.2(例如，木瓜蛋白酶)、EC 3.4.22.3(例如，无花果蛋白酶(ficain))、EC 3.4.22.32(例如，有树干蛋白酶(stem bromelain))、EC 3.4.22.33(例如，菠萝果蛋白酶(fruit bromelain))、EC 3.4.22.6(例如，木瓜凝乳蛋白酶)、EC 3.4.23.1(例如，胃蛋白酶A)、EC 3.4.23.2(例如，胃蛋白酶B)、EC 3.4.23.22(例如，壳室囊菌蛋白酶(endothiapepsin))、EC 3.4.23.23(例如，mucorpepsin)、EC 3.4.23.3(例如，胃亚蛋白酶(gastricsin))、EC 3.4.24.X(例如，金属内肽酶(metalloendopeptidase))、EC 3.4.24.39(例如，deuterolysin)、EC 3.4.24.40(例如，serralysin)、EC 3.5.1.1(例如，天冬酰胺酶)、EC 3.5.1.11(例如，青霉素酰胺酶)、EC 3.5.1.14(例如，N-酰基-脂肪族-L-氨基酸氨基水解酶)、EC 3.5.1.2(例如，L-谷氨酰胺氨基水解酶)、EC 3.5.1.28(例如，N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸酰胺酶)、EC 3.5.1.4(例如，酰胺酶)、EC 3.5.1.44(例如，蛋白-L-谷氨酰胺氨基水解酶)、EC 3.5.1.5(例如，脲酶)、EC 3.5.1.52(例如，肽-N(4)-(N-乙酰基-β-葡糖胺)天冬酰胺酰胺酶)、EC 3.5.1.81(例如，N-酰基-D-氨基-酸脱酰基酶)、EC 3.5.4.6(例如，AMP脱氨酶)和EC 3.5.5.1(例如，腈水解酶)。

在其他实施例中，POI是包括但不限于选自以下的EC 4(裂解酶)酶的裂解酶：EC4.1.2.10(例如，苯乙醇腈裂解酶)、EC 4.1.3.3(例如，N-乙酰神经氨酸裂解酶)、EC4.2.1.1(例如，碳酸脱水酶)、EC 4.2.2.-(例如，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶)、EC4.2.2.10(例如，果裂解酶)、EC 4.2.2.22(例如，果胶三糖-裂解酶)、EC 4.2.2.23(例如，鼠李半乳糖醛酸聚糖内切裂解酶)和EC 4.2.2.3(例如，甘露糖醛特异性海藻酸裂解酶)。

在某些其他实施例中，POI是包括但不限于选自以下的EC 5(异构酶)酶的异构酶：EC 5.1.3.3(例如，醛糖1-差向异构酶)、EC 5.1.3.30(例如，D-阿洛酮糖3-差向异构酶)、EC5.4.99.11(例如，异麦芽酮糖合酶)和EC 5.4.99.15(例如，(1→4)-α-D-葡聚糖1-α-D-葡萄糖基变位酶((1→4)-α-D-glucan 1-α-D-glucosylmutase))。

在又其他实施例中，POI是包括但不限于选自以下的EC 6(连接酶)酶的连接酶：EC6.2.1.12(例如，4-香豆酸：辅酶A连接酶)和EC 6.3.2.28(例如，L-氨基酸α-连接酶)。

因此，在某些实施例中，产生工业蛋白酶的芽孢杆菌属宿主细胞提供特别优选的表达宿主。同样地，在某些其他实施例中，产生工业淀粉酶的芽孢杆菌属宿主细胞提供特别优选的表达宿主。

例如，存在两种一般类型的蛋白酶通常由芽孢杆菌属物种分泌，即中性(或“金属蛋白酶”)和碱性(或“丝氨酸”)蛋白酶。例如，芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶蛋白质(酶)是可用于在本公开中使用的示例性丝氨酸蛋白酶。已经鉴定并测序了多种枯草芽孢杆菌蛋白酶，例如枯草杆菌蛋白酶168、枯草杆菌蛋白酶BPN′、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶DY、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶309(例如，WO 1989/06279和Stahl等人,1984)。在本公开的一些实施例中，经修饰的芽孢杆菌属细胞产生突变体(即，变体)蛋白酶。许多参考文献提供变体蛋白酶的实例，如PCT公开号WO 1999/20770；WO 1999/20726；WO1999/20769；WO 1989/06279；U.S.RE34,606；美国专利号4,914,031；4,980,288；5,208,158；5,310,675；5,336,611；5,399,283；5,441,882；5,482,849；5,631,217；5,665,587；5,700,676；5,741,694；5,858,757；5,880,080；6,197,567和6,218,165。因此，在某些实施例中，本公开的经修饰的芽孢杆菌属细胞包含编码蛋白酶的表达构建体。

在某些其他实施例中，本公开的经修饰的芽孢杆菌属细胞包含编码淀粉酶的表达构建体。多种淀粉酶及其变体是本领域技术人员已知的。例如，国际PCT公开号WO 2006/037484和WO 2006/037483描述了具有改善的溶剂稳定性的变体α-淀粉酶，公开号WO 1994/18314公开了氧化稳定的α-淀粉酶变体，公开号WO 1999/19467、WO 2000/29560和WO 2000/60059公开了Termamyl-样α-淀粉酶变体，公开号WO 2008/112459公开了衍生自芽孢杆菌属物种编号707的α-淀粉酶变体，公开号WO 1999/43794公开了麦芽生成的α-淀粉酶变体，公开号WO 1990/11352公开了超热稳定的(hyper-thermostable)α-淀粉酶变体，公开号WO2006/089107公开了具有颗粒淀粉水解活性的α-淀粉酶变体。

在其他实施例中，在本公开的经修饰细胞中表达和产生的POI或变体POI是肽、肽激素、生长因子、凝血因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、抗体、受体、粘附分子、微生物抗原(例如，HBV表面抗原、HPV E7等)、其变体、其片段等。其他类型的目的蛋白(或其变体)可以是能够为食品或作物提供营养价值的蛋白质或变体。非限制性实例包括可以抑制抗营养因子形成的植物蛋白质和具有更理想的氨基酸组成的植物蛋白质(例如比非转基因植物具有更高的赖氨酸含量)。

本领域普通技术人员已知有用于检测和测量细胞内和细胞外所表达的蛋白质的活性的各种测定。特别地，对于蛋白酶，存在基于来自酪蛋白或血红蛋白的酸溶性肽的释放的测定，其作为280nm下的吸光度测量或使用Folin方法进行比色测定(例如Bergmeyer等人，1984)。其他测定涉及生色底物的溶解(参见例如，Ward，1983)。其他示例性测定包括琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对-硝基苯胺测定(SAAPFpNA)和2,4,6-三硝基苯磺酸钠盐测定(TNBS测定)。本领域技术人员已知的许多另外的参考文献提供了适合的方法(参见例如，Wells等人,1983；Christianson等人,1994和Hsia等人,1999)。

国际PCT公开号WO 2014/164777公开了可用于本文所述淀粉酶活性的Ceralphaα-淀粉酶活性测定。

用于确定宿主细胞中目的蛋白的分泌水平并且检测所表达的蛋白质的手段包括使用对蛋白质具有特异性的多克隆或单克隆抗体的免疫测定。实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(FIA)以及荧光激活细胞分选术(FACS)。

实例

根据以下实例可以进一步理解本发明的某些方面，所述实例不应被解释为限制性的。材料和方法的修改对本领域技术人员而言是显而易见的。

实例1

-1A UTR表达构建体的构建及淀粉酶产生的检测

通过创建野生型枯草芽孢杆菌aprE 5′UTR(SEQ ID NO:1)或经修饰的5′UTR(SEQID NO:2)的表达盒(例如，参见图1)，测试了经修饰的5′非翻译区(5′-UTR)对芽孢杆菌属细胞中编码目的蛋白的基因表达的影响。更特别地，本实例描述了用于评估各种(经修饰的)5′UTR构建体的芽孢杆菌属菌株/宿主细胞的创建，以及当此类经修饰的5′UTR构建体有效地连接到上游(5′)启动子和编码目的蛋白的下游(3′)可读框时，其对所述目的蛋白的产生的影响/作用。

在本实例中，包含携带木糖诱导的comK编码序列(SEQ ID NO:3)的质粒的亲本地衣芽孢杆菌细胞在含有100μg/ml盐酸大观霉素的125ml带挡板的烧瓶中于15ml L肉汤(1％(w/v)胰蛋白胨、0.5％酵母提取物(w/v)、1％NaCl(w/v))中在37℃和250RPM下生长过夜。将过夜培养物在250ml挡板烧瓶中在含有100μg/ml盐酸大观霉素的25ml新鲜L肉汤中稀释至0.7(OD₆₀₀单位)。将细胞在37℃(250RPM)下生长1小时。将D-木糖添加至来自50％(w/v)原料的0.1％(w/v)。使细胞在37℃(250RPM)下再生长4小时，并在1700x g下沉淀7分钟。

使用用过的培养基将细胞重悬于1/4体积的原始培养物中。将一百(100)μl浓缩的细胞与大约1μg野生型(WT)5′UTR表达构建体(WT-5′UTR；SEQ ID NO:4)或经修饰的5′UTR表达构建体(mod-5′UTR；SEQ ID NO:5)混合。例如，每个表达盒包含(按5′至3′方向)相同的5′catH同源臂(SEQ ID NO:6)、catH基因(SEQ ID NO:7)和spoVGrrnIp杂合启动子(SEQ IDNO:8)，有效地连接到野生型枯草芽孢杆菌aprE 5′UTR(SEQ ID NO:1)或经修饰的aprE 5′UTR(SEQ ID NO:2)。另外，所述5′UTR有效地连接到编码SEQ ID NO:9的淀粉酶信号序列的DNA上，随后连接到编码SEQ ID NO:13的变体嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶的SEQ ID NO:10的DNA(ORF)(例如，参见PCT公开号WO 2009/134670，通过引用以其全文特此并入)。将编码变体嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:10)的DNA(ORF)的3′端有效地连接到所述SEQ ID NO:11的淀粉酶终止子，所述淀粉酶终止子有效地连接到所述3′catH同源臂(SEQID NO:12)。将转化反应在37℃、1000RPM下孵育大约90分钟。

将转化混合物铺板在填充有L-肉汤的培养皿上，所述L肉汤含有用1.5％(w/v)琼脂固化的10μg/ml氯霉素。将培养皿在37℃下孵育2天。将菌落在用含有用1.5％(w/v)琼脂固化的1％(w/v)不溶性玉米淀粉的L-肉汤满充的培养皿上进行条纹纯化。将平板在37℃下孵育24小时直至形成菌落。通过清除菌落周围的不溶性淀粉(形成晕圈)来指示淀粉水解，并用于选择表达变体嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶蛋白质(SEQ ID NO:13)的转化体。使用标准技术以及引物对：正向引物(TGTGTGACGGCTATCATGCC；SEQ ID NO:16)/反向引物(TTGAGAGCCGGCGTTCC；SEQ ID NO:17)，将菌落PCR用于扩增来自菌落产生的晕圈的catH基因座(WT构建体；SEQ ID NO:14)(经修饰的构建体，SEQ ID NO:15)。使用标准技术将PCR产物从过量的引物和核苷酸中纯化，且使用桑格(Sanger)法和以下测序引物测序：

AACGAGTTGGAACGGCTTGC；正向引物(SEQ ID NO:18)，

GGCAACACCTACTCCAGCTT；正向引物(SEQ ID NO:19)，

GATCACTCCGACATCATCGG；正向引物(SEQ ID NO:20)。

将包含WT-5′UTR表达盒(SEQ ID NO:4)的经序列验证的地衣芽孢杆菌(子代)细胞以子代细胞BF134存储，并且将包含经修饰的5′-UTR(mod-5′UTR)表达盒(SEQ ID NO:5)的经序列验证的地衣芽孢杆菌(子代)细胞以子代细胞BF117存储。

实例2

经修饰的5′UTR对目的蛋白生产影响的评估

在本实例中，上述实例1中经修饰的地衣芽孢杆菌子细胞(即包含SEQ ID NO:4的子代细胞BF134和包含SEQ ID NO:5的子代细胞BF117)在标准发酵条件下生长84小时。更具体地，地衣芽孢杆菌子代细胞BF134和BF117的相对淀粉酶产量是用标准方法测量的，其结果如下表1所示。

如表1所示，BF117细胞(包含mod-5′UTR表达构建体；SEQ ID NO:5)产生的淀粉酶比BF134细胞(包含WT-5′UTR表达构建体；SEQ ID NO:4)多20％。更特别地，在每OD₅₅₀单位基础上，所述BF117细胞产生的淀粉酶比BF134细胞多40％。

表1

经修饰的地衣芽孢杆菌细胞的淀粉酶产率

参考文献

PCT国际公开号WO 1989/06279

PCT国际公开号WO 1999/20726

PCT国际公开号WO 1999/20769

PCT国际公开号WO 1999/20770

PCT国际公开号WO 2002/14490

PCT国际公开号WO 2003/083125

PCT国际公开号WO 2003/089604

PCT国际公开号WO 2014/164777

美国专利号4,914,031

美国专利号4,980,288

美国专利号5,208,158

美国专利号5,310,675

美国专利号5,336,611

美国专利号5,399,283

美国专利号5,441,882

美国专利号5,482,849

美国专利号5,631,217

美国专利号5,665,587

美国专利号5,700,676

美国专利号5,741,694

美国专利号5,858,757

美国专利号5,880,080

美国专利号6,197,567

美国专利号6,218,165

美国专利公开号2014/0329309

美国RE 34,606

Bansal,“Relative stability of DNA as a generic criterion for promoterprediction:whole genome annotation of microbial genomes with varyingnucleotide base composition”,Mol.Biosyst.,5:1758-1769,2009.

Bergmeyer et al.,"Methods of Enzymatic Analysis"vol.5,Peptidases,Proteinases and their Inhibitors,Verlag Chemie,Weinheim,1984.

Botstein and Shortle,Science 229:4719,1985.

Brode et al.,“Subtilisin BPN'variants:increased hydrolytic activityon surface-bound substrates via decreased surface activity”,Biochemistry,35(10):3162-3169,1996.

Caspers et al.,“Improvement of Sec-dependent secretion of aheterologous model protein in Bacillus subtilis by saturation mutagenesis ofthe N-domain of the AmyE signal peptide”,Appl.Microbiol.Biotechnol.,86(6):1877-1885,2010.

Chang et al.,Mol.Gen.Genet.,168:11-115,1979.

Christianson et al.,Anal.Biochem.,223:119-129,1994.

de Avila et al.,“BacPP:bacterial promoter prediction-a tool foraccurate sigma-factor specific assignment in enterobacteria”,J.Theor.Biol.,287,92-99,2011.

Devereux et a/.,Nucl.Acid Res.,12:387-395,1984.

Dontsova et al.,“The location of mRNA in the ribosomal 30S initiationcomplex；site-directed cross-linking of mRNA analogues carrying severalphotoreactive labels simultaneously on either side of the AUG start codon”,EMBO J.,10:2613-2620,1991.

Earl et al.,“Ecology and genomics of Bacillus subtilis”,Trends inMicrobiology.,16(6):269-275,2008.

Ferrari et al.,"Genetics,"in Harwood et al.(ed.),Bacillus,PlenumPublishing Corp.,1989.

Fisher et.al.,Arch.Microbiol.,139:213-217,1981.

Haldenwang et al.,Microbiol Reviews 59(1):1-30,1995.

Hamoen et al.,Genes Dev.12:1539-1550,1998.

Higuchi et al.,Nucleic Acids Research 16:7351,1988.

Ho et al.,Gene 77:61,1989.

Hoch et al.,J.Bacteriol.,93:1925-1937,1967.

Holubova,Folia Microbiol.,30:97,1985.

Hopwood,The Isolation of Mutants in Methods in Microbiology(J.R.Norris and D.W.Ribbons,eds.)pp 363-433,Academic Press,New York,1970.

Horton et al.,Gene 77:61,1989.

Hsia et al.,Anal Biochem.,242:221-227,1999.

Iglesias and Trautner,Molecular General Genetics 189:73-76,1983.

Jacob et al.,“A single base change in the Shine-Dalgarno region ofthe 16S rRNA of E.coli affects translation of many proteins”,PNAS,84:4757-4761,1987.

Jacques and Dreyfus,“Translation initiation in E.coli:old and newquestions”,Mol.Microbiol.4:1063-1067,1990.

Jensen et al.,“Cell-associated degradation affects the yield ofsecreted engineered and heterologous proteins in the Bacillus subtilisexpression system”Microbiology,146(Pt 10:2583-2594,2000.

Klucar et al.,Nucleic Acids Res.38:D366-D370,2010.

Liu and Zuber,1998,

Lo et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:2285,1985.

Mann et al.,Current Microbiol.,13:131-135,1986.

McDonald,J.Gen.Microbiol.,130:203,1984.

Munch et al.,Nucleic Acids Res.,31(1):266-269,2003

Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443,1970.

Olempska-Beer et al.,“Food-processing enzymes from recombinantmicroorganisms--a review”’Regul.Toxicol.Pharmacol.,45(2):144-158,2006.

Palmeros et al.,Gene 247:255-264,2000.

Parish and Stoker,FEMS Microbiology Letters 154:151-157,1997.

Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988.

Perego,1993,In A.L.Sonneshein,J.A.Hoch,and R.Losick,editors,Bacillussubtilis and Other Gram-Positive Bacteria,Chapter 42,American Society ofMicrobiology,Washington,D.C.

Raul et al.,“Production and partial purification of alpha amylasefrom Bacillus subtilis(MTCC 121)using solid state fermentation”,BiochemistryResearch International,2014.

Salamov,“Automatic annotation of microbial genomes and metagenomicsequences”,In:Li RW(ed),Metagenomics and its applications in agriculture,biomedicine and environmental studies.Nova Science Publishers,Hauppauge,NY,pp.61-78,2011.

Sarkar and Sommer,BioTechniques 8:404,1990.

Saunders et al.,J.Bacteriol.,157:718-726,1984.

Shimada,Meth.Mol.Biol.57:157；1996

Shine and Dalgarno,“Determinant of cistron specificity in bacterialribosomes”,Nature,254:34-38,1975.

Shine and Dalgarno,“The 3’-terminal sequence of E.coli 16s ribosomalRNA:complementary to nonsense triplets and ribosome binding sites”,PNAS,71:1342-1346,1974.

Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482,1981.

Smith et al.,Appl.Env.Microbiol.,51:6341986.

Stahl and Ferrari,J.Bacteriol.,158:411-418,1984.

Stahl et al,J.Bacteriol.,158:411-418,1984.

Tarkinen,et al,J.Biol.Chem.258:1007-1013,1983.

Van Dijl and Hecker,“Bacillus subtilis:from soil bacterium to super-secreting cell factory”,Microbial Cell Factories,12(3).2013.

Vorobjeva et al.,FEMS Microbiol.Lett.,7:261-263,1980.

Ward,"Proteinases,"in Fogarty(ed.).,Microbial Enzymes andBiotechnology.Applied Science,London,pp 251-317,1983.

Wells et al.,Nucleic Acids Res.11:7911-7925,1983.

Westers et al.,“Bacillus subtilis as cell factory for pharmaceuticalproteins:a biotechnological approach to optimize the host organism”,Biochimica et Biophysica Acta.,1694:299-310,2004.

Yang et al,J.Bacteriol.,160:15-21,1984.

Yang et al.,Nucleic Acids Res.11:237-249,1983.

Youngman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2305-2309,1983.

Claims (37)

1.一种分离的多核苷酸，其包含源自野生型枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)aprE5′-非翻译区(WT-5′-UTR)核酸序列SEQ ID NO:1的经修饰的枯草芽孢杆菌aprE 5′-非翻译区(mod-5′-UTR)核酸序列。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述mod-5′-UTR包含SEQ ID NO:2。

3.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述mod-5′-UTR进一步包含位于所述mod-5′-UTR的5′并有效地连接到所述mod-5′-UTR的上游(5′)启动子区核酸序列。

4.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述mod-5′-UTR进一步包含编码目的蛋白的下游(3′)可读框(ORF)核酸序列，其中所述ORF序列位于所述mod-5′-UTR的3′并有效地连接到所述mod-5′-UTR。

5.如权利要求1所述的多核苷酸，其包含按5′至3′方向的式(I)：

(I)：[Pro][mod-5′-UTR][ORF]；

其中[Pro]是在芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)细胞中有效的启动子区核酸序列，[mod-5′-UTR]是经修饰的枯草芽孢杆菌aprE 5′非翻译区(mod-5′-UTR)核酸序列，并且[ORF]是编码目的蛋白(POI)的可读框核酸序列，其中所述[Pro]、[mod-5′-UTR]和[ORF]核酸序列是有效地连接的。

6.一种载体，其包含如权利要求1所述的多核苷酸。

7.一种DNA表达构建体，其包含如权利要求1所述的多核苷酸。

8.一种芽孢杆菌属物种细胞，其包含如权利要求1所述的多核苷酸。

9.如权利要求8所述的芽孢杆菌属物种细胞，其中所述细胞是地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)细胞。

10.一种分离的多核苷酸，其包含源自野生型芽孢杆菌属物种5′-UTR(WT-5′-UTR)序列的经修饰的芽孢杆菌属物种5′-UTR(mod-5′-UTR)核酸序列，所述分离的经修饰的多核苷酸包含按5′至3′方向以有效组合的式(II)的核酸序列：

(II)：[TIS][mod-5′UTR][tss密码子]

其中[TIS]是转录起始位点(TIS)，[mod-5′-UTR]包含经修饰的枯草芽孢杆菌5′-UTR核酸序列，并且[tss密码子]是三(3)核苷酸翻译起始位点(tss)密码子。

11.如权利要求10所述的多核苷酸，其中所述[mod-5′-UTR]序列包含SEQ ID NO:2。

12.如权利要求10所述的多核苷酸，其进一步包含：

(a)位于所述[TIS]的上游(5′)并有效地连接到所述[TIS]的核酸启动子序列，该启动子序列在芽孢杆菌属物种细胞中是有效的，以及

(b)位于所述tss密码子的下游(3′)并有效地连接到所述tss密码子的ORF核酸序列，其中所述ORF序列编码POI。

13.一种载体，其包含如权利要求10所述的多核苷酸。

14.一种DNA表达构建体，其包含如权利要求10所述的多核苷酸。

15.一种芽孢杆菌属物种细胞，其包含如权利要求10所述的多核苷酸。

16.如权利要求15所述的芽孢杆菌属物种细胞，其中所述细胞是地衣芽孢杆菌细胞。

17.一种分离的多核苷酸，其包含按5′至3′方向并且以有效组合的式(III)的核酸序列，

(III)：[5′-HR][TIS][mod-5′-UTR][tss密码子][3′-HR]，

其中[TIS]是转录起始位点(TIS)，[mod-5′-UTR]包含经修饰的枯草芽孢杆菌5′-UTR核酸序列，[tss密码子]是三(3)核苷酸翻译起始位点(tss)密码子，[5′-HR]是5′-核酸序列同源区并且[3′-HR]是3′-核酸序列同源区，其中所述5′-HR和3′-HR分别与紧邻所述[TIS]序列的上游(5′)和紧邻所述[tss密码子]序列的下游(3′)的基因组(染色体)区域(基因座)具有足够的同源性，以实现通过同源重组将引入的多核苷酸构建体整合到经修饰的芽孢杆菌属细胞基因组中。

18.一种载体，其包含如权利要求17所述的多核苷酸。

19.一种DNA表达构建体，其包含如权利要求17所述的多核苷酸。

20.一种芽孢杆菌属物种细胞，其包含如权利要求17所述的多核苷酸。

21.如权利要求17所述的芽孢杆菌属物种细胞，其中所述细胞是地衣芽孢杆菌细胞。

22.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述ORF序列编码选自由以下组成的组的POI：乙酰酯酶、芳基酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶(arabinase)、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、糖基水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其组合。

23.如权利要求12所述的多核苷酸，其中所述ORF序列编码选自由以下组成的组的POI：乙酰酯酶、芳基酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、糖基水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其组合。

24.一种分离的多核苷酸，其包含源自野生型芽孢杆菌属物种5′-UTR(WT-5′-UTR)序列的经修饰的5′-UTR(mod-5′-UTR)核酸序列，所述分离的多核苷酸包含按5′至3′方向并且以有效组合的式(IV)的核酸序列：

(IV)：[TIS][5′-UTR^-ΔxN][tss密码子]，

其中[TIS]是转录起始位点(TIS)，[tss密码子]是三(3)核苷酸翻译起始位点(tss)密码子并且[5′-UTR-ΔxN]是源自野生型芽孢杆菌属物种5′-UTR核酸序列的经修饰的芽孢杆菌属物种5′-UTR核酸序列，其中所述mod-5′-UTR核酸序列[5′-UTR^-ΔxN]在所述WT-5′-UTR核酸序列的远(3′)端处包含“x”个核苷酸(“N”)的缺失(-Δ)。

25.一种分离的多核苷酸，其包含源自野生型芽孢杆菌属物种5′-UTR(WT-5′-UTR)序列的经修饰的5′-UTR(mod-5′-UTR)核酸序列，所述分离的多核苷酸包含按5′至3′方向并且以有效组合的式(V)的核酸序列：

(V)：[TIS][5′-UTR⁺ΔxN][tss密码子]，

其中[TIS]是转录起始位点，[tss密码子]是三(3)核苷酸翻译起始位点(tss)密码子并且[5′-UTR⁺ΔxN]是源自野生型芽孢杆菌属物种5′-UTR核酸序列的经修饰的芽孢杆菌属物种5′-UTR核酸序列，其中所述mod-5′-UTR核酸序列[5′-UTR⁺ΔxN]在所述野生型芽孢杆菌属物种5′-UTR核酸序列的远(3′)端处包含“x”个核苷酸(“N”)的添加(⁺Δ)。

26.一种载体，其包含如权利要求24或25所述的多核苷酸。

27.一种DNA表达构建体，其包含如权利要求24或25所述的多核苷酸。

28.一种芽孢杆菌属物种细胞，其包含如权利要求24或25所述的多核苷酸。

29.如权利要求24或25所述的芽孢杆菌属物种细胞，其中所述细胞是地衣芽孢杆菌细胞。

30.一种经修饰的芽孢杆菌属物种(子代)细胞，当将其培养在适于产生异源目的蛋白(POI)的培养基中时产生增加量的异源POI，所述经修饰的芽孢杆菌属细胞包含引入的表达构建体，所述表达构建体包含按5′至3′方向并且以有效组合的式(I)的核酸序列，

(I)：[Pro][mod-5′-UTR][ORF]；

其中[Pro]是在芽孢杆菌属物种细胞中有效的启动子区核酸序列，[mod-5′-UTR]是经修饰的枯草芽孢杆菌非翻译区(mod-5′-UTR)核酸序列，并且[ORF]是编码目的蛋白(POI)的可读框核酸序列，其中所述[Pro]、[mod-5′-UTR]和[ORF]核酸序列是有效地连接的；其中，当在相似条件下培养时，相对于产生相同POI的未经修饰的地衣芽孢杆菌(亲本)细胞，所述经修饰的芽孢杆菌属(子代)细胞产生增加量的异源POI。

31.如权利要求30所述的芽孢杆菌属细胞，其中所述mod-5′-UTR包含SEQ ID NO:2。

32.如权利要求30所述的芽孢杆菌属细胞，其中所述细胞是地衣芽孢杆菌细胞。

33.如权利要求30所述的芽孢杆菌属细胞，其中所述ORF序列编码选自由以下组成的组的POI：乙酰酯酶、芳基酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、糖基水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其组合。

34.一种在经修饰的芽孢杆菌属细胞中产生增加量的异源目的蛋白(POI)的方法，所述方法包括：

(a)向亲本芽孢杆菌属物种细胞中引入表达构建体，所述表达构建体包含按5′至3′方向并且以有效组合的核酸序列[Pro][mod-5′-UTR][ORF]，其中[Pro]是在芽孢杆菌属物种细胞中有效的启动子区核酸序列，[mod-5′-UTR]是具有SEQ ID NO:2的mod-5′-UTR核酸序列，并且[ORF]是编码目的蛋白(POI)的可读框核酸序列，以及

(b)在适于产生异源POI的培养基中培养步骤(a)的经修饰的芽孢杆菌属物种细胞，

其中相对于步骤(b)的相同培养基中培养的芽孢杆菌属对照细胞，所述经修饰的芽孢杆菌属(子代)细胞产生增加量的POI，其中所述芽孢杆菌属对照细胞包含引入的表达构建体，所述表达构建体包含按5′至3′方向并且以有效组合的核酸序列[Pro][WT-5′-UTR][ORF]，其中所述[Pro]和[ORF]核酸序列与步骤(a)中的[Pro]和[ORF]序列相同且所述[WT-5′-UTR]包含SEQ ID NO:1。

35.如权利要求34所述的芽孢杆菌属细胞，其中所述细胞是地衣芽孢杆菌细胞。

36.如权利要求34所述的芽孢杆菌属细胞，其中所述ORF序列编码选自由以下组成的组的POI：乙酰酯酶、芳基酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、糖基水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其组合。

37.一种在经修饰的芽孢杆菌属细胞中产生增加量的内源目的蛋白(POI)的方法，所述方法包括：

(a)获得产生内源POI的亲本芽孢杆菌属细胞，

(b)向步骤(a)的细胞中引入多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体包含按5′至3′方向并且以有效组合的式(VI)的核酸序列，

(VI)：[5′-HR][mod-5′-UTR][3′-HR]，

其中[mod-5′-UTR]包含SEQ ID NO:2，[5′-HR]是与编码内源POI的内源GOI的内源野生型5′-UTR(WT-5′-UTR)序列的上游(5′)紧邻的基因组基因座具有同源性的5′-核酸序列同源区，并且[3′-HR]是与编码内源POI的内源GOI的内源WT-5′-UTR序列的下游(3′)紧邻的基因组基因座具有同源性的3′-核酸序列同源区，其中5′-HR和3′-HR与所述基因组基因座具有足够的同源性，以实现通过同源重组将引入的mod-5′-UTR多核苷酸构建体整合到经修饰的芽孢杆菌属细胞的基因组中，从而用SEQ ID NO:2的mod-5′-UTR取代内源WT-5′-UTR，以及

(c)在适于产生所述内源POI的培养基中培养步骤(b)的经修饰的芽孢杆菌属物种细胞，

其中当在相似条件下培养时，相对于步骤(a)的亲本细胞，步骤(c)的经修饰的细胞产生增加量的内源POI。

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