MX2007007107A

MX2007007107A - Polipeptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleotidos que los codifican.

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Publication number: MX2007007107A
Application number: MX2007007107A
Authority: MX
Inventors: Eric Allain; Hiroaki Udagawa; Shiro Fukuyama; Jiyin Liu; Chee-Leong Soong; Sara Landvik; Michiko Ihara
Original assignee: Novozymes North America Inc
Priority date: 2004-12-22
Filing date: 2005-12-22
Publication date: 2007-08-08
Also published as: DK1831384T3; US20110104759A1; WO2006069289A3; AR051864A1; US8512986B2; AU2005319074B2; CA2591745C; US20100216213A1; EP2365068A2; JP5452869B2; AU2005319073B2; US7326548B2; MX2007007030A; US20060148054A1; EP1831385A4; EP2365068A3; US8148127B2; US20080090271A1; EP1831384A4; US20060172403A1

Abstract

La presente invencion se relaciona con polipeptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleotidos aislados que codifican para dichos polipeptidos. La invencion tambien se relaciona con construcciones de acido nucleico, vectores y celulas hospedadoras que comprenden los polinucleotidos asi como metodos para la elaboracion y uso de los polipeptidos. La invencion tambien se relaciona con la composicion que comprende una glucoamilasa de la invencion asi como el uso de dichas composiciones para procedimientos de conversion de almidon, fermentacion que incluye procedimientos para producir productos de fermentacion o jarabes.

Description

POLIPETIDOS QUE TIENEN ACTIVIDAD DE GLUCOAMILASA Y POLINUCLEOTIDOS QUE LOS CODIFICAN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican para los polipéptidos. La invención también se relaciona con construcciones de ácido nucleico, vectores y células hospedadoras que comprenden los polinucleótidos así como métodos para producir y utilizar los polipéptidos, y con el uso de glucoamilasa de la invención para la conversión de almidón para producir productos de fermentación tales como etanol y jarabes tales como glucosa. La invención también se relaciona con una composición que comprende una glucoamilasa de la invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La glucoamilasa ( 1, 4-a-D-glucanoglucohidrolasa, EC 3.2.1.3) es una enzima la cual cataliza la liberación de D-glucosa de los extremos no reductores de almidón o de moléculas de oligosacáridos y polisacáridos relacionadas. Las glucoamilasas se producen por varios hongos filamentosos y levaduras, entre los cuales el más importante comercialmente es Aspergill us . Comercialmente, las glucoamilasas se utilizan para REF. : 182036 convertir material de almidón, el cual se hidroliza parcialmente con facilidad por una a-amilasa, a glucosa. La glucosa después de convierte, directa o indirectamente, en un producto de fermentación utilizando un organismo fermentador. Los ejemplos de productos de fermentación comerciales incluyen alcoholes (por ejemplo etanol, metanol, butanol, 1, 3-propanodiol) ; ácidos orgánicos (por ejemplo ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico, gluconato, ácido láctico, ácido succinico, ácido 2, 5-diceto-D-glucónico) ; cetonas (por ejemplo acetona); aminoácidos (por ejemplo ácido glutámico) ; gases (por ejemplo H2 y C02) y compuestos más complejos que incluyen, por ejemplo, antibióticos (por ejemplo penicilina y tetraciclina); enzimas; vitaminas (por ejemplo riboflavina, B?2, ß-caroteno) ; hormonas y otros compuestos los cuales son difíciles de producir sintéticamente. Los procedimientos de fermentación también se utilizan comúnmente en el alcohol consumible (por ejemplo cerveza y vino), en productos lácteos (por ejemplo en la elaboración de yogur y queso, y en las industrias del cuero y el tabaco. El producto final también puede ser un jarabe. Por ejemplo, el producto final puede ser glucosa pero también se puede convertir, por ejemplo, por glucosa isomerasa a fructosa o una mezcla constituida casi por igual de glucosa y fructosa. Esta mezcla, o una mezcla adicional enriquecida (con concentración aumentada) de fructuosa es el jarabe de maiz con alta fructuosa utilizado más comúnmente (HFCS, por sus siglas en inglés), comercializado en todo el mundo. Boel et al., (1984), EMBO J. 3(5)p. 1097-1102 describe glucoamilasa Gl o G2 de Aspergill us níger. La patente de E.U.A. número 4,727,046 describe una glucoamilasa derivada de Cortici um rolfsii la cual también se denomina como Athelia rolfsii . El documento WO 84/02921 describe una glucoamilasa derivada de Aspergill us awamori . El documento WO 99/28248 describe una glucoamilasa derivada de Talaromyces emersonii . El documento WO 00/75296 describe una glucoamilasa derivada de Thermoascus crusta ceus . Un objetivo de la presente invención es proporcionar polipéptidos que tengan actividad de glucoamilasa y polinucleótidos que codifiquen para los polipéptidos y los cuales proporcionen un alto rendimiento en los procedimientos de elaboración de productos de fermentación, tales como procedimientos de elaboración de etanol que incluyen procedimientos de fermentación de etanol en una etapa a partir de almidón crudo no gelatinizado (o sin cocinar) .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa que se seleccionan del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual es por lo menos 75% idéntica con los aminoácidos de un polipéptido maduro, aminoácidos 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2; o (al) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual es por lo menos 75% idéntica con los aminoácidos de un polipéptido maduro, aminoácidos 1 a 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37; o (b) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotidica (i) la cual hibridiza bajo condiciones de por lo menos baja rigurosidad con nucleótidos 55 a 2166 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 o (ii) la cual hibridiza bajo condiciones de por lo menos rigurosidad media con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 55 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii) ; o (bl) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotídica (i) la cual hibridiza bajo condiciones de por lo menos baja rigurosidad con los nucleótidos 55 a 2166 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 36, o (ii) el cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de rigurosidad media con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 55 a 1737 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 38, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii); y (c) una variante que comprende una sustitución, supresión y/o inserción conservadora de uno o más aminoácidos de los aminoácidos 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, o (cl) una variante que comprende una sustitución, supresión y/o inserción conservadora de uno o más aminoácidos de los aminoácidos 1 a 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37. La presente invención también se relaciona con los polinucleótidos que codifican para polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa, que se seleccionan del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual es por lo menos 75% idéntica con los aminoácidos de un polipéptido maduro 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2; (al) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual es por lo menos 75% idéntica con los aminoácidos de un polipéptido maduro 1 a 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37; o (b) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 55 a 2166 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1; o (bl) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 55 a 2166 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 36; (c) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 55 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3; o (cl) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 55 a 1737 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 38; (d) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotidica: (i) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad con los nucleótidos 55 a 2166 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1, o (ii) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de rigurosidad media con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 55 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii) , o (di) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotídica: (i) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad con los nucleótidos 55 a 2166 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 36, o (ii) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de rigurosidad media con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 55 a 1737 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 38, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii) . En una modalidad preferida, el polipéptido es derivable de una cepa del género Trametes, preferiblemente Trametes cingula ta o la cepa de E . coli depositada en DSMZ y a la que se le proporciona el número DSM 17106. La cepa depositada DSM 17106 alberga el plásmido HUda595 que comprende una secuencia idéntica a la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1. Un polipéptido específico de la invención es el polipéptido maduro que se obtiene cuando se expresa el plásmido pHUda440 en una célula hospedadora micótica adecuada tal como Aspergill us oryzae, como se describe en el ejemplo 6. En un segundo aspecto, la presente invención se relaciona con polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa que se seleccionan del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual es por lo menos 70% idéntica con los aminoácidos para el polipéptido maduro de los aminoácidos 1 a 575 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5; o (al) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual es por lo menos 70% idéntica con los aminoácidos para los aminoácidos del polipéptido maduro 1 a 565 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40; (b) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotidica: (i) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad con los nucleótidos 55 a 2189 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4, o (ii) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de rigurosidad media con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 55 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii); o (bl) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotidica (i) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad con los nucleótidos 55 a 2182 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 39, o (ii) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de rigurosidad media con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 55 a 1749 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 41, o (ii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii); y (c) una variante que comprende una sustitución, supresión y/o inserción conservadora de uno o más aminoácidos de los aminoácidos 1 a 575 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5; o (cl) una variante que comprende una sustitución, supresión y/o inserción conservadora de uno o más aminoácidos de los aminoácidos 1 a 565 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40. La presente invención también se relaciona con polinucleótidos que codifican para polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa que se seleccionan del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual es por lo menos 75% idéntica con los aminoácidos de un polipéptido maduro 1 a 575 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5; (al) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual es por lo menos 75% idéntica con los aminoácidos de un polipéptido maduro 1 a 565 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40; o (b) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 55 a 2189 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4; o (bl) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 55 a 2182 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 39; (c) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 55 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6; o (cl) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 55 a 1749 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 41; (d) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotídica: (i) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad con los nucleótidos 55 a 2189 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4, o (ii) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de rigurosidad media con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 55 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii), o (di) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotidica: (i) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad con los nucleótidos 55 a 2182 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 39, o (ii) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de rigurosidad media con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 55 a 1749 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 41, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii) . En una modalidad preferida, el polipéptido es derivable de una cepa del género Pachykytospora , preferiblemente Pachykytospora papyra cea o la cepa E . coli depositada en DSMZ y a la que se le proporciona el número DSM 1705. La cepa depositada DSM 17105 alberga el plásmido HUda594 que comprende una secuencia idéntica a la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4. Un polipéptido especifico de la invención es un polipéptido maduro que se obtiene cuando se expresa el plásmido pHUda450 en una célula hospeadora micótica adecuada tal como Aspergillus oryzae, como se describe en el ejemplo 6. En un tercer aspecto, la invención se relaciona con polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa que se seleccionan del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual es por lo menos 60% idéntica con los aminoácidos para los aminoácidos del polipéptido maduro 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26; o (al) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual es por lo menos 60% idéntica con los aminoácidos para los aminoácidos del polipéptido maduro 1 a 548 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24; o (a2) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual es por lo menos 60% idéntica con los aminoácidos para los aminoácidos del polipéptido maduro 1 a 523 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43; (b) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotídica: (i) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad con los nucleótidos 117 a 2249 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23, o (ii) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de rigurosidad con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 52 a 1719 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 25, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii); (bl) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotidica (i) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 52 a 1620 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 42, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii) ; y (c) una variante que comprende una sustitución, supresión y/o inserción conservadora de uno o más aminoácidos de los aminoácidos 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26; o (cl) una variante que comprende una sustitución, supresión y/o inserción conservadora de uno o más aminoácidos de los aminoácidos 1 a 548 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24; (c2) una variante que comprende una sustitución, supresión y/o inserción conservadora de uno o más aminoácidos de los aminoácidos 1 a 523 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43. La presente invención también se relaciona con polinucleótidos que codifican para polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa, que se seleccionan del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual es por lo menos 60% idéntica con los aminoácidos de un polipéptido maduro 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26; o (al) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual tiene por lo menos 60% idéntica con los aminoácidos de un polipéptido maduro 1 a 548 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24; o (a2) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual tiene por lo menos 60% de identidad con los aminoácidos de un polipéptido maduro 1 a 523 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43; (b) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 117 a 2249 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23; o (c) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 52 a 1719 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 25; o (cl) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 52 a 1620 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 42; (d) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotídica: (i) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad con los nucleótidos 117 a 2249 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23, o (ii) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 52 a 1620 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 42, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii), o (di) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotídica: (i) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 52 a 1719 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 25, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii) . En una modalidad preferida, el polipéptido es derivable de una cepa del género Leucopaxillus, preferiblemente Leucopaxill us gigan teus o la secuencia que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26. Un polipéptido especifico de la invención es un polipéptido maduro que se obtiene cuando se expresa el plásmido pENI3372 en una célula hospeadora micótica adecuada tal como Aspergill us niger, como se describe en el ejemplo 11.

La presente invención también se relaciona con construcciones de ácido nucleico, vectores de expresión recombinante y células hospedadoras recombinantes que comprenden los polinucleótidos de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1 a 3 (ADNc) o 36 o 38 (ADNc); o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4 o 6 (ADNc) o 39 o 41 (ADNc); o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23 o 25 (ADNc) o 42 (ADNc), respectivamente. Los clones que, hasta la mejor creencia de los inventores, son idénticos a las SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 y 4 se depositaron el 2 de febrero del 2005 bajo los términos del tratado de Budapest respecto al reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para los propósitos de procedimiento de patente en Deutshe Sammmlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig Alemania. A los clones se les proporcionan los números de depósitos DSM 17106 y DSM 17105, respectivamente. La presente invención también se relaciona con métodos par elaborar dichos polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa que comprende: (a) cultivar una célula hospedadora recombinante que comprende una construcción de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica para el polipéptido bajo condiciones conductoras para la elaboración del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

La presente invención también se relaciona con un procedimiento para la elaboración de un producto de fermentación o jarabe.

Definiciones Actividad de glucoamilasa: El término glucoamilasa ( 1 , 4-a-D-glucanoglucohidrolasa, EC 3.2.13) se define como una enzima la cual cataliza la liberación de D-glucosa de los extremos no reductores de almidón o de moléculas relacionadas de oligosacáridos o polisacáridos. Para propósitos de la presente invención, se determina la actividad de glucoamilasa de acuerdo con el procedimiento descrito en la sección de "materiales y métodos" posterior. Los polipéptidos de la presente invención tienen por lo menos 20%, de manera preferible por lo menos 40%, de manera más preferible por lo menos 50%, de manera más preferible por lo menos 60%, de manera más preferible por lo menos 70%, de manera más preferible por lo menos 80%, incluso de manera más preferible por lo menos 90%, de manera más preferible por lo menos 95% e incluso de manera más preferible por lo menos 100% de la actividad glucoamilasa del polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos que se muestran como aminoácidos 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o los aminoácidos 1 a 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37; o los aminoácidos 1 a 575 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 o los aminoácidos 1 a 565 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40; o los aminoácidos 1 a 548 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24 o los aminoácidos 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26 o los aminoácidos 1 a 523 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43, respectivamente . Polipéptido: El término "polipéptido", como se utiliza en la presente, se refiere a un polipéptido aislado el cual es por lo menos 20% puro, preferiblemente por lo menos 40% puro, de manera más preferible por lo menos 60% puro, e incluso de manera más preferible por lo menos 80% y de manera más preferible por lo menos 90% puro y de manera mucho más preferible por lo menos 95% puro, determinado por SDS-PAGE. Polipéptido sustancialmente puro: El término "polipéptido sustancialmente puro" indica en la presente una preparación polipeptidica la cual contiene como máximo 10%, de manera preferible como máximo 8%, de manera más preferible como máximo 6%, de manera más preferible como máximo 5%, de manera más preferible como máximo 4%, como máximo 3%, incluso de manera más preferible como máximo 2%, de manera mucho más preferible como máximo 1% e incluso de manera más preferible como máximo 0.5% en peso de otro material polipeptídico con el cual se asocia de manera nativa. Por lo tanto, se prefiere que el polipéptido sustancialmente puro sea por lo menos 92% puro, de manera preferible por lo menos 94% puro, de manera más preferible por lo menos 95% puro, de manera más preferible por lo menos 96% puro, de manera más preferible por lo menos 97% puro, de manera más preferible por lo menos 98; puro incluso de manera más preferible por lo menos 99%, de manera más preferible por lo menos 99.5% puro e incluso de manera más preferible 100% puro en peso del material polipeptidico total presente en la preparación. Los polipéptidos de la presente invención preferiblemente están en forma sustancialmente pura. En particular, se prefiere que los polipéptidos estén en "forma esencialmente pura", es decir, que la preparación polipeptidica esté esencialmente libre de otro material polipeptidico con el cual se asocie cuando se encuentran en la naturaleza. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, al preparar el polipéptido por medios de métodos recombinantes bien conocidos o por métodos de purificación clásica. En la presente, el término "polipéptido sustancialmente puro" es sinónimo con el término "polipéptido aislado" y "polipéptido en forma aislada". Identidad: La relación entre las secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias nucleotídicas se describe por el parámetro "identidad". Para propósitos de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos está determinado por el método Clustal (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153) utilizando el programa (software) LASERGENEMR MEGALIGNMR (DNASTAR, Inc., Madison, Wl) con una tabla de identidad y los siguientes parámetros de alineación múltiple: Castigo por separación de 10 y castigo por longitud de separación de 10. Los parámetros de alineación pareados son K = 1, castigo por separación = 3, intervalos = 5 y diagonales = 5. Para propósitos de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias nucleotidicas está determinado por el método de Wilbur-Lipman (Wilbur and Lipman, 1983, Proceeding of the Na tional Academy of Science USA 80: 726-730) utilizando el programa (software) LASERGENEMR MEGALIGNMR (DNASTAR, Inc., Madison, Wl) con una tabla de identidad y los siguientes parámetros de alineación múltiple: Castigo por separación de 10 y castigo por longitud de separación de 10. Los parámetros de alineación pareados son K = 3, castigo por separación = 3 e intervalos = 20. Fragmento polipeptidico: El término "fragmento polipeptidico" se define en la presente como un polipéptido que tiene uno o más aminoácidos suprimidos de la parte amino y/o carboxilo terminal de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 2 o 37; SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 5 o 40; o SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 24, 26 o 43, respectivamente, o secuencias homologas de los mismos, en donde el fragmento tiene actividad de glucoamilasa. Subsecuencia: El término "subsecuencia" se define en la presente como una secuencia nucleotidica que tiene uno o más nucleótidos suprimidos del extremo 5' y/o 3' de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1, 36 ó 38, respectivamente, o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4, 39 ó 41 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23, 25 o 42, respectivamente, o secuencias homologas de las mismas, en donde la subsecuencia codifica para un fragmento polipeptídico que tiene actividad de glucoamilasa. Variante alélica: El término "variante alélica" indica en la presente cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupan el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de manera natural por mutación y puede resultar en polimorfismo dentro de poblaciones. Las mutaciones de genes pueden ser silenciosas (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar para polipéptidos que tengan secuencias alteradas de aminoácidos. Una variante alélica en un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen. Polinucleótido sustancialmente puro: El término "polinucleótido sustancialmente puro", como se utiliza en la presente, se refiere a una preparación polinucleotídica libre de otros nucleótidos extraños o no deseados y en una forma adecuada para uso dentro de sistemas de producción y proteínas sometidos a ingeniería genética. De esta manera, un polinucleótido sustancialmente puro contiene un máximo de 10%, preferiblemente un máximo de 8%, de manera más preferible un máximo de 6%, de manera más preferible un máximo de 5%, de manera más preferible un máximo de 4%, de manera más preferible un máximo de 3%, incluso de manera más preferible un máximo de 2%, de manera más preferible un máximo de 1% e incluso de manera más preferible un máximo de 0.5% en peso del otro material polinucleotidico con el cual se asocia de manera natural. No obstante, un polinucleótido sustancialmente puro puede incluir regiones 5' y 3' no traducidas como se encuentran en la naturaleza tales como promotores y terminadores. Se prefiere que el polinucleótido sustancialmente puro sea por lo menos 90%, preferiblemente por lo menos 92%, de manera más preferible por lo menos 94% puro, de manera más preferible por lo menos 95% puro, de manera más preferible por lo menos 96% puro, de manera más preferible por lo menos 97% puro, incluso de manera más preferible por lo menos 98% puro, de manera más preferible por lo menos 99% puro e incluso de manera más preferible por lo menos 99.5% puro en peso. Los polinucleótidos de la presente invención preferiblemente están en una forma sustancialmente pura. En particular, se prefiere que los polinucleótidos descritos en la presente estén en "forma esencialmente pura" es decir, que la preparación polinucleotídica esté esencialmente libre de otro material polinucleotídico con el cual se relaciona de manera natural. En la presente, el término "polinucleótido sustancialmente puro" es sinónimo con el término "polinucleótido aislado" y "polinucleótido en forma aislada". Los polinucleótidos pueden ser de origen genómico, de ADNc, ARN, semisintéticos, sintéticos o cualquier combinación de los mismos. ADNc: El término "ADNc" se define en la presente como una molécula de ADN la cual se puede preparar por transcripción inversa a partir de una molécula de ARNm madura, empalmada que se obtiene de una célula eucariótica. El ADNc carece de secuencias de intrón que habitualmente están presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcrito inicial primario de ARN es un precursor para ARNm el cual es procesado a través de una serie de etapas antes de aparecer como ARNm empalmado maduro. Estas etapas incluyen la separación de las secuencias de intrón por un procedimiento denominado empalme. El ADNc derivado de ARNm por lo tanto carece de secuencias de intrón. Construcción de ácido nucleico: El término "construcción de ácido nucleico" como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea de cadena sencilla o doble, la cual se aisla de un gen como se encuentra en la naturaleza o el cual se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de un modo tal que, de otra manera, no existirían en la naturaleza. El término construcción de ácido nucleico es sinónimo con el término "cásete de expresión" cuando la construcción de ácido nucleico contiene las secuencias de control necesarias para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención. Secuencia de control: El término "secuencias de control" se definen en la presente para incluir todos los componentes los cuales son necesarios o ventajosos para la expresión de un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o extraña a la secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido. Tales secuencias de control incluyen, pero no se limitan a: un lider, una secuencia de poliadenilación, una secuencia propéptido, un promotor, una secuencia de péptido señal y un terminador de transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de detención transcripcionales y traduccionales . Las secuencias de control se pueden proporcionar con enlazantes con el propósito de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la ligación de las secuencias de control con la región codificante de la secuencia nucleotidica que codifica para un polipéptido.

Unido operablemente: El término "unido operablemente" indica en la presente una configuración en la cual se coloca una secuencia control en una posición apropiada en relación a la secuencia codificante de la secuencia polinucleótidica de manera tal que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante de un polipéptido. Secuencia codificante: Cuando se utiliza en la presente, el término "secuencia codificante" significa una secuencia nucleotídica la cual especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto proteínico. Los límites de la secuencia codificante generalmente se determinan por un marco de lectura abierto, el cual habitualmente comienza con el codón de inicio ATG o codones de inicio alternativos tales como GTG y TTG. La secuencia codificante puede ser ADN, ADNc o secuencias nucleotídicas recombinantes . Expresión: El término "expresión" incluye cualquier etapa involucrada en la producción del polipéptido que incluye, pero que no se limita a transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación post-traduccional y secreción. Vector de expresión: El término "vector de expresión" se define en la presente como una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la invención y el cual está unido operablemente a nucleótidos adicionales que se proporcionan para su expresión. Célula hospedadora: El término "célula hospedadora" como se utiliza en la presente, incluye cualquier tipo de célula la cual sea susceptible de transformación, transfección, tranducción y similar con una construcción de ácido nucleico que comprende un polinucleótido de la presente invención . Modificación: El término "modificación" significa en la presente cualquier modificación química del polipéptido que consiste de los aminoácidos 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o los aminoácidos 1 a 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37; o los aminoácidos 1 a 675 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5, o aminoácidos 1 a 565 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40; o aminoácidos 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 a 548 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 a 523 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43, respectivamente, asi como la manipulación genética del ADN que codifica para los polipéptidos. Una o varias de las modificaciones pueden ser una o varias sustituciones, una o varias supresiones y/o una o varias inserciones de uno o varios aminoácidos así como una a varias sustituciones de una o varias cadenas laterales de aminoácidos . Variante artificial: Cuando se utiliza en la presente, el término "variante artificial" significa un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa producido por un organismo que expresa una secuencia nucleotidica modificada de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1 ó 3 (ADNc) con las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 36 ó 38 (ADNc), o las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 4 ó 6 (ADNc) o las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 39 o 41 (ADNc) o las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 23 ó 25 (ADNc) o 42 (ADNc) . La secuencia nucleotidica modificada se obtiene a través de intervención humana por modificación de la secuencia nucleotídica descrita en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 ó 3, o la SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 36 ó 38; o las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 4 ó 6, o las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 39 ó 41; o las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 23 ó 25 ó 42, respectivamente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA FIGURA La figura 1 muestra la actividad de desramificación hacia pululano de glucoamilasa de Trametes cingula ta en comparación con glucoamilasas de Athelia rolfsii , Aspergill us niger y Talaromyces emersonii .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa En un primer aspecto, la presente invención se relaciona con polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos la cual tiene un grado de identidad a aminoácidos 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o los aminoácidos 1-561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37; o los aminoácidos 1 a 575 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 o los aminoácidos 1-565 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40; o los aminoácidos 1-556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26 o los aminoácidos 1-548 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24 o los aminoácidos 1-523 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43 (es decir, el polipéptido maduro) , respectivamente. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos tiene actividad de glucoamilasa y es por lo menos 75%, preferiblemente por lo menos 80%, de manera más preferible por lo menos 85%, incluso de manera más preferible por lo menos 90%, de manera más preferible por lo menos 95%, de manera más preferida por lo menos 96%, incluso de manera más preferida por lo menos 97%, incluso de manera más preferida por lo menos 98%, incluso de manera más preferible por lo menos 99% idéntica a la parte madura de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37 (a continuación: "polipéptidos homólogos"). En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos tiene actividad de glucoamilasa y tiene por lo menos 70%, de manera más preferible por lo menos 75%, de manera más preferible por lo menos 80%, de manera más preferible por lo menos 85%, incluso de manera más preferible por lo menos 90%, de manera más preferible por lo menos 95%, de manera más preferida por lo menos 96%, incluso de manera más preferida por lo menos 97%, incluso de manera más preferida por lo menos 98%, incluso de manera más preferible por lo menos 99% de idéntica a la parte madura de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40 (a continuación: "polipéptidos homólogos"). En una modalidad, la secuencia de aminoácidos tiene actividad de glucoamilasa y es por lo menos 60%, por lo menos 55%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, preferiblemente por lo menos 80%, de manera más preferible por lo menos 85%, incluso de manera más preferible por lo menos 90%, de manera más preferible por lo menos 95%, de manera más preferida por lo menos 96%, incluso de manera más preferida por lo menos 97% e incluso de manera más preferida por lo menos 98%, incluso de maneras más preferible por lo menos 99% idéntica a la parte madura de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26, 24 o 43, respectivamente (a continuación: "polipéptidos homólogos" ) .

En un aspecto preferido, los polipéptidos homólogos tienen una secuencia de aminoácidos la cual difiere por diez aminoácidos, preferiblemente por cinco aminoácidos, de manera más preferible por cuatro aminoácidos, incluso de manera más preferible por tres aminoácidos, de manera más preferible por dos aminoácidos e incluso de manera más preferible por un aminoácido de los aminoácidos 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, o los aminoácidos 1 a 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37; o los aminoácidos 1 a 575 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5, o los aminoácidos 1 a 565 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40; o los aminoácidos 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26 o los aminoácidos 1 a 548 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24 o los aminoácidos 1 a 523 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43, respectivamente . Un polipéptido de la presente invención preferiblemente comprende las secuencias maduras de aminoácidos de las SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 ó 37, o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 ó 40; o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26, 24 ó 43, respectivamente, o variantes alélicas de las mismas, o fragmentos de las mismas que tengan actividad de glucoamilasa, por ejemplo el dominio catalítico.

Dominio Catalítico En un aspecto, la invención se relaciona con polipéptidos que comprenden la región/dominio catalítico de las secuencias de aminoácidos de las SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 ó 37; o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 ó 40 o SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26, 24 ó 43, respectivamente. La región/dominio catalítico de la glucoamilasa de Trametes cingula ta se localiza de los aminoácidos 1 a 455 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o de los aminoácidos 1 a 460 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37. En una modalidad, la región se puede considerar que incluye la región enlazante de los aminoácidos 456 a 465 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o los aminoácidos 461 a 470 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37, respectivamente, o partes de la misma. El dominio de unión está encerrado por los polinucleótidos 1423 a 1725 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3 o los polinucleótidos 1774 a 2163 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 36 o los polinucleótidos 1465 a 1737 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 38, respectivamente. La región/dominio catalítico de la glucoamilasa de Pa chykytospora papyra cea se localiza de los aminoácidos 1 a 475 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 o de los aminoácidos 1 a 465 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40. En una modalidad, la región se puede considerar que incluye la región enlazante de los aminoácidos 476 a 484 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 o los aminoácidos 466 a 474 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40, respectivamente, o partes de la misma. El dominio de unión es codificado por los polinucleótidos 1420 a 1725 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6 o los polinucleótidos 1763 a 2182 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 39 o los polinucleótidos 1477 a 1749 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 41, respectivamente. La región/dominio catalítico de la glucoamilasa de Leucopaxillus gigan teus se localiza de los aminoácidos 1 a 451 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26 o de los aminoácidos 1 a 455 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24 o los aminoácidos 1-418 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43, respectivamente. En una modalidad, la región se puede considerar que incluye la región enlazante de los aminoácidos 452 a 461 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26 o los aminoácidos 456 a 466 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24 o los aminoácidos 419 a 429 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43, respectivamente, o partes de la misma. El dominio de unión (CBM) está codificado por los polinucleótidos 1438 a 1719 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 25 o los polinucleótidos 1854 a 2249 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23 o los polinucleótidos 1339 a 1620 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 42, respectivamente. En una modalidad preferida, la invención se relaciona con una región catalítica la cual tiene por lo menos 60% de identidad, de manera preferible por lo menos 65% de identidad, de manera más preferible por lo menos 70% de identidad, de manera más preferible por lo menos 75% de identidad, de manera más preferible por lo menos 80% de identidad, de manera más preferible por lo menos 85% de identidad, incluso de manera más preferible por lo menos 90% de identidad, de manera más preferible por lo menos 95% de identidad, de manera más preferida por lo menos 96% de identidad, incluso de manera más preferida por lo menos 97% de identidad, incluso de manera más preferida por lo menos 98% de identidad, incluso de manera más preferible por lo menos 99% de identidad, especialmente, 100% de identidad con los aminoácidos 1 a 455 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o los aminoácidos 1 a 460 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37 ( Trametes) ; o los aminoácidos 1 a 475 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 o los aminoácidos 1 a 465 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40 ( Pachykytospora ) ; o los aminoácidos 1 a 451 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26 o los aminoácidos 1 a 455 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24 o los aminoácidos 1 a 418 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43 ( Leucopaxill us) , respectivamente, y los cuales tienen actividad de glucoamilasa (a continuación "polipéptidos homólogos"). En un aspecto preferido, las regiones catalíticas homologas tienen secuencias de aminoácidos las cuales difieren por diez aminoácidos, preferiblemente por cinco aminoácidos, de manera más preferible por cuatro aminoácidos, incluso de manera más preferible por tres aminoácidos, de manera más preferible por dos aminoácidos, incluso de manera más preferible por un aminoácido de los aminoácidos 1 a 455 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o los aminoácidos 1 a 460 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37 ( Trametes cingula ta ) ; o los aminoácidos 1 a 475 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 o los aminoácidos 1 a 465 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40 ( Pa chykytospora ) o aminoácidos 1 a 451 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26 o los aminoácidos 1 a 455 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2424 o los amino'cidos 1 a 418 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43 ( Leucopaxillus gigan teus) , respectivamente.

Dominio de Unión En otro aspecto, la invención se relaciona con polipéptidos que tienen afinidad de unión por carbohidratos, preferiblemente afinidad de unión por almidón. El dominio de unión en la glucoamilasa de Trametes se localiza de los aminoácidos 466 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 y está codificada por los polinucleótidos 1420 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3 o se localiza desde el aminoácido 471 al 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37 y es codificado por polinucleótidos 1465 a 1737 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 38. El dominio de unión en la glucoamilasa de Pa chykytospora se localiza del aminoácido, aminoácido 485 a 575 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 ( Pa chykytospora ) y está codificada por los polinucleótidos 1423 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6 o se localiza desde el aminoácido 475 al 565 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40 y es codificado por polinucleótidos 1477 a 1749 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 41. El dominio de unión en la glucoamilasa de Leucopaxillus se localiza de los aminoácidos 463 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26 o de los aminoácidos 467 a 548 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24 o de los aminoácidos 430 a 523 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43, respectivamente y está codificado por los polinucleótidos 1854 a 2249 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23 o los polinucleótidos 1438 a 1719 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 25 o los polinucleótidos 1339 a 1620 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 42, respectivamente . En consecuencia, en este aspecto, la invención se relaciona con un polipéptido que tiene afinidad de unión de carbohidrato, que se selecciona del grupo que consiste de: (a) i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene por lo menos 60% de identidad con los aminoácidos 466 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o los aminoácidos 471 a 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37, respectivamente, o ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene por lo menos 60% de identidad con los aminoácidos 485 a 575 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 o los aminoácidos 475 a 565 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40, respectivamente, o iii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene por lo menos 60% de identidad con los aminoácidos 463 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26 o los aminoácidos 467 a 568 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24 o los aminoácidos 430 a 523 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43, respectivamente; (b) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotídica la cual hibridiza bajo condiciones de baja rigurosidad con una sonda polinucleotidica que se selecciona del grupo que consiste de: (i) la cadena complementaria de los nucleótidos 1420 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3 o los nucleótidos 1465 a 1737 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 38, respectivamente; (ii) la cadena complementaria de los nucleótidos 1423 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6 o los nucleótidos 1477 a 1749 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 41, respectivamente; (iii) la cadena complementaria de los nucleótidos 1438 a 1719 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 25 o los nucleótidos 1854 a 2249 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23 o los nucleótidos 1339 a 1620 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 42, respectivamente; (c) un fragmento de (a) o (b) que tiene una afinidad de unión de carbohidratos. En una modalidad preferida, la afinidad de unión de carbohidratos es afinidad de unión a almidón. En una modalidad preferida, la invención se relaciona con un polipéptido que tiene afinidad de unión de carbohidratos la cual tiene por lo menos 60% de identidad, preferiblemente por lo menos 70% de identidad, de manera más preferible por lo menos 75% de identidad, de manera más preferible por lo menos 80% de identidad, de manera más preferible por lo menos 85% de identidad, incluso de manera más preferible por lo menos 90% de identidad, de manera más preferible por lo menos 95% de identidad, de manera más preferida por lo menos 96% de identidad, incluso de manera más preferida por lo menos 97% de identidad, incluso de manera más preferida por lo menos 98% de identidad, incluso de manera más preferible por lo menos 99% de identidad, especialmente, 100% de identidad con los aminoácidos 466 a 556 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o los aminoácidos 471 a 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37, respectivamente ( Trametes) ; o los aminoácidos 485 a 575 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 o los aminoácidos 475 a 565 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40, respectivamente ( Pachykytospora ) ; o los aminoácidos 463 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26 o los aminoácidos 467 a 548 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24 o los aminoácidos 430 a 423 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43, respectivamente ( Leucopaxillus) , respectivamente. En un aspecto preferido, los dominios de unión homólogos tienen secuencia de aminoácidos los cuales difieren por diez aminoácidos, preferiblemente por cinco aminoácidos, de manera más preferible por cuatro aminoácidos, incluso de manera más preferible por tres aminoácidos, de manera más preferible por dos aminoácidos, incluso de manera más preferible por un aminoácido de los aminoácidos 466 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, o los aminoácidos 471 a 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37, respectivamente ( Trametes cingula ta ) ; o los aminoácidos 485 a 575 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5, o los aminoácidos 475 a 565 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40, respectivamente ( Pachykytospora ) ; o los aminoácidos 463 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26 o los aminoácidos 467 a 548 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24 o los aminoácidos 430 a 523 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43, respectivamente ( Leucopaxillus) , respectivamente. En otra modalidad, la invención se relaciona con un polipéptido que tiene afinidad de unión por carbohidrato, que se selecciona del grupo que consiste de: (a) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotídica la cual hibridiza bajo condiciones de baja rigurosidad, preferiblemente bajo condiciones de rigurosidad media, de manera más preferible bajo condiciones de rigurosidad alta con una sonda polinucleotídica que se selecciona del grupo que consiste de: (i) la cadena complementaria de nucleótidos 1420 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3 o los nucleótidos 1465 a 1737 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 38, respectivamente; (ii) la cadena complementaria de nucleótidos 1423 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6 o los nucleótidos 1477 a 1749 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 41, respectivamente; (iii) la cadena complementaria de nucleótidos 1438 a 1719 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 25 o los nucleótidos 1854 a 2249 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23 o los nucleótidos 1339 a 1620 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 42, respectivamente; (b) un fragmento del inciso (a) que tiene afinidad de unión por carbohidrato. La invención también se relaciona con un polipéptido que tiene afinidad de unión por carbohidrato en donde el polipéptido es una variante artificial la cual comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos una sustitución, supresión y/o inserción de un aminoácido en comparación con los aminoácidos 466 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o los aminoácidos 471 a 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37 ( Trametes) ; o los aminoácidos 485 a 575 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 o los aminoácidos 475 a 565 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40 ( Pa chykytospora ) ; o los aminoácidos 463 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26 o los aminoácidos 467 a 548 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24 o los aminoácidos 430 a 523 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43 ( Leucopaxill us) , respectivamente. La invención también se relaciona con un polipéptido que tiene afinidad de unión por carbohidratos, en donde el polipéptido es una variante artificial la cual comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos una sustitución, supresión y/o inserción de un aminoácido en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada por el dominio de unión de carbohidrato que codifica parte de las secuencias polinucleotídicas que se muestran en la posición 1420 a 1725 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3, o la posición 1465 a 1737 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 38; o la posición 1423 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6 o la posición 1477 a 1749 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 41; o la posición 1438 a 1719 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 25 o la posición 1854 a 2249 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23 o los nucleótidos 1339 a 1620 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 42, respectivamente.

Híbridos Las glucoamilasas o regiones catalíticas de la invención se pueden enlazar, via una secuencia enlazante o directamente, a uno o más dominios de unión extraños (también denominados como módulos de unión (CBM) ) . Un dominio de unión "extraño" es un dominio de unión que no se deriva de las glucoamilasas naturales de la invención en cuestión. El dominio de unión preferiblemente es un dominio de unión de carbohidrato (es decir, tiene afinidad a unión por un carbohidrato) , especialmente un dominio de unión a almidón o un dominio de unión a celulosa. Los dominios de unión preferidos son de origen micótico o bacteriano. Los ejemplos de dominios de unión de almidón contemplados de manera específicamente se describen en el documento WO 2005/003311 el cual se incorpora en la presente como referencia. En una modalidad preferida, el enlazante en una glucoamilasa de la invención está sustituido con un enlazante más estable, es decir, un enlazante que es más difícil de cortar que el enlazante de origen. Esto se hace para evitar que el dominio de unión sea eliminado por separación. Específicamente, se contemplan enlazantes estables que incluyen al enlazante de Aspergill us kawa chii : TTTTTTAAAT STSKATTSSSSSSAAATTSSS (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 22) Así, en una modalidad preferida, la invención se relaciona con una glucoamilasa hibrida que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o 37, respectivamente, en donde el enlazante nativo se localiza de los aminoácidos 456 a 465 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o de los aminoácidos 461 a 470 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37, respectivamente, o una parte de los mismos, es sustituido con el enlazante de Aspergillus kawa chii en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 22.

Así, en otra modalidad preferida, la invención se relaciona con una glucoamilasa hibrida que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 o 40, respectivamente, en donde el enlazante nativo localizado de 476 a 484 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 o de los aminoácidos 466 a 474 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40, respectivamente, o una parte del mismo, se sustituye con el enlazante de Aspergíll us kawa chii que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 22. Asi, en otra modalidad preferida, la invención se relaciona con una glucoamilasa híbrida que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26 o 24, respectivamente, en donde el enlazante nativo localizado de 452 a 462 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26 o de los aminoácidos 456 a 466 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24, o de los aminoácidos 419 a 429 en la la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24, respectivamente, o parte del mismo, se sustituye con el enlazante de Aspergill us kawa chii que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 22. Por lo tanto, la invención también se relaciona con híbridos que consisten de una glucoamilasa de la invención o un dominio catalítico de la invención que tiene actividad de glucoamilasa fusionado con un enlazante estable (por ejemplo enlazante de Aspergill us kawa chii ) y uno o más dominios de unión a carbohidrato, por ejemplo un módulo de unión a carbohidrato (CBM) descrito en el documento WO 2005/003311 en la página 5, linea 30 a página 8, linea 12, incorporado en la presente como referencia.

Hibridación En otro aspecto, la presente invención se relaciona con polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa los cuales son codificados por polinucleótidos (i) los cuales hibridizan bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad, preferiblemente condiciones de rigurosidad media, de manera más preferible condiciones de rigurosidad media-alta, incluso de manera más preferible condiciones de rigurosidad alta y de manera mucho más preferible condiciones de rigurosidad muy alta con una secuencia nucleotídica con los nucleótidos 55 a 2166 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1 o los nucleótidos 55 a 2166 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 36, respectivamente (ADN genómico de Trametes) , o (ii) los cuales hibridizan bajo condiciones por lo menos de rigurosidad media, preferiblemente condiciones de rigurosidad media-alta, de manera más preferible condiciones de rigurosidad alta, de manera más preferible condiciones de rigurosidad muy alta con una secuencia nucleotidica con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 55 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3 o los nucleótidos 55 a 1737 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 38, respectivamente (ADNc de Trametes) o (iii) una subsecuencia de los incisos (i) o (ii), o (iv) una cadena complementaria para los incisos (i), (ii), o (iii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Labora tory Manual , 2d edición, Cold Spring Harbor, Nueva York) . Una subsecuencia de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1 ó 3 o las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 36 ó 38 ( Trametes) contiene por lo menos 100 nucleótidos contiguos o preferiblemente por lo menos 200 nucleótidos contiguos. Además, la subsecuencia puede codificar para un fragmento polipeptidico el cual tiene actividad de glucoamilasa. La invención también se relaciona con polipéptidos aislados que tienen actividad de glucoamilasa los cuales son codificados por polinucleótidos (i) los cuales hibridizan bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad, preferiblemente condiciones de rigurosidad media, de manera más preferible condiciones de rigurosidad media-alta, incluso de manera más preferible condiciones de rigurosidad alta y de manera mucho más preferible condiciones de rigurosidad muy alta con una secuencia nucleotidica con los nucleótidos 55 a 2189 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 4 o los nucleótidos 55 a 2182 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 39, respectivamente (ADN genómico de Pachykytospora ) o (ii) los cuales hibridizan bajo condiciones por lo menos de rigurosidad media, de manera preferible condiciones de rigurosidad media-alta, de manera más preferible condiciones de rigurosidad alta e incluso de manera más preferible condiciones de rigurosidad muy alta con una secuencia nucleotidica con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 55 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 6 o los nucleótidos 55 a 1749 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 41, respectivamente (ADNc de Pachykytospora ) o (iii) una subsecuencia de los incisos (i) o (ii), o (iv), una cadena complementaria de los incisos (i), (ii) , o (iii) . La invención también se relaciona con polipéptidos aislados que tienen actividad de glucoamilasa los cuales son codificados por polinucleótidos (i) los cuales hibridizan bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad, preferiblemente condiciones de rigurosidad media, de manera más preferible condiciones de rigurosidad media-alta, incluso de manera más preferible condiciones de rigurosidad alta y de manera mucho más preferible condiciones de muy alta rigurosidad con una secuencia nucleotídica con los nucleótidos 117 a 2249 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 23 (ADN genómico de Leucopaxill us) , o (ii) los cuales hibridizan bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad, preferiblemente de media, de manera más preferible condiciones de rigurosidad media-alta, de manera más preferible condiciones de rigurosidad alta e incluso de manera más preferible condiciones de rigurosidad muy alta con una secuencia nucleotidica con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 52 a 1719 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 25 o los nucleótidos 52 a 1620 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 42, (ADNc de Leucopaxillus) o (iii) una subsecuencia de los incisos (i) o (ii), o (iv) , una cadena complementaria de los incisos (i), (ii) , o (iii) . La secuencia nucleotídica de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1, 3, 36 ó 38, respectivamente, o una subsecuencia de la misma, o la secuencia nucleotídica de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 4, 6, 39 ó 41, respectivamente, o una subsecuencia de la misma, o la secuencia nucleotídica de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 23, 25 ó 42, respectivamente, o una subsecuencia de las mismas, asi como la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 2 ó 37, respectivamente, o un fragmento de las mismas, o la secuencia de aminoácidos de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 5 ó 40, respectivamente, o un fragmento de la misma, o la secuencia de aminoácidos de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 26, 24 ó 43, respectivamente, o un fragmento de la misma, se pueden utilizar para diseñar una sonda de ácido nucleico para identificar un ADN de clon que codifica para polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa de cepas de géneros o especies diferentes, de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. En particular, dichas sondas se pueden utilizar para hibridación de ADN genómico o ADNc del género o especies de interés, siguiendo procedimientos de transferencia Southern estándar con el fin de identificar y aislar el gen correspondiente en la presente. Tales sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia completa, pero deben de ser por lo menos 14, preferiblemente por lo menos 25, de manera más preferible por lo menos 35 y de manera mucho más preferible por lo menos 70 de nucleótidos de longitud. No obstante, se prefiere que la sonda de ácido nucleico sea de una longitud de por lo menos 100 nucleótidos. Por ejemplo, la sonda de ácido nucleico puede tener una longitud de por lo menos 200 nucleótidos, preferiblemente por lo menos 300 nucleótidos, de manera más preferible por lo menos 400 nucleótidos y de manera mucho más preferible por lo menos 500 nucleótidos. Se pueden utilizar sondas incluso más grandes, por ejemplo, sondas de ácido nucleico las cuales son de por lo menos 600 nucleótidos, por lo menos de manera preferible de por lo menos 700 nucleótidos, de manera más preferible de por lo menos 800 nucleótidos, o de manera mucho más preferible de por lo menos 900 nucleótidos de longitud. Se pueden utilizar sondas tanto de ADN como de ARN. Las sondas típicamente se marcan para detectar el gen correspondiente (por ejemplo con 32P, 3H, 35S, biotina o avidina) . Tales sondas están incluidas por la presente invención . Por lo tanto, un ADN genómico o una biblioteca de ADNc preparada a partir de dichos organismos adicionales se puede cribar en búsqueda de ADN que hibridice con las sondas descritas en lo anterior y el cual codifique para un polipéptido que tenga actividad de glucoamilasa. El ADN genómico u otro ADN de dichos organismos adicionales se pueden separar por agarosa o electroforesis en gel de poliacrilamida, u otras técnicas de separación. El ADN de las bibliotecas o el ADN separado se pueden transferir e inmovilizar sobre nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Con el fin de identificar un clon o ADN el cual es homólogo con las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1, 3, 36 ó 38, respectivamente, o una subsecuencia del mismo, o las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 4, 6, 39 ó 41, respectivamente, o una subsecuencia de la misma, o las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 23, 25 ó 42, respectivamente, o una subsecuencia de las mismas, el material portador se utiliza en una prueba de Southern blot. Para propósitos de la presente invención, la hibridación indica que las secuencias nucleotídicas hibridizan con las sondas marcadas de ácido nucleico que corresponden a la secuencia nucleotídica que se muestra en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1, 3, 36 ó 38, respectivamente o las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 4, 6, 39 ó 41, respectivamente, o las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 23, 25 ó 42, respectivamente, sus cadenas complementarias o subsecuencias de las mismas, bajo condiciones de rigurosidad baja o media a muy alta. Las moléculas a las cuales hibridizan las sondas de ácido nucleico bajo estas condiciones se pueden detectar utilizando películas de rayos X. En una modalidad preferida, la sonda de ácido nucleico es de los nucleótidos 55 a 2166 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1 o los nucleótidos 55 a 2166 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 36, o los nucleótidos 1 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3 o los nucleótidos 55 a 1737 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 38 (ADNc de Trametes) . En una modalidad preferida, la sonda de ácido nucleico es de los nucleótidos 55 a 2186 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 4 o los nucleótidos 55 a 2182 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 39 o los nucleótidos 1 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 6 o los nucleótidos 55 a 1749 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 41 (ADNc de Pachykytospora ) . En una modalidad preferida, la sonda de ácido nucleico es de los nucleótidos 117 a 2249 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 23 o los nucleótidos 52 a 1719 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 25 (ADNc de Leucopaxill us) o los nucleótidos 52 a 1620 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 42 (ADNc de Leucopaxill us) . En otro aspecto preferido, la sonda de ácido nucleico es una secuencia polinucleotídica la cual codifica para la región catalítica entre los aminoácidos 1 y 455 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2 o los aminoácidos 1 a 460 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 37 ( Trametes) o entre los aminoácidos 1 y 475 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 5 o los aminoácidos 1 a 465 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 40 ( Pa chykytospora ) o entre los aminoácidos 1 y 455 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 24 o los aminoácidos 1 a 451 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 26 o los aminoácidos 1 a 418 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 43 ( Leucopaxillus) . En otro aspecto, la invención se relaciona con sondas de ácido nucleico que codifica para el dominio de unión en los aminoácidos 466 a 456 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2 los aminoácidos 471 a 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 37, respectivamente, o los aminoácidos 485 a 575 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 5 o los aminoácidos 475 a 565 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 40, respectivamente, o los aminoácidos 463 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 26 o los aminoácidos 467 a 548 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 24 o los aminoácidos 430 a 523 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 43, respectivamente. En otro aspecto preferido, la sonda de ácido nucleico es el polipéptido maduro que codifica para la región de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1, 3, 36 ó 38, respectivamente ( Trametes) . En otra modalidad preferida, la sonda de ácido nucleico es la región codificante de polipéptido maduro de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 4, 6, 39 ó 41 ( Pa chykytospora ) . En otra modalidad preferida, la sonda de ácido nucleico es la región codificante del polipéptido maduro de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 23, 25 ó 42 ( Leucopaxill us) . En otro aspecto preferido, la sonda de ácido nucleico es la parte de las secuencias en los plásmidos pHUda595 y pHUda594, respectivamente, que codifican para los polipéptidos maduros de la invención. Los plásmidos pHUda595 y pHUda594 los cuales están contenidos en Escherichia coli de DSM 17106 y Escherichia coli de DSM 17105, respectivamente, codifican para polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa. Para sondas grandes de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, se definen condiciones de rigurosidad muy alta como prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, SDS 0.3%, 200 µg/ml de ADN de esperma de salmón cizallado y depuralizado y ya sea formamida 25% para rigurosidades bajas, formamida 35% para rigurosidades medias y media alta o formamida 50% para rigurosidades alta y muy alta, siguiendo los procedimientos de Southern blotting estándar durante 12 a 24 horas de manera óptima. Para sondas grandes con una longitud de por lo menos 100 nucleótidos, el material portador finalmente se lava tres veces, cada uno durante 15 minutos utilizando 2X SSC, SDS 0.2% preferiblemente por lo menos a 50°C (rigurosidad baja), de manera más preferible por lo menos a 55°C (rigurosidad media) , de manera más preferible por lo menos a 60°C (rigurosidad de media-alta), de manera incluso más preferible por lo menos a 65°C (rigurosidad alta) y de manera más preferible por lo menos a 70°C (rigurosidad muy alta) . Para sondas cortas las cuales tienen una longitud de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos, las condiciones de rigurosidad se definen como prehibridación, hibridación y lavado post-hibridación a aproximadamente 5°C hasta aproximadamente 10°C por debajo de la Tm calculado utilizando el cálculo de acuerdo con Bolton y McCarthy (1962, Proceedings of the Na tional Academy of Sciences USA 48:1390) en NaCl 0.9 M, Tris-HCl 0.09 M, pH 7.6, EDTA 6 mM, NP-40 0.5%, solución de Denhardt IX, pirofosfato de sodio 1 mM, fosfato monobásico de sodio 1 mM, ATP 0.1 mM y 0.2 mg de ARN de levadura por ml siguiendo procedimientos estándar Southern blotting. Para sondas cortas las cuales son de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, el material portador se lava una vez en 6X SCC más SDS 0.1% durante 15 minutos y dos veces cada uno durante 15 minutos utilizando 6X SSC a 5°C a 10°C por debajo de la Tm calculada. Bajo condiciones de hibridación que contienen sal, la Tm eficaz que controla el grado de identidad requerido entre la sonda y el ADN unido a filtro para hibridación exitosa. Se puede determinar la Tm eficaz utilizando la fórmula a continuación para determinar el grado de identidad requerido para que hibridicen dos ADN bajo diversas condiciones de rigurosidad. Tm eficaz = 81.5 + 16.6 (log M[Na+]) + 0.41 (%G+C) - 0.72 (% de formamida) (Véase www. ndsu . nodak. edu/instruct/mcclean/pisc731/dna/dna6. htm) El contenido de G+C de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1 o los nucleótidos 55 a 2166 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1 es 60.5%. El contenido de G+C de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3 (ADNc) o los nucleótidos 55 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3 es 62.3%. El contenido de G+C de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 4 o los nucleótidos 55 a 2189 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 4 es 60.7%. El contenido de G+C de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 6 (ADNc) o los nucleótidos 55 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 6 es 63.7%. Para rigurosidad media, la formamida es 35% y la concentración de Na+ para 5X SSPE es 0.75 M. Aplicando estos valores a la fórmula, la Tm eficaz es 79.0°C. Otra relación relevante es que un mal pareamiento de 1% de dos ADN disminuye la Tm en 1.4°C. Para determinar el grado de identidad requerido para que hibridicen dos ADN bajo condiciones de rigurosidad media a 42°C se utiliza la siguiente fórmula: % de homología = 100 - [ (Tm eficaz - temperatura de hibridación) /l.4] (Véase www. ndsu . nodak. edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6. htm) Aplicando estos valores de fórmula, el grado de identidad requerido que hibridicen dos ADN bajo condiciones de rigurosidad media a 42°C es -[(79.0 - 42)/1.4] = 51%.

Variantes En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con variantes artificiales que comprenden una sustitución, supresión y/o inserción conservadora de uno o más aminoácidos en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 2, 5, 24, 26, 37, 40 y 43, respectivamente, o el polipéptido maduro del mismo. Preferiblemente, los cambios de aminoácidos son de naturaleza menor, es decir, sustituciones o inserciones de aminoácidos que no afectan de manera significativa el plegado (naturalización) y/o la actividad de la proteina; supresiones pequeñas, típicamente de uno o a aproximadamente 30 aminoácidos; extensiones pequeñas de la parte amino o carboxilo terminal tal como un residuo metionina en la parte aminoterminal; un péptido enlazante pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos; o una extensión pequeña que facilita la purificación al cambiar la carga neta u otra función, tal como un tracto poli-histidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión. Los ejemplos de sustituciones conservadoras están dentro del grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina) , aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico) , aminoácidos polares (glutamina y asparagina) , aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina) . Las sustituciones de aminoácidos las cuales generalmente no alteran la actividad específica se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, In , The Proteins , Academic Press, Nueva York. Los intercambios que se presentan más comúnmente son Ala/Ser, Val/lie, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lie, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly. Además de los 20 aminoácidos convencionales, se pueden sustituir aminoácidos no convencionales (tales como 4-hidroxiprolina, 6-N-metillisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina y a-metilserina) por residuo aminoácidos de un polipéptido natural. Un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no son codificados por el código genético y aminoácidos no naturales pueden estar sustituidos por residuos aminoácidos. Los "aminoácidos no naturales" se han modificado después de la sintesis de proteína y/o tienen una estructura química en una o varias de sus cadenas laterales diferente de los aminoácidos convencionales. Los aminoácidos no naturales se pueden sintetizar químicamente y de manera preferible están disponibles comercialmente e incluyen ácido pipecólico, ácido tiazolidincarboxilico, deshidropolina, 3- y 4-metilprolina y 3, 3-dimetilprolina . De manera alternativa, los cambios de aminoácidos son de tal naturaleza que se alteran las propiedades fisicoquímicas de los polipéptidos. Por ejemplo, los cambios de aminoácido pueden mejorar la estabilidad térmica del polipéptido, alterar la especificidad del sustrato, cambiar el pH óptimo y similares. Los aminoácidos esenciales en los polipéptidos de origen se pueden identificar de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida a sitio o mutagénesis de exploración de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta última técnica, se introducen mutaciones de alanina única en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultante se prueban para determinar actividad biológica (es decir, actividad de glucoamilasa) para identificar los residuos aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Véase también. Hilton, et al . 1996, J. Biol . Chem . 271: 4699-4708. El sitio activo de las enzimas u otra interacción biológica también se puede determinar por análisis físico de la estructura, determinado por técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o marcado de fotoafinidad, junto con mutación del sitio de contacto putativo de los aminoácidos. Véase, por ejemplo Vos et al . , 1992, Science 255: 306-312; Smith et al . , 1992, J. Mol . Biol . , 224: 899-904; Wlodaver et al . , 1992, FEBS Lett . 309:59-64. Las identidades de los aminoácidos esenciales también se pueden inferir del análisis de identidades de polipéptidos que se relacionan con un polipéptido de acuerdo con la invención. Las sustituciones de aminoácidos simples o múltiples se pueden elaborar y probar utilizando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o aleatorios, seguido por un procedimiento de cribado pertinente tal como los descritos por Reidhaard-Olson y Sauer, 1988, Science 214: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que se pueden utilizar incluyen PCR susceptible a error, presentación de fago (por ejemplo Lowman et al . , 1991, Biochem . 30/10832-10837; Patente de E.U.A. No. 5,223,409; WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a región (Derbyshire et al . , 1986, Gene 46:145; Ner et al . 1988, DNA 7:127). Se pueden combinar métodos de mutagénesis/aleatorios con métodos de cribado automatizados de alto rendimiento para detectar la actividad de polipéptidos clonados y mutagenizados expresados por células hospedadoras. Las moléculas de ADN mutagenizado que codifican para polipéptidos activos se pueden recuperar de las células hospedadoras y se secuencias rápidamente utilizando métodos estándar en la técnica. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de residuos aminoácidos individuales en un polipéptido de interés y se pueden aplicar a polipéptidos de estructura desconocida. El número total de sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos de los aminoácidos en la posición 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2 o la posición 1 a 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 37 (glucoamilasa de Trametes) ; o en la posición 1 a 575 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 5 o la posición 1 a 565 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 40 (glucoamilasa de Pa chykytospora ) o la posición 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 26 o la posición 1 a 548 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 24 o la posición 1 a 523 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 43 (glucoamilasa de Leucopaxill us) , respectivamente es de 10, preferiblemente 9, de manera más preferible 8, de manera más preferible 7, de manera más preferible como máximo 6, de manera más preferible como máximo 5, de manera más preferible 4, incluso de manera más preferible 3, de manera más preferible 2 e incluso de manera más preferible 1.

Fuentes de Polipéptidos que Tienen Actividad de Glucoamilasa Se puede obtener un polipéptido de la presente invención a partir de microorganismos de cualquier género, para propósitos de la presente invención, el término "obtenido de", como se utiliza en la presente, en relación con una fuente dada, significará que el polipéptido codificado por una secuencia nucleotidica es producido por la fuente o por una cepa en la cual se ha insertado la secuencia nucleotidica de la fuente. En un aspecto preferido, el polipéptido obtenido de una fuente dada es secretado extracelularmente . En una modalidad preferida la glucoamilasa de la invención se deriva de la clase Basidiomycetes . En una modalidad más preferida, una glucoamilasa de la invención se deriva de una cepa del género Trametes, de manera más preferible de una cepa de la especie Trametes cingula ta o del clon depositado DSM 17106 o una cepa del género Pa chykytospora , de manera más preferible una cepa de la especie Pachykytospora papyracea , o el clon depositado DSM 17105, o una cepa del género Leucopaxill us , de manera más preferible una cepa de la especie Leucopaxillus gigan teus . Deberá entenderse que para las especies mencionadas antes, la invención abarca tanto los estados perfectos e imperfectos y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo anamórficos, sin importar el nombre de la especie mediante la cual son conocidos. Aquellos expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de los equivalentes apropiados . La cepa Trametes cingula ta se recolectó en Zimbabwe en el periodo de 1995 a 1997. La cepa de Pa chykytospora papyra cea se recolectó en Zimbabwe en el periodo de 1995 a 1997. La cepa Leucopaxillus giganteus se recolectó en Dinamarca en 2003. Además, dichos polipéptidos se pueden identificar y obtener de otras fuentes que incluyen micoorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo suelo, compostas, agua, etcétera), utilizando las sondas mencionadas antes. Las técnicas para aislar micoorganismos de los habitat naturales son bien conocidos en la técnica. El polinucleótido después se puede obtener al cribar de manera similar una biblioteca genómica o de ADNc u otro microorganismo. Una vez que se ha detectado con una o varias de las sondas una secuencia polinucleotidica que codifica para un polipéptido, se puede aislar o clonar el polipéptido utilizando técnicas que son bien conocidas por aquellos habitualmente expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al . , 1989, supra ) . Los polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos fusionados o polipéptidos de fusión susceptibles de separarse en los cuales se fusiona otro polipéptido en la parte N terminal o la parte C terminal del polipéptido o fragmento del mismo. Se produce un polipéptido fusionado al fusionar una secuencia nucleotídica (o una porción de la misma) que codifica para otro polipéptido con una secuencia nucleotidica (o una porción de la misma) de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son conocidas en el arte e incluyen ligar las secuencias codificantes que codifican para los polipéptidos de manera que estén en marco y que la expresión del polipéptido fusionado esté bajo el control de uno o varios promotores iguales y terminador. Polinucleótidos La presente invención también se relaciona con polinucleótidos aislados que tienen una secuencia nucleotídica la cual codifica para un polipéptido de la presente invención. En un aspecto preferido, la secuencia nucleotidica se establece en cualquiera de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1, 3, 4, 6, 23, 25, 36, 38, 39, 41 ó 42, respectivamente. En otro aspecto más preferido, la secuencia nucleotídica es la secuencia contenida en el plásmido pHuda595 o pHuda594 y está contenida en Escherichia coli de DSM 17106 y Escheri chia coli de DSM 17105, respectivamente. En otro aspecto preferido, la secuencia nucleotidica es la región codificante polipeptídica madura de cualquiera de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1, 3, 4, 6, 23, 25, 36, 38, 39, 41 ó 42, respectivamente. La presente invención también abarca secuencias nucleotídicas las cuales codifican para un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 2, 5, 24, 26, 37, 40 ó 43, respectivamente, o el polipéptido maduro de los mismos, el cual difiere de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1, 3, 4, 6, 23, 25, 36, 38, 39, 41 ó 42, respectivamente, en virtud de la degeneración del código genético. La presente invención también se relaciona con subsecuencias de cualquiera de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1, 3, 4, 6, 23, 25, 36, 38, 39, 41 ó 42, respectivamente, las cuales codifican para fragmentos de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 2, 5, 24, 26, 37, 39, 40 ó 43, respectivamente, que tienen actividad de glucoamilasa. La presente invención también se relaciona con polinucleótidos mutantes que comprenden por lo menos una mutación en el polipéptido maduro que codifica para la secuencia de cualquiera de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1, 3, 4, 6, 23, 25, 36, 38, 39, 41 ó 42, respectivamente en la cual la secuencia nucleotidica mutante que codifica para un polipéptido el cual consiste de los aminoácidos 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2, aminoácidos 1 a 575 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 5, aminoácidos 1 a 548 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 24, aminoácido 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 26, aminoácidos 1 a 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 37, aminoácidos 1 a 565 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 40 o los aminoácidos 1 a 523 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 43, respectivamente. Las técnicas utilizadas para aislar o clonar un polinucleótido que codifica para un polipéptido se conocen en el arte e incluyen el aislamiento de ADN genómica, preparación a partir de ADNc o una combinación de los mismos.

La clonación de los polinucleótidos de la presente invención a partir de dicho ADN genómico se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante la utilización de la reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) bien conocida o el cribado de anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados con características estructurales compartidas. Véase, por ejemplo, Innis, et al . , 1990, PCR : a Guíde to Methods and Appli ca tion , Academic Press, Nueva York. Otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico tales como reacción en cadena de ligasa (LCR, por sus siglas en inglés), transcripción activada y ligada (LAT, por sus siglas en inglés) y amplificación basada en secuencia nucleotídica (NASBA, por sus siglas en inglés) se puede utilizar. Los polinucleótidos se pueden clonar de una cepa del género Trametes , Pa chykytospora , Leucopaxill us u otros organismos relacionados y por lo tanto, por ejemplo, puede ser una variante alélica o de especie de la región codificante para polipéptido de las secuencias nucleotidicas. La presente invención también se relaciona con polinucleótidos que tienen secuencias nucleotidicas las cuales tienen un grado de identidad con la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1 (es decir, nucleótidos 55 a 2166), o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3 (es decir, nucleótidos 55 a 1725), o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 4 (es decir, nucleótidos 55 a 2182), o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 6 (es decir, nucleótidos 55 a 1725) o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 25 (es decir, nucleótidos 52 a 1719) o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 38 (es decir, nucleótidos 55 a 1737) o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 41 (es decir, nucleótidos 55 a 1749) o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 42 (es decir, el nucleótido 55 a 1620) , respectivamente, de por lo menos 60%, de manera preferible por lo menos 65%, de manera más preferible por lo menos 70%, de manera más preferible por lo menos 75%, de manera más preferible por lo menos 80%, de manera más preferible por lo menos 85%, de manera más preferible por lo menos 90%, incluso de manera más preferible por lo menos 95%, incluso de manera más preferible 96%, incluso más 97%, incluso más 98% y de manera mucho más preferible por lo menos 99% de identidad, el cual codifica para un polipéptido activo. La modificación de una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para la síntesis de polipéptidos sustancialmente similares al polipéptido. El término "sustancialmente similar" al polipéptido se refiere a formas del polipéptido las cuales no se encuentran de manera natural. Estos polipéptidos pueden diferir en cierta manera sometida a ingeniería del polipéptido aislado de su fuente natural, por ejemplo variantes artificiales que difieren en actividad específica, termoestabilidad, pH óptimo o similar. La secuencia variante se puede construir en base en la secuencia nucleotidica presentada como la región codificante para el polipéptido maduro de cualquiera de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1, 3, 4, 6, 23, 25, 36, 38, 39, 41 ó 42, respectivamente, por ejemplo subsecuencias de las mismas y/o por introducción de sustituciones nucleotídicas, los cuales no dan lugar entre si a secuencias de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia nucleotídica, pero los cuales corresponden al uso de codón del organismo hospedador diseñado para producción de la enzima o por introducción de sustituciones nucleotídicas las cuales pueden generar una secuencia diferente de aminoácidos. Para una descripción general de la sustitución nucleotídica, véase, por ejemplo, Ford et al., 1991, Protein Expressíon and Purifica tion 2 : 95-107. Será evidente para aquellos expertos en la técnica que tales sustituciones se pueden realizar fuera de las regiones críticas para la función de la molécula y aún resultar en un polipéptido activo. Los residuos aminoácidos esenciales para la actividad del polipéptido codificado por un polinucleótido aislado de la invención y por lo tanto de manera preferible no sujeto a sustitución se pueden identificar de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida a sitio o mutagénesis de exploración de alanina (véase, por ejemplo, Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta última técnica se introducen mutaciones y cada residuo cargado positivamente en la molécula y las moléculas mutantes resultantes se prueban para actividad de glucoamilasa para identificar residuos aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Los sitios de interacción sustrato-enzima también se pueden determinar por análisis de la estructura tridimensional, determinado por dichas técnicas como análisis de resonancia magnética nuclear, cristalografía o marcado de fotoafinidad (véase, por ejemplo, de Vos et al . , 1992, Science 255: 306-312; Smith et al . , 1992, Journal Of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al . , 1992, FEBS Letters 309: 59-64) . La presente invención también se relaciona con polinucleótidos aislados que codifican para un polipéptido de la presente invención (i) el cual hibridiza bajo condiciones de baja rigurosidad, de manera más preferible condiciones de rigurosidad media, de manera más preferible condiciones de rigurosidad media-alta, incluso de manera más preferible condiciones de alta rigurosidad y de manera mucho más preferible condiciones de muy alta rigurosidad con los nucleótidos 55 a 2166 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1 o los nucleótidos 55 a 2166 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 36, respectivamente, o (ii) los cuales hibridizan bajo condiciones de rigurosidad media, de manera más preferible condiciones de rigurosidad media-alta, incluso de manera más preferible condiciones de alta rigurosidad y de manera mucho más preferible condiciones de rigurosidad muy alta con los nucleótidos de la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 55 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3 o los nucleótidos 55 a 1737 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 38, respectivamente, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii) ; o variantes alélicas y subsecuencias de los mismos (Sambrook et al , 1989, supra ) , como se define en la presente. La presente invención también se relaciona con polinucleótidos aislados que codifican para un polipéptido de la presente invención (i) el cual hibridiza bajo condiciones de baja rigurosidad, de manera más preferible condiciones de rigurosidad media, de manera más preferible condiciones de rigurosidad media-alta, incluso de manera más preferible condiciones de alta rigurosidad y de manera mucho más preferible condiciones de muy alta rigurosidad con los nucleótidos 55 a 2189 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 4 o los nucleótidos 55 a 2182 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 39, respectivamente, o (ii) los cuales hibridizan bajo condiciones de rigurosidad media, de manera más preferible condiciones de rigurosidad media-alta, incluso de manera más preferible condiciones de alta rigurosidad y de manera mucho más preferible condiciones de rigurosidad muy alta con los nucleótidos de la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 55 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 6 o los nucleótidos 55 a 1749 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 41, o (iii) una cadena complementaria de (i) o (ii); o variantes alélicas y subsecuencias de las mismas (Sambrook et al , 1989, supra ) , como se definen en la presente . La presente invención también se relaciona con polinucleótidos aislados que codifican para un polipéptido de la presente invención (i) el cual hibridiza bajo condiciones de baja rigurosidad, de manera más preferible condiciones de rigurosidad media, de manera más preferible condiciones de rigurosidad media-alta, incluso de manera más preferible condiciones de alta rigurosidad y de manera mucho más preferible condiciones de muy alta rigurosidad con los nucleótidos 117 a 2249 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 23 o (ii) los cuales hibridizan bajo condiciones de rigurosidad baja, de manera preferible condiciones de rigurosidad media, de manera más preferible condiciones de rigurosidad media-alta, incluso de manera más preferible condiciones de alta rigurosidad y de manera mucho más preferible condiciones de rigurosidad muy alta con los nucleótidos de la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 52 a 1719 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 25 o los nucleótidos 52 a 1620 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 42, respectivamente, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii); o variantes alélicas y subsecuencias de los mismos (Sambrook et al , 1989, supra ) , como se define en la presente. La presente invención también se relaciona con polinucleótidos aislados que se obtienen al: (a) hibridizar una población de ADN bajo condiciones de rigurosidad baja, media, media-alta, alta o muy alta con: (i) nucleótidos 55 a 2166 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1 o los nucleótidos 55 a 2166 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 36, respectivamente, o (ii) hibridizar una población de ADN bajo condiciones de rigurosidad media, media-alta, alta o muy alta con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 55 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3 o los nucleótidos 55 a 1737 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 38, respectivamente, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii) y (b) aislar el polinucleótido hibridizante el cual codifica para un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa. La presente invención también se relaciona con polinucleótidos aislados que se obtienen al: (a) hibridizar una población de ADN bajo condiciones de rigurosidad baja, media, media-alta, alta o muy alta con: (i) nucleótidos 55 a 2189 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 4 o los nucleótidos 55 a 2182 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 39, respectivamente, o (ii) hibridizar una población de ADN bajo condiciones de rigurosidad media, media-alta, alta o muy alta con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 55 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 6 o los nucleótidos 55 a 1749 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 41, respectivamente, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii); y (b) aislar el polinucleótido hibridizante el cual codifica para un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa. La presente invención también se relaciona con polinucleótidos aislados que se obtienen al: (a) hibridizar una población de ADN bajo condiciones de rigurosidad baja, media, media-alta, alta o muy alta con: (i) nucleótidos 117 a 2249 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 23 o (ii) hibridizar una población de ADN bajo condiciones de rigurosidad media, media-alta, alta o muy alta con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 52 a 1719 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 25 o los nucleótidos 52 a 1620 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 42, respectivamente, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii) ; y (b) aislar el polinucleótido hibridizante el cual codifica para un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa.

Construcciones de Acido Nucleico La presente invención también se relaciona con construcciones de ácido nucleico que comprende un polinucleótido aislado de la presente invención unido operablemente a una o más secuencias de control las cuales dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula hospedadora adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. Un polinucleótido aislado que codifica para un polipéptido de la presente invención puede ser manipulado de una diversidad de maneras para proporcionar la expresión del polipéptido. La manipulación de la secuencia del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria, dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar secuencias polinucleotidicas utilizando métodos de ADN recombinante son bien conocidas en el arte. La secuencia de control puede ser una secuencia promotora apropiada, una secuencia nucleotidica la cual es reconocida por una célula hospedadora para expresión de un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la presente invención. La secuencia promotor contiene secuencias de control transcripcionales las cuales median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia nucleotidica la cual muestra actividad transcripcional en la célula hospedadora de elección que incluyen promotores mutantes, truncados e híbridos y que se pueden obtener de genes que codifican para polipéptidos extracelulares o intracelulares ya sea homólogos o heterólogos a la célula hospedadora. Los ejemplos de promotores adecuados para detectar la transcripción de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedadora micótica filamentosa son promotores que se obtienen de los genes de la amilasa TAKA de Aspergill us oryzae, aspártico proteinasa de Rhizomucor miehei , a-amilasa neutra de Aspergill us Níger, a-amilasa estable en ácido de Aspergill us Níger, glucoamilasa ( glaA) de Aspergillus Niger o Aspergill us awamori , lipasa de Rhi zomucor miehei , proteasa alcalina de Aspergill us oryzae , triosafosfato isomerasa de Aspergill us oryzae, acetamidasa de de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Fusarium venena tum (WO 00/56900), Daria de Fusari um venena tum (WO 00/56900), Quinn de Fusari um venena tum (WO 00/56900), proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), ß-glucosidasa de Tri choderma reesei , cellobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Tri choderma reesei , endoglucanasa III de Tri choderma reesei , endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei , xilanasa I de Trichoderma reesei , xilanasa II de Tri choderma reesei , ß-xilosidasa de Trichoderma reesei , así como el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes para la a-amilasa neutra de Aspergill us Níger y la triosa fosfato isomerasa de Aspergill us oryzae) ; y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos. En una célula hospedadora, los promotores útiles se obtienen a partir de los genes para enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactocinasa (GAL1) de Sa ccharomyces cerevisiae, alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADHl, ADH2/GAP) de Sa ccharomyces cerevisiae, triosa fosfato isomerasa (TPI) de Sa ccharomyces cerevisiae, metalotionina (CUP1) de Sa ccharomyces cerevisiae y 3-fosfogliceratocinasa de Sa ccharomyces cerevisiae . Otros promotores útiles de células hospedadoras de levadura se describen en Romanos et al . , 1992, Yeast 8: 423-488. La secuencia control también puede ser una secuencia terminadora de transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula hospedadora para finalizar la transcripción. La secuencia terminadora se une operablemente a la parte 3' terminal de la secuencia nucleotidica que codifica para el polipéptido. Se puede utilizar en la presente invención cualquier terminador el cual sea funcional en la célula hospedadora de elección. Los terminadores preferidos para células hospedadoras micóticas filamentosas se obtienen de los genes para amilasa TAKA de Aspergill us oryzae, glucoamilasa de Aspergillus níger, antranilatosintasa de Aspergill us nidulans, a-glucosidasa de Aspergill us Niger y proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum . Los terminadores preferidos para células hospedadoras de levadura se obtienen a partir de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae , citocromo C (CYC1) de Sa ccharomyces cerevisiae, y gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae . Otros terminadores útiles para células hospedadoras de levadura se describen por Romanos et al . , 1992, supra . La secuencia de control también puede ser una secuencia lider adecuada, una región no traducida de un ARNm el cual es importante para la traducción por la célula hospedadora. La secuencia líder se une operablemente a la parte 5' terminal de la secuencia nucleotidica que codifica para el polipéptido. Se puede utilizar en la presente invención cualquier secuencia lider que sea funcional en la célula hospedadora de elección. Los líderes preferidos para células hospedadoras micóticas filamentosas se obtienen de los genes para amilasa TAKA de Aspergillus oryzae y triosafosfatoisomerasa de Aspergillus nidulans . Los líderes adecuados para células hospedadoras de levadura se obtienen de los genes para enolasa (ENO-1) , de Sa ccharomyces cerevisiae, 3-fosfogliceratocinasa de Sacc aro-T¡yces cerevisiae, factor a de Sa ccharomyces cerevisiae , y alcohol deshidrogenasa-gliceraldehído-3-fosfatodeshidrogenasa (ADH2/GAP) de Sa ccharomyces cerevisiae . La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia unida operablemente a la parte 3' de la secuencia nucleotidica y la cual, cuando se transcribe, es reconocida por la célula hospedadora como una señal para agregar residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Se puede utilizar en la presente invención cualquier secuencia de poliadenilación la cual sea funcional en la célula hospedadora de elección. Las secuencias preferidas de poliadenilación para células hospedadoras micóticas filamentosas se obtienen de los genes para amilasa TAKA de Aspergill us oryzae, glucoamilasa de Aspergill us niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans , proteasa similar a tripsina de Fusari um oxysporum y a-glucosidasa de Aspergillus niger. Las secuencias útiles de poliadenilación para células hospedadoras de levadura se describen por Guo y Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990. La secuencia de control también puede ser una región codificante del péptido señal que codifica para una secuencia de aminoácidos unida a la parte aminoterminal de un polipéptido y dirige el polipéptido codificado a la via secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante de la secuencia nucleotidica puede contener de manera inherente una región codificante de péptido señal unida naturalmente en el marco de lectura de traducción con el segmento de la región codificante la cual codifica para el polipéptido secretado. De manera alternativa, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región codificante de péptido señal la cual es extraña para la secuencia codificante. La región codificante de péptido señal extraña se puede requerir cuando la secuencia codificante no contiene de manera natural una región codificante de péptido señal. De manera alternativa, la región codificante de péptido señal simplemente puede sustituir a la región codificante de péptido señal con el fin de incrementar la secreción del polipéptido. No obstante, se puede utilizar en la presente invención cualquier región codificante de péptido señal la cual dirija el polipéptido expresado en la vía secretora de una célula hospedadora de elección. Las regiones codificantes de péptido señal eficaces para células hospedadoras micóticas filamentosas son las regiones codificantes de péptido señal que se obtienen de los genes para amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, amilasa neutra de Aspergill us niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei , celulasa de Humi cola insolens y lipasa de Humicola lanuginosa . Los péptidos señal útiles para células hospedadoras de levadura se obtienen de los genes para el factor a de Sa ccharomyces cerevisiae y la invertasa de Saccharomyces cerevisiae . Otras regiones codificantes de péptido señal útiles se describen por Romanos et al . , 1992, supra . La secuencia de control también puede ser una región codificante propeptidica que codifica para una secuencia de aminoácidos colocada en la parte aminoterminal de un polipéptido. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o propolipéptido (o en algunos casos como un zimógeno) . Un propolipéptido generalmente es inactivo y se puede convertir a un polipéptido activo maduro por separación catalítica o autocatalitica del propéptido del propolipéptido. La región codificante del propéptido se puede obtener por los genes de proteasa alcalina ( aprE) de Bacillus subtilis, proteasa neutra ( nprT) de Ba cillus subtilis, factor a de Saccharomyces cerevisiae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei , y lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836) . Cuando están presentes tanto la región de péptido señal como de propéptido en la parte aminoterminal de un polipéptido, la región de propéptido se coloca cercana a la parte aminoterminal de un polipéptido y la región de péptido señal se coloca cercana a la parte aminoterminal de la región propéptido. También puede ser deseable agregar secuencias reguladoras las cuales permiten la regulación de la expresión del polipéptido en relación al crecimiento de la célula hospedadora. Los ejemplos de sistemas reguladores son aquellos los cuales provocan la expresión del gen que va a activarse o inactivarse en respuesta a un estímulo químico o físico, e incluyen la presencia de un compuesto regulador. En levadura, se puede utilizar el sistema ADH2 o el sistema GALl. En hongos filamentosos, el promotor de a-amilasa TAKA, el promotor de glucoamilasa de Aspergill us niger y el promotor de glucoamilasa de Aspergill us oryzae se pueden utilizar como secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellos que permiten la amplificación del gen. En sistemas eucarióticos, estos incluyen al gen para dihidrofolatoreductasa el cual se amplifica en presencia de metotrexato y los genes de metalotioneina los cuales se amplifican con metales pesados. En estos casos, la secuencia nucleotidica que codifica para el polipéptido se puede unir operablemente con la secuencia reguladora .

Vectores de Expresión La presente invención también se relaciona con vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención, un promotor y señales de detención transcripcionales y tradiccionales . Las diversas secuencias de ácido nucleico y controles descritos en lo anterior se pueden unir juntas para producir un vector de expresión recombinante el cual puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia nucleotidica que codifica para el polipéptido en dichos sitios. De manera alternativa, una secuencia nucleotidica de la presente invención se puede expresar al insertar la secuencia nucleotidica de una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia en un vector apropiado para expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante se puede colocar en el vector de manera que la secuencia codificante esté unida operablemente con las secuencias de control apropiadas para expresión . El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo un plásmido o virus) el cual se puede someter convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y se puede llevar a cabo la expresión de la secuencia nucleotidica. La selección del vector típicamente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula hospedadora dentro de la cual se va a introducir el vector. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados.

El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector el cual existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar autorreplicación. De manera alternativa, el vector puede ser uno el cual, cuando se introduce en la célula hospedadora, se integra en el genoma y se replica junto con uno o varios de los cromosomas dentro del cual se ha integrado. Además se puede utilizar un vector único o un plásmido o dos o más vectores o plásmidos los cuales juntos contienen el ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula hospedadora o un transposón. Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen uno o más marcadores seleccionables los cuales permiten la selección fácil de las células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o viral, resistencia a metales pesados, prototrofía o auxótrofos, y similares. Los ejemplos de marcadores adecuados para células hospedadoras de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRPl y URA3. Los marcadores seleccionables para uso en células hospedadoras micóticas filamentosas incluyen, pero no se limitan a amdS (acetamida), argB (ornitina carbamoiltransferasa) , bar (fosfinotricina acetiltransferasa) , hph (higromicina fosfotransferasa) , niaD (nitrato reductasa), PyrG (orotidina-5' -fosfato descarboxilasa) , sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antralinato sintasa) así como equivalentes de los mismos. Se prefieren para uso en la célula Aspergillus los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergíll us oryzae y el gen Jar de Streptomyces hygroscopicus . Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen uno o varios elementos que permiten la integración del vector en el genoma de células hospedadoras o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma. Para integración en el genoma de la célula hospedadora, el vector se puede basar en la secuencia polinucleotidica que codifica para el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para integración en el genoma por recombinación homologa o no homologa. De manera alternativa, el vector puede contener secuencias nucleotídicas adicionales para dirigir la integración por recombinación homologa en el genoma de la célula hospedadora en uno o varios lugares precisos en uno o varios cromosomas. Para aumentar la probabilidad de integración en un lugar preciso, los elementos de integración preferiblemente deben contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10,000 pares de bases, de manera preferible 400 a 10,000 pares de bases y de manera mucho más preferible 800 a 10,000 pares de bases los cuales tienen un alto grado de identidad con la secuencia objetivo correspondiente para incrementar la probabilidad de recombinación homologa. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que es homologa con la secuencia objetivo en el genoma de la célula hospedadora. Además, los elementos de integración pueden ser secuencias nucleotídicas no codificantes o codificantes. Por otra parte, el vector se puede integrar en el genoma de la célula hospedadora por recombinación no homologa. Para replicación autónoma, el vector puede comprender adicionalmente un origen de replicación que permita al vector replicarse de manera autónoma en la célula hospedadora en cuestión. El origen de replicación puede ser un replicador plasmídico que medie la replicación autónoma el cual funciona en una célula. El término "origen de replicación" o "plásmido replicador" se define en la presente como una secuencia nucleotidica que permite que un plásmido o vector se replique in vivo . Los ejemplos de orígenes de replicación para uso en una célula hospedadora de levadura son los orígenes de replicación de 2 micrones ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3 y la combinación de ARS4 y CEN6. Los ejemplos de orígenes de replicación útiles en células micóticas filamentosas son AMAl y ANSÍ (Gems et al . , 1991 , Gene 98 : 61 - 67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175, WO 00/24883). El aislamiento del gen AMAl y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden al gen se pueden llevar a cabo de acuerdo con los métodos descritos en WO 00/24883. Se puede insertar en la célula hospedadora más de una copia de un polinucleótido de la presente invención para incrementar la producción del producto de gen. Se puede obtener un incremento en el número de copias del polinucleótido al integrar por lo menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedadora o al incluir un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido en donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable y por lo tanto copias adicionales del polinucleótido, se pueden seleccionar por cultivo de las células en presencia de un agente seleccionable apropiado. Los procedimientos utilizados para ligar los elementos descritos en lo anterior para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención con bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al . , 1989, supra ) .

Células Hospedadoras La presente invención también se relaciona con células hospedadoras recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención los cuales son utilizados ventajosamente en la producción recombinante de los polipéptidos. Un vector que comprende un polinucleótido de la presente invención se introduce dentro de una célula hospedadora de manera que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante, como se ha descrito en lo anterior. El término "célula hospedadora" abarca cualquier progenie de una célula de origen que no sea idéntica a la célula de origen debido a mutaciones que se producen durante la replicación. La selección de una célula hospedadora en gran medida dependerá del gen que codifica para el polipéptido y su fuente . La célula hospedadora puede ser una eucariota, tal como una célula de mamifero, de insecto, de planta o micótica . En un aspecto preferido, la célula hospedadora es una célula micótica. El término "hongos", como se utiliza en la presente incluye a el phyla Ascomycota , Basidiomycota , Chytridiomycota y Zygomycota (como se define por Hawksworth et al . , In , Ainsworth and Bisby' s Dictionary of The Fungi , 8td edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido) y como los Oomycota (como se menciona en Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawksworth et al, 1995, supra) . En un aspecto más preferido, la célula hospedadora micótica es una célula de levadura. El término "levadura", como se utiliza en la presente, incluye a las levaduras ascosporógenas (Endomy ceta les) , levaduras basidiosporógenas y levaduras que pertenecen a los hongos imperfectos (Blastomycetes) . Dado que la clasificación de levadura pueda cambiar en el futuro, para los propósitos de esta invención, la levadura se debe definir como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M. y Davenport, R.R., eds. Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980) . En un aspecto incluso más preferido, la célula hospedadora de levadura es una célula de Candida, Hansenula , Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia . En un aspecto más preferido, la célula hospedadora de levadura es una célula de Saccharomyces carisbergensis , Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus , Saccharomyces douglasii , Saccharomyces kluyveri , Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis . En otro aspecto más preferido, la célula hospedadora de levadura es una célula de Kluyveromyces lactis. En otro aspecto más preferido, la célula hospedadora de levadura es una célula de Yarrowia lipolyti ca . En otro aspecto más preferido, la célula hospedadora micótica es una célula micótica filamentosa. El término "hongos filamentosos" incluye todas las formas filamentosas de la subdivisión _-.u-t¡ycota y Oomycota (como se define por Hawksworth et al . , 1995, supra ) . Los hongos filamentosos generalmente están caracterizados por una pared micelial compuesta de quitina, celulosa, glucano, quitosana, mañano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por elongación de las hifal y catabolismo del carbono y son aerobicos obligados. En contraste, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Sa ccharomyces cerevisiae es por formación de yemas de un tallo unicelular y el catabolismo del carbono puede ser fermentativo. En un aspecto incluso más preferido, las células hospedadoras micóticas filamentosas son una célula de Acremoni um , Aspergill us , Aureobasidi um , Bjerkandera , Ceriporiopsis , Coprinus , Coriol us , Cryptococcus , Filobasidium , Fusari um , Humi cola , Magnaporthe, Mucor, Mycelioph tora , Neocallimastix, Neurospora , Paecilomyces , Peni cilli um , Phanerochaete , Phlebia , Piromyces , Pleurotus , Schi zophyllum , Talaromyces , Thermoascus , Thielavia , Tolypocladi um , Trametes o Tri choderma . En un aspecto más preferido, la célula hospedadora micótica filamentosa es una célula de Aspergill us awamori , Aspergillus fumiga tus , Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus , Aspergillus nidulans , Aspergillus Níger o Aspergill us oryzae . En otro aspecto más preferido la célula hospedadora micótica filamentosa es una célula de Fusari um bactridioides , Fusarium cerealis , Fusarium crookwellense , Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi , Fusarium oxysporum, Fusarium reticula tum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides , Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides o Fusarium venena tum . En otro aspecto más preferido, la célula hospedadora micótica filamentosa es una célula de Bj erkandera adusta , Ceriporiopsis aneirina , Ceriporipsis aneirina , Ceriporiopsis caregiea , Ceriporiopsis gilvescens , Ceriporiopsis pannocinta , Ceriporiopsis rivulosa , Ceriporiopsis subrufa o Ceriporiopsis subvermispora , Coprinus cinereus , Coriolus hirsutus , Humicola insolens , Humicola lanuginosa , Mucor miehei , Myceliophthora thermophila , Neurospora crassa , Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radia ta , Pleurotus eryngii , Thielavia terrestris , Trametes villosa , Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachia tum , Trichoderma reesei o Trichoderma viride . Las células micóticas se pueden transformar por un procedimiento que involucra formación de protoplastos, transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular de una manera conocida por sí misma. Los procedimientos adecuados para transformación de células hospedadoras de Aspergill us y Tri choderma se desriben en el documento EP 238 023 y Yelton et al . , 1984, Proceedings of the Na tional Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Los métodos adecuados para transformar especies de Fusarium se describen por Malardier et al . , 1989, Gene 78: 147-156 y WO 96/00787. La levadura se puede transformar utilizando los procedimientos descritos por Becker y Guarente en Abelson, J.N. y Simón, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology , Methods in Enzymology , Volumen 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al . , 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; y Hinnen et al . , 1978, Proceedings of the Na tional Academy of Sciences USA 75: 1920.

Métodos de Producción La presente invención también se relaciona con métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprende (a) cultivar una célula, la cual, en su forma natural, es capaz de producir el polipéptido, bajo condiciones que llevan a la producción del polipéptido y (b) recuperar el polipéptido. Preferiblemente, la célula es del género Trametes , Pa chykytospora o Leucopaxill us y de manera más preferible, Trametes cingula ta , Pa chykytospora papyracea o Leucopaxill us gigan teus . La presente invención también se relaciona con métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprende: (a) cultivar una célula hospedadora bajo condiciones que llevan a la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. La presente invención también se relaciona con métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprende: (a) cultivar una célula hospedadora bajo condiciones que llevan a la producción del polipéptido, en donde la célula hospedadora comprende una secuencia nucleotidica que tiene la región codificante del polipéptido maduro de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1, 3, 4, 6, 23, 25, 36, 38, 39, 41 ó 42, respectivamente, en donde la secuencia nucleotidica codifica para un polipéptido el cual consiste de los aminoácidos 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2 o los aminoácidos 1 a 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 37, respectivamente; o aminoácidos 1 a 575 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 5 o aminoácidos 1 a 565 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 40, respectivamente; o aminoácidos 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 26 o los aminoácidos 1 a 548 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 24 o los aminoácidos 1 a 523 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 43, respectivamente, y (b) recuperar el polipéptido. En los métodos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción del polipéptido utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar mediante cultivo en matraz de agitación y fermentación a pequeña escala o a gran escala (que incluye las fermentaciones continua, por lotes, de alimentación por lotes o el estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales que se realizan en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten que el polipéptido se exprese y/o aisle. El cultivo se lleva a cabo en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o se puede preparar de acuerdo con composiciones publicadas (por ejemplo en los catálogos de American Type Culture Collection) . Sí el polipéptido es secretado en el medio nutritivo, se puede recuperar el polipéptido directamente del medio. Si el polipéptido no es secretado, se puede recuperar de lisados celulares. Se pueden detectar los polipéptidos utilizando métodos conocidos en la técnica que son específicos para los polipéptidos. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, formación de un producto enzimático o desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, se puede utilizar un análisis enzimático para determinar la actividad del polipéptido, como se describe en la presente. El polipéptido resultante se puede recuperar utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido se puede recuperar del medio nutritivo por procedimientos convencionales que incluyen pero que no se limitan a centrifugación, filtración, extracción, secado por aspersión, evaporación o precipitación. Los polipéptidos de la presente invención se pueden purificar por una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen pero que no se limitan a cromatografía (por ejemplo de intercambio de iones, de afinidad, hidrofóbica, cromatoenfoque y de exclusión de tamaño), procedimientos electroforeticos (por ejemplo enfonque isoeléctrico preparativo) , solubilidad diferencial (por ejemplo precipitación con sulfato de amonio), SDS-PAGE o extracción (véase, por ejemplo Protein Purifica tion, J. -C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) .

Plantas La presente invención también se relaciona con una planta transgénica, parte de una planta o un a célula vegetal la cual ha sido transformada con una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa de la presente invención de manera que exprese y produzca el polipéptido en cantidades recuperables. El polipéptido se puede recuperar de la planta o de la parte de la planta. De manera alternativa, la planta o la parte de la planta que contiene al polipéptido recombinante se puede utilizar como tal para mejorar la calidad de un alimento o pienso, por ejemplo, mejorar el valor nutricional, el sabor agradable y las propiedades biológicas o destruir algún factor antinutritivo. La planta transgénica puede ser dicotiledónea (de dos cotiledones) o monocotiledonea (de un cotiledón). Los ejemplos de plantas monocotiledoneas son pastos tales como meadow grass (pasto azul, Poa) , pasto de forraje tal como Festuca, Lolium, pasto temperado tal como Agrostis y cereales, por ejemplo trigo, avena, cebada, centeno, arroz, sorgo y maiz. Los ejemplos plantas dicoltiledoneas son tabaco, leguminosas tales como lupins, papa, remolacha, chícharo, frijol y soya y plantas cruciferas (familia Brassicaceae) tal como coliflor, colza y el organismo de modelo relacionado estrechamente Arabidopsis thaliana . Los ejemplos de partes de plantas son tallo, callo, hoja, raiz, frutos, semillas y tubérculos asi como tejidos individuales que comprenden estas partes, por ejemplo epidermis, mesofilo, parenquima, tejidos vasculares y meristemos. Los compartimientos específicos de células vegetales tales como cloroplastos, apoplastos, mitocondria, vacuolas, peroxisomas y citoplasma también se consideran parte de la planta. Además, cualquier célula vegetal, cualquiera que sea su tejido de origen, se considera que es una parte de planta. De igual manera, las partes de planta tales como los tejidos específicos y células aisladas para facilitar la utilización de la invención también se consideran partes de planta, por ejemplo embriones, endospermas, aleurona y recubrimientos de semillas. También se incluyen dentro del alcance de la presente invención la descendencia de dichas plantas, partes de plantas y células vegetales. La planta o célula vegetal transgénica expresa un polipéptido de la presente invención se puede construir de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Brevemente, la planta o célula vegetal se construye al incorporar una o más construcciones de expresión que codifican para un polipéptido de la presente invención en el genoma hodpedador de la planta y se propaga la planta o célula vegetal modificada resultante en una planta o célula vegetal transgénica. La construcción de expresión convenientemente es una construcción de ácido nucleico la cual comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la presente invención unido operablemente con secuencias reguladoras apropiadas requeridas para la expresión de la secuencia nucleotidica en la planta o parte de la planta de elección. Además, la construcción de expresión puede comprender un marcador seleccionable útil para identificar células hospedadoras en las cuales la construcción de expresión se ha integrado y las secuencias de ADN necesarias para introducción de la construcción en la planta en cuestión (esto último depende del método de introducción de ADN que se utilice) . La selección de las secuencias reguladoras, tal como las secuencia promotora y terminadora, y opcionalmente las secuencias de señal o tránsito está determinado, por ejemplo, en base en determinar cuando, donde y como se desea que se exprese el polipéptido. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica para un polipéptido de la presente invención puede ser constitutivo o inducible, o puede ser especifico del desarrollo, de una etapa o de tejido y el producto de gen se puede dirigir a un tejido o una parte de la planta específicos tal como las semillas o las hojas. Las secuencias reguladoras se describen , por ejemplo, por Tague et al., Plan t Physiology 86:506. Para expresión constitutiva, se pueden utilizar los promotores 35S-CaMV, la ubiquitina 1 de maiz y el promotor de actina 1 de arroz (Franck et al . , 1980, Cell 21: 285-294, Christensen et al . , 1992, Plan t Mo . Biol . 18: 675-689; Zhang et al., Plan t Cell 3: 1155-1165). Los promotores específicos de órgano pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos de remojado de almacenamiento tales como semillas, papas, tubérculos y frutas (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann . Rev. Genet . 24: 275-303) o a partir de tejidos de humedecimiento metabólicos tales como meristemos (Ito et al., 1994, Plan t Mol . Bíol . 24: 863-878), un promotor específico de semillas tal como glutelina, prolamina, globulina o un promotor de albúmina de arroz (Wu et al., 1998, Plant and cell Physiology 39: 885-889), un promotor de Vi cia faba de la leguminosa B4 y el gen de proteina de semilla desconocida de Vi cia faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plan t Physiology 152: 708-711), un promotor de una proteína corporal oleosa de semilla (Chen et al., 1998, Plan t and Cell Physiology 39: 935-941), el promotor napA de proteina de almacenamiento de Brassica napus o cualquier otro promotor especifico de semilla conocido en la técnica, por ejemplo como se describe en el documento WO 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor especifico de hoja tal como el promotor rbcs de arroz o tomate (kyozuka et al., 1993, Plan t Physiology 102: 991-1000), el promotor del gen para adenina metiltransferasa del virus de clorella (Mitra and Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93) o el promotor del gen aldP de arroz (kagaya et al., 1995, Molecular and General Geneti cs 248: 668-674) o un promotor inducible por heridas tal como el promotor pin2 de papa (Xu et al., 1993, Plan t Molecular Biology 22: 573-588). De igual manera, el promotor puede ser inducible por tratamientos abióticos tales como temperatura, inundación o alteraciones en la salinidad o puede inducirse por sustancias aplicadas exógenamente que activen el promotor, por ejemplo etanol, oestrógenos, hormonas vegetales tales como etileno, ácido abscisico, ácido giberelico y metales pesados. Un elemento mejorador de promotor también se puede utilizar para obtener una mayor expresión de un polipéptido de la presente invención en la planta. Por ejemplo, el elemento mejorador promotor puede ser un intrón el cual se coloca entre el promotor y la secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, Xu et al., 1993, supra, describe el uso del primer entrón del gen para actina 1 de arroz para mejorar la expresión . El gen marcador seleccionable y cualquier otra parte de la construcción de expresión se pueden seleccionar de las disponibles en la técnica. La construcción de ácido nucleico se incorpora dentro del genoma de la planta de acuerdo con técnicas convencionales conocidas en el arte, que incluyen transformación mediada por Agrobacteri um, transformación mediada por virus, microinyección, bombardeo de partículas, transformación biolística y electroporación (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Na ture 338: 274). Actualmente, la transferencia del gen mediada por Agrobacteri um tumefaciens es el método de elección para generar dicotiledóneas transgénicas (para una revisión véase Hooykas y Schilperoort , 1992, Plan t Molecular Biology 19: 15-38) y también se pueden utilizar para transformar monocotiledonias, aunque para estas plantas se utilizan con frecuencia otros métodos de transformación. Actualmente, el método de elección para generar monocotiledonias transgénicas es bombardeo de partículas (partículas microscópicas de oro o tungsteno recubiertas con el ADN transformante) o callo embriónico o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plan t Journal 2 : 275-281; Shimamoto, 1994, Curren t Opinión Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo para transformación de monocotiledonias se basa en la transformación de protoplastos como se describe por Omirulleh et al., 1993, Plan t Molecular Biology 21: 415-428. Después de la transformación, los transformantes que tengan incorporadas las construcciones de expresión se seleccionan y regeneran en plantas completas de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Con frecuencia el procedimiento de transformación se diseña para la eliminación selectiva de los genes de selección ya sea durante la regeneración o en las siguientes generaciones mediante la utilización, pro ejemplo, de cotransformación con dos construcciones de T-ADN separadas o corte específico de sitio del gen de selección por una recombinasa especifica. La presente invención también se relaciona con métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprende: (a) cultivar una plantas transgénica o una célula vegetal que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa de la presente invención bajo condiciones que llevan a la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

Composiciones La presente invención también se relaciona con composiciones que comprenden un polipéptido de la presente invención. Preferiblemente, las composiciones se enriquecen con dicho polipéptido. El término "enriquecido" indica que se ha incrementado la actividad de glucoamilasa de la composición, por ejemplo en un factor de enriquecimiento de 1.1. La composición puede comprender un polipéptido de la presente invención como un componente enzimático principal, por ejemplo una composición de un solo componente. De manera alternativa, la composición puede comprender actividades enzimáticas múltiples tales como aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glucosiltransferasa, desoxirribunocleasa, esterasa, a-galactosidasa, ß-galactosidasa, glucoamilasa, a-glucosidasa, ß-glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, laccasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolítica, péptidoglutaminasa, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa. Se pueden producir una o más enzimas adicionales, por ejemplo, por un microorganismo que pertenezca al género Aspergillus, preferiblemente Aspergillus aculeatus , Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus , Aspergillus foetidus , Aspergillus japonicus , Aspergillus nidulans , Aspergillus niger, o Aspergillus oryzae; Fusarium, preferiblemente Fusarium bactridioides , Fusarium cerealis , Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi , Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides , o Fusarium venenatum; Humicola, preferiblemente Humicola insolens o Humicola lanuginosa ; o Tri choderma, preferiblemente Trichoderma harzianum , Tri choderma koningíi , Tri choderma longibra chia tum , Trichoderma reesei , o Trichoderma viride Las composiciones polipeptídicas se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de una composición liquida o seca. Por ejemplo, la composición polipeptidica puede estar en forma de un granulado o y un microgranulado . El polipéptido que se va a incluir en la composición se puede estabilizar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

Combinación de glucoamilasa y a-amilasa acida De acuerdo con este aspecto de la invención, una glucoamilasa de la invención se puede combinar con una a-amilasa acida en una proporción de entre 0.3 y 5.0 AFAU/AGU. De manera más preferible, la relación entre la actividad de a-amilasa acida y la actividad de glucoamilasa es de por lo menos 0.35, por lo menos 0.40, por lo menos 0.50, por lo menos 0.60, por lo menos 0.7, por lo menos 0.8, por lo menos 0.9, por lo menos 1.0, por lo menos 1.1, por lo menos 1.2, por lo menos 1.3, por lo menos 1.4, por lo menos 1.5, por lo menos 1.6, por lo menos 1.7, por lo menos 1.8, por lo menos 1.85 o incluso por lo menos 1.9 AFAU/AGU. No obstante, la relación entre la actividad de a-amilasa acida y la actividad de glucoamilasa preferiblemente debe ser menor de 4.5, menor de 4.0, menor de 3.5, menor de 3.0, menor de 2.5 o incluso menor de 2.25 AFAU/AGU. En AUU/AGI, las actividades de a-amilasa y glucoamilasa preferiblemente están presentes en una relación de entre 0.4 y 6.5 AUU/AGI. De manera más preferible, la relación entre la actividad de a-amilasa acida y la actividad de glucoamilasa es de por lo menos 0.45, por lo menos 0.50, por lo menos 0.60, por lo menos 0.7, por lo menos 0.8, por lo menos 0.9, por lo menos 1.0, por lo menos 1.1, por lo menos 1.2, por lo menos 1.3, por lo menos 1.4, por lo menos 1.5, por lo menos 1.6, por lo menos 1.7, por lo menos 1.8, por lo menos 1.9, por lo menos 2.0, por lo menos 2.1, por lo menos 2.2, por lo menos 2.3, por lo menos 2.4 o incluso por lo menos 2.5 AUU/AGI. No obstante, la relación entre la actividad de a-amilasa acida y la actividad de glucoamilasa preferiblemente es menor de 6.0, menor de 5.5, menor de 4.5, menor de 4.0, menor de 3.5 o incluso menor de 3.0 AUU/AGI. La composición anterior es adecuada para uso en un procedimiento de conversión de almidón mencionado en lo siguiente para producir jarabe y productos de fermentación tal como etanol. Se proporcionan a continuación ejemplos de usos preferidos de las composiciones polipeptídicas de la invención. La dosificación de la composición polipeptídica de la invención y otras condiciones bajo las cuales se utiliza la composición se pueden determinar en base en los métodos conocidos en la técnica.

Combinación de glucoamilasa de Trametes cingula ta con otra glucoamilasa y una a-amilasa acida La glucoamilasa de Trametes cingula ta de la invención se ha encontrado que tiene 4-7 veces mayor actividad de desramificación a-1, 6 en comparación con otras glucoamilasas tales como las de Athelia rolfsii , Aspergill us niger y Talaromyces emersonii (véase ejemplo 12). Por lo tanto, de acuerdo con la invención, la glucoamilasa de Trametes cingula ta se puede combinar con a-amilasa acida y con otra glucoamilasa adicional. Dicha combinación de enzimas puede ser adecuada en procedimientos que comprenden conversión de almidón, que incluyen producción de etanol, que incluye un procedimiento de fermentación en una etapa. La a-amilasa puede ser cualquier a-amilasa. En una modalidad preferida, la a-amilasa es cualquiera de las que se incluyen en la sección de "a-amilasa" posterior. En una modalidad preferida, la a-amilasa es una a-amilasa micótica, especialmente aquellas descritas en lo siguiente en la sección de "a-amilasas micóticas", especialmente la a-amilasa de Aspergillus kawa chii . También se prefieren las a-amilasa híbridas descritas en lo siguiente en la sección de "a-amilasa hibrida micótica" posterior, que incluye híbridos descritos de la publicación de Patente de E.U.A. No. 2005/0054071 (se contemplan especialmente los híbridos que se incluyen en la tabla 3) y adicionalmente los híbridos descritos en la solicitud de E.U.A. copendiente No. 60/638,614 que incluyen especialmente la variante Fungamyl con el dominio catalítico JAI18 y Athelia rolfsii SBD (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 28, en la presente y SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 100 en el documento de E.U.A. 60/638,614); a-amilasa de Rhizomucor pusill us con el enlazante AMG de Athelia rolfsii y SBD (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 29 en la presente y SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 101 en la solicitud de E.U.A. No. 60/638,614); y la a-amilasa de Meripil us gigan teus con el enlazante de glucoamilasa de Athelia rolfsii y SBD (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 30 en la presente y SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 102 en la solicitud de E.U.A. No. 60/638, 614) . La glucoamilasa puede ser cualquier glucoamilasa, que incluye glucoamilasas de origen micótico o bacteriano que se seleccionan del grupo que consiste de glucoamilasas de Aspergill us, en particular glucoamilasa Gl o G2 de A . niger (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102), o variantes de las mismas, tales como las descritas en los documentos WO 92/00381, WO 00/04136 y WO 01/04273 (de Novozymes, Dinamarca); la glucoamilasa de A. awamori (WO 84/02921), A . oryzae (Agrie. Biol. Chem. (1991), 55 (4), p. 941-949) o variantes o fragmentos de las mismas. Otras variantes de glucoamilasa de Aspergillus incluyen variantes para incrementar la estabilidad térmica: G137A y G139A (Chen et al. (1996), Prot Eng. 9, 499-505); D257E y D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Engng . 8, 575-582); N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301, 275-281); enlaces disulfúro, A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35, 8698-8704); y la introducción de residuos Pro en la posición A435 y S436 (Li et al. (1997), Protein Engng. 10, 1199-1204). Otras glucoamilasas incluyen la glucoamilasa de Corticium rolfsii (Patente de E.U.A. No. 4,727,046) también denominada como Athelia rolfsii , glucoamilasas de Talaromyces, en particular derivadas de Talaromyces emersonii (WO 99/28448), Talaromyces leycet tanus (patente de E.U.A. No. RE.32153), Talaromyces dupon ti , Talaromyces thermophilus (patente de E.U.A. No. 4,587,215), Rhi zopus nivi us (por ejemplo la enzima disponibles de Shin Nihon Chemicals, Japón, bajo el nombre comercial "CU CONC"), Humicola grísea var. thermoidea (por ejemplo ATCC 16453, NRRL 15222, NRRL 15223, NRRL 15224, NRRL 15225) . Las glucoamilasas bacterianas contempladas incluyen glucoamilasa del género Clostridium, en particular C. thermoamylolyticum (EP 135,138) y C. thermohydrosulfuricum (WO 86/01831) . Los ejemplos de composiciones disponibles comercialmente que comprenden otras glucoamilasas incluyen AMG 200L; AMG 300 L, SANMR SUPER, SANMR EXTRA L, SPIRIZYMEMR PLUS, SPIRIZYMEMK FUEL, SPIRIZYMEra? B4U y AMG -MmR? E (de Novozymes A/S); OPTIDEXMR 300 (de Genencor Int.); AMIGASEMR y AMIGASEMR PLUS (de DSM); G-ZYMEMR G900, G-ZYMEMR y G990 ZR (de Genencor Int. ) . En una modalidad específica la glucoamilasa de Trametes cingula ta de la invención se combina con glucoamilasa derivada de Aspergillus Níger, Athea rolfsii , o Talaromyces emersonii y la a-amilasa de Rhi zomucor pusill us y el enlazante de AMG de Athelia rolfsii y SBD (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 29 en la presente y SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 101 en la Solicitud de E.U.A. No. 60/638,614) .

Usos La presente invención también se relaciona con procedimientos/métodos para utilizar los polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa de la invención.

Los usos de acuerdo con la invención incluyen conversión de almidón, por ejemplo, para jarabe y productos de fermentación que incluyen etanol y bebidas. Los ejemplos de procedimientos en donde se puede utilizar la glucoamilasa de la invención son aquellos descritos en WO 2004/081193, WO 2004/080923, WO 2003/66816, WO 2003/66826 y WO 92/20777, los cuales se incorporan en la presente como referencia.

Producción de Productos de Fermentación Procedimientos para elaborar productos de fermentación a partir de material que contiene algodón gelatinizado En este aspecto la presente invención se relaciona con un procedimiento para producir un producto de fermentación, especialmente etanol, a partir de material que contiene almidón, procedimiento el cual incluye una etapa de licuefacción y de manera separada o simultánea realizar sacarificación y una o varias etapas de fermentación. La invención se relaciona con un procedimiento para elaborar un producto de fermentación a partir de material que contiene almidón, que comprende las etapas de: (a) licuar el material que contiene almidón en presencia de una a-amilasa; (b) sacarificar el material licuado obtenido en la etapa (a) utilizando una glucoamilasa de la invención; (c) fermentar el material sacarificado utilizando un organismo de fermentación. El producto de fermentación, tal como especialmente etanol, opcionalmente se puede recuperar después de fermentación, por ejemplo por destilación, materiales iniciales que contienen almidón adecuados se incluyen en la sección "materiales que contienen almidón" que se presenta a continuación . Las enzimas contempladas se incluyen en la sección de "enzimas" en lo siguiente. Preferiblemente, la fermentación se lleva a cabo en presencia de levadura, preferiblemente una cepa de Saccharomyces . Los organismos de fermentación adecuados incluyen en la sección de "organismos de fermentación" siguiente. En una modalidad preferida, las etapas (b) y (c) se llevan a cabo simultáneamente (procedimiento SSF) . En una modalidad particular, el procedimiento de la invención comprende además, antes de la etapa (a), las etapas de: x) reducir el tamaño de partícula del material que contiene almidón, preferiblemente por molido; y) formar una suspensión que comprende el material que contiene almidón y agua. La suspensión acuosa puede contener 10-40% en peso, preferiblemente 25-35% en peso de material que contiene almidón. La suspensión se calienta a la temperatura anterior de gelatinización y a-amilasa, preferiblemente a-amilasa bacteriana o micótica acida se pueden agregar para iniciar la licuefacción (dilución) . La suspensión en una modalidad se puede cocinar por chorro para gelatinizar adicionalmente la suspensión antes de que se someta a una a-amilasa en la etapa (a) de la invención. De manera más especifica, la licuefacción se puede llevar a cabo como un procedimiento de suspensión en caliente de tres etapas. La suspensión se calienta entre 60-95°C, de manera preferible 80-85°C y se agrega a-amilasa para iniciar la licuefacción (dilución) . Después, la suspensión se puede cocinar a chorro a una temperatura entre 95-140°C, preferiblemente 105-125°C durante 1-15 minutos, de manera preferible durante 3-10 minutos, especialmente aproximadamente 5 minutos. La suspensión se enfria a 60-95°C y se agrega más a-amilasa para finalizar la hidrólisis (licuefacción secundaria). El procedimiento de licuefacción habitualmente se lleva a cabo a un pH de 4.5-6.5, en particular a un pH entre 5 y 6. Los granos completos molidos y licuados se conocen como macerado. La sacarificación en la etapa (b) se puede llevar a cabo utilizando condiciones bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento de sacarificación completo puede durar desde aproximadamente 24 hasta aproximadamente 72 horas, no obstante, es común que únicamente se realiza una presacarificación típicamente de 40-90 minutos a una temperatura entre 30-65 °C, típicamente de aproximadamente 60°C, seguido por sacarificación completa durante la fermentación en un procedimiento simultánea de sacarificación y fermentación (SSF, por sus siglas en inglés) . La sacarificación típicamente se lleva a cabo a temperaturas entre 30-65°C, típicamente aproximadamente a 60°C y en un pH entre 4 y 5, normalmente a aproximadamente 4.5. El procedimiento utilizado más ampliamente en la elaboración de etanol es el procedimiento simultáneo de sacarificación y fermentación (SSF), en el cual no existe una etapa de espera para la sacarificación, lo que significa que el organismo fermentador, tal como levadura y/o enzimas, se pueden agregar juntos. Cuando se realiza SSF, es común introducir una etapa de pre-sacarificación a una temperatura superior a 50°C, justo antes de la fermentación. De acuerdo con la presente invención, la etapa (c) de fermentación incluye, sin limitación, el procedimiento de fermentación se utiliza para producir alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol, butanol); ácidos orgánicos (por ejemplo ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico), cetonas (por ejemplo acetona); aminoácidos (por ejemplo ácido glutámico) ; gases (por ejemplo H2 y C02) ; antibióticos (por ejemplo penicilina y tetraciclina) ; enzimas; vitaminas (por ejemplo riboflavina, B12, ß-caroteno) y hormonas. El procedimiento de fermentación preferible incluye un procedimiento de fermentación por alcohol, como es bien conocido en la técnica. El procedimiento de fermentación preferido son procedimientos de fermentación anaeróbicos, como son bien conocidos en la técnica. Procedimientos para elaborar productos de fermentación a partir de los que contienen almidón no gelatinizado En este aspecto, la invención se relaciona con procedimientos para elaborar un producto de fermentación a partir de material que contiene almidón sin gelatinización del material que contiene almidón. En una modalidad, únicamente se utiliza glucoamilasa de la invención durante la sacarificación y fermentación. De acuerdo con la invención, el producto de fermentación deseado, tal como etanol, se puede elaborar sin licuar la suspensión acuosa que contiene el material que contiene almidón. Una modalidad, un procedimiento de la invención incluye sacarificar material que contiene almidón molido por debajo de la temperatura de gelatinización en presencia de una glucoamilasa de la invención para producir azúcares que se pueden fermentar en el producto de fermentación deseado por un organismo de fermentación adecuado. Los ejemplos 7 y 8 a continuación describen la producción de etanol a partir de almidón molido no gelatinizado (no cocinado) , utilizando glucoamilasas de la invención derivadas de Trametes cingula ta y Pachykytospora papyracea . Ambas glucoamilasas muestran rendimientos de etanol significativamente mayores en comparación con los procedimientos correspondientes llevados a cabo utilizando glucoamilasas derivadas de Aspergill us Níger o Talaromyces emersonii , respectivamente. En consecuencia, en este aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para elaborar un producto de fermentación a partir de un material que contiene almidón, que comprende: (a) sacarificar material que contiene almidón con una glucoamilasa que tiene: (i) la secuencia que se muestra como aminoácidos 1 a 556 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2 o los aminoácidos 1 a 561 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 37; o una glucoamilasa que tiene por lo menos 75% de identidad con la misma, y/o ii) la secuencia mostrada como aminoácidos 1 a 575 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 5 o los aminoácidos l a 565 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 40; o una glucoamilasa que tiene por lo menos 70% de identidad para la misma, y/o (iii) la secuencia mostrada como aminoácidos 1 a 548 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 24 o los aminoácidos 1 a 556 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 26 o los aminoácidos 1 a 523 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 43 o una glucoamilasa que tenga por lo menos 60% de identidad con la misma, a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial del material que contiene almidón, (b) fermentación utilizando un organismo fermentador . Las etapas (a) y (b) del procedimiento de la invención se pueden llevar a cabo secuencialmente o de manera simultánea. El término "temperatura de gelatinización inicial" significa la menor temperatura a la cual comienza la gelatinización del almidón. El almidón calentado en agua calienta a gelatinizar entre 50°C y 75°C; la temperatura exacta de gelatinización depende del almidón específico y se puede determinar fácilmente por un experto en la técnica. De esta manera, la temperatura de gelatinización inicial puede variar de acuerdo con la especie vegetal, con la variedad particular de la especie vegetal así como con las condiciones de crecimiento. En el contexto de esta invención, la temperatura de galatinización inicial de un material dado que contiene almidón es la temperatura a la cual se pierde birrefringencia en 5% de los granulos de almidón utilizando el método descrito por Gorinstein. S. y Lii, C, Starch/Stárke, Vol. 44 (12) pp . 461-466 (1992).

Antes de la etapa (a) se puede preparar una suspensión de material que contiene almidón tal como almidón granular, que tiene 20-55% en peso de sólidos secos, preferiblemente 25-40% en peso de sólidos secos, de manera más preferible 30-35% de sólidos secos de material que contiene almidón. La suspensión puede incluir agua y/o agua de procedimiento tal como residuos de elaboración (contracorriente) , agua de depurador, condensado o destilado de evaporador, agua de destilación secundaria de la destilación u otra agua de proceso de una planta de producto de fermentación. Debido a que el proceso de la invención se lleva a cabo por debajo de la temperatura de gelatinización y por lo tanto no se lleva a cabo un incremento significativo en la viscosidad, se pueden utilizar altas concentraciones de residuos de elaboración, si se desea. En una modalidad, la suspensión acuosa contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 70% en volumen de residuos de elaboración, preferiblemente 15-60% en volumen % de residuos de elaboración, especialmente de aproximadamente 30-50% en volumen de residuos de elaboración. Se puede preparar el material que contiene almidón hasta reducir el tamaño de partícula, preferiblemente por molido, a 0.05 a 3.0 mm, de manera preferible 0.1-0.5 mm. Después de someterse a un procedimiento de la invención, por lo menos 85%, por lo menos 86%, por lo menos 87%, por lo menos 88%, por lo menos 89%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98% o preferiblemente por lo menos 99% de los sólidos secos del material que contiene almidón se convierten en un hidrolizado soluble de almidón. El procedimiento de la invención se lleva a cabo a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial. Preferiblemente, la temperatura a la cual se lleva a cabo la etapa (a) está entre 30-75°C, de manera preferible entre 45-60°C. En una modalidad preferida, la etapa (a) y la etapa (b) se llevan a cabo como procedimientos simultáneos de sacarificación y fermentación. En dicha modalidad preferida, el procedimiento típicamente se lleva a cabo a una temperatura entre 28°C y 33°C, por ejemplo entre 29°C y 35°C, por ejemplo entre 30°C y 34°C, por ejemplo a aproximadamente 32°C. De acuerdo con la invención, se puede ajustar la temperatura aumentándola o disminuyéndola durante la fermentación. En una modalidad se lleva a cabo sacarificación y fermentación simultánea de manera que la concentración de azúcar, tal como la concentración de glucosa, se mantiene en una concentración baja, por ejemplo inferior a 6% en peso, de manera preferible inferior a aproximadamente 3% en peso, de manera preferible inferior a aproximadamente 2% en peso y de manera más preferida inferior a aproximadamente 1% en peso, de manera más preferible inferior a aproximadamente 0.5% en peso o incluso de manera más preferida 0.25% en peso, por ejemplo inferior a aproximadamente 0.1% en peso. Tales concentraciones bajas de azúcar se pueden llevar a cabo simplemente al utilizar cantidades ajustadas de enzima y organismo fermentador. Una persona experta en la técnica puede determinar con facilidad cuáles cantidades de enzima y organismo fermentador utilizar. Las cantidades utilizadas de enzima y organismo fermentador también se pueden seleccionar para mantener concentraciones bajas de maltosa en el caldo de fermentación. Por ejemplo, la concentración de maltosa se puede mantener por debajo de aproximadamente 0.5% en peso o por debajo de aproximadamente 0.2% en peso. El procedimiento de la invención se puede llevar a cabo en un pH en el intervalo de 3 y 7 , de manera preferible de pH 3.5 a 6, de manera más preferible de pH 4 a 5.

Materiales que contienen almidón Se puede utilizar de acuerdo con la presente invención cualquier material inicial que contenga almidón adecuado, que incluye almidón granular. El material inicial generalmente se selecciona en base en el producto de fermentación deseado. Los ejemplos de materiales iniciales que contienen almidón adecuados para uso en un procedimiento de la presente invención incluyen tubérculos, raíces, tallos, granos completos, maíces, mazorcas, trigo, cebada, centeno, kafir feterita, sagú, mandioca, sorgo, vaina de arroz, frijoles o camotes, o mezclas de los mismos, o cereales, materias primas que contienen azúcar, tales como melasas, materiales de fruta, caña de azúcar o remolacha de azúcar, papas y materiales que contienen celulosa tales como madera o residuos vegetales, o mezclas de los mismos. Se contemplan los tipos ceroso y no ceroso de maíz y cebada. El término "almidón granular" significa almidón crudo sin cocinar, es decir, almidón en su forma natural como se encuentra en cereales, tubérculos o granos. El almidón se forma dentro de las células vegetales como granulos delgados insolubles en agua. Cuando se colocan en agua fría, los granulos de almidón pueden absorber una cantidad pequeña de liquido y expandirse. A temperaturas de hasta 50°C a 75°C, la expansión puede ser reversible. No obstante, con temperaturas más altas comienza una expansión irreversible denominada "gelatinización". El almidón granular que se va a procesar puede ser de calidad de almidón altamente refinado, preferiblemente por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 97%, o lo menos 99.5% puro o puede ser un material que contenga almidón más crudo que comprende la totalidad del grano molido que incluye fracciones no almidonosas tales como residuos de germen y fibras. El material crudo, tal como el grano completo, se muele con el fin de abrir la estructura y permitir procesamiento adicional. Se prefieren dos procedimientos de molido de acuerdo con la invención. Molido húmedo y seco. En el molido seco, los núcleos completos se muelen y se utilizan. El molido húmedo proporciona una buena separación de germen y harina (granulos de almidón y proteína) y con frecuencia se aplica en lugares en donde el hidrolizado de almidón se utiliza en la producción de jarabes. El molido tanto seco como el húmedo es bien conocido en la técnica del procesamiento de almidón e igualmente se contempla para el proceso de la invención. El material que contiene almidón se reduce en tamaño, preferiblemente por molido, con el fin de exponer más área superficial. En una modalidad, el tamaño de partícula está entre 0.05 y 3.0 mm, preferiblemente 0.1-0.5 mm, o similar, de manera que por lo menos 30%, de manera preferible por lo menos 50%, de manera más preferible por lo menos 70%, incluso de manera más preferible por lo menos 90% del material molido que contiene almidón pasa a través de un tamiz con una malla de 0.05 a 3.0 mm, preferiblemente 0.1-0.5 mm de malla.

Productos de fermentación El término "producto de fermentación" significa un producto elaborado por un procedimiento que incluye la etapa de fermentación utilizando un organismo fermentador. Los productos de fermentación contemplados de acuerdo con la invención incluyen alcoholes (por ejemplo etanol, metanol, butanol); ácidos orgánicos (por ejemplo ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico) ; cetonas (por ejemplo acetona) ; aminoácidos (por ejemplo ácido glutámico) ; gases (por ejemplo H2 y C02) ; antibióticos (por ejemplo penicilina y tetraciclina); enzimas; vitaminas (por ejemplo riboflavina, B?2, ß-caroteno); y hormonas. En una modalidad preferida el producto de fermentación es etanol, por ejemplo etanol combustible; etanol potable, es decir, espíritus neutros potables; o etanol industrial o productos utilizados en la industria del alcohol consumible (por ejemplo cerveza y vino), la industria láctea (por ejemplo productos lácteos fermentados), industria del cuero e industria del tabaco. Los tipos preferidos de cerveza comprenden ales, stouts, porters, lagers, bitters, licores de malta, happoushu, cerveza con alto contenido de alcohol, cerveza con bajo contenido de alcohol, cerveza baja en calorías o cerveza ligera. Los procedimientos de fermentación preferidos utilizados incluyen procedimientos de fermentación de alcohol, como son bien conocidos en la técnica. Los procedimientos de fermentación preferidos son procedimientos de fermentación anaeróbica, como es bien conocido en la técnica .

Organismos de fermentación El término "organismo de fermentación" se refiere a cualquier organismo, incluyen organismos bacterianos y micóticos, de acuerdo para uso en un proceso de fermentación y capaces de generar el producto de fermentación que se desea. Los organismos de fermentación adecuados especialmente son capaces de fermentar, es decir, convertir azúcares tales como glucosa o maltosa, directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado. Los ejemplos de organismos de fermentación incluyen organismos micóticos, tales como levaduras. Las levaduras preferidas incluyen cepas del género Saccharomyces, en particular Sa ccharomyces cerevisiae . Las levaduras disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo Red StarMR/Lesaffre Etanol Red (disponible de Red Star/Lesaffre, USA), FALI (disponible de Fleischmann' s Yeast, una división de Burns Philp Food Inc., USA), SUPERSTART (disponible de Alltech) , GERT STRAND (disponible de Gert Strand AB, Suecia) y FERMIOL (disponible de DMS Specialties) .

ENZIMAS Glucoamilasa La glucoamilasa preferiblemente es una glucoamilasa de la invención. No obstante, como se menciona en lo anterior, una glucoamilasa de la invención también se puede combinar con otras glucoamilasas. La glucoamilasa se puede agregar en una cantidad de 0.001 a 10 AGU/g DS, de manera preferible de 0.01 a 5 AGU/g DS, por ejemplo aproximadamente 0.1, 0.3, 0.5, 1 ó 2 AGU/g DS, especialmente 0.1 a 0.5 AGU/g DS o 0.02-20 AGU/g DS, preferiblemente 0.1-10 AGU/g DS . a-amilasa De acuerdo con la invención, la a-amilasa puede ser de cualquier origen. Se prefieren las a-amilasas de origen micótico o bacteriano. En una modalidad preferida, la a-amilasa es una a-amilasa acida, por ejemplo a-amilasa ácido micótica o a-amilasa acida bacteriana. El término "a-amilasa acida" significa una a-amilasa (E.C. 3.2.1.1) la cual se agrega en una cantidad eficaz que presenta una actividad óptima a un pH en el intervalo de 3 a 7 , preferiblemente de 3.5 a 6, de manera más preferible de 4-5. a-amilasas bacterianas De acuerdo con la invención, una a-amilasa bacteriana preferiblemente se puede derivar del género Bacillus . En una modalidad preferida, la a-amilasa de Bacill us se deriva de una cepa de B . licheniformis , B . amyloliquefaciens , B . subtilis o B . stearothermophilus, pero también se puede derivar de otro género de Ba cill us . Los ejemplos específicos de a-amilasas contempladas incluyen la a-amilasa de Ba cill us li cheniformis (BLA, por sus siglas en inglés), que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 4 en WO 99/19467, la a-amilasa de Bacill us amyloliquefaciens (BAN, por sus siglas en inglés) que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 5 en WO 99/19467, y la a-amilasa de Ba ci ll us stearothermophilus (BSG, por sus siglas en inglés) que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3 en el documento WO 99/19467. En una modalidad de la invención, la a-amilasa es una enzima que tiene un grado de identidad de por lo menos 60%, preferiblemente por lo menos 70%, de manera más preferida por lo menos 80%, incluso de manera más preferida por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98% o por lo menos 99% de identidad con cualquiera de las secuencias que se muestran en las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 1, 2, 3, 4 ó 5, respectivamente, en el documento WO 99/19467. La a-amilasa de Bacill us también puede ser una variante y/o híbrido, especialmente uno descrito en cualquiera de los documentos WO 96/23873, WO 96/23874, WO 97/41213, WO 99/19467, WO 00/60059 y WO 02/10355 (todos los documentos se incorporan en la presente como referencia) . Las variantes de a-amilasa contempladas de manera especifica se describen en las patentes de E.U.A. números 6,093,562; 6,297,038 o la patente de E.U.A. número 6,187,576 (incorporada en la presente como referencia) e incluye a-amilasa de Ba cill us Stearothermophilus (a-amilasa de BSG, por sus siglas en inglés) , variantes que tienen una supresión de uno o dos aminoácidos en la posición 179 a 182, preferiblemente una supresión doble descrita en el documento WO 1996/023873 - véase por ejemplo, página 20, lineas 1-10 (incorporada en la presente como referencia) que preferiblemente corresponden a ? (181-182) en comparación con las secuencias de aminoácidos de a-amilasa BSG de tipo natural que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3 descrita en WO 99/19467 o la supresión de aminoácidos 169 y 180 utilizando la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3 en WO 99/19467 para numeración (referencia la cual se incorpora en la presente como referencia) . Se prefieren adicionalmente las a-amilasas de Bacill us, especialmente a-amilasa de Bacill us stearothermophilus, la cual tiene una supresión doble que corresponde a ? (181-182) y que comprende además una sustitución N193F (también indicada como 1181* + G182* + N193F) en comparación con la secuencia de aminoácidos de a-amilasa BSG de tipo natural que se establece en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3 descrita en WO 99/19467. La a-amilasa también puede ser una a-amilasa maltogénica. Una "a-amilasa maltogénica" (glucano 1,4-a-maltohidrolasa, E.C. 3.2.1.133) es capaz de hidrolizar amilosa y amilopectina a maltosa en configuración a. La a-amilasa maltogénica de Ba cill us stearothermophil us cepa NCIB 11837 está disponible comercialmente de Novozymes A/S, Dinamarca. La a-amilasa maltogénica se describe en las patentes de E.U.A. números 4,598,048, 4,604,355 y 6,162,628, las cuales se incorporan en la presente como referencia. a-amilasas híbridas bacterianas La a-amilasa hibrida contemplada específicamente comprende 445 residuos aminoácidos de la parte C terminal de la a-amilasa de Ba cillus licheniformis (que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4 en WO 99/19467) y los 37 residuos de aminoácidos en la parte N terminal de la a-amilasa derivada de Ba cill us amyloliquefaciens (que se muestra como SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3 en el documento WO 99/194676) o en uno o más, especialmente la totalidad de las siguientes sustituciones: G48A+T491+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S (utilizando la numeración de Bacillus licheniformis) . También se prefieren las variantes que tienen una o más de las siguientes mutaciones (o mutaciones correspondientes en otras estructuras principales de a-amilasa de Bacillus) : H154Y, A181T, N190F, A209V y Q264S y/o supresión de dos residuos entre las posiciones 176 y 179, preferiblemente la supresión de E178 y G179 (utilizando la numeración de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 de WO 99/19467). La a-amilasa bacteriana se puede agregar en cantidades como son bien conocidas en la técnica. Cuando se miden en unidades KNU (que se describen a continuación en la sección de "materiales y métodos"), la actividad de la a-amilasa preferiblemente está presente en una cantidad de 0.5-5,000 NU/g de DS, en una cantidad de 1-500 NU/g de DS o de manera más preferible en una cantidad de 5-1,000 NU/g de DS, tal como 10-100 NU/g DS . a-amilasas micóticas Las a-amilasas acidas micóticas incluyen a-amilasas acidas derivadas de una cepa del género Aspergill us, tal como a-amilasas de Aspergillus oryzae, Aspergillus niger o Aspergillus kawachii . Una a-amilasa micótica acida preferida es una a- amilasa similar a Fungamyl, la cual es preferiblemente derivada de una cepa de Aspergillus oryzae . En la presente descripción, el término a-amilasa similar a Fungamyl" indica una a-amilasa la cual presenta una identidad alta, es decir, mayor de 70%, mayor de 75%, mayor de 80%, mayor de 85%, mayor de 90%, mayor de 95%, mayor de 96%, mayor de 97%, mayor de 98%, mayor de 99% o incluso 100% de identidad con la parte madura de una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 10 en WO 96/23874. Otra a-amilasa acida preferida se deriva de una cepa de Aspergíll us níger. En una modalidad preferida la a-amilasa micótica acida es una de A . niger descrita como "AMYA_ASPNG" en la base de datos Swiss-prot/TeEMBL bajo el número de acceso primario P56271 y descrita con mayor detalle en el documento WO 89/01969 (ejemplo 3) . La a-amilasa acida de Aspergill us niger acida también se muestra como la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 en WO 2004/080923 (Novozymes), la cual se incorpora en la presente como referencia. Además se contemplan variantes de dicha amilasa micótica acida que tiene por lo menos 70% de identidad, tal como por lo menos 80% o incluso por lo menos 90% de identidad, tal como por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98% o por lo menos 99% de identidad con la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 en el documento WO 2004/080923. Una a-amilasa micótica acida disponible comercialmente adecuada derivada de Aspergillus niger es SP288 (disponible de Novozymes A/S, Dinamarca) . En una modalidad preferida, la a-amilasa se deriva de Aspergill us kawa chii y se describe por Kaneko et al. J. Ferment. 81:292-298 (1996) "Molecular-cloning and determination of the nucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable alpha-amylase from Aspergillus kawachii " y adicionalmente como EMBL: #AB008370. La a-amilasa acida micótica también puede ser una enzima natural que comprende un módulo de unión de carbohidrato (CBM, por sus siglas en inglés) y un dominio catalítico de a-amilasa (es decir, un sin híbrido) o una variante del mismo. En una modalidad, la a-amilasa acida natural se deriva de una cepa de Aspergill us kawa chii . a-amilasas híbridas micóticas En una modalidad preferida, la a-amilasa acida micótica es una a-amilasa híbrida. Los ejemplos preferidos de a-amilasas híbridas micóticas incluyen aquellas descritas en los documentos WO 2005/003311 o la publicación de patente de E.U.A. número 2005/0054071 (Novozymes) o la solicitud de patente de E.U.A. número 60/638,614 (Novozymes), las cuales se incorporan en la presente como referencia. Una a-amilasa hibrida puede comprender un dominio catalítico de a-amilasa (CD, por sus siglas en inglés) y un dominio/módulo de unión de carbohidrato (CBM) y opcionalmente un enlazante. Los ejemplos específicos de a-amilasas híbridas contempladas incluyen aquellas descritas en la solicitud de patente de E.U.A. número 60/638,614 que incluyen la variante Fungamyl con el dominio catalítico JAI 18 y Athelia rolfsii (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 28, en la presente y SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 100 en la solicitud de E.U.A. número 60/638,614), a-amilasa de Rhizomucor pusillus y enlazante Athelia rolfsii AMG y SBD (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 29 en la presente y SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 101 en la solicitud de E.U.A. número 60/638,614) y la a-amilasa de Meripilus giganteus con el enlazante de glucoamilasa de Athelia rolfsii y SBD ("SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 30 en la presente y SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 102 en la solicitud de E.U.A. número 60/638,614) . Otros ejemplos específicos de a-amilasas híbridas contempladas incluyen los descritos en la publicación de patente de E.U.A. número 2005/0054071, que incluye aquellos descritos en la tabla 3 en la página 15, tal como la a-amilasa de Aspergillus niger con el enlazante de Aspergillus kawachii y el dominio de unión de almidón.

Productos comerciales de a-amilasa Las composiciones comerciales preferidas que comprenden a-amilasa incluyen MYCOLASE de DSM (Gist Brocades), BANMR, TERMAMYLMR SC, FUNGAMYLMR, LIQUOZYMEMR X y SANMR SUPER, SANMR EXTRA L (Novozymes A/S) y CLARASEMR L-40,000, DEXLOMR, SPEZYMEMR FRED, SPEZYNEMR AA, y SPEZYMEMRDELTA AA (Genencor Int.), y la a-amilasa micótica acida vendida bajo el nombre comercial SP288 (disponible de Novozymes A/S, Dinamarca) . Una a-amilasa acida de acuerdo con la invención, se puede agregar en una cantidad de 0.1 a 10 AFAU/g DS, preferiblemente 0.10 a 5 AFAU/g DS, especialmente 0.3 a 2 AFAU/g DS.

Producción de jarabe La presente invención también proporciona un procedimiento para utilizar una glucoamilasa de la invención para la elaboración de jarabe, tal como glucosa y similar, a partir de material que contiene almidón. Los materiales iniciales adecuados se ejemplifican en la sección anterior de "materiales que contienen almidón". Generalmente, el procedimiento comprende las etapas de hidrolizar parcialmente material que contiene almidón (licuefacción) en presencia de a-amilasas y después sacarificar adicionalmente la liberación de glucosa a partir de los extremos no reductores del almidón o de las moléculas oligosacáridas o polisacáridas relacionadas en presencia de glucoamilasa de la invención. La licuefacción y sacariricación se pueden llevar a cabo como se describe en lo anterior para la elaboración de un producto de fermentación. La glucoamilasa de la invención también se puede utilizar en forma inmovilizada. Esto es adecuado y con frecuencia se utiliza para la elaboración de jarabes de especialidad tales como jarabes de maltosa y adicionalmente para la corriente de rafinado de oligosacáridos en relación con la producción de jarabes de fructosa, por ejemplo un jarabe con alta concentración de fructosa (HFS, por sus siglas en inglés) . En consecuencia, este aspecto de la invención se relaciona con un procedimiento para la elaboración de jarabe a partir de material que contiene almidón, que comprende: (a) licuar material que contiene almidón en presencia de una a-amilasa, (b) sacarificar el material que se obtiene en la etapa (a) utilizando una glucoamilasa de la invención. Se puede recuperar un jarabe del material sacarificado que se obtiene en la etapa (b) . Los detalles sobre las condiciones adecuadas se pueden encontrar en lo anterior.

Fermentación Una glucoamilasa de la invención también se puede utilizar en un proceso de fermentación (braceaje o elaboración de cerveza) . Las glucoamilasas de la invención se agregan en cantidades eficaces las cuales se pueden determinar con facilidad por una persona experta en la técnica. Por ejemplo, en la producción de cervezas "poco carbonatadas" o superatenuadas se desea una mayor proporción de alcohol y una menor cantidad de dextrina residual. Estas cervezas se formulan utilizando composiciones de enzimas exógenas que comprenden actividades de enzima capaces de des-ramificar las dextrinas limite. Se puede aplicar una glucoamilasa de la invención, preferiblemente Trametes cingula ta para reducir el contenido de dextrinas límite así como hidrolizar los enlaces a-1, 4. La invención descrita y que se reclama en la presente no se limita en su alcance por las modalidades especificas descritas en la presente, dado que estas modalidades se pretende que sean ilustraciones de los diversos aspectos de la invención. Cualquiera de las modalidades equivalentes se pretende que estén dentro del alcance de esta invención. En realidad, las diversas modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en la presente, se volverán evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción precedente. Se pretende también que dichas modificaciones se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. En caso de conflicto, la presente descripción, incluyendo las definiciones es la que prevalecerá. Las diversas referencias se mencionan en la presente, cuyas descripciones se incorporan como referencia en su totalidad. La presente invención se describe adicionalmente por los siguientes ejemplos los cuales no deben construirse como limitantes del alcance de la invención .

Materiales y Métodos Glucoamilasas : * Glucoamilasa derivada de Trametes cingula ta descrita en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 y disponible de Novozymes A/S * Glucoamilasa derivada de Pachykytospora papyraceae descrita en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: y disponible de Novozymes A/S * Glucoamilasa derivada de Leucopaxill us giganteus descrita en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24 y disponible de Novozymes A/S * Glucoamilasa derivada de Aspergill us niger descrita en (Boel et al., (1984), EMBO J. 3(5) p. 1097-1102) y disponible de Novozymes A/S. * Glucoamilasa derivada de Talaromyces emersonii descrita en W099/28448 y disponible de Novozymes A/S. Enzimas para manipulaciones de ADN (por ejemplo endonucleasas de restricción, ligasas, etc.), se obtienen de New Englands Biolabs, Inc., y se utilizan de acuerdo con las instrucciones del fabricante. a-amilasa : a-amilasa A híbrida: a-amilasa de Rhizomucor pusill us con enlazante de glucoamilasa de Athelia rolfsii y SBD descrita en la solicitud de patente de E.U.A. número 60/638,614 y la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 29.

Levadura: Red Star disponible de Red Star/Lesaffre, E.U.A.

Cepas Microbianas E. coli DHl2a (GIBCO BRL, Life Technologies, E.U.A. ) Aspergillus oryzae IFO 4177 está disponible de Institute for Fermentation, Osaka (IFO) Culture Collection of Microorganisms, 17-85, Juso-honmachi, 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532-8686, Japón. Aspergill us oryzae BECh-2 descrita en WO 2000/39322 (Novozymes) . Es un mutante de Jal228 (descrita en WO 98/12300) el cual es un mutante de IFO 4177. Aspergill us niger cepa Mbinll9 se describe en WO 2004/090155 (véase ejemplo 11) .

Otros materiales Pululana disponible de Wako Puré Chemical (Japón) Depósito de Material Biológico El siguiente material biológico se ha depositado bajo los términos del Tratado de Budapest en el Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig DE, y se le proporciona el siguiente número de acceso La cepa se ha depositado bajo las condiciones que aseguran el acceso al cultivo el cual estará disponible durante la pendencia de esta solicitud de patente para una persona, determinada por el Comisionado de Patentes y Marcas, capacitada para esto bajo 37 C.F.R. §1.14 y 35 U.S.C. §122. El depósito representa un cultivo sustancialmente puro de la cepa depositada. El depósito está disponible como se requiere para las leyes de patentes extranjeras en paises en donde las contrapartes de la presente solicitud o su descendencia se presenten. No obstante, debe entenderse que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para la práctica de la presente invención en derogación a los derechos de patente otorgados por acción gubernamental.

Medio y reactivos: Las sustancias químicas utilizadas como amortiguadores y sustratos son productos comerciales de por lo menos grado reactivo. PDA2 : agar dextrosa papa 39 g/l, agar 20 g/l, agar 20 g/l, glicerol 50 ml/l Cove : Sacarosa 342.3 g/l, solución salina COVE 20 ml/l, acetamida 10 mM, agar noble 30 g/l. Solución salina Cove: por litro, 26 g de KCl, 26 g de MgS04-7aq, 76 g de KH2P04, 50 ml de metales en trazas Cove. Metales en trazas de Cove: por litro: 0.04 g de NaB4O7-10aq, 0.4 g de CuS04 5-aq, 1.2 g de FeS04-7aq, 0.7 g de MnS04-aq, 0.7 g de Na2Mo02-2aq, 0.7 g de ZnS04-7aq. YPG: Extracto de levadura 4 g/l, KH2P04 1 g/l, MgS04-7aq 0.5 g/l, Glucosa 5 g/l, pH 6.0. STC: Sorbitol 0.8M, Tris 25 mM, pH 8, CaCl2 25 mM. STPC: PEG4000 40% en amortiguador STC. Agarosa superior Cove: Sacarosa 342.3 g/l, solución salina COVE 20 ml/l, acetamida 10 mM, agarosa con bajo punto de fusió, 10 g/l. MS-9: por litro, polvo de soya 30 g, glicerol g, pH 6.0. MDU-pH5: por litro, maltosa-laq 45 g, extracto de levadura 7 g, KH2P04 12 g, MgS04-7aq 1 g, K2S04 2 g, solución de metal en trazas AMG 0.5 ml y ácido 2-morfolinoetansulfónico 25 g, pH 5.0.

Métodos A menos que se establezca de otra manera, las manipulaciones y transformaciones de ADN se realizan utilizando métodos estándar de biología molecular como se describe en Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C.R., and Cutting, S. M. (eds.). "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990.

Actividad de glucoamilasa La actividad de glucoamilasa se puede medir en unidades AGÍ o unidades de glucoamilasa (AGU, por sus siglas en inglés) .

Actividad de Glucoamilasa (AGÍ) La glucoamilasa (equivalente a amiloglucosidasa) convierte almidón en glucosa. Se determina aqui la cantidad de glucosa por el método de glucosa oxidasa para determinación de actividad. El método se describe en la sección 76-11 del método de almidón-glucoamilasa con medición subsecuente de glucosa con glucosa oxidasa en "Approved methods of the American Association of Cereal Chemists". Vol. 1-2 AACC, de American Association of Cereal Chemists, (2000); ISBN: 1-891127-12-8. Una unidad de glucoamilasa (AGÍ) es la cantidad de enzima la cual formará 1 micromol de glucosa por minuto bajo condiciones estándar del método.

Condiciones estándar/condiciones de reacción: Sustrato Almidón soluble, concentración aproximada de 16 g de material seco/1 Amortiguador : Acetato, aproximadamente 0.04 M, pH = 4.3 pH: 4.3 Temperatura de 60°C incubación: Tiempo de 15 minutos reacción: Finalización de NaOH a una concentración de la reacción: aproximadamente 0.2 g/l (pH~9) Concentración de 0.15-0.55 AAU/ml enzima: El almidón debe ser almidón Lintner, el cual es un almidón con una ebullición ligera utilizada en el laboratorio como indicador colorimétrico. El almidón Lintner se obtiene por tratamiento con ácido clorhídrico diluido del almidón natural de manera que retiene su capacidad para teñir de azul con yodo.

Actividad de glucoamilasa (AGU) La unidad de glucoamilasa Novo (AGU) se define como la cantidad de enzima la cual hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto bajo condiciones estándar de 37°C, pH 4.3 de sustrato: maltosa 23.2 mM, amortiguador: acetato 0.1 M, tiempo de reacción 5 minutos. Se puede utilizar un sistema autoanalizador. Se agrega multarotasa al reactivo de glucosa deshidrogenasa de manera que cualquier a-D-glucosa presente se convierte en ß-D-glucosa. La glucosa deshidrogenasa reacciona específicamente con ß-D-glucosa en la reacción mencionada antes, formando NADH, la cual se determina utilizando un fotómetro a 340 nm como una medida de la concentración original de glucosa.

Esta disponible un documento (EB-SM-0131.02/01) que describe este método analítico con mayor detalle, a solicitud, en Novozymes A/S, Dinamarca, documento el cual se incorpora en la presente como referencia.

Actividad de a-amilasa (KNU por sus siglas en inglés) Se puede determinar la actividad de a-amilasa utilizando almidón de papa como sustrato. Este método se basa en la degradación de almidón de papa modificado por la enzima y la reacción es seguida por muestras de mezclado de la solución de almidón/enzima con una solución de yodo. Inicialmente se forma un color negrusco-azul pero durante la descomposición del almidón el color azul se vuelve más débil y gradualmente cambia a roj izo-pardo, el cual se compara con un estándar de vidrio coloreado. Se define una kilo unidad de a-amilasa Novo (KNU) como la cantidad de enzima la cual, bajo condiciones estándar (es decir, a 37°C + 0.05; Ca2+ 0.0003 M y pH 5.6), dextriniza 5260 mg de sustancia seca de almidón Merck Amylum soluble. Un documento EB-SM-0009.02/01 que describe este método con mayor detalle está disponible, a solicitud, de Novozymes A/S, Dinamarca, documento el cual se incorpora en la presente como referencia.

Actividad de a-amilasa acida Cuando se utiliza de acuerdo con la presente invención, la actividad de la a-amilasa acida se puede medir en AFAU (unidades de a-amilasa acida micótica) . De manera alternativa la actividad de a-amilasa acida se puede medir en AAU (unidades de a-amilasa acida) .

Unidades de a-amilasa acida (AAU) La actividad de la a-amilasa acida se puede medir en AAU (unidades de a-amilasa acida) , el cual es un método absoluto. Una unidad de amilasa acida (AAU) es la cantidad de enzima que convierte 1 g de almidón (100% de materia seca) por hora bajo condiciones estandarizadas en un producto que tiene una transmisión a 260 nm después de la reacción con una solución de yodo de fuerza conocida, igual a uno de una referencia de color.

Condiciones estándar/condiciones de reacción: El almidón debe ser almidón Lintner, el cual es un almidón de ebullición ligero utilizado en el laboratorio como indicador colorimétrico. El almidón Lintner se obtiene por tratamiento con ácido clorhídrico diluido del almidón natural de manera que retiene la capacidad para teñir de azul con yodo. Los detalles adicionales se pueden encontrar en EP 0140410 B2, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia . Actividad de a-amilasa acida (AFAU) Se puede medir la actividad de a-amilasa acida en AFAU (unidades de a-amilasa acida micótica) , las cuales se determinan en relación a un estándar de enzima. Se define 1 AFAU como la cantidad de enzima que degrada 5.260 mg de materia seca de almidón por hora bajo las condiciones estándar mencionadas en lo siguiente. La a-amilasa acida, una endo-a-amilasa (1,4-a-D-glucano-glucanohidrolasa, E.C. 3.2.1.1) hidroliza enlaces a-1, 4-glucósidicos en las regiones interiores de la molécula de almidón para formar dextrinas y oligosacáridos con longitudes de cadena diferentes. La intensidad de color que se forma con yodo es directamente proporcional a la concentración de almidón. Se determina la actividad de amilasa utilizando calorimetría inversa como una reducción de la concentración de almidón bajo las condiciones analíticas especificadas. a-AMILASA ALMIDÓN + YODO - DEXTRINAS + OLIGOSACÁRIDOS 40°, pH 2,5 ? = 590 nm azul/violeta tiempo = 23 seg decoloración Condiciones estándar/condiciones de reacción: Sustrato Almidón soluble, aproximadamente 0.17 g/l Amortiguador: Citrato, aproximadamente 0.03 M Yodo (I2) : 0.03 g/l CaCl2: 1.85 mM pH: 2.50 ± 0.05 Temperatura de incubación : 40°C Tiempo de reacción: 23 segundos Longitud de onda: 590 nm Concentración de enzima: 0.025 AFAU/ml Intervalo de funcionamiento de enzima: 0.01-0.04 AFAU/ml Está disponible un documento EB-SM-0259.02/01 que describe este método analítico con mayor detalle, a solicitud, de Novozymes A/S, Dinamarca, documento el cual se incorpora en la presente como referencia.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Cribado molecular de genes para glucoamilasa Se hace crecer Trametes cingula ta en medio PDA2 y se aisla el ADN genómico a partir de 0.2 g de micelios utilizando el equipo para suelo FastDNA Spin (Qbiogene, USA) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La reacción por PCR se realiza en ADN genómico con los cebadores degenerados ArAFl y ArAR3 ARAfl 5'-CRTRCTYDVCAACATYGG-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 7) ArAR3 5' GTCAGARCADGGYTGRRASGTG-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 8) en donde D = A o G o T; R = A o G; S = C o G; V = A o C o G; Y = C o T La reacción de amplificación (13 µl) está constituida de 1 µl de solución de ADN de genoma, 1 µM de cebador ArAfl, 1 µM de cebador ArAR3, 11 µl de alargador Hi-Fidelity PCR Master Mix (ABgene, Reino Unido) . La reacción se incuba en DNA Engine Dyad PTC-0220 (MJ Research, EUA) programada como sigue: 1 ciclo a 94°C durante 2 minutos; 20 ciclos, cada uno a 94°C durante 30 segundos, 65°C durante 45 segundos, con una temperatura de reasociación que disminuye en 1°C por ciclo y 72°C durante 1 minuto 30 segundos; seguido por 20 ciclos cada uno a 94°C durante 30 segundos, 45°C durante 45 segundos y 72°C durante 1 minuto a 30°segundos; 1 ciclo a 72°C durante 7 minutos y una permanencia a 4°C. El producto de PCR se purifica utilizando ExoSAP-IT (USB, EUA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se secuencia. Las secuencias de comparación subsecuentemente con el gen para glucoamilasa de Aspergillus niger que muestra que el producto de PCR codifica para una parte de una glucoamilasa.

Ejemplo 2 Cribado molecular de genes para glucoamilasa Se hace crecer Pa chykytospora papyracea en medio PDA2 y se aisla el ADN genómico a partir de 0.2 g de micelios utilizando el equipo para suelo FastDNA SPIN (Qbiogene, EUA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La reacción de PCR (PCR 1) se realiza en ADN genómico con los cebadores degenerados AM2F y AM4R2: AM2F 5' TGGGGIMGNCCNCARMGNGAYGG-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 9) AM4R2 5' RTCYTCNGGRTANCKNCC-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 10) en donde I = inosina; K = G o T; M = A o C; N = A o C o G o T; R = A o G; Y = C o T La reacción de amplificación (25 µl) está constituida de 1 µl de solución de ADN genómico, 2 µM de cebador AM2F, 2 µM de cebador AM4R2, 22 µl de Reddy PCR Master Mix (ABgene, Reino Unido) . La reacción se incuba en un equipo DNA Engine Dyad PTC-0220 (MJ Research, EUA) programado como sigue: 1 ciclo a 94°C durante 2 minutos; 20 ciclos, cada uno a 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto con una declinación de temperatura de reasociación de 1°C por ciclo y 72°C durante 1 minuto; seguido por 20 ciclos, cada uno a 94°C durante 1 minuto, 40°C durante 1 minuto y 72°C durante 1 minuto; 1 ciclo a 72°C durante 7 minutos y se mantiene a 4°C. Posteriormente se realiza una reacción PCR sobre una alícuota de la primera reacción de PCR (PCR 1) con los cebadores degenerados AM3F y AM4R2: AM3F 5'-TAYGAYYTNYGGGARGA-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 11) AM4R2 5'-RTCYTCNGGRTANCKNCC-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 10) en donde K = G o T; N = A o C o G o T; R = A o G; Y = C o T La reacción de amplificación (13 µl) está constituida de 1 µl de la primera reacción de PCR (PCR 1) , 1 µM de cebador AM3F, 1 µM de cebador AM4R2, 11 µl de Reddy PCR Master Mix (ABgene, Reino Unido) . La reacción se incuba en un equipo DNA Engine Dyad PTC-0220 (MJ Research, EUA) programado como sigue: 1 ciclo a 94°C durante 2 minutos; 5 ciclos cada uno a 94°C durante 45 segundos, 45°C durante 45 segundos y 72°C durante 1 minuto; seguido por 30 ciclos cada uno a 94°C durante 45 segundos, 40°C durante 45 segundos y 72°C durante 1 minuto; 1 ciclo a 72°C durante 7 minutos y se mantiene a 4°C. Se obtiene una banda de PCR amplificada de 0.5 kb. El producto de reacción se aisla en un gel de agarosa 1.0% utilizando amortiguador TBE y se corta del gel y purifica utilizando ADN para PCR GFX y el equipo de purificación de banda de gel (Amersham Biosciences, Reino Unido) . La banda cortada se secuencia y posteriormente se compara con el gen para glucoamilasa de Aspergill us niger que muestra que el producto PCR codifica para una parte de una glucoamilasa.

Ejemplo 3 Clonación del gen para glucoamilasa de Trametes cingula ta A partir de la secuencia parcial del glucoamilasa de Trametes cingula ta , se obtienen más secuencias del gen con caminado de gen (gene walking) basado en PCR utilizando el equipo Vectorette de SIGMA-Genosys . El procedimiento de gene walking se realiza como se describe en el protocolo del fabricante. Se digieren 0.15 µg de ADN genómico de Trametes cingula ta con EcoRI, BamHl y HindIII independientemente. El ADN digerido se liga con las unidades Vectorette correspondientes suministradas por el fabricante utilizando el equipo DNA Engine Dyad PTC-0220 (MJ Research, EUA) programado como sigue: 1 ciclo a 16°C durante 60 minutos; 4 ciclos cada uno a 37°C durante 20 minutos, 16°C durante 60 minutos, 37°C durante 10 minutos; seguido por 1 ciclo a 16°C durante 60 minutos y una retención a 4°C. Las reacciones de ligación posteriormente se diluyen 5 veces con agua estéril . Las reacciones de PCR con el ADN de genoma ligado a enlazante de Trametes cingula ta como plantilla se realizan con un equipo DNA Engine Dyad PTC-0220 (MJ Research, EUA) programado como sigue: 1 ciclo a 94°C durante 2 minutos; 40 ciclos, cada uno a 94°C durante 15 segundos, 72°C durante I minuto, 72°C durante 1 minuto, 1 ciclo a 72°C durante 7 minutos y retención a 4°C utilizando el cebador Vectorette suministrado y el cebador TraFl como se muestra en lo siguiente. TraFl: 5 * -TAGTCGTACTGGAACCCCACC-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 12) Las reacciones de amplificación (12.5 µl) están constituidas de 0.5 µl de los ADN de genoma ligados enlazante, cebador Vecotrette 400 nM, cebador TraFl 400 nM, II µl de alargador Hi-Fidelity PCR Master Mix (ABgene, Reino Unido) . Se obtiene una banda aplicada de 0.5 kb por la reacción de PCR a partir del ADN de genoma digerido con HindIII. El producto de reacción se aisla en un gel de agarosa 1.0% utilizando amortiguador TBE y se corta del gel. Se agregan al gel cortado 100 µl de agua estéril del fragmento de gel y se funde por incubación a 95°C durante 5 minutos para liberar el ADN. La banda de ADN se reamplifica al repetir la reacción de PCR descrita en lo anterior utilizando 0.5 µl del fragmento de ADN claro en vez del ADN genómico ligado a enlazante. Después de la reacción de PCR, el ADN se purifica utilizando ExoSAP-IT (USB, EUA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se secuencia y posteriormente se compara con el gen de glucoamilasa para Aspergillus niger, que muestra que codifica para una parte adicional de 250 pares de bases del gen para glucoamilasa. Con el fin de clonar las partes perdidas del gen para glucoamilasa de Trametes cingula ta se lleva a cabo la prueba de gene walking basada en PCR utilizando el equipo de clonación in vi tro LA PCRMR (TAKARA, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se digieren 5 µg de ADN genómico de Trametes cingula ta con BamHl, EcoRI, HindIII, PstI, Salí y Xbal, independientemente. Se agregan 200 ml de etanol enfriado con hielo a la mezcla de reacción (50 µl) y después el ADN digerido se recupera por centrifugación a 15,000 x g durante 30 minutos a 4°C. El ADN recuperado se liga con los enlazantes artificiales correspondientes suministrados por los fabricantes. El ADN ligado con el enlazante se recupera al agregar 200 ml de etanol enfriado con hielo a la mezcla de reacción (50 µl) seguido por centrifugación a 15,000 x g durante 30 minutos a 4°C. Las reacciones de PCR con el ADN de genoma ligado a enlazante de Trametes cingula ta como plantilla se realiza con el sistema LA PCR (TAKARA, Japón) utilizando el cebador Cl y TC5' para clonación del gen para 5 ' -glucoamilasa perdido y el cebador Cl y TC3' para clonación del gen 3 ' -glucoamilasa perdido, como se muestra a continuación.

Cl : 5 ' -gtacatattgtcgttagaacgcgtaatacgactca-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 13) TC5': 5'-cgtatatgtcagcgctaccatgt-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 14) TC3': 5'-aaacgtgagcgaccattttctgt-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 15 Las reacciones de amplificación (50 µl) están constituidas de 1 ng de ADN de plantilla por µl, dNTP 250 mM cada uno, cebador 250 nM, cebador 250 nM, 0.1 U de LA Taq polimerasa por µl en amortiguador IX (TAKARA, Japón) . Las reacciones se incuban en un equipo ADN Engine PTC-200 (MJ-Research, Japón) programado como sigue: 1 ciclo a 94 °C, durante 2 minutos; 30 ciclos, cada uno a 94°C durante 0.5 minutos, 55°C durante 2 minutos y 72°C durante 2 minutos; 1 ciclo a 72°C durante 10 minutos y se mantiene a 4°C. Se obtienen bandas a 0.4 kb y 1.0 kb amplificadas a partir del ADN de genoma digerido con Salí con el cebador Cl y TC5' y ADN de genoma digerido con Xbal con el cebador Cl y TC3 ' , respectivamente. Estos productos de reacción se aislan en un gel de agarosa 1.0% utilizando amortiguador TAE y se cortan del gel y purifican utilizando el equipo de extracción en gel QIAquickTM (QIAGEN Inc., Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los fragmentos de ADN amplificados se ligan en pT7/Blue (Invitrogen, Países Bajos), independientemente. La mezcla de ligación después se transforma en E. coli DH12a (GIBCO BRL, Life Technologies, USA) para crear pHUda438 y pHUda439 para una banda amplificada de 0.4 kb y una banda amplificada de 1.0 kb, respectivamente. Los plásmidos resultantes se secuencian y comparan con el gen para glucoamilasa de Aspergill us niger que muestra que los clones codifican para las partes perdidas de la glucoamilasa.

Ejemplo 4 Construcción del Vector de Expresión de pHUda440 El vector de expresión pHUda440 se construye para trascripción del gen para glucoamilasa a partir de Trametes cingula ta . Se realiza una reacción de PCR con el ADN de genoma de Trametes cingula ta como plantilla con un sistema PCR ExpandTM (Roche Diagnostics, Japón) utilizando cebadores TFF para introducir un sitio BamH I y un cebador TFR para introducir un sitio Xho I, como se muestra a continuación. TFF: 5 ' -tttggatccaccatgcgtttcacgctcctcacctcc-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 16) TFR: 5' tttctcgagctaccgccaggtgtcattctg-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 17) La reacciones de amplificación (50 µl) están constituidas de 1 ng de ADN de plantilla por µl, dNTP 250 mM cada uno, cebador TFF 250 nM, cebador TFR 250 nM, 0.1 U de Taq polimerasa por µl en amortiguador IX (Roche Diagnostics, Japón) . Las reacciones se incuban en un equipo DNA Engine PTC-200 (MJ-Research, Japón) programado como sigue: 1 ciclo a 94°C durante 2 minutos; 30 ciclos cada uno a 92°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos; 1 ciclo a 72°C durante 10 minutos y se mantiene a 4°C. Los productos de reacción se aislan en gel de agarosa 1.0% utilizando amortiguador TAE en donde se cortan 2.2 kb de banda de producto del gel y se purifica utilizando el equipo de extracción en gel QIAquickTM (QIAGEN Inc., Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento de ADN amplificado de 2.2 kb se digiere con BamHl y Xhol y se ligan en cásete de expresión de Aspergill us pCaHj483 digerido con BamHl y Xhol. La mezcla de ligación se transforma de E. coli DH12a (GIBCO BRL, Life Technologies, USA) para crear el plásmido de la expresión pHUda440. El plásmido amplificado se recupera utilizando un equipo QIAprepMR Spin MiniPrep (QIAGEN Inc., Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El plásmido pCaHj483 comprende un cásete de expresión basado en el promotor para amilasa II neutro de Aspergillus niger fusionado a una secuencia lider no traducida de triosa fosfate isomerasa de Aspergillus nidulans (promotor Na2/tpi) y el terminador de glucoamilasa de Aspergill us niger ( o terminador AMG) , el marcador selectivo amdS de Aspergill us nidulans que permite el crecimiento en acetamida como fuente única de nitrógeno.

Ejemplo 4 Clonación del gen para glucoamilasa de Pachykytospora papyraceae Con el fin de clonar las partes perdidas del gen para glucoamilasa de Pa chykytospora papyraceae, se lleva a cabo la prueba de gen walking basado en PCR utilizando el equipo de clonación in vitro LA PCRMR (TAKARA, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se digieren 5 µg del ADN genómico de Pachykytospora papyraceae con BamHl, EcoRI, HindIII, PstI, Salí y Xbal, independientemente. Se agregan 200 ml de etanol enfriado con hielo a 50 µl de la mezcla de reacción y después el ADN digerido se recupera por centrifugación a 15,000 x g durante 30 minutos a 4°C. El ADN recuperado se liga con enlazantes artificiales correspondientes suministrados por los fabricantes. El ADN ligado a enlazante se recupera al agregar 200 ml de etanol enfriado con hielo a la mezcla de reacción (50 µl) seguido por centrifugación a 15,000 x g durante 30 minutos a 4°C.

Las reacciones de PCR con el ADN genómico ligado con enlazante de Pachykytospora papyra ceae como platilla se realizan con un sistema LA PCR (TAKARA, Japón) utilizando el cebador Cl y PP5 ' para clonación del gen para 5 ' -glucoamilasa perdido y el cebador Cl y PP3 ' para clonación del gen para 3 ' -glucoamilasa perdido, como se muestra en la siguiente. Cl : 5 ' -gtacatattgtcgttagaacgcgtaatacgactca-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 13) PP5': 5' -cctccctgagtgagcgatgctgc-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 18) PP3': 5' -caactccggcctctcctccagcg-31 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 19) Las reacciones de amplificación (50 µl) están constituidas de 1 ng de ADN plantillas por µl, dNTP 250 mM cada uno, cebador 250 nM, cebador 250 nM, 0.1 U de LA Taq polimerasa por µl en amortiguador IX (TAKARA; Japón) . Las reacciones se incuban en un equipo DNA Engine PTC-200 (MJ-Research, Japón) programado como sigue: 1 ciclo a 94 °C durante 2 minutos; 30 ciclos cada uno a 94 °C durante 0.5 minutos, 55°C durante 2 minuto y 72°C durante 2 minutos; 1 ciclo a 72°C durante 10 minutos y retención a 4°C. Se obtienen bandas amplificadas de 0.5 kb y 0.9 kb a partir del ADN de genoma digerido con Xbal con el cebador Cl y PP5 ' y ADN de genoma digerido con EcoRI con el cebador Cl y PP3', respectivamente. Estos productos de reacción se aislan en un gel de agarosa 1.0% utilizando amortiguador TAE y se cortan del gel y purifican utilizando el equipo de extracción en gel QIAquickTM (QIAGEN Inc., Valencia CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento de ADN amplificado se ligan en pT7Blue (Invitrogen, Países Bajos) independientemente. La mezcla de ligación después se transforma en E. coli DH12a (GIBCO BRL, Life Technologies, USA) para crear pHUda448 y pHUda449 de una banda amplificada de 0.5 kb y una banda amplificada de 0.9 kb, respectivamente. Los plásmidos resultantes se secuencian y comparan con el gen para glucoamilasa de Aspergill us niger, que muestra que los clones codifican para las partes perdidas de la glucoamilasa.

Ejemplo 5 Construcción de vector de expresión pHUda450 Se construye el vector de expresión pHuda450 para trascripción del gen para glucoamilasa Pa chykytospora papyraceae . Una reacción de PCR con el ADN genoma de Pachykytospora papyraceae como plantilla se realiza en un sistema de PCR ExpandTM (Roche Diagnostics, Japón) utilizando cebadores PPF para introducir un sitio BamH I y el cebador PPR para introducir un sitio Xho I, como se muestra en lo siguiente.

PPF: 5 ' -tttggatccaccatgcgcttcaccctcctctcctcc-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 20) PPR: 5 ' -tttctcgagtcaccgccaggtgtcgttctg-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 21) Una cantidad de 50 µl de las reacciones de amplificación está constituida de 1 ng de ADN de plantilla por µl, dNTP 250 mM, cebador PPF 250 nM, cebador PPR 250 nM, 0.1 U de Taq polimerasa por µl en amortiguador IX (Roche Diagnostics, Japón) . Las reacciones se incuban en un equipo DNA Engine PTC-200 (MJ-Research, Japón) programado como sigue: 1 ciclo a 94 °C durante 2 minutos; 30 ciclos cada uno a 92°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos; 1 ciclo a 72°C durante 10 minutos que se mantiene a 4°C. Los productos de reacción se aislan en un gel de agarosa 1.0% utilizando amortiguador TAE en donde se corta una banda de 2.2 kb del gel y se purifica utilizando el equipo de extracción en gel QIAquickTM (QIAGEN Inc., Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento de ADN amplificado de 2.2 kb se digiere con BamHl y Xhol y se ligan en cásete de expresión de Aspergill us pCaHj483 digerido con BamHl y Xhol. La mezcla de ligación se transforma de E. coli DH12a (GIBCO BRL, Life Technologies, USA) para crear el plásmido de expresión pHUda450. El plásmido amplificado se recupera utilizando un equipo QIAprepMR Spin MiniPrep (QIAGEN Inc., Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 6 Expresión de genes para glucoamilasa derivados de Trametes cingula ta y Pachykytospora papyraceae en Aspergillus oryzae Se inocula Aspergillus oryzae cepa BECh-2 en 100 ml de medio YPG se incuba durante 16 horas a 32°C a 80 rpm. Los sedimentos se recolectan y lavan con KCl 0.6 M y se resuspenden en 20 ml de KCl 0.6 M que contienen un producto de ß-glucanasa comercial (GLUCANEXMR, Novozymes A/S, Bagsvasrd, Dinamarca) a una concentración final de 600 µl por ml . La suspensión se incuba a 32°C y 80 rpm hasta que se forman protoplastos y después se lavan dos veces con amortiguador STC. Los protoplastos se cuentan en un hematócitometro y se resuspenden y ajustan en una solución 8.2:0.1 de STC: STPC: DMSO hasta una concentración final de 2.5 x 107 protoplastos/ml. Se agregan aproximadamente 3 µg de pHUda440 o pHUda450 a 100 µl de suspensión de protoplastos, se mezclan suavemente y se incuban en hielo durante 20 minutos. Se agrega 1 ml de SPTC y la suspensión de protoplastos se incuba durante 30 minutos a 37°C. Después de la adición de 10 ml de agarosa superior COVE 50°C, la reacción se vierte en placas de agar COVE y las placas se incuban a 32°C. Después de 5 días se seleccionan los transformantes del medio COVE. Cuatro transformantes seleccionados aleatoriamente se inoculan en 100 ml de medio MS-9 y se cultivan a 32°C durante 1 día. Se incuban 3 ml de medio MS-9 en 100 ml de medio MDU-pH5 y se cultiva a 30°C durante 3 dias. Se obtienen los sobrenadantes por centrifugación a 3,000 x g durante 10 minutos . Se determina la actividad de glucoamilasa en las muestras de sobrenadante como un incremento en la producción de NADH por glucosa deshidrogenasa y reacción con mutarotasa con generación de glucosa y se mide la absorbancia a 340 nm. Se disuelven 6 µl de muestras de enzima en amortiguador de acetato de sodio 100 mM, pH 4.3 y se mezcla con 31 µl de maltosa 23.2 mM en amortiguador de acetato de sodio 100 mM, pH 4.3 y se incuba a 37 °C durante 5 minutos. Después se agregan a la mezcla de reacción 313 µl de reactivo de color (430 U de glucosa deshidrogenasa por litro, 9 U de mutarotasa por litro, NAD 0.21 mM, NaCl 0.15 M en amortiguador fosfato 0.12 M, pH 7.6) y se incuba a 37 °C durante 5 minutos. Se mide la actividad a 340 nm en un espectrofotómetro. Se utilizan 6 µl de agua destilada en lugar de las muestras de enzima como controles.

Las Tablas 1 y 2 muestran las actividades de glucoamilasa de dos transformantes seleccionados, en relación a la actividad de la cepa hospedadora, Aspergillus oryzae BECh-2, la cual se normaliza a 1.0.

Tabla 1. Resultados en matraz de agitación de los transformantes seleccionados que expresan glucoamilasa de Trametes cingula ta Tabla 2. Resultados en matraz de agitación de los transformantes seleccionados que expresan glucoamilasa de Pachykytospora papyracea Ejemplo 7 Evaluación de la glucoamilasa de Trametes cingula ta en fermentaciones de etanol combustible de una etapa Se evalúa por medio de fermentación a miniescala el funcionamiento relativo de glucoamilasa de Trametes cingula ta respecto a la glucoamilasa de Aspergillus niger y la glucoamilasa de Talaromyces emersonii . Se agregan aproximadamente 380 g de maíz molido (triturado en un molino de martillos a escala piloto a través de una malla de 1.65 mm) a aproximadamente 620 g de agua corriente. Esta mezcla se suplementa con 3 ml de penicilina g/l. Se ajusta el pH de esta suspensión a 5.0 con H2S04 40%. Se determina la concentración de sólidos secos (DS, por sus siglas en inglés) por triplicado la cual es de aproximadamente 32%. Aproximadamente 5 g de esta suspensión se agregan a tubos de ensayo de 15 ml . Se lleva a cabo con cada enzima dos veces una curva dosis-respuesta. Las dosificaciones utilizadas son 0.3 y 0.6 nmol/g de DS . Se corren seis duplicados de cada tratamiento. Después de dosificación los tubos se inoculan con 0.04 ml/g de macerado de propagado de levadura (levadura RED STARMR) que se ha hecho crecer durante 22.5 horas en macerado de maiz. Los tubos se tapan con un roscado en la parte superior la cual se ha perforado con una aguja pequeña para permitir la liberación de gas y se someten a remolino brevemente antes de pesado e incubación a 32°C. Se llevan a cabo fermentaciones durante 70 horas y se determinan los rendimientos de etanol al pesar los tubos. Los tubos se someten a remolino brevemente antes del pesado. Los resultados del experimento se muestran en la Tabla 1. Se puede ver de la Tabla 3 que el rendimiento de etanol por gramo de DS es significativamente mayor cuando se utiliza glucoamilasa de Trametes cingula ta en comparación con los rendimientos de las glucoamilasas naturales de Aspergillus niger y Talaromyces emersonii .

Tabla 3 Ejemplo 8 Evaluación de glucoamilasa de Pa chykytospora papyra cea en las fermentaciones de etanol para combustible de una etapa Se evalúan por fermentaciones a mini escala el funcionamiento relativo de la glucoamilasa de Pachykytospora papyra cea respecto a la glucoamilasa de Aspergillus niger y la glucoamilasa de Talaromyces emersonii . Se agregan aproximadamente 380 g de maíz molido (triturado en un molino de martillos a escala piloto a través de una malla de 1.65 mm) a aproximadamente 620 g de agua corriente. Esta mezcla se suplementa con 3 ml de penicilina 1 g/l. Se ajusta el pH de esta suspensión a 5.0 con H2S04 40%. Se determina la concentración de sólidos secos (DS) por triplicado la cual es de aproximadamente 32%. Se agregan aproximadamente 5 g de esta suspensión a tubo de ensayo de 15 ml. Se lleva a cabo con cada enzima dos análisis de dosis-respuesta. La dosificaciones utilizadas son 0.3 y 0.6 nmol/g de DS. Se corren seis duplicados de cada tratamiento. Después de la dosificación los tubos se inoculan con 0.04 ml/g de macerado de propagado de levadura (levadura RED STAR ) que se ha hecho crecer durante 22.5 horas en macerado de maíz. Los tubos se rematan con un tapón roscado en la parte superior el cual ha sido perforado con una aguja pequeña para permitir la liberación de gas y se somete a remolino brevemente antes de pesar e incubación a 32°C. Se llevan a cabo fermentaciones durante 70 horas y se determinan los rendimientos de etanol al pesar los tubos. Los tubos se someten a remolino brevemente antes del pesado. En la tabla 4 se muestra en los resultados del experimento. Como se puede ver de la Tabla 4, el rendimiento de etanol por gramo de DS es significativamente mayor cuando se utiliza la glucoamilasa de Pachykytospora papyracea , en comparación con los rendimientos de las glucoamilasas naturales de Aspergill us niger y Talaromyces emersonii .

Tabla 4 Ejemplo 9 Glucoamilasa de Trametes cingula ta en combinación con a-amilasa A híbrida de Rhizomucor pusillus para fermentación en una etapa Todos los tratamientos se evalúan vía fermentaciones a mini escala . Se agregan 410 g de maíz molido a 590 g de agua corriente. Esta mezcla se suplementa con 3.0 ml de penicilina 1 g/l y 1 g de urea . Se ajusta el pH de esta suspensión a 4.5 con NaOH 5N (pH inicial, antes del ajuste, aproximadamente 3.8) . Se determina la concentración de sólido seco (DS) para que sea 35% . Se agregan a frascos de 20 ml de aproximadamente 5 g de esta suspensión. Cada frasco se dosifica con la cantidad apropiada de enzima seguido por adición de 200 µl de propagado de levadura/5 g de fermentación. Las dosificaciones reales se basan en el peso exacto de la suspensión de maíz en cada frasco. Los frascos se incuban a 32°C. Se corren 9 fermentaciones por duplicado de cada tratamiento. Se seleccionan tres duplicados para los puntos de análisis en el tiempo a las 24 horas, 48 horas y 70 horas. Los frascos se someten a remolino a las 24, 48 y 70 horas. El análisis de punto en el tiempo consiste de pesaje de los frascos y preparaciones de la muestra para CLAP. La preparación de CLAP consiste de detención de la reacción por adición de 50 µl de H2S04, 40%, centrifugación y filtrado a través de un filtro de 0.45 um. Las muestras esperan para análisis por CLAP se almacenan a 4°C. Tabla 5 Enzimas utilizadas en este estudio Ensayo Porcentaje de dosis de AGU/g DS AFAU/g DS # enzima Glucoamilasa a-amilasa A de Glucoamilasa a-amilasa de T. Rhizomucor de T. A de cingulata pusillus cingulata Rhizomucor pusillus 1 100% 0% 0.43 0 2 90% 10% 0.387 0.01 3 80% 20% 0.344 0.02 4 70% 30% 0.301 0.03 5 60% 40% 0.258 0.04 6 45% 55% 0.1935 0.055 7 30% 70% 0.129 0.07 8 15% 85% 0.0645 0.085 9 0% 100% 0 0.1 Nota: Glucoamilasa de T. cingulasa 49 AGU/ml y a-amilasa híbrida de Rhizomucor pusillus (17 AFAU/ml) son enzimas purificadas de Novozymes, Japón. DS = sólido seco.

Resultados En la Tabla 6 se muestran los efectos sinergísticos de a-amilasa y glucoamilasa. Cuando se utiliza glucoamilasa de T. cingulata sola en la fermentación en una etapa, produce 54.1, 81.2 y 99.0 g/l de etanol después de 24, 48 y 70 horas de fermentación, respectivamente. Cuando se utiliza el híbrido de a-amilasa A de Rhizomocur pusillus en la fermentación, produce 90.5, 124.6 y 138.1 g/l de etanol después de 24, 48 y 70 horas de fermentación, respectivamente.

Tabla 6 La relación óptima de glucoamilasa de T. cingulata respecto a la a-amilasa A hibrida de la a-amilasa de Rhizomucor pusillus es de aproximadamente 6.5 AGU/AFAU (véase Tabla 6) . Se observa un funcionamiento esencialmente similar en término de rendimiento de etanol después de 70 horas de fermentación en un intervalo de una relación de 0.76-38.7 de AGU/AFAU, lo que indica un funcionamiento robusto para un intervalo de cociente de actividad amplio de las mezclas de glucoamilasa de T. cingulata respecto a la a-amilasa A.

Ejemplo 10 Extracción de ADN y amplificación por PCR de Leucopaxillus giganteus: Se utilizan 0.2-2 g de la capa formadora de esporas (laminillas) de cuerpos de fruta frescos de Leucopaxillus giganteus para extracción de ADN genómico utilizando el equipo para suelo FastDNA SPIN (Qbiogene, EUA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realiza una reacción de PCR en el ADN genómico con los cebadores degenerados ArAFl y ArAR3 ArAFl 5'-CRTRCTYDVCAACATYGG-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 7) ArAR3 5'-GTCAGARCADGGYTGRRASGTG-3' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 8) en donde D = A o G o T; R = A o G; S = C o G; V = A o C o G; Y = C o T La reacción de amplificación (13 µl) está constituida de 1 µl de solución de ADN genómico, cebador ArAFl 1 µM (25 pmol/µl), cebador ArAR3 1 µM (25 pmol/µl), 11 µl de alargador Hi-Fidelity PCR Master Mix (ABgene, Reino Unido) . La reacción se incuba en un equipo DNA Engine Dyad PTC-0220 (MJ Research, EUA) programado como sigue: 1 ciclo a 94°C durante 2 minutos; 20 ciclos cada uno a 94°C durante 30 segundos, 65°C durante 45 segundos con una disminución en la temperatura de recocido de 1°C por ciclo y 72°C durante 1 minuto a 30 segundos; seguido por 20 ciclos cada uno a 94°C durante 30 segundos, 45°C durante 45 segundos y 72°C durante 1 minuto a 30 segundos; 1 ciclo a 72°C durante 7 minutos; y una retención a 4°C. El producto de PCR se purifica utilizando ExoSAP-IT (USB, EUA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y secuenciado utilizando los cebadores como se utilizan en la reacción de amplificación. La secuencia se compara subsecuentemente con el gen para glucoamilasa de Aspergill us niger que muestra que el producto de PCR codifica para una parte de una glucoamilasa. A partir de la secuencia parcial de la glucoamilasa de Leucopaxill us gigan teus, se obtiene la secuencia de gen con gene walking basado en PCR utilizando el equipo Vectorette de SIGMA-Genosys. La prueba de gene walking se realiza como se describe en el protocolo del fabricante. Se digieren 0.15 µg de ADN genómico de Leucopaxillus giganteus, con EcoRI, BamHl e HindIII, independientemente. El ADN digerido se liga con las unidades Vectorette correspondientes suministradas por el fabricante utilizando un equipo DNA Engine Dyad PCT-0220 (MJ Research, USA) programado como sigue: 1 ciclo a 16°C durante 60 minutos; 4 ciclos, cada uno a 37°C durante 20 minutos, 16°C durante 60 minutos, 37°C durante 10 minutos; seguido por un ciclo a 16°C durante 60 minutos y una retención a 4°C. Las reacciones de ligación posteriormente se diluyen 5 veces con agua estéril. Las reacciones por PCR con el ADN genómico ligado a enlazante de Leucopaxillus giganteus como plantilla se realizan con el equipo DNA Engine Dyad PCT-0220 (MJ Research, USA) programado como sigue: 1 ciclo a 94 °C durante 2 minutos; 40 ciclos, cada uno a 94°C durante 15 segundos, 72°C durante 1 minuto, 72°C durante 1 minuto; 1 ciclo a 72°C durante 7 minutos y una retención a 4°C utilizando el cebador Vectorette suministrado y los cebadores específicos para AMG de Leucopaxillus giganteus NclR2 y NC1F0, respectivamente, como se muestran en lo siguiente. NclR2 : 5 ' -GGTAGACTAGTTACCTCGTTGG-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 31) NclFO : 5 ' -GCTTCCCTAGCCACTGCCATTGG-3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 32) Las reacciones de amplificación (12.5 µl) están constituidas de 0.5 µl de los ADN de genoma ligados a enlazante, cebador Vectorette 400 nM, cebador específico para Leucopaxillus giganteus 400 nM, 11 µl de Extensor Hi-Fidelity PCR Master Mix (ABgene, Reino Unido) . Después de la reacción de PCR, los productos de PCR se purifican utilizando el equipo ExoSAP-IT (USB, EUA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se secuencian y posteriormente se comparan con el gen para glucoamilasa de Aspergillus níger. Se obtiene una banda amplificada de 1.7 kb por la reacción de PCR a partir del ADN genómico digerido con HindIII amplificada con el cebador NclR2. El secuenciado del producto de PCR utilizando el cebador muestra que codifica para las 600 partes de bases restantes del gen para glucoamilasa en la dirección 5'. Se obtiene una banda amplificada de 1.8 por la reacción por PCR a partir del ADN genómico digerido con HindIII amplificado con el cebador NclFO. El secuenciado del producto de PCR utilizando este cebador muestra que codifica para aproximadamente 530 pares de bases del gen para glucoamilasa, no obstante, no llega al fin del gen. Por lo tanto se diseña un cebador se secuenciado adicional NclF2 en base en la secuencia adicional recién obtenida del gen para glucoamilasa. Utilizando NclF2 como un cebador corriente abajo de NclFO para el mismo producto de PCR se demuestra que codifica para las restantes aproximadamente 520 pares de bases del gen para glucoamilasa en la dirección 3'. NclF2 5 ' -GTTGATTTAACTTGGAGCTATGC (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 33) Ejemplo 11 Clonación y expresión de glucoamilasa de Leucopaxill us giganteus A partir de la secuencia parcial de la glucoamilasa de Leucopaxill us giganteus se obtiene más secuencia del gen. Se utilizan los siguientes cebadores de clonación por PCR: Cebador directo: 5'- TCCCTTGGATCCAGGATGCATTTCTCTGTCCTCTC 3 ' ( SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 34) BamHl Cebador inverso 5'- CTTATCCTCGAGCTACTTCCACGAGTCATTCTGG 3 ' (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 35) Xhol Se realiza PCR con ADNg de Leucopaxill us gigan teus como plantilla utilizando Phusion como polimerasa y los cebadores anteriores introduciendo respectivamente BamHl y Xhol. Se prueban 5 µl del producto de PCR en un gel de agarosa 1% y muestra una banda en aproximadamente 2.2 kb. El producto de PCR se purifica en una columna QIAquick. El producto purificado y el vector de Aspergillus PENI2516 Leucopaxillus gigan teus (véase WO 2004/069872) se digieren con BamHl y Xhol. El vector y los fragmentos de inserción se purifican a partir de gel de agarosa preparativo 1% utilizando el método QIAquick. El fragmento de 2.2 kb se digiere en el vector pENl2516 y se transforma en células E. coli TOP10 competentes. El plásmido resultante se denomina PENI3372.

Transformación en Aspergillus niger Se elaboran protoplastos de Aspergillus niger cepa Mbinll9 (véase WO 2004/090155) . Se transforman aproximadamente 5 µg de pENI3372 en los protoplastos. Los transformantes resultantes de Aspergill us niger se prueban para determinar la actividad de glucoamilasa.

Ejemplo 12 Actividad de desramificación hacia pululano de glucoamilasa de Trametes cingula ta Se investigó la actividad desramificadora a-1, 6 de glucoamilasas derivadas de Trametes cingula ta , Athelia rolfsii , Aspergill us niger y Talaromyces emersonii . Se disuelve pululano (peso molecular 50,000-100,000) en agua MilliQ y se agrega a una mezcla de reacción hasta una concentración final 3% que contiene amortiguador NaAc 50 mM, pH 4.0, con dosificación de enzima de 0.42 µg de enzima/mg de pululano a 37 °C. El perfil de oligosacáridos se analiza periódicamente por CLAP. El resultado de la prueba se presenta en la figura 1. La invención descrita y reclamada en la presente no debe considerarse limitada en su alcance por los aspectos específicos descritos en la presente, dado que estos aspectos se pretende que sean ilustraciones de los diversos aspectos de la invención. Se pretende que cualquiera de los aspectos equivalentes esté dentro del alcance de la invención. En realidad, diversas modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en la presente, se volverán evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción precedente. Dichas modificaciones también se pretende que se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. En caso de contradicción prevalecerá la presente descripción, incluyendo las definiciones. Se mencionan en la presente diversas referencias, cuyas descripciones se incorporan como referencia en su totalidad. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa caracterizado porque se seleccionan del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual tiene por lo menos 75% de identidad con los aminoácidos para los aminoácidos de polipéptido maduro, 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2; o (al) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual tiene por lo menos 75% de identidad con los aminoácidos para los aminoácidos de polipéptido maduro, 1 a 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37; (b) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotídica (i) la cual hibridiza bajo condiciones de por lo menos baja rigurosidad con nucleótidos 55 a 2166 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1 o (ii) la cual hibridiza bajo condiciones de por lo menos rigurosidad media con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 55 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii); o (bl) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotídica (i) la cual hibridiza bajo condiciones de por lo menos baja rigurosidad con los nucleótidos 55 a 2166 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 36, o (ii) el cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de rigurosidad media con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 55 a 1737 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 38, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii) ; y (c) una variante que comprende una sustitución, supresión y/o inserción conservadora de uno o más aminoácidos de los aminoácidos 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, o (cl) una variante que comprende una sustitución, supresión y/o inserción conservadora de uno o más aminoácidos de los aminoácidos 1 a 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37.
2. Un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa caracterizado porque se seleccionan del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual es por lo menos 70% idéntica con los aminoácidos para los aminoácidos del polipéptido maduro 1 a 575 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5; o (al) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual es por lo menos 70% idéntica con los aminoácidos para los aminoácidos del polipéptido maduro 1 a 565 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40; (b) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotídica: (i) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad con los nucleótidos 55 a 2189 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4, o (ii) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de rigurosidad media con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 55 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii) ; o (bl) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotídica (i) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad con los nucleótidos 55 a 2182 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 39, o (ii) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de rigurosidad media con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 55 a 1749 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 41, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii); y (c) una variante que comprende una sustitución, supresión y/o inserción conservadora de uno o más aminoácidos de los aminoácidos 1 a 575 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5; o (cl) una variante que comprende una sustitución, supresión y/o inserción conservadora de uno o más aminoácidos de los aminoácidos 1 a 565 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40.
3. Un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa, caracterizado porque que se selecciona del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual tiene por lo menos 60% de identidad con los aminoácidos para los aminoácidos del polipéptido maduro 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26; o (al) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual tiene por lo menos 60% de identidad con los aminoácidos para los aminoácidos del polipéptido maduro 1 a 548 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24; o (a2) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual tiene por lo menos 60% de identidad con los aminoácidos para los aminoácidos del polipéptido maduro 1 a 523 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43; (b) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotídica: (i) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad con los nucleótidos 117 a 2249 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23, o (ii) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 52 a 1719 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 25, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii); (bl) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotidica (i) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 52 a 1620 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 42, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii) ; y (c) una variante que comprende una sustitución, supresión y/o inserción conservadora de uno o más aminoácidos de los aminoácidos 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26; o (cl) una variante que comprende una sustitución, supresión y/o inserción conservadora de uno o más aminoácidos de los aminoácidos 1 a 548 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24; o (c2) una variante que comprende una sustitución, supresión y/o inserción conservadora de uno o más aminoácidos de los aminoácidos 1 a 523 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43.
4. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque consiste de la parte madura de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 2 o 37, respectivamente, o un fragmento de las mismas que tiene actividad de glucoamilasa.
5. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 5 o 40, respectivamente, o un fragmento de las mismas que tiene actividad de glucoamilasa.
6. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque consiste de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 24, 26 o 43, o un fragmento de las mismas que tiene actividad de glucoamilasa.
7. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido es una variante que comprende una sustitución, supresión y/o inserción conservadora de uno o más aminoácidos de los aminoácidos 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o los aminoácidos 1 a 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37.
8. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido es una variante que comprende una sustitución, supresión y/o inserción conservadora de uno o más aminoácidos de los aminoácidos 1 a 575 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 o los aminoácidos 1 a 565 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40.
9. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el polipéptido es una variante que comprende una sustitución, supresión y/o inserción conservadora de uno o más aminoácidos de los aminoácidos 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26 o los aminoácidos 1 a 548 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24 o los aminoácidos 1 a 523 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43.
10. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una región catalítica de los aminoácidos 1 a 455 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o los aminoácidos 1 a 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37.
11. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende una región catalítica que se localiza de los aminoácidos 1 a 475 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 o los aminoácidos 1 a 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40.
12. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende una región catalítica que se localiza desde los aminoácidos 1 a 451 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26 o los aminoácidos 1 a 455 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24 o los aminoácidos 1 a 418 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43.
13. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende dominios de unión que se localizan desde el aminoácido 466 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o los aminoácidos 471 a 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37.
14. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende un dominio de unión que se localiza del aminoácido 485 a 575 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 o los aminoácidos 475 a 565 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40. 15. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende un dominio de unión que se localiza desde los aminoácidos 463 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26 o los aminoácidos 467 a 548 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24 o los aminoácidos 430 a 523 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43. 16. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es codificado por el polinucleótido contenido en el plásmido pHUda595 albergado en E . coli DSM 17106. 17. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque es codificado por el polinucleótido contenido en el plásmido pHUda594 albergado en E . coli DSM 17105. 18. Un polipéptido que tiene afinidad de unión a carbohidrato, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: (a) i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene por lo menos 60% de identidad con los aminoácidos 466 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o los aminoácidos 471 a 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37, respectivamente, ii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene por lo menos 60% de identidad con los aminoácidos 485 a 575 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN
NÚMERO: 5 o los aminoácidos 475 a 565 de la SECUENCIA DE
IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40, respectivamente, iii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene por lo menos 60% de identidad con los aminoácidos 463 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26 o los aminoácidos 467 a 548 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24 o los aminoácidos 430 a 523 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43, respectivamente; (b) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotídica la cual hibridiza bajo condiciones de baja rigurosidad con una sonda polinucleotídica que se selecciona del grupo que consiste de: (i) la cadena complementaria de los nucleótidos 1420 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3 o los nucleótidos 1465 a 1737 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 38, respectivamente; (ii) la cadena complementaria de los nucleótidos 1423 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6 o los nucleótidos 1477 a 1749 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN
NUMERO: 41, respectivamente; (iii) la cadena complementaria de los nucleótidos 1438 a 1719 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN
NÚMERO: 25 o los nucleótidos 1854 a 2249 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23 o los nucleótidos 1339 a 1620 de la
SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 42, respectivamente; (c) un fragmento de los incisos (a) o (b) que tiene una afinidad de unión de carbohidratos. 19. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la afinidad de unión a carbohidratos es afinidad de unión a almidón. 20. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 18 ó 19, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene por lo menos 60% de identidad con los aminoácidos 466 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2, o los aminoácidos 471 a 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37, respectivamente, de manera preferible por lo menos 70% de identidad, de manera preferible por lo menos 80% de identidad, por lo menos 85% de identidad, por lo menos 90% de identidad, por lo menos 95%, preferiblemente por lo menos 96%, de manera más preferible por lo menos 97%, de manera más preferible por lo menos 98% de identidad, de manera más preferible por lo menos 99% de identidad con los aminoácidos 466 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o los aminoácidos 471 a 561 de la
SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37, respectivamente.
21. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque comprende los aminoácidos 466 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o los aminoácidos 471 a 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37, respectivamente.
22. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 18 ó 19, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos la cual tiene por lo menos 60% de identidad con los aminoácidos 485 a 575 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5, o los aminoácidos 475 a 565 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40, respectivamente, de manera preferible por lo menos 70% de identidad, de manera preferible por lo menos 80% de identidad, por lo menos 85% de identidad, por lo menos 90% de identidad, por lo menos 95%, de manera preferible por lo menos 96%, de manera más preferible por lo menos 97%, de manera más preferible por lo menos 98% de identidad o de manera más preferible por lo menos 99% de identidad con los aminoácidos 485 a 575 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 o los aminoácidos 475 a 565 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40 respectivamente .
23. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque comprende los aminoácidos 485 a 575 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 o los aminoácidos 475 a 565 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40, respectivamente.
24. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 18 ó 19, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos la cual tiene por lo menos 60% de identidad con los aminoácidos 463 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26, o los aminoácidos 467 a 548 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24, o los aminoácidos 430 a 523 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43, respectivamente, de manera preferible por lo menos 70% de identidad, de manera preferible por lo menos 80% de identidad, por lo menos 85% de identidad, por lo menos 90% de identidad, por lo menos 95%, de manera preferible por lo menos 96%, de manera más preferible por lo menos 97%, de manera más preferible por lo menos 98% de identidad o de manera más preferible por lo menos 99% de identidad con los aminoácidos 463 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26 o los aminoácidos 467 a 548 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24 o los aminoácidos 430 a 523 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43, respectivamente.
25. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque comprende los aminoácidos 463 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26, o los aminoácidos 467 a 548 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24, o los aminoácidos 430 a 523 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43, respectivamente.
26. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 25, caracterizado porque es una variante artificial la cual comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos una sustitución, supresión y/o inserción de un aminoácido en comparación con los aminoácidos 485 a 575 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 2 o los aminoácidos 471 a 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37, respectivamente; o los aminoácidos 485 a 575 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5 o los aminoácidos 475 a 565 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40, respectivamente; o los aminoácidos 463 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26; o los aminoácidos 467 a 548 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24, o los aminoácidos 430 a 523 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43, respectivamente.
27. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 26, caracterizado porque el polipéptido es una variante artificial la cual comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos una sustitución, supresión y/o inserción de un aminoácido en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada por la parte codificante del dominio que une a carbohidrato de las secuencias polinucleotídicas que se muestran en la posición 1420 a 1725 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3 o los nucleótidos 1465 a 1737 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 38, respectivamente; o la posición 1423 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6 o los nucleótidos 1477 a 1749 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 41, respectivamente; o la posición 1438 a 1719 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 25 o los nucleótidos 1854 a 2249 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23 o los nucleótidos 1339 a 1620 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 42, respectivamente .
28. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 27, caracterizado porque es codificado por una secuencia nucleotídica la cual hibridiza bajo condiciones de baja rigurosidad, preferiblemente condiciones de rigurosidad media, preferiblemente bajo condiciones de rigurosidad alta, con una sonda polinucleotídica que se selecciona del grupo que consiste de: (i) la cadena complementaria de los nucleótidos 1420 a 1725 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3 o los nucleótidos 1465 a 1737 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 38, respectivamente; (ii) la cadena complementaria de los nucleótidos 1423 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6 o los nucleótidos 1477 a 1749 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 41, respectivamente; (iii) la cadena complementaria de los nucleótidos 1438 a 1719 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 25 o los nucleótidos 1854 a 2249 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23 o los nucleótidos 1339 a 1620 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 42, respectivamente.
29. Un polipéptido híbrido que tiene actividad de glucoamilasa caracterizado porque consiste de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, en donde la región enlazante se ha sustituido con el enlazante que se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 22.
30. Un polinucleótido que tiene una secuencia nucleotídica caracterizado porque codifica para el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29.
31. Una construcción de ácido nucleico caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 30 unido operablemente a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un hospedador de expresión.
32. Un vector de expresión recombinante caracterizado porque comprende la construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 31.
33. Una célula hospedadora recombinante caracterizada porque comprende la construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 31 o un vector de expresión recombinante de conformidad con la reivindicación 32.
34. Un método para producir un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, caracterizado porque comprende: (a) cultivar una célula, la cual es una forma natural que es capaz de producir el polipéptido bajo condiciones que llevan a la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.
35. Un método para elaborar un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, caracterizado porque comprende: (a) cultivar una célula hospedadora, que comprende una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotidica que codifica para el polipéptido bajo condiciones que llevan a la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.
36. Un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene actividad de glucoamilasa, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual tiene por lo menos 75% de identidad con los aminoácidos del polipéptido maduro 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 2 ; o (al) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual tiene por lo menos 75% de identidad con los aminoácidos de un polipéptido maduro 1 a 561 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37; (b) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 55 a 2166 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1; o (bl) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 55 a 2166 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 36; (c) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 55 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3; o (cl) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 55 a 1737 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 38; (d) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotídica: (i) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad con los nucleótidos 55 a 2166 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 1, o (ii) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de rigurosidad media con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 55 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 3, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii), o (di) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotídica: (i) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad con los nucleótidos 55 a 2166 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 36, o (ii) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de rigurosidad media con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 55 a 1737 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 38, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii) .
37. Un polinucleótido que codifica para un polipéptidos que tiene actividad de glucoamilasa, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual tiene por lo menos 75% de identidad con los aminoácidos de un polipéptido maduro 1 a 575 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5; o (al) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual tiene por lo menos 75% de identidad con los aminoácidos de un polipéptido maduro 1 a 565 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 40; (b) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 55 a 2189 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4; o (bl) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 55 a 2182 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 39; (c) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 55 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6; o (cl) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 55 a 1749 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 41; (d) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotidica: (i) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad con los nucleótidos 55 a 2189 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 4, o (ii) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de rigurosidad media con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 55 a 1725 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii), o (di) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotidica: (i) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad con los nucleótidos 55 a 2182 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 39, o (ii) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de rigurosidad media con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 55 a 1749 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 41, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii) .
38. Un polinucleótido que codifica para polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual tiene por lo menos 60% de identidad con los aminoácidos del polipéptido maduro 1 a 556 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 26; o (al) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual tiene por lo menos 60% de identidad con los aminoácidos de un polipéptido maduro 1 a 548 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24; o (a2) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual tiene por lo menos 60% de identidad con los aminoácidos de un polipéptido maduro 1 a 523 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 43; (b) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 117 a 2249 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23; o (c) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 52 a 1719 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 25; o (cl) un polinucleótido que tiene por lo menos 60% de identidad con los nucleótidos 52 a 1620 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 42; (d) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotídica: (i) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad con los nucleótidos 117 a 2249 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23, o (ii) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 52 a 1620 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 42, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii) , o (di) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia nucleotidica: (i) la cual hibridiza bajo condiciones por lo menos de baja rigurosidad con la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos 52 a 1719 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 25, o (iii) una cadena complementaria de los incisos (i) o (ii) .
39. Un procedimiento para la elaboración de un producto de fermentación a partir del material que contiene almidón, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) licuar el material que contiene almidón en presencia de la a-amilasa; (b) sacarificar el material licuado obtenido en la etapa (a) utilizando una glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29; (c) fermentar el material sacarificado utilizando un organismo fermentador.
40. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el producto de fermentación se recupera después de la fermentación, preferiblemente por destilación.
41. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 39 ó 40, caracterizado porque la etapa (b) y (c) se llevan a cabo de manera secuencial o simultánea (es decir, un proceso SSF) .
42. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 41, caracterizado porque el producto de fermentación es etanol.
43. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 42, caracterizado porque el material inicial que contiene almidón son granos completos, preferiblemente granos completos de maíz o trigo.
44. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 43, caracterizado porque el organismo fermentador es una cepa de Sa ccharomyces .
45. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 44, caracterizado porque comprende además, antes de la etapa (a), las etapas de: x) reducir el tamaño de partícula del material que contiene almidón; y) formar una suspensión que comprende el material que contiene almidón y agua.
46. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la suspensión se calienta por encima de la temperatura de gelatinización.
47. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la suspensión se cocina a chorro a una temperatura entre 95-140°C, preferiblemente 105-125°C durante 1-15 minutos, preferiblemente durante 3-10 minutos, de manera especial aproximadamente 5 minutos.
48. Un procedimiento para producir un producto de fermentación a partir de material que contiene almidón, caracterizado porque comprende: (a) sacarificar material que contiene almidón con una glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-29 y/o que tiene: (i) la secuencia que se muestra como aminoácidos 1 a 556 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2 o los aminoácidos 1 a 561 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 37; o una glucoamilasa que tiene por lo menos 75% de identidad con la misma, y/o ii) la secuencia mostrada como aminoácidos 1 a 575 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 5 o los aminoácidos 1 a 565 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 40; o una glucoamilasa que tiene por lo menos 70% de identidad para la misma, y/o (iii) la secuencia mostrada como los aminoácidos 1 a 548 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 24 o los aminoácidos 1 a 556 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 26 o los aminoácidos 1 a 523 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 43 o una glucoamilasa que tenga por lo menos 60% de identidad con la misma, a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización inicial del material que contiene almidón, (b) fermentación utilizando un organismo fermentador .
49. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque se lleva a cabo durante un período de 1 a 250 horas, de manera preferible es de 25 a 190 horas, de manera más preferible de 30 a 180 horas, de manera más preferible de 40 a 170 horas, incluso de manera más preferible de 50 a 160 horas, de manera aún más preferible de 60 a 150 horas incluso de manera aún más preferible de 70 a 140 horas y de manera mucho más preferible de 80 a 130 horas.
50. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 48 ó 49, caracterizado porque se lleva a cabo a un pH en el intervalo entre 3 y 7, preferiblemente de 3.5 a 6 o de manera más preferible de 4 a 5.
51. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 50, caracterizado porque el contenido de sólido seco (DS) se encuentra en el intervalo de 20-55% en peso, de manera preferible 25-40% en peso, de manera más preferible 30-35% en peso.
52. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 51, caracterizado porque la concentración de azúcar se mantiene a un nivel por debajo de aproximadamente 6% en peso durante la sacarificación y fermentación.
53. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 52, caracterizado porque se prepara antes de la etapa (a) una suspensión que comprende agua y material que contiene almidón.
54. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 53, caracterizado porque el material que contiene almidón se prepara al reducir el tamaño de partícula del material que contiene almidón a un tamaño de partícula de 0.1-0.5 mm.
55. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 53, caracterizado porque la reducción del tamaño de partícula del material que contiene almidón se realiza por molido.
56. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 55, caracterizado porque el material que contiene almidón es almidón granular.
57. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 55, caracterizado porque el material que contiene almidón son granos completos.
58. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 57, caracterizado porque la sacarificación y fermentación se llevan a cabo simultáneamente.
59. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque la temperatura durante la sacarificación y fermentación simultáneas, o la fermentación en la etapa (b) es entre 28°C y 36°C, por ejemplo entre 29°C y 35°C, por ejemplo entre 30°C y 34°C, por ejemplo a aproximadamente 32°C.
60. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 59, caracterizado porque la glucoamilasa está presente en una cantidad de 0.001 a 10 AGU/g DS, preferiblemente de 0.01 a 5 AGU/g DS, especialmente 0.1 a 0.5 AGU/g DS .
61. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 60, caracterizado porque está presente una a-amilasa.
62. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la a-amilasa es una a-amilasa micótica preferiblemente derivada del género Aspergillus, especialmente una cepa de A . niger, A . oryzae , A . awamori o Aspergill us kawachii o del género Rhizomucor, preferiblemente una cepa de Rhizomucor pusillus o el género Meripilus, preferiblemente una cepa de Meripilus gigan teus .
63. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque la a-amilasa micótica es una enzima híbrida que comprende un dominio catalítico (CD) de a-amilasa y un módulo/dominio de unión a carbohidratos (CBM) y opcionalmente un enlazante de un dominio catalítico (CD) de a-amilasa acida micótica natural y un módulo de unión de carbohidrato (CBM) y opcionalmente un enlazante .
64. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque la a-amilasa híbrida se selecciona del grupo de la variante de Fungamyl con el dominio catalítico JAI18 y SBD de Athelia rolfsii (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 28), a-amilasa de Rhizomucor pusill us con el enlazante AMG de Athelia rolfsii y SBD (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 29), a-amilasa de Meripilus gigan teus con el enlazante de glucoamilasa de Athelia rolfsii y SBD (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 30) .
65. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque la a-amilasa híbrida es a-amilasa de Aspergill us niger con un enlazante de Aspergillus kawa chii y el dominio de unión a almidón (SBD) .
66. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61 a 64, caracterizado porque la a-amilasa está presente en una cantidad de 0.01 a 10 AFAU/g DS, de manera preferible 0.1 a 5 AFAU/g DS, especialmente 0.3 a 2 AFAU/g DS.
67. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 66, caracterizado porque la a-amilasa y la glucoamilasa se agregan en una relación de entre 0.1 a 10 AGU/AFAU, de manera preferible 0.30 y 5 AFAU/AGU, especialmente entre 0.5 y 3 AFAU/AGU.
68. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 67, caracterizado porque también se agrega otra glucoamilasa.
69. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque la otra glucoamilasa se selecciona del grupo que consiste de glucoamilasa de Aspergillus niger, glucoamilasa de Athelia rolfsii y glucoamilasa de Ta laromyces emersonii , o una mezcla de las mismas .
70. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 69, caracterizado porque el producto de fermentación se recupera después de la fermentación.
71. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 70, caracterizado porque el producto de fermentación es un alcohol, preferiblemente etanol, especialmente etanol combustible, etanol potable y/o etanol industrial.
72. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 71, caracterizado porque el material que contiene almidón se obtiene de tubérculos, raices, tallos, frutos, semillas o granos completos.
73. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 72, caracterizado porque el material que contiene almidón se obtiene de maíz, mazorcas, trigo, cebada, centeno, kafir, sagú, mandioca, manioca, tapioca, sorgo, arroz o papas.
74. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 73, caracterizado porque el material que contiene almidón es almidón granular.
75. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 74, caracterizado porque la temperatura durante la sacarificación en la etapa (a) es de 30°C a 75°C, de manera preferible entre 45 y 60°C.
76. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 75, caracterizado porque la etapa (a) y (b) se llevan a cabo secuencialmente o de manera simultánea (es decir, fermentación en una etapa) .
77. Un procedimiento para elaborar un jarabe a partir de material que contiene almidón, caracterizado porque comprende : (a) licuar el material que contiene almidón en presencia de una a-amilasa, (b) sacarificar el material que se obtiene en la etapa (a) utilizando una glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29.
78. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque comprende además refinado, conversión y/o recuperación del jarabe.
79. El uso de una glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29 para la elaboración de un jarabe y/o un producto de fermentación.
80. El uso de conformidad con la reivindicación 79, en donde el material inicial es material que contiene almidón gelatinizado o no gelatinizado.
81. El uso de una glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29 para elaboración de cerveza .
82. Una composición caracterizada porque comprende una glucoamilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29.
83. La composición de conformidad con la reivindicación 82, caracterizada porque comprende además una a-amilasa .
84. La composición de conformidad con la reivindicación 83, caracterizada porque la a-amilasa es una a-amilasa acida, preferiblemente una a-amilasa acida micótica.
85. La composición de comformidad con la reivindicación 83 u 84, caracterizada porque la a-amilasa es de origen micótico.
86. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 83 a 85, caracterizada porque la a-amilasa se deriva del género Aspergill us , preferiblemente una cepa de A. niger, A . oryzae, Aspergill us awamorí o A . kawachii del género Rhi zomucor, preferiblemente una cepa de Rhizomucor pusillus o el género Meripilus, preferiblemente una cepa de Meripil us gigan teus .
87. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 83 a 85, caracterizada porque la a-amilasa es un híbrido preferiblemente una variante de Fungamyl con dominio catalítico JA118 y SBD de Athelia rolfsii (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 28), a-amilasa de Rhizomucor pusillus con el enlazante AMG y SBD de Athelia rolfsii (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 29), a-amilasa de Meripilus gigan teus con el enlazante de glucoamilasa de Athelia rolfsii y SBD (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 30) .
88. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 82 a 87, caracterizada porque comprende además otra glucoamilasa.
89. La composición de conformidad con la reivindicación 88, caracterizada porque la glucoamilasa se deriva del género Aspergill us , preferiblemente una cepa de Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori , o el género Athelia , preferiblemente una cepa de Athelia rolfsii , el género Talaromyces, preferiblemente una cepa de Talaromyces emersonii o el género Rhizopus, tal como una cepa de Rhi zopus nivius o del género Humicola , preferiblemente una cepa de Humicola grísea , var. thermoidea.
90. La composición de conformidad con la reivindicación 88 u 89, caracterizada porque comprende una glucoamilasa derivada de glucoamilasa de Trametes cingula ta , a-amilasa derivada de a-amilasa de Rhizomucor pusillus con enlazante AMG y SBD de Athelia rolfsii y glucoamilasa derivada de Talaromyces emersonii .
91. La composición de conformidad con la reivindicación 88 u 89, caracterizada porque comprende la glucoamilasa derivada de Trametes cingula ta , a-amilasa derivada de a-amilasa de Rhi zomucor pusillus con enlazante AMG y SBD de Athelia rolfsii y glucoamilasa derivada de Aspergillus niger.