JPS59140896A - カララ属のカビの生産する酵素を用いた澱粉の糖化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は澱粉の糖化法に関１−１詳；７くはカララ属に
属するカビの生産する澱粉分解酵素を澱粉に作用させて
グルコースを得ることよりなる澱粉の直接糖化法に関す
るものである。

澱粉の糖化に際しては通常澱粉を一度糊化；−１α−ア
ミラーセヲ用いて澱粉糊を液化ｊ−て後にり゛ルコアミ
ラーゼを添加してブドウ糖の生産を行っている。しか（
７、この方法では澱粉を糊化する際にエネルギーを必要
とする。そこで、このようなエネルギーの消費を可及的
に少なくすることを目的として、生澱粉に直接作用でき
るアミラーゼの検索が最近特に活発に行われるようにな
ってきた。

たとえばバイオマス資源としての各種澱粉を用いて燃料
用アルコールを生産する場合には、省エネルギー的な澱
粉糖化法が必須の条件となる。生澱粉の酵素分解反応に
ついてはすでに上田等、林田等、パーク等の研究が知ら
れている。

上田等は古くから黒麹（’Ｂｌａｃｋ　Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ。

９−・ツーｍｏｒ〕、）の生産するグルコアミラーゼを
用いて生澱粉分解反応を研究してきた。（Ｓ、　Ｕｅｄ
ａ。

Ｙ＋Ｋｏｂａ、　　Ｊ、　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５８．　ｒ’ｈ　３＊２３７　
（１９８０ｊ；　Ｓ、　Ｕｅｄａｓｔ′ａ１．　Ｒｉｏ
ｔｅｃｈ。

］Ｈｏｅｎｇ、、Ｖｏ１．２３．２９１　（１９８１）
　）。

林田等にアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐ、　ａｗａ
−一−ＩＶ−−−訃−―■−−−−−響 一社−）の生産するアミラーゼはアスペルギルス・オリ
ゼー（Ａｓｐ、　ｏｒｙｚａｅ−）の生産するアミラー
ゼあるいは麦芽アミラーゼに比較ｌ〜て生澱粉をよく分
解することを報告している。また、Ｙ、　Ｋ、　Ｐａｒ
ｋ。

ｅｔ　ａｌ　（Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｂｉｏｅｎｇ、　２
４−、４９５　（１９８２）　）もアスペルギルス−ニ
ガーやアスペルギルス−アワモリのグルコアミラーゼに
よる無蒸煮アルコール醗酵についての研究結果を述べて
いる。

しかし、これらアスペルギルス・ニガーやアスペルギル
ス・アワモリ、さらにはリゾプス（Ｒｈ１ｚｏｐｕｓ　
）属のグルコアミラーゼを用いる生澱粉の糖化について
の未解決の最大の問題点は、これらの酵素の生澱粉分解
速度が糊化澱粉に比較１゜て著１．　＜低いことである
。換言子れば、酵素活性が高くても生澱粉分解活性は著
しく低いということである。通常、糊化澱粉の分解速度
の１／３０の速度で生澱粉を分解できる酵素は生澱粉分
解酵素として有望と考えられている（　Ｓ、　Ｕｅｄａ
、ワークショップ１１炭水化物資源と７（イオテクノロ
ジニー″Ｐ。２５．１９８２　　食品総合研究所主催、
国連大学後援）。

本発明者等は、広く土壌中および木材寄生菌から微生物
の検索を進め、糊化澱粉分解速度／生澱粉分解速度＝１
０以下のものを求めるため約２０００株の微生物を検索
し、この条件に適合するもの数珠を得た。この菌株はカ
ララ（Ｃｈａｌａｒａ　）属に属するもので、この菌株
が分泌する酵素は酵素反応の機作からグルコアミラーゼ
に類似するものである。カララ属の生産するこの澱粉分
解酵素は、微酸性領域に広い活性安定域を有し、生澱粉
の分解活性が従来のグルコアミラーゼに比して著（２く
高く、糊化澱粉分解活性／生澱粉分解活性＝６．５〜５
であり、従半の公知のグルコアミラーゼに比較すると著
Ｌ　＜高く、本酵素を用いることにより、生澱粉分解の
工業的工程を有利に行えることを見出し、本発明を完成
するに至った。

すなわち本発明はカララ属に属するカビの生産する澱粉
分解酵素を澱粉に作用させてグルコースを得ることより
なる澱粉の糖化方法゛である。

本発明において用いる微生物はカララ属に属し、生澱粉
分解能の高い酵素を生産する能力を有するカビであれば
よく、その代表例と＋７てカララ・）ぐラドキザ（ｑ吠
仄１に包ｘａ−）　ＰＮＳ　−８０株がある。本菌株の
菌学的性質を［菌類図Ｆｉ”ＦＪ椿啓介、宇田用俊−他
著、講談社すイエンテイフイク）に基いて検討した。結
果を以下に示す。

菌学的性質 ａ）形態 ＋１）菌糸より直立する分生子柄を形成（７、長円筒形
で２〜３個の隔壁を有する。

■　フイアロ型分生子を形成１ｙ　、形状に円筒もしく
はたる型のもので平均１２×４μの大きさをもつ。

■　褐色状もｔ、　＜　Ｕ灰黒色の厚膜胞子を形成し、
表層に平滑あるいはいぼ状の外壁でおおわれる。

ｂ）生育状況 ｄ）麦芽寒天培地に発育］２、灰色、灰黄色の綿毛状に
生育する。生育後期には更に暗色になる。

（の　可溶性澱粉１係、ポリペプトン１係、肉□　エキ
スＱ、７％の培地に発育し、上記■と同様の綿毛状に生
育する。

以上の形態学的特徴および生育状況から考えて本菌株バ
カラン・パラドキサであると同定することが至当である
。本菌株は微工研にＦＥＲＭ　　Ｐ−６８６８と（７て
寄託されている。

次に、カララ属のカビを用いて目的とする酵素を生産す
るには、本菌株を通常の好気的液体培養せたは通気攪拌
培養を行えばよい。ここで使用する培地としては種々の
ものがあり、たとえば炭素源としては生澱粉を用いて目
的とする酵素の誘導を行うため、コーン、馬鈴薯、甘藷
、キ４′ツサノ（。

ワキシーコーン、米、小麦、サゴ、ｌ・イアミロースコ
ーン等の生澱粉やＤＥ　１０〜２５の澱粉部分加水分解
物を２〜７％の割合で用いることが好ましい。窒素源と
１〜ては、ペプトン、肉エキス、コーン・ステイープ・
リカー、ペプチド含有物など各種のものを単独あるいは
適宜組合せて用いる。

その他必要に応じ少喰の無機塩、たとえばＮ　ａ　Ｃ１
。

Ｆｅ５０．、　Ｂａ（ＯＨ）、、　ＦｅＣｌ３・６Ｈ２
０，５ｒＣｔ２・６Ｈ２０゜ＬｉＣ１、Ｍｇ５ｏ、−７
Ｈ２０、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２０などを適当に添加した培
地が使用される。

この培地に上記菌株を接種し、ｐＨ４〜８．５にて２５
〜４０′Ｃで２４〜９６時間程度好気的に培養すること
によって目的とする酵素を生成蓄積せしめることができ
る。

本発明に用いる酵素としては、上記の如くカララ属に属
する澱粉分解酵素生産菌を栄養培地に培養して得られる
培養液を用いることができるほか、培養濾液、培養濾液
濃縮物およびこれらから誘導される精製物、すなわち各
段階の酵素製品等を使用することができる。

培養液から酵素を採取・精製する方法としては、従来各
種の培養物からその含有酵素を採取、精製するために知
られた常法を適宜使用することができる。たとえば培養
濾液を減圧また限外ｅ過にて濃縮する方法、硫安、硫酸
ソーダ、食塩等で塩析する方法、生澱粉による特異吸着
法、メタノール。

エタノール、アセトン等による分画沈澱法。

ＤＥＡＥ−セファデックス、イオン交換樹脂によるクロ
マトグラフィー、等電点沈澱、電気透析法等の中独ある
いは組み合せによる精製が可能である。

本酵素の活性測定は、生コーンスターチ２０■。

［１１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）　Ｉｌｌ　２〜Ｉ、
酵素液０、２　”　＋純水１．６　ｍｌを加えて４０Ｃ
，３０分反応を行い、生成するグルコースをソモギーネ
ルソン法で測定し、この条件下で毎分１μｍｏｌｅ　（
１８０μデ）のグルコースを生成する酵素活性を１単位
とした。

また、糊化澱粉の分解活性については、可溶性澱粉２％
溶液（０，２５ｄ）を用いて同様の実験を行い、生成す
る還元糖を測定１−１同様に表示した。

以下に本酵素の理化学的性質を示す。なお、酵素として
は培養濾液を限外濾過したものを用いた。

（１）作用および基質特異性 本酵素はトウモロコシ、馬鈴薯、米、甘藷。

ワキシーコーン、サゴ、タピオカの生および糊化澱粉に
作用し、還元糖を生成する。この還元糖ヲペーパークロ
マトグラフイーおよび高速液体クロマトグラフィーで測
定したところ、２糖類以上のオリ□ゴ糖が生ずることな
く、反応初期よりグルコースを生成、蓄積している８こ
のととまり本酵素ｆ′１ｅｘｏ−型に澱粉を分解するグ
ルコアミラーゼであると考えられる。

（２）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲の測定を０．２　Ｍ酢酸緩
衝液（ｐＴ（３〜５．０’）、）リス・マレート緩衝液
（’ｐＨ５，５〜８．５）および炭酸グーダ緩衝液（ｐ
Ｈ９，０〜Ｉ　Ｏ，０）を用い、４０Ｃ１５０分間、生
澱粉に対ｌ、て反応させることにより行った。結果は第
１図および第２図の通りである。

（６）　　至適温度および温度安定性 至適温度および温度安定性は、各温度に３０分処理１７
た際の残存する酵素活性により示す。

糊化１．た可溶性澱粉を基質として用いた実験結果に第
３１図および第４図に示した。本酵素利ハ１の本来の目
的は生澱粉に作用させることなので作用温度は酵素の安
定温度域にある。

（４）　　共存イオンの影響 Ｃａイオンを添加することにより糊化澱粉糖化活性の熱
安定性は約５Ｃ上昇する。

本酵素を生澱粉および／または糊化澱粉に作用させるこ
と例よってグルコースを得ることができる。

なお、本酵素の生産菌と（７てはカラン・パラドキザ？
ｓ　−’ｓ　ｏのほかに、たとえばカラン・フラジ・エ
レガンス（Ｃ，ｅｌｅｇａｎｓ　）　＋カラン０ミフデ
ルマ（Ｃ，ｍｙｃｏｄｅｒｍａ−）　、カララークエレ
イナ　　・（−ら姐虹蛙竺）などがある。

本発明によれば、澱粉を直接糖化することができるので
□、バイ°オマス資源と′１．ての各種の澱粉を原料と
１．てアルご−ル等の有用物質を簡便、かつ効率的に製
造することが可能である。特に、本発明に用いるｉ素は
生澱粉の分解活性が高いので、工業的利用に適したもの
である。

次に、本発明を実施例により説明する。

実施例１ コーン・ステイープ・リカー６５１．肉エキス７ｙ。

１！！−塩３１−９硫酸第１鉄５００■を含む培地（ｐ
Ｈ４、０）　１．１３を５１フラスコにとり、殺菌した
。殺菌終了後、予め１００Ｃで乾熱殺菌したサゴ澱粉４
０？を加え、さらにカラ２・パラドギサＰＭＳ−８０株
（ＦＥＲＭ　　ｐ−６ａ６ｅ　　）をスラントより１白
菌耳接種して３０ｒで５日間振盪培養した。

培養終了後、菌体および未反応の澱粉を遠心分離（−て
除き、上澄を粗酵素液（生澱粉分解活性ｔ　ＯＩＵ／ｍ
／　）として用いた。

ワキシーコーンスターチ、コーンスターチ、小麦澱粉２
．５ｆ！をそれぞれ別々の三角フラスコにとり、本酵素
液をそれぞれ２．５　ｍｌ加えた。さらに、０．１Ｍ酢
酸緩衝溶液（ｐＨ４，５）　２５ｍｌと純水２００　ｍ
ｌを加えて３０Ｃで振盪培養し、生成するグルコースを
ソモギーネルソン法で測定した。

２４時間反応後、コーンスターチは分解率６８係、、ワ
キシーコーンスターチＵ８５．５％、小麦澱粉ｆ１７６
．３％であり、生成糖をペーパークロマトグラフィーで
検討したところ、ブドウ糖のみであった。

実施例２ 培地組成をコーン・ステイープ・リカー６５Ｆ。

食塩３１放射線殺菌を行ったタピオカ澱粉７０？に代え
て実施例１と同じ菌株を培養した。、培養終了後、培養
液に２倍量のエタノールを加えて酵素を沈澱させた。こ
の沈澱５０■にα１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４−５）５０ｍ
／と純水２００　ｍ／を加えた。以下、実施例１と同じ
方法により米澱粉。

馬鈴薯澱粉およびサゴ澱粉の分解を行ったところ、２４
時間後に米澱粉は８９％、馬鈴薯澱粉は１１係、甘藷澱
粉は４８．６　％の分解率を示１〜た。

実施例３ コーン・ステイープ・リカー６５ｚ、肉エキス７１ｉ’
、　Ｎａ（Ｊ　３　Ｆおよび硫酸第１鉄５００　ｍ９を
含む培□地（ｐＨ４，０）１ノを５ノフラスコにとり殺
菌１７た。殺菌終了後、予め放射線殺菌ｊ−たサゴ澱粉
７０９−を加え、さらに実施例１と同じ菌株をスラント
より１白菌耳接種して６日間振盪培養した。

培養終了後、遠心分離して上澄液を得、て粗酵素（ｔ６
１Ｕ／ｍｌ）と１−て以下の生澱粉分解反応に用いた。

米澱粉、ワキシーコーンスターチおよび小麦澱粉をそれ
ぞれ５グ・ずつ秤りとり、別々の三角フラスコに入れた
後、本酵素液をそれぞれ２５ｍｇおよび（１１Ｍ酢酸緩
衝液（ｐＨ４，５）　２５ｍｔ、純水２００　ｍｌを加
え、３０Ｃで４８時間振盪培養した。

生成するグルコースをソモギーネルソン法で測定した。

それぞれの分解率に米澱粉８６％、ワキシーコーンスタ
ーチ８６％、トウモロコシ澱粉８６係であった。

実施例４ 実施例乙の基質である米澱粉、ワキシーコーンスターチ
および小麦澱粉をタピオカ澱粉、甘藷澱粉に代えたこと
以外はすべて実施例３に記載の方法と同一の方法によっ
て生澱粉分解を行ったところ、タピオカ澱粉ｉｊ　８９
．８％、甘藷澱粉は８４係分解された。

実施例５ 実施例３の基質をサゴ澱粉、馬鈴薯澱粉に代えたこと以
外はすべて実施例乙の記載の方法と同一の方法によって
生澱粉分解を行ったところ、分解率はサゴ澱粉５２％、
馬鈴薯澱粉３５％であった。

【図面の簡単な説明】

第１図はカラ２・パラドキサＰＮＳ−８０株（ＦＥＲＭ
　　Ｐ−６８６８）の生産する酵素の各ｐＨにおける活
性を示すグラフであり、本酵素を可溶性澱粉に４０ｔｌ
’で６０分間反応を行った際の相対活性値である。 第２図に各ｐＨで酵素液を４ＤＣで６０分間処珪１〜だ
後の残存活性を測定１〜たｐＨ安定曲線である。 第３図はカラ２・パラドキサＰＮＳ−８０株（ＦＥＲＭ
　　Ｐ　−６８６８）の産生ずる酵素の至適温度を示す
曲線であり、各温度で３０分間反応を行った際の相対酵
素活性である。第４図は温度安定性を示すもので、各温
度で３０分間処理した後の残存活性を示すものである。 第１図 ｐＨ 第２図 ３　　４　　５　６　　７　　８　　９　１０Ｈ 第３１￥１ 第４Ｎ 侃　唐　１　”ｒ　１ 手続袖正書（自発） 昭和５９年５月１３日 特許庁長官　若杉和夫　殿 １、　事件の表示 特願昭５８−５５６４ ２　発明の名称 カララ属のカビの生産する酵素を用いた澱粉の糖化法＆
　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 農林水産省食品総合研究所長 ４、代理人 〒１０４ 東京都中央区京橋１丁目１番１０号 西勘ピル５階 （７４ｏ　７）弁理士　久保田藤部 電話（２７５）０７２１番 ５、　補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の榴 ６、　補正の内容 （１）明ａＩ書第１０頁６行目と７行目の間に次の文を
加入する。 「（５）　　分子猷（ＳＤＳ電気泳動によシ測定）８２
，０００品の比活性 生澱粉に対して　　　　１３．３工Ｕ／Ｑ糊化澱粉に対
して　　　４２．４工Ｕ／Ｉｇ（７）　　金属イオン、
阻害剤および賦活剤の影響Ｂａ０４　　　　　　　　１
０５　　　　　　　　　９　ＢＬｉ、Ｓｏ、　　　　　
１００　　　　　１００Ｎ１０４　　　　　　　　１０
０　　　　　　　　　９ＢＭｇＳＯ４１ｏ０　　　　　
　　　　９７０ａＣ４９９１００ ＺｎＳ０４　　　　　　　　　９８　　　　　　　　　
９７Ｐｅｓｏ４　　　　　　　　　９７　　　　　　　
　　９８０ｕＳ０．　　　　　　　　　　９，０　　　
　　　　　　８７Ｍｎ５Ｏ４８７８５ ＡｇＮＯｓ　　　　　　　　　　ａｓ　　　　　　　　
　　７５Ａ４（Ｓｏ、）、　　　　　７９　　　　　１
　ＢＦｅ０４　　　　　　　　　．７９　　　　　　　
　　　７ＨｇＯ４４５２１ Ｓｒ０４　　　　　　　　１１５　　　　　　　　　９
９阻害剤および賦活剤 ヨードアセトアミド　　　　　９９　　　　　　　　　
８４ＰＯＭＥ　　　　　　　　　　　９９　　　　−　
　　　　　７８無　　　　　　　　　１００　　　　　
　　１　ＱＱンスプイン　　　　　　　　　１１５　　
　　’　　　　　　　１４０　　　　Ｊ（２）　　同第
１１頁８行目の１１白菌耳」を「１白金耳」に訂ｉＥす
る。 （３１同第１１頁１４行目の「２．５ｉｌＪを［２５ｍ
１　ｊに訂正する。 （４）　　同第１２頁５行目の「食塩３ｇ」と「放射線
殺菌」との間に「、」　を加入する。 （５）　　同第１２頁１１行目の「サゴ澱粉」を１甘藷
澱粉」に訂正する。 （６）　　同第１２頁最終行の「１白菌耳」を「１白金
耳」に訂正する。 （７）　　同、第１５頁１１行目の「トウモロコシ澱粉
」を１小麦澱粉」に訂正する。 （以上）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｔカララ属のカビの生産する澱粉分解酵素を澱粉に作用
   させてグルコースを得ることを特徴とする澱粉の糖化法
   。 ２、カララ属のカビがカララーパラドキサ（Ｃｈａｌａ
   ｒａｐａｒａｄｏｘａ　）　ＰＮＳ　−８０（ＦＥＲＭ
   　Ｐ　−６８６８）で−ある特許請求の範囲第１項記載
   の糖化法。 ３、酵素がカララ属のカビの培養液、培養濾液。 培養濾液濃縮物およびこれらから誘導さ第１る精製物の
   いずれかである特許請求の範囲第１項記載の糖化法。 ４、澱粉が生澱粉および／または糊化澱粉である特許請
   求の範囲第１項記載の糖化法。