KR840000946B1

KR840000946B1 - 인슐린 전구체의 제조방법

Info

Publication number: KR840000946B1
Application number: KR1019810000989A
Authority: KR
Inventors: 힐 프랭크 브루스
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니; 아더 알 웨일
Priority date: 1980-03-27
Filing date: 1981-03-26
Publication date: 1984-07-01
Also published as: AR224933A1; RO81951A; EP0037255A1; DK149863C; CA1154435A; EP0037255B1; DE3161475D1; FI810917L; PL230292A1; EG15310A; GB2073204B; FI810917A7; AU6871981A; NZ196609A; NO151898B; AU540644B2; KR830005251A; GR73517B; ES500747A0; IE51172B1

Abstract

내용 없음.

Description

인슐린 전구체의 제조방법

본 발명은 다음 일반식의 인슐린 전구체의 제조방법에 관한 것이다.

상기 일반식에서

R은 수소, 화학적 또는 효소적으로 분해 가능한 아미노산 잔기 또는 2이상의 아미노산 잔기를 가진 화학적 또는 효소적으로 분해 가능한 펩타이드 부분이고

Y는 ―Lys―Z―이고(여기에서 Z는 Ala, Thr 또는 Ser임).

(B-29) (B-30)

A-1 내지 A-21의 부분은 인슐린 A쇄이고

B-1 내지 B-30의 부분은 인슐린 B쇄이고

X는 A-1의 아미노 그룹에서 인슐린 A-쇄와 B-29의 ε-아미노그룹 또는 B-30의 카복실 그룹에서 인슐린 B-쇄에 결합된 부위이며 이 부위는 분열이 없이 A-쇄 및 B-쇄로 부터 효소적 또는 화학적으로 분리될 수 있다.

지난 수년간 인슐린의 합성 또는 반합성 제법에 대해 다양한 연구를 해왔다. 인슐린은 2개의 펩타이드쇄즉 21의 아미노산 잔기를 함유한 A-쇄와 30의 아미노산 잔기를 함유한 B-쇄를 가진 분자이다.

이들 쇄에는 각각 2개의 시스테이닐 잔기로 부터 형성된 3개의 디설파이드 브리지가 함유되어 있다. 2개의 디설파이드 브리지는 A-쇄가 B-쇄에 결합되어 있다. 브리지는 A-6 및 A-11, A-7 및 B-7 A-20 및 B-19에서 각기 시스테이닐 잔기로 부터 형성된다.

인슐린을 제조하는 하나의 일반적 방법은 프로인슐린 또는 프로인슐린 의사 분자를 통하는 것이다. 프로인슐린은 단일쇄 폴리펩타이드이며 여기에서 인슐린 A-쇄의 N-말단을 인슐린 B-쇄의 C-말단으로 연결된 펩타이드를 통해 결합되어 있으며 적합한 시스테인 잔기는 디설파이드 결합에 의해 결합되어 있다. 인체 프로인슐린(아미노산 잔기 86개를 가짐)은 이중 35개가 펩타이드에 연결되어 있다. 야나이하라 등 [Diabetes 27 (Suppl 1) 149-160(1978)]은 다양하게 연결된 펩타드 및 인체 프로인슐린의 합성에 대해 발표하였다.

가타 프로인슐린-의사 분자는 문헌에 기술되어 있으며 프로인슐린과의 근본적인 차이는 인슐린 A-및 B-쇄가 연결되고 이러한 지점을 갖는 부분의 구조에 있다. 따라서 버세등은 카보닐 그룹에 의해 N-말단에서 연결된 2개의 메틸오닐 잔기 및 A-1글리실의 Nα-말단과 N-29리실의 Nε-말단에서 연결된 생성 부위가 함유되어 있는 결합에 대해 발표하였다[Biochemistry 15, No 8, 1649 1657 (1976)]. 유사하게 기타의 결합 부위에 대해서도 문헌에 발표된 바 있다.

[참조 : Geiger et al., Biochem. and Biophys. Reo. Comm. 55, 60-66(1973), Brandenburg et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. bd. 354, 613-627(1973), 미국특허 제3,847,893호, 제3,907,763호, 제3,883,496호, 제3,883,500호 및 제3,884,897호].

특정된 부분을 통해 연결된 인슐린 A- 및 B-쇄를 함유한 단일 쇄를 거쳐 인슐린을 제조하는 이들 방법은 어느 것이나 인슐린 A- 및 B-쇄의 직접 내부 연결을 A- 및 B-쇄에 존재하는 6개의 시스테이닐 잔기로 부터 3개의 디설파이드 브리지 형성 방법으로 수행해야 된다. 디설파이드 결합을 형성시킨후 원래의 연결 부분은 인슐린 형성으로 제거된다.

인슐린 제조를 수행함에 있어서 정확한 디설파이드 브리지 형성에 효과적이고 간편한 방법이 가장 바람직하다. 일반적으로 디설파이드 브리지를 형성하는, 문헌에 기술된 방법은 사응하는 -SH 구조를 공기산화하는 방법이다. 더욱이 -SH구조가 불안정한 것으로 알려져 있기 때문에 통상적으로 전구체는 S-보호그룹, 전형적으로는 S-설포네이트(-S-SO₃-)부분으로 발생된다.

따라서 문헌에 기술된 방법은 그 단계 서열 즉 메르캅탄으로 처리한 후 이어서 형성된 -SH화합물을 공기 산화함으로써 S-설포네이트를 -SH로 환원시키는 것이다. S-설포네이트를 목적한 디설파이드 인슐린 전구체로 직접 전환시키는 간편하고 효과적인 방법을 발견하였는데 이 방법은 산화-환원 서열이 포함되어 있지는 않다.

대신에, 필수적인 것은 아니나 산화제 부재하의 바람직한 조건하에, 직접 교환이 수행된다. 그러나 인슐린 A- 및 B-쇄의 결합 및 S-설포네이트 인슐린 전구체로 부터 디설파이드 형성을 하지 않는 일반적으로 2단계 방법으로 수행되는 선 기술에 있어서 하나의 예외적인 가능성은 디옥산 등 [Natnre 188, 721-724(1960)]에 대해 제시된 바 있으며 이것은 단일 용액중에 A- 및 B-쇄 S-설포네이트의 결합에 의한 인슐린 생성을 암시해주고 있다. 상기 선기술의 방법은 매우 불완전하며 회수된 생성물의 작용성만을 기준으로 한 수율은 겨우 1 내지 2%일 뿐이다. 이후 디옥산은 혐기성 S-설포네이트 환원후, 디설파이드로 산화하는 2단계 공정을 발표하였다. [Proc. Intern, Congr. Endocrinal 2nd London 1964, 1207-1215 (1965) Table Iv, p.1211].

본 발명에 따라 다음 일반식이 S-설포네이트를 수용성 매질중에서 각 -SSO₃-잔기당 약 1 내지 5-SH잔기를 얻을 수 있는 량의 메르캅탄과 pH 7 내지 11.5에서 수용설 매질 ml당 약 10mg까지의 S-설포네이트 농도로서 반응 시킴을 특징으로 하여 상기 일반식(Ⅰ)의 인슐린 전구체 제조방법을 얻게된다.

상기 일반식에서

R, X 및 Y는 상기에서 정의된 바와 같다.

본 명세서에서 “인슐린 전구체”는 (1) 인슐린 A-쇄 및 인슐린 B-쇄를 함유하고 (2) 각기 (a) A-6 및 A-11, (B) A-7 및 B-7 및 (C) A-20 및 A-19에서 A- 및 B-쇄에 위치한 각 Cys 잔기내의 황이 결합된 3개이상의 디설파이드 결합을 갖고 (3) A-1에서 아미노그룹의 인슐린 A-쇄와 B-29에서 리신 잔기의 ε-아미노그룹 또는 B-30에서 아미노산 잔기의 카복실 그룹의 인슐린 B-쇄에 결합된 제거 가능한 연결 부분을 가진 분자를 말한다. 인슐린의 B-30 아미노산 잔기를 정의한 Z그룹은 Ala, Thr 또는 Ser이다.

이들 잔기는 천연적으로 발생되는 인슐린, 인체 인슐린에서 Thr 소 및 돼지 인슐린에서 Ala, 토끼 인슐린에서 Ser을 나타낸다. R그룹은 수소, 아미노산 잔기 또는 2개 이상의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드 부분이다. R이 아미노산 잔기 또는 펩타이드 부분인 경우 R은 잔류 인슐린 구조의 손실이 없이 본발명의 공정에 따른 인슐린 전구체 생성물로 부터 분리 가능한 그룹이다. 펩타이드 부분의 광범위한 범위의 모든 아미노산 잔기가 R그룹의 정의내에 포함된다. 분리 가능한 아마노산 잔기의 예를들면 알기닌(Arg) 또는 리신(Lys) 및 아미노산 잔기에 의해 카복실에서 말단화한 펩타이드 부분과 같은 염기성 아미노산이다. 이들 잔기는 단백질 분해 효소 트립신으로 처리함에 따라 분리가 용이한 것으로 알려져 있다. 분리 가능한 아미노산 잔기의 다른 예로서는 메티오니 (met) 및 카복시 말단 Met가 있는 펩타이드 부분이 있다. 이들 잔기는 시아노겐 브로마이드로 처리하여 제거할 수 있다. 또다른 예를들면 트립토판(Trp) 또는 카복시 말단에 Trp이 함유된 펩타이드 부분이 있다.

이 잔기는 N-브로모석신 이미드로 처리함에 따라 제거된다. 인슐린 전구체 및 직쇄 S-설포네이트 인슐린 전구체의 연결 부위 X는 광범위한 구조를 갖는다. 바람직하기는 부분 X는 폴리펩타이드이다.

일반걱으로 폴리펩다이드는 아미노산 잔기 2이상, 바람직하기는 2내지 35, 가장 바람직하기는 6내지 35개를 갖는다. 부분X는 A-1의 아미노산그룹에서 A-쇄와 B-30의 카복실 그룹에서 B-쇄에 결합되어 있다. 가장 바람직하기론 X가 펩타이드인 경우, 연결부위 X는 인슐린 전구체의 천연 연결 펩타이드기 때문에 일반적으로 인슐린의 상기 펩타이드는 결합된 A- 및 B-쇄 하나 또는 양자에 의해 표시된다.

천연적으로 발생되는 연결 펩타이드의 예를들면 다음과 같다.

토 끼 : -Arg-Arg-Glu-Val-Glu-Glu-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Ala-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Gly-Leu-Gln-Pro-Ser-Ala-Leu-Glu-Ala-Leu-Gln-Lys-Arg-.

인 체 : -Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-.

원숭이 : -Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-.

말 : -Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Ala-Gly-Pro-Glu-Gln-Lys-Arg-.

쥐 : -Arg-Arg-Glu-Val-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Pro-Gln-Leu-Glu -Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Glu-Ala-Gly-Asp-Leu-Gln-Thr-Leu-Ala-Leu-Glu-Val-Ala-Arg-Gln-Lys-Arg-.

쥐 : -Arg-Arg-Glu-Val-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Ala-Gln-Lau-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Asp-Leu-Gln-Leu-Ala-Leu-Leu-Glu-Val-Ala-Arg-Gln-Lys-Arg-.

돼 지 : -Arg-Arg-Glu-Val-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Ala-Gln-Leu-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Asp-Leu-Gln-Thr-Leu-Ala-Leu-Glu-Val-Ala-Arg-Gln-Lys-Arg-.

소, 양 : -Arg-Arg-Glu-Val-Glu-Gly-Pro-Gln-Val-Gly-Ala-Leu-Glu-Leu-Ala-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Gly-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-Lys-Arg-.

개 : -Arg-Arg-Asp-Val-Glu-Leu-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Gly -Gly-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Len-Glu-Gly-Ala-Leu-Gln-Lys-Arg.

몰못트 : -Arg-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Glu-Gln-Thr-Glu-Leu-Gly-Met-Gly-Ala-Gly-Gly-Leu-Gln-Pro-Leu-Gln-Gly-Ala-Leu-Gln-Lys-Arg.

친친라 : -Arg-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Gly-Gln-Ala-Asp-Pro-Gly-Val-Val-Pro-Glu-Ala-Gly-Arg-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Met -Thr-Leu-Gln-Lys-Arg-.

오 리 : -Arg-Arg-Asp-Val-Glu-Gln-Pro-Leu-Val-Asn-Gly-Pro-Leu-His-Gly-Glu-Val-Gly-Glu-Leu-Pro-Phe-Gln-His-Glu-Glu-Thr-Gln-Lys-Arg-.

A-1에서 A-21, X 및 B-1에서 B-30에 의해 표시된 아미노산 서열은 A-쇄, 연결 펩타이드 및 돼지, 송아지 또는 인체프로인슐린의 B-쇄 가장 바람직하기는 인체 인슐린의 B-쇄에 있어서 천연적으로 발생되는 서열이 아주 바람직하다.

상술한 바와 같이 천연의 연결 서열을 사용하는 것이 바람직하지만 더 짧은 펩타이드 서열을 연결 펩타이드에 사용할 수 있다. (1) 연결 펩타이드는 A- 및 B-쇄 사이의 적합한 디설파이드 결합이 형성되기에 충분한 길이라 (2) 인슐린 현성을 수반하는 인슐린 전구체로부터 분리될 수 있는 요건이 필요하다. 사용할 수 있는 전형적인 디펩타이드는 -Arg-Arg-이다.

이밖에도 일반식 Arg-X'-Arg-(여기에서 X'는 하나 이상의 아미노산 잔기임)를 갖는 상기 변형 디펩타이드는 용이하게 사용할 수 있다. 매우 바람직하게 연결된 펩타이드는 -Arg-Arg-Lys-Arg- 및 구조식 -Arg-Arg-X₂-LYs-Arg-(여기에서 X₂는 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하기는 아미노산 잔기 2개임)를 갖는 장쇄 펩타이드이다. 후자의 펩타이드는 상술한바 있는 수많은 천연펩타이드도 포함된다.

상기 정의된 범위내에 속한 기타의 연결 부위이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 연결 부위가 폴리펩타이드 경우 연결점은 A-쇄(A-1)의 아미노말단 및 B-쇄 (B-30)의 카복실 말단이다. 그러나 B-29아미노산 잔기(Lys)에 ε-아미노 그룹이 함유되어 있기 때문에 연결부위는 A-1 및 B-29에서 아미노그룹울 거쳐 A- 및 B-쇄에 결합할 수 있다. 따라서 카보닐비스(메티오닐) (By Busse et al., Supra), 2,2'-설포닐비스(에톡시카보닐) [by Obermeier et al., Hoppe-Sayler's Z. physiol. Chem 356, 1631-1634(1975)], 2,7-디아미노 수베로일(by Geiger et al., Supra)등은 후자의 펩타이드에 있어서 유효한 연결 부위가 된다.

본 발명의 방법을 수행함에 있어서 선형 S-설포네이트 인슐린 전구체는 pH7내지 11.5의 수용성 매질중에서 메르캅탄으로 처리한다. 여기에서 메트캅탄은 적어도 하나의 -SH 그룹이 함유된 화합물을 말한다. 본 발명의 방법에서 사용된 메르캅탄은 수 가용성인 것만으로 제한한다. 전형적인 수가용성 메르캅탄의 예를들면 디티오트레이톨, 디티오에리트리톨, 2-메르캅토에탄올, 메틸티오글리콜레이트, 3-메르캅토-1,2-프로판디올, 2-메르캅토프로피온산 등이 있다. 디티오트레이톨과 같은 다수의 -SH그룹을 가진 메르캅탄을 사용할 수 있으나 한개의 -SH그룹을 가진 메르캅탄을 사용하는 것이 바람직하다.

이중 2-메르캅토 에탄올이 가장 바람직하다.

본 발명의 방법은 일반적으로 적합한 완충제를 첨가하여 목적한 pH가 유지되는 수용성 매질중에서 수행한다. 매질의 pH는 7내지 11.5이다. 그러나 9.5내지 10.5의 pH가 바람직하다. 그러므로 상술한 범위내의 완충농도를 가진 완충제이면 어느 것이나 본 발명의 공정에서 사용될 수 있다. 적합한 완충제의 예를들면 인산염 완충제, 트리(하이드록시메틸) 아미노메탄(Tris), 붕산염 완충액, 글리신등이 있다. 일반적으로 수용성 매질중의 완충제의 농도는 0.5N까지이나, 바람직한 범위는 0.005N 내지 0.5N, 더욱 바람직하기는 0.005N 내지 0.1N이다.

선형 S-설포네이트 인슐린 전구체는 ml당 10mg이하의 농도로 수용성 매질중에 혼입시킨다. 바람직하기는 농도가 낮은 경우이며 일반적으로 ml당 0.05mg 내지 2mg이 함유된다.

본 발명 방법에서 중요한 요인은 직쇄 S-설포네이트 인슐린 전구체에 사용된 메르캅탄의 량이다. S-설포네이트를 -SH로 환원시키는 선기술의 방법에서는 S-설포네이트에 대해 대단히 많은량의 메르캄탄을 사용하였다. S-설포네이트가 상응하는 -SH화합물로 완전히 환원되는데 있어서 이러한 과량의 메르캅탄은 S-설포네이트 출발물질에 비해 압도적으로 필요함이 명백히 나타났다. 이로인해 -SH 중간물질의 분리 또는 반응 혼합물의 많은 희석에 이어 -SH 중간물질의 분리 또는 반응 혼합물의 많은 희석에 이어 -SH 중간물질을 목적한 -S-S-화합물로 전환시킴에 있어서 일반적으로 공기를 사용하는 각 산화 단계를 필요로 하게 된다. [참조 : Crestfield et al., J.Biol, Chem. 238, 622-627(1963), Steiner et al., Proc. Nat'l Acad U.S.A 60, 622-629(1968) and Yanaihard et al., Diabetes 27(Suppl. 1), 199-160(1978)].

이에 대해 본 발명의 방법에서는 각 -SSO₃-잔기당 1 내지 5의 -SH 잔기, 바람직하기는 -SSO₃-잔기당 2 내지 약 2내지 4의 -SH 잔기를 부여할 수 있는 량의 메르캅탄만이 필요하다.

메르캅탄을 상기 범위내의 량으로 사용할 경우 고도의 효율로서 용이하게 선형 S-설포네이트 인슐린 전구체를 목적한 디설파이드 인슐린 전구체로 직접 전환시킬 수 있음을 발견하였다. 선형 S-설포네이트 인슐린 전구체의 일부로서 존재하는 인슐린 A- 및 B-쇄에 6개의 S-설포네이트 그룹이 함유하기 때문에 상수한 범위내로 하기 위해서, 한개의 -SH 그룹이 함유된 메르캅탄을 6 : 1 내지 30 : 1의 몰비로서 사용해야 한다. 본 발명의 발명을 수행함에 있어서 선형 S-설포네이트 인슐린 전구체의 pH, 완충강도 및 농도와의 관계는 필수적인 것은 아니다 중요한 의미를 갖고 있다.

일반적으로 선형 S-설포네이트 인슐린 전구체의 pH 및 농도는 증가되고 완충 강도는 감소되는 것이 바람직하다. 더욱이 선 기술의 방법과 분명한 차이점은 본 발명의 방법을 수행함에 있어서 산화 대기하의 조건은 필수적인 것이 아니라는데 있다. 반응 매질중에 산화제(예, 공기)가 존재할 수 있으나 공기 또는 기타 산화제의 실제적인 부재하에 반응을 수행하는 것이 매우 바람직하다는 것을 알게 되었다.“실제적인 부재”는 공기를 실제로 첨가하는 것을 피하는 것 만을 의미한다. 예를들면 공기 또는 기타 산화제의 이용이 차단된 폐쇄된 장치내에서 반응을 수행함으로써 상기 목적을 달성할 수 있다. 공기를 더욱 차단하기 위해서는 수용성 매질에 질소를 통과시키고 반응물의 첨가전에 탈기시킨다.

본 발명의 방법에서 필수적인 것은 아니지만 또다른 중요한 점은 온도 조절을 하는 것이다. 일반적으로 반응 공정은 0 내지 37℃에서 수행하나, 바람직하기는 일반적으로 2 내지 8℃, 특히 4 내지 6℃이다. 그러나 더욱 바람직하기는 공정을 두 온도 범위에서 수행하는 것이다. 반응 혼합물을 실온에서 제조하고 일단 제조된 생성물을 2 내지 8℃의 온도로 냉각시킨 다음 나머지 반응 기간 동안을 8℃로 유지시킨다.

그러므로 전형적으로 본 발명의 방법을 수행하는 데 있어서 pH를 조절한 수용성 매질은 0.05N 농도에서 글리신을 사용하여 제조한다. 제조된 수용성 매질은 일반적으로 0내지 37℃의 온도로, 바림직하기는 실온으로 유지시키고 탈기 및 질소를 도입한 다음 다시 탈기한다. 선형 S-설포네이트 인슐린 전구체는 목적산 농도를 제공할 수 있는 량 예를들면 매질의 0.1mg/ml를 수용성 매질중에 용해 시킨다. 메르캅탄은 -SSO₃- 그룹당 5-SH 그룹을 얻을수 있는 량을 가한다. 공기 또는 기타 산화제의 부재하에 유지시킨 반응 혼합물을 4내지 6℃로 냉각하고 반응이 완결될때 까지 상기 범위내의 온도로 유지시킨다.

일반적으로 반응시간은 5내지 72시간, 더 일반적으로는 15내지 24시간, 통상적으로는 18내지 20시간이 소요된다. 반응시간이 경과된 후 인슐린 전구체 생성물은 인슐린 정제 분야에서 알려져 있는 광범위한 방법중의 한가지 방법에 의해 분리할 수 있다. 가장 통상적으로 사용되는 방법은 크로마토그라피적 방법 예를 들면 겔 여과 및 이온 교환 크로마토그라피 법이다.

생성된 인슐린 전구체는 문헌에 밝혀져 있는 방법으로 효소적 또는 화학적으로 인슐린으로 전환할 수 있다. 이들 방법은 문현에 기술된 바와 같이 트립산 및 카복시펩티다제 B를 혼합 사용하여 분리시킬 수 있다. [Kemmler et al., J. Biol. Chem. 146, 6786-6791(1971)].

인슐린 생성물은 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법, 아미노산분석, 방사선 수용체 분석, 방사선, 면역분석, 고성능액체 크로마토 그래피(HPLC), 자외선 스펙트럼, 단실화반응, 토끼 혈증 글루코즈 분석등과 같은 기지 방법에 의해 순도 및 상대 작용도를 분석할 수 있다. 선형 S-설포네이트 인슐린 전구체 출발물질은 재결합 DNA방법에 의해 사용된다.

이들 물질은 천연의 인슐린 및 프로인슐린 및 분류학적 펩타이드 합성 방법 또는 용액 또는 고체상 방법으로 부터 제조할 수 있다. 선형 S-설포네이트 인슐린 전구체는 프로인슐린으로 부터 다음과 같이 제조한다. 100ml의 냉각된 탈이온화 7M 우레아에 786㎎의 아황산나트륨을 가한다. 용액을 잘 교반하고 나트륨 테트라티오네트 (594㎎)를 가한다. 교반한 후 대부분의 나트륨 테트라 티오네이트가 용해되나 용액은 혼탁해진다. pH를 빙초산을 가해 7.7로 조정하고 HPLC 정제소의 프로인슐린(503㎎)을 교반하면서 가한다. 반응 용액의 pH를 2N 수산화나트륨으로 7.6으로 조정하고 얻어진 약간 혼탁된 용액을 6℃에서 18시간 동안 교반한다. 반응 혼합물 약 1/2에 2N 수산화 나트륨을 가해 pH 9.1로 조정하고 세파덱스 G-25 코스컬럼에 넣는다. 크로마토그라피의 조건은 다음과 같다.

용매 : 0.05M 중탄산암모늄, pH : 9.0, 컬럼크기 : 2×90㎝, 온도 21℃, 유속 : 18.5ml/분. 120ml의 초기 유출액은 버린 다음 이후의 유출액 75ml를 합한다. 컬럼을 400ml의 0.05M 중탄산암모늄, pH 9.0으로 세척한다. 이 조작을 상기 반응 용액의 나머지반으로 반복한다.

두개의 획분을 UV분광 분석한 결과 총 401mg이 회수되었다. 두 획분을 합하고 동결 건조시킨다. 총 445.7mg의 건조된 탈염 생성물을 모은다. 출발물질 부재의 생성물 즉 선형 S-설폰화 소의 프로인슐린은 셀룰로즈 아세테이트 전기영동법 및 폴리아크릴아미드 디스크-겔 전기 영동법에 의해 확인한다. 선형 S-설폰화 소의 프로인슐린은 DEAE 셀룰로즈 크로마토그라피에 의해 정제한다. 불순한 시료(443mg)를 10ml의 7.5M 우레아-0.01M 트리스-0.001M EDTA, pH8.5에 용해하고 DEAE 셀룰로즈 컬럼에 넣는다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같다.

용매 : 7.5M -우레아 0.01M 트리스-0.001M EDTA, pH8.5, 경사 용매 0-0.35M 염화나트륨, 컬럼크기 2.5×90cm, 온도 : 4℃, 유속 : 0.9ml/분, 획분용적 : 5.3ml. 획분수에 대해 플롯트한 각 획분의 276nm에서의 흡광은, 다소 늘어진 대형 피크를 나타내었다. UV분광 분석에서 대형 피크는 생성물을 나타내었다. 유출 용적 1069-1291ml인 획분 199-240을 합하고 UV분광 분석한 결과 이 시료중 355mg이 나타났다.

생성 혼합물을 세파덱스 G-25코스 컬럼상에서 탈염한다. 크로마토그라피 조건은 다음과 같다. 용매 : 0.05M 중탄산나트륨, pH:8.5, 컬럼크기 3.7×105cm, 온도 : 4℃, 유속 : 16.0ml/분, 초기 395ml의 유출액은 버리고 다음 유출액 250ml를 모은다. 컬럼을 2000ml의 0.05M 중탄산나트륨, pH8.0으로 세척한다. 유출액의 UV분광 분석결과 이 시료중 321mg이 나타났다. 시료를 동결 건조시킨다. 총 373mg의 무수물질을 모은다. 생성물의 확인은 폴리아미드 디스크겔 전기 영동법 및 용출 위치를 기준으로 한 고성능 저압 액체 크로마토그래피로 수행한다.

다음 실시예는 본 발명의 방법을 설명한 것이고 이로써 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

[실시예 1]

1.61mg의 선형 S-설포네이트 소의 프로인슐린을 16.1ml의 탈기된 0.05M 글리신, pH9.5에 녹인 용액을 제조한다. 이 용액에 0.158ml의 수용성 2-메르캅토-에탄올 저장용액을 가한다. 이 용액은 엘만시약으로 적정한 결과 메르캅탄 농도가 2.11mg /ml으로 나타났다. 이것은 선형 S-설포네이트 소의 프로인슐린 중에 -SSO₃-당 2-메르캅토 에탄올 4당량이 된다.

최종 pH는 9.46이고 실온에서 제조된 용액을 파라 필름으로 밀봉한후 6℃에서 19시간 동안 냉각하면서 교반해준다. 반응 혼합물을 진한 염산 및 0.5N 수산화나트륨으로 pH 4.0±0.1(온도조정)로 산성화한다. 생성물을 분리하고 고성능 저압 액체 크로마토그래피로 확인한다. HPLPLC 조건은 다음과 같다.

컬럼 : LP-1/C₁₈(166% C함유)로 충진된 1.1×54cm 유리컬럼, 용매 30%

아세토니트릴/70%(0.1M 암모늄 포르메이트, pH4.25) 온도 : 21℃, 압력 8028g/㎠, 유속 : 2.40ml/분 시료를 5ml 시료-루프 주입기로 컬럼에 가하고 280nm에서 검색한다. 0.1mg/ml의 단백질 농도를 가진 5ml의 소 프로인슐린 저장용액을 첫번째 시료로 사용하였다. 사용된 두번째 시료는 5ml의 산성화된 반응 혼합물이다. 반응 혼합물중의 다량체성 소 프로인슐린의 함유 여부는 용출 위치를 기준으로 하여 확인한다. 수행한 두 HPLPLC의 피크 면적을 계산한 결과 반응 혼합물중의 소프로인슐린의 수율은 82.6%이었다.

50.14ml의 탈기된 0.05M 글리신, pH10.51에 용해한 25.07mg의 선형 S-설포네이트 소프로인슐린 용액을 제조한다. 이 용액에 1.302ml의 수용성 2-메르캅토-에탄올 저장용액을 가하는데 이 용액을 엘만시약으로 적정한 결과 메르캅탄의 농도가 2.10mg/ml으로 나타났다. 이것은 선형 S-설포네이트 소프로인슐린 중에 -SSO₃-당 20메르캅토에탄올 2.1당량이 된다.

최종 pH는 10.47이다. 실온에서 제조된 용액을 파라필름으로 밀봉한 후 6℃에서 18시간 동안 냉각하면서 교반한다. 반응 혼합물을 진한 염산 및 0.1N 염산을 사용하여 pH4.0±0.1(온도 조정)로 산성화한다. HPLPLC에 의해 분석한 결과 반응 혼합물중의 소프로인슐린의 수율은 69%이었다.

탐염후 생성물을 겔여과 크로마토그라피로 분리시킨다. 반응 혼합물을 진한 수산화암모늄으로 pH9.0으로 조정하고 세파덱스 G-25코스 컬럼에 가한다. 탈염화 크로마토그라피 조건은 다음과 같다.

용매 : 0.05M : 중탄산암모늄, pH : 9.0, 컬럼크기 : 2×90㎝, 온도 21℃, 유속 : 18.5ml/분. 초기120ml의 유출액은 버리고 다음의 유출액 75ml를 모은다(단백질 획분). 컬럼을 0.05M 중탄산암모늄, pH 9.0으로 세척한다. 단백질 회분을 uv분광 분석한 결과 단백질 21.6mg이 회수되었다.

획분을 동결 건조한다. 총 22.21mg의 건조된 탈염 단백질이 회수되었다. 이 물질일부(1.48mg)를 5.5ml의 1.0M아세트산에 용해한다. 투명한 용액을 UV분광 분석한 결과 2.56mg/ml의 단백질 농도가 나타났다. 이 용액 5ml(12.8mg,uv에 의해)를 세파덱스 G-50 수퍼파인 컬럼에 가한다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같다.

용매 : 1M 아세트산, 컬럼크기 : 1.5×100㎝, 온도 21℃, 유속 : 0.19ml분, 획분용적 : 약 1.9ml컬럼을 1M 아세트산으로 하루밤 용출한 후 280nm에서의 흡광도를 검색하였다. 그래프상에 2개의 피크가 나타났다. 첫번째 소형 피크는 응집된 형태의 소프로인슐린을 나타내고, 두번째 피크는 단량체성 소프로인슐린을 나타내었다. 두개 피크상의 획분을 합한다. 합한 획분 및 유출용적은 다음과 같다.

유출액 Ⅰ : 획분 30-46(55.0-84.0ml, 피크 70.4ml)

유출액 Ⅱ : 획분 47-62(84.0-112.0ml, 피크 99.8ml)

분광 분석한 결과 유출액 Ⅰ은 1.94mg 및 유출액 Ⅱ는 10.11mg이었다. 총 12.05mg(회수율 94.1%)을 컬럼에 가한다. 회수된 총량중 단량체성 소프로인슐린은 83.9%이었다. 상기 2개의 유출물을 동결 건조한다. 유출액 Ⅱ증의 생성물 HPLPLC를 가하며 용출 위치 기준으로 소프로인슐린으로서 확인되었다. 소프로인슐린을 제조하는 데는 문헌에 기술된 방법에 따라 트립신 및 카복시 펩티다제로 처리하여 확인할 수도 있다.

[실시예 3]

실예시 1의 방법을 사용하여 선형 s-설포네이트 소프로인슐린으로 부터 소프로인슐린의 수율에 온도가 미치는 효과를 측정한다. 반응 조건은 다음과 같다. 단백질 농도 : 0.1mg/ml, 완충액 : 0.05M 글리신. pH : 9.5, 메르캅탄 : _SSO₃-당 4당량의 -SH를 제공하는 량의 2메르캅토 에탄올·시간 : 18시간 응반을 21℃에서 수행하는 경우 HPLPLC에 의해 측정된 프로인슐린의 수율은 47%이다. 반응물은 21℃에서 혼합하는 경우 혼합물의 온도를 6℃로 낮추면 수율은 77%이다.

[실시예 4]

실시예 1의 방법을 사용하여 동시에 수행되는 일련의 반응에서 선형 s-설포네이트 소 프로인슐린으로 부터 소프로인슐린의 수율에 pH가 미치는 효과를 측정한다. 반응 조건은 다음과 같다. 단백질 농도 : 0.5mg/ml, 완충액 : 0.05M 글리신, 메르캅탄 : -SSO₃-당 2당량의 -SH를 제공하는 량의 2-메르캅토에탄올, 시간 : 18시간, 온도 : 6℃. HPLPLC에 의해 측정된 프로인슐린의 수율은 다음과 같다.

[실시예 5]

실시예 1의 방법을 사용하여 동시에 수행되는 일련의 반응에서 선형 s-설포네이트 소프로인슐린으로 부터 소프로인슐린의 수율에 단백질 농도가 미치는 효과를 측정한다. 반응 조건은 다음과 같다.

완충액 : 0.05M 글리신, pH : 9.5, 메르캅탄 : -SSO₃-당 4당량의 -SH를 제공하는 량의 2-메르캅토에탄올 시간 : 18시간, 온도 : 6℃. HPLPLC에 의해 측정된 프로인슐린의 수율은 다음과 같다.

-SSO₃- 당 2당량의 -SH로 수행한 시험 결과는 다음과 같다.

* -SH : -SSO₃- 비율 = 1.2

[실시예 6]

실시예 1의 방법을 사용하여 동시에 수행되는 일련의 반응에서 선형 s-설포네이트 소프로인슐린으로 부터 소프로인슐린의 수율에 -SH : -SSO₃비율의 효과를 측정한다. 반응 조건은 다음과 같다.

단백질 농도 : 0.5mg/ml, 완충액 : 0.05M 글리신, pH : 9.5, 시간 : 18시간, 온도 : 6℃. HPLPLC에 의해 측정된 프로인슐린의 수율은 다음과 같다.

[실시예 7]

실시예 1의 방법을 사용하여 동시에 수행되는 일련의 반응에서 선형 s-설포네이트 소프로인슐린으로 부터 소프로인슐린의 수율에 미치는 메르캅탄 구조의 효과를 측정한다. 반응 조건은 다음과 같다.

단백질 농도 : 0.1mg/ml, 완충액 : 0.05M 글리신, pH : 9.5, 메르캅탄 : -SSO₃-당 4당량의 -SH 시간 : 18시간, 온도 : 6℃. HPLPLC에 의해 측정된 프로인슐린의 수율은 다음과 같다.

[실시예 8]

실시예 1의 방법을 사용하여 동시에 수행되는 일련의 반응에서 선형 s-설포네이트 소 프로인슐린으로 부터 프로인슐린의 수율에 미치는 단백질 형태의 효과를 측정한다. 반응 조건은 다음과 같다.

단백질 농도 : 0.1mg/ml, 완충액 : 0.05M 글리신, pH : 9.5, 메르캅탄 : -SSO₃-당 4당량의 -SH를 제공하는 량의 2-메르캅토에탄올, 시간 : 18시간, 온도 : 6℃ HPLPLC에 의해 측정된 프로인슐린의 수율은 다음과 같다.

[실시예 9]

1.69.3mg의 생합성적으로 제조된 선형 s-설포네이트 인체프로인슐린을 338.6ml의 탈기된 0.05M글리신 (pH 10.54)에 녹인 용액을 제조한다.

이 용액에 7.71ml의 수용성 2-메르캅토에탄올 저장용액을 가하는데 이 용액은 엘만의 시약으로 처리한 결과 메르캅탄의 농도가 2.08mg/ml이다. 최종 pH는 5N 수산화나트륨을 사용하여 약간 조정함으로써 10.52의 pH로 만들수 있다. 이 용액은 파라필름으로 밀봉하고 18시간 동안 6℃에서 교반한다. 반응 혼합물을 진한 염산을 사용하여 pH 2.9±0.1(온도 조정)로 산성화한다. 얻어진 맑은 용액은 세파덱스 G-25 코스 탈염화 컬럼에 가한다.

크로마토그래피 조건은 다음과 같다. 용매 : 2% 아세트산(v/v) 컬럼크기 : 5×100cm, 온도 ; 25℃, 유속 : 28.8ml/분 획분용적 : 20.2ml 초기의 유출액 779ml는 버리고 다음의 유출액 464ml를 모은다. 280nm에서 검색되는 광학 밀도를 기준으로 하여 단백질 획분으로 측정한다. 컬럼을 2500ml의 2% 아세트산으로 세척한다. 단백질 유출액의 uv 스펙트럼 기준으로 계산한 결과 컬럼에 사용한 량의 101.9%이었다.

이 유출액을 냉동하고 동결 건조한다.

목적한 생성물은 겔 여과 크로마토그라피로서 분리시킨다. 건조물질(미평량)을 20ml의 1M 아세트산에 용해한다. 얻어진 투명한 용액을 세파덱스 G-50 수퍼파인 컬럼에 가한다. 크로마토그라피 조건은 다음과 같다.

용매 : 1M 아세트산, 컬럼크기 : 2.5×125cm, 온도 ; 25℃, 유속 : ~0.82ml/분, 획분용적 : ~4.92ml, 280nm에서의 흡광도는 1M 아세트산으로 하루밤 용출시킨 컬럼으로서 검색한다. 획분수에 대해 280nm에서의 흡광도의 그래프는 2개의 주 피크가 나타났다.

첫번째 피크(소형)는 응집된 형태의 인체 프로인슐린을 나타내고 있다. 두번째 피크의 단량체성 인체프로인슐린이다. 정면에 숄더가 있다. 획분중 3개의 유출액을 모은다. 합한 획분 및 이의 유출액 용적은 다음과 같다.

유출액 Ⅰ : 획분 46-67(218-325.5ml) 유출액 Ⅱ : 획분 68-81(325.5-395.5ml) 유출액 Ⅲ : 획분 82-100(395.5-490.3ml).

단백질의 량은 이들 유출물을 uv스펙트라로 부터 계산한다.

유출액 Ⅰ : 22.1mg 유출액 Ⅱ : 28.3mg 유출액 Ⅲ : 103.6mg

총량 154mg이고 컬럼에 사용한 량의 회수율은 94%이다. 회수량증 67.3%가 단량체성 인체 프로인슐린이다. 3개의 유출액 모두 동결하고 동결 건조한다. 무수물질 106.55mg을 유출액 Ⅲ으로 부터 모은다. 아미노산 분석 및 폴리아크릴아미드 디스크겔 전기영동법에 의해 인체 프로인슐린으로서 확인한다.

인체 프로인슐린이 소 프로인슐린에 대해 용출되는 것으로 기대할 수 있는 위치에서 HPLC상에 용출시킨다. 더욱이 인체 인슐린을 제조하기 위해 트립신 및 카복시 펩티다제 B로 처리하여 확인한다.

Claims

다음 일반식(Ⅱ)의 s-설포네이트를 수용성 매질 ml당 약 10mg까지의 농도로 수용성 매질중에서 각 -SSO₃-잔기당 약 1내지 5-SH 잔기를 얻을 수 있는 량의 메르캅탄과 pH 약 7 내지 11.5에서 반응시킴을 특징으로 하는 상기 일반식(Ⅰ)의 인슐린 전구체의 제조방법.

상기 일반식에서

R은 수소, 화학적 또는 효소적으로 분해 가능한 아미노산 잔기 또는 2이상의 아미노산 잔기를 가진 화학적 또는 효소적으로 분해 가능한 펩타이드 부분이고

Y는 ―Lys―Z―이고(여기에서 Z는 Ala, Thr 또는 Ser임).

(B-29) (B-30)

A-1 내지 A-21의 부분은 인슐린 A쇄이고

B-1 내지 B-30의 부분은 인슐린 B쇄이고

X는 A-1의 아미노 그룹에서 인슐린 A-쇄와, B-29의 ε-아미노그룹 또는 B-30의 카복실 그룹에서 인슐린 B-쇄에 결합된 부위이며 이 부위는 분열이 없이 A-쇄 및 B-쇄로 부터 효소적 또는 화학적으로 분리될 수 있다.