JPS58183659A - 修飾プロインシュリン前駆体、これを暗号化するｄｎａ配列およびそれらの産生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インシュリンは開繊中で最初プレープワインシュリンと
して合成され分解してプロインシュリンとなる。プロイ
ンシュリンは６つのアミノ酸配列、すなわち、インシュ
リン分子を形成するＡ及びＢ鎖、及びＡ鎖Ｂ鎖を結合す
るＣ鎖を有している。

４ｙｅ；ｊＫ（ｉｎ−ｍ）ではＣ鎖は、まだ、はっきり
確認されない酵素で分解されインシュリンが形成される
。

インシュリンの合成は多くの問題を有している。

プロインシュリンを暗号化するＤＮＡ配列はベクター中
に組み込む事が出来プロインシュリンが表現される生産
細胞中に置かれる。しかし、特定の酵素が存在しないと
否ヱ　ど迭ノｉｎ　ｖｉｖｏ　）では、Ｃ鎖は分解され
ない。Ｃ鎖は並Ｚ　忙上１（二ｖｊ、ｔｒｏ）では分解
されるがＡ鎖Ｂ鎖が更に分解し、この方法ではインシュ
リンの収率が減少する。

Ａ及びＢアミノ酸銀は別々に合成し、Ｃ鎖なしで互いに
結合せしめる事が出来る。この方法は、Ａ及びＢ鎖を個
々に精製ぜねばならない欠点がある。加えて、Ａ鎖Ｂ鎖
はＣ鎖無しで、不正確な配位により連続して配列する。

本発明はインシュリンの組成物及び製法を提供する。本
発明に従い、修飾プロインシュリン前駆体のインビボ（
ｉ、ｎ　ｖｉ、ｖｏ　）合成を特徴とする方法によりイ
ンシュリンを製造する。１じ飾プロインシュリン前駆体
はＣ鎖のアミノ末端の了ミノ酸をアスパラギン酸で置換
したもの、Ｃ鎖のカルボキシル末端のアミノ酸をメチオ
ニンを置換したもの。

又はその両者の併合物、を特徴とする。好適なプロイン
シュリンＵｇ体は、ヒト、フロインシュリンである。

修飾プロインシュリン前駆体を暗号化するＤＮＡ配列は
、少くとも１つのオリゴヌクレオチビプライマーを、プ
ロインシュリン前駆体を暗号化する１本鎖ＤＮＡ配列を
含むＲフタ−に結合せしめて製する。良好な態様は、プ
ライマーをＭ１３ベクトルに組み込んだヒトプロインシ
ュリンを特徴とするプロインシュリン前駆体を暗号化す
る１木調相補性ＤＮＡ　（ＣＤＮＡ　）ｌ’ｉ’：結合
せしめる。

Ｃ鎖の了ミノ末端のアミノ酸をアスパラギン酸に置換せ
しめるために、プライマーはアスパラギン酸を暗号化す
るヌクレオチド９トリプレツト及びプライマーが一木調
配列−ＬのＣ鎖のカルボキシル末端のアミノ酸を暗号化
するアスパラギン酸のトリプレットの位置に効率よく結
合ぜしめるためのプロインシュリン前駆体を暗号化する
一本鎖のメツセージ同義ＤＮＡ配列と相補的な充分量の
ヌクレオチド゛を有する。

同様に、Ｃ鎖のアミン末端のアミノ酸をアスパラギンば
に１耐侠するために、前述のプライマーと相補的なプラ
イマーを調製し、プロインシュリンを暗号化する一本鎖
ＤＮＡ配列と結合せしめる。

Ｃ鎖のカルボキシル末端の了ミノ酸をメチオニンと効率
より置換するため１Ｃは、プライマーはメチオニンを暗
号化するヌクレオチド９トリプレツト及びＣ鎖のカルボ
キシル末端のアミノ酸を暗号化するメチオニンのトリプ
レットの位置でプライマーが一本鎖、メツセージ同義Ｄ
ＮＡ配列に効率よく結合するプロインシュリン前駆体を
暗号化する一本鎖ＤＮＡと相補的な充分量のヌクレオチ
ドを有する。

同様に、Ｃ鎖のカルボキシル末端のアミノ酸をメチオニ
ンに置換するために、メチオニンを暗号化するトリプレ
ットを含む前述のプライマーと相補的なプライマーとプ
ロインシュリン前駆体を暗号化する一本鎖ＤＮＡ配列と
結合せしめる。

クローニングに続いて修飾プロインシュリン前駆体を暗
号化する改変ＤＮＡ配列を有するばフタ−を同定するた
めには、制限酵素認識配列を含むヌクレオチド配列を同
様にプロインシュリンｍ［Ｋ体を暗号化する一本鎖メッ
セージ同義ＤＮＡ配列と結合せしめる。むしろ、プライ
マーはそのような制限酵素認識配列を有する方がよい。

一方、制限酵素認識配列と相補的な配列を含むヌクレオ
チド配列配列をＤＮＡ配列の暗号化銀に結合せしめる。

プライマー及び、もし必要なら、制限酵素認識配列を有
するヌクレオチド配列配列又はその相補性配列を（フタ
−に結合せしめた後、プライマーを伸長させ、環状二本
鎖ベクターを形成するためにＤＮＡ鎖を結合せしめ、そ
れを大腸菌などの細胞の中に注入せしめる。細胞及びベ
クターを復製せしめる。これにより、少なくとも、２種
類のベクターが形成される。一方のベクターは正常なプ
ロインシュリンを暗号化する改変されていないＤＮＡ配
列を特徴とするものであり、他方は、修飾ブロインンユ
リン前駆体を暗号化する改変ＤＮＡ配列を特徴とするも
のである。改変ＤＮＡ配列を有するベクターは制限酵素
分解後の電気泳動等の普通の技術によって同定され、単
離される。

改＜　Ｌ）　ｔｉ　Ａ配列は、さらに、はフタ−から開
裂′　され、産生細胞中でプロインシュリンを高濃度で
発現させることがｒ＝Ｊ能な第二のベクターに糺込まさ
れる。

双方のアミノ酸置換を有する修飾プロインシュリン前駆
体が必要な時は、二つのプライマー、それぞれのアミノ
酸置換を効率化するヌクレオチドトリプレットを含むプ
ライマー又はその相補性配列、を同時に、又は順々に、
（１）又は（−）の方向性でプロインシュリン前駆体を
暗号化する一本鎖ＤＮＡ配列に結合せしめ得る。

同時によりも、第二のプライマーを逐次的に結合せしめ
ることが望ましい。一つのプライマーを組込んだ改変Ｄ
ＮＡを有するベクターが単離された後、ベクターの二本
鎖改変ＤＮＡ配列のうちの片側鎖が取出させれる。

第二のプライマー及び、必要な場合には、制限酵素認識
配列を含む第二のマクレオチド配列又はその相補性配列
を一木調改変ＩＩ）ＮＡ配列に結合せしめ、伸長させ、
ＤＮＡ鎖を結合せしめる。このようにして形成された二
本鎖ベクターを再び大腸菌の菌体に導入し、細胞とベク
ターを複製させる。

両方のＤＮＡ配列改変を有する（フタ−は同定され、単
離されろ。二つのアミノ酸置換を有する修飾プロインシ
ュリン前駆体を暗号化する二度目の改変をうけたＤＮＡ
配列は、次にベクターから切断され、好適な産生細胞中
でプロインシュリン前駆体を高水準で発現する新たなベ
クターの中に組込まれる。

細胞の中で産生された修飾プロインシュリン前駆体は回
収され、精製される。回収及び精製のための一般的な方
法は、アガロースビーズのクロマトグラフ用絹体に結合
させたモノクローナル抗体への特異的な吸着法を利用す
るとよい。修飾プロインシュリン前駆体分子の特異的断
片に特有な親和性をもたせるためにモノクローナル抗体
を用いる３、モノクローナル抗体カラムを洗浄した後、
修飾プロインシュリン前駆体を解離せしめる。

Ｃ鎖及び１３鎖のアミノ末端に結合したアミノ酸鎖及び
Ａ鎖のカルボキシル末端はイン　ビトロ（ｊ、ｎ　ｖｊ
、ｔｒｏ　）でインツユリンを得るために修飾プロイン
ツユリン前駆体から切断される。

このようにして産生されたインシュリンは、さら１（、
溶媒分画、塩沈殿、モノクローナル抗体カラムへの特呉
的吸着等の方法により精製される。

本発明の原理に従えば、インシュリンはインｙトーヲ（
、ｉｇ　ｖｊｔ！Ｙ隻−）で修飾プロインシュリン前１
に体を分解することにより産生される。プロインシュリ
ンは、Ａ、Ｂ及びＣと称される三つのアミノ酸鎖からな
る。Ｃ鎖はＡ及びＢ鎖を連結せしめ、Ａ及びＢ鎖からな
るインシュリンを産生ずるときにプロインシュリンから
分解される。プロインシュリン前駆体はプロインシュリ
ンを特徴とし、前のＢ鎖のアミノ酸鎖、すなわち、Ｂ鎖
の了ミノ末端に結合するアミノ酸鎖を有すること及び／
又は次のＡ鎖のアミノ酸鎖、すなわち、Ａ鎖のカルボキ
シル末端に結合するアミノ酸鎖を有することを特徴とす
る。

ｔｌＡ定により、プロインシュリンのアミノ酸は、Ｂ鎖
の了ミノ末端を出発点とすることにより標識される。本
発明の方法は、すべてのプロインシュリン前駆体に適用
可能であり、特に、プロインシ　　　・ニリンのＡ鎖及
びＢ鎖にメチオニン又はアスパラギン酸を含まないヒト
プロインシュｌＪｙにおいて特徴的である。

ヒトプロインシュリンは８６個のアミノ酸配列を有し、
Ｂ鎖は１から３０番目までのアミノ酸からなる。ヒトプ
ロインシュリンのＣ鎖は、３１番目から６５番目のアミ
ノ酸からなり、Ａ鎖は６６番目から８６番１」のアミノ
酸で構成される。インシュリンを産生ずる時のヒトプロ
インシュリンの切断は、６０番目と６１番目のアミノ酸
の間及び６５番目と６６番目のアミノ酸の間で行なわれ
る。

インシュリンの長さ及び間爬ま進化論的に高度に保存さ
れており、すなわち、動物の種を越えてかなり一定であ
る。しかし、プロインシュリンのＣ鎖の長さ及び構成は
動物によって大きく異なる。

修飾プロインシュリン前駆体はそのようなプロインシュ
リン前駆体とは異なる。すなわち、修飾プロインシュリ
ン前駆体はＣ鎖のアミノ末端のアミノば、例えは、ヒト
プロインシュリンでは６１番目のアミノ酸が、アス・ξ
ラギン酸に置換されているか、又は、Ｃ鎖のカルボキシ
ル末端のアミノ酸、ヒトプロインシュリンの場合は６５
番目のアミノ酸がメチオニンに置換されているか、Ｃ鎖
の了ミノ末端が了ス・ξラギン酸及びＣ鎖のカルボキシ
ル末端がメチオニンに同時に１を換されている。

加うるＫ、少なくとも、一つの投ブチｌ−’鎖がＢ鎖の
アミノ末端又はＡ鎖のカルボキシル末端のいずれか一方
に結合している。付Ｄｎシたアミノ酸鎖は、正常ヒトプ
ロインシュリンＲプチト８のようなプロインシュリンの
インビボ（ｉ、ｎ　ｖｊｖｏ　）での切断を許すような
配列を有するか、又は、前のＢ鎖のアミノ酸がプロイン
シュリンのマイナス１番目の位置にメチオニンを有する
か、及び／又は後のＡ鎖のアミノ酸鎖のアミノ末端を形
成するアミノ酸がアス２ぐラギン酸であり、それ故イン
ビトロ（川ｖｉ、ｔｒｏ）で切断を可能にしている。

修飾プロインシュリン前駆体産生の良好な態様は、ヒ）
−プロインシュリンを特徴とするプロインシュリン＋ｌ
Ｉ　ｇ俸乞暗号化する相捕性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が二本
鎖Ｍ１３−＜フタ−中に組込まれることである。（・Ｄ
１４八はヒトインンユリン産生スイ臓細胞中で正常な染
色体Ｄ　ｌｉ　Ａから転写さね、たＲＮＡを抽出１〜、
これを逆転写酵素によってＲＮ　ＡかもＤＮＡ複製を読
み取らせることによって製ぜられる。

ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは、Ｍ１３ベクターとｃＤＮＡの切断末
端に接着末端を生じさせる制限酵素を用いてＭ１３ベク
ターとｃＤＮＡ（ヒトプロインシュリンを暗号化する遺
伝子は完全な形で残る）を最初に分解するか、又は接着
末端を酵素学的にｃＤＮＡと結合させることにより、環
状二本鎖Ｍ１３ベクターに組込ませ１〜める。ｃＤＮＡ
は、ベクターに混合することにより結合させ、必要に応
じて、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａとベクター間にリン酸結合を形成
することを触媒するＤ　Ｎ　Ａ　ｔＪカーゼで結合せし
める。

大腸菌は、Ｍｔｓはフタ−を用いて通常の方法で形質転
換さ亡ろ。例えば、菌は、適当な濃度まで至適な培地で
成育させ、次に連続的に集画して濃縮する。大腸菌は、
塩化力ルンユーム又は塩化マンガン／鳩化ルビジウム浴
液中に低温（約Ｏ〜５℃）で懸濁さげ、Ｍ１３ばフタ−
と低温で混合させろ。混合液は約３５℃から約４５℃に
５分間温めて、再び冷却する。菌は増殖培地に戻して増
殖せしめる。

大腸菌の中でにフタ−は複製する。二本鎖ベクターの一
部は、Ｍ１５の感染形態である環状二本鎖ベクターを形
成する。一本鎖ベクターは細胞膜を通つ℃培地中ｆ出て
くるので回収することが可能である。

合成オリイヌクレオチド９プライマーは、緩衝液ノ中で
混合することにより（モ）又は←→の方向性をもつｃＤ
ＮＡ配列を有する一本鎖ベクターと結合せしめる。（４
→方向性とは、一本鎖ベクターのうち、メツセージ・類
似ＤＮＡ鎖をもつｃＤＮＡを意味し、（−）方向性とは
、ＣＤＮＡの暗号化銀、すなわち、（＋）方向性鎖に相
補的なものを意味する。以下に記述する操作は（１）又
は（−）方向性、いずれのベクターに同等１だ適用でき
るが、こ匁では、←１→方向性のベクターに対する操作
法のみを詳細に述べる。（−）方向性のベクターに対し
では、プライマーの相補性配列が用いられる。

プライマーは、３つの連続したヌクレオチ１、ゝを特徴
とする。すなわち、アスパラギン酸を暗号化するトリプ
レット及びヒトプロインシュリンの３１番目のアミノ酸
な暗号化するトリプレットに対応する了ス／ξラギン酸
を暗号化するトリプレットが一本鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ上の
位＋１ｘｖｃプライヤーとして結合させることが可能と
なるメツセージ類似一本鎖ｃ　ＤＮＡと相補的なり　ｌ
ｉ　Ａ配列をｌ−ＩＪプレットの両側に充分量のヌクレ
オチドを有することを特徴としている。

了ス・ξラギン酸を暗号化するｌ・リプレットのヌクレ
オチ）パ配列は既知である。その塩基配列はＡＴ　（、
及びＧＴＣ（ここにおいて、Ｃはシトシン。

Ｔはチンン、Ａばアデニン及びＧはグアニンを表わす）
であり、５′力５３′の方向に向って読み取られる。ヒ
トプロインシュリンを暗号化するｃＤＮＡ配列のヌクＶ
オチトゝ配列も同様に知られている。

プライマーはさらに、ヒトプロインシュリンの第６１１
ｆ目のアミノ酸であるアルギニンを暗号化するトリプレ
ットの両側のメツセージ類似ｃＤＮＡのヌクレオチドゝ
と相補性の了スーξラギン酸を暗号化スルトリプレット
の両側のヌクレオチドも特徴とする。それぞれの配列の
ヌクレオチドの数はプライマーがメツセージ類似ｃＤＮ
Ａと効率よく結合するのに十分な量である。典型的には
、少なくとも三つの相補性ヌクレオチドゝかアスパラギ
ン酸を暗号化するトリプレットの両側にそれぞれ必要と
する。

本発明においてアスパラギン酸のトリプレットの両側に
それぞれ６コずつの相補性配列を有する。

望ましいプライマーの塩基配列は、ＣＴＣＣＣＧＸＸＸ
ＧＧＴＣＴＴ　で１．＝ｘで＆！ＸＸＸはＡＴＣ又＆！
ＧＴＣを規定する。塩基配列でＧＧＴＣＴＴを有するヌ
クレオチド９配列は、ヒトプロインシュリンの２９番目
と６０番目のアミノ酸を暗号化するメツセージ類似、ｃ
ＤＮＡの一部と相補的であり、塩基配列ＣＴＣＣＣＧを
もつヌクレオチド配列はヒトプロインシュリンの３２番
目と６６番目の位置のアミノ酸を暗号化するメツセージ
類似ｃＤＮＡ鎖の一部と相補的である。

塩基配列ＡＴＣを有するトリプレットがアスパラギン酸
を暗号化するトリプレットとして良好である。その理由
として、クローニングに際し改変配列を同定するのに有
用な塩基配列ＣＧＡＴＣＧを隣接のヌクレオチド゛とと
もに形成することにより、Ｐ　Ｖ　１１．　Ｉ制限酵素
認識配列をつくりだすからである。

塩基配列ＧＴＣをもつトリプレットを有するプライマー
も同様に使われるが、制限酵素認識配列のような改変配
列を同定するのに必要とされ、ＤＮＡ鋳型への結合にも
供される。

プライマー及び必要に応じて、制限酵素認識配列をメツ
セージ類似ｃＤＮＡと結合させ、次に結合した配列をＤ
ＮＡポリメラーゼを用いて伸長せしめる。これは緩衝液
中に結合したＤＮＡをもつ一本鎖にフタ−と十分胤のデ
オギシグ了ノシン−５′−６リン酸（ａＧＴＰ）デオギ
シ了デノシン−５７−ろリン酸（ａＡＴＰ）、デオキン
チジン−５７−ろリン酸（ｄＣＴＰ）　及びデオギシチ
　ジン−５′−６リン酸（ｄＴ、’Ｉ’　Ｐ　）　　を
尻合することによって得られる。

Ｄ　Ｎ　Ａ　リガーゼもまた、伸長されたＤＮＡ鎖の末
端を結合せしめるために添加される。これにより、環状
二本鎖ベクターが形成される。

二本鎖ベクターは、再び、通常の方法により、大腸菌の
中に導入される。非常（（少ない・ξ−セントの大腸菌
が実際にはベクターとともに播かれる。

次に菌を寒天培地中で拡げ、成育させる。二本鎖ベクタ
ーはそこで複製する。こ〜で一種類の二本鎖はフタ−が
産生ずる。一方は、正常ヒトゾロインシュリンを特徴と
するプロインシュリン前駆体を暗号化するｃＤＮＡを有
するものであり、他方は、ヒトプロインシュリンの６１
番目のアルギニンの代わりにアスパラギン酸をもつこと
を特徴とする修飾プロインシュリン前駆体上暗号化する
改変ｃＤＮＡを有する。

大腸菌はＭ１３ベクターを感染させると増殖速度がベク
ターをもたない菌に比べて遅くなる。菌が増えるのに従
い、プラーク、すなわち、増殖する細菌集団のなかに「
穴」が形成されるようになり、そこではＭ１３ベクター
を有寸る大腸菌が複製している。一つ一つのプラークは
実質的に均一な集団”Ｃ”　＝Ｉ）す、一種類のｃＤＮ
Ａをもつ、すなわち、正常ヒトプロインシュリンを特徴
とするプロインシュリン前駆体を暗号化するｃＤＮＡか
又は修飾プロインシュリン前駆体を暗号化するｃＤＮＡ
かのいずれかである。

あるプラークから得た菌が改変ｃＤＮＡをもつにフタ−
を含むものであることを確認するためには、そのプラー
クから得た菌の一部のベクターを制限酵素ＰｖｕＩで消
化し、その認識配列の有無で同定する。制限酵素配列を
有するベクターは、酵素により分解され、非環状ＤＮＡ
断片を生ずる。一方、認識配列を有しないはフタ−は環
状のままである。

消化産生物の同定にはアガロースゲル上での電気泳動等
を用いて行なわしめる。

改変ｃＤＮＡ配列をもつＭ１３はフタ−を含むと判定さ
れた大腸菌は液体培地で培養される。改変ｃＤＮＡをも
つ一本鎖ベクターは細胞壁を通って培地中に放出され、
回収される。

３１Ｊ目のアルギニンに代わってアスパラギン酸を置換
したのに加えて、６５番目のアルギニンをメチオニンに
置換させた修飾プロインシュリン前駆体を育生ずるため
には、メチオニンを暗号化するヌクレオチド９トリプレ
ツトをすでに６１番目の了ミノ酸がアス・ぐラギン酸に
置換されたメッセ）　Ｍ　似ｃ　Ｄｌｉ　Ａ上のヒトプ
ロインシュリンノロ５番目の正常なアルギニンを暗号化
するヌクレオチド・トリプレットを置換させる。

この置換を効率よくするためには、第２のプライマーを
既に改変された（（１）方向性のｃＤＮＡを有する一重
鎖ベクターに結合させることが必要である。

プライマーは、メチオニンを暗号化する塩基配列ＣＡＴ
のトリプレットを有すると同時に、メチオニンを暗号化
するトリプレットトがヒトプ。イ、。

ニリンの６５番目のアミノ酸を暗号化する位置に効率よ
く結合させるために、メチオニンのトリプレットの両側
にメツセージ類似ｃＤＮＡと相補性のヌクレオチドを充
分量必要とする。

好適なプライマーのヌクレオチド配列は、塩基配列とＬ
　てＡＡＴＧＣＣＣＡＴＣＴＴＣＴＧ　であｎ、塩基配
列ＣＴＴＣＴＧはプロインシュリンの６６及び６４番目
のアミノ酸を暗号化するメツセージ類似ｃ　ＤＮＡの一
部と相補性をもち、塩基配列ＡＡＴＧＣＣはプロインシ
ュリンの６６及び６７番目のアミノ酸を暗号化するメツ
セージ類似ｃＤＮＡの一部と相補的でル）る。

プライマーの好適なヌクレオチド配列は、さらに以下の
理由で有月１である。塩基配列ＴＣＴＴＣをもち、これ
は制限酵素Ｍｂｏｌｌの認識配列であり、後の修飾Ｒフ
タ−の同定に便利である。

結合させた配列は前述の如く、伸長し、ＤＮＡ鎖を結合
させて、環状二本鎖にフタ−を形成する。

二本鎖反りターは再び大腸菌に導入され、複製させられ
る。次に、Ｍｌろベクターをもつ菌からプラークを形成
せしめる。

二つのアミノ酸置換を暗号化された二本鎖はフタ−の同
定にはあるプラークから得られたベクターを制限酵素認
識配列のＰ　ｖ　ｕ　Ｉ及びＭｂｏ１１部位を認識する
ことによる。二つの認識配列を有する二本鎖ｃＤＮＡ配
列は、双方の酵素で切断される。

二つのアミノ酸置換を暗号化した修飾ｃＤ　ＮＡ配列は
アガロースゲル上で電気泳動することによって同定され
る。

二つの置換を有する修飾プロインシュリン前駆体を暗号
化する二本鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列？もつベクターが同定
された際には、そのベクターを有する菌を培養する。菌
から二本鎖ＤＮＡを分離し、改変ｃＤＮＡ断片を得るた
めに制限酵素で切断する。このようにして、改変ｃＤＮ
Ａ断片が単離される。

産生菌中でプロインシュリンを高濃度で発見せしめるこ
とが知られている第二のベクターに例えば、ヒトプロイ
ンシュリンを暗号化するｃＤＮＡを含むトリプトファン
融合ベクターを、同じ制限酵素で分解し、正常なＣＤＮ
Ａを除去する。第二のベクターを単離する。

Ｍｌろベクターから切り出された改変ＣＤＮＡ配列は、
次に第二のベクターに挿入される。第二のベクターは産
生細胞中に導入され、複製される。

第二のベクターを有する圀を分離し、修飾プロインシュ
リン前駆体を高水準で発現する集団を産生ずるために培
養する。

修飾プロインシュリン前駆体を単離する好適な、一般的
な方法は例えば、Ｃ鎖の６２番目から４８番目の位置の
配列のような修飾プロインシュリン前駆体の特定の断片
（Ｃ対するモノクローナル抗体を調製することを特徴と
する。そのような適した配列をもつ合成、はプチドを製
する。次にネズミなペプチド゛で感査し、ポリエチレン
グリコールによる細胞融合法により、モノクローナル抗
体産生細胞を回収する。ヒトプロインシュリンの’１（
７）断片に対するモノクローナル抗体を分泌している細
胞はサント９イツチラジオイムノ了ツセイによって同定
する、モノクローナル抗体は培養液の上清から稍刺し、
ヒトプロインシュリン断片に特異的ニ親和性を何する担
体を製するためにクロマトクラフ用了ガロースビーズに
吸着せしめる。

単離された細胞によって作られた修飾プロインシュリン
前駆体はモノクローナル抗体カラムへの特異的な吸着に
よって精製される。修飾プロインシュリン前駆体な含む
分画は濃縮され、経験的に修飾プロインシュリン前駆体
を沈殿させることが知られる量の硫安を加えることによ
り部分的に純化せられる。硫安分画で純化せられた前駆
体は次にモノクローナル抗体カラムにかけられカラムに
吸着しない夾雑蛋白質を洗い去る。修飾プロインシュリ
ンは次にｐＨ約１０、イオン強度０１の炭酸アンモニウ
ムを流すことによってカラムから解離せられる。

単離された修飾プロインシュリン前駆体はＣ鎖のカルボ
キシル末端で切断される。すなわち、６５番目と６６番
目の間であり、必要な場合ＩＬ′Ｃは、Ｂ鎖の了ミノ末
端、すなわちマイナス１番目もシアン化臭素処理により
切断する。修飾プロインシュリン前駆体は透析及び凍結
乾燥により、余分な塩から回収され、純粋なギ酸に溶Ｍ
され、水で約７０％に希釈してから、１００倍から２０
０倍の過剰シアン化水素を添加してメチオニン残基の部
分で切断する。約５ηｌの修飾ノロインシュリン前駆体
が１解のギ酸に溶解される。反応はシャ光子で２４時間
、室温で進行し、分解産物は凍結乾燥により余分な試楽
を防去する。

Ｃ鎖の了ミノ末端の分解、すなわち、６１番目と６ろ番
Ｈのアミノ酸の間及び必要に応じて、Ａ鎖のカルボキシ
ル末端は、修飾プロインシュリンＡｆｔ躯体を２Ｍ尿素
を含む、ｏ、ｏ１ｑ１次酸了ンモン（ｐＨ８，０）中に
溶解ｌ〜て切断する。修飾プロインシュリン前駆体は約
５　ｍｙ　／　ｍｌの濃度に溶解され、分解は尤・Ｚノ
−ジ（用−。用梗ヨ）変異株Ｍｅ１酵素Ｙ　ｉｌｌ　ｆ
ｆｉプロインシュリン前駆体の濃度の約’／ｌｏ。

程度（すなわち約５０〜／　ｍｌ　）添加して行なわし
める。反応は３７℃で２４時間行なわしめる。

分解された修飾プロインシュリン前、躯体から切り出さ
れたインシュリンは従来の手法によって精製される。

前に触れた様に、前述の方法は、−重鎖型のベクターの
中からｃ　ＤＮＡの暗号比類が得られた時にも同様に適
用される。この場合は、調製され、ベクターに結合した
プライマーは前述のプライマーの相補性配列でよい。例
えば、６１番目のアミノ酸のアルギニンをアスパラギン
酸に置換するのを効率よくするｆこめには、メツセージ
類似鎖に結合スる塩基配列ＣＴＣＣＣＧＡＴＣＧＧＴＣ
ＴＴを有するプラィマート相補的な塩基配列Ａ　ＡＧＡ
　ＣＣＧＡ　’ＩＣ；ＧＧＧＡＧを有するようなプライ
マーが好適である。

同様に、塩基配列０Ａ（１，ＡＡＣＡＴＧＧＧＣＡＴＴ
をもつプライマーは６５番目のアミノ酸のアルギニンを
メチオニンに置換する際に有効な働きをする。

このプライマーは、塩基配列ＡＡＴＧＣＣＣＡＴＣＴＴ
ＣＴＧを有するプライマーど相補的である。

修飾ブロイ／シュリン前駆体を暗号化するＤＮＡ配列の
産生に際し−Ｍ１ろは本発明において好ましいベクター
である。その理由は、Ｍｌ３が二本鎖及び−重鎖型の２
つ種類で存在し得るという独特な能力Ｖこよる。これに
より、プライマーを一本鎖ウィルス型ＤＮＡに結合させ
る際に二本鎖の片側鎖を消化する手間を省略できる。

しかしながら、二本鎖ベクター又はプラスミドも使用し
得る。この場合には、プラスミドゝの二本鎖ベクターの
ｃＤＮＡに合成ブライマーを結合せしめる前に二本鎖の
うち一本を消化しなければならない。プライマーのヌク
レオチド゛配列は除去されるｃＤＮＡ鎖に従って調製さ
れる。

この過程は、二本鎖ベクター又はプロインシュリンを暗
号化する天然ｃＤＮＡ配列を有するプラスミド゛を分解
することにより行う。分解は天然ｃＤＮＡの一端をエン
ビヌクレ了−ゼで行なわれる。分解されたプラスミド又
はベクターは次にエクソヌクレアーゼで消化していく、
例えば５′→６′の方向で進み、二本鎖ｃＤＮＡを切断
された一端から一本鎖のみ行なわれる。エクソヌクレア
ーゼでｃＤＮＡの一本鎖を徐々に消化していき、合成ブ
ライマー−が適当な位置のｃＤＮＡの一重鎖土に結合で
きるだけの十分なし“さのヌクレオチド゛配列を産生じ
なげればならない。

合成プライマーは１次に、ｃＤＮＡの一本鎖に結合させ
、伸長され、最後に、ＤＮＡ鎖の両端を連結して環状二
本鎖のベクター又はプラスミド゛を産生じ、続いて大腸
菌の中へ導入され、複製される。

以下の方法は、Ｍｌろの項で既に述べた通りである。

この方法の欠点は、エクソヌクレアーゼ・反応をいかな
る時点で停市させたらいいかを知ることが難しい点にあ
り、この方法の効率や信頼性を減少させる傾向にある。

本発明では、合成プライマーを天然ｃＤＮＡをもつ一本
鎖Ｍｌろベクターのプロインンユリンノ６１番目のアミ
ノ酸ケ暗号化する位置に結合させ、引続いて６５番目の
アミノ酸を暗号比する位置にも置換すべきアミノ酸を暗
号化ｌ〜だプライマーを結合さぜることを特徴とする。

しかし、２つの置換が希望される場合ｊ・Ｇは、二つの
プライマーを順々ｆ／（結合させるよりも：同時に結合
させる方がよい。一方、同時に反応させた時は、二つの
プライマーが希望する位置にっく可能性に問題が提起さ
れることもある。

改変ＤＮＡ配列を回収できる成功率はおよそ２０回Ｖこ
１回位である。引続き増殖するコロニーの中で目的とす
る改変ｃＤＮＡを表現している菌のプラークの単離及び
同定は比較的素早く、少なくとも２０のプラーク中には
１つの目的とするＤＮＡの変化を起こし℃いるものが存
在する。

二つの合成プライマーを同時に結合せしめる時の成功率
は４００回に１回位の割合になる。そのため、４００コ
のプラークの単離と同定が目的とするＤ　ＮＡを得るた
めに必要となる。従って、そのようなプラークを同定す
ることは比較的長期的な解析が要求される。

前述１−だモノクローナル抗体を用いた単離及ヒ精製は
現在好ましい一般的な方法とされている。

他の修飾プロインシュリン前駆体な回収する方法と１２
では、大腸菌のトリプト）了ンオ深ロン融合深ゾチピな
どの場合は、トリプトフ了ンオはロンー々プチト゛了ミ
ノ末端を含む蛋白質（ヒトプロインシュリンを含む）の
不溶性を利用する。不溶性の融合蛋白質は、生理的塩濃
度（０，１から０．２モルの食塩）存在下で不連続遠心
法によって精製される。他の従来の方法は、イオン交換
及びゲル口過クロマトグラフィー等の方法が有効に用い
られる。

修飾プロインシュリン前駆体のＣ鎖の切断の他の良好な
態様は、細菌やイーストが産生細胞として使用している
場合は、特に有効である。ある種の菌は、プロインシュ
リンの前のＢ鎖の了ミノ末端の最初のアミノ酸を分解す
る能力を特徴とする。

そのような産生細胞を使用している場合は、Ｃ鎖のアル
ギニンを了ス／にラギン酸に置換させる了ミノ末端にの
みヒトプロインシュリンの修飾を提供するｃＤＮＡが変
化する。Ｃ鎖のカルボキシル末端ではＩＷ換はみられな
い。Ｃ鎖の了ミノ末端の置換及び修飾されたプロインシ
ュリンの回収を効率よくする手段は、前述した通Ｉ］で
ある。

インシュリンを形成するＣ鎖の分解はＰ、フラジ（Ｐ、
　ｆｒａｇｉ　）変異株の酵素を用い、前述のように２
４時間で行なう。修飾プロインシュリン前駆体のろＯ番
目と６１番目のアミノ酸の間の分解及び必要に応じて、
Ａ鎖のカルボキシル末端と続くＡ鎖のアミノ酸鎖間の分
解は、修飾プロインシュリン前駆体濃度の約”’ｏｏｏ
のトリプシン添加により行なう。反応は、一定の時間で
行なわれ典型的には２時間である。トリプシン消化は６
５番目と６６曲目のアミノ酸の間を切断する。反応は、
急速冷却又は大豆トリプシン阻害剤、ジイソプロピル−
フルオロリン酸又はＰ−）ルエンスルフォニルフルオ’
ｌ　ｌ”Ｊの１旧害剤を添加することによつ℃停止させ
る。

本方法によって産生ぜしめたインシュリンは、溶媒分画
、塩沈６殿、モノクロール抗体カラムへの特異的吸着等
、従来の方法で精製する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　　Ａ、　　Ｂ両鎖に、メチオニンもアスパラギン
   酸も含まず、 八　Ｃ鎖のアミン末端のアミノ酸がアスパラギン酸で置
   換されているか又は； ｂ、　　Ｃ鎖のカルボキシル末端のアミノ酸がメチオニ
   ンで置換されているか、又は； Ｃ，Ｃ鎖のアミン末端のアミノ酸がアスパラギン酸で置
   換され、カルボキシル末端のアミノ酸が、メチオニンで
   直換されている、 プロインシュリンから成る修飾プロインシュリン前駆体
   。 ２゜ａ、　６１位のアミノ酸のアルギニンがアスパラギ
   ン酸で置換されているか又は； ｂ、　６５位のアミノ酸のアルギニンがメチオニンで置
   換されているか又は； ｃ、３１位のアミノ酸のアルギニンがアスパラギン酸で
   置換され６５位のアミノ酸のアルギニンがメチオニンで
   置換されている、 ヒト　プロインシュリンからなる修飾プロインシュリン
   前駆体。 ３、ａ、　　Ｇ鎖の了ミノ末端のアミノ酸を暗号化する
   ヌクレオチド月・リプレットの代りにアスパラギン酸を
   暗号化するヌクレオチド゛トリプレット、又は； ｂ、　　Ｃ鎖のカルボキシル末端のアミノ酸を暗号化す
   るヌクレオチド゛トリプレットの代りにメチオニンを暗
   号化するヌクレオチド９トリプレツト、又は； ｃ、　　Ｇ鎖のアミン末端のアミノ酸を暗号化するヌク
   レオチド９トリプレットの代りにアスパラギン酸を暗号
   化するヌクレオチ）パトリプレット及びＣ鎖のカルボキ
   シ末端のアミノ酸を暗号化するヌクレオチド９トリプレ
   ツトの代りに、Ｉチ、４−＝ンｌｊｌ暗号化するヌクレ
   オチ）−゛）　ＩＪ　フレットを有する、 プロインンユリン暗号化ＤＮＡ配列からなる修飾プロイ
   ンシュリン前駆体を暗号化するＤＮＡ配列。 ４、アスパラギン酸を暗号化するヌクレオチドトリプレ
   ットが、塩基配列、ＡＴＣである事を特徴とする特許請
   求の範囲第６項のＤＮＡ配列。 ５、了ス・ξラギン酸を暗号化するヌクレオチドトリプ
   レットトが塩基配列、ＧＴＣである事を特徴とする特許
   請求の範囲第３項のＤＮＡ配列。 ６、　メチオニンを暗号化するヌクレオチドトリプレッ
   トが塩基配列、ＣＡＴである事を特徴とする特許請求の
   範囲第３項のＤＮＡ配列。 ７、ａ、　　ＡＴＣ及びＧＴＣから成る群から選択１７
   た塩基配列からなるヌクレオチドトリプレットによって
   ３１位のアミノ酸の位置でアルギニンを暗号化するヌク
   レオチドトリプレットが置換されているか又は； ｂ、　６５位のアミノ酸の位置でアルギニンを暗−１１
   １Ｚｆるヌクレオチドゝトリプレットの代りに、塩基配
   列ＣＡＴからなるヌクレオチド９トリプレツトで置換さ
   れているが、又は； 。、　３１位のアミノ酸の位置でアルギニンを暗号化す
   るヌクレオチド９トリプレツトの代りに、ＡＴＣ及びＧ
   ＴＣより成る群から選出した塩基配列からなるヌクレオ
   チド９トリプレツトテ置換され、６５位のアミノ酸の位
   置でアルギニンを暗号化するヌクレオチドトリプレット
   の代りに、塩基配列ＣＡＴからなるヌクレオチドトリプ
   レットで置換されている、 ヒトプロインシュリンを暗号化するＤＮＡ配列からなる
   修飾プロインシュリン前駆体を暗号化するＤＮＡ配列。 ８、ａ、了ス・ξラギン酸を暗号化するヌクレオチド９
   トリゾレツト；及び、アスパラギン酸を暗号化するｌ・
   リプレットがプロインシュリン前駆体のＣ鎖の了ミノ末
   端におけるアミノ酸を暗号化する位置でプライマーを、
   −木調ＤＮＡ配列に効果的に結合させる（了ニール）事
   の出来るプロインシュリンからなる、プロインシュリン
   前駆体を暗号化する一重鎖メッセージ類似ＤＮＡ配列の
   ヌクレオチド９に相補的なトリプレットの両側における
   十分なヌクレオチド９からなるプライマーを作製し； ｂ、プロインシュリン前駆体を暗号化する一重鎖メッセ
   ージ同義ＤＮＡ配列を含むベクターにプライマーを結合
   せしめ； Ｃ０環状二本鎖はフタ−を形成せしめるためプライマー
   を伸張及び結合せしめ；及び ｄ、　　［胞及び二本鎖ベクターを複製せしめ、少なく
   ともプロインシュリン前駆体を暗号化する改変されてな
   いＤＮＡ配列からなる第一のグループのはフタ−及びＣ
   鎖の了ミノ末端にアスパラギン酸を含む修飾プロインシ
   ュリン前駆体を暗号化する改変ＤＮＡ配列からなる第二
   のグループのベクターを産生せしめることを特徴とする
   Ｃ鎖の了ミノ末端にアスパラギン酸を有する修飾プロイ
   ンシュリン前駆体を暗号化するＤＮＡ配列を産生ずる方
   法。 ９、ベクターの一本鎖ＤＮＡ配列上に制限酵素認識配列
   からなるヌクレオチド配列を調製及び結合　　□せしめ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第８項の方法。 １０、制限酵素認識配列を有するヌクレオチド配列を特
   徴とする合成プライマーの特許請求の範囲第８項の方法
   。 １１、アスパラギン酸を暗号化するヌクレオチドゝトリ
   プレットが塩基配列ＡＴＣである特許請求の範囲第８項
   の方法。 １２、プロインシュリン前駆体が塩基配列ＣＴＣＣＣＧ
   ＡＴＣＧＧＴＣＴＴを有するヌクレオチド配列からなる
   ヒトプロインシュリン及びプライマーであることを特徴
   とする特許請求の範囲第８項の方法。 １３゜ａ。メチオニンを暗号化するヌクレオチド９トリ
   プレツトと、メチオニンを暗号化するヌクレオチド９ト
   リプレットがプロインシュリンのＣ鎖のアミン末端を暗
   号化する位置で改変ＤＮＡ配列のメツセージ同義鎖第二
   のプライマーを効率よく粘付することができる改変ＤＮ
   Ａ配列のメツセージ同義鎖と相補的であり、メチオニン
   暗号化ヌクレオチドの両側で充分量のヌクレオチドゝと
   、からなる第二のプライマーを作製し； ｂ、第二のグループのベクターから改変ＤＮＡ配列のメ
   ツセージ同義銀からなるベクターを供１−； Ｃ０改変ＤＮＡ配列のメツセージ同義銀に第二のプライ
   マーを結合せしめ； ｄ、第二の環状二本鎖ベクターを作製するために第二の
   プライマーを伸長及び結合せしめ；。、第二の環状二本
   鎖ベクターを用いて菌を形質転換せしめ；及び ｆ。少なくとも既に改変ＤＮＡ配列を有する第三のグル
   ープのベクター及びＣ鎖のアミノ末端にアスパラギン酸
   、Ｃ鎖のカルボキシル末端にメチオニンを有するヒトプ
   ロインシュリンを有する修飾プロインシュリン前駆体を
   暗号化する二度改変ＤＮＡ配列からなる第四のグループ
   な形成せしめるために菌及び二本鎖ベクターを複製せし
   める事を特徴とする特許請求の範囲第８項の方法。 １４、改変ＤＮＡ配列のメツセージ同義銀に第二の制限
   酵素認識配列からな・るヌクレオチド配列を調製及び結
   合せしめる事を特徴とする特許請求の範囲第１６項の方
   法〇 １５、第二のプラ・イマーが制限酵素認識配列を有する
   ヌクレオチド配列である事を特徴とする特許請求の範囲
   第１３項の方法。 １６、メチオニンを暗号化するヌクレオチドトリプレッ
   ト 許請求の範囲第１６項の方法。 １７、プロインシュリン前駆体がヒトプロインシュリン
   である事及び第二のプライマーが塩基配列ＡＡＴＧＣＣ
   ＣＡＴＣＴＴｃＴＧを何するヌクレオチド配列である事
   を特徴とする特許請求の範囲第１６項の方法。 １Ｂ．ａ．アス・ξラギン酸を暗号化するヌクレオチド
   トリプレットに相補的なヌクレオチドトリプレット及び
   プロインシュリンのＣ鎖の了ミノ末端にアミノ酸を暗号
   化するトリプレットの相補性銀の位置が了ス・ξラギン
   酸を暗号化するトリプレットに相補的なトリプレットで
   あるために暗号化ＤＮＡ配列にプライマーを効率よく結
   合せしめるプロインシュリンからなるプロインシュリン
   前駆体を暗号化する一体鎖暗号化ＤＮＡ配列のヌクレオ
   チドに相補的であるトリプレットの両側の充分量のヌク
   レオチ）ごを作製し； ｂ．　プロインシュリン前駆体を暗号化する一本鎖暗号
   化ＤＮＡ配列を有するにフタ−にプライマーを結合せし
   め； Ｃ．環状二本鎖ベクターを産するため１でプライマーを
   伸長及び結合せしめ； ｄ．二本鎖ベクターで菌を形質転換せしめ；ｅ．少なく
   ともプロインシュリン前駆体を暗号化する改変されてい
   ないＤＮＡ配列を特徴とする第一のグループのベクター
   及びＣ鎖のアミノ末端にアスパラギン酸を有する修飾プ
   ロインシュリン前駆体を暗号化する改変ＤＮＡ配列から
   なる第二のグループのベクターな産するために菌及びベ
   クターを複製せしめる事を特徴とするＣ鎖の了ミノ末端
   にアスパラギン酸を有する修飾プロインシュリン前駆体
   を暗号化するＤＮＡ配列を産生せしめる方法。 １９、−木調暗号化ＤＮＡ配列に制限酵素認識配列に相
   補的なヌクレオチド９配列からなるヌクレオチド配列を
   調製及び結合せしめることを特徴とする特許請求の範囲
   第１８項の方法。 ２０、合成プライマーが制限酵素認識配列に相補的なヌ
   クレオチド配列である事を特徴とする特許請求の範囲第
   １８項の方法．、 ２１、アスパラギン酸を暗号化するヌクレオチドトリプ
   レットに相補的なヌクレオチドトリプレットが塩基配列
   ＧＡＴである事を特徴とする特許請求の範囲第１８項の
   方法。 ２２、プロインシュリン前駆体がヒトプロインシュリン
   である事及びプライマーが塩基配列ＡＡ（、ＡＣＣＧＡ
   ＴＣＧＣＧＡＣを有するヌクレオチド配列である事を特
   徴とする特許請求の範囲第１８項の方法。 ２３、ａ、　　メチオニンな暗号化するヌクレオチド゛
   トリプレットに相補的なヌクレオイド９トリプレツトト
   、前記トリプレットの両側にあって改変ＤＮＡ配列の暗
   号化鎖に第二のプライマーが効率よく結合させるだめの
   改変ＤＮＡ配列の暗号化鎖に相補的である十分量のヌク
   レオチド９とからなる第二のプライマーを作製し、それ
   によって第二のプライマー及びプロインシュリンのＣ鎖
   のアミノ酸を暗号化するトリプレットに相補的な位置が
   、メチオニンを暗号化するヌクレオチドトリプレットに
   相補的ブよヌクレオイド９トリプレツトであり； ｂ、第二のグループのベクターから改変ＤＮＡ配列の暗
   号化鎖からなるベクターを供せしめ；。、改変ＤＮＡ配
   列の暗号化鎖に第二のプライマーを結合せしめ； ｄ、第二の環状二本鎖ばフタ−を形成するために第二の
   プライマーを伸長及び結合せしめ；。、第二の環状二本
   鎖で菌を形質転換せしめ；及び ｆ、少ｌ農くとも既に改変されたＤＮＡ配列からナル第
   三のグループのベクター、及び（［の了ミノ末端にアス
   パラギン酸、Ｃ鎖のカルボキシル末端にメチオニンを有
   するヒトプロインシュリンからなる修飾プロインシュリ
   ン前駆体を暗号化する二度改変ＤＮＡ配列からなる第四
   のグループのベクターを第四のグループのベクターから
   形成せしめるために菌及び二本鎖ベクターを複製せしめ
   る事を特徴とする特許請求の範囲第１８項の方法。 ２４、第二の制限酵素認識配列に相補的なヌクレオチｌ
   −”配列からなるヌクレオチド配列配列を調製し、改変
   ＤＮＡ配列の暗号銀に結合せしめる事を特徴とする特許
   請求の範囲第２６項の方法。 ２５、第二のプライマーが制限酵素認識配列と相補的な
   ヌクレオチド配列である事を特徴とする特許請求の範囲
   第２６項の方法。 ２６、メチオニンを暗号化するヌクレオチドトリプレッ
   トと相補的なヌクレオチドトリプレットが塩基配列ＡＴ
   Ｃである事を特徴とする特許請求の範囲第２６項の方法
   。 ２７、プロインシュリン前駆体がヒトフロインシュリン
   である事及び第二のプライマーが塩基配列ＣＡＧＡＡＧ
   ＡＴＧＧＧＯＡＴＴを有するヌクレオチド配列である事
   を特徴とする特許請求の範囲第２６項の方法。 ２Ｂ、　ａ、アスパラギン酸を暗号化するヌクレオチド
   ゛トリプレット及びプロインシュリンのＣ鎖の了ミノ末
   端のアミノ酸を暗号化するアスパラギン酸の暗号化位置
   で第一のプライ、−が効率よく一本鎖ＤＮＡ配列に結合
   せしめるためのプロインシュリンかうするプロインシュ
   リン前駆体を暗号化する一重鎖メッセージ類似ＤＮＡ配
   列と相補的であるトリプレットの両側の十分量のヌクレ
   オチドからなる第一のプライマーを作製し； ｂ、メチオニンを暗号化するヌクレオチドトリプレット
   及びプロインシュリンのＣ鎖のカルボキシル末端のアミ
   ノ酸を暗号化するメチオニンのトリプレットの位置で第
   二のプライマーが効率よく一本鎖ＤＮＡ配列に結合せし
   めるための一重鎖メッセージ類似ＤＮＡ配列のヌクレオ
   チド゛と相補的なトリプレットの両側の十分量のヌクレ
   オチドからなる第二のプライマーを作製し； Ｃ０プロインシュリン前駆体を暗号化する一重鎖メッセ
   ージ類似ＤＮＡ配列を有するはフタ−に第−及び第二の
   プライマーを結合せしめ；ｄ、プライマーを伸長及び結
   合せしめて環状二本鎖（フタ−を形成せしめ； ｅ、バクターで菌を形質転換せしめ；及びｒ、　　少７
   ’、Ｃくともプロインシュリン前駆体を暗号化する改変
   されていないＩ）ＮＡ配列からなる第一のグループのベ
   クター及びＣ鎖のアミノ酸末端にアスパラギン酸、Ｃ鎖
   のカルボキシル末端にメチオニンを有する修飾プロイン
   ／ニリン前駆体を暗号化する改変ＤＮＡ配列からなる第
   二のグループのベクターを形成する１こめに茜及び二本
   鎖ベクターを複製せしめる事を特徴とする修飾プロイン
   シュリン前駆体を暗号化するＤＮＡ配列を産生せしめる
   方法。 ２９．制限酵素認識配列からなる少なくとも一つのヌク
   レオチドを調製し、プロインシュリンを暗号化する一本
   鎖に結合せしめる事を特徴とする特許請求の範囲第２８
   項の方法。 ３０、第一のプライマーが制限酵素認識配列を有するヌ
   クレオチド配列である事を特徴とする特許請求の範囲第
   ２８項の方法。 ３１、第二のプライマーが制限酵素認識配列を有するヌ
   クレオチド配列である事を特徴とする特許請求の範囲第
   ２８項の過程。 ３２、第一のプライマー及び第二のプライマーがそれぞ
   れ制限酵素認識配列を有するヌクレオチド配列である事
   を特徴とする特許請求の範囲第２８項の方法０ ３３、了ス・ξラギン酸を暗号化するヌクレオチドトリ
   プレットが塩基配列ＡＴＣである事を特徴とする特許請
   求の範囲第２８項の方法。 ３４、プロインシュリン前駆体がヒトプロインシュリン
   である事及び第一のプライマーが塩基配列ＣＴＣＣＣＧ
   ＡＴＣＣＧＴＣＴＴを有するヌクレオチド９配列である
   事を特徴とする特許請求の範囲第２８項の方法。 ３５、メチオニンを暗号化するヌクレオチドトリプレッ
   ト 許請求の範囲第２８項の方法。 ３６、フロインシュリン前駆体がヒトプロインシュリン
   である事及び第二のプライマーが塩基配列ＡＡＴＧＣＣ
   ＣＡＴＣＴＴＣＴＧを有するヌクレオチド９配列である
   事を特徴とする特許請求の範囲第２８項の方法。 ３７、　ａ．アスパラギン酸を暗号化するヌクレオチド
   トリプレットに相補的なヌクレオチドトリフレット及び
   プロインシュリンのＣ鎖のアミノ酸末端のアミノ酸を暗
   号化するヌクレオチドトリフレットに相補的な位置にア
   スパラギン酸を暗号化するヌクレオチド９トリプレツト
   に相補的なヌクレオチドトリブレットをおくために第一
   のプライマーがＩ）ＮＡ配列の暗号化鎖に効率よく結合
   せしめるためのプロインシュリンからなるプロインシュ
   リン前駆体を暗号化する暗号化鎖のヌクレオチドと相補
   的なトリプレットの両側の十分量のヌクレオチｌ−Ｓか
   らなる第一のプライマーを作製し； ｂ．　メチオニンを暗号化するヌクレオチド９トリフレ
   ツトに相補的なヌクレオチドトリプレット及びプロイン
   シュリンのＣ鎖のカルボキシル末端のアミノ酸を暗号化
   するヌクレオチドトリフレットに相補的な位置にメチオ
   ニンを暗号化するヌクレオチド書リプレットに相補的な
   ヌクレオチドトリプレットをおくために第二のプライマ
   ーがＤＮＡ配列の暗号化鎖に効率よく結合せしめるため
   のプロインシュリン前駆体を暗号化するＤＮＡ配列の暗
   号化鎖のヌクレオチドと相補的なトリプレットの両側の
   十分量のスクレテオト９からなる第二のプライマーを作
   製し； Ｃ．第一のプライマー及び第二のプライマーをプロイン
   シュリン前駆体を暗号化するＤＮＡ配列の暗号化鎖を有
   するベクターに結合せしめ； ｄ．プライマーを伸長及び結合し、環状二本鎖ベクター
   を形成せしめ； ｅ．二本鎖はフタ−で菌を形質転換せしめ；及び ｆ．少なくともプロインシュリン前駆体を暗号化する改
   変されていないＤＮＡ配列からなる第一のグループのベ
   クター及びＣ鎖のアミノ末端子スパラギン酸、Ｃ鎖のカ
   ルボキシル末端（（メチオニンを有する修飾プロインシ
   ュリン前駆体を暗号化する改変ＤＮＡ配列からなる第二
   のグループのばフタ−を形成せしめるために菌及び二本
   鎖ベクターを複製せしめる事を特徴とする修飾プロイン
   シュリン前駆体を暗号化するＤＮＡ配列の産生の方法。 ３８、制限酵素認識配列に相補的なヌクレオチド配列か
   らなる少なくとも一つのヌクレオチド配列を調製し、Ｄ
   ＮＡ配列の暗号化鎖に結合せしめる事を特徴とする椅ｉ
   ｆｆ−請求の範囲第６７項の方法。 ′３９．第一のプライマーが制限酵素認識配列と相補的
   なヌクレオチド配列である事を特徴とする特許請求の範
   囲第６７項の過程。 ４０、第二のプライヤーが制限酵素認識配列と相補的な
   ヌクレオチド９配列である事を特徴とする特許請求の範
   囲第６７項の方法。 ４　］　、？１ｆ−４）プライマー及び第二のプライマ
   ーがそれぞれ一９１１限酵素認識配列と相補的なヌクレ
   オチド配列配列である事を特徴とする特許請求の範囲第
   ６７項の方法。 ４２、アス・ξラギン酸を暗号化するヌクレオチドトリ
   ブレットが塩基配列ＧＡＴである事を特徴とする特許請
   求の範囲第３７項の方法。 ４３、フロインシュリン前駆体がヒトプロインシュリン
   である事及び第一のプライマーが塩基配列ＡＡＧＡＣＣ
   ＧＡＴＣＧＣＧＡＣを有するヌクレオチド９配列である
   事を特徴とする特許請求の範囲第６７項の方法。 ４４、第二のプライマーが塩基配列ＡＴＧを有するヌク
   レオチド配列である事を特徴とする特許請求の範囲第６
   ７項の方法。 ４５、フロインシュリン前駆体がヒトプロインシュリン
   である事及び第二のプライマーが塩基配列ＣＡＣＡＡＣ
   ＡＴＧＧＧＣＡＴ’ｒが有するヌクレオチｌご配列であ
   る事を特徴とする特許請求の範囲第１８項の方法。 ４６、　ａ、特許請求の範囲第６項中に記された修飾プ
   ロインシュリン前駆体を暗号化するＤＮＡ配列を作製し
   ； ｂ、ＤＮＡ配列を第一のベクターに挿入し；Ｃ１第一の
   ばフタ−で菌を形質転換せしめ；ｄ、菌により産せられ
   た修飾プロインシュリン前駆体を単離し；及び ｅ、修飾プロインシュリン前駆体を分解してインシュリ
   ンを与る事を特徴とするインシュリンの産生方法。 ４７、修飾プロイン／ニリン前駆体がＣ鎖のアミン末端
   に了ス・ξラギン酸を有する事及びＢ鎖のカルボキシル
   末端とＣ鎖のアミン末端の間を過剰量のＰ、　７　ラブ
   （）’、　ｆｒａｇｉ　）変異株Ｍｅｔ酵素消化で分解
   する事を特徴とする特許請求の範囲第４６項の方法。 ４８、修飾プロインシュリン前駆体がＣ鎖の了ミノ末端
   及びＡ鎖に続くアミノ酸鎖のカルボキシル末端に了スパ
   ラギ／酸を有する事及びＢ鎖のカルボキシル末端とＡ鎖
   のアミン末端の間及びＡ鎖に続くアミノ酸鎖のカルボキ
   シル末端とＡ鎖の了ミノ末端の間が過剰量のＰ、ブラシ
   （Ｐ、　　ｆｒａｇ’ｉ　）変異株Ｍｅｌ酵素消化によ
   り分解される事を特徴とする特許請求の範囲第４６項の
   方法。 ４９、修飾プロインシュリン前駆体がＣ鎖のカルボキシ
   ル末端にメチオニンを有する事及びＣ鎖とＡ銀量が過剰
   量のトリプシン消化により分解される事を特徴とする特
   許請求の範囲第４７又は４８項の方法。 ５０、修飾プロインシュリン前駆体がＣ鎖のカルボキシ
   ル末端にメチオニンを有する事及びＣ鎖のアミノ末端と
   Ａ鎖のカルボキシル末端の間が修飾プロインシュリン前
   駆体を分解するのに充分な濃度のシ゛アン化美累からな
   る水浴液処理により分解される事を特徴とする特許請求
   の範囲第４６項の方法。　　□５１、修飾プロインシュ
   リン前駆体がＣ鎖のカルボキシル末端及びＢ鎖の了ミノ
   末端に付着するアミノ酸鎖のカルボキシル末端にメチオ
   ニンを有スる事及びＢ鎖のアミノ末端とＢ鎖（（付着す
   るアミノ酸鎖のカルボキシル末端の間が修飾プロインシ
   ュリン前駆体を分解するのに充分な濃度のシアン化臭素
   処理で分解される事を特徴とする特許請求の範囲第４６
   項の方法。