NO151898B - Fremgangsmaate for fremstilling av en insulin-forloeper - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av en insulinforløper.

Det har i de senere år vært foreslått en rekke fremgangsmåter for fremstilling av syntetisk ellersemi-syntetiske insulin. Insulin er et molekyl med to peptidkjeder, en A-kjede inneholdende 21 aminosyrerester og en B-kjede inneholdende 3 0 aminosyrerester. Disse kjedene inneholder tre disulfidbroer, hver dannet fra to cysteinylrester. To av disulfidbroene går fra A-kjeden til B-kjeden. Broene er dannet fra cysteinylrestene ved A-6 og A-11, A-7 og B-7, og A-20 og B-19, henholdsvis.

En generell fremgangsmåte for insulinproduksjonen går via proinsulin eller et proinsulin-lignende molekyl. Proinsulin er et enkelkjedet polypeptid hvor N-sluttkretsen på insulin A-kjeden er forbundet via et peptid med C-sluttgruppen på insulin B-kjeden, og hvor de passende cysteinrester er forbundet med disulfidbindinger. Humant proinsulin har således 86 aminosyrerester, og 35 av disse utgjøres av det forbindende peptid. Yanaihara et al., Diabetes 27 (Suppl. 1) 149-160

(1978) beskriver bl.a. syntesen av en rekke forskjellige forbinnende peptider og humant proinsulin.

Det er i litteraturen også beskrevet andre proinsulin-lignende molekyler, og disse skiller seg fra proisulin ved strukturen på den gruppe som forbinder insulin A- og B-kjedene samt de punkter hvor slik forbindelse er utført.

Således har Busse et al., Biochemistry 15, No. 8, 1649-1657 (1976) angitt en binding som består av to metionyl-residua som er forbundet ved deres N-avsluttende atomer til en karbonylgruppe, og hvor den resulterende gruppe er forbundet med det Na<->avsluttende atom i A-I glycyl og det Ne avsluttende atom i B-29 lysyl.

På lignende måte er andre forbindende grupper blitt beskrevet. Se f.eks. Geiger et al., Biochem. og Biophys. Res. Comm. 55, 60-66 (1973); Brandenburg et al., Hoppe - Seyler' s Z. Physiol. Chem. bd. 354, 613-627 (1973); U.S. Patenter nr. 3,847,893, 3,907,763, 3,883,496, 3,883,500 og 3,884,897.

I hver av de ovennevnte fremgangsmåter for fremstilling av insulin via en enkeltkjede bestående av insulin A- og B-kjeder forbundet gjennom en definert gruppe, så skjer forbindelsen mellom insulin A- og B-kjedene via en dannelse av tre disulfidbroer fra de seks cysteinylrestene som er tilstede på A- og B-kjedene. Etterat man har dannet disulfidbindingene, så blir den opprinnelige forbindende gruppen fjernet hvorved man får dannet insulin.

For å få en effektiv fremstilling av insuli r på ovennevnte måte, så er det meget ønskelig å få en effektiv og lett fremgangsmåte for dannelse av de korrekte di-sulf idbroene. De fremgangsmåter som er beskrevet for dannelse av disulfidbroen inbefatter blant annet luftoksydasjon av de tilsvarende -SH-strukturer. Ettersom det er velkjent at -SH-strukturen er ustabil, så vil"forløperen normalt ha en S-beskyttende gruppe, typisk en S-sulfonat-gruppe (-S-S03 ). Litteraturen beskriver således fremgangsmåter som inbefatter to trinn, dvs. først en reduksjon av S-sulfonatet til -SH ved behandling med et merkaptan fulgt av luftoksydasjon av den dannede -SH-forbindelsen.

Man har nu oppdaget en enkel og meget effektiv fremgangsmåte for direkte omdannelse av S-sulfonatet til den forønskede disulfidinsulinforløper forbindelsen. Denne fremgangsmåten inbefatter ikke en sekvens med reduksjon og oksydasjon. Istedenfor får man en direkte syntese under betingelser at man foretrekker et fravær av et oksydasjons-middel, skjønt dette ikke er kritisk. Foreliggende oppfinnelse angår en slik fremgangsmåte.

En mulig unntagelse til de tidligere kjente to-trinns metoder, som imidlertid er anvendt på en kombinasjon av insulin A- og B-kjeder og ikke på en disulfid-dannelse fra en lineærkjedet S-sulfonat-insulin-forløper, er angitt av Dixon et al., Nature 188 , 721-724 (1960),

som muligens inbefatter en produksjon av insulin ved en kombinasjon av A- og B-kjede S-sulfonater i en enkel oppløsning. Detaljene ved denne tidligere kjente fremgangsmåte er relativt vage, og utbyttet basert på aktivitet

av det innvunne produkt, er angitt til bare en til to prosent. I en senere publikasjon, Dixon, Proe. Intern. Congr. Endo-crinal. 2.nd. utgave London 1964, 1207-1215 (1965), synes til en viss grad å oppklare detaljene i denne fremgangsmåte, og antyder i tabell IV, side 1211, en to-trinns prosess som inbefatter anaerob S-sulfonat-reduksjon fulgt av en oksydasjon til disulfidet.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av en insulinforløper med følgende formel

hvor R er hydrogen, et kjemisk eller en enzymatisk spaltbar aminosyrere st, eller en kjemisk eller en enzymatisk spaltbar peptidgruppe med minst to aminosyrerester; Y er

-Lys Z-, hvor Z er Ala, Thr, eller Ser; gruppen fra (B-29) (B-30)

A-I til A-21 er en insulin A-kjede; gruppen fra B-l til B-30 er en insulin B-kjede; og X er en gruppe som er knyttet til insulin A-kjeden ved aminogruppen i A-I og til insulin B-kjeden ved e-aminogruppen i B-29 eller karboksylgruppen i B-30, og hvor denne gruppen enzymatisk eller kjemisk kan avspaltes uten at man bryter ned hverken A-kjeden eller B-kjeden. Fremgangsmåten er kjennetegnet ved at man omsetter et S-sulfonat med følgende formel

hvor R, X og Y er som definert ovenfor, med et merkaptan

i tilstrekkelig mengde til at man tilveiebringer fra 1 til 5 -SH-grupper pr. hver -SS03 grupper i et vandig medium ved pH fra 7 til 11,5 og ved en S-sulfonatkonsentrasjon på opptil 10 mg pr. ml vandig medium.

Med begrepet "insulinforløper" forståes et molekyl som (1) inneholder en insulinA-kjede og en insulin B-kjede, (2) har minst tre disulfidbindinger representert ved at man binder sammen svovelatomene i hver av de Cys-grupper som er plassert i A- og B-kjedene ved (a) A-6 og A-ll, (b) A-7 og B-7, og (c) A-20 og B-19, henholdsvis,

og (3) har en fjernbar forbindende gruppe som er knyttet til insulin A-kjeden ved aminogruppen i A-I og til insulin B-kjeden ved e-aminogruppen i lysinresten ved B-29 eller karboksylgruppen i aminosyreresten B-30.

Gruppen Z, som definerer B-30 aminosyre-residuet i insulin, er enhver av gruppene Ala, Thr eller Ser. Disse rester representerer et naturlig forekommende insulin. Thr i human-insulin, Ala i storfeinsulin og svine-insulin, mens Ser forekommer i kanininsulin.

R-gruppen er hydrogen, en aminosyrerest,

eller en peptidgruppe med minst to aminosyrerester. I

de tilfeller hvor R er en aminosyrerest eller en peptid-

gruppe så er R en gruppe som lar seg avspalte fra insulin-forløperproduktet fremstilt ifølge oppfinnelsen uten at man taper noe av den gjenværende insulinstrukturen. En rekke forskjellige aminosyrerester av peptidgrupper ligger innenfor definisjonen av R så sant de oppfyller ovennevnte krav. Eksempler på avspaltbare aminosyrerester er basiske aminosyrer så som arginin (Arg) eller lysin (Lys) såvel som peptidgrupper som ved karboksylgruppen er avsluttet med slike aminosyrerester. Slike grupper lag seg lett gjenkjenne ved at de kan avspaltes ved behandling med det proteolytiske enzym trypsin. Et annet eksempel på en av-spaltbar aminosyrerest er metionin (Met) , foruten peptidgrupper som har Met ved sin karboksyavsluttende gruppe. Disse kan fjernes ved behandling med cyanogen-bromid. Et annet eksempel er tryptofan (Trp) eller en peptidgruppe som har Trp ved sin karboksyavsluttende gruppe. En slik gruppe fjernes ved behandling med N-bromsuccinimid.

Den forbinnende gruppe X, i nevnte insulin-forløper og den lineærkjedede S-sulfonatinsulinforløper kan ha en rekke forskjellige strukturer. Det er foretrukket at gruppen X er et polypeptid. Dette polypeptid har vanligvis minst 2, og fortrinnsvis fra 2 til 35, mest foretrukket fra 6 til 35 aminosyrerester. Gruppen X er forbundet med A-kjeden ved aminogruppen A-I

og til B-kjeden ved karboksylgruppen i B-30. Når den forbindende gruppen X er et peptid, så er det mest foretrukket at dette er et naturlig forbindnde peptid i en insulinforløper, og generelt fra det insulin som er representert ved en eller begge A- og B-kjedene til hvilke det er forbundet. Eksempler på naturlig forekommende forbindende peptider er følaende:

Det er foretrukket at den aminosyresekvens

som er representert ved A-I til A-21, X, og B-l til B-30

er den naturlige forekommende sekvens for A-kjeden, ved forbindende peptid, og B-kjeden i proinsulin, enten fra svin, storfe eller mennesker, mest foretrukket fra mennesker.

Skjønt det er mest foretrukket å bruke den naturlige forekommende sekvens, slik dette er angitt ovenfor, så kan man også bruke langt kortere peptidsekvenser som det forbindende peptid. De eneste krav som stilles er (1) at de er av tilstrekkelig lengde til at man får en passende disulfidbindingsdannelse mellom A- og B-kjedene,

og (2) at de kan avspaltes fra insulinforløperen med etterfølgende insulindannelse. Et typisk dipeptid som kan brukes er -Arg-Arg-. I.tillegg til dette kan man anvende modifikasjoner av det forannevnte dipeptid f.eks. med formelen -Arg-X'-Arg-, hvor X' representerer minst ett aminosyreresiduum. Meget foretrukne forbinnende peptider er -Arg-Arg-Lys-Arg- så vel som lengere peptider med strukturen -Arg-Arg-X 2 -Lys-Arg- hvor X 2er minst en aminosyrerest og fortrinnsvis to aminosyrerester. De sistnevnte kan selvsagt inbefatte naturlig forekomne peptider og mange av disse er beskrevet ovenfor.

Såsant de ovennevnte krav er oppfylt kan man bruke en rekke forskjellige forbindende grupper. I de tilfelle hvor den forbindende gruppen er et polypeptid,

så vil forbindelsespunktene være aminosluttgruppen i A-Kjeden (A-I) og karboksylsluttgruppen i B-kjeden (B-30).

Ettersom B-29 aminosyreresten (Lys) inneholder en e-aminogruppe, så kan imidlertid den forbindende gruppe være knyttet til A- og B-kjedene via aminogruppene ved A-I og B-29. Man kan således f.eks. ha karbonylbis(metionyl),

slik dette er beskrevet av Busse et al., se ovenfor; 2,2'-sulfonylbis(etoksykarbonyl), beskrevet av Obermeiser et al., Hoppe- Sayler' s Z. Physiol. Chem. 356, 1631-1634 (1975); 2,7-diamino-suberoyl, beskrevet av Geiger et al.,se ovenfor; og lignende.

Ved gjennomføring av foreliggende fremgangsmåte blir den lineærkjedede S-sulfonatinsulinforløperen behandlet med et merkaptan i et vandig medium ved en pH fra 7 til 11,5. Ved merkaptan forståes en forbindelse som inneholder minst en -SH-gruppe. Den eneste begrensning som settes på det merkaptan som brukes i foreliggende fremgangsmåte er at det er vannoppløselig.

Eksempler på typiske vannoppløselige merkaptaner er ditiotreitol, ditioerytritol, 2-merkaptometanol, metyltioglykolat, 3-merka<p>to-l,2-propandiol, 3-merkapto-propionsyre og lignende. Skjønt man kan bruke merkaptaner med flere -SH-grupper, så som ditiotreitol, så er det foretrukket å bruke et merkaptan med en enkel -SH-gruppe. Av disse er 2-merkaptoetanol mest foretrukket.

Foreliggende fremgangsmåte gjennomføres i et vandig medium som holdes på den forønskede pH, fortrinnsvis • ved at man tilsetter et egnet bufferingsmiddel. pH på mediet varierer fra 7 til 11,5. Det er imidlertid mest foretrukket at pH varierer fra 9,5 til 10,5. Man kan således anvende enhver buffer som har bufferkapasitet innenfor de forannevnte områder. Eksempler på egnede buffere er fosfatbuffere, tri(hydroksymetyl)aminometan (tris), boratbuffere, glycin og lignende.

Konsentrasjonen av bufferingsmidler i det vandige medium vil vanligvis varieres opp til ca. 0,5N. Fortrinnsvis vil området ligge fra 0,005 til 0,5N, mest foretrukket fra 0,00 5 til ca. 0,1N.

Den lineærkjedede S-sulfonatinsulinforløper tilsettes det vandige medium i en konsentrasjon som ikke er større enn ca. 10 milligram pr. milliliter. Fortrinnsvis er konsentrasjonen lavere, vanligvis fra 0,05 til 2 milligram pr. milliliter.

Et viktig trekk ved foreliggende fremgangsmåte er den mengde merkaptan som brukes i forhold til konsentrasjonen av ovennevnte lineærkjedede S-sulfonatinsulinfor-løper. Tidligere kjente fremgangsmåter hvor man har redu-sert -S^sulfonat til -SH har anvendt store overskudd av merkaptan i forhold til S-sulfonatet. Det er nu inn-lysende at så store overskudd har vært overveldende for S-sulfonatet og gitt en fullstendig reduksjon av S-sulfonatet til en tilsvarende SH-forbindelse. Dette har så igjen nødvendiggjort en isolasjon av -SH-mellomproduktet eller en høy fortynning av reaksjonsblandingen fulgt av etr distinkt oksydasjonstrinn, vanligvis ved hjelp av luft, for å omdanne ovennevnte -SH-mellomprodukt til den for-ønskede-S-S-forbindelse. Se f.eks. Crestfield et al, J. Biol. ChemT 238, 622-627 (1963); Steiner et al.,

Proe. Nat' l Acad. Sei. U. S. A. 60, 622-629 (1968); and Yanaihara et al., Diabetes 27 (Suppl. 1), 149-160 (1978).

Foreliggende fremgangsmåte krever på den

annen side bruk av merkaptan i en mengde som tilveiebringer fra 1 til 5 -SH-grupper pr. hver -S-SO^ -grupper, og fortrinnsvis i mengder som gir fra 2 til 4 -SH-grupper pr. "SSO^ -grupper. Når merkaptankonsentrasjonen ligger innenfor det ovennevnte variasjonsområdet har man oppdaget at det er mulig effektivt og elegant å omdanne den lineærkjedede S-sulfonatinsulinforløperen direkte til den forønskede disulfidinsulinforløper. Ettersom de insulin A- og B-kjeder som er tilstede som en del av den lineærkjedede S-sulfonatinsulinforløper inneholder seks S-sulfonatgrupper, så må man hvis man bruker et merkaptan inneholdende en enkel -SH-gruppe, for å oppnå mengder som ligger innenfor de ovennevnte variasjonsområder, bruke et molart forhold som varierer fra 6:1 til 30:1.

Forholdet mellom pH, bufferstyrke og konsentrasjon av den lineærkjedede S-sulfonatinsulinforløper er viktig, så er nevnte forhold ikke fullt ut kritisk for gjennomføring av foreliggende fremgangsmåte. Det er således foretrukket å øke pH og å senke bufferstyrken med økende konsentrasjon av den lineærkjedede S-sulfonat-insulinforløperen.

I motsetning til tidligere kjente fremgangsmåter så er det ikke kritisk at fremgangsmåten gjennom-føres i en oksyderende atmosfære. Skjønt et oksydasjon-middel, f.eks. luft kan være tilstede i reaksjonsmediet, så har man overraskende funnet at det er foretrukket å utføre reaksjonen i et alt vesentlig fravær av luft eller andre oksydasjonsmidler. Med begrepet "i alt vesentlig fravær" forståes bare at man unngår å direkte tilsette luft. Dette oppnås f.eks. ved å gjennomføre reaksjonen i et lukket system som utelukker tilgjengelighet av luft eller andre oksydasjonsmidler. For ytterligere å sikre et fravær av luft, så kan det vandige medium renses med nitrogen og avgasses ført man tilsetter reaktantene.

Et annet viktig, men dog ikke kritisk trekk ved foreliggende fremgangsmåte er temperaturkontrollen. Fremgangsmåten utføres vanligvis ved temperaturer fra

0 til 37°C. Reaksjonstemperaturen bør imidlertid fortrinnsvis ligge i den nedre del av nevnte variasjons-område, vanligvis fra 2 til 8°C, mere foretrukket fra 4 til 6°C. Det er imidlertid mest foretrukket at fremgangsmåten gjennomføres i to temperaturvariasjons-områder. Reaksjonsblandingen kan således fremstilles ved romtemperatur og så snart den er fremstillet avkjøles den til en temperatur mellom 2 og 8°C og holdes i sistnevnte område for resten av reaksjonsperioden.

For gjennomføring av foreliggende fremgangsmåte fremstiller man således et vandig medium med en pH innenfor de ovennevnte områder, f.eks. glysin ved en konsentrasjon på 0,05 N. Det fremstilte vandige medium holdes generelt på en temperatur fra 0 til 37°C, fortrinnsvis ca. romtemperatur, det avgasses deretter og renses med nitrogen for så igjen å avgasses. Den lineærkjedede S-sulfonatinsulinforløperen oppløses i det vandige medium i tilstrekkelig mengde til at man får den forønskede konsentrasjon, f.eks. 0,1 mg/ml medium Merkaptanet tilsettes i en mengde som gir ca. 5 -SH grupper pr. -S-SO^ -gruppe. Den resulterende blanding med utelukkelse av luft eller andre oksydasjonsmidler avkjøles til 4 - 6°C og holdes

i dette området inntil reaksjonen er fullstendig. Dette vil vanligvis ta fra 5 til . 7 2 timer, mere vanlig fra 15 til 24 timer, mest vanlig fra 18 til 20 timer.

Etterat reaksjonen er ferdig kan produktet isoleres på en rekke forskjellige måter, og alle disse er velkjente eller beskrevet i litteraturen. De mest vanlige fremgangsmå.ter er kromatografisk teknikk, f.eks. gel-filtrering og ioneutbytningskromatografi.

Den resulterende insulinforløper kan omdannes til insulin enten ezymatisk eller kjemisk ved hjelp av kjente fremgangsmåter. Slike fremgangsmåter inbefatter f.eks. en avspaltning ved hjelp av en kombinasjon av trypsin og karboksypeptidase B slik det er beskrevet av Kemmler et al., J. Biol. Chem. 246, 6786-6791 (1971).

Insulinproduktet kan undersøkes for renhet og relativ aktivitet ved hjelp av kjente fremgangsmåter, så som polyakrylamidgelelektroforese, aminosyreanalyse, radioreceptorprøve, radioimmunoprøve, høytrykksvæskekroma-tografi (HPLC), ultrafiolett spektrum, densylering, prøve ved hjelp av kaninblodglukose og lignende.

Utgangsmaterialet, dvs. den lineærkjedede S-sulfonatinsulinforløperen er tilgjengelig ved hjelp av rekombinant DNA-metoder. Nevnte utgangsstoffer kan også fremstilles fra naturlige insuliner og pro-insuliner så vel som ved hjelp av klassisk peptidsyntese, enten dette inbefatter en teknikk hvor man anvender oppløsninger eller faste faser.

En lineærkjedet S-sulfonatinsulinforløper kan fremstilles fra proinsulin på følgende måte: 100 ml av-kjølt deionisert 7M urea ble tilsatt 786 mg natriumsulfitt. Oppløsningen ble så rørt til alle stoffene var oppløst. Deretter tilsatte man 594 mg natriumtetradionat. Etterat natriumtetrationatet var op<p>løst var oppløsningen imidlertid noe uklar. pH ble så justert til 7,7 med iseddik. HPLC-renset storfeproinsulin (503 mg) ble så tilsatt

under røring. pH på reaksjonsoppløsningen ble igjen justert til 7,6 med 2N natriumhydroksyd. Den resulterende svakt uklare oppløsning ble rørt ved 6°C i 18 timer.

Ca. en halvpart av reaksjonsblandingen ble justert til pH 9,1 med 2N natriumhydroksyd og påsatt en Sephadex G-25 grov kolonne. De kromatografiske betingelser var følgende: oppløsningsmiddel 0,05 M ammoniumbikarbonat, pH 9,0, kolonnestørrelse 2 x 90 cm; temperatur 21°C; strømningshastighet 18,5 ml/minutt. De første 120 ml fra kolonnen ble kastet, mens de neste 75 ml ble oppsamlet. Kolonnen ble så vasket med ytterligere 400 ml av 0,05 M ammoniumbikarbonat med pH 9,0. Denne fremgangsmåte ble gjentatt med den annen halvpart av oppløsningen. UV-spektroskopi av de to porsjonene indikerte at man totalt hadde innvunnet 401 mg. De to porsjoner ble slått sammen og lyofilisert til tørrhet. Totalt fikk man 445,7 mg av et tørt avsaltet produkt. Dette produkt, det vil si, lineærkjedet S-sulfonert storfeproinsulin, og et fravær av utgangsmaterialet, ble bekreftet ved calluloseacetatelektro-forese og polyakrylamid skive-gel elektroforese.

Det lineærkjedede S-sulfonerte storfeinsulinet ble renset ved DEAE-cellulosekromatografi. Råproduktet på 44 3 mg ble oppløst i 10 ml 7,5 M urea-0,01M tris-0,001M EDTA, pH 8,5 og påsatt en DEAE-cellulosekolonne. De kromatografiske betingelser var følgende: oppløsningsmiddel 7,5 M urea-0,01M tris-0,001M EDTA, pH 8,5, med en gradient på 0-0,35M natriumklorid; kolonnestørrelse 2,5 x 90 cm; temperatur 4°C; strømningshastighet ca. 0,9 ml/minutt og fraksjonsvolum 5,3 ml.

Ved å avsette absorbsjonen ved 276 nm for hver fraksjon i forhold til fraksjonstallet ga en stor topp som var noe utdradd på den ene siden- UV-spektroskopi indikerte at hovedtoppen var produktet. Fraksjonen 199-240 med volumet fra 1069-1291 ml ble slått sammen. UV-spektroskopi indikerte at denne prøven inneholdt 355 mg.

De samlede fraksjoner ble avsaltet på en " Sephadex G-25 ii grov kolonne. De kromatografiske betingelser var følgende: oppløsningsmiddel 0,05M ammoniumbikarbonat, pH 8,0; kolonnestørrelse 3,7 x 105 cm; temperatur 4°C; strømningshastighet 16,0 ml/minutt. De første 39 5 ml fra kolonnen ble kastet, mens de neste 250 ml ble oppsamlet. Kolonnen ble så vasket med ytterligere 2000 ml 0,05 M ammoniumbikarbonat, pH 8,0. UV-spektroskopi av porsjonen indikerte at man hadde 321 mg produkt. Prøven ble så lyofilisert til tørrhet, og man fikk totalt 373 mg produkt i tørr form. Identiteten på produktet ble fastslått ved polyakrylamid ved skivegelelektroforese og høytrykksvæske-kromatografi på basis av elueringsstilling.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen. Eksempel 1: Ved å bruke en konsentrasjon på 0, 1 mg/ ml.

Det ble fremstilt en oppløsning av 1,61 mg av lineærkjedet S-sulfonat storfeproinsulin oppløst i 16,1 ml avgasset 0,05 M glysin, pH 9,5. Oppløsningen ble tilsatt 0,158 ml av en vandig 2-merkapto-etanol-lagerløsning, som ved en titrering med Ellmans reagens, viste seg å ha en merkaptankonsentrasjon på 2,11 mg/ml. Dette representerer 4 ekvivalenter 2-merkaptoetanol pr -SSO^ i det lineærkjedede S-sulfonat storfeproinsultnet. Den endelige pH var 9,46. Oppløsningen sojii ble fremstilt ved romtemperatur, ble lukket med parafilm og så rørt under avkjøling ved 6°C i 19 timer.

Blandingen ble så surgjort til pH 4,0 + 0,1 (temperaturen justert) idet man brukte konsentrert saltsyre og 0,5 N natriumhydroksyd. Produktet ble isolert og verifisert ved hjelp av høytrykksvæskekromatografi (HPLPLC). Betingelsene var følgende: kolonne 1,1 x 54 cm glasskolonne pakket med LP-l/C^g 16,6% C-innhold; oppløsningsmiddel 30% acetonitril/70% (0,1M ammoniumformat, pH 4,25); temperatur 21°C; trykk 8028 g/cm^; strømningshastighet 2,40 ml/minutt. Prøvene ble påsatt kolonnen ved hjelp av en 5 ml injektor og ble undersøkt ved 280 nm.

Den første prøven som ble påsatt var 5 ml av en storfeproinsulin lagerløsning som hadde en nominell proteinkonsentrasjon på 0,1 mg/ml. Den annen prøve som ble påsatt var 5 ml av surgjort reaksjonsblanding. Nærværet av monomerisk storfeproinsulin i reaksjonsblandingen ble verifisert ved av elueringsstilling. Beregning av arealene under toppene på de to HPLPLC-forsøkene indikerte at at man i reaksjonsblandingen hadde et utbytte på 8 2,6% av storfe-proinsulin.

Eksempel 2: Ved å bruke en konsentrasjon på 0, 5 mg/ ml

Man fremstilte en oppløsning av 25,07 mg lineærkjedet S-sulfonat storfeproinsulin i 50,14 ml avgasset 0,05M glysin, pH 10,51. Oppløsningen ble tilsatt 1,302 ml av en vandig 2-merkapto-etanol-lagerløsning som ved titrering med Ellmans reagens, viste seg å ha en merkaptankonsentrasjon på 2,10 mg/ml. Dette tilsvarer 2,1 ekvivalenter av 2-merkaptoetanol pr. -SSO^ i det lineærkjedede S-sulfonatstorfeproinsulinet. Den endelige pH var 10,47. Oppløsningen som ble fremstilt ved romtemperatur, ble lukket med parafilm og så rørt under avkjøling ved 6°C i 18 timer.

Reaksjonsblandingen ble så surgjort til pH

4,0 +0,1 (temperaturjustert) ved å bruke konsentrert saltsyre og 0,1N saltsyre. Analyse ved hjelp av HPLPLC indikerte at man i reaksjonsblandingen hadde et utbytte på 69%

av storfeproinsulin.

Produktet ble etter avsalting isolert ved hjelp av gelfiltreringskromatografi. Reaksjonsblandingen ble justert til pH 9,0 med konsentrert ammoniumhydroksyd og påsatt en Sephadex G-25 grovkollonne. De avsaltende kromatografiske betingelser var følgende: oppløsnings-middel 0,05 M ammoniumbikarbonat, pH 9,0; kolonnestørrelse

2 x 90 cm; temperatur 21°C; strømningshastighet 18,5 ml/min. De første 120 ml fra kolonnen ble kastet, menst de neste 7 5 ml ble op<p>samlet (proteinporsjon). Kolonnen ble så vasket med ytterligere 400 ml 0,05M ammoniumbikarbonat, pH 9,0. UV-spektroskopi av proteinporsjonen indikerte at man hadde innvunnet 21,6 mg protein. Porsjonen ble lyofilisert til tørrhet og totalt fikk man 22,21 mg tørt avsaltet protein. 14,84 mg av ovennevnte produkt ble o<p>pløst i 5,5 ml 1,0M eddiksyre. UV spektroskopi av den klare opp-løsningen indikerte en proteinkonsentrasjon på 2,56 mg/ml. 5.ml av denne oppløsningen (12,8 mg ved UV) ble tilsatt en ii Sephadex G-50 iisuperfin kolonne. De kromatografiske betingelser var følgende: oppløsningsmiddel, IM eddiksyre; kolonnestørrelse 1,5 x lOOcm; temperatur 21°C; strømnings-hastighet 0,19 ml/minutt; fraksjonsvolum, ca. 1,9 ml.

Absorbsjon ved 280 nm ble utført etterhvert som kolonnen ble eluert over natten med IM eddiksyre. Den resulterende kurve indikerte to topper. Den første og mindre toppen representerte sammenklumpede former av storfeproinsulin. Den annen topp var monomer storfeproinsulin. Man slo fraksjonene fra de to toppene sammen, og volumene var følgende: Porsjon I: Fraksjonene 30-46 (55,0 - 84,0 ml; topp 70,4 ml)

Porsjon II:Fraksjonene 47-62 (84,0 -112,0 ml; topp, 9 9,8 ml) .

UV-spektroskopi indikerte at man hadde 1,94 mg i porsjon I og 10,11 mg i porsjon II. Dette er totalt 12,05 mg og representerer et utbytte på 94,1% av den mengde som er påsatt kolonnen. Av det totalt innvunne var 83,9% monomerisk storfeproinsulin.

Begge porsjonene ble lyofilisert til tørrhet. Produktet i porsjon II ble verifisert som storfeproinsulin på basis av elueringsstilling i et forsøk med HPLPLC. Det ble også verifisert ved en behandling med trypsin og karboksypeptidase B ved å bruke den fremgangsmåte fra litteraturen som er beskrevet for fremstilling av storfe-

insulin.

Eksempel 3 : Effekt- av temperatur

Man brukte fremgangsmåten fra eksempel 1 for å bestemme effekten av temperaturen på utbyttet av storfe-proinsulin fra lineærkjedet S-sulfonat storfe-proinsulin. Reaksjonsbetingelsene var følgende: proteinkonsentrasjon

0,1 mg/ml; buffer 0,05M glycin; pH 9,5; merkaptan, 2-merkaptoetanol i en mengde som ga 4 ekvivalenter -SH pr.

-SSO tid 18 timer.

Når reaksjonen ble utført ved 21 oC var utbyttet av proinsulin slik dette kunne bestemmes ved HPLPLC 47%. Når reaktantene ble blandet ved 21°C og temperaturen på blandingen ble senket til 6°C, så var utbyttet 77%.

Eksempel 4: Effekt av pH

Man brukte fremgangsmåten fra eksempel 1 for

å bestemme effekten av pH på utbyttet av storfeproinsulin fra lineærkjedet S-sulfonatstorfeproinsulin i en serie reaksjoner som ble utført samtidig. Reaksjonsbetingelsene var følgende: proteinkonsentrasjon 0,5 mg/ml; buffer 0,05 M glycin; merkaptan, 2-merkaptoetanol i en mengde som ga 2 ekvivalenter -SH pr. -SSO^ ; tid 18 timer; temperatur 6°C.

Man oppnådde de følgende utbytter av proinsulin, bestemt ved hjelp av HPLPLC:

Eksempel 5: Effekt av proteinkonsentrasjon

Man brukte fremgangsmåte fra eksempel 1 for

å bestemme effekten av proteinkonsentrasjonen på utbyttet av storfeproinsulin fra lineærkjedet S-sulfonate storfeproinsulin i en serie reaksjoner som ble utført samtidig. Reaksjonsbetingelsene var følgende: buffer, 0,05 M glycin;

pH 9,5; merkaptan 2-merkaptoetanol i en mengde som ga 4 ekvivalenter -SH pr "SSO^ ; tid 18 timer; temperatur 6°C.

Man oppnådde de følgende utbytter slik dette ble bestemt ved hjelp av HPLPLC:

Man utførte en annen serie med forsøk med 2 ekvivalenter -SH pr. -SS03 og pH 10,5 med følgende resultater:

Eksempel 6: Effekt av - SH: SSO ^ forhold

Man brukte fremgangsmåten fra eksempel 1 for

å bestemme effekten av forholdet -SH og ~SS03 på utbyttet av storfeproinsulin fra lineærkjedet S-sulfonat storfe-proinsulin i en serie reaksjoner som ble utført samtidig. Betingelsene var følgende: proteinkonsentrasjon 0,5 mg/ml; buffer 0,05M glycin; pH 9,5, tid 18 timer; temperatur 6°C.

Man oppnådde de følgende utbytter av pro-insulinen bestemt ved hjelp av HPLPLC:

Eksempel 7; Effekt av type av merkaptan

Man brukte fremgangsmåten fra eksempel 1 for å bestemme effekten av merkaptanstrukturen på utbyttet av storfeproinsulin fra lineærkjedet S-sulfonat storfeproinsulin i en serie reaksjoner som ble utført samtidig. Reaksjonsbetingelsene var følgende: proteinkonsentrasjon 0,1 mg/ml; buffer 0,05M glycin; pH 9,5; merkaptan 4 ekvivalenter -SH pr. -SSO^ ; tid 18 timer; temperatur 6°C.

Man fikk de følgende utbytter av proinsulin, slik dette ble bestemt ved hjelp av HPLPLC:

Eksempel 8: Effekt av type av protein

Man brukte fremgangsmåten fra eksempel 1 for

å bestemme effekten av proteintypen på utbyttet av proinsulin fra lineærkjedet S-sulfonat proinsulin i en serie reaksjoner som ble utført samtidig. Reaksjonsbetingelsene var følgende: proteinkonsentrasjon 0,1 mg/ml; buffer 0,05M glycin; pH 9,5; merkaptan, 2-merkaptoetanol i en mengde som ga 4 ekvivalenter -SH pr -SSO^ ; tid 18 timer; temperatur 6°C.

Man oppnådde følgende utbytter av proinsulin, bestemt ved hjelp av HPLPLC:

Eksempel 9: Fremstilling av humant proinsulin

Det ble fremstilt en oppløsning av 169,3 mg biosyntetisk fremstilt lineærkjedet S-sulfonat humant proinsulin i 338,6 ml, avgasset 0,05M glycin med en pH = 10,54. Denne oppløsning ble tilsatt 7,71 ml av en vandig 2-merkaptoetanol lagerløsning som ved titrering med Ellmans reagens viste seg å ha en merkaptankonsentrasjon på 2,08 mg/ml. Dette representerer 2 ekvivalenter 2-merkaptoetanol pr. -SSO^ i det lineærkjedede S-sulfonat humane proinsulin. Den endelige pH på 10,52 ble oppnådd ved en svak justering ved å bruke 5N natriumhydroksyd. Oppløsningen ble lukket med en parafilm og rørt ved 6°C i 18 timer.

Reaksjonsblandingen ble så surgjort til pH 2,9+0,1 (temperaturjustert) ved å bruke konsentrert saltsyre. Den resulterende klare oppløsningen ble påsatt en Sephadex G-25 grov avsaltningskolonne. Kromatograferingsbetingelsene var følgende: oppløsningsmiddel 2% eddiksyre (v/v); kolonnestørrelse 5 x 100 cm; temperatur 25°C; strømningshastighet 28,8 ml/minutt; fraksjonsvolum 20,2 ml.

De første 779 ml fra kolonnen ble kastet, mens de neste 4 64 ml ble oppsamlet. På basis av optisk tetthet målt ved 280 nm, ble det bestemt at dette var proteinfrak-sjonen. Kolonnen ble vasket med ytterligere 2500 ml 2% eddiksyre. Beregninger basert på UV-spektrumet av protein-fraksjonen indikerte en innvinning av 164 mg protein,- og dette representerer 101,9% av den mengde som var påsatt kolonnen.(Det teoretiske utbyttet av omdanningsreaksjonen). Nevnte proteinfraksjon ble frosset og lyofilisert til tørr-het.

Det forønskede produkt ble isolert ved hjelp av gelfiltreringskromatografi. Det tørkede materiale (uveiet) ble o<p>pløst i 20 ml IM eddiksyre. Den resulterende klare oppløsning ble påsatt en "Sephadex G-50"-superfin kolonne. Kromatograferingsbetingelsene: oppløsningsmiddel IM eddiksyre; kolonnestørrelse 2,5 x 12 5cm; temperatur 25°C; strømningshastighet 0,82 ml/minutt; fraksjonsvolum 4,9 2 ml.

Man målte absorbsjonen ved 280 nm og kolonnen ble eluert ved IM eddiksyre over natten. Ut fra den resulterende kurven med hensyn til absorbsjon ved 280 nm i forhold til fraksjonstallet så fikk man 2 hovedtopper. Den minste og første toppen representerer sammenklumpede former av humant proinsulin. Den annen topp var monomerisk humant proinsulin. Den hadde også en skulder på forsiden. Det ble oppsamlet tre prosjoner av fraksjoner. Fraksjonene ble slått sammen og deres volumer var: Porsjon I: fraksjon 46-67 (218-325,5 ml) Porsjon II: fraksjon 68-81 (325,5-395,5 ml) Porsjon III: fraksjon 82-100 (395,5-490,3 ml)

Ut fra UV-spektrene av disse porsjonene ble følgende mengder protein beregnet:

Porsjon I: 22,1 mg

Porsjon II: 28,3 mg

Porsjon III: 103,6 mg

Dette utgjorde totalt 154 mg og representerer en 94% innvinning av den mengde som var påsatt kolonnen.

Av den mengde som ble innvunnet var 67,3% monomerisk humanproinsulin. Alle 3 porsjonene ble frosset og lyofilisert til tørrhet.

Totalt ble 106,55 m tørrmateriale oppsamlet

fra porsjon III. Det ble fastslått at dette var humant proinsulin ved hjelp av aminosyreanalyse og polyakrylamid-skivegelelektroforese. Produktet ble også eluert ved hjelp av HPLC til en stilling som tilsvarer den man ville få fra humant proinsulin i forhold stofeproinsulin. Det ble videre fastslått at ved å behandle produktet med trypsin og karboksypeptidase B fikk man fremstilt humant insulin.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en insulin-

   forløner med følgende formel

   hvor R er hydrogen, en kjemisk eller enzymatisk spaltbar aminosyrerest, eller en kjemisk eller enzymatisk spaltbar peptidgruppe med minst to aminosyrerester; Y er -Lys Z- , hvor Z er Ala, Thr, eller Ser, gruppen fra (B-29) (B-30) A-I til A-21 er en insulin A-kjede, gruppen fra B-l til B-30 er en insulin B-kjede, og X er en gruppe som er forbundet med insulin A-kjeden ved aminogruppen i A-I og til insulin B-kjeden ved e-aminogruppen i B-29 eller karboksylgruppen i B-30, og hvor nevnte gruppe kan enzymatisk eller kjemisk avspaltes uten at man bryter i stykker A-kjeden eller B-kjeden, karakterisert ved at man omsetter et S-sulfonat med følgende formel

   hvor R, X og Y er som definert ovenfor, med et merkaptan i en mengde som tilveiebringer fra 1 til 5 -SH-grupper pr -SSO^-gruppe i et vandig medium ved en pH fra 7 til 11,5 og ved en S-sulfonatkonsentrasjon på opp til 10 mg/ml vandig medium.