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KR20180107111A - 암 및 면역학적 장애를 치료하기 위한 bcma 항체 및 이의 용도 - Google Patents

암 및 면역학적 장애를 치료하기 위한 bcma 항체 및 이의 용도 Download PDF

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KR20180107111A
KR20180107111A KR1020187021211A KR20187021211A KR20180107111A KR 20180107111 A KR20180107111 A KR 20180107111A KR 1020187021211 A KR1020187021211 A KR 1020187021211A KR 20187021211 A KR20187021211 A KR 20187021211A KR 20180107111 A KR20180107111 A KR 20180107111A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
ser
seq
thr
gly
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020187021211A
Other languages
English (en)
Inventor
장고 서스만
모린 라이언
로리 웨스텐도르프
마이클 펠드하우스
Original Assignee
시애틀 지네틱스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 시애틀 지네틱스, 인크. filed Critical 시애틀 지네틱스, 인크.
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Abstract

본 발명은 BCMA에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체를 제공한다. 항체는 다양한 암 및 면역 장애의 치료 및 진단뿐만 아니라 BCMA의 검출에 유용하다.

Description

암 및 면역학적 장애를 치료하기 위한 BCMA 항체 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 2월 17일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/296,594호 및 2016년 9월 16일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/396,084호의 유익을 주장하며, 이들 기초출원 둘 다 모든 목적을 위해 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
서열목록에 대한 참조
본 출원에 개시된 서열은 본 명세서와 함께 제출된 서열목록에 포함된다.
B-세포 성숙 항원(BCMA, CD269)은 TNF 수용체 슈퍼패밀리의 구성원이다. BCMA의 발현은 B-세포 계통으로 제한되며, 이는 배중심의 모낭사이 영역에서 그리고 분화 혈장 세포 및 혈장 아구 상에서 우세하게 발현된다. BCMA는 2개의 별개의 리간드, 즉, 증식 유도 리간드(APRIL) 및 B-세포 활성화 인자(BAFF, 또한 BlyS, TALL-1 및 THANK로서 알려짐)에 결합한다. BCMA에 대한 리간드는 2가지의 추가적인 수용체, 즉, 막 활성자 및 칼슘 조절자 및 사이클로필린 리간드 상호작용자(TACI) 및 BAFF 수용체(BR3으로도 불리는 BAFF-R)에 결합한다. TACI은 APRIL 및 BAFF에 결합하는 반면, BAFF-R은 BAFF에 대해 제한되지만 고친화도 결합을 나타낸다. 종합하면, BCMA, TACI, BAFF-R 및 그들의 대응하는 리간드는 체액성 면역, B-세포 발생 및 항상성의 상이한 양상을 조절한다.
BCMA는 사실상 미경험 및 기억 B 세포 상에 없지만(Novak et al., Blood 103, 689-94 (2004)), 혈장 세포 분화 동안 선택적으로 유도되는데, 이는 정상 혈장 세포 및 혈장 아구의 생존을 촉진시킴으로써 체액성 면역을 지지할 수 있다(O'Conner et al., J. Exp Med. 199, 91-98 (2004)). BCMA는 원발성 다발성 골수종(MM) 샘플에서 발현되는 것으로 보고되었다. BCMA는 또한 호지킨 질환을 갖는 환자로부터의 리드-스텐버그 세포(Reed-Sternberg cell)(CD30+) 상에서 검출되었다. BCMA는 호지킨병 세포주의 증식과 생존 둘 다에 기여하는 넉다운(knockdown) 실험에 기반하는 것으로 보고되었다(Chiu et al., Blood 109,729-39 (2007)).
본 발명은 ATCC PTC-6937로서 기탁된 항체의 인간화된 형태 또는 키메라 형태인 인간화된, 키메라 또는 베니어(veneered) 항체를 제공한다. 선택적으로, 항체는 hSG16.17 VH3(서열번호 13)에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역 및 hSG16.17 VK2(서열번호 19)에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함한다. 선택적으로, 항체는 hSG16.17 VH3(서열번호 13)에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역 및 hSG16.17 VK2(서열번호 19)에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함한다. 선택적으로, 항체는 hSG16.17 VH3(서열번호 13)의 3개의 카바트(Kabat) CDR(서열번호 60 내지 62) 및 hSG16.17 VK2(서열번호 19)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 90 내지 92)을 포함하되, 단, 위치 H58은 N 또는 K에 의해 점유될 수 있고, 위치 H60은 A 또는 N에 의해 점유될 수 있으며, 위치 H61은 Q 또는 E에 의해 점유될 수 있고, 위치 H62은 K 또는 N에 의해 점유될 수 있으며, 위치 H64는 Q 또는 K에 의해 점유될 수 있고, 위치 H65는 G 또는 T에 의해 점유될 수 있으며, 위치 L24는 R 또는 L에 의해 점유될 수 있고, 위치 L53은 S 또는 R에 의해 점유될 수 있다. 선택적으로, 상기 항체는 hSG16.17 VH3(서열번호 13)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 60 내지 62) 및 hSG16.17 VK2(서열번호 19)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 90 내지 92)을 포함한다. 선택적으로, 위치 H58, H60, H61, H62, H64 및 H65는 각각 N, A, Q, K, Q 및 G에 의해 각각 점유되고, L24 및 L53은 R 및 S에 의해 각각 점유된다. 선택적으로, 위치 H20, H48, H69, H71, H73, H76, H80, H88, H91 및 H93은 L, I, M, A, K, N, V, A, F 및 T에 의해 각각 점유되고, 그리고 위치 L46, L48 및 L87은 V, V 및 F에 의해 각각 점유된다. 선택적으로, 성숙중쇄 가변 영역은 hSG16.17VH3(서열번호 13)의 서열을 갖고, 그리고 성숙 경쇄 가변 영역은 SG16.17VK2(서열번호 19)의 서열을 가진다.
본 발명은 추가로 VH(서열번호 23) 및 VK(서열번호 33) 서열을 갖는 래트 SG16.45 항체의 인간화된, 키메라 또는 베니어 형태인 인간화된, 키메라 또는 베니어 항체를 제공한다. 선택적으로, 상기 항체는 hSG16.45 VH5(서열번호 31)에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 중쇄 성숙 가변 영역 및 hSG16.45 VK2(서열번호 36)에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함한다. 선택적으로, 상기 항체는 hSG16.45 VH5(서열번호 31)에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역 및 hSG16.45 VK2(서열번호 36)에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함한다. 선택적으로, hSG16.45 VH5(서열번호 31)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 152 내지 154) 및 hSG16.45 VK2(서열번호 36)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 179 내지 181)을 포함하며, 단, 위치 H50은 A 또는 S에 의해 점유될 수 있으며, 위치 L24는 R 또는 L에 의해 점유될 수 있고, 위치 L26은 S 또는 T에 의해 점유될 수 있다. 선택적으로, 상기 항체는 hSG16.45 VH5(서열번호 31)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 152 내지 154) 및 hSG16.45 VK2(서열번호 36)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 179 내지 181)을 포함한다. 선택적으로 위치 H30, H93 및 H94는 각각 N, T 및 S에 의해 점유된다. 선택적으로, 성숙 중쇄 가변 영역은 SG16.45VH5의 서열(서열번호 31)을 갖고, 그리고 성숙 경쇄 가변 영역은 hSG16.45 VK2의 서열(서열번호 36)을 갖거나, 또는 성숙 중쇄 가변 영역은 hSG16.45 VH1의 서열(서열번호 27)을 갖고, 그리고 성숙 경쇄 가변 영역은 hSG16.45 VK1의 서열(서열번호 35)을 갖거나 또는 성숙 중쇄 가변 영역은 hSG16.45 VH1의 서열(서열번호 27)을 가지며, 성숙 경쇄 가변 영역은 hSG16.45 VK3의 서열(서열번호 37)을 가진다.
임의의 상기 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 중쇄 불변 영역에 융합될 수 있고, 성숙 경쇄 가변 영역은 경쇄 불변 영역에 융합될 수 있다. 선택적으로, 중쇄 불변 영역은 천연 인간 불변 영역에 비해 Fcγ 수용체에 대해 감소된 결합을 갖는 천연 인간 불변 영역의 돌연변이체 형태이다. 선택적으로, 중쇄 불변 영역은 IgG1 아이소타입을 가진다. 선택적으로, 중쇄 불변 영역은 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 불변 영역은 서열번호 3을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 선택적으로, 중쇄 불변 영역은 서열번호 7의 아미노산 서열(S239C)을 가지고, 경쇄 불변 영역은 서열번호 3을 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 선택적으로, 상기 항체는 네이키드 항체이다. 선택적으로, 상기 항체는 세포독성제 또는 세포정지제에 접합된다. 선택적으로, 상기 항체는 세포독성제에 접합된다. 선택적으로, 세포독성제는 효소 절단성 링커를 통해 접합된다. 선택적으로, 세포독성제는 DNA 소홈(minor groove) 결합제, 예를 들어, 하기 화학식을 갖는 세포독성제이다:
Figure pct00001
선택적으로, 세포독성제는 MMAE 또는 MMAF이다.
본 발명은 추가로 임의의 상기 기재한 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 hSG16.17 VH3(서열번호 13)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 60 내지 62) 및 hSG16.17 VK2(서열번호 19)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 90 내지 92)을 포함하는 항체를 제공한다. 추가 실시형태에서, 본 발명은 hSG16.17 VH3의 서열(서열번호 13)을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역 및 hSG16.17 VK2의 서열(서열번호 19)을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 제공한다. 다른 실시형태에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 중쇄 불변 영역에 융합되고, 성숙 경쇄 가변 영역은 경쇄 불변 영역에 융합된다. 항체는, 예를 들어, IgG1 항체일 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 항체는 푸코스 또는 푸코스 유사체에 의한 코어 푸코실화(core fucosylation)가 없다. 상기 항체는, 예를 들어, 약제학적으로 허용 가능한 담체의 첨가에 의해 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다.
추가 실시형태에서, 약제학적 조성물은 hSG16.17 VH3의 서열(서열번호 13)을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역 및 hSG16.17 VK2의 서열(서열번호 19)을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역을 갖는 복수의 항체를 가진다. 이들 항체의 가변 영역은 바람직하게는 적절한 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 융합된다. 다른 실시형태에서, 항체는 IgG1 항체이다. 추가 실시형태에서, 복수의 항체는 푸코스 또는 푸코스 유사체에 의한 코어 푸코실화를 갖는 약 5% 미만의 항체를 가진다. 추가 실시형태에서, 복수의 항체는 푸코스 또는 푸코스 유사체에 의한 코어 푸코실화를 갖는 약 10% 미만의 항체를 가진다. 다른 실시형태에서, 복수의 항체는 푸코스 또는 푸코스 유사체에 의한 코어 푸코실화를 갖는 약 2%의 항체를 포함한다. 다른 실시형태에서, 복수의 항체는 푸코스 또는 푸코스 유사체에 의한 코어 푸코실화를 갖는 2%의 항체를 포함한다.
본 발명은 추가로 환자에게 상기 기재한 바와 같은 항체의 유효 요법을 투여하는 단계를 포함하는 BCMA를 발현시키는 암을 갖거나 또는 가질 위험에 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 선택적으로, 암은 혈액암이다. 선택적으로, 혈액암은 골수종, 백혈병 또는 림프종이다. 선택적으로, 혈액암은 다발성 골수종이다. 선택적으로 혈액암은 비호지킨 림프종(NHL) 또는 호지킨 림프종이다. 선택적으로, 혈액암은 골수 형성이상 증후군(MDS), 골수증식 증후군(MPS), 발덴스트롬마크로글로불린혈증 또는 버킷 림프종이다.
본 발명은 추가로 환자에게 임의의 상기 기재한 항체의 유효 요법을 투여하는 단계를 포함하는 BCMA를 발현시키는 면역 세포에 의해 매개되는 면역 장애를 갖거나 또는 가질 위험에 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 선택적으로, 장애는 B 세포 매개 장애이다. 선택적으로, 면역 장애는 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스(SLE), I형 당뇨병, 천식, 아토피 피부염, 알레르기성 비염, 혈소판 감소성 자반병, 다발성 경화증, 건선, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 그레이브씨병, 원발성 담즙성 간경화증, 베게너 육아종증, 결핵, 및 이식편대 숙주 질환이다.
도 1A는 BCMA의 구조를 나타낸 도면.
도 1B는 BCMA의 세포외 도메인과 BAFF의 구조적 상호작용을 나타낸 도면.
도 2는 항체 선택 절차를 도시한 도면.
도 3은 비클론 하이브리도마 웰에 대한 세포 결합 데이터 및 리간드 차단 활성을 도시한 도면.
도 4는 항-BCMA 항체의 차단 활성/저해 백분율을 도시한 도면.
도 5는 항-BCMA 항체로 적정한 APRIL 차단의 저해를 도시한 도면.
도 6은 항-BCMA 항체를 이용하여 차단하는 BAFF의 적정을 도시한 도면.
도 7은 인간 VH 수용자 서열, HV1-2/HJ3과 함께 hSG16.17 중쇄 변이체의 정렬을 도시한 도면. 이는 카바트 CDR(서열번호 39 내지 41) 및 IMGT CDR(서열번호 42 및 43)을 갖는 래트 SG16.17 vH(서열번호 8); 카바트 CDR(서열번호 44 및 45) 및 IMGT CDR(서열번호 46 및 "AR")을 갖는 Hu HV1-2/HJ3(서열번호 9); 카바트 CDR(서열번호 50 내지 52) 및 IMGT CDR(서열번호 53 및 54)을 갖는 hSG16.17 vH1 (서열번호 11); 카바트 CDR(서열번호 55 내지 57) 및 IMGT CDR(서열번호 58 및 59)을 갖는 hSG16.17 vH2(서열번호 12); 카바트 CDR(서열번호 60 내지 62) 및 IMGT CDR(서열번호 63 및 64)을 갖는 hSG16.17 vH3(서열번호 13); 및 카바트 CDR(서열번호 65 내지 67) 및 IMGT CDR(서열번호 68 및 69)을 갖는 hSG16.17 vH4(서열번호 14)를 나타낸다.
도 8은 인간 VH 수용자 서열; HV1-46/HJ3과 함께 hSG16.17 중쇄 변이체의 배열을 도시한 도면. 이는 카바트 CDR(서열번호 39 내지 41) 및 IMGT CDR(서열번호 42 및 43)을 갖는 래트 SG16.17 vH(서열번호 8); 카바트 CDR(서열번호 47 및 48) 및 IMGT CDR(서열번호 49 및 "AR")을 갖는 Hu HV1-46/HJ3(서열번호 10); 카바트 CDR(서열번호 70 내지 72) 및 IMGT CDR(서열번호 73 및 74)을 갖는 hSG16.17 vH5 (서열번호 15); 및 카바트 CDR(서열번호 75 내지 77) 및 IMGT CDR(서열번호 78 및 79)을 갖는 hSG16.17 vH6(서열번호 16)의 서열을 나타낸다.
도 9는 hSG16.17 중쇄 변이체의 정렬을 도시한 도면. 이는 hSG16.17 vH1-6의 서열(서열번호 11 내지 16)을 나타낸다.
도 10은 인간 VK 수용자 서열; KV1-12/KJ5와 함께 hSG16.17 경쇄 변이체의 정렬을 도시한 도면. 이는 카바트 CDR(서열번호 80 내지 82) 및 IMGT CDR(각각 서열번호 83, "TTS" 및 서열번호 84)을 갖는 래트 SG16.17 vK(서열번호 17); 카바트 CDR(서열번호 85-87) 및 IMGT CDR(각각 서열번호 88, "AAS", 및 서열번호 89)을 갖는 Hu KV1-12/KJ5(서열번호 18); 카바트 CDR(서열번호 90 내지 92) 및 IMGT CDR(각각 서열번호 93, "TTS", 및 서열번호 94)를 갖는 hSG16.17 VK2(서열번호 19); 카바트 CDR(서열번호 95 내지 97) 및 IMGT CDR(각각 서열번호 98, "TTS", 및 서열번호 99)을 갖는 hSG16.17 vK3(서열번호 20); 카바트 CDR(서열번호 100-102) 및 IMGT CDR(각각 서열번호 103, "TTS", 및 서열번호 104)을 갖는 hSG16.17 vK4(서열번호 21); 및 카바트 CDR(서열번호 105 내지 107) 및 IMGT CDR(각각 서열번호 108, "TTS", 및 서열번호 109)을 갖는 hSG16.17 vK5(서열번호 22)의 서열을 나타낸다.
도 11은 hSG16.17 경쇄 변이체의 정렬을 도시한 도면. 이는 hSG16.17 vK2, vK3, vK4, vK5의 서열(서열번호 19 내지 22)을 나타낸다.
도 12는 인간 FcRIIIa에 대한 키메라 SG16.17의 결합을 나타내는 경쟁 결합 분석을 도시한 도면.
도 13은 키메라 SG16.17이 FcγRIIIA를 통해 신호전달을 유도한다는 것을 도시한 도면.
도 14는 인간 HV 수용자 서열 HV3-23/HJ3과 함께 hSG16.45 중쇄 변이체의 정렬을 도시한 도면. 이는 카바트 CDR(서열번호 110 내지 112) 및 IMGT CDR(서열번호 113-115)을 갖는 래트 SG16.45 vH(서열번호 23); 카바트 CDR(서열번호 116 및 117) 및 IMGT CDR(각각 서열번호 118 및 119, 및 "AK")을 갖는 Hu HV3-23/HJ3(서열번호 24); 카바트 CDR(서열번호 128 내지 130) 및 IMGT CDR(서열번호 131 내지 133)을 갖는 hSG16.45 vH1 (서열번호 27); 카바트 CDR(서열번호 134 내지 136) 및 IMGT CDR(서열번호 137 내지 139)을 갖는 hSG16.45 vH2(서열번호 28); 카바트 CDR(서열번호 140 내지 142) 및 IMGT CDR(서열번호 143 내지 145)을 갖는 hSG16.45 vH3(서열번호 29); 및 카바트 CDR(서열번호 146 내지 148) 및 IMGT CDR(서열번호 149-151)을 갖는 hSG16.45 vH4(서열번호 30)의 서열을 나타낸다.
도 15는 인간 HV 수용자 서열 HV3-74/HJ3을 갖는 hSG16.45 중쇄 변이체의 정렬을 도시한 도면. 이는 카바트 CDR(서열번호 110 내지 112) 및 IMGT CDR(서열번호 113 내지 115)를 갖는 래트 SG16.45 vH(서열번호 23); 카바트 CDRs (서열번호 120 및 121) 및 IMGT CDR(각각 서열번호 122 및 123, 및 "AR")을 갖는 Hu HV3-74/HJ3(서열번호 25); 카바트 CDR(서열번호 152 내지 154) 및 IMGT CDR(서열번호 155-157)을 갖는 hSG16.45 vH5(서열번호 31)의 서열을 나타낸다.
도 16은 인간 HV 수용자 서열 HV3-9/HJ3을 갖는 hSG16.45 중쇄 변이체의 정렬을 도시한 도면. 이는 카바트 CDR(서열번호 110 내지 112) 및 IMGT CDR(서열번호 113 내지 115)을 갖는 래트 SG16.45 vH(서열번호 23); 카바트 CDRs (서열번호 124 및 125) 및 IMGT CDR(각각 서열번호 126 및 127, 및 "AR")을 갖는 Hu HV3-9/HJ3(서열번호 26); 카바트 CDR(서열번호 158 내지 160) 및 IMGT CDR(서열번호 161 내지 163)을 갖는 hSG16.45 vH6(서열번호 32)의 서열을 나타낸다.
도 17은 hSG16.45 중쇄 변이체의 정렬을 도시한 도면. 이는 hSG16.45 vH1-6의 서열(서열번호 27 내지 32)을 나타낸다.
도 18은 인간 KV 수용자 서열 KV3-20/KJ2를 갖는 hSG16.45 경쇄 변이체의 정렬을 도시한 도면. 이는 카바트 CDR(서열번호 164 내지 166) 및 IMGT CDR(각각 서열번호 167, "STS" 및 서열번호 168)을 갖는 래트 SG16.45 vK (서열번호 33); 카바트 CDR(서열번호 169 내지 171) 및 IMGT CDR(각각 서열번호 172, "STS" 및 서열번호 173)을 갖는 Hu KV3-20/KJ2 (서열번호 34); 카바트 CDR(서열번호 174 내지 176) 및 IMGT CDR(각각 서열번호 177, "STS", 및 서열번호 178)을 갖는 hSG16.45 vK1(서열번호 35); 카바트 CDR(서열번호 179 내지 181) 및 IMGT CDR(각각 서열번호 182, "STS" 및 서열번호 183)을 갖는 hSG16.45 vK2(서열번호 36); 카바트 CDR(서열번호 184 내지 186) 및 IMGT CDR(각각 서열번호 187, "STS" 및 서열번호 188)을 갖는 hSG16.45 vK3(서열번호 37); 및 카바트 CDR(서열번호 189 내지 191) 및 IMGT CDR(각각 서열번호 192, "STS", 및 서열번호 193)을 갖는 hSG16.45 vK5(서열번호 38)의 서열을 나타낸다.
도 19는 hSG16.45 경쇄 변이체의 정렬을 도시한 도면. 이는 hSG16.45 vK1, vK2, vK3, vK5의 서열(서열번호 35 내지 38)을 나타낸다.
도 20A 내지 도 20C는 SCID 마우스에서 MM1S 파종성 종양 모델에서의 다회 용량 hSG16.17-SEA의 생체내 활성을 도시한 도면.
도 21A 내지 21C는 NSG 마우스에서 EJM 파종성 종양 모델에서의 단일 용량 hSG16.17-SEA의 생체내 활성을 도시한 도면.
도 22는 NSG 마우스에서 NCI-H929-루시퍼라제 파종성 종양 모델에서의 다회 용량 hSG16.17-SEA의 생체내 활성을 도시한 도면.
도 23A 내지 도 23B는 NSG 마우스에서 NCI-H929-루시퍼라제 파종성 종양 모델에서의 단일 용량 hSG16.17-SEA의 생체내 활성을 도시한 도면.
도 24는 SCID 마우스에서 MOLP-8-루시퍼라제 파종성 종양 모델에서의 단일 용량 hSG16.17-SEA의 생체내 활성을 제공하는 도면.
도 25는 MM1R 표적 세포 상의 SG16.17 SEA 항체의 ADCC 활성을 제공하는 도면.
정의
"단리된" 항체는 천연 환경의 성분으로부터 단리 및 분리되고/되거나 회수된 항체 및/또는 재조합적으로 생성된 항체를 지칭한다. "정제된 항체"는 전형적으로 적어도 50% w/w 순도의 간섭 단백질 및 그의 생성 또는 정제로부터 생기는 다른 오염물질인 항체이지만, 단클론성 항체는 과량의 약제학적으로 허용 가능한 담체(들) 또는 그의 사용을 용이하게 하는 것으로 의도된 다른 비히클과 조합될 가능성을 배제하지 않는다. 간섭 단백질 및 기타 오염물질은, 예를 들어, 항체로부터 단리되거나 또는 재조합적으로 생성된 세포의 세포 성분을 포함할 수 있다. 때때로 단클론성 항체는 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95 또는 99% w/w 순도의 간섭 단백질 및 생성 또는 정제로부터의 오염물질이다. 래트, 키메라, 베니어 및 인간화된 항체를 포함하는 본 명세서에 기재된 항체는 단리 및/또는 정제된 형태로 제공될 수 있다.
"단클론성 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 얻어진 항체를 지칭하며, 즉, 집단을 포함하는 개개 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 유래 돌연변이를 제외하고 동일하다. 변형어 "단클론성"은 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 얻어지는 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의해 항체의 생성을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 단클론성 항체는 문헌[Kohler et al. (1975) Nature 256:495]에 의해 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4816567호 참조). "단클론성 항체"는 또한 문헌[Clackson et al. (1991) Nature, 352:624-628 및 Marks et al. (1991) J. Mol . Biol ., 222:581-597]에 기재된 기법을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있거나, 예를 들어 다른 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 명세서에 기재된 항체는 단클론성 항체이다.
단클론성 항체의 그의 표적 항원에 대한 특이적 결합은 적어도 106, 107, 108, 109 또는 1010 M-1의 친화도를 의미한다. 특이적 결합은 규모가 검출 가능하게 더 크며, 적어도 하나의 비관련 표적에 대해 생기는 비특이적 결합과 구별 가능하다. 특이적 결합은 특정 작용기 또는 특정 공간적 맞춤(예를 들어, 자물쇠와 열쇠형) 사이의 결합 형성 결과일 수 있는 반면, 비특이적 결합은 보통 반데르발스힘의 결과이다.
기본적 항체 구조 단위는 서브유닛의 4량체이다. 각각의 4량체는 폴리펩타이드 쇄의 2개의 동일한 쌍을 포함하며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50 내지 70kDa)를 가진다. 각각의 쇄의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 초래하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 가변 영역을 포함한다. 절단 가능한 신호 펩타이드에 연결된 이 가변 영역은 초기에 발현된다. 신호 펩타이드가 없는 가변 영역은 때때로 성숙 가변 영역으로서 지칭된다. 따라서, 예를 들어, 경쇄 성숙 가변 영역은 경쇄 신호 펩타이드가 없는 경쇄 가변 영역을 의미한다. 각각의 쇄의 카복시-말단 부분은 주로 효과기 기능을 초래하는 불변 영역을 정한다.
경쇄는 카파 또는 람다 중 하나로서 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로서 분류되고, 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로서 항체의 아이소타입을 정한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 결합되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. (일반적으로 모든 목적을 위해 전문이 참고로 포함된 문헌[Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7] 참조).
각각의 경쇄/중쇄쌍의 성숙 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 무손상 항체는 2개의 결합 부위를 가진다. 2작용성 또는 이중특이성 항체에서를 제외하고, 2개의 결합 부위는 동일하다. 쇄들은 모두 상보성 결정 영역 또는 CDR로도 불리는 3개의 초가변 영역에 의해 결합되는 상대적으로 보존된 프레임워크 영역(FR)의 동일한 일반적 구조를 나타낸다. 각각의 쌍의 2개 쇄로부터의 CDR은 특정 에피토프에 대한 결합을 가능하게 하는 프레임워크 영역에 의해 정렬된다. N-말단으로부터 C-말단까지, 경쇄와 중쇄는 둘 다 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각각의 도메인에 대한 아미노산의 부여는 카바트 정의, 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991), 또는 Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883(1989)], 또는 카바트 및 코티아(Chothia), 또는 IMGT, AbM 또는 Contact 또는 CDR의 다른 통상적인 정의의 복합에 따른다. 카바트는 또한 널리 사용되는 넘버링 관례(카바트 넘버링)를 제공하며, 이때 상이한 중쇄 사이의 또는 상이한 경쇄 사이의 대응하는 잔기는 동일한 수가 부여된다. 내용으로부터 달리 명확하지 않다면, 카바트 넘버링은 가변 영역 내 아미노산의 위치를 지정하기 위해 사용된다. 내용으로부터 달리 명확하지 않다면, EU 넘버링은 불변 영역에서 위치를 지정하기 위해 사용된다.
용어 "항체"는 무손상 항체 및 이의 결합 단편을 포함한다. 전형적으로, 항체 단편은 그들로부터 별개의 중쇄, 경쇄 Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, 다이어바디, Dab, 나노바디 및 Fv를 포함하는 표적에 대한 특이적 결합이 유래된 무손상 항체와 경쟁한다. 단편은 재조합 DNA 기법에 의해, 또는 무손상 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 분리에 의해 생성될 수 있다. 용어 "항체"는 또한 다이어바디(동종이량체 Fv 단편) 또는 미니바디(VL-VH-CH3), 이중특이성 항체 등을 포함한다. 이중특이성 또는 2작용성 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 혼성 항체이다(예를 들어, 문헌[Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol.,79:315-321(1990); Kostelny et al.,J. Immunol.,148:1547-53(1992)] 참조).
용어 "항체"는 항체 단독(네이키드 항체) 또는 세포독성 또는 세포정지 약물에 접합된 항체를 포함한다.
키메라 항체는 비인간 항체(예를 들어, 마우스)의 경쇄 및 중쇄의 성숙 가변 영역이 인간 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 조합되는 항체이다. 이러한 항체는 실질적으로 또는 전체적으로 마우스 항체의 결합 특이성을 보유하며, 인간 서열의 약 2/3이다.
베니어 항체는 비인간 항체의 일부 그리고 보통 모든 CDR 및 일부의 비인간 가변 영역 프레임워크 잔기를 보유하지만, B- 또는 T-세포 에피토프, 예를 들어 노출 잔기에 기여할 수 있는 다른 가변 영역 프레임워크 잔기(Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991)를 인간 항체 서열의 대응하는 위치로부터의 잔기로 대체하는 인간화된 항체의 유형이다. 결과는 CDR이 비인간 항체로부터 전체적으로 또는 실질적으로 유래되고, 비인간 항체의 가변 영역 프레임워크가 치환에 의해 더 인간 유사하게 제조되는 항체이다.
용어 "에피토프"는 항체가 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 하나 이상의 단백질의 3차 폴딩에 의해 나란히 놓이는 인접한 아미노산 또는 비인접 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 인접한 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 대한 노출에 대해 보유되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 의한 처리에 대해 상실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간적 입체배좌에서 적어도 3, 더 보통으로는, 적어도 5 또는 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 입체배좌를 결정하는 방법은, 예를 들어, x-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)] 참조.
동일 또는 중복 에피토프를 인식하는 항체는 표적 항원에 대한 다른 항체의 결합과 경쟁하는 하나의 항체의 능력을 나타내는 단순한 면역분석에서 동정될 수 있다. 항체의 에피토프는 또한 접촉 잔기를 동정하기 위해 항원에 결합된 항체의 X-선 결정학에 의해 정해질 수 있다. 대안적으로, 2개의 항체는 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 또는 제거하는 항원에서의 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 또는 제거한다면 동일한 에피토프를 가진다. 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 또는 제거하는 일부 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 또는 제거한다면 2개의 항체는 중복 에피토프를 가진다.
항체 사이의 경쟁은 시험 하의 항체가 공통 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 저해하는 분석에 의해 결정된다(예를 들어, 문헌[Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990)] 참조. 과량의 시험 항체(예를 들어, 적어도 2x, 5x, 10x, 20x 또는 100x)가 경쟁적 결합 분석에서 측정하여 적어도 50% 그러나 바람직하게는 75%, 90% 또는 99%만큼 기준 항체의 결합을 저해한다면, 시험 항체는 기준 항체와 경쟁한다. 경쟁 분석(경쟁 항체)에 의해 동정된 항체는 기준 항체 및 입체 장애가 생기는 기준 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접하는 인접한 에피토프에 결합하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 인간 BCMA 단백질에 대한 결합을 위해 h2H12 항체와 경쟁하는 항체는 본 개시내용에 포함된다.
용어 "환자"는 예방적 또는 치료적 처리를 받는 인간 및 다른 포유류 대상체를 포함한다.
아미노산 치환을 보존적 또는 비보존적으로서 분류하는 목적을 위해, 아미노산은 다음과 같이 그룹화된다: 그룹 I(소수성 측쇄): met, ala, val, leu, ile; 그룹 II(중성 친수성 측쇄): cys, ser, thr; 그룹 III(산성 측쇄): asp, glu; 그룹 IV(염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; 그룹 V(쇄 배향에 영향을 미치는 잔기): gly, pro; 및 그룹 VI(방향족 측쇄): trp, tyr, phe. 보존적 치환은 동일한 분류의 아미노산 사이의 치환을 수반한다. 비보존적 치환은 이들 분류 중 하나의 구성원을 다른 분류의 구성원으로 교환하는 것으로 구성된다.
서열 동일성 백분율은 카바트 넘버링 관례에 의해 최대로 정렬되는 항체 서열에 의해 결정된다. 정렬 후에, 대상 항체 영역(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 전체 성숙 가변 영역)을 기준 항체의 동일 영역과 비교한다면, 대상과 기준 항체 영역 사이의 서열 동일성 백분율은 대상과 기준 항체 영역 둘 다에서의 동일한 아미노산에 의해 점유되는 위치의 수를 계수화하지 않은 갭을 갖는 두 영역의 정렬 위치의 총 수로 나누고 100을 곱하여서 백분율로 전환하는 것이다.
하나 이상의 열거된 요소를 "포함하는" 조성물 또는 방법은 구체적으로 열거되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체를 포함하는 조성물은 단독으로 또는 다른 성분과 조합하여 항체를 포함할 수 있다.
다양한 값의 표기는 범위 내의 또는 범위를 정하는 모든 정수를 포함한다.
항체 효과기 기능은 Ig의 Fc 도메인(들)에 의해 기여되는 기능을 지칭한다. 이러한 기능은, 예를 들어, 항체-의존적 세포의 세포독성, 항체-의존적 세포의 식균 작용 또는 상보체-의존적 세포독성일 수 있다. 이러한 기능은, 예를 들어, 식세포 또는 요해 활성을 갖는 면역 세포 상에서의 Fc 수용체에 대한 Fc 효과기 도메인(들)의 결합에 의해 또는 상보체 시스템의 성분에 대한 Fc 효과기 도메인(들)의 결합에 의해 달성될 수 있다. 전형적으로, Fc-결합 세포 또는 상보체 성분에 의해 매개되는 효과(들)는 BCMA 표적화된 세포의 저해 및/또는 고갈을 초래한다. 항체의 Fc 영역은 Fc 수용체(FcR)-발현 세포를 동원할 수 있으며, 그들을 항체-코팅된 표적 세포와 나란이 둘 수 있다. FcγRIII(CD16), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD64)을 포함하는 IgG에 대해 표면 FcR을 발현시키는 세포는 IgG-코팅 세포의 파괴를 위한 효과기 세포로서 작용할 수 있다. 이러한 효과기 세포는 단핵구, 대식세포, 자연 살해(NK) 세포, 호중구 및 호산구를 포함한다. IgG에 의한 FcγR의 맞물림은 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC) 또는 항체-의존적 세포의 식균 작용(ADCP)을 활성화시킨다. ADCC는 막 기공-형성 단백질 및 프로테아제의 분비를 통해 CD16+ 효과기 세포에 의해 매개되는 반면, 식균 작용은 CD32+ 및 CD64+ 효과기 세포에 의해 매개된다(문헌[Fundamental Immunology, 4th ed., Paul ed., Lippincott-Raven, N.Y., 1997, Chapters 3, 17 and 30; Uchida et al., 2004, J. Exp. Med . 199:1659-69; Akewanlop et al., 2001, Cancer Res. 61:4061-65; Watanabe et al., 1999, Breast Cancer Res. Treat. 53:199-207] 참조). ADCC 및 ADCP에 추가로, 세포-결합 항체의 Fc 영역은 또한 상보체-의존적 세포독성(CDC)을 유발하기 위해 상보체 고전적 경로를 활성화시킬 수 있다. 상보체 시스템의 C1q는 그들이 항원과 복합체화될 때 항체의 Fc 영역에 결합한다. 세포-결합 항체에 대한 C1q의 결합은 C3 전환효소를 생성하기 위해 C4 및 C2의 단백질분해 활성화를 수반하는 사건의 캐스케이드를 개시할 수 있다. C3 전환효소에 의한 C3의 C3b로의 절단은 C5b, C6, C7, C8 및 C9를 포함하는 말단 상보체 성분의 활성화를 가능하게 한다. 종합적으로, 이들 단백질은 항체-코팅된 세포 상에서 막-공격 복합체 기공을 형성한다. 이들 기공은 표적 세포를 사멸시키는 세포 막 완전성을 파괴한다(문헌[Immunobiology, 6th ed., Janeway et al., Garland Science, N. Y., 2005, Chapter 2] 참조).
용어 "항체-의존적 세포의 세포독성" 또는 ADCC는 항체-코팅된 표적 세포와 면역 세포 소유 용해 활성(또한 효과기 세포로서 지칭됨)과의 상호작용에 의존하는 세포사를 유도하기 위한 메커니즘이다. 이러한 효과기 세포는 자연 살해 세포, 단핵구/대식세포 및 호중구를 포함한다. 효과기 세포는 그들의 항원-조합 부위를 통해 표적 세포에 결합된 Ig의 Fc 효과기 도메인(들)에 부착한다. 항체-코팅된 표적 세포의 사멸은 효과기 세포 활성의 결과로서 생긴다.
용어 "항체-의존적 세포의 식균 작용" 또는 ADCP는 항체-코팅된 세포에 의해 Ig의 Fc 효과기 도메인(들)에 결합하는 식균작용 면역 세포(예를 들어, 대식세포, 호중구 및 수지상 세포)에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 내재화된 과정을 지칭한다.
용어 "상보체-의존적 세포독성" 또는 CDC는 표적-결합 항체의 Fc 효과기 도메인(들)이 표적 세포막 내 구멍의 형성에서 절정에 달하는 일련의 효소 반응을 활성화시키는 세포사를 유도하기 위한 메커니즘을 지칭한다. 전형적으로, 항원-항체 복합체, 예컨대 항체-코팅된 표적 세포 상의 항원-항체 복합체는 상보체 성분 C1q에 결합하고, 활성화시키는데, 이는 결국 표적 세포사를 야기하는 상보체 캐스케이드를 활성화시킨다. 상보체의 활성화는 또한 백혈구 상의 상보체 수용체(예를 들어, CR3)에 결합함으로써 ADCC를 용이하게 하는 표적 세포 표면 상의 상보체 성분의 침착을 초래할 수 있다.
"세포독성 효과"는 표적 세포의 고갈, 제거 및/또는 사멸을 지칭한다. "세포독성제"는 세포 상에서 세포독성 효과를 갖는 제제를 지칭한다.
세포독성제는 항체에 접합되거나 또는 항체와 조합하여 투여될 수 있다.
"세포정지 효과"는 세포 증식의 저해를 지칭한다. "세포정지제"는 세포 상에서 세포정지 효과를 가짐으로써, 세포의 특정 서브세트의 성장 및/또는 확장을 저해하는 제제를 지칭한다. 세포정지제는 항체에 접합되거나 또는 항체와 조합하여 투여될 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 동물에서, 그리고 더 구체적으로는 인간에서 사용하기 위해 연방정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 또는 승인 가능하고 미국약전 또는 다른 일반적으로 인식되는 약전에서 열거된 것을 의미한다. 용어 "약제학적으로 적합한 성분"은 항-BCMA 항체와 함께 대상체에게 투여되는 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다.
어구 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 항-BCMA-1 항체 또는 이의 접합체의약제학적으로 허용 가능한 유기 또는 무기 염 또는 항-BCMA-1 항체와 함께 투여되는 제제를 지칭한다. 예시적인 염은 황산염, 시트르산염, 아세트산염, 옥살산염, 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 질산염, 중황산염, 인산염, 산 인산염, 아이소니코틴산염, 락트산염, 살리실산염, 산 시트르산염, 주석산염, 올레산염, 타닌산염, 판토텐산염, 중주석산염, 아스코르브산염, 숙신산염, 말레산염, 겐티스산염, 퓨마르산염, 글루콘산염, 글루쿠론산염, 당산염, 폼산염, 벤조산염, 글루탐산염, 메탄설폰산염, 에탄설폰산염, 벤젠설폰산염, p-톨루엔설폰산염 및 파모산염(즉, 1,1'-메틸렌 비스-(2-하이드록시-3-나프토에이트))을 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 다른 분자, 예컨대 아세트산염 이온, 숙신산염 이온 또는 다른 반대이온의 포함을 수반할 수 있다. 반대이온은 모 화합물에 대해 전하를 안정화시키는 임의의 유기 또는 무기 모이어티일 수 있다. 더 나아가, 약제학적으로 허용 가능한 염은 그의 구조에서 1개 초과의 하전된 원자를 가질 수 있다. 다수의 하전된 원자가 약제학적으로 허용 가능한 염의 부분인 예는 다중 반대 이온을 가질 수 있다. 따라서, 약제학적으로 허용 가능한 염은 하나 이상의 하전된 원자 및/또는 하나 이상의 반대이온을 가질 수 있다.
내용으로부터 달리 분명하지 않다면, 용어 "약"은 (예를 들어, 오류 또는 실험 측정의 차이 내에서) 기능성 특성에 대해 유의한 효과를 갖지 않는 실질적이지 않은 변화를 포함한다.
상세한 설명
I. 일반
본 발명은 BCMA에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체를 제공한다. 항체는 다양한 암 및 면역학적 장애의 치료 및 진단뿐만 아니라 BCMA의 검출에 유용하다.
II. 표적 분자
달리 표시되지 않는 한, BCMA는 인간 BCMA를 의미한다. 예시적인 인간 핵산 및 아미노산 서열은 서열번호 1 및 2에 의해 제공된다. 문맥으로부터 달리 분명하지 않다면, BMCA에 대한 언급은 적어도 단백질의 세포외 도메인(대략 서열번호 2의 잔기 1 내지 54) 및 때때로 완전한 단백질을 의미한다. 마찬가지로, 문맥으로부터 달리 분명하지 않다면, BAFF 및 APRIL 및 BCMA 이외의 그들의 수용체에 대한 언급은, 예를 들어, 스위스 프롯 데이터베이스(Swiss Prot Database)에 제공된 바와 같은 야생형 인간 서열을 지칭한다.
III. 본 발명의 항체
A. 결합 특이성 및 기능적 특성
SG16.17 항체는 실시예에 기재된 바와 같은 인간 BCMA에 특이적으로 결합하는 래트 단클론성 항체이다. ATCC 기탁은 부다페스트 협약 하에 2005년 8월 15일자에 이루어졌다. ATCC는 미국 버지니아주 20110-2209 매너서스 유니버시티 불러바드 10801에 위치된다. ATCC 기탁은 수탁 번호 PTA-6937가 부여되었다. SG16.17 항체는 그의 리간드인 APRIL과 BAFF 둘 다에 대한 BCMA의 결합을 저해한다. 인간 IgG1에 연결될 때 SG16.17 항체는 ADCC를 유발하며, Fcγ 수용체에 결합하고, 이를 통해 신호전달을 유발한다. SG16.17 항체는 또한 BCMA를 발현시키는 세포 내부로 연결 약물을 전달하기 위한 항체 약물 접합체에 혼입될 수 있다. SG16.45 항체는 인간 BCMA에 특이적으로 결합하고, 그의 리간드에 대한 그의 결합을 저해하며, BCMA를 발현시키는 세포 내부에 연결 약물을 전달할 수 있는 다른 래트 단클론성 항체이다.
본 발명은 SG16.17 항체(hSG16.17, cSG16.17 또는 vSG16.17로 표기) 및 SG16.45(유사하게 표기)의 인간화, 키메라 및 베니어 형태를 제공한다. 이러한 항체는 전형적으로 상기 언급한 SG16.17 또는 SG16.45에 대한 일부 또는 모든 특성을 보유한다. 임의의 주어진 특성에 대해, 인간화된, 키메라 또는 베니어 항체는 래트 SG16.17 또는 SG16.45보다 거의 실험 오차 내에서 동일한 정도로 특성을 나타낼 수 있다. 래트 SG16.17 항체의 인간화된, 키메라 또는 베니어 형태의 친화도(즉, Ka)는 래트 SG16.17 항체보다 더 클 수 있거나, 또는 인간 BCMA에 대한 래트 SG16.17 항체보다 5배 또는 2배(즉, 초과 또는 미만) 이내일 수 있다. 바람직한 인간화된, 키메라 또는 베니어 SG16.17 항체는 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 인간 BCMA에 대한 결합에 대해 래트 SG16.17 항체와 경쟁한다. 래트 SG16.45 항체의 인간화된, 키메라 또는 베니어 형태의 친화도(즉, Ka)는 래트 SG16.45 항체보다 더 클 수 있거나, 또는 인간 BCMA에 대한 래트 SG16.45 항체보다 5배 또는 2배(즉, 초과 또는 미만) 이내일 수 있다. 바람직한 인간화된, 키메라 또는 베니어 SG16.45 항체는 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 인간 BCMA에 대한 결합에 대해 래트 SG16.45 항체와 경쟁한다.
바람직한 인간화된, 키메라 및 베니어 항체는 시험관내에서, 동물 모델 또는 임상 시험에서 나타난 바와 같이 암(예를 들어, 세포의 성장, 전이 및/또는 유기체에 대한 치사율) 또는 B-세포 매개 면역 장애를 저해한다.
B. 항체
인간화된 항체는 비인간 "공여자" 항체로부터의 CDR이 인간 "수용자" 항체 서열에 접합된 유전자 조작된 항체이다(예를 들어, 퀸(Queen)의 미국 특허 제5,530,101호 및 제5,585,089호; 윈터(Winter)의 미국 특허 제5,225,539호; 카터(Carter)의 미국 특허 제6,407,213호; 아다이르(Adair)의 미국 특허 제5,859,205호; 및 푸트(Foote)의 미국 특허 제6,881,557호 참조). 수용자 항체 서열은, 예를 들어, 성숙 인간 항체 서열, 이러한 서열의 복합물, 인간 항체 서열의 공통 서열, 또는 생식계열 영역 서열일 수 있다. SG16.17의 인간화를 위해, 중쇄에 대한 바람직한 수용자 서열은 생식계열 VH 엑손 VH1-2 및 J 엑손(JH), 엑손 JH-3이다. 경쇄에 대해, 바람직한 수용자 서열은 엑손 VL1-12 및 J 엑손 JK5이다. SG16.45의 인간화를 위해, 바람직한 중쇄 수용자 서열은 HV3-23/HJ3(서열번호 24)이고, 바람직한 경쇄 수용자 서열은 KV3-20/KJ2(서열번호 34)이다.
따라서, 인간화된 항체는 비인간 공여자 항체로부터 전체적으로 또는 실질적으로 적어도 4개의 CDR 그리고 존재한다면 인간 항체 서열로부터 전체적으로 또는 실질적으로 가변 영역 프레임워크 서열 및 불변 영역을 갖는 항체이다. 유사하게, 인간화된 중쇄는 공여자 항체 중쇄로부터 전체적으로 또는 실질적으로 적어도 2개 및 보통 모두 3개의 CDR, 및 존재한다면, 인간 중쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열로부터 실질적으로 중쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 중쇄 불변 영역을 가진다. 유사하게, 인간화된 경쇄는 공여자 항체 경쇄로부터 전체적으로 또는 실질적으로 적어도 2개 및 보통 모두 3개의 CDR, 및 존재한다면, 인간 경쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열로부터 실질적으로 경쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 경쇄 불변 영역을 가진다. 나노바디 및 dAb 이외에, 인간화된 항체는 인간화된 중쇄 및 인간화된 경쇄를 포함한다. 인간화된 또는 인간 항체에서 CDR은 적어도 60%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 대응하는 잔기(카바트에 의해 정함)가 각각의 CDR 사이에 동일할 때 비인간 항체에서의 대응하는 CDR로부터 실질적으로 유래되거나 또는 이에 대해 실질적으로 동일하다. 항체 쇄의 가변 영역 프레임워크 서열 또는 항체 쇄의 불변 영역은 카바트에 의해 정해진 대응하는 잔기의 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%가 동일할 때 각각 인간 가변 영역 프레임워크 서열 또는 인간 불변 영역으로부터 실질적으로 유래된다.
인간화된 항체는 종종 마우스로부터의 모두 6개의 CDR(바람직하게는 카바트에 의해 정해지지만, 대안적으로 IMGT, 코티아, 복합 바트-코티아, AbM 또는 Contact 또는 다른 통상적인 정의에 의해 정해짐)을 혼입하지만, 그들은 또한 마우스 항체로부터의 모든 CDR 미만(예를 들어, 적어도 4, 또는 5) CDR로 이루어질 수 있다(예를 들어, 문헌[Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol . Immunol. 36:1079-1091, 1999; Tamura et al, Journal of Immunology, 164:1432-1441, 2000]).
인간 가변 영역 프레임워크 잔기로부터의 특정 아미노산은 항원에 대한 CDR 입체배좌 및/또는 결합에 대해 그들의 가능한 영향에 기반하여 치환을 위해 선택될 수 있다. 이러한 가능한 영향의 연구는 모델링에 의해 특정 위치에서 아미노산의 특징의 시험, 또는 특정 아미노산의 치환 또는 돌연변이유발 효과의 경험적 관찰이다.
예를 들어, 아미노산이 뮤린 가변 영역 프레임워크 잔기와 선택된 인간 가변 영역 프레임워크 잔기 사이에 상이할 때, 인간 프레임워크 아미노산은 아미노산이:
(1) 항원에 직접적으로 비공유적으로 결합하거나,
(2) CDR 영역에 인접하거나,
(3) CDR 영역과 달리 상호작용하거나(예를 들어, CDR 영역의 약 6 ÅA 내임); 또는
(4) 중쇄와 경쇄 사이의 상호작용을 매개하는 것으로
합리적으로 예상될 때 마우스 항체로부터의 동등한 프레임워크 아미노산에 의해 치환될 수 있다.
본 발명은 6개의 예시된 인간화된 중쇄 성숙 가변 영역(hSG16.17 VH1-6)(서열번호 11 내지 16) 및 4개의 예시된 인간화된 경쇄 성숙 가변 영역(hSG16.17 VK2-5)(서열번호 19 내지 22)을 포함하는 래트 SG16.17 항체의 인간화된 형태를 제공한다. 중쇄 및 경쇄는 임의의 순열로 조합될 수 있으며, 임의의 hSG16.17 VH1, VH3 또는 VH5를 포함하는 순열이 바람직하다. 결합 친화도의 최고의 조합, 인간 생식계열에 대한 서열 동일성 백분율, 발현 및 단량체 함량의 백분율을 갖는 순열은 hSG16.17 VH3 VK2이다. 이 항체는 중쇄와 경쇄 가변 영역에서 인간 생식계열과 85% 초과의 서열 동일성으로 래트 SG16.17과 실험 오차 내에서 유사한 친화도(따라서, 새로운 INN 가이드라인 하에 "인간화된" 표기를 부여), CHO 세포에서의 고발현, 및 고비율의 단량체를 나타낸다. 전반적인 항체가 INN 가이드라인 하에 인간화되는 것으로 분류되는 인간 생식계열 서열에 대해 충분한 서열 동일성을 갖도록 대부분의 다른 인간화된 항체 hSG16.17 VH3 VK2에 비교하여 매우 다수의 가변 영역 프레임워크 돌연변이를 갖는 것이 보통이며, 이때 인간 수용자 잔기는 대응하는 래트 잔기(13)로 바뀔 뿐만 아니라 매우 다수의 "정방향" CDR 돌연변이를 가지고, 카바트 CDR 내 래트 잔기는 인간 수용자 서열 내 대응하는 잔기로 바뀐다. 대부분의 이전의 인간화된 항체는 공여자 항체로부터 전체적으로 카바트 CDR을 가진다.
본 발명은 중쇄 가변 영역이 hSG16.17 VH3(서열번호 13)에 대해 적어도 90% 동일성을 나타내고, 경쇄 가변 영역이 hSG16.17 VK2(서열번호 19)에 대해 적어도 90% 동일성을 나타내는 항체를 제공한다. 일부 항체는 HV3에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성 그리고 VK2에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타낸다. 일부 이러한 항체는 hSG16.17 VH3(서열번호 13)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 60 내지 62) 및 hSG16.17 VK2(서열번호 19)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 90 내지 92)을 포함한다. 일부 이러한 항체는 hSG16.17 VH3(서열번호 13)의 3개의 카바트(Kabat) CDR(서열번호 60 내지 62) 및 hSG16.17 VK2(서열번호 19)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 90 내지 92)을 포함하되, 단, 위치 H58은 N 또는 K에 의해 점유될 수 있고, 위치 H60은 A 또는 N에 의해 점유될 수 있으며, 위치 H61은 Q 또는 E에 의해 점유될 수 있고, 위치 H62은 K 또는 N에 의해 점유될 수 있으며, 위치 H64는 Q 또는 K에 의해 점유될 수 있고, 위치 H65는 G 또는 T에 의해 점유될 수 있으며, 위치 L24는 R 또는 L에 의해 점유될 수 있고, 위치 L53은 S 또는 R에 의해 점유될 수 있다. 바람직하게는, 위치 H58, H60, H61, H62, H64 및 H65는 각각 N, A, Q, K, Q 및 G에 의해 각각 점유되고, L24 및 L53은 R 및 S에 의해 각각 점유된다. 이들 열거된 잔기는 카바트 CDR 내의 위치를 점유하는 인간 수용자 서열로부터의 아미노산을 나타낸다. 일부 항체는 인간 수용자 서열로부터의 대응하는 잔기로 대체되는 인간 카바트 CDR 내의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 래트 잔기를 가진다. 일부 항체에서, 위치 H58, H60, H61, H62, H64 및 H65는 각각 N, A, Q, K, Q 및 G에 의해 각각 점유되고, L24 및 L53은 R 및 S에 의해 각각 점유된다. 일부 항체는 가변 영역 인간 수용자 서열 잔기의 대응하는 래트 잔기로의 대체를 나타내는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 복귀 돌연변이를 포함한다.
일부 항체에서, 위치 H20, H48, H69, H71, H73, H76, H80, H88, H91 및 H93의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11은 각각 L, I, M, A, K, N, V, A, F 및 T에 의해 점유된다. 일부 항체에서, 위치 L46, L48 및 L87의 적어도 1, 2 또는 3개는 각각 V, V 및 F에 의해 점유된다. 일부 항체에서, 각각의 위치 H20, H48, H69, H71, H73, H76, H80, H88, H91 및 H93은 L, I, M, A, K, N, V, A, F 및 T에 의해 각각 점유되고, 그리고 각각의 L46, L48 및 L87은 V, V 및 F에 의해 각각 점유된다.
인간화된 항체가 예시된 hSG16.17 VH3 VK2 인간화된 항체로부터의 임의의 변화를 나타내는 한, 이러한 추가적인 변화에 대한 한 가지 가능성은 가변 영역 프레임워크에서의 추가적인 복귀 돌연변이이다. 다른 예시된 인간화된 중쇄 또는 경쇄 성숙 가변 영역에서 복귀 돌연변이된 임의의 또는 모든 위치는 또한 R에 의해 점유된 H8, A에 의해 점유된 H67 및 A에 의해 점유된 H78, S에 의해 점유된 L40, M에 의해 점유된 L78 및 D에 의해 점유된 L85(즉, 1, 2, 3, 4, 5 또는 모두 6), 또는 중쇄에서 N에 의해 점유된 H38, R에 의해 점유된 H40, K에 의해 점유된 H73, S에 의해 점유된 H82A, 및 T에 의해 점유된 H83의 모두 5 및 K에 의해 점유된 L3, 및 경쇄에서 I에 의해 점유된 L20 중 하나 또는 둘 다로 이루어질 수 있다. 그러나, 이러한 추가적인 복귀 돌연변이는, 그들이 일반적으로 친화도를 개선시키지 않고, 더 많은 마우스 잔기를 도입하는 것이 면역원성의 증가된 위험을 제공할 수 있기 때문에, 바람직하지 않다.
다른 가능한 변화는 마우스 항체의 CDR 내의 더 많은 또는 더 적은 잔기를 인간 CDR 서열로부터의 대응하는 잔기, 전형적으로 예시된 인간화된 항체를 설계하는데 사용되는 인간 수용자 서열의 CDR로부터의 대응하는 잔기로 치환하는 것이다. 일부 항체에서, CDR의 일부, 즉, SDR로 지칭되는 결합에 필요한 CDR 잔기의 서브세트만이 인간화된 항체에서의 결합을 보유하는 데 필요하다. 항원과 접촉하지 않고 SDR에 있지 않은 CDR 잔기는 다른 정의, 예컨대 코티아 초가변 루프(Chothia, J. Mol . Biol . 196:901, 1987)에 따라 CDR 밖에 놓여 있는 카바트 CDR의 영역에 기반하여 분자 모델링에 의해 그리고/또는 경험적으로, 또는 문헌[Gonzales et al., Mol. Immunol. 41: 863(2004)]에 기재된 바와 같이 동정될 수 있다. 이러한 인간화된 항체에서, 하나 이상의 공여자 CDR 잔기가 없거나 또는 전체 공여자 CDR이 생략되는 위치에서, 상기 위치를 점유하는 아미노산은 수용자 항체 서열에서 (카바트 넘버링에 의해) 대응하는 위치를 점유하는 아미노산일 수 있다. CDR 내 공여자 아미노산이 포함하는 수용자의 이러한 치환의 수는 경쟁하는 고려사항의 균형을 반영한다. 이러한 치환은 인간화된 항체에서 마우스 아미노산 수를 감소시키는 데, 그리고 결과적으로 잠재적 면역원성을 감소시키는 데 잠재적으로 유리하다. 그러나, 치환은 또한 친화도의 변화를 야기할 수 있으며, 친화도의 상당한 감소는 바람직하게 회피된다. CDR 내의 치환을 위한 위치 및 치환되는 아미노산은 또한 경험적으로 선택될 수 있다.
바람직하지 않더라도, 예를 들어, CDR과 접촉되지 않는 프레임워크 잔기에서, 또는 심지어 CDR 내의 일부 잠재적 CDR-접촉 잔기 아미노산에서 다른 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 종종 변이체 인간화 서열에서 이루어진 대체는 대체된 hSG16.17 VH3 VK2 아미노에 대해 보존적이다. 바람직하게는, hSG16.17 VH3 VK2에 대한 대체는 (보존적이든 아니든) 인간화된 mAb의 결합 친화도 또는 효능, 즉, 인간 BCMA에 결합하고 암 세포의 성장을 저해하는 그의 능력에 대해 실질적인 효과가 없다.
변이체는 전형적으로 소수의 (예를 들어, 전형적으로 경쇄 또는 중쇄 성숙 가변 영역 중 하나, 또는 둘 다에서 1, 2, 3, 5 또는 10개 이하) 대체, 결실 또는 삽입에 의해 hSG16.17 VH3 VK2의 중쇄 및 경쇄 성숙 가변 영역 서열과 상이하다.
인간화된 중쇄 및 경쇄의 다른 바람직한 조합은 임의의 hSG16.17 VH1 VK2, VH1 VK3, VH1 VK4, VH1 VK4, VH3 VK2, VH3 VK3, VH3 VK4, 및 VH3 VK5 및 VH5 VK2, VH5 VK3, VH5 VK4, VH5 VK5뿐만 아니라 인간화된 항체를 포함하며, 이때 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 임의의 이들 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역과의 적어도 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 나타낸다.
본 발명 6개의 예시된 인간화된 중쇄 성숙 가변 영역(hSG16.45 VH1-6)(서열번호 27-32) 및 4개의 예시된 인간화된 경쇄 성숙 가변 영역(hSG16.45 VK1, 2, 3 및 5)(서열번호 35 내지 38)를 포함하는 래트 SG16.45 항체의 인간화된 형태를 제공한다. 중쇄 및 경쇄는 임의의 순열로 조합될 수 있되, 순열 hSG16.45 VH5 VK2, VH1 VK1 및 VH1 VK5가 바람직하다. hSG16.45 HV5 VK2는 중쇄와 경쇄 가변 영역 둘 다에서 인간 생식계열과 85% 초과의 서열 동일성(따라서, 새로운 INN 가이드라인 하에 "인간화된" 표기를 부여), CHO 세포에서 높은 발현, 고비율의 단량체 및 래트 또는 키메라 SG16.45보다 약간 더 적기는 하지만 적절한 결합을 나타낸다. 전반적인 항체가 INN 가이드라인 하에 인간화된 것으로 분류되는 인간 생식계열 서열에 대해 충분한 서열 동일성을 갖도록, hSG16.45 VH5 VK2는 3개의 가변 영역 복귀 돌연변이(중쇄에서 모두) 및 3개의 카바트 CDR 정방향 돌연변이를 가지며, 이때 카바트 CDR 내 래트 잔기는 인간 수용자 서열 내 대응하는 잔기로 바뀐다.
본 발명은 중쇄 가변 영역이 hSG16.45 VH5(서열번호 31)에 대해 적어도 90% 동일성을 나타내고, 경쇄 가변 영역이 hSG16.45 VK2에 대해 적어도 90% 동일성을 나타내는 항체를 제공한다. 일부 항체는 hSG16.45 VH5에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성 그리고 VK2에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타낸다. 일부 이러한 항체는 hSG16.45 VH5(서열번호 31)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 152 내지 154)및 hSG16.45 VK2(서열번호 36)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 179 내지 181)을 포함한다. 일부 이러한 항체는 hSG16.45 VH5(서열번호 31)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 152 내지 154) 및 hSG16.45 VK2(서열번호 36)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 179 내지 181)을 포함하며, 단, 위치 H50은 A 또는 S에 의해 점유될 수 있으며, 위치 L24는 R 또는 L에 의해 점유될 수 있고, 위치 L26은 S 또는 T에 의해 점유될 수 있다. 바람직하게 위치 H50은 A에 의해 점유되고, 위치 L24 및 L26은 R 및 S에 의해 점유된다. 이들 열거된 잔기는 카바트 CDR 내의 위치를 점유하는 인간 수용자 서열로부터의 아미노산을 나타낸다. 일부 항체는 인간 수용자 서열로부터의 대응하는 잔기로 대체되는 인간 카바트 CDR 내의 적어도 1, 2 또는 3개의 래트 잔기를 가진다. 일부 항체에서 위치 H50, L24 및 L26은 각각 A, R 및 S에 의해 점유된다. 일부 항체는 가변 영역 인간 수용자 서열 잔기의 대응하는 래트 잔기로의 대체를 나타내는 적어도 1, 2 또는 3개의 복귀 돌연변이를 포함한다.
일부 항체에서, 위치 H30, H93 및 H94의 적어도 1, 2 또는 3은 각각 N, T 및 S에 의해 점유된다. 일부 항체에서, 위치 H30, H93 및 H94는 각각 N, T 및 S에 의해 점유된다.
인간화된 항체가 예시된 hSG16.45 VH5 VK2 인간화된 항체로부터의 임의의 변화를 나타내는 한, 이러한 추가적인 변화에 대한 한 가지 가능성은 가변 영역 프레임워크에서의 추가적인 복귀 돌연변이이다. 다른 예시된 인간화된 중쇄 또는 경쇄 성숙 가변 영역에서 복귀돌연변이된 임의의 또는 모든 위치는 또한 각각 I, I, N 및 V에 의해 점유되는 H37, H48, H76, H107(즉, 1, 2, 3 또는 4) 및/또는 A, V, I, H, V, Y 및 M에 의해 각각 점유되는 L14, L19, L21, L38, L58, L71 및 L78의 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7로 이루어질 수 있다. 그러나, 이러한 추가적인 복귀 돌연변이는, 그들이 일반적으로 친화도를 개선시키지 않고, 더 많은 마우스 잔기를 도입하는 것이 면역원성의 증가된 위험을 제공할 수 있기 때문에, 바람직하지 않다.
다른 가능한 변화는 마우스 항체의 CDR 내의 더 많은 또는 더 적은 잔기를 인간 CDR 서열로부터의 대응하는 잔기, 전형적으로 예시된 인간화된 항체를 설계하는데 사용되는 인간 수용자 서열의 CDR로부터의 대응하는 잔기로 치환하는 것이다. 일부 항체에서, CDR의 일부, 즉, SDR로 지칭되는 결합에 필요한 CDR 잔기의 서브세트만이 인간화된 항체에서의 결합을 보유하는 데 필요하다. 항원과 접촉하지 않고 SDR에 있지 않은 CDR 잔기는 다른 정의, 예컨대 코티아 초가변 루프(Chothia, J. Mol . Biol . 196:901, 1987)에 따라 CDR 밖에 놓여 있는 카바트 CDR의 영역에 기반하여 분자 모델링에 의해 그리고/또는 경험적으로, 또는 문헌[Gonzales et al., Mol. Immunol. 41: 863(2004)]에 기재된 바와 같이 동정될 수 있다. 이러한 인간화된 항체에서, 하나 이상의 공여자 CDR 잔기가 없거나 또는 전체 공여자 CDR이 생략되는 위치에서, 상기 위치를 점유하는 아미노산은 수용자 항체 서열에서 (카바트 넘버링에 의해) 대응하는 위치를 점유하는 아미노산일 수 있다. CDR 내 공여자 아미노산이 포함하는 수용자의 이러한 치환의 수는 경쟁하는 고려사항의 균형을 반영한다. 이러한 치환은 인간화된 항체에서 마우스 아미노산 수를 감소시키는 데, 그리고 결과적으로 잠재적 면역원성을 감소시키는 데 잠재적으로 유리하다. 그러나, 치환은 또한 친화도의 변화를 야기할 수 있으며, 친화도의 상당한 감소는 바람직하게 회피된다. CDR 내의 치환을 위한 위치 및 치환되는 아미노산은 또한 경험적으로 선택될 수 있다.
바람직하지 않더라도, 예를 들어, CDR과 접촉되지 않는 프레임워크 잔기에서, 또는 심지어 CDR 내의 일부 잠재적 CDR-접촉 잔기 아미노산에서 다른 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 종종 변이체 인간화 서열에서 이루어진 대체는 대체된 hSG16.45 VH3 VK2 아미노에 대해 보존적이다. 바람직하게는, hSG16.45 VH5 VK2에 대한 대체는 (보존적이든 아니든) 인간화된 mAb의 결합 친화도 또는 효능, 즉, 인간 BCMA에 결합하고 암 세포의 성장을 저해하는 그의 능력에 대해 실질적인 효과가 없다.
변이체는 전형적으로 소수의 (예를 들어, 전형적으로 경쇄 또는 중쇄 성숙 가변 영역 중 하나, 또는 둘 다에서 1, 2, 3, 5 또는 10개 이하) 대체, 결실 또는 삽입에 의해 SG16.45 VH5 VK2의 중쇄 및 경쇄 성숙 가변 영역 서열과 상이하다.
인간화된 중쇄 및 경쇄의 다른 바람직한 조합은 임의의 hSG16.45 VH1 VK1 및 VH1 VK5뿐만 아니라 인간화된 항체를 포함하며, 이때 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 임의의 이들 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역과의 적어도 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 나타낸다.
C. 불변 영역의 선택
인간화된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 인간 불변 영역의 적어도 일부에 연결될 수 있다. 불변 영역의 선택은 항체-의존적 세포-매개 세포독성, 항체 의존적 세포의 식균 작용 및/또는 상보체 의존적 세포독성이 요망되는지의 여부에 부분적으로 의존한다. 예를 들어, 인간 아이소타입 IgG1 및 IgG3은 강한 상보체-의존적 세포독성, 인간 아이소타입 IgG2 약한 상보체-의존적 세포독성을 가지며, 인간 IgG4는 상보체-의존적 세포독성이 없다. 인간 IgG1 및 IgG3은 또한 인간 IgG2 및 IgG4보다 더 강한 세포 매개 효과기 기능을 유도한다. 경쇄 불변 영역은 람다 또는 카파일 수 있다. 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는 4량체로서, 별개의 중쇄, 경쇄로서, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv로서, 또는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인이 스페이서를 통해 연결되는 단일 쇄 항체로서 발현될 수 있다.
인간 불변 영역은 상이한 개체 사이의 알로타입 변형 및 아이소알로타입 변형을 나타내며, 즉, 불변 영역은 하나 이상의 다형성 위치에서 상이한 개체에서 상이할 수 있다. 아이소알로타입은 아이소알로타입을 인식하는 혈청이 하나 이상의 다른 아이소타입의 비-다형성(non-polymorphic) 영역에 결합한다는 점에서 알로타입과 상이하다. 예시적인 야생형 인간 카파 및 IgG1 불변 영역 서열(후자는 C-말단 라이신이 있거나 또는 없음)은 서열번호 3 내지 5에서 제공된다.
경쇄 및/또는 중쇄의 아미노 또는 카복시 말단에서 하나 또는 몇몇 아미노산, 예컨대 중쇄의 C-말단 라이신은 분자에 비례하여 또는 모두에서 상실되거나 또는 유도체화될 수 있다. 효과기 기능, 예컨대 상보체-매개 세포독성 또는 ADCC를 감소시키거나 또는 증가시키기 위해(예를 들어, 윈터 등의 미국 특허 제5,624,821호; Tso 등의 미국 특허 제5,834,597호; 및 라자(Lazar) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006] 참조), 또는 인간에서 반감기를 연장시키기 위해(예를 들어, 문헌[Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004] 참조) 불변 영역에서 치환될 수 있다.
예시적인 치환은 천연 아미노산의 시스테인 잔기로의 아미노산 치환이 아미노산 위치 234, 235, 237, 239, 267, 298, 299, 326, 330 또는 332에서 도입된 것, 바람직하게는 인간 IgG1 아이소타입에서의 S239C 돌연변이를 포함한다(넘버링은 EU 지표에 따른다(Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991); 미국 특허제20100158909호, 본 명세서에서 참고로 포함됨). C-말단 라이신이 있는 그리고 없는 S239C를 갖는 중쇄 불변 영역의 서열은 서열번호 6 및 7에 의해 제공된다. 추가적인 시스테인 잔기의 존재는 쇄간 이황화결합 형성을 허용한다. 이러한 쇄간 이황화결합 형성은 입체 장애를 야기하여, Fc 영역-Fcγ결합 상호작용의 친화도를 감소시킬 수 있다. IgG 불변 영역의 Fc 영역에 또는 근접하여 도입된 시스테인 잔기(들)는 또한 티올 특이적 시약, 예컨대 약물의 말레이미드 유도체를 이용하여 치료제(즉, 결합 세포독성 약물)에 대한 접합을 위한 부위로서 작용할 수 있다. 치료제의 존재는 입체 장애를 야기함으로써, Fc 영역-Fcγ결합 상호작용의 친화도를 추가로 감소시킨다. 임의의 위치 234, 235, 236 및/또는 237에서 다른 치환은 Fcγ수용체, 특히 Fcγ수용체에 대한 친화도를 감소시킨다(예를 들어, 미국 특허 제6,624,821호, 미국 특허 제5,624,821호 참조) 돌연변이의 바람직한 조합은 S239D, A330L 및 I332E인데, 이는 FcγRIIIA에 대한 Fc 도메인의 친화도를 증가시키고, 결과적으로 ADCC를 증가시킨다.
항체의 생체내 반감기는 또한 그의 효과기 기능에 영향을 미칠 수 있다. 항체의 반감기는 그의 치료적 활성을 변형시키기 위해 증가 또는 감소될 수 있다. FcRn은 β2-마이크로글로불린과 비공유적으로 회합하는 MHC 클래스 I 항원과 구조적으로 유사한 수용체이다. FcRn은 IgG의 대사 및 조직을 가로지르는 그들의 세포통과(transcytosis)를 조절한다(Ghetie and Ward, 2000, Annu. Rev. Immunol. 18:739-766; Ghetie and Ward, 2002, Immunol . Res. 25:97-113). IgG-FcRn 상호작용은 pH 6.0(세포내 소수포의 pH)에서 일어나지만, pH 7.4(혈액의 pH)에서는 일어나지 않으며; 이런 상호작용은 IgG가 순환으로 다시 재순환되는 것을 가능하게 한다(Ghetie and Ward, 2000, Ann. Rev. Immunol . 18:739-766; Ghetie and Ward, 2002, Immunol . Res. 25:97-113). FcRn 결합에 수반된 인간 IgG1에 대한 영역이 맵핑되었다(Shields et al., 2001, J. Biol . Chem . 276:6591-604). 인간 IgG1의 위치 Pro238, Thr256, Thr307, Gln311, Asp312, Glu380, Glu382 또는 Asn434에서 알라닌 치환은 FcRn 결합을 향상시킨다(Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604). 이들 치환을 보유하는 IgG1 분자는 더 긴 혈청 반감기를 가진다. 결과적으로, 이들 변형된 IgG1 분자는 그들의 효과기 기능을 수행할 수 있고, 따라서 비변형 IgG1에 비해 더 장시간의 기간에 걸쳐 그들의 치료 효과를 발휘할 수 있다. FcRn에 대한 결합을 증가시키기 위한 다른 예시적인 치환은 위치 250에서 Gln 및/또는 위치 428에서 Leu를 포함한다. 불변 영역 내 모든 위치에 대해 EU 넘버링이 사용된다.
보존된 Asn297에 공유적으로 부착된 올리고당은 FcγR에 결합하는 IgG의 Fc 영역의 능력에 연루된다(Lund et al., 1996, J. Immunol. 157:4963-69; Wright and Morrison, 1997, Trends Biotechnol . 15:26-31). IgG 상에서 이런 당형(glycoform)의 조작은 IgG-매개 ADCC를 상당히 개선시킬 수 있다. 이 당형에 대한 이등분 N-아세틸글루코사민 변형의 첨가(Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol. 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotech. Bioeng . 74:288-94) 또는 이 당형으로부터 푸코스의 제거(Shields et al., 2002, J. Biol . Chem . 277:26733-40; Shinkawa et al., 2003, J. Biol . Chem . 278:6591-604; Niwa et al., 2004, Cancer Res. 64:2127-33)는 IgG Fc와 FcγR 사이의 결합을 개선시킴으로써, Ig-매개 ADCC 활성을 향상시키는, IgG Fc 조작의 2가지 예이다.
인간 IgG1 Fc 영역의 용매-노출 아미노산의 전체 치환은 FcγR 결합 친화도가 변경된 IgG 변이체를 생성하였다(Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604). 모 IgG1에 비교할 때, Thr256/Ser298, Ser298/Glu333, Ser298/Lys334 또는 Ser298/Glu333/Lys334에서 Ala로의 치환을 수반하는 이들 변이체의 서브세트는 FcγR에 대한 결합 친화도와 ADCC 활성이 둘 다 증가되었음을 입증한다(Shields et al., 2001, J. Biol . Chem . 276:6591-604; Okazaki et al., 2004, J. Mol . Biol . 336:1239-49).
항체의 상보체 고정 활성은 (C1q 결합과 CDC 활성 둘 다) Lys326 및 Glu333에서의 치환에 의해 개선될 수 있다(Idusogie et al., 2001, J. Immunol. 166:2571-2575). 인간 IgG2 백본에 대한 동일한 치환은 C1q에 불량하게 결합하면서, C1q에 결합하고 CDC를 매개할 수 있는 것에 대한 상보체 활성화 활성이 심하게 결여된 항체 아이소타입을 전환시킬 수 있다(Idusogie et al., 2001, J. Immunol. 166:2571-75). 몇몇 다른 방법이 또한 항체의 상보체 고정 활성을 개선시키기 위해 적용되었다. 예를 들어, IgG의 카복실-말단에 대한 IgM의 18-아미노산 카복실-말단 꼬리 조각의 접합은 그들의 CDC 활성을 크게 향상시킨다. 이는 검출 가능한 CDC 활성을 정상적으로 갖지 않는 IgG4에 의해서조차 관찰된다(Smith et al., 1995, J. Immunol . 154:2226-36). 또한, IgG1 중쇄의 카복시-말단에 가깝게 위치된 Ser444를 Cys으로 치환하는 것은 단량체 IgG1에 대해 CDC 활성의 200배 증가를 갖는 IgG1의 꼬리-대-꼬리(tail-to-tail) 이량체화를 유도하였다(Shopes et al., 1992, J. Immunol . 148:2918-22). 추가로, C1q에 대해 특이성을 갖는 이중특이성 다이어바디 작제물은 또한 CDC 활성을 부여한다(Kontermann et al., 1997, Nat. Biotech. 15:629-31).
상보체 활성은 중쇄의 아미노산 잔기 318, 320 및 322 중 적어도 하나를 상이한 측쇄, 예컨대 Ala을 갖는 잔기로 돌연변이시킴으로써 감소될 수 있다. 3가지 잔기 중 임의의 하나 대신에 다른 알킬-치환 비이온성 잔기, 예컨대 Gly, Ile, Leu 또는 Val, 또는 이러한 방향족 비극성 잔기, 예컨대 Phe, Tyr, Trp 및 Pro은 또한 C1q 결합을 감소시키거나 또는 없앤다. C1q 결합 활성을 감소시키거나 또는 없애기 위해 Ser, Thr, Cys 및 Met이 잔기 320 및 322에서 사용될 수 있지만, 318에서는 그렇지 않다. 극성 잔기에 의한 318(Glu) 잔기의 대체는 C1q 결합 활성을 변형시킬 수 있지만, 없앨 수는 없다. 잔기 297(Asn)을 Ala으로 대체해는 것은 용해 활성의 제거를 초래하지만 C1q에 대한 친화도는 단지 약간(약 3배 더 약함) 감소시킨다. 이 변경은 상보체 활성화에 필요한 글리코실화 부위 및 탄수화물의 존재를 파괴한다. 이 부위에서 임의의 다른 치환은 또한 글리코실화 부위를 파괴한다. 다음의 돌연변이 및 이의 임의의 조합은 또한 C1q 결합을 감소시킨다: D270A, K322A, P329A 및 P311S(WO 06/036291 참조).
인간 불변 영역에 대한 언급은 임의의 천연 알로타입을 갖는 불변 영역 또는 천연 알로타입에서의 다형성 위치를 점유하는 잔기의 임의의 순열을 포함한다. 또한, 1, 2, 5 또는 10개까지의 돌연변이가 천연 인간 불변 영역, 예컨대 Fcγ 수용체 결합을 감소시키는 것으로 또는 FcRN에 대한 결합을 증가시키는 것으로 상기 표시된 것에 대해 존재할 수 있다.
D. 재조합 항체의 발현
인간화된, 키메라 또는 베니어 항체는 재조합체 발현에 의해 전형적으로 생성된다. 재조합 폴리뉴클레오타이드 작제물은 전형적으로 자연적으로 회합된 또는 이종성 프로모터 영역을 포함하는 항체 쇄의 암호 서열에 조작 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함한다. 바람직하게는, 발현 제어 서열은 진핵 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터 내 진핵 프로모터 시스템이다. 일단 벡터가 적절한 숙주 내로 혼입된다면, 숙주는 뉴클레오타이드 서열의 고수준 발현, 및 상호작용 항체의 수집 및 정제에 적합한 조건 하에 유지된다.
포유류 세포는 면역글로불린 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 세그먼트를 발현시키기 위한 바람직한 숙주이다. 문헌[Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987)] 참조. 무손상 이종성 단백질을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주는 당업계에서 개발되었고, CHO 세포주(예를 들어, DG44), 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, HEK293 세포, L 세포, 및 Sp2/0 및 NS0를 포함하는 비-항체-생성 골수종을 포함한다. 바람직하게는, 세포는 비인간이다. 이들 세포에 대한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제기점, 프로모터, 인핸서(Queen et al., Immunol . Rev. 89:49 (1986)), 및 필요한 가공 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 발현 제어 서열은 내인성 유전자, 사이토메갈로바이러스, SV40, 아데노바이러스, 소 유두종바이러스 등으로부터 유래된 프로모터이다. 문헌[Co et al., J. Immunol . 148:1149(1992)] 참조.
일단 발현되면, 항체는 HPLC 정제, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하는 당업계의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다(일반적으로, 문헌[Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)] 참조).
E. 글리코실화 변이체
항체는 그들의 불변 영역에서 보존된 위치에서 글리코실화될 수 있다(Jefferis and Lund, (1997) Chem. Immunol. 65:111-128; Wright and Morrison, (1997) TibTECH 15:26-32). 면역글로불린의 올리고당 측쇄는 단백질의 기능(Boyd et al., (1996) Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe and Howard, (1990) Biochem. 29:4175-4180), 및 당단백질의 입체배좌 및 제시된 3차원 표면에 영향을 미칠 수 있는 당단백질의 부분 사이의 세포내 상호작용에 영향을 미친다(Hefferis and Lund, 상기 참조; Wyss and Wagner, (1996) Current Opin. Biotech. 7:409-416). 올리고당은 또한 특정 인식 구조에 기반하여 특정 분자의 주어진 당단백질을 표적화하는 작용을 할 수 있다. 예를 들어, 이는 비갈락토실화된 IgG에서, 올리고당 모이어티는 CH2 사이 공간 밖으로 '플립(flip)'되고, 말단 N-아세틸글루코사민 잔기는 만노스 결합 단백질에 결합하도록 이용 가능하다는 것이 보고되었다(Malhotra et al., (1995) Nature Med. 1:237-243). 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 생성된 CAMPATH-1H(인간 림프구의 CDw52 항원을 인식하는 재조합 인간화된 뮤린 단클론성 IgG1 항체)로부터의 올리고당의 글리코펩티다제에 의한 제거는 상보체 매개 용해(CMCL)의 완전한 감소를 초래한 반면(Boyd et al., (1996) Mol. Immunol. 32:1311-1318), 뉴라미니다제를 이용하는 시알산 잔기의 선택적 제거는 DMCL의 상실을 초래하지 않았다. 항체의 글리코실화는 또한 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC)에 영향을 미치는 것으로 보고되었다. 특히, b이등분 GlcNAc의 형성을 촉매하는 글리코실트랜스퍼라제인 (1,4)-N-아세틸글루코사민일트랜스퍼라제 III(GnTIII)의 테트라사이클린-조절 발현을 갖는 CHO 세포는 개선된 ADCC 활성을 갖는 것으로 보고되었다(Umana et al. (1999) Mature Biotech. 17:176-180).
항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결이다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 트라이펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 효소 부착에 대한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드에서 이들 트라이펩타이드 서열 중 하나의 존재는 잠재적 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결 글리코실화는, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신이 또한 사용될 수 있지만, 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중 하나의 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 대한 부착을 지칭한다.
항체의 글리코실화 변이체는 항체의 글리코실화 패턴이 변경된 변이체이다. 변경은 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 결실, 항체에 대한 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 첨가, 글리코실화(글리코실화 패턴)의 조성 변화, 글리코실화 정도 등을 의미한다.
항체에 대한 글리코실화 부위의 첨가는 그것이 (N-연결 글리코실화 부위에 대해) 상기 기재한 트라이펩타이드 서열을 포함하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 달성될 수 있다. 변경은 또한 (O-연결 글리코실화 부위에 대해) 본래의 항체의 서열에 대해 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 첨가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다. 유사하게, 글리코실화 부위의 제거는 항체의 천연 글리코실화 부위 내의 아미노산 변경에 의해 달성될 수 있다.
아미노산 서열은 보통 기저 핵산 서열을 변경시킴으로써 변경된다. 이들 방법은, (천연 유래 아미노산 서열 변이체의 경우에) 천연 공급원으로부터의 단리 또는 올리고뉴클레오타이드-매개(또는 부위 지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 더 빨리 생성된 변이체 또는 항체의 비-변이체 형태의 카세트 돌연변이유발에 의한 제조를 포함한다.
항체의 글리코실화(글리코실화 패턴을 포함)는 또한 아미노산 서열 또는 기저 뉴클레오타이드 서열을 변경시키는 일 없이 변경될 수 있다. 글리코실화는 대부분 항체를 발현시키기 위해 사용되는 숙주에 의존한다. 잠재적 치료제로서 재조합 당단백질, 예를 들어, 항체의 발현을 위해 사용되는 세포 유형은 천연 세포에서 드물기 때문에, 항체의 글리코실화 패턴에서 상당한 변화가 예상될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Hse et al., (1997) J. Biol. Chem. 272:9062-9070] 참조. 숙주 세포의 선택에 추가로, 항체의 재조합 생성 동안 글리코실화에 영향을 미치는 인자는 성장 방식, 배지 제형, 배양물 밀도, 산화, pH, 정제 계획 등을 포함한다. 올리고당 생성에 수반된 특정 효소를 도입하거나 또는 과발현시키는 것을 포함하는 특정 숙주 유기체에서 달성된 글리코실화 패턴을 변경시키기 위한 다양한 방법이 제안되었다(미국 특허 제5047335호; 제5510261호; 제5278299호). 글리코실화, 또는 특정 유형의 글리코실화는, 예를 들어 엔도글리코시다제 H(Endo H)를 이용하여 당단백질로부터 효소적으로 제거될 수 있다. 추가로, 재조합 숙주 세포는 유전자 조작될 수 있으며, 예를 들어, 특정 유형의 다당류를 가공하는 데 결함을 만들 수 있다. 이들 및 유사한 기법은 당업계에 잘 공지되어 있다.
항체의 글리코실화 구조는 렉틴 크로마토그래피, NMR, 질량분석법, HPLC, GPC, 단당류 조성물 분석, 순차적 효소 분해, 및 전하에 기반하여 올리고당을 분리하기 위해 고 pH 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하는 HPAEC-PAD를 포함하는 탄수화물 분석의 통상적인 기법에 의해 용이하게 분석될 수 있다. 분석 목적을 위해 올리고당을 방출하기 위한 방법이 또한 공지되어 있으며, 소 처리(펩타이드-N-글리코시다제 F/엔도-β갈락토시다제를 이용하여 통상적으로 수행됨), 주로 O-연결된 구조를 방출하기 위해 강한 알칼리성 환경을 이용하는 제거, 및 N- 그리고 O-연결된 올리고당을 둘 다 방출하기 위해 무수 하이드라진을 이용하는 화학적 방법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
항체의 글리코실화 변형의 바람직한 형태는 감소된 코어 푸코실화이다. "코어 푸코실화"는 N-연결 글리칸의 환원 말단에서 N-아세틸글루코사민 ("GlcNAc")에 대한 푸코스("푸코실화")의 첨가를 지칭한다.
"복잡한 N-글리코사이드-연결 당쇄"는 전형적으로 아스파라긴 297(카바트 넘버링에 따름)에 결합된다.　 본 명세서에서 사용되는 복합 N-글리코사이드-연결 당쇄는 주로 다음의 구조를 갖는 다음 2안테나형 복합 당 쇄를 가진다:　
Figure pct00002
여기서 ±는 당 분자가 존재할 수 있거나 또는 없을 수 있다는 것을 나타내고, 수는 당 분자 사이의 결합 위치를 나타낸다.　상기 구조에서, 아스파라긴에 결합하는 당쇄 말단은 (우측에서) 환원 말단으로 불리며, 반대측은 비환원 말단으로 불린다. 푸코스는 보통 전형적으로 α1,6 결합에 의해 환원 말단의 N-아세틸글루코사민("GlcNAc")에 결합한다(GlcNAc의 6-위치는 푸코스의 1-위치에 연결된다). "Gal"은 갈락토스를 지칭하고, "Man"은 만노스를 지칭한다.
"복잡한 N-글리코사이드-연결 당쇄"는 1) 복잡한 유형(여기서 코어 구조의 비환원 말단측은 갈락토스-N-아세틸글루코사민(또한 "gal-GlcNAc"로서 지칭됨)의 1개 이상의 분자를 갖고, 그리고 Gal-GlcNAc의 비환원 말단측은 선택적으로 N-아세틸글루코사민 등을 이등분하는 시알산을 가짐); 또는 2) 하이브리드 유형(여기서 코어 구조의 비환원 말단측은 고 만노스 N-글리코사이드-연결 당쇄의 분지와 복잡한 N-글리코사이드-연결 당쇄를 둘 다 가짐)을 포함한다.
일부 실시형태에서, "복잡한 N-글리코사이드-연결 당쇄"는 1) 복잡한 유형(여기서 코어 구조의 비환원 말단측은 갈락토스-N-아세틸글루코사민(또한 "gal-GlcNAc"로서 지칭됨)의 0, 1개 이상의 분자를 갖고, 그리고 Gal-GlcNAc의 비환원 말단측은 선택적으로 N-아세틸글루코사민 등을 이등분하는 시알산과 같은 구조를 추가로 가진다.
본 방법에 따르면, 전형적으로 소량의 푸코스만이 인간화된, 키메라 또는 베니어 SG16.17 또는 SG16.45 항체의 복잡한 N-글리코사이드-연결 당쇄(들) 내로 혼입된다. 예를 들어, 다양한 실시형태에서, 약 60% 미만, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 또는 약 3% 미만의 항체 분자는 푸코스에 의한 코어 푸코실화를 가진다.　 일부 실시형태에서, 약 2%의 항체 분자는 푸코스에 의한 코어 푸코실화를 가진다.
특정 실시형태에서, 소량의 푸코스 유사체(또는 푸코스 유사체의 대사물질 또는 생성물)만이 복잡한 N-글리코사이드-연결 당쇄(들) 내로 혼입된다.　 예를 들어, 다양한 실시형태에서, 약 60% 미만, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 또는 약 3% 미만의 인간화된, 키메라 또는 베니어 SG16.17 또는 SG16.45 항체는 푸코스 유사체 또는 푸코스 유사체의 대사물질 또는 생성물에 의한 코어 푸코실화를 가진다. 　 일부 실시형태에서, 약 2%의 인간화된, 키메라 또는 베니어 SG16.17 항체는 푸코스 유사체 또는 푸코스 유사체의 대사물질 또는 생성물에 의한 코어 푸코실화를 가진다.
항체-생성 세포를 푸코스 유사체와 함께 인큐베이션시킴으로써 비푸코실화 항체를 제조하는 방법은, 예를 들어, WO2009/135181에 기재되어 있다.　 간략하게, 인간화된, 키메라 또는 베니어 SG16.17 항체를 발현시키기 위해 조작된 세포는 푸코스 유사체 또는 세포내 푸코스 유사체의 대사물질 또는 생성물의 존재 하에 인큐베이션된다. 세포내 대사물질은, 예를 들어, GDP-변형된 유사체 또는 완전히 또는 부분적으로 탈에스터화된 유사체일 수 있다.　 생성물은, 예를 들어, 완전히 또는 부분적으로 탈에스터화된 유사체일 수 있다.　 일부 실시형태에서, 푸코스 유사체는 푸코스 구조 경로에서 효소(들)를 저해할 수 있다.　 예를 들어, 푸코스 유사체(또는 세포내 푸코스 유사체의 대사물질 또는 생성물)는 푸코키나제 또는 GDP-푸코스-파이로포스포릴라제의 활성을 저해할 수 있다.　 일부 실시형태에서, 푸코스 유사체(또는 세포내 푸코스 유사체의 대사물질 또는 생성물)는 푸코실트랜스퍼라제(바람직하게는 1,6-푸코실트랜스퍼라제, 예를 들어, FUT8 단백질)를 저해한다.　 일부 실시형태에서, 푸코스 유사체(또는 세포내 푸코스 유사체의 대사물질 또는 생성물)는 푸코스에 대한 드노보 합성 경로에서 효소 활성을 저해할 수 있다.　 예를 들어, 푸코스 유사체(또는 세포내 푸코스 유사체의 대사물질 또는 생성물)는 GDP-만노스 4,6-데하이드라타제 또는/또는 GDP-푸코스 합성효소의 활성을 저해할 수 있다.　 일부 실시형태에서, 푸코스 유사체(또는 세포내 푸코스 유사체의 대사물질 또는 생성물)는 푸코스 운반체(예를 들어, GDP-푸코스 운반체)를 저해할 수 있다.
일 실시형태에서, 푸코스 유사체는 2-플루로푸코스이다.　 성장 배지 및 다른 푸코스 유사체에서 푸코스 유사체를 이용하는 방법은, 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된 WO/2009/135181에 개시된다.
코어 푸코실화를 감소시키기 위해 세포주를 조작하는 다른 방법은 유전자 넉아웃(knock-out), 유전자 넉인(knock-in) 및 RNA 간섭(RNAi)을 포함하였다.　 유전자 넉아웃에서, FUT8을 암호화하는 유전자(알파 1,6- 푸코실트랜스퍼라제 효소)는 비활성화된다.　 FUT8은 GDP-푸코스로부터 N-글리칸의 Asn-연결(N-연결) GlcNac의 위치 6까지 푸코실 잔기의 전달을 촉매한다.　 FUT8은 Asn297에서 N-연결 2안테나형 탄수화물에 대한 푸코스의 첨가를 초래하는 유일한 효소가 되는 것으로 보고되고 있다.　 유전자 넉인은 GNTIII 또는 골지 알파 만노시다제 II와 같은 효소를 암호화하는 유전자를 첨가한다.　세포 내 이러한 효소 수준의 증가는 푸코실화 경로로부터 단클론성 항체를 우회시키고(감소된 코어 푸코실화를 야기), 증가된 양의 이등분 N-아세틸글루코사민을 가진다.　 RNAi 전형적으로 또한 FUT8 유전자 발현을 표적화하여, 감소된 mRNA 전사체 수준 또는 넉아웃 유전자 발현을 전체적으로 야기한다.　 임의의 이들 방법은 비-푸코실화된 항체, 예를 들어, 인간화된, 키메라 또는 베니어 SG16.17 항체를 생성할 수 있는 세포주를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
다수의 방법은 항체에 대한 푸코실화의 양을 결정하기 위해 이용 가능하다.　 방법은, 예를 들어, PLRP-S 크로마토그래피 및 전자분무 이온화 사중극자 TOF MS를 통한 LC-MS를 포함한다.
IV. 핵산
본 발명은 상기 기재한 임의의 인간화된 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산을 추가로 제공한다. 전형적으로, 핵산은 또한 성숙 중쇄 및 경쇄에 융합된 신호 펩타이드를 암호화한다. 핵산 상의 암호 서열은 암호 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 부위, 전사 종결 신호 등의 발현을 보장하기 위해 조절 서열과 작동 가능하게 연결될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산은 단리된 형태로 생길 수 있거나 또는 하나 이상의 벡터로 클로닝될 수 있다. 핵산은, 예를 들어, 고체 상태 합성 또는 중복 올리고뉴클레오타이드의 PCR에 의해 합성될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산은 하나의 인접한 핵산으로서, 예를 들어, 발현 벡터 내에서 결합될 수 있거나, 또는 별개일 수 있고, 예를 들어 각각 그 자신의 발현 벡터로 클로닝될 수 있다.
V. 항체 약물 접합체
항-MCMA 항체는 세포독성 모이어티에 접합되어 항체-약물 접합체(ADC)를 형성한다. 항체에 대한 접합을 위한 특히 적합한 모이어티는 세포독성제(예를 들어, 화학치료제), 프로드러그 전환효소, 방사성동위원소 또는 화합물, 또는 독소이다(이들 모이어티는 종합적으로 치료제 또는 약물로서 지칭됨). 예를 들어, 항-BCMA 항체는 세포독성제, 예컨대 화학치료제, 또는 독소(예를 들어, 세포정지제 또는 세포파괴제, 예컨대, 아브린, 리신 A, 슈도모나스 엑소톡신 또는 디프테리아 독소)에 접합될 수 있다. 유용한 분류의 세포독성제의 예는, 예를 들어, DNA 소홈 결합제, DNA 알킬화제 및 튜불린 저해제를 포함한다. 예시적인 세포독성제는, 예를 들어, 아우리스타틴, 캄토테신, 듀오카르마이신, 에토포사이드, 메이탄신 및 메이탄시노이드(예를 들어, DM1 및 DM4), 탁산, 벤조다이아제핀(예를 들어, 피롤로[1,4]벤조다이아제핀(PBD), 인돌리노벤조다이아제핀 및 옥소졸리디노벤조다이아제핀) 및 빈카 알칼로이드를 포함한다. 단백질 및 특히 항체에 대해 치료제를 접합하기 위한 기법은 잘 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌[Alley et al., Current Opinion in Chemical Biology 2010 14:1-9; Senter, Cancer J., 2008, 14(3):154-169.] 참조)
치료제(예를 들어, 세포독성제)는 (예를 들어, 가수분해에 의해, 항체 분해에 의해 또는 절단제에 의해) 항체로부터 탈착되지 않는 한 그의 활성을 감소시키는 방식으로 항체에 접합될 수 있다. 이러한 치료제는 링커를 통해 항체에 부착될 수 있다. 링커에 접합된 치료제는 또한 본 명세서에서 약물 링커로서 지칭된다. 링커의 특성은 크게 다를 수 있다. 링커를 구성하는 성분은 그들의 특징에 기반하여 선택되는데, 이는 접합체가 전달되는 부위에서의 조건에 의해 부분적으로 지시될 수 있다.
치료제는 항-BCMA-발현 암세포의 세포내 환경에서 절단에 민감하지만, (예를 들어, 엔도좀에서 또는, 예를 들어 pH 민감도 또는 프로테아제 민감도 때문에, 라이소좀 환경에서 또는 포낭 환경에서) 그것이 항-BCMA-발현 암세포에 의해 내재화될 때 접합체가 항체로부터 절단되도록, 세포외 환경에 대해 민감하지 않은 절단 가능한 링커에 의해 항체에 부착될 수 있다. 치료제는 또한 비절단성 링커에 의해 항체에 부착될 수 있다.
표시한 바와 같이, 링커는 절단성 단위를 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 표적 부위(예를 들어, 표적 세포)에서 존재하는 효소 작용에 의해 절단되도록, 절단 가능한 단위의 구조 및/또는 서열이 선택된다. 다른 실시형태에서, pH 변화(예를 들어, 산 또는 염기 불안정), 온도 또는 방사선 조사(예를 들어, 광 불안정)에 의해 절단 가능한 절단 가능 단위가 또한 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 절단 가능한 단위는 하나의 아미노산 또는 인접한 서열의 아미노산을 포함할 수 있다. 아미노산 서열은 효소에 대한 표적 기질일 수 있다.
일부 양상에서, 절단 가능한 단위는 펩티딜 단위이고, 적어도 2개의 아미노산 길이이다. 절단제는 카텝신 B 및 D 및 플라스민을 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123] 참조). 항-BCMA 발현 세포, 즉, 효소 절단성 링커에서 존재하는 효소에 의해 절단 가능한 절단 가능 단위가 가장 전형적이다. 따라서, 링커는 라이소좀 또는 엔도좀 프로테아제를 포함하는 세포내 펩티다제 또는 프로테아제 효소에 의해 절단될 수 있다. 예를 들어, 암성 조직에서 고도로 발현된 티올-의존적 프로테아제 카텝신-B에 의해 절단 가능한 링커(예를 들어, Phe-Leu 또는 Val-Cit 펩타이드 또는 Val-Ala 펩타이드를 포함하는 링커)가 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 링커는 절단 가능한 단위(예를 들어, 펩티딜 단위)를 포함할 것이고, 절단 가능한 단위는 치료제에 직접적으로 접합될 것이다. 다른 실시형태에서, 절단 가능한 단위는 추가적인 기능성 단위, 예를 들어, 자기-희생 스페이서 단위 또는 비-자기 희생 스페이서 단위를 통해 치료제에 접합될 것이다. 비 자기-희생 스페이서 단위는 부분적 또는 모든 스페이서 단위는 항체 약물 접합체로부터 절단 가능한 단위(예를 들어, 아미노산)의 절단 후에 약물 단위에 결합된 채로 남아있는 것이다. 약물을 유리시키기 위해, 독립적 가수분해 반응은 약물로부터의 스페이서 단위를 절단하기 위해 표적 세포 내에서 일어난다.
자기-희생 단위에 의해, 약물은 별개의 가수분해 단계에 대한 약물에 대한 필요없이 방출된다. 일 실시형태에서, 링커는 절단 가능한 단위 및 자기 희생기를 포함하며, 절단 가능한 단위는 효소 작용에 의해 절단 가능한 단위의 절단 후에 절단 가능하고, 자기-희생기(들)는 치료제를 방출한다. 일부 실시형태에서, 링커의 절단 가능한 단위는 하나의 말단 상에서 치료제에 직접적으로 또는 간접적으로 접합될 것이고, 다른 말단 상에서 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 접합될 것이다. 일부 이러한 실시형태에서, 절단 가능한 단위는 하나의 말단 상에서 치료제에 (예를 들어, 자기-희생 또는 비-자기희생 스페이서 단위를 통해) 직접적으로 또는 간접적으로 접합될 것이고, 다른 말단 상에서 스트레처(stretcher) 단위를 통해 항체에 접합될 것이다. 스트레처 단위는 약물 및/또는 약물 링커의 나머지에 항체를 연결한다. 일 실시형태에서, 항체와 약물 또는 약물 링커의 나머지 사이의 연결은 말레이미드기를 통하며, 예를 들어 말레이미도카프로일 링커를 통한다. 일부 실시형태에서, 상기 항체는 이황화물을 통해 약물에 연결될 것이고, 예를 들어, 이황화물 연결된 메이탄시노이드는 SPDB-DM4 및 SPP-DM1에 접합한다.
항체와 링커 사이의 연결은 다수의 상이한 경로를 통해, 예를 들어, 티오에터 결합을 통해, 이황화물 결합을 통해, 아마이드 결합을 통해 또는 에스터 결합을 통할 수 있다. 일 실시형태에서, 항-BCMA 항체와 링커 사이의 연결은 항체의 시스테인 잔기의 티올 그룹과 링커의 말레이미드기 사이에 형성된다. 일부 실시형태에서, 항체의 쇄간 결합은 링커의 작용기와의 반응 전에 유리 티올기로 전환된다. 일부 실시형태에서, 시스테인 잔기는 항체의 중쇄 또는 경쇄 내에 도입되고, 링커와 반응된다. 항체 중쇄 또는 경쇄에서 치환에 의한 시스테인 삽입을 위한 위치는 공개된 미국 특허 출원 제2007-0092940호 및 국제 특허 출원 공개 WO2008070593에 기재된 것을 포함하며, 이들 각각은 그의 전문이 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참고로 포함된다.
일부 실시형태에서, 상기 항체-약물 접합체는 다음의 식 I을 가진다:
L - (LU-D)p (I)
L은 항-BCMA 항체이며, LU는 링커 단위이고, D는 약물 단위(즉, 치료제)이다. 아래첨자 p는 1 내지 20의 범위이다. 이러한 접합체는 링커를 통해 적어도 하나의 약물에 공유적으로 연결된 항-BCMA 항체를 포함한다. 링커 단위는 항체의 하나의 말단에서 그리고 약물의 다른 말단에서 연결된다.
약물 부하는 항체 당 약물 분자의 수인 p로 나타낸다. 약물 부하는 항체 당 1 내지 20개의 약물 단위(D)의 범위일 수 있다. 일부 양상에서, 아래첨자 p는 1 내지 20의 범위일 것이다(즉, 1 내지 20의 정수와 비정수 값 둘 다). 일부 양상에서, 아래첨자 p는 1 내지 20의 정수일 것이고, 단일 항체에 대해 약물-링커의 수를 나타낼 것이다. 다른 양상에서, p는 항체 당 약물-링커 분자의 평균 수, 예를 들어, 반응 혼합물 또는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물) 중의 항체 당 약물-링커의 평균 수를 나타내고, 정수 또는 비-정수 값일 수 있다. 따라서, 일부 양상에서, 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에 대해, p는 조성물 중의 항체-약물 접합체의 평균 약물 부하를 나타내고, 그리고 p는 1 내지 20의 범위이다.
일부 실시형태에서, p는 항체 당 약 1 내지 약 8개의 약물이다. 일부 실시형태에서, p는 1이다. 일부 실시형태에서, p는 2이다. 일부 실시형태에서, p는 항체 당 약 2 내지 약 8개의 약물이다. 일부 실시형태에서, p는 항체 당 약 2 내지 6, 2 내지 약 5, 또는 2 내지 약 4개의 약물이다. 일부 실시형태에서, p는 항체 당 약 2, 약 4, 약 6 또는 약 8개의 약물이다.
접합 반응으로부터의 제조에서 항체 단위 당 약물의 평균 수는 통상적인 수단, 예컨대 질량 분석법, ELISA 분석, HIC 및 HPLC를 특징으로 할 수 있다. p에 대해 접합체의 정량적 분포가 또한 결정될 수 있다.
예시적인 항체-약물 접합체는 아우리스타틴 기반 항체-약물 접합체, 즉, 약물 성분이 아우리스타틴 약물인 접합체를 포함한다. 아우리스타틴은 튜불린에 결합하고, 미세소관 역학 및 핵 및 세포 분화를 방해하는 것으로 나타났으며, 항암 활성을 가진다. 전형적으로 아우리스타틴 기반 항체-약물 접합체는 아우리스타틴 약물과 항-BCMA 항체 사이에 링커를 포함한다. 아우리스타틴은 링커에 적합한 임의의 위치에서 항-BCMA 항체에 연결될 수 있다. 링커는, 예를 들어, 절단성 링커(예를 들어, 펩티딜 링커) 또는 비-절단성 링커(예를 들어, 항체의 분해에 의해 방출된 링커)일 수 있다. 아우리스타틴은 아우리스타틴 E 또는 이의 유도체일 수 있다. 아우리스타틴은, 예를 들어, 아우리스타틴 E와 케토산 사이에 형성된 에스터일 수 있다. 예를 들어, 아우리스타틴 E는 파라아세틸벤조산 또는 벤조일발레르산과 반응되어 각각 AEB 및 AEVB를 생성할 수 있다. 다른 전형적인 아우리스타틴은 MMAF(모노메틸 아우리스타틴 F), 및 MMAE(모노메틸 아우리스타틴 E)를 포함한다. 예시적인 아우리스타틴의 합성 및 구조는 미국 특허 공개 제7,659,241호, 제7,498,298호, 제2009-0111756호, 제2009-0018086호, 및 제7,968,687호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그의 전문이 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참고로 포함된다.
예시적인 아우리스타틴 기반 항체-약물 접합체는 이하에 나타내는 바와 같은 vcMMAE, vcMMAF 및 mcMMAF 항체-약물 접합체 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하되, Ab는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체이고, val-cit는 발린-시트룰린 다이펩타이드를 나타낸다:
Figure pct00003
Figure pct00004
.
약물 부하는 항체 당 약물-링커 분자의 수인 p로 나타낸다. 내용에 따라서, p는 평균 약물 부하로도 지칭되는 항체 당 약물-링커 분자의 평균 수를 나타낼 수 있다. 변수 p는 1 내지 20의 범위이고, 바람직하게는 1 내지 8이다. 일부 바람직한 실시형태에서, p가 평균 약물 부하를 나타낼 때, p는 약 2 내지 약 5의 범위이다. 일부 실시형태에서, p는 약 2, 약 3, 약 4, 또는 약 5이다. 일부 양상에서, 상기 항체는 시스테인 잔기의 황 원자를 통해 링커에 접합된다. 일부 양상에서, 시스테인 잔기는 항체로 조작된 것이다. 다른 양상에서, 시스테인 잔기는 쇄간 이황화물 시스테인 잔기이다.
예시적인 항체-약물 접합체는 PBD 기반 항체-약물 접합체; 즉, 항체-약물 접합체를 포함하되, 약물 성분은 PBD 약물이다.
PBD는 하기의 일반 구조식을 가진다:
Figure pct00005
그들은 그들의 방향족 A 고리와 피롤로 C 고리 둘 다에서, 그리고 C 고리의 포화도에서 치환체의 수, 유형 및 위치가 상이하다. B-고리에서, DNA의 알킬화를 초래하는 친전자성 중심인 N10-C11 위치에서 이민(N=C), 카빈올아민(NH-CH(OH)), 또는 카빈올아민 메틸 에터(NH-CH(OMe))가 있다. 모든 공지된 천연 생성물은 카이랄 C11a 위치에서 (S)-입체배치를 갖는데, 이는 C 고리로부터 A 고리쪽으로 살펴볼 때 그들에게 우회선(right-handed twist)을 제공한다. 이는 B-형태 DNA의 소홈을 갖는 등나사선성(isohelicity)을 위해 그들에게 적절한 3차원 형상을 제공하여, 결합 부위에서의 꼭 맞춤을 야기한다. 소홈에서 부가물을 형성하는 PBD의 능력은 그들이 DNA 가공을 방해하여, 따라서 항종양제로서 그들이 사용되게 할 수 있다.
이들 분자의 생물학적 활성은 가요성 알킬렌 링커를 통해 그들의 C8/C'-하이드록실 작용기를 통해하여 함께 2개의 PBD 단위를 결합함으로써 강화될 수 있다. PBD 이량체는 서열-선택적 DNA 병변, 예컨대 회문식 5'-Pu-GATC-Py-3' 쇄간교차연관을 형성하는 것으로 생각되는데, 이는 주로 그들의 생물학적 활성을 초래하는 것으로 생각된다.
일부 실시형태에서, PBD 기반 항체-약물 접합체는 항-BCMA 항체에 연결된 PBD 이량체를 포함한다. PBD 이량체를 형성하는 단량체는 동일 또는 상이할 수 있으며, 즉, 대칭적 또는 비대칭적일 수 있다. PBD 이량체는 링커에 대한 접합에 적합한 임의의 위치에서 항-BCMA 항체에 연결될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, PBD 이량체는 화합물을 항-BCMA 항체에 연결하기 위한 앵커를 제공하는 C2 위치에서 치환체를 가질 것이다. 대안의 실시형태에서, PBD 이량체의 N10 위치는 항-BCMA 항체에 화합물을 연결하기 위한 앵커를 제공할 것이다.
전형적으로 PBD 기반 항체-약물 접합체는 PBD 약물과 항-BCMA 항체 사이에 링커를 포함한다. 링커는 절단 가능한 단위(예를 들어, 효소에 대한 표적 기질인 아미노산 또는 아미노산의 인접 서열) 또는 비절단성 링커(예를 들어, 항체의 분해에 의해 방출되는 링커)를 포함할 수 있다. 링커는 항체에 대한 결합을 위한 말레이미드기, 예를 들어, 말레이미도카프로일을 추가로 포함할 수 있다. 링커는, 일부 실시형태에서, 자기-희생기, 예를 들어, p-아미노벤질 알코올(PAB) 단위를 추가로 포함할 수 있다.
접합체로서 사용하기 위한 예시적인 PBD 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염은 국제 특허 출원 WO 2011/130613에 기재되어 있으며, 다음과 같되, 물결선은 링커에 대한 부착 부위를 나타낸다:
Figure pct00006
.
예시적인 링커는 다음과 같되, 물결선은 약물에 대한 부착 부위를 나타내고, 항체는 말레이미드기를 통해 연결된다.
Figure pct00007
예시적인 PBD 기반 항체-약물 접합체 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염은 이하에 나타내는 바와 같은 항체-약물 접합체를 포함하되, Ab는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체이다:
Figure pct00008
.
약물 부하는 항체 당 약물-링커 분자의 수인 p로 나타낸다. 내용에 따라서, p는 평균 약물 부하로도 지칭되는 항체 당 약물-링커 분자의 평균 수를 나타낼 수 있다. 변수 p는 1 내지 20의 범위이고, 바람직하게는 1 내지 8이다. 일부 바람직한 실시형태에서, p가 평균 약물 부하를 나타낼 때, p는 약 2 내지 약 5의 범위이다. 일부 실시형태에서, p는 약 2, 약 3, 약 4, 또는 약 5이다. 일부 양상에서, 상기 항체는 항체로 조작되는 시스테인 잔기의 황 원자를 통해 약물 링커에 접합된다. 일부 양상에서, 시스테인 잔기는 EU 지표에 의해 결정되는 바와 같이 위치 239(IgG1)에서 항체로 조작된다(Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991).
VI. 면역학적 장애 또는 BCMA - 발현암의 동물 모델
항-BCMA 항체 또는 유도체는 면역학적 장애 또는 BCMA-발현암의 동물 모델에서 시험되거나 또는 검증될 수 있다. 당뇨병, 낭창, 전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 실험적 자가면역 뇌수막염(다발성 경화증), 갑상선염, 중증 근무력증, 관절염, 포도막염, 염증성 장 질환을 포함하는 전신 및 기관-특이적 자가면역 질환의 동물 모델의 예는 문헌[Bigazzi, "Animal Models of Autoimmunity: Spontaneous and Induced," The Autoimmune Diseases (Rose and Mackay eds., Academic Press, 1998)] 및 문헌["Animal Models for Autoimmune and Inflammatory Disease," Current Protocols in Immunology (Coligan et al. eds., Wiley and Sons, 1997)]에 의해 기재되었다.
알레르기성 병태, 예를 들어, 천식 및 피부염이 또한 설치류에서 모델링될 수 있다. 기도 과민성은 오발부민(Tomkinson et al., 2001, J. Immunol. 166:5792-800) 또는 만손주혈흡충 충란항원(Tesciuba et al., 2001, J. Immunol. 167:1996-2003)에 의해 마우스에서 유도될 수 있다. 마우스의 Nc/Nga 균주는 혈청 IgE에서 표시된 증가를 나타내고, 자발적으로 아토피성 피부염-유사 병변을 발생시킨다(Vestergaard et al., 2000, Mol. Med. Today 6:209-10; Watanabe et al., 1997, Int. Immunol. 9:461-66; Saskawa et al., 2001, Int. Arch. Allergy Immunol. 126:239-47).
치명적으로 방사선 조사된 조직-부적합 숙주 내로 면역적격 공여자 림프구의 주사는 마우스에서 GVHD를 유도하기 위한 고전적 접근이다. 대안적으로, 모 B6D2F1 뮤린 모델은 급성과 만성 GVHD를 둘 다 유도하기 위한 시스템을 제공한다. 이 모델에서, B6D2F1 마우스는 C57BL/6과 DBA/2 마우스의 모 균주 사이의 교배로부터의 F1 자손이다. DBA/2 림프구 세포의 비-방사선 조사 B6D2F1 마우스 내로의 전달은 만성 GVHD를 야기하는 반면, C57BL/6, C57BL/10 또는 B10.D2 림프구 세포의 전달은 급성 GVHD를 야기한다(Slayback et al., 2000, Bone Marrow Transpl. 26:931-938; Kataoka et al., 2001, Immunology 103:310-318).
추가적으로, 인간 조혈 줄기 세포와 성숙 말초 혈액 림프구 세포는 둘 다 SCID 마우스에 접합될 수 있고, 이들 인간 림포-조혈세포는 SCID 마우스에서 기능성으로 남아있다(McCune et al., 1988, Science 241:1632-1639; Kamel-Reid and Dick, 1988, Science 242:1706-1709; Mosier et al., 1988, Nature 335:256-259). 이는 인간 림프구 세포에 대해 잠재적 치료제의 직접 시험을 위함 작은 동물 모델 시스템을 제공하였다. (예를 들어, 문헌[Tournoy et al., 2001, J. Immunol. 166:6982-6991] 참조).
게다가, 항-BCMA 항체 또는 유도체의 생체내 효능을 시험하기 위한 작은 동물 모델은 BCMA-발현 인간 종양 세포주를 적절한 면역결핍 설치류 균주, 예를 들어, 흉선 누드 마우스 또는 SCID 마우스를 이식함으로써 생성될 수 있다. BCMA-발현 인간 림프종 세포주의 예는, 예를 들어, Daudi(Ghetie et al., 1994, Blood 83:1329-36; Ghetie et al., 1990, Int. J. Cancer 15:481-85; de Mont et al., 2001, Cancer Res. 61:7654-59), Ramos(Ma et al., 2002, Leukemia 16:60-6; Press et al., 2001, Blood 98:2535-43), HS-Sultan(Cattan and Maung, 1996, Cancer Chemother. Pharmacol. 38:548-52; Cattan and Douglas, 1994, Leuk. Res. 18:513-22), Raji(Ochakovskaya et al., 2001, Clin. Cancer Res. 7:1505-10; Breisto et al., 1999, Cancer Res. 59:2944-49), 및 CA46(Kreitman et al., 1999, Int. J. Cancer 81:148-55)를 포함한다. BCMA-발현 호지킨 림프종 계통의 비제한적 예는 L540cy이다(Barth et al., 2000, Blood 95:3909-14; Wahl et al., 2002, Cancer Res. 62:3736-42). BCMA 발현 인간 신장 세포 암종 세포주의 비제한적 예는 786-O(Ananth et al., 1999, Cancer Res. 59:2210-16; Datta et al., 2001, Cancer Res. 61:1768-75), ACHN(Hara et al., 2001, J. Urol. 166:2491-94; Miyake et al., 2002, J. Urol. 167:2203-08), Caki-1(Prewett et al., 1998, Clin. Cancer Res. 4:2957-66; Shi and Siemann, 2002, Br. J. Cancer 87:119-26), 및 Caki-2(Zellweger et al., 2001, Neoplasia 3:360-67)를 포함한다. BCMA-발현 비인두암종 세포주의 비제한적 예는 C15 및 C17을 포함한다(Busson et al., 1988, Int. J. Cancer 42:599-606; Bernheim et al., 1993, Cancer Genet. Cytogenet. 66:11-5). BCMA-발현 인간 신경교종 세포주의 비제한적 예는 U373(Palma et al., 2000, Br. J. Cancer 82:480-7) 및 U87MG(Johns et al., 2002, Int. J. Cancer 98:398-408)를 포함한다. 이들 종양 세포주는 피하 주사에 의해 고형 종양으로서 또는 정맥내 주사에 의해 파종성 종양으로서 면역결핍 설치류 숙주에서 확립될 수 있다. 숙주 내에서 일단 확립되면, 이들 종양 모델은 생체내 종양 성장을 조절함에 있어서 항-BCMA 항체 또는 유도체의 치료 효능을 평가하도록 적용될 수 있다.
VII. 치료적 적용
본 발명의 항-BCMA 항체는 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 이러한 암은 단백질(예를 들어, 예시된 항체 중 하나를 이용하는 면역분석에 의해) 또는 mRNA 수준에서 측정된 BCMA의 검출 가능한 수준을 나타낸다. 일부 이러한 암은 동일한 유형으로부터의, 바람직하게는 동일한 환자로부터의 비암성 조직에 비해 BCMA의 상승된 수준을 나타낸다. 치료될 수 있는 암 세포에 대한 BCMA의 예시적인 수준은 더 고수준 또는 더 저수준으로 치료될 수 있지만, 5000 내지 150000 BCMA 분자/세포이다. 선택적으로, 암에서 BCMA의 수준은 치료를 수행하기 전에 측정된다.
본 발명의 항체에 의해 치료 가능한 암은 고형 종양 및 혈액암, 예컨대 백혈병 및 림프종을 포함한다. 상기 항체는 B-세포의 암에 대해 특히 적합하다. 항체로 치료 가능한 암의 예는 성인 및 소아 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 림프성 백혈병(ALL), 만성 림프성 백혈병(CLL) 및 2차 백혈병; 비호지킨 림프종(NHL) 및 호지킨병; 골수 형성이상 증후군 (MDS), 골수증식 증후군(MPS) 다발성 골수종, 발덴스트롬마크로글로불린혈증 또는 버킷 림프종, 악성 혈장 세포 신생물, BCMA+고등급 림프종, 칼러병 및 골수종증; 혈장 세포 백혈병; 형질세포종; B-세포 전림프성 백혈병; 모발세포 백혈병; 여포성 림프종(여포성 비호지킨 림프종 유형을 포함); 버킷 림프종(풍토성 버킷 림프종; 산발적 버킷 림프종): 대역 림프종(점막-관련 림프 조직: MALT 1 MALToma; 단핵구모양 B 세포 림프종; 융모 림프구에 의한 비장 림프종); 맨틀 세포 림프종; 거대 세포 림프종(미만성 거대 세포; 광범위 혼합 세포; 면역아세포 림프종; 원발성 종격동 B 세포 림프종; 혈관중심성 림프종 폐 B 세포): 소 림프성 림프종(SLL); 전구체 B-림프아구성 림프종; 골수성 백혈병(과립구; 골수성; 급성 골수성 백혈병; 만성 골수성 백혈병; 아급성 골수성 백혈병; 골수성 육종; 녹색종; 과립구 육종; 급성 전골수성 백혈병; 급성 골수단핵구성 백혈병); 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 또는 다른 B-세포 백혈병 또는 림프종을 포함한다.
본 발명의 항체는 또한 BCMA를 발현시키는 면역 세포에 의해 매개되는 면역 장애, 특히 B-세포 매개 장애에 유용하다. 이러한 질환의 예는 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스(SLE), I형 당뇨병, 천식, 아토피 피부염, 알레르기성 비염, 혈소판 감소성 자반병, 다발성 경화증, 건선, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 그레이브씨병, 원발성 담즙성 간경화증, 베게너 육아종증, 결핵, 및 이식편대 숙주 질환, 면역-매개 혈소판 감소증, 용혈성 빈혈, 수포성 유사천포창, 중증 근무력증, 그레이브스병, 애디슨병, 낙엽상천포창, 건선, 건선 관절염, 및 강직성 척추염이다.
항-BCMA 항체 단독 또는 이의 약물-접합체는 개시를 지연시키고/시키거나, 중증도를 감소시키고/시키거나, 추가적인 악화를 저해하고/하거나 암의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 개선시키는 투약량, 투여 경로 및 투여 빈도를 의미하는 유효 요법으로 투여된다. 환자가 이미 암으로 고통받고 있다면, 요법은 치료적 유효 요법으로서 지칭될 수 있다. 환자가 일반적 집단에 비해 암의 상승된 위험에 있지만, 아직 증상을 경험하지 않았다면, 요법은 예방적 유효 요법으로서 지칭될 수 있다. 일부 예에서, 치료적 또는 예방적 효능은 동일한 환자에서의 조직학적 제어 또는 과거의 경험에 대해 개개 환자에서 관찰될 수 있다. 다른 예에서, 치료적 또는 예방적 효능은 비처리 환자의 제어 집단에 대해 치료 환자의 집단에서의 전임상 또는 임상 시험에서 입증될 수 있다.
단클론성 항체에 대한 예시적인 투약량은 0.1㎎/㎏ 내지 50㎎/㎏의 환자 체중, 더 전형적으로는 1㎎/㎏ 내지 30㎎/㎏, 또는 1㎎/㎏ 내지 20㎎/㎏, 또는 1㎎/㎏ 내지 15㎎/㎏, 또는 1㎎/㎏ 내지 12㎎/㎏, 또는 1㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏, 1 또는 2㎎/㎏ 내지 30㎎/㎏, 또는 2㎎/㎏ 내지 20㎎/㎏, 또는 2㎎/㎏ 내지 15㎎/㎏, 또는 2㎎/㎏ 내지 12㎎/㎏, 또는 2㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏, 또는 3㎎/㎏ 내지 30㎎/㎏, 또는 3㎎/㎏ 내지 20㎎/㎏, 또는 3㎎/㎏ 내지 15㎎/㎏, 또는 3㎎/㎏ 내지 12㎎/㎏, 또는 3㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏이다. 이의 활성 단클론성 항체 약물 접합체, 예를 들어, 아우리스타틴에 대한 예시적인 투약량은 고정 투약량으로서 1㎎/㎏ 내지 7.5㎎/㎏, 또는 2㎎/㎏ 내지 7.5㎎/㎏ 또는 3㎎/㎏ 내지 7.5㎎/㎏의 대상체 체중, 또는 0.1 내지 20, 또는 0.5 내지 5㎎/㎏ 체중(예를 들ㄹ어, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10㎎/㎏) 또는 10 내지 1500 또는 200 내지 1500㎎이다. 이의 고도로 활성인 단클론성 항체 약물 접합체, 예를 들어, PBD에 대한 예시적인 투약량은 1.0㎍/㎏ 내지 1.0㎎/㎏, 또는 1.0㎍/㎏ 내지 500.0㎍/㎏의 대상체 체중이다. 일부 방법에서, 이어서, 환자에게 항체 또는 ADC가 2, 3 또는 4주마다 투여된다. 투약량은 특히, 투여 빈도, 환자의 병태 및 선행 치료에 대한 반응, 만약에 있다면, 치료가 예방적인지 또는 치료적인지의 여부 및 장애가 급성인지 또는 만성인지의 여부에 의존한다.
투여는 비경구, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 척추강내, 복강내, 국소, 비강내 또는 근육내일 수 있다. 투여는 또한 종양 내로 직접적으로 국소화된다. 정맥내 또는 피하 투여에 의한 전신 내로의 투여가 바람직하다. 정맥내 투여는, 예를 들어, 30 내지 90분과 같은 기간에 따른 주입에 의하거나 또는 단일 볼루스 주사에 의할 수 있다.
투여 빈도는 특히 순환에서 항체 또는 항체-약물 접합체의 반감기, 투여 경로에 의존한다. 빈도는 환자의 병태에서 변화에 대반 반응 또는 치료 중인 암의 진행에서 1일, 1주, 1개월, 분기마다 또는 불규칙적 간격일 수 있다. 정맥내 투여를 위한 예시적인 빈도는, 다소 빈번한 투약이 또한 가능하지만, 연속적 치료 과정에 걸쳐 1주 2회 내지 분기마다이다. 정맥내 투여를 위한 다른 예시적인 빈도는, 다소 빈번한 투약이 또한 가능하지만, 연속적 치료 과정에 걸쳐 1주 1회 또는 1개월에 1회이다. 피하 투여를 위해, 예시적인 투약 빈도는, 다소 빈번한 투약이 또한 가능하지만, 1일 내지 1개월이다.
투여되는 투약량의 수는 암 또는 자가면역 질환의 특성(예를 들어, 급성 또는 만성 증상이 존재하는지의 여부) 및 치료에 대한 장애의 반응에 의존한다. 급성 장애 또는 만성 장애의 급성 악화에 대해 1 내지 10회 용량은 종종 충분하다. 때때로 선택적으로 분할된 형태로 단일 볼루스 용량은 급성 장애 또는 만성 장애의 급성 악화에 충분하다. 치료는 급성 장애 또는 급성 악화의 재발을 위해 반복될 수 있다. 만성 장애에 대해, 항체는 규칙적 간격으로, 예를 들어, 매주, 격주, 매달, 분기마다, 6개월마다 적어도 1, 5 또는 10년 동안, 또는 환자의 수명 동안 투여될 수 있다.
비경구 투여를 위한 약제학적 조성물은 바람직하게는 멸균 및 실질적으로는 등장성이고, GMP 병태 하에 제조된다. 약제학적 조성물은 단위 투약량 형태(즉, 단일 투여를 위한 투약량)로 제공될 수 있다. 약제학적 조성물은 하나 이상의 생리적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 이용하여 제형화될 수 있다. 제형은 선택된 투여 경로에 의존한다. 주사를 위해, 항체는 (주사 부위에서 불편함을 감소시키기 위해) 수용액 중에서, 바람직하게는 생리적으로 적합한 완충제, 예컨대 행크스 용액, 링거 용액, 또는 생리 식염수 또는 아세트산염 완충제 중에서 제형화될 수 있다. 용액은 제형화제, 예컨대 현탁제, 안정제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로 항체는 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어, 무발열원수를 이용하는 구성을 위해 동결건조 형태일 수 있다. 액체 제형 중의 항체 농도는, 예를 들어, 0.01 내지 10㎎/㎖, 예컨대 1.0㎎/㎖일 수 있다.
본 발명의 항체에 의한 치료는 화학요법, 방사선, 줄기 세포 치료, 수술, 치료 중인 장애에 대해 유효한 다른 치료와 조합될 수 있다. BCMA에 대한 항체와 함께 투여될 수 있는 다른 제제의 유용한 분류는, 예를 들어, 암성 세포 상에서 발현된 다른 수용체에 대한 항체, 항튜불린제(예를 들어, 아우리스타틴), DNA 소홈 결합제(예를 들어, PBD), DNA 복제 저해제, 알킬화제(예를 들어, 백금 복합체, 예컨대 시스-플라틴, 모노(백금), 비스(백금) 및 3핵 백금 복합체 및 카보플라틴), 안트라사이클린, 항생제, 항엽산제, 항대사물질제, 화학요법 감작제, 듀오카르마이신, 에토포사이드, 플루오린화된 피리미딘, 증감제, 렉시트롭신, 나이트로소유레아, 플라틴올, 전형성 화합물, 퓨린 항대사물질, 퓨로마이신, 방사선 감작제, 스테로이드, 탁산, 토포아이소머라제 저해제, 빈카 알칼로이드 등을 포함한다. 암에 대해 상기 언급한 동일한 추가적인 치료는 또한 면역 매개 장애에 대해 사용될 수 있다. 면역 매개 장애에 대한 추가적인 제제는 면역 억제제, 예컨대 비만 세포 탈과립 저해제, 항-히스타민, 코르티코스테로이드, NSAID, 아자티오프린, 사이클로포스파마이드, 류케란 및 사이클로스포린 및 생물학적 항-염증제, 예컨대 타이사브리(Tysabri)(등록상표) 또는 휴미라(Humira)(등록상표)를 포함한다.
선택적으로 단독으로 또는 항체 약물 접합체로서 임의의 다른 제제 또는 상기 기재한 요법과 조합한 항-BCMA 항체에 의한 치료는 암이 있는 환자의 중앙값 무진행 생존 또는 전체 생존 시간을, 특히 재발될 때 또는 난치성일 때, 항-BCMA 항체가 없는 동일한 치료(예를 들어, 화학치료)에 비해 적어도 30% 또는 40%만큼 그러나 바람직하게는 50%, 60% 내지 70% 또는 심지어 100% 이상으로 증가시킬 수 있었다. 추가로 또는 대안적으로, 단독으로 또는 항체-약물 접합체로서 항-BCMA 항체를 포함하는 치료(예를 들어, 표준 화학요법)은 종양이 있는 환자의 완전한 반응 속도, 부분적 반응 속도, 또는 객관적 반응 속도(완전 + 부분적)를 항-BCMA 항체가 없는 동일한 치료(예를 들어, 화학요법)에 비해 적어도 30% 또는 40%만큼 그러나 바람직하게는 50%, 60% 내지 70% 또는 심지어 100%만큼 증가시킬 수 있다.
전형적으로, 임상 시험(예를 들어, II상, II/III상 또는 III상 시험)에서, 표준요법 단독(또는 + 위약)을 받은 환자의 대조군 그룹에 비해, 표준 요법 + 항-BCMA 항체로 치료된 환자의 중앙값 무진행 생존 및/또는 반응 속도에서의 앞서 언급한 증가는, 예를 들어 p = 0.05 또는 0.01 또는 심지어 0.001 수준에서 통계적으로 유의하다. 완전한 그리고 부분적 반응 속도는, 예를 들어, 국립 암 연구소 및/또는 식품 의약품국에 의해 열거되거나 또는 허용되는 암에 대한 임상 시험에서 통상적으로 사용되는 객관적 기준에 의해 결정된다.
VIII. 다른 적용
본 명세서에 개시된 항-BCMA 항체는 임상 진단 또는 치료의 내용에서 또는 연구에서 BCMA를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 암에 대한 BCMA의 발현은 암이 본 발명의 항체에 의한 치료를 잘 받을 수 있다는 표시를 제공한다. 항체는 또한 BCMA를 보유하는 세포 및 다양한 자극에 대한 그들의 반응을 검출함에 있어서 실험실 연구를 위한 연구 시약으로서 판매될 수 있다. 이러한 용도에서, 단클론성 항체는 형광 분자, 스핀 표지 분자, 효소 또는 방사성 동위원소로 표지될 수 있고, BCMA에 대한 분석을 수행하기 위해 모든 필요한 시약과 함께 키트의 형태로 제공될 수 있다. 상기 항체는 또한, 예를 들어, 친화도 크로마토그래피에 의해 BCMA 단백질을 정제하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 임의의 특징, 단계, 요소, 실시형태 또는 양상은 달리 구체적으로 표시되지 않는 한, 임의의 다른 것과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명은 명확함 및 이해의 목적을 위해 예시 및 실시예에 의해 일부 상세하게 기재하였지만, 특정 변화 및 변형이 첨부하는 청구범위의 범주 내에서 실행될 수 있다는 것은 분명할 것이다.
실시예
실시예 1 : 항체 발생
재조합 BCMA 세포외 도메인( BCMA ECD )의 제조
인간(아미노산 1 내지 51) 및 마우스 BCMA(아미노산 1 내지 46)의 세포외 도메인(ECD)을 클로닝하고, GST 융합 단백질(pGEX4T1; 아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences))로서 발현시켰다. 글루타티온-세파로스를 이용하여 BCMA 융합 단백질을 포획함으로써 그리고 트롬빈을 이용하여 프로테아제 분해에 의해 BCMA ECD를 방출함으로써 정제된 BCMA ECD를 얻었다. 벤즈아미딘 세파로스에 의해 트롬빈을 후속적으로 제거하였다.
악성종양 B-세포주 상에서 BCMA 발현의 동정
BCMA에 대한 상업적 항체인 Vicky-1(알렉시스 바이오테크놀로지(Alexis Biotechnology))을 이용하여 다발성 골수종 세포주 상에서 정량적 유세포 분석을 수행하였다. 결과는 BCMA가 시험한 골수종 계통 중에서 우세하다는 것을 나타낸다. NCI H929는 BCMA에 대한 양성 세포 표면 염색을 나타내었지만, BR3 또는 TACI 중 하나의 발현이 결여되었다. NCI H929는 BCMA를 발현시켰지만, BR3 또는 TACI는 발현시키지 않았기 때문에, 이를 BCMA 하이브리도마의 세포기반 선별에 대해 사용하였다.
형질감염 BCMA 세포주의 발생.
전장 BCMA 클론 또는 빈 벡터 중 하나를 이용하여 HEK 293 세포를 형질감염시킴으로써 안정한 세포주를 발생시켰다. 유세포 분석은 BCMA의 표면 상에서 BCMA의 양성 발현(293: BCMA)을 확인하였지만, 빈 벡터 대조군 플라스미드(293: 벡터)는 그렇지 않았다. 이들 세포주는 후속적으로 클로닝된 BCMA 항체의 특이성을 확인하기 위한 도구로서 사용하였다.
실시예 2: 비클로닝 하이브리도마 웰의 면역화 및 선별
항혈청의 면역화 및 선별
본 발명자들의 면역화 전략은 BCMA ECD의 아미노산 1 내지 50을 사용하였고, 따라서 리간드 결합 도메인에 대한 에피토프 내부 및 외부는 항체에 의해 표적화될 수 있으며(도 1A 및 도 1B) KLH-접합 BCMA ECD는 상업적 공급원으로부터 생성하였다(알렉시스 바이오케미컬스(Alexis Biochemicals)). 최대 면역 반응을 ELISA에 의해 검출하였을 때까지 타이터맥스(Titermax) 보조제를 이용하여 KLH-접합된 BCMA에 의해 래트를 면역화시켰다. 플레이트 기반 분석에서 APRIL 결합을 차단하는 능력에 대해 면역화된 래트 혈청을 선별하였다. 인간 BCMA 항체의 상당한 역가를 갖고, 그것은 강한 차단 활성을 나타내기 때문에 융합을 위해 래트 2 내지 3을 선택하였다.
래트 2 내지 3으로부터의 비장 세포를 채취하고 나서, X-63.Ag8.653.3.12.11 마우스 골수종 세포에 융합시키고, 기재한 바와 같이 선택하였다(Goding, 1989). 얻어진 하이브리도마로부터의 배양물 상청액을 정제된 hBCMA-GST를 이용하여 ELISA에 의해 선별하였다(도 2의 흐름도 참조). 80개의 양성 웰을 동정하고 나서, 확장을 위해 선택하였다. 80개의 양성 웰 중 60개는 확장 후 ELISA에 의해 계속해서 OD > 0.5를 나타내었다. 이어서, 이들 60개의 비클로닝 하이브리도마 웰을 세포 기반 결합을 위한 2차 분석, 리간드 차단 활성 및 마우스 BCMA에 대한 교차 반응성에서 선별하였다. 이는 12개의 리드 BCMA 하이브리도마 웰의 동정을 야기하였다. 이들 12개 리드 웰로부터의 세포 결합 데이터 및 리간드 차단 활성을 도 3에서 요약한다. 하이브리도마 웰 17은 상업적 단클론성 Vicky-1(알렉시스 바이오케미컬스)을 현탁시킨 세포 결합 및 리간드 차단 활성을 나타내었다. 8개의 웰(도 3에서 적색 별표로 나타냄)을 BCMA-양성 세포에 결합하거나 또는 리간드 결합을 차단하는 그들의 능력에 기반하여 클로닝을 기대하였다.
실시예 3 : 클론 하이브리도마의 특성규명
세포 결합 및 리간드 차단 활성.
제한된 희석 클로닝의 2회 라운드를 통해 하이브리도마 웰 11, 17, 20, 29, 40, 45 및 70을 취하였다. 이 지점으로부터 앞으로, 표 1에 나타낸 형식적 클론 ID를 갖는 항체를 설계할 것이다. 293에 대한 항체의 특이적 결합: BCMA 세포(293에 대해서는 아님): 벡터 대조군 세포는 항체가 BCMA에 결합한다는 것을 확인하였다.
형식적 클론 ID.
비클로닝된 표기 클론닝된 ID
11 SG16.11
17 SG16.17
20 SG16.20
29 SG16.29
40 SG16.40
45 SG16.45
70 SG16.70
새로운 BCMA 항체의 리간드 차단 활성을 비클로닝 마스터 웰로부터의 상청액, 클로닝된 웰로부터의 상청액 및 클로닝된 웰로부터의 정제된 항체를 이용하여 비교하였다(도 4). 상업적 항체를 양성 대조군으로서 사용하였다. SG-16.17은 클로닝된 하이브리도마 웰로부터의 배양물 상청액을 이용하여 APRIL 결합의 상당한 차단을 제공하였다. APRIL 결합의 SG16.17 차단의 적정을 정제된 SG16.17 및 상업적 항체를 이용하여 별개의 실험에서 수행하였다(도 5). 정제된 SG16.17은 상업적 항체에 비교할 때 유사한 농도에 걸쳐 개선된 차단 활성을 나타내었다. SG-16.45는 SG-16.17만큼 강하지는 않더라도, April 결합의 용량-의존적 저해를 나타내었다. 남아있는 BCMA 항체(SG-16.11, SG16.20, SG16.29, SG16.40 및 SG16.70)에 대한 리간드 차단 활성은 더 크지는 않았다. 특정 차단 BCMA 항체는 SG-16.17에 의해 관찰된 것보다 APRIL 결합의 75% 초과의 저해를 나타낸다. SG-16.11, SG-16.20, SG-16.29, SG-16.40 및 SG-16.70을 포함하는 더 "크지 않은" 항체 차단은 APRIL 결합의 약 30% 저해를 나타내었다(도 4).
고정된 BCMA에 결합하는 BAFF의 능력을 정제된 BCMA 항체의 존재 및 부재 하에 분석하였다. BCMA 항체 SG16.17, SG16.40, SG16.20 및 SG17.70에 의한 전처리는 모두 BCMA에 대한 BAFF 결합의 적정 가능한 저해를 초래하였다(도 6). 항체 처리의 부재 하에 고정된 BCMA에 대한 BAFF의 결합에 의해 상대적 저해를 결정하였다(도 6, 별표). 종합하면, 도 5 및 도 6의 데이터는 BCMA 항체가 BCMA에 대한 APRIL 및 BAFF의 리간드 결합을 차단함으로써, B 세포 생존 신호를 방해한다는 것을 나타낸다.
실시예 4: ADCC에 대한 SG16.17 및 SG16.45 항체 및 ADC로서 세포독성의 시험
야생형 인간 IgG1 중쇄 및 κ 경쇄 불변 도메인에 각각 래트 VH 및 VL 도메인을 융합시킴으로써 SG16.17 항체를 래트-인간 키메라 IgG로 전환시켰다. cSG16.17 야생형으로 표기되는 키메라화된 항체는 모 항체 SG16.17에 비교할 때 유사한 항원 결합 특성을 나타내었다. 다음에, 본 발명자들은 cSG16.17 돌연변이체를 생성하기 위해 ADCC를 향상시키는 것으로 알려진 Fc 돌연변이, S239D:A330L:I332E를 설치하였다. cSG16.17 야생형과 유사하게, Fc 삼중 돌연변이체의 생성은 cSG16.17 돌연변이체의 항원-결합 특성을 변경시키지 않았다. 정제된 자연 살해 세포를 이용하는 ADCC 분석에서 cSG16.17 야생형 및 cSG16.17 돌연변이체의 평가는 JJN3 및 U266 세포의 용량-의존적 용해를 초래한 반면, 비결합 인간 IgG 대조군에 의한 상당한 용해는 관찰되지 않았다. cSG16.17 야생형 항체는 JJN3 세포 상에서 제한된 ADCC 활성을 나타내었는데, cSG16.17 돌연변이체에 의해 효력(potency)이 대략 100배 및 효능이 2배 초과로(최대 용해) 증가되었다. 유사하게, U266 세포에 대해, cSG16.17 돌연변이체의 ADCC 활성은 모 키메라 항체에 비해 효력이 대략 100배 및 효능이 2배 향상되었다. JJN3과 U266 세포 둘 다의 최대 용해에 필요한 cSG16.17 돌연변이체의 농도는 대략 100p㏖/ℓ였다. 대조적으로, JJN3 및 U266 세포에 대한 cSG16.17의 해리 상수(K D)는 각각 15 및 10n㏖/ℓ로서 추정하였다. 따라서, cSG16.17 돌연변이체에 의한 최대 용해는 포화 결합에 도달하는 데 필요한 것보다 훨씬 아래의 농도에서 달성되었다.
본 발명자들은 항체 당 8개 약물의 화학량론으로 vcMMAF를 이용하여 ADC로서 세포독성을 유도하는 SG16.17 및 SG16.45의 능력을 평가하였다. SG16.17 또는 SG16.45-vcMMAF8은 H929 세포에 대해 강하게 세포독성이었다. 비결합 대조군 ADC 또는 비접합 항체를 이용하여 세포 생존도의 감소는 관찰되지 않았다. 본 발명자들은 또한 JJN3 및 U266 세포주를 포함하는 다른 MM 세포 걸친 SG16.17 ADC의 효능을 시험하였다. SG16.17-vcMMAF8은 모든 3개 MM 세포주에 걸쳐 일관되고 높은 효력(IC50 값 ≤130p㏖/ℓ)을 나타낸 반면, SG16.45-vcMMAF8은 더 큰 가변성 및 더 적은 전반적 효능을 나타내었다.
실시예 5: FcγRIIIa에 대한 결합, 및 FcγRIIIa를 통한 신호전달에 대한 SG16.17 항체의 시험
결합 분석을 위해, CHO 세포를 FcγRIIIa(hCD16)로 형질감염시키고, 키메라 SG16.17과 야생형 IgG1 및 IgG1 S239D, A330L, I332E 유전자형, 및 다양한 IgG1 대조군 항체와의 경쟁에서 측정한 표지 h00 항체와 결합하였다. 도 12는 키메라 SG16.17이 두 대조군 항체, 즉, 리툭시맙 및 cOKT9보다 더 강하게 경쟁하였다는 것을 나타낸다. SG16.17의 돌연변이체 형태는 야생형 IgG1 형태보다 더 강하게 경쟁하였다. 신호전달 분석은 BCMA를 발현시키는 U266 표적 세포, FcγRIIIa를 발현시키는 Jurkat 효과기 세포를 사용하고, NFAT 반응 요소 및 Bio-Glo 지표로부터의 루시퍼라제 리포터를 발현시키도록 조작하였다. cSG16.17 G1 WT와 S239D, A330L, I332E는 둘 다 FcγRIIIa 신호전달을 유발하였고, S239D, A330L, I332E 형태로부터의 신호전달은 더 강하였다(도 13).
실시예 6: SG16.17의 인간화
hSG16.17 중쇄 변이체에서의 인간화 돌연변이
vH 변이체 HV 엑손 수용자 서열 공여자 프레임워크 잔기 수용자 CDR 잔기
hvH1 HV1-2/HJ3 H8, H20, H48, H67, H69, H71, H73, H76, H80, H88, H91, H93 없음
hvH2 HV1-2/HJ3 H20, H48, H69, H71, H73, H76, H80, H88, H91, H93 H34, H50, H58, H60, H61, H62, H64, H65
hvH3 HV1-2/HJ3 H20, H48, H67, H69, H71, H73, H76, H80, H88, H91, H93 H58, H60, H61, H62, H64, H65
hvH4 HV1-2/HJ3 H48, H67, H69, H71, H73, H76, H80, H88, H91, H93 H34, H50, H58, H60, H61, H62, H64, H65
hvH5 HV1-46/HJ3 H48, H67, H71, H73, H76, H78, H80, H91, H93 없음
hvH6 HV1-46/HJ3 H8, H20, H48, H71, H73, H76, H78, H80, H91, H93 없음
hSG16.17 카파 경쇄 변이체에서의 인간화 돌연변이
vK 변이체 KV 엑손 수용자 서열 공여자 프레임워크 잔기 수용자 CDR 잔기
hVK2 KV1-12/KJ5 L46, L48, L87 L53
hVK3 KV1-12/KJ5 L46, L48, L87 L24, L53
hVK4 KV1-12/KJ5 L46, L48, L78, L85, L87 없음
hVK5 KV1-12/KJ5 L40, L46, L48, L87 L24, L53
hSG16.17 중쇄 변이체에서의 특정 프레임워크 돌연변이
변이체 H8 H20 H48 H67 H69 H71 H73 H76 H78 H80 H88 H91 H93 인간%
hvH1 R* L* I* A* M* A* K* N* A V* A* F* T* 79.6
hvH2 G L* I* V M* A* K* N* A V* A* F* T* 88.8
hvH3 G L* I* A* M* A* K* N* A V* A* F* T* 86.7
hvH4 G V I* A* M* A* K* N* A V* A* F* T* 88.8
hvH5 G V I* A* M A* K* N* A* V* A F* T* 78.6
hvH6 R* L* I* V M A* K* N* A* V* A F* T* 85.7
*래트 잔기
hSG16.17 카파 경쇄 변이체에서의 특정 프레임워크 돌연변이
변이체 L40 L46 L48 L78 L85 L87 인간%
hvK2 P V* V* L T F* 86.3
hvK3 P V* V* L T F* 87.4
hvK4 P V* V* M* D* F* 83.2
hvK5 S* V* V* L T F* 86.3
*래트 잔기
SG16.17을 발현시키는 래트 하이브리도마의 래트 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 서열분석하였다. HV1-2/HJ3(서열번호 9) 또는 HV1-46/HJ3(서열번호 10)을 중쇄에 대한 인간 수용자 서열로서 사용하였고, KV1-12/KJ5(서열번호 18)를 경쇄에 대한 인간 수용자 서열로서 사용하였다.
래트 공여자와 인간 수용자 서열 사이의 상이한 위치는 H8, H20, H48, H67, H69, H71, H76, H78, H80, H88, H91, H93, L40, L46, L48, L78, L85 및 L87을 포함하였다. 이들 잔기의 상이한 순열은 상이한 인간화된 중쇄 및 경쇄 서열에서 복귀 돌연변이로서 포함하였다. 또한 인간 수용자 서열의 대응하는 잔기로의 치환을 위해 카바트 CDR에서 몇몇 래트 잔기를 시험하였다. 이들 잔기의 위치는 H34, H50, H58, H60, H61, H62, H64 및 H65, 및 L24 및 L53이었다. 6개의 인간화된 중쇄 변이체 및 4개의 인간화된 경쇄 변이체를 설계하고, 발현시켰다. 표 2 및 표 3은 각각의 인간화된 변이체 쇄에서의 인간 수용자 서열, 복귀 돌연변이(공여자 프레임워크 잔기), 및 CDR 치환(수용자 CDR 잔기)을 나타낸다. 표 4 및 표 5는 각각의 인간화된 변이체 쇄에서 복귀 돌연변이를 위해 고려된 각각의 위치를 점유하는 아미노산을 나타낸다. 이들 표는 또한 가장 가까운 인간 생식계열 서열과 동일한 잔기의 백분율을 나타낸다. 최근의 INN 가이드라인에 따르면, 중쇄와 경쇄 둘 다에서 인간 생식계열 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 항체만을 인간화된 것으로 지칭할 수 있다. 도 7 내지 도 9는 인간화된 중쇄 가변 영역의 정렬을 나타낸다. 도 10 및 도 11은 래트 가변 영역 및 인간 수용자 서열을 갖는 인간화된 경쇄 가변 영역의 정렬을 나타낸다. 가변 경쇄의 C-말단 알기닌(R)은 대안적으로 경쇄 불변 영역의 N-말단 알기닌으로서 간주할 수 있다.
세포 당 BCMA의 약 50,000개 분자를 발현시키는 NCI-H929 세포 상에서 발현된 BCMA에 대한 결합에 대한 모든 24가지의 가능한 순열에서 6개의 인간화된 중쇄 및 4개의 인간화된 경쇄를 시험하였다. 결과를 이하의 표 6에 나타낸다. 간략하게, 모든 인간화된 경쇄는 양호한 결합을 나타내었다. 인간화된 중쇄 중에서, 변이체 VH1, VH3 및 VH5는 모두 키메라 또는 래트 SG16.17 항체 중 하나에 비해 개선된 결합을 나타내었다.
NCI-H929 세포 상에서 발현된 BCMA에 대한 인간화된 항체 hSG16.17 결합
hSG16.17 vH vK NCI-H929 3-pt 분석
1 vH1 vK2 ++++
2 vH1 vK3 ++++
3 vH1 vK4 ++++
4 vH1 vK5 ++++
5 vH2 vK2 -
6 vH2 vK3 -
7 vH2 vK4 -
8 vH2 vK5 -
9 vH3 vK2 ++++
10 vH3 vK3 ++++
11 vH3 vK4 ++++
12 vH3 vK5 ++++
13 vH4 vK2 -
14 vH4 vK3 -
15 vH4 vK4 -
16 vH4 vK5 -
17 vH5 vK2 ++++
18 vH5 vK3 ++++
19 vH5 vK4 ++++
20 vH5 vK5 ++++
21 vH6 vK2 ++
22 vH6 vK3 ++
23 vH6 vK4 ++
24 vH6 vK5 ++
cSG16.17 +++
rSG16.17 +++
NCI-H929 분석에서 최상으로 수행하는 인간화된 항체(즉, VH1, VH3 또는 VH5 중쇄를 포함하는 것)를 농도 지점의 전체 범위에서 U266 세포에 대한 결합에 대해 추가로 시험하였다. 이 분석에서, VH1 중쇄를 포함하는 인간화된 항체는 (이의 인간화된 경쇄 변이체가 포함되는지와 상관없이) 래트 또는 키메라 SG16.17에 비해 향상된 결합을 나타내었다. VH3 또는 VH5 중쇄를 포함하는 인간화된 항체는 (이의 인간화된 경쇄 변이체가 포함되었는지와 상관없이) 래트 또는 키메라 SG16.17 결합으로서 실험 오차 내에서 동일한 결합을 나타내었다. VH2 또는 VH6 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체는 이의 인간화된 경쇄 변이체가 포함되었는지와 상관없이 래트 또는 키메라 SG16.17에 비해 감소된 결합을 나타내었다.
NCI-H929 분석에 대해 최상으로 수행하는 인간화된 항체는 또한 이하의 표 7에 나타낸 바와 같은 인간 생식계열에 대한 단백질 발현 수준, 단량체 수준 및 서열 동일성 백분율에 비교하였다.
hSG16.17 vH vK hBCMA
결합 		일시적 역가(mg/L) aSEC
(단량체%) 		≥85% 인간(vH, vK)
및 INN 표기 		리드 선택
1 vH1 vK2 ++++ 139 90.4 79.6 86.3 혼합 Y
2 vH1 vK3 ++++ 126 89.6 79.6 87.4 혼합 Y
3 vH1 vK4 ++++ 80 94.6 79.6 83.2 키메라 N
4 vH1 vK5 ++++ 119 89.5 79.6 86.3 혼합 N
9 vH3 vK2 ++++ 129 94.1 86.7 86.3 인간화 Y
10 vH3 vK3 ++++ 116 94.1 86.7 87.4 인간화 Y
11 vH3 vK4 ++++ 82 95.2 86.7 83.2 혼합 Y
12 vH3 vK5 ++++ 117 93.5 86.7 86.3 인간화 Y
17 vH5 vK2 ++++ 97 96.2 78.6 86.3 혼합 Y
18 vH5 vK3 ++++ 86 96.1 78.6 87.4 혼합 Y
19 vH5 vK4 ++++ 65 96.5 78.6 83.2 키메라 N
20 vH5 vK5 ++++ 73 95.0 78.6 86.3 혼합 Y
VH3 VK2 인간화된 항체를 (실험 오차 내에서) 래트 및 마우스 SG16.17 항체와 동일한 인간 BCMA에 대한 결합 친화도; 중쇄와 경쇄 가변 영역 둘 다에서 인간 생식계열 서열에 대해 85% 초과의 동일성, 양호한 발현 및 높은 단량체 백분율을 갖는 것에 기반하여 리드 인간화 항체로서 선택하였다.
실시예 7: SG16.45의 인간화
hSG16.45 중쇄 변이체에서의 인간화 돌연변이
vH 변이체 HV 엑손 수용자 서열 공여자 프레임워크 잔기 수용자 CDR 잔기
hvH1 HV3-23/HJ3 H30, H37, H48, H93, H94, H107 없음
hvH2 HV3-23/HJ3 H30, H37, H48, H93, H94, H107 H50, H60
hvH3 HV3-23/HJ3 H30, H37, H48, H76, H93, H94, H107 H50, H60
hvH4 HV3-23/HJ3 H30, H48, H76, H93, H94 H50
hvH5 HV3-74/HJ3 H30, H93, H94 H50
hvH6 HV3-9/HJ3 H30, H93, H94 H50, H60
hSG16.45 카파 경쇄 변이체에서의 인간화 돌연변이
vK 변이체 KV 엑손 수용자 서열 공여자 프레임워크 잔기 수용자 CDR 잔기
hvK1 KV3-20/KJ2 L14, L19, L21. L38, L58, L71, L78 L24, L26
hvK2 KV3-20/KJ2 없음 L24, L26
hvK3 KV3-20/KJ2 L21, L38, L58, L71 L24, L26
hvK5 KV3-20/KJ2 L38, L71 없음
hSG16.45 중쇄 변이체에서의 특정 프레임워크 돌연변이
변이체 H30 H37 H48 H76 H93 H94 H107 인간%
hvH1 N* I* I* N T* S* V* 86.5
hvH2 N* I* I* N T* S* V* 88.5
hvH3 N* I* I* S* T* S* V* 87.5
hvH4 N* V I* S* T* S* T 87.5
hvH5 N* V V N T* S* T 88.5
hvH6 N* V V N T* S* T 88.5
*래트 잔기
hSG16.45 카파 경쇄 변이체에서의 특정 프레임워크 돌연변이
변이체 L14 L19 L21 L38 L58 L71 L78 인간%
hvK1 A* V* I* H* V* Y* M* 79.2
hvK2 L A L Q I F L 86.5
hvK3 L A I* H* V* Y* L 82.3
hvK5 L A L H* I Y* L 82.3
*래트 잔기
SG16.45를 발현시키는 래트 하이브리도마의 래트 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 서열분석하였다. HV3-23/HJ3(서열번호 24)을 중쇄에 대한 인간 수용자 서열로서 사용하였고, KV3-20/KJ2(서열번호 34)를 경쇄에 대한 인간 수용자 서열로서 사용하였다.
래트 공여자와 인간 수용자 서열 사이에 상이한 가변 영역 프레임워크 위치는 H30, H37, H48, H67, H93, H94 및 H107 그리고 위치 L14, L19, L21, L38, L58, L71 및 L78을 포함하였다. 이들 잔기의 상이한 순열은 상이한 인간화된 중쇄 및 경쇄 서열에서 복귀 돌연변이로서 포함하였다. 또한 인간 수용자 서열의 대응하는 잔기로의 치환을 위해 카바트 CDR에서 몇몇 래트 잔기를 시험하였다. 이들 잔기의 위치는 H50, H60, L24 및 L26이었다. 6개의 인간화된 중쇄 변이체 및 4개의 인간화된 경쇄 변이체를 설계하고, 발현시켰다. 표 8 및 표 9는 각각의 인간화된 변이체 쇄에서의 인간 수용자 서열, 복귀 돌연변이(공여자 프레임워크 잔기), 및 CDR 치환(수용자 CDR 잔기)을 나타낸다. 표 10 및 표 11은 각각의 인간화된 변이체 쇄에서 복귀 돌연변이를 위해 고려된 각각의 위치를 점유하는 아미노산을 나타낸다. 이들 표는 또한 가장 가까운 인간 생식계열 서열과 동일한 잔기의 백분율을 나타낸다. 최근의 INN 가이드라인에 따르면, 중쇄와 경쇄 둘 다에서 인간 생식계열 서열에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 항체만을 인간화된 것으로 지칭할 수 있다. 도 14 내지 도 17은 인간화된 중쇄 가변 영역의 정렬을 나타낸다. 도 18 및 도 19는 경쇄 가변 영역의 정렬을 나타낸다. 가변 경쇄의 C-말단 알기닌(R)은 대안적으로 경쇄 불변 영역의 N-말단 알기닌으로서 간주할 수 있다.
세포 당 BCMA의 약 50,000개 분자를 발현시키는 NCI-H929 세포 상에서 발현된 BCMA에 대한 결합에 대한 모든 24가지의 가능한 순열에서 6개의 인간화된 중쇄 및 4개의 인간화된 경쇄를 시험하였다. 결과를 이하의 표 12에 나타낸다.
NCI-H929 세포 상에서 발현된 BCMA에 대한 인간화된 항체 hSG16.45 결합
hSG16.45 vH vK NCI-H929 3-pt 분석
1 vH1 vK1 +++
2 vH1 vK2 +++
3 vH1 vK3 +++
4 vH1 vK5 +++
5 vH2 vK1 -
6 vH2 vK2 -
7 vH2 vK3 -
8 vH2 vK5 -
9 vH3 vK1 -
10 vH3 vK2 -
11 vH3 vK3 -
12 vH3 vK5 ++
13 vH4 vK1 +
14 vH4 vK2 +
15 vH4 vK3 +
16 vH4 vK5 ++
17 vH5 vK1 ++
18 vH5 vK2 ++
19 vH5 vK3 ++
20 vH5 vK5 ++
21 vH6 vK1 +
22 vH6 vK2 +
23 vH6 vK3 +
24 vH6 vK5 ++
cSG16.45 +++
rSG16.45 +++
NCI-H929 분석에 대해 최상으로 수행하는 인간화된 항체를 농도 지점의 전체 범위에서 U266에 대한 결합에 대해서 뿐만 아니라 발현 및 단량체 함량에 대해서 뿐만 아니라 인간 생식계열에 대한 서열 동일성에 대해서 추가로 시험하였다(표 13).
hSG16.45 VH VK hBCMA IgG㎎ aSEC% VH% VK% INN
1 VH1 VK1 +++ 0.67 94.5 86.5 79.2 혼합
3 VH1 VK3 +++ 0.54 94.6 86.5 82.3 혼합
4 VH1 VK5 +++ 0.16 76.0 86.5 82.3 혼합
17 VH5 VK1 ++ 0.64 94.4 88.5 79.2 혼합
18 VH5 VK2 ++ 0.65 93.7 88.5 86.5 Hu
19 VH5 VK3 ++ 0.64 94.1 88.5 82.3 혼합
VH5 VK2, VH1 VK1 및 VH1 VK3은 인간에 대한 결합 친화도, 중쇄와 경쇄 가변 영역 둘 다에서 인간 생식계열 서열에 대한 서열 동일성에 기반하여 전반적으로 최고의 항체였으며, VH1 VK1 및 VH1 VK3의 양호한 발현 및 높은 백분율은 다소 더 높은 결합을 갖지만(실험 오차 내에서 래트 또는 키메라와 동일) 인간 생식계열에 대해 더 낮은 서열 동일성을 가졌다.
실시예 8: - hSG16.17 hSG16.45
hSG16.17 VH3 VK2 또는 hSG16.45 VH5 VK2 항체를 CHO 세포에서 발현시켰다.　 비- 푸코실화된 항체를 초래한 항체의 생성 동안 세포 배양 배지에 푸코실화 저해제인 2-플루오로푸코스를 포함시켰다.　　 예를 들어, 문헌[Okeley et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 110:5404-55409(2013)] 참조.　 세포 성장을 위한 기저 배지는 무 푸코스이며, 2-플루로푸코스를 배지에 첨가하여 단백질 푸코실화를 저해하였다.　 상기 참조.　 PLRP-S 크로마토그래피 및 전자분무 이온화 사중극자 TOF MS를 통해 LC-MS에 의해 항체 내로 푸코스의 혼입을 측정하였다.　 상기 참조.
실시예 9: SCID NSG hSG16.17-SEA
도 20A 내지 도 20C는 SCID 마우스에서 MM1S 파종성 종양 모델에서의 다회 용량 hSG16.17-SEA의 생체내 활성을 나타내었다. 동물에 MM1S 세포를 IV로 이식하였고, 이식 후 9일에 항체 투약을 개시하였다. 동물 생존은 시간에 따랐다. N=8마리 동물/그룹. BCMA 복제수 = 7,000, CD38 복제수 = 14,000. A) 5주 동안 ip로 매주 1㎎/㎏ B) 5주 동안 ip로 매주 3㎎/㎏ 및 C) 5주 동안 ip로 매주 10㎎/㎏. SCID 동물은 ADCC 및 ADCP를 매개하는 효과기 세포를 포함한다. 이 도면에서의 데이터는 hSG16.17 SEA가 다라투무맙(CD38 표적화된 Ab)과 비슷하게 생존을 개선시킨다는 것을 나타낸다. 비결합 h00 대조군은 활성을 나타내지 않았다.
도 21A 내지 21C는 NSG 마우스에서 EJM 파종성 종양 모델에서의 단일 용량 hSG16.17-SEA의 생체내 활성을 나타내었다. NSG 동물은 NK 세포 및 최소로 활성인 대식세포를 포함하지 않았다. 동물에 EJM 세포를 IV로 이식하였고, 단일 용량의 항체에 이식 후 5일에 ip로 제공하였다. 동물 생존은 시간에 따랐다. N=8마리 동물/그룹. BCMA 복제수 = 45,000. CD38 복제수 = 47,000. CS1 복제수 = 14,000. A) 1㎎/㎏ 용량 B) 3㎎/㎏ 용량 C) 10㎎/㎏ 용량. 이 도면에서의 데이터는 hSG16.17 SEA가 다라투무맙(CD38 표적화된 Ab) 및 엘로투주맙(CS1 표적화된 Ab)과 동일 또는 더 큰 정도로 생존을 증가시킨다는 것을 나타낸다. WT SG16.17은 또한 증가된 생존을 유도할 수 있다. 비결합 h00 대조군은 가장 고용량에서 활성을 나타내지 않았다. 이들 동물에서 최소 효과기 세포가 있기 때문에, WT 및 SEA hSG16.17 항체의 활성은 APRIL 및 BAFF 증식 신호의 차단에 기인할 가능성이 있다.
도 22는 NSG 마우스에서 NCI-H929-루시퍼라제 파종성 종양 모델에서의 다회 용량 hSG16.17-SEA의 생체내 활성을 나타내었다. NSG 동물에 NCI-H929 루시퍼라제 세포를 이식하였다. 골수에서 생물발광(bioluminescence)을 관찰하였을 때 이식 후 21일에 항체 투약을 개시하였다. 총 5회 용량에 대해 매주 ip로 투약. N=5마리 동물/그룹. BCMA 복제수= 25,000. CD38 복제수 = 45,000. CS1 복제수 = 3,000. 비처리 및 미경험 동물에 비해 시간에 따라 평균 발광을 플롯팅한다. hSG16.17 SEA는 다라투무맙(CD38 표적화된 Ab) 및 엘로투주맙(CS1 표적화된 Ab)에 비해 훨씬 더 양호한 활성을 나타내었다. hSG16.17-SEA 10㎎/㎏ 그룹에서 관찰된 증가된 발광을 신호 동물에 의해 유도한다.
도 23A 내지 도 23B는 NSG 마우스에서 NCI-H929-루시퍼라제 파종성 종양 모델에서의 단일 용량 hSG16.17-SEA의 생체내 활성을 나타내었다. NSG 동물에 NCI-H929 루시퍼라제 세포를 이식하였다. 골수에서 생물발광을 관찰하였을 때 주사 후 21일에 항체 투약을 개시하였다. 1회 IP로 투약. N=5마리 동물/그룹. A) 3㎎/㎏ WT 대 SEA 항체. B) hSG16.17 SEA의 용량 범위. 이 도면에서의 데이터는 hSG16.17 SEA가 0.3㎎/㎏ 단일 용량에서 활성일 수 있고, hSG16.17SEA가 그의 WT(푸코실화된) 상대보다 더 활성일 수 있다는 것을 나타낸다.
도 23A 내지 도 23B는 NSG 마우스에서 NCI-H929-루시퍼라제 파종성 종양 모델에서의 단일 용량 hSG16.17-SEA의 생체내 활성을 나타내었다. NSG 동물에 NCI-H929 루시퍼라제 세포를 이식하였다. 골수에서 생물발광을 관찰하였을 때 주사 후 21일에 항체 투약을 개시하였다. 1회 IP로 투약. N=5마리 동물/그룹. A) 3㎎/㎏ WT 대 SEA 항체. B) hSG16.17 SEA의 용량 범위. 이 도면에서의 데이터는 hSG16.17 SEA가 0.3㎎/㎏ 단일 용량에서 활성일 수 있고, hSG16.17SEA가 그의 WT(푸코실화된) 상대보다 더 활성일 수 있다는 것을 나타낸다. 발광에 대한 효과는 연장된 동물 생존으로 해석된다(데이터 미제시).
도 24는 SCID 마우스에서 MOLP-8-루시퍼라제 파종성 종양 모델에서의 단일 용량 hSG16.17-SEA의 생체내 활성을 제공한다. SCID 동물에 MOLP-8 루시퍼라제 세포를 IV로 이식하였다. 골수에서 생물발광을 관찰하였을 때 주사 후 13일에 항체 투약을 개시하였다. 1회 IP로 투약. N=5마리 동물/그룹. BCMA 복제수 =2,000. 발광을 시간에 따라 플롯팅한다. 이들 데이터는 2000 BCMA 복제물만에 의할 때조차 hSG16.17-SEA가 상당한 항종양 활성을 나타낸다는 것을 보여준다. FcγRII 또는 FcγRIII에 결합하지 않는 탈글리코실화된 SEA BCMA 항체는 h00 SEA 비-결합 대조군과 유사한 활성을 나타내지 않았다. 이는 이 모델에서 Fc 매개 활성의 중요성을 나타낸다.
도 25, SG16.17 SEA 항체가 시험관내 WT 항체에 비해 MM1R 표적 세포 상에서 개선된 ADCC 활성을 나타낸다. EasySep 인간 NK 세포 농축 키트를 이용하여 음성 선택을 통해 PBMC로부터 NK 세포를 단리시키고, 얻어진 CD16+ 세포를 정량화하였다. 다발성 골수종 MM1R ADCC 표적 세포를 1시간 동안 크로뮴-51을 이용하여 표지하였다. 연속 희석 항체를 분석 플레이트에 첨가한 후에, 13:1 E:T 비로 표적 세포(T) 및 NK 효과기 세포(E)를 첨가하였다. 4시간 후에 37℃에서 전체 그리고 자발적 방출 제어에 기반하여 용해를 계산하였다. 이들 데이터는 WT 항체뿐만 아니라 임상 항체, 다라투무맙 및 엘로투주맙 이상으로 푸코실화된 SEA SG16.17 항체의 ADCC 활성의 상당한 개선을 나타낸다.
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SEQUENCE LISTING <110> SEATTLE GENETICS, INC. <120> BCMA ANTIBODIES AND USE OF SAME TO TREAT CANCER AND IMMUNOLOGICAL DISORDERS <130> WO/2017/143069 <140> PCT/US2017/018177 <141> 2017-02-16 <150> US 62/396,084 <151> 2016-09-16 <150> US 62/296,594 <151> 2016-02-17 <160> 193 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 994 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aagactcaaa cttagaaact tgaattagat gtggtattca aatccttagc tgccgcgaag 60 acacagacag cccccgtaag aacccacgaa gcaggcgaag ttcattgttc tcaacattct 120 agctgctctt gctgcatttg ctctggaatt cttgtagaga tattacttgt ccttccaggc 180 tgttctttct gtagctccct tgttttcttt ttgtgatcat gttgcagatg gctgggcagt 240 gctcccaaaa tgaatatttt gacagtttgt tgcatgcttg cataccttgt caacttcgat 300 gttcttctaa tactcctcct ctaacatgtc agcgttattg taatgcaagt gtgaccaatt 360 cagtgaaagg aacgaatgcg attctctgga cctgtttggg actgagctta ataatttctt 420 tggcagtttt cgtgctaatg tttttgctaa ggaagataaa ctctgaacca ttaaaggacg 480 agtttaaaaa cacaggatca ggtctcctgg gcatggctaa cattgacctg gaaaagagca 540 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Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 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Leu Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 155 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vH5 IMGT CDR1 <400> 155 Gly Phe Thr Phe Asn Asp His Trp 1 5 <210> 156 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vH5 IMGT CDR2 <400> 156 Ile Thr Asn Thr Gly Gly Ala Thr 1 5 <210> 157 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vH5 IMGT CDR3 <400> 157 Thr Ser Pro Gly Leu Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 158 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vH6 Kabat CDR1 <400> 158 Asp His Trp Met Thr 1 5 <210> 159 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vH6 Kabat CDR2 <400> 159 Gly Ile Thr Asn Thr Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 160 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vH6 Kabat CDR3 <400> 160 Pro Gly Leu Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 161 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vH6 IMGT CDR1 <400> 161 Gly Phe Thr Phe Asn Asp His Trp 1 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<213> homo sapiens <400> 171 His Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro Thr 1 5 <210> 172 <211> 7 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 172 Ser Ser Val Ser Val Met Tyr 1 5 <210> 173 <211> 9 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 173 His Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro Thr 1 5 <210> 174 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vK1 Kabat CDR1 <400> 174 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Val Met Tyr 1 5 10 <210> 175 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vK1 Kabat CDR2 <400> 175 Ser Thr Ser Ser Leu Ala Ser 1 5 <210> 176 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vK1 Kabat CDR3 <400> 176 His Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro 1 5 <210> 177 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vK1 IMGT CDR1 <400> 177 Ser Ser Val Ser Val Met Tyr 1 5 <210> 178 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vK1 IMGT CDR3 <400> 178 His Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro 1 5 <210> 179 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vK2 Kabat CDR1 <400> 179 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Val Met Tyr 1 5 10 <210> 180 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vK2 Kabat CDR2 <400> 180 Ser Thr Ser Ser Leu Ala Ser 1 5 <210> 181 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vK2 Kabat CDR3 <400> 181 His Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro Thr 1 5 <210> 182 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vK2 IMGT CDR1 <400> 182 Ser Ser Val Ser Val Met Tyr 1 5 <210> 183 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vK2 IMGT CDR3 <400> 183 His Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro Thr 1 5 <210> 184 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vK3 Kabat CDR1 <400> 184 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Val Met Tyr 1 5 10 <210> 185 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vK3 Kabat CDR2 <400> 185 Ser Thr Ser Ser Leu Ala Ser 1 5 <210> 186 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vK3 Kabat CDR3 <400> 186 His Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro Thr 1 5 <210> 187 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vK3 IMGT CDR1 <400> 187 Ser Ser Val Ser Val Met Tyr 1 5 <210> 188 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vK3 IMGT CDR3 <400> 188 His Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro Thr 1 5 <210> 189 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vK5 Kabat CDR1 <400> 189 Leu Ala Thr Ser Ser Val Ser Val Met Tyr 1 5 10 <210> 190 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vK5 Kabat CDR2 <400> 190 Ser Thr Ser Ser Leu Ala Ser 1 5 <210> 191 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vK5 Kabat CDR3 <400> 191 His Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro Thr 1 5 <210> 192 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vK5 IMGT CDR1 <400> 192 Ser Ser Val Ser Val Met Tyr 1 5 <210> 193 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hSG16.45 vK5 IMGT CDR3 <400> 193 His Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro Thr 1 5

Claims (71)

  1. 인간화된, 키메라 또는 베니어(veneered) 항체로서, ATCC PTC-6937로서 기탁된 항체의 인간화된, 키메라 또는 베니어 형태인, 항체.
  2. 제1항에 있어서, hSG16.17 VH3(서열번호 13)에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역 및 hSG16.17 VK2(서열번호 19)에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  3. 제2항에 있어서, hSG16.17 VH3(서열번호 13)에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역 및 hSG16.17 VK2(서열번호 19)에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 hSG16.17 VH3(서열번호 13)의 3개의 카바트(Kabat) CDR(서열번호 60 내지 62) 및 hSG16.17 VK2(서열번호 19)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 90 내지 92)을 포함하되, 단, 위치 H58은 N 또는 K에 의해 점유될 수 있고, 위치 H60은 A 또는 N에 의해 점유될 수 있으며, 위치 H61은 Q 또는 E에 의해 점유될 수 있고, 위치 H62는 K 또는 N에 의해 점유될 수 있으며, 위치 H64는 Q 또는 K에 의해 점유될 수 있고, 위치 H65는 G 또는 T에 의해 점유될 수 있으며, 위치 L24는 R 또는 L에 의해 점유될 수 있고, 위치 L53은 S 또는 R에 의해 점유될 수 있는, 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, hSG16.17 VH3(서열번호 13)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 60 내지 62) 및 hSG16.17 VK2(서열번호 19)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 90 내지 92)을 포함하는, 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 H20, H48, H69, H71, H73, H76, H80, H88, H91 및 H93은 L, I, M, A, K, N, V, A, F 및 T에 의해 각각 점유되고, 그리고 위치 L46, L48 및 L87은 V, V 및 F에 의해 각각 점유되는, 항체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 성숙 중쇄 가변 영역은 hSG16.17 VH3의 서열(서열번호 13)을 가지며, 상기 성숙 경쇄 가변 영역은 hSG16.17 VK2의 서열(서열번호 19)을 갖는, 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성숙 중쇄 가변 영역은 중쇄 불변 영역에 융합되고, 상기 성숙 경쇄 가변 영역은 경쇄 불변 영역에 융합되는, 항체.
  9. 제6항에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역은 천연 인간 불변 영역에 비해 Fcγ 수용체에 대해 감소된 결합을 갖는 상기 천연 인간 불변 영역의 돌연변이체 형태인, 항체.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 아이소타입을 갖는, 항체.
  11. 제8항에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고, 그리고 상기 경쇄 불변 영역은 서열번호 3을 포함하는 아미노산 서열을 갖는, 항체.
  12. 제8항에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역은 서열번호 7을 포함하는 아미노산 서열(S239C)을 갖고, 그리고 상기 경쇄 불변 영역은 서열번호 3을 포함하는 아미노산 서열을 갖는, 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 네이키드(naked) 항체인, 항체.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 세포독성제 또는 세포정지제에 접합되는, 항체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 항체는 세포독성제에 접합되는, 항체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 세포독성제는 효소 절단성 링커를 통해 상기 항체에 접합되는, 항체.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 세포독성제는 DNA 소홈(minor groove) 결합제인, 항체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 세포독성제는 하기 화학식을 갖는, 항체:
    Figure pct00009
  19. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 세포독성제는 MMAE 또는 MMAF인, 항체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  21. BCMA를 발현시키는 암을 갖거나 또는 가질 위험이 있는 환자의 치료 방법으로서, 상기 환자에게 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체의 유효 요법을 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 암은 혈액암인, 치료 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 혈액암은 골수종, 백혈병 또는 림프종인, 치료 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 혈액암은 다발성 골수종인, 치료 방법.
  25. 제22항에 있어서, 상기 혈액암은 비호지킨 림프종(NHL) 또는 호지킨 림프종인, 치료 방법.
  26. 제22항에 있어서, 상기 혈액암은 골수 형성이상 증후군(MDS), 골수증식 증후군(MPS), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 또는 버킷 림프종인, 치료 방법.
  27. BCMA를 발현시키는 면역 세포에 의해 매개되는 면역 장애를 갖거나 또는 가질 위험이 있는 환자의 치료 방법으로서, 상기 환자에게 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 인간화된 항체의 유효 요법을 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
  28. 제27항에 있어서, B 세포 매개 장애인, 치료 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 면역 장애는 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스(SLE), I형 당뇨병, 천식, 아토피 피부염, 알레르기성 비염, 혈소판 감소성 자반병, 다발성 경화증, 건선, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 그레이브씨병, 원발성 담즙성 간경화증, 베게너 육아종증, 결핵 및 이식편대 숙주 질환인, 치료 방법.
  30. 인간화된, 키메라 또는 베니어 항체로서, 서열번호 23의 성숙 중쇄 가변 영역 및 서열번호 33의 성숙 경쇄 가변 영역을 갖는 래트 SG16.45 항체의 인간화된, 키메라 또는 베니어 형태인, 항체.
  31. 제30항에 있어서, hSG16.45 VH5(서열번호 31)에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역 및 hSG16.45 VK2(서열번호 36)에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  32. 제31항에 있어서, hSG16.45 VH5(서열번호 31)에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역 및 hSG16.45 VK2(서열번호 36)에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, hSG16.45 VH5(서열번호 31)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 152 내지 154) 및 hSG16.45 VK2(서열번호 36)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 179 내지 181)을 포함하되, 단, 위치 H50은 A 또는 S에 의해 점유될 수 있으며, 위치 L24는 R 또는 L에 의해 점유될 수 있고, 위치 L26은 S 또는 T에 의해 점유될 수 있는, 항체.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, hSG16.45 VH5(서열번호 31)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 152 내지 154) 및 hSG16.45 VK2(서열번호 36)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 179 내지 181)을 포함하는, 항체.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 H30, H93 및 H94는 각각 N, T 및 S에 의해 점유되는, 항체.
  36. 제30항에 있어서, 상기 성숙 중쇄 가변 영역은 hSG16.45 VH5의 서열(서열번호 31)을 갖고 그리고 상기 성숙 경쇄 가변 영역은 hSG16.45 VK2의 서열(서열번호 36)을 갖거나, 또는 상기 성숙 중쇄 가변 영역은 hSG16.45 VH1의 서열(서열번호 27)을 갖고 그리고 상기 성숙 경쇄 가변 영역은 hSG16.45 VK1의 서열(서열번호 35)을 갖거나, 또는 상기 성숙 중쇄 가변 영역은 hSG16.45 VH1의 서열(서열번호 27)을 갖고 그리고 상기 성숙 경쇄 가변 영역은 hSG16.45 VK3의 서열(서열번호 37)을 갖는, 항체.
  37. 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성숙 중쇄 가변 영역은 중쇄 불변 영역에 융합되고, 상기 성숙 경쇄 가변 영역은 경쇄 불변 영역에 융합되는, 항체.
  38. 제37항에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역은 천연 인간 불변 영역에 비해 Fcγ 수용체에 대해 감소된 결합을 갖는 상기 천연 인간 불변 영역의 돌연변이체 형태인, 항체.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 아이소타입을 갖는, 항체.
  40. 제37항에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역은 서열번호 5를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 그리고 상기 경쇄 불변 영역은 서열번호 3을 포함하는 아미노산 서열을 갖는, 항체.
  41. 제37항에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역은 서열번호 7을 포함하는 아미노산 서열(S239C)을 갖고, 그리고 상기 경쇄 불변 영역은 서열번호 3을 포함하는 아미노산 서열을 갖는, 항체.
  42. 제30항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 네이키드 항체인, 항체.
  43. 제30항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 세포독성제 또는 세포정지제에 접합되는, 항체.
  44. 제43항에 있어서, 상기 항체는 세포독성제에 접합되는, 항체.
  45. 제44항에 있어서, 상기 세포독성제는 효소 절단성 링커를 통해 상기 항체에 접합되는, 항체.
  46. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 세포독성제는 DNA 소홈 결합제인, 항체.
  47. 제46항에 있어서, 상기 세포독성제는 하기 화학식을 갖는, 항체:
    Figure pct00010
  48. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 세포독성제는 MMAE 또는 MMAF인, 항체.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 불변 영역의 EU 위치 297에서의 asn 잔기에서 5% 미만의 N-글리코사이드 연결 당 쇄는 푸코스 또는 이의 유사체를 포함하되, 상기 항체를 발현시키는 세포는 상기 항체의 푸코실화를 감소시키도록 배양된, 항체.
  50. 제30항 내지 제48항 중 어느 한 항의 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  51. BCMA를 발현시키는 암을 갖거나 또는 가질 위험이 있는 환자의 치료 방법으로서, 상기 환자에게 제30항 내지 제49항 중 어느 한 항의 인간화된 항체의 유효 요법을 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 암은 혈액암인, 치료 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 혈액암은 골수종, 백혈병 또는 림프종인, 치료 방법.
  54. 제52항에 있어서, 상기 혈액암은 다발성 골수종인, 치료 방법.
  55. 제52항에 있어서, 상기 혈액암은 비호지킨 림프종(NHL) 또는 호지킨 림프종인, 치료 방법.
  56. 제52항에 있어서, 상기 혈액암은 골수 형성이상 증후군(MDS), 골수증식 증후군(MPS), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 또는 버킷 림프종인, 치료 방법.
  57. BCMA를 발현시키는 면역 세포에 의해 매개되는 면역 장애를 갖거나 또는 가질 위험에 있는 환자의 치료 방법으로서, 상기 환자에게 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 항체의 유효 요법을 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
  58. 제56항에 있어서, B 세포 매개 장애인, 치료 방법.
  59. 제56항에 있어서, 상기 면역 장애는 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스(SLE), I형 당뇨병, 천식, 아토피 피부염, 알레르기성 비염, 혈소판 감소성 자반병, 다발성 경화증, 건선, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 그레이브씨병, 원발성 담즙성 간경화증, 베게너 육아종증, 결핵 및 이식편대 숙주 질환인, 치료 방법.
  60. 인간 BCMA 단백질에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체로서, hSG16.17 VH3(서열번호 13)에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역 및 hSG16.17 VK2(서열번호 19)에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화된 항체.
  61. 제60항에 있어서, hSG16.17 VH3(서열번호 13)에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역 및 hSG16.17 VK2(서열번호 19)에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  62. 제60항에 있어서, hSG16.17 VH3(서열번호 13)의 3개의 카바트(Kabat) CDR(서열번호 60 내지 62) 및 hSG16.17 VK2(서열번호 19)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 90 내지 92)을 포함하되,
    단, 위치 H58은 N 또는 K에 의해 점유될 수 있고, 위치 H60은 A 또는 N에 의해 점유될 수 있으며, 위치 H61은 Q 또는 E에 의해 점유될 수 있고, 위치 H62는 K 또는 N에 의해 점유될 수 있으며, 위치 H64는 Q 또는 K에 의해 점유될 수 있고, 위치 H65는 G 또는 T에 의해 점유될 수 있으며, 위치 L24는 R 또는 L에 의해 점유될 수 있고, 위치 L53은 S 또는 R에 의해 점유될 수 있는, 항체.
  63. 제60항에 있어서, hSG16.17 VH3(서열번호 13)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 60 내지 62) 및 hSG16.17 VK2(서열번호 19)의 3개의 카바트 CDR(서열번호 90 내지 92)을 포함하는, 항체.
  64. 제60항에 있어서, 위치 H20, H48, H69, H71, H73, H76, H80, H88, H91 및 H93은 L, I, M, A, K, N, V, A, F 및 T에 의해 각각 점유되고, 그리고 위치 L46, L48 및 L87은 V, V 및 F에 의해 각각 점유되는, 항체.
  65. 제60항에 있어서, 상기 성숙 중쇄 가변 영역은 hSG16.17 VH3의 서열(서열번호 13)을 갖고, 그리고 상기 성숙 경쇄 가변 영역은 hSG16.17 VK2의 서열(서열번호 19)을 갖는, 항체.
  66. 제60항에 있어서, 상기 성숙 중쇄 가변 영역은 중쇄 불변 영역에 융합되고, 그리고 상기 성숙 경쇄 가변 영역은 경쇄 불변 영역에 융합되는, 항체.
  67. 제65항에 있어서, 상기 성숙 중쇄 가변 영역은 중쇄 불변 영역에 융합되고, 그리고 상기 성숙 경쇄 가변 영역은 경쇄 불변 영역에 융합되는, 항체.
  68. 제67항의 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  69. 제68항에 있어서, 상기 항체의 약 10% 미만은 푸코스 또는 푸코스 유사체에 의한 코어 푸코실화(core fucosylation)를 갖는, 약제학적 조성물.
  70. 제68항에 있어서, 상기 항체의 약 5% 미만은 푸코스 또는 푸코스 유사체에 의한 코어 푸코실화를 갖는, 약제학적 조성물.
  71. 제69항에 있어서, 상기 항체의 약 2%는 푸코스 또는 푸코스 유사체에 의한 코어 푸코실화를 갖는, 약제학적 조성물.
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