TW202019473A

TW202019473A - 抗steap1抗原結合蛋白

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Publication number: TW202019473A
Application number: TW108123303A
Authority: TW
Inventors: 史提沃斯奧利維爾諾蘭; 康李; 克里斯多福Ｍ姆勞斯基; 班傑明Ｍ阿巴; 尼拉吉加格底許阿格沃; 凱文葛漢; 珍妮特黎安史提夫斯; 格里高利摩爾
Original assignee: 美商安進公司; 美商山可爾股份有限公司
Priority date: 2018-07-02
Filing date: 2019-07-02
Publication date: 2020-06-01
Also published as: EP3817770A2; US11530274B2; TWI851585B; MA53094A; SA521420953B1; CN112584859A; JOP20200343A1; CL2020003391A1; CO2021000497A2; UY38289A; IL279355A; PH12020552270A1; JP2021528973A; US20210179731A1; JP7633810B2; CR20210047A; CA3104386A1; BR112020026724A2; CL2023001064A1; MX2021000163A

Abstract

本揭露提供了結合STEAP1的新穎抗原結合蛋白以及使用方法。

Description

抗STEAP1抗原結合蛋白

本揭露提供了結合前列腺六跨膜上皮抗原1（STEAP1）之新穎抗原結合蛋白及其用途。相關申請的交叉引用

本申請要求於2018年7月2日提交的美國臨時專利申請案號62/693,216和於2019年2月1日提交的美國臨時專利申請案號62/800,259，所述申請的揭露內容藉由引用以其整體併入本文。序列表

作為本揭露之單獨部分，本申請包含呈電腦可讀形式之序列表（檔案名：52601_Seqlisting.txt；大小：298,914位元組；創建日：2019年6月27日），該序列表藉由引用以其全文併入本文。

前列腺癌仍然是美國男性中最常見的癌症之一。美國癌症統計工作組（U.S. Cancer Statistics Working Group）. 美國癌症統計: 基於網路報告的1999-2014發病率和死亡率（1999-2014 Incidence and Mortality Web-based Report）；亞特蘭大（GA）: 衛生與人類服務部，疾病控制與預防中心（Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention）和國家癌症研究所（National Cancer Institute）；2017。雖然與其他癌症類型相比前列腺癌的存活率相對較高，但目前的治療選擇伴隨著風險和不希望的副作用。例如，手術伴隨著神經損傷和陽痿的風險，並且放射療法可能增加發展膀胱癌或胃腸道癌之風險。傳統化療與許多副作用相關聯，該等副作用限制了患者在治療期間的生活品質。

基於抗體的療法已經成功地治療多種疾病，包括癌症和自身免疫/炎性障礙。至少部分地由於前列腺癌特異性抗原的存在，據信前列腺癌特別適合於基於抗體的療法。儘管最近在闡明癌發生和潛在生物標誌物的潛在生物學機制方面取得了進展，但仍存在對用於癌症（包括前列腺癌）的基於抗體的可替代治療選擇之需要。

本揭露提供了結合SEQ ID NO: 2的STEAP1的抗原結合蛋白，並且該抗原結合蛋白包含：(a) 重鏈CDR，其包含與 i) vhCDR1 SEQ ID NO: 14、vhCDR2 SEQ ID NO:15或vhCDR2 SEQ ID NO: 21、和vhCDR3 SEQ ID NO: 16；或 ii) vhCDR1 SEQ ID NO: 33、vhCDR2 SEQ ID NO: 34、和vhCDR3 SEQ ID NO: 35差異不超過3、2、或1個胺基酸的胺基酸序列；或 (b) 輕鏈CDR，其包含與 i) vlCDR1 SEQ ID NO: 11、vlCDR2 SEQ ID NO: 12、和vlCDR3 SEQ ID NO: 13；或 ii) vlCDR1 SEQ ID NO: 30、vlCDR2 SEQ ID NO: 31、和vlCDR3 SEQ ID NO: 32差異不超過3、2、或1個胺基酸的胺基酸序列；或 (c) 輕鏈可變結構域，其包含與SEQ ID NO: 183或SEQ ID NO: 186具有至少90%同一性的胺基酸序列；或 (d) 重鏈可變結構域，其包含與SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 184、或SEQ ID NO: 185具有至少90%同一性的胺基酸序列。在多個方面，該抗原結合蛋白包含：含有SEQ ID NO: 14的vhCDR1、含有SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 21的vhCDR2、含有SEQ ID NO: 16的vhCDR3、含有SEQ ID NO: 11的vlCDR1、含有SEQ ID NO: 12的vlCDR2、和含有SEQ ID NO: 13的vlCDR3。可替代地，該抗原結合蛋白包含：含有SEQ ID NO: 33的vhCDR1、含有SEQ ID NO: 34的vhCDR2、含有SEQ ID NO: 35的vhCDR3、含有SEQ ID NO: 30的vlCDR1、含有SEQ ID NO: 31的vlCDR2、和含有SEQ ID NO: 32的vlCDR3。在多個方面，該抗原結合蛋白包含：含有SEQ ID NO: 182或SEQ ID NO: 184的可變重鏈結構域和含有SEQ ID NO: 183的可變輕鏈結構域；例如，該抗原結合蛋白包含：含有SEQ ID NO: 182的可變重鏈結構域和含有SEQ ID NO: 183的可變輕鏈結構域，或含有SEQ ID NO: 184的可變重鏈結構域和含有SEQ ID NO: 183的可變輕鏈結構域。可替代地，該抗原結合蛋白包含：含有SEQ ID NO: 185的可變重鏈結構域和含有SEQ ID NO: 186的可變輕鏈結構域。本揭露進一步提供了抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白包含：含有SEQ ID NO: 201的重鏈和含有SEQ ID NO: 200的輕鏈；或含有SEQ ID NO: 203的重鏈和含有SEQ ID NO: 200的輕鏈。

本揭露進一步提供了包含第一單體的異源二聚體抗體，該第一單體包含第一重鏈，該第一重鏈包含：1) 第一可變重鏈結構域；2) 第一恒定重鏈，其包含第一CH1結構域和第一Fc結構域；和3) scFv，其結合人CD3並且包含scFv可變輕鏈結構域、scFv連接子（linker）和scFv可變重鏈結構域；其中使用一個或多個結構域連接子將所述scFv共價附接至所述CH1結構域的C末端和所述第一Fc結構域的N末端之間；該異源二聚體抗體進一步包含第二單體，該第二單體包含：第二重鏈，該第二重鏈包含第二可變重鏈結構域和含有第二Fc結構域的第二恒定重鏈；和共同輕鏈，該共同輕鏈包含可變輕鏈結構域和恒定輕鏈結構域。該第一可變重鏈結構域和該可變輕鏈結構域結合人STEAP1，該第二可變重鏈結構域和該可變輕鏈結構域結合人STEAP1，並且其中 (i) 該第一可變重鏈結構域和該第二可變重鏈結構域包含重鏈CDR，該等重鏈CDR包含與vhCDR1 SEQ ID NO: 14、vhCDR2 SEQ ID NO: 15或vhCDR2 SEQ ID NO: 21、和vhCDR3 SEQ ID NO: 16差異不超過3、2、或1個胺基酸的胺基酸序列，並且該可變輕鏈結構域包含輕鏈CDR，該等輕鏈CDR包含與vlCDR1 SEQ ID NO: 11、vlCDR2 SEQ ID NO: 12、和vlCDR3 SEQ ID NO: 13差異不超過3、2、或1個胺基酸的胺基酸序列；或 (ii) 該第一可變重鏈結構域和該第二可變重鏈結構域包含重鏈CDR，該等重鏈CDR包含與vhCDR1 SEQ ID NO: 33、vhCDR2 SEQ ID NO: 34、和vhCDR3 SEQ ID NO: 35差異不超過3、2、或1個胺基酸的胺基酸序列，並且該可變輕鏈結構域包含輕鏈CDR，該等輕鏈CDR包含與vlCDR1 SEQ ID NO: 30、vlCDR2 SEQ ID NO: 31、和vlCDR3 SEQ ID NO: 32差異不超過3、2、或1個胺基酸的胺基酸序列；或 (iii) 該第一可變重鏈結構域和該第二可變重鏈結構域包含與SEQ ID NO: 182或SEQ ID NO: 184具有至少90%同一性的胺基酸序列，並且該可變輕鏈結構域包含與SEQ ID NO: 183具有至少90%同一性的胺基酸序列；或 (iv) 該第一可變重鏈結構域和該第二可變重鏈結構域包含與SEQ ID NO: 185具有至少90%同一性的胺基酸序列，並且該可變輕鏈結構域包含與SEQ ID NO:186具有至少90%同一性的胺基酸序列。在多個方面，該第一可變重鏈結構域和該第二可變重鏈結構域包含CDR序列：含有SEQ ID NO: 14的vhCDR1、含有SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 21的vhCDR2、和含有SEQ ID NO: 16的vhCDR3；並且該可變輕鏈結構域包含CDR序列：含有SEQ ID NO: 11的vlCDR1、含有SEQ ID NO: 12的vlCDR2、和含有SEQ ID NO: 13的vlCDR3。在多個方面，該第一可變重鏈結構域和該第二可變重鏈結構域包含CDR序列：含有SEQ ID NO: 33的vhCDR1、含有SEQ ID NO: 34的vhCDR2、和含有SEQ ID NO: 35的vhCDR3；並且該可變輕鏈結構域包含CDR序列：含有SEQ ID NO: 30的vlCDR1、含有SEQ ID NO: 31的vlCDR2、和含有SEQ ID NO: 32的vlCDR3。在多個方面，該第一可變重鏈結構域和該第二可變重鏈結構域包含SEQ ID NO: 182或SEQ ID NO: 184，並且該可變輕鏈結構域包含SEQ ID NO: 183（例如，SEQ ID NO: 182和183或SEQ ID NO: 184和183）、或該第一可變重鏈結構域和該第二可變重鏈結構域包含SEQ ID NO: 185，並且該可變輕鏈結構域包含SEQ ID NO: 186。該scFv包含CDR，該等CDR包含：含有SEQ ID NO: 170的vhCDR1、含有SEQ ID NO: 171的vhCDR2、含有SEQ ID NO: 172的vhCDR3、含有SEQ ID NO:174的vlCDR1、含有SEQ ID NO: 175的vlCDR2、和含有SEQ ID NO: 176的vlCDR3；或SEQ ID NO:169和SEQ ID NO:173的可變重鏈區和可變輕鏈區。

還提供了治療癌症（例如前列腺癌）之方法，該方法包括向對其有需要的受試者投與本文所述的抗原結合蛋白。

本文中節標題的使用僅僅是為了便於閱讀，而不是意圖限制本身。整個文件旨在被視為統一的揭露，並且應理解，可以考慮本文描述的特徵的所有組合。

除非本文另作定義，否則結合本申請使用的科技術語應當具有熟悉該項技術者通常所瞭解的含義。另外，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數形式，並且複數術語應包括單數形式。除非另有說明，否則術語「包含」、「具有」，「包括」和「含有」應被解釋為開放式術語。如果將本發明的各方面描述為「包括」特徵，則實施方式也被認為係「由該特徵組成」或「基本上由該特徵組成」。本文提供的任何和所有實例或示例性語言（例如「例如」）的應用僅旨在更好地說明本揭露，而不對另外要求保護的本揭露的範圍做出限制。說明書中的語言不應當被解釋為指示任何未要求保護的要素為實踐本揭露所必需的。除操作實例中或在另外指示的情況下以外，本文所使用的表示成分或反應條件的量的所有數字應當理解為在所有情況下被術語「約」修飾，該術語將由相關領域的技術人員解釋。

在本文引證數值的範圍僅旨在用作單獨地提及每個單獨的數值落在該範圍內和每個端點的速記之方法，除非本文另外說明，並且每個單獨的數值和端點被結合到本說明書中就像它被單獨地在本文引證一樣。

總體而言，本文所述的細胞和組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學、蛋白質和核酸化學、製造、配製物、藥理學、和藥品的術語和技術係本領域中熟知並且常用的那些。除非另作指示，否則本申請的方法和技術一般係根據本領域熟知的常規方法且如本說明書全篇所引用和論述的各種通用和更具體的參考文獻中所描述來進行。參見，例如，Sambrook等人., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)[分子選殖: 實驗室手冊, 第3版, 冷泉港實驗室出版社, 冷泉港, 紐約洲 (2001)]；Ausubel等人., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)[分子生物學現代方法, 格林出版聯合公司 (1992)]；以及Harlow和Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)[抗體: 實驗室手冊, 冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約州 (1990)]，該等文獻藉由引用併入本文。酶促反應和純化技術係根據製造商的說明，如本領域通常所實現或如本文中所描述進行的。與本文所描述的分析化學、合成有機化學以及醫藥和藥物化學結合使用的術語及其實驗方法與技術係本領域熟知且常用的那些。標準技術可以用於化學合成、化學分析、藥物製備、配製和遞送以及患者的治療。使用本領域常規使用的方法計算百分比同一性，包括在例如美國專利公開號2017/0342155中描述的方法，將該專利藉由引用以其全文併入本文並特別是關於段落[0075]-[0083]。

STEAP1係包含六個跨膜結構域的339個胺基酸的蛋白質，產生三個胞外環和兩個胞內環。人STEAP1的胺基酸序列在本文中示為SEQ ID NO: 2。胞外環的估計位置係胺基酸92-118（胞外環1）、胺基酸185-217（胞外環2）和胺基酸279-290（胞外環3）。與正常組織相比，STEAP1在前列腺癌中差異表現，並且與原發性前列腺癌樣本相比，觀察到骨和淋巴結前列腺癌轉移灶中的表現增加。STEAP1代表用於診斷和基於抗體的治療的理想靶標，例如雙特異性抗STEAP1/抗CD3T細胞募集抗體，以例如觸發T細胞依賴性細胞毒性或前列腺癌細胞的重定向裂解。如本文進一步所述，本揭露提供了結合STEAP1的抗原結合蛋白。抗原結合蛋白

「抗原結合蛋白」係包含結合特定靶標抗原（例如STEAP1）的部分的蛋白質。抗原結合蛋白包含支架或框架部分，其允許抗原結合部分採用促進抗原結合蛋白與抗原結合的構象。在示例性方面，抗原結合蛋白係抗體或免疫球蛋白（例如，異源二聚體和/或雙特異性抗體）、或抗原結合抗體片段、或抗體蛋白產物。

術語「抗體」係指完整的抗原結合免疫球蛋白。「抗體」係一種抗原結合蛋白。抗體可以是IgA、IgD、IgE、IgG、或IgM抗體，包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任何一種。在多個實施方式中，完整抗體包含兩條全長重鏈和兩條全長輕鏈。抗體具有可變區和恒定區。在IgG型式中，可變區通常為約100-110或更多個胺基酸，包含三個互補決定區（CDR），主要負責抗原識別，並且與結合不同抗原的其他抗體差異很大。可變區典型地包含至少三個重鏈或輕鏈CDR（Kabat等人, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest [免疫相關蛋白質序列], Public Health Service [公共衛生署] N.I.H., 貝塞斯達, 馬里蘭州；還參見Chothia和Lesk, 1987, J. Mol. Biol.[分子生物學雜誌] 196:901-917；Chothia等人, 1989, Nature [自然] 342: 877-883），位於框架區內（由Kabat等人, 1991指定框架區1-4、FR1、FR2、FR3、和FR4；還參見Chothia和Lesk, 1987, 同上）。恒定區允許抗體募集免疫系統的細胞和分子。

在多個方面，抗體係單株抗體。在某些方面，抗體係人抗體。在某些方面，抗體（或其他抗原結合蛋白）係嵌合的或人源化的。術語「嵌合」係指含有來自兩種或更多種不同抗體的結構域的抗體。嵌合抗體可以例如含有來自一個物種的恒定結構域，和來自第二物種的可變結構域，或更一般地，可以含有來自至少兩個物種的胺基酸序列的區段。「嵌合」和「人源化」兩者通常是指組合來自多於一個物種的區域的抗原結合蛋白。嵌合抗體還可以含有同一物種內的兩種或更多種不同抗體的結構域。在一個實施方式中，嵌合抗體係CDR接枝抗體。

當與抗原結合蛋白相關使用時，術語「人源化」係指如下抗原結合蛋白（例如，抗體），其至少具有來自非人來源的CDR區，並且被工程化為具有比原始來源的抗體更相似於真實的人抗體的結構和免疫功能。例如，人源化可涉及將來自非人抗體（例如小鼠抗體）的CDR接枝到人框架區中。通常，在人源化抗體中，除CDR之外的整個抗體由人起源的多核苷酸編碼或與這種抗體相同（其CDR內除外）。CDR（部分或全部由源自非人生物體的核酸編碼）被接枝到人抗體可變區的β-折疊框架中以產生抗體，其特異性由接枝的CDR決定。這種抗體的產生描述於例如國際專利公開案號WO 92/11018；Jones, 1986, Nature [自然] 321:522-525；和Verhoeyen 等人, 1988, Science [科學] 239:1534-1536，所述公開均藉由引用整體併入。通常採用選擇的受體框架殘基向相應的供體殘基的「回復突變」，以重新獲得在初始接枝的構建體中喪失的親和力（參見例如，美國專利案號5530101；5585089；5693761；5693762；6180370；5859205；5821337；6054297；和6407213，均藉由引用整體併入）。人源化抗體視需要還包含免疫球蛋白（典型地是人免疫球蛋白）恒定區的至少一部分，並且因此典型地包含人Fc區。

用於產生嵌合抗體、人源化抗體和重構型非人抗體的多種技術和方法係本領域熟知的。參見Tsurushita和Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies [單株抗體的人源化], Molecular Biology of B Cells [B細胞的分子生物學], 533-545, Elsevier Science（愛思唯爾科學出版社）（美國），和其中引用的參考文獻；Jones等人., 1986, Nature [自然] 321:522-525；Riechmann等人.,1988；Nature [自然] 332:323-329；Verhoeyen等人., 1988, Science [科學], 239:1534-1536；Queen等人., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA [美國科學院院刊] 86:10029-33；He等人., 1998, J. Immunol. [免疫學雜誌] 160: 1029-1035；Carter等人., 1992, Proc Natl Acad Sci USA [美國科學院院刊] 89:4285-9, Presta等人., 1997, Cancer Res. [癌症研究] 57(20):4593-9；Gorman等人., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國科學院院刊] 88:4181-4185；O'Connor等人., 1998, Protein Eng [蛋白質工程] 11:321-8, 美國專利公開案號20030039649；美國專利案號5,869,619、5,225,539、5,821,337、5,859,205；Padlan等人., 1995, FASEB J. [美國實驗生物學學會聯合會雜誌] 9:133-39；以及Tamura等人., 2000, J. Immunol. [免疫學雜誌] 164:1432-41，全部藉由引用以全文併入。降低非人抗體可變區的免疫原性的人源化或其他方法可包括表面重修方法，如例如描述於Roguska 等人, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國科學院院刊] 91:969-973中，藉由引用整體併入。親本抗體可以是親和力成熟的，這在本領域中被很好地理解。可以使用基於結構的方法用於人源化和親和力成熟，例如像在美國專利公開案號20060008883中所述。可以使用基於選擇的方法用於人源化和/或親和力成熟抗體可變區，包括但不限於在以下各項中描述的方法：Wu等人., 1999, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 294:151-162；Baca等人., 1997, J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 272(16):10678-10684；Rosok等人., 1996, J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 271(37): 22611-22618；Rader等人., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國科學院院刊] 95: 8910-8915；Krauss等人., 2003, Protein Engineering [蛋白質工程] 16(10):753-759，均藉由引用以全文併入。人源化還可以涉及所選擇的胺基酸取代以使非人序列更類似於人序列。其他人源化方法可以涉及僅移植部分CDR，包括但不限於在Tan等人., 2002, J. Immunol. [免疫學雜誌] 169:1119-1125；De Pascalis等人., 2002, J. Immunol. [免疫學雜誌] 169:3076-3084中所述的方法，均藉由引用以全文併入。

在其他實施方式中，抗原結合蛋白係抗原結合抗體片段，即缺少抗體輕鏈的部分或全部和/或抗體重鏈的部分或全部的抗體片段。抗體片段可以重組產生或可以藉由使用酶（例如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶）切割完整抗體來製備。木瓜蛋白酶切割抗體以產生兩個Fab片段和單個Fc片段。胃蛋白酶切割抗體以產生F(ab')₂ 片段和pFc'片段。在示例性實例中，抗原結合抗體片段係Fab片段或F(ab')₂ 片段。Fab片段係具有VL、VH、CL和CH1結構域的單價片段。Fab可以指單獨的該區域，或在全長抗體，抗體片段等的背景下指該區域。F(ab')₂ 片段係具有由二硫橋在鉸鏈區連接的兩個Fab片段的二價片段。

已經開發出抗體的構造以產生越來越多可替代的型式，該等型式跨越至少約12-150 kDa的分子量範圍並且具有從單體（n = 1）至二聚體（n = 2）、至三聚體（n = 3）、至四聚體（n = 4），和至潛在更高範圍的效價（n）；此類可替代的型式在本文中被稱為「抗體蛋白質產物」，並且是抗原結合蛋白的實例。抗體蛋白產物包括基於完整抗體結構的那些和模擬保留完整抗原結合能力的抗體片段的那些，例如scFv和VHH/VH（以下討論的）。單鏈抗體（scFv）係以下抗體，其中VL和VH區經由連接子（例如，長度通常為約15個胺基酸的胺基酸殘基的合成序列）連接以形成連續的蛋白質鏈，其中該連接子足夠長以允許蛋白質鏈自身折回並形成單價抗原結合位點（參見，例如，Bird等人., 1988, Science [科學] 242:423-26和Huston等人., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國科學院院刊] 85:5879-83）。

保留其完整抗原結合位點的抗原結合片段係Fv片段，該Fv片段完全由可變（V）區（單一抗體的VL和VH結構域）組成。可溶的柔性胺基酸肽連接子通常用於將V區連接至scFv（單鏈片段可變的）片段用於穩定分子，或將恒定（C）結構域添加至V區中以產生Fab片段（片段，抗原結合）。scFv和Fab片段可以容易地在宿主細胞中產生，例如原核或真核宿主細胞。其他抗體蛋白產物包括二硫鍵穩定的scFv（ds-scFv）、單鏈Fab（scFab）、單鏈抗體（SCA）、結構域抗體（dAb）（例如，包含VH結構域、VL結構域、或VH或VL結構域的抗原結合片段的肽）、包含Fd片段的肽（包含VH和CH1結構域）、互補決定區（CDR）片段，以及二聚體和多聚體抗體型式（如二抗體、三抗體、和四抗體、或微型抗體（miniAb），該等抗體型式包含由與寡聚結構域連接的scFv組成的不同型式。最小的片段係駱駝科重鏈Ab的VHH/VH以及單結構域Ab（sdAb）。肽體（peptibody）或肽-Fc融合體係另一種抗體蛋白產物。肽體的結構由接枝到Fc結構域上的生物活性肽組成。本領域進一步描述了肽體。參見，例如，Shimamoto等人., mAbs 4(5): 586-591 (2012)。

可替代地，抗體蛋白產物可以包含例如，可替代的蛋白支架或具有接枝的CDR或CDR衍生物的人工支架。此類支架包括但不限於抗體衍生的支架（包含引入例如，穩定抗原結合蛋白的三維結構的突變）以及全合成支架（包含例如，生物相容性聚合物）。參見，例如，Korndorfer等人., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics [蛋白質: 結構、功能和生物資訊學], 第53卷, 第1期: 121-129；Roque等人., 2004, Biotechnol. Prog. [生物技術進展] 20:639-654。另外，可以使用肽抗體模擬物（「PAM」），以及基於利用纖維接合素組分作為支架的抗體模擬物的支架。

在多個方面，該抗原結合蛋白包含重鏈CDR，該等重鏈CDR包含與 i) vhCDR1 SEQ ID NO: 14、vhCDR2 SEQ ID NO: 15或vhCDR2 SEQ ID NO: 21、和vhCDR3 SEQ ID NO: 16；或 ii) vhCDR1 SEQ ID NO: 33、vhCDR2 SEQ ID NO: 34、和vhCDR3 SEQ ID NO: 35差異不超過3、2、或1個胺基酸的胺基酸序列；和/或包含輕鏈CDR，該等輕鏈CDR包含與 i) vlCDR1 SEQ ID NO: 11、vlCDR2 SEQ ID NO: 12、和vlCDR3 SEQ ID NO: 13；或 ii) vlCDR1 SEQ ID NO: 30、vlCDR2 SEQ ID NO: 31、和vlCDR3 SEQ ID NO: 32差異不超過3、2、或1個胺基酸的胺基酸序列。儘管取代（例如，保守取代）係較佳的，但每個這樣的序列差異獨立地是缺失、插入或取代。保守取代的實例包括但不限於以下各組內的交換：小的脂肪族非極性或輕微極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；極性帶負電荷的殘基及其醯胺和酯：Asp、Asn、Glu、Gln、半胱磺酸和高半胱胺酸；極性，帶正電荷的殘基：His、Arg、Lys、鳥胺酸（Orn）；大的脂肪族非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val、Cys、正亮胺酸（Nle）、高半胱胺酸；和大的芳香族殘基：Phe、Tyr、Trp、乙醯基苯丙胺酸。

在多個方面，抗原結合蛋白包含以下CDR序列：a) 含有SEQ ID NO: 14的vhCDR1、含有SEQ ID NO:15或SEQ ID NO: 21的vhCDR2、和含有SEQ ID NO: 16的vhCDR3；或 b) 含有SEQ ID NO: 33的vhCDR1、含有SEQ ID NO: 34的vhCDR2、和含有SEQ ID NO: 35的vhCDR3。可替代地或另外地，抗原結合蛋白包含以下CDR序列：a) 含有SEQ ID NO: 11的vlCDR1、含有SEQ ID NO: 12的vlCDR2、和含有SEQ ID NO: 13的vlCDR3；或 b) 含有SEQ ID NO: 30的vlCDR1、含有SEQ ID NO: 32的vlCDR2、和含有SEQ ID NO: 33的vlCDR3。

因此在多個方面，該抗原結合蛋白包含：含有SEQ ID NO: 14的vhCDR1、含有SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 21的vhCDR2、含有SEQ ID NO: 16的vhCDR3、含有SEQ ID NO: 11的vlCDR1、含有SEQ ID NO: 12的vlCDR2、和含有SEQ ID NO: 13的vlCDR3。在可替代的方面，該抗原結合蛋白包含：含有SEQ ID NO: 33的vhCDR1、含有SEQ ID NO: 34的vhCDR2、含有SEQ ID NO: 35的vhCDR3、含有SEQ ID NO: 30的vlCDR1、含有SEQ ID NO: 31的vlCDR2、和含有SEQ ID NO: 32的vlCDR3。

在多個實施方式中，抗原結合蛋白包含輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域包含與SEQ ID NO: 183或SEQ ID NO:186具有至少90%同一性（例如，至少95%同一性或100%同一性）的胺基酸序列；和/或包含重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含與SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 184、或SEQ ID NO:185具有至少90%同一性（例如，至少95%同一性或100%同一性）的胺基酸序列。例如，抗原結合蛋白可以包含 (i) SEQ ID NO: 183和SEQ ID NO: 182；(ii) SEQ ID NO: 184和SEQ ID NO: 183；或 (iii) SEQ ID NO: 185和SEQ ID NO: 186。在多個方面，抗原結合蛋白包含輕鏈可變區和/或重鏈可變區，該輕鏈可變區和/或重鏈可變區包含與前述胺基酸序列僅相差15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1個殘基的胺基酸序列，其中每個這樣的序列差異獨立地是缺失、插入、或取代（例如，保守取代）。在多個方面，一個或多個序列差異位於CDR外部（例如，在框架區內）。

在多個實施方式中，抗原結合蛋白包含輕鏈，該輕鏈包含與SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 36具有至少90%同一性（例如，至少95%同一性或100%同一性）的胺基酸序列；和/或包含重鏈，該重鏈包含與SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 199或SEQ ID NO: 37具有至少90%同一性（例如，至少95%同一性或100%同一性）的胺基酸序列。例如，抗原結合蛋白可以包含 (i) SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18；(ii) SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 199；或 (iii) SEQ ID NO: 36和SEQ ID NO: 37。

在多個實施方式中，抗原結合蛋白包含輕鏈，該輕鏈包含與SEQ ID NO: 200或SEQ ID NO: 204具有至少90%同一性（例如，至少95%同一性或100%同一性）的胺基酸序列；和/或包含重鏈，該重鏈包含與SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 203或SEQ ID NO: 205具有至少90%同一性（例如，至少95%同一性或100%同一性）的胺基酸序列。例如，抗原結合蛋白可以包含 (i) SEQ ID NO: 200和SEQ ID NO: 201；(ii) SEQ ID NO: 200或SEQ ID NO: 203；(iii) SEQ ID NO: 204和SEQ ID NO: 205。競爭、表位、結合親和力

抗原結合蛋白結合SEQ ID NO: 2的STEAP1。例如，藉由測定與對照分子的結合相比的分子的結合（該對照分子通常是具有相似結構不具有結合活性的分子），可以測定特異性結合（即，與STEAP1的結合可測量地不同於非特異性相互作用）。例如，藉由與類似於靶標的對照分子的競爭可以測定特異性結合。

抗原結合蛋白與STEAP1的結合親和力可以用解離常數（Kd）來描述。在示例性方面，本文提供的抗原結合蛋白的Kd係微莫耳、納莫耳、皮莫耳或飛莫耳。典型地，相對於靶抗原或表位，特異性結合抗原的抗原結合蛋白對於對照分子具有20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍的Kd。同樣，特定抗原的特異性結合可以展現為，例如，相對於對照，抗體對表位具有如下抗原或表位KA或Ka：至少20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多，其中KA或Ka係指特定抗體-抗原相互作用的解離率。在示例性方面，本文提供的抗原結合蛋白針對STEAP1的KD小於或等於10^-7 M、小於或等於10^-8 M、小於或等於10^-9 M、小於或等於10^-10 M、小於或等於10^-11 M、或小於或等於10^-12 M。例如，抗原結合蛋白的KD視需要在約10^-4 至10^-6 M、或約10^-7 至10^-9 M、或約10^-10 至10^-12 M、或約10^-7 至10^-12 、或約10^-9 至10^-12 、或約10^-13 至10^-15 M的範圍內。可替代地（或另外地）該抗原結合蛋白具有與STEAP1的低解離速率。在一些實施方式中，該抗原結合蛋白具有K_解離為1x10^-4 s^-1 或更低。在另一個實施方式中，K_解離為5x10^-5 s^-1 或更低。在多個方面，抗原結合蛋白區分表現高水平STEAP1的靶細胞和顯示較少STEAP1的脫靶細胞。例如，在多個方面，抗原結合蛋白優先地結合細胞，該等細胞包含多於約100,000個STEAP受體/細胞（例如，約200,000個STEAP1受體/細胞）低至約10,000個STEAP1受體/細胞。將理解，關於與STEAP1相關的競爭、結合親和力、和結合特異性的本揭露還適用於多特異性抗原結合蛋白與第二或第三抗原（例如，CD3）的結合或用於與抗STEAP1抗原結合蛋白連接的不同抗體。例如，在示例性方面，本文提供的抗原結合蛋白針對CD3（或如下所述的PD-1）的Kd小於或等於10^-7 M、小於或等於10^-8 M、小於或等於10^-9 M、小於或等於10^-10 M、小於或等於10^-11 M、或小於或等於10^-12 M。例如，抗原結合蛋白的Kd視需要在約10^-4 至10^-6 M、或約10^-7 至10^-9 M、或約10^-10 至10^-12 M、或約10^-7 至10^-12 、或約10^-9 至10^-12 、或約10^-13 至10^-15 M的範圍內。可替代地（或另外地）該抗原結合蛋白具有與CD3的低解離速率。在一些實施方式中，該抗原結合蛋白具有K_解離為1 x 10^-4 s^-1 或更低。在另一個實施方式中，關於CD3，K_解離係5 x 10^-5 s^-1 或更低。

本揭露進一步提供了抗原結合蛋白（例如，抗體），該抗原結合蛋白與本文所述的任何抗原結合蛋白（例如，Ab-A、Ab-A1、Ab-A2、Ab-B、或Ab-B1，包括呈如本文所述的^XmAb2+1 型式）競爭結合STEAP1。換言之，本揭露提供了抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白交叉阻斷本文所述的參考抗原結合蛋白與STEAP1的結合或該抗原結合蛋白與STEAP1的結合被參考抗原結合蛋白交叉阻斷。藉由「競爭」來表示一種抗原結合蛋白阻止、減少或抑制參考抗原結合蛋白與STEAP1的結合。可以使用許多類型的競爭性結合測定，例如，表面電漿共振、固相直接或間接放射免疫測定（RIA）、固相直接或間接酶免疫測定（EIA）、夾心法競爭測定（參見，例如，Stahli等人., 1983, Methods in Enzymology [酶學方法] 9:242-253）、固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA（參見，例如，Kirkland等人., 1986, J. Immunol. [免疫學雜誌] 137:3614-3619）、固相直接標記測定、固相直接標記夾心法測定（參見，例如，Harlow和Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press[抗體，實驗室手冊，冷泉港出版社]）、使用1-125標記固相直接標記RIA（參見，例如，Morel等人., 1988, Molec. Immunol. [分子免疫學] 25:7-15）、固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA（參見，例如，Cheung,等人., 1990, Virology [病毒學] 176:546-552）、以及直接標記的RIA（Moldenhauer等人., 1990, Scand. J. Immunol. [斯堪的納維亞免疫學雜誌] 32:77-82）。典型地，這種測定涉及使用與固體表面結合或暴露在細胞上的純化抗原，未標記的測試抗原結合蛋白和經標記的參考抗原結合蛋白。藉由在測試抗原結合蛋白的存在下，測定結合至固體表面或細胞的標記的量來測量競爭性抑制。通常，測試抗原結合蛋白係過量存在的。藉由競爭測定（競爭性抗原結合蛋白）鑒定的抗原結合蛋白包括與參考抗原結合蛋白結合相同表位（與由參考抗原結合蛋白識別的表位重疊的表位，以及不重疊但允許在測試抗原結合蛋白和參考抗原結合蛋白之間發生空間位阻的表位）的抗原結合蛋白。通常，當競爭性抗原結合蛋白過量存在時，其將使參考抗原結合蛋白與共同抗原的結合抑制至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、或75%。在一些情況下，結合被抑制至少80%、85%、90%、95%、或97%或更多。在至少一個方面，抗原結合蛋白（例如，抗體）與參考抗原結合蛋白（例如，本文所述的Ab-A、Ab-A1、Ab-A2、Ab-B、或Ab-B1，視需要呈雙特異性抗體型式，例如在實例中所述的雙特異性抗體型式（例如，XmAb²⁺¹ ））競爭，使得該參考抗原結合蛋白與STEAP1的結合降低至少80%或至少90%。

抗原結合蛋白結合SEQ ID NO: 2的STEAP1。競爭（或交叉阻斷）抗原結合蛋白可以結合以下表位：重疊由參考抗原結合蛋白識別的表位，或不重疊但允許在測試抗原結合蛋白和參考抗原結合蛋白之間發生空間位阻的表位。在多個方面，抗原結合蛋白與參考抗原結合蛋白結合相同的表位，所述參考抗原結合蛋白係例如Ab-A、Ab-A1、Ab-A2（N67Q）、Ab-B、或Ab-B1或本文所述的其雙特異性或異源二聚體形式（例如，Ab-A1 XmAb²⁺¹ 、Ab-A2 (N67Q) XmAb²⁺¹ 、或Ab-B1 XmAb²⁺¹ ）。例如，本揭露的抗原結合蛋白視需要結合STEAP1的第二胞外環的外部區域。在至少一個實施方式中，抗原結合蛋白結合STEAP1的胺基酸92-118（胞外環1）和/或胺基酸279-290（胞外環3）內的區域。在多個方面，本揭露提供了結合STEAP 1的胺基酸92-118和胺基酸279-290內的區域的抗原結合蛋白。還視需要，抗原結合蛋白不結合STEAP2（UniProtKB號Q8NFT2；SEQ ID NO: 177）。如果需要，可以藉由解析與STEAP1或其部分結合的抗原結合蛋白的X射線晶體結構來確定參考抗原結合蛋白和/或測試的抗原結合蛋白的表位。在一個這樣的實施方式中，表位被定義為在STEAP1細胞外部分上的那些殘基，當抗原結合蛋白（參考抗原結合蛋白或測試的抗原結合蛋白）與其結合時，與不結合時相比，溶劑可及性降低至少10%。製備抗原結合蛋白之方法

製備抗原結合蛋白（例如，抗體、抗原結合抗體片段、和抗體蛋白產物）的適合的方法係本領域已知的。例如，用於產生抗體的標準雜交瘤方法描述於例如Harlow和Lane (編輯), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press [抗體: 實驗室手冊，CSH出版社](1988)；和CA. Janeway等人. (編輯), Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, NY [免疫生物學，第5版，加蘭出版社，紐約，紐約州](2001))中。EBV-雜交瘤方法和噬菌體載體表現系統描述於例如Haskard和Archer, J. Immunol. Methods [免疫學方法雜誌], 74(2), 361-67 (1984)；Roder等人., Methods Enzymol. [酶學方法], 121, 140-67 (1986)；以及Huse等人., Science [科學], 246, 1275-81 (1989))中。在非人動物中產生抗體的方法描述於例如美國專利案號5,545,806、5,569,825、5,714,352和5,814,318；以及美國專利申請公開案號2002/0197266中（均藉由引用並於本文中）。在某些方面，提供了結合STEAP1的重組抗原結合蛋白。在該上下文中，「重組蛋白」係使用重組技術，例如藉由表現重組核酸所製備的蛋白質。用於產生重組蛋白之方法和技術係本領域中熟知的。

結合位點中CDR的分子進化也已經被用於產生具有增加的親和力的抗原結合蛋白（例如，抗體），例如，如由Schier等人., 1996, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 263:551中所述對於c-erbB-2具有增加的親和力的抗體。此類技術在製備抗STEAP1抗原結合蛋白（或本文所述的其他抗原結合蛋白）中是有用的。

測試抗原結合蛋白與抗原（例如STEAP1）的結合能力的方法係本領域已知的，並包括，例如放射免疫測定（RIA）、ELISA、西方墨點法、免疫沈澱法、表面電漿共振（例如，BIAcore®）、和競爭性抑制測定（參見，例如，Janeway等人.,下文；美國專利公開案號2002/0197266；和美國專利案號7,872,106，該等文獻的全部在此藉由引用以其全文併入本文，並特別是關於競爭測定的揭露內容）。實際上，測試抗原結合蛋白與第二抗原結合蛋白競爭結合抗原，或結合其表位的能力的測定在本領域中是已知的，並可以被用於測試抗體與例如STEAP1結合的能力。參見，例如，美國專利申請公開案號2014/0178905；Chand等人., Biologicals [生物製品] 46: 168-171 (2017)；Liu等人., Anal Biochem [分析生物化學] 525: 89-91 (2017)；以及Goolia等人., J Vet Diagn Invest [獸醫診斷調查雜誌] 29(2): 250-253 (2017)。可以將表面電漿共振用於測定抗原結合蛋白和第二抗原結合蛋白的結合常數，並且可以比較這兩個結合常數。多特異性抗原結合蛋白

抗體技術中持續存在的問題係對同時結合兩種（或多種）不同抗原的雙特異性（和/或多特異性）抗體的需要，通常允許不同的抗原接近並產生新功能和新療法。本揭露提供了結合STEAP1和一種或多種另外的靶抗原的新穎多特異性抗原結合蛋白。在較佳的實施方式中，本揭露提供了新穎的雙特異性抗原結合蛋白（例如，雙特異性抗體），該抗原結合蛋白包含如上所述的抗STEAP1結合結構域以及結合第二靶抗原（該抗原可以是不同的STEAP1表位，但通常是不同的抗原）的結合區。在多個方面，第二抗原係存在於效應細胞上的細胞表面分子，即，表現一個或多個FcR（例如，FcγRIII）並進行歸因於抗體的Fc區的一個或多個效應子功能的白血球。

效應子功能的實例包括但不限於，Clq結合和補體依賴性細胞毒性（CDC）、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）、吞噬作用、細胞表面受體的下調、和B細胞活化。涉及ADCC的效應細胞的實例包括但不限於，細胞毒性T細胞、外周血單核細胞（PBMC）、天然殺傷（NK）細胞、單核細胞、和嗜中性粒細胞。在多個方面，本揭露提供了結合CD3（例如，SEQ ID NO: 1）和STEAP1（SEQ ID NO: 2）二者的雙特異性抗原結合蛋白（例如，雙特異性抗體）。在多個方面，本揭露提供了結合CD3以及STEAP1的胞外環1和3的雙特異性抗原結合蛋白（例如，雙特異性抗體）。

在多個方面，多特異性抗原結合蛋白區分表現高水平STEAP1的靶細胞和顯示較少STEAP1的脫靶細胞。在這方面，在一些實施方式中，本揭露的雙特異性抗原結合蛋白（例如，異源二聚體抗體）能夠優先介導T細胞依賴性殺傷腫瘤細胞，證明降低的「脫靶」效應。例如，在一些方面，包含本文所述的STEAP1抗原結合蛋白的雙特異性抗體與CD3抗原結合區一起優先介導T細胞依賴性殺傷細胞，其中STEAP1的表面密度高於10,000（例如，與具有STEAP1的表面密度低於10,000的細胞相比，對於具有STEAP1的表面密度高於10,000的細胞EC90係至少低10倍）。

本揭露提供了包含新穎抗CD3序列的雙特異性抗原結合蛋白，包括多組CDR和完全可變輕鏈和重鏈。在一些方面，雙特異性構建體的CD3結合結構域（視需要如以下所討論的scFv）包含：含有重鏈CDR的可變重鏈結構域，該等重鏈CDR包含與vhCDR1 SEQ ID NO: 170、vhCDR2 SEQ ID NO: 171、和vhCDR3 SEQ ID NO: 172差異不超過3、2、或1個胺基酸的胺基酸序列；以及含有輕鏈CDR的可變輕鏈結構域，該等輕鏈CDR包含與vlCDR1 SEQ ID NO: 174、vlCDR2 SEQ ID NO:175、和vlCDR3 SEQ ID NO: 176差異不超過3、2、或1個胺基酸的胺基酸序列。例如，本揭露提供了多特異性（例如，雙特異性）構建體，該構建體包含可變重鏈結構域，該可變重鏈結構域包含與SEQ ID NO:169具有至少90%同一性（例如，至少95%同一性或100%同一性）的胺基酸序列；和包含可變輕鏈結構域，該可變輕鏈結構域包含與SEQ ID NO:173具有至少90%同一性（例如，至少95%同一性或100%同一性）的胺基酸序列。

例如，抗CD3部分視需要包含CDR序列，該等CDR序列包含：含有SEQ ID NO:170的vhCDR1、含有SEQ ID NO: 171的vhCDR2、含有SEQ ID NO: 172的vhCDR3、含有SEQ ID NO: 174的vlCDR1、含有SEQ ID NO: 175的vlCDR2、和含有SEQ ID NO: 176的vlCDR3。就此而言，CD3結合區視需要包含SEQ ID NO:169的可變重鏈區和SEQ ID NO:173的可變輕鏈區。

雙特異性抗原結合蛋白可以包含兩個抗原結合結構域（例如，每個抗原單價結合）或三個（或更多個）抗原結合結構域（例如，一個抗原雙價結合並且另一個抗原單價結合），例如本文所述的STEAP1和CD3結合結構域。雙特異性抗體包括但不限於傳統的雙特異性免疫球蛋白（例如，BsIgG）；包含附加的抗原結合結構域的IgG（例如，輕鏈或重鏈的胺基或羧基末端與另外的抗原結合結構域連接，例如單結構域抗體或配對的抗體可變結構域（例如，Fv或scFv））；BsAb片段（例如，雙特異性單鏈抗體）；雙特異性融合蛋白（例如，與效應部分融合的抗原結合結構域）和BsAb軛合物（conjugate）。參見，例如，Spiess等人., Molecular Immunology [分子免疫學] 67(2) A部分: 97-106 (2015)，該文獻描述了多種雙特異性型式並在此藉由引用併入本文。雙特異性構建體的實例包括但不限於，雙抗體、單鏈雙抗體、串聯scFvs、和Fab₂ 雙特異抗體，以及包含全長抗體的工程化構建體。參見，例如，Chames & Baty, 2009, mAbs 1[6]:1-9；和Holliger & Hudson, 2005, Nature Biotechnology [自然生物技術] 23[9]:1126-1136；Wu等人., 2007, Nature Biotechnology [自然生物技術] 25[11]:1290-1297；Michaelson等人., 2009, mAbs 1[2]:128-141；國際專利公開案號2009032782和2006020258；Zuo等人., 2000, Protein Engineering [蛋白質工程] 13[5]:361-367；美國專利申請公開案號20020103345；Shen等人., 2006, J Biol Chem [生物化學雜誌] 281[16]:10706-10714；Lu等人., 2005, J Biol Chem [生物化學雜誌] 280[20]:19665-19672；以及Kontermann, 2012 MAbs 4(2):182，所以該等都明確地併入本文。

在多個方面，雙特異性抗原結合蛋白係雙特異性單鏈抗體（BiScFv）。輕鏈可變區和重鏈可變區彼此連接成為單鏈作為第一抗原結合結構域，該第一抗原結合結構域視需要經由連接子連接至具有相似結構的第二抗原結合結構域。在使用連接子的情況下，該連接子較佳的是具有足以確保第一抗原結合結構域和第二抗原結合結構域中的每一者均可以彼此獨立地保留其差異結合特異性的長度和序列。雙特異性單鏈分子係本領域中已知的，並且進一步描述於美國專利案號7635472，國際專利公開案號WO 99/54440；Mack, J. Immunol. [免疫學雜誌](1997), 158, 3965-3970；Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025；Kufer, Cancer Immunol. Immunother. [癌症免疫學與免疫療法], (1997), 45, 193-197；Loffler, Blood [血液], (2000), 95, 6, 2098-2103；Bruhl, Immunol. [免疫學], (2001), 166, 2420-2426；以及Kipriyanov, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌], (1999), 293,41-56中，該等文獻均藉由引用以其全文併入。

可替代的雙特異性抗原結合型式描述於例如美國專利申請公開案號2011/0054151中，藉由引用並於本文中。例如，雙特異性抗原結合蛋白可以包含mAb-Fv型式，其中IgG抗體在C末端處與Fv片段融合。可替代地，可以使用mAb-Fab型式，其中IgG抗體在C末端處與Fab融合。mAb-Fab構建體包含C末端Fv融合的C末端的CH和CL恒定結構域，而mAb-Fv不包含。參見美國專利申請公開案號2011/0054151的圖8。視需要，mAb-Fv和mAb-Fab構建體的N末端結合區缺少輕鏈和CH1結構域（即，包含單結構域VHH區）。mAb-Fv和mAb-Fab構建體包含三個可變區，使得它們二價結合第一抗原和單價結合第二抗原。適合的雙特異性抗原結合型式還包括在美國專利申請公開案號2011/0054151中所述的Fab-Fv和Fab-Fab構建體。Fab-Fv和Fab-Fab免疫球蛋白包含結合第一抗原的N末端Fab片段和結合第二抗原的C末端Fv或Fab片段。

在一個方面，本揭露針對異源二聚體抗體的產生，該等異源二聚體抗體共同銜接抗原並依賴於在每條鏈上不同的恒定區中的胺基酸變體以促進異源二聚體形成和/或允許異源二聚體相比於同源二聚體純化的簡化。通常，藉由將每條重鏈和輕鏈的基因包括在宿主細胞中來製備雙特異性抗體。這通常導致形成所希望的異源二聚體（A-B），以及兩個同源二聚體（A-A和B-B）。然而，多特異性抗體形成的主要障礙係難以純化異源二聚體抗體與同源二聚體抗體分開和/或相比於同源二聚體的形成偏斜形成異源二聚體的。

本揭露提供了異源二聚體抗體型式，該等型式克服了與先前技術相關的障礙。另外，在STEAP1/CD3雙特異性抗原結合蛋白的上下文中，本揭露的異源二聚體抗體允許CD3的單價結合。T細胞的CD3活化僅在當其相關聯的T細胞受體（TCR）在高度親合的細胞-細胞突觸中在抗原呈遞細胞上銜接負載抗原的MHC時發生（Kuhns等人., 2006, Immunity [免疫力] 24:133-139）。使用抗CD3抗體的CD3的非特異性二價交聯引發細胞介素風暴和毒性（Perruche等人., 2009, J Immunol [免疫學雜誌] 183[2]:953-61；Chatenoud和Bluestone, 2007, Nature Reviews Immunology [免疫學自然綜述] 7:622-632；藉由引用明確地併入）。因此，對於實際的臨床應用，用於重定向殺傷靶細胞的CD3共同參與的較佳的模式係單價結合，其僅在與共同銜接的靶標銜接時導致活化。因此，在一個實施方式中，本揭露的異源二聚體抗體提供了以提供有效抗體生產的型式單價結合CD3和二價結合STEAP1的優點。

示例性異源二聚體抗體型式包含具有單鏈Fv（scFv）的重鏈和處於「規則」Fab 型式的第二重鏈（即，包含可變重鏈和輕鏈）。換言之，異源二聚體抗體包含 a) 第一重鏈，其包含第一可變Fc結構域和結合第一抗原（視需要CD3）的單鏈Fv區（scFv）；b) 第二重鏈，其包含第二可變Fc結構域和第一可變重鏈結構域；和 c) 第一輕鏈，其包含第一可變輕鏈結構域和第一恒定輕鏈結構域，其中第一可變重鏈結構域和第一可變輕鏈結構域結合第二抗原（視需要STEAP1）。為說明，構建體包含：具有scFv區-結構域連接子-Fc結構域的一個單體和具有VH-CH1-鉸鏈- CH2-CH3加相關的輕鏈的第二單體，視需要具有異源二聚體化變體（包括空間和pI變體），Fc和FcRn變體，以及包括在該等區域中的另外的抗原結合結構域（具有視需要的連接子）。在一些實施方式中，該連接子係鉸鏈區或其片段。該結構在本文中被稱為XmAb型式，「三聯的F」型式（scFv-FAb-Fc）或「開瓶器」型式。藉由使用如下文詳細描述的促進異源二聚體抗體形成的恒定區（例如，Fc結構域和/或鉸鏈區）中的胺基酸變體將兩條鏈較佳的是結合在一起。較佳的是，scFv結合CD3，並視需要包括帶正電荷的scFv連接子。可替代地，scFv結合STEAP1。「三聯的F」型式進一步描述於美國專利案號9,822,186中，藉由引用以其全文併入本文，並特別地是關於異源二聚體抗體結構的揭露內容。

在另一個方面，雙特異性抗原結合蛋白係包含第一單體的異源二聚體抗體，該第一單體包含第一重鏈，該第一重鏈包含第一可變重鏈結構域、含有第一CH1結構域和第一Fc結構域的第一恒定重鏈，其中scFv包含scFv可變輕鏈結構域、scFv連接子、和scFv可變重鏈結構域。使用一個或多個結構域連接子，scFv在重恒定結構域CH1結構域的C末端和第一Fc結構域的N末端之間共價附接，並且該scFv結合CD3。異源二聚體抗體進一步包含第二單體，該第二單體包含第二重鏈，該第二重鏈包含第二可變重鏈結構域和含有第二Fc結構域的第二恒定重鏈。異源二聚體抗體進一步利用包含可變輕鏈結構域和恒定輕鏈結構域的共同輕鏈，該輕鏈與重鏈結合以形成結合STEAP1的兩個相同的Fab。由於與一種靶抗原的二價結合，該型式在文中有時被稱為「XmAb²⁺¹ 」型式。因此，在一個實施方式中，本揭露的異源二聚體抗體提供了以提供有效抗體生產的型式單價結合CD3和二價結合STEAP1的優點。

如下進一步描述，異源二聚體抗體還可以包括突變以產生偏斜變體、pI變體、消融變體、另外的Fc變體等。例如，在多個方面，所述第一和所述第二Fc結構域具有一組胺基酸取代，該等胺基酸取代選自由以下各項組成之群組：S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411T/E360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；和K370S : S364K/E357Q。

本揭露的XmAb²⁺¹ 異源二聚體抗體型式的圖示提供在圖1中。scFv結構域和兩個Fab部分的提供形成三個抗原結合結構域，其中兩個單體的Fab部分結合STEAP1，並且該scFv結構域結合CD3。將scFv結構域插入該等單體之一的Fc結構域和CH1-Fv區之間。

異源二聚體抗體較佳的是IgG類，該IgG類具有若干個亞類，包括但不限於IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4，儘管還考慮了IgM、IgD、IgG、IgA、和IgE。應當理解，抗體還可以包含同種型和/或亞類的雜合體。例如，如在美國專利公開案號2009/0163699（藉由引用併入）中所示的IgG1/G2雜合體的pI工程化被考慮作為本揭露的一部分。

存在許多機制，該等機制可用於產生本揭露的異源二聚體。另外，如熟悉該項技術者所理解的並且在下文更全面地描述，可以組合該等機制以確保高度異源二聚體化。

也可視需要使用本領域通常稱為「杵臼」的一種機制（「knobs and holes」，簡稱「KIH」）的一種機制，其指的是產生空間影響以促進異源二聚體形成且不利於同源二聚體形成的胺基酸工程化；這有時被稱為「杵臼」，如美國專利公開案號20130205756中所述，Ridgway等人., Protein Engineering [蛋白質工程] 9(7):617 (1996)；Atwell等人., J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 1997 270:26；和美國專利案號8,216,805，所有該等文獻在此藉由引用以其全文併入本文，特別地是關於異源二聚體抗體產生的揭露內容。此外，如描述於Merchant 等人, Nature Biotech. [自然生物技術] 16:677 (1998)，該等「杵臼」突變可以與二硫鍵組合，使形成偏斜異二聚化。突變的實例包括與T366W配對的T366S/L368A/Y407V，以及具有橋接二硫化物的該變體，與T366W/S354C配對的T366S/L368A/Y407V/Y349C，特別地是與其他異源二聚體化變體（包括如下文概述的pi變體）組合。

發現用於生成異源二聚體的另一種機制有時被稱為「靜電轉向」，如描述於Gunasekaran 等, J. Biol. Chem.[生物化學雜誌] 285(25):19637 (2010)中，將其整體藉由引用併入本文。這有時在本文中稱為「電荷對」。在該實施方式中，靜電用於使形成偏斜異二聚化。如熟悉該項技術者將理解的，該等也可能對pI有影響，並且因此對純化也有影響，並且因此在某些情況下也可以考慮pI變體。然而，由於產生該等以強制異二聚化並且不用作純化工具，因此它們被歸類為「空間變體」。該等包括但不限於D221E/P228E/L368E，與D221R/P228R/K409R配對（即，該等係單體對應組）；和C220E/P228E/368E，與C220R/E224R/P228R/K409R配對。在框架區的一些實施方式中，位置220突變去除對於重鏈和輕鏈二硫化物形成不再需要的半胱胺酸。「空間變體」係本揭露視需要的實施方式。

有若干種機制可以導致異源二聚體蛋白質的純化的簡化；一種依賴於使用pI變體，使得每種單體具有不同的pI，因此允許A-A、A-B和B-B二聚體蛋白的等電純化。可替代地，可以基於大小進行分離。也可能使相對於同源二聚體的異源二聚體的形成「偏斜」，如下文通常所概述。因此，在本揭露的上下文中可以使用空間異源二聚體化變體和pI或電荷對變體的組合。另外，scFv可以包括帶電荷的scFv連接子（正電荷或負電荷），出於純化目的給出進一步的pI加強。如熟悉該項技術者所理解的，一些三聯的F型式（僅具有帶電荷的scFv連接子並且無另外的pi調節）係有用的，儘管本發明還確實提供了具有帶電荷的scFv連接子的偏斜變體（和本文所述Fc、FcRn、和KO變體的組合）的用途。

在利用pI作為分離機制的實施方式中，可以將胺基酸變體引入單體多肽的一者或兩者中；即，單體之一（本文簡稱為「單體A」）的pI可以遠離單體B地工程化，或單體A和B兩者都可以被改變，其中單體A的pI增加且單體B的pI減少。可以藉由去除或添加帶電荷的殘基（例如，中性胺基酸被帶正電荷或帶負電荷的胺基酸殘基替換，例如甘胺酸替換為麩胺酸）來完成任一種或兩種單體的pI變化，將帶電荷的殘基從正或負變為相反電荷（天冬胺酸變為離胺酸）或將帶電荷的殘基改變為中性殘基（例如，電荷的喪失；離胺酸變為絲胺酸）。另外，用於在產生本文異源二聚體抗體中使用的適合的pI變體係同種型的那些變體，例如從不同IgG同種型導入pI變體，使得pI在不引入顯著免疫原性的情況下改變；參見來自美國專利公開案號20140288275的圖29，在此藉由引用以其全文併入本文。

因此，實施方式提供了在至少一個單體中產生pI的足夠變化，使得異源二聚體可以與同源二聚體分離。這可以藉由使用「野生型」重鏈恒定區和變體區來實現，所述變體區已被工程化為增加或減少其pI（wt A-+B或wt A - -B），或藉由增加一個區域並減少其他區域（A+ -B-或A- B+）來實現。該注意的是，在該討論中，哪個單體包含scFv並且哪個Fab包含scFv無關緊要。與pI變體的使用相關的示意圖在美國專利案號9,822,186的圖34中列出（藉由引用以其全文併入本文，特別是關於異源二聚體抗體變體和抗CD3序列的討論）。pI變體可以按「隨插即用（plug and play）」型式與偏斜變體組合，因為該等變體的作用容易地轉移到具有不同Fv區的不同抗體中並且非常穩定。

因此，通常本揭露的方面包括抗體恒定區中的胺基酸變體，藉由將胺基酸取代（「pI變體」或「pI取代」）摻入一個或兩個單體中指導該等變體改變至少一個（如果不是兩個）抗體單體的等電點（pI）以形成「pI異源二聚體」（即，「pI抗體」）。如果兩個單體的pI相差少至0.1個pH單位（例如0.2、0.3、0.4和0.5 pH或更大的差異），可以實現異源二聚體與兩種同源二聚體的分離。

為了實現良好分離，包括在每個或兩個單體上的pI變體的數量將部分取決於一個或多個scFv和Fab的起始pI。即，為了確定要工程化的單體或「方向」（例如更正或更負），計算兩個靶抗原的Fv序列並由此做出決定。如本領域所知，不同的Fv將具有被開發利用的不同起始pI。通常，將pI工程化為導致每種單體的總pI差異為至少約0.1 log，較佳的是0.2至0.5。

此外，在一些情況下（取決於型式）異源二聚體可以基於大小（例如，分子量）與同源二聚體分離。例如，如在圖18A-I的一些實施方式中所示，一些型式形成具有不同大小的同源二聚體和異源二聚體（例如，對於開瓶器，一種同源二聚體係「雙scFv」型式，一種同源二聚體係標準抗體，並且異源二聚體具有一個Fab和一個scFv）。另外，如圖18A-I所示，可能的是一些抗原二價結合（例如，兩個抗原結合位點與單個抗原結合）。如將理解的，可以利用Fab和scFv的任何組合來實現所希望的結果和組合。

在使用pI變體實現異源二聚體化的情況下，藉由使用一個或多個重鏈的恒定區，提供了設計和純化多特異性蛋白質（包括抗體）的更模組化的方法。因此，在一些實施方式中，異源二聚體化變體（包括偏斜和純化異源二聚體化變體）不包括在可變區中，使得必須工程化每種單獨的抗體。另外，在一些實施方式中，藉由從不同IgG同種型導入pI變體顯著降低由pI變體產生的免疫原性的可能性，使得pI在不引入顯著免疫原性的情況下改變。因此，待解決的另一個問題係闡明具有高人序列含量的低pI恒定結構域，例如，在任何特定位置處最小化或避免非人殘基。

用pI工程化可能發生的附帶益處還包括血清半衰期的延長和FcRn結合的增加。即，如美國專利公開案號20120028304（藉由引用以其全文併入本文）中所述，降低抗體恒定結構域（包括在抗體和Fc融合體中發現的那些）的pI可以導致體內更長的血清滯留。該等用於增加血清半衰期的pI變體也促進用於純化的pI變化。

本揭露的異源二聚體融合蛋白可呈現多種構型，如圖18A-I中一般所示。一些圖描繪了「單端」構型，其中在分子的一個「臂」上存在一種類型的特異性，而在其他「臂」上存在不同的特異性。其他圖描繪了「雙端」構型，其中在分子的「頂部」存在至少一種類型的特異性，在分子的「底部」存在一種或多種不同的特異性。可用於本揭露的一種異源二聚體支架係如圖18A所示和上文所述的「三聯的F」或「開瓶器」支架型式。「三聯的F」型式具有若干個明顯的優點。依賴於兩種scFv構建體的抗體類似物通常具有穩定性和聚集問題，這可以藉由由本文所述的構建體藉由添加「常規」重鏈和輕鏈配對得到緩解。另外，與依賴於兩條重鏈和兩條輕鏈的型式相反，重鏈和輕鏈的不正確配對（例如，重1與輕2配對等）不產生問題。另外有用的抗原結合蛋白型式描述如下。

在多個方面，異源二聚體抗體的scFv包含本文所述的抗CD3 CDR序列。例如，在多個方面，該scFv包含：含有SEQ ID NO: 170的vhCDR1、含有SEQ ID NO: 171的vhCDR2、含有SEQ ID NO: 172的vhCDR3、含有SEQ ID NO: 174的vlCDR1、含有SEQ ID NO: 175的vlCDR2、和含有SEQ ID NO: 176的vlCDR3。例如，scFv視需要包含SEQ ID NO: 169的可變重鏈區和SEQ ID NO: 173的可變輕鏈區。在多個方面，scFv包含SEQ ID NO: 44的序列。

在一些實施方式中，scFv包含在圖19中列出的胺基酸序列，例如在SEQ ID NO: 44中列出的胺基酸序列。圖19中列出的序列提供了具有不同親和力的抗原結合結構域。在一些跡象中，較強的親和力可能是較佳的，而在其他情況下，可以使用較小的親和力。因此，在一些實施方式中，本揭露提供了包含抗CD3抗原結合結構域的異源二聚體抗體，該等抗原結合結構域係CD3的「強」或「高親和力」結合劑（例如，一個實例係描繪為H1.30_L1.47（視需要包括適當的帶電荷的連接子）的重和輕可變結構域）。在其他實施方式中，本揭露提供了包含抗CD3抗原結合結構域的異源二聚體抗體，該等抗原結合結構域係CD3的「輕」或「低親和力」結合劑。

典型的scFv連接子係本領域熟知的，並且通常長度為10至25個胺基酸，並包括甘胺酸和絲胺酸。藉由「帶電荷的scFv連接子」來表示利用帶電荷的胺基酸用於在產生和純化包含至少一個scFv的異源二聚體抗體中使用的scFv連接子。適合的帶電荷的scFv連接子顯示在圖8A、8B和19中，儘管還可以使用其他的。通常，如與標準不帶電荷的scFv連接子（例如，傳統上使用的(GGGGS)_3-5 （SEQ ID NO:179）序列）相比，預期用於在本揭露的上下文中使用的帶電荷的scFv連接子具有從3至8（3、4、5、6、7、或8均係可能的）的電荷變化（負電荷或正電荷）。該帶電荷的scFv視需要包含胺基酸序列，該胺基酸序列選自：IRPRAIGGSKPRVA（SEQ ID NO: 145）、GKGGSGKGGSGKGGS（SEQ ID NO: 146）、GGKGSGGKGSGGKGS（SEQ ID NO: 147）、GGGKSGGGKSGGGKS（SEQ ID NO: 148）、GKGKSGKGKSGKGKS（SEQ ID NO: 149）、GGGKSGGKGSGKGGS（SEQ ID NO: 150）、GKPGSGKPGSGKPGS（SEQ ID NO: 151）、GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS（SEQ ID NO: 152）、或GKGKSGKGKSGKGKSGKGKS（SEQ ID NO: 153）。在多個方面，scFv包含胺基酸序列GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS（SEQ ID NO: 152）。

在示例性方面，scFv包含與本文提供的序列（例如，SEQ ID NO: 4-6、8-10、11-17、21、23-25、27-29、30-35、170-173、和174-176中任一個或多個的CDR序列；SEQ ID NO: 3、7、22、26、41、42、45、46、49、50、53、54、57、58、61、62、65、66、69、70、73、74、77、78、81、82、85、86、89、90、93、94、97、98、101、102、105、106、109、110、113、114、117、118、121、122、125、126、129、130、133、134、137、138、141、142、169、173、和182-186中任一個或多個的可變區序列；SEQ ID NO: 143-168中任一個的scFv連接子序列；和/或SEQ ID NO: 19、20、38、40、43、44、47、48、51、52、55、56、59、60、63、64、67、68、71、72、75、76、79、80、83、84、87、88、91、92、95、96、99、100、104、104、107、108、111、112、115、116、119、120、123、124、127、128、131、132、135、136、139、和140中任一個的scFv序列）中任一個具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、或具有高於約90%（例如，約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%）序列同一性的CDR序列、可變區序列、scFv連接子序列、或scFv序列。例如，scFv可以包含如在SEQ ID NO: 4-6、8-10、11-17、21、23-25、27-29、30-35、170-173、和174-176中任一個或多個中列出的CDR序列，但包含一個或兩個胺基酸取代。可替代地，在多個方面，scFv可以包含可變區序列，該等可變區序列關於SEQ ID NO: 3、7、22、26、41、42、45、46、49、50、53、54、57、58、61、62、65、66、69、70、73、74、77、78、81、82、85、86、89、90、93、94、97、98、101、102、105、106、109、110、113、114、117、118、121、122、125、126、129、130、133、134、137、138、141、142、169、173、或182-186被修飾，其中該等修飾係在CDR序列外。

在多個方面，異源二聚體抗體的第一可變重鏈結構域和第二可變重鏈結構域包含本文所述的抗STEAP1 CDR或可變區序列。例如，在一些實施方式中，異源二聚體抗體的第一可變重鏈結構域和第二可變重鏈結構域包含：含有SEQ ID NO: 14的vhCDR1、含有SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 21的vhCDR2、和含有SEQ ID NO: 16的vhCDR3；並且可變輕鏈結構域包含：含有SEQ ID NO: 11的vlCDR1、含有SEQ ID NO: 12的vlCDR2、和含有SEQ ID NO: 13的vlCDR3。可替代地，第一可變重鏈結構域和第二可變重鏈結構域包含：含有SEQ ID NO: 33的vhCDR1、含有SEQ ID NO: 34的vhCDR2、和含有SEQ ID NO: 35的vhCDR3；並且可變輕鏈結構域包含：含有SEQ ID NO: 30的vlCDR1、含有SEQ ID NO: 31的vlCDR2、和含有SEQ ID NO: 32的vlCDR3。在較佳的實施方式中，第一可變重鏈結構域和第二可變重鏈結構域包含SEQ ID NO: 182或SEQ ID NO: 184，並且可變輕鏈結構域包含SEQ ID NO: 183。可替代地，第一可變重鏈結構域和第二可變重鏈結構域包含SEQ ID NO: 185，並且可變輕鏈結構域包含SEQ ID NO: 186。

在本揭露的多個方面，異源二聚體抗體包含a) 含有SEQ ID NO: 19或20的序列的第一單體、含有SEQ ID NO: 18的序列的第二單體、和含有SEQ ID NO: 17的序列的共同輕鏈；或 b) 含有SEQ ID NO: 38的序列的第一單體、含有SEQ ID NO: 37的序列的第二單體、和含有SEQ ID NO: 36的序列的共同輕鏈。

在本揭露的多個方面，異源二聚體抗體包含：含有SEQ ID NO: 202或207的序列的第一單體、含有SEQ ID NO: 201或203的序列的第二單體、和含有SEQ ID NO: 200的序列的共同輕鏈（例如，含有SEQ ID NO: 202的序列的第一單體、含有SEQ ID NO: 201的序列的第二單體、和含有SEQ ID NO: 200的序列的輕鏈；或含有SEQ ID NO: 207的序列的第一單體、含有SEQ ID NO: 203的序列的第二單體、和含有SEQ ID NO: 200的序列的輕鏈）。可替代地；異源二聚體抗體可以包含：含有SEQ ID NO: 206的序列的第一單體、含有SEQ ID NO: 205的序列的第二單體、和含有SEQ ID NO: 204的序列的共同輕鏈。

在示例性方面，第一和/或第二可變重鏈結構域可以包含與本文提供的序列（例如，SEQ ID NO: 4-6、14-17、21、23-25、33-35、和170-172中任一個或多個的CDR序列；或SEQ ID NO: 3、22、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137、141、169、182、184、和185中任一個的可變區序列）中任一個具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、或具有高於約90%（例如，約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%）序列同一性的CDR序列或可變區序列。例如，第一和/或第二可變重鏈結構域可以包含如在SEQ ID NO: 4-6、14-17、21、23-25、33-35、和170-172中任一個或多個中列出的CDR序列，但包含一個或兩個胺基酸取代。可替代地，在多個方面，第一和/或第二可變重鏈結構域可以包含可變區序列，該等可變區序列關於SEQ ID NO: 3、22、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137、141、169 182、184、或185被修飾，其中該等修飾係在CDR序列外。類似地，在多個方面，可變輕鏈結構域可以包含與本文提供的序列（例如，SEQ ID NO: 8-10、11-13、27-29、30-32、和174-176中任一個或多個的CDR序列；或SEQ ID NO: 7、26、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、122、126、130、134、138、142、173、183、和186中任一個的可變區序列）中任一個具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、或具有高於約90%（例如，約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%）序列同一性的CDR序列或可變區序列。例如，可變輕鏈結構域可以包含如在SEQ ID NO: 8-10、11-13、27-29、30-32、和174-176中任一個或多個中列出的CDR序列，但包含一個或兩個胺基酸取代。可替代地，在多個方面，可變輕鏈結構域可以包含可變區序列，該等可變區序列關於SEQ ID NO: 7、26、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、122、126、130、134、138、142、173、183、或186被修飾，其中該等修飾係在CDR序列外。如果需要，該第一單體可以包含與本文提供的序列（SEQ ID NO: 19、20、38、202、206、或207）中任一個具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、或具有高於約90%（例如，約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%）序列同一性的胺基酸序列；該第二單體可以包含與本文提供的序列（SEQ ID NO: 18、199或37；或SEQ ID NO: 202、207、或206）中任一個具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、或具有高於約90%（例如，約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%）序列同一性的胺基酸序列；和/或該共同輕鏈可以包含與本文提供的序列（SEQ ID NO: 17、36、200、或204）中任一個具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、或具有高於約90%（例如，約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%）序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施方式中，使用全長異源二聚體抗體。藉由「全長」來表示構成抗體的天然生物形式的結構，包括可變區和恒定區，包括如本文所概述的一種或多種修飾。本揭露的異源二聚體抗體可以是單株的、合成的、嵌合的和/或人源化的。在異源二聚體抗體的上下文中的抗原結合抗體片段包含至少一個恒定結構域，該結構域可以被工程化以產生異源二聚體（例如pI工程化）。其他抗體片段包括含有一個或多個已經被pI工程化的本發明的CH1、CH2、CH3、鉸鏈和CL結構域的片段。例如，Fc融合體係與另一種蛋白質融合的Fc區（CH2和CH3，視需要具有鉸鏈區）的融合體。許多Fc融合體係本領域已知的，並且可以藉由添加本發明的異源二聚體化變體來改善。可以製備包含CH1；CH1、CH2和CH3；CH2；CH3；CH2和CH3；CH1和CH3的抗體融合體，其中任何或所有可以視需要與鉸鏈區一起使用，利用本文所述的異源二聚體化變體的任何組合。

本揭露的該等抗原結合蛋白（包含異源二聚體抗體）通常是分離的或重組的。編碼本文所述的異源二聚體抗體的全部或部分的核酸、載體、和宿主細胞係本文所述的，並預期作為本揭露的一部分。抗體結構/Fc區修飾

本揭露包括具有修飾的Fc變體的抗體，該等變體具有相對於野生型抗體序列的胺基酸修飾。根據組成它們的胺基酸修飾來定義該等變體。因此，例如，N434S或434S係相對於親本Fc多肽在位置434處具有取代絲胺酸的Fc變體，其中根據EU索引編號。同樣，M428L/N434S定義了相對於親本Fc多肽具有取代M428L和N434S的Fc變體。野生型胺基酸的同一性可以是未指明的，在這種情況下，前述變體被稱為428L/434S。提供的取代的順序係任意的，即，例如，428L/434S係與M428L/N434S相同的Fc變體，等等。修飾可以是添加、缺失、或取代。取代可包括天然存在的胺基酸，並且在某些情況下，可包括合成胺基酸。實例包括美國專利案號6,586,207；美國專利公開案號20040214988；國際專利公開案號WO 98/48032、WO 03/073238、WO 05/35727A2、和WO 05/74524A2；J. W. Chin等人., (2002), Journal of the American Chemical Society [美國化學學會雜誌] 124:9026-9027；J. W. Chin和P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem [化學生物化學] 11:1135-1137；J. W. Chin, 等人., (2002), PICAS United States of America [PICAS美利堅合眾國] 99:11020-11024；以及L. Wang和P. G. Schultz, (2002), Chem. [化學]1-10，均藉由引用以全文併入。

對於在本揭露中所討論的與抗體和其他抗原結合蛋白有關的所有位置，除非另外指出，胺基酸位置編號係根據EU索引進行。EU索引或如在Kabat或EU編號方案中的EU索引係指EU抗體的編號（Edelman 等人, 1969, Proc Natl Acad Sci USA [美國科學院院刊] 63:78-85, 將其全文藉由引用併入本文）。例如，應理解，每個可變重鏈區（VH）和可變輕鏈區（VL）由三個高變區（「互補決定區」，「CDR」）和四個FR組成，按以下順序從胺基末端到羧基末端排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。高變區通常涵蓋在輕鏈可變區中從約胺基酸殘基24至34（LCDR1；「L」表示輕鏈）、50至56（LCDR2）和89至97（LCDR3）和在重鏈可變區中約31至35B（HCDR1；「H」表示重鏈）、50至65（HCDR2）和95至102（HCDR3）的胺基酸殘基；Kabat等人.,SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, [免疫學目的蛋白的序列，第5版，公共衛生服務，美國國立衛生研究院], 貝塞斯達，馬里蘭州（Bethesda, Md.）(1991)和/或形成高變環的那些殘基（例如，輕鏈可變區中的殘基26-32（LCDR1）、50-52（LCDR2）和91-96（LCDR3）以及重鏈可變區中的26-32（HCDR1）、53-55（HCDR2）和96-101（HCDR3）；Chothia和Lesk (1987) J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 196:901-917）。

如熟悉該項技術者所理解的，在不同編號系統之間CDR的確切編號和放置可以是不同的。然而，應該理解，可變重鏈和/或可變輕鏈序列的揭露內容包括相關的（固有的）CDR的揭露內容。因此，每個可變重鏈區的揭露內容係vhCDR（例如vhCDRl、vhCDR2和vhCDR3）的揭露內容，並且每個可變輕鏈區的揭露內容係vlCDR（例如vlCDRl、vlCDR2和vlCDR3）的揭露內容。CDR編號的有用比較如下，，參見Lafranc等人, Dev. Comp. Immunol. [發育和比較免疫學] 27(l):55-77 (2003)：

在整個說明書中，當提及可變結構域中的殘基時（大約係輕鏈可變區的殘基1-107和重鏈可變區的殘基1-113），通常使用Kabat編號系統（例如，Kabat等人., 同上 (1991)）。

每條鏈的羧基末端部分限定恒定區，主要負責效應子功能。Kabat等人收集了重鏈和輕鏈可變區的許多一級序列。基於序列的保守程度，他們將各個一級序列分類為CDR和框架並做出其列表（參見SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication [免疫學目的序列，第5版，NIH出版], 第91-3242號, E.A. Kabat等人., 藉由引用以全文併入）。

在免疫球蛋白的IgG亞類中，重鏈中存在若干個免疫球蛋白結構域。藉由本文中的「免疫球蛋白（Ig）結構域」來表示具有不同三級結構的免疫球蛋白區域。令人感興趣的是重鏈結構域，包括恒定重鏈（CH）結構域和鉸鏈結構域。在IgG抗體的背景下，IgG同種型各自具有三個CH區域。因此，在IgG上下文中的「CH」結構域如下：根據如在Kabat中的EU索引，「CH1」係指位置118-220。根據如在Kabat中的EU索引，「CH2」係指位置237-340，並且如在Kabat中根據EU索引，「CH3」係指位置341-447。如本文所示和下文所述，該等pI變體可以在下面討論的一個或多個CH區中以及鉸鏈區中。在多個方面，本文描述的序列始於CH1區，位置118；除非另有說明，否則不包括可變區。

重鏈Ig結構域的另一種類型係鉸鏈區。藉由本文中的「鉸鏈」或「鉸鏈區」或「抗體鉸鏈區」或「免疫球蛋白鉸鏈區」意指包含在抗體的第一和第二恒定結構域之間的胺基酸的柔性多肽。結構上，IgG CH1結構域在EU位置220處終止，並且IgG CH2結構域在殘基EU位置237處開始。因此，對於IgG，抗體鉸鏈在本文中被定義為包括位置221（IgG1中的D221）至236（IgG1中的G236），其中該編號係根據如在Kabat中的EU索引。在一些實施方式中，例如在Fc區的上下文中，包括下鉸鏈，其中該「下鉸鏈」通常指位置226或230。如本文所述，pI變體也可以在鉸鏈區中製備。

藉由如本文所使用的「Fc」或「Fc區」或「Fc結構域」來表示包含抗體恒定區的多肽，該抗體恒定區不包括第一恒定區免疫球蛋白結構域，並且在一些情況不包括鉸鏈的一部分。因此，Fc係指IgA、IgD和IgG的最後兩個恒定區免疫球蛋白結構域，IgE和IgM的最後三個恒定區免疫球蛋白結構域，以及在該等結構域的N末端的柔性鉸鏈。對於IgA和IgM，Fc可以包括J鏈。對於IgG，Fc結構域包含免疫球蛋白結構域Cγ2和Cγ3（Cγ2和Cγ3）以及Cγ1（Cγ1）和Cγ2（Cγ2）之間的下鉸鏈區。儘管Fc區的邊界可以變化，人IgG重鏈Fc區通常定義為在其羧基末端包括殘基C226或P230，其中根據如在Kabat中的EU索引進行編號。

可以將胺基酸變體引入本揭露的抗原結合蛋白（例如，雙特異性抗體）中以添加額外的官能性。例如，可以添加Fc區內的胺基酸變化（對一個單體或兩者），以促進增加的ADCC或CDC（例如，改變與Fcγ受體的結合），以允許或增加添加毒素和藥物的產量（例如，對於ADC），以及增加與FcRn的結合和/或增加所得分子的血清半衰期。可藉由改變胺基酸序列調節的效應子功能包括但不限於ADCC、ADCP和CDC。本文概述的任何和所有變體可以視需要和獨立地與其他變體組合。

藉由「FcRn」或「新生兒Fc受體」來表示結合IgG抗體Fc區並且至少部分地由FcRn基因編碼的蛋白質。FcRn可以來自任何生物，包括但不限於人、小鼠、大鼠、兔和猴。如本領域所知，功能性FcRn蛋白包含兩個多肽，通常稱為重鏈和輕鏈。該輕鏈係β-2-微球蛋白，並且該重鏈由FcRn基因編碼。除非本文另有說明，否則FcRn或FcRn蛋白係指FcRn重鏈與β-2-微球蛋白的複合物。使用多種FcRn變體來增加與FcRn受體的結合，並且在一些情況下，用於增加血清半衰期。賦予與FcRn受體的增加的結合和血清半衰期的相應增加的Fc變體包括但不限於，434A、434S、428L、308F、259I、428L/434S、259I/308F、436I/428L、436I或V/434S、436V/428L、252Y、252Y/254T/256E和259I/308F/428L。為清楚起見，由於每條重鏈不同，FcRn變體（以及Fc變體）可以存在於一個或兩個單體上。

另一類別的功能性變體係「Fcγ消融變體」或「Fc敲除（FcKO或KO）變體」。在該等實施方式中，對於一些治療應用，期望減少或去除Fc結構域與一種或多種或全部Fcγ受體（例如，FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等）的正常結合，以避免另外的作用機制。藉由「Fcγ受體」、「FcγR」或「FcgammaR」來表示結合IgG抗體Fc區並由FcγR基因編碼的蛋白質家族的任何成員。在人中，該家族包括但不限於FcγRI（CD64），包括同種型FcγRIa、FcγRIb、和FcγRIc；FcγRII（CD32），包括同種型FcγRIIa（包括同種異型H131和R131）、FcγRIIb（包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2），和FcγRIIc；以及FcγRIII（CD16），包括同種型FcγRIIIa（包括同種異型V158和F158）和FcγRIIIb（包括同種異型FcγRIIb-NA1和FcγRIIb-NA2）（Jefferis等人., 2002, Immunol Lett [免疫學通訊]82:57-65, 藉由引用以全文併入）。FcγR可以來自任何生物，包括但不限於人、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcγR包括但不限於FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、FcγRIII（CD16）、和FcγRIII-2（CD16-2）。在許多實施方式中，通常需要消融FcγRIIIa結合以消除或顯著降低ADCC活性。美國專利案號9,822,186的圖36描述了Fc敲除（或消融變體）之用途，該用途保留了野生型穩定性但去除了所有FcγR結合。

代表性的消融變體包括選自下組的那些，該組由以下組成：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G、和E233P/L234V/L235A/G236del。應注意，本文引用的消融變體消融FcyR結合，但通常不消除FcRn結合。

如本領域已知的，人IgG1的Fc結構域與Fγ受體具有最高結合，並因此當異源二聚體抗體主鏈中的恒定結構域（或Fc結構域）係IgG1時，可以使用消融變體。可替代地，或除了IgGl背景中的消融變體之外，例如，在糖基化位置297處的突變（通常為A或S）可顯著消融與FcγRIIIa的結合。人IgG2和IgG4具有天然降低的與Fcγ受體的結合，因此該等主鏈可以與消融變體一起使用或不與消融變體一起使用。

脫醯胺可嚴重影響抗體活性和穩定性。在多個方面，異源二聚體抗體包含一個或多個取代以去除脫醯胺位點。在這方面，異源二聚體抗體視需要包含在位置N67處的取代，例如取代N67Q。異源二聚體重鏈恒定區

本揭露提供了基於使用含有變體重鏈恒定區作為第一結構域的單體的異源二聚體抗體。藉由本文中的「單體」來表示異源二聚體蛋白的一半。應注意，傳統抗體實際上係四聚體（兩條重鏈和兩條輕鏈）。為了便於參考，在本揭露的上下文中，包含重鏈和輕鏈的配對被認為係「單體」。包含scFv（並且在一些情況下為Fab）的重鏈區被認為係單體。基本上，每個單體包含足夠的重鏈恒定區以允許異源二聚體工程化（無論是整個恒定區，例如CH1-鉸鏈-CH2-CH3，Fc區（CH2-CH3），還是僅CH3結構域）。

該等變體重鏈恒定區可包含全部或部分重鏈恒定區，包括全長構建體、CH1-鉸鏈-CH2-CH3、或其部分，包括例如單獨的CH2-CH3或CH3。另外，每個單體的重鏈區可以是相同的主鏈（CH1-鉸鏈-CH2-CH3或CH2-CH3）或不同的。N末端和C末端平截和添加也包括在定義內；例如，一些pI變體包括向重鏈結構域的C末端添加帶電荷的胺基酸。

除了本文概述的異源二聚體化變體（例如，空間變體和pI變體）之外，該等重鏈區還可以包含額外的胺基酸取代，包括用於改變FcγR和FcRn結合的變化。

異源二聚體化變體包括許多不同類型的變體，包括但不限於空間變體（包括帶電荷的變體）和pI變體，該等變體可以視需要和獨立地與任何其他變體組合。在該等實施方式中，重要的是使「單體A」與「單體B」匹配，即，如果異源二聚體蛋白依賴於空間變體和pI變體二者，則該等需要與每個單體正確匹配，例如，有效的空間變體組（1組在單體A上，1組在單體B上）與pI變體組組合（1組在單體A上，1組在單體B上），使得每種單體上的該等變體被設計成實現所希望的功能。在例如空間變體也可以改變電荷的情況下，正確的組必須與正確的單體匹配。

本文概述的異源二聚體化變體（例如，包括但不限於圖中所示的那些變體）可以視需要和獨立地與任何其他變體組合，並且在任何其他單體上。對於異源二聚體化而言重要的是存在變體的「組」，針對一個單體的一組和針對另一個單體的一組。無論該等係組合的1對1（例如，單體1列表可以一起）還是轉換的（單體1 pI變體與單體2 空間變體），係無關緊要的。然而，當如上概述進行組合時，應保留「股態（strandedness）」，使得異源二聚體化係有利的；例如，增加pI的帶電荷的變體應該與增加的pI變體和/或具有增加的pI的scFv連接子等一起使用。藉由在異源二聚體蛋白單體的上下文中的「股態」來表示，與「匹配」的兩條DNA股類似，將異源二聚體化變體摻入每個單體中，以保持「匹配」的能力從而形成異源二聚體。例如，如果將一些pI變體工程化為單體A（例如，使pI更高），則還可以利用的空間變體（係「電荷對」）不會干擾pI變體，例如，使pI更高的帶電荷的變體放在相同的「股」或「單體」上以保持兩種官能性。此外，對於另外的Fc變體（例如FcγR結合、FcRn結合、消融變體等），單體或兩個單體可以獨立地並視需要包括任何列出的變體。在一些情況下，兩個單體都具有另外的變體，並且在一些情況下，僅一個單體具有另外的變體，或者它們可以組合。空間變體

在一些實施方式中，藉由添加空間變體促進異源二聚體的形成。即，藉由改變每條重鏈中的胺基酸，不同的重鏈更可能聯合以形成異源二聚體結構而不是形成具有相同Fc胺基酸序列的同源二聚體。代表性的合適的空間變體顯示在圖中。

用於產生空間變體的一種機制係上述「杵臼」機制。發現用於生成異源二聚體的另一種機制有時被稱為「靜電轉向」，如描述於Gunasekaran 等, J. Biol. Chem.[生物化學雜誌] 285(25):19637 (2010)中，將其整體藉由引用併入本文。這有時在本文中稱為「電荷對」。在該實施方式中，靜電用於使形成偏斜異二聚化。該等也可能對pI有影響，並且因此對純化也有影響，並且因此在某些情況下也可以考慮pI變體。然而，由於產生該等以強制異二聚化並且不用作純化工具，因此它們被歸類為「空間變體」。該等包括但不限於，導致高於75%異源二聚體化的變體，例如與D221R/P228R/K409R（例如，該等係「單體對應組」）配對的D221E/P228E/L368E以及與C220R/E224R/P228R/K409R配對的C220E/P228E/368E。

在一些實施方式中，基於「杵臼」機制和「靜電轉向」機制，偏斜變體有利地且同時地偏好異源二聚體化。這些變體以「組」的「對」出現。即，該對中的一組摻入第一單體並且該對中的另一組摻入第二單體。應該注意到，這些組的行為不是必須像「杵臼」變體（在一個單體上的殘基與另一個單體上的殘基之間具有一對一的對應關係）那樣。也就是說，這些組的對可以反而在兩個單體之間形成介面，該介面促進異源二聚體的形成並阻止同源二聚體的形成，這允許在生物條件下自發形成的異源二聚體的百分比超過90%，而不是預期的50%（25%同源二聚體A/A : 50%異源二聚體A/B : 25%同源二聚體B/B）。「偏斜」變體的示例性異源二聚體化在圖4中描述。這種偏斜變體的實例包括配對的突變組，包括但不限於S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411T/E360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S : S364K/E357Q；和T366S/L368A/Y407V : T366W（視需要包括橋接二硫化物，T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C）。

另外的單體A和單體B變體可以與任選地且獨立地以任何量的其他變體組合，例如本文概述的pI變體或美國公開案號2012/0149876的圖37（該圖和其中的圖例通過引用明確地併入本文）中所示的其他空間變體。

在一些實施實施方式中，本文概述的空間變體可任選地且獨立地與任何異源二聚化變體，包括pI變體（或其他變體，例如Fc變體，FcRn變體，消融變體等）摻入到一個或兩個單體中。針對異源二聚體的pI（等電點）變體

通常，有兩種類別的pI變體：增加蛋白質pI的那些（鹼性變化）和降低蛋白質pI的那些（酸性變化）。如本文所述，可以進行該等變體的所有組合：一個單體可以是野生型，或者係不顯示與野生型顯著不同的pI的變體，並且另一個可以是更鹼性或更酸性的。可替代地，改變每個單體，一個更鹼性，並且一個更酸性。pI變體的示例性組合顯示在圖中。

在多個實施方式中，例如在圖18A，E、F、G、H和I型式中，pI變體的較佳的組合具有包含208D/295E/384D/418E/421D變體（當相對於人IgGl時的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D）的一個單體（負電荷Fab側）以及包含帶正電荷的scFv連接子（包括(GKPGS)₄ ）的第二單體（正電荷scFv側）。然而，如熟悉該項技術者所理解的，第一單體包括CH1結構域，包括位置208。因此，在不包含CH1結構域的構建體中（例如對於在其中一個結構域上不利用CH1結構域的抗體，例如處於雙scFv型式或「單臂」型式，例如在圖18B、C或D中描繪的那些），較佳的負電荷pI變體Fc組包括295E/384D/418E/421D變體（當相對於人IgGl時，Q295E/N384D/Q418E/N421D）。酸性pI變化

當使包含變體重鏈恒定結構域的一個單體更具正電荷時（例如，降低pI），一個或多個以下的修飾（例如，取代）在本揭露的上下文中是適合的：S119E、K133E、K133Q、T164E、K205E、K205Q、N208D、K210E、K210Q、K274E、K320E、K322E、K326E、K334E、R355E、K392E、K447的缺失、在C末端處添加DEDE肽、G137E、N203D、K274Q、R355Q、K392N、和Q419E。該等變化相對於IgG1描述，但所有同種型以及同種型雜合體都可以藉由這種方式改變。在重鏈恒定結構域來自IgG2-4的情況下，也可以使用R133E和R133Q。鹼性pI變化

當使包含變體重鏈恒定結構域的一個單體更具負電荷（例如，增加pI）時，以下示例性取代中的一個或多個在本揭露的上下文中是適合的：Q196K、P217R、P228R、N276K、和H435R。該等變化相對於IgG1描述，但所有同種型以及同種型雜合體都可以藉由這種方式改變。異源二聚體抗體輕鏈變體

還可以在抗體輕鏈中製備pI變體。用於降低輕鏈pI的胺基酸修飾包括但不限於，K126E、K126Q、K145E、K145Q、N152D、S156E、K169E、S202E、K207E和在輕鏈的C末端處添加DEDE肽。基於恒定λ輕鏈的該類別中的變化包括但不限於在R108Q、Q124E、K126Q、N138D、K145T、和Q199E處的一個或多個取代。另外，增加輕鏈的pI也是可能的並且在本揭露的多個方面中考慮。同種型變體

另外，本揭露的多個實施方式需要將在特定位置處的pI胺基酸從一種IgG同種型「輸入」到另一種IgG同種型中，從而減少或消除將不需要的免疫原性引入變體中的可能性。該等變體中的許多顯示在美國專利公開案號2014/0370013的圖21中，在此藉由引用併入。換言之，IgG1係用於治療性抗體的常見同種型，其原因有多種，包括高效應子功能。然而，IgG1的重鏈恒定區具有比IgG2更高的pI（8.10對7.31）。藉由將特定位置處的IgG2殘基引入IgG1主鏈，所得單體的pI降低（或增加）並且另外表現出更長的血清半衰期。例如，IgG1在位置137處具有甘胺酸（pI 5.97），並且IgG2具有麩胺酸（pI 3.22）；輸入的麩胺酸將影響所得蛋白質的pI。通常需要許多胺基酸取代來顯著影響變體抗體的pI。然而，應該注意如下的討論，即使IgG2分子的變化也允許增加血清半衰期。

在其他實施方式中，進行非同種型胺基酸改變，以減少所得蛋白質的總電荷狀態（例如，藉由將更高的pI胺基酸改變為更低的pI胺基酸）或允許在結構中適應穩定性，等等。

另外，藉由pI工程化重鏈和輕鏈恒定結構域，可以觀察到異源二聚體的每個單體中的顯著變化。如本文所討論的，使兩個單體的pI相差至少0.5可以允許藉由離子交換層析或等電聚焦或對等電點敏感的其他方法進行分離。

另外，可以產生電子等排的pI變體，例如與親本胺基酸大致相同大小的帶電荷的變體，並且在本文中考慮。計算pI

每個單體的pI可取決於變體重鏈恒定結構域的pI和總單體的pI，包括變體重鏈恒定結構域和融合配偶體。因此，在一些實施方式中，在變體重鏈恒定結構域的基礎上計算pI中的變化。可替代地，可以比較每個單體的pI。類似地，計算「起始」可變區（例如，scFv或Fab）的pI以告知哪個單體將在哪個方向上被工程化。 pI變體在體內賦予更好的FcRn結合

降低單體pI的pI變體可顯示出改善體內血清滯留的附加益處。

據信Fc區在體內具有更長的半衰期，因為在內體中在pH 6下與FcRn的結合螯合Fc（Ghetie和Ward, 1997 Immunol Today. [當代免疫]18(12): 592-598，在此藉由引用併入）。然後，內體區室將Fc再循環至細胞表面。一旦區室向細胞外空間打開，較高的pH（約7.4）誘導Fc釋放回血液中。認為Fc在pH 7.4下對FcRn的親和力增加禁止將Fc釋放回血液中。因此，將在體內增加Fc半衰期的Fc突變將理想地在較低的pH下增加FcRn結合，同時仍允許在較高pH下釋放Fc。胺基酸組胺酸在6.0至7.4的pH範圍內改變其電荷狀態。因此，在Fc/FcRn複合物的重要位置處發現His殘基並不奇怪。

最近提出，具有較低等電點的可變區的抗體還可以具有更長的血清半衰期（Igawa等人., 2010 PEDS. 23(5): 385-392，藉由引用以全文併入）。具有降低的pI和延長的半衰期的恒定區變體提供了更加模組化的方法來改善抗體的藥物動力學特性。

在附圖中揭露了可用於該實施方式的pI變體，以及它們用於純化優化的用途。變體的組合

如熟悉該項技術者所理解的，所有所述的異源二聚體化變體可以視需要並獨立地以任何方式組合，只要它們保持其「股態」或「單體分配」即可。另外，所有該等變體可以組合成任何異源二聚體化型式。在pI變體的情況下，雖然在附圖中示出了示例性實施方式，但是可以根據改變兩個單體之間的pI差異以促進純化的基本規則產生其他組合。抗原結合蛋白（例如，抗體）型式

可用於本揭露上下文中的一種異源二聚體支架係如上所述和在圖18中列出的「三聯的F」或「開瓶器」支架型式。在該實施方式中，抗體的一條重鏈包含單鏈Fv（「scFv」，如下定義），並且另一條重鏈係「規則的」Fab型式，包含可變重鏈和輕鏈。本文概述的許多實施方式通常依賴於開瓶器型式，該開瓶器形式包含含有scFv的第一單體，該scFv包含可變重鏈結構域和可變輕鏈結構域，使用scFv連接子（在許多但非全部實例中帶電荷）共價附接，其中該scFv通常藉由結構域連接子（如本文所概述該結構域連接子可以是未帶電荷的或帶電荷的，並且可以是外源的或內源的（例如全部或部分天然的鉸鏈結構域））共價附接至第一Fc結構域的N末端。開瓶器型式的第二單體係重鏈，並且組成物進一步包含輕鏈。

另外，開瓶器型式的Fc結構域通常包含偏斜變體（例如，選自由以下各項組成之群組：S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411T/E360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S : S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V : T366W；和T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C），視需要包含消融變體，視需要包含帶電荷的scFv連接子，以及包含pI變體的重鏈。在一些實施方式中，該開瓶器型式包括偏斜變體、pI變體、和消融變體。因此，一些實施方式包括開瓶器型式，該等開瓶器型式包含：a) 第一單體（「scFv單體」），其包含帶電荷的scFv連接子、偏斜變體S364K/E357Q、消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、和Fv；b) 第二單體（「Fab單體」），其包含偏斜變體L368D/K370S、pI變體N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、和可變重鏈結構域（與可變輕鏈結構域構成結合第二抗原的Fv）；和c) 輕鏈。

在一些實施方式中，該開瓶器型式包括偏斜變體、pI變體、消融變體、和FcRn變體。因此，一些實施方式包括開瓶器型式，該等開瓶器型式包含：a) 第一單體（「scFv單體」），其包含帶電荷的scFv連接子、偏斜變體S364K/E357Q、消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn變體 M428L/N434S、和結合第一抗原的Fv；b) 第二單體（「Fab單體」），其包含偏斜變體L368D/K370S、pI變體、N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn變體M428L/N434S、和可變重鏈結構域（與可變輕鏈結構域構成結合第二抗原的Fv）；和c) 輕鏈。

可用於本揭露的另一種異源二聚體支架係圖18H中所示的mAb-Fv型式。在該實施方式中，該型式依賴於使用「額外的」可變重鏈結構域與一個單體的C末端附接和「額外的」可變輕鏈結構域與另一個單體的C末端附接，因此形成第三抗原結合結構域，其中兩個單體的Fab部分結合一個抗原，並且「額外的」scFv結構域結合不同抗原。

在該實施方式中，第一單體包含：含有第一可變重鏈結構域的第一重鏈，以及含有第一Fc結構域的第一恒定重鏈結構域，其中使用結構域連接子（vhl-CHl-[結構域連接子（例如，鉸鏈）]-CH2-CH3-[視需要的結構域連接子]-vl2），第一可變輕鏈結構域共價附接至第一Fc結構域的C末端。第二單體包含：含有第二Fc結構域的第二恒定重鏈結構域的第二可變重鏈結構域，和使用結構域連接子（vhl-CHl-結構域連接子（例如，鉸鏈）-CH2-CH3-[視需要的結構域連接子]-vh2）共價附接至第二Fc結構域的C末端的第三可變重鏈結構域。兩個C末端附接的可變結構域構成scFv。該實施方式進一步利用包含可變輕鏈結構域和恒定輕鏈結構域的共同輕鏈，其與重鏈結合以形成兩個相同的Fab。對於本文的許多實施方式，該等構建體包括如所希望的和本文所述的偏斜變體、pI變體、消融變體、另外的Fc變體等。

視需要，mAb-Fv型式的Fc結構域包含偏斜變體（例如，選自由以下各項組成之群組：S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411T/E360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L，K370S : S364K/E357Q，T366S/L368A/Y407V : T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C），視需要包含消融變體，視需要包含帶電荷的scFv連接子，以及包含pI變體的重鏈。在一些實施方式中，該mAb-Fv型式包括偏斜變體、pI變體、和消融變體。因此，一些實施方式包括開瓶器型式，該等開瓶器型式包含：a) 第一單體，其包含偏斜變體S364K/E357Q、消融變體233P/L234V/L235A/G236del/S267K、和第一可變重鏈結構域（與輕鏈的第一可變輕鏈結構域構成結合抗原的Fv），以及第二可變重鏈結構域；b) 第二單體，其包含偏斜變體L368D/K370S、pI變體N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、和第一可變重鏈結構域（與第一可變輕鏈結構域構成結合第一抗原的Fv），以及第二可變輕鏈（與第二可變重鏈一起形成結合第二抗原的Fv）；和c) 包含第一可變輕鏈結構域和恒定輕鏈結構域的輕鏈。

可用於本揭露的又另一種異源二聚體支架係圖18I中顯示的mAb-scFv型式。在該實施方式中，該型式依賴於使用scFv與其中一個單體的C末端附接，因此形成第三抗原結合結構域，其中兩個單體的Fab部分結合一個抗原，並且「額外的」scFv結構域結合不同抗原。在該實施方式中，第一單體包含第一重鏈（包含可變重鏈結構域和恒定結構域），其中包含scFv可變輕鏈結構域、scFv連接子、和scFv可變重鏈結構域的C末端共價附接的scFv處於任一取向(vhl-CHl-結構域連接子-CH2-CH3-[視需要的結構域連接子] -vh2-scFv連接子-vl2或vhl-CHl-結構域連接子-CH2-CH3-[視需要的結構域連接子] -vl2-scFv連接子-vh2）。該實施方式進一步利用包含可變輕鏈結構域和恒定輕鏈結構域的共同輕鏈，其與重鏈結合以形成結合其中一個靶抗原的兩個相同的Fab。對於本文的許多實施方式，該等構建體包括如所希望的和本文所述的偏向變體、pI變體、消融變體、另外的Fc變體等。

另外，mAb-scFv型式的Fc結構域視需要包含偏斜變體（例如，選自由以下各項組成之群組：S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411T/E360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S : S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V : T366W；和T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C），視需要包含消融變體，視需要包含帶電荷的scFv連接子，以及包含pI變體的重鏈。在一些實施方式中，該mAb-scFv型式包括偏斜變體、pI變體、和消融變體。因此，一些實施方式包括以下型式，該等型式包含：a) 第一單體，其包含偏斜變體S364K/E357Q、消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、和第一可變重鏈結構域（與輕鏈的第一可變輕鏈結構域構成結合第一抗原的Fv），以及第二可變重鏈結構域；b) 第二單體，其包含偏斜變體L368D/K370S、pI變體N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、和第一可變重鏈結構域（與第一可變輕鏈結構域構成結合第一抗原的Fv），以及第二可變輕鏈（與第二可變重鏈一起形成結合第二抗原的Fv）；和c) 包含第一可變輕鏈結構域和恒定輕鏈結構域的輕鏈。

可用於本揭露的又另一種異源二聚體支架係圖18F中顯示的中心-scFv或「XmAb²⁺¹ 」型式。該型式依賴於使用插入的scFv結構域，因此形成第三抗原結合結構域，其中兩個單體的Fab部分結合一個靶標，並且「額外」scFv結構域結合另一個。將scFv結構域插入該等單體中的一個的Fc結構域和CH1-Fv區之間，因此提供第三抗原結合結構域。在該實施方式中，一種單體包含第一重鏈，該第一重鏈包含第一可變重鏈結構域、CH1結構域（和視需要的連接子/鉸鏈）和Fc結構域，其中scFv包含scFv可變輕鏈結構域、scFv連接子和scFv可變重鏈結構域。使用視需要的結構域連接子（VHl-CHl-[視需要的結構域連接子] -VH2-scFv連接子-VL2-[包括鉸鏈的視需要的結構域連接子]-CH2-CH3，或針對scFv的相反取向，VHl -CH1 -[視需要的結構域連接子] -VL2-scFv連接子-VH2-[包括鉸鏈的視需要的結構域連接子] -CH2-CH3），scFv在重恒定結構域CH1結構域的C末端和第一Fc結構域的N末端之間共價附接。在一些實施方式中，第一單體係VH1-CH1結構域連接子-VH2-scFv連接子-VL2-結構域連接子-CH2-CH3。其他單體係標準Fab側（即VH1-CH1-結構域連接子（例如，鉸鏈）-CH2-CH3）。該實施方式進一步利用包含可變輕鏈結構域和恒定輕鏈結構域的共同輕鏈，其與重鏈結合以形成結合靶標的兩個同一的Fab。對於本文的許多實施方式，該等構建體包括如所希望的和本文所述的偏斜變體、pI變體、消融變體、另外的Fc變體等。

在多個方面，抗原結合蛋白包含第一重鏈，該第一重鏈包含VHl-CHl-[結構域連接子] -VH2-scFv連接子-VL2-[結構域連接子（視需要包括鉸鏈）]-CH2-CH3；第二重鏈，該第二重鏈包含VH1-CH1-結構域連接子-CH2-CH3；和包含VL1的共同輕鏈；其中VH1和VL1結合STEAP1，並且VH2和VL2結合CD3。在該型式中，VH2視需要包含SEQ ID NO: 170（CDR1）、SEQ ID NO: 171（CDR2）、和SEQ ID NO: 172（CDR3）的CDR序列，而VL2包含SEQ ID NO: 174（CDR1）、SEQ ID NO: 175（CDR2）、和SEQ ID NO:176（CDR3）的CDR序列。VH1包含SEQ ID NO: 14（CDR1）、SEQ ID NO: 15或21（CDR2）、和SEQ ID NO: 16（CDR3）的CDR序列；並且VL1包含SEQ ID NO: 11（CDR1）、SEQ ID NO: 12（CDR2）、和SEQ ID NO: 13（CDR3）的CDR序列。可替代地，VH1包含SEQ ID NO: 33（CDR1）、SEQ ID NO: 34（CDR2）、和SEQ ID NO: 35（CDR3）的CDR序列；並且VL1包含SEQ ID NO: 30（CDR1）、SEQ ID NO: 31（CDR2）、和SEQ ID NO: 32（CDR3）的CDR序列。視需要，抗原結合蛋白包含第一重鏈中的修飾，所述修飾包括但不限於E233P、delL234、L235V、G236A、S267K、r292c、n297g、v302c、E357Q、和S364K（EU編號，小寫字母指示本文進一步描述的SEFL2取代），並且第二重鏈包含修飾，所述修飾包括但不限於N208D、E233P、delL234、L235V、G236A、S267K、r292c、Q295E、n297g、v302c、L368D、K370S、N384D、Q418E、和N421D（EU編號，小寫字母指示本文進一步描述的SEFL2取代）。用於本實施方式的上下文的連接子視需要為GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS（SEQ ID NO: 152）。

中心scFv型式的Fc結構域視需要包含偏斜變體（例如，選自由以下各項組成之群組：S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411T/E360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S : S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V : T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C），視需要包含消融變體，視需要包含帶電荷的scFv連接子，和包含pI變體的重鏈。在一些實施方式中，中心scFv型式包括偏斜變體、pI變體、和消融變體。因此，一些實施方式包括以下型式，該等型式包含：a) 第一單體，其包含偏斜變體S364K/E357Q、消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、和第一可變重鏈結構域（與輕鏈的第一可變輕鏈結構域構成結合第一靶標的Fv），以及第二可變重鏈結構域；b) 第二單體，其包含偏斜變體L368D/K370S、pI變體N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、和第一可變重鏈結構域（與第一可變輕鏈結構域構成結合第一靶標的Fv），以及第二可變輕鏈（與第二可變重鏈一起形成結合第二靶標的Fv）；和c) 包含第一可變輕鏈結構域和恒定輕鏈結構域的輕鏈。

可特別用於本揭露的另一種異源二聚體支架係圖l8G中所示的中心-Fv型式。該型式依賴於使用插入的scFv結構域，因此形成第三抗原結合結構域，其中兩個單體的Fab部分結合一個靶標，並且「額外」scFv結構域結合另一個。將scFv結構域插入單體的Fc結構域和CHl-Fv區之間，因此提供第三抗原結合結構域，其中每種單體包含scFv的組分（例如，一個單體包含可變重鏈結構域，並且另一個單體包含可變輕鏈結構域）。在該實施方式中，一個單體包含第一重鏈（該第一重鏈包含第一可變重鏈結構域、CH1結構域、和Fc結構域）以及另外的可變輕鏈結構域。使用結構域連接子（vhl -CHI -[視需要的結構域連接子]-vl2-鉸鏈-CH2-CH3），輕鏈結構域在重鏈恒定結構域CH1結構域的C末端和第一Fc結構域的N末端之間共價附接。其他單體包含第一重鏈，該第一重鏈包含第一可變重鏈結構域、CH1結構域、和Fc結構域、以及另外的可變重鏈結構域（vhl -CHI -[視需要的結構域連接子] -vh2-鉸鏈-CH2-CH3）。使用結構域連接子，將輕鏈結構域在重鏈恒定結構域的CH1結構域的C末端和第一Fc結構域的N末端之間共價附接。該實施方式進一步利用包含可變輕鏈結構域和恒定輕鏈結構域的共同輕鏈，其與重鏈結合以形成結合靶標的兩個相同的Fab。對於本文的許多實施方式，該等構建體包括如所希望的和本文所述的偏斜變體、pI變體、消融變體、另外的Fc變體等。

可用於本揭露上下文中的另外的異源二聚體支架係圖18C中所示的單臂中心-scFv型式。在該實施方式中，一個單體僅包含Fc結構域，而另一個單體使用插入的scFv結構域，因此形成第二抗原結合結構域。在該型式中，Fab部分結合一個靶標，並且scFv結合另一個靶標。將scFv結構域插入其中一個單體的Fc結構域和CHl-Fv區之間。在該實施方式中，一個單體包含第一重鏈，該第一重鏈包含第一可變重鏈結構域、CH1結構域和Fc結構域，其中scFv包含scFv可變輕鏈結構域、scFv連接子和scFv可變重鏈結構域。使用結構域連接子，將scFv在重恒定結構域的CH1結構域的C末端和第一Fc結構域的N末端之間共價附接。第二單體包含Fc結構域。該實施方式進一步利用包含可變輕鏈結構域和恒定輕鏈結構域的輕鏈，其與重鏈結合以形成Fab。對於本文的許多實施方式，該等構建體包括如所希望的和本文所述的偏斜變體、pI變體、消融變體、另外的Fc變體等。

另外，單臂中心-scFv型式的Fc結構域視需要包含偏斜變體（例如，選自由以下各項組成之群組：S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411T/E360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S : S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V : T366W；和T366S/L368A/Y407V Y349C : T366W/S354C），視需要包含消融變體，視需要包含帶電荷的scFv連接子，以及包含pI變體的重鏈。在一些實施方式中，該單臂中心-scFv型式包括偏斜變體、pI變體、和消融變體。因此，一些實施方式包括開瓶器型式，該等開瓶器型式包含：a) 第一單體，其包含偏斜變體S364K/E357Q、消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、和第一可變重鏈結構域（與輕鏈的第一可變輕鏈結構域構成結合第一靶標的Fv），以及第二可變重鏈結構域；b) 第二單體，其包含偏斜變體L368D/K370S、pI變體N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融變體E233P/L234V/L235A/ G236del/S267K、和第一可變重鏈結構域（與第一可變輕鏈結構域構成結合第一靶標的Fv），以及第二可變輕鏈（與第二可變重鏈一起形成結合第二靶標的Fv）；和c) 包含第一可變輕鏈結構域和恒定輕鏈結構域的輕鏈。在一些實施方式中，該單臂中心-scFv型式包括偏斜變體、pi變體、消融變體、和FcRn變體。因此，一些實施方式包括以下型式，該等型式包含：a) 第一單體，其包含偏斜變體S364K/E357Q、消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn變體M428L/N434S、和第一可變重鏈結構域（與輕鏈的第一可變輕鏈結構域構成結合第一靶標的Fv），以及第二可變重鏈結構域；b) 第二單體，其包含偏斜變體L368D/K370S、pi變體N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn變體M428L/N434S、和第一可變重鏈結構域（與第一可變輕鏈結構域構成結合如本文概述的第一靶標的Fv），以及第二可變輕鏈（與第二可變重鏈一起形成結合第二靶標的Fv）；和c) 包含第一可變輕鏈結構域和恒定輕鏈結構域的輕鏈。

可用於本揭露的另外的異源二聚體支架係圖18D中所示的單臂scFv-mAb型式。在該實施方式中，一個單體僅包含Fc結構域，而另一個單體使用在重鏈的N末端處附接的scFv結構域，所述附接通常藉由使用連接子：vh-scFv連接子-vl-[視需要的結構域連接子] -CHl-鉸鏈-CH2-CH3或（處於相反取向）vl-scFv連接子- vh-[視需要的結構域連接子] -CHl-鉸鏈-CH2-CH3。在該型式中，Fab部分結合一個靶標，並且scFv結合另一個靶標。該實施方式進一步利用包含可變輕鏈結構域和恒定輕鏈結構域的輕鏈，其與重鏈結合以形成Fab。對於本文的許多實施方式，該等構建體包括如所希望的和本文所述的偏斜變體、pI變體、消融變體、另外的Fc變體等。

單臂scFv-mAb的Fc結構域包含偏斜變體（例如，選自由以下各項組成之群組：S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411T/E360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S : S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V : T366W；和T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C），視需要包含消融變體，視需要包含帶電荷的scFv連接子，以及包含pi變體的重鏈。在一些實施方式中，該單臂scFv-mAb型式包括偏斜變體、pi變體、和消融變體。因此，一些實施方式包括開瓶器型式，該等開瓶器型式包含：a) 第一單體，其包含偏斜變體S364K/E357Q、消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、和第一可變重鏈結構域（與輕鏈的第一可變輕鏈結構域構成結合第一靶標的Fv），以及第二可變重鏈結構域；b) 第二單體，其包含偏斜變體L368D/K370S、pI變體N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、和第一可變重鏈結構域（與第一可變輕鏈結構域構成結合如本文概述的第一靶標的Fv），以及第二可變輕鏈（與第二可變重鏈一起形成結合第二靶標的Fv）；和c) 包含第一可變輕鏈結構域和恒定輕鏈結構域的輕鏈。在一些實施方式中，該單臂scFv-mAb型式包括偏斜變體、pI變體、消融變體、和FcRn變體。因此，一些實施方式包括開瓶器型式，該等開瓶器型式包含：a) 第一單體，其包含偏斜變體S364K/E357Q、消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn變體M428L/N434S、和第一可變重鏈結構域（與輕鏈的第一可變輕鏈結構域構成結合第一靶標的Fv），以及第二可變重鏈結構域；b) 第二單體，其包含偏斜變體L368D/K370S、pi變體N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn變體M428L/N434S、和第一可變重鏈結構域（與第一可變輕鏈結構域構成結合如本文概述的第一靶標的Fv），以及第二可變輕鏈（與第二可變重鏈一起形成結合第二靶標的Fv）；和c) 包含第一可變輕鏈結構域和恒定輕鏈結構域的輕鏈。

可用於本揭露的另一種異源二聚體支架係圖18E中所示的mAb-scFv型式。在該實施方式中，該型式依賴於使用scFv與其中一個單體的N末端附接，因此形成第三抗原結合結構域，其中這兩個單體的Fab部分結合一個靶標，並且「額外的」scFv結構域結合不同靶標。在該實施方式中，第一單體包含第一重鏈（包含可變重鏈結構域和恒定結構域），其中包含scFv可變輕鏈結構域、scFv連接子、和scFv可變重鏈結構域的N末端共價附接的scFv處於任一取向（（vhl-scFv連接子-vll -[視需要的結構域連接子]- vh2-CHl-鉸鏈-CH2-CH3）或（其中該scFv處於相反取向）（vll-scFv連接子-vhl-[視需要的結構域連接子]-vh2-CHl-鉸鏈-CH2-CH3））。該實施方式進一步利用包含可變輕鏈結構域和恒定輕鏈結構域的共同輕鏈，其與重鏈結合以形成結合其中一個靶抗原的兩個相同的Fab。對於本文的許多實施方式，該等構建體包括如所希望的和本文所述的偏斜變體、pi變體、消融變體、另外的Fc變體等。

scFv-mAb型式的Fc結構域視需要包含偏斜變體（例如，選自由以下各項組成之群組：S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411T/E360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S : S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V : T366W；和T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C），視需要包含消融變體，視需要包含帶電荷的scFv連接子，以及包含pI變體的重鏈。在一些實施方式中，該mAb-scFv型式包括偏斜變體、pI變體、和消融變體。因此，一些實施方式包括開瓶器型式，該等開瓶器型式包含：a) 第一單體，其包含偏斜變體S364K/E357Q、消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、和第一可變重鏈結構域（與輕鏈的第一可變輕鏈結構域構成結合第一靶標的Fv），以及第二可變重鏈結構域；b) 第二單體，其包含偏斜變體L368D/K370S、pi變體N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、和第一可變重鏈結構域（與第一可變輕鏈結構域構成結合如本文概述的第一靶標的Fv），以及第二可變輕鏈（與第二可變重鏈一起形成結合第二靶標的Fv）；和c) 包含第一可變輕鏈結構域和恒定輕鏈結構域的輕鏈。在一些實施方式中，該mAb-scFv型式包括偏斜變體、pI變體、消融變體和FcRn變體。因此，一些實施方式包括開瓶器型式，該等開瓶器型式包含：a) 第一單體，其包含偏斜變體S364K/E357Q、消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn變體M428L/N434S、和第一可變重鏈結構域（與輕鏈的第一可變輕鏈結構域構成結合第一靶標的Fv），以及第二可變重鏈結構域；b) 第二單體，其包含偏斜變體L368D/K370S、pI變體N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn變體M428L/N434S、和第一可變重鏈結構域（與第一可變輕鏈結構域構成結合第一靶標的Fv），以及第二可變輕鏈（與第二可變重鏈一起形成結合第二靶標的Fv）；和c) 包含第一可變輕鏈結構域和恒定輕鏈結構域的輕鏈。

本揭露還提供了雙scFv型式，例如在圖18B中所描繪。在該實施方式中，異源二聚體抗原結合蛋白由兩個scFv-Fc單體（兩個單體呈(vh-scFv連接子-vl-[視需要的結構域連接子] -CH2-CH3)型式或(vl-scFv連接子- vh- [視需要的結構域連接子]-CH2-CH3)型式，或其中一個單體處於一種取向並且另一個處於其他取向）構成。雙scFv型式的Fc結構域視需要包含偏斜變體（例如，選自由以下各項組成之群組：S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411T/E360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S : S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V : T366W；和T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C），視需要包含消融變體，視需要包含帶電荷的scFv連接子，以及包含pI變體的重鏈。

在一些實施方式中，該雙scFv型式包括偏斜變體、pI變體、和消融變體。因此，一些實施方式包括以下型式，該等型式包含：a) 第一單體，其包含偏斜變體S364K/E357Q、消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、和第一可變重鏈結構域（與輕鏈的第一可變輕鏈結構域構成結合第一靶標的Fv），以及第二可變重鏈結構域；b) 第二單體，其包含偏斜變體L368D/K370S、pi變體N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、和第一可變重鏈結構域（與第一可變輕鏈結構域構成結合如本文概述的第一靶標的Fv），以及第二可變輕鏈（與第二可變重鏈一起形成結合第二靶標的Fv）；和c) 包含第一可變輕鏈結構域和恒定輕鏈結構域的輕鏈。在一些實施方式中，該雙scFv型式包括偏斜變體、pI變體、消融變體、和FcRn變體。因此，一些實施方式包括開瓶器型式，該等開瓶器型式包含：a) 第一單體，其包含偏斜變體S364K/E357Q、消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn變體M428L/N434S、和第一可變重鏈結構域（與輕鏈的第一可變輕鏈結構域構成結合第一靶標的Fv），以及第二可變重鏈結構域；b) 第二單體，其包含偏斜變體L368D/K370S、pi變體N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn變體M428L/N434S、和第一可變重鏈結構域（與第一可變輕鏈結構域構成結合第一靶標的Fv），以及第二可變輕鏈（與第二可變重鏈一起形成結合第二靶標的Fv）；和c) 包含第一可變輕鏈結構域和恒定輕鏈結構域的輕鏈。

抗體型式的另外的描述提供在國際專利公開案號WO 2017/218707中，在此藉由引用併入。抗體結合

在多個方面，本揭露的雙特異性抗原結合蛋白（例如，異源二聚體抗體）結合CD3和STEAP1。不同結合區獨立地展示針對其各自抗原的KD，該KD小於或等於10^-4 M、小於或等於10^-5 M、小於或等於10^-6 M、小於或等於10^-7 M、小於或等於10^-8 M、小於或等於10^-9 M、小於或等於10^-10 M、小於或等於10^-11 M、或小於或等於10^-12 M，其中KD係指特定的抗體-抗原相互作用的解離速率。結合親和力被進一步描述如上。STEAP1結合區不需要以與例如CD3結合區結合CD3的相同的親和力結合STEAP1。在雙特異性抗原結合蛋白的上下文中揭露的結合親和力還適用於本文所述的任何單特異性構建體，包括結合PD-1的構建體。另外的抗體修飾

除了以上概述的修飾之外，還可以做出其他修飾。例如，可以藉由摻入連接VH和VL結構域的二硫橋來穩定分子（Reiter等人., 1996, Nature Biotech. [自然生物技術] 14:1239-1245，藉由引用以全文併入）。另外，存在抗體的多種共價修飾，該等共價修飾可以如下所概述製備。

抗體的共價修飾包括在本揭露的範圍內，並且通常但不總是在翻譯後進行。例如，藉由使抗體的特定胺基酸殘基與能夠與選擇的側鏈或N或C末端殘基反應的有機衍生劑反應，將抗體的若干種類型的共價修飾引入到分子中。

半胱胺醯殘基最常見地與α-鹵代乙酸酯（和相應的胺），諸如氯乙酸或氯乙醯胺反應，以得到羧甲基或羧醯胺甲基衍生物。半胱胺醯殘基還可以藉由與溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、磷酸氯乙醯酯、N-烷基馬來醯亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對氯汞苯甲酸酯、2-氯汞-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑等的反應來衍生出。

另外，半胱胺酸的修飾在抗體-藥物軛合物（ADC）應用中特別有用，進一步描述如下。在一些實施方式中，抗體的恒定區可以被工程化為含有一個或多個特別是「硫醇反應性」的半胱胺酸，以便允許藥物部分的更具體和受控的放置。參見例如美國專利案號7,521,541，藉由引用以其全文併入本文。

組胺醯殘基係藉由在pH 5.5-7.0下與焦碳酸二乙酯反應衍生出，因為這種劑對組胺醯側鏈相對具有特異性。對溴苯甲醯甲基溴也是有用的；該反應較佳的是在pH 6.0的0.1 M二甲胂酸鈉中進行。

賴胺醯殘基和胺基末端殘基與琥珀酸酐或其他羧酸酐反應。用該等劑情況下的衍生化逆轉賴胺醯殘基的電荷。用於衍生含α-胺基的殘基的其他合適試劑包括亞胺酸酯，諸如甲基吡啶亞胺甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；硼氫化氯；三硝基苯磺酸；O-甲基異脲；2,4-戊二酮；以及轉胺酶催化的與乙醛酸鹽的反應。

精胺醯殘基藉由與一種或多種常規試劑（其中苯甲醯甲醛、2,3-丁二酮、1,2-環己二酮和茚三酮）反應而被修飾。由於胍官能基的高pKa，精胺酸殘基的衍生化要求反應在鹼性條件下進行。此外，該等試劑可以與離胺酸基團以及精胺酸ε-胺基基團反應。

可以對酪胺醯殘基進行特定修飾，特別感興趣的是藉由與芳族重氮化合物或四硝基甲烷反應將光譜標記引入到酪胺醯殘基中。最常見地，將N-乙醯基咪唑和四硝基甲烷分別用於形成O-乙醯基酪胺醯物質和3-硝基衍生物。使用125I或131I碘化酪胺醯殘基以製備用於放射免疫測定的標記蛋白質，上述氯胺T法係合適的。

羧基側基團（天冬胺醯基或穀胺醯基）藉由與碳二亞胺（R'-N=C=N--R'）反應而選擇性地修飾，其中R和R'視需要為不同的烷基基團，諸如1-環己基-3-(2-𠰌啉基-4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳二亞胺。此外，天冬胺醯殘基和穀胺醯殘基藉由與銨離子反應轉化為天冬醯胺醯殘基和穀胺醯胺醯殘基。

用雙功能劑情況下的衍生化可用於將抗體交聯到水不溶性載體基質或表面以用於多種方法中。常用的交聯劑包括例如1,1-雙(重氮乙醯基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀醯亞胺酯（例如與4-疊氮基水楊酸的酯）、同雙官能亞胺酸酯（包括二琥珀醯亞胺酯，諸如3,3'-二硫代雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)，和雙官能馬來醯亞胺，諸如雙-N-馬來醯亞胺-1,8-辛烷）。衍生劑諸如3-[(對疊氮基苯基)二硫代]丙醯亞胺酸甲基酯產生能夠在光存在下形成交聯的可光活化中間體。可替代地，將在美國專利案號3,969,287、3,691,016、4,195,128、4,247,642、4,229,537、和4,330,440（均藉由引用以全文併入）中所述的反應性水不溶性基質（諸如溴化氰活化的碳水化合物）和反應性底物用於蛋白質固定化。

穀胺醯胺醯殘基和天冬醯胺醯殘基通常分別脫醯胺成相應的穀胺醯殘基和天冬胺醯殘基。可替代地，該等殘基在弱酸性條件下脫醯胺。該等殘基的任一形式都屬於本揭露的範圍。

其他修飾包括對脯胺酸和離胺酸的羥基化、對絲胺醯或蘇胺醯殘基的羥基基團的磷酸化、對離胺酸、精胺酸和組胺酸側鏈的α-胺基基團的甲基化（T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties [蛋白質：結構和分子特性], W. H. Freeman & Co. [W.H.弗裡曼公司], San Francisco [三藩市], 第79-86頁 [1983]，藉由引用以全文併入）、對N末端胺的乙醯化、和對任何C末端羧基基團的醯胺化。

另外，如熟悉該項技術者所理解的，可以將標記物（包括螢光的、酶的、磁性的、放射性的等）添加至本文所述的任何抗原結合蛋白（以及本揭露的其他組成物）。糖基化

另一種類型的共價修飾係糖基化的改變。在另一個實施方式中，本文揭露的該等抗體（或其他類型的抗原結合蛋白）可以被修飾為包括一個或多個工程化的糖型。藉由如本文所使用的「工程化的糖型」來表示與抗體共價附接的碳水化合物組成物，其中所述碳水化合物組成物與親本抗體的化學組成不同。工程化的糖型可用於多種目的，包括但不限於，增強或降低效應子功能。工程化的糖型的較佳的形式係非岩藻糖基化，該非岩藻糖基化已經顯示其與ADCC功能的增加相關，可能是藉由與FcγRIIIa受體的更緊密結合。在該上下文中，「非岩藻糖基化」表示宿主細胞中產生的大部分抗體基本上不含岩藻糖，例如，90%、95%、或98%的所產生的抗體不具有明顯的岩藻糖作為抗體的碳水化合物部分（通常附接在Fc區的N297處）的組分。在功能上定義的非岩藻糖基化抗體通常對FcγRIIIa受體表現出至少50%或更高的親和力。

視需要，異源二聚體抗體包含序列修飾，該修飾例如在位置292、297、或302中的一個或多個處去除一個或多個糖基化位點。一個非限制性實例包括引入一個或多個穩定的效應子無功能（SEFL2）突變（例如，在IgG1主鏈中），其進一步描述於例如美國專利案號9,546,203中，該專利藉由引用以其全文併入本文，並且特別是關於SEFL2突變的描述。除了本文揭露的任何其他修飾之外，還可以使用該修飾（例如，N67Q修飾）以減少脫醯胺作用。

可以藉由本領域已知的多種方法產生工程化的糖型。參見，例如，Umaña等人., 1999, Nat Biotechnol [自然生物技術] 17:176-180；Davies等人., 2001, Biotechnol Bioeng [生物技術與生物工程] 74:288-294；Shields等人., 2002, J Biol Chem [生物化學雜誌] 277:26733-26740；Shinkawa等人., 2003, J Biol Chem [生物化學雜誌] 278:3466-3473；美國專利案號6,602,684；美國專利公開案號2003/0157108和2003/0003097；以及國際專利公開案號WO 00/61739A1、WO 01/29246A1、WO 02/31140A1和WO 02/30954A1，均藉由引用以全文併入，以及Potelligent®技術[Biowa公司，普林斯頓，新澤西州]和GlycoMAb®糖基化工程化技術[格力卡生物技術公司（Glycart Biotechnology AG），蘇黎世，瑞士]。該等技術中的許多基於控制與Fc區共價附接的岩藻糖基化和/或二等分寡糖的水平，例如藉由在不同生物體或細胞系中表現IgG，工程化或其他情況（例如，Lec-13 CHO細胞或大鼠雜交瘤YB2/0細胞）；藉由調節參與糖基化途徑的酶（例如FUT8 [α1,6-岩藻糖基轉移酶]和/或β1-4-N-乙醯葡糖胺基轉移酶III [GnTIII]））；或在IgG已經表現後藉由修飾一種或多種碳水化合物。例如，「糖工程化的抗體技術」藉由在生產過程中添加抑制岩藻糖基化的經修飾的糖來起作用；參見例如美國專利公開案號20090317869，在此藉由引用以其全文併入本文。工程化的糖型通常是指不同的碳水化合物或寡糖；因此，抗體可包括工程化的糖型。

可替代地，工程化的糖型可以指包含不同碳水化合物或寡糖的IgG變體。如本領域中已知的，糖基化模式可以取決於蛋白質的序列（例如，下文論述的特定糖基化胺基酸殘基的存在或不存在）或其中產生蛋白質的宿主細胞或生物體。下面論述特定的表現系統。

多肽的糖基化典型地是N-連接或O-連接的。N-連接係指碳水化合物部分連接至天冬醯胺殘基的側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸和天冬醯胺-X-蘇胺酸（其中X為除脯胺酸以外的任何胺基酸）係將碳水化合物部分酶促連接至天冬醯胺側鏈的識別序列。因此，在多肽中該等三肽序列中的任一者的存在產生潛在的糖基化位點。O-連接糖基化係指將糖N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一種連接至羥基胺基酸，最常見的是絲胺酸或蘇胺酸，但是也可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。

藉由改變胺基酸序列以使得它含有上述三肽序列中的一者或多者而方便地完成向抗體添加糖基化位點（用於N-連接的糖基化位點）。還可以藉由向起始序列添加一個或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或由一個或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代來作出改變（用於O-連接的糖基化位點）。為了方便起見，抗體胺基酸序列較佳的是藉由DNA水平的變化來改變，特別是藉由在預選鹼基處突變編碼靶多肽的DNA，以使得產生將翻譯成所希望胺基酸的密碼子。

增加抗原結合蛋白（例如，抗體）上的碳水化合物部分的數量的另一種手段係藉由將糖苷化學或酶促偶聯至蛋白質。該等程序的有利之處在於它們不需要在具有用於N-和O-連接的糖基化的糖基化能力的宿主細胞中產生蛋白質。取決於所使用的偶聯方式，一種或多種糖可連接至 (a) 精胺酸和組胺酸，(b) 游離羧基基團，(c) 游離巰基基團，諸如半胱胺酸的那些，(d) 游離羥基基團，諸如絲胺酸、蘇胺酸或羥基脯胺酸的那些，(e) 芳香族殘基，諸如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸的那些，或 (f) 穀胺醯胺的醯胺基團。該等方法描述於國際專利公開案號WO 87/05330以及Aplin和Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem. [CRC生物化學關鍵評論], 第259-306頁中，二者藉由引用以全文併入。

存在於起始抗體（例如，翻譯後）上的碳水化合物部分的去除可以化學或酶促方式完成。化學去糖基化要求將蛋白質暴露於化合物三氟甲磺酸，或等效化合物。該處理導致除連接糖（N-乙醯葡糖胺或N-乙醯半乳糖胺）以外的大多數或所有糖切割，同時使多肽保持完整。化學去糖基化由Hakimuddin等人., 1987, Arch. Biochem. Biophys. [生物化學與生物物理學集刊] 259:52和由Edge等人., 1981, Anal. Biochem. [分析生物化學] 118:131所述，二者藉由引用以全文併入。多肽上碳水化合物部分的酶促切割可以藉由使用多種內切糖苷酶和外切糖苷酶實現，如由Thotakura等人., 1987, Meth. Enzymol. [酶學方法] 138:350所述，藉由引用以全文併入。可以藉由使用化合物衣黴素預防潛在糖基化位點處的糖基化，如由Duskin等人., 1982, J. Biol. Chem. [生物化學雜誌] 257:3105所述，藉由引用以全文併入。衣黴素阻斷蛋白質-N-糖苷鍵的形成。

抗體的另一種類型的共價修飾包括以在例如，來自內克塔治療公司（Nektar Therapeutics）的2005-2006 PEG目錄（可從Nektar網站獲得）、或美國專利案號4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；或4,179,337（均藉由引用以全文併入）中列出的方式將抗體與多種非蛋白質聚合物連接，該等聚合物包括但不限於各種多元醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、或聚氧化烯。此外，如本領域中已知的，可以在抗體內的不同位置進行胺基酸取代從而利於添加聚合物諸如PEG。參見例如，美國專利公開案號2005/0114037 A1，藉由引用以全文併入。用於另外的官能性的另外的Fc變體

除了上述pI胺基酸變體和其他變體之外，還有許多有用的Fc胺基酸修飾，該等修飾可以由於多種原因而產生，包括但不限於改變與一種或多種FcγR受體的結合，改變與FcRn受體的結合等。除了上述任何修飾之外或可替代地可以採用以下修飾。 FcγR變體

可以進行許多有用的Fc取代以改變與一種或多種FcγR受體的結合。導致增加的結合以及降低的結合的取代可能是有用的。例如，已知增加與FcγRIIIa的結合通常導致ADCC增加（抗體依賴性細胞介導的細胞毒性；細胞介導的反應，其中表現FcγR的非特異性細胞毒性細胞識別靶標細胞上的結合抗體並且隨後引起靶標細胞的裂解）。類似地，在某些情況下，與FcγRIIb（抑制性受體）的結合降低也是有益的。可用於本揭露的有用的胺基酸取代包括美國專利公開案號2006/0024298（特別是圖41）、2006/0121032、2006/0235208、2007/0148170中列出的那些，所述公開全部藉由引用明確地併入本文，並且特別是其中揭露的變體。可以使用的具體的變體包括但不限於，236A、239D、239E、332E、332D、239D/332E、267D、267E、328F、267E/328F、236A/332E、239D/332E/330Y、239D、332E/330L、和299T。

此外，發現另外的Fc取代，其可用於增加與FcRn受體的結合和增加血清半衰期，如美國專利公開案號2009/0163699中具體揭露的，所述公開藉由引用以其整體併入本文，所述取代包括但不限於434S、428L、308F、259I、428L/434S、259I/308F、436I/428L、436I或V/434S、436V/428L和259I/308F/428L。 Fc消融變體

可用於本揭露上下文中的其他變體係消融（例如，減少或消除）與Fcγ受體結合的變體。減少異源二聚體抗體的潛在作用機制（例如，降低ADCC活性）可能是所希望的。許多適合的Fc消融變體描繪於圖6中，並可以視需要和獨立地包括或排除與任何其他異源二聚體化變體（包括pI變體和空間變體）組合。

在一些實施方式中特別有用的是與正電荷側（不包含pI變體、偏斜變體S364K/E357Q和消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K（視需要兩個單體都包含FcRn變體428L/434S））配對的第一單體（「負電荷側」）（包含pI變體N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、偏斜變體368D/370S、和消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K），其中該正電荷側係包含scFv的單體，並且包含帶電荷的scFv連接子。第二實施方式利用與正電荷側（包含pI變體Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K、偏斜變體S364K/E357Q和消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K（視需要兩個單體都包含FcRn變體428L/434S））配對的的第一負電荷側單體（包含I199T/N203D/K274Q/R355Q/Q419E/K447del、偏斜變體S364K/E357Q和消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K（視需要兩個單體都包含FcRn變體428L/434S）），其中該正電荷側係包含scFv的單體，並且包含帶電荷的scFv連接子。第三實施方式利用與正電荷側單體（不包含pI變體、偏斜變體S364K/E357Q和消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K（視需要兩個單體都包含FcRn變體428L/434S））配對的第一負電荷側單體（包含I199T/N203D/K274Q/R355Q/N384S/K392N/V397M/Q419E/K447del、偏斜變體S364K/E357Q和消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K（視需要兩個單體都包含FcRn變體428L/434S）），其中該正電荷側係包含scFv的單體，並且包含帶電荷的scFv連接子。第四實施方式利用與正電荷側（不包含pI變體、偏斜變體S364K/E357Q和消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S239K（視需要兩個單體都包含FcRn變體428L/434S））配對的第一單體（「負電荷側」）（包含pI變體N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、偏斜變體368D/370S和消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S239K）。第五實施方式利用與正電荷側（包含pI變體Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K、偏斜變體S364K/E357Q和消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S239K（視需要兩個單體都包含FcRn變體428L/434S））配對的第一負電荷側單體（包含I199T/N203D/K274Q/R355Q/Q419E/K447del、偏斜變體S364K/E357Q和消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S239K（視需要兩個單體都包含FcRn變體428L/434S））。第六實施方式利用與正電荷側單體（包含偏斜變體S364K/E357Q和消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S239K（視需要兩個單體都包含FcRn變體428L/434S））配對的第一負電荷側單體（包含I199T/N203D/K274Q/R355Q/N384S/K392N/V397M/Q419E/K447del、偏斜變體S364K/E357Q和消融變體E233P/L234V/L235A/G236del/S267K（視需要兩個單體都包含FcRn變體428L/434S）），其中該正電荷側係scFv單體，並且包含帶電荷的scFv連接子（特別地當scFv係抗CD3時）。第七實施方式利用與正電荷側（不包含pI變體、偏斜變體S364K/E357Q和消融變體S239K/S267K（視需要兩個單體都包含FcRn變體428L/434S））配對的第一單體（「負電荷側」）（包含pI變體N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、偏斜變體368D/370S和消融變體S239K/S267K），其中該正電荷側係scFv單體，並且包含帶電荷的scFv連接子。第八實施方式利用與正電荷側（包含pI變體Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K、偏斜變體S364K/E357Q和消融變體S239K/S267K（視需要兩個單體都包含FcRn變體428L/434S））配對的第一負電荷側單體（包含I199T/N203D/K274Q/R355Q/Q419E/K447del、偏斜變體S364K/E357Q和消融變體S239K/S267K（視需要兩個單體都包含FcRn變體428L/434S）），其中該正電荷側係scFv單體，並且包含帶電荷的scFv連接子。第九實施方式利用與正電荷側單體（不包含pI變體、偏斜變體S364K/E357Q和消融變體S239K/S267K（視需要兩個單體都包含FcRn變體428L/434S））配對的第一負電荷側單體（包含I199T/N203D/K274Q/R355Q/N384S/K392N/V397M/Q419E/K447del、偏斜變體S364K/E357Q和消融變體S239K/S267K（視需要兩個單體都包含FcRn變體428L/434S）），其中該正電荷側係scFv單體，並且包含帶電荷的scFv連接子。第十實施方式利用與正電荷側（不包含pI變體、偏斜變體S364K/E357Q和消融變體S267K/P329K（視需要兩個單體都包含FcRn變體428L/434S））配對的第一單體（「負電荷側」）（包含pI變體N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、偏斜變體368D/370S和消融變體S267K/P329K），其中該正電荷側係scFv單體，並且包含帶電荷的scFv連接子。第十一實施方式利用與正電荷側（包含pI變體Q196K/I199T/P271R/P228R/N276K、偏斜變體S364K/E357Q和消融變體S267K/P329K（視需要兩個單體都包含FcRn變體428L/434S））配對的第一負電荷側單體（包含I199T/N203D/K274Q/R355Q/Q419E/K447del、偏斜變體S364K/E357Q和消融變體S267K/P329K（視需要兩個單體都包含FcRn變體428L/434S）），其中該正電荷側係scFv單體，並且包含帶電荷的scFv連接子。第12實施方式利用與正電荷側單體（不包含pI變體、偏斜變體S364K/E357Q和消融變體S267K/P329K（視需要兩個單體都包含FcRn變體428L/434S））配對的第一負電荷側單體（包含I199T/N203D/K274Q/R355Q/N384S/K392N/V397M/Q419E/K447del、偏斜變體S364K/E357Q和消融變體S267K/P329K（視需要兩個單體都包含FcRn變體428L/434S）），其中該正電荷側係scFv單體，並且包含帶電荷的scFv連接子。

在多個方面，第一單體包含第一重鏈（其包含第一可變重鏈結構域、含有第一CH1結構域和第一Fc結構域的第一恒定重鏈）、scFv（其結合人CD3並且包含scFv可變輕鏈結構域、scFv連接子和scFv可變重鏈結構域（即，「Fab-scFv-Fc」重鏈）），該第一單體包含在上鉸鏈中的缺失，並引入CH2和CH3取代。該等取代包括例如，E233P、delL234、L235V、G236A、S267K、r292c、n297g、v302c、E357Q、和S364K（EU編號，參考SEFL2取代的小寫字母）中的一個或多個（例如，全部）。第二單體包含第二重鏈（其包含第二可變重鏈結構域和含有第二Fc結構域的第二恒定重鏈），該第二單體視需要包含以下突變中的一個或多個（例如，全部）：N208D、E233P、delL234、L235V、G236A、S267K、r292c、Q295E、n297g、v302c、L368D、K370S、N384D、Q418E、和N421D（EU編號，參考SEFL2取代中的小寫字母）。連接子

本文中的「連接子」還被稱為「連接子序列」或「間隔子」或語法等同物。同源或異源雙功能連接子的熟知的（參見，1994 皮爾斯化學公司（Pierce Chemical Company）目錄，technical section on cross-linkers[關於交聯的技術部分]，第155-200頁，藉由引用完全併入）。（注意通用「連接子」和「scFv連接子」和「帶電荷的scFv連接子」之間的區別。）可以使用許多策略將分子共價連接在一起。該等包括但不限於蛋白質或蛋白質結構域的N末端和C末端之間的多肽連接、經由二硫鍵的連接、和藉由化學交聯劑的連接。在該實施方式的一個方面，連接子係藉由重組技術或肽合成產生的肽鍵。連接子肽可主要包括以下胺基酸殘基：Gly、Ser、Ala、或Thr。連接子肽應具有適於連接兩個分子的長度，使得它們相對於彼此呈現正確的構象，使得這兩個分子保持所希望的活性。在一個實施方式中，連接子長度為從約1至50個胺基酸，較佳的是長度為約1至30個胺基酸。在一個實施方式中，可以使用長度為1至20個胺基酸的連接子。有用的連接子包括甘胺酸-絲胺酸聚合物（包括例如(GS)n、(GSGGS)n（SEQ ID NO: 178）、(GGGGS)n（SEQ ID NO: 179）、和(GGGS)n（SEQ ID NO: 180），其中n係至少一的整數），甘胺酸-丙胺酸聚合物，丙胺酸-絲胺酸聚合物和其他柔性連接子。可替代地，各種非蛋白質聚合物，包括但不限於聚乙二醇（PEG）、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物，可用作連接子。

其他連接子序列可包括CL/CH1結構域的任何長度（但不包括CL/CH1結構域的所有殘基）的任何序列；例如，CL/CH1結構域的前5-12個胺基酸殘基。連接子可以衍生自免疫球蛋白輕鏈，例如Cκ或Cλ。連接子可以衍生自任何同種型的免疫球蛋白重鏈，包括例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε、和Cμ。連接子序列還可以衍生自其他蛋白質，例如Ig樣蛋白質（例如，TCR、FcR、KIR），鉸鏈區衍生的序列和來自其他蛋白質的其他天然序列。

在一些實施方式中，「連接子係」結構域連接子，用於將本文所概述的任何兩個結構域連接在一起。例如，在圖18F中，存在將Fab的CH1結構域的C末端與scFv的N末端附接的結構域連接子，其中存在將scFv的C末端與CH2結構域附接的另一種視需要的結構域連接子（儘管在許多實施方式中，鉸鏈被用作該結構域連接子）。在一些實施方式中，該連接子係鉸鏈區或其片段。抗體-藥物軛合物

本揭露的抗原結合蛋白（例如，抗體或異源二聚體抗體）視需要與藥物軛合以形成抗體-藥物軛合物（ADC）。通常，在不同的上下文（包括腫瘤學應用）中使用ADC，其中使用抗體-藥物軛合物用於局部遞送細胞毒性或細胞抑制劑允許將藥物部分靶向遞送至腫瘤，這可以允許更高的功效，更低的毒性等。對該技術的綜述提供在Ducry等人., Bioconjugate Chem., [生物軛合物化學] 21:5-13 (2010)；Carter等人., Cancer J. [癌症雜誌] 14(3):154 (2008)；以及Senter, Current Opin. Chem. Biol. [化學生物學新見] 13:235-244 (2009)中，均在此藉由引用以其全文併入本文。

通常，藉由與抗體共價附接來進行軛合，如下文進一步描述的，並且通常依賴於連接子，通常是肽連接（如本文所述，其可被設計為在靶位點處對蛋白酶切割敏感或不敏感）。另外，連接子-藥物單元（LU-D）的連接可以藉由與抗體內半胱胺酸的附接來實現。藥物部分的數量/抗體可以根據反應條件而變化，並且可以在1 : 1至10 : 1的藥物 : 抗體之間變化。如熟悉該項技術者所理解的，實際數字係平均數。

ADC的藥物可以選自許多藥劑中的任何一種，包括但不限於細胞毒性劑（例如化學治療劑，生長抑制劑）、毒素（例如，細菌、真菌、植物或動物來源或其片段的酶活性毒素）或放射性同位素（即，放射性軛合物）。本揭露進一步提供了使用ADC的方法。

在本揭露的上下文中使用的藥物包括細胞毒性藥物，特別是用於癌症治療的那些。該等藥物通常包括DNA損傷劑、抗代謝物、天然產物及其類似物。細胞毒性劑的示例性類別包括酶抑制劑（例如二氫葉酸還原酶抑制劑和胸苷酸合成酶抑制劑）、DNA嵌入劑、DNA切割劑、拓撲異構酶抑制劑、藥物的蒽環家族、長春花鹼藥物、絲裂黴素（mitomycins）、博來黴素（bleomycins）、細胞毒性核苷（cytotoxic nucleoside）、藥物的蝶啶家族、二炔（diynenes）、鬼臼毒素（podophyllotoxins）、朵拉司他汀（dolastatins）、美登木素（maytansinoids）生物鹼、分化誘導劑、和紫杉醇。

該等類別的成員包括，例如，胺甲喋呤（methotrexate）、甲蝶呤（methopterin）、二氯胺甲喋呤（dichloromethotrexate）、5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、胞嘧啶阿拉伯糖苷、美法侖（melphalan）、環氧長春鹼（leurosine）、leurosideine、放線菌素（actinomycin）、柔紅黴素（daunorubicin）、多柔比星（doxorubicin）、絲裂黴素C（mitomycin C）、絲裂黴素A、卡米黴素（caminomycin）、胺基蝶呤（aminopterin）、他利黴素（tallysomycin）、鬼臼毒素（podophyllotoxin）和鬼臼毒素（etoposide）衍生物（如依託泊苷或依託泊苷磷酸鹽）、長春花鹼（vinblastine）、長春新鹼（vincristine）、長春地辛（vindesine）、紫杉烷類（包括紫杉醇）、多西他賽（taxotere）、視黃酸、丁酸、N8-乙醯基亞精胺、喜樹鹼（camptothecin）、卡奇黴素（calicheamicin）、埃斯波黴素（esperamicin）、烯-二炔、多卡米新（duocarmycin）A、多卡米新SA（duocarmycin SA）、卡奇黴素（calicheamicin）、喜樹鹼、美登木素生物鹼（包括DM1）、單甲基奧瑞他汀E（MMAE）、單甲基奧瑞他汀F（MMAF）、和美登木素生物鹼（DM4）及其類似物。

可以將毒素用作抗體-毒素軛合物，並且包括細菌毒素（例如白喉毒素）、植物毒素（例如蓖麻毒素）、小分子毒素（例如格爾德黴素）（Mandler等人 (2000) J. Nat. Cancer Inst. [國家癌症研究所雜誌]92(19):1573-1581；Mandler等人 (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters [生物有機化學與醫藥化學通訊] 10:1025-1028；Mandler等人 (2002) Bioconjugate Chem. [生物軛合物化學]1 3:786-791）、美登木素生物鹼（EP 1391213；Liu等人., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國科學院院刊] 93:8618-8623）、以及卡奇黴素（Lode等人 (1998) Cancer Res. [癌症研究] 58:2928；Hinman等人 (1993) Cancer Res. [癌症研究] 53:3336-3342）。毒素可藉由包括微管蛋白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制的機制發揮其細胞毒性和細胞抑制作用。

考慮了抗體（或其他抗原結合蛋白）和一種或多種小分子毒素（例如美登木素生物鹼、朵拉司他汀（dolastatins）、單端孢黴烯（auristatins）、單端孢黴烯（trichothecene）、卡奇黴素（calicheamicin）和CC1065）的軛合物，以及具有毒素活性的該等毒素的衍生物。

適合用作美登木素生物鹼藥物部分的美登素化合物係本領域熟知的，並且可以根據已知方法從天然來源中分離，使用基因工程技術產生（參見Yu等人 (2002) PNAS 99:7968-7973），或根據已知方法合成地製備美登醇和美登醇類似物。如下所述，可以藉由摻入功能活性基團（如硫醇或胺基團）來修飾藥物以軛合抗體。

示例性美登木素生物鹼藥物部分包括具有經修飾的芳香族環的那些，例如：C-19-脫氯（美國專利案號4,256,746）（藉由氫化鋁鋰還原安絲菌素（ansamytocin）P2製備）；C-20-羥基（或C-20-脫甲基）+/-C-19-脫氯（美國專利案號4,361,650和4,307,016）（藉由使用鏈黴菌或放線菌進行脫甲基化或使用LAH進行脫氯製備）；和C-20-脫甲氧基、C-20-醯氧基(--OCOR), +/-脫氯（美國專利案號4,294,757）（藉由使用醯氯醯化製備）和在其他位置處具有修飾的那些。

示例性美登木素生物鹼藥物部分還包括具有如下修飾的那些：C-9-SH（美國專利案號4,424,219）（藉由美登醇與H2S或P2S5的反應製備）；C-14-烷氧基甲基（脫甲氧基/CH2OR）（美國專利案號4,331,598）；C-14-羥甲基或醯氧基甲基（CH2OH或CH2OAc）（美國專利案號4,450,254）（由諾卡氏菌（Nocardia）製備）；C-15-羥基/醯氧基（美國專利案號4,364,866）（藉由鏈黴菌轉化美登醇製備）；C-15-甲氧基（美國專利案號4,313,946和4,315,929）（從滑桃樹（Trewia nudlflora）中分離）；C-18-N-脫甲基（美國專利案號4,362,663和4,322,348）（藉由鏈黴菌對美登醇的脫甲基作用製備）；和4,5-去氧（美國專利案號4,371,533）（由三氯化鈦/美登醇的LAH還原製備）。

特別有用的是DM1（揭露於美國專利案號5,208,020中，藉由引用併入）和DM4（揭露於美國專利案號7,276,497中，藉由引用併入）。還參見美國專利案號5,416,064、6,441,163、7,303,749、7,368,565、和7,601,354；國際專利公開案號WO/01/24763、WO 02/098883、WO 02/16368和WO 04/1033272；以及USSN 12/631,508中的許多另外的美登木素生物鹼衍生物和方法，均明確地藉由引用以其全文併入本文。

含有美登木素生物鹼的ADC、其製備方法及其治療用途揭露於例如，美國專利案號5,208,020、5,416,064、6,441,163和歐洲專利EP 0 425 235 B1中，該等專利的揭露內容在此明確地藉由引用併入。Liu等人., Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國科學院院刊] 93:8618-8623 (1996)描述了包含命名為DM1的美登木素生物鹼（其與針對人結腸直腸癌的單株抗體C242連接）的ADC。

Chari等人., Cancer Research [癌症研究] 52:127-131 (1992)描述了ADC，其中美登木素生物鹼藉由二硫化物連接子與鼠抗體A7（其與人結腸癌細胞系上的抗原結合）軛合、或與另一種鼠單株抗體TA.1（其結合HER-2/neu癌基因）軛合。藥物軛合物實現了與游離美登木素生物鹼藥物類似的程度的細胞毒性，該細胞毒性可以藉由增加美登木素生物鹼分子數量/抗體分子來增加。

在一些實施方式中，ADC包含朵拉司他汀或朵拉司他汀肽類似物或衍生物、或奧瑞他汀（auristatin）（美國專利案號5,635,483和5,780,588）。已經顯示朵拉司他汀和奧瑞他汀干擾微管動力學、GTP水解、以及核分裂和細胞分裂（Woyke等人 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. [抗微生物劑與化學療法] 45(12):3580-3584），並具有抗癌作用（美國專利案號5,663,149）和抗真菌活性（Pettit等人 (1998) Antimicrob. Agents Chemother. [抗微生物劑與化學療法] 42:2961-2965）。朵拉司他汀或奧瑞他汀藥物部分可以藉由肽藥物部分的N（胺基）末端或C（羧基）末端與抗體附接（國際專利公開案號WO 02/088172）。在多個方面，異源二聚體抗體係治療計畫的一部分，其還包括施用艾日布林。

示例性奧瑞他汀的實施方式包括在「Senter等人, Proceedings of the American Association for Cancer Research [美國癌症研究協會學報], 第45卷, 文摘號623, 於2004年3月28日呈遞中揭露以及在美國專利公開案號2005/0238648（其揭露內容明確地藉由引用以其全文併入本文）中所述的N末端連接的單甲基奧瑞他汀藥物部分DE和DF。示例性奧瑞他汀的實施方式係MMAE（參見美國專利案號6,884,869，明確地藉由引用以其全文併入本文）。另一個示例性奧瑞他汀的實施方式係MMAF（參見美國專利案號2005/0238649和美國專利案號5,767,237和6,124,431，明確地藉由引用以其全文併入本文）。

典型地，可以藉由在兩個或更多個胺基酸和/或肽片段之間形成肽鍵來製備基於肽的藥物部分。例如，可以根據在肽化學領域熟知的液相合成方法（參見E. Schroder和K. Lubke, 「The Peptides」[肽], 第1卷, 第76-136頁, 1965, 學術出版社）製備此類肽鍵。可以根據以下中方法製備奧瑞他汀/朵拉司他汀藥物部分：美國專利案號5,635,483和5,780,588；Pettit等人 (1989) J. Am. Chem. Soc. [美國化學學會雜誌] 111:5463-5465；Pettit等人 (1998) Anti-Cancer Drug Design [抗癌藥物設計] 13:243-277；Pettit, G. R.,等人. Synthesis [合成], 1996, 719-725；Pettit等人 (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. [化學學會鉑金彙報雜誌] 1 5:859-863；以及Doronina (2003) Nat Biotechnol [自然生物技術] 21(7):778-784。

在其他實施方式中，ADC包含一個或多個卡奇黴素分子。例如，吉妥單抗係第一個商業ADC藥物，並利用卡奇黴素γ1作為有效負載（參見美國專利案號4,970,198，藉由引用以其全文併入本文）。另外的卡奇黴素衍生物描述於美國專利案號5,264,586、5,384,412、5,550,246、5,739,116、5,773,001、5,767,285和5,877,296中，均明確的藉由引用併入。抗生素的卡奇黴素家族能夠在亞皮莫耳濃度下產生雙股DNA斷裂。對於卡奇黴素家族的軛合物的製備，參見美國專利案號5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001、5,877,296（均屬於美國氰胺公司（American Cyanamid Company））。可以使用的卡奇黴素的結構類似物包括但不限於γ1I、α2I、α2I、N-乙醯基- γ1I、PSAG和θI1（Hinman等人., Cancer Research [癌症研究] 53:3336-3342 (1993), Lode等人., Cancer Research [癌症研究] 58:2925-2928 (1998)，以及前述屬於美國氰胺公司的美國專利）。抗體可以軛合的另一種抗腫瘤藥物係QFA，它係一種抗葉酸劑。卡奇黴素和QFA都具有細胞內作用位點，並且不容易穿過質膜。因此，該等藥劑藉由抗體介導的內化作用的細胞攝取大大增強了它們的細胞毒性作用。

CC-1065（參見美國專利案號4,169,888，藉由引用併入）和多卡米新係ADC中使用的抗腫瘤抗生素家族的成員。該等抗生素似乎藉由序列選擇性地在DNA的小溝中腺嘌呤N3處烷基化起作用，這引發了導致細胞凋亡的級聯事件。多卡米新的重要成員包括多卡米新A（美國專利案號4,923,990藉由引用併入）和多卡米新SA（美國專利案號5,101,038藉由引用併入），以及如在美國專利案號7,517,903、7,691,962、5,101,038、5,641,780、5,187,186、5,070,092、5,070,092、5,641,780、5,101,038、5,084,468、5,475,092、5,585,499、5,703,080、6,989,452、7,087,600、7,129,261、7,498,302、7,507,420、和5,846,545；以及國際專利公開案號WO 2007/089149和WO 2009/017394A1中所述的大量類似物，該等專利均明確地藉由引用併入。其他細胞毒性劑

可以與抗原結合蛋白軛合的其他抗腫瘤劑包括BCNU、鏈脲黴素、長春新鹼和5-氟脲嘧啶，在美國專利案號5,053,394和5,770,710中所述的已知共同稱為LL-E33288複合物的藥劑家族，以及埃斯波黴素（esperamicins）（美國專利案號5,877,296）。

可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A（diphtheria A）鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A（exotoxin A）鏈來自銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ））、蓖麻毒素A（ricin A）鏈、相思豆毒素A（abrin A）鏈、蒴蓮根毒素A（modeccin A）鏈、α-八疊球菌（alpha-sarcin）、油桐蛋白（Aleurites fordii proteins）、香石竹毒蛋白（dianthin protein）、美洲商陸（Phytolaca americana）蛋白（PAPI、PAPII、和PAP-S）、苦瓜抑制劑、麻風樹毒蛋白（curcin）、巴豆毒素（crotin）、肥皂草抑制劑、白樹毒素（gelonin）、米托菌素（mitogellin）、局限麴菌素（restrictocin）、酚黴素（phenomycin）、伊諾黴素（enomycin）和單端孢黴烯（tricothecenes）。參見，例如，國際專利公開案號WO 93/21232。

本揭露進一步考慮了在抗原結合蛋白和具有核溶解活性的化合物（例如，核糖核酸酶或DNA核酸內切酶，例如去氧核糖核酸酶；DNA酶）之間形成的ADC。

對於腫瘤的選擇性破壞，抗原結合蛋白（例如，抗體或異源二聚體抗體）可包含高放射性原子。多種放射性同位素可用於生產放射性軛合物。實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。

放射性標記或其他標記可以按已知的方式摻入軛合物中。例如，肽可以是生物合成的，或者可以使用適合的胺基酸先質藉由化學胺基酸合成來合成，所述胺基酸先質涉及例如氟-19代替氫。可以經由肽中的半胱胺酸殘基將標記（例如Tc99m或I123、Re186、Re188、和In111）附接。釔-90可以經由離胺酸殘基附接。可以將IODOGEN方法（Fraker等人 (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. [生物化學與生物物理研究通訊] 80: 49-57）用於摻入碘-123。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy [免疫閃爍掃描中的單株抗體]」（Chatal, CRC出版社, 1989）詳細描述了其他方法。

在一些情況下，可以藉由諸如反相HPLC或電泳的方法實現均質ADC的分離、純化和表徵（其中p係來自具有其他藥物載量的ADC的特定值）。在示例性實施方式中，p係2、3、4、5、6、7、或8或其一分數。

應當理解，還可以對所需化合物進行化學修飾，以使該化合物的反應更方便用於製備本發明的軛合物。例如，官能基（例如胺、羥基或巰基）可以在對藥物的活性或其他性質具有最小或可接受的影響的位置附加到藥物上。連接子單元

典型地，抗原結合蛋白-藥物軛合物包含在藥物單元和抗原結合蛋白單元之間的連接子單元。在一些實施方式中，連接子在細胞內或細胞外條件下是可切割的，使得連接子的切割在適當的環境中從抗原結合蛋白釋放藥物單元。例如，分泌某些蛋白酶的實體瘤可以作為可切割連接子的靶標；在其他實施方式中，所利用的是胞內蛋白酶。在又其他實施方式中，連接子單元係不可切割的，並且例如藉由溶酶體中的抗體降解釋放藥物。

在一些實施方式中，連接子可被存在於胞內環境（例如，在溶酶體或核內體或細胞凹陷內）中的切割劑切割。該連接子可以例如為一種肽基連接子，它被細胞內肽酶或蛋白酶（包括但不限於，溶酶體或核內體蛋白酶）切割。在一些實施方式中，該肽基連接子為至少兩個胺基酸長或至少三個胺基酸長或更長。

切割劑可以包括但不限於組織蛋白酶B和D及纖溶酶，已知它們均水解二肽藥物衍生物，引起靶細胞內部活性藥物的釋放（參見，例如，Dubowchik和Walker, 1999, Pharm. Therapeutics [藥物治療] 83:67-123）。肽基連接子可以被存在於表現CD38的細胞中的酶切割。例如，可以使用可被硫醇依賴性蛋白酶組織蛋白酶-B（其在癌組織中高度表現）切割的肽基連接子體（例如，Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly連接子（SEQ ID NO: 181））。此類連接子的其他實例描述於例如美國專利案號6,214,345中，藉由引用以其全文併入本文。

在一些實施方式中，由胞內蛋白酶切割的肽基連接子係Val-Cit連接子或Phe-Lys連接子（參見，例如，美國專利案號6,214,345，該專利描述了具有val-cit連接子的多柔比星的合成）。

在其他實施方式中，可切割連接子係pH敏感性的，即，對在某些pH值下水解敏感。典型地，該pH敏感性連接子在酸性條件下可水解。例如，可以使用在溶酶體中可水解的酸不穩定性連接子（例如，腙、縮胺基脲、縮胺基硫脲、順-烏頭醯胺、原酸酯、乙縮醛、縮酮等）。（參見，例如，美國專利案號5,122,368；5,824,805；和5,622,929；Dubowchik和Walker, 1999, Pharm. Therapeutics [藥物治療] 83:67-123；Neville等人., 1989, Biol. Chem. [生物化學] 264:14653-14661.）。該等連接子在中性pH條件（如在血液中的那些）下相對穩定，但在低於pH 5.5或5.0（近似為溶酶體的pH值）下不穩定。在某些實施方式中，可水解的連接子係硫醚連接子（例如像，藉由醯腙鍵與治療劑附接的硫醚（參見，例如，美國專利案號5,622,929））。

在又其他實施方式中，連接子在還原條件下是可切割的（例如，二硫鍵連接子）。本領域中已知多種二硫化物連接子，包括例如，可以使用SATA（N-琥珀醯亞胺基-5-乙醯基硫代乙酸酯）、SPDP（N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯）、SPDB（N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯）及SMPT（N-琥珀醯亞胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯）以及SPDB和SMPT形成的那些。參見，例如，Thorpe等人., 1987, Cancer Res. [癌症研究] 47:5924-5931；Wawrzynczak等人., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer [在免疫軛合物：在癌症的無線成像和癌症治療中的軛合物]（C. W. Vogel編輯., 牛津大學出版社（Oxford U. Press）, 1987）。還參見美國專利案號4,880,935。

在其他實施方式中，連接子係丙二酸酯連接子（Johnson等人., 1995, Anticancer Res. [抗癌研究] 15:1387-93）、馬來醯亞胺基苯甲醯基連接子（Lau等人., 1995, Bioorg-Med-Chem. [生物有機化學與醫藥化學] 3(10):1299-1304）、或3'-N-amide analog（Lau等人., 1995, Bioorg-Med-Chem. [生物有機化學與醫藥化學] 3(10):1305-12）。

在又其他實施方式中，該連接子單元係係不可切割的，並且該藥物係藉由抗體降解來釋放。參見，例如，美國專利公開案號2005/0238649藉由引用以其全文併入本文。

在許多實施方式中，連接子係自犧牲型。如本文所使用，術語「自犧牲型間隔子」係指雙官能化學部分，其能夠將兩個間隔的化學部分共價連接在一起形成穩定的三聯分子。如果其與第一部分的鍵斷裂，它將自發地與第二化學部分分離。參見，例如，國際專利公開案號WO 2007059404A2、WO 06110476A2、WO 05112919A2、WO 2010/062171、WO 09/017394、WO 07/089149、WO 07/018431、WO 04/043493、和WO 02/083180，該等專利涉及藥物可切割的底物軛合物，其中藥物和可切割的底物視需要藉由自我犧牲型連接子連接，並且該等專利都藉由引用明確地併入。

通常，連接子對胞外環境基本上不敏感，即當抗原結合蛋白-藥物軛合物存在於細胞外環境中（例如，在血漿中）時，在抗原結合蛋白 -藥物軛合物樣本中不超過約20%、15%、10%、5%、3%或不超過約1%的連接子被切割。可以藉由以下方法確定連接子是否對胞外環境基本上不敏感：例如藉由將抗原結合蛋白-藥物軛合物化合物與血漿孵育持續預定的時間段（例如，2、4、8、16、或24小時），並然後定量血漿中存在的游離藥物的量。

在其他非互斥的實施方式中，連接子促進細胞內化。在某些實施方式中，當與治療劑（即，在如本文所述的ADC的連接子-治療劑部分的環境）軛合時，連接子促進細胞內化。在又其他實施方式中，當與本揭露的奧瑞他汀化合物和抗原結合蛋白軛合時，連接子促進細胞內化。

可與本發明的組成物和方法一起使用的多種示例性連接子描述於國際專利公開案號WO 2004-010957和美國專利公開案號2006/0074008、20050238649、和2006/0024317中（各自藉由引用以其全文併入本文）。

應當理解，在多個實施方式中，上述治療劑可以被單獨投與，即不與抗原結合蛋白軛合。藥物載量

藥物載量由p表示，並且是分子中藥物部分平均數/抗原結合蛋白。藥物載量（「p」）可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個部分（D）/抗原結合蛋白，儘管通常平均數係分數或小數。通常，1至4的藥物載量通常是有用的，並且1至2也是有用的。本揭露的ADC包括與一系列藥物部分（從1至20）軛合的抗原結合蛋白的集合。來自軛合反應的ADC製劑中的藥物部分平均數/抗原結合蛋白可以藉由常規方法（如質譜法和ELISA測定）來表徵。

也可以確定依據p的ADC的定量分佈。在一些情況下，可以藉由諸如電泳的方法實現均質ADC的分離、純化和表徵（其中p係來自具有其他藥物載量的ADC的特定值）。

對於一些ADC，p可能受抗原結合蛋白上附接位點的數量的限制。例如，在附接物係半胱胺酸硫醇的情況下，如在上述示例性實施方式中，抗原結合蛋白可以僅具有一個或若干個半胱胺酸硫醇基團，或者可以僅具有一個或若干個充分反應性硫醇基團，藉由該基團可以附接連接子。在某些實施方式中，較高的藥物載量（例如p ＞ 5）可能導致某些抗體-藥物軛合物的聚集、不溶性、毒性、或喪失細胞通透性。在某些實施方式中，針對本揭露ADC的藥物載量的範圍係1至約8；從約2至約6；從約3至約5；從約3至約4；從約3.1至約3.9；從約3.2至約3.8；從約3.2至約3.7；從約3.2至約3.6；從約3.3至約3.8；或從約3.3至約3.7。實際上，已經表明，對於某些ADC，藥物部分/抗原結合蛋白的最佳比例可以小於8，並且可以是約2至約5。參見美國專利公開案號2005/0238649 A1（在此藉由引用以其全文併入本文）。

在某些實施方式中，在軛合反應期間，少於理論最大值的藥物部分與抗原結合蛋白軛合。抗原結合蛋白可以包含例如不與如下所述的藥物-連接子中間體或連接子試劑反應的離胺酸殘基。通常，抗體不包含許多游離的和反應性的半胱胺酸硫醇基團，該等基團可以與藥物部分連接；實際上，抗體中的大多數半胱胺酸硫醇殘基以二硫鍵存在。在某些實施方式中，在部分或總還原條件下，可以用還原劑（如二硫蘇糖醇（DTT）或三羰基乙基膦（TCEP））還原抗體，以產生反應性半胱胺酸硫醇基團。在某些實施方式中，使抗體經歷變性條件以揭示反應性親核基團（例如離胺酸或半胱胺酸）。

可以按不同的方式控制ADC的載量（藥物/抗原結合蛋白比率），例如藉由：(i) 限制藥物-連接子中間體或連接子試劑相對於抗體的莫耳過量；(ii) 限制軛合反應時間或溫度；(iii) 針對半胱胺酸硫醇修飾的部分還原條件或限制性還原條件；(iv) 藉由重組技術，使抗原結合蛋白的胺基酸序列工程化，使得半胱胺酸殘基的數目和位置被修飾用於控制連接子-藥物附接的數目和/或位置（諸如在例如國際專利公開案號WO 2006/034488（在此藉由引用以其全文併入本文）中揭露所製備的thioMab或thioFab）。

應理解，當多於一個親核基團與藥物-連接子中間體或連接子試劑反應，隨後與藥物部分試劑反應時，則所得產物係ADC化合物的混合物，其中具有與抗原結合蛋白附接的一個或多個藥物部分的分佈。藥物平均數/抗原結合蛋白可以藉由雙重ELISA抗體測定從混合物計算，該抗體測定對抗原結合蛋白係特異性的並且對藥物係特異性的。可以藉由質譜法在混合物中鑒定單個ADC分子，並藉由HPLC分離，例如疏水相互作用層析法。

在一些實施方式中，可以藉由電泳或層析法從軛合混合物中分離具有單一載量值的均質ADC。組成物

藉由將具有所需純度的抗原結合蛋白與視需要的藥學上可接受的運載體、賦形劑或穩定劑混合來製備根據本揭露使用的製劑用於儲存（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition [雷明頓藥物科學，第16版], Osol, A.編輯[1980]），處於凍乾製劑或水溶液的形式。本揭露的組成物較佳的是無菌的。可接受的運載體、賦形劑或穩定劑在所用劑量和濃度下對接受者係無毒的，並且包括緩衝劑（如磷酸鹽、檸檬酸鹽）和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫胺酸; 防腐劑（如十八烷基二甲基苄基氯化銨；六甲基氯化銨；氯化卞二甲烴銨、氯化本索寧；苯酚、丁基或苄醇；烷基對羥基苯甲酸酯，如甲基對羥基苯甲酸酯或丙基對羥基苯甲酸酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲酚）；低分子量（少於約10個殘基）多肽；蛋白質（如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白）；親水聚合物（如聚乙烯吡咯啶酮）；胺基酸（如甘胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸）；單糖、二糖和其他碳水化合物（包括葡萄糖、甘露糖或糊精）；螯合劑（如EDTA）；糖（如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇）；成鹽抗衡離子（如鈉）；金屬錯合物（如Zn-蛋白質錯合物）；和/或非離子型表面活性劑（如TWEEN^TM 、PLURONICS^TM 或聚乙二醇（PEG））。

該製劑還可含有所治療的具體適應症所必需的一種以上的活性化合物，較佳的是那些具有互補活性而不會相互產生不利影響的活性化合物。例如，可能需要提供具有其他特異性的抗原結合蛋白。可替代地或另外地，組成物可以包含細胞毒性劑、細胞介素、生長抑制劑和/或小分子拮抗劑，例如本文提及的任何藥物。此類分子合適地以對預期目的有效的量組合存在。

也可以將活性成分包埋在例如藉由凝聚技術或藉由介面聚合製備的微膠囊（例如分別為羥甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊）中，包埋在膠體藥物遞送系統（例如脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米顆粒和奈米膠囊）中或包埋在粗滴乳狀液中。此類技術揭露於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition [雷明頓藥物科學，第16版], Osol, A. 編輯(1980)中。

可以製備持續釋放製劑。持續釋放製劑的適合的實例包括含有抗原結合蛋白的固體疏水聚合物的半透性基質，該基質處於成型製品的形式（例如薄膜或微膠囊）。持續釋放基質的實例包括聚酯、水凝膠（例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇)）、聚乳酸（美國專利案號3,773,919）、L-麩胺酸和γ-乙基-L-麩胺酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOT^TW （由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球），以及聚-D-(-)-3-羥丁酸。雖然聚合物（如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸）能夠釋放分子超過100天，但某些水凝膠釋放蛋白質持續的時間更短。

當包封的抗體長時間保留在體內時，它們會因暴露於37°C的濕氣而變性或聚集，導致生物活性的喪失和免疫原性的可能變化。可以根據所涉及的機制設計合理的策略以實現穩定。例如，如果發現聚集機理係藉由硫代-二硫化物交換形成分子間S-S鍵，則可以藉由修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍乾、控制水分含量、使用適當的添加劑並且開發特定的聚合物基質組成物來實現穩定化。投與模式

根據臨床上可接受的方法將抗原結合蛋白和視需要的共同治療（例如一種或多種化學治療劑或另一種抗體治療劑（例如，抗PD-1抗體））按以下途徑投與受試者，例如靜脈內、肌內、腹膜內、皮下、關節內、病灶內、滑膜內、鞘內、口服、局部、腫瘤內、藉由淋巴管輸入或吸入途徑。較佳的是靜脈內或皮下投與抗原結合蛋白。預期推注和連續輸注，如在疾病或損傷部位局部投藥。還考慮了在離體方法中使用抗原結合蛋白（視需要與另一種治療劑）。例如，患者的血液或其他體液可以離體與抗原結合蛋白接觸，並且視需要係投與。抗原結合蛋白可以與適合的不溶性基質或固體支持物結合。使用方法

本揭露提供了治療對其有需要的受試者之方法，該方法包括向受試者投與本文所述的抗原結合蛋白（例如，抗體或異源二聚體抗體）。在多個實施方式中，本揭露提供了在對其有需要的受試者中治療癌症（例如前列腺癌或Ewing氏肉瘤（Ewing sarcoma））之方法，該方法包括向受試者投與本文所述的抗原結合蛋白（例如，抗體或異源二聚體抗體）。本揭露進一步提供了本揭露的抗原結合蛋白（例如，抗體或異源二聚體抗體）用於治療對其有需要的受試者的用途，例如用於在受試者中治療癌症（例如，前列腺癌或Ewing氏肉瘤）的用途。該癌症較佳的是與STEAP1表現增加相關的癌症（例如，多於10,000個STEAP1/細胞）。癌症的實例包括但不限於前列腺癌、乳癌、胰臟癌、膀胱癌、胃腸道癌、睾丸癌、卵巢癌、子宮頸癌，以及肉瘤（Ewing氏肉瘤）和黑素瘤。

治療本文所述受試者的方法旨在提供疾病或病症的改善，和/或與疾病或病症相關的症狀的改善。例如，治療應答係指疾病中的以下改善中的一種或多種：(1) 贅生性細胞數量減少；(2) 贅生性細胞死亡增加；(3) 贅生性細胞存活的抑制；(5) 腫瘤生長或新病變出現的抑制（即，在一定程度上減慢，較佳的是停止）；(6) 提高的患者存活率；和/或 (7) 從與疾病或病症（例如，在前列腺癌、尿頻、夜尿、血尿、排尿困難或骨痛的情況下；在受影響的區域中Ewing氏肉瘤、疼痛，腫脹或壓痛的情況下）相關的一種或多種症狀中得到一些緩解。

任何給定疾病或病症中的治療應答可以藉由對該疾病或病症特異的標準化應答標準來確定。可以使用篩查技術評估腫瘤應答，例如磁共振成像（MRI）掃描、x-放射成像、電腦斷層攝影術（CT）掃描、正電子發射斷層掃描（PET）、骨掃描、超音波、腫瘤活檢取樣、循環中的腫瘤細胞的計數、和/或腫瘤抗原的測量（例如，前列腺特異性抗原（PSA）和/或甲胎蛋白（AFP））。除了該等治療應答之外，接受治療的受試者可以經歷與疾病相關的症狀改善的有益效果。

受試者係哺乳動物，較佳的是人，視需要人類男性。在癌症的情況下，受試者可被診斷為該疾病的任何階段（即，I期、II期、III期或IV期前列腺癌），或可能處於發展為尚未臨床證實的癌症的風險。

對於前列腺癌，受試者可能經歷前列腺癌相關的症狀（例如本文所述的那些）的減少、腫瘤大小的減小、前列腺癌標誌物水平的降低、新病變的出現率降低等。在多個方面，本揭露的方法進一步包括監測受試者的治療。考慮受試者健康狀況的任何改善（例如，沒有臨床可檢測的疾病，在沒有新病灶情況下可測量的腫瘤負荷的任何減少（例如至少約50%減少）（即，受試者中存在的惡性細胞的數量或測量的腫瘤腫塊質量）、疼痛減輕、排尿改善）。

根據本揭露的治療包括所使用的藥物的「治療有效量」。「治療有效量」係指以劑量計並且持續所需的時間段以實現所希望的治療結果的有效的量。「治療有效量」可以根據多種因素而變化，例如個體疾病狀態、年齡、性別、以及體重，以及藥物在個體中引發希望的應答的能力。治療有效量還是其中的任何毒性或不利影響被治療有益的效果勝過的一個量。用於腫瘤治療的「治療有效量」還可以藉由其穩定疾病進展的能力來測量。本揭露的治療有效量的抗原結合蛋白的示例性、非限制性範圍係約0.1-100 mg/kg。為了易於投與和劑量均勻性，可以將腸胃外組成物配製成單位劑型。劑量單位形式用於本文時係指作為針對待治療受試者的單一劑量適合的物理上離散的單位；每個單位含有與所需藥用載體聯合的、經計算產生所希望的生物效果的預定量的治療劑。

在一些實施方式中，將抗原結合蛋白（例如，單特異性抗體或異源二聚體抗體）與一種或多種另外的治療劑（例如，化學治療劑或免疫治療劑）組合使用。可以將一種或多種另外的治療劑連續投與（在彼此的分鐘、小時、天、或周內）或平行投與；它們還可以按預先混合的單一組成物投與患者。

DNA損傷性化學治療劑的非限制性實例包括拓撲異構酶I抑制劑（例如，伊立替康（irinotecan）、托泊替康（topotecan）、喜樹鹼及其類似物或代謝物，和多柔比星（doxorubicin））；拓撲異構酶II抑制劑（如依託泊苷、替尼泊苷和柔紅黴素）；烷基化劑（例如，美法侖、苯丁酸氮芥（chlorambucil,）、白消安（busulfan）、噻替派（thiotepa,）、異環磷醯胺、卡莫司汀（carmustine）、洛莫司汀（lomustine）、司莫司汀（semustine）、鏈脲黴素（streptozocin）、胺烯咪胺、胺甲喋呤、絲裂黴素C和環磷醯胺）；DNA嵌入劑（如順鉑、奧沙利鉑（oxaliplatin）、表柔比星（epirubicin）和卡鉑（carboplatin））；DNA嵌入劑和自由基生成劑（如博來黴素）；和核苷模擬物（例如，5-氟脲嘧啶、卡培他濱（capecitibine）、吉西他濱（gemcitabine）、氟達拉濱（fludarabine）、阿糖胞苷（cytarabine）、巰基嘌呤，硫鳥嘌呤、噴司他丁（pentostatin）和羥基脲）。

破壞細胞複製的化學治療劑包括但不限於紫杉醇、多西他賽和相關類似物；卡巴他塞（cabzitaxel）；長春新鹼、長春鹼和相關類似物；沙利度胺（thalidomide）、來那度胺（lenalidomide）和相關類似物（例如CC-5013和CC-4047）；酪胺酸蛋白激酶抑制劑（例如，甲磺酸伊馬替尼（imatinib）和吉非替尼（gefitinib））；蛋白酶體抑制劑（例如，硼替佐米（bortezomib））；NF-κB抑制劑（包括IκB激酶抑制劑）；抗體，其與癌症中過表現的蛋白質結合，從而下調細胞複製（例如，曲妥珠單抗（trastuzumab,）、利妥昔單抗（rituximab）、西妥昔單抗（cetuximab）和貝伐單抗（bevacizumab））；以及已知在癌症中上調的、過表現的或活化的蛋白質或酶（對其的抑制作用下調細胞複製）的其他抑制劑。

在一些實施方式中，本揭露的抗原結合蛋白（例如，單特異性抗體或異源二聚體抗體）可在用多西他賽的治療之前，與其同時或之後使用。在多個方面，抗原結合蛋白（例如，單特異性抗體或異源二聚體抗體）作為包括手術和/或放射（例如，外部束或近距離放射治療）的治療計畫的一部分投與。

在多個方面，抗原結合蛋白（例如，單特異性抗體或異源二聚體抗體）作為治療計畫的一部分提供，該治療計畫還包括投與激素療法（例如，雄性激素剝奪療法，例如阻斷促黃體激素釋放激素釋放或產生的藥劑（例如，亮丙瑞林（leuprolide）、戈舍瑞林（goserelin）、曲普瑞林（triptorelin）或地加瑞克（degarelix））；抗雄激素（例如比卡魯胺（bicalutamide）、氟他胺（flutamide）或尼魯米特（nilutamide））；酮康唑；醋酸阿比特龍（abiraterone）；恩雜魯胺（enzalutamide）），

在多個方面，抗原結合蛋白（例如，單特異性抗體或異源二聚體抗體）作為治療計畫的一部分提供，該治療計畫還包括投與另一種免疫療法（例如，西普魯塞-T（sipuleucel-T）、貝伐單抗、阿特珠單抗（atezolizumab）、阿維魯單抗（avelumab）、易普利姆瑪、曲美木單抗（tremelimumab）、AM-224、MDX-1105、依替莫德α（eftilagimod alpha）（IMP321）、或依諾妥珠單抗（enoblituzumab）（MGA271））。在這方面，該方法視需要包括投與另一種靶向不同抗原的抗原結合蛋白，例如癌症相關的抗原或與免疫應答相關的抗原。例如，在多個實施方式中，將抗STEAP1抗原結合蛋白與PD-1靶向抗原結合蛋白（例如，抗體）一起投與受試者，該PD-1靶向抗原結合蛋白降低、阻斷、抑制、消除或干擾來自PD-1與其一種或多種結合配偶體（例如PD-L1或PD-L2）的相互作用的訊號轉導。在具體的方面，PD-1抗原結合蛋白抑制PD-1與PD-L1和/或PD-L2的結合。在一個實施方式，PD-1抗原結合蛋白減少由T淋巴細胞上表現的細胞表面蛋白介導的藉由PD-1的傳訊所介導的或藉由其的負共刺激訊號，從而使功能失調的T細胞減少功能失調（例如，增強效應子對抗原識別的應答）。抗PD-1抗體的實例包括納武單抗（nivolumab）（BMS-936558）、派姆單抗（pembrolizumab）（MK-3475）、BMS 936558、BMS- 936559、TSR-042（Tesaro公司）、ePDR001（諾華公司（Novartis））和匹地利珠單抗（pidilizumab）（CT-011）。雖然本揭露涉及PD-1抗原結合蛋白，本揭露還考慮使用其他PD-1結合拮抗劑，該等拮抗劑減少、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-1與一種或多種其結合配偶體（partner）（如PD-L1或PD-L2）相互作用引起的訊號轉導。

本文提供的關於抗STEAP1抗原結合蛋白的本揭露內容還適用於抗PD-1抗原結合蛋白。例如，在不同情況下，抗PD-1抗原結合蛋白係抗體（例如單株IgG）。抗PD-1抗體、其抗原結合抗體片段、或抗PD-1抗體蛋白產物係單價或二價的。在示例性方面，抗PD-1抗體、其抗原結合抗體片段、或抗PD-1抗體蛋白產物與人PD-1（其具有SEQ ID NO: 187的胺基酸序列）結合。在示例性方面，抗PD-1抗體、其抗原結合抗體片段、或抗PD-1抗體蛋白產物與食蟹猴PD-1（其具有SEQ ID NO: 188的胺基酸序列）結合。在示例性實例中，抗PD-1抗體、其抗原結合抗體片段、或抗PD-1抗體蛋白產物與人PD-1和食蟹猴PD-1二者結合。

在示例性實施方式中，抗PD-1抗體、其抗原結合抗體片段、或抗PD-1抗體蛋白產物與PD-1的結合強度可以用KD描述。在示例性方面，本文提供的抗PD-1抗體、其抗原結合抗體片段、或抗PD-1抗體蛋白產物的KD為約10^-1 M、約10^-2 M、約10^-3 M、約10^-4 M、約10^-5 M、約10^-6 M、約10^-7 M、約10^-8 M、約10^-9 M、或更低。在示例性方面，本文提供的抗PD-1抗體、其抗原結合抗體片段、或抗PD-1抗體蛋白產物的KD係微莫耳、納莫耳、皮莫耳或飛莫耳。在示例性方面，本文提供的抗PD-1抗體、其抗原結合抗體片段、或抗PD-1抗體蛋白產物的KD係在約10^-4 至10^-6 M、或10^-7 至10^-9 M、或10^-10 至10^-12 M、或10^-13 至10^-15 M的範圍內。在示例性方面，抗PD-1抗體、其抗原結合抗體片段、或抗PD-1抗體蛋白產物對人PD-1、食蟹猴PD-1、或二者具有高親和力。在示例性方面，抗PD-1抗體、其抗原結合抗體片段、或抗PD-1抗體蛋白產物對人PD-1的KD為低於100 pM，視需要約1 pM至約50 pM。在示例性方面，抗PD-1抗體、其抗原結合抗體片段、或抗PD-1抗體蛋白產物對人PD-1的KD在約1 pM至約20 pM內或低於約10 pM。在示例性方面，抗PD-1抗體、其抗原結合抗體片段、或抗PD-1抗體蛋白產物對食蟹猴PD-1的KD為低於100 pM，視需要約1 pM至約75 pM。在示例性方面，抗PD-1抗體、其抗原結合抗體片段、或抗PD-1抗體蛋白產物對食蟹猴PD-1的KD在約1 pM至約20 pM內或低於10 pM。

在示例性方面，抗PD-1抗體、其抗原結合抗體片段、或抗PD-1抗體蛋白產物將PD-1和PD-L1或PD-L2之間的結合相互作用抑制至少50%。在示例性方面，抗PD-1抗體、其抗原結合抗體片段、或抗PD-1抗體蛋白產物展示出對PD-1和PD-L1或PD-L2之間結合相互作用的至少約50%、至少約60%、或至少約70%的抑制。

在示例性實例中，在混合的淋巴細胞反應（MLR）中，藉由抗PD-1抗體、其抗原結合抗體片段、或抗PD-1抗體蛋白產物抑制PD-1介導的T細胞IL-2產生。在示例性方面，在MLR中抗PD-1抗體、其抗原結合抗體片段、或抗PD-1抗體蛋白產物的IC50係在約0.1 nM至約5 nM內。在示例性方面，在MLR中抗PD-1抗體、其抗原結合抗體片段、或抗PD-1抗體蛋白產物的IC50低於2 nM或低於1 nM。在示例性方面，在MLR中抗PD-1抗體、其抗原結合抗體片段、或抗PD-1抗體蛋白產物的IC50為約0.5 nM至約2 nM。

測試抗體與PD-1結合能力的方法係本領域已知的，並且包括任何適合的抗體-抗原結合測定，例如像放射免疫測定（RIA）、ELISA、西方墨點法、免疫沈澱法、SPR、和競爭性抑制測定（參見，例如，Janeway等人., 下文，和美國專利申請公開案號2002/0197266，以及與競爭測定有關的上述部分）。其他結合測定（例如競爭性結合測定或競爭測定，該等測定測試抗體與第二抗體競爭與抗原或與其表位結合的能力）可用於測試抗體與PD-1結合的能力。參見，例如，美國專利申請公開案號2014/0178905；Chand等人., Biologicals [生物製品] 46: 168-171 (2017)；Liu等人., Anal Biochem [分析生物化學] 525: 89-91 (2017)；以及Goolia等人., J Vet Diagn Invest [獸醫診斷調查雜誌] 29(2): 250-253 (2017)。此外，比較兩種抗體的其他方法係本領域已知的，並且包括例如表面電漿共振（SPR）。可以將SPR用於測定抗體和第二抗體的結合常數，並且可以比較這兩個結合常數。本揭露考慮使用抗PD1抗原結合蛋白，其在本揭露方法的上下文中與本文所述的任何抗PD-1抗體與PD-1蛋白的結合競爭或交叉阻斷該結合。

用於表徵人和食蟹猴PD-1結合親和力的代表性方法如下。將抗體在含有3倍連續稀釋的可溶性重組受體人PD-1(1-170)-FLAG-His或食蟹猴PD-1(1-167)-FLAG-His的孔中孵育。在兩種情況下，可以選擇30 nM的最高PD-1濃度。可以使用300秒的締合和500秒的解離，因為該等參數通常產生足夠的曲率以用於精確的動力學擬合。可以用ForteBio Octet HTX和RED384儀器對人/食蟹猴PD-1結合親和力定量。標準Octet樣本緩衝液可用於樣本稀釋和結合基線、締合、和解離步驟（例如，10 mM Tris、pH 7.5、150 mM NaCl、1 mM CaCl2、0.10 mg.ml BSA、0.13%（v/v）Triton X-100）。可以使用標準儀器數據分析軟體（v9和v10）以下列方式處理ForteBio原始數據：(a) 將具有固定靶標但沒有相互作用的兩條參考曲線（即僅緩衝液）平均，並從同一列中的剩餘樣本曲線中減去；(b) 分離締合和解離曲線並與Y軸對齊；(c) 締合和解離級間係對齊的；(d) 實施Savitzky-Golay濾除以減少訊號雜訊，和 (e) 針對每個樣本-靶標相互作用的締合和解離曲線組用單個1 : 1結合模型全域擬合，以確定結合速率常數ka和解離速率常數kd的測量值；將平衡解離常數KD計算為解離和締合速率常數的比率（= kd/ka）。

在示例性實例中，抗PD-1抗體（或其抗原結合抗體片段或抗體蛋白產物）包含：在SEQ ID NO: 189中列出的重鏈（HC）互補決定區1（vhCDR1）胺基酸序列、在SEQ ID NO: 190中列出的HC CDR2（vhCDR2）胺基酸序列、在SEQ ID NO: 191中列出的HC CDR3（vhCDR3）胺基酸序列、在SEQ ID NO: 192中列出的輕鏈（LC）CDR1（vlCDR1）胺基酸序列、在SEQ ID NO: 193中列出的LC CDR2（vlCDR2）胺基酸序列、和在SEQ ID NO: 194中列出的LC CDR3（vlCDR3）胺基酸序列。在示例性實施方式中，抗PD-1抗體（或其抗原結合抗體片段或抗體蛋白產物）包含重鏈可變區（vh）和/或輕鏈可變區（vl），該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 195的胺基酸序列具有至少90%同一性（例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性）的胺基酸序列；該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 196的胺基酸序列具有至少90%同一性（例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性）的胺基酸序列。在示例性實施方式中，抗PD-1抗體（或其抗原結合抗體片段或抗體蛋白產物）包含重鏈和/或輕鏈，該重鏈包含與SEQ ID NO: 197的胺基酸序列具有至少90%同一性（例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性）的胺基酸序列；該輕鏈包含與SEQ ID NO: 198的胺基酸序列具有至少90%同一性（例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性）的胺基酸序列。

在示例性方面，本文所述的抗STEAP1構建體係治療方案的一部分，該治療方案包括投與有效抑制腫瘤轉移和/或對至少一個細胞群具有抗增殖作用的細胞介素、淋巴因子、生長因子、或造血因子。此類細胞介素、淋巴因子、生長因子、或其他造血因子包括但不限於：M-CSF、GM-CSF、TNF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IFN、TNFα、TNF1、TNF2、G-CSF、Meg-CSF、GM-CSF、促血小板生成素、幹細胞因子、和紅血球生成素。另外的生長因子包括例如，血管生成素（angiogenin）、骨形態發生蛋白（bone morphogenic protein）-1、骨形態發生蛋白-2、骨形態發生蛋白-3、骨形態發生蛋白-4、骨形態發生蛋白-5、骨形態發生蛋白-6、骨形態發生蛋白-7、骨形態發生蛋白-8、骨形態發生蛋白-9、骨形態發生蛋白-10、骨形態發生蛋白-11、骨形態發生蛋白-12、骨形態發生蛋白-13、骨形態發生蛋白-14、骨形態發生蛋白-15、骨形態發生蛋白受體IA、骨形態發生蛋白受體IB、腦源性神經營養因子、睫狀神經營養因子、睫狀神經營養因子受體α、細胞介素誘導的中性粒細胞趨化因子1、細胞介素誘導的中性粒細胞、趨化因子2 α、細胞介素誘導的中性粒細胞趨化因子2 β、β內皮細胞生長因子、內皮素1、上皮衍生的中性粒細胞引誘劑、膠質細胞系衍生的神經營養因子受體α 1、膠質細胞系衍生的神經營養因子受體α 2、生長相關蛋白、生長相關蛋白α、生長相關蛋白β、生長相關蛋白γ、肝素結合表皮生長因子、肝細胞生長因子、肝細胞生長因子受體、胰島素樣生長因子I、胰島素樣生長因子受體、胰島素樣生長因子II、胰島素樣生長因子結合蛋白、角化細胞生長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受體α、神經生長因子、神經生長因子受體、神經營養因子-3、神經營養因子-4、前B細胞生長刺激因子、幹細胞因子、幹細胞因子受體、轉化生長因子α、轉化生長因子β、轉化生長因子β1、轉化生長因子β1.2、轉化生長因子β2、轉化生長因子β3、轉化生長因子β5、潛在轉化生長因子β1、轉化生長因子β結合蛋白I、轉化生長因子β結合蛋白II、轉化生長因子β結合蛋白III、腫瘤壞死因子受體I型、腫瘤壞死因子受體II型、尿激酶型纖溶酶原活化劑受體、和嵌合蛋白以及其生物學或免疫學活性片段。在示例性實施方式中，抗STEAP1構建體作為治療方案的一部分被投與，該治療方案涉及投與對前述細胞介素、淋巴因子、生長因子或其他造血因子中的任一種特異性的抗體。

本揭露考慮了抗STEAP1抗原結合蛋白或異源二聚體抗體在製備用於在對其有需要的受試者中治療癌症的藥物中的用途。視需要，該藥物係用於投與與有效量的抗PD-1抗原結合蛋白（例如，本文所述的抗PD-1抗原結合蛋白中的任一種）聯合的有效量的抗STEAP1抗原結合蛋白或異源二聚體抗體。

本揭露進一步考慮了用於在對其有需要的受試者中治療癌症（即，在對其有需要的受試者中治療癌症（如前列腺癌或Ewing氏肉瘤）的方法）中使用的本文所述的抗STEAP1抗原結合蛋白或異源二聚體抗體。視需要，將抗STEAP1抗原結合蛋白或異源二聚體抗體與抗PD1抗原結合蛋白一起投與。藉由「與······一起投與」來表示抗STEAP1抗原結合蛋白或異源二聚體抗體係包括投與抗PD1抗原結合蛋白的治療方案的一部分。實際上，抗STEAP1抗原結合蛋白（例如，異源二聚體抗體）可以在用抗PD1抗原結合蛋白治療之前、與其同時或之後使用。抗STEAP1抗原結合蛋白或異源二聚體抗體和抗PD1抗原結合蛋白的投與不需要同時發生，儘管本揭露考慮了其中組分包含在相同藥物組成物中並一起投與的實施方式。本揭露還提供了治療方法，其中抗STEAP1抗原結合蛋白或異源二聚體抗體和抗PD1抗原結合蛋白存在於分開的藥物組成物中，該等藥物組成物平行投與或近時間施用。可以將抗STEAP1抗原結合蛋白或異源二聚體抗體和抗PD1抗原結合蛋白按任何順序連續投與（例如，在彼此的分鐘、小時、天、或周內）。投與模式如上所述。

例如，在體外或體內檢測STEAP1的存在的測定中也可以使用本文所述的抗STEAP1抗原結合蛋白。還可以藉由例如免疫親和層析，使用抗原結合蛋白來純化STEAP1。核酸、載體、宿主細胞

本揭露進一步提供了編碼本文所述的抗原結合蛋白（例如，單特異性抗體或異源二聚體抗體）的核酸組成物。編碼本揭露的抗原結合蛋白的組分的核酸可以如本領域已知的並且取決於用於產生該抗原結合蛋白的宿主細胞而被摻入表現載體中。表現載體的實例包括但不限於質體、病毒載體、非游離型哺乳動物載體和其他表現載體。通常，編碼所希望的多肽的核酸序列與任何數量的調節元件（啟動子、複製起點、選擇標誌物、核糖體結合位點、誘導子等）可操作地連接。表現載體可以是染色體外載體或整合載體。

本揭露的核酸和/或表現載體視需要被引入本領域熟知的任何數量的不同類型的宿主細胞（包括哺乳動物、細菌、酵母、昆蟲和/或真菌細胞）中，其中哺乳動物細胞（例如，CHO細胞）可用於許多實施方式。在另一個方面，本揭露提供了這樣的宿主細胞，其中已經引入編碼抗原結合蛋白的表現載體。適合的哺乳動物宿主細胞系的實例包括猴腎細胞的COS-7系（ATCC CRL 1651）（Gluzman等人., 1981, Cell [細胞]23:175）、L細胞、人胚腎293細胞或其衍生物（例如，HEK293T、HEK293-EBNA）、C127細胞、小鼠胚胎成纖維細胞（3T3細胞）（ATCC CCL 163）、中國倉鼠卵巢（CHO）細胞和其衍生物（例如，CHO-K1、CHO pro-3）、小鼠骨髓瘤細胞（例如，NS0、GS-NS0、Sp2/0）、人宮頸癌細胞（HeLa細胞）、幼倉鼠腎（BHK）細胞（ATCC CRL 10）細胞系、人骨骨肉瘤上皮細胞U2-OS、腺癌人肺泡基底上皮細胞（A549）、人纖維肉瘤細胞（HT1080）、小鼠腦腫瘤細胞（CAD）、胚胎瘤細胞（P19）、小鼠神經母細胞瘤細胞（N2a）、人乳癌細胞s（MCF-7）、視網膜母細胞瘤細胞（Y79）、人視網膜母細胞瘤細胞（SO-Rb50）、人肝癌細胞（Hep G2）、小鼠B骨髓瘤細胞（J558L）、和非洲綠猴腎細胞（例如，COS細胞、VERO細胞和其衍生物（包括如由McMahan等人., 1991, EMBO J. [歐洲分子生物學學會會刊]10: 2821所描述的來源自非洲綠猴腎細胞系 CVI（ATCC CCL 70）的CVI/EBNA細胞系））。可以在促進抗原結合蛋白表現的條件下培養轉化的細胞，並藉由常規蛋白質純化程序回收蛋白質。一種這樣的純化程序包括使用親和層析法，例如經過STEAP1的全部或部分（例如，一個或多個胞外環）與其結合的的基質。考慮用於本文的抗原結合蛋白包括基本上不含污染性內源物質的基本上均質的重組抗原結合蛋白。

關於異源二聚體抗體，在多個方面，提供了組成物，該組成物包含編碼第一單體的核酸、編碼第二單體的核酸、和編碼共同輕鏈的核酸。本揭露還提供了編碼單體和共同輕鏈的部分的核酸構建體（例如結合STEAP1的抗STEAP1 Fab或包含本文揭露的六個CDR的抗體片段）、抗CD3 scFv、結合STEAP1和/或CD3的可變輕鏈和/或可變重鏈結構域等。

在一些實施方式中，通常在不同或相同的啟動子控制下，編碼每個單體的核酸和視需要編碼共同輕鏈的核酸各自包含在單一表現載體內。在多個實施方式中，這兩個或三個核酸中的每一個都包含在不同的表現載體上。如美國專利公開案號2016/0215063（在此藉由引用以其全文併入本文，並特別地是關於對重組抗體產生的討論）中所述，可以使用不同的載體比率用於驅動異源二聚體形成。令人驚訝地，在抗體構建體包含以1 : 1 : 2比率的第一單體 : 第二單體 : 輕鏈的情況下，該等不一定係產生最佳結果的比例。參見美國專利公開案號2016/0215063的圖65，藉由引用並於本文。在多個方面，本揭露提供了核酸組成物，其包含：a) 包含第一核酸的第一表現載體，該第一核酸編碼第一單體；b) 包含第二核酸的第二表現載體，該第二核酸編碼第二單體；和c) 包含第三核酸的第三表現載體，該第三核酸編碼共同輕鏈。在可替代的實施方式中，編碼共同輕鏈的第三核酸與第一或第二核酸存在於相同的表現載體上。

異源二聚體抗體視需要藉由培養包含一種或多種表現載體的宿主細胞來製備。一旦產生，就進行抗體純化步驟，典型地包括離子交換層析步驟。如本文所討論的，使兩個單體的pI相差至少0.5可以允許藉由離子交換層析或等電聚焦或對等電點敏感的其他方法進行分離。換言之，包含改變每個單體的等電點（pI）的pI取代使得每個單體具有不同的pI，並且異源二聚體也具有不同的pI，從而促進等電純化異源二聚體（例如，陰離子交換柱，陽離子交換柱）。該等取代還有助於確定和監測純化（例如，IEF凝膠、cIEF和分析IEX柱）後的任何污染性mAb同源二聚體。套組

在一些實施方式中，本揭露的抗原結合蛋白在套組（kit）中提供。在示例性方面，該套組包含作為單位劑量（即，分散在合適的載體中的離散量）的抗原結合蛋白。在示例性方面，該套組包含若干個單位劑量，例如，一周或一個月的單位劑量供應，視需要，每個單位劑量單獨包裝或以其他方式與其他單位劑量分開包裝。在一些實施方式中，該套組/單位劑量的組分與對患者投藥的說明書一起包裝。在一些實施方式中，該套組包含一種或多種用於向患者施用的裝置，例如針和遞送裝置（如注射器）等。在一些方面，抗原結合蛋白以即用形式（例如注射器，靜脈輸液袋等）預包裝，但還考慮抗原結合蛋白可以按需要重構的凍乾形式提供。在一些方面，套組進一步包含包括本文所述的任何一種的其他治療劑或診斷劑或藥學上可接受的運載體（例如，溶劑、緩衝劑、稀釋劑等）。

在此所引用的所有參考文獻（包括出版物、專利申請、和專利）均藉由引用在此併入，引用的程度如同每個參考文獻被個別地並且明確地指示藉由引用結合並且以其全部內容在此闡述。

給出以下實施方式僅用於說明本揭露而不以任何方式限制其範圍。實例實例1

該實例描述了使用如上所述的單特異性抗體在前列腺癌細胞的表面上檢測STEAP1。

將使用針對STEAP1的CRISPR構建體被工程化以喪失STEAP1表現的前列腺癌細胞（C4-2B luc細胞（圖11A）或C4-2B luc^{STEAP1 KO} 細胞（圖11B））與同種型對照抗體或抗STEAP1小鼠單株抗體（Ab-Am）以10 μg/mL的濃度在4°C下孵育1小時。在與FITC軛合的（圖11A）或APC軛合（圖11B）的抗小鼠IgG二抗孵育後，藉由流式細胞術檢測細胞結合的Ab-Am。將鑒定STEAP1依賴性訊號的FITC或APC螢光繪製在長條圖（實心灰色長條圖）中，並與同種型對照（白色長條圖）進行比較。結果顯示在圖11A和11B中。實例2

該實例描述了抗STEAP1抗體的表徵。

產生一組22種抗人STEAP1小鼠單株抗體。與其他測試相比，抗體A顯示出改進的流式細胞術結合特性（親本mAb結合LnCAP(+)/DU145(-) FACS轉換（倍數））：Ab-A（60.1）、Ab-B（3.6）、Ab-C（2.4）、和Ab-D（4.3）。

為確定由本揭露的抗體識別的STEAP1區，產生嵌合構建體，其中STEAP1的三個胞外環中的每一個被相應的STEAP2區替換並在293細胞中表現。Ab-A結合STEAP1，並且不結合STEAP2。用來自STEAP2的相應的環替換STEAP1的胞外環1和3消除了結合，而當胞外環2被STEAP2對應物替換時，Ab-A與STEAP1的結合未被破壞。Ab-A似乎與STEAP1的胞外環2外結合。

如在例如美國專利公開案號2016/0215063中所述，以「XmAb」型式製備包含Ab-A1、Ab-A2（N67Q）和Ab-B1的STEAP-1結合臂以及抗CD3結合臂的異源二聚體抗體。該等異源二聚體抗體顯示出TDCC活性（pM）: Ab-A1x（273.8）、Ab-A2x（387.9）、和Ab-B1x（128.7）。實例3

該實例比較了具有本揭露的異源二聚體抗STEAP1/抗CD3（Xmab²⁺¹ ）的不同支架的抗STEAP1/抗CD3雙特異性抗體（XmAb）與C4-2B細胞的結合（由EC50表徵）。

如例如美國專利公開案號2016/0215063（藉由引用併入本文，特別地是關於對「開瓶器」型式的討論）中所述產生處於「XmAb」型式的三種抗STEAP1人源化抗體（Ab-A1、Ab-A2(N67Q)和Ab-B1）。該XmAb型式需要：包含與抗CD3 scFv附接的Fc結構域的第一重鏈；包含Fc結構域和第一可變重鏈結構域的第二重鏈；以及包含可變輕鏈結構域和恒定輕鏈結構域的輕鏈。可變重鏈結構域和所述可變輕鏈結構域與STEAP1結合。以異源二聚體XmAb²⁺¹ 型式（Ab-A1 XmAb²⁺¹ 和Ab-B1 XmAb²⁺¹ ）產生兩種抗STEAP1人源化抗體。Ab-A1 XmAb²⁺¹ 和Ab-B1 XmAb²⁺¹ 的CDR序列列出在SEQ ID NO: 11-16（Ab-A1 XmAb²⁺¹ ）和SEQ ID NO: 30-35（Ab-B1 XmAb²⁺¹ ）中。還產生了具有N67Q修飾的Ab-A1 XmAb²⁺¹ 的變體，本文中被命名為Ab-A2(N67Q) XmAb²⁺¹ 。Ab-A2(N67Q) XmAb²⁺¹ 的CDR序列列出在SEQ ID NO: 11-13、14、16和21中。抗體命名Ab-A2和Ab-A2(N67Q) XmAb²⁺¹ 在本文中可互換地使用。評估異源二聚體雙特異性抗體與在C4-2B前列腺癌細胞的表面上表現的STEAP1結合的能力，以及評估未被人源化的處於XmAb型式（Ab-Mx1、Ab-Mx2、和Ab-Mx3）的三種小鼠抗STEAP1抗體。

將C4-2B-Luc細胞與遞增濃度的Ab-A1 XmAb²⁺¹ 、Ab-A1 Xmab、Ab-B1 Xmab、Ab-Mx1、Ab-Mx2和Ab-Mx3在4°C下孵育至5 μM，持續1小時。與APC軛合的抗人IgG二抗孵育後，藉由流式細胞術檢測細胞結合的抗體，並且檢測遞增濃度的各抗體的APC通道的平均螢光強度（MFI）。如表3所示，Ab-A1 Xmab²⁺¹ 表明細胞結合比處於XmAb型式的相同結合劑（即，Ab-A1 Xmab）的結合EC50低65倍，表明超過相應XmAb的非常強的親合力。XmAb²⁺¹ 型式顯著改進了Ab-A結合劑與在前列腺癌細胞上表現的STEAP1的結合。表3.抗STEAP XmAb和抗STEAP Xmab²⁺¹ 與C4-2B細胞的結合EC50

用Ab-A按以下多種型式（Ab-A（傳統的、單特異性抗體、非人源化）重複實驗：Ab-A1 XmAb型式、Ab-A1 Xmab²⁺¹ 型式、和Ab-A2(N67Q) Xmab²⁺¹ 型式（具有N67Q修飾））和Ab-B XmAb型式。在4°C下，將C4-2B-Luc細胞用遞增濃度的抗STEAPI XmAb或XmAb²⁺¹ 分子一起孵育至5 μM，持續1小時。與APC軛合的抗人IgG二抗孵育後，藉由流式細胞術檢測細胞結合的XmAb，並且展示遞增濃度的各抗STEAPI XmAb分子的APC通道的平均螢光強度（MFI）。結果顯示在以下圖12A-12C和圖13和表4中。 [表4]. EC50結合至C4-2B luc細胞

無論異源二聚體型式如何，該等抗體均結合STEAP1。與其他抗體型式相比，XmAb²⁺¹ 型式表明與STEAP1的改進的結合。

還使用與上述方法類似的方法評估TDCC活性。所有測試的抗體均顯示TDCC活性，其中XmAb²⁺¹ 的抗體表現出比Xmab抗體更好的活性：Ab-A XmAb（EC50 = 274 pM，EC90 = 438 pM）、Ab-A1 Xmab（EC50 = 388 pM，EC90 = 722 pM）、Ab-B1 Xmab（EC50 = 129 pM，EC90 = 265 pM）、Ab-A1 Xmab²⁺¹ （EC50 = 6 pM，EC90 = 11 pM）、和Ab-B1 Xmab²⁺¹ （EC50 = 19 pM，EC90 = 43 pM）。實例5

該實例表徵由抗STEAP1 XmAb和XmAb²⁺¹ 介導的人T細胞對人腫瘤細胞系C4-2B luc的裂解。

將C4-2B luc前列腺癌細胞與人泛T細胞按E : T細胞比率為10比1，以及遞增濃度的（圖14A）Ab-A1 XmAb、（圖14B）Ab-A1 XmAb²⁺¹ 、或（圖14C）Ab-A2(N67Q) XmAb²⁺¹ 型式（具有N67Q取代）共培養持續48小時。藉由螢光素酶活性測量監測靶細胞裂解，並且與無XmAb對照條件相比，在每個濃度下繪製特異性細胞毒性。如圖14A-14C所示，Ab-A1 Xmab、Ab-A1 XmAb²⁺¹ 、和Ab-A2(N67Q) XmAb²⁺¹ 成功介導靶細胞裂解。實例6

該實例證明了本揭露的異源二聚體抗體區分表現STEAP1細胞和不表現STEAP的細胞的能力。

STEAP1陽性C4-2B luc前列腺癌細胞（●）和STEAP1陰性C4-2B luc^{STEAP1 KO} 細胞（■）與人泛T細胞按E : T細胞比率為10比1以及遞增濃度的Ab-A1 XmAb²⁺¹ 共培養48小時。藉由螢光素酶活性測量監測靶細胞裂解，並且與對照條件（缺少XmAb）相比，在每個濃度下繪製特異性細胞毒性。結果示於以下圖15和表5中。Ab-A1 XmAb²⁺¹ 劑量依賴性地介導人腫瘤細胞系C4-2B luc的靶細胞裂解，但不介導被修飾以敲除STEAP1表現的C4-2B luc細胞的裂解。 [表5].在抗STEAP1 XmAb（Ab-A1 XmAb）和XmAb²⁺¹ （Ab-A1和Ab-A2(N67Q)）變體情況下針對C4-2B luc和C4-2B luc^STEAP1KO 的T細胞依賴性細胞毒性（TDCC）EC50

另外，用人STEAP1穩定轉染的293T細胞（圖16A）或親本293T細胞（圖16B）與同種型對照抗體或抗STEAP1 Ab-A小鼠單株抗體（Ab-Am；無雙特異性型式）按10 μg/mL的濃度在4°C下孵育1小時。在與FITC軛合的抗小鼠IgG二抗（圖16A）孵育後，藉由流式細胞術檢測細胞結合的Ab-Am。將鑒定STEAP1依賴性訊號的FITC螢光繪製在長條圖（實心灰色長條圖）中，並與同種型對照（白色長條圖）進行比較。如圖16A和16B所示，Ab-Am檢測在兩個所測試的細胞群中表現的STEAP-1。

圖16C說明了將STEAP1穩定的293T細胞（●）和STEAP1陰性親本293T細胞（■）與人泛T細胞按E : T細胞比率為10比1以及遞增濃度的Ab-A2(N67Q) XmAb²⁺¹ 共培養持續48小時的結果。藉由螢光素酶活性測量監測靶細胞裂解，並且與無XmAb對照條件相比，在每個濃度下繪製特異性細胞毒性。結果示於以下圖16A-16C和表6中。抗STEAP1/抗CD3異源二聚體抗體選擇性地介導表現STEAP1的細胞的細胞裂解。 [表6].在Ab-A2-N67Q XmAb²⁺¹ 情況下針對用人STEAP1穩定轉染的293T細胞和親本293T細胞的T細胞依賴性細胞毒性（TDCC）EC50

還將STEAP1陽性C4-2B luc前列腺癌細胞與人泛T細胞按E : T細胞比率為10比1以及遞增濃度的Ab-B1 Xmab（●）或Ab-B1 XmAb²⁺¹ （■）共培養持續48小時。如圖17A所示，Ab-B1 Xmab和Ab-B1 XmAb²⁺¹ 介導C4-2B luc前列腺癌細胞的靶細胞裂解。

將C4-2B luc前列腺癌細胞與人泛T細胞按E : T細胞比率為10比1以及遞增濃度的XmAb²⁺¹ Ab-B1-G37A（具有G37A取代的XmAb²⁺¹ ）（■）、XmAb²⁺¹ Ab-B1-S39A（具有S39A取代的XmAb²⁺¹ 型式）（▲）、或XmAb²⁺¹ Ab-B1-G37A/S39A（同時具有G37A和S39A取代的XmAb²⁺¹ 型式）（▼ ）共培養持續48小時。如圖17B中顯示，Ab-B1變體（即，Ab-B1-G37A、Ab-B1-S39A、和Ab-B1-G37A/S39A）介導C4-2B luc前列腺癌細胞的靶細胞裂解。還參見以下表7。類似地，將STEAP1陰性C4-2B luc^{STEAP1 KO} 癌細胞與人泛T細胞按E : T細胞比率為10比1以及遞增濃度的Ab-B1 XmAb²⁺¹ （●）、Ab-B1-G37A（ ■）、Ab-B1-S39A（▲）、或Ab-B1-G37A/S39A（▼）共培養持續48小時。藉由螢光素酶活性測量監測靶細胞裂解，並且與無XmAb對照條件相比，在每個濃度下繪製特異性細胞毒性。結果示於以下圖17C和表7中。抗STEAP1/抗CD3異源二聚體抗體選擇性地介導表現STEAP1的細胞的細胞裂解，並且本揭露的XmAb²⁺¹ 型式優於其他型式。 [表7].在Ab-B1變體情況下針對C4-2B luc和C4-2B luc^STEAP1KO 的T細胞依賴性細胞毒性（TDCC）EC50

實例7

該實例表徵了本揭露的異源二聚體抗體Ab-A2(N67Q) XmAb²⁺¹ 針對人和食蟹猴CD3ε的平衡結合常數（KD）。

使用表面電漿共振（SPR - Pioneer FE），測量重組人或食蟹猴CD3ε的親和力Ab-A2(N67Q) XmAb²⁺¹ 。使用標準胺偶聯程序，在約60 RU下，將重組人CD3ε-Fc和食蟹猴CD3ε-Fc固定在CM5晶片表面上。將Ab-A2(N67Q) XmAb²⁺¹ 按100、33.3、11.1和3.7 nM的濃度注射。如下表8中所列，分別針對120秒和300秒記錄Ab-A2(N67Q) XmAb²⁺¹ 與配位基相互作用的締合速率和解離速率。平衡解離常數（K _D ）值作為解離速率常數和締合速率常數（k_解離 /k_締合）的比率導出。 [表8].Ab-A2-N67Q XmAb²⁺ 與人和食蟹猴CD3相互作用的締合速率和解離速率「a」表示使用BIAcore®生成的數據，並且「b」表示使用Octet生成的數據

實例8

該實例說明了本揭露的異源二聚體抗體（Ab-A2(N67Q) XmAb²⁺¹ ）介導顯示一系列STEAP1表面密度的靶細胞的裂解。

評估多種靶細胞系（SNU-5、C4-2B、Sk-N-MC、LOX-IMVI、VCaP、IM-95、TYKNU、22RV-1、HBSCM、HUCCT1、PC3、HCT116和NCIH1869）表面上的STEAP-1密度。參見下表9，鑒定了如使用Dako Qifikit方法測量的在第3列中的STEAP1密度（STEAP I抗體結合位點的數目/細胞）。 [表9].STEAP1表面密度和T細胞依賴性細胞毒性（TDCC）EC50和EC90

在單獨的研究中，評估了OE33、EBC1、和A673細胞系表面上的STEAP-1密度。參見下表10，鑒定了如使用Dako Qifikit方法測量的在第3列中的STEAP1密度（STEAP I抗體結合位點的數目/細胞）。

將來自人供體的T細胞與靶細胞系，以及遞增濃度的Ab-A2 (N67Q)XmAb²⁺¹ 分子在37°C下孵育48小時。48小時後，使用穩定的glo (B)或細胞滴度glo測量靶細胞活力從而測量細胞活力。Ab-A2(N67Q) XmAb²⁺¹ 殺傷細胞系，其中EC90不同。

Ab-A2 (N67Q) XmAb²⁺¹ 能夠殺傷癌細胞系，該等癌細胞系具有從約200,000個STEAP1受體/細胞（SNU5細胞系）降至約10,000個STEAP1受體/細胞（LOX-IMV細胞系）範圍內的STEAP1密度。當STEAP1受體密度降至10,000個/細胞時，Ab-A2 (N67Q) XmAb²⁺¹ 的效力降低。在該方面，Ab-A2 (N67Q) XmAb²⁺¹ 優先介導T細胞依賴性地殺傷STEAP1的表面密度高於10,000的細胞（例如，與STEAP1的表面密度低於10,000的細胞相比，對於STEAP1的表面密度高於10,000的細胞的EC90低至少10倍）。

與Ab-A2-N67G XmAb²⁺¹ 相比，用處於Xmab²⁺¹ 型式（Ab-B-G52A XmAb²⁺¹ 和小鼠抗體Ab-Cm XmAb²⁺¹ ）的其他抗體評估癌細胞的差異殺傷。Ab-A2-N67G XmAb²⁺¹ 表明高表現和低表現STEAP1的細胞之間的差異殺傷，然而Ab-B-G52A XmAb²⁺¹ 沒有在高表現和低表現STEAP1的表現細胞之間區分，而是殺傷每個表現STEAP1細胞。參見表11。Ab-A2-N67G XmAb²⁺¹ 不傷害以較低水平（即，低於10,000/細胞）表現STEAP1的正常細胞，例如HSMBC（初始人平滑肌支氣管細胞）。 [表11]. Ab-B1 XmAb²⁺¹ 和Ab-Cm XmAb²⁺¹ 殺傷高表現和低表現STEAP1的細胞。

實例9

該實例表明，使用本文所述的抗CD3/抗STEAP1異源二聚體抗體與抗PD-1抗體的組合，增強T細胞依賴性細胞毒性。

PD-L1 過表現細胞系的產生： 在補充有10%胎牛血清、1% Pen/Strep、1% HEPES、和1% GlutaMAX的DMEM培養基中培養GP2-293細胞。將細胞以75%匯合鋪板於10 cm培養皿中，並在37°C，5% CO₂ 下孵育過夜。第二天早上，將細胞進行轉染。向管A中添加45 µL的脂質體3000和500 µL的OptiMEM培養基。向管B中，添加15 µg的MSCV_GFP_PD-L1質體、1.8 µg的VSV-g質體、30 µL P3000試劑、和500 µL的OptiMEM培養基。將管A和管B混合，並在室溫下孵育10分鐘。將混合物逐滴添加至GP2-293細胞的培養皿中，在37°C，5% CO₂ 下孵育過夜。第二天早上，取出培養基並用10 mL新鮮培養基替換。當天下午，將靶細胞以75%匯合鋪板於6孔板中，並在37°C，5% CO₂ 下孵育過夜。第二天早晨，從GP2-293細胞中收集病毒上清液並離心（5分鐘，1200 rpm）。將上清液收集在新管中，並以1 : 1000添加聚凝胺。從含有靶細胞的平板中去除培養基，並添加2 mL病毒上清液。對於懸浮細胞，將1E6細胞以1500 rpm離心5分鐘，重懸於500 µL補充有10%胎牛血清和1% pen/strep的RPMI中，並鋪板於6孔板中，向其中添加2 mL病毒上清液。將含有靶細胞和病毒上清液的平板在1200 x g，32°C下離心1.5小時，然後在37°C，5% CO₂ 下孵育。5小時後添加培養基。四天後，用FACSymphony，藉由流式細胞術分析細胞的GFP和PD-L1表現。使用PE軛合的抗體（殖株29E.2A3）檢測PD-L1。在BD Melody分選儀上對PD-L1表現＜ 70%陽性的細胞進行分選，以選擇表現高水平PD-L1的細胞。

T 細胞依賴性細胞毒性（ TDCC ）測定： 將Ab-A2 (N67Q) XmAb²⁺¹ 稀釋於細胞培養基（RPMI、10% 熱滅活的胎牛血清、1X GlutaMAX、1X Pen/Strep）中，連續稀釋（1 : 3，總共22次）並使用Bravo液體處理機器轉移至具有黑色、透明底的384孔板中。使用磁鐵從珠分離CD3/CD28 Dynabeads（1 : 1，48小時）預活化的人泛T細胞（n = 4），並在細胞培養基中稀釋。(藉由流式細胞術評估來自每個供體的活化T細胞的等分試樣的PD-1表現。如上所述對細胞進行染色，並在FACSymphony流式細胞儀上收集數據，並使用FlowJo v10.1進行分析。）將活化的T細胞（2500個細胞/20 µL；4行/供體），隨後是過表現PD-L1的靶細胞鋪板於384孔測定板（2500個細胞/20 µL；全板）中，使得最終的效應子與靶細胞（E : T）比率為1 : 1。將包含SEQ ID NO: 189-194的CDR序列的本揭露的抗PD-1抗體（5 µL中最終為10 µg/mL）添加至每種T細胞供體的兩行中。將板用MicroClime蓋覆蓋，並在37°C，5% CO₂ 下孵育24小時。對於具有表現螢光素酶的靶細胞的測定，添加30 µL的Steady-Glo、Bright-Glo、或One-Glo試劑（普洛麥格公司（Promega））。用PBS洗滌具有不表現螢光素酶的粘附靶細胞的平板，以使用EL406平板洗滌器去除T細胞，並添加25 µL細胞滴度Glo試劑。將板在室溫下在黑暗中與試劑一起孵育10分鐘。使用BioTek Neo讀板儀檢測發光。相對於用不含Ab-A2 XmAb²⁺¹ 的T細胞孵育的靶細胞，計算特異性細胞毒性。使用Graphpad Prism軟體繪製劑量曲線並用四參數可變斜率曲線擬合計算EC50值。

TDCC測定的結果示於圖20A和20B中。與單獨的Ab-A2 (N67Q) XmAb²⁺¹ 相比，Ab-A2 (N67Q) XmAb²⁺¹ 和抗PD-1抗體的組合顯示出增強的細胞毒性和降低的EC50。實例10

該實例說明了本揭露的異源二聚體抗體（例如，Ab-A2 (N67Q) XmAb²⁺¹ ）在體內減小Ewing氏肉瘤腫瘤體積的能力。

在第1天，用5 x 10⁶ 個表現STEAP1的SK-N-MC腫瘤細胞移植亞致死照射的NOD/SCID雌性免疫受損小鼠。在第8天，腹膜內注射2 x 10⁷ CD3+ 人T細胞。在第12、19、和26天，按0.01、0.1、或1 mg/kg，藉由靜脈內（IV）推注投與Ab-A2 (N67Q) XmAb²⁺¹ 或媒介物對照。隨時間的腫瘤體積數據以圖形方式呈現（圖22）。

Ab-A2 (N67Q) XmAb²⁺¹ 誘導初始腫瘤消退，其中在第15天和第22天之間在所有劑量組中相對腫瘤體積（RTV）＜ 1，而媒介物處理的動物的RTV持續增加直至研究結束。來自接受最低劑量Ab-A2 (N67Q) XmAb²⁺¹ （0.01 mg/kg）的動物的腫瘤在第22天後開始繼續生長，而用更高Ab-A2 (N67Q) XmAb²⁺¹ 劑量（0.1和1 mg/kg）處理的小鼠平均RTV分別＜ 1直到第28和25天（表12）。 [表12].與第11天相比的相對腫瘤體積

在第15和第22天之間，當與媒介物處理的對照組2相比時，在所有Ab-A2 (N67Q) XmAb²⁺¹ 劑量水平處達到p值＜ 0.001，並且在第22天後，在0.1和1 mg/kg Ab-A2 (N67Q) XmAb²⁺¹ 劑量處達到p值＜ 0.001（圖23）。在第28天，媒介物處理的小鼠（第2組）的腫瘤相對於在初始處理之前的初始體積具有平均5.29倍更大的體積，而在Ab-A2 (N67Q) XmAb²⁺¹ 處理組中組平均RTV為0.61（第3組）、1.13（第4組）和4.24（第5組）（表1）。在第28天生命期結束時，最高Ab-A2 (N67Q) XmAb²⁺¹ 劑量組（第3組）中9/10的動物被認為係無腫瘤的，其中腫瘤生長抑制（TGI）為97%（表13）。 [表13].腫瘤生長抑制（腫瘤體積）

因此，在臨床上相關的異種移植模型中，Ab-A2 (N67Q) XmAb²⁺¹ 展示出令人信服的抗腫瘤活性。

[圖1]描繪了本揭露之雙特異性抗體。

[圖2]描繪了人CD3 ε鏈之序列（SEQ ID NO: 1）。

[圖3]描繪了人STEAP1的序列（SEQ ID NO: 2）。對胞外環之序列加底線。

[圖4A-4E]描繪了有用之異源二聚化變體對集合（包括偏斜（skew）變體和pI變體）。

[圖5]描繪了電子等排（isosteric）變體抗體恒定區及其各自的取代之列表。pI_(-)指示較低pI的變體，而pI_(+)指示較高pI的變體。該等可以視需要且獨立地與本揭露的其他異源二聚化變體（以及如本文所概述的其他變體類型）組合。

[圖6]描繪了消融FcγR結合的有用消融變體（有時稱為「敲除」或「KO」變體）。

[圖7]描繪了本揭露的兩個實施方式。

[圖8A和8B]描繪了有用的連接子，包括帶電荷的scFv連接子以及可用于本文提供的抗原結合蛋白和異源二聚體抗體型式中的結構域連接子。本揭露的多個方面中帶電荷的連接子可用於例如增加或降低利用一個或多個scFv作為組分的異源二聚體抗體的pI。具有單電荷的唯一先前技術scFv連接子被稱為「惠特洛（Whitlow）」，來自Whitlow等人, Protein Engineering [蛋白質工程] 6(8):989-995 (1993)。該連接子用於減少scFv中的聚集和增強蛋白水解穩定性。

[圖9]描繪了工程化異源二聚體-偏斜Fc變體、連同異源二聚體產率（藉由HPLC-CIEX確定）和熱穩定性（藉由DSC確定）的列表。未確定的熱穩定性由「n.d」指示。另外的資訊在美國專利案號9,822,186中提供，將其藉由引用以全文併入本文。

[圖10A和10B]描繪了穩定性經優化的人源化抗CD3變體scFv。相對於H1_L1.4 scFv序列給出取代。胺基酸編號係Kabat編號。指出了具體的可變輕鏈區和可變重鏈區；所列出的取代可用於除具體列出的那些之外的可變輕鏈區和可變重鏈區。另外的資訊在國際專利公開案號2017/091656中提供，將其藉由引用以全文併入本文。

[圖11A和11B]顯示用鼠STEAP1抗體Ab-Am在C4-2B luc細胞的表面上特異性檢測STEAP1。

[圖12A-12C]顯示使用鼠STEAP1 抗體Ab-Am（圖12A）；Ab-A1 XmAb（●）或Ab-A1 XmAb²⁺¹ （■）在4°C下持續1 hr（圖12B）和抗體Ab-A1 XmAb²⁺¹ （圖12C）在C4-2B luc前列腺癌細胞上特異性檢測STEAP1。

[圖13]顯示用STEAP1抗體Ab-Bx（Ab-B1 XmAb）在C4-2B luc前列腺癌細胞上特異性檢測STEAP1。

[圖14A-14C]顯示STEAP1抗體Ab-Ax（圖14A）、STEAP1抗體Ab-A1 Xmab²⁺¹ （圖14B）、和STEAP1抗體Ab-A2(N67Q) Xmab²⁺¹ （圖14C）介導（mediated）人T細胞對人腫瘤細胞系C4-2B luc的靶細胞裂解。

[圖15]顯示STEAP1抗體Ab-A1 Xmab²⁺¹ 和Ab-A2(N67Q) Xmab²⁺¹ 介導人T細胞對人腫瘤細胞系C4-2B luc（而不是C4-2B luc STEAP1 KO）的劑量依賴性靶細胞裂解。

[圖16A-16B]顯示鼠STEAP1抗體Ab-Am檢測的由測試的293 T細胞表現的STEAP1。圖16C顯示STEAP1結合劑Ab-A2(N67Q) Xmab²⁺¹ 介導用人STEAP1穩定轉染的人細胞系293T而不是親本人293T細胞系的劑量依賴性靶細胞裂解。

[圖17A]顯示Ab-Bx (Ab-B1-XmAb)和Ab-B1 Xmab²⁺¹ 介導C4-2B luc前列腺癌細胞的靶細胞裂解。圖17B顯示Xmab²⁺¹ Ab-B1變體（即，Ab-B1-G37A、Ab-B1-S39A、和Ab-B1-G37A/S39A）介導C4-2B luc前列腺癌細胞的靶細胞裂解。圖17C顯示Xmab²⁺¹ Ab-B1變體（即，Ab-B1-G37A、Ab-B1-S39A、和Ab-B1-G37A/S39A）不介導C4-2B luc STEAP1敲除前列腺癌細胞的靶細胞裂解。

[圖18A-18I]描繪了抗原結合蛋白的若干種型式：「開瓶器（bottle opener）」型式、mAb-Fv、mAb-scFv、中心-scFv、中心-Fv、單臂中心-scFv、單scFv-mAb、scFv-mAb和雙scFv。對於所描繪的所有scFv結構域，它們可以是N-末端至C-末端可變重鏈-(視需要的連接子)-可變輕鏈，或相反。另外，對於單臂scFv-mAb，scFv可以附接至重鏈單體的N-末端或輕鏈的N-末端。

[圖19]提供了本揭露的CDR、可變重鏈結構域、可變輕鏈結構域、scFv、連接子序列、和單體序列的序列。加底線的可變區序列表示CDR序列。

[圖20A和20B]說明了在實例9中描述的T細胞依賴性細胞毒性測定的結果。圖20A係說明在一種代表性T-細胞供體（y軸 = Log（pM））中由單獨的Ab-A2 (N67Q) XmAb²⁺¹ （開口圓）以及Ab-A2 (N67Q) XmAb²⁺¹ 與抗PD-1抗體的組合（閉合圓）介導的特異性細胞毒性（%）的圖。圖20B說明來自四個不同T-細胞供體的單獨的Ab-A2 (N67Q) XmAb²⁺¹ （左側）以及Ab-A2 (N67Q) XmAb²⁺¹ 與抗PD-1抗體的組合（右側）的EC50（pM）。

[圖21A-21C]係說明暴露於不同量的Ab-A2 (N67Q) XmAb²⁺¹ 的總T細胞（圖21A）、CD8⁺ T細胞（圖21B）、和CD4⁺ T細胞（圖21C）中PD-1表現（% CD3+）的線圖。圖中圓形和方形表示T細胞的不同供體。在暴露於本揭露的異源二聚體抗體的T細胞中PD-1表現增加。

[圖22]係說明腫瘤體積（mm³ ；y軸）隨時間（研究的天數，x軸）的線圖。在第1天，將人SK-N-MC細胞（5 x 10⁶ 個細胞/小鼠）皮下注射到雌性、亞致死照射的NOD/SCID小鼠的右背側中。在第8天，除第1組外，將人CD3+ T細胞（2 x 10⁷ 個細胞/小鼠）注射到所有動物的腹膜腔中。在第12、19和26天（圖中頂部的箭頭），藉由靜脈推注按1.0、0.1、或0.01 mg/kg（分別在第3、4、5組）的劑量水平投與媒介物（第1和2組）或Ab-A2 (N67Q) XmAb²⁺ 。使用電子卡尺按三次/周測定腫瘤體積。顯示組平均腫瘤體積 [mm³ ] +/- SEM。圖中的星號表示在媒介物（第2組）和Ab-A2(N67Q) XmAb²⁺ 處理組之間的統計學顯著差異（單因素方差分析；* = p ＜ 0.05；*** = p ＜ 0.001）。

[圖23]. 雌性NOD/SCID小鼠中平均和中位SK-N-MC人神經母細胞瘤腫瘤體積。

Claims

一種抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白結合SEQ ID NO: 2的STEAP1並且包含： (a) 重鏈CDR，其包含與i) vhCDR1 SEQ ID NO: 14、vhCDR2 SEQ ID NO: 15或vhCDR2 SEQ ID NO: 21、和vhCDR3 SEQ ID NO: 16；或 ii) vhCDR1 SEQ ID NO: 33、vhCDR2 SEQ ID NO: 34、和vhCDR3 SEQ ID NO: 35差異不超過3、2、或1個胺基酸的胺基酸序列；或 (b) 輕鏈CDR，其包含與 i) vlCDR1 SEQ ID NO: 11、vlCDR2 SEQ ID NO: 12、和vlCDR3 SEQ ID NO: 13；或ii) vlCDR1 SEQ ID NO: 30、vlCDR2 SEQ ID NO: 31、和vlCDR3 SEQ ID NO: 32差異不超過3、2、或1個胺基酸的胺基酸序列；或 (c) 輕鏈可變結構域，其包含與SEQ ID NO: 183或SEQ ID NO: 186具有至少90%同一性的胺基酸序列；或 (d) 重鏈可變結構域，其包含與SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 184、或SEQ ID NO: 185具有至少90%同一性的胺基酸序列。
如請求項1之抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白包含CDR序列 a) 含有SEQ ID NO: 14的vhCDR1、含有SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 21的vhCDR2、和含有SEQ ID NO: 16的vhCDR3；或 b) 含有SEQ ID NO:33的vhCDR1、含有SEQ ID NO: 34的vhCDR2、和含有SEQ ID NO: 35的vhCDR3。
如請求項1或2之抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白包含CDR序列，其選自 a) 含有SEQ ID NO: 11的vlCDR1、含有SEQ ID NO: 12的vlCDR2、和含有SEQ ID NO: 13的vlCDR3；或 b) 含有SEQ ID NO: 30的vlCDR1、含有SEQ ID NO: 31的vlCDR2、和含有SEQ ID NO: 32的vlCDR3。
如請求項1至3中任一項之抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白包含含有SEQ ID NO: 14的vhCDR1、含有SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 21的vhCDR2、含有SEQ ID NO: 16的vhCDR3、含有SEQ ID NO: 11的vlCDR1、含有SEQ ID NO: 12的vlCDR2、和含有SEQ ID NO: 13的vlCDR3。
如請求項1至3中任一項之抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白包含含有SEQ ID NO: 33的vhCDR1、含有SEQ ID NO: 34的vhCDR2、含有SEQ ID NO: 35的vhCDR3、含有SEQ ID NO: 30的vlCDR1、含有SEQ ID NO: 31的vlCDR2、和含有SEQ ID NO: 32的vlCDR3。
如請求項1至3中任一項之抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白包含含有SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 184、或SEQ ID NO: 185的可變重鏈結構域。
如請求項1至3中任一項之抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白包含含有SEQ ID NO: 183或SEQ ID NO: 186的可變輕鏈結構域。
如請求項1至3中任一項之抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白包含含有SEQ ID NO: 182或SEQ ID NO: 184的可變重鏈結構域以及含有SEQ ID NO: 183的可變輕鏈結構域。
如請求項1至3中任一項之抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白包含含有SEQ ID NO: 185的可變重鏈結構域和含有SEQ ID NO: 186的可變輕鏈結構域。
一種抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白交叉阻斷如請求項1-9中任一項之參考抗原結合蛋白與STEAP1的結合，或該抗原結合蛋白與STEAP1的結合被如請求項1至9中任一項之參考抗原結合蛋白交叉阻斷。
如請求項10之抗原結合蛋白，其中藉由表面電漿共振或ELISA檢測該交叉阻斷。
如請求項10之抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白不結合STEAP1的胞外環2。
如請求項10之抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白優先介導T細胞依賴性地殺傷具有大於10,000的STEAP1表面密度的細胞。
一種抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白結合STEAP1的胺基酸92-118和胺基酸279-290內的區域。
如請求項1至14中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係抗體。
如請求項15之抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白係單株抗體、嵌合抗體、或人源化抗體。
如請求項1至14中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係抗原結合抗體片段。
如請求項1至14中任一項之抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白包含單鏈抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、或結構域抗體。
一種藥物組成物，該藥物組成物包含如請求項1至18中任一項之抗原結合蛋白和生理學上可接受的運載體。
如請求項19之藥物組成物，該藥物組成物進一步包含抗PD-1抗原結合蛋白，該抗PD-1抗原結合蛋白包含：含有在SEQ ID NO: 189中列出的胺基酸序列的vhCDR1、含有在SEQ ID NO: 190中列出的胺基酸序列的vhCDR2、含有在SEQ ID NO: 191中列出的胺基酸序列的vhCDR3、含有在SEQ ID NO: 192中列出的胺基酸序列的vlCDR1、含有在SEQ ID NO: 193中列出的胺基酸序列的vhCDR2、和含有在SEQ ID NO: 194中列出的胺基酸序列的vl CDR3。
一種治療癌症之方法，該方法包括向有需要的受試者投與如請求項1至18中任一項之抗原結合蛋白。
如請求項21之方法，該方法進一步包括向該受試者投與抗PD-1抗原結合蛋白。
一種如請求項1至18中任一項之抗原結合蛋白在製備藥物中的用途，該藥物用於在對其有需要的受試者中治療癌症。
如請求項23之用途，其中該藥物係用於投與與有效量的抗PD-1抗原結合蛋白聯合的有效量的抗STEAP1抗原結合蛋白。
如請求項1至18中任一項之抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白用於在治療對其有需要的受試者的癌症中使用。
如請求項25使用之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白與抗PD1抗原結合蛋白一起被投與。
如請求項22、24、或26使用之方法、用途、或抗原結合蛋白，其中該抗PD1抗原結合蛋白包含：含有在SEQ ID NO: 189中列出的胺基酸序列的vhCDR1、含有在SEQ ID NO: 190中列出的胺基酸序列的vhCDR2、含有在SEQ ID NO: 191中列出的胺基酸序列的vhCDR3、含有在SEQ ID NO: 192中列出的胺基酸序列的vlCDR1、含有在SEQ ID NO: 193中列出的胺基酸序列的vhCDR2、和含有在SEQ ID NO: 194中列出的胺基酸序列的vl CDR3。
如請求項27使用之方法、用途、或抗原結合蛋白，其中該抗PD1抗原結合蛋白包含：含有與SEQ ID NO: 195的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域以及含有與SEQ ID NO: 196的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
如請求項28使用之方法、用途、或抗原結合蛋白，其中該抗PD1抗原結合蛋白包含：含有SEQ ID NO: 195的胺基酸序列的重鏈可變結構域以及含有SEQ ID NO: 196的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
如請求項27至29中任一項使用之方法、用途、或抗原結合蛋白，其中該抗PD-1抗原結合蛋白係抗原結合抗體片段。
如請求項27至29中任一項使用之方法、用途、或抗原結合蛋白，其中該抗PD-1抗原結合蛋白係抗體。
如請求項27至29中任一項使用之方法、用途、或抗原結合蛋白，其中該抗PD-1抗原結合蛋白係單株抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
如請求項27至31中任一項使用之方法、用途、或抗原結合蛋白，其中該抗PD1抗原結合蛋白包含：含有SEQ ID NO: 197的胺基酸序列的重鏈以及含有SEQ ID NO: 198的胺基酸序列的輕鏈。
如請求項21至33中任一項使用之方法、用途、或抗原結合蛋白，其中該癌症係前列腺癌。
如請求項21至33中任一項使用之方法、用途、或抗原結合蛋白，其中該癌症係Ewing氏肉瘤。
一種多核苷酸，該多核苷酸包含編碼如請求項1至14中任一項之抗原結合蛋白的輕鏈可變結構域和/或重鏈可變結構域的核酸序列。
一種表現載體，該表現載體包含如請求項36之多核苷酸。
一種組成物，該組成物包含：含有編碼如請求項1至14中任一項抗原結合蛋白的輕鏈可變結構域的核酸序列的多核苷酸以及含有編碼如請求項1至14中任一項之抗原結合蛋白的重鏈可變結構域的核酸序列的多核苷酸。
一種製備抗原結合蛋白之方法，該方法包括在允許輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域表現的條件下使宿主細胞與請求項36之多核苷酸或與請求項38之組成物接觸。
一種雙特異性抗原結合蛋白，該雙特異性抗原結合蛋白包含如請求項1至14中任一項之抗原結合蛋白。
如請求項40之雙特異性抗原結合蛋白，該雙特異性抗原結合蛋白結合STEAP1和CD3。
如請求項41之雙特異性抗原結合蛋白，該雙特異性抗原結合蛋白包含CD3結合結構域，該CD3結合結構域包含SEQ ID NO: 170-172和174-176的CDR序列。
一種異源二聚體抗體，該異源二聚體抗體包含： a) 第一單體，其包含第一重鏈，該第一重鏈包含： 1) 第一可變重鏈結構域； 2) 第一恒定重鏈，其包含第一CH1結構域和第一Fc結構域； 3) scFv，其結合人CD3並且包含scFv可變輕鏈結構域、scFv連接子和scFv可變重鏈結構域；其中使用一個或多個結構域連接子將所述scFv共價附接至所述CH1結構域的C末端和所述第一Fc結構域的N末端之間； b) 第二單體，其包含第二重鏈，該第二重鏈包含第二可變重鏈結構域和含有第二Fc結構域的第二恒定重鏈；以及 c) 共同輕鏈，其包含可變輕鏈結構域和恒定輕鏈結構域；其中所述第一可變重鏈結構域和所述可變輕鏈結構域結合人STEAP1，所述第二可變重鏈結構域和所述可變輕鏈結構域結合人STEAP1，並且其中 (i) 該第一可變重鏈結構域和該第二可變重鏈結構域包含重鏈CDR，該等重鏈CDR包含與 (a) vhCDR1 SEQ ID NO: 14；(b) vhCDR2 SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 21；和 (3) vhCDR3 SEQ ID NO: 16差異不超過3、2、或1個胺基酸的胺基酸序列，並且該可變輕鏈結構域包含輕鏈CDR，該等輕鏈CDR包含與vlCDR1 SEQ ID NO: 11、vlCDR2 SEQ ID NO: 12、和vlCDR3 SEQ ID NO: 13差異不超過3、2、或1個胺基酸的胺基酸序列；或 (ii) 該第一可變重鏈結構域和該第二可變重鏈結構域包含重鏈CDR，該等重鏈CDR包含與vhCDR1 SEQ ID NO: 33、vhCDR2 SEQ ID NO: 34、和vhCDR3 SEQ ID NO: 35差異不超過3、2、或1個胺基酸的胺基酸序列，並且該可變輕鏈結構域包含輕鏈CDR，該等輕鏈CDR包含與vlCDR1 SEQ ID NO: 30、vlCDR2 SEQ ID NO: 31、和vlCDR3 SEQ ID NO: 32差異不超過3、2、或1個胺基酸的胺基酸序列；或 (iii) 該第一可變重鏈結構域和該第二可變重鏈結構域包含與SEQ ID NO: 182或184具有至少90%同一性的胺基酸序列，並且該可變輕鏈結構域包含與SEQ ID NO: 183具有至少90%同一性的胺基酸序列；或 (iv) 該第一可變重鏈結構域和該第二可變重鏈結構域包含與SEQ ID NO: 185具有至少90%同一性的胺基酸序列，並且該可變輕鏈結構域包含與SEQ ID NO: 186具有至少90%同一性的胺基酸序列。
如請求項43之異源二聚體抗體，其中該第一單體包含胺基酸取代E233P、L235V、G236A、S267K、R292C、N297G、V302C、E357Q、和S364K；該第二單體包含胺基酸取代N208D、E233P、L235V、G236A、S267K、R292C、Q295E、N297G、V302C、L368D、K370S、N384D、Q418E、和N421D；並且兩個單體都包含在位置234處的缺失。
如請求項43或44之異源二聚體抗體，其中所述scFv包含 (i) 包含重鏈CDR的可變重鏈結構域以及包含輕鏈CDR的可變輕鏈結構域，該等重鏈CDR包含與vhCDR1 SEQ ID NO: 170、vhCDR2 SEQ ID NO: 171、和vhCDR3 SEQ ID NO: 172差異不超過3、2、或1個胺基酸的胺基酸序列，該等輕鏈CDR包含與vlCDR1 SEQ ID NO: 174、vlCDR2 SEQ ID NO:175、和vlCDR3 SEQ ID NO: 176差異不超過3、2、或1個胺基酸的胺基酸序列；或 (ii) 包含與SEQ ID NO: 169具有至少90%同一性的胺基酸序列的可變重鏈結構域以及包含與SEQ ID NO: 173具有至少90%同一性的胺基酸序列的可變輕鏈結構域。
如請求項43或44之異源二聚體抗體，其中所述scFv包含CDR，該等CDR包含：含有SEQ ID NO: 170的vhCDR1、含有SEQ ID NO: 171的vhCDR2、含有SEQ ID NO: 172的vhCDR3、含有SEQ ID NO:174的vlCDR1、含有SEQ ID NO: 175的vlCDR2、和含有SEQ ID NO: 176的vlCDR3。
如請求項43至45中任一項之異源二聚體抗體，其中所述scFv包含SEQ ID NO: 169和SEQ ID NO: 173的可變重鏈區和可變輕鏈區。
如請求項43至47中任一項之異源二聚體抗體，其中所述scFv具有帶電荷的scFv連接子。
如請求項48之異源二聚體抗體，其中該帶電荷的scFv連接子具有從3至8的正電荷，並且選自由SEQ ID NO: 143至153組成的組。
如請求項48之異源二聚體抗體，其中該scFv連接子包含SEQ ID NO: 152。
如請求項43至47中任一項之異源二聚體抗體，其中所述scFv包含SEQ ID NO: 44的序列。
如請求項43至51中任一項之異源二聚體抗體，其中該第一可變重鏈結構域和該第二可變重鏈結構域包含以下CDR序列：含有SEQ ID NO: 14的vhCDR1、含有SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 21的vhCDR2、含有SEQ ID NO: 16的vhCDR3，並且其中該可變輕鏈結構域包含以下CDR序列：含有SEQ ID NO: 11的vlCDR1、含有SEQ ID NO: 12的vlCDR2、和含有SEQ ID NO: 13的vlCDR3。
如請求項43至51中任一項之異源二聚體抗體，其中該第一可變重鏈結構域和該第二可變重鏈結構域包含以下CDR序列：含有SEQ ID NO: 33的vhCDR1、含有SEQ ID NO: 34的vhCDR2、含有SEQ ID NO: 35的vhCDR3，並且其中該可變輕鏈結構域包含以下CDR序列：含有SEQ ID NO: 30的vlCDR1、含有SEQ ID NO: 31的vlCDR2、和含有SEQ ID NO: 32的vlCDR3。
如請求項43至51中任一項之異源二聚體抗體，其中該第一可變重鏈結構域和該第二可變重鏈結構域包含SEQ ID NO: 182或SEQ ID NO: 184，並且該可變輕鏈結構域包含SEQ ID NO: 183。
如請求項43至51中任一項之異源二聚體抗體，其中該第一可變重鏈結構域和該第二可變重鏈結構域包含SEQ ID NO: 185，並且該可變輕鏈結構域包含SEQ ID NO: 186。
如請求項52或53之異源二聚體抗體，該異源二聚體抗體包含胺基酸取代N67Q和/或在位置292、297、或302中的一個或多個處的取代。
如請求項43之異源二聚體抗體，其中 a) 該第一單體包含SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20的序列，該第二單體包含SEQ ID NO: 18或199的序列，並且該共同輕鏈包含SEQ ID NO: 17的序列；或 b) 該第一單體包含SEQ ID NO: 38的序列，該第二單體包含SEQ ID NO:37的序列，並且該共同輕鏈包含SEQ ID NO:36的序列。
如請求項43之異源二聚體抗體，其中 a) 該第一單體包含SEQ ID NO: 202的序列，該第二單體包含SEQ ID NO: 201的序列，並且該共同輕鏈包含SEQ ID NO: 200的序列； b) 該第一單體包含SEQ ID NO: 207的序列，該第二單體包含SEQ ID NO: 203的序列，並且該共同輕鏈包含SEQ ID NO: 200的序列；或 c) 該第一單體包含SEQ ID NO: 206的序列，該第二單體包含SEQ ID NO: 205的序列，並且該共同輕鏈包含SEQ ID NO: 204的序列。
一種核酸組成物，該核酸組成物包含： a) 編碼如請求項43至58中任一項之第一單體的第一核酸； b) 編碼如請求項43至58中任一項之第二單體的第二核酸，和 c) 編碼如請求項43至58中任一項之共同輕鏈的第三核酸。
一種核酸組成物，該核酸組成物包含： a) 包含第一核酸的第一表現載體，該第一核酸編碼如請求項43至58中任一項之第一單體； b) 包含第二核酸的第二表現載體，該第二核酸編碼如請求項43至58中任一項之第二單體；以及 c) 包含第三核酸的第三表現載體，該第三核酸編碼如請求項43至58中任一項之共同輕鏈。
一種宿主細胞，該宿主細胞包含如請求項59或60之核酸組成物。
一種藥物組成物，該藥物組成物包含如請求項43至58中任一項之異源二聚體抗體。
一種治療有需要的受試者之方法，該方法包括向該受試者投與如請求項43至58中任一項之異源二聚體抗體。
一種在有需要的受試者中治療癌症之方法，該方法包括向該受試者投與如請求項43至58中任一項之異源二聚體抗體。
如請求項63或64之方法，該方法進一步包括向該受試者投與抗PD-1抗原結合蛋白。
一種如請求項43至58中任一項之異源二聚體抗體在製備藥物中的用途，該藥物用於在對其有需要的受試者中治療癌症。
如請求項66之用途，其中該藥物係用於投與與有效量的抗PD-1抗原結合蛋白聯合的有效量的異源二聚體抗體。
如請求項43至58中任一項之異源二聚體抗體，該異源二聚體抗體用於在治療對其有需要的受試者的癌症中使用。
如請求項68用於使用的異源二聚體抗體，其中該異源二聚體抗體與抗PD1抗原結合蛋白一起被投與。
如請求項65、67、或69中任一項使用之方法、用途、或抗原結合蛋白，其中該抗PD1抗原結合蛋白包含：含有在SEQ ID NO: 189中列出的胺基酸序列的vhCDR1、含有在SEQ ID NO: 190中列出的胺基酸序列的vhCDR2、含有在SEQ ID NO: 191中列出的胺基酸序列的vhCDR3、含有在SEQ ID NO: 192中列出的胺基酸序列的vlCDR1、含有在SEQ ID NO: 193中列出的胺基酸序列的vhCDR2、和含有在SEQ ID NO: 194中列出的胺基酸序列的vl CDR3。
如請求項70使用之方法、用途、或抗原結合蛋白，其中該抗PD1抗原結合蛋白包含：含有與SEQ ID NO: 195的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列的重鏈可變結構域以及含有與SEQ ID NO: 196的胺基酸序列具有至少90%同一性的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
如請求項71使用之方法、用途、或抗原結合蛋白，其中該抗PD1抗原結合蛋白包含：含有SEQ ID NO: 195的胺基酸序列的重鏈可變結構域以及含有SEQ ID NO: 196的胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
如請求項70至72中任一項使用之方法、用途、或異源二聚體抗體，其中該抗PD-1抗原結合蛋白係抗原結合抗體片段。
如請求項70至72中任一項使用之方法、用途、或異源二聚體抗體，其中該抗PD-1抗原結合蛋白係抗體。
如請求項70至72中任一項使用之方法、用途、或異源二聚體抗體，其中該抗PD-1抗原結合蛋白係單株抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
如請求項70至75中任一項使用之方法、用途、或異源二聚體抗體，其中該抗PD1抗原結合蛋白包含：含有SEQ ID NO: 197的胺基酸序列的重鏈以及含有SEQ ID NO: 198的胺基酸序列的輕鏈。
如請求項70至75中任一項使用之方法、用途、或異源二聚體抗體，其中該抗PD1抗原結合蛋白包含：含有SEQ ID NO: 208的胺基酸序列的重鏈以及含有SEQ ID NO: 209的胺基酸序列的輕鏈。
如請求項64至77中任一項使用之方法、用途、或異源二聚體抗體，其中該癌症係前列腺癌。
如請求項64至77中任一項使用之方法、用途、或異源二聚體抗體，其中該癌症係Ewing氏肉瘤。