KR20170141660A - 암의 치료 및/또는 예방용 의약 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명의 목적은 암세포의 표면에 특이적으로 발현하는 암항원 단백질을 동정하고, 그것을 표적으로 한 항체의, 암의 치료 및/또는 예방제로서의 용도를 제공하는 것이다. 서열번호 8, 4, 6, 10, 12로 나타내어지는 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 CSPG5 단백질, 또는 연속하는 7 이상의 아미노산으로 이루어지는 그 단편과 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 프래그먼트를 유효성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는, 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.

Description

암의 치료 및/또는 예방용 의약 조성물

본 발명은 CSPG5 단백질에 대한 항체 또는 그 프래그먼트의 암의 치료 및/또는 예방제 등으로서의 신규인 의약 용도에 관한 것이다.

암은 전체 사망 원인의 제 1위를 차지하는 질환이며, 현재 행해지고 있는 치료는 수술요법을 주체로 방사선요법과 화학요법을 조합시킨 것이다. 최근의 새로운 수술법의 개발이나 새로운 항암제의 발견에도 불구하고, 일부의 암을 제외하고 암의 치료 성적은 그다지 향상되지 않은 것이 현재의 상태이다. 분자생물학이나 암면역학의 진보에 의해 암에 특이적으로 반응하는 항체류, 세포상해성 T세포에 의해 인식되는 암항원류, 암항원을 코드하는 유전자류 등이 동정되어 있고, 암항원류를 타깃으로 한 특이적 암치료법에 대한 기대가 높아지고 있다.

암치료법에 있어서는 부작용을 경감하는 이유로부터 항원으로서 인식되는 펩티드(폴리펩티드를 포함한다)는, 정상세포에는 거의 존재하지 않고, 암세포에 특이적으로 존재하고 있는 것이 바람직하다. 1991년, 벨기에국 Ludwig 연구소의 Boon 등은 자기 암세포주와 암 반응성 T세포를 이용한 cDNA 발현 클로닝법에 의해 CD8 양성 T세포가 인식하는 인간 멜라노머 항원 MAGE1을 단리했다(비특허문헌 1). 그 후, 암환자의 생체 내에서 자기의 암에 반응해서 산생되는 항체가 인식하는 암항원을 유전자의 발현 클로닝의 방법을 도입하여 동정하는 SEREX(serological identification of antigens by recombinant expression cloning)법이 보고되어(특허문헌 1, 비특허문헌 2), 이 방법에 의해 정상세포에는 거의 발현이 없고, 암에 특이적으로 발현되는 몇개의 암항원이 단리되어 있다(비특허문헌 3). 또한, 그 암항원의 아미노산 서열의 일부를 타깃으로 해서 상기 암항원에 특이적으로 반응하는 면역세포를 이용한 세포요법이나, 암항원을 포함하는 백신 등의 암특이적 면역요법의 임상시험이 실시되어 있다.

한편, 암세포 상의 특정의 항원 단백질을 표적으로 한 암을 치료하기 위한 각종 항체 의약이 세상에 대두해 왔다. 표적이 되는 항원 단백질의 대부분은 암특이적 치료약으로서 일정한 약효가 얻어져 주목받고 있지만, 복수의 정상세포에도 발현된다. 그 때문에, 항체 투여의 결과, 암세포 뿐만 아니라 정상세포까지도 상해해 버리기 때문에 부작용이 큰 문제가 되고 있다. 따라서, 정상세포에는 발현되지 않고, 암세포 표면에만 특이적으로 발현되는 암항원을 동정하고, 그것을 표적으로 한 항체를 의약품으로서 사용할 수 있으면, 보다 부작용이 적은 항체 의약에 의한 치료가 가능하게 된다고 기대된다.

미국 특허 제5698396호

Bruggen P. et al., Science, 254: 1643-1647(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11810-11813(1995) Int. J. Cancer, 72: 965-971(1997)

본 발명의 목적은 암세포의 표면에 특이적으로 발현되는 암항원 단백질을 동정하고, 그것을 표적으로 한 항체의, 암의 치료 및/또는 예방제로서의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 개의 정소조직 유래 cDNA 라이브러리와 유방암 환견의 혈청을 사용한 SEREX법으로 암에 특이적으로 발현되는 항원의 단리를 행한 결과, CSPG5 단백질을 코드하는 cDNA를 취득했다. CSPG5 단백질은 다양한 담암 생체 유래의 혈청 중에 존재하는 항체와 결합할 수 있다. 또한, 본 발명자들은 CSPG5 단백질이 유방암, 폐암, 뇌종양, 백혈병, 악성 림프종, 선암, 비만세포종, 편평상피암, 멜라노머 또는 신경아종 세포에 특이적으로 발현하고 있는 것, CSPG5 단백질의 일부가 그들 암세포의 세포 표면에 특이적으로 발현하고 있는 것을 찾아냈다. CSPG5(Chondroitin Sulfate Proteoglycan 5) 단백질은, 1형의 막 관통 단백질이며, 뉴레귤린 패밀리 단백질의 하나이다. 또한, ErbB3 단백질에 결합해서 증식인자로서 작용하는 것, BRCA1 단백질에 변이가 있는 난소암에 있어서, 발현이 상승하고 있는 것이 보고되어 있다(Kinugasa, Y., et al., 2004, Biochem. Biophys. Res. Commun., 321: 1045; Press, J. Z., et al., 2010, Neoplasia., 12(12): 993-1002). 또한, CSPG5 단백질은 망막 신경절세포나 푸르킨예세포, 해마 등의 신경계의 조직에서 고발현하고 있고, 신경세포의 증식·분화인자로서 작용함으로써 신경 축색돌기의 신장에 관여하는 것이 알려져 있다(Yasuda, Y. et al., 1998, Neurosci. Res., 32: 313; Aono, S., et al., 2006, J. Neurosci. Res., 83: 110; Nakanishi, K., et al., 2006, J. Biol. Chem., 281: 24970). 그러나, CSPG5 단백질이 암세포에 대한 면역유도 활성을 갖고, 그것에 의해서 상기 단백질이 암의 치료나 예방에 유용하다고 하는 보고는 없다.

또한, 취득한 개 CSPG5 유전자 및 그 인간, 고양이, 마우스 상동성 유전자를 기초로 하여, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 및 16의 서열번호로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 CSPG5 단백질 및 그것들의 CSPG5 단백질에 대한 항체를 제작했다. 그리고, 그것들 CSPG5 단백질의 각 암세포의 세포 표면에 발현하는 부분, 즉 세포외 영역에 대한 항체가 CSPG5 단백질을 발현하는 암세포를 상해하는 것을 찾아내고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

따라서, 본 발명은 이하의 특징을 갖는다.

(1) CSPG5 단백질, 또는 연속하는 7 이상의 아미노산 잔기로 이루어지는 그 단편과 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 프래그먼트를 유효성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.

(2) 상기 CSPG5 단백질이 서열번호 8, 4, 6, 10, 및 12로 나타내어지는 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 (1)에 기재된 의약 조성물.

(3) 상기 암이 백혈병 또는 악성 림프종인 (1) 또는 (2)에 기재된 의약 조성물.

(4) 상기 항체가 단일클론 항체 또는 다중클론 항체인 (1)∼(3) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.

(5) 상기 항체가 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 2중특이성 항체인 (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초가 되는 일본국 특허출원번호 2015-093640호의 개시 내용을 포함한다.

(발명의 효과)

본 발명에서 사용되는 CSPG5 단백질에 대한 항체는 암세포를 상해한다. 따라서, CSPG5 단백질에 대한 항체는 암의 치료나 예방에 유용하다.

도 1은 동정한 CSPG5 유전자의, 개 종양조직 또는 암세포주에서의 발현 패턴을 나타내는 도면이다. 도면 중, 참조번호 1은 개 CSPG5 유전자의 개의 각 조직 및 세포주에서의 발현 패턴을 나타내고, 참조번호 2는 개 GAPDH 유전자의 개의 각 조직 및 세포주에서의 발현 패턴을 나타낸다.
도 2는 동정한 CSPG5 유전자의, 인간 종양조직 또는 암세포주에서의 발현 패턴을 나타내는 도면이다.
도 3은 동정한 CSPG5 유전자의, 마우스 종양조직 또는 암세포주에서의 발현 패턴을 나타내는 도면이다. 참조번호 3은 마우스 CSPG5 유전자의 마우스의 각 조직 및 세포주에서의 발현 패턴을 나타내고, 참조번호 4는 마우스 GAPDH 유전자의 마우스의 각 조직 및 세포주에서의 발현 패턴을 나타낸다.
도 4는 CSPG5 유전자를 발현하는 백혈병 세포주(K562) 및 악성 림프종 세포(L-1236)에 대한 CSPG5 단백질에 대한 다중클론 항체(항CSPG5 다중클론 항체)의 세포상해활성을 나타내는 도면이다. 도면 중, 참조번호 5는 컨트롤 다중클론 항체를 첨가했을 때의 K562 세포에 대한 세포상해활성을 나타내고, 참조번호 6은 항CSPG5 다중클론 항체를 첨가했을 때의 K562 세포에 대한 세포상해활성을 나타내고, 참조번호 7은 컨트롤 다중클론 항체를 첨가했을 때의 L-1236 세포에 대한 세포상해활성을 나타내고, 그리고 참조번호 8은 항CSPG5 다중클론 항체를 첨가했을 때의 L-1236 세포에 대한 세포상해활성을 나타낸다.
도 5는 CSPG5 유전자를 발현하는 백혈병 세포주(K562) 및 악성 림프종 세포(L-1236)에 대한 CSPG5 단백질에 대한 단일클론 항체(항CSPG5 단일클론 항체)의 세포상해활성을 나타내는 도면이다. 도면 중, 참조번호 9는 컨트롤 단일클론 항체를 첨가했을 때의 K562 세포에 대한 세포상해활성을 나타내고, 참조번호 10은 항CSPG5 단일클론 항체를 첨가했을 때의 K562 세포에 대한 세포상해활성을 나타내고, 참조번호 11은 컨트롤 단일클론 항체를 첨가했을 때의 L-1236 세포에 대한 세포상해활성을 나타내고, 그리고 참조번호 12는 항CSPG5 단일클론 항체를 첨가했을 때의 L-1236 세포에 대한 세포상해활성을 나타낸다.

본 발명에서 사용되는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16으로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드에 대한 항체의 항종양 활성은, 후술하는 바와 같이, 생체 내에서 담암 동물에 대한 종양 증식의 억제를 조사함으로써, 또는 생체 밖에서 상기 폴리펩티드를 발현하는 종양세포에 대하여 면역세포또는 보체를 통한 세포상해활성을 나타내는지의 여부를 조사함으로써 평가할 수 있다.

또한, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16으로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열은, 각각 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 또는 15로 나타내어져 있다.

본 발명이 개시하는 서열표의 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열은, 개 정소조직 유래 cDNA 라이브러리와 유방암 환견의 혈청을 사용한 SEREX법에 의해, 담암 개 유래의 혈청 중에 특이적으로 존재하는 항체와 결합하는 폴리펩티드로서, 또한 서열번호 4, 6, 8, 10, 12로 나타내어지는 아미노산 서열은 그 인간 상동인자(호모로그)로서, 서열번호 14로 나타내어지는 아미노산 서열은 그 고양이 상동인자로서, 서열번호 16으로 나타내어지는 아미노산 서열은 그 마우스 상동인자로서 단리된 CSPG5 단백질의 아미노산 서열이다(후술의 실시예 1 참조).

CSPG5 단백질은 아미노산 서열로부터 1형의 막 관통 단백질인 것이 알려져 있고, 그 서열로부터 예측되는 세포외 영역이 신경세포 표면에 발현하는 것이 알려져 있었지만, 본원에 의해 CSPG5 단백질의 세포외 영역이 각종 암세포의 세포 표면에서 실제로 발현(존재)하고 있는 것이 밝혀졌다. 본 발명에서는 CSPG5 단백질에 있어서 암세포의 세포외 영역, 또는 상기 세포외 영역의 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드에 결합하는 항체가 바람직하게 사용된다.

본 발명에서 사용되는 상기 CSPG5 단백질에 대한 항체는 항종양 활성을 발휘할 수 있는 한 어떠한 종류의 항체라도 되고, 예를 들면 단일클론 항체, 다중클론 항체, 합성 항체, 다중특이성 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체(scFV), 항체 프래그먼트(예를 들면, Fab, F(ab')₂, Fv) 등을 포함한다. 이들 항체 및 그 프래그먼트는 당업자에게 공지인 방법에 의해 조제하는 것이 가능하다. 본 발명에 있어서는 CSPG5 단백질과 특이적으로 결합하는 것이 가능한 항체가 바람직하고, 단일클론 항체인 것이 바람직하지만, 균질한 항체를 안정되게 생산할 수 있는 한, 다중클론 항체라도 된다. 또한, 피험자가 인간일 경우에는 거부반응을 회피 또는 억제하기 위해서 인간 항체 또는 인간화 항체인 것이 바람직하다.

여기에서, 「CSPG5 단백질과 특이적으로 결합한다」라고 하는 것은, CSPG5 단백질에 특이적으로 결합하고, 그 이외의 단백질과 실질적으로 결합하지 않는 것을 의미한다.

또한, 본 발명에 있어서의 암의 치료 및/또는 예방의 대상인 피험체는 인간, 애완동물, 가축류, 경기용 동물 등의 포유동물이며, 바람직한 피험체는 인간이다.

이하에, 본 발명에 관한 항원의 제작, 항체의 제작, 및 의약 조성물에 대하여 설명한다.

<항체 제작용 항원의 제작>

본 발명에서 사용되는 CSPG5 단백질에 대한 항체(항CSPG5 항체)를 취득하기 위한 감작항원으로서 사용되는 단백질 또는 그 단편은, 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트, 소, 말, 닭 등, 그 유래가 되는 동물종에 제한되지 않는다. 그러나 세포융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려해서 선택하는 것이 바람직하다. 일반적으로는, 포유동물 유래의 단백질이 바람직하고, 특히 인간 유래의 단백질이 바람직하다. 예를 들면, CSPG5 단백질이 인간 CSPG5 단백질인 경우, 인간 CSPG5 단백질이나 그 부분 폴리펩티드, 및 인간 CSPG5 단백질을 발현하는 세포 등을 사용할 수 있다.

CSPG5 단백질 및 그 호모로그의 염기서열 및 아미노산 서열은, 예를 들면 GenBank(미국 NCBI)에 액세스하고, BLAST, FASTA 등의 알고리즘(Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993； Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997)을 이용함으로써 입수할 수 있다.

예를 들면, 인간 CSPG5 단백질을 기준으로 했을 경우, 인간 CSPG5 단백질을 코드하는 염기서열(서열번호 3, 5, 7, 9 또는 11), 및 그 염기서열과 70%∼100%, 바람직하게는 80%∼100%, 보다 바람직하게는 90%∼100%, 더 바람직하게는 95%∼100%, 예를 들면 97%∼100%, 98%∼100%, 99%∼100% 또는 99.5%∼100%의 염기동일성을 갖는 핵산이 타깃이 된다. 또한, 인간 CSPG5 단백질의 아미노산 서열(서열번호 4, 6, 8, 10 또는 12), 및 그 아미노산 서열과 70%∼100%, 바람직하게는 80%∼100%, 보다 바람직하게는 90%∼100%, 더 바람직하게는 95%∼100%, 예를 들면 97%∼100%, 98%∼100%, 99%∼100% 또는 99.5%∼100%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드가 타깃이 된다. 여기에서, 「염기 동일성」은 2개의 염기서열을 최대의 유사도가 되도록 적당하게 갭을 도입하고, 얼라인먼트(정렬)했을 때, 염기의 총수 에 대한 동일 염기의 퍼센티지(%)를 의미한다. 마찬가지로, 「아미노산 동일성」은 2개의 아미노산 서열을 최대의 유사도가 되도록 적당하게 갭을 도입하고, 얼라인먼트(정렬)했을 때, 아미노산의 총수에 대한 동일 아미노산의 퍼센티지(%)를 의미한다.

CSPG5 단백질의 단편은 에피토프(항원결정기)의 아미노산 길이 이상, 상기 단백질의 전체 길이 미만의 길이를 갖는다. 에피토프는 포유동물, 바람직하게는 인간에 있어서 항체가 인식하는 최소 단위로, 항원성 또는 면역원성을 갖는 폴리펩티드 단편을 가리키고, 그 길이는 약 7∼12 아미노산, 예를 들면 8∼11 아미노산으로 이루어지는 아미노산 서열을 들 수 있다.

상기한 인간 CSPG5 단백질이나 그 부분 펩티드를 포함하는 폴리펩티드는, 예를 들면 Fmoc법(플루오렌일메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 따라서 합성할 수 있다(일본 생화학회편, 생화학 실험강좌 1, 단백질의 화학 IV, 화학 수식과 펩티드 합성, 토쿄 카가쿠 도우진(일본), 1981년). 또한, 각종의 시판의 펩티드 합성기를 이용해서 상법에 의해 합성할 수도 있다. 또한, 공지의 유전자 공학적 방법(Green, M.R. and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, Ausubel 등 , Short Protocols in Molecular Biology, 제3판, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995), John Wiley & Sons 등)을 이용하여, 상기 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 조제하고, 상기 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 짜넣어 숙주세포에 도입하고, 상기 숙주세포 중에서 폴리펩티드를 산생시킴으로써 목적으로 하는 폴리펩티드를 얻을 수 있다.

상기 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 공학적 방법이나 시판의 핵산 합성기를 사용한 상법에 의해 용이하게 조제할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 DNA는 인간 염색체 DNA 라이브러리 또는 인간 cDNA 라이브러리를 주형으로서 사용하고, 서열번호 3에 기재한 염기서열을 증폭 할 수 있게 설계한 한쌍의 프라이머를 이용하여 PCR을 행함으로써 조제할 수 있다. PCR의 반응 조건은 적당하게 설정할 수 있고, 예를 들면, 내열성 DNA 폴리메라아제(예를 들면 Taq 폴리메라아제 등) 및 Mg²⁺ 함유 PCR 버퍼를 이용하여 94℃에서 30초간(변성), 55℃에서 30초∼1분간(어닐링), 72℃에서 2분간(신장)으로 이루어지는 반응 공정을 1사이클로 해서, 예를 들면 30사이클 행한 후, 72℃에서 7분간 반응시키는 조건 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. PCR의 방법, 조건 등에 대해서는, 예를 들면 Ausubel 등, Short Protocols in Molecular Biology, 제3판, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995), John Wiley & Sons(특히 제15장)에 기재되어 있다.

또한, 본 명세서 중의 서열표의 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 또는 15로 나타내어지는 염기서열 정보에 의거하여 적당한 프로브나 프라이머를 조제하고, 그것을 이용하여 인간 등의 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 소망의 DNA를 단리 할 수 있다. cDNA 라이브러리는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16으로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 발현하고 있는 세포, 기관 또는 조직으로부터 제작하는 것이 바람직하다. 그러한, 세포나 조직의 예는 정소, 또는 백혈병, 유방암, 림프종, 뇌종양, 폐암, 대장암, 비만세포종, 멜라노머, 및 신경아종세포 등의 암 또는 종양에 유래하는 세포 또는 조직이지만 이것에 한정되지 않는다. 상기한 프로브 또는 프라이머의 조제, cDNA 라이브러리의 구축, cDNA 라이브러리의 스크리닝, 및 목적 유전자의 클로닝 등의 조작은 당업자에게 기지이며, 예를 들면, Green, M.R. and Sambrook(상기), Ausbel 등(상기) 등에 기재된 방법에 준해서 행할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 DNA로부터 CSPG5 단백질이나 그 부분 펩티드를 코드하는 DNA를 얻을 수 있다.

상기 숙주세포로서는 상기 폴리펩티드를 발현 가능한 세포이면 어떠한 것이라도 되고, 원핵세포의 예로서는 대장균, 진핵세포의 예로서는 출아효모나 분열효모 등의 효모세포, 누에세포 등의 곤충세포, 아프리카발톱개구리 난세포, 또는 원숭이 신장세포 COS1, 중국햄스터 난소세포 CHO, 인간 태아 신장세포주 HEK293, 마우스 태자 피부세포주 NIH3T3 등의 포유동물 세포를 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다.

숙주세포로서 원핵세포를 사용할 경우, 발현 벡터로서는 원핵세포 중에서 복제 가능한 오리진, 프로모터, 리보솜 결합부위, 멀티클로닝사이트, 터미네이터, 약제내성 유전자, 영양요구성 상보유전자 등을 갖는 발현 벡터를 사용한다. 대장균용 발현 벡터로서는 pUC계, pBluescriptII, pET 발현 시스템, pGEX 발현 시스템 등을 예시할 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 짜넣고, 상기 벡터에서 원핵 숙주세포를 형질전환한 후, 얻어진 형질전환체를 배양하면 상기DNA가 코드하고 있는 폴리펩티드를 원핵 숙주세포 중에서 발현시킬 수 있다. 이 때, 상기 폴리펩티드를 다른 단백질과의 융합단백질로서 발현시킬 수도 있다.

숙주세포로서 진핵세포를 사용할 경우, 발현 벡터로서는 프로모터, 스플라이싱 영역, 폴리(A) 부가부위 등을 갖는 진핵세포용 발현 벡터를 사용한다. 그러한 발현 벡터로서는 pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV 벡터, pRS, pcDNA 3.1, pYES2 등을 예시할 수 있다. 상기와 마찬가지로, 상기 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 짜넣고, 상기 벡터에서 진핵 숙주세포를 형질전환한 후, 얻어진 형질전환체를 배양하면 상기 DNA가 코드하고 있는 폴리펩티드를 진핵 숙주세포 중에서 발현시킬 수 있다. 발현 벡터로서 pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 등을 사용했을 경우에는, His 태그(예를 들면 (His)₆∼(His)₁₀), FLAG 태그, myc 태그, HA 태그, GFP 등 각종 태그를 부가한 융합단백질로서 상기 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다.

발현 벡터의 숙주세포에의 도입은 전기천공법, 인산 칼슘법, 리포솜법, DEAE덱스트란법, 마이크로인젝션, 바이러스 감염, 리포펙션, 세포막 투과성 펩티드와의 결합 등의 주지의 방법을 사용할 수 있다.

숙주세포로부터 목적의 폴리펩티드를 단리 정제하기 위해서는, 공지의 분리 조작을 조합시켜서 행할 수 있다. 예를 들면 요소 등의 변성제나 계면활성제에 의한 처리, 초음파 처리, 효소 소화, 염석이나 용매분별 침전법, 투석, 원심분리, 한외여과, 겔여과, SDS-PAGE, 등전점 전기영동, 이온교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 등을 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다.

<항체의 구조>

항체는 통상 적어도 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 헤테로 다량체 당단백질이다. IgM을 제외한 다른 4종의 면역글로블린은 원칙적으로 2개의 동일한 경(L)쇄 및 2개의 동일한 중(H)쇄로 구성되는 약 150kDa의 헤테로 4량체 당단백질이다. 전형적으로는 각각의 경쇄는 1개의 디술피드 공유결합에 의해 중쇄에 연결되어 있지만, 중쇄간의 디술피드 결합의 수는 여러가지 면역글로블린 아이소타입에 의해 변동한다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 쇄내 디술피드 결합도 갖는다. 각 중쇄는 일단에 가변 도메인(VH 영역)을 갖고, 그것에 몇개의 정상영역이 계속된다. 각 경쇄는 일단에 가변 도메인(VL 영역)을 갖고, 타단에 정상영역을 1개 갖는다. 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬하고 있고, 또한 경쇄의 정상영역은 중쇄의 가변 도메인에 계속되는 최초의 정상영역과 정렬하고 있다. 항체의 가변 도메인은 상보성 결정영역(CDR)으로 불리는 3개의 특정한 영역이 가변성을 나타내고, 항체에 결합 특이성을 부여한다. 가변영역에 있어서 상대적으로 보존되어 있는 부분은 프레임워크 영역(FR)이라고 부르고 있다. 완전한 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 3개의 CDR에 의해 연결된 4개의 FR(N 말단측에서 순서대로 FR1, FR2, FR3, 및 FR4)을 포함한다. 상기 3개의 CDR는 그 N 말단측에서 순서대로, 중쇄에서는 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3이라고 부르고, 경쇄에서는 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3이라고 부르고 있다. 항체의 항원에의 결합 특이성에는 CDRH3이 가장 중요하다. 또한, 각 쇄의 CDR은 FR 영역에 의해 근접한 상태에서 함께 유지되고, 다른쪽의 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원 결합부위의 형성에 기여한다. 정상영역은 항체가 항원에 결합하는 것에 직접 기여는 하지 않지만, 여러가지 이펙터 기능, 예를 들면 항체의존성 세포성 세포상해활성(ADCC)에의 관여, Fcγ 수용체에의 결합을 통한 식작용, 신생아 Fc 수용체(FcRn)를 통한 반감기/클리어런스 속도, 보체 캐스케이드의 C1q 구성요소를 통한 보체의존성 세포상해(CDC)를 나타낸다.

<항체의 제작>

본 발명에 있어서의 항CSPG5 항체란 CSPG5 단백질의 전장 또는 그 단편과 면역학적 반응성을 갖는 항체를 의미한다.

여기에서, 「면역학적 반응성」이란, 생체 내에서 항체와 CSPG5 항원이 결합하는 특성을 의미한다. 이러한 결합을 통해서 종양을 상해(예를 들면, 사멸, 억제 또는 퇴축)하는 기능이 발휘된다. 즉, 본 발명에서 사용되는 항체는 CSPG5 단백질과 결합해서 종양, 예를 들면 유방암, 폐암, 뇌종양, 백혈병, 악성 림프종, 선암, 비만세포종, 편평상피암, 멜라노머 또는 신경아종세포 등을 상해할 수 있으면, 그 종류를 묻지 않는다.

항체의 예는, 상술한 바와 같이 단일클론 항체, 다중클론 항체, 유전자 재조합 항체, 항체 프래그먼트(예를 들면 Fab나 F(ab')₂) 등을 포함한다. 또한, 항체는 면역글로블린 분자의 임의의 클래스, 예를 들면 IgG, IgE, IgM, IgA, IgD 및 IgY, 또는 임의의 서브클래스, 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 등이다.

항체는 또한, 글리코실화 이외에, 아세틸화, 포르르밀화, 아미드화, 인산화, 또는 페그(PEG)화 등에 의해 수식되어 있어도 된다.

이하에, 여러가지 항체의 제작예를 나타낸다.

(1) 단일클론 항체

단일클론 항체에, 인간 단일클론 항체, 비인간 동물 단일클론 항체(예를 들면, 마우스 단일클론 항체, 래트 단일클론 항체, 토끼 단일클론 항체, 닭 단일클론 항체 등) 등이 포함된다.

항체가 단일클론 항체일 때에는, 소망의 항원(여기에서는 CSPG5 단백질)이나 소망의 항원을 발현하는 세포를 감작항원으로서 사용하고, 이것을 통상의 면역방법에 따라서 면역하고, 얻어진 면역세포를 통상의 세포융합법에 의해 공지의 친세포와 융합시켜, 통상의 스크리닝법에 의해 단일클론인 항체산생세포(하이브리도마)를 스크리닝함으로써 제작할 수 있다.

우선, 공지의 방법에 따라서 감작항원을 동물에 면역한다. 일반적 방법으로서 감작항원을 포유동물, 예를 들면 마우스의 복강내 또는 피하에 주사함으로써 행하여진다. 구체적으로는, 감작항원인 CSPG5 단백질을 PBS(Phosphate-Buffered Saline)이나 생리식염수 등에 의해 적당량으로 희석, 현탁한 것에 소망에 따라 통상의 아쥬반트, 예를 들면 프로인트 완전 아쥬반트를 적당량 혼합하고, 유화 후, 포유동물, 예를 들면 마우스에 4∼21일마다 수회 투여한다. 또한, 감작항원 면역시에 적당한 담체를 사용할 수도 있다. 또는 CSPG5 유전자를 발현하는 백혈병 세포주 K562 등을 면역동물에 투여해서 면역해도 좋다.

이와 같이 포유동물을 면역하고, 혈청 중에 소망의 항체 레벨이 상승하는 것을 확인한 후에, 단일클론 항체를 산생하는 하이브리도마의 제작을 위해 포유동물로부터 면역세포를 채취하고, 세포융합에 제공한다. 하이브리도마의 제작에 바람직한 면역세포로서는, 특히 비장세포를 들 수 있다.

상기 면역세포와 융합되는 다른쪽 친세포로서, 포유동물의 골수종세포를 사용한다. 이 골수종세포는 공지의 여러가지 세포주, 예를 들면 P3U1(P3-X63Ag8U1), P3(P3x63Ag8.653)(J. Immunol. (1979)123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81, 1-7), NS-1(Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976)6, 511-519), MPC-11(Margulies. D.H. et al., Cell(1976)8, 405-415), SP2/0(Shulman, M. et al., Nature(1978)276, 269-270), FO(deSt. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods(1980)35, 1-21), S194(Trowbridge, I.S. J.Exp.Med.(1978)148, 313-323), R210(Galfre, G. et al., Nature(1979)277, 131-133) 등이 적합하게 사용된다.

상기 면역세포와 골수종세포의 세포융합은, 기본적으로는 공지의 방법, 예를 들면 쾰러와 밀스테인 등의 방법(Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol.(1981)73, 3-46) 등에 준해서 행할 수 있다.

보다 구체적으로는, 상기 세포융합은, 예를 들면 세포융합 촉진제의 존재 하에 통상의 영양배양액 중에서 실시된다. 융합 촉진제로서는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 또한 소망에 의해 융합 효율을 높이기 위해서 디메틸술폭시드 등의 보조제를 첨가 사용할 수도 있다.

면역세포와 골수종세포의 사용 비율은 임의로 설정할 수 있다. 예를 들면 골수종세포에 대하여 면역세포를 1∼10배로 할 수 있다. 상기 세포융합에 사용하는 배양액으로서는, 예를 들면 상기 골수종세포주의 증식에 적합한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 기타 이 종류의 세포배양에 사용되는 통상의 배양액이 사용 가능하고, 또한 소태아혈청(FCS) 등의 혈청보액을 병용할 수도 있다.

세포융합은 상기 면역세포와 골수종세포의 소정량을 상기 배양액 중에서 잘 혼합하고, 미리 37℃ 정도로 가온한 PEG 용액(예를 들면, 평균 분자량 1000∼6000정도)을 통상 30∼60%(w/v)의 농도로 첨가하고, 혼합함으로써 목적으로 하는 하이브리도마를 형성한다. 계속해서, 적당한 배양액을 축차 첨가하고, 원심해서 상청을 제거하는 조작을 반복함으로써 하이브리도마의 생육에 바람직하지 못한 세포융합제 등을 제거한다.

이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마는, 통상의 선택 배양액, 예를 들면 HAT배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)으로 배양함으로써 선택된다. 상기 HAT 배양액에서의 배양은, 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸하는데도 충분한 시간(통상, 수일∼수주간) 계속한다. 이어서, 통상의 한계희석법을 실시하고, 목적으로 하는 항체를 산생하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝을 행한다.

또한, 인간 이외의 동물에 항원을 면역해서 상기 하이브리도마를 얻는 것 이외에, 인간 림프구, 예를 들면 EB 바이러스에 감염한 인간 림프구를 in vitro에서 단백질, 단백질 발현세포 또는 그 용해물로 감작하고, 감작 림프구를 인간 유래의 영구분열능을 갖는 골수종세포, 예를 들면 U266(등록번호 TIB196)과 융합시켜, 소망의 활성(예를 들면, 세포증식 억제활성)을 갖는 인간 항체를 산생하는 하이브리도마를 얻을 수도 있다.

이와 같이 하여 제작되는 단일클론 항체를 산생하는 하이브리도마는, 통상의 배양액 중에서 계대배양하는 것이 가능하고, 또한 액체질소 중에서 장기보존하는 것이 가능하다.

(2) 다중클론 항체

항체가 다중클론 항체인 경우에는 천연의 CSPG5 단백질, GST 등과의 융합단백질로서 대장균 등의 미생물에 있어서 발현시킨 재조합 CSPG5 단백질, 또는 그 부분 펩티드를 마우스, 인간 항체 산생 마우스, 토끼 등의 소동물에 면역하여 혈청을 얻는다. 이것을, 예를 들면 유안침전, 단백질A, 단백질G 컬럼, DEAE 이온교환 크로마토그래피, CSPG5 단백질이나 합성 펩티드를 커플링한 친화성 칼럼 등에 의해 정제함으로써 조제한다. 후술의 실시예에서는, CSPG5 단백질의 아미노산 서열 중, 암세포의 세포외 영역에 대한 마우스 다중클론 항체가 제작되어, 항종양 효과가 확인되어 있다.

여기에서, 인간 항체 산생 마우스로서는, 예를 들면 KM 마우스(키린파마/Medarex) 및 Xeno 마우스(Amgen)가 알려져 있다(예를 들면, 국제공개 제02/43478호, 동 제02/092812호 등). 이러한 마우스를 CSPG5 단백질 또는 그 단편으로 면역할 때에는 완전 인간 다중클론 항체를 혈액으로부터 얻을 수 있다.

항원의 조제는, 예를 들면 동물세포를 사용한 방법(일본 특허공표 2007-530068)이나 바큘로바이러스를 사용한 방법(예를 들면, 국제공개 제98/46777호 등) 등에 준해서 행할 수 있다. 항원의 면역원성이 낮을 경우에는, 알부민 등의 면역원성을 갖는 거대분자와 결합시켜 면역을 행하면 좋다.

(3) 재조합 항체

항체가 유전자 재조합 항체일 경우, 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하고, 적당한 벡터에 짜넣고, 이것을 숙주에 도입하여 유전자 재조합 기술을 이용하여 산생시킨 유전자 재조합 항체를 사용할 수 있다(예를 들면 Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 참조). 구체적으로는, 하이브리도마의 mRNA로부터 역전사 효소를 이용하여 항체의 가변영역(V영역)의 cDNA를 합성한다. 목적으로 하는 항체의 V영역을 코드하는 DNA가 얻어지면, 이것을 소망의 항체 정상영역(C영역)을 코드하는 DNA와 연결하고, 얻어진 DNA를 발현 벡터에 짜넣는다. 또는, 항체의 V영역을 코드하는 DNA를, 항체 C영역의 DNA를 포함하는 발현 벡터에 짜넣어도 좋다. 발현제어 영역, 예를 들면 인핸서, 프로모터의 제어를 기초로 발현되도록 발현 벡터에 짜넣는다. 이어서, 이 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환하고, 유전자 재조합 항체를 발현시킬 수 있다.

유전자 재조합 항체에는 키메라 항체, 인간화 항체, 단쇄 항체, 2중특이성 항체 등의 다중쇄 항체를 들 수 있다.

「키메라 항체」는 다른 동물 유래의 서열을 조합시켜서 제작되는 항체이며, 예를 들면 마우스 항체의 중쇄, 경쇄의 가변영역과 인간 항체의 중쇄, 경쇄의 정상영역으로 이루어지는 항체 등이다. 키메라 항체의 제작은 공지의 방법을 이용하여 행할 수 있고, 예를 들면 항체 V영역을 코드하는 DNA와 인간 항체 C영역을 코드하는 DNA를 연결하고, 이것을 발현 벡터에 짜넣어서 숙주에 도입해 산생시킴으로써 얻어진다. 일례로서, 인간 이외의 동물(예를 들면 마우스 등) 유래의 항체의 경쇄또는 중쇄의 가변영역을 코드하는 DNA를 각각, 인간 항체 유래의 경쇄 또는 중쇄의 정상영역을 코드하는 DNA와 연결함으로써, 인간-마우스 키메라 항체를 코드하는 DNA를 제작할 수 있다.

「인간화 항체」는 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 불리는 개변항체이다. 인간화 항체는 면역동물 유래의 항체의 CDR를, 인간 항체의 상보성 결정영역에 이식함으로써 구축된다. 그 일반적인 유전자 재조합 방법도 알려져 있다. 구체적으로는, 단일클론 항체를 코드하는 DNA를 클로닝하고, 이것을 주형으로 해서 상기 항체의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 코드하는 DNA를 RT-PCR법 등에 의해 제작하고, Kabat EU numbering system(Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5thEd. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md.(1991))에 의거하여 경쇄 및 중쇄의 각 가변영역의 서열 또는 각 CDR1, CDR2, CDR3의 서열을 결정한다. 계속해서, 마우스 항체의 CDR과 인간 항체의 프레임워크 영역(framework region； FR)을 연결하도록 설계한 DNA 서열을, 말단부에 오버랩하는 부분을 갖도록 제작한 수개의 올리고뉴클레오티드로부터 PCR법에 의해 합성한다. 얻어진 DNA를, 인간 항체 정상영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이어서 발현 벡터에 짜넣어서, 이것을 숙주에 도입해 산생시킴으로써 얻어진다(유럽 특허출원공개 제239400호, 국제공개 제96/02576호 참조). CDR을 통해서 연결되는 인간 항체의 FR은 상보성 결정영역이 양호한 항원결합부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라, 재구성 인간 항체의 상보성 결정영역이 적절한 항원결합부위를 형성하도록 항체의 가변영역에 있어서의 프레임워크 영역의 아미노산을 치환해도 좋다(Sato K., et al., Cancer Research, 1993, 53: 851-856). 또한, 다양한 인간 항체 유래의 프레임워크 영역에 치환해도 좋다(국제공개 제99/51743호 참조).

CDR을 통해서 연결되는 인간 항체의 프레임워크 영역은, 상보성 결정영역이 양호한 항원결합부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라서 재구성 인간 항체의 상보성 결정영역이 적절한 항원결합부위를 형성하도록, 항체의 가변영역에 있어서의 프레임워크 영역의 아미노산을 치환해도 좋다(Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856).

키메라 항체나 인간화 항체를 제작한 후에, 가변영역(예를 들면 FR)이나 정상영역 중의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하거나 해도 좋다.

아미노산의 치환은, 예를 들면 15 미만, 10 미만, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하의 아미노산, 바람직하게는 1∼5 아미노산, 보다 바람직하게는 1 또는 2 아미노산의 치환이며, 치환 항체는 미치환 항체와 기능적으로 동등해야 한다. 치환은 보존적 아미노산 치환이 바람직하고, 이것은 전하, 측쇄, 극성, 방향족성 등의 성질이 유사한 아미노산간의 치환이다. 성질이 유사한 아미노산은, 예를 들면 염기성 아미노산(아르기닌, 리신, 히스티딘), 산성 아미노산(아스파르트산, 글루탐산), 무전하 극성 아미노산(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신), 무극성 아미노산(류신, 이소류신, 알라닌, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌), 분기쇄 아미노산(트레오닌, 발린, 이소류신), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 히스티딘) 등으로 분류할 수 있다.

항체수식물로서는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 들 수 있다. 본 발명의 항체수식물에 있어서는 결합되는 물질은 한정되지 않는다. 이러한 항체수식물은 얻어진 항체에 화학적인 수식을 실시함으로써 얻을 수 있다. 이들 방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다.

여기에서 「기능적으로 동등」이란, 대상이 되는 항체가 본 발명의 항체와 같은 생물학적 또는 생화학적 활성, 구체적으로는 종양을 상해하는 기능을 갖는 것, 인간에의 적용시에 거부반응을 본질적으로 일으키지 않는 것 등을 가리킨다. 이러한 활성으로서는, 예를 들면 세포증식억제 활성, 또는 결합 활성을 예시할 수 있다.

어떤 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 조제하기 위한, 당업자에게 잘 알려져진 방법으로서는, 폴리펩티드에 변이를 도입하는 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 당업자라면 부위 특이적 변이유발법(Hashimoto-Gotoh, T. et al., (1995)Gene, 152, 271-275: Zoller, MJ., and Smith, M. (1983)Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W.et al., (1984)Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer, W.and Fritz, HJ., (1987)Methods Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA., (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 488-492; Kunkel (1988)Methods Enzymol., 85, 2763-2766) 등을 이용하여, 본 발명의 항체에 적당하게 변이를 도입 함으로써, 상기 항체와 기능적으로 동등한 항체를 조제할 수 있다.

항CSPG5 항체가 인식하는 CSPG5 단백질의 에피토프를 인식하는 항체는, 당업자에게 공지의 방법에 의해 얻는 것이 가능하다. 예를 들면, 항CSPG5 항체가 인식하는 CSPG5 단백질의 에피토프를 통상의 방법(예를 들면, 에피토프 매핑 등)에 의해 결정하고, 상기 에피토프에 포함되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 면역원으로 해서 항체를 제작하는 방법이나, 통상의 방법으로 제작된 항체의 에피토프를 결정하고, 항CSPG5 항체와 에피토프가 같은 항체를 선택하는 방법 등에 의해 얻을 수 있다.

본 발명의 항CSPG5 항체와 암세포 표면 상의 CSPG5 단백질의 친화정수(결합정수) Ka(kon/koff)는, 적어도 10⁷M^-1, 적어도 10⁸M^-1, 적어도 5×10⁸M^-1, 적어도 10⁹M^-1, 적어도 5×10⁹M^-1, 적어도 10¹⁰M^-1, 적어도 5×10¹⁰M^-1, 적어도 10¹¹M^-1, 적어도 5×10¹¹M^-1, 적어도 10¹²M^-1, 또는 적어도 10¹³M^-1이다. 결합 친화성은 높을수록, 보다 강한 항종양 활성이 얻어진다. 따라서, CSPG5 단백질과 높은 결합 친화성을 갖는 항CSPG5 항체를 획득할 수 있으면, 보다 강한 항종양 효과를 기대할 수 있고, 암의 치료 및/또는 예방을 목적으로 한 의약 조성물로서 적응하는 것이 가능하게 된다.

「단쇄 항체」는, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 링커를 통해서 직선 형상으로 연결된 항체이며, 중쇄 가변영역을 코드하는 DNA, 링커를 코드하는 DNA, 및 경쇄 가변영역을 코드하는 DNA를 결합함으로써 단쇄 항체를 코드하는 DNA를 제작할 수 있다. 여기에서, 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역은 모두 인간 항체 유래의 것이거나, 또는 CDR만 인간 이외의 동물(예를 들면, 마우스, 래트, 닭 등) 유래의 항체의 CDR에 의해 치환된 인간 항체 유래의 것이 바람직하다. 또한, 링커는 12∼19 아미노산으로 이루어지고, 예를 들면 15 아미노산의 (G4S)3(G. B. Kim 등, Protein Engineering Design and Selection, 2007, 20(9): 425-432)을 들 수 있다.

「2중특이성 항체(diabody)」의 경우에는, 이 항체는 2개의 다른 에피토프와 특이적으로 결합 가능한 항체이며, 예를 들면 중쇄 가변영역 A를 코드하는 DNA, 경쇄 가변영역 B를 코드하는 DNA, 중쇄 가변영역 B를 코드하는 DNA, 및 경쇄 가변영역 A를 코드하는 DNA를 이 순서로 결합함(단, 경쇄 가변영역 B를 코드하는 DNA와 중쇄 가변영역 B를 코드하는 DNA는 상기와 같은 링커를 코드하는 DNA를 통해서 결합된다.)으로써 2중특이성 항체를 코드하는 DNA를 제작할 수 있다. 여기에서, 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역은 모두 인간 항체 유래의 것이거나, 또는 CDR만 인간 이외의 동물(예를 들면, 마우스, 래트, 닭 등) 유래의 항체의 CDR에 의해 치환된 인간 항체 유래의 것이 바람직하다.

상기와 같이 해서 제작된 재조합 DNA를, 1개 또는 복수의 적당한 벡터에 짜넣고, 이것을 숙주세포(예를 들면 포유동물세포, 효모세포, 곤충세포 등)에 도입하고, (공)발현시킴으로써 재조합형 항체를 제작할 수 있다(P. J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS； J. W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS).

상기 항체는, 바람직하게는 세포상해활성을 갖고 있고, 이것에 의해 항종양 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명의 항체는 다른 항종양제와 콘쥬게이트할 수 있다. 항체와 항종양제의 결합은 아미노기, 카르복실기, 히드록시기, 티올기 등과 반응성의 기(예를 들면, 숙신산 이미딜기, 포르밀기, 2-피리딜디티오기, 말레이이미딜기, 알콕시카르보닐기, 히드록시기 등)를 갖는 스페이서를 통해서 행할 수 있다.

항종양제의 예는, 문헌 등에서 공지인 하기의 항종양제, 즉, 파클리탁셀, 독소루비신, 다우노루비신, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 티오테파, 부설판, 임프로설판, 피포설판, 벤조도파(benzodopa), 칼보콘, 메트레도파(meturedopa), 우레도파(uredopa), 알트레트아민(altretamine), 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드(triethilenethiophosphoramide), 트리메틸올멜라민(trimethylolomelamine), 불라타신, 불라타시온, 캄토테신, 브리오스타틴, 칼리스타틴(callystatin), 크립토파이신 1, 크립토파이신 8, 도라스타틴, 듀오카르마이신, 에레우테로빈, 판크라스타틴, 사르코딕틴, 스폰지 스타틴, 클로람부실, 클로나파진(chloRNAphazine), 클로로포스파미드(cholophosphamide), 에스트라무스틴, 아이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민옥시드히드로클로라이드, 멜파란, 노벰비킨(novembichin), 페네스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 토로포스파미드(trofosfamide), 우라실 머스터드, 카무스틴, 클로로조토신(chlorozotocin), 포테무스틴(fotemustine), 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴, 칼리키아미신(calicheamicin), 다이네마이신, 클로드로네이트, 에스페라마이신, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오스라마이신(authramycin), 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신(cactinomycin), 카라비신(carabicin), 카르미노마이신, 카르치노필린(carzinophilin), 크로모마이신, 닥티노마이신 데토르비신(detorbicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마셀로마이신(marcellomycin), 마이토마이신 C, 마이코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycins), 페프로마이신, 포트피로마이신(potfiromycin), 퓨로마이신, 케라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘(tubercidin), 우베니멕스, 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin), 데놉테린(denopterin), 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 플루다라빈(fludarabine), 6-메르캅토푸린, 치아미푸린, 티오 구아닌, 안시타빈, 아자시티딘(azacitidine), 6-아자우리딘(azauridine), 카모풀, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에녹시타빈(enocitabine), 플록슈리딘(floxuridine); 안드로겐류, 예를 들면 칼루스테론(calusterone), 프로피온산 도로모스타노론, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤(testolactone), 아미노글루테티미드, 티토탄, 트릴로스탄, 프로린산(frolinic acid), 아세글락톤, 알도포스파미드 글리코시드, 아미노레불린산, 에닐우라실, 암사크린(amsacrine), 베스트라부실(bestrabucil), 바이센트린(bisantrene), 에다트락세이트(edatraxate), 디포파민(defofamine), 데메콜신(demecolcine), 디아지콘(diaziquone), 엘포르니틴(elfornithine), 아세트산 엘립티니움(elliptinium), 에포틸린(epothilone), 에토글루시드(etoglucid), 렌티난, 로니다민(lonidamine), 메이탄신(maytansine), 안사미토신(ansamitocine), 미토구아존(mitoguazone), 미톡산트론, 모피단몰(mopidanmol), 니트라에린(nitraerine), 텐토스타틴, 페나메트(phenamet), 피라루비신, 로속산트론(losoxantrone), 포도필린산(podophyllinic acid), 2-에틸히드라지드, 프로카르바진, 라족산(razoxane), 리족신, 시조필란, 스피로게르마늄(spirogermanium), 테누아진산(tenuazonic acid), 트리아지콘(triaziquone), 로리딘(roridine) A, 언구이딘(anguidine), 우레탄, 빈데신, 다카바진, 만노무스틴(mannomustine), 미토브로니톨, 미토락톨(mitolactol), 피포브로만(pipobroman), 가시토신(gacytosine), 도세탁셀, 클로람부실, 젬시타빈(gemcitabine), 6-티오구아닌, 메르캅토푸린, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카보플라틴, 빈블라스틴, 에토포시드, 이포스파마이드, 마이토산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 노반트론(novantrone), 테니포시드, 에다트렉세이트(edatrexate), 다우노마이신, 아미노프테린, 젤로다(xeloda), 이반드로네이트(ibandronate), 이리노테칸, 토포이소머라아제 인히비터, 디플루오로메틸올니틴(DMFO), 레티노산, 카페시타빈(capecitabine), 및 그것들의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 유도체를 포함한다.

또는, 본 발명의 항체에는 문헌 등에서 공지인 ²¹¹At, ¹³¹I, ¹²⁵I, ⁹⁰Y, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁵³Sm, ²¹²Bi, ³²P, ¹⁷⁵Lu, ¹⁷⁶Lu 등의 방사성 동위체를 결합하는 것도 가능하다. 방사성 동위체는 종양의 치료나 진단을 위해서 유효한 것이 바람직하다.

본 발명의 항체는 CSPG5 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 항체, 또는 CSPG5 단백질을 특이적으로 인식하는 항체이다. 상기 항체는 그것을 투여하는 대상동물에 있어서 거부반응이 거의 또는 완전히 회피되는 구조를 가지는 항체이어야 한다. 그러한 항체로서는, 예를 들면 대상동물이 인간일 경우, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체(예를 들면 인간-마우스 키메라 항체) 등을 들 수 있다.

또한, 인간 CSPG5 단백질에 대한 인간 항체 또는 비인간 동물항체(예를 들면, 마우스 항체)를 산생할 수 있는 하이브리도마를 제작한다. 그 하이브리도마가 산생하는 단일클론 항체를 회수하여 인간 CSPG5 단백질과의 면역학적 결합성 및 세포상해활성을 지표로 해서 목적의 항체인지의 여부를 판정한다. 그것에 의해서 목적의 단일클론 항체 산생 하이브리도마를 식별하고, 선택한다. 그 후, 상기한 바와 같이, 상기 하이브리도마로부터 목적의 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 코드하는 DNA를 조제해서 염기서열 결정하고, 상기 DNA의 염기서열 정보를 다른 항체의 제작을 위해서 이용한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 상기 항체를 코드하는 DNA, 또는 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코드하는 DNA, 또는 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄의 가변영역을 코드하는 DNA도 제공한다.

이들 DNA에 코드되는 CDR은 항체의 특이성을 결정하는 영역이다. 항체의 CDR 이외의 영역(즉, 정상영역 및 프레임워크 영역)을 코드하는 염기서열은 다른 항체유래의 염기서열이라도 된다. 여기에서 다른 항체란, 인간 이외의 생물 유래의 항체도 포함하지만, 부작용 저감의 관점으로부터는 인간 유래의 것이 바람직하다. 즉, 상기 DNA에서는 중쇄 및 경쇄의 각 프레임워크 영역 및 각 정상영역을 코드하는 영역이 인간 항체 유래의 대응 아미노산 서열을 코드하는 염기서열을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 유효성분인 항체의 DNA는, 예를 들면 상기 방법 또는 이하의 방법으로 얻을 수 있다. 우선, 본 발명의 항체에 관계되는 하이브리도마로부터 시판의 RNA 추출 키트를 이용하여 전체 RNA를 조제하고, 랜덤 프라이머 등을 이용하여 역전사 효소에 의해 cDNA를 합성한다. 이어서 기지의 마우스 항체 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자의 각 가변영역에 있어서, 각각 보존되어 있는 서열의 올리고뉴클레오티드를 프라이머에 사용한 PCR법에 의해 항체를 코드하는 cDNA를 증폭시킨다. 정상영역을 코드하는 서열에 대해서는 기지의 서열을 PCR법으로 증폭함으로써 얻을 수 있다. DNA의 염기서열은 서열 결정용 플러스미드 또는 살균 바이러스에 짜넣거나 하여, 상법에 의해 결정할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항CSPG5 항체에 의한 CSPG5 단백질 발현 암세포에 대한 항종양 효과는, 이펙터 세포를 개재한 항체 의존적 세포상해성(ADCC), 및 보체 의존적 세포상해성(CDC)의 기서에 의해 일어난다고 생각된다.

따라서, 본 발명에서 사용되는 항CSPG5 항체의 활성평가는, 실시예에 구체적으로 나타내어지는 바와 같이, 생체 밖에서 CSPG5 단백질을 발현하는 암세포에 대하여 상기 ADCC 활성 또는 CDC 활성을 측정함으로써 평가할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항CSPG5 항체는 암세포 표면 상에 존재하는 CSPG5 단백질의 세포외 영역과 결합하고, 상기 활성에 의해 항종양 작용을 나타내기 때문에, 암의 치료 또는 예방에 유용하다고 생각된다. 즉 본 발명은, 항CSPG5 항체를 유효성분으로 하는, 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물을 제공한다. 항CSPG5 항체를 인체에 투여하는 목적(항체 치료)으로 사용할 경우에는, 면역원성을 저하시키기 위해서 인간 항체나 인간화 항체로 하는 것이 바람직하다.

<항원 발현세포에의 결합>

항체가 CSPG5 단백질에 결합하는 능력은 실시예에서 서술되는 바와 같은, 예를 들면 ELISA, 웨스턴블롯법, 면역형광 및 플로사이토메트리(flow cytometry) 분석 등을 사용한 결합 분석을 이용해서 특정할 수 있다.

<면역 조직 화학 염색>

CSPG5 단백질을 인식하는 항체는 당업자에게 주지인 면역 조직 화학 염색법에 의해, CSPG5 단백질과의 반응성에 관해서 각종 조직이나 절편을 시험할 수 있다. 예를 들면, 외과수술의 사이에 환자로부터 얻은 조직, 자연히, 또는 트랜스펙션 후에 CSPG5 단백질을 발현하는 세포계를 접종한 이종 이식 조직을 담지하는 동물로부터 얻은 조직, 파라포름알데히드 또는 아세톤 고정한 동결절편, 또는 파라포름알데히드로 고정한 파라핀 포매한 조직절편을 사용할 수 있다.

면역 조직 화학 염색을 위해, CSPG5 단백질에 대하여 반응성이 있는 항체를 다양한 방법으로 염색시킬 수 있다. 예를 들면, 호스래시디(horseradish) 퍼옥시다아제 복합 염소 항마우스 항체나 염소 항토끼 항체를 반응시킴으로써 가시화할 수 있다.

<의약 조성물>

본 발명의 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물의 표적은 CSPG5 단백질을 세포 표면에 발현하는 암(세포)이면 특별하게 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 「종양」 및 「암」이라고 하는 용어는, 악성 신생물을 의미하고, 호환적으로 사용된다.

본 발명에 있어서 대상이 되는 암으로서는, CSPG5 유전자를 발현하고 있는 암, 구체적으로는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 및 16으로 나타내어지는 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 7 이상의 연속 아미노산으로 이루어지는 그 부분 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 발현하고 있는 암인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 난소암을 제외하는 암이며, 더 바람직하게는 유방암, 폐암, 뇌종양, 백혈병, 악성 림프종, 비만세포종, 멜라노머 또는 신경아종세포이며, 특히 바람직하게는 백혈병 또는 악성 림프종이다.

이들 특정의 암에는, 예를 들면 유선암, 복합형 유선암, 유선 악성 혼합종양, 유관내 유두상 선암, 폐선암, 편평상피암, 소세포암, 대세포암, 신경상피조직성 종양인 신경아교종, 뇌실상의종, 신경세포성 종양, 태아형의 신경외배엽성 종양, 신경초종, 신경섬유종, 수막종, 만성형 림프구성 백혈병, 호지킨 림프종, 소화관형 림프종, 소화기형 림프종, 소∼중세포형 림프종, 맹장암, 상행결장암, 하행결장암, 횡행결장암, S상 결장암, 직장암이 포함되지만, 이것들에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 의약 조성물의 대상이 되는 동물은 포유동물이며, 예를 들면 영장류, 애완동물, 가축류, 경기용 동물 등을 포함하는 포유동물이며, 특히 인간, 개 및 고양이가 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 항체를 의약 조성물로서 사용할 경우에는, 당업자에게 공지인 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 예를 들면, 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 액체와의 무균성 용액의 형태로, 또는 현탁액제의 주사제의 형태로, 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약리학상 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는, 멸균수나 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 결합제 등과 적당하게 조합하여, 일반적으로 인정된 제약실시에 요구되는 단위용량 형태로 혼화함으로써 제제화하는 것이 생각된다. 이들 제제에 있어서의 유효성분량은 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 하는 것이다.

주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비히클을 이용하여 통상의 제제 실시에 따라서 처방할 수 있다.

주사용의 수용액으로서는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 그 밖의 보조약을 포함하는 등장액, 예를 들면 D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 염화나트륨을 들 수 있고, 적당한 용해보조제, 예를 들면 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리알코올, 예를 들면 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리솔벤드 80^(TM), HCO-60과 병용해도 좋다.

유성액으로서는 참깨유, 대두유를 들 수 있고, 용해보조제로서 벤조산 벤질, 벤질알코올과 병용해도 좋다. 또한, 완충제, 예를 들면 인산염 완충액, 아세트산 나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면 염산 프로카인, 안정제, 예를 들면 벤질알코올, 페놀, 산화방지제와 배합해도 좋다. 조제된 주사액은 통상, 적당한 앰플에 충전시킨다.

투여는, 경구 또는 비경구이며, 바람직하게는 비경구투여이며, 구체적으로는, 주사제형, 경비투여제형, 경폐투여제(經肺投與劑)형, 경피투여형 등을 들 수 있다. 주사제형의 예로서는, 예를 들면 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다.

또한, 환자의 연령, 체중, 성별, 증상 등에 따라 적당하게 투여방법을 선택할 수 있다. 항체 또는 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 의약 조성물의 투여량으로서는, 예를 들면 1회에 대해서 체중 1kg당 0.0001mg에서 1000mg의 범위에서 선택하는 것이 가능하다. 또는, 예를 들면 환자당 0.001∼100000mg/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있지만, 이들 수치에 반드시 제한되는 것은 아니다. 투여량, 투여방법은 환자의 체중, 연령, 성별, 증상 등에 따라 변동하지만, 당업자라면 적당하게 선택하는 것이 가능하다.

(실시예)

이하, 본 발명을 이하의 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들 구체예에 의해 제한되지 않는 것으로 한다.

<실시예 1: SEREX법에 의한 신규 암항원 단백질의 동정>

(1) cDNA 라이브러리의 제작

건강한 개의 정소조직으로부터 산 구아니디움-페놀-클로로포름법(Acid guanidium-Phenol-Chloroform법)에 의해 전체 RNA를 추출하고, Oligotex-dT30 mRNA purification Kit(타카라슈조사제)를 이용하여 키트 첨부의 프로토콜에 따라서 폴리A RNA를 정제했다.

이 얻어진 mRNA(5㎍)를 이용하여 개 정소 cDNA 파지 라이브러리를 합성했다. cDNA 파지 라이브러리의 제작에는 cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Clonig Kit(Agilent Technologies사제)를 사용하고, 키트 첨부의 프로토콜에 따라서 라이브러리를 제작했다. 제작한 cDNA 파지 라이브러리의 사이즈는 7.73×10⁵pfu/mL이었다.

(2) 혈청에 의한 cDNA 라이브러리의 스크리닝

상기 제작한 개 정소 cDNA 파지 라이브러리를 이용하여, 면역스크리닝를 행하였다. 구체적으로는 Φ90×15㎜의 NZY 아가로스 플레이트에 2210클론으로 되도록 숙주대장균(XL1-Blue MRF')에 감염시켜, 42℃, 3∼4시간 배양하고, 용균반(플라크)을 만들게 하여 IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토시드)를 침투시킨 니트로셀룰로오스 멤브레인(Hybond C Extra: GE Healthcare Bio-Scinece사제)로 플레이트를 37℃에서 4시간 피복함으로써 단백질을 유도·발현시켜 멤브레인에 단백질을 전사했다. 그 후 멤브레인을 회수해 0.5% 탈지분유를 포함하는 TBS(10mM Tris-HCl, 150mM NaCl pH7.5)에 담그고, 4℃에서 하룻밤 진탕함으로써 비특이반응을 억제했다. 이 필터를 500배 희석한 환견 혈청과 실온에서 2∼3시간 반응시켰다.

상기 환견 혈청에는 유방암의 환견으로부터 채취한 혈청을 사용했다. 이들 혈청은 -80℃에서 보존하고, 사용 직전에 전처리를 행하였다. 혈청의 전처리 방법은 이하의 방법에 의한다. 즉, 외래유전자를 삽입하지 않는 λ ZAP Express 파지를 숙주대장균(XL1-Blure MRF')에 감염시킨 후, NZY 플레이트 배지 상에서 37℃, 하룻밤 배양했다. 이어서 0.5M NaCl을 포함하는 0.2M NaHCO₃ pH8.3의 버퍼를 플레이트에 첨가해, 4℃에서 15시간 정치 후, 상청을 대장균/파지 추출액으로서 회수했다. 이어서, 회수한 대장균/파지 추출액을 NHS-컬럼(GE Healthcare Bio-Science사제)에 통액하고, 대장균·파지 유래의 단백질을 고정화했다. 이 단백질 고정화 컬럼에 상기 환견 혈청을 통액·반응시켜, 대장균 및 파지에 흡착하는 항체를 혈청으로부터 제거했다. 컬럼을 지나친 혈청 획분은, 0.5% 탈지분유를 포함하는 TBS에서 500배 희석하고, 이것을 면역스크리닝 재료로 했다.

이러한 처리 혈청과 상기 융합단백질을 블롯한 멤브레인을 TBS-T(0.05% Tween(등록상표) 20/TBS)에서 4회 세정을 행한 후, 2차 항체로서 0.5% 탈지분유를 포함하는 TBS에서 5000배 희석을 행한 염소 항견 IgG(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conｊugated: BETHYL Laboratories사제)를, 실온 1시간 반응시켜 NBT/BCIP 반응 액(Roche사제)을 사용한 효소 발색 반응에 의해 검출하고, 발색 반응 양성 부위에 일치하는 콜로니를 Φ90×15㎜의 NZY 아가로스 플레이트 상에서 채취하고, SM 완충액(100mM NaCl, 10mM MgClSO₄, 50mM Tris-HCl, 0.01% 젤라틴 pH7.5) 500μL에 용해시켰다. 발색 반응 양성 콜로니가 단일화할 때까지 상기와 같은 방법으로, 2차, 3차 스크리닝을 반복하고, 혈청 중의 IgG와 반응하는 9110개의 파지 클론을 스크리닝하여 1개의 양성 클론을 단리했다.

(3) 단리 항원 유전자의 상동성 검색

상기 방법에 의해 단리한 1개의 양성 클론을 염기서열 해석에 제공하기 위해서, 파지 벡터로부터 플러스미드 벡터로 전환하는 조작을 행하였다. 구체적으로는 숙주대장균(XL1-Blue MRF')을 흡광도 OD₆₀₀이 1.0이 되도록 조제한 용액 200μL와, 정제한 파지 용액 100μL 또한 ExAssist helper phage(Agilent Technologies사제) 1μL를 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응 후, LB 배지를 3mL 첨가하고, 37℃에서 2.5∼3시간 배양을 행하고, 즉시 70℃의 수욕으로 20분간 보온한 후, 4℃, 1000×g, 15분간 원심을 행하고, 상청을 파지미드(phagemid) 용액으로서 회수했다. 이어서 파지미드 숙주대장균(SOLR)을 흡광도 OD₆₀₀이 1.0이 되도록 조제한 용액 200μL와, 정제한 파지 용액 10μL를 혼합한 후, 37℃에서 15분간 반응시켜 50μL를 암피실린(마지막 농도 50㎍/mL) 함유 LB 한천 배지에 뿌려 37℃ 하룻밤 배양했다. 트랜스폼한 SOLR의 싱글 콜로니를 채취하고, 암피실린(마지막 농도 50㎍/mL) 함유 LB 배지 37℃에서 배양 후, QIAGEN plasmid Miniprep Kit(키아겐사제)를 사용하여 목적의 인서트를 가지는 플러스미드 DNA를 정제했다.

정제한 플러스미드는 서열번호 17에 기재된 T3 프라이머와 서열번호 18에 기재된 T7 프라이머를 이용하여, 프라이머 워킹법에 의한 인서트 전장 서열의 해석을 행하였다. 이 시퀀스 해석에 의해 서열번호 1에 기재된 유전자 서열을 취득했다. 이 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 이용하여 서열 동일성 검색 프로그램 BLAST 서치(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 행해 기지 유전자와의 서열 동일성 검색을 행한 결과, 얻어진 유전자는 CSPG5 유전자인 것이 판명되었다. 개 CSPG5 유전자의 인간 상동인자인 인간 CSPG5 유전자에서는 염기서열 동일성이 87%, 또한 인간 CSPG5 단백질에서는 아미노산 서열 동일성이 87%이며, 고양이 CSPG5 유전자에서는 염기서열 동일성이 92%, 또한 고양이 CSPG5 단백질에서는 아미노산 서열 동일성이 91%이며, 그리고 마우스 상동인자인 마우스 CSPG5 유전자에서는 염기서열 동일성이 84%, 또한 마우스 CSPG5 단백질에서는 아미노산 서열 동일성이 85%이었다. 인간 CSPG5 유전자의 염기서열을 서열번호 3, 5, 7, 9 및 11에, 또한 인간 CSPG5 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 4, 6, 8, 10 및 12에, 고양이 CSPG5 유전자의 염기서열을 서열번호 13에, 또한 고양이 CSPG5 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 14에, 그리고 마우스 CSPG5 유전자의 염기서열을 서열번호 15에, 또한 마우스 CSPG5 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 16에 나타낸다.

(4) 각 조직에서의 유전자 발현 해석

상기 방법에 의해 얻어진 유전자에 대하여 개, 인간 및 마우스의 각종 인간 정상조직, 및 각종 암조직 및 암세포주에 있어서의 발현을 RT-PCR(Reverse Transcription-PCR)법에 의해 조사했다. 역전사 반응은 이하와 같이 행했다. 즉, 각 조직 50∼100mg 및 각 세포주 5∼10×10⁶개의 세포로부터 TRIZOL 시약(Thermo Fisher Scientific사제)을 이용하여 첨부의 프로토콜에 따라 전체 RNA를 추출했다. 이 전체 RNA를 이용하여 Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Thermo Fisher Scientific사제)에 의해 첨부의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성했다. 인간 정상조직(뇌, 해마, 정소, 결장, 태반)의 cDNA는, 유전자풀 cDNA(Thermo Fisher Scientific사제), QUICK-Clone cDNA(클론텍사제) 및 Large-Insert cDNA Library(클론텍사제)를 사용했다. PCR 반응은 취득한 유전자 특이적인 프라이머(개 프라이머는 서열번호 19 및 20, 인간 프라이머는 서열번호 21 및 22, 마우스 프라이머는 서열번호 23 및 24에 기재)를 이용하여 하기와 같이 행하였다. 즉, 역전사 반응에 의해 조제한 샘플 0.25μL, 상기 프라이머를 각 2μM, 0.2mM의 각 dNTP, 0.65U의 ExTaq 폴리메라아제(타카라슈조사제)로 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 더해 전량을 25μL로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD사제)를 이용하여 94℃-30초, 55℃-30초, 72℃-1분의 사이클을 30회 반복하여 행하였다. 비교 대조를 위해, GAPDH 특이적인 프라이머(개 및 인간 GAPDH 프라이머는 서열번호 25 및 26, 마우스 GAPDH프라이머는 서열번호 27 및 28에 기재)도 동시에 사용했다. 그 결과, 도 1에 나타내는 바와 같이, 개 CSPG5 유전자는 건강한 개 조직에서는 대부분의 조직에서 발현이 보이지 않고, 한편 개 종양조직에서는 강한 발현이 보여졌다. 인간 및 마우스 CSPG5 유전자의 발현도 개 CSPG5 유전자와 같이, 인간 및 마우스 정상조직에서는 거의 발현을 확인할 수 없고, 암세포에서는 유방암, 폐암, 뇌종양, 난소암, 백혈병, 악성 림프종의 세포주에서 발현이 검출되었다(도 2, 도 3).

<실시예 2: 인간 CSPG5 단백질의 제작>

(1) 인간 CSPG5를 코드하는 전장 cDNA 및 인간 CSPG5의 세포외 영역을 코드하는 cDNA의 클로닝

인간 CSPG5 유전자를 코드하는 전장 cDNA는, 실시예 1에서 취득한 서열번호 7의 유전자를 기초로 이하의 방법으로 클로닝했다. PCR은 실시예 1에서 제작한 각종 조직·세포 cDNA로부터 RT-PCR법에 의한 발현을 확인할 수 있었던 cDNA를 1μL, KpnI 및 EcoRI 제한효소 절단 서열을 포함하는 2종류의 프라이머(서열번호 29 및 30에 기재)를 각 0.4μM, 0.2mM dNTP, 1.25U의 PrimeSTAR HS 폴리메라아제(타카라슈조사제)가 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 더해 전량을 50μL로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD사제)를 이용하여 98℃-10초, 68℃-2.5분의 사이클을 30회 반복함으로써 행하였다. 또한, 상기 2종류의 프라이머는 서열번호 7의 아미노산 서열 전장을 코드하는 영역을 증폭하는 것이었다. PCR 후, 증폭된 DNA를 1% 아가로스 겔로 전기영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사제)를 이용하여 약 1.7kbp의 DNA 단편을 정제했다. 상기 PCR 반응에 의해 얻어진 증폭산물은 pcDNA 3.1(Thermo Fisher Scientific사)에 삽입했다(이하, CSPG5/pcDNA 3.1). 또한, DNA 시퀀서를 사용한 시퀀싱에 의해 인간 CSPG5 유전자를 코드하는 cDNA 서열인 것을 확인했다. 서열번호 7로 나타내어지는 서열은 인간 CSPG5 유전자의 염기서열을, 서열번호 8로 나타내어지는 서열은 인간 CSPG5 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.

또한, 서열번호 7을 기초로, KpnI 및 EcoRI 제한효소 절단 서열을 포함하는 2종류의 프라이머(서열번호 29 및 30에 기재)를 각 0.4μM, 0.2mM dNTP, 1.25U의 PrimeSTAR HS 폴리메라아제(타카라슈조사제)로 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 더해 전량을 50μL로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD사제)를 이용하여 98℃-10초, 68℃-2.5분의 사이클을 30회 반복함으로써 행하였다. 또한, 상기 2종류의 프라이머는 서열번호 7 중 CSPG5 단백질의 세포외 영역의 아미노산 서열을 코드하는 영역을 증폭하는 것이었다. PCR 후, 증폭된 DNA를 1% 아가로스 겔로 전기영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사제)를 이용하여 약 1.3kbp의 DNA 단편을 정제했다. 상기 PCR 반응에 의해 얻어진 증폭산물은 마우스 IgG2a Fc 단백질을 코드하는 cDNA가 삽입된 pcDNA 3.1에 연결하고, 인간 CSPG5 세포외 영역/마우스 IgG2a Fc 융합단백질(이하, hCSPG5ECD-mIgG2aFc)을 코드하는 발현 벡터로 했다(이하, pcDNA-hCSPG5ECD-IgG2aFc). 또한, DNA 시퀀서를 사용한 시퀀싱에 의해 hCSPG5ECD-mIgG2aFc를 코드하는 cDNA 서열인 것을 확인했다. 서열번호 32로 나타내어지는 서열은 hCSPG5ECD-mIgG2aFc를 코드하는 염기서열을, 서열번호 33으로 나타내어지는 서열은 hCSPG5ECD-mIgG2aFc의 아미노산 서열을 나타낸다.

(2) hCSPG5ECD-mIgG2aFc의 제작

CSPG5 단백질에 대한 항체를 제작하기 위한 면역항원으로서 hCSPG5ECD-mIgG2aFc를 제작했다.

발현 벡터 pcDNA-hCSPG5ECD-mIgG2aFc를 인간 태아 신장세포주 HEK293 세포에 리포펙션법에 의해 도입하고, 도입 7일 후의 배양 상청으로부터 hCSPG5ECD-mIgG2aFc의 정제를 실시했다. 배양 상청을 Hi Trap ProteinG HP(GEhealth kea bioscience사) 컬럼에 어플라이하고, 결합 버퍼(20mM 인산 나트륨(pH7.0)으로 세정 후, 용출 버퍼(0.1M 글리신-HCl(pH2.7))로 용출했다. 용출액은 중화 버퍼(1M Tris-HCl(pH9.0))를 첨가한 튜브에 용출함으로써 즉시 중화했다. 이어서, 상기 방법에 의해 얻어진 상기 용출액을, 한외여과 NANOSEP 10K OMEGA(PALL사제)를 이용하여 생리용 인산 완충액(닛스이 세이야쿠사제) 치환한 후, HT 터프린 아크로디스크(HT Tuffryn Acrodisc) 0.22㎛(PALL사제)로 무균 여과를 행하고, 이것을 이하의 실험에 사용했다.

<실시예 3: CSPG5의 세포외 영역에 결합하는 다중클론 항체의 제작>

(1) CSPG5에 대한 다중클론 항체의 제작

CSPG5의 세포외 영역에 결합하는 항체를 얻기 위해서, 상기에서 제작한 hCSPG5ECD-mIgG2aFc의 0.1mg을 항원으로 해서, 등용량의 완전프로인트항원보강제(CFA) 용액과 혼합하고, 이것을 2주간마다 4회, 마우스의 피하에 투여를 행하였다. 그 후 혈액을 채취하고, 다중클론 항체를 포함하는 항혈청을 얻었다. 또한, 이 항혈청을 단백질 G담체(GE 헬스케어 바이오사이언스사제)를 이용하여 정제하고, hCSPG5ECD-mIgG2aFc에 대한 다중클론 항체를 얻었다. 또한, 항원을 투여하지 않는 마우스의 혈청을 상기와 마찬가지로 해서 단백질 G담체를 이용하여 정제한 것을 컨트롤 항체로 했다.

(2) 전체 길이 인간 CSPG5 정상 발현 세포의 수립

상기에서 제작한 CSPG5/pcDNA 3.1을 CHO-K1세포(ATCC사)에 리포펙션법에 의해 도입하고, 500㎍/mL의 G418(나카라이사)에 의한 선발에 의해 전체 길이 인간 CSPG5를 정상적으로 발현하는 CHO세포주를 수립했다(CHO-CSPG5). 또한, CSPG5를 코드하는 cDNA가 삽입되어 있지 않은 발현 벡터(이하, emp/pcDNA 3.1)를 상기와 마찬가지로 도입해서 선발한 세포를 컨트롤 세포로 했다(이하, CHO-emp).

마찬가지로, 마우스 백혈병 세포주 EL4(ATCC사)에 CSPG5/pcDNA 3.1을 리포펙션법에 의해 도입하고, 500㎍/mL의 G418(나카라이사)에 의한 선발에 의해 전체 길이 인간 CSPG5 유전자를 정상적으로 발현하는 EL4세포주를 수립했다(EL4-CSPG5). 또한, CSPG5 유전자를 코드하는 cDNA가 삽입되어 있지 않은 발현 벡터(이하, emp/pcDNA 3.1)를 상기와 마찬가지로 도입해서 선발한 세포를 컨트롤 세포로 했다(이하, EL4-emp).

(3) 세포 표면 상에서의 항원 단백질의 발현 해석

이어서 (2)에서 수립한 세포 표면 상에 발현되는 CSPG5 단백질 특이적으로 (1)에서 제작한 다중클론 항체가 반응하는지의 여부를 조사했다. CHO-CSPG5 세포 및 CHO-emp 세포 각각 10⁶개 세포를 1.5mL의 마이크로 원심튜브에서 원심분리했다. 이것에 상기 (1)에서 조제한 CSPG5 단백질에 대한 다중클론 항체 2㎍(5μL)을 첨가하고, 또한 95μL의 0.1% 소태아혈청을 포함하는 PBS로 현탁 후, 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정한 후, 5μL의 FITC 표식 염소 항마우스 IgG 항체(Santacruz사제) 및 95μL의 0.1% 소태아혈청(FBS)을 포함하는 PBS로 현탁하고, 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정 후, FACS 캘리버(BD사제)로 형광강도를 측정했다. 한편, 상기와 같은 조작을, CSPG5 단백질 대한 다중클론 항체 대신에 상기 (1)에서 조제한 컨트롤 항체를 이용하여 행하고, 컨트롤로 했다. 그 결과, 항인간 CSPG5 항체를 첨가한 CHO-CSPG5 세포는 컨트롤에 비교하여 형광강도가 221%의 증강을 나타냈다. 한편, 같은 조작을 CHO-emp 세포에 대하여 실시했다. 그 결과, 항인간 CSPG5 항체를 첨가된 CHO-emp 세포는 컨트롤과 같은 형광강도를 나타냈다. 이것으로부터, 항인간 CSPG5 항체는 세포막 표면 상에 발현하는 CSPG5 단백질 특이적으로 결합하는 것이 명확하게 되었다.

또한, 상기 형광강도의 증강율은 각 세포에 있어서의 평균 형광강도(MFI값)의 증가율로 나타내어지고, 이하의 계산식에 의해 산출했다.

평균 형광강도의 증가율(형광강도의 증강율)(%)=((항인간 CSPG5 항체를 반응시킨 세포의 MFI값)-(컨트롤 MFI값))÷(컨트롤 MFI값)×100

이어서 CSPG5 유전자의 발현이 많이 확인된 백혈병 세포주 2종(K562, THP-1) 및 악성 림프종 세포주 2종(L-1236, P3HR-1)에 대해서, 그 세포 표면 상에 CSPG5 단백질이 발현되고 있는지의 여부를 조사했다. 상기에서 유전자 발현이 확인된 각 인간 세포주 각각 10⁶개 세포를 1.5mL의 마이크로 원심튜브에서 원심분리했다. 이것에 상기 (1)에서 조제한 CSPG5 단백질에 대한 다중클론 항체 2㎍(5μL)을 첨가하고, 또한 95μL의 0.1% 소태아혈청을 포함하는 PBS로 현탁 후, 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정한 후, 5μL의 FITC 표식 염소 항마우스 IgG 항체(Santacruz사제) 및 95μL의 0.1% 소태아혈청(FBS)을 포함하는 PBS로 현탁하고, 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정 후, FACS 캘리버(BD사제)로 형광강도를 측정했다. 한편, 상기와 같은 조작을, CSPG5 단백질에 대한 다중클론 항체 대신에 상기 (1)에서 조제한 컨트롤 항체를 이용하여 행하고, 컨트롤로 했다. 그 결과, 항인간 CSPG5 항체를 첨가된 세포는 컨트롤에 비하여 어느 것이나 형광강도가 30% 이상 강했다. 구체적으로는, K562가 184%, THP-1이 51%, L-1236이 115%, P3HR-1이 82%의 형광강도의 증강을 나타냈다. 이것으로부터, 상기 인간 암세포주의 세포막 표면 상에 CSPG5 단백질이 발현하고 있는 것이 확인되었다.

<실시예 4: CSPG5 단백질에 대한 다중클론 항체의 암세포에 대한 항종양 효과(ADCC 활성)>

이어서 CSPG5 단백질에 대한 다중클론 항체가 CSPG5 단백질을 발현하는 종양세포를 상해할 수 있는지의 여부를 검토했다. 실시예 3에서 조제한 인간 CSPG5에 대한 다중클론 항체를 이용하여 평가를 행했다. CSPG5 단백질의 발현이 확인되어 있는 인간 백혈병 세포주 K562 및 악성 림프종 세포주 L-1236 각각 10⁶개를 50mL 용량의 원심튜브에 모으고, 100μCi의 크로뮴 51을 첨가해 37℃에서 2시간 인큐베이트했다. 그 후 10% 소태아혈청을 포함하는 RPMI1640 배지로 3회 세정하고, 96구멍 V바닥 플레이트 1구멍당 10³개씩 첨가했다. 이것에, 상기 인간 CSPG5 단백질에 대한 다중클론 항체를 각각 1㎍씩 첨가하고, 또한 토끼의 말초혈로부터 분리한 림프구를 각각 2×10⁵개씩 첨가하고여 37℃, 5% CO₂의 조건 하에서 4시간 배양했다. 배양 후, 상해를 입은 종양세포로부터 방출되는 배양 상청 중의 크로뮴(Cr) 51의 양을 측정하고, 인간 CSPG5 단백질에 대한 다중클론 항체에 의한 각 암세포에 대한 ADCC 활성을 산출했다. 그 결과, K562 및 L-1236 세포 각각에 대하여, 각각 23.2% 및 18.7%의 ADCC 활성이 확인되었다(도 4 참조). 한편, 항원이 면역되어 있지 않은 마우스의 말초혈로부터 조제한 컨트롤 항체(실시예 3)를 사용해서 같은 조작을 행했을 경우, 및 항체를 첨가하지 않았을 경우에는, 활성은 거의 확인되지 않았다(도 4 참조). 따라서, CSPG5 단백질에 대한 항체를 사용한 ADCC 활성에 의해 CSPG5 단백질을 발현하는 종양세포를 상해할 수 있는 것이 밝혀졌다.

또한, 세포상해활성은, 상기와 같이 본 발명에서 사용되는 CSPG5 단백질에 대한 항체, 토끼 림프구 및 크로뮴 51을 도입시킨 10³개의 각 세포주를 혼합해서 4시간 배양하고, 배양 후 배지에 방출된 크로뮴 51의 양을 측정하고, 이하 계산식 *에 의해 산출한 각 백혈병 세포주에 대한 세포상해활성을 나타낸 결과이다.

*식: 세포상해활성(%)=CSPG5 단백질에 대한 항체 및 토끼 림프구를 첨가했을 때의 K562 및 L-1236로부터의 크로뮴 51 유리량÷1N 염산을 첨가한 표적 세포로부터의 크로뮴 51 유리량×100

<실시예 5: CSPG5 단백질에 대한 단일클론 항체의 제작>

실시예 2에서 조제한 서열번호 33으로 나타내어지는 항원 단백질(hCSPG5ECD-mIgG2aFc) 100㎍을 등량의 MPL+TDM 아쥬반트(시그마사제)와 혼합하고, 이것을 마우스 1마리당의 항원 용액으로 했다. 항원 용액을 6주령의 Balb/c 마우스(니혼 SLC사제)의 복강 내에 투여 후, 1주간마다 4회 투여를 더 행해 면역을 완료했다. 최후의 면역으로부터 3일 후에 적출한 각각의 비장을 멸균한 2매의 슬라이드글라스에 끼워서 갈아서 으깨고, PBS(-)(닛스이사제)를 이용하여 세정해 1500rpm으로 10분간 원심해서 상청을 제거하는 조작을 3회 반복하여 비장세포를 얻었다. 얻어진 비장세포와 마우스 골수종세포 SP2/0(ATCC로부터 구입)를 5:1의 비율로 혼화하고, 거기에 37℃로 가온한 10% FBS를 포함하는 RPMI1640 배지 200μL와 PEG1500(베링거사제) 800μL를 혼화해서 조제한 PEG 용액을 첨가해서 5분간 정치해서 세포융합을 행하였다. 1700rpm으로 5분간 원심하고, 상청을 제거 후, Gibco사제의 HAT 용액을 2% 당량 첨가한 15% FBS를 포함하는 RPMI1640 배지(HAT 선택 배양지) 150mL로 세포를 현탁하고, 96구멍 플레이트(눈크사제)의 1웰당 100μL씩, 플레이트 15매에 파종했다. 7일간, 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양함으로써 비장세포와 골수종세포가 융합한 하이브리도마를 얻었다.

제작한 하이브리도마가 산생하는 항체의 hCSPG5ECD-mIgG2aFc에 대한 결합 친화성을 지표로 하이브리도마를 선발했다. 실시예 2에서 조제한 hCSPG5ECD-mIgG2aFc 단백질 용액 1㎍/mL을 96구멍 플레이트 1웰당에 100μL 첨가하고, 4℃에서 18시간 정치했다. 각 웰을 PBS-T로 3회 세정 후, 0.5% Bovine Serum Albumin(BSA) 용액(시그마사제)을 1웰당 400μL 첨가해서 실온에서 3시간 정치했다. 용액을 제거하고, 1웰당 400μL의 PBS-T로 웰을 3회 세정 후, 상기에서 얻어진 하이브리도마의 각 배양 상청을 1웰당 100μL 첨가하고, 실온에서 2시간 정치했다. PBS-T로 각 웰을 3회 세정한 후, PBS로 5000배로 희석한 HRP 표식 항마우스 IgG(H+L) 항체(인비트로젠사제)를 1웰당 100μL 첨가해서 실온에서 1시간 정치했다. PBS-T로 웰을 3회 세정한 후, TMB 기질 용액(Thermo사제)을 1웰당 100μL 첨가해서 15∼30분간 정치해서 발색 반응을 행하였다. 발색 후, 1규정 황산을 1웰당 100μL 첨가해서 반응을 정지시켜 흡광도계를 이용하여 450㎚와 595㎚의 흡광도값을 측정했다. 그 결과, 흡광도값이 높았던 항체를 산생하는 하이브리도마를 복수개 선발했다.

선발한 하이브리도마를 96구멍 플레이트 1웰당에 0.5개가 되도록 플레이트에 첨가해 배양했다. 1주간 후, 웰 중에 단일의 콜로니를 형성하고 있는 하이브리도마가 관찰되었다. 그들 웰의 세포를 더욱 배양하고, 클로닝된 하이브리도마가 산생하는 항체의 CSPG5 단백질에 대한 결합 친화성을 지표로 하이브리도마를 선발했다. 실시예 2에서 조제한 hCSPG5ECD-mIgG2aFc 단백질 용액 1㎍/mL를 96구멍 플레이트 1웰당에 100μL 첨가하고, 4℃에서 18시간 정치했다. 각 웰을 PBS-T로 3회 세정 후, 0.5% BSA 용액을 1웰당 400μL 첨가해서 실온에서 3시간 정치했다. 용액을 제거하고, 1웰당 400μL의 PBS-T로 웰을 3회 세정 후, 상기에서 얻어진 하이브리도마의 각 배양 상청을 1웰당 100μL 첨가하고, 실온에서 2시간 정치했다. PBS-T로 각 웰을 3회 세정 후, PBS로 5000배로 희석한 HRP 표식 항마우스 IgG(H+L) 항체(Thermo Fisher Scientific사제)를 1웰당 100μL 첨가해서 실온에서 1시간 정치했다. PBS-T로 웰을 3회 세정한 후, TMB 기질 용액(Thermo사제)을 1웰당 100μL 첨가해서 15∼30분간 정치해서 발색반응을 행하였다. 발색 후, 1규정 황산을 1웰당 100μL 첨가해서 반응을 정지시켜 흡광도계를 이용하여 450㎚와 595㎚의 흡광도값을 측정했다. 그 결과, CSPG5 단백질에 반응성을 나타내는 단일클론 항체를 산생하는 312개의 하이브리도마주를 얻었다.

이어서 그것들 단일클론 항체 중, CSPG5 단백질을 발현하는 세포의 세포 표면에 반응성을 나타내는 것을 선발했다. 구체적으로는, 실시예 2에서 수립한 10⁶개의 CSPG5 단백질을 발현하는 세포(CHO-CSPG5)를 1.5mL 용량의 마이크로 원심튜브에서 원심분리하고, 이것에 상기 각 하이브리도마의 배양 상청 100μL를 첨가하여 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정한 후, 0.1% FBS를 포함하는 PBS로 500배 희석한 FITC 표식 염소 항마우스 IgG 항체(Thermo Fisher Scientific사제)를 첨가하고, 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정 후, FACS 캘리버(BD사제)로 형광강도를 측정했다. 한편, 상기와 같은 조작을 CSPG5 단백질을 발현하고 있지 않은 CHO 세포(CHO-emp)를 이용하여 행하고, 컨트롤로 했다. 그 결과, 컨트롤에 비해서 형광강도가 강한, 즉 CSPG5 단백질을 발현하는 세포의 세포 표면에 반응하는 단일클론 항체 18개(#1∼#18)를 선발했다.

<실시예 6: 선발한 항체의 특징>

(1) CSPG5 단백질에 대한 단일클론 항체의 암세포에 대한 항종양 효과(ADCC 활성)

상기에서 선발한 CSPG5 단백질에 대한 단일클론 항체 #1의 암세포에 대한 세포상해활성(ADCC 활성)을 평가했다. 단일클론 항체를 산생하는 각 하이브리도마를 하이브리도마 SFM(Thermo Fisher Scientific사제) 배지를 이용하여 배양하고, 얻어진 상청을 Hitrap ProteinA SepharoseFF(GE 헬스케어사제)를 이용하여 정제하고, PBS(-)로 치환해서 0.22㎛의 필터(미리포아사제)로 여과한 것을 활성 측정용의 항체로서 사용했다. 인간 백혈병 세포주 K562 및 악성 림프종 세포주 L-1236 각각 10⁶개의 세포를 50mL 용량의 원심튜브에 모으고, 100μCi의 크로뮴 51을 첨가해 37℃에서 2시간 인큐베이트했다. 그 후 10% FBS를 포함하는 RPMI1640 배지로 3회 세정하고, 96구멍 V바닥 플레이트 1구멍당 10³개씩 첨가해서 표적세포로 했다. 이것에, 상기 정제 항체를 각각 1㎍ 첨가하고, 또한 마우스 비장으로부터 분리한 마우스 림프구를 2×10⁵개 첨가하여 37℃, 5% CO₂의 조건 하에서 4시간 배양했다. 배양 후, 상해를 입은 종양세포로부터 방출되는 배양 상청 중의 크로뮴 51의 양을 측정하고, 항CSPG5 단일클론 항체에 의한 암세포에 대한 ADCC 활성을 산출했다.

(2) CSPG5 단백질에 대한 단일클론 항체의 암세포에 대한 항종양 효과(CDC 활성)

상기에서 선발한 #1의 CSPG5 단백질에 대한 단일클론 항체의 암세포에 대한 세포상해활성(CDC 활성)을 평가했다. 토끼로부터 채혈한 혈액을 에펜도르프 튜브에 넣어, 실온에서 60분간 정치한 후 3000rpm으로 5분간 원심분리함으로써 CDC 활성 측정용의 혈청을 조제했다. 인간 백혈병 세포주 K562 및 악성 림프종 세포주 L-1236의 각각을 50mL 용량의 원심튜브에 10⁵개 모으고, 100μCi의 크로뮴 51을 첨가해 37℃에서 2시간 인큐베이트한 후, 10% FBS를 포함하는 RPMI 배지에서 3회 세정했다. 그 후 상기에서 조제한 토끼 혈청을 50% 포함하는 RPMI 배지에서 현탁하고, 96구멍 V바닥 플레이트 1구멍당 10³개씩 첨가했다. 이것에 상기 (1)에서 사용한 #1의 단일클론 항체를 각각 1㎍씩 첨가하고, 37℃, 5% CO₂의 조건 하에서 4시간 배양했다. 배양 후, 상해를 입은 종양세포로부터 방출되는 배양 상청 중의 크로뮴 51의 양을 측정하고, 하이브리도마 상청 중의 항CSPG5 단일클론 항체에 의한 K562 및 L-1236에 대한 CDC 활성을 산출했다. 그 결과, #1의 단일클론 항체는 26%의 CDC 활성을 나타냈다. 한편, 실시예 5에서 제작한 CSPG5 단백질 자체에는 반응하지만, 암세포의 세포 표면에 반응하지 않는 단일클론 항체를 이용하여 같은 조작을 행하였을 경우, 세포상해활성은 확인되지 않았다. 따라서, CSPG5 단백질에 대한 단일클론 항체(#1)는 CDC 활성에 의해서도 CSPG5 단백질을 발현하는 종양세포를 상해할 수 있는 것이 밝혀졌다.

<실시예 7: 마우스 생체 내에 있어서의 항CSPG5 단일클론 항체의 항종양 효과>

이어서, 취득한 #1의 CSPG5 단백질에 대한 단일클론 항체의 담암 마우스 생체 내에 있어서의 항종양 효과를 평가했다. 사용한 항체는 상기와 마찬가지로 각 하이브리도마의 배양 상청을 컬럼 정제한 것을 사용했다.

실시예 3-(2)에서 수립한 CSPG5 단백질을 발현하는 마우스 유래의 백혈병 세포주 EL4-CSPG5를 이식한 담암 마우스를 이용하여 CSPG5 단백질에 대한 단일클론 항체(#1)의 항종양 효과를 검토했다. 30마리의 C57BL/6 마우스(니혼 SLC사제)의 등부 피하에, 1마리당 10⁶개의 EL4-CSPG5를 이식하고, 종양이 직경 7㎜정도의 크기가 될 때까지 성장시켰다. 그 중, 10마리의 담암 마우스에 대하여 #1의 CSPG5 단백질에 대한 단일클론 항체를 1마리당 100㎍(100μL)씩 복강내 투여했다. 또한, 별도의 10마리에는 실시예 5에서 제작한 CSPG5 단백질 자체에는 반응하지만, 암세포의 세포 표면에 반응하지 않는 단일클론 항체를 1마리당 100㎍(100μL)씩 복강내 투여했다. 그 후에 2일 간격으로 1회, 합계 3회 동량의 각 항체를 각 담암 마우스의 복강에 투여하고, 매일 종양의 크기를 계측하여 항종양 효과를 관찰했다. 한편, 나머지 10마리의 담암 마우스에 대하여 항체 대신에 PBS(-)를 투여하고, 이것을 컨트롤군으로 했다. 항종양 효과의 관찰의 결과, #1의 CSPG5 단백질에 대한 단일클론 항체를 투여한 검토군은, 종양이 항체투여 개시시의 종양 체적을 100%라고 했을 경우에, 10일째에는 90% 정도로 축소하고, 20일째에는 70% 정도, 30일째에는 60몇%로 종양이 축소했다. 한편, 컨트롤군에서는 10일째, 20일째, 30일째에는 각각, 약260%, 350%, 550%로까지 종양이 증대했다. 또한, CSPG5 단백질 자체에는 반응하지만, 암세포의 세포 표면에 반응하지 않는 단일클론 항체를 투여한 군에서는 항종양 효과는 얻을 수 없고, 컨트롤군과 마찬가지로 종양이 증대했다. 이 결과로부터, 취득한 #1의 CSPG5 단백질에 대한 단일클론 항체는 CSPG5 단백질을 발현하는 백혈병암세포에 대하여, 생체 내에서 강한 항종양 효과를 발휘하는 것이 나타내어졌다. 또한, 종양의 크기는 장경×단경×단경×0.5의 계산식을 이용하여 체적을 산출했다.

(산업상의 이용 가능성)

본 발명의 항체는 암의 치료 및/또는 예방을 위해서 유용하다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 그대로 인용에 의해 본 명세서에 도입되는 것으로 한다.

SEQUENCE LISTING <110> TORAY INDUSTRIES, INC. <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATMENT AND/OR PREVENTION OF CANCER <130> PH-6535-PCT <150> JP 2015-093640 <151> 2015-04-30 <160> 33 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 2270 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> CDS <222> (1)..(1434) <223> <400> 1 ggg gag gag gag acc tcg tgt act gca cct ggc ggc ctg ccg gcc gtg 48 Gly Glu Glu Glu Thr Ser Cys Thr Ala Pro Gly Gly Leu Pro Ala Val 1 5 10 15 gtg ggg cct ggg gtc ggg cca gag gag gcg ctg gag gcg tcc gcg gcc 96 Val Gly Pro Gly Val Gly Pro Glu Glu Ala Leu Glu Ala Ser Ala Ala 20 25 30 gtg acc ggc aca gcc tgg ctg gag gct gac agc ccg ggc ctg ggc gga 144 Val Thr Gly Thr Ala Trp Leu Glu Ala Asp Ser Pro Gly Leu Gly Gly 35 40 45 gcg acc gta gag gct ggc agc ggc gac acc cag gcc ctt ccg gcc acg 192 Ala Thr Val Glu Ala Gly Ser Gly Asp Thr Gln Ala Leu Pro Ala Thr 50 55 60 ctc ccg act ccg gag gag gcc ctc cga cgt gca tcg gtg gcc ccc gcc 240 Leu Pro Thr Pro Glu Glu Ala Leu Arg Arg Ala Ser Val Ala Pro Ala 65 70 75 80 acc ccc gag act aca gag gcc agc gga cca ccc tcc ccc act cct ggc 288 Thr Pro Glu Thr Thr Glu Ala Ser Gly Pro Pro Ser Pro Thr Pro Gly 85 90 95 gac cag cta cgc cca ggc ccc gaa ctc ccc aag gag agc ccc ttg gag 336 Asp Gln Leu Arg Pro Gly Pro Glu Leu Pro Lys Glu Ser Pro Leu Glu 100 105 110 gtt tgg ctg aac ctg gga ggc agc aca cat gac ccg cat ggg cca gag 384 Val Trp Leu Asn Leu Gly Gly Ser Thr His Asp Pro His Gly Pro Glu 115 120 125 ccc acg ttc ccc ttt cag ggc aca ctg gag ccc cgg ccg gcg tca gat 432 Pro Thr Phe Pro Phe Gln Gly Thr Leu Glu Pro Arg Pro Ala Ser Asp 130 135 140 atc att gac atc gac tac ttc gaa gga ttg gat ggt gag ggc cgt ggc 480 Ile Ile Asp Ile Asp Tyr Phe Glu Gly Leu Asp Gly Glu Gly Arg Gly 145 150 155 160 gcc gac ttg ggg agc ttc ccg gtg tcg cca gga acc tca gag cac cac 528 Ala Asp Leu Gly Ser Phe Pro Val Ser Pro Gly Thr Ser Glu His His 165 170 175 ccc gat act ggg gga gag acc cct tcc tgg agc ctg ctt gac tta tac 576 Pro Asp Thr Gly Gly Glu Thr Pro Ser Trp Ser Leu Leu Asp Leu Tyr 180 185 190 gat gac ttc acc ccc ttt gat gaa tct gac ttc tac ccc act aca tcc 624 Asp Asp Phe Thr Pro Phe Asp Glu Ser Asp Phe Tyr Pro Thr Thr Ser 195 200 205 ttc tat gat gac ttg gag gaa gag gag gag gaa gag gat gac gac aag 672 Phe Tyr Asp Asp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Lys 210 215 220 gat gca gcg gaa ggt gga gac ctg gaa gat gaa agt gac ctt ctg gtg 720 Asp Ala Ala Glu Gly Gly Asp Leu Glu Asp Glu Ser Asp Leu Leu Val 225 230 235 240 ccc act gag aag cct ggg ctg agg cca ggg cct ggc cag ccc acc agt 768 Pro Thr Glu Lys Pro Gly Leu Arg Pro Gly Pro Gly Gln Pro Thr Ser 245 250 255 cgg tgg cat gct gtc ccc cca cag cat act ctg ggg ttg gtc cct ggc 816 Arg Trp His Ala Val Pro Pro Gln His Thr Leu Gly Leu Val Pro Gly 260 265 270 agc agc atc gcc ctc aga ccc cgt ccg gga gag ccg ggc agg gac ctg 864 Ser Ser Ile Ala Leu Arg Pro Arg Pro Gly Glu Pro Gly Arg Asp Leu 275 280 285 gcc ccg agc gag aac ggc act gag tgc cgc agc ggc ttt gtg cgg cat 912 Ala Pro Ser Glu Asn Gly Thr Glu Cys Arg Ser Gly Phe Val Arg His 290 295 300 aac ggc tcc tgc cga tcc gtg tgc gac ctc ttc cca agt tac tgt cac 960 Asn Gly Ser Cys Arg Ser Val Cys Asp Leu Phe Pro Ser Tyr Cys His 305 310 315 320 aac ggc ggc cag tgc tac ctg gtg gac aac ata ggg gcc ttc tgc agg 1008 Asn Gly Gly Gln Cys Tyr Leu Val Asp Asn Ile Gly Ala Phe Cys Arg 325 330 335 tgt aac aca cag gac tac atc tgg cac aag ggg atg cgc tgc gag tcc 1056 Cys Asn Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg Cys Glu Ser 340 345 350 atc atc acc gac ttc cag gtg atg tgc gtg gcc gtc ggc tca gcc gcc 1104 Ile Ile Thr Asp Phe Gln Val Met Cys Val Ala Val Gly Ser Ala Ala 355 360 365 ctc gtg ctg ctc ctg ctc ttc atg atg aca gtg ttc ttc gcc aag aag 1152 Leu Val Leu Leu Leu Leu Phe Met Met Thr Val Phe Phe Ala Lys Lys 370 375 380 ctg tat ctg ctc aag aca gag aat acc aag ctg cgt agg acc aac aaa 1200 Leu Tyr Leu Leu Lys Thr Glu Asn Thr Lys Leu Arg Arg Thr Asn Lys 385 390 395 400 ttc cgg acc ccg tct gag ctc cac aac gat aac ttc tcc ctt tcc acc 1248 Phe Arg Thr Pro Ser Glu Leu His Asn Asp Asn Phe Ser Leu Ser Thr 405 410 415 att gcc gaa ggc tct cac cca aac gac gat ccc agt gct tcc cac aaa 1296 Ile Ala Glu Gly Ser His Pro Asn Asp Asp Pro Ser Ala Ser His Lys 420 425 430 atc cag gag gtt ctc aag tcc tgc ctg aaa gag gag gag tca ttt aac 1344 Ile Gln Glu Val Leu Lys Ser Cys Leu Lys Glu Glu Glu Ser Phe Asn 435 440 445 atc cag aac tcc atg tcc ccc aaa ctg gag ggt ggc aaa ggt gac cag 1392 Ile Gln Asn Ser Met Ser Pro Lys Leu Glu Gly Gly Lys Gly Asp Gln 450 455 460 gct gac ttg gag gtg aac tgt ctt cag aac aac ctc acc taa 1434 Ala Asp Leu Glu Val Asn Cys Leu Gln Asn Asn Leu Thr 465 470 475 agcagagcaa gaagagaggg aatgggggag ggcggggggt ggcaggggaa gaaacatgac 1494 ctcctcttgt acagagtcta tttcttgtaa ccatttgtta aactctcttc tttttctggt 1554 ctcatggcat gccttgatgt attttgtaca ggagggagaa aacacaaaat aagcaaagaa 1614 cctgaacaga atcgcataca ccgggttgtt tcgtctgtgc tgtctgtata ttgcttctgc 1674 tgctgtgatt tctaaaccta tgctgttatt caactgactt tttttttgta ctttgaccca 1734 cctttttttg aaataagagt taaaaaacaa agttcttgaa ataaaacttt ttaaaaagcc 1794 attttccatc agtgtgtcca cttcctaccc attcttgtca gcttgagttg aattcttacg 1854 ttccctgaag atgtatattt atatgtgttt gaaatcctgg aagtgctctc tgtattagcc 1914 taggttgccg taactaaaca tcatagactg gatcacttaa gcaatagaaa tttatttttg 1974 aacagtaata gaggctggat ccccaagatc aaggtgccaa cagagttggt ttctggcagg 2034 gcctctctgc ctggcttgca aagagccatc ttcttgctat gtcctcacaa ggccttttgt 2094 ctgtgcacat ctcttcctct tctgataagg acaccagtcc tattggccta ggatccattt 2154 aacctcaatt acctcctcat aggccctact ccagatacag tcacacttag gggttatggc 2214 ttcaacatga cttttggggt gacataattc agtccacaag tctgtagcac ctgatt 2270 <210> 2 <211> 477 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 2 Gly Glu Glu Glu Thr Ser Cys Thr Ala Pro Gly Gly Leu Pro Ala Val 1 5 10 15 Val Gly Pro Gly Val Gly Pro Glu Glu Ala Leu Glu Ala Ser Ala Ala 20 25 30 Val Thr Gly Thr Ala Trp Leu Glu Ala Asp Ser Pro Gly Leu Gly Gly 35 40 45 Ala Thr Val Glu Ala Gly Ser Gly Asp Thr Gln Ala Leu Pro Ala Thr 50 55 60 Leu Pro Thr Pro Glu Glu Ala Leu Arg Arg Ala Ser Val Ala Pro Ala 65 70 75 80 Thr Pro Glu Thr Thr Glu Ala Ser Gly Pro Pro Ser Pro Thr Pro Gly 85 90 95 Asp Gln Leu Arg Pro Gly Pro Glu Leu Pro Lys Glu Ser Pro Leu Glu 100 105 110 Val Trp Leu Asn Leu Gly Gly Ser Thr His Asp Pro His Gly Pro Glu 115 120 125 Pro Thr Phe Pro Phe Gln Gly Thr Leu Glu Pro Arg Pro Ala Ser Asp 130 135 140 Ile Ile Asp Ile Asp Tyr Phe Glu Gly Leu Asp Gly Glu Gly Arg Gly 145 150 155 160 Ala Asp Leu Gly Ser Phe Pro Val Ser Pro Gly Thr Ser Glu His His 165 170 175 Pro Asp Thr Gly Gly Glu Thr Pro Ser Trp Ser Leu Leu Asp Leu Tyr 180 185 190 Asp Asp Phe Thr Pro Phe Asp Glu Ser Asp Phe Tyr Pro Thr Thr Ser 195 200 205 Phe Tyr Asp Asp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Lys 210 215 220 Asp Ala Ala Glu Gly Gly Asp Leu Glu Asp Glu Ser Asp Leu Leu Val 225 230 235 240 Pro Thr Glu Lys Pro Gly Leu Arg Pro Gly Pro Gly Gln Pro Thr Ser 245 250 255 Arg Trp His Ala Val Pro Pro Gln His Thr Leu Gly Leu Val Pro Gly 260 265 270 Ser Ser Ile Ala Leu Arg Pro Arg Pro Gly Glu Pro Gly Arg Asp Leu 275 280 285 Ala Pro Ser Glu Asn Gly Thr Glu Cys Arg Ser Gly Phe Val Arg His 290 295 300 Asn Gly Ser Cys Arg Ser Val Cys Asp Leu Phe Pro Ser Tyr Cys His 305 310 315 320 Asn Gly Gly Gln Cys Tyr Leu Val Asp Asn Ile Gly Ala Phe Cys Arg 325 330 335 Cys Asn Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg Cys Glu Ser 340 345 350 Ile Ile Thr Asp Phe Gln Val Met Cys Val Ala Val Gly Ser Ala Ala 355 360 365 Leu Val Leu Leu Leu Leu Phe Met Met Thr Val Phe Phe Ala Lys Lys 370 375 380 Leu Tyr Leu Leu Lys Thr Glu Asn Thr Lys Leu Arg Arg Thr Asn Lys 385 390 395 400 Phe Arg Thr Pro Ser Glu Leu His Asn Asp Asn Phe Ser Leu Ser Thr 405 410 415 Ile Ala Glu Gly Ser His Pro Asn Asp Asp Pro Ser Ala Ser His Lys 420 425 430 Ile Gln Glu Val Leu Lys Ser Cys Leu Lys Glu Glu Glu Ser Phe Asn 435 440 445 Ile Gln Asn Ser Met Ser Pro Lys Leu Glu Gly Gly Lys Gly Asp Gln 450 455 460 Ala Asp Leu Glu Val Asn Cys Leu Gln Asn Asn Leu Thr 465 470 475 <210> 3 <211> 2175 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> 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tcg gct gcg gtg acc ggc 467 Leu Ala Gly Pro Glu Glu Val Leu Gln Glu Ser Ala Ala Val Thr Gly 85 90 95 acc gcc tgg ctg gaa gct gac agc cca ggc ctg gga gga gtg acc gca 515 Thr Ala Trp Leu Glu Ala Asp Ser Pro Gly Leu Gly Gly Val Thr Ala 100 105 110 gag gcg ggc agc ggc gat gcc cag gcc ctt cca gct acg ctc cag gct 563 Glu Ala Gly Ser Gly Asp Ala Gln Ala Leu Pro Ala Thr Leu Gln Ala 115 120 125 ccc cac gag gtc ctc ggg cag tca atc atg ccc cct gcc att cct gag 611 Pro His Glu Val Leu Gly Gln Ser Ile Met Pro Pro Ala Ile Pro Glu 130 135 140 145 gct aca gag gcc agc ggg cca ccc tcc ccc acc ccc ggc gac aag ctg 659 Ala Thr Glu Ala Ser Gly Pro Pro Ser Pro Thr Pro Gly Asp Lys Leu 150 155 160 agc cca gct tct gaa ctc ccc aag gag agc ccc ttg gag gtt tgg ctg 707 Ser Pro Ala Ser Glu Leu Pro Lys Glu Ser Pro Leu Glu Val Trp Leu 165 170 175 aac ctg ggg ggc agc aca ccc gac cct caa ggg cca gag ctg act tac 755 Asn Leu Gly Gly Ser Thr Pro Asp Pro Gln Gly Pro Glu Leu Thr Tyr 180 185 190 cca ttt cag ggc acc ctg gag ccc 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ctg ggg ccc ggg aca ggc cag ccc acc agt cgg tgg cat 1139 Lys Pro Gly Leu Gly Pro Gly Thr Gly Gln Pro Thr Ser Arg Trp His 310 315 320 gct gtc cct cca cag cac act ctg ggg tcg gtc ccc ggc agc agc atc 1187 Ala Val Pro Pro Gln His Thr Leu Gly Ser Val Pro Gly Ser Ser Ile 325 330 335 gcc ctc agg ccc cgc cca gga gag cca ggc agg gac ttg gcc tcc agt 1235 Ala Leu Arg Pro Arg Pro Gly Glu Pro Gly Arg Asp Leu Ala Ser Ser 340 345 350 gaa aat ggc act gag tgc cgc agt ggc ttt gtg cgg cat aac ggc tcc 1283 Glu Asn Gly Thr Glu Cys Arg Ser Gly Phe Val Arg His Asn Gly Ser 355 360 365 tgc cgg tca gtg tgc gac ctc ttc cca agt tac tgt cac aat ggc ggc 1331 Cys Arg Ser Val Cys Asp Leu Phe Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly Gly 370 375 380 385 cag tgc tac ctg gtg gag aac ata ggg gcc ttc tgc agg tgc aac acg 1379 Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn Thr 390 395 400 cag gac tac atc tgg cac aag ggg atg cgc tgc gag tcc atc atc acc 1427 Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg Cys Glu Ser Ile Ile Thr 405 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Gln Ala Asp Leu 515 520 525 gat gtg aac tgt ctt cag aat aat tta acc taa agcagagcaa gaagagagga 1816 Asp Val Asn Cys Leu Gln Asn Asn Leu Thr 530 535 agcgggggta gtgggtgggg ggtaggggaa gaaacattat ctcctcttgt acagagtcta 1876 tttcttgtaa ccatttgtta aactcttttc tttttctgat ctcatggcat gcttttatgt 1936 attttgtaca ggaggcaaaa aaatacttaa aataagcaaa gaaactgaac agaattgcat 1996 acattgggtt gttttttctg tgctgtctgt acattgcttc tgctgctgtg atttctaaac 2056 ctgtgctgtt attcaactga cttttttttg tactttgacc cacgtttttt tgaaatacca 2116 gtaaaaaaca aagttcttga aataaaactt tttaaaaagt taaaaaaaaa aaaaaaaaa 2175 <210> 4 <211> 539 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Gly Arg Ala Gly Gly Gly Gly Pro Gly Arg Gly Pro Pro Pro Leu 1 5 10 15 Leu Leu Phe Leu Gly Ala Ala Leu Val Leu Ala Ser Gly Ala Val Pro 20 25 30 Ala Arg Glu Ala Gly Ser Ala Val Glu Ala Glu Glu Leu Val Lys Gly 35 40 45 Ser Pro Ala Trp Glu Pro Pro Ala Asn Asp Thr Arg Glu Glu Ala Gly 50 55 60 Pro Pro Ala Ala Gly Glu Asp Glu Ala Ser Trp Thr Ala Pro Gly Gly 65 70 75 80 Glu Leu Ala Gly Pro Glu Glu Val Leu Gln Glu Ser Ala Ala Val Thr 85 90 95 Gly Thr Ala Trp Leu Glu Ala Asp Ser Pro Gly Leu Gly Gly Val Thr 100 105 110 Ala Glu Ala Gly Ser Gly Asp Ala Gln Ala Leu Pro Ala Thr Leu Gln 115 120 125 Ala Pro His Glu Val Leu Gly Gln Ser Ile Met Pro Pro Ala Ile Pro 130 135 140 Glu Ala Thr Glu Ala Ser Gly Pro Pro Ser Pro Thr Pro Gly Asp Lys 145 150 155 160 Leu Ser Pro Ala Ser Glu Leu Pro Lys Glu Ser Pro Leu Glu Val Trp 165 170 175 Leu Asn Leu Gly Gly Ser Thr Pro Asp Pro Gln Gly Pro Glu Leu Thr 180 185 190 Tyr Pro Phe Gln Gly Thr Leu Glu Pro Gln Pro Ala Ser Asp Ile Ile 195 200 205 Asp Ile Asp Tyr Phe Glu Gly Leu Asp Gly Glu Gly Arg Gly Ala Asp 210 215 220 Leu Gly Ser Phe Pro Gly Ser Pro Gly Thr Ser Glu Asn His Pro Asp 225 230 235 240 Thr Glu Gly Glu Thr Pro Ser Trp Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Asp Asp 245 250 255 Phe Thr Pro Phe Asp Glu Ser Asp Phe Tyr Pro Thr Thr Ser Phe Tyr 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Lys Asp Ala 275 280 285 Val Gly Gly Gly Asp Leu Glu Asp Glu Asn Glu Leu Leu Val Pro Thr 290 295 300 Gly Lys Pro Gly Leu Gly Pro Gly Thr Gly Gln Pro Thr Ser Arg Trp 305 310 315 320 His Ala Val Pro Pro Gln His Thr Leu Gly Ser Val Pro Gly Ser Ser 325 330 335 Ile Ala Leu Arg Pro Arg Pro Gly Glu Pro Gly Arg Asp Leu Ala Ser 340 345 350 Ser Glu Asn Gly Thr Glu Cys Arg Ser Gly Phe Val Arg His Asn Gly 355 360 365 Ser Cys Arg Ser Val Cys Asp Leu Phe Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly 370 375 380 Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn 385 390 395 400 Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg Cys Glu Ser Ile Ile 405 410 415 Thr Asp Phe Gln Val Met Cys Val Ala Val Gly Ser Ala Ala Leu Val 420 425 430 Leu Leu Leu Leu Phe Met Met Thr Val Phe Phe Ala Lys Lys Leu Tyr 435 440 445 Leu Leu Lys Thr Glu Asn Thr Lys Leu Arg Arg Thr Asn Lys Phe Arg 450 455 460 Thr Pro Ser Glu Leu His Asn Asp Asn Phe Ser Leu Ser Thr Ile Ala 465 470 475 480 Glu Gly Ser His Pro Asn Asp Asp Pro Ser Ala Pro His Lys Ile Gln 485 490 495 Glu Val Leu Lys Ser Cys Leu Lys Glu Glu Glu Ser Phe Asn Ile Gln 500 505 510 Asn Ser Met Ser Pro Lys Leu Glu Gly Gly Lys Gly Asp Gln Ala Asp 515 520 525 Leu Asp Val Asn Cys Leu Gln Asn Asn Leu Thr 530 535 <210> 5 <211> 2253 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (669)..(1874) <223> <400> 5 agtccagtga ggaataactg tagataagat gagatgatgg gcattaagtg taactgctga 60 gaagccttca tagagggaaa ggtgataaga actgagtttt tctggcatga ggagtttacc 120 aggcaggaga ggtggagacg ctaggctagg caaataggct gcagccatag ttctgctgag 180 aaacaggttt tgaaccaagg caactccatc tggagatatg tatcagaaag attaggagat 240 agaatctcca tcttggtcac ttatttggtc ttctaagaca gcaatgggac cgtctcttaa 300 atactggagt tgtcctatct ccttgggctg ataccctgaa ctgtcatttg gcgcgtgagg 360 cgggcagcgc ggttgaggcc gaagagctgg tgaagggcag cccggcgtgg gagccgcctg 420 ccaacgacac gcgggaagaa gccggcccac cagcggctgg ggaagatgag gcgtcgtgga 480 cggcgcccgg tggcgagctg gccgggccag aagaggtgct gcaggagtcg gctgcggtga 540 ccggcaccgc ctggctggaa gctgacagcc caggcctggg aggagtgacc gcagaggcgg 600 gcagcggcga tgcccaggcc cttccagcta cgctccaggc tccccacgag gtcctcgggc 660 agtcaatc atg ccc cct gcc att cct gag gct aca gag gcc agc ggg cca 710 Met Pro Pro Ala Ile Pro Glu Ala Thr Glu Ala Ser Gly Pro 1 5 10 ccc tcc ccc acc ccc ggc gac aag ctg agc cca gct tct gaa ctc ccc 758 Pro Ser Pro Thr Pro Gly Asp Lys Leu Ser Pro Ala Ser Glu Leu Pro 15 20 25 30 aag gag agc ccc ttg gag gtt tgg ctg aac ctg ggg ggc agc aca ccc 806 Lys Glu Ser Pro Leu Glu Val Trp Leu Asn Leu Gly Gly Ser Thr Pro 35 40 45 gac cct caa ggg cca gag ctg act tac cca ttt cag ggc acc ctg gag 854 Asp Pro Gln Gly Pro Glu Leu Thr Tyr Pro Phe Gln Gly Thr Leu Glu 50 55 60 ccc caa ccg gca tca gat atc att gac atc gac tac ttc gaa gga ctg 902 Pro Gln Pro Ala Ser Asp Ile Ile Asp Ile Asp Tyr Phe Glu Gly Leu 65 70 75 gat ggt gag ggt cgt ggc gca gat ctg ggg agc ttc cca ggg tca cca 950 Asp Gly Glu Gly Arg Gly Ala Asp Leu Gly Ser Phe Pro Gly Ser Pro 80 85 90 gga acc tca gag aac cac cct gat act gag gga gag acc cct tcc tgg 998 Gly Thr Ser Glu Asn His Pro Asp 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Gly Arg Asp Leu Ala Ser Ser Glu Asn Gly Thr Glu Cys Arg 210 215 220 agt ggc ttt gtg cgg cat aac ggc tcc tgc cgg tca gtg tgc gac ctc 1382 Ser Gly Phe Val Arg His Asn Gly Ser Cys Arg Ser Val Cys Asp Leu 225 230 235 ttc cca agt tac tgt cac aat ggc ggc cag tgc tac ctg gtg gag aac 1430 Phe Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn 240 245 250 ata ggg gcc ttc tgc agg tgc aac acg cag gac tac atc tgg cac aag 1478 Ile Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys 255 260 265 270 ggg atg cgc tgc gag tcc atc atc acc gac ttc cag gtg atg tgc gtg 1526 Gly Met Arg Cys Glu Ser Ile Ile Thr Asp Phe Gln Val Met Cys Val 275 280 285 gcc gtg ggc tcg gct gcc ctc gtc ctg ctc ctg ctc ttc atg atg acg 1574 Ala Val Gly Ser Ala Ala Leu Val Leu Leu Leu Leu Phe Met Met Thr 290 295 300 gtg ttc ttt gcc aag aag ctc tac ctg ctc aag acg gag aat acc aag 1622 Val Phe Phe Ala Lys Lys Leu Tyr Leu Leu Lys Thr Glu Asn Thr Lys 305 310 315 ctg cgt agg acc aac aaa ttc cgg acc cca tct gag ctc cac aat gat 1670 Leu Arg Arg Thr Asn Lys Phe Arg Thr Pro Ser Glu Leu His Asn Asp 320 325 330 aac ttc tcc ctc tcc acc att gcc gag ggc tct cac cca aat gat gat 1718 Asn Phe Ser Leu Ser Thr Ile Ala Glu Gly Ser His Pro Asn Asp Asp 335 340 345 350 cct agt gct ccc cac aaa atc cag gag gtt ctc aag tcc tgc ctg aaa 1766 Pro Ser Ala Pro His Lys Ile Gln Glu Val Leu Lys Ser Cys Leu Lys 355 360 365 gag gag gag tca ttt aac atc cag aac tcc atg tcg ccc aaa ctt gag 1814 Glu Glu Glu Ser Phe Asn Ile Gln Asn Ser Met Ser Pro Lys Leu Glu 370 375 380 ggt ggc aaa ggt gac cag gct gac ttg gat gtg aac tgt ctt cag aat 1862 Gly Gly Lys Gly Asp Gln Ala Asp Leu Asp Val Asn Cys Leu Gln Asn 385 390 395 aat tta acc taa agcagagcaa gaagagagga agcgggggta gtgggtgggg 1914 Asn Leu Thr 400 ggtaggggaa gaaacattat ctcctcttgt acagagtcta tttcttgtaa ccatttgtta 1974 aactcttttc tttttctgat ctcatggcat gcttttatgt attttgtaca ggaggcaaaa 2034 aaatacttaa aataagcaaa gaaactgaac agaattgcat acattgggtt gttttttctg 2094 tgctgtctgt acattgcttc tgctgctgtg atttctaaac ctgtgctgtt attcaactga 2154 cttttttttg tactttgacc cacgtttttt tgaaatacca gtaaaaaaca aagttcttga 2214 aataaaactt tttaaaaagt taaaaaaaaa aaaaaaaaa 2253 <210> 6 <211> 401 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Pro Pro Ala Ile Pro Glu Ala Thr Glu Ala Ser Gly Pro Pro Ser 1 5 10 15 Pro Thr Pro Gly Asp Lys Leu Ser Pro Ala Ser Glu Leu Pro Lys Glu 20 25 30 Ser Pro Leu Glu Val Trp Leu Asn Leu Gly Gly Ser Thr Pro Asp Pro 35 40 45 Gln Gly Pro Glu Leu Thr Tyr Pro Phe Gln Gly Thr Leu Glu Pro Gln 50 55 60 Pro Ala Ser Asp Ile Ile Asp Ile Asp Tyr Phe Glu Gly Leu Asp Gly 65 70 75 80 Glu Gly Arg Gly Ala Asp Leu Gly Ser Phe Pro Gly Ser Pro Gly Thr 85 90 95 Ser Glu Asn His Pro Asp Thr Glu Gly Glu Thr Pro Ser Trp Ser Leu 100 105 110 Leu Asp Leu Tyr Asp Asp Phe Thr Pro Phe Asp Glu Ser Asp Phe Tyr 115 120 125 Pro Thr Thr Ser Phe Tyr Asp Asp Leu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu 130 135 140 Glu Asp Asp Lys Asp Ala Val Gly Gly Gly Asp Leu Glu Asp Glu Asn 145 150 155 160 Glu Leu Leu Val Pro Thr Gly Lys Pro Gly Leu Gly Pro Gly Thr Gly 165 170 175 Gln Pro Thr Ser Arg Trp His Ala Val Pro Pro Gln His Thr Leu Gly 180 185 190 Ser Val Pro Gly Ser Ser Ile Ala Leu Arg Pro Arg Pro Gly Glu Pro 195 200 205 Gly Arg Asp Leu Ala Ser Ser Glu Asn Gly Thr Glu Cys Arg Ser Gly 210 215 220 Phe Val Arg His Asn Gly Ser Cys Arg Ser Val Cys Asp Leu Phe Pro 225 230 235 240 Ser Tyr Cys His Asn Gly Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile Gly 245 250 255 Ala Phe Cys Arg Cys Asn Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met 260 265 270 Arg Cys Glu Ser Ile Ile Thr Asp Phe Gln Val Met Cys Val Ala Val 275 280 285 Gly Ser Ala Ala Leu Val Leu Leu Leu Leu Phe Met Met Thr Val Phe 290 295 300 Phe Ala Lys Lys Leu Tyr Leu Leu Lys Thr Glu Asn Thr Lys Leu Arg 305 310 315 320 Arg Thr Asn Lys Phe Arg Thr Pro Ser Glu Leu His Asn Asp Asn Phe 325 330 335 Ser Leu Ser Thr Ile Ala Glu Gly Ser His Pro Asn Asp Asp Pro Ser 340 345 350 Ala Pro His Lys Ile Gln Glu Val Leu Lys Ser Cys Leu Lys Glu Glu 355 360 365 Glu Ser Phe Asn Ile Gln Asn Ser Met Ser 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cca gcg gct ggg gaa gat gag gcg tcg tgg acg gcg ccc ggt ggc gag 419 Pro Ala Ala Gly Glu Asp Glu Ala Ser Trp Thr Ala Pro Gly Gly Glu 70 75 80 ctg gcc ggg cca gaa gag gtg ctg cag gag tcg gct gcg gtg acc ggc 467 Leu Ala Gly Pro Glu Glu Val Leu Gln Glu Ser Ala Ala Val Thr Gly 85 90 95 acc gcc tgg ctg gaa gct gac agc cca ggc ctg gga gga gtg acc gca 515 Thr Ala Trp Leu Glu Ala Asp Ser Pro Gly Leu Gly Gly Val Thr Ala 100 105 110 gag gcg ggc agc ggc gat gcc cag gcc ctt cca gct acg ctc cag gct 563 Glu Ala Gly Ser Gly Asp Ala Gln Ala Leu Pro Ala Thr Leu Gln Ala 115 120 125 ccc cac gag gtc ctc ggg cag tca atc atg ccc cct gcc att cct gag 611 Pro His Glu Val Leu Gly Gln Ser Ile Met Pro Pro Ala Ile Pro Glu 130 135 140 145 gct aca gag gcc agc ggg cca ccc tcc ccc acc ccc ggc gac aag ctg 659 Ala Thr Glu Ala Ser Gly Pro Pro Ser Pro Thr Pro Gly Asp Lys Leu 150 155 160 agc cca gct tct gaa ctc ccc aag gag agc ccc ttg gag gtt tgg ctg 707 Ser Pro Ala Ser Glu Leu Pro Lys Glu Ser Pro Leu Glu Val Trp Leu 165 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Ala Val 275 280 285 gga ggt gga gac cta gaa gat gaa aat gag ctt cta gtg ccc act ggg 1091 Gly Gly Gly Asp Leu Glu Asp Glu Asn Glu Leu Leu Val Pro Thr Gly 290 295 300 305 aag cct ggt ctg ggg ccc ggg aca ggc cag ccc acc agt cgg tgg cat 1139 Lys Pro Gly Leu Gly Pro Gly Thr Gly Gln Pro Thr Ser Arg Trp His 310 315 320 gct gtc cct cca cag cac act ctg ggg tcg gtc ccc ggc agc agc atc 1187 Ala Val Pro Pro Gln His Thr Leu Gly Ser Val Pro Gly Ser Ser Ile 325 330 335 gcc ctc agg ccc cgc cca gga gag cca ggc agg gac ttg gcc tcc agt 1235 Ala Leu Arg Pro Arg Pro Gly Glu Pro Gly Arg Asp Leu Ala Ser Ser 340 345 350 gaa aat ggc act gag tgc cgc agt ggc ttt gtg cgg cat aac ggc tcc 1283 Glu Asn Gly Thr Glu Cys Arg Ser Gly Phe Val Arg His Asn Gly Ser 355 360 365 tgc cgg tca gtg tgc gac ctc ttc cca agt tac tgt cac aat ggc ggc 1331 Cys Arg Ser Val Cys Asp Leu Phe Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly Gly 370 375 380 385 cag tgc tac ctg gtg gag aac ata ggg gcc ttc tgc agg tgc aac acg 1379 Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn Thr 390 395 400 cag gac tac atc tgg cac aag ggg atg cgc tgc gag tcc atc atc acc 1427 Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg Cys Glu Ser Ile Ile Thr 405 410 415 gac ttc cag gtg atg tgc gtg gcc gtg ggc tcg gct gcc ctc gtc ctg 1475 Asp Phe Gln Val Met Cys Val Ala Val Gly Ser Ala Ala Leu Val Leu 420 425 430 ctc ctg ctc ttc atg atg acg gtg ttc ttt gcc aag aag ctc tac ctg 1523 Leu Leu Leu Phe Met Met Thr Val Phe Phe Ala Lys Lys Leu Tyr Leu 435 440 445 ctc aag acg gag aat acc aag ctg cgt agg acc aac aaa ttc cgg acc 1571 Leu Lys Thr Glu Asn Thr Lys Leu Arg Arg Thr Asn Lys Phe Arg Thr 450 455 460 465 cca tct gag ctc cac aat gat aac ttc tcc ctc tcc acc att gcc gag 1619 Pro Ser Glu Leu His Asn Asp Asn Phe Ser Leu Ser Thr Ile Ala Glu 470 475 480 ggc tct cac cca aat gta agg aaa ctt tgc aac act ccc cgt acc tcc 1667 Gly Ser His Pro Asn Val Arg Lys Leu Cys Asn Thr Pro Arg Thr Ser 485 490 495 tcc ccc cat gcc cgt gcc ttg gct cac tat gat aac gtt atc tgt cag 1715 Ser Pro His Ala Arg Ala Leu Ala His Tyr Asp Asn Val Ile Cys Gln 500 505 510 gat gat cct agt gct ccc cac aaa atc cag gag gtt ctc aag tcc tgc 1763 Asp Asp Pro Ser Ala Pro His Lys Ile Gln Glu Val Leu Lys Ser Cys 515 520 525 ctg aaa gag gag gag tca ttt aac atc cag aac tcc atg tcg ccc aaa 1811 Leu Lys Glu Glu Glu Ser Phe Asn Ile Gln Asn Ser Met Ser Pro Lys 530 535 540 545 ctt gag ggt ggc aaa ggt gac cag gct gac ttg gat gtg aac tgt ctt 1859 Leu Glu Gly Gly Lys Gly Asp Gln Ala Asp Leu Asp Val Asn Cys Leu 550 555 560 cag aat aat tta acc taa agcagagcaa gaagagagga agcgggggta 1907 Gln Asn Asn Leu Thr 565 gtgggtgggg ggtaggggaa gaaacattat ctcctcttgt acagagtcta tttcttgtaa 1967 ccatttgtta aactcttttc tttttctgat ctcatggcat gcttttatgt attttgtaca 2027 ggaggcaaaa aaatacttaa aataagcaaa gaaactgaac agaattgcat acattgggtt 2087 gttttttctg tgctgtctgt acattgcttc tgctgctgtg atttctaaac ctgtgctgtt 2147 attcaactga cttttttttg tactttgacc cacgtttttt tgaaatacca gtaaaaaaca 2207 aagttcttga aataaaactt tttaaaaagt taaaaaaaaa aaaaaaaaa 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Gln Pro Ala Ser Asp Ile Ile 195 200 205 Asp Ile Asp Tyr Phe Glu Gly Leu Asp Gly Glu Gly Arg Gly Ala Asp 210 215 220 Leu Gly Ser Phe Pro Gly Ser Pro Gly Thr Ser Glu Asn His Pro Asp 225 230 235 240 Thr Glu Gly Glu Thr Pro Ser Trp Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Asp Asp 245 250 255 Phe Thr Pro Phe Asp Glu Ser Asp Phe Tyr Pro Thr Thr Ser Phe Tyr 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Lys Asp Ala 275 280 285 Val Gly Gly Gly Asp Leu Glu Asp Glu Asn Glu Leu Leu Val Pro Thr 290 295 300 Gly Lys Pro Gly Leu Gly Pro Gly Thr Gly Gln Pro Thr Ser Arg Trp 305 310 315 320 His Ala Val Pro Pro Gln His Thr Leu Gly Ser Val Pro Gly Ser Ser 325 330 335 Ile Ala Leu Arg Pro Arg Pro Gly Glu Pro Gly Arg Asp Leu Ala Ser 340 345 350 Ser Glu Asn Gly Thr Glu Cys Arg Ser Gly Phe Val Arg His Asn Gly 355 360 365 Ser Cys Arg Ser Val Cys Asp Leu Phe Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly 370 375 380 Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn 385 390 395 400 Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg Cys Glu Ser Ile Ile 405 410 415 Thr Asp Phe Gln Val Met Cys Val Ala Val Gly Ser Ala Ala Leu Val 420 425 430 Leu Leu Leu Leu Phe Met Met Thr Val Phe Phe Ala Lys Lys Leu Tyr 435 440 445 Leu Leu Lys Thr Glu Asn Thr Lys Leu Arg Arg Thr Asn Lys Phe Arg 450 455 460 Thr Pro Ser Glu Leu His Asn Asp Asn Phe Ser Leu Ser Thr Ile Ala 465 470 475 480 Glu Gly Ser His Pro Asn Val Arg Lys Leu Cys Asn Thr Pro Arg Thr 485 490 495 Ser Ser Pro His Ala Arg Ala Leu Ala His Tyr Asp Asn Val Ile Cys 500 505 510 Gln Asp Asp Pro Ser Ala Pro His Lys Ile Gln Glu Val Leu Lys Ser 515 520 525 Cys Leu Lys Glu Glu Glu Ser Phe Asn Ile Gln Asn Ser Met Ser Pro 530 535 540 Lys Leu Glu Gly Gly Lys Gly Asp Gln Ala Asp Leu Asp Val Asn Cys 545 550 555 560 Leu Gln Asn Asn Leu Thr 565 <210> 9 <211> 2099 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (177)..(1610) <223> <400> 9 ggggaggcgc ggcgcgccgg ggacagcggc ggacggcggc ggcggcggca tgcggctcct 60 cgcgctgccc atcgtgggct gaggcggccg cagaaccggc gggaggcgcg gcggccgggc 120 gagccgaggg cgcagccagc cgggcggacc gcggacagcg gtcggggcgc cgcgcc atg 179 Met 1 ggg cga gcc ggg ggc ggg ggc ccg ggc cgg ggg ccg ccg cca ctg ctg 227 Gly Arg Ala Gly Gly Gly Gly Pro Gly Arg Gly Pro Pro Pro Leu Leu 5 10 15 ctg ttt ctg ggg gcc gcg ctg gtc ctg gcc tct ggg gcc gtg ccg gcg 275 Leu Phe Leu Gly Ala Ala Leu Val Leu Ala Ser Gly Ala Val Pro Ala 20 25 30 cgt gag gcg ggc agc gcg gtt gag gcc gaa gag ctg gtg aag ggc agc 323 Arg Glu Ala Gly Ser Ala Val Glu Ala Glu Glu Leu Val Lys Gly Ser 35 40 45 ccg gcg tgg gag ccg cct gcc aac gac acg cgg gaa gaa gcc ggc cca 371 Pro Ala Trp Glu Pro Pro Ala Asn Asp Thr Arg Glu Glu Ala Gly Pro 50 55 60 65 cca gcg gct ggg gaa gat gag gcg tcg tgg acg gcg ccc ggt ggc gag 419 Pro Ala Ala Gly Glu Asp Glu Ala Ser Trp Thr Ala Pro Gly Gly Glu 70 75 80 ctg gcc ggg cca gaa gag gtg ctg cag gag tcg gct gcg gtg acc ggc 467 Leu Ala Gly Pro Glu Glu Val Leu Gln Glu Ser Ala Ala Val Thr Gly 85 90 95 acc gcc tgg ctg gaa gct gac agc cca ggc ctg gga gga gtg acc gca 515 Thr Ala Trp Leu Glu Ala Asp Ser Pro Gly Leu Gly Gly Val Thr Ala 100 105 110 gag gcg ggc agc ggc gat gcc cag gcc ctt cca gct acg ctc cag gct 563 Glu Ala Gly Ser Gly Asp Ala Gln Ala Leu Pro Ala Thr Leu Gln Ala 115 120 125 ccc cac gag gtc ctc ggg cag tca atc atg ccc cct gcc att cct gag 611 Pro His Glu Val Leu Gly Gln Ser Ile Met Pro Pro Ala Ile Pro Glu 130 135 140 145 gct aca gag gcc agc ggg cca ccc tcc ccc acc ccc ggc gac aag ctg 659 Ala Thr Glu Ala Ser Gly Pro Pro Ser Pro Thr Pro Gly Asp Lys Leu 150 155 160 agc cca gct tct gaa ctc ccc aag gag agc ccc ttg gag gtt tgg ctg 707 Ser Pro Ala Ser Glu Leu Pro Lys Glu Ser Pro Leu Glu Val Trp Leu 165 170 175 aac ctg ggg ggc agc aca ccc gac cct caa ggg cca gag ctg act tac 755 Asn Leu Gly Gly Ser Thr Pro Asp Pro Gln Gly Pro Glu Leu Thr Tyr 180 185 190 cca ttt cag ggc acc ctg gag ccc caa ccg gca tca gat atc att gac 803 Pro Phe Gln Gly Thr Leu Glu Pro Gln Pro Ala Ser Asp Ile Ile Asp 195 200 205 atc gac tac ttc gaa gga ctg gat ggt gag ggt cgt ggc gca gat ctg 851 Ile Asp Tyr Phe Glu Gly Leu Asp Gly Glu Gly Arg Gly Ala Asp Leu 210 215 220 225 ggg agc ttc cca ggg tca cca gga acc tca gag aac cac cct gat act 899 Gly Ser Phe Pro Gly Ser Pro Gly Thr Ser Glu Asn His Pro Asp Thr 230 235 240 gag gga gag acc cct tcc tgg agc ctg ctt gac tta tac gat gat ttc 947 Glu Gly Glu Thr Pro Ser Trp Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Asp Asp Phe 245 250 255 acc ccc ttc gat gaa tct gat ttc tac ccc acc aca tcc ttt tat gat 995 Thr Pro Phe Asp Glu Ser Asp Phe Tyr Pro Thr Thr Ser Phe Tyr Asp 260 265 270 gac ttg gat gaa gag gag gag gaa gag gag gat gac aaa gat gca gta 1043 Asp Leu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Lys Asp Ala Val 275 280 285 gga ggt gga gac cta gaa gat gaa aat gag ctt cta gtg ccc act ggg 1091 Gly Gly Gly Asp Leu Glu Asp Glu Asn Glu Leu Leu Val Pro Thr Gly 290 295 300 305 aag cct ggt ctg ggg ccc ggg aca ggc cag ccc acc agt cgg tgg cat 1139 Lys Pro Gly Leu Gly Pro Gly Thr Gly Gln Pro Thr Ser Arg Trp His 310 315 320 gct gtc cct cca cag cac act ctg ggg tcg gtc ccc ggc agc agc atc 1187 Ala Val Pro Pro Gln His Thr Leu Gly Ser Val Pro Gly Ser Ser Ile 325 330 335 gcc ctc agg ccc cgc cca gga gag cca ggc agg gac ttg gcc tcc agt 1235 Ala Leu Arg Pro Arg Pro Gly Glu Pro Gly Arg Asp Leu Ala Ser Ser 340 345 350 gaa aat ggc act gag tgc cgc agt ggc ttt gtg cgg cat aac ggc tcc 1283 Glu Asn Gly Thr Glu Cys Arg Ser Gly Phe Val Arg His Asn Gly Ser 355 360 365 tgc cgg tca gtg tgc gac ctc ttc cca agt tac tgt cac aat ggc ggc 1331 Cys Arg Ser Val Cys Asp Leu Phe Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly Gly 370 375 380 385 cag tgc tac ctg gtg gag aac ata ggg gcc ttc tgc agg tgc aac acg 1379 Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn Thr 390 395 400 cag gac tac atc tgg cac aag ggg atg cgc tgc gag tcc atc atc acc 1427 Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg Cys Glu Ser Ile Ile Thr 405 410 415 gac ttc cag gtg atg tgc gtg gcc gtg ggc tcg gct gcc ctc gtc ctg 1475 Asp Phe Gln Val Met Cys Val Ala Val Gly Ser Ala Ala Leu Val Leu 420 425 430 ctc ctg ctc ttc atg atg acg gtg ttc ttt gcc aag aag ctc tac ctg 1523 Leu Leu Leu Phe Met Met Thr Val Phe Phe Ala Lys Lys Leu Tyr Leu 435 440 445 ctc aag acg gag aat acc aag ctg cgt agg acc aag atg atc cta gtg 1571 Leu Lys Thr Glu Asn Thr Lys Leu Arg Arg Thr Lys Met Ile Leu Val 450 455 460 465 ctc ccc aca aaa tcc agg agg ttc tca agt cct gcc tga aagaggagga 1620 Leu Pro Thr Lys Ser Arg Arg Phe Ser Ser Pro Ala 470 475 gtcatttaac atccagaact ccatgtcgcc caaacttgag ggtggcaaag gtgaccaggc 1680 tgacttggat gtgaactgtc ttcagaataa tttaacctaa agcagagcaa gaagagagga 1740 agcgggggta gtgggtgggg ggtaggggaa gaaacattat ctcctcttgt acagagtcta 1800 tttcttgtaa ccatttgtta aactcttttc tttttctgat ctcatggcat gcttttatgt 1860 attttgtaca ggaggcaaaa aaatacttaa aataagcaaa gaaactgaac agaattgcat 1920 acattgggtt gttttttctg tgctgtctgt acattgcttc tgctgctgtg atttctaaac 1980 ctgtgctgtt attcaactga cttttttttg tactttgacc cacgtttttt tgaaatacca 2040 gtaaaaaaca aagttcttga aataaaactt tttaaaaagt taaaaaaaaa aaaaaaaaa 2099 <210> 10 <211> 477 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Gly Arg Ala Gly Gly Gly Gly Pro Gly Arg Gly Pro Pro Pro Leu 1 5 10 15 Leu Leu Phe Leu Gly Ala Ala Leu Val Leu Ala Ser Gly Ala Val Pro 20 25 30 Ala Arg Glu Ala Gly Ser Ala Val Glu Ala Glu Glu Leu Val Lys Gly 35 40 45 Ser Pro Ala Trp Glu Pro Pro Ala Asn Asp Thr Arg Glu Glu Ala Gly 50 55 60 Pro Pro Ala Ala Gly Glu Asp Glu Ala Ser Trp Thr Ala Pro Gly Gly 65 70 75 80 Glu Leu Ala Gly Pro Glu Glu Val Leu Gln Glu Ser Ala Ala Val Thr 85 90 95 Gly Thr Ala Trp Leu Glu Ala Asp Ser Pro Gly Leu Gly Gly Val Thr 100 105 110 Ala Glu Ala Gly Ser Gly Asp Ala Gln Ala Leu Pro Ala Thr Leu Gln 115 120 125 Ala Pro His Glu Val Leu Gly Gln Ser Ile Met Pro Pro Ala Ile Pro 130 135 140 Glu Ala Thr Glu Ala Ser Gly Pro Pro Ser Pro Thr Pro Gly Asp Lys 145 150 155 160 Leu Ser Pro Ala Ser Glu Leu Pro Lys Glu Ser Pro Leu Glu Val Trp 165 170 175 Leu Asn Leu Gly Gly Ser Thr Pro Asp Pro Gln Gly Pro Glu Leu Thr 180 185 190 Tyr Pro Phe Gln Gly Thr Leu Glu Pro Gln Pro Ala Ser Asp Ile Ile 195 200 205 Asp Ile Asp Tyr Phe Glu Gly Leu Asp Gly Glu Gly Arg Gly Ala Asp 210 215 220 Leu Gly Ser Phe Pro Gly Ser Pro Gly Thr Ser Glu Asn His Pro Asp 225 230 235 240 Thr Glu Gly Glu Thr Pro Ser Trp Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Asp Asp 245 250 255 Phe Thr Pro Phe Asp Glu Ser Asp Phe Tyr Pro Thr Thr Ser Phe Tyr 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Lys Asp Ala 275 280 285 Val Gly Gly Gly Asp Leu Glu Asp Glu Asn Glu Leu Leu Val Pro Thr 290 295 300 Gly Lys Pro Gly Leu Gly Pro Gly Thr Gly Gln Pro Thr Ser Arg Trp 305 310 315 320 His Ala Val Pro Pro Gln His Thr Leu Gly Ser Val Pro Gly Ser Ser 325 330 335 Ile Ala Leu Arg Pro Arg Pro Gly Glu Pro Gly Arg Asp Leu Ala Ser 340 345 350 Ser Glu Asn Gly Thr Glu Cys Arg Ser Gly Phe Val Arg His Asn Gly 355 360 365 Ser Cys Arg Ser Val Cys Asp Leu Phe Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly 370 375 380 Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn 385 390 395 400 Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg Cys Glu Ser Ile Ile 405 410 415 Thr Asp Phe Gln Val Met Cys Val Ala Val Gly Ser Ala Ala Leu Val 420 425 430 Leu Leu Leu Leu Phe Met Met Thr Val Phe Phe Ala Lys Lys Leu Tyr 435 440 445 Leu Leu Lys Thr Glu Asn Thr Lys Leu Arg Arg Thr Lys Met Ile Leu 450 455 460 Val Leu Pro Thr Lys Ser Arg Arg Phe Ser Ser Pro Ala 465 470 475 <210> 11 <211> 2334 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (669)..(1955) <223> <400> 11 agtccagtga ggaataactg tagataagat gagatgatgg gcattaagtg taactgctga 60 gaagccttca tagagggaaa ggtgataaga actgagtttt tctggcatga ggagtttacc 120 aggcaggaga ggtggagacg ctaggctagg caaataggct gcagccatag ttctgctgag 180 aaacaggttt tgaaccaagg caactccatc tggagatatg tatcagaaag attaggagat 240 agaatctcca tcttggtcac ttatttggtc ttctaagaca gcaatgggac cgtctcttaa 300 atactggagt tgtcctatct ccttgggctg ataccctgaa ctgtcatttg gcgcgtgagg 360 cgggcagcgc ggttgaggcc gaagagctgg tgaagggcag cccggcgtgg gagccgcctg 420 ccaacgacac gcgggaagaa gccggcccac cagcggctgg ggaagatgag gcgtcgtgga 480 cggcgcccgg tggcgagctg gccgggccag aagaggtgct gcaggagtcg gctgcggtga 540 ccggcaccgc ctggctggaa gctgacagcc caggcctggg aggagtgacc gcagaggcgg 600 gcagcggcga tgcccaggcc cttccagcta cgctccaggc tccccacgag gtcctcgggc 660 agtcaatc atg ccc cct gcc att cct gag gct aca gag gcc agc ggg cca 710 Met Pro Pro Ala Ile Pro Glu Ala Thr Glu Ala Ser Gly Pro 1 5 10 ccc tcc ccc acc ccc ggc gac aag ctg agc cca gct tct gaa ctc ccc 758 Pro Ser Pro Thr Pro Gly Asp Lys Leu Ser Pro Ala Ser Glu Leu Pro 15 20 25 30 aag gag agc ccc ttg gag gtt tgg ctg aac ctg ggg ggc agc aca ccc 806 Lys Glu Ser Pro Leu Glu Val Trp Leu Asn Leu Gly Gly Ser Thr Pro 35 40 45 gac cct caa ggg cca gag ctg act tac cca ttt cag ggc acc ctg gag 854 Asp Pro Gln Gly Pro Glu Leu Thr Tyr Pro Phe Gln Gly Thr Leu Glu 50 55 60 ccc caa ccg gca tca gat atc att gac atc gac tac ttc gaa gga ctg 902 Pro Gln Pro Ala Ser Asp Ile Ile Asp Ile Asp Tyr Phe Glu Gly Leu 65 70 75 gat ggt gag ggt cgt ggc gca gat ctg ggg agc ttc cca ggg tca cca 950 Asp Gly Glu Gly Arg Gly Ala Asp Leu Gly Ser Phe Pro Gly Ser Pro 80 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Pro Arg Pro Gly 195 200 205 gag cca ggc agg gac ttg gcc tcc agt gaa aat ggc act gag tgc cgc 1334 Glu Pro Gly Arg Asp Leu Ala Ser Ser Glu Asn Gly Thr Glu Cys Arg 210 215 220 agt ggc ttt gtg cgg cat aac ggc tcc tgc cgg tca gtg tgc gac ctc 1382 Ser Gly Phe Val Arg His Asn Gly Ser Cys Arg Ser Val Cys Asp Leu 225 230 235 ttc cca agt tac tgt cac aat ggc ggc cag tgc tac ctg gtg gag aac 1430 Phe Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn 240 245 250 ata ggg gcc ttc tgc agg tgc aac acg cag gac tac atc tgg cac aag 1478 Ile Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys 255 260 265 270 ggg atg cgc tgc gag tcc atc atc acc gac ttc cag gtg atg tgc gtg 1526 Gly Met Arg Cys Glu Ser Ile Ile Thr Asp Phe Gln Val Met Cys Val 275 280 285 gcc gtg ggc tcg gct gcc ctc gtc ctg ctc ctg ctc ttc atg atg acg 1574 Ala Val Gly Ser Ala Ala Leu Val Leu Leu Leu Leu Phe Met Met Thr 290 295 300 gtg ttc ttt gcc aag aag ctc tac ctg ctc aag acg gag aat acc aag 1622 Val Phe Phe Ala Lys Lys Leu Tyr Leu Leu Lys Thr Glu Asn Thr Lys 305 310 315 ctg cgt agg acc aac aaa ttc cgg acc cca tct gag ctc cac aat gat 1670 Leu Arg Arg Thr Asn Lys Phe Arg Thr Pro Ser Glu Leu His Asn Asp 320 325 330 aac ttc tcc ctc tcc acc att gcc gag ggc tct cac cca aat gta agg 1718 Asn Phe Ser Leu Ser Thr Ile Ala Glu Gly Ser His Pro Asn Val Arg 335 340 345 350 aaa ctt tgc aac act ccc cgt acc tcc tcc ccc cat gcc cgt gcc ttg 1766 Lys Leu Cys Asn Thr Pro Arg Thr Ser Ser Pro His Ala Arg Ala Leu 355 360 365 gct cac tat gat aac gtt atc tgt cag gat gat cct agt gct ccc cac 1814 Ala His Tyr Asp Asn Val Ile Cys Gln Asp Asp Pro Ser Ala Pro His 370 375 380 aaa atc cag gag gtt ctc aag tcc tgc ctg aaa gag gag gag tca ttt 1862 Lys Ile Gln Glu Val Leu Lys Ser Cys Leu Lys Glu Glu Glu Ser Phe 385 390 395 aac atc cag aac tcc atg tcg ccc aaa ctt gag ggt ggc aaa ggt gac 1910 Asn Ile Gln Asn Ser Met Ser Pro Lys Leu Glu Gly Gly Lys Gly Asp 400 405 410 cag gct gac ttg gat gtg aac tgt ctt cag aat aat tta acc taa 1955 Gln Ala Asp Leu Asp Val Asn Cys Leu Gln Asn Asn Leu Thr 415 420 425 agcagagcaa gaagagagga agcgggggta gtgggtgggg ggtaggggaa gaaacattat 2015 ctcctcttgt acagagtcta tttcttgtaa ccatttgtta aactcttttc tttttctgat 2075 ctcatggcat gcttttatgt attttgtaca ggaggcaaaa aaatacttaa aataagcaaa 2135 gaaactgaac agaattgcat acattgggtt gttttttctg tgctgtctgt acattgcttc 2195 tgctgctgtg atttctaaac ctgtgctgtt attcaactga cttttttttg tactttgacc 2255 cacgtttttt tgaaatacca gtaaaaaaca aagttcttga aataaaactt tttaaaaagt 2315 taaaaaaaaa aaaaaaaaa 2334 <210> 12 <211> 428 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Pro Pro Ala Ile Pro Glu Ala Thr Glu Ala Ser Gly Pro Pro Ser 1 5 10 15 Pro Thr Pro Gly Asp Lys Leu Ser Pro Ala Ser Glu Leu Pro Lys Glu 20 25 30 Ser Pro Leu Glu Val Trp Leu Asn Leu Gly Gly Ser Thr Pro Asp Pro 35 40 45 Gln Gly Pro Glu Leu Thr Tyr Pro Phe Gln Gly Thr Leu Glu Pro Gln 50 55 60 Pro Ala Ser Asp Ile Ile Asp Ile Asp Tyr Phe Glu Gly Leu Asp Gly 65 70 75 80 Glu Gly Arg Gly Ala Asp Leu Gly Ser Phe Pro Gly Ser Pro Gly Thr 85 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aga cct ccc cga gac cct tcc cct ccc cga aca 144 Leu Val Asp Thr Arg Arg Pro Pro Arg Asp Pro Ser Pro Pro Arg Thr 35 40 45 cgg cat tgg cgc aga aat ctg aga ggt ccg tgc acc ccg ggc tcg gct 192 Arg His Trp Arg Arg Asn Leu Arg Gly Pro Cys Thr Pro Gly Ser Ala 50 55 60 cat ttc cac agc tcc agc tcg ggc ttc cgc ccc ctg cgg ccc ttc cga 240 His Phe His Ser Ser Ser Ser Gly Phe Arg Pro Leu Arg Pro Phe Arg 65 70 75 80 gcc ccg ccc caa gct tgc ggg tgt ctg ggc ccc cgc ctc cgt gct cgc 288 Ala Pro Pro Gln Ala Cys Gly Cys Leu Gly Pro Arg Leu Arg Ala Arg 85 90 95 cgc gtg gcg ggt ggg ttc ctc gca ggt ggg ggg ccc gtg cca gct ctc 336 Arg Val Ala Gly Gly Phe Leu Ala Gly Gly Gly Pro Val Pro Ala Leu 100 105 110 cac ggg gag ggc ggg ccc cgc ccc aca ggt ctc ccg ccc gtg cac ctg 384 His Gly Glu Gly Gly Pro Arg Pro Thr Gly Leu Pro Pro Val His Leu 115 120 125 tcg gct aac gcc acg cac ggc gct gtg ctc cgc acc cgc gct act cca 432 Ser Ala Asn Ala Thr His Gly Ala Val Leu Arg Thr Arg Ala Thr Pro 130 135 140 cgt ccg ttt gtc tcg gcg tcc cga gcc ggg ggt acc gac tgc gac cag 480 Arg Pro Phe Val Ser Ala Ser Arg Ala Gly Gly Thr Asp Cys Asp Gln 145 150 155 160 gac ccc cgc ggc cct cgc gcc cca ccc tgg gcc agg gtc ccg ctg gcc 528 Asp Pro Arg Gly Pro Arg Ala Pro Pro Trp Ala Arg Val Pro Leu Ala 165 170 175 tcg ggt aca ggc gga gtt agc gag ctg tgg caa ggg ggc ggg gca gct 576 Ser Gly Thr Gly Gly Val Ser Glu Leu Trp Gln Gly Gly Gly Ala Ala 180 185 190 cct tgc ccg cga ccg ggg cgg ggg aag ggg cgc gcg aag agg tgg gat 624 Pro Cys Pro Arg Pro Gly Arg Gly Lys Gly Arg Ala Lys Arg Trp Asp 195 200 205 act tgg ggg agg ccg agg ggt tgg ggg cgg ccc cgg ccc ggg tgt ccg 672 Thr Trp Gly Arg Pro Arg Gly Trp Gly Arg Pro Arg Pro Gly Cys Pro 210 215 220 gac aga gcc cgt gag gct ggc agc gcc gtc gag gcc cac gag cag gtg 720 Asp Arg Ala Arg Glu Ala Gly Ser Ala Val Glu Ala His Glu Gln Val 225 230 235 240 aag agc atc ctg gcg agg gag ccg act gcc aac gaa acg agg gag aag 768 Lys Ser Ile Leu Ala Arg Glu Pro Thr Ala Asn Glu Thr Arg Glu Lys 245 250 255 gcc ggc cca cca gca gct gag gaa gac gag acc tcg tgg acc gca cct 816 Ala Gly Pro Pro Ala Ala Glu Glu Asp Glu Thr Ser Trp Thr Ala Pro 260 265 270 ggc ggt gag cag gcc atg atg ggg cct agt gtc ggg cca gag gag gtg 864 Gly Gly Glu Gln Ala Met Met Gly Pro Ser Val Gly Pro Glu Glu Val 275 280 285 ctg gag gcg tcg gca gcg gtg acc ggc gca ccc tgg ctg gag gct gac 912 Leu Glu Ala Ser Ala Ala Val Thr Gly Ala Pro Trp Leu Glu Ala Asp 290 295 300 agc cct ggc ctg ggt gga gtg acc gca gag gcc ggc agc ggc gac acc 960 Ser Pro Gly Leu Gly Gly Val Thr Ala Glu Ala Gly Ser Gly Asp Thr 305 310 315 320 cag gcc ctt cca gct acg ctc ccg gct ccc aag gag gcc ctg gga cag 1008 Gln Ala Leu Pro Ala Thr Leu Pro Ala Pro Lys Glu Ala Leu Gly Gln 325 330 335 tca tcg atg gcc ccc tcc atc ccc aag gct aca gag gcc agc aga cca 1056 Ser Ser Met Ala Pro Ser Ile Pro Lys Ala Thr Glu Ala Ser Arg Pro 340 345 350 ccc tcc ccc aca cct ggc gac atg ctg agc ccc ggc cca gaa cac ccc 1104 Pro Ser Pro Thr Pro Gly Asp Met Leu Ser Pro Gly Pro Glu His Pro 355 360 365 aag gag agt ccc ttg gag gtt tgg ttg aac ctg gga ggc agc aca cat 1152 Lys Glu Ser Pro Leu Glu Val Trp Leu Asn Leu Gly Gly Ser Thr His 370 375 380 gac cct cat ggg cca gag ccc aca ttc ccc ttt cag ggc aca atg gag 1200 Asp Pro His Gly Pro Glu Pro Thr Phe Pro Phe Gln Gly Thr Met Glu 385 390 395 400 ccc cag cca gtg tca gat ata att gac atc gac tac ttc gaa gga ttg 1248 Pro Gln Pro Val Ser Asp Ile Ile Asp Ile Asp Tyr Phe Glu Gly Leu 405 410 415 gat ggt gag ggc cgt ggt gcc gac ctg gag agc ttc cca ggg tcg cca 1296 Asp Gly Glu Gly Arg Gly Ala Asp Leu Glu Ser Phe Pro Gly Ser Pro 420 425 430 gga acc tca gag cac cac cct gat act ggg gga gag acc cct tcc tgg 1344 Gly Thr Ser Glu His His Pro Asp Thr Gly Gly Glu Thr Pro Ser Trp 435 440 445 agc ctg ctt gac tta tac gat gac ttc acc ccc ttt gat gaa tct gac 1392 Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Asp Asp Phe Thr Pro Phe Asp Glu Ser Asp 450 455 460 ttc tac ccc acc aca tcc ttc tat gat gac ctt gat gaa gag gag gag 1440 Phe Tyr Pro Thr Thr Ser Phe Tyr Asp Asp Leu Asp Glu Glu Glu Glu 465 470 475 480 gaa gag gat gac aag gat gca gcg gga ggt gaa gac ctg gaa gat gaa 1488 Glu Glu Asp Asp Lys Asp Ala Ala Gly Gly Glu Asp Leu Glu Asp Glu 485 490 495 agt gac ctt ctg gtg cct acc gag aag cct ggt ctg ggg ccc ggg act 1536 Ser Asp Leu Leu Val Pro Thr Glu Lys Pro Gly Leu Gly Pro Gly Thr 500 505 510 ggc cag cct acc agt cgg tgg cat gct gtg ccc cca cag cat act ctg 1584 Gly Gln Pro Thr Ser Arg Trp His Ala Val Pro Pro Gln His Thr Leu 515 520 525 ggg atg gtc cct ggc agc agc atc gcc ctc agg ccc cgc cct gga gag 1632 Gly Met Val Pro Gly Ser Ser Ile Ala Leu Arg Pro Arg Pro Gly Glu 530 535 540 cca ggc agg gac ctg acc cca agc gag aat ggc act gag tgc cgc agc 1680 Pro Gly Arg Asp Leu Thr Pro Ser Glu Asn Gly Thr Glu Cys Arg Ser 545 550 555 560 ggc ttt gtg cga cat aac ggc tcc tgc cgg tca gtg tgc gac ctc ttt 1728 Gly Phe Val Arg His Asn Gly Ser Cys Arg Ser Val Cys Asp Leu Phe 565 570 575 cca agt tac tgt cac aat ggc ggc cag tgc tac ctg gtg gag aac ata 1776 Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile 580 585 590 ggg gcc ttc tgc agg tgc aac aca cag gac tac atc tgg cac aag ggg 1824 Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly 595 600 605 atg cgc tgc gag tcc atc atc acc gac ttc cag gtg atg tgc gtg gcc 1872 Met Arg Cys Glu Ser Ile Ile Thr Asp Phe Gln Val Met Cys Val Ala 610 615 620 gtc ggc tcg gct gcc ctt gta ctg ctc ctg ctc ttc atg atg aca gtg 1920 Val Gly Ser Ala Ala Leu Val Leu Leu Leu Leu Phe Met Met Thr Val 625 630 635 640 ttc ttc gcc aag aag cta tat ctg ctc aag aca gag aat acc aag ctg 1968 Phe Phe Ala Lys Lys Leu Tyr Leu Leu Lys Thr Glu Asn Thr Lys Leu 645 650 655 cgt agg acc aac aaa ttc cgg acc ccg tct gaa ctc cac aac gat aac 2016 Arg Arg Thr Asn Lys Phe Arg Thr Pro Ser Glu Leu His Asn Asp Asn 660 665 670 ttc tcc ctc tcc acc att gcc gaa ggc tct cac cca aac gat gac cct 2064 Phe Ser Leu Ser Thr Ile Ala Glu Gly Ser His Pro Asn Asp Asp Pro 675 680 685 agt gct ccc cac aaa atc cag gaa gct ctc aag tcc tgc ctg aaa gag 2112 Ser Ala Pro His Lys Ile Gln Glu Ala Leu Lys Ser Cys Leu Lys Glu 690 695 700 gag gag tca ttt aac atc cag aac tcc atg tca ccc aaa ctt gag ggt 2160 Glu Glu Ser Phe Asn Ile Gln Asn Ser Met Ser Pro Lys Leu Glu Gly 705 710 715 720 ggc aaa ggt gac cag gct gac ttg gag gtg aac tgt ctt cag aat aac 2208 Gly Lys Gly Asp Gln Ala Asp Leu Glu Val Asn Cys Leu Gln Asn Asn 725 730 735 cta acc taa agcagaacaa gaagagagga aatgggggga gggggggtac 2257 Leu Thr ggggagaaac atgacctcct cttgtacaga gtctatttct tgtaaccatt tgttaaactc 2317 ttttcttttt ctgatctcat ggcatgcttt gatgtatttt gtacaggagg ggaaacacac 2377 acacacacac acacacacac acacacacac acacacacta agcaaagaac ccagacaaaa 2437 ttgcatacgt tgggttgttt tgtctgtgct gtctgtacat tgcttctgct gctgtgattt 2497 ctaaacctac gctgttattc aactactttt tttttgtact ttgacccacc tttttttgaa 2557 ataagagtaa aaaacaaagt tcttgaaata aaact 2592 <210> 14 <211> 738 <212> PRT <213> Felis catus <400> 14 Met Gly Phe Gly Tyr Gly Arg Ile Arg Ser Asp Pro Ile Arg Ala Arg 1 5 10 15 Ala Val Gly Phe Ala Pro Leu Pro Gly Ala Ala Ser Ala Arg Pro Ala 20 25 30 Leu Val Asp Thr Arg Arg Pro Pro Arg Asp Pro Ser Pro Pro Arg Thr 35 40 45 Arg His Trp Arg Arg Asn Leu Arg Gly Pro Cys Thr Pro Gly Ser Ala 50 55 60 His Phe His Ser Ser Ser Ser Gly Phe Arg Pro Leu Arg Pro Phe Arg 65 70 75 80 Ala Pro Pro Gln Ala Cys Gly Cys Leu Gly Pro Arg Leu Arg Ala Arg 85 90 95 Arg Val Ala Gly Gly Phe Leu Ala Gly Gly Gly Pro Val Pro Ala Leu 100 105 110 His Gly Glu Gly Gly Pro Arg Pro Thr Gly Leu Pro Pro Val His Leu 115 120 125 Ser Ala Asn Ala Thr His Gly Ala Val Leu Arg Thr Arg Ala Thr Pro 130 135 140 Arg Pro Phe Val Ser Ala Ser Arg Ala Gly Gly Thr Asp Cys Asp Gln 145 150 155 160 Asp Pro Arg Gly Pro Arg Ala Pro Pro Trp Ala Arg Val Pro Leu Ala 165 170 175 Ser Gly Thr Gly Gly Val Ser Glu Leu Trp Gln Gly Gly Gly Ala Ala 180 185 190 Pro Cys Pro Arg Pro Gly Arg Gly Lys Gly Arg Ala Lys Arg Trp Asp 195 200 205 Thr Trp Gly Arg Pro Arg Gly Trp Gly Arg Pro Arg Pro Gly Cys Pro 210 215 220 Asp Arg Ala Arg Glu Ala Gly Ser Ala Val Glu Ala His 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tatctgggta 420 agcaagcccc ctcttgactg gaactccaaa ctaggacacg tatgtctggt tgccactctc 480 tagatgtcat acagacccta catagccacc tccgagccag gatataagag cctagctgct 540 ggaattttgt cagccttgag gggactctaa gctgcaacca tacttgtgag agaaaaggag 600 tgttgaacca aggcaactca ctagaagaca ggtatgagac agattaaatg atggtcctcc 660 atcttgttca tatttggtca ctgacagaag actatcaaca ccagcatcgc ccttggacta 720 acccttggac tgagctgaac atgatcattt aggtcgataa taaaacatca atatgtaggc 780 tatttggagg cggggaaagc caggtgacta agctgtagtt ctgcctccct tccaacaggt 840 ctcccagtaa gcagtgaacc tgggttagga acagagacct ctctctccac gttgcatgtg 900 cacctggcag tgatctagac ctcttggttt aaccaggaac ttgggtttgg gtagtactgg 960 tcacctgcgg aaggccgccc tggatttaga aaacgcaagg tggagtccaa atactgggga 1020 ccggataaca cgttgggtgg acctggctgt gcaagattta aactaatggc tttggctgtg 1080 gacagattag gtctgatcca attagagcct aggccgtagt attcgcctcc ttgccaggct 1140 ctgtcgatgt tctccctgct ctccggaaga agacttagag tcggactgga gaaccttctg 1200 gacaccgaat tctggattgg caccggacag tccgtgcccc gggctccgct ctctccacac 1260 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Met Pro Pro Ala Ile Pro Glu Ala Thr Glu Thr Ser 145 150 155 gga cct ccc tcc cct gct gtc cat gat aag cct agt gta ggc cct gaa 2331 Gly Pro Pro Ser Pro Ala Val His Asp Lys Pro Ser Val Gly Pro Glu 160 165 170 ctc cct aaa gag atc ccc ttg gag gtt cgg ctg aac ctg gga ggc agc 2379 Leu Pro Lys Glu Ile Pro Leu Glu Val Arg Leu Asn Leu Gly Gly Ser 175 180 185 aca cca gag ccc act ttt ccc ctt cag ggc act ctc gag acc caa cca 2427 Thr Pro Glu Pro Thr Phe Pro Leu Gln Gly Thr Leu Glu Thr Gln Pro 190 195 200 gcc tca gat ata att gac att gat tac ttt gaa gga ttg gat agt gag 2475 Ala Ser Asp Ile Ile Asp Ile Asp Tyr Phe Glu Gly Leu Asp Ser Glu 205 210 215 220 ggt cgt ggt gca gac atg ggc agc ttc ccg ggg tca cca gga acc tca 2523 Gly Arg Gly Ala Asp Met Gly Ser Phe Pro Gly Ser Pro Gly Thr Ser 225 230 235 gaa aat cac cct gat acc gaa gga gag acc cct tcc tgg agc ctg ctt 2571 Glu Asn His Pro Asp Thr Glu Gly Glu Thr Pro Ser Trp Ser Leu Leu 240 245 250 gat ttg tat gat gac ttc acc cct ttt gat gag tct gat ttc tac ccc 2619 Asp Leu Tyr Asp Asp Phe Thr Pro Phe Asp Glu Ser Asp Phe Tyr Pro 255 260 265 acc aca tcc ttc tat gat gat ttg gaa gag gag gaa gaa gag gag gag 2667 Thr Thr Ser Phe Tyr Asp Asp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 270 275 280 gat aag gat aca gta gga ggt gga gac ctg gaa gat gaa aac gac ctt 2715 Asp Lys Asp Thr Val Gly Gly Gly Asp Leu Glu Asp Glu Asn Asp Leu 285 290 295 300 ctc ctg ccc tct caa aag cct ggt gtg ggg cct ggg aca gga cag ccc 2763 Leu Leu Pro Ser Gln Lys Pro Gly Val Gly Pro Gly Thr Gly Gln Pro 305 310 315 acc aac cgg tgg cat gct gtt ccc cca cag cat act ctg ggg atg gta 2811 Thr Asn Arg Trp His Ala Val Pro Pro Gln His Thr Leu Gly Met Val 320 325 330 cct ggc agc agc atc tct ctt agg ccc cgc ccc gga gat cca ggc aag 2859 Pro Gly Ser Ser Ile Ser Leu Arg Pro Arg Pro Gly Asp Pro Gly Lys 335 340 345 gac ctg gcc tca gga gaa aat ggc aca gag tgc cga gtt ggc ttc gtc 2907 Asp Leu Ala Ser Gly Glu Asn Gly Thr Glu Cys Arg Val Gly Phe Val 350 355 360 agg cac aat ggc tcc tgc cgg tca gtc tgt gac ctc ttt ccg agt tac 2955 Arg His Asn Gly Ser Cys Arg Ser Val Cys Asp Leu Phe Pro Ser Tyr 365 370 375 380 tgt cac aac ggc ggc cag tgc tac ctg gtg gag aac ata ggg gct ttc 3003 Cys His Asn Gly Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile Gly Ala Phe 385 390 395 tgc agg tgt aac acc cag gac tac atc tgg cac aag ggg atg cgc tgt 3051 Cys Arg Cys Asn Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg Cys 400 405 410 gag tcc atc atc acg gac ttc cag gtg atg tgc gtg gcc gtt ggc tcg 3099 Glu Ser Ile Ile Thr Asp Phe Gln Val Met Cys Val Ala Val Gly Ser 415 420 425 gct gct ctc gtg ctt ctc ctc ctg ttc atg atg act gtg ttc ttt gcc 3147 Ala Ala Leu Val Leu Leu Leu Leu Phe Met Met Thr Val Phe Phe Ala 430 435 440 aag aag ctc tat ctg ctc aag act gag aat acc aag ctg cgg agg acc 3195 Lys Lys Leu Tyr Leu Leu Lys Thr Glu Asn Thr Lys Leu Arg Arg Thr 445 450 455 460 aat aaa ttc cgg acc cca tct gag ctc cac aac gac aac ttc tcc ctc 3243 Asn Lys Phe Arg Thr Pro Ser Glu Leu His Asn Asp Asn Phe Ser Leu 465 470 475 tcc acc att gcc gag ggc tct cat cca aat gta agg aaa ttt tgc gac 3291 Ser Thr Ile Ala Glu Gly Ser His Pro Asn Val Arg Lys Phe Cys Asp 480 485 490 act ccc cgt gtc tcc tcc ccc cat gcc cgt gcc ttg gct cac tat gat 3339 Thr Pro Arg Val Ser Ser Pro His Ala Arg Ala Leu Ala His Tyr Asp 495 500 505 aac att gtc tgt cag gac gac ccc agc gct ccc cac aaa atc cag gac 3387 Asn Ile Val Cys Gln Asp Asp Pro Ser Ala Pro His Lys Ile Gln Asp 510 515 520 cct ctc aag tcc cgc ctg aag gag gaa gag tcc ttt aac atc cag aac 3435 Pro Leu Lys Ser Arg Leu Lys Glu Glu Glu Ser Phe Asn Ile Gln Asn 525 530 535 540 tcc atg tca ccc aaa ctt gag ggt ggc aaa ggt gac cag gat gac ttg 3483 Ser Met Ser Pro Lys Leu Glu Gly Gly Lys Gly Asp Gln Asp Asp Leu 545 550 555 ggg gtg aac tgt ctg cag aat aac cta acc tga gactgaggaa gaagagagga 3536 Gly Val Asn Cys Leu Gln Asn Asn Leu Thr 560 565 aaggggggtg ggggagggaa ggactgttgt ctcctctcgg gcagagtcgg cttcttgtaa 3596 ccatttgtta agcttttctt tttctgatct catggcatgc tctgatgtgt tttgtaggag 3656 gggaaacact taaaataagc 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Ala Thr Glu Thr Ser Gly Pro Pro Ser 145 150 155 160 Pro Ala Val His Asp Lys Pro Ser Val Gly Pro Glu Leu Pro Lys Glu 165 170 175 Ile Pro Leu Glu Val Arg Leu Asn Leu Gly Gly Ser Thr Pro Glu Pro 180 185 190 Thr Phe Pro Leu Gln Gly Thr Leu Glu Thr Gln Pro Ala Ser Asp Ile 195 200 205 Ile Asp Ile Asp Tyr Phe Glu Gly Leu Asp Ser Glu Gly Arg Gly Ala 210 215 220 Asp Met Gly Ser Phe Pro Gly Ser Pro Gly Thr Ser Glu Asn His Pro 225 230 235 240 Asp Thr Glu Gly Glu Thr Pro Ser Trp Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Asp 245 250 255 Asp Phe Thr Pro Phe Asp Glu Ser Asp Phe Tyr Pro Thr Thr Ser Phe 260 265 270 Tyr Asp Asp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Lys Asp Thr 275 280 285 Val Gly Gly Gly Asp Leu Glu Asp Glu Asn Asp Leu Leu Leu Pro Ser 290 295 300 Gln Lys Pro Gly Val Gly Pro Gly Thr Gly Gln Pro Thr Asn Arg Trp 305 310 315 320 His Ala Val Pro Pro Gln His Thr Leu Gly Met Val Pro Gly Ser Ser 325 330 335 Ile Ser Leu Arg Pro Arg Pro Gly Asp Pro Gly Lys Asp Leu Ala Ser 340 345 350 Gly Glu Asn Gly Thr Glu Cys Arg Val Gly Phe Val Arg His Asn Gly 355 360 365 Ser Cys Arg Ser Val Cys Asp Leu Phe Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly 370 375 380 Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn 385 390 395 400 Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg Cys Glu Ser Ile Ile 405 410 415 Thr Asp Phe Gln Val Met Cys Val Ala Val Gly Ser Ala Ala Leu Val 420 425 430 Leu Leu Leu Leu Phe Met Met Thr Val Phe Phe Ala Lys Lys Leu Tyr 435 440 445 Leu Leu Lys Thr Glu Asn Thr Lys Leu Arg Arg Thr Asn Lys Phe Arg 450 455 460 Thr Pro Ser Glu Leu His Asn Asp Asn Phe Ser Leu Ser Thr Ile Ala 465 470 475 480 Glu Gly Ser His Pro Asn Val Arg Lys Phe Cys Asp Thr Pro Arg Val 485 490 495 Ser Ser Pro His Ala Arg Ala Leu Ala His Tyr Asp Asn Ile Val Cys 500 505 510 Gln Asp Asp Pro Ser Ala Pro His Lys Ile Gln Asp Pro Leu Lys Ser 515 520 525 Arg Leu Lys Glu Glu Glu Ser Phe Asn Ile Gln Asn Ser Met Ser Pro 530 535 540 Lys Leu Glu Gly Gly Lys Gly Asp Gln Asp Asp Leu Gly Val Asn Cys 545 550 555 560 Leu Gln Asn Asn Leu Thr 565 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T3 primer <400> 17 aattaaccct cactaaaggg 20 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T7 primer <400> 18 taatacgact cactatagg 19 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> canis RT primer sense <400> 19 aagttactgt cacaacggcg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> canis RT primer antisense <400> 20 tcatcatgaa gagcaggagc 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> human RT primer sense <400> 21 aagttactgt cacaatggcg g 21 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> human RT primer antisense <400> 22 tcatcatgaa gagcaggagc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mouse RT primer sense <400> 23 gagttactgt cacaacggcg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mouse RT primer antisense <400> 24 tcatcatgaa caggaggaga 20 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH primer <400> 25 gggctgcttt taactctg 18 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH primer <400> 26 ccaggaaatg agcttgac 18 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH primer <400> 27 cttcaccacc atggagaagg 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH primer <400> 28 tgaagtcgca ggagacaacc 20 <210> 29 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> homo CSPG5 kpn clo <400> 29 ggtaccatgg ggcgagccgg gggcgggggc ccgggccggg ggccgccgcc a 51 <210> 30 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> homocspg ecoRI clo <400> 30 gaattcttag gttaaattat tctgaagaca gttcacatcc aagtcagcc 49 <210> 31 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 31 gaattcgcac atcacctgga agtcggtgat gatgga 36 <210> 32 <211> 1998 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Fc fusion protein <220> <221> CDS <222> (1)..(1998) <223> <400> 32 acc acg aag ctt gcc gcc acc atg ggg cga gcc ggg ggc ggg ggc ccg 48 Thr Thr Lys Leu Ala Ala Thr Met Gly Arg Ala Gly Gly Gly Gly Pro 1 5 10 15 ggc cgg ggg ccg ccg cca ctg ctg ctg ttt ctg ggg gcc gcg ctg gtc 96 Gly Arg Gly Pro Pro Pro Leu Leu Leu Phe Leu Gly Ala Ala Leu Val 20 25 30 ctg gcc tct ggg gcc gtg ccg gcg cgt gag gcg ggc agc gcg gtt gag 144 Leu Ala Ser Gly Ala Val Pro Ala Arg Glu Ala Gly Ser Ala Val Glu 35 40 45 gcc gaa gag ctg gtg aag ggc agc ccg gcg tgg gag ccg cct gcc aac 192 Ala Glu Glu Leu Val Lys Gly Ser Pro Ala Trp Glu Pro Pro Ala Asn 50 55 60 gac acg cgg gaa gaa gcc ggc cca cca gcg gct ggg gaa gat gag gcg 240 Asp Thr Arg Glu Glu Ala Gly Pro Pro Ala Ala Gly Glu Asp Glu Ala 65 70 75 80 tcg tgg acg gcg ccc ggt ggc gag ctg gcc ggg cca gaa gag gtg ctg 288 Ser Trp Thr Ala Pro Gly Gly Glu Leu Ala Gly Pro Glu Glu Val Leu 85 90 95 cag gag tcg gct gcg gtg acc ggc acc gcc tgg ctg gaa gct gac agc 336 Gln Glu Ser Ala Ala Val Thr Gly Thr Ala Trp Leu Glu Ala Asp Ser 100 105 110 cca ggc ctg gga gga gtg acc gca gag gcg ggc agc ggc gat gcc cag 384 Pro Gly Leu Gly Gly Val Thr Ala Glu Ala Gly Ser Gly Asp Ala Gln 115 120 125 gcc ctt cca gct acg ctc cag gct ccc cac gag gtc ctc ggg cag tca 432 Ala Leu Pro Ala Thr Leu Gln Ala Pro His Glu Val Leu Gly Gln Ser 130 135 140 atc atg ccc cct gcc att cct gag gct aca gag gcc agc ggg cca ccc 480 Ile Met Pro Pro Ala Ile Pro Glu Ala Thr Glu Ala Ser Gly Pro Pro 145 150 155 160 tcc ccc acc ccc ggc gac aag ctg agc cca gct tct gaa ctc ccc aag 528 Ser Pro Thr Pro Gly Asp Lys Leu Ser Pro Ala Ser Glu Leu Pro Lys 165 170 175 gag agc ccc ttg gag gtt tgg ctg aac ctg ggg ggc agc aca ccc gac 576 Glu Ser Pro Leu Glu Val Trp Leu Asn Leu Gly Gly Ser Thr Pro Asp 180 185 190 cct caa ggg cca gag ctg act tac cca ttt cag ggc acc ctg gag ccc 624 Pro Gln Gly Pro Glu Leu Thr Tyr Pro Phe Gln Gly Thr Leu Glu Pro 195 200 205 caa ccg gca tca gat atc att gac atc gac tac ttc gaa gga ctg gat 672 Gln Pro Ala Ser Asp Ile Ile Asp Ile Asp Tyr Phe Glu Gly Leu Asp 210 215 220 ggt gag ggt cgt ggc gca gat ctg ggg agc ttc cca ggg tca cca gga 720 Gly Glu Gly Arg Gly Ala Asp Leu Gly Ser Phe Pro Gly Ser Pro Gly 225 230 235 240 acc tca gag aac cac cct gat act gag gga gag acc cct tcc tgg agc 768 Thr Ser Glu Asn His Pro Asp Thr Glu Gly Glu Thr Pro Ser Trp Ser 245 250 255 ctg ctt gac tta tac gat gat ttc acc ccc ttc gat gaa tct gat ttc 816 Leu Leu Asp Leu Tyr Asp Asp Phe Thr Pro Phe Asp Glu Ser Asp Phe 260 265 270 tac ccc acc aca tcc ttt tat gat gac ttg gat gaa gag gag gag gaa 864 Tyr Pro Thr Thr Ser Phe Tyr Asp Asp Leu Asp Glu Glu Glu Glu Glu 275 280 285 gag gag gat gac aaa gat gca gta gga ggt gga gac cta gaa gat gaa 912 Glu Glu Asp Asp Lys Asp Ala Val Gly Gly Gly Asp Leu Glu Asp Glu 290 295 300 aat gag ctt cta gtg ccc act ggg aag cct ggt ctg ggg ccc ggg aca 960 Asn Glu Leu Leu Val Pro Thr Gly Lys Pro Gly Leu Gly Pro Gly Thr 305 310 315 320 ggc cag ccc acc agt cgg tgg cat gct gtc cct cca cag cac act ctg 1008 Gly Gln Pro Thr Ser Arg Trp His Ala Val Pro Pro Gln His Thr Leu 325 330 335 ggg tcg gtc ccc ggc agc agc atc gcc ctc agg ccc cgc cca gga gag 1056 Gly Ser Val Pro Gly Ser Ser Ile Ala Leu Arg Pro Arg Pro Gly Glu 340 345 350 cca ggc agg gac ttg gcc tcc agt gaa aat ggc act gag tgc cgc agt 1104 Pro Gly Arg Asp Leu Ala Ser Ser Glu Asn Gly Thr Glu Cys Arg Ser 355 360 365 ggc ttt gtg cgg cat aac ggc tcc tgc cgg tca gtg tgc gac ctc ttc 1152 Gly Phe Val Arg His Asn Gly Ser Cys Arg Ser Val Cys Asp Leu Phe 370 375 380 cca agt tac tgt cac aat ggc ggc cag tgc tac ctg gtg gag aac ata 1200 Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile 385 390 395 400 ggg gcc ttc tgc agg tgc aac acg cag gac tac atc tgg cac aag ggg 1248 Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly 405 410 415 atg cgc tgc gag tcc atc atc acc gac ttc cag ccg aat tct gca gat 1296 Met Arg Cys Glu Ser Ile Ile Thr Asp Phe Gln Pro Asn Ser Ala Asp 420 425 430 atc ccc aga ggg ccc aca atc aag ccc tgt cct cca tgc aaa tgc cca 1344 Ile Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro 435 440 445 gca cct aac ctc ttg ggt gga cca tcc gtc ttc atc ttc cct cca aag 1392 Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 450 455 460 atc aag gat gta ctc atg atc tcc ctg agc ccc ata gtc aca tgt gtg 1440 Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val 465 470 475 480 gtg gtg gat gtg agc gag gat gac cca gat gtc cag atc agc tgg ttt 1488 Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe 485 490 495 gtg aac aac gtg gaa gta cac aca gct cag aca caa acc cat aga gag 1536 Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu 500 505 510 gat tac aac agt act ctc cgg gtg gtc agt gcc ctc ccc atc cag cac 1584 Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His 515 520 525 cag gac tgg atg agt ggc aag gag ttc aaa tgc aag gtc aac aac aaa 1632 Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys 530 535 540 gac ctc cca gcg ccc atc gag aga acc atc tca aaa ccc aaa ggg tca 1680 Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser 545 550 555 560 gta aga gct cca cag gta tat gtc ttg cct cca cca gaa gaa gag atg 1728 Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met 565 570 575 act aag aaa cag gtc act ctg acc tgc atg gtc aca gac ttc atg cct 1776 Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro 580 585 590 gaa gac att tac gtg gag tgg acc aac aac ggg aaa aca gag cta aac 1824 Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn 595 600 605 tac aag aac act gaa cca gtc ctg gac tct gat ggt tct tac ttc atg 1872 Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met 610 615 620 tac agc aag ctg aga gtg gaa aag aag aac tgg gtg gaa aga aat agc 1920 Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser 625 630 635 640 tac tcc tgt tca gtg gtc cac gag ggt ctg cac aat cac cac acg act 1968 Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr 645 650 655 aag agc ttc tcc cgg act ccg ggt aaa tga 1998 Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 660 665 <210> 33 <211> 665 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fc fusion protein <400> 33 Thr Thr Lys Leu Ala Ala Thr Met Gly Arg Ala Gly Gly Gly Gly Pro 1 5 10 15 Gly Arg Gly Pro Pro Pro Leu Leu Leu Phe Leu Gly Ala Ala Leu Val 20 25 30 Leu Ala Ser Gly Ala Val Pro Ala Arg Glu Ala Gly Ser Ala Val Glu 35 40 45 Ala Glu Glu Leu Val Lys Gly Ser Pro Ala Trp Glu Pro Pro Ala Asn 50 55 60 Asp Thr Arg Glu Glu Ala Gly Pro Pro Ala Ala Gly Glu Asp Glu Ala 65 70 75 80 Ser Trp Thr Ala Pro Gly Gly Glu Leu Ala Gly Pro Glu Glu Val Leu 85 90 95 Gln Glu Ser Ala Ala Val Thr Gly Thr Ala Trp Leu Glu Ala Asp Ser 100 105 110 Pro Gly Leu Gly Gly Val Thr Ala Glu Ala Gly Ser Gly Asp Ala Gln 115 120 125 Ala Leu Pro Ala Thr Leu Gln Ala Pro His Glu Val Leu Gly Gln Ser 130 135 140 Ile Met Pro Pro Ala Ile Pro Glu Ala Thr Glu Ala Ser Gly Pro Pro 145 150 155 160 Ser Pro Thr Pro Gly Asp Lys Leu Ser Pro Ala Ser Glu Leu Pro Lys 165 170 175 Glu Ser Pro Leu Glu Val Trp Leu Asn Leu Gly Gly Ser Thr Pro Asp 180 185 190 Pro Gln Gly Pro Glu Leu Thr Tyr Pro Phe Gln Gly Thr Leu Glu Pro 195 200 205 Gln Pro Ala Ser Asp Ile Ile Asp Ile Asp Tyr Phe Glu Gly Leu Asp 210 215 220 Gly Glu Gly Arg Gly Ala Asp Leu Gly Ser Phe Pro Gly Ser Pro Gly 225 230 235 240 Thr Ser Glu Asn His Pro Asp Thr Glu Gly Glu Thr Pro Ser Trp Ser 245 250 255 Leu Leu Asp Leu Tyr Asp Asp Phe Thr Pro Phe Asp Glu Ser Asp Phe 260 265 270 Tyr Pro Thr Thr Ser Phe Tyr Asp Asp Leu Asp Glu Glu Glu Glu Glu 275 280 285 Glu Glu Asp Asp Lys Asp Ala Val Gly Gly Gly Asp Leu Glu Asp Glu 290 295 300 Asn Glu Leu Leu Val Pro Thr Gly Lys Pro Gly Leu Gly Pro Gly Thr 305 310 315 320 Gly Gln Pro Thr Ser Arg Trp His Ala Val Pro Pro Gln His Thr Leu 325 330 335 Gly Ser Val Pro Gly Ser Ser Ile Ala Leu Arg Pro Arg Pro Gly Glu 340 345 350 Pro Gly Arg Asp Leu Ala Ser Ser Glu Asn Gly Thr Glu Cys Arg Ser 355 360 365 Gly Phe Val Arg His Asn Gly Ser Cys Arg Ser Val Cys Asp Leu Phe 370 375 380 Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile 385 390 395 400 Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly 405 410 415 Met Arg Cys Glu Ser Ile Ile Thr Asp Phe Gln Pro Asn Ser Ala Asp 420 425 430 Ile Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro 435 440 445 Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 450 455 460 Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val 465 470 475 480 Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe 485 490 495 Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu 500 505 510 Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His 515 520 525 Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys 530 535 540 Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser 545 550 555 560 Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met 565 570 575 Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro 580 585 590 Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn 595 600 605 Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met 610 615 620 Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser 625 630 635 640 Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr 645 650 655 Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 660 665

Claims (5)

1. CSPG5 단백질, 또는 연속하는 7 이상의 아미노산 잔기로 이루어지는 그 단편과 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 프래그먼트를 유효성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는, 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 CSPG5 단백질이,
   서열번호 8, 4, 6, 10, 및 12로 나타내어지는 어느 하나의 아미노산 서열, 또는
   상기 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 의약 조성물.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 암이 백혈병 또는 악성 림프종인 의약 조성물.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 항체가 단일클론 항체 또는 다중클론 항체인 의약 조성물.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 항체가 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 2중특이성 항체인 의약 조성물.

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