JP4315257B2 - 新規コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、そのコア蛋白質、それをコードするｄｎａおよびそれに対する抗体 - Google Patents

Description

本発明は、新規なコンドロイチン硫酸プロテオグリカン、そのコア蛋白質、それをコードするＤＮＡおよびそれに対する抗体に関する。

プロテオグリカンはグリコサミノグリカンが共有結合的に蛋白質（コア蛋白質）に結合した化合物の総称である。それらは細胞表面と細胞外空間に局在し、ケモトロフィック(chemotrophic)因子、細胞接着分子さらには細胞外マトリックス糖タンパク質（非特許文献１、２）等に結合することによって体細胞上でさまざまな調節効果をもつと推定されている。

また哺乳動物の脳のタンパク質についての最近の生化学的研究において、脳の発生過程で様々なプロテオグリカンが正確に調節されて発現することが明らかにされた（非特許文献３、４）。このようなプロテオグリカンの分子発生学的に調節された発現は神経膠繊維（非特許文献５）、視覚システム（非特許文献６）、そして大脳皮質のバレル(barrel)システム（非特許文献７−９）のような脳中のいくつかの複雑な構造形成に関与している。インビトロでの研究で、同様に神経系プロテオグリカンがたとえば軸索発生におけるニューロンの形態形成に関与することが示された。このプロテオグリカンはインビトロでの軸索の成長におけるポジテイブ（非特許文献１０、１１）とネガテイブ（非特許文献１２−１５）の両方の効果に関与する。

神経系プロテオグリカンの機能については、他の体細胞におけるコア蛋白質の一次構造が明らかにされてきているのでそれに伴って様々なことが明らかになってきている。そのような研究の進展の成果として、多くのプロテオグリカンのコア蛋白質が似たような配列モチーフを有しており、いくつかのファミリーにグループ化できることを明らかにされた。ニューロカン(Neurocan)（非特許文献１６）、ブレビカン(brevican)（非特許文献１７）、バーシカン(versican)（非特許文献１８）そしてＢＥＨＡＢ（非特許文献１９）は可溶性コンドロイチン硫酸プロテオグリカンファミリーのメンバーである。これらの配列はヒアルロン酸結合ドメインのタンデム繰り返し構造を含んでいる。Ｎ−シンデカン(N-syndecan)（非特許文献２０）は多くの似たような膜貫通ドメインと細胞質ドメインを含むヘパラン硫酸プロテオグリカンであるシンデカンファミリーのメンバーである。さらに最近、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンであるフォスファカン（phosphacan）／６Ｂ４プロテオグリカンが受容体様タンパク質であるチロシンフォスファターゼ、ＲＰＴＰβ／ζ（非特許文献２１、２２）の細胞質外性変異体であることが明らかにされた。

前記したように最近多数のコア蛋白質の一次構造が報告されてきた。しかしながら、脳においては多くのプロテオグリカンがまだ未同定のままである。ラット脳の膜結合分画において少なくとも１６種類のコア蛋白質があるが（非特許文献４）、わずかに３種類の膜結合型プロテオグリカンの完全な一次構造が報告されているのみである。つまりＮＧ２（非特許文献２３）、グリピカン（glypican）（非特許文献２４）そしてセレブログリカン（cerebroglycan)（非特許文献２５）である。
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新規のプロテオグリカンを発見し精製、同定することは、脳研究の進展をもたらし、脳疾患の新規の診断方法の確立、脳疾患の新規の治療方法および予防方法の開発につながる。とくに本発明の膜結合型新規プロテオグリカンは神経の軸索発生に関与しこれらを通じて神経系形態形成に関与していると推定される。本発明者らは、このような脳の新規なプロテオグリカンの探索を行ない、新規なプロテオグリカンを見出した。従って、本発明の課題は、脳における新規なプロテオグリカンを発見し、精製そして同定し、これを提供することである。さらに、本発明の課題は、このような新規プロテオグリカンの発見のためには、ツールとしての脳に特異的な膜結合型プロテオグリカンに対する抗体の作成が必要とされており、このような抗体を提供することにある。またさらに本発明のプロテオグリカン又は蛋白質をコードするＤＮＡを提供することにある。

本発明者らは前記課題を解決するために、最初に新規のプロテオグリカンの分離同定を試みた。次いで分離した新規プロテオグリカンに対する抗体作成を試み、得られた抗体を利用して前記新規プロテオグリカンに対するｃＤＮＡを得、全遺伝子構造を解析した後このコンドロイチン硫酸プロテオグリカンが脳に特異的なものであることを確認し、本発明を完成させるに至った。

本発明の新規コンドロイチン硫酸プロテオグリカンは神経回路網の正常な形成に寄与すると考えられるので神経疾患等の新規診断法の開発、神経疾患等の予防や治療に用いることができる。

次に、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの抽出と部分精製以下の方法で新規コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの抽出を行うことができる。哺乳動物（例えばラット等）の脳をタンパク質分解酵素阻害剤（例えば２ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド等）、金属キレート剤（例えば２０ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等）及び還元剤（例えば１０ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド等）を含む緩衝液（例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）等）でホモジナイザー等を用いてホモジナイズし、ホモジネートは高速遠心等を行い、不溶性物質を得る（再度ホモジネーションと高速遠心等を繰り返してもよい）。この不溶性物質をタンパク質分解酵素阻害剤と界面活性剤（例えばトリトン系界面活性剤（ノニデットＰ−４０（商品名）等）等）を含む緩衝液中でホモジナイズした後、遠心等を行なって上清としてコンドロイチン硫酸プロテオグリカン粗画分が得られる。

このようにして得られたコンドロイチン硫酸プロテオグリカン粗画分よりコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの部分精製を行うことができる。すなわち該粗画分をそのまま又は凍結乾燥等の後、界面活性剤（例えばトリトン系界面活性剤（ノニデットＰ−４０（商品名）等）等）、金属キレート剤（例えばＥＤＴＡ等）、還元剤（例えばＮ−エチルマレイミド等）及び蛋白質分解酵素阻害剤（例えばフェニルメチルスルフォニルフルオライド等）を含む高濃度尿素液（例えば４Ｍ尿素）を含む緩衝液（尿素緩衝液）の適量に分散する。その後同尿素緩衝液で透析する。高速遠心（例えば27,000ｇ，３０分間）後、上清を尿素緩衝液で平衡化した陰イオン交換樹脂（例えばＤＥＡＥセファセル等）と混合する。該陰イオン交換樹脂を常法に従って回収し、カラムに詰め、尿素緩衝液中で食塩の濃度勾配（例えば 0.1Ｍから 0.7Ｍへの直線濃度勾配）によってコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを溶出する。プロテオグリカン画分（0.45から0.68Ｍ ＮａＣｌの濃度で溶出される画分）を集め、常法に従って（例えば限外濾過等）、濃縮する。濃縮試料について次にセファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア製）等のゲル濾過剤を用いてゲル濾過クロマトグラフを行う。

コンドロイチン硫酸プロテオグリカン画分（Ｋａｖは0.11から0.65）を集め、常法で濃縮（例えば限外濾過等）する。プロテオグリカンを酢酸カリウム（例えば約 1.3％（ｗ／ｖ）を含むエタノール水溶液（例えば約９５％濃度のエタノール）の添加によって溶液から沈澱させる。沈澱物は氷冷下、酢酸カリウム（例えば１％（Ｗ／Ｖ））を含むエタノール水溶液（例えば約７５％エタノール）で洗浄し、減圧乾燥する。乾燥物を適量のグアニジン塩酸（好ましくは４Ｍ）を含む緩衝液（グアニジン緩衝液）等に溶解し、オクチルセファロース等を用いて疎水クロマトグラフィーを行い、界面活性剤（例えばトリトン系界面活性剤（ノニデットＰ−４０（商品名）等）等）の濃度勾配によって溶出する。コンドロイチン硫酸プロテオグリカン画分（例えばノニデットＰ−４０の場合 0.3％から 0.6％のノニデットＰ−４０濃度の画分）を集め、上述したようにエタノール等で沈澱し、乾燥する。こうして得たコンドロイチン硫酸プロテオグリカンは、グアニジン緩衝液中で塩化セシウム（ＣｓＣｌ）密度勾配遠心法（例えば初期密度1.38ｇ／ｍｌ）によって常法に従い遠心（例えば150,000Xg で３０時間）してさらに精製してもよい。こうして精製されたコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを得ることができる。こうして得られるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンはドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で還元条件下において約１５０キロダルトン（ｋＤａ）のバンドを形成する。

また本発明により、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質のアミノ酸配列が明らかにされたので、アミノ酸からコア蛋白質を合成し、当該コア蛋白質に糖鎖を共有結合させることによっても本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを得ることができる。また本発明により、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列が明らかにされたので、このＤＮＡから当該コア蛋白質を発現させ、発現させて得られるコア蛋白質に糖鎖を共有結合させることによっても本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを得ることができる。

＜２＞コア蛋白質の精製
次にコア蛋白質は、部分的に前田ら（非特許文献２２）によって記述されたプロテオグリカン型蛋白質であるチロシンホスファターゼの部分精製のために使われた方法に従って精製することができる。すなわち、哺乳動物全脳から調製した核除去分画を１％ＣＨＡＰＳ等で可溶化する。可溶化したものはＤＥＡＥ−樹脂（例えばＤＥＡＥトヨパール）等の陰イオン交換樹脂のカラムに負荷し常法によって、高濃度食塩（例えば約 0.6Ｍ）溶液等で溶出する。続いてＣｓＣｌ密度勾配遠心にて分画する。得られた分画をコンドロイチナーゼＡＢＣで消化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（例えば６％ポリアクリルアミド等）等によって分離しコア蛋白質を得ることができる。こうして得られたコア蛋白質は還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で１２０ｋＤａのバンドを形成する。またこのコア蛋白質はウエスタンブロットを用いて、後述の新規のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを認識するモノクローナル抗体によって認識される。また本発明により、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質のアミノ酸配列が明らかにされたので、アミノ酸からコア蛋白質を合成することもできる。また本発明により、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列が明らかにされたので、このＤＮＡから当該コア蛋白質を発現させ、コア蛋白質を得ることもできる。

＜３＞本発明の抗体の製造
本発明の抗体は、本発明のプロテオグリカンおよび本発明の蛋白質の両者あるいはどちらか一方と結合する抗体であり、ポリクローナル、モノクローナルのいずれでもよい。本発明の抗体は、上記のようにして製造された本発明のプロテオグリカンもしくはそのコア蛋白質またはこれらと他の蛋白質との融合蛋白質を抗原として、常法に従って例えば以下のように作製することが可能である。ポリクローナルな本発明の抗体は、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の被免疫動物を上記抗原で免疫し、これらの動物から血清を採取することによって得ることができる。被免疫動物を免疫する際に、補助剤（アジュバント）を併用することは、抗体産生細胞を賦活するので望ましい。得られた抗血清から、常法によってイムノグロブリン分画を精製してもよい。

モノクローナルな本発明の抗体は、例えば次のようにして得られる。すなわち、上記抗原をマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の被免疫動物の腹腔内、皮下、足蹠(footpad）に投与した後に脾臓又は膝窩リンパ節を摘出し、これらから採取した細胞と腫瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを樹立し、得られたハイブリドーマを連続増殖させ、さらに得られたハイブリドーマからの本発明のプロテオグリカンまたは本発明の蛋白質に対する特異抗体を継続的に産生する細胞株を選別する。こうして選別された株を好適な培地で培養することによって、培地中にモノクローナルな本発明の抗体が得られる。あるいは、マウスの腹腔などの生体内にて前記ハイブリドーマを培養することによって、モノクローナルな本発明の抗体を大量に製造することができる。細胞融合に用いる細胞としては、脾細胞以外にリンパ節細胞および末梢血中のリンパ細胞等を用いることができる。また、ミエローマ細胞株は、異種細胞種由来のものに比べ同種細胞種由来のものが望ましく、安定な抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。

得られたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の精製法としては、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等による塩析、低温アルコール沈殿およびポリエチレングリコールまたは等電点による選択的沈殿分別法、電気泳動法、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−誘導体、ＣＭ（カルボキシメチル）−誘導体等のイオン交換体を用いたイオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡまたはプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、抗原を固定化した免疫吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過法および超遠心法等を挙げることができる。なお本発明の抗体を、抗原結合部位（Ｆａｂ）を分解しないプロテアーゼ（例えばプラスミン、ペプシン、パパイン等）で処理して得られるＦａｂを含むフラグメントとしても良い。また本発明の抗体をコードする遺伝子の塩基配列もしくは抗体のアミノ酸配列が決定されれば、遺伝子工学的に本発明の抗体のＦａｂを含むフラグメントやキメラ抗体（例えば本発明の抗体のＦａｂ部分を含むキメラ抗体等）を作製することができ、このようなフラグメントやキメラ抗体も、本発明の抗体に包含される。

本発明の抗体の製造方法の一例を以下に述べるが、これに限定されるものではない。本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを、例えば２週間間隔で完全および不完全フロイントアジュバントとともマウスの腹腔に投与する。４回目にブースターとして投与した後、マウスを屠殺し脾臓細胞はポリエチレングリコールを用いてミエローマ細胞と融合する。培地中で選択したハイブリドーマを培養後、該ハイブリドーマを培養上清を用いて本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンと反応する抗体の有無でウエスタンブロッテイングによってスクリーニングする。陽性ハイブリドーマは限界希釈法によってクローン化する。確立したハイブリドーマ細胞株はウエスタンブロットでコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（分子量約１５０ｋＤａ）又はコア蛋白質（約１２０ｋＤａ）と反応する抗体を製造した。

抗体生産はしかしながら他の方法によっても製造することができる。つまり抗体はコア蛋白質が配列表配列番号２に示す１番目のバリン（Ｖａｌ）から５１４番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までのアミノ酸と相同性を有するアミノ酸配列で示されるプロテオグリカン、配列表配列番号２に示される２５２番目のリジン（Ｌｙｓ）から３９８番目のシステイン（Ｃｙｓ）までのアミノ酸配列もしくはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していても良い蛋白質またはそれらのペプチドフラグメントをヒト以外の哺乳動物に免疫し、該動物の体液から採取することができ、または該動物の抗体産生細胞によって産生され、該プロテオグリカンおよび該蛋白質の両者あるいはどちらか一方と反応する抗体であって、そのような抗体の製造方法であれば抗体生産の方法として用いることができる。なお、得られた抗体によって認識される蛋白質もしくはそのフラグメントは脳に局在している。上記の方法で得られた抗体は、さらに公知の方法で精製してもよい。

＜４＞ｃＤＮＡライブラリーとコンドロイチン硫酸プロテオグリカンに対するｃＤＮＡクローンの分離
哺乳動物の全脳から得られるポリ（Ａ）⁺ を用いて鋳型およびランダムプライマーとして使用するｃＤＮＡライブラリー（非特許文献２２）を調製する。また哺乳動物の全脳から得られるポリ（Ａ）⁺ を用いて鋳型およびオリゴｄ（Ｔ）プライマーとして使用するｃＤＮＡライブラリーを構築する。これらのｃＤＮＡライブラリーは、先に得られたコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを認識するモノクローナル抗体等を用いて免疫学的にスクリーニングすることができる。免疫学的スクリーニングはサムブロックら(Sambrook et al)の文献（非特許文献２９）に記述されたようにして行なうことができる。陽性クローンを免疫学的スクリーニングによって分離し常法に従ってＤＮＡの配列決定等を行うことで、配列表配列番号１に示されるＤＮＡを得ることができる。こうして３０残基のシグナルペプチドと新規コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質をすべてコードする５１４残基のアミノ酸をコードするｃＤＮＡを得ることができた。

こうして見い出され同定された新規コンドロイチン硫酸プロテオグリカンは脳に局在し、他の知られているいずれのプロテオグリカンとも相同性を示さない故、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンは新規なコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであって（図１）、これらはニューロンの形態形成に関与すると考えられるので、神経系疾患等に対する診断方法、治療薬や予防薬としての使用が期待さる。また、治療あるいは予防における投与経路としては静脈注射、動脈注射、脳室内投与、ウイルス遺伝子を利用した遺伝子工学的投与手段等を用いることができる。

＜５＞本発明のプロテオグリカン
本発明のプロテオグリカンは次の性質を有するコア蛋白質と糖鎖とからなるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンである。
（Ａ）コア蛋白質の一次構造：配列表配列番号２の１番目のバリン（Ｖａｌ）から５１４番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までのアミノ酸配列もしくはそれと相同性を有するアミノ酸配列を有する。
（Ｂ）糖鎖：分子量約３０キロダルトンのコンドロイチン硫酸を含有する。
（Ｃ）本プロテオグリカンにノイラミニダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼまたはＮ−グリコシダーゼを作用させると糖鎖が遊離する。

さらに分子量が、還元条件下におけるドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において約１５０キロダルトンであることを特徴とする該コンドロイチン硫酸プロテオグリカンも本発明に含まれる。

＜６＞本発明の糖蛋白質
次の性質を有する糖蛋白質も本発明に含まれる。
（Ａ）分子量：（ａ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で還元条件下において約１２０キロダルトンのバンドを形成する、（ｂ）ノイラミニダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼおよびＮ−グリコシダーゼの酵素反応後、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で還元条件下において約１００キロダルトンのバンドを形成する、（Ｂ）蛋白質の一次構造：配列表配列番号２に示す１番目のバリン（Ｖａｌ）から５１４番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を有する。

＜７＞本発明の蛋白質
配列表配列番号２に示す１番目のバリン（Ｖａｌ）から５１４番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していてもよい蛋白質も本発明に含まれる。さらには、配列表配列番号２の２５２番目のリジン（Ｌｙｓ）から３９８番目のシステイン（Ｃｙｓ）までのアミノ酸配列は本発明のプロテオグリカンや蛋白質の特徴であるので、配列表配列番号２の２５２番目のリジン（Ｌｙｓ）から３９８番目のシステイン（Ｃｙｓ）までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していてもよい蛋白質も本発明に含まれ、上記それぞれのプロテオグリカンや蛋白質をコードするＤＮＡも本発明に含まれる。

このような蛋白質には、例えば配列表配列番号２に示す−３０番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から５１４番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していてもよい蛋白質が包含される。本発明においてアミノ酸配列において相同性を有するとは、本発明のプロテオグリカン及び蛋白質が由来する生物種が相違しても同一機能を有するプロテオグリカン及び蛋白質においては一定の割合のアミノ酸配列が維持され、共通性を有していることを意味する。例えば既知のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであるバーシカンでは、ニワトリ由来の該プロテオグリカンとヒト由来の該プロテオグリカンのコア蛋白質のうち、活性ドメインのアミノ酸配列は、９６％の相同性を有している。また既知の膜結合型プロテオグリカンであるシンデカンのコア蛋白質ではマウスとヒトとの間でアミノ酸配列に高い相同性部分を有することが知られている。したがって本発明のプロテオグリカン及び蛋白質も、種間におけるアミノ酸配列の相同性は約６０〜９０％以上と想定される。

本発明の一例のｃＤＮＡの遺伝子配列から推定される蛋白質はシグナルペプチドドメイン、コンドロイチン硫酸結合ドメイン（ＣＳアタッチメント）、塩基性アミノ酸のクラスター、システイン含有ドメイン、膜貫通ドメイン（transmembrane domain）そして細胞質ドメイン（cytoplasmic domain）の各部分からなると推定される（図１）。本発明の脳に局在する新規コンドロイチン硫酸プロテオグリカンをニューログリカンＣと命名した（以下、ＮＧＣという）。ＮＧＣのｍＲＮＡはノーザンブロットによる分析において、新生児および成熟哺乳動物の脳中に 3.1ｋｂの単一ｍＲＮＡとして検出されるが、しかし腎臓、肝臓、肺臓、筋肉のいずれからも検出されない。コア蛋白質の配列はいかなる他の既知のタンパク質とも有意のホモロジーを示さなかった。このことはニューログリカンＣ（ＮＧＣ）が新規のプロテオグリカンであることを示している。

また、本発明には配列表配列番号４の３１番目のバリン（Ｖａｌ）から５４５番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していてもよい蛋白質、配列表配列番号４の２８３番目のリジン（Ｌｙｓ）から４２９番目のシステイン（Ｃｙｓ）までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していてもよい蛋白質も包含される。これらはヒト由来の蛋白質であることから、ヒトに対して用いる医薬品として特に好ましい。このような蛋白質には、例えば配列表配列番号４に示す１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から５４５番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していてもよい蛋白質が包含される。

なお本発明蛋白質は、必ずしも単独の蛋白質でなくてもよく、必要により融合蛋白質の一部となっていてもよい。融合蛋白質は、公知の遺伝子工学的手法により製造することができ、通常、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを任意の蛋白質をコードするＤＮＡと連結させることによって得た組換えＤＮＡから発現させることによって得ることができる。

また本発明の蛋白質には、配列表配列番号２に示されるアミノ酸配列と配列番号４に示されるアミノ酸配列との間で共通するアミノ酸をその順序で含むアミノ酸配列を有し、糖鎖を有していてもよい蛋白質も包含される。配列表配列番号２に示されるアミノ酸配列と配列番号４に示されるアミノ酸配列との間で共通しないアミノ酸は任意のアミノ酸でよい。ただし、配列表配列番号４の２８２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）に対応する配列表配列番号２のアミノ酸はないものとする。

＜８＞本発明のＤＮＡ
本発明には、上記のプロテオグリカン、糖蛋白質及び蛋白質をコードするＤＮＡが包含される。例えば配列表配列番号２に示す１番目のバリン（Ｖａｌ）から５１４番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していてもよい蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡとして具体的には、配列表配列番号１の１０３番目のグアニン（Ｇ）から１６４４番目のシトシン（Ｃ）までの塩基配列を含むＤＮＡが例示される。また、配列表配列番号２の２５２番目のリジン（Ｌｙｓ）から３９８番目のシステイン（Ｃｙｓ）までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していてもよい蛋白質をコードするＤＮＡとして具体的には、配列表配列番号１の８５６番目のアデニン（Ａ）から１２９６番目のシトシン（Ｃ）までの塩基配列を含むＤＮＡが例示される。このようなＤＮＡには、配列表配列番号１に示す１３番目のアデニン（Ａ）から１６４４番目のシトシン（Ｃ）までの塩基配列を含むＤＮＡも含まれる。

配列表配列番号４の３１番目のバリン（Ｖａｌ）から５４５番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していてもよい蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡとして具体的には、配列表配列番号３の９１番目のグアニン（Ｇ）から１６３５番目のシトシン（Ｃ）までの塩基配列を含むＤＮＡが例示される。配列表配列番号４の２８３番目のリジン（Ｌｙｓ）から４２９番目のシステイン（Ｃｙｓ）までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していてもよい蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡとして具体的には、配列表配列番号３の８４７番目のアデニン（Ａ）から１２８７番目のシトシン（Ｃ）までの塩基配列を含むＤＮＡが例示される。このようなＤＮＡには、配列表配列番号３に示す１番目のアデニン（Ａ）から１６３５番目のシトシン（Ｃ）までの塩基配列を含むＤＮＡも含まれる。

なお、遺伝暗号の縮重による異なった塩基配列のＤＮＡも本発明のＤＮＡに包含されることは、当業者であれば容易に理解されるところである。これらのＤＮＡのいずれもが本発明ＤＮＡに包含される。また本発明には、本発明のＤＮＡに相補的なＤＮＡまたはＲＮＡが包含される。さらに本発明ＤＮＡは、上記蛋白質をコードするコード鎖のみの一本鎖であってもよいし、この一本鎖及びこれと相補的な配列を有するＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖とからなる二本鎖であってもよい。また本発明ＤＮＡには、公知の遺伝子工学的手法によって本発明ＤＮＡに任意の蛋白質をコードするＤＮＡや、機能を有するＤＮＡを連結させることによって得た組換えＤＮＡも包含される。なお、染色体由来の本発明蛋白質の遺伝子は、コード領域にイントロンを含むことが予想されるが、そのようなイントロンで分断されているＤＮＡ断片であっても、本発明蛋白質をコードする限り、本発明ＤＮＡに含まれる。すなわち、本明細書において「コードする」とは、転写時にプロセッシング等を受けて最終的に目的の蛋白質を生じ得る塩基配列を有することも包含する。

以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例によって何等制限されるものではない。

膜結合型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの抽出
１０日齢スプラグ−ドウリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットの脳（通常実験当たり１００匹のラット；Ｓｌｃ：ＳＤ系統；ＳＬＣ（株）製）をプロテアーゼ阻害剤として２ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオライド、２０ｍＭのＥＤＴＡ及び１０ｍＭのＮ−エチルマレイミドを含む氷冷リン酸塩緩衝食塩水(phosphate-buffered saline) （ＰＢＳ）（２ｍｌ／脳）中でテフロングラスホモジナイザーを用いてホモジナイズした。ホモジナイゼーションおよびそれに続く工程は特に示していない限り、全て４℃で行なった。ホモジネートは27,000Xgで４０分間遠心した。沈澱物を同じ溶液で再度ホモジネーションした。遠心後、ＰＢＳ−不溶性物質を前記プロテアーゼ阻害剤と１％ノニデット(Nonidet)Ｐ−４０を含むＰＢＳ（２ｍｌ／脳）中で０℃においてホモジナイズした。ホモジネートをマグネチックスターラーで６０分間撹拌し、次に27,000Xgで４０分間遠心した。上清はとっておき、沈澱物を再度界面活性剤含有緩衝液で処理し遠心した。遠心後、これらの界面活性剤含有上清を合わせ、凍結乾燥した。

膜結合型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの部分精製
実施例１で得られた凍結乾燥残渣を、0.2 ％ノニデットＰ−４０、0.1 Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド及び0.2 ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライドを含む４Ｍ尿素、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液、pH7.5 （尿素緩衝液）中に脳１個当り１ｍｌの割合で分散した、そしてこの分散液は同緩衝液を用いて透析した。27,000Xgで３０分間遠心後、上清を尿素緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファセル樹脂（ファルマシア社製）と脳１個当り１ｍｌの割合で混合し、混合物をマグネチックスターラーで２時間撹拌した。このＤＥＡＥセファセル樹脂を6,500Xg 、１０分間の遠心によって回収し、そして尿素緩衝液で２回洗浄した。この樹脂をガラスカラムに詰め、この樹脂からプロテオグリカンを0.1 Ｍから0.7 ＭのＮa Ｃｌを含む尿素緩衝液での直線濃度勾配によって溶出した。

プロテオグリカン画分（0.45から0.68ＭのＮａＣｌ濃度で溶出）を集め、そしてダイアフロー ＹＭ−１０メンブラン（アミコン（株）製）を使って５ｍｌに濃縮した。濃縮した溶液を、0.2 ％ノニデットＰ−４０と前記プロテアーゼインヒビターとを含む４Ｍグアニジン塩酸、５０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ7.5 を用いてセファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製）のカラム（直径1.6 ｃｍ×１００ｃｍ）上でクロマトグラフを行った。プロテオグリカン画分（Ｋａｖ0.11から0.65）を集め、ダイアフローＹＭ−１０メンブランを用いて３ｍｌに濃縮した。プロテオグリカンを1.3 ％（Ｗ／Ｖ）酢酸カリウムを含む３倍容の９５％エタノールを添加して溶液から沈澱した。沈澱物を０℃で１％（Ｗ／Ｖ）酢酸カリウムを含む７５％エタノールで２回洗浄し、減圧下P2O5で乾燥した。得られた乾燥物を室温で４Ｍグアニジン塩酸、５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ7.5（グアニジン塩酸緩衝液）１０ｍｌ中に溶解した。この溶液をオクチルセファロース（ファルマシア社製）のカラム（直径1.6 ｃｍ径×5.0 ｃｍ）に負荷した。ノニデットＰ−４０を０％から0.8 ％（Ｖ／Ｖ）含むグアニジン塩酸緩衝液で直線濃度勾配によって溶出を行った。0.3 ％から0.6 ％のノニデットＰ−４０濃度で溶出した画分を集め、そして集めた画分中のプロテオグリカンをエタノールで沈澱し上述したようにして乾燥した。

さらに、得られたプロテオグリカンを、初期密度1.38ｇ／ｍｌ（４Ｍグアニジン塩酸、５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ7.5)のＣｓＣｌ密度勾配によってＲＰＳ−６５Ｔローター（日立社製）を用いて１０℃で150,000Xg で３０時間超遠心することによって精製した。遠心後、試料を７分画して集めた。分画番号２から６の試料を集め、４℃でＰＢＳに対して透析を行った。プロテオグリカン溶液中のヘキスロン酸(hexuronate)とタンパク質の含量を Bitter and Muir法（非特許文献２６）及びタンパク質分析キット(Bio-Rad社製）によってそれぞれ測定した。この精製方法によって、１００個の脳からヘキスロン酸含量約３マイクロモル（蛋白質含量2.2ｍｇ）のプロテオグリカンを得た。

また、可溶性プロテオグリカンをプロテアーゼインヒビターを含むＰＢＳで１０日齢のラットの脳から公知の方法（非特許文献３）で抽出し精製した。すなわち、プロテオグリカンを、ＤＥＡＥセファロースを用いたカラムクロマトグラフィーとセファロースＣＬ−４Ｂを用いたゲル濾過によって分画し、精製した。0.45から0.60の範囲のＫａｖを有する画分をウエスタンブロット分析のために用いた。

グリコシダーゼを用いる膜結合型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの処理
プロテオグリカンのコア蛋白質からコンドロイチン硫酸側鎖とヘパラン硫酸側鎖を除去するため、膜結合型コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ウロン酸含量５０ｎｍｏｌ）をプロテアーゼの含まれていないコンドロイチナーゼＡＢＣ（ＥＣ４．２．２．４；生化学工業（株）製）で消化し、次にヘパリチーゼＩ(heparitinase I)（ＥＣ４．２．２．８；生化学工業（株）製）で消化した（非特許文献８参照）。得られた蛋白（コアグリコプロテイン）を、続いて２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド、0.2 ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド及び0.07ｍＭペプスタチンを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ5.01００μｌ中でノイラミニダーゼ２ｍＩＵ（ＥＣ ３．２．１．１８；ナカライテスク社製）で３７℃、１時間処理した。酵素反応を０℃で 1.3％酢酸カリウムを含む９５％エタノール３００μｌの添加によって停止させた。１時間後コア糖蛋白質（以下、コアグリコプロティン）を遠心によって沈澱させた。コアグリコプロテインを説明書の指示に従ってコアプロテインの変性後さらに１ ＩＵ Ｎーグリコシダーゼ Ｆ（ＥＣ ３．２．２．１８；ベーリンガーマンハイム社製）を用いるかあるいは１ｍＩＵのＯ−グリコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．９７；ベーリンガーマンハイム社製）を用いて３７℃で２４時間消化することによって脱グリコシレーションした。

ゲル電気泳動とウエスタンブロット分析
膜結合型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを６％分離ゲルと３％スタッキングゲルを用いてジチオスライトールでの還元条件下でドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離した。それらを４℃で２０％（Ｖ／Ｖ）メタノールを含む２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン（ｐＨ8.3 ）中で一昼夜６０Ｖでポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（イモビロン−Ｐ（商品名）；ミリポアー社製）に電気泳動的に移動（転写）させた。抗体の非特異的結合を阻止するため、該膜を１％スキムミルク（ＤＩＦＣＯ ラボラトリース社製）を含むＰＢＳ中でインキュベートした。次にこの膜を後記実施例５のハイブリドーマの培養上清（マウスモノクローナル抗体を含む）で４℃、一昼夜処理し、そしてベクタステイン(Vectastain)ＡＢＣキット（ベクター研究所製）を用いてＰＢＳ中で染色した。いくつかの実験においては、免疫染色の強度はイメージスキャナー（ＧＴ−６５００；エプソン社）を経てコンピューター（ＬＣ５２０；アップル社）とアプリケーションソフト、ＮＩＨイメージプログラム（パブリックドメイン）を用いて定量した。

モノクローナル抗体の製造
各種モノクローナル抗体は公知の方法（非特許文献２７参照）によって製造した。すなわち、膜結合型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの調製物（５０μｇタンパク質／投与）を２週間間隔で完全および不完全フロイントアジュバントとともＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に注射した。４回目にブースターとして投与後、マウスを屠殺し、得られた脾臓細胞をポリエチレングリコールを用いてＰＡＩミエローマ細胞と融合した。ＨＡＴ培地中で選択したハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社製）で培養した。培養されたハイブリドーマを培養上清を用いてプロテオグリカンと反応する抗体の有無でウエスタンブロッテイングによってスクリーニングした。陽性ハイブリドーマは限界希釈法によってクローン化した。選択されたハイブリドーマより得られたモノクローナル抗体Ｃ１，Ｃ３，Ｃ５及びＣ１５が実施例２の膜結合型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンと反応した。これらの４つの抗体のすべてがマウスモノクローナル抗体イソタイピングキット（イムノタイプ（商品名）；シグマ社製）を用いてＩｇＧ1 であると決定された。

コアグリコプロテインの精製
コアグリコプロティンは、前田ら（非特許文献２２）によって述べられたプロテオグリカン型タンパク質であるチロシンホスファターゼの部分精製のために使われた方法（非特許文献２２）に従って精製した。すなわち、８日齢ラットの全脳から調製した核除去画分を１％ＣＨＡＰＳ（３−〔（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスルホン酸）で可溶化した。可溶化したものをＤＥＡＥトーヨーパール（トーソー（株）製）のカラムに負荷し、0.25Ｍ ＮａＣｌで洗浄し、つづいて0.6 Ｍ ＮａＣｌで溶出した。溶出物（カラムから得られた負に荷電した部分精製物）からプロテオグリカンを分離するためＣｓＣｌ密度勾配超遠心にて分画した。遠心後、勾配を１０分画にして集めた。これらの画分をコンドロイチナーゼＡＢＣで消化後分析したところ、３つの最も低い密度の画分中に１４０ｋＤａと１２０ｋＤａのタンパク質が主要な成分として検出された（非特許文献２２中の （図２を参照）。従って、これらの画分中のプロテオグリカンをコンドロイチナーゼＡＢＣで消化し、得られたコアグリコプロテインをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（６％ポリアクリルアミド）によって分離した。このコアグリコプロテインはＰＶＤＦ膜に移され、そして１２０ｋＤａのコアグリコプロテインのバンドを手術用メスで切りだした。１２０ｋＤａのコアグリコプロテインはウエスタンブロットにおいて４つのモノクローナル抗体Ｃ１，Ｃ３，Ｃ５及びＣ１５によって認識された。

この精製された１２０ｋＤａコアグリコプロテインのアミノ酸配列分析を行った。１２０ｋＤａのコアグリコプロテインの断片をスコットら（Scott et al)の文献（非特許文献２８）に記述されたように臭化シアン（ＣＮＢｒ）処理によって得た。完全なコアグリコプロテインとその断片とを上述したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。そして該タンパク質とその断片とを１０％メタノールを含む１０ｍＭＣＡＰＳ（３−（シクロヘキシルアミノ）プロパンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ１１）中で0.3 Ａ（アンペア）で４℃、３時間でＰＶＤＦ膜に移した。0.5 ％ポンシュー レッド（Ｐｏｎｃｅａｕ Ｒｅｄ）含有１％酢酸で染色後、タンパク質のバンドを膜から切り出し、そしてタンパク質のアミノ酸配列を自動タンパク質シークエンサー（ＰＰＳＱ−１０；島津）で決定した。

ｃＤＮＡライブラリーとｃＤＮＡクローンの分離
１８日齢（Ｐ１８）スプラグ−ドウリー(Sprague-Dawley)ラットの全脳から得られるポリ（Ａ） ⁺ＲＮＡを鋳型として使い、ランダムプライマーを用いて構築したλｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーを利用した。他のλｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーは、８日齢（Ｐ８）スプラグ−ドウリーラットの全脳から得られるポリ（Ａ） ⁺ＲＮＡを鋳型として使い、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて構築した。これらのｃＤＮＡライブラリーはモノクローナル抗体Ｃ１，Ｃ３，Ｃ５及びＣ１５の培養上清の混合液を用いて１×１０⁶ プラークを免疫学的にスクリーニングした。免疫学的スクリーニングはサムブロックら(Sambrook et al)の文献（非特許文献２９）に記述されたようにして免疫的検出のためのベクタステイン(Vectastain)ＡＢＣキットを用いて行なった。

最初の２つのクローン、（ランダムプライマーｃＤＮＡライブラリーからの）(ＮＧＣ１と（オリゴ−ｄ（Ｔ）プライマーｃＤＮＡライブラリーからの）(ＮＧＣ３が免疫学的スクリーニングによって単離され、続いてクローンを³²Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを用いてプラークハイブリダイゼーションによって得た。プラークハイブリダイゼーションとノーサンブロッテイングのためのｃＤＮＡプローブはメガプライム（Megaprime)ＤＮＡラベリングシステム（アマーシャム インターナショナル社製）を用いて標識した。(ｇｔ１１クローンからのｃＤＮＡ挿入物を精製し、そして pBluescript II プラスミドベクター（ストラトジーンクローニングシステム社製）中にサブクローンした。

ＤＮＡの配列決定
配列決定のために制限酵素を用いたデレーションによるサブクローニングを行なった。ＤＮＡ配列決定は自動ＤＮＡシークエンサー（ＡｌｆII／Ａｌｆｒｅｄコンバインドシステム；ファーマシア社）を用いてＴａｑ ポリメラーゼと色素標識プライマーを使用し、行なった。配列の編集(Editing) と分析はＧＥＮＥＴＹＸ ソフトウエアー（ソフトウエアー開発（株））を用いて行われた。リーデングフレームは１２０ｋＤａのコアグリコプロテインのＮ末端アミノ酸配列とＣＮＢｒ処理によって得られたその断片についての本発明者らのデーターから裏付けられた。ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（Ｒｅｌｅａｓｅ８７）とスイス−プロット（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）（Ｒｅｌｅａｓｅ３１）中の配列との比較は部分配列探索ツールを用いて行った（非特許文献３０）。

ノーサンブロット分析
全ＲＮＡはチョムジンスキーおよびサッキー(Chomczynsky and Sacchi)らの文献（非特許文献３１）に記述されたようにして生後７日および成熟ラットの脳から抽出し、同様に腎臓、肝臓、肺臓そして筋肉からも抽出した。ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡはその方法手順にしたがってオリゴテックス−ｄＴ３０（タカラバイオケミカル社製）を用いて精製した。ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡ（５μｇ）を 2.2Ｍ ホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲル上で電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（イモビロン−Ｎ、ミリポア社製）に移した（転写した）。(ＮＧＣ１からの６８２塩基対挿入物を³²Ｐ−ｄＣＴＰで標識しそして３×１０⁶ ｃｐｍ／ｍｌの濃度でプローブとして用いた。このフィルターを最後に0.2 ×ＳＳＣ（ＳＳＣ：0.15 ＮａＣｌと0.015 Ｍ 酢酸ナトリウム）中で６８℃で洗浄しオートラジオグラフィーのためＸ−線フィルム（富士フィルム社）に露光した。

モノクローナル抗体の特徴
本発明者らは、４種類のハイブリドーマ細胞株（Ｃ１，Ｃ３，Ｃ５そしてＣ１５）を確立した。それぞれがウエスタンブロットにおいて膜結合型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの調製品と反応する抗体（モノクローナル抗体Ｃ１，Ｃ３，Ｃ５およびＣ１５）を生産した。この４種類のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）全ては抗原として用いた膜結合型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの調製品が試験されたとき平均分子量１５０ｋＤａに相当する非常に広いバンドを認識した（図３Ａレーン１、ＭＡｂ Ｃ５を用いたイムノブロット）。膜結合型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの調製品をコンドロイチナーゼＡＢＣで消化した時、１２０ｋＤａのタンパク質のバンドがＭＡｂ Ｃ５を用いたイムノブロットで検出された（図３Ａレーン２および図３Ｂレーン１）。ヘパリチナーゼで処理してもこのバンドは移動しなかった（図３Ａレーン３）。１０日齢ラットの脳から得られたＰＢＳ可溶性プロテオグリカンの調製品を多量に用いてウエスタンブロットで分析したとき、７５ｋＤａのコアグリコプロテインがＭＡｂ Ｃ５で弱く検出された。ＭＡｂ Ｃ５は肝臓、肺臓、腎臓、筋肉そして軟骨のような神経系以外から調製したいかなるプロテオグリカンのコアグリコプロテインとも反応しなかった。

プロテオグリカンがコンドロイチン硫酸鎖に加えてオリゴ糖側鎖を有する可能性を試験するため、コアグリコプロテインを図３Ｂに示したように３つのグリコシダーゼ（ノイラミダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼ、Ｎ−グリコシダーゼ）で順に消化しそして脱グリコシレーションされたコア蛋白質の分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した（図３Ｂレーン２、３、４）。グリコシダーゼとのそれぞれの処理はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのコア蛋白質のバンドの移動度の増加をひきおこした。コア蛋白質を認識するＭＡｂ Ｃ５の能力はいずれのグリコシダーゼとの消化によっても影響されなかった。それ故、ＭＡｂ Ｃ５によって認識されるエピトープはポリペプチド部分に存在していると思われる。

ラット大脳皮質におけるプロテオグリカンの発現をＭＡｂ Ｃ５を用いた免疫組織化学的染色によって試験した。すなわち、生後０日で、ＭＡｂ Ｃ５で免疫染色した結果から該プロテオグリカンは発生中の神経細胞と関連していた（図４Ａ）。同様の染色パターンは生後７日の大脳皮質にも見られた（図４Ｂ）。成熟脳においては、大脳皮質の免疫染色の強度は減少した。大脳皮質におけるプロテオグリカンの一時的発現を定量するため、種々の発生段階（１２日胚（Ｅ１２）から成熟まで）での大脳皮質のＰＢＳ−不溶性抽出物をコンドロイチナーゼＡＢＣで消化し、イムノブロッテイングを行い免疫標識されたバンドの強度を定量した。少量のプロテオグリカンが１６日胚（Ｅ１６）から１８日胚（Ｅ１８）において検出された。プロテオグリカンの量は生後２０日（Ｐ２０）付近で最大レベルに達するほどに増加した（図４Ｃ）。Ｐ２０の後、プロテオグリカンの量は減少した。そして成熟大脳皮質においては、このプロテオグリカンは発現の最大レベルの約半分となった。

ｃＤＮＡクローンの分離
１２０ｋＤａのコアグリコプロテインを精製し、それをＣＮＢｒで処理することによって数種のペプチドに分解し、完全なコアグリコプロテインと２つのペプチドの部分Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。完全なコアグリコプロテインのＮ末端配列はアミノ酸の一文字表記でＶＰＡＲＥＡＧＳＡＩＥＡＥＥＬであった。完全に異なったＮ末端配列がＣＮＢｒによって消化された２つの生産物（１５ｋＤａと２４ｋＤａ）中で見いだされた。１５ｋＤａと２４ｋＤａのペプチドについてそれぞれ（Ｍ）ＶＰＧＧＳＩＳＬＲＰＲＰＧＤＰＧＫＤＬＡ及び（Ｍ）ＧＲＦＰＧＳＰであった。

４種のＭＡｂ Ｃ１，Ｃ３，Ｃ５及びＣ１５の混合液を用いて免疫学的にスクリーニングすることによって、Ｐ１８のラット脳から誘導された(ｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリー（ランダムプライマー）から一個の陽性クローン（λＮＧＣ１）を単離し、Ｐ８のラット脳から誘導された(ｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリー（オリゴ−ｄ（Ｔ）プライマー）から他の陽性クローン（λＮＧＣ３）を最初に単離した。λＮＧＣ１とλＮＧＣ３はそれぞれ６８２塩基対と１３９８塩基対のインサートｃＤＮＡをそれぞれ含む（図５）。λＮＧＣ１に由来するβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質はＭＡｂ Ｃ１とのみ反応し、ＭＡｂ Ｃ３、Ｃ５及びＣ１５とは反応しなかった。対照的にλＮＧＣ３に由来する融合タンパク質はＭＡｂ Ｃ３、Ｃ５及びＣ１５と反応したが、ＭＡｂ Ｃ１とは反応しなかった。さらに分析を行なうためにλＮＧＣ１とλＮＧＣ３をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIプラスミドベクター中にサブクローンした（以下それぞれをｐＮＧＣ１とｐＮＧＣ３という）。これらのクローンの信頼性は１２０ｋＤａのコアグリコプロテインと２４ｋＤａのＣＮＢｒ処理で得られた断片のアミノ酸配列がｐＮＧＣ１中のインサートｃＤＮＡ（第６図アンダーライン部分参照）から推定したアミノ酸配列の範囲内で一致し、そして１５ｋＤａのＣＮＢｒ処理で得られた断片のアミノ酸配列がｐＮＧＣ３中のインサートｃＤＮＡから推定したアミノ酸配列の範囲内で一致することから明白に立証された（図６参照、下線部分）。

ｐＮＧＣ１中のインサートｃＤＮＡを〔³²Ｐ〕−ｄＣＴＰで標識しそしてこれに重なっているｃＤＮＡクローンを同定するためのプローブとして用い、Ｐ１８のラット脳から誘導された(ｇｔ１１ ｃＤＮＡ ライブラリー（ランダムプライマー）から４種類のｃＤＮＡクローン（λＮＧＣ７、λＮＧＣ１３、λＮＧＣ１５及びλＮＧＣ１９）が、重なっているｃＤＮＡ部分を含み、プロテオグリカンのコア蛋白質を全てコードするｃＤＮＡを得た。 図５はプロテオグリカン、すなわちニューログリカンＣ（ＮＧＣ）の完全な配列の決定のために用いた異なったｃＤＮＡクローンの位置を示す。

ＮＧＣのコア蛋白質の予想構造
ＮＧＣのコア蛋白質を全てコードするｃＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列を図６に示した。これらのクローンは５４４アミノ酸をコードする読み取り枠（オープンリーデングフレーム）を含む２，１０７塩基対以上をカバーしている。算出された分子量(molecular mass)は５８，６１２Ｄａであった。３'未翻訳領域は４６３ヌクレオチドからなり、ポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）を含む。このコーデイング領域において、ＣＮＢｒ切断による２種類の生産物の配列（下線部分）が同定された。１２０ｋＤａのコアグリコプロテインのＮ末端アミノ酸配列（図６のアミノ酸残基３１番ではじまる配列（下線部分))を決定した。１３番目のヌクレオチドから始まるＡＴＧトリプレット付近のヌクレオチド配列は翻訳の開始部位に対応する配列に相当する（非特許文献３２）。ｃＤＮＡの５'領域の１２塩基対は５'未翻訳領域である。最初のメチオニンから成熟コア蛋白質の最初のアミノ酸残基（バリン）までに疎水性アミノ酸配列があるがこれは恐らくシグナルペプチド配列である。カイテとドウーリトル(Kyte and Doolittle)ら（非特許文献３３）の方法による予想タンパク質アミノ酸配列の疎水性か親水性かの分析（図２）から２個の塩基性残基に続く２４アミノ酸からなる（図６のアミノ酸残基番号４２６−４５０）カルボキシル末端付近に第２の疎水性配列が明らかになった（図６、破線）。この配列はサバチニら(Sabatini et al)（非特許文献３４）によって提案された膜貫通ドメインについての性質に一致する。

ＮＧＣのコアグリコプロテインはグリシン（10.5％）、ロイシン（9.9 ％）、プロリン（9.0 ％）、グルタミン酸（8.1 ％）、セリン（7.9 ％）そしてスレオニン（7.7 ％）残基に富んでいる。計算より求められたＮＧＣのｐＩは4.9 である。コアグリコプロテイン中に全部で１０のシステイン残基が見いだされた。これら全てはＮＧＣの中央に位置し、膜貫通ドメインより細胞の外側に位置している。ＮＧＣのコアグリコプロテインの推定される細胞外ドメインは３つのＮ−グリコシレーション可能な部位（非特許文献３５）をふくみそしてＯ−結合糖鎖が結合可能な３つのセリンースレオニンクラスター（図６のアミノ酸残基番号１４３−１４４、１８８−１８９及び２７１−２７２）を含む（非特許文献３６）。

図６のアミノ酸番号残基３１から２８１のＮ−末端領域は８個のセリン−グリシン（ＳＧ）あるいはグリシン−セリン（ＧＳ）のジペプチド配列を含んでいる。これらのジペプチドは、コンドロイチン硫酸の結合部位に合致するコア−部位の配列であると考えられる（非特許文献１８、３７）。この８個のセリン残基のまわりのアミノ酸配列はＳＧＸＧ（非特許文献３７）と（Ｅ／Ｄ）ＧＳＧ（Ｅ／Ｄ)(非特許文献１８）で示されるグリコサミノグリカンの結合部位に対応する配列とは異なっている。しかしながら、これらの対応する配列はコア蛋白質へグリコサミノグリカンが結合し得る唯一の配列ではない。例えば、ニューロカンにおいて、コンドロイチン硫酸鎖が結合しているセリン残基付近の配列はＥＥＶＡＳＧＱＥＤ（非特許文献１６）である。アグリカン、バーシカン、シンデカン、デコリン及びIX型コラーゲンのようなプロテオグリカンにおけるコンドロイチン硫酸の結合部位に特徴的なアミノ酸の配列は前にＳＧ／ＧＳがそして酸性アミノ酸残基が続くことが報告されている（図７）。コンドロイチン硫酸の結合において酸性アミノ酸残基の重要性は同様に別の文献に記述されている（非特許文献１８、３７、３８）。ＮＧＣコア蛋白質の８個のＳＧ／ＧＳ−ジペプチドの付近にこれらに対応する配列が並んでいる。ＮＧＣは予想される細胞外ドメイン中に２個の付加的ジペプチド配列（（図２の３４１番と３７４番のセリン残基）を含む。しかしながら、これらのジペプチドはコンドロイチン硫酸の結合部位に対応する配列と関連していなかった。従って、Ｎ−末端ドメインを推定コンドロイチン硫酸結合ドメインとした。塩基性アミノ酸の短い配列ＫＲＲＫＲＲＲＲＩＲ（図６のアミノ酸残基番号２８２−２９１）が仮のコンドロイチン硫酸結合ドメインに近接して見いだされた（２本下線で示す）。さらに塩基性アミノ酸の短い配列の後に、１０個のシステイン残基を含む１３３個のアミノ酸（図６のアミノ酸残基番号２９２−４２５）からなる領域が見だされた。

またＮＧＣの細胞質ドメインはプロテインキナーゼによってリン酸化可能な部位となるセリンおよびスレオニン残基を含む。図６のアミノ酸残基番号４６５番のスレオニン残基付近のアミノ酸配列（ＫＬＲＲＴＮＫ）と５２１番のセリン残基付近のアミノ酸配列（ＳＰＫ）はグラフら(Graff et al)(非特許文献４２）によって提案されたプロテインキナーゼＣによるリン酸化部位に対応する配列（Ｘ（Ｒ／Ｋ）ＸＸ（Ｔ／Ｓ）Ｘ（Ｒ／Ｋ））に類似している。ＮＧＣがリン酸化されるかどうかは決定されていないけれども、ＮＧＣがシグナル伝導に関与している可能性はある。仮の細胞質ドメインは２つのチロシン残基を含む。しかしこれらのチロシン残基に接続する配列はチロシンのリン酸化に対して報告された対応する配列とは異なっている（非特許文献４３）。図８はＮＧＣコア蛋白質の提案されるドメイン構造の図示的表現である。

アミノ酸レベルでのデータベース検索によりＮＧＣの小さな部位がアグリカン、および軟骨のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（非特許文献４４）のコアプロテインと似ている。この類似する領域は全てＮＧＣの推定の細胞外ドメイン中に分布している。推定のコンドロイチン硫酸結合ドメインにおいて、１１のホモロジーのあるクラスターを同定した：ＮＧＣの （図２のアミノ酸残基番号４５−９４とアグリカンの残基番号９０７−９５６（３２％同一性／４８％化学的相似性）；以下同様に残基番号とその同一性、相似性を示すと２６−７０と９６７−１０１１（２９％／５６％）；５３−１０３と９５５−１００５（２２％／４７％）；８８−１１３そして１５８５−１６１０（４２％／５４％）；１１７−１５１と１６４９−１６８３（３１％／４０％）；４３−９２と１１３０−１１７９（２８％／３８％）；５０−９４と８９２−９３６（２７％／４７％）；５９−１０８と１２３３−１２８２（２２％／４４％）；１２２−１６３と１２９６−１３３７（２９％／３６％）；１０９−１５３と１７０５−１７４９（３１％／４０％）；及び９０−１１４と１１０８−１１３２（３２％／５６％）である。アグリカンにおいてホモロジーのあるクラスターの全ては推定されるコンドロイチン硫酸結合部位ドメインに局在している。ＮＧＣのシステイン含有ドメイン中に本発明者らは３つのホモロジーのあるクラスターを見いだした： （図２のアミノ酸残基番号２８７−３２２と１８２７と１８６２（３１％同一性／４２％化学的相似性）；以下同様に３４８−３８６と１８９８−１９３６（２３％／３８％）；及び４０１−４１１と１９９８−２００８（５５％／５５％）である。アグリカン中の対応するホモロジーのあるクラスターの全ては同様にアグリカンのシステイン含有ドメインのひとつに局在している。ラットアグリカンとＮＧＣのホモロジーのある配列の図示的配列が図９に示されている。アグリカンはいくつかの構造的に異なったドメインからなる、つまり、免疫グロブリン様ドメインとＮ末端部位中でのヒアルロン酸結合領域の２回の繰り返し、中央部のコンドロイチン硫酸結合部位ドメインとＥＧＦ様ドメイン、レクチン様ドメイン及びカルボキシ末端部位での補体調節タンパク質様ドメインからなる（非特許文献４４）（図９参照）。いくつかの他のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン、例えばバーシカン（非特許文献１８）、ニューロカン（非特許文献１６）、ブレビカン（非特許文献１７）そしてＢＥＨＡＢ（非特許文献１９）は同様にこれらのドメインを含む。従って、これらは全てアグリカンファミリーのメンバーであるとされる。ＮＧＣはこのファミリーのメンバーではない、なぜならＮＧＣコア蛋白質はコンドロイチン硫酸結合ドメインを除いてこれらのいかなるドメインももたないからである（図９）。

ノーサンブロット分析
ＮＧＣのｍＲＮＡの組織分布をノーザンブロット分析によって検討し（図１０）、3.1 ｋｂの単一転写産物が７日齢と成熟ラットの脳の分析で検出された。ここでＮＧＣのコーデイング領域とＮＧＣのｍＲＮＡの間の長さの違いはｍＲＮＡにおける５'未翻訳領域と３'非コーデイング領域（図５、矢印）の存在に帰する。この転写産物は腎臓、肝臓、肺臓そして筋肉の分析では検出されなかった。

ヒト由来のＮＧＣのクローニング
³²Ｐ標識したｃＤＮＡプローブをラットのＮＧＣのＤＮＡ断片（制限酵素XbaI-Hind III 消化ＤＮＡ断片：配列表１の塩基番号６２４〜１７３５）をもとにして作製した。これをプローブとし２歳の健常な女性の側頭皮質より作製した市販のｃＤＮＡライブラリー(Stratagene Cloning System社) からプラークハイブリダイゼーションによって相同性の高い塩基配列を有するクローンを単離した。プラークハイブリダイゼーションの宿主には大腸菌(Escherichia coli) XL-1 blue MRF'(Stratagene Cloning System社) を用いた。ハイブリダイゼーションの条件は、60℃、３ｘＳＳＣ(SSC：0.15M NaCl、0.015M酢酸ナトリウム) 中で行い、洗浄は60℃、0.1 ｘＳＳＣで行った。単離したＤＮＡクローンは、pBluescriptII(Stratagene Cloning System社) にサブクローンした。

ＤＮＡの塩基配列決定は、実施例８と同様に行った。ＮＧＣのコア蛋白質を全てコードするｃＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列を配列番号２に示した。これらのクローンは５４５アミノ酸をコードする読み取り枠（オープンリーディングフレーム）を含む１７４０塩基対以上をカバーしている。算出された蛋白質の分子量は58538.89（未確定の３アミノ酸残基を除く）であった。またラットのＮＧＣ遺伝子との相同性は８３．６％であった。また、ヒト由来のＮＧＣをコードするDNA の塩基配列から推定されるアミノ酸配列を、配列番号２に併記した。ラットのＮＧＣとの相同性は８３．９％であった。

本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの模式図を示す。ＣＳ−アタッチメントドメイン、塩基性アミノ酸クラスタードメイン、システイン含有ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質内アミノ酸配列ドメインよりなる。 本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのアミノ酸配列の疎水性及び親水性分析結果を示す。横軸が 図６に示したアミノ酸残基番号を示し、縦軸はマイナスが疎水性を示し、プラスが親水性を示す。 １０日齢ラットから部分精製した膜結合型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのポリアクリルアミドゲル上での電気泳動図を示す。 ラット大脳皮質におけるＮＧＣの発現パターンを示す。(A) ０日齢ラットの大脳皮質の前顎断切片をＭＡｂ Ｃ５で免疫染色したもの。(B) ７日齢ラットの大脳皮質の前顎断切片をＭＡｂ Ｃ５で免疫染色したもの。(C) 本発明のプロテオグリカンのコアグリコプロテインの相対発生量の変化。 本発明のラットＮＧＣをコードするクローンを示す。 本発明のラットＮＧＣのｃＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸は一文字表記法を用いた。 本発明のラットＮＧＣ、バーシカン、アグリカン、ニューロカン、シンデカン、デコリン及びIX型コラーゲンのグリコサミノグリカン結合又は結合可能な部位のアミノ酸配列を示す。 ＮＧＣコア蛋白質の構造の模式図を示す。 ラットＮＧＣのアミノ酸配列とラットアグリカン（非特許文献６１）のアミノ酸配列との対比を示す。ＮＧＣとラットアグリカンとの類似したクラスターの中央部位間を線で結んだ。ＣＳ，ＣＳ１，ＣＳ２及びＣＳ３はコンドロイチン硫酸結合ドメインを、ＩＧは、免疫グロブリン様ドメインを、Ｈ１及びＨ２はヒアルロン酸結合ドメインを、ＫＳは、ケラタン硫酸結合ドメインを、Ｇ（ＥＬＣ）はＥＧＦ様ドメイン、レクチン様ドメイン及び補体調節タンパク質様ドメインを含むグロブラードメインを、Ｇはグロブラードメインを、Ｔは膜貫通ドメインを、ＣＰは細胞質ドメインをそれぞれ示す。アミノ酸残基数をスケールで示している。 ７日齢ラットの脳（Ｂ７）、成熟ラットの脳（Ｂａ）、成熟ラット腎臓（Ｋ）、肝臓（Ｌｉ）、肺臓（Ｌｕ）及び筋肉（Ｍ）からのＮＧＣのｍＲＮＡのノーザンブロットを示す。

Claims (4)

1. 以下の方法で製造され、かつ、以下の性質を有するコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを、ヒト以外の哺乳動物に免疫し、該動物の体液から採取することができるか、または該動物の抗体産生細胞によって産生される、以下の性質を有する抗体。
   （コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの製造方法）
   工程１：ラットの脳を２ｍＭ フェニルメチルスルフォニルフルオライド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ及び１０ｍＭ Ｎ−エチルマレイミドを含むリン酸塩緩衝食塩水中でホモジナイズし、そのホモジネートを27,000xgで４０分間遠心して沈澱物を回収する。（本工程および以下の工程は特に示していない限り全て４℃で行う。）
   工程２：工程１で回収した沈殿物について、再度、工程１と同様にホモジネーションし、遠心して、不溶性物質を回収する。
   工程３：工程２で回収した不溶性物質を、２ｍＭ フェニルメチルスルフォニルフルオライドと１％ノニデット Ｐ−４０を含むリン酸塩緩衝食塩水中で０℃においてホモジナイズし、ホモジネートを回収する。
   工程４：工程３で回収したホモジネートを６０分間撹拌し、次いでこれを27,000xgで４０分間遠心して上清を回収し、これを凍結乾燥する。
   工程５：工程４で得られた凍結乾燥物を、0.2 ％ノニデットＰ−４０、0.1 Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド及び0.2 ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライドを含む４Ｍ尿素、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH7.5）中に分散し、次いで同緩衝液に対して透析する。
   工程６：工程５における透析後の溶液を27,000xgで３０分間遠心し、上清を回収する。
   工程７：工程６で回収した上清を、尿素緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−樹脂と混合し、この混合物を２時間撹拌する。
   工程８：工程７における撹拌後のＤＥＡＥ−樹脂を回収し、これを尿素緩衝液で洗浄する。
   工程９：工程８における洗浄後のＤＥＡＥ−樹脂をカラムにつめ、次いで尿素緩衝液中でＮａＣｌの直線濃度勾配（0.1 Ｍから0.7 Ｍ）をかけ、0.45から0.68ＭのＮａＣｌ濃度で溶出される画分を回収する。
   工程１０：工程９で回収された画分を濃縮し、この濃縮液を、0.2 ％ノニデットＰ−４０と２ｍＭ フェニルメチルスルフォニルフルオライドとを含む４Ｍグアニジン塩酸、５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.5）を用いたセファロースＣＬ−４Ｂのカラム（直径1.6 ｃｍ×１００ｃｍ）のクロマトグラフィーに付し、Ｋａｖが0.11から0.65の範囲にある画分を回収する。
   工程１１：工程１０で回収された画分を濃縮する。
   工程１２：工程１１で得られた濃縮液に、1.3 ％（Ｗ／Ｖ）酢酸カリウムを含む３倍容の９５％エタノールを添加して、沈殿物を形成させる。
   工程１３：工程１２で形成された沈澱物を、０℃で、１％（Ｗ／Ｖ）酢酸カリウムを含む７５％エタノールで洗浄し、減圧乾燥する。
   工程１４：工程１３で得られた乾燥物を、室温で、グアニジン塩酸緩衝液（４Ｍグアニジン塩酸、５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ7.5）に溶解する。
   工程１５：工程１４で得られた溶液をオクチルセファロースのカラム（直径1.6 ｃｍ×5.0 ｃｍ）に負荷し、グアニジン塩酸緩衝液中でノニデットＰ−４０の直線濃度勾配（０％から0.8 ％（Ｖ／Ｖ））をかけ、0.3 ％から0.6 ％(v/v)のノニデットＰ−４０濃度で溶出される画分を回収する。
   工程１６：工程１５で回収した画分にエタノールを添加して沈殿物を形成させ、この沈殿物を減圧乾燥する。
   工程１７：工程１６で得られた乾燥物を、グアニジン塩酸緩衝液（４Ｍグアニジン塩酸、５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ7.5）中で塩化セシウム密度勾配遠心法（初期密度1.38ｇ／ｍｌ；１０℃；150,000xg で３０時間）に付する。
   工程１８：工程１７の処理が終了した試料を７つに分画し、その第２番目から第６番目の画分を回収する。
   工程１９：工程１８で回収した画分をリン酸塩緩衝食塩水に対して透析して、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン画分を取得する。
   （コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの性質）
   （Ａ）糖鎖：分子量３０キロダルトンのコンドロイチン硫酸を含有する。
   （Ｂ）本プロテオグリカンにノイラミニダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼまたはＮ−グリコシダーゼを作用させると糖鎖が遊離する。
   （Ｃ）分子量が、還元条件下におけるドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において１５０キロダルトンである。
   （コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコア蛋白質の性質）
   （ａ）配列表配列番号２に示す１番目のバリン（Ｖａｌ）から５１４番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までのアミノ酸配列を有する。
   （ｂ）分子量が、還元条件下におけるドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において１２０キロダルトンである。
   （抗体の性質）
   （１） 上記のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン及び上記のコア蛋白質の両者あるいはいずれか一方に結合する。
   （２） 上記のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンをコンドロイチナーゼＡＢＣで消化して得られる産物に結合する。
   （３） 上記（２）により得られる産物をさらにヘパリチナーゼＩで消化して得られる産物に結合する。
   （４） 上記（３）により得られる産物をさらにノイラミニダーゼで消化して得られる産物に結合する。
   （５） 上記（４）により得られる産物を、さらにＮ−グリコシダーゼ及びＯ−グリコシダーゼのいずれかの酵素で消化して得られる１００キロダルトン（還元条件下におけるドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）の産物にも結合する。
   （６） エピトープが、上記のプロテオグリカンのポリペプチド部分に存在する。
2. モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
3. マウス由来であり、かつ、イソタイプがＩｇＧ１である、請求項１又は２に記載の抗体。
4. 大脳皮質のリン酸緩衝食塩水−不溶性抽出物をコンドロイチナーゼＡＢＣで消化して得られた試料を、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体を用いてイムノブロッテイングを行うことを特徴とする、大脳皮質におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン又はそのコア蛋白質を測定する方法。
   

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