KR102412803B1 - 암의 치료 및/또는 예방용 의약 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명의 목적은 암세포의 표면에 특이적으로 발현하는 암항원 단백질을 동정하고, 그것을 표적으로 한 항체의 암의 치료 및/또는 예방제로서의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 서열번호 2~8 중 짝수의 서열번호로 나타내어지는 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 MCEMP1 단백질, 또는 연속하는 7개 이상의 아미노산을 포함하는 그 단편과 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 프래그먼트를 유효성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물 등에 관한 것이다.

Description

암의 치료 및/또는 예방용 의약 조성물

본 발명은 MCEMP1에 대한 항체 또는 그 프래그먼트의 암의 치료 및/또는 예방제 등으로서의 신규한 의약 용도에 관한 것이다.

최근, 암세포 상의 항원 단백질을 표적으로 한, 암을 치료하기 위한 각종 항체 의약이 세상에 대두되어 왔다. 그것들 항체 의약은 암특이적 치료약으로서 일정한 약효가 얻어져 주목되고 있지만, 표적이 되는 항원 단백질의 대부분은 복수의 정상 세포에도 발현하는 것이어서, 항체 투여의 결과 암세포뿐만 아니라 항원이 발현하는 정상 세포도 장해되어 버려, 그 결과 발생되는 부작용이 문제가 되고 있다. 따라서, 암세포 표면에 특이적으로 발현하는 암항원을 동정하고, 그것을 표적으로 한 항체를 의약품으로서 사용할 수 있다면, 보다 부작용이 적은 항체 의약에 의한 치료가 가능해질 것으로 기대된다.

Mast Cell-Expressed Membrane Protein 1(MCEMP1)은 2형의 막관통 단백질이고, 비만세포 특이적으로 세포막에 발현하고 있는 것이 보고되고 있으며, 비만 세포의 분화, 면역 반응, 알레르기 반응에 관여할 가능성이 시사되고 있다(비특허문헌 1). 그러나, MCEMP1 단백질이 암세포에 대한 면역 유도 활성을 갖고, 그것에 의해서 상기 단백질이 암의 치료나 예방에 유용하다고 하는 보고는 없다.

Kang Li. et al. Genomics, 86:68-75(2005)

본 발명의 목적은 암세포의 표면에 특이적으로 발현하는 암항원 단백질을 동정하고, 그것을 표적으로 한 항체의 암의 치료 및/또는 예방제로서의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 예의 연구의 결과, 개의 정소 조직 유래 cDNA 라이브러리와 백혈병 환견의 혈청을 이용한 SEREX법에 의해 담암 생체 유래의 혈청 중에 존재하는 항체와 결합하는 단백질을 코딩하는 cDNA를 취득하고, 취득한 개 유전자 및 그 인간, 고양이, 마우스 상동성 유전자를 기초로 하여 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 MCEMP1 및 그것들 MCEMP1에 대한 항체를 제작했다. 그리고, MCEMP1이 백혈병, 골수이형성증후군, 골육종, 흉선종, 비만세포종, 항문 주위 선암에 특이적으로 발현하고 있는 것, 그리고 MCEMP1 단백질의 일부가 그것들 암세포의 세포 표면에 특이적으로 발현하고 있는 것을 발견했다. 그리고, 그것들 MCEMP1의 각 암세포의 세포 표면에 발현하는 부분에 대한 항체가 MCEMP1을 발현하는 암세포를 저해하는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명은 이하의 형태를 포함한다.

(1)서열번호 2, 4, 6 또는 8로 나타내어지는 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 MCEMP1 단백질, 또는 연속하는 7개 이상의 아미노산을 포함하는 그 단편과 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 프래그먼트를 유효성분으로서 포함하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.

(2)(1)에 있어서,

상기 MCEMP1 단백질의 세포 외 영역 부분을 포함하는 폴리펩티드로서, 서열번호 10, 12, 14 또는 16으로 나타내어지는 아미노산 서열의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드, 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드와 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 프래그먼트를 유효성분으로서 포함하는 의약 조성물.

(3)(1) 또는 (2)에 있어서,

상기 암이 MCEMP1을 세포 표면에 발현하는 암인 의약 조성물.

(4)(1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서,

상기 암이 백혈병, 골수이형성증후군, 골육종, 흉선종, 비만세포종 및 항문 주위 선암으로 이루어지는 군에서 선택되는 의약 조성물.

(5)(1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서,

상기 항체가 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체인 의약 조성물.

(6)(1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서,

상기 항체가 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 다중 특이성 항체인 의약 조성물.

(7)MCEMP1 단백질의 세포 외 영역 부분을 포함하는 폴리펩티드로서, 서열번호 10, 12, 14 또는 16으로 나타내어지는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드와 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 프래그먼트.

(8)(7)에 있어서,

상기 항체가 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 다중 특이성 항체인 항체 또는 그 프래그먼트.

(9)(1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물과, 항종양제를 포함하는 의약 조성물을 포함하여 이루어지는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 조합 의약품.

(10)서열번호 2, 4, 6 또는 8로 나타내어지는 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 MCEMP1 단백질, 또는 연속하는 7개 이상의 아미노산을 포함하는 그 단편과 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 프래그먼트를 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 및/또는 예방 방법.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초가 되는 일본 특허 출원 번호 2016-064035호의 개시 내용을 포함한다.

(발명의 효과)

본 발명에서 사용되는 MCEMP1에 대한 항체는 암세포를 장해한다. 따라서, MCEMP1에 대한 항체는 암의 치료나 예방에 유용하다.

도 1은 동정한 개 MCEMP1 유전자의 개의 종양 조직에서의 발현 패턴을 나타내는 도면이다.
도 2는 동정한 MCEMP1 유전자의 인간의 각 조직 및 암세포주에서의 발현 패턴을 나타내는 도면이다. A : 인간 MCEMP1 유전자의 인간의 각 조직에서의 발현 패턴을 나타낸다. B : 인간 MCEMP1 유전자의 인간의 각 암세포주에서의 발현 패턴을 나타낸다.
도 3은 동정한 마우스 MCEMP1 유전자의 마우스의 각 암세포주에서의 발현 패턴을 나타내는 도면이다.
도 4는 MCEMP1에 대한 폴리클로날 항체(항 MCEMP1 폴리클로날 항체)에 의한 MCEMP1 유전자를 발현하는 백혈병 세포주(U937) 및 골수이형성증후군 세포주(MDS92)에 대한 세포 장해 활성을 나타내는 도면이다. 컨트롤-1 : 컨트롤 폴리클로날 항체를 첨가했을 때의 U937 세포에 대한 세포 상해 활성, 항 MCEMP1-1 : 항 MCEMP1 폴리클로날 항체를 첨가했을 때의 U937 세포에 대한 세포 상해 활성을 나타낸다. 컨트롤-2; 컨트롤 폴리클로날 항체를 첨가했을 때의 MDS92 세포에 대한 세포 상해 활성, 항 MCEMP1-2; 항 MCEMP1 폴리클로날 항체를 첨가했을 때의 MDS92 세포에 대한 세포 상해 활성을 나타낸다.

본 발명은 MCEMP1 단백질 또는 그 단편에 대한 항체 또는 그 프래그먼트, 바람직하게는 항원 결합성 프래그먼트의 암의 치료 및/또는 예방 용도에 관한 것이다.

본 발명은 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 나타내어지는 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상(바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 99% 이상, 예를 들면 99.5% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 MCEMP1 단백질, 또는 연속하는 7개 이상(7개~각 서열의 전체 길이, 바람직하게는 7개~150개, 보다 바람직하게는 7개~50개)의 아미노산을 포함하는 그 단편과 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 프래그먼트를 유효성분으로서 포함하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 MCEMP1 단백질의 부분 폴리펩티드로서, 서열번호 10~24 중 짝수의 서열번호 중 어느 하나로 나타내어지는 아미노산 서열의 연속하는 7개 이상(7개~각 서열의 전체 길이, 바람직하게는 7개~40개, 보다 바람직하게는 7개~20개, 예를 들면 7~12개 또는 8~11개)의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드, 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상(바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드와 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 프래그먼트를 유효성분으로서 포함하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그 단편에 대한 항체 또는 그 프래그먼트의 항종양 활성은 담암 동물에 대한 종양 증식의 억제를 생체 내(in vivo)에서 조사함으로써, 또는 후술하는 바와 같이 상기 폴리펩티드를 발현하는 종양 세포에 대하여 면역 세포 또는 보체를 통한 세포 장해 활성을 나타내는지의 여부를 생체 외(in vitro)에서 조사함으로써 평가할 수 있다.

마찬가지로, 본 발명에서 사용되는 서열번호 10~16 중 짝수의 서열번호의 폴리펩티드 또는 그 단편에 대한 항체 또는 그 프래그먼트의 항종양 활성은 담암 동물에 대한 종양 증식의 억제를 생체 내(in vivo)에서 조사함으로써, 또는 후술하는 바와 같이 상기 폴리펩티드를 발현하는 종양 세포에 대하여 면역 세포 또는 보체를 통한 세포 장해 활성을 나타내는지의 여부를 생체 외(in vitro)에서 조사함으로써 평가할 수 있다.

또한, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열은 각각 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15에 나타내고 있다.

본 발명이 개시하는 서열표의 서열번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열은 개 정소 조직 유래 cDNA 라이브러리와 백혈병 환견의 혈청을 이용한 SEREX법에 의해 담암견 유래의 혈청 중에 특이적으로 존재하는 항체와 결합하는 폴리펩티드로서, 또한 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열은 그 인간 상동인자(호모로그)로서, 서열번호 6으로 나타내어지는 아미노산 서열은 그 고양이 상동인자로서, 서열번호 8로 나타내어지는 아미노산 서열은 그 마우스 상동인자로서 단리된 MCEMP1의 아미노산 서열이다(후술의 실시예 1 참조).

본 발명에서는 MCEMP1 단백질 중, 암세포의 세포 표면에 발현하는 부분에 결합하는 항체가 바람직하게 사용된다. 구체적으로는, MCEMP1 단백질의 세포 외 영역 부분을 포함하는 폴리펩티드인, 서열번호 10(인간), 12(개), 14(고양이) 또는 16(마우스)으로 나타내어지는 아미노산 서열, 그 단편(바람직하게는 그것들 아미노산 서열의 연속하는 7개 이상의 아미노산으로 이루어짐), 또는 이것들 폴리펩티드와 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열이 예시되고, 본 발명의 항체에는 이들 폴리펩티드에 결합하고, 또한 항종양 활성을 나타내는 모든 항체가 포함된다.

본 발명에서 사용되는 상기 MCEMP1에 대한 항체는 항종양 활성을 발휘할 수 있는 한 어떠한 종류의 항체여도 좋고, 예를 들면 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 합성 항체, 다중 특이성 항체(예를 들면, 이중 특이성 항체), 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 또는 단쇄 항체(scFV) 등이어도 좋다. 본 발명에서 사용하는 항체는 또한, 항체 프래그먼트(예를 들면, Fab나 F(ab')₂ 등의 항원 결합성 프래그먼트를 포함한다. 이것들 항체 및 그 프래그먼트는 또한 당업자에게 공지된 방법에 의해 조제하는 것이 가능하다. 본 발명에 있어서는, MCEMP1 단백질과 특이적으로 결합하는 것이 가능한 항체 또는 그 단편이 바람직하고, 모노클로날 항체인 것이 바람직하지만, 균질한 항체를 안정적으로 생산할 수 있는 한 폴리클로날 항체여도 좋다. 또한, 피험자가 인간인 경우에는 거절 반응을 회피 또는 억제하기 위해 인간 항체 또는 인간화 항체인 것이 바람직하다.

여기서, 「MCEMP1 단백질 또는 그 단편과 특이적으로 결합하는」이란 MCEMP1 단백질 또는 그 단편에 특이적으로 결합하고, 그것 이외의 단백질과 실질적으로 결합하지 않는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용할 수 있는 항체의 항종양 활성은 생체 내에서 종양 동물에 대한 종양 증식의 억제를 조사함으로써, 또는 후술하는 바와 같이 생체 외에서 상기 폴리펩티드를 발현하는 종양 세포에 대하여 면역 세포 또는 보체를 통한 세포 장해 활성을 나타내는지의 여부를 조사함으로써 평가할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서의 암의 치료 및/또는 예방의 대상이 되는 피험자는 인간, 애완동물, 가축류, 경기용 동물, 실험 동물 등의 포유동물이며, 바람직한 피험자는 인간이다.

이하에, 본 발명에 관한 항원의 제작, 항체의 제작, 및 의약 조성물에 대해서 설명한다.

<항체 제작용 항원의 제작>

본 발명에서 사용되는 MCEMP1에 대한 항체를 취득하기 위한 감작 항원으로서 사용되는 단백질 또는 그 단편은 인간, 개, 고양이, 마우스, 소, 말, 랫트, 닭 등, 그 유래가 되는 동물종은 제한되지 않는다. 그러나, 세포 융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하고, 일반적으로는 포유동물 유래의 단백질이 바람직하고, 특히 인간 유래의 단백질이 바람직하다. 예를 들면, MCEMP1이 인간 MCEMP1인 경우, 인간 MCEMP1 단백질이나 그 부분 폴리펩티드, 인간 MCEMP1을 발현하는 세포 등을 사용할 수 있다.

인간 MCEMP1 및 그 호모로그의 염기 서열 및 아미노산 서열은, 예를 들면 GenBank(미국 NCBI)의 Web 사이트에 액세스해서 BLAST, FASTA 등의 알고리즘(Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877, 1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)을 이용함으로써 입수할 수 있다.

본 발명에서는 인간 MCEMP1의 서열번호 1의 염기 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 기준으로 한 경우, 이것들 ORF 또는 성숙 부분의 염기 서열 또는 아미노산 서열과 70%~100%, 바람직하게는 80%~100%, 보다 바람직하게는 90%~100%, 더욱 바람직하게는 95%~100%, 예를 들면 97%~100%, 98%~100%, 99%~100% 또는 99.5%~100%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어지는 핵산 또는 단백질이 타겟으로 된다. 여기서, 「%서열 동일성」은 2개의 서열을 갭을 도입하거나 또는 갭을 도입하지 않고 최대의 유사도로 되도록 얼라인먼트(정렬)했을 때, 아미노산(또는 염기)의 총수에 대한 동일 아미노산(또는 염기)의 퍼센테이지(%)를 의미한다.

MCEMP1 단백질의 단편은 항체가 인식하는 최소 단위인 에피토프(항원 결정기)의 아미노산 길이에서부터, 상기 단백질의 전체 길이 미만의 길이를 갖는다. 에피토프는 포유동물, 바람직하게는 인간에 있어서 항원성 또는 면역원성을 갖는 폴리펩티드 단편을 가리키며, 그 최소 단위는 약 7~12개의 아미노산, 예를 들면 8~11개의 아미노산으로 이루어지며, MCEMP1 단백질의 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드가 예시된다.

상기한 인간 MCEMP1 단백질이나 그 부분 펩티드를 포함하는 폴리펩티드는, 예를 들면 Fmoc법(플루올레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 따라 합성할 수 있다(일본생화학회편, 생화학실험강좌 1, 단백질의 화학 IV, 화학 수식과 펩티드 합성, 도쿄화학동인(일본), 1981년). 또한, 각종의 시판의 펩티드 합성기를 이용하여 상법에 의해 합성할 수도 있다. 또한, 공지의 유전자 공학 방법(Sambrook 등, Molecular Cloning, 제2판, Current Protocols in Molecular Biology(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ausubel 등, Short Protocols in Molecular Biology, 제3판, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995), John Wiley & Sons 등)을 이용하여 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 조제하고, 상기 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 삽입시켜 숙주 세포에 도입하고, 상기 숙주 세포 중에서 폴리펩티드를 생산시킴으로써 목적으로 하는 폴리펩티드를 얻을 수 있다.

상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 공학적 방법이나 시판의 핵산 합성기를 이용한 상법에 의해 용이하게 조제할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 염기 서열을 포함하는 DNA는 인간 염색체 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로서 사용하고, 서열번호 1에 기재된 염기 서열을 증폭할 수 있도록 설계한 한 쌍의 프라이머를 이용하여 PCR을 행함으로써 조제할 수 있다. PCR의 반응 조건은 적절히 설정할 수 있고, 예를 들면 내열성 DNA 폴리메라아제(예를 들면, Taq 폴리메라아제 등) 및 Mg²⁺ 함유 PCR 버퍼를 이용하여 94℃에서 30초간(변성), 55℃에서 30초~1분간(어닐링), 72℃에서 1분간(신장)으로 이루어지는 반응 행정을 1사이클로 해서, 예를 들면 30사이클 행한 후, 72℃에서 7분간 반응시키는 조건 등을 예시할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. PCR의 방법, 조건 등에 대해서는, 예를 들면 Ausubel 등, Short Protocols in Molecular Biology, 제3판, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995), John Wiley & Sons(특히, 제15장)에 기재되어 있다.

또한, 본 명세서 중의 서열표의 서열번호 1~8로 나타내어지는 염기 서열 및 아미노산 서열의 정보에 의거해서 적절한 프로브나 프라이머를 조제하고, 그것을 이용하여 인간 등의 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 소망의 DNA를 단리할 수 있다. cDNA 라이브러리는 서열번호 2, 4, 6 또는 8의 단백질을 발현하고 있는 세포, 기관 또는 조직으로부터 제작하는 것이 바람직하다. 그러한 세포나 조직의 예는 골수, 말초혈단핵세포(PBMC), 백혈병, 골수이형성증후군, 골육종, 흉선종, 비만 세포종, 항문 주위 선암 등의 암 또는 종양으로부터 유래하는 세포 또는 조직이지만, 이것에 한정되지 않는다. 상기한 프로브 또는 프라이머의 조제, cDNA 라이브러리의 구축, cDNA 라이브러리의 스크리닝, 및 목적 유전자의 클로닝 등의 조작은 당업자에게 이미 알려져 있으며, 예를 들면 Sambrook 등, Molecular Cloning, 제2판, Current Protocols in Molecular Biology(1989), Ausbel 등(상기) 등에 기재된 방법에 준하여 행할 수 있다. 이와 같이 해서 얻어진 DNA로부터, 인간 MCEMP1 단백질이나 그 부분 펩티드를 코딩하는 DNA를 얻을 수 있다.

상기 숙주 세포로서는 상기 폴리펩티드를 발현 가능한 세포라면 어떠한 것이라도 좋고, 원핵 세포의 예로서는 대장균 등, 진핵 세포의 예로서는 원숭이 신장 세포 COS1, 차이니즈 햄스터 난소 세포 CHO 등의 포유동물 세포, 인간 배아 신장 세포주 HEK293, 마우스 태아 피부 세포주 NIH3T3, 출아 효모, 분열 효모 등의 효모 세포, 누에 세포, 아프리카 발톱 개구리 난세포 등이 예시되지만, 이것들에 한정되지 않는다.

숙주 세포로서 원핵 세포를 사용하는 경우, 발현 벡터로서는 바람직하게는 원핵 세포 내에서 복제 가능한 오리진, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 멀티클로닝 사이트, 터미네이터, 약제 내성 유전자, 영양 요구성 상보 유전자, 리포터 유전자 등을 갖는 발현 벡터를 사용한다. 대장균용 발현 벡터로서는 pUC계, pBluescriptII, pET 발현 시스템, pGEX 발현 시스템 등이 예시될 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 삽입시키고, 상기 벡터에 의해 원핵 숙주 세포를 형질 전환한 후, 얻어진 형질 전환체를 배양하면, 상기 DNA가 코딩하고 있는 폴리펩티드를 원핵 숙주 세포 내에서 발현시킬 수 있다. 이 때, 상기 폴리펩티드를 다른 단백질과의 융합 단백질로서 발현시킬 수도 있다.

숙주 세포로서 진핵 세포를 이용하는 경우, 발현 벡터로서는 바람직하게는 프로모터, 스플라이싱 영역, 폴리(A) 부가 부위 등을 갖는 진핵 세포용 발현 벡터를 사용한다. 그러한 발현 벡터로서는 pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV 벡터, pRS, pcDNA3.1, pSecTag(A, B, C), pYES2 등이 예시될 수 있다. 상기와 마찬가지로, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 삽입하고, 상기 벡터에 의해 진핵 숙주 세포를 형질 전환한 후, 얻어진 형질 전환체를 배양하면, 상기 DNA가 코딩하고 있는 폴리펩티드를 진핵 숙주 세포 내에서 발현시킬 수 있다. 발현 벡터로서, pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 등을 이용한 경우에는 His 태그(예를 들면, (His)6~(His)10), FLAG 태그, myc 태그, HA 태그, GFP 등 각종 태그를 부가한 융합 단백질로서 상기 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다.

발현 벡터의 숙주 세포로의 도입은 전기 천공법, 인산칼슘법, 리포솜법, DEAE 덱스트란법, 마이크로인젝션, 바이러스 감염, 리포펙션, 세포막 투과성 펩티드와의 결합 등의 주지의 방법을 이용할 수 있다.

숙주 세포로부터 목적의 폴리펩티드를 단리 정제하기 위해서는 공지의 분리 조작을 조합해서 행할 수 있다. 단리 정제 기술로서는, 예를 들면 요소 등의 변성제나 계면활성제에 의한 처리, 초음파 처리, 효소 소화, 염석이나 용매 분별 침전법, 투석, 원심분리, 한외 여과, 겔 여과, SDS-PAGE, 등전점 전기영동, 이온 교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 어피너티 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 등이 예시되지만, 이것들에 한정되지 않는다.

<항체의 구조>

항체는 통상 적어도 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 헤테로 다량체 당단백질이다. IgM은 별개로 하고, 다른 클래스의 항체는 2개의 동일한 경(L)쇄 및 2개의 동일한 중(H)쇄로 구성되는 약 150kDa의 헤테로 4량체 당단백질이다. 전형적으로, 각각의 경쇄는 하나의 디술피드 공유결합에 의해 중쇄에 연결되어 있지만, 여러가지 면역 글로불린 이소타입의 중쇄 사이의 디술피드 결합의 수는 변동한다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 쇄 내 디술피드 결합도 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 끝에 가변 도메인(VH 영역)을 갖고, 거기에 몇 가지의 정상 영역이 이어진다. 각각의 경쇄는 가변 도메인(VL 영역)을 갖고, 그 반대의 끝에 하나의 정상 영역을 갖는다. 경쇄의 정상 영역은 중쇄의 최초의 정상 영역과 정렬되어 있고, 또한 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬하고 있다. 항체의 가변 도메인은 특정 영역이 상보성 결정 영역(CDR)이라고 불리는 특정의 가변성을 나타내어 항체에 결합 특이성을 부여한다. 가변 영역의 상대적으로 보존되어 있는 부분은 프레임워크 영역(FR)이라고 칭하고 있다. 완전한 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 3개의 CDR에 의해 연결된 4개의 FR을 포함한다. 3개의 CDR은 중쇄에서는 그 N말단으부터 순서대로 CDRH1, CDRH2, CDRH3, 마찬가지로 경쇄에서는 CDRL1, CDRL2, CDRL3이라고 칭하고 있다. 항체의 항원에의 결합 특이성에는 CDRH3이 가장 중요하다. 또한, 각 쇄의 CDR은 FR 영역에 의해서 근접한 상태로 동시에 유지되고, 다른쪽의 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. 정상 영역은 항체가 항원에 결합하는 것에 직접 기여하지 않지만, 각종 이펙터 기능, 예를 들면 항체 의존성 세포 장해 활성(ADCC 활성)에의 관여, Fcγ 수용체에의 결합을 통한 식작용, 신생아 Fc 수용체(FcRn)를 통한 반감기/클리어런스 속도, 보체 캐스케이드의 C1q 구성요소를 통한 보체 의존성 세포 장해 활성(CDC 활성)을 나타낸다.

<항체의 제작>

본 발명에 있어서의 항 MCEMP1 항체란 상기와 같은 MCEMP1 단백질의 전체 길이 또는 그 단편과 면역학적 반응성을 갖는 항체를 의미한다.

여기서, 「면역학적 반응성」이란 생체 내에서 또는 생체 외에서 항체와 MCEMP1 항원이 결합하는 특성을 의미하고, 이러한 결합을 통해서 종양 또는 종양 세포를 장해(예를 들면, 사멸, 억제 또는 퇴축)하는 기능이 발휘된다. 즉, 본 발명 에서 사용되는 항체는 MCEMP1 단백질과 결합하여 종양, 바람직하게는 MCEMP1 단백질을 세포 표면에 발현하고 있는(갖고 있는) 암, 예를 들면 백혈병, 골수이형성증후군, 골육종, 흉선종, 비만세포종 또는 항문 주위 선암 등을 장해할 수 있다면, 그 종류를 불문한다.

항체의 예는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 합성 항체, 다중 특이성 항체(예를 들면, 이중 특이성 항체), 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체 등을 포함한다. 항체는 또한, 예를 들면 항체 프래그먼트(예를 들면, Fab나 F(ab')₂ 등의 프래그먼트를 포함한다. 또한, 항체는 면역 글로불린 분자의 임의의 클래스여도 좋고, 예를 들면 IgG, IgE, IgM, IgA, IgD 및 IgY, 또는 임의의 서브 클래스, 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 등이다.

항체는, 또한 글리코실화 이외에 아세틸화, 포르밀화, 아미드화, 인산화, 또는 페그(PEG)화 등에 의해 수식되어 있어도 좋다.

이하, 각종 항체의 제작예를 나타낸다.

본 발명에서 사용 가능한 폴리클로날 항체는, 예를 들면 다음과 같이 해서 얻을 수 있다.

천연의 MCEMP1 단백질 또는 GST 등과의 융합 단백질로서 대장균 등의 미생물에 있어서 발현시킨 재조합 MCEMP1 단백질 또는 그 부분 펩티드를 마우스, 인간 항체 산생 마우스, 토끼 등의 작은 동물에 면역하여 혈청을 얻는다. 이것을, 예를 들면 황산암모늄 침전, 프로테인 A, 프로테인 G 컬럼, DEAE 이온교환 크로마토그래피, MCEMP1 단백질이나 합성 펩티드를 커플링한 어피너티 컬럼 등에 의해 정제함으로써 조제한다. 후술의 실시예에서는 MCEMP1 단백질의 아미노산 서열 중, 암세포의 세포 표면에 발현하는 영역에 대한 마우스 폴리클로날 항체가 제작되어 항종양 효과가 확인되고 있다.

본 발명에서 사용 가능한 항체의 다른 예는 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체는, 예를 들면 다음과 같이 해서 얻을 수 있다. 예를 들면, MCEMP1을 세포 표면에 발현하는 세포(백혈병 세포주 U937 등)를 마우스에 투여하여 면역하고, 동 마우스로부터 비장을 추출하여 세포를 분리한 후, 상기 세포와 마우스 미엘로마 세포를 융합시켜 얻어진 융합 세포(하이브리도마) 중에서 암세포 증식 억제 작용을 갖는 항체를 산생하는 클론을 선택한다. 암세포 증식 억제 작용을 갖는 모노클로날 항체 산생 하이브리도마를 단리하고, 상기 하이브리도마를 배양하고, 배양 상청으로부터 일반적인 어피너티 정제법에 의해 항체를 정제함으로써 조제하는 것이 가능하다.

모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마는, 예를 들면 이하와 같이 해도 제조할 수 있다. 우선, 공지의 방법에 따라 감작 항원을 동물에 면역한다. 일반적 방법으로서, 감작 항원을 포유동물의 복강 내 또는 피하에 주사함으로써 행해진다. 구체적으로는, 감작 항원을 PBS(Phosphate-Buffered Saline)나 생리 식염수 등에 의해 적당량으로 희석하고, 현탁한 것에 소망에 따라 통상의 애주번트, 예를 들면 프로인트 완전 애주번트를 적량 혼합하고, 유화 후 포유동물에 4~21일마다 수회 투여한다. 또한, 감작 항원 면역시에 적절한 담체를 사용할 수도 있다.

이와 같이, 포유동물을 면역하고, 혈청 중에 소망의 항체 레벨이 상승하는 것을 확인한 후, 포유동물로부터 면역 세포를 채취하여 세포 융합에 붙이지만 바람직한 면역 세포로서는 특히 비장세포가 예시된다.

상기 면역 세포와 융합되는 다른쪽의 친세포로서 포유동물의 미에로마 세포를 이용한다. 이 미에로마 세포는 공지의 각종 세포주, 예를 들면 P3U1(P3-X63Ag8U1), P3(P3x63Ag8.653)(J. I㎜unol. (1979)123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and I㎜unology (1978)81, 1-7), NS-1(Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. I㎜unol. (1976)6, 511-519), MPC-11(Margulies. D.H. et al., Cell (1976)8, 405-415), SP2/0(Shulman, M. et al., Nature (1978)276, 269-270), FO(deSt. Groth, S. F. et al., J. I㎜unol. Methods (1980)35, 1-21), S194(Trowbridge, I.S. J. Exp. Med (1978)148, 313-323), R 210(Galfre, G. et al., Nature (1979)277, 131-133) 등이 적합하게 사용된다.

상기 면역 세포와 미에로마 세포의 세포 융합은 기본적으로는 공지의 방법, 예를 들면 쾰러와 밀스테인 등의 방법(Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol. (1981)73, 3-46) 등에 준하여 행할 수 있다.

보다 구체적으로는, 상기 세포 융합은 예를 들면 세포 융합 촉진제의 존재 하에 통상의 영양 배양액 중에서 실시된다. 융합 촉진제로서는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이 바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 또한 소망에 따라 융합 효율을 높이기 위해 디메틸술폭시드 등의 보조제를 첨가 사용할 수도 있다.

면역 세포와 미에로마 세포의 사용 비율은 임의로 설정할 수 있다. 예를 들면, 미에로마 세포에 대하여 면역 세포를 1~10배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포 융합에 사용되는 배양액으로서는, 예를 들면 상기 미에로마 세포주의 증식에 적합한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 기타 이 종류의 세포 배양에 사용되는 통상의 배양액이 사용 가능하고, 또한 소태아 혈청(FCS) 등의 혈청 보액을 병용할 수도 있다.

세포 융합은 상기 면역 세포와 미에로마 세포의 소정량을 상기 배양액 중에서 잘 혼합하고, 미리 37℃ 정도로 가온한 PEG 용액(예를 들면, 평균 분자량 1,000~6,000 정도)을 통상 30~60%(w/v)의 농도로 첨가하고, 혼합함으로써 목적으로하는 하이브리도마를 형성한다. 계속해서, 적당한 배양액을 축차적으로 첨가하고, 원심하여 상청을 제거하는 조작을 반복함으로써 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포 융합제 등을 제거한다.

이렇게 해서 얻어진 하이브리도마는 통상의 선택 배양액, 예를 들면 HAT 배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)에서 배양함으로써 선택된다. 상기 HAT 배양액에서의 배양은 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합 세포)가 사멸하는데 충분한 시간(통상, 수 일~수 주간) 계속한다. 이어서, 통상의 한계 희석법을 실시하여 목적으로 하는 항체를 산생하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝을 행한다.

또한, 인간 이외의 동물에 항원을 면역하여 상기 하이브리도마를 얻는 것 이외에 인간 림프구, 예를 들면 EB 바이러스에 감염된 인간 림프구를 in vitro에서 단백질, 단백질 발현 세포 또는 그 용해물에 의해 감작하고, 감작 림프구를 인간 유래의 영구 분열능을 갖는 미에로마 세포, 예를 들면 U266(등록번호 TIB196)과 융합시켜 소망의 활성(예를 들면, 세포 증식 억제 활성)을 갖는 인간 항체를 산생하는 하이브리도마를 얻을 수도 있다.

이렇게 해서 제작되는 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대 배양하는 것이 가능하며, 또한 액체 질소 중에서 장기 보존하는 것이 가능하다.

즉, 소망의 항원이나 소망의 항원을 발현하는 세포를 감작 항원으로서 사용하고, 이것을 통상의 면역 방법에 따라 면역하여 얻어지는 면역 세포를 통상의 세포 융합법에 의해 공지의 친세포와 융합시켜 통상의 스크리닝법에 의해 모노클로날의 항체 산생 세포(하이브리도마)를 스크리닝함으로써 제작할 수 있다.

여기서, 인간 항체 산생 마우스로서는, 예를 들면 KM 마우스(기린파마/Medarex) 및 Xeno 마우스(A㎎en)이 알려져 있다(예를 들면, 국제 공개 제WO02/43478호, 동 제WO02/092812호 등). 이러한 마우스를 MCEMP1 단백질 또는 그 단편에 의해 면역하는 경우에는 완전 인간 폴리클로날 항체를 혈액으로부터 얻을 수 있다. 또한, 면역 후의 마우스로부터 비장 세포를 인출하고, 미에로마 세포와의 융합법에 의해 완전 인간 모노클로날 항체를 제작할 수 있다.

항원의 조제는, 예를 들면 동물 세포를 이용한 방법(일본 특허 공표 2007-530068) 및 바큘로바이러스를 이용한 방법(예를 들면, 국제 공개 제WO98/46777호 등) 등에 준하여 행할 수 있다. 항원의 면역원성이 낮은 경우에는 알부민 등의 면역원성을 갖는 거대 분자와 결합시켜 면역을 행하면 좋다.

또한, 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하고, 적당한 벡터에 포함시켜 이것을 숙주에 도입하고, 유전자 재조합 기술을 이용하여 산생시킨 유전자 재조합형 항체를 사용할 수 있다(예를 들면, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 참조). 구체적으로는, 하이브리도마의 mRNA로부터 역전사 효소를 이용하여 항체의 가변 영역(V 영역)의 cDNA를 합성한다. 목적으로 하는 항체의 V 영역을 코딩하는 DNA가 얻어지면, 이것을 소망의 항체 정상 영역(C 영역)을 코딩하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현 벡터에 삽입시킨다. 또한, 항체의 V 영역을 코딩하는 DNA를, 항체 C 영역의 DNA를 포함하는 발현 벡터에 삽입시켜도 좋다. 발현 제어 영역, 예를 들면 인핸서, 프로모터의 제어 하에서 발현하도록 발현 벡터에 삽입한다. 이어서, 그 발현 벡터에 의해 숙주 세포를 형질전환하여 항체를 발현시킬 수 있다.

모노클로날 항체에는 인간 모노클로날 항체, 비인간 동물 모노클로날 항체(예를 들면, 마우스 모노클로날 항체, 랫트 모노클로날 항체, 토끼 모노클로날 항체, 닭 모노클로날 항체 등) 등이 포함된다. 모노클로날 항체는 MCEMP1 단백질 또는 그 단편을 면역한 비인간 포유동물(예를 들면, 마우스, 인간 항체 산생 마우스 등)로부터의 비장세포와 미에로마 세포의 융합에 의해 얻어진 하이브리도마를 배양함으로써 제작될 수 있다.

키메라 항체는 다른 동물 유래의 서열을 조합하여 제작되는 항체이며, 예를 들면 마우스 항체의 중쇄, 경쇄의 가변 영역과 인간 항체의 중쇄, 경쇄의 정상 영역으로 이루어지는 항체 등이다. 키메라 항체의 제작은 공지의 방법을 사용하여 행할 수 있고, 예를 들면 항체 V 영역을 코딩하는 DNA와 인간 항체 C 영역을 코딩하는 DNA를 연결하고, 이것을 발현 벡터에 삽입하여 숙주에 도입하여 산생함으로써 얻어진다.

폴리클로날 항체에는 인간 항체 산생 동물(예를 들면, 마우스)에 MCEMP1 단백질 또는 그 단편을 면역하여 얻어지는 항체가 포함된다.

인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 불리는 개변 항체이다. 인간화 항체는 면역 동물 유래의 항체의 CDR을 인간 항체의 상보성 결정 영역에 이식함으로써 구축된다. 그 일반적인 유전자 재조합 방법도 알려져 있다.

구체적으로는, 마우스 항체의 CDR과 인간 항체의 프레임워크 영역(framework region; FR)을 연결하도록 설계한 DNA 서열을 말단부에 오버랩되는 부분을 갖도록 제작한 수 개의 올리고뉴클레오티드로부터 PCR법에 의해 합성한다. 얻어진 DNA를 인간 항체 정상 영역을 코딩하는 DNA와 연결하고, 이어서 발현 벡터 에 삽입하고, 이것을 숙주에 도입하여 산생함으로써 얻어진다(유럽 특허 출원 공개 제EP239400호, 국제 공개 제WO96/02576호 참조). CDR을 통해서 연결되는 인간 항체의 FR은 상보성 결정 영역이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라, 재구성 인간 항체의 상보성 결정 영역이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 항체의 가변 영역에 있어서의 프레임워크 영역의 아미노산을 치환해도 좋다(Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53:851-856). 또한, 각종 인간 항체 유래의 프레임워크 영역으로 치환해도 좋다(국제 공개 제WO99/51743호 참조).

키메라 항체나 인간화 항체를 제작한 후에, 가변 영역(예를 들면, FR)이나 정상 영역 중의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하거나 해도 좋다.

아미노산의 치환은, 예를 들면 15개 미만, 10개 미만, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하의 아미노산, 바람직하게는 1~5개의 아미노산, 보다 바람직하게는 1개 또는 2개 아미노산의 치환이며, 치환 항체는 미치환 항체와 기능적으로 동등해야 한다. 치환은 보존적 아미노산 치환이 바람직하고, 이것은 전하, 측쇄, 극성, 방향족성 등의 성질이 유사한 아미노산 사이의 치환이다. 성질이 유사한 아미노산은, 예를 들면 염기성 아미노산(아르기닌, 리신, 히스티딘), 산성 아미노산(아스파르트산, 글루타민산), 무전하 극성 아미노산(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신), 비극성 아미노산(류신, 이소류신, 알라닌, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌), 분기쇄 아미노산(트레오닌, 발린, 이소류신), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 히스티딘) 등으로 분류할 수 있다.

본 발명의 항체는 항체 수식물이어도 좋다. 항체 수식물로서는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 예시할 수 있다. 본 발명의 항체 수식물에 있어서는 결합되는 물질은 한정되지 않는다. 이러한 항체 수식물을 얻기 위해서는 얻어진 항체에 화학적인 수식을 실시함으로써 얻을 수 있다. 이들 방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다.

여기서, 「기능적으로 동등」이란 대상이 되는 항체가 본 발명의 항체와 마찬가지의 생물학적 또는 생화학적 활성, 구체적으로는 종양을 저해하는 기능을 갖는 것, 인간에게의 적용시에 거절 반응을 본질적으로 일으키지 않는 것 등을 가리킨다. 이러한 활성으로서는, 예를 들면 세포 증식 억제 활성, 또는 결합 활성을 예시할 수 있다.

소정 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 제조하기 위한, 당업자에게 잘 알려진 방법으로서는 폴리펩티드에 변이를 도입하는 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 당업자라면 부위 특이적 변이 유발법(Hashimoto-Gotoh, T. et al., (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ., and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W. et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer, W. and Fritz, HJ., (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492, Kunkel (1988) Methods Enzymol 85, 2763-2766) 등을 이용하여 본 발명의 항체에 적절히 변이를 도입함으로써 상기 항체와 기능적으로 동등한 항체를 조제할 수 있다.

상기 항 MCEMP1 항체가 인식하는 MCEMP1 단백질의 에피토프를 인식하는 항체는 당업자에게 공지된 방법에 의해 얻는 것이 가능하다. 예를 들면, 항 MCEMP1 항체가 인식하는 MCEMP1 단백질의 에피토프를 통상의 방법(예를 들면, 에피토프 매핑 등)에 의해 결정하고, 상기 에피토프에 포함되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 면역원으로 해서 항체를 제작하는 방법이나, 통상의 방법에 의해 제작된 항체의 에피토프를 결정하고, 항 MCEMP1 항체와 에피토프가 같은 항체를 선택하는 방법 등에 의해 얻을 수 있다. 여기서, 「에피토프」는 포유동물, 바람직하게는 인간에 있어서 항원성 또는 면역원성을 갖는 폴리펩티드 단편을 가리키며, 그 최소 단위는 약 7~12개 아미노산, 바람직하게는 8~11개 아미노산으로 이루어진다.

본 발명의 항체의 친화정수 Ka(kon/koff)는, 바람직하게는 적어도 10⁷M^-1, 적어도 10⁸M^-1, 적어도 5×10⁸M^-1, 적어도 10⁹M^-1, 적어도 5×10⁹M^-1, 적어도 10¹⁰M^-1, 적어도 5×10¹⁰M^-1, 적어도 10¹¹M^-1, 적어도 5×10¹¹M^-1, 적어도 10¹²M^-1, 또는 적어도 10¹³M^-1 이다.

본 발명의 항체는 항종양제와 콘쥬게이트할 수 있다. 항체와 항종양제의 결합은 아미노기, 카르복실기, 히드록시기, 티올기 등과 반응성의 기(예를 들면, 숙신산이미딜기, 포르밀기, 2-피리딜디티오기, 말레이이미딜기, 알콕시카르보닐기, 히드록시기 등)를 갖는 스페이서를 개재해서 행할 수 있다.

항종양제의 예는 문헌 등에서 공지의 하기의 항종양제, 즉 파클리탁셀, 독소루비신, 다우노루비신, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 티오테파, 부술판, 임프로술판, 피포술판, 벤조도파(benzodopa), 카보쿠온, 메투레도파(meturedopa), 우레도파(uredopa), 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드(triethilenethiophosphoramide), 트리메틸올로멜라민(trimethylolomelamine), 불라타신, 불라타시논, 캄프토텍신, 브리오스타틴, 칼리스타틴(callystatin), 크립토피신 1, 크립토피신 8, 돌라스타틴, 듀오카르마이신, 엘레우테로빈, 판크라티스타틴, 사르코딕틴(sarcodictyin), 스폰지스타틴, 클로람부실, 클로나파진(chloRNAphazine), 콜로포스파미드(cholophosphamide), 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민옥시드히드로클로라이드, 멜파란, 노벰비친(novembichin), 페네스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실 머스타드, 카르무스틴, 클로로조토신(chlorozotocin), 호테무스틴(fotemustine), 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴, 칼리케아마이신(calicheamicin), 다이네마이신, 클로드로네이트, 에스페라마이신, 아크라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신(authramycin), 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신(cactinomycin), 카라비신(carabicin), 칼미노마이신, 카르지노필린(carzinophilin), 크로모마이신, 닥티노마이신, 데토르비신(detorbicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신(marcellomycin), 마이토마이신 C, 마이코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycins), 페플로마이신, 포트피로마이신(potfiromycin), 퓨로마이신, 쿠엘라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘(tubercidin), 우베니멕스, 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin), 데노프테린(denopterin), 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 플루다라빈(fludarabin), 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌, 안시타빈, 아자시티딘(azacitidine), 6-아자우리딘(azauridine), 카르모푸르, 시타라빈, 디옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈(enocitabine), 플록슈리딘(floxuridine); 안드로겐류, 예를 들면 칼루스테론(calusterone), 프로피온산 드로모스타놀론, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤(testolactone), 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄, 플로린산(frolinic acid), 아세글라톤, 알도포스파미드글리코시드, 아미노레불린산, 에닐우라실, 암사크린(amsacrine), 베스트라부실(bestrabucil), 비산트렌(bisantrene), 에다트락세이트(edatraxate), 데포파민(defofamine), 데메콜신(demecolcine), 디아지쿠온(diaziquone), 엘포르니틴(elfornithine), 아세트산 엘립티늄(elliptinium), 에포틸론(epothilone), 에토글루시드(etoglucid), 렌티난, 로니다민(lonidamine), 메이탄신(maytansine), 안사미토신(ansamitocine), 미토구아존(mitoguazone), 미토헥산트론, 모피단몰(mopidanmol), 니트라에린(nitraerine), 펜토스타틴, 페나메트(phenamet), 피라루비신, 로소크산트론(losoxantrone), 포도필린산(podophyllinic acid), 2-에틸히드라지드, 프로카바진, 라족산(razoxane), 리족산, 시조피란, 스피로게르마늄(spirogermanium), 테뉴아존산(tenuazonic acid), 트리아지쿠온(triaziquone), 로리딘(roridine) A, 안구이딘(anguidine), 우레탄, 빈데신, 다카바진, 만노무스틴(mannomustine), 미토브로니톨, 미토락톨(mitolactol), 피포브로만(pipobroman), 가시토신(acytosine), 도세탁셀, 클로람부실, 겜시타빈(gemcitabine), 6-티오구아닌, 메르캅토퓨린, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카보플라틴, 빈블라스틴, 에토포시드, 이포스파미드, 마이트헥산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 노반트론(novantrone), 테니포시드, 에다트렉세이트(edatrexate), 다우노마이신, 아미노프테린, 크셀로다(xeloda), 이반드로네이트(ibandronate), 이리노테칸, 토포이소머라아제 인히비터, 디플루오로메틸오르니틴(DMFO), 레티노산, 카페시타빈(capecitabine), 및 이것들의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 유도체를 포함한다.

또는, 본 발명의 항체에는 문헌 등에서 공지의 ²¹¹At, ¹³¹I, ¹²⁵I, ⁹⁰Y, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁵³SM, ²¹²Bi, ³²P, ¹⁷⁵Lu, ¹⁷⁶Lu 등의 방사성 동위체를 결합하는 것도 가능하다. 방사성 동위체는 종양의 치료나 진단을 위해 유효한 것이 바람직하다.

본 발명의 항체는, 바람직하게는 MCEMP1과 면역학적 반응성을 갖는 항체, 또는 MCEMP1을 특이적으로 인식하는 항체이다. 상기 항체는 그것을 투여하는 대상 동물에 있어서 거절 반응이 거의 또는 완전히 회피되는 구조를 갖는 항체여야 한다. 그러한 항체로서는, 예를 들면 대상 동물이 인간인 경우, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체(예를 들면, 인간-마우스 키메라 항체), 단쇄 항체, 이중 특이성 항체 등이 예시된다. 이들 항체는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 인간 항체 유래의 것이거나, 또는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 비인간 동물 항체 유래의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)과 인간 항체 유래의 프레임워크 영역으로 이루어지는 것이거나, 또는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 비인간 동물 항체 유래이며, 또한 중쇄 및 경쇄의 정상 영역이 인간 항체 유래의 것인 재조합형 항체이다. 바람직한 항체는 상기 2개의 항체이다.

이들 재조합형 항체는 다음과 같이 하여 제작할 수 있다. 하이브리도마 등의 항체 산생 세포로부터 인간 MCEMP1에 대한 모노클로날 항체(예를 들면, 인간 모노클로날 항체, 마우스 모노클로날 항체, 랫트 모노클로날 항체, 토끼 모노클로날 항체, 닭 모노클로날 항체 등)를 코딩하는 DNA를 클로닝하고, 이것을 주형으로 하여 상기 항체의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 RT-PCR법 등에 의해 제작하여 Kabat EU numbering system(Kabat 등, Sequences of Proteins of I㎜unological Interest, 5thEd. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md.(1991))에 의거해서 경쇄 및 중쇄의 각 가변 영역의 서열 또는 각 CDR1, CDR2, CDR3의 서열을 결정한다.

또한, 이들 각 가변 영역을 코딩하는 DNA 또는 각 CDR을 코딩하는 DNA를 유전자 재조합 기술(Sambrook 등, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)) 또는 DNA 합성기를 사용하여 제작한다. 여기서, 상기 인간 모노클로날 항체 산생 하이브리도마는 인간 항체 산생 동물(예를 들면, 마우스)에 인간 MCEMP1을 면역한 후, 상기 면역 동물로부터 절제한 비장세포와 미에로마 세포를 융합시킴으로써 제작할 수 있다. 이것과는 별도로, 필요에 따라 유전자 재조합 기술 또는 DNA 합성기를 이용하여 인간 항체 유래의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역 및 정상 영역을 코딩하는 DNA를 제작한다.

인간화 항체의 경우에는 인간 항체 유래의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA 중 CDR의 코딩 서열을 그것들에 대응하는 인간 이외의 동물(예를 들면, 마우스, 랫트, 닭 등) 유래의 항체의 CDR 코딩 서열과 치환한 DNA를 제작하고, 그것에 의해서 얻어진 DNA를 각각 인간 항체 유래의 경쇄 또는 중쇄의 정상 영역을 코딩하는 DNA와 연결함으로써 인간화 항체를 코딩하는 DNA를 제작할 수 있다.

키메라 항체의 경우에는 인간 이외의 동물(예를 들면, 마우스, 랫트, 닭 등) 유래의 항체의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA를 각각 인간 항체 유래의 경쇄 또는 중쇄의 정상 영역을 코딩하는 DNA와 연결함으로써 키메라 항체를 코딩하는 DNA를 제작할 수 있다.

단쇄 항체의 경우에는, 이 항체는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 링커를 개재해서 직선형상으로 연결시킨 항체이며, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA, 링커를 코딩하는 DNA, 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 결합함으로써 단쇄 항체를 코딩하는 DNA를 제작할 수 있다. 여기서, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역은 모두 인간 항체 유래의 것이거나 또는 CDR만 인간 이외의 동물(예를 들면, 마우스, 랫트, 닭 등) 유래의 항체의 CDR에 의해 치환시킨 인간 항체 유래의 것이다. 또한, 링커는 12~19개 아미노산으로 이루어지고, 예를 들면 15개 아미노산의 (G4S)3(G. -B. Kim 등, Protein Engineering Design and Selection 2007, 20(9):425-432)이 예시된다.

이중 특이성 항체(diabody)의 경우에는 이 항체는 2개의 다른 에피토프와 특이적으로 결합 가능한 항체이며, 예를 들면 중쇄 가변 영역 A를 코딩하는 DNA, 경쇄 가변 영역 B를 코딩하는 DNA, 중쇄 가변 영역 B를 코딩하는 DNA, 및 경쇄 가변 영역 A를 코딩하는 DNA를 이 순서로 결합함(단, 경쇄 가변 영역 B를 코딩하는 DNA와 중쇄 가변 영역 B를 코딩하는 DNA는 상기와 같은 링커를 코딩하는 DNA를 개재해서 결합된다.)으로써 이중 특이성 항체를 코딩하는 DNA를 제작할 수 있다. 여기서, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역은 모두 인간 항체 유래의 것이거나 또는 CDR만 인간 이외의 동물(예를 들면, 마우스, 랫트, 닭 등) 유래의 항체의 CDR에 의해 치환된 인간 항체 유래의 것이다.

상기와 같이 하여 제작된 재조합 DNA를 하나 또는 복수의 적당한 벡터에 삽입하고, 이것을 숙주 세포(예를 들면, 포유동물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 등)에 도입하여 (공)발현시킴으로써 재조합형 항체를 제작할 수 있다(P. J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; J. W. Goding., Monoclonal Antibodies : principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS).

상기 항체는 바람직하게는 세포 장해 활성을 갖고 있으며, 이것에 의해 항종양 효과를 발휘할 수 있다.

또한, 인간 MCEMP1에 대한 다른 인간 항체 또는 인간 동물 항체(예를 들면, 마우스 항체)를 산생할 수 있는 하이브리도마를 제작하고, 하이브리도마가 산생하는 모노클로날 항체를 회수하여 인간 MCEMP1과의 면역학적 결합성 및 세포 장해 활성을 지표로 하여 목적의 항체인지의 여부를 판정한다. 그것에 의해, 목적의 모노클로날 항체 산생 하이브리도마를 식별한 후, 상기와 같이 상기 하이브리도마로부터 목적의 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA를 제작하여 서열 결정하고, 상기 DNA를 다른 항체의 제작을 위해 이용한다.

또한, 본 발명의 상기 항체는 MCEMP1을 특이적으로 인식한다고 하는 특이성을 갖는 한, 항체의 특히 프레임워크 영역의 서열 및/또는 고정 영역의 서열에 있어서 1 또는 수 개(바람직하게는, 1 또는 2개)의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가가 있어도 좋다. 여기서, 수 개란 2~5개, 바람직하게는 2개 또는 3개를 의미한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 상기 항체를 코딩하는 DNA 또는 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 DNA 또는 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA도 제공한다.

이들 서열의 DNA에 의해 코딩되는 상보성 결정 영역(CDR)은 항체의 특이성을 결정하는 영역이기 때문에 항체의 그것 이외의 영역(즉, 정상 영역 및 프레임워크 영역)을 코딩하는 서열은 다른 항체 유래의 서열이어도 좋다. 여기서, 다른 항체란 인간 이외의 생물 유래의 항체도 포함하지만, 부작용 감소의 관점에서 인간 유래의 것이 바람직하다. 즉, 상기 DNA에서는 중쇄 및 경쇄의 각 프레임워크 영역 및 각 정상 영역을 코딩하는 영역이 인간 항체 유래의 대응 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 DNA는, 예를 들면 상기 방법 또는 이하의 방법에 의해 얻을 수 있다. 우선, 본 발명의 항체에 관한 하이브리도마로부터, 시판의 RNA 추출 키트를 사용하여 전체 RNA를 조제하고, 랜덤 프라이머 등을 이용하여 역전사 효소에 의해 cDNA를 합성한다. 이어서, 이미 알려진 마우스 항체 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자의 각 가변 영역에 있어서, 각각 보존되어 있는 서열의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용한 PCR법에 의해 항체를 코딩하는 cDNA를 증폭시킨다. 정상 영역을 코딩하는 서열에 대해서는 이미 알려진 서열을 PCR법에 의해 증폭함으로써 얻을 수 있다. DNA의 염기 서열은 서열 결정용 플라스미드 또는 파지에 삽입시키거나 해서 상법에 의해 결정할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항 MCEMP1 항체에 의한 MCEMP1 발현 암세포에 대한 항종양 효과는 MCEMP1 발현 세포의 이펙터 세포 항체 의존성 세포 장해 활성(ADCC 활성) 또는 MCEMP1 발현 세포의 보체 의존성 세포 장해 활성(CDC 활성)에 의해 일어나는 것으로 생각된다.

따라서, 본 발명에서 사용되는 항 MCEMP1 항체의 활성은 이하의 실시예에 구체적으로 나타내어지는 바와 같이, 생체 외에서 MCEMP1을 발현하는 암세포에 대해 상기 ADCC 활성 또는 CDC 활성을 측정함으로써 평가할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항 MCEMP1 항체는 암세포 상의 MCEMP1 단백질과 결합하고, 상기 활성에 의해 항종양 작용을 나타내기 때문에 암의 치료 또는 예방에 유용하다고 생각된다. 즉, 본 발명은 항 MCEMP1 항체를 유효성분으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물을 제공한다. 항 MCEMP1 항체를 인체에 투여하는 목적(항체 치료)으로 사용하는 경우에는 면역원성을 저하시키기 위해 인간 항체나 인간화 항체로 하는 것이 바람직하다.

또한, 항 MCEMP1 항체와 암세포 표면 상의 MCEMP1 단백질과의 결합 친화성이 높을수록, 항 MCEMP1 항체에 의한 보다 강한 항종양 활성이 얻어진다. 따라서, MCEMP1 단백질과 높은 결합 친화성을 갖는 항 MCEMP1 항체를 획득할 수 있으면 보다 강한 항종양 효과가 기대될 수 있어 암의 치료 및/또는 예방을 목적으로 한 의약 조성물로서 적응하는 것이 가능해진다. 높은 결합 친화성으로서, 상술한 바와 같이 결합정수(친화정수) Ka(kon/koff)가 바람직하게는 적어도 10⁷M^-1, 적어도 10⁸M^-1, 적어도 5×10⁸M^-1, 적어도 10⁹M^-1, 적어도 5×10⁹M^-1, 적어도 10¹⁰M^-1, 적어도 5×10¹⁰M^-1, 적어도 10¹¹M^-1, 적어도 5×10¹¹M^-1, 적어도 10¹²M^-1, 또는 적어도 10¹³M^-1인 것이 바람직하다.

<항원 발현 세포에의 결합>

항체가 MCEMP1에 결합하는 능력은 실시예에서 설명하는 바와 같은, 예를 들면 ELISA, 웨스턴 블롯법, 면역 형광 및 플로 사이토메트리 분석 등을 이용한 결합 어세이를 이용하여 특정할 수 있다.

<면역 조직 화학 염색>

MCEMP1을 인식하는 항체는 당업자에게 주지의 방법에 의한 면역 조직 화학에 의해 외과 수술 동안에 환자로부터 얻은 조직, 환자의 골수 조직, 림프절 또는 말초혈 세포나 자연히 또는 트랜스펙션 후에 MCEMP1을 발현하는 세포계를 접종한 이종 이식 조직을 담지하는 동물에서 얻은 조직으로부터, 파라포름알데히드 또는 아세톤 고정시킨 동결 절편 또는 파라포름알데히드로 고정시킨 파라핀 포매한 조직 절편을 사용하여 MCEMP1과의 반응성에 관해서 시험할 수 있다.

면역 조직 화학 염색을 위해 MCEMP1에 대하여 면역학적 반응성이 있는 항체를 여러가지 방법으로 염색시킬 수 있다. 예를 들면, 호스래디쉬 퍼옥시다아제 복합 염소 항 마우스 항체나 염소 항 토끼 항체를 반응시킴으로써 가시화할 수 있다.

<의약 조성물>

본 발명은 본 발명의 항체, 즉 상술한 MCEMP1에 대한 항체 또는 그 프래그먼트(바람직하게는 항원 결합성 프래그먼트)를 포함하는 의약 조성물(또는 의약)을 제공한다. 본 발명의 의약 조성물(또는 의약)은 통상은 상술한 MCEMP1에 대한 항체 또는 그 프래그먼트(바람직하게는 항원 결합성 프래그먼트)를 유효량으로 포함한다.

본 발명의 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물의 표적은 MCEMP1 유전자를 발현하는 암(세포)이면 특별히 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 「종양」 및 「암」이라고 하는 용어는 악성 신생물을 의미하며, 호환적으로 사용된다.

본 발명에 있어서, 대상이 되는 암으로서는 서열번호 2, 4, 6 또는 8의 아미노산 서열 또는 7개 이상의 연속 아미노산으로 이루어지는 그 부분 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 발현하고 있는 암이고, 바람직하게는 그러한 폴리펩티드를 세포 표면에 발현하고 있는 암이다. 본 발명에 있어서 대상이 되는 암은, 바람직하게는 백혈병, 골수이형성증후군, 골육종, 흉선종, 비만세포종 또는 항문 주위 선암이며, 이들 특정의 암에는 예를 들면, 급성비림프구성백혈병, 만성림프구성백혈병, 급성과립구성백혈병, 만성과립구성백혈병, 급성전골수구성백혈병, 성인 T세포백혈병, 무백혈병성백혈병, 백혈구혈증성백혈병(leukocythemic leukemia), 호염기구성백혈병, 아세포성백혈병, 소백혈병, 만성골수성백혈병, 피부백혈병, 배아세포성백혈병, 호산구성백혈병, 그로스백혈병, 리더세포성백혈병, 실링백혈병, 간세포성백혈병, 아백혈성백혈병, 미분화세포성백혈병, 유모상세포성백혈병, 혈구아세포성백혈병(hemoblastic leukemia), 혈구아세포성백혈병(hemocytoblastic leukemia), 조직구백혈병, 간세포성백혈병, 급성단구성백혈병, 백혈구감소성백혈병, 림프성백혈병, 림프아구성백혈병, 림프구성백혈병, 림프향성 백혈병, 림프모양백혈병, 림프육종세포성백혈병, 비만세포백혈병, 거핵구성백혈병, 소골수아구성백혈병, 단구성백혈병, 골수아구성백혈병 골수구성백혈병, 골수과립구성백혈병, 골수단구성백혈병, 나에겔리백혈병, 형질세포백혈병, 형질세포성백혈병, 전골수구성백혈병, 불응성빈혈(RA), 철아구를 수반하는 불응성빈혈(RARS), 아구 증가를 수반하는 불응성빈혈(RAEB), 이행기 RAEB(RAEB-T), 전백혈병 및 만성골수단구성백혈병(CMML), 골내통상형골육종과 아계골육종(골내고분화형골육종, 원형세포골육종, 표재골육종, 방골골육종, 골막골육종 또는 표재고악성골육종), 흉선종, 비만세포종, 항문 주위 선종, 항문 주위 선암이 포함되지만, 이것들에 한정되지 않는다.

또한, 대상이 되는 동물은 포유동물이며, 예를 들면 영장류, 애완동물, 가축류, 경기용 동물 실험 동물 등을 포함하는 포유동물이고, 특히 인간, 개 및 고양이가 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 항체를 의약 조성물로서 사용하는 경우에는 당업자에게 공지의 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 예를 들면, 물 또는 그것 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 액과의 무균성 용액 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약리학상 허용되는 담체 또는 매체 또는 첨가제, 구체적으로는 멸균수나 생리식염수, 식물기름, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 결합제 등과 적절히 조합하고, 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼합함으로써 제제화하는 것이 고려된다. 이들 제제에 있어서의 유효성분량은 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 하는 것이다.

주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비히클을 사용하여 통상의 제제 실시에 따라 조제할 수 있다.

주사용 수용액으로서는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 기타 보조약을 포함하는 등장액, 예를 들면 D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨이 예시되고, 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리알코올, 예를 들면 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트 80(TM), HCO-60과 병용해도 좋다.

유성액으로서는 참기름, 대두유가 예시되고, 용해 보조제로서 벤조산벤질, 벤질알코올과 병용해도 좋다. 또한, 완충제, 예를 들면 인산염 완충액, 아세트산나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면 염산프로카인, 안정제, 예를 들면 벤질알코올, 페놀, 산화방지제와 배합해도 좋다. 조제된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전시킨다.

투여는 경구 또는 비경구이며, 바람직하게는 비경구 투여이며, 구체적으로는 주사제형, 경비 투여제형, 경폐 투여제형, 경피 투여형 등이 예시된다. 주사제형의 예로서는, 예를 들면 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국소적으로 투여할 수 있다. 또한, 주사, 주입, 서방제제의 매입 등에 의한 종양에의 국소 투여에 의해 본 발명의 항체를 종양에 직접 투여해도 좋다.

또한, 환자의 연령, 체중, 성별, 증상 등에 따라 적절히 투여 방법을 선택할 수 있다. 항체 또는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 의약 조성물의 투여량으로서는, 예를 들면 1회에 대해 체중 1㎏당 0.0001㎎~1,000㎎의 범위에서 선택하는 것이 가능하다. 또는, 예를 들면 환자당 0.001~100,000㎎/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있지만, 이들 수치에 반드시 제한되는 것은 아니다. 투여량, 투여 방법은 환자의 체중, 연령, 성별, 증상 등에 따라 변동되지만, 당업자라면 적절히 선택하는 것이 가능하다.

본 발명의 항체 또는 그 프래그먼트, 또는 그것을 포함하는 상기 의약 조성물을 피험자에게 투여함으로써 상술의 암, 특히 MCEMP1을 세포 표면에 발현하고 있는 암, 바람직하게는 백혈병, 골수이형성증후군, 골육종, 흉선종, 비만세포종 또는 항문 주위 선암을 치료 및/또는 예방할 수 있다.

또한, 본 발명의 의약 조성물(또는 의약)을 위에서 예시한 바와 같은 항종양제 또는 항종양제를 포함하는 의약 조성물(또는 의약)과 조합하여 피험자에게 병용 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 및/또는 예방 방법도 본 발명에 포함된다. 대상이 되는 암은 상기와 같다. 본 발명의 항체 또는 그 프래그먼트와 항종양제는 동시에 또는 별도로 피험자에게 투여될 수 있다. 별도로 투여하는 경우에는, 어느 의약 조성물이 먼저이거나 또는 나중이어도 좋고, 그것들의 투여 간격, 투여량, 투여 경로 및 투여 횟수는 전문의에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 동시에 투여하는 경우, 예를 들면 본 발명의 항체 또는 그 프래그먼트와 항종양제를 약리학상 허용되는 담체(또는 매체) 중에서 혼합해서 제제화하여 얻어지는 의약제형의 의약 조성물도 포함되는 것으로 한다. 또한, 항종양제를 함유하는 상기 의약 조성물 및 제형 중 어느 것에 대해서도 본 발명의 항체를 함유하는 의약 조성물 및 제형에 대한 처방, 제제화, 투여 경로, 용량, 암 등의 설명을 적용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 의약 조성물과, 위에서 예시한 바와 같은 항종양제를 포함하는 의약 조성물을 포함하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 조합 의약품 및 그것을 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 및/또는 예방 방법도 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그 프래그먼트와 항종양제를 약리학상 허용되는 담체 및/또는 첨가제와 함께 포함하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물도 제공한다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의거해서 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들 구체예에 의해 제한되지 않는 것으로 한다.

실시예 1 SEREX법에 의한 신규 암 항원 단백질의 동정

(1) cDNA 라이브러리의 제작

건상한 개의 정소 조직으로부터, 산 구아니듐-페놀-클로로포름법(Acid guanidium-Phenol-Chloroform법)에 의해 전체 RNA를 추출하고, Oligotex-dT30 mRNA purification Kit(타카라슈조우)를 이용하여 키트 첨부의 프로토콜에 따라 폴리 A RNA를 정제했다.

이 얻어진 mRNA(5㎍)를 이용하여 개 정소 cDNA 파지 라이브러리를 합성했다. cDNA 파지 라이브러리의 제작에는 cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Clonig Kit(STRATAGENE)를 이용하고, 키트 첨부의 프로토콜에 따라 라이브러리를 제작했다. 제작한 cDNA 파지 라이브러리의 사이즈는 1×10⁶pfu/㎖였다.

(2) 혈청에 의한 cDNA 라이브러리의 스크리닝

상기에서 제작한 개 정소 cDNA 파지 라이브러리를 이용하여 이뮤노스크리닝을 행했다. 구체적으로는 Φ90×15㎜의 NZY 아가로오스 플레이트에 약 2,500클론이 되도록 숙주 대장균(XL1-Blue MRF')에 파지를 감염시키고, 42℃, 3~4시간 배양하여 용균반(플라크)을 제작하고, IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토시드)를 침투시킨 니트로셀룰로오스 멤브레인(Hybond C Extra : GE Healthcare Bio-Scinece)에 의해 플레이트를 37℃에서 4시간 덮음으로써 단백질을 유도·발현시켜 멤브레인에 단백질을 전사했다. 그 후, 멤브레인을 회수하고, 0.5% 탈지분유를 포함하는 TBS(10mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH7.5)에 침지하고, 4℃에서 하룻밤 진탕함으로써 비특이 반응을 억제했다. 이 필터를 500배 희석한 환견 혈청과 실온에서 2~3시간 반응시켰다.

상기 환견 혈청으로서는 백혈병 환견으로부터 채취한 혈청을 사용했다. 이들 혈청은 -80℃에서 보존하고, 사용 직전에 전처리를 행했다. 혈청의 전처리 방법은 이하의 방법에 의한다. 즉, 외래 유전자를 삽입하고 있지 않은 λ ZAP Express 파지를 숙주 대장균(XL1-Blure MRF')에 감염시킨 후, NZY 플레이트 배지 상에서 37℃, 하룻밤 배양했다. 이어서, 0.5M NaCl을 포함하는 0.2M NaHCO₃ pH8.3의 버퍼를 플레이트에 추가하고, 4℃에서 15시간 정치 후, 상청을 대장균/파지 추출액으로서 회수했다. 이어서, 회수한 대장균/파지 추출액을 NHS-컬럼(GE Healthcare Bio-Science)에 통액하여 대장균·파지 유래의 단백질을 고정화했다. 이 단백질 고정화 컬럼에 환견 혈청을 통액·반응시켜 대장균 및 파지에 흡착하는 항체를 혈청으로부터 제거했다. 컬럼을 그냥 지나친 혈청 획분은 0.5% 탈지 분유를 포함하는 TBS로 500배 희석하여 이것을 이뮤노스크리닝 재료로 했다.

이러한 처리 혈청과 단백질을 블롯팅한 상기 멤브레인을 TBS-T(0.05% Tween20/TBS)에서 4회 세정한 후, 2차 항체로서 0.5% 탈지분유를 포함하는 TBS로 5,000배 희석을 행한 염소 항 개 IgG(Goat anti Dog IgG-h+L HRP conjugated : BETHYL Laboratories)를 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켜 NBT/BCIP 반응액(Roche)을 이용한 효소 발색 반응에 의해 검출하고, 발색 반응 양성 부위에 일치하는 콜로니를 Φ90×15㎜의 NZY 아가로오스 플레이트 상에서 채취하여 SM 완충액(100㎜ NaCl, 10mM MgClSO₄, 50mM Tris-HCl, 0.01% 젤라틴 pH7.5) 500㎕에 용해시켰다. 발색 반응 양성 콜로니가 단일화될 때까지 상기와 마찬가지의 방법에 의해 2차, 3차 스크리닝을 반복하여 혈청 중의 IgG와 반응하는 약 10,000개의 파지 클론을 스크리닝하여 1개의 양성 클론을 단리했다.

(3) 단리 항원 유전자의 상동성 검색

상기 방법에 의해 단리한 1개의 양성 클론을 염기 서열 해석에 제공하기 위해 파지 벡터로부터 플라스미드 벡터로 전환하는 조작을 행했다. 구체적으로는, 숙주 대장균(XL1-Blue MRF')을 흡광도(OD₆₀₀)가 1.0으로 되도록 조제한 용액 200㎕와, 정제한 파지 용액 100㎕, 또한 ExAssist helper phage(STRATAGENE) 1㎕를 혼합한 후, 37℃에서 15분간 반응 후 LB 배지를 3㎖ 첨가하고, 37℃에서 2.5~3시간 배양을 행하고, 즉시 70℃의 수욕에서 20분간 보온한 후 4℃, 1,000×g, 15분간 원심을 행하여 상청을 파지미드 용액으로서 회수했다. 이어서, 파지미드 숙주 대장균(SOLR)을 흡광도 OD₆₀₀이 1.0으로 되도록 조제한 용액 200㎕와, 정제된 파지 용액 10㎕를 혼합한 후 37℃에서 15분간 반응시키고, 50㎕를 암피실린(최종 농도 50㎍/㎖) 함유 LB 한천 배지에 시딩하여 37℃에서 하룻밤 배양했다. 트랜스폼한 SOLR의 싱글 콜로니를 채취하고, 암피실린(최종 농도 50㎍/㎖) 함유 LB 배지에서 37℃에서 배양 후, QIAGEN plasmid Miniprep Kit(퀴아젠)를 사용하여 목적의 인서트를 갖는 플라스미드 DNA를 정제했다.

정제한 플라스미드는 서열번호 17에 기재된 T3 프라이머와 서열번호 18에 기재된 T7 프라이머를 이용하여 프라이머 워킹법에 의한 인서트 전체 길이 서열의 해석을 행했다. 이 시퀀스 해석에 의해 서열번호 3에 기재된 유전자 서열을 취득했다. 이 유전자의 염기 서열 및 아미노산 서열을 이용하여 서열 동일성 검색 프로그램 BLAST 서치(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 행하여 이미 알려진 유전자와의 서열 동일성 검색을 행한 결과, 얻어진 유전자는 MCEMP1 유전자인 것이 판명되었다. 개 MCEMP1의 인간 상동인자인 인간 MCEMP1에서는 서열 동일성이 염기 서열 70%, 아미노산 서열 51%이며, 고양이 MCEMP1에서는 서열 동일성이 염기 서열 83%, 아미노산 서열 64%이고, 마우스 상동인자인 마우스 MCEMP1에서는 서열 동일성이 염기 서열 65%, 아미노산 서열 47%였다. 인간 MCEMP1의 염기 서열을 서열번호 1, 아미노산 서열을 서열번호 2로, 고양이 MCEMP1의 염기 서열을 서열번호 5, 아미노산 서열을 서열번호 6으로, 마우스 MCEMP1의 염기 서열을 서열번호 7, 아미노산 서열을 서열번호 8로 나타낸다.

(4) 각 조직에서의 유전자 발현 해석

상기 방법에 의해 얻어진 유전자에 대해 개, 인간 및 마우스의 각종 정상 조직, 각종 종양 조직 및 각종 암세포주에 있어서의 발현을 RT-PCR(Reverse Transcription-PCR)법에 의해 조사했다. 역전사 반응은 이하와 같이 행했다. 즉, 각 조직 50~100㎎ 및 각 세포주 5~10×10⁶개의 세포로부터 TRIZOL 시약(ThermoFisher Scientific)을 이용하여 첨부의 프로토콜에 따라 전체 RNA를 추출했다. 이 전체 RNA를 이용하여 Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(ThermoFisher Scientific)에 의해 본 키트 첨부의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성했다. 인간 정상 조직(뇌, 정소, 결장, 태반)의 cDNA는 유전자 풀 cDNA(ThermoFisher Scientific), QUICK-Clone cDNA(클론테크) 및 Large-Insert cDNA Library(클론테크)를 사용했다. PCR 반응은 취득한 유전자 특이적인 프라이머(개 프라이머는 서열번호 19 및 20, 인간 프라이머는 서열번호 21 및 22, 마우스 프라이머는 서열번호 23 및 24에 기재)를 사용하여 이하와 같이 행했다. 즉, 역전사 반응에 의해 조제한 cDNA 샘플 0.25㎕, 상기 프라이머를 각 2μM, 0.2mM의 각 dNTP, 0.65U의 ExTaq 폴리메라아제(타카라슈조우)로 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 첨가하여 전체량을 25㎕로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD)를 이용하여 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분의 사이클을 30회 반복하여 PCR을 행했다. 그 결과, 도 1에 나타내는 바와 같이 개 MCEMP1 유전자는 개 종양 조직에서는 비만세포종, 항문 주위 선암에서 강한 발현이 보여졌다(도 1). 인간 MCEMP1 유전자 발현에 있어서는 건상한 인간 조직에서는 대부분의 조직에서 발현이 보이지 않고, 한편 인간 암세포에서는 백혈병, 골수이형성증후군, 골육종의 세포주에서 인간 MCEMP1 유전자의 강한 발현이 보여졌다(도 2). 또한, 마우스 MCEMP1 유전자는 백혈병, 흉선종의 세포주에서 발현이 검출되었다(도 3).

실시예 2 인간 MCEMP1 단백질의 제작

(1) 인간 MCEMP1을 코딩하는 전체 길이 cDNA 및 인간 MCEMP1의 세포외 영역을 코딩하는 cDNA의 클로닝

인간 MCEMP1을 코딩하는 전체 길이 cDNA는 실시예 1에서 취득한 서열번호 1의 유전자를 기초로 이하의 방법에 의해 클로닝했다. PCR은 실시예 1에서 제작한 각종 조직·세포 유래 cDNA 중 RT-PCR법에 의한 발현이 확인되었던 cDNA를 1㎕, EcoRI 및 NotI 제한 효소 절단 서열을 포함하는 2종류의 프라이머(서열번호 25 및 26으로 기재)를 각 0.4μM, 0.2mM dNTP, 1.25U의 PrimeSTAR HS 폴리메라아제(타카라슈조우)로 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 첨가하여 전체량을 50㎕로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD)를 이용하여 98℃에서 10초, 55℃에서 15초, 72℃에서 1분의 사이클을 30회 반복함으로써 PCR을 행했다. 또한, 상기 2종류의 프라이머는 서열번호 2의 아미노산 서열 전체 길이를 코딩하는 영역을 증폭하는 것이었다. PCR 후, 증폭된 DNA를 1% 아가로오스 겔에서 전기영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)를 이용하여 약 0.6kbp의 DNA 단편을 정제했다. 상기 PCR 반응에 의해 얻어진 증폭 산물은 pcDNA3.1(ThermoFisher Scientific)에 삽입했다(이하, 인간 MCEMP1/pcDNA3.1). 또한, DNA 시퀀서를 이용한 시퀀싱에 의해, 그 증폭 산물이 인간 MCEMP1을 코딩하는 cDNA 서열인 것을 확인했다. 서열번호 1로 나타내어지는 서열은 인간 MCEMP1 유전자의 염기 서열을, 서열번호 2로 나타내어지는 서열은 인간 MCEMP1 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.

또한, 서열번호 1을 기초로 KpnI 및 EcoRI 제한 효소 절단 서열을 포함하는 2종류의 프라이머(서열번호 27 및 28에 기재)를 각 0.4μM, 0.2mM dNTP, 1.25U의 PrimeSTAR HS 폴리메라아제(타카라슈조우)로 되도록 각 시약과 첨부 버퍼를 첨가하여 전량을 50㎕로 하고, Thermal Cycler(BIO RAD)를 이용하여 98℃에서 10초, 55℃에서 15초, 72℃에서 30초의 사이클을 30회 반복함으로써 PCR을 행했다. 또한, 상기 2종류의 프라이머는 서열번호 1 중 MCEMP1 단백질의 세포 외 영역의 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 10을 코딩하는 영역을 증폭하는 것이었다. PCR 후, 증폭된 DNA를 1% 아가로오스 겔에서 전기영동하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)를 이용하여 약 0.3kbp의 DNA 단편을 정제했다. 상기 PCR 반응에 의해 얻어진 증폭 산물은 마우스 IgG2a Fc 단백질을 코딩하는 cDNA가 삽입된 pSecTagB(ThermoFisher Scientific)에 연결하고, 인간 MCEMP1 세포 외 영역/마우스 IgG2a Fc 융합 단백질(이하, hMCEMP1ECD-mIgG2aFc)을 코딩하는 발현 벡터로 했다(이하, pSecB-hMCEMP1ECD-mIgG2aFc). 또한, DNA 시퀀서를 이용한 시퀀싱에 의해서 hMCEMP1ECD-mIgG2aFc를 코딩하는 cDNA 서열인 것을 확인했다. 서열번호 29로 나타내어지는 서열은 hMCEMP1ECD-mIgG2aFc를 코딩하는 염기 서열을, 서열번호 30으로 나타내어지는 서열은 hMCEMP1ECD-mIgG2aFc의 아미노산 서열을 나타낸다.

(2) hMCEMP1ECD-mIgG2aFc의 제작

MCEMP1에 대한 항체를 제작하기 위한 면역 항원으로서 hMCEMP1ECD-mIgG2aFc를 제작했다.

발현 벡터 pSecB-hMCEMP1ECD-mIgG2aFc를 인간 태아 신장 세포주 HEK293 세포에 리포펙션법에 의해 도입하고, 도입 7일 후의 배양 상청으로부터 hMCEMP1ECD-mIgG2aFc의 정제를 실시했다. 배양 상청을 Hi Trap ProteinA HP 컬럼(GE 헬스케어 바이오사이언스)에 어플라이하고, 결합 버퍼(20mM 인산나트륨(pH7.0))로 세정 후, 용출 버퍼(0.1M 글리신-HCl(pH2.7))로 용출했다. 용출액은 중화 버퍼(1M Tris-HCl(pH9.0))를 첨가한 튜브에 용출함으로써 즉시 중화했다. 이어서, 상기 방법에 의해 얻어진 용출액의 버퍼를 한외 여과 NANOSEP 10K OMEGA(PALL)를 이용하여 생리용 인산 완충액(닛스이세이야쿠)으로 치환한 후, HT 터프린 아크로디스크 0.22μm(PALL)에서 무균 여과를 행하고, 이것을 이하의 실험에 사용했다.

실시예 3 MCEMP1의 세포 외 영역에 결합하는 폴리클로날 항체의 제작

(1)MCEMP1에 대한 폴리클로날 항체의 제작

MCEMP1의 세포 외 영역에 결합하는 항체를 얻기 위해, 상기에서 제작한 hMCEMP1ECD-mIgG2aFc 0.1㎎을 항원으로 하여, 등용량의 완전 프로이드 어주번트(CFA) 용액과 혼합하고, 이것을 2주간마다 4회, 마우스의 피하에 투여를 행했다. 그 후, 혈액을 채취하여 폴리클로날 항체를 포함하는 항혈청을 얻었다. 또한, 이 항혈청을 프로테인 G 담체 컬럼(GE 헬스케어 바이오사이언스)을 이용하여 정제하고, hMCEMP1ECD-mIgG2aFc에 대한 폴리클로날 항체를 얻었다. 또한, 항원을 투여하고 있지 않는 쥐의 혈청을 상기와 마찬가지로 하여 단백질 G 담체를 이용하여 정제한 것을 컨트롤 항체로 했다.

(2)전체 길이 인간 MCEMP1 정상 발현 세포의 수립

상기에서 제작한 인간 MCEMP1/pcDNA3.1을 CHO-K1 세포(ATCC사)에 리포펙션법에 의해 도입하고, 500㎍/㎖의 G418(나카라이사)에 의한 선발에 의해, 전체 길이 인간 MCEMP1을 정상적으로 발현하는 CHO 세포주를 수립했다(CHO-인간 MCEMP1). 또한, MCEMP1을 코딩하는 cDNA가 삽입되어 있지 않은 발현 벡터(이하, emp/pcDNA3.1)를 상기와 마찬가지로 도입하여 선발한 세포를 컨트롤 세포로 했다(이하, CHO-emp).

(3) 세포 표면 상에서의 항원 단백질의 발현 해석

이어서, (2)에서 수립한 세포 표면 상에 발현하는 MCEMP1 특이적으로 (1)에서 제작한 폴리클로날 항체가 반응하는지의 여부를 조사했다. CHO-인간 MCEMP1 세포 및 CHO-emp 세포 각각 10⁶개 세포를 1.5㎖의 마이크로 원심 튜브에서 원심분리했다. 이것에, 상기 (1)에서 조제한 MCEMP1에 대한 폴리클로날 항체 2㎍(5㎕)를 첨가하고, 또한 95㎕의 0.1% 소태아 혈청을 포함하는 PBS로 현탁 후, 얼음 위에서 1시간 정치했다. PBS로 세정한 후, 5㎕의 FITC 표지 염소 항 마우스 IgG 항체(산타크루즈) 및 95㎕의 0.1% 소태아 혈청(FBS)을 포함하는 PBS로 현탁하고, 얼음 위에서 1시간 정치했다. PBS로 세정 후, 벡톤 디킨슨(주)의 FACS 칼리버에 의해 형광 강도를 측정했다. 한편, 상기와 마찬가지의 조작을 MCEMP1에 대한 폴리클로날 항체 대신에 상기 (1)에서 조제한 컨트롤 항체를 이용해서 행하여 컨트롤로 했다. 그 결과, 항 인간 MCEMP1 항체를 첨가시킨 CHO-인간 MCEMP1 세포는 컨트롤에 비해서 형광 강도가 208%인 형광 강도의 증강을 나타냈다. 한편, 마찬가지의 조작을 CHO-emp 세포에 대하여 실시했다. 그 결과, 항 인간 MCEMP1 항체를 첨가시킨 CHO-emp 세포는 컨트롤에 비해서 형광 강도가 0%인 형광 강도의 증강을 나타냈다. 이것으로부터, 항 인간 MCEMP1 항체는 세포막 표면 상에 발현하는 MCEMP1 단백질 특이적으로 결합하는 것이 명백해졌다. 또한, 상기 형광 강도의 증강률은 각 세포에 있어서의 평균 형광 강도(MFI값)의 증가율로 나타내어지고, 이하의 계산식에 의해 산출했다.

평균 형광 강도의 증가율(형광 강도의 증강률)(%)=((항 인간 MCEMP1 항체를 반응시킨 세포의 MFI값)-(컨트롤 MFI값))÷(컨트롤 MFI값)×100.

이어서, MCEMP1 유전자의 발현이 많이 확인된 백혈병 세포주 2종(U937, THP-1) 및 골수이형성증후군 세포주 1종(MDS92)에 대하여, 그 세포 표면 상에 MCEMP1 단백질이 발현하고 있는지의 여부를 조사했다. 상기에서 유전자 발현이 확인된 각 인간 세포주 각각 10⁶개 세포를 1.5㎖의 마이크로 원심 튜브에서 원심 분리했다. 이것에, 상기 (1)에서 조제한 MCEMP1에 대한 폴리클로날 항체 2㎍(5㎕)을 첨가하고,또한 95㎕의 0.1% 소태아 혈청을 포함하는 PBS로 현탁 후, 얼음 위에서 1시간 정치했다. PBS로 세정한 후, 5㎕의 FITC 표지 염소 항 마우스 IgG 항체(산타크루즈) 및 95㎕의 0.1% 소태아 혈청(FBS)을 포함하는 PBS로 현탁하고, 얼음 위에서 1시간 정치했다. PBS로 세정 후, 벡톤 디킨슨(주)의 FACS 칼리버에 의해 형광 강도를 측정했다. 한편, 상기와 마찬가지의 조작을 MCEMP1에 대한 폴리클로날 항체 대신에 상기 (1)에서 조제한 컨트롤 항체를 이용해서 행하여 컨트롤로 했다. 그 결과, 항 인간 MCEMP1 항체를 첨가시킨 세포는 컨트롤에 비해서 모두 형광 강도가 30% 이상 강했다. 구체적으로는, U937이 175%, THP-1이 123%, MDS92가 137%인 형광 강도의 증강을 나타냈다. 이것으로부터, 상기 인간 암세포주의 세포막 표면 상에 MCEMP1 단백질이 발현되어 있는 것이 확인되었다.

또한, 상기 형광 강도의 증강률은 각 세포에 있어서의 평균 형광 강도(MFI 값)의 증가율로 나타내어지며, 이하의 계산식에 의해 산출했다.

평균 형광 강도의 증가율(형광 강도의 증강률)(%)=((항 인간 MCEMP1 항체를 반응시킨 세포의 MFI값)-(컨트롤 MFI값))÷(컨트롤 MFI값)×100.

실시예 4 MCEMP1에 대한 폴리클로날 항체의 암세포에 대한 항종양 효과(ADCC 활성)

이어서, MCEMP1에 대한 폴리클로날 항체가 MCEMP1을 발현하는 종양 세포를 장해할 수 있는지의 여부를 검토했다. 실시예 3에서 조제한 인간 MCEMP1에 대한 폴리클로날 항체를 이용하여 평가를 행했다. MCEMP1의 발현이 확인되어 있는 인간 백혈병 세포주 U937, 골수이형성증후군 세포주 MDS92를 10⁶개 50㎖용량의 원심 튜브에 모아 100μCi의 크로뮴 51을 첨가하고, 37℃에서 2시간 인큐베이트했다. 그 후, 10% 소태아 혈청을 포함하는 RPMI1640 배지로 3회 세정하고, 96웰 바닥 플레이트 1웰당 10³개씩 첨가했다. 이것에, 상기 인간 MCEMP1에 대한 폴리클로날 항체를 1㎍ 첨가하고, 또한 마우스의 말초혈로부터 분리한 림프구를 각각 2×10⁵개씩 첨가하고, 37℃, 5% CO₂의 조건 하에서 4시간 배양했다. 배양 후, 장해를 받은 종양 세포로부터 방출되는 배양 상청 중의 크롬(Cr) 51의 양을 측정하고, 인간 MCEMP1에 대한 폴리클로날 항체에 의한 암세포에 대한 ADCC 활성을 산출했다. 그 결과, U937 세포에 대하여 18.1%, MDS92 세포에 대하여 17.3%의 ADCC 활성이 확인되었다(도 4 참조). 한편, 각각의 세포주에 대하여 항원에 의해 면역되어 있지 않은 마우스의 말초혈로부터 조제한 컨트롤 항체(실시예 3)를 이용하여 마찬가지의 작업을 행한 경우, 및 항체를 첨가하지 않았던 경우에는, 활성은 거의 확인되지 않았다(도 4 참조). 따라서, MCEMP1에 대한 항체를 이용한 ADCC 활성에 의해 MCEMP1을 발현하는 종양 세포를 장해할 수 있는 것이 명확해졌다.

또한, 도 4 중의 세포 장해 활성(ADCC 활성)은 상기와 같이 본 발명에서 사용되는 MCEMP1에 대한 항체, 마우스 림프구 및 크롬 51을 도입시킨 10³개의 세포주를 혼합하여 4시간 배양하고, 배양 후 배지에 방출된 크롬 51의 양을 측정하여 이하의 계산식 *에 의해 산출한 백혈병 세포주에 대한 세포 장해 활성을 나타낸 결과이다.

*식 : 세포 장해 활성(%)=MCEMP1에 대한 항체 및 마우스 림프구를 첨가했을 때의 U937로부터의 크롬 51 유리량÷1N 염산을 첨가한 표적 세포로부터의 크롬 51 유리량×100.

(산업상 이용가능성)

본 발명의 항체는 암의 치료 및/또는 예방을 위해 유용하다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 그대로 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.

SEQUENCE LISTING <110> TORAY INDUSTRIES, INC. <120> A pharmaceutical composition for treating and/or preventing a cancer <130> PH-6864-PCT <150> JP 2016-064035 <151> 2016-03-28 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1326 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (26)..(589) <400> 1 tggacaaatt tgcgggctgg ggacc atg gaa gtg gag gaa atc tac aag cac 52 Met Glu Val Glu Glu Ile Tyr Lys His 1 5 cag gaa gtc aag atg caa gca cca gcc ttc agg gac aag aaa cag ggg 100 Gln Glu Val Lys Met Gln Ala Pro Ala Phe Arg Asp Lys Lys Gln Gly 10 15 20 25 gtc tca gcc aag aat caa ggt gcc cat gac cca gac tat gag aat atc 148 Val Ser Ala Lys Asn Gln Gly Ala His Asp Pro Asp Tyr Glu Asn Ile 30 35 40 acc ttg gcc ttc aaa aat cag gac cat gca aag ggt ggt cat tca cga 196 Thr Leu Ala Phe Lys Asn Gln Asp His Ala Lys Gly Gly His Ser Arg 45 50 55 ccc acg agc caa gtc cca gcc cag tgc agg ccg ccc tca gac tcc acc 244 Pro Thr Ser Gln Val Pro Ala Gln Cys Arg Pro Pro Ser Asp Ser Thr 60 65 70 cag gtc ccc tgc tgg ttg tac aga gcc atc ctg agc ctg tac atc ctc 292 Gln Val Pro Cys Trp Leu Tyr Arg Ala Ile Leu Ser Leu Tyr Ile Leu 75 80 85 ctg gcc ctg gcc ttt gtc ctc tgc atc atc ctg tca gcc ttc atc atg 340 Leu Ala Leu Ala Phe Val Leu Cys Ile Ile Leu Ser Ala Phe Ile Met 90 95 100 105 gtg aag aat gct gag atg tcc aag gag ctg ctg ggc ttt aaa agg gag 388 Val Lys Asn Ala Glu Met Ser Lys Glu Leu Leu Gly Phe Lys Arg Glu 110 115 120 ctt tgg aat gtc tca aac tcc gta caa gca tgc gaa gag aga cag aag 436 Leu Trp Asn Val Ser Asn Ser Val Gln Ala Cys Glu Glu Arg Gln Lys 125 130 135 aga ggc tgg gat tcc gtt cag cag agc atc acc atg gtc agg agc aag 484 Arg Gly Trp Asp Ser Val Gln Gln Ser Ile Thr Met Val Arg Ser Lys 140 145 150 att gat aga tta gag acg aca tta gca ggc ata aaa aac att gac aca 532 Ile Asp Arg Leu Glu Thr Thr Leu Ala Gly Ile Lys Asn Ile Asp Thr 155 160 165 aag gta cag aaa atc ttg gag gtg ctg cag aaa atg cca cag tcc tca 580 Lys Val Gln Lys Ile Leu Glu Val Leu Gln Lys Met Pro Gln Ser Ser 170 175 180 185 cct caa taa atgagaggac attgtggcag ccaaagccac aacttggaag 629 Pro Gln atggggctgc acctgccaac gaagacggga aatgaccccc cccccccagc ctagtgtgaa 689 cctgcccctc gtcccacgta tagaaaaacc tcgagtcatg gtgaatgagt gtctcggagt 749 tgctcgtgtg tgtgtacacc tgcgtgcgtg tgtgtgcgtg tgtgcgcgtg tgttcgtgta 809 tgtgcgtgtg tgcgtgcgcg tgtgtgtgca ttttgcaaag ggtggacatt tcagtgtatc 869 tcccagaaag gtgatgaatg aataggactg agagtcacag tgaatgtggc atgcatgcct 929 gtgtcatgtg acatatgtga gtctcggcat gtcacggtgg gtggctgtgt ctgagcacct 989 ccagcagatg tcactctgag tgtgggtgtt ggtgacatgc attgcacggg cctgtctccc 1049 tgtttgtgta aacatactag agtatactgc ggcgtgtttt ctgtctaccc atgtcatggt 1109 gggggagatt tatctccgta catgtgggtg tcgccatgtg tgccctgtca ctatctgtgg 1169 ctgggtgaac ggctgtgtca ttatgagtgt gccgagttat gccaccctgt gtgctcaggg 1229 cacatgcaca cagacattta tctctgcact cacattttgt gacttatgaa gataaataaa 1289 gtcaagggaa aacagcgtca aaaaaaaaaa aaaaaaa 1326 <210> 2 <211> 187 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Glu Val Glu Glu Ile Tyr Lys His Gln Glu Val Lys Met Gln Ala 1 5 10 15 Pro Ala Phe Arg Asp Lys Lys Gln Gly Val Ser Ala Lys Asn Gln Gly 20 25 30 Ala His Asp Pro Asp Tyr Glu Asn Ile Thr Leu Ala Phe Lys Asn Gln 35 40 45 Asp His Ala Lys Gly Gly His Ser Arg Pro Thr Ser Gln Val Pro Ala 50 55 60 Gln Cys Arg Pro Pro Ser Asp Ser Thr Gln Val Pro Cys Trp Leu Tyr 65 70 75 80 Arg Ala Ile Leu Ser Leu Tyr Ile Leu Leu Ala Leu Ala Phe Val Leu 85 90 95 Cys Ile Ile Leu Ser Ala Phe Ile Met Val Lys Asn Ala Glu Met Ser 100 105 110 Lys Glu Leu Leu Gly Phe Lys Arg Glu Leu Trp Asn Val Ser Asn Ser 115 120 125 Val Gln Ala Cys Glu Glu Arg Gln Lys Arg Gly Trp Asp Ser Val Gln 130 135 140 Gln Ser Ile Thr Met Val Arg Ser Lys Ile Asp Arg Leu Glu Thr Thr 145 150 155 160 Leu Ala Gly Ile Lys Asn Ile Asp Thr Lys Val Gln Lys Ile Leu Glu 165 170 175 Val Leu Gln Lys Met Pro Gln Ser Ser Pro Gln 180 185 <210> 3 <211> 1124 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> CDS <222> (66)..(689) <400> 3 ctcatctgcc atgacacctt ccggtgggtg gggatgtgtg tgggtaaact ggcccactgg 60 gaacc atg gag tct gag gaa atc tac acg aat cag aag gtc gag atg cag 110 Met Glu Ser Glu Glu Ile Tyr Thr Asn Gln Lys Val Glu Met Gln 1 5 10 15 gca gcc ttc aaa gac aag aaa cag agg gtc cca gct gat aag gaa ggt 158 Ala Ala Phe Lys Asp Lys Lys Gln Arg Val Pro Ala Asp Lys Glu Gly 20 25 30 gca gat aac cct gac tat gag aat atc acc ttg gcc ttc aga aac cag 206 Ala Asp Asn Pro Asp Tyr Glu Asn Ile Thr Leu Ala Phe Arg Asn Gln 35 40 45 gac cag cca aag ggc agc cat tta cca ccc aag aat cag agc aag cag 254 Asp Gln Pro Lys Gly Ser His Leu Pro Pro Lys Asn Gln Ser Lys Gln 50 55 60 cca cct gcc agg aca cat cac acg gcc ttg gga ggg gcc cac gtc cca 302 Pro Pro Ala Arg Thr His His Thr Ala Leu Gly Gly Ala His Val Pro 65 70 75 acc ctg tct agg ctg ccc tca gac tct ggc cag ctc ccc cgt tgt ctg 350 Thr Leu Ser Arg Leu Pro Ser Asp Ser Gly Gln Leu Pro Arg Cys Leu 80 85 90 95 cac aga gtc atc atg agc ctg tac atg ctc ctc gcc ctg tcc tgc atc 398 His Arg Val Ile Met Ser Leu Tyr Met Leu Leu Ala Leu Ser Cys Ile 100 105 110 att ctc tta gtc ttg gtc ctc atg aag aat ctg gag atg tcc cag gag 446 Ile Leu Leu Val Leu Val Leu Met Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Glu 115 120 125 ttg ctg gcc ctg aaa agg gag ctc tgg aat gtg tcc gtc tcg gtg caa 494 Leu Leu Ala Leu Lys Arg Glu Leu Trp Asn Val Ser Val Ser Val Gln 130 135 140 gag tgc cag gag cag cag aat cag ggc tgg agc acc gtc cgg cag ctc 542 Glu Cys Gln Glu Gln Gln Asn Gln Gly Trp Ser Thr Val Arg Gln Leu 145 150 155 ctg gtg gag gcc aag cgt gac att tcc atg gtc ggg aga aat gcc cag 590 Leu Val Glu Ala Lys Arg Asp Ile Ser Met Val Gly Arg Asn Ala Gln 160 165 170 175 ctt gcg agt gag aag gtg aag acg ctg aca gca gac ata agc cat atc 638 Leu Ala Ser Glu Lys Val Lys Thr Leu Thr Ala Asp Ile Ser His Ile 180 185 190 aag agt aag tta cag gaa atc tcc aag atg ctg gag aag cca aag cca 686 Lys Ser Lys Leu Gln Glu Ile Ser Lys Met Leu Glu Lys Pro Lys Pro 195 200 205 tag acctcaacat acgcgaggac atcgaagccc tggctgcagc ttggcggacg 739 gggctgcgcc tcccagtgaa gatggccacg tgtgtgcacc acgtgtgttg tgagcctaag 799 gcgtgacaca gtgggtggct gtgtcagcag ggaccacgaa agtgtgtcag cgtgttgttg 859 gcagcatgtg tagcaccgtg aacgcgtgtg actgtcctgt ggtatgttgt gtgtaaatgt 919 gtcacggcag agccgtggcg ggggcacccc acgtgtcact gtaattgtgg gtgccctgtc 979 actacctgtg ttggtgtgaa caggtgtctg ccaacgagcg actgaggatg tcacggaggg 1039 ggttcggagc atgtacacat gtatgtccat ttgttcccgc gctcacgttg tgtgatttgt 1099 gaagataaag gccgatggaa aagaa 1124 <210> 4 <211> 207 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 4 Met Glu Ser Glu Glu Ile Tyr Thr Asn Gln Lys Val Glu Met Gln Ala 1 5 10 15 Ala Phe Lys Asp Lys Lys Gln Arg Val Pro Ala Asp Lys Glu Gly Ala 20 25 30 Asp Asn Pro Asp Tyr Glu Asn Ile Thr Leu Ala Phe Arg Asn Gln Asp 35 40 45 Gln Pro Lys Gly Ser His Leu Pro Pro Lys Asn Gln Ser Lys Gln Pro 50 55 60 Pro Ala Arg Thr His His Thr Ala Leu Gly Gly Ala His Val Pro Thr 65 70 75 80 Leu Ser Arg Leu Pro Ser Asp Ser Gly Gln Leu Pro Arg Cys Leu His 85 90 95 Arg Val Ile Met Ser Leu Tyr Met Leu Leu Ala Leu Ser Cys Ile Ile 100 105 110 Leu Leu Val Leu Val Leu Met Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Glu Leu 115 120 125 Leu Ala Leu Lys Arg Glu Leu Trp Asn Val Ser Val Ser Val Gln Glu 130 135 140 Cys Gln Glu Gln Gln Asn Gln Gly Trp Ser Thr Val Arg Gln Leu Leu 145 150 155 160 Val Glu Ala Lys Arg Asp Ile Ser Met Val Gly Arg Asn Ala Gln Leu 165 170 175 Ala Ser Glu Lys Val Lys Thr Leu Thr Ala Asp Ile Ser His Ile Lys 180 185 190 Ser Lys Leu Gln Glu Ile Ser Lys Met Leu Glu Lys Pro Lys Pro 195 200 205 <210> 5 <211> 1416 <212> DNA <213> Felis catus <220> <221> CDS <222> (24)..(641) <400> 5 tctgcttgaa tcaggaggtc agg atg caa gca gca gac ttc aaa ggc aag aaa 53 Met Gln Ala Ala Asp Phe Lys Gly Lys Lys 1 5 10 cag agg gcc cca gac cat aag gaa ggt tcg gta cct caa ggt gca gac 101 Gln Arg Ala Pro Asp His Lys Glu Gly Ser Val Pro Gln Gly Ala Asp 15 20 25 cct gac tat gag aat atc acc ttg acc ttc aga aac cag gag caa cca 149 Pro Asp Tyr Glu Asn Ile Thr Leu Thr Phe Arg Asn Gln Glu Gln Pro 30 35 40 agg ggc agc cat tca cca ccc aag aat cga ggc aag cag cca cct gcc 197 Arg Gly Ser His Ser Pro Pro Lys Asn Arg Gly Lys Gln Pro Pro Ala 45 50 55 agc ccg cac ctc aca gcc tcg gga ggg gcc cct gtc cca gcc tgg tcg 245 Ser Pro His Leu Thr Ala Ser Gly Gly Ala Pro Val Pro Ala Trp Ser 60 65 70 aag cag gcc cca gac tct gcc cag gtc cct cgt tgg ctg cac aga gtc 293 Lys Gln Ala Pro Asp Ser Ala Gln Val Pro Arg Trp Leu His Arg Val 75 80 85 90 acc ctg agc ctg tac atc ctc ctt gcc ctg ttc tgc atc gtt ctc ttg 341 Thr Leu Ser Leu Tyr Ile Leu Leu Ala Leu Phe Cys Ile Val Leu Leu 95 100 105 gcc ttg gtc ctg gtg aag aat tct gag gtg tcc cag gag ctg ctg gtc 389 Ala Leu Val Leu Val Lys Asn Ser Glu Val Ser Gln Glu Leu Leu Val 110 115 120 gtg aaa agg gag ctc cag aat gtc tcc atc tcg gga caa cag tgt cag 437 Val Lys Arg Glu Leu Gln Asn Val Ser Ile Ser Gly Gln Gln Cys Gln 125 130 135 gag gag cag aaa cag ggc tgg agc agc gtc cag cag ctc atc acg gag 485 Glu Glu Gln Lys Gln Gly Trp Ser Ser Val Gln Gln Leu Ile Thr Glu 140 145 150 gcc agg cag gac att gac atg atc aag aga aat gtc cac atc ggg aac 533 Ala Arg Gln Asp Ile Asp Met Ile Lys Arg Asn Val His Ile Gly Asn 155 160 165 170 gag aaa gtg aag acg ctg tca aca gac tta agc caa atc aag act aaa 581 Glu Lys Val Lys Thr Leu Ser Thr Asp Leu Ser Gln Ile Lys Thr Lys 175 180 185 tta cat gaa atc tcc aag ata cta gag aag aag ccg cag cca cag ccc 629 Leu His Glu Ile Ser Lys Ile Leu Glu Lys Lys Pro Gln Pro Gln Pro 190 195 200 aca gct caa taa atgagaagac attgacaccc aggctgcagc ttggaggacg 681 Thr Ala Gln 205 gggctgcact tccccgtgaa gacggccgca tgtgtgcctc atggtgtcac gggagcgata 741 acacatgata cagtgggcgg ctgtgtcagc aaggaccgca gaagtgtgtc agcctgggcg 801 cgggtgttgg taacacgtgt tgcactgtga acacgtgtga atgtcctgtg gtatgttgtg 861 tgtgaatgtc atggagctgt gtgtgtgtgt gcgcgtgcgt gtgtgtgtgt ggagcacccc 921 ctacatcact gtaactgcgg gtgttgaggg tgtaccccgt cactccctgt gttgtgtgaa 981 caggtgggtg tcagtgtgtg actgattatg tcaccgaggg tgtgcagagc gggtacattt 1041 gtgcgttccc ttgtttctgc actcacgttt tgtgatttgt gacgataaag gccaatggga 1101 aagaatgtgg ctttcagatc tgttcctggg agcatctggg ggtgggggtg gggacccggt 1161 ggcggagggt ctgcaagtat taagggatga ggaaagtcac acagcaagca cgcggacgtg 1221 ataaccagga gccctggggg cacgagtgtg tgtgagcatg aatgccctga atgggtcctt 1281 ttgtgcccat gaacttgtac ccagcaagga acagtctccg tgtctgagac tgtgtgccca 1341 gcagggtttg tggcccgaga tatacactgt ttccctaagt ggggctcctg ggtggctcag 1401 tcggttaagc gtccg 1416 <210> 6 <211> 205 <212> PRT <213> Felis catus <400> 6 Met Gln Ala Ala Asp Phe Lys Gly Lys Lys Gln Arg Ala Pro Asp His 1 5 10 15 Lys Glu Gly Ser Val Pro Gln Gly Ala Asp Pro Asp Tyr Glu Asn Ile 20 25 30 Thr Leu Thr Phe Arg Asn Gln Glu Gln Pro Arg Gly Ser His Ser Pro 35 40 45 Pro Lys Asn Arg Gly Lys Gln Pro Pro Ala Ser Pro His Leu Thr Ala 50 55 60 Ser Gly Gly Ala Pro Val Pro Ala Trp Ser Lys Gln Ala Pro Asp Ser 65 70 75 80 Ala Gln Val Pro Arg Trp Leu His Arg Val Thr Leu Ser Leu Tyr Ile 85 90 95 Leu Leu Ala Leu Phe Cys Ile Val Leu Leu Ala Leu Val Leu Val Lys 100 105 110 Asn Ser Glu Val Ser Gln Glu Leu Leu Val Val Lys Arg Glu Leu Gln 115 120 125 Asn Val Ser Ile Ser Gly Gln Gln Cys Gln Glu Glu Gln Lys Gln Gly 130 135 140 Trp Ser Ser Val Gln Gln Leu Ile Thr Glu Ala Arg Gln Asp Ile Asp 145 150 155 160 Met Ile Lys Arg Asn Val His Ile Gly Asn Glu Lys Val Lys Thr Leu 165 170 175 Ser Thr Asp Leu Ser Gln Ile Lys Thr Lys Leu His Glu Ile Ser Lys 180 185 190 Ile Leu Glu Lys Lys Pro Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gln 195 200 205 <210> 7 <211> 1132 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (21)..(572) <400> 7 acgtgaatca accaagcaga atg cat gca tca gcc tcc cag gat aag aac cgg 53 Met His Ala Ser Ala Ser Gln Asp Lys Asn Arg 1 5 10 agg aag cca ggt cat gat gaa ggt gct cac aat cct gac tac gag aat 101 Arg Lys Pro Gly His Asp Glu Gly Ala His Asn Pro Asp Tyr Glu Asn 15 20 25 ata acc ttg gcc ttc aga aac aag gac caa ctc aaa ctc agc caa tca 149 Ile Thr Leu Ala Phe Arg Asn Lys Asp Gln Leu Lys Leu Ser Gln Ser 30 35 40 aca ccc aca aaa caa gcc aag ttc aag aca tcc ctg gac cca gct gag 197 Thr Pro Thr Lys Gln Ala Lys Phe Lys Thr Ser Leu Asp Pro Ala Glu 45 50 55 tcc ccg cct tgg ttg tac aga acc att atg atg ttg tat gtt ctc ctt 245 Ser Pro Pro Trp Leu Tyr Arg Thr Ile Met Met Leu Tyr Val Leu Leu 60 65 70 75 gct ctc gtc ttt tta tcc tgc atc gtc ctc tct gct ttg gtc ttg gtg 293 Ala Leu Val Phe Leu Ser Cys Ile Val Leu Ser Ala Leu Val Leu Val 80 85 90 aaa aat tct gag atg tcc aag gag ctg tgg acc ttg aaa gca gag ctt 341 Lys Asn Ser Glu Met Ser Lys Glu Leu Trp Thr Leu Lys Ala Glu Leu 95 100 105 tcg aat gtt tca gac acg gtg tgg aat atc cgg gag ctc cag aat cag 389 Ser Asn Val Ser Asp Thr Val Trp Asn Ile Arg Glu Leu Gln Asn Gln 110 115 120 caa acg agg att tgg gaa gct gcc cag ggg gac atc aag gag gtc aag 437 Gln Thr Arg Ile Trp Glu Ala Ala Gln Gly Asp Ile Lys Glu Val Lys 125 130 135 aag acc ctt ggc aca gtc atg agt agc atc cag act gga aac gac cgg 485 Lys Thr Leu Gly Thr Val Met Ser Ser Ile Gln Thr Gly Asn Asp Arg 140 145 150 155 ctg aag act gtg ccg gca gat ata acc caa atc aag aaa act ctt gag 533 Leu Lys Thr Val Pro Ala Asp Ile Thr Gln Ile Lys Lys Thr Leu Glu 160 165 170 gcg cta gaa aag aag gca cag cct cag ccc agt aca taa gaggacacca 582 Ala Leu Glu Lys Lys Ala Gln Pro Gln Pro Ser Thr 175 180 cagcagtacc tgtgaagact ccgaattgca cctgctagtg aagatggcag atgggggtgg 642 gtactgagct tgagtgtgaa cctgccgtgc atcctcatat aaaaaagatt ctccaccagg 702 gggaatgagt gttgaagagg tgtgtatgca aatgagcatt tggggtttcc atgtattcca 762 ggagaagggt ttatggtgga aagagaacat ggcagtcaca gcaggtgtta ctctttatgg 822 gccacatagg tgtatgccct ggcttatgtg agtataggca tgtcctggtt ggcagctatt 882 cccgagaagt ccccaaagtg taagtgacat gtaggacatg cctccccatt ctcttgctca 942 tgtatgtgca tctggctgtt ctgtatgtgt gtcactgaag tggtgggtga tagacatcac 1002 cctggagatg tgtcatggca tgggtcattc ctagtgtttt tggtcatgtc agcttgtgtg 1062 ttcagggcat gcacacaaat gtagccatcg atttctgcac ttgtatttat gattcaagaa 1122 gataaatgcc 1132 <210> 8 <211> 183 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Met His Ala Ser Ala Ser Gln Asp Lys Asn Arg Arg Lys Pro Gly His 1 5 10 15 Asp Glu Gly Ala His Asn Pro Asp Tyr Glu Asn Ile Thr Leu Ala Phe 20 25 30 Arg Asn Lys Asp Gln Leu Lys Leu Ser Gln Ser Thr Pro Thr Lys Gln 35 40 45 Ala Lys Phe Lys Thr Ser Leu Asp Pro Ala Glu Ser Pro Pro Trp Leu 50 55 60 Tyr Arg Thr Ile Met Met Leu Tyr Val Leu Leu Ala Leu Val Phe Leu 65 70 75 80 Ser Cys Ile Val Leu Ser Ala Leu Val Leu Val Lys Asn Ser Glu Met 85 90 95 Ser Lys Glu Leu Trp Thr Leu Lys Ala Glu Leu Ser Asn Val Ser Asp 100 105 110 Thr Val Trp Asn Ile Arg Glu Leu Gln Asn Gln Gln Thr Arg Ile Trp 115 120 125 Glu Ala Ala Gln Gly Asp Ile Lys Glu Val Lys Lys Thr Leu Gly Thr 130 135 140 Val Met Ser Ser Ile Gln Thr Gly Asn Asp Arg Leu Lys Thr Val Pro 145 150 155 160 Ala Asp Ile Thr Gln Ile Lys Lys Thr Leu Glu Ala Leu Glu Lys Lys 165 170 175 Ala Gln Pro Gln Pro Ser Thr 180 <210> 9 <211> 249 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(249) <400> 9 gtg aag aat gct gag atg tcc aag gag ctg ctg ggc ttt aaa agg gag 48 Val Lys Asn Ala Glu Met Ser Lys Glu Leu Leu Gly Phe Lys Arg Glu 1 5 10 15 ctt tgg aat gtc tca aac tcc gta caa gca tgc gaa gag aga cag aag 96 Leu Trp Asn Val Ser Asn Ser Val Gln Ala Cys Glu Glu Arg Gln Lys 20 25 30 aga ggc tgg gat tcc gtt cag cag agc atc acc atg gtc agg agc aag 144 Arg Gly Trp Asp Ser Val Gln Gln Ser Ile Thr Met Val Arg Ser Lys 35 40 45 att gat aga tta gag acg aca tta gca ggc ata aaa aac att gac aca 192 Ile Asp Arg Leu Glu Thr Thr Leu Ala Gly Ile Lys Asn Ile Asp Thr 50 55 60 aag gta cag aaa atc ttg gag gtg ctg cag aaa atg cca cag tcc tca 240 Lys Val Gln Lys Ile Leu Glu Val Leu Gln Lys Met Pro Gln Ser Ser 65 70 75 80 cct caa taa 249 Pro Gln <210> 10 <211> 82 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Val Lys Asn Ala Glu Met Ser Lys Glu Leu Leu Gly Phe Lys Arg Glu 1 5 10 15 Leu Trp Asn Val Ser Asn Ser Val Gln Ala Cys Glu Glu Arg Gln Lys 20 25 30 Arg Gly Trp Asp Ser Val Gln Gln Ser Ile Thr Met Val Arg Ser Lys 35 40 45 Ile Asp Arg Leu Glu Thr Thr Leu Ala Gly Ile Lys Asn Ile Asp Thr 50 55 60 Lys Val Gln Lys Ile Leu Glu Val Leu Gln Lys Met Pro Gln Ser Ser 65 70 75 80 Pro Gln <210> 11 <211> 267 <212> DNA <213> Canis familiaris <220> <221> CDS <222> (1)..(267) <400> 11 aag aat ctg gag atg tcc cag gag ttg ctg gcc ctg aaa agg gag ctc 48 Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Glu Leu Leu Ala Leu Lys Arg Glu Leu 1 5 10 15 tgg aat gtg tcc gtc tcg gtg caa gag tgc cag gag cag cag aat cag 96 Trp Asn Val Ser Val Ser Val Gln Glu Cys Gln Glu Gln Gln Asn Gln 20 25 30 ggc tgg agc acc gtc cgg cag ctc ctg gtg gag gcc aag cgt gac att 144 Gly Trp Ser Thr Val Arg Gln Leu Leu Val Glu Ala Lys Arg Asp Ile 35 40 45 tcc atg gtc ggg aga aat gcc cag ctt gcg agt gag aag gtg aag acg 192 Ser Met Val Gly Arg Asn Ala Gln Leu Ala Ser Glu Lys Val Lys Thr 50 55 60 ctg aca gca gac ata agc cat atc aag agt aag tta cag gaa atc tcc 240 Leu Thr Ala Asp Ile Ser His Ile Lys Ser Lys Leu Gln Glu Ile Ser 65 70 75 80 aag atg ctg gag aag cca aag cca tag 267 Lys Met Leu Glu Lys Pro Lys Pro 85 <210> 12 <211> 88 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 12 Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Glu Leu Leu Ala Leu Lys Arg Glu Leu 1 5 10 15 Trp Asn Val Ser Val Ser Val Gln Glu Cys Gln Glu Gln Gln Asn Gln 20 25 30 Gly Trp Ser Thr Val Arg Gln Leu Leu Val Glu Ala Lys Arg Asp Ile 35 40 45 Ser Met Val Gly Arg Asn Ala Gln Leu Ala Ser Glu Lys Val Lys Thr 50 55 60 Leu Thr Ala Asp Ile Ser His Ile Lys Ser Lys Leu Gln Glu Ile Ser 65 70 75 80 Lys Met Leu Glu Lys Pro Lys Pro 85 <210> 13 <211> 285 <212> DNA <213> Felis catus <220> <221> CDS <222> (1)..(285) <400> 13 aag aat tct gag gtg tcc cag gag ctg ctg gtc gtg aaa agg gag ctc 48 Lys Asn Ser Glu Val Ser Gln Glu Leu Leu Val Val Lys Arg Glu Leu 1 5 10 15 cag aat gtc tcc atc tcg gga caa cag tgt cag gag gag cag aaa cag 96 Gln Asn Val Ser Ile Ser Gly Gln Gln Cys Gln Glu Glu Gln Lys Gln 20 25 30 ggc tgg agc agc gtc cag cag ctc atc acg gag gcc agg cag gac att 144 Gly Trp Ser Ser Val Gln Gln Leu Ile Thr Glu Ala Arg Gln Asp Ile 35 40 45 gac atg atc aag aga aat gtc cac atc ggg aac gag aaa gtg aag acg 192 Asp Met Ile Lys Arg Asn Val His Ile Gly Asn Glu Lys Val Lys Thr 50 55 60 ctg tca aca gac tta agc caa atc aag act aaa tta cat gaa atc tcc 240 Leu Ser Thr Asp Leu Ser Gln Ile Lys Thr Lys Leu His Glu Ile Ser 65 70 75 80 aag ata cta gag aag aag ccg cag cca cag ccc aca gct caa taa 285 Lys Ile Leu Glu Lys Lys Pro Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gln 85 90 <210> 14 <211> 94 <212> PRT <213> Felis catus <400> 14 Lys Asn Ser Glu Val Ser Gln Glu Leu Leu Val Val Lys Arg Glu Leu 1 5 10 15 Gln Asn Val Ser Ile Ser Gly Gln Gln Cys Gln Glu Glu Gln Lys Gln 20 25 30 Gly Trp Ser Ser Val Gln Gln Leu Ile Thr Glu Ala Arg Gln Asp Ile 35 40 45 Asp Met Ile Lys Arg Asn Val His Ile Gly Asn Glu Lys Val Lys Thr 50 55 60 Leu Ser Thr Asp Leu Ser Gln Ile Lys Thr Lys Leu His Glu Ile Ser 65 70 75 80 Lys Ile Leu Glu Lys Lys Pro Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gln 85 90 <210> 15 <211> 279 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(279) <400> 15 aaa aat tct gag atg tcc aag gag ctg tgg acc ttg aaa gca gag ctt 48 Lys Asn Ser Glu Met Ser Lys Glu Leu Trp Thr Leu Lys Ala Glu Leu 1 5 10 15 tcg aat gtt tca gac acg gtg tgg aat atc cgg gag ctc cag aat cag 96 Ser Asn Val Ser Asp Thr Val Trp Asn Ile Arg Glu Leu Gln Asn Gln 20 25 30 caa acg agg att tgg gaa gct gcc cag ggg gac atc aag gag gtc aag 144 Gln Thr Arg Ile Trp Glu Ala Ala Gln Gly Asp Ile Lys Glu Val Lys 35 40 45 aag acc ctt ggc aca gtc atg agt agc atc cag act gga aac gac cgg 192 Lys Thr Leu Gly Thr Val Met Ser Ser Ile Gln Thr Gly Asn Asp Arg 50 55 60 ctg aag act gtg ccg gca gat ata acc caa atc aag aaa act ctt gag 240 Leu Lys Thr Val Pro Ala Asp Ile Thr Gln Ile Lys Lys Thr Leu Glu 65 70 75 80 gcg cta gaa aag aag gca cag cct cag ccc agt aca taa 279 Ala Leu Glu Lys Lys Ala Gln Pro Gln Pro Ser Thr 85 90 <210> 16 <211> 92 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Lys Asn Ser Glu Met Ser Lys Glu Leu Trp Thr Leu Lys Ala Glu Leu 1 5 10 15 Ser Asn Val Ser Asp Thr Val Trp Asn Ile Arg Glu Leu Gln Asn Gln 20 25 30 Gln Thr Arg Ile Trp Glu Ala Ala Gln Gly Asp Ile Lys Glu Val Lys 35 40 45 Lys Thr Leu Gly Thr Val Met Ser Ser Ile Gln Thr Gly Asn Asp Arg 50 55 60 Leu Lys Thr Val Pro Ala Asp Ile Thr Gln Ile Lys Lys Thr Leu Glu 65 70 75 80 Ala Leu Glu Lys Lys Ala Gln Pro Gln Pro Ser Thr 85 90 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T3 primer <400> 17 aattaaccct cactaaaggg 20 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T7 primer <400> 18 taatacgact cactatagg 19 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> canis RT primer sense <400> 19 ccacgtccca accctgtcta 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> canis RT primer antisense <400> 20 gtgctccagc cctgattctg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> human RT primer sense <400> 21 tggccttcaa aaatcaggac 20 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> human RT primer antisense <400> 22 aggctcagga tggctctgta c 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mouse RT primer sense <400> 23 tccaaggagc tgtggacctt 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mouse RT primer antisense <400> 24 agtcttcagc cggtcgtttc 20 <210> 25 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> human MCEMP1 EcoRI primer sense <400> 25 gaattcgccg ccaccatgga agtggaggaa atctacaag 39 <210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> human MCEMP1 NotI primer antisense <400> 26 gcggccgctt attgaggtga ggactgtgg 29 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> human MCEMP1ECD KpnI primer sense <400> 27 ggtaccaaga atgctgagat gtccaagg 28 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> human MCEMP1ECD EcoRI primer antisense <400> 28 gaattcggtt gaggtgagga ctgtggc 27 <210> 29 <211> 960 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Fc fusion protein <220> <221> CDS <222> (1)..(960) <400> 29 aag aat gct gag atg tcc aag gag ctg ctg ggc ttt aaa agg gag ctt 48 Lys Asn Ala Glu Met Ser Lys Glu Leu Leu Gly Phe Lys Arg Glu Leu 1 5 10 15 tgg aat gtc tca aac tcc gta caa gca tgc gaa gag aga cag aag aga 96 Trp Asn Val Ser Asn Ser Val Gln Ala Cys Glu Glu Arg Gln Lys Arg 20 25 30 ggc tgg gat tcc gtt cag cag agc atc acc atg gtc agg agc aag att 144 Gly Trp Asp Ser Val Gln Gln Ser Ile Thr Met Val Arg Ser Lys Ile 35 40 45 gat aga tta gag acg aca tta gca ggc ata aaa aac att gac aca aag 192 Asp Arg Leu Glu Thr Thr Leu Ala Gly Ile Lys Asn Ile Asp Thr Lys 50 55 60 gta cag aaa atc ttg gag gtg ctg cag aaa atg cca cag tcc tca cct 240 Val Gln Lys Ile Leu Glu Val Leu Gln Lys Met Pro Gln Ser Ser Pro 65 70 75 80 caa ccg aat tct gca gat atc ccc aga ggg ccc aca atc aag ccc tgt 288 Gln Pro Asn Ser Ala Asp Ile Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys 85 90 95 cct cca tgc aaa tgc cca gca cct aac ctc ttg ggt gga cca tcc gtc 336 Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 100 105 110 ttc atc ttc cct cca aag atc aag gat gta ctc atg atc tcc ctg agc 384 Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser 115 120 125 ccc ata gtc aca tgt gtg gtg gtg gat gtg agc gag gat gac cca gat 432 Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp 130 135 140 gtc cag atc agc tgg ttt gtg aac aac gtg gaa gta cac aca gct cag 480 Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln 145 150 155 160 aca caa acc cat aga gag gat tac aac agt act ctc cgg gtg gtc agt 528 Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser 165 170 175 gcc ctc ccc atc cag cac cag gac tgg atg agt ggc aag gag ttc aaa 576 Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys 180 185 190 tgc aag gtc aac aac aaa gac ctc cca gcg ccc atc gag aga acc atc 624 Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile 195 200 205 tca aaa ccc aaa ggg tca gta aga gct cca cag gta tat gtc ttg cct 672 Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro 210 215 220 cca cca gaa gaa gag atg act aag aaa cag gtc act ctg acc tgc atg 720 Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met 225 230 235 240 gtc aca gac ttc atg cct gaa gac att tac gtg gag tgg acc aac aac 768 Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn 245 250 255 ggg aaa aca gag cta aac tac aag aac act gaa cca gtc ctg gac tct 816 Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser 260 265 270 gat ggt tct tac ttc atg tac agc aag ctg aga gtg gaa aag aag aac 864 Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn 275 280 285 tgg gtg gaa aga aat agc tac tcc tgt tca gtg gtc cac gag ggt ctg 912 Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu 290 295 300 cac aat cac cac acg act aag agc ttc tcc cgg act ccg ggt aaa tga 960 His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 305 310 315 <210> 30 <211> 319 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fc fusion protein <400> 30 Lys Asn Ala Glu Met Ser Lys Glu Leu Leu Gly Phe Lys Arg Glu Leu 1 5 10 15 Trp Asn Val Ser Asn Ser Val Gln Ala Cys Glu Glu Arg Gln Lys Arg 20 25 30 Gly Trp Asp Ser Val Gln Gln Ser Ile Thr Met Val Arg Ser Lys Ile 35 40 45 Asp Arg Leu Glu Thr Thr Leu Ala Gly Ile Lys Asn Ile Asp Thr Lys 50 55 60 Val Gln Lys Ile Leu Glu Val Leu Gln Lys Met Pro Gln Ser Ser Pro 65 70 75 80 Gln Pro Asn Ser Ala Asp Ile Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys 85 90 95 Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 100 105 110 Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser 115 120 125 Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp 130 135 140 Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln 145 150 155 160 Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser 165 170 175 Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys 180 185 190 Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile 195 200 205 Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro 210 215 220 Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met 225 230 235 240 Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn 245 250 255 Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser 260 265 270 Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn 275 280 285 Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu 290 295 300 His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 305 310 315

Claims (10)

1. MCEMP1 단백질의 세포 외 영역 부분을 포함하는 폴리펩티드로서, 서열번호 10, 12, 14 또는 16으로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드와 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 항원 결합성 프래그먼트를 유효성분으로서 포함하는, MCEMP1을 세포 표면에 발현하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 암이 백혈병, 골수이형성증후군, 골육종, 흉선종, 비만세포종 및 항문 주위 선암으로 이루어지는 군에서 선택되는, 의약 조성물.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 항체 또는 그 항원 결합성 프래그먼트가, 항종양제를 콘쥬게이트시킨 항체 또는 그 항원 결합성 프래그먼트이며, 상기 항체가 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체인, 의약 조성물.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 항체가 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 다중 특이성 항체인, 의약 조성물.
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 의약 조성물과, 항종양제를 포함하는 의약 조성물을 포함하여 이루어지는, 암의 치료 및/또는 예방을 위한 조합 의약품.
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