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KR20170116050A - 항-당단백질 항체 및 그의 용도 - Google Patents

항-당단백질 항체 및 그의 용도 Download PDF

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KR20170116050A
KR20170116050A KR1020177022748A KR20177022748A KR20170116050A KR 20170116050 A KR20170116050 A KR 20170116050A KR 1020177022748 A KR1020177022748 A KR 1020177022748A KR 20177022748 A KR20177022748 A KR 20177022748A KR 20170116050 A KR20170116050 A KR 20170116050A
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KR
South Korea
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antibody
seq
glycoprotein
protein
sequence
Prior art date
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Withdrawn
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KR1020177022748A
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Inventor
파멜라 브라운
제프리 에프. 리
벤자민 둣자르
제니 에이. 멀리건
다니엘 에스. 앨리슨
에탄 더블유. 오잘라
아마짓 싱
Original Assignee
앨더 바이오파마슈티컬즈, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 앨더 바이오파마슈티컬즈, 인코포레이티드 filed Critical 앨더 바이오파마슈티컬즈, 인코포레이티드
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Abstract

당단백질에 대해 특이성을 가지는 새로운 종류의 항체가 기재되어 있다. 항체는 만노실화 단백질, 예컨대 균류에 의해 생성된 단백질에 민감하게 및 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다. 샘플에서의 당단백질의 존재를 모니터링하기 위한 이 항당단백질 항체를 사용한 검정이 제공된다. 이러한 방법은 원하는 폴리펩타이드의 제조 및/또는 정제를 위한 방법을 모니터링하기 위해 사용될 수 있고, 이것은 정제된 생성물에서 생성되고/되거나 존재하는 글라이코실화 폴리펩타이드의 양을 변형(예를 들어, 감소 또는 증가)시키기 위해 공정 매개변수를 변형시키기 위해 사용될 수 있다. 폴리펩타이드의 발현 및 분비의 수준을 검출하기 위해 해당 항체를 사용하는 방법, 및 샘플로부터 당단백질을 정제하거나 고갈시키기 위해 해당 항체를 사용하는 방법이 또한 제공된다. 예시적인 실시형태에서, 원하는 폴리펩타이드는 피치아 파스토리스와 같은 효모에서 생성될 수 있는 항체와 같은 다중-아단위 단백질일 수 있다.

Description

항-당단백질 항체 및 그의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 발명의 명칭이 "ANTI-GLYCOPROTEIN ANTIBODIES AND USES THEREOF"(변호사 문서 번호 43257.4802호)인 2015년 1월 16일에 출원된 미국 가출원 제62/104,407호(그 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 포함됨)의 이익을 주장한다.
서열 목록 개시내용
본원은, 이의 개시내용의 일부로서, 크기 136,707 바이트를 가지고 2016년 1월 15일에 생성된 명칭 "43257o4813.txt"를 가지는 전자 생물학적 서열 목록 텍스트 파일(그 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 포함됨)을 포함한다.
기술분야
본 개시내용은 일반적으로 항당단백질 항체에 관한 것이다. 예시된 항체는 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, 이것은 미생물 시스템, 예를 들어 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 제조될 수 있다. 항체는 예컨대 만노실화 단백질을 고갈시키거나 농후화하기 위해, 또는 만노실화 단백질을 검출하기 위해 또는 이의 풍부도를 결정하기 위해 단백질의 정제 또는 모니터링에 사용될 수 있다.
단백질의 대규모 경제적 정제는 생명공학 산업에서 점점 더 중요한 관심이다. 일반적으로, 단백질은 그 단백질에 대한 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드의 삽입에 의해 관심 있는 단백질을 제조하도록 조작된 원핵생물, 예를 들어 박테리아 또는 진핵생물, 예를 들어 포유류 또는 균류의, 세포주를 사용하여 세포 배양에 의해 제조된다. 사용된 세포주가 살아 있는 유기체이므로, 이것은 동물 혈청의 제제로부터 때때로 공급되는 당, 아미노산 및 성장 인자를 포함하는 복잡한 성장 배지가 공급되어야 한다. 인간 치료제로서 사용하기에 충분한 순도로의 세포로 공급된 화합물의 혼합물 및 세포 자체에 의해 생성된 부산물로부터의 단백질의 분리는 어마어마한 도전과제를 부여한다.
다합체 단백질은, 균질 또는 비균질 중합체로 존재하는 지와 무관하게, 생물학적 분자에서 발견된 가장 복잡한 구조 체계 중 일부를 나타낸다. 구성성분 폴리펩타이드 사슬이 (2차 구조 및 3차 도메인으로) 폴딩해야할 뿐만 아니라, 안정한 아단위 상호작용을 허용하는 상보성 계면을 또한 형성해야 한다. 이 상호작용은 고도로 특이적이고, 동일한 아단위 사이 또는 상이한 아단위 사이일 수 있다.
특히, 종래의 항체는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진 사합체 단백질이다. 특정한 유형의 순수한 인간 항체는 많은 목적을 위해 충분한 양으로 천연 소스로부터 정제하기 어려울 수 있다. 그 결과, 생명공학 및 제약 회사는 대규모로 항체를 제조하기 위해 재조합 DNA 기반 방법에 의지한다. 수백 개의 치료학적 단일클론 항체(mAb)는 현재 판매 중이거나 개발 중에 있다. 기능적 항체(기능적 항체 단편 포함)의 제조는 일반적으로 2개의 폴리펩타이드의 합성, 및 N 말단 분비 신호 서열의 단백질분해 처리; 사합체로의 폴리펩타이드의 적절한 폴딩 및 조립; 이황화 결합의 형성을 포함하는 다수의 번역 후 사건을 포함하고; 통상적으로 특이적 N 연결 글라이코실화를 포함한다.
추가로, 증식, 분화 및 면역계 및 조혈계의 다른 세포 기능을 조절하는 다면발현성 조절자로서의 사이토카인은 광범위한 감염성 및 자가면역 질환에 대한 가능한 치료학적 용도를 가진다. 더욱 항체와 같이, 재조합 발현 방법은 조사 및 제약 분야에서 후속 사용을 위한 재조합 사이토카인을 발현하도록 대개 사용된다.
이러한 단백질의 재조합 합성은 생물학적 활성 재료를 생성하도록 더 고차의 진핵생물 세포의 배양에 대개 의존하고, 배양된 포유류 세포가 매우 흔히 사용된다. 그러나, 포유류 조직 배양 기반 제조 시스템은 미생물 발효 방법에 비해 상당한 부가 비용 및 문제를 야기한다. 추가로, 포유류 세포 배양으로부터 유래한 생성물은 배양된 세포 또는 배양에서 사용된 동물 유래 생성물, 예컨대 혈청에 존재할 수 있는 포유류 병원균(바이러스 포함)으로부터 자유를 보장하기 위한 추가적인 안전성 시험을 요할 수 있다.
선행 작업은 조사, 진단학적 및 치료학적 사용에 잠재적으로 적합한 기능적 항체를 제조하기 위한 비용 효과적인 플랫폼으로서 효모 피치아 파스토리스를 확립하는 것을 도왔다. 공동 소유된 미국 특허 제7,935,340호; 제7,927,863호 및 제8,268,582호(이들 각각은 그 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 포함됨)를 참조한다. 상기 방법은 재조합 단백질의 발현을 위한 피. 파스토리스 발효의 설계를 위해 문헌에 또한 공지되어 있고, 최적화는 세포 밀도, 브로쓰 용적, 기질 공급 속도 및 반응의 각각의 단계의 길이를 포함하는 매개변수와 관련하여 기재되어 있다. 문헌[Zhang et al., "Rational Design and Optimization of Fed-Batch and Continuous Fermentations" in Cregg, J. M., Ed., 2007, Pichia Protocols (2nd edition), Methods in Molecular Biology, vol. 389, Humana Press, Totowa, N.J., 페이지 43-63](이들의 각각은 그 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 포함됨)을 참조한다. 또한, US 20130045888; 및 US 20120277408(이들 각각은 그 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 포함됨)을 참조한다.
재조합 단백질이 배양된 세포로부터 제조될 수 있지만, 원치 않는 부산물이 또한 제조될 수 있다. 예를 들어, 배양된 세포는 원치 않는 또는 비정상 글라이코실화를 가지는 단백질과 함께 원하는 단백질을 생성할 수 있다. 추가로, 배양된 세포는 부정확한 입체화학을 가지는 유리 단량체 및 복합체와 함께 다중-아단위 단백질을 생성할 수 있어서, 잠재적으로 제조 비용을 증가시키고 원하는 복합체의 전체 수율을 감소시킬 수 있는 추가적인 정제 단계를 요한다. 더구나, 정제 후에도, 원치 않는 부산물은 우려를 야기하는 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 글라이코실화 부산물은 안정성, 반감기 및 비활성(specific activity)과 같은 특성에 부정적으로 영향을 미치는 양으로 존재할 수 있지만, 비정상 복합체 또는 응집체는 비활성을 감소시킬 수 있고, 또한 잠재적으로 면역원성일 수 있다.
본 개시내용은 만노실화 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 것으로 본 명세서에서 입증된 새로운 종류의 항당단백질 항체, 및 이의 항원 결합 단편 및 변이체, 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 이를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 개시내용의 예시적인 항당단백질 항체는 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, 및 이들의 단편 및 변이체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 (예를 들어, 발효 공정으로부터의) 하나 이상의 샘플로부터 원하는 폴리펩타이드를 정제하는 공정을 제공하고, 상기 방법은 예를 들어 O 연결 글라이코실화 및/또는 N 연결 글라이코실화로부터 생긴 원하는 폴리펩타이드의 당변이체와 같은 상기 글라이코실화 불순물에 결합하는 항체를 사용하여 샘플(들)에서 글라이코실화 불순물의 양 및/또는 유형을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 재조합 폴리펩타이드의 발현 및 임의로 분비를 발생시키는 조건 하에 원하는 세포 또는 미생물을 배양하는 단계를 또한 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 예를 들어 효모 또는 섬질 균류 세포에서 발현된 원하는 폴리펩타이드를 제조하고/하거나 정제하는 공정을 제공하고, 상기 공정은 글라이코실화 폴리펩타이드를 검출하기 위해 항당단백질 항체를 사용하는 단계를 포함한다. 그 결과, 제조 공정 및/또는 정제 방법은 예를 들어 원치 않는 당단백질을 감소시키거나 제거하기 위해 글라이코실화 폴리펩타이드의 양을 증가시키거나 감소시키도록 조정될 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 원하는 단백질은 다중-아단위 단백질, 예컨대 항체이고, 숙주 세포는 효모 세포, 예컨대 피. 파스토리스이고, 글라이코실화 폴리펩타이드는 원하는 폴리펩타이드의 당변이체, 예컨대 N 연결 및/또는 O 연결 당변이체이다.
더욱 또 다른 양태에서, 본 개시내용은, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 또는 Ab5로부터 선택된 항당단백질 항체와, 당단백질 상의, 동일한 또는 중첩하는 선형 또는 입체적 에피토프(conformational epitope)(들)에 특이적으로 결합하고/하거나, 당단백질 상의, 동일한 또는 중첩하는 선형 또는 입체적 에피토프(들)에 대한 결합에 대해 경쟁하는, 항당단백질 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 항당단백질 항체 또는 항체 단편은, 항당단백질 항체 Ab1과, 당단백질 상의, 동일한 또는 중첩하는 선형 또는 입체적 에피토프(들)에 특이적으로 결합하고/하거나, 동일한 또는 중첩하는 선형 또는 입체적 에피토프(들)에 대한 결합에 대해 경쟁할 수 있다. 상기 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 1가 항체 또는 metMab, 예를 들어 Fab 단편으로부터 선택될 수 있다. 항당단백질 항체 또는 항체 단편은 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 또는 Ab5로부터 선택된 항당단백질 항체와 동일한 CDR을 포함할 수 있다.
Fab 단편은 서열 번호 4의 CDR1 서열, 서열 번호 6의 CDR2 서열 및 서열 번호 8의 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄 및/또는 서열 번호 24의 CDR1 서열, 서열 번호 26의 CDR2 서열 및 서열 번호 28의 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함할 수 있다.
항당단백질 항체 또는 항체 단편은 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 또는 Ab5로부터 선택된 항당단백질 항체에 함유된 것과 동일한 가변 경쇄 및 가변 중쇄 영역의 각각에서 적어도 2개의 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR)을 포함할 수 있다.
항당단백질 항체 또는 항체 단편은 인간화된, 단쇄 또는 키메라 항체일 수 있다. 항당단백질 항체 또는 항체 단편은 하나 이상의 당단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 항당단백질 항체 또는 항체 단편은 하나 이상의 만노실화 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 항당단백질 항체 또는 항체 단편은 만노실화 항체 중쇄 또는 경쇄에 특이적으로 결합할 수 있다.
항당단백질 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 201, 205 또는 209의 서열을 가지는 중쇄 불변 폴리펩타이드를 포함하는 만노실화 인간 IgG1 항체 또는 항체 단편, 또는 이의 만노실화 단편 및/또는 서열 번호 203, 207 또는 211의 서열을 포함하는 만노실화 인간 IgG1 항체 경쇄 불변 폴리펩타이드, 또는 이의 만노실화 단편에 특이적으로 결합할 수 있다.
상기 만노실화 단백질은 효모 종, 예를 들어 칸디다 종(Candida spp.), 데바리오마이세스 한세니(Debaryomyces hansenii), 한세눌라 종(Hansenula spp.)(오가타에아 종(Ogataea spp.)), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus), 리포마이세스 종(Lipomyces spp.), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis)(쉐페르소마이세스 스티피티스(Scheffersomyces stipitis)), 피치아 종(Pichia sp.)(코마가타엘라 종(Komagataella spp.)), 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이콥시스 종(Saccharomycopsis spp.), 슈반니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)(코마가타엘라 파스토리스(Komagataella pastoris))로 이루어진 군으로부터 선택된 효모 종에서 생성될 수 있다.
상기 만노실화 단백질은 섬질 균류 종, 예를 들어 트리초데르마 레세이(Trichoderma reesei), 아스퍼질러스 종(Aspergillus spp.), 아스퍼질러스 니게르(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 페니실륨 종(Penicillium spp.), 페니실륨 치리소게눔(Penicillium chrysogenum), 페니실륨 푸르푸로게눔(Penicillium purpurogenum), 페니실륨 푸니쿨로숨(Penicillium funiculosum), 페니실륨 에머르소니(Penicillium emersonii), 리조푸스 종(Rhizopus spp.), 리조푸스 미에헤이(Rhizopus miehei), 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae), 리조푸스 푸실루스(Rhizopus pusillus), 리조푸스 아르히주스(Rhizopus arrhizus), 파네로차에테 크리소스포륨(Phanerochaete chrysosporium) 및 푸사륨 그라미네아룸(Fusarium graminearum)으로 이루어진 군으로부터 선택된 섬질 균류 종에서 생성될 수 있다.
상기 만노실화 단백질은 피치아 파스토리스에서 생성될 수 있다.
항당단백질 항체 또는 항체 단편은 검출 가능한 라벨 또는 치료제에 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 항당단백질 항체 또는 항체 단편을 코딩하는, 예를 들어 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 또는 Ab5로부터 선택된 항당단백질 항체와, 당단백질 상의, 동일한 또는 중첩하는 선형 또는 입체적 에피토프(들)에 특이적으로 결합하고/하거나, 당단백질 상의, 동일한 또는 중첩하는 선형 또는 입체적 에피토프(들)에 대한 결합에 대해 경쟁하는, 항당단백질 항체 또는 항체 단편을 코딩하는, 핵산 서열 또는 핵산 서열들을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 상기 핵산 서열 또는 서열들을 포함하는 벡터, 예를 들어 플라스미드 또는 재조합 바이러스 벡터를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 항체 또는 항체 단편을 발현하는, 예를 들어 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 또는 Ab5로부터 선택된 항당단백질 항체와, 당단백질 상의, 동일한 또는 중첩하는 선형 또는 입체적 에피토프(들)에 특이적으로 결합하고/하거나, 당단백질 상의, 동일한 또는 중첩하는 선형 또는 입체적 에피토프(들)에 대한 결합에 대해 경쟁하는, 항당단백질 항체 또는 항체 단편을 발현하는, 배양된 또는 재조합 세포를 제공한다. 세포는 포유류, 효모, 박테리아, 균류 또는 곤충 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 효모 세포, 예컨대 이배체 효모 세포일 수 있다. 세포는 속 피치아, 예컨대 피치아 파스토리스일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 서열 번호 2, 42, 82, 122 또는 162로부터 선택된 VH 폴리펩타이드 서열, 또는 이것과 적어도 90%의 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체; 및/또는 서열 번호 22, 62, 102, 142 또는 182로부터 선택된 VL 폴리펩타이드 서열, 또는 이것과 적어도 90%의 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체를 포함하는 단리된 항당단백질 항체 또는 항체 단편을 제공하고, 상기 항당단백질 항체는 하나 이상의 당단백질에 특이적으로 결합한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 서열 번호 2, 42, 82, 122 또는 162로부터 선택된 VH 폴리펩타이드 서열, 또는 이것과 적어도 90%의 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체; 및/또는 서열 번호 22, 62, 102, 142 또는 182로부터 선택된 VL 폴리펩타이드 서열, 또는 이것과 적어도 90%의 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체를 포함하는 단리된 항당단백질 항체 또는 항체 단편을 제공하고, 상기 VH 또는 VL 폴리펩타이드에서의 프레임워크(framework; FR) 또는 CDR 잔기 중 하나 이상은 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되어 하나 이상의 당단백질에 특이적으로 결합하는 항당단백질 항체를 생성시킨다.
상기 항체 또는 항체 단편의 하나 이상의 프레임워크(FR) 잔기는 상기 VH 또는 VL 폴리펩타이드에 함유된 상보성 결정 영역(CDR)이 유래한 모 토끼 항당단백질 항체에서의 상응하는 부위에 존재하는 아미노산에 의해 또는 보존적 아미노산 치환에 의해 치환될 수 있다.
예를 들어, 상기 VL 폴리펩타이드 서열의 CDR에서의 잔기 중 기껏해야 1개 또는 2개는 변형될 수 있다. 추가의 예로서, 상기 VH 폴리펩타이드 서열의 CDR에서의 잔기 중 기껏해야 1개 또는 2개는 변형될 수 있다.
상기 항체는 인간화될 수 있다. 상기 항체는 키메라일 수 있다. 상기 항체는 단쇄 항체를 포함할 수 있다. 상기 항체는 인간 Fc, 예컨대 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 불변 영역, 또는 이의 변이체 또는 변형된 형태를 포함할 수 있다.
상기 항체는 하나 이상의 만노실화 단백질, 예컨대 만노실화 항체 중쇄 또는 경쇄에 특이적으로 결합할 수 있다.
상기 항체는 서열 번호 201, 205 또는 209의 서열을 가지는 중쇄 불변 폴리펩타이드를 포함하는 만노실화 인간 IgG1 항체 또는 항체 단편, 또는 이의 만노실화 단편 및/또는 서열 번호 203, 207 또는 211의 서열을 포함하는 만노실화 인간 IgG1 항체 경쇄 불변 폴리펩타이드, 또는 이의 만노실화 단편에 특이적으로 결합할 수 있다.
상기 만노실화 단백질은 효모 종 또는 섬질 균류 종에서 생성될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 상기 샘플을 항당단백질 항체와 접촉시키는 단계, 및 상기 당단백질과 상기 항당단백질 항체와의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 샘플에서 당단백질을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 항당단백질 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항당단백질 항체, 예를 들어 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 또는 Ab5로부터 선택된 항당단백질 항체와, 당단백질 상의, 동일한 또는 중첩하는 선형 또는 입체적 에피토프(들)에 특이적으로 결합하고/하거나, 당단백질 상의, 동일한 또는 중첩하는 선형 또는 입체적 에피토프(들)에 대한 결합에 대해 경쟁하는, 항당단백질 항체 또는 항체 단편일 수 있다.
상기 만노실화 단백질은 효모 종, 예컨대 칸디다 종, 데바리오마이세스 한세니, 한세눌라 종(오가타에아 종), 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 막시아누스, 리포마이세스 종, 피치아 스티피티스(쉐페르소마이세스 스티피티스), 피치아 종(코마가타엘라 종), 사카로마이세스 세레비시아에, 스키조사카로마이세스 폼베, 사카로마이콥시스 종, 슈반니오마이세스 옥시덴탈리스, 야로위아 리폴리티카 및 피치아 파스토리스(코마가타엘라 파스토리스)로 이루어진 군으로부터 선택된 효모 종에서 생성될 수 있다.
상기 만노실화 단백질은 섬질 균류 종, 예컨대 트리초데르마 레세이, 아스퍼질러스 종, 아스퍼질러스 니게르, 아스퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 아와모리, 아스퍼질러스 오리자에, 뉴로스포라 크라사, 페니실륨 종, 페니실륨 치리소게눔, 페니실륨 푸르푸로게눔, 페니실륨 푸니쿨로숨, 페니실륨 에머르소니, 리조푸스 종, 리조푸스 미에헤이, 리조푸스 오리자에, 리조푸스 푸실루스, 리조푸스 아르히주스, 파네로차에테 크리소스포륨 및 푸사륨 그라미네아룸으로 이루어진 군으로부터 선택된 섬질 균류 종에서 생성될 수 있다.
상기 만노실화 단백질은 피치아 파스토리스에서 생성될 수 있다.
상기 당단백질과 상기 항당단백질 항체의 결합을 검출하는 상기 단계는 ELISA 검정, 예컨대 겨자무과산화효소 또는 유로퓸 검출을 이용하는 ELISA 검정을 포함할 수 있다.
상기 항당단백질 항체는 지지체에 결합할 수 있다.
샘플에서 당단백질을 검출하는 방법은 정제 칼럼으로부터의 다중 분획에서 실행될 수 있고, 당단백질의 검출된 수준에 기초하여, 다중 분획은 상기 항당단백질 항체에 결합하는 당단백질이 고갈된 정제된 생성물을 생성하도록 혼주된다.
샘플에서 당단백질을 검출하는 방법은 정제 칼럼으로부터의 다중 분획에서 실행될 수 있고, 당단백질의 검출된 수준에 기초하여, 다중 분획은 상기 항당단백질 항체에 결합하는 당단백질이 농후한 정제된 생성물을 생성하도록 혼주된다.
상기 검출 단계는 단백질-단백질 상호작용 모니터링 공정, 예컨대 광 간섭법, 이중 편극 간섭법, 정적 광 산란, 동적 광 산란, 다중 각 광 산란, 표면 플라즈몬 공명, ELISA, 화학발광성 ELISA, 유로퓸 ELISA, 파 웨스턴(far western) 또는 전장 발광을 이용하는 단백질-단백질 상호작용 모니터링 공정을 이용할 수 있다.
검출된 당단백질은 O 연결 글라이코실화의 결과일 수 있다.
샘플은 원하는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
검출된 당단백질은 원하는 폴리펩타이드의 당변이체일 수 있다.
원하는 폴리펩타이드는 호르몬, 성장 인자, 수용체, 항체, 사이토카인, 수용체 리간드, 전사 인자 또는 효소일 수 있다.
원하는 폴리펩타이드는 원하는 항체 또는 원하는 항체 단편, 예컨대 원하는 인간 항체 또는 원하는 인간화 항체 또는 이의 단편일 수 있다.
상기 원하는 인간화 항체는 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 양 또는 소 기원, 예를 들어 토끼 기원일 수 있다.
상기 원하는 항체 또는 원하는 항체 단편은 원하는 1가, 2가 또는 다가 항체를 포함할 수 있다.
상기 원하는 항체 또는 원하는 항체 단편은 IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IFN-알파, IFN-감마, BAFF, CXCL13, IP-10, CBP, 안지오텐신, 안지오텐신 I, 안지오텐신 II, Nav1.7, Nav1.8, VEGF, PDGF, EPO, EGF, FSH, TSH, hCG, CGRP, NGF, TNF, HGF, BMP2, BMP7, PCSK9 또는 HRG에 특이적으로 결합할 수 있다.
임의로, 10% 미만의 당단백질을 포함하는 샘플 또는 이의 용리물 또는 분획이 혼주될 수 있거나, 5% 미만의 당단백질을 포함하는 샘플 또는 이의 용리물 또는 분획이 혼주되거나, 1% 미만의 당단백질을 포함하는 샘플 또는 이의 용리물 또는 분획이 혼주되거나, 0.5% 미만의 당단백질을 포함하는 이의 분획이 혼주된다.
임의로, 90% 초과의 당단백질을 포함하는 샘플 또는 이의 용리물 또는 분획이 혼주되거나, 95% 초과의 당단백질을 포함하는 샘플 또는 이의 용리물 또는 분획이 혼주되거나, 99% 초과의 당단백질을 포함하는 샘플 또는 이의 용리물 또는 분획이 혼주되거나, 99.5% 초과의 당단백질을 포함하는 샘플 또는 이의 용리물 또는 분획이 혼주된다.
상기 방법은 원하는 폴리펩타이드의 순도에 기초하여 상이한 샘플 또는 이의 용리물 또는 분획을 혼주하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 예를 들어 90% 초과, 91%, 97% 또는 99% 순도를 포함하는 샘플 또는 이의 용리물 또는 분획이 혼주된다.
순도는 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드의 전체 질량의 백분율로서 글라이코실화 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 글라이코실화 경쇄 폴리펩타이드의 질량을 측정함으로써 결정될 수 있다.
원하는 폴리펩타이드는 친화도 크로마토그래피 지지체를 사용하여 정제될 수 있다. 친화도 크로마토그래피 지지체는 면역친화도 리간드, 예를 들어 단백질 A 또는 렉틴을 포함할 수 있다. 친화도 크로마토그래피 지지체는 혼합 모드 크로마토그래피 지지체, 예컨대 세라믹 수산화인회석, 세라믹 불화인회석, 결정질 수산화인회석, 결정질 불화인회석, 캅토어드히어(CaptoAdhere), 캅토 MMC(Capto MMC), HEA 하이퍼셀(Hypercel), PPA 하이퍼셀 또는 토요펄(Toyopearl)(등록상표) MX-Trp-650M, 예컨대 세라믹 수산화인회석을 포함할 수 있다.
친화도 크로마토그래피 지지체는 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체, 예컨대 뷰틸 세파로스(Sepharose)(등록상표) 4 FF, 뷰틸-S 세파로스(등록상표) FF, 옥틸 세파로스(등록상표) 4 FF, 페닐 세파로스(등록상표) BB, 페닐 세파로스(등록상표) HP, 페닐 세파로스(등록상표) 6 FF 하이 서브(High Sub), 페닐 세파로스(등록상표) 6 FF 로우 서브(Low Sub), 소스(Source) 15ETH, 소스 15ISO, 소스 15PHE, 캅토 페닐, 캅토 뷰틸, 스트림라인 페닐(Streamline Phenyl), TSK 에터 5PW(20㎛ 및 30㎛), TSK 페닐 5PW(20㎛ 및 30㎛), 페닐 650S, M 및 C, 뷰틸 650S, M 및 C, 헥실-650M 및 C, 에터-650S 및 M, 뷰틸-600M, 슈퍼 뷰틸-550C, 페닐-600M, PPG-600M; 기공 크기 120, 200, 300A를 가지는 YMC-팩(YMC-Pack) 옥틸 칼럼-3, 5, 10P, 15 및 25㎛, 기공 크기 120, 200 및 300A를 가지는 YMC-팩 페닐 칼럼-3, 5, 10P, 15 및 25㎛, 기공 크기 120, 200 및 300A를 가지는 YMC-팩 뷰틸 칼럼-3, 5, 10P, 15 및 25㎛, 셀루핀 뷰틸, 셀루핀 옥틸, 셀루핀 페닐; WP HI-프로필(C3); 마크로프렙(Macroprep) t-뷰틸 또는 마크로프렙 메틸; 또는 고밀도 페닐―HP2 20㎛, 예컨대 폴리프로필렌 글라이콜(PPG) 600M 또는 페닐 세파로스(등록상표) HP를 포함할 수 있다.
크기 배제 크로마토그래피는 불순물을 모니터링하도록 실행될 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피 지지체는 GS3000SW를 포함할 수 있다.
도 1a-g, 2a-d, 3a-s, 4-i, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12는 완전 중쇄 및 경쇄, 가변 중쇄 및 경쇄, CDR, 프레임워크 영역 및 불변 영역을 포함하는 항당단백질 항체 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 및 Ab5의 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 항체의 이 개별 부분의 하위서열 좌표 및 서열 번호를 제공한다.
도 13은 항체 Ab-A의 상이한 롯트의 글라이코실화를 검출하기 위한 Ab1 및 Ab2를 사용한 ELISA 검정의 결과를 보여준다. 검정 포맷은 겨자무과산화효소(HRP) 검출에 의한 항당변이체(AGV) 항체 다운이었다. 바이오티닐화 항체를 스트렙타비딘 플레이트에 결합시키고, 상이한 Ab-A 롯트가 적정되었다. 2개의 항체 Ab1 및 Ab2는 각각의 시험 샘플과 유사하게 반응하였다. 이 검정 포맷에서, Ab1 및 Ab2의 민감성은, 가능하게는 플레이트 상의 항체 다운에 의한 "초결합도" 효과 및 용액 중의 다점 만노실화 Ab-A로 인해, 비교적 유사하였다.
도 14는 항체 Ab-A 및 Ab-C의 상이한 롯트의 글라이코실화를 검출하기 위한 Ab3, Ab4 및 Ab5를 사용한 ELISA 검정의 결과를 보여준다. 검정 포맷은 스트렙타비딘 플레이트 상의 바이오티닐화 항원 다운이었고, 항당변이체(AGV) 항체가 적정되었다. 항체는 (친화도 차이로 인할 수 있는 약간의 차이가 있지만) 상이한 항원과 유사하게 반응하였다.
도 15는 항체 Ab-A의 상이한 롯트의 글라이코실화를 검출하기 위한 Ab1을 사용한 ELISA 검정의 결과를 보여준다. 검정 포맷은 각각 왼쪽 및 오른쪽 패널에서 겨자무과산화효소(HRP) 또는 유로퓸(Euro) 검출에 의한 항당변이체(AGV) 항체 다운이었다. 바이오티닐화 항체를 스트렙타비딘 플레이트에 결합시키고, 상이한 Ab-A 롯트가 적정되었다. 오른쪽 패널에서, 검출은 (토끼 불변 도메인을 함유하는) Ab1이 아니라 (인간 불변 도메인을 함유하는) Ab-A에 결합하는 유로퓸 표지된 항체에 의했다. 검출에 대한 유로퓸의 사용은 HRP보다 더 큰 신호를 발생시켰다.
도 16은 Ab-A 롯트2 코팅된 바이오센서에 대한 DC-SIGN의 결합(회색)은 Ab1 존재에 의해 불가능하게 된다(검정)는 것을 보여주어서, Ab1이 결합하는 에피토프가 DC-SIGN에 대한 결합 자리와 적어도 중첩한다는 것을 입증한다.
도 17a-b는 정제 분획에서의 당단백질의 수준을 정량화하기 위한 고속 검정(high throughput assay; HTRF)에서의 AGV 항체 Ab1의 사용을 보여준다. Ab-B(도 17a) 및 Ab-D(도 17b)는 칼럼 정제로 처리되고, 당단백질의 상대 양을 결정하도록 AGV 항체를 사용하여 선택 분획(수평 축에서 숫자 매겨짐)을 평가하였다. 항체의 양은 대조군의 백분율(POC), 구체적으로 Ab-A의 당단백질 농후화 제제(Ab-A 롯트 2)에 대한 당단백질의 양으로 표시된다. 참고로, (비교적 적은 양의 당단백질을 함유하는) Ab-A 롯트 1에 함유된 당단백질의 양은, 대조군의 약 25%의 수준인, 수평 선에 의해 표시된다. 이 측정에 기초하여, 분획은 원하는 바대로 당단백질 농후화 또는 당단백질 고갈 제제를 얻도록 선택되거나 혼주될 수 있다.
도 18a는 폴리프로필렌 글라이콜(PPG) 칼럼으로부터 용리된 Ab-A의 분획에 함유된 당단백질의 정량화를 보여준다. Ab1 및 GNA은 각각의 분획에 함유된 (대조군의 백분율(POC)로서 표현된) 당단백질의 상대 양을 평가하기 위해 사용되었다. 각각의 분획에 함유된 단백질 질량은 또한 상대 단위(질량 RU)로 나타냈다. 반응성의 유사한 패턴이 Ab1 및 GNA를 사용하여 검출에 나타났다.
도 18b는, 낮은 범위에서 더 자세히 보여주도록, 0 내지 23의 POC 값으로 수직 축 확대된 및 절삭된, 도 18a의 확대된 버전이다.
도 19A-D는 도 18a-b에 도시된 정제로부터 혼주된 분획의 당단백질 분석의 결과를 보여준다. 도 19A는 도 15에서처럼 유로퓸 기반 항체 다운 ELISA 검정에서 AGV 항체 Ab1을 사용한 상이한 제제(플레이트 상의 Ab1 다운, 용액 중의 0.3㎍/㎖의 Ab-A 샘플)에서의 당단백질의 ELISA 검출을 보여준다. 도 19B는 대조군 샘플의 백분율(POC)로서 ELISA 검정을 이용하여 검출된 당단백질의 검출된 수준을 그래프로 예시한다. 도 19C-D는 각각 GNA 또는 DC-SIGN을 사용하여 결정된 동일한 샘플에서의 당단백질의 검출된 수준을 보여준다. 라벨 "fxn12-21" 및 "fxn4-23"은 도 18a-b에 도시된 정제로부터의 숫자 12 내지 21 또는 4 내지 23의 분획의 혼주를 각각 나타낸다. 매우 유사한 프로필이 이 샘플에서 AGV 항체, GNA 및 DC-SIGN 검정에 의해 나타난다.
도 20은, 각각 대조군 샘플의 백분율(POC)로서 표현된, ELISA 검출(왼쪽 패널) 또는 GNA 검정(오른쪽 패널)을 이용한 항체 제제의 당단백질 분석의 결과를 보여준다. 결과는 6개의 시험된 롯트에 걸쳐 정량적으로 유사하고, 상대 피크 높이는 각각에 대해 유사한 패턴을 형성한다.
도 21은 AGV, GNA 및 DC-SIGN으로부터의 신호에 대한 O-단백당형 조성 분석의 결과를 보여준다. 결과는 AGV mAb(Ab1), GNA 및 DC-SIGN 결합 검정으로부터 얻어진 신호가 서로 및 Ab1 상의 만노스의 양과 상관된다는 것을 보여준다. 표는 GNA, Ab1 및 DC-SIGN 신호와 비교된 당 알콜의 상대 단위를 보여준다.
도 22는 실시예 10에서 실험에서 사용된 포획 시약의 배열의 도식적 도시를 보여준다.
도 23a-b는 포획 시약을 세포에 커플링하기 위해 사용된 GNA(도 23a) 또는 항당단백질 항체 Ab1(도 23b)에 결합된 세포의 유세포분석법 프로필을 보여준다. GNA의 사용은 포획된 형광이 비표지된 세포로 이동하게 하지만, Ab1 결합은 더 안정하고 형광 신호가 보유되게 한다.
도 24a-b는 다양한 기간 동안 배양된 세포의 유세포분석법 프로필을 보여준다. 한결같이 증가한 신호는 0, 0.5 또는 2시간 후 처리된 항체 발현 세포의 샘플에 대한 증가한 항온처리 시간에 의해 입증되지만(도 24b), 대조군 비생성 "무 균주(null strain)"는 동일한 시점에 걸쳐 임의의 신호 증가를 나타내지 않았다(도 24a).
도 25a-c는 동시배양된 항체 생성 및 비생성 "무" 균주의 유세포분석법 프로필을 보여준다. 종래의 배양 배지를 사용하여, 표지된 항체 분비 "제조 균주"와 매트릭스 표지된 비생성 무 균주의 교차 결합을 관찰하였다(도 25a). 10% PEG8000에 의한 보충은 생산성에 부정적으로 영향을 미치지 않으면서 교차 결합을 제한하는 것으로 발견되었다(도 25b 및 도 25c).
도 26A-B는 개별적으로 배양된(도 26A) 또는 동시배양된(도 26B) 고생성 균주 및 저생성 균주의 유세포분석법 프로필을 보여준다. 개별 균주에 의한 항체 제조는 배양에서 0시간 또는 2시간 후 세포를 처리함으로써 규명되어서(도 26A), 검정이 고생성 균주와 저생성 균주 사이의, 배양 시간에 걸쳐 증가한, 형광 신호의 차이를 검출한다는 것을 확인시켜준다. 고생성 균주 및 저생성 균주의 혼합 배양을 표면-포획 매트릭스에 의해 표지하여, 10% PEG8000 보충된 배지 중에 항체를 분비하게 하고, 검출 항체에 의해 세척하고 염색하고, 유세포계수법을 이용하여, 최고 형광 신호를 가지는 세포의 상부 0.25%를 집단으로부터 단리하였다(도 26B).
도 27은 0시간 및 2시간 동안 개별적으로 배양된 고생성 및 저생성 균주의 유세포분석법 프로필을 보여주어서, 세포 배양의 기간에 걸친 이 균주 사이에 항체 제조 수준의 예상된 차이의 검출을 입증한다.
본 개시내용은, 항체가 만노실화 단백질에 특이적으로 결합한다는 것을 나타내는, 피치아 파스토리스로부터 제조된 당단백질에 특이적으로 결합하지만, 포유류 세포로부터 제조된 동일한 당단백질에는 결합하지 않는, 당단백질 결합 항체를 제공하는 것이다.
추가로, 본 개시내용은 숙주 세포 또는 미생물에 의해 발현된 폴리펩타이드(예를 들어, 재조합 폴리펩타이드)를 제조하고 정제하는 공정을 제공한다. 특히, 본 개시내용은 효모 또는 섬질 균류 세포에서 발현된 폴리펩타이드, 예컨대 동종중합체 또는 이종중합체 폴리펩타이드(예를 들어, 항체)를 제조하고 정제하는 공정을 제공한다. 본 방법은 글라이코실화 불순물의 정량적 표시자로서 항체 결합을 포함하여서, 제조 및/또는 정제 공정은 원하는 단백질의 수율을 최대화하고, 글라이코실화 불순물의 존재를 감소시키도록 변형될 수 있다.
추가로, 본 공정은 원치 않는 생성물 연관 불순물, 예컨대 글라이코실화 불순물(예를 들어, 당변이체), 핵산 및 응집체/분해물로부터 원하는 폴리펩타이드를 실질적으로 정제하기 위해 발효 공정으로부터의 샘플의 크로마토그래피 분리를 포함하는 정제 공정을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상이한 크로마토그래피 단계로부터의 이의 용리물 또는 분획은 글라이코실화 불순물의 유형 및/또는 양을 검출하기 위해 항당단백질(예를 들어, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 또는 Ab5) 결합 활성에 대해 모니터링된다. 검출된 글라이코실화 불순물의 양 및/또는 유형을 기준으로, 발효 공정으로부터의 소정의 샘플 및/또는 크로마토그래피 정제로부터의 분획은 추가의 정제를 위해 폐기되고/되거나 처리되고/되거나 선택적으로 혼주된다.
예시적인 실시형태에서, 원하는 단백질은 항체 또는 항체 결합 단편이고, 효모 세포는 피치아 파스토리스이고, 글라이코실화 불순물은 원하는 폴리펩타이드의 당변이체, 예컨대 N 연결 및/또는 O 연결 당변이체이고, 글라이코실화 불순물은 항체 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 또는 Ab5를 사용하여 검출된다.
바람직한 실시형태에서, 원하는 단백질은 항체 또는 항체 단편, 예컨대 2개의 중쇄 아단위 및 2개의 경쇄 아단위로 이루어진 인간화 또는 인간 항체이다. 바람직한 균류 세포는 효모를 포함하고, 특히 바람직한 효모는 메탄영양 효모 균주, 예를 들어 피치아 파스토리스, 한세눌라 폴리모르파(피치아 안구스타), 피치아 구이렐르모르디, 피치아 메타놀리카, 피치아 이노시토베라, 및 기타(예를 들어 미국 특허 제4,812,405호, 제4,818,700호, 제4,929,555호, 제5,736,383호, 제5,955,349호, 제5,888,768호 및 제6,258,559호(이들 각각은 그 전문이 참고문헌으로 포함됨) 참조)를 포함한다. 효모 세포는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 유전자 카피수의 상이한 조합을 함유하는 이배체 또는 사배체 효모 세포의 패널은 개별 아단위 유전자의 다양한 카피 수를 함유하는 세포를 교배시킴으로써(카피 수는 바람직하게는 교배 전에 알려짐) 생성될 수 있다.
출원인은 효모 또는 섬질 균류 세포에서 생성된 단백질의 제조 및 정제에 유용한 항체를 발견하였다. 특히, 본 명세서에 개시된 공정은, 재조합 폴리펩타이드의 양에 대한 검출된 글라이코실화 불순물의 양 및/또는 유형에 기초하여, 예를 들어 제조 및/또는 정제 계획으로부터의 소정의 분획을 선택적으로 폐기하고/하거나 처리하고/하거나 정제함으로써, 관심 있는 주요 단백질 생성물로부터 생성물 연관 불순물, 예를 들어 글라이코실화 불순물의 제거를 개선하기 위해, 단백질 제조 및/또는 정제 계획으로 순도 모니터링 단계를 도입한다. 작업 실시예는 이러한 제조 및 정제 모니터링 방법이 원하는 단백질 생성물의 높은 수율을 유지시키면서 생성물 정제의 높은 수준을 발생시킨다는 것을 입증한다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 원하는 폴리펩타이드를 제조하고 발효 배지로부터 원하는 폴리펩타이드를 정제하기 위한 발효 공정을 포함한다. 일반적으로, 효모 세포 또는 미생물은 발효 배지로 원하는 폴리펩타이드, 및 하나 이상의 불순물의 발현 및 분비를 발생시키는 조건 하에 배양되고, 샘플은 예를 들어 발효 실행 동안 또는 후에 수집되고, 샘플(들)에서의 글라이코실화 불순물의 양 및/또는 유형은 항당단백질 항체, 예컨대 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 또는 Ab5를 사용하여 모니터링되어서, 발효 공정의 매개변수, 예를 들어 온도, pH, 가스 성분(예를 들어, 산소 수준, 압력, 유속), 공급물 성분(예를 들어, 글루코스 수준 또는 속도), 교반, 포기(aeration), 소포(예를 들어, 유형 또는 농도) 및 기간은 검출된 글라이코실화 불순물에 기초하여 변형될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 상기 방법은, 샘플(들)에서의 글라이코실화 불순물의 양 및/또는 유형을 검출하기 위해 항당단백질 항체, 예컨대 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 또는 Ab5를 사용함으로써, 발효 배지로 원하는 폴리펩타이드 및 하나 이상의 불순물의 발현 및 분비를 발생시키는 조건 하에 원하는 세포 또는 미생물을 배양하는 것을 포함하는, 발효 공정으로부터 생긴, 하나 이상의 샘플로부터 원하는 폴리펩타이드를 정제하는 공정을 포함한다. 본 발명자들은 항당단백질 항체 결합 검정이 글라이코실화 불순물의 정량적 또는 반정량적 수단을 제공하여서, 정제 공정이 불순물의 검출된 수준 및 유형에 반응하여 조정될 수 있다는 것을 결정하였다.
특정한 실시형태에서, 정제 공정은 숙주 효모 또는 섬질 균류 세포 및 불순물에서 발현된 발효 공정으로부터의 하나 이상의 샘플(예컨대, 원하는 단백질, 예를 들어 항체를 함유하는 발효 배지)을 적어도 하나의 크로마토그래피 지지체와 접촉시키는 단계 및 이후 원하는 폴리펩타이드를 선택적으로 용리시키는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 샘플은 항당단백질 항체, 예컨대 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 또는 Ab5에 대한 결합을 검출하는 검정을 이용하여 글라이코실화 불순물에 대해 시험되고, 검출된 글라이코실화 불순물의 유형 및/또는 양에 따라, 친화도 크로마토그래피 지지체(예를 들어, 단백질 A 또는 렉틴), 혼합 방식 크로마토그래피 지지체(예를 들어, 세라믹 수산화인회석) 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체(예를 들어, 폴리프로필렌 글라이콜(PPG) 600M)와 접촉할 수 있다. 원하는 단백질은 후속적인 크로마토그래피 지지체와 접촉하기 전에 각각의 크로마토그래피 지지체로부터 분리, 예를 들어 선택적으로 용리되어서, 실질적으로 정제된 원하는 단백질을 포함하는 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체로부터 이의 용리물 또는 분획을 생성시킨다.
상기 방법은, 원하는 단백질에 대한 적어도 하나의 변형(예를 들어, 아미노산 치환, N 말단 변형, C 말단 변형, 미스매치된 S-S 결합, 폴딩, 절두, 응집, 다합체 해리, 변성, 아세틸화, 지방 아실화, 탈아마이드화, 산화, 카바밀화, 카복실화, 폼일화, 감마-카복시글루타밀화, 글라이코실화, 메틸화, 인산화, 황화, PEG화 및 유비퀴틴화)을 포함하는, 적어도 하나의 생성물 연관 불순물, 예컨대 균류 세포 단백질, 균류 세포 핵산, 외래성 바이러스, 내인성 바이러스, 내독소, 응집체, 분해물 또는 원치 않는 단백질의 존재에 대한, 친화도 크로마토그래피 지지체, 혼합 방식 크로마토그래피 지지체 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체 중 적어도 하나로부터의 발효 공정의 샘플 및/또는 이의 용리물 또는 분획의 부분을 모니터링하는 단계를 임의로 추가로 포함한다. 특히, 제조 및 정제 공정은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 샘플 또는 분획에서 응집 및/또는 분해 불순물의 양을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
원하는 단백질 또는 다중-아단위 복합체와 관련하여 "실질적으로 정제된"은 샘플이 3% 미만, 2.5% 미만, 2% 미만, 1.5% 미만 또는 1% 미만의 불순물, 즉 응집체, 변이체 및 저분자량 생성물과 함께 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 98.5%의 원하는 단백질을 포함한다는 것을 의미한다. 일 실시형태에서, 실질적으로 정제된 단백질은 10ng/㎎ 미만, 바람직하게는 5ng/㎎ 미만 또는 더 바람직하게는 2ng/㎎ 미만의 균류 세포 단백질; 및/또는 10ng/㎎ 미만 또는 바람직하게는 5ng/㎎ 미만의 핵산을 포함한다.
많은 본 개시내용이 항체의 제조를 기재하지만, 본 명세서에 기재된 방법은 다른 다중-아단위 복합체, 및 단일 아단위 단백질에 용이하게 적용된다. 본 명세서에 개시된 방법은 재조합으로 발현되거나 발현되지 않을 수 있는 임의의 단일 또는 다중-아단위 복합체의 수율 및/또는 순도를 개선하도록 용이하게 사용될 수 있다. 추가로, 본 방법은 단백질 복합체의 제조로 제한되지 않고, 텔로머라제, hnRNP, 리보솜, snRNP, 신호 인식 입자, 원핵생물 및 진핵생물 RNase P 복합체, 및 다수의 단백질 및/또는 RNA 아단위를 함유하는 임의의 다른 복합체를 포함하는 리보뉴클레오단백질(ribonucleoprotein; RNP) 복합체와 사용하기 위해 또한 용이하게 적용될 수 있다. 추가로, 다중-아단위 복합체를 발현하는 세포는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 유전자 카피수의 상이한 조합을 함유하는 이배체 또는 사배체 효모 세포의 패널은 개별 아단위 유전자의 다양한 카피 수를 함유하는 세포를 교배시킴으로써(카피 수는 바람직하게는 교배 전에 알려짐) 생성될 수 있다.
항체 폴리펩타이드 서열
항체 Ab1
일 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, 하기 기재된 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 중쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: QEQLVESGGGLVQPGASLTLTCTASGFSFSNTNYMCWVRQAPGRGLEWVGCMPVGFIASTFYATWAKGRSAISKSSSTAVTLQMTSLTVADTATYFCARESGSGWALNLWGQGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(서열 번호 1).
일 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, 하기 기재된 가변 중쇄 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 중쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: QEQLVESGGGLVQPGASLTLTCTASGFSFSNTNYMCWVRQAPGRGLEWVGCMPVGFIASTFYATWAKGRSAISKSSSTAVTLQMTSLTVADTATYFCARESGSGWALNLWGQGTLVTVSS(서열 번호 2).
일 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, Ab1과 동일한 에피토프 특이성을 보유하고 하기 기재된 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 불변 중쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: GQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(서열 번호 10).
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, 하기 기재된 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: DPVLTQTPSPVSAAVGGTVTISCQASESVESGNWLAWYQQKPGQPPKLLIYYTSTLASGVPSRFKGSGSGAHFTLTISGVQCDDAATYYCQGAFYGVNTFGGGTEVVVKRTPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC(서열 번호 21).
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, 하기 기재된 가변 경쇄 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: DPVLTQTPSPVSAAVGGTVTISCQASESVESGNWLAWYQQKPGQPPKLLIYYTSTLASGVPSRFKGSGSGAHFTLTISGVQCDDAATYYCQGAFYGVNTFGGGTEVVVK(서열 번호 22).
일 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, Ab1과 동일한 에피토프 특이성을 보유하고 하기 기재된 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 불변 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: RTPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC(서열 번호 30).
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하고, 서열 번호 1의 중쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역)에 상응하거나, 서열 번호 2의 가변 중쇄 서열을 포함하는 서열 번호 4; 서열 번호 6; 및 서열 번호 8의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개 또는 3개를 포함하고/하거나, 서열 번호 21의 경쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역)에 상응하거나, 서열 번호 22의 가변 경쇄 서열을 포함하는 서열 번호 24; 서열 번호 26; 및 서열 번호 28의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개 또는 3개를 추가로 포함하는 항체 또는 항체 단편, 또는 이것에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열의 조합을 함유하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편은 예시화된 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 또는 상기 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열 중 하나 이상, 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명은 서열 번호 1의 중쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 2의 가변 중쇄 서열에 상응하는 서열 번호 3; 서열 번호 5; 서열 번호 7; 및 서열 번호 9의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개, 3개 또는 4개, 및/또는 서열 번호 21의 경쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 22의 가변 경쇄 서열에 상응하는 서열 번호 23; 서열 번호 25; 서열 번호 27; 및 서열 번호 29의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개, 3개 또는 4개를 포함하는 항당단백질 항체 또는 항체 단편, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합 또는 이것에 적어도 80%, 90% 또는 95% 동일한 서열을 추가로 고려한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 FR, CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 상기 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열 중 하나 이상, 예컨대 이들 모두 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항당단백질 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 폴리펩타이드 서열 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 폴리펩타이드를 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 단편은 서열 번호 21 또는 서열 번호 22의 폴리펩타이드 서열 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 폴리펩타이드를 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 1의 중쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역) 또는 서열 번호 2의 가변 중쇄 서열에 상응하는 서열 번호 4; 서열 번호 6; 및 서열 번호 8의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개 또는 3개 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 21의 경쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역) 또는 서열 번호 22의 가변 경쇄 서열에 상응하는 서열 번호 24; 서열 번호 26; 및 서열 번호 28의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개 또는 3개 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 1의 중쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 2의 가변 중쇄 서열에 상응하는 서열 번호 3; 서열 번호 5; 서열 번호 7; 및 서열 번호 9의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개, 3개 또는 4개 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 당해 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 21의 경쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 22의 가변 경쇄 서열에 상응하는 서열 번호 23; 서열 번호 25; 서열 번호 27; 및 서열 번호 29의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개, 3개 또는 4개 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 하나 이상의 항체 단편을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체의 단편은 서열 번호 2의 가변 중쇄 영역; 서열 번호 22의 가변 경쇄 영역; 서열 번호 2의 가변 중쇄 영역의 상보성 결정 영역(서열 번호 4; 서열 번호 6; 및 서열 번호 8); 및 서열 번호 22의 가변 경쇄 영역의 상보성 결정 영역(서열 번호 24; 서열 번호 26; 및 서열 번호 28)의 항체 단편 중 1개, 2개, 3개 이상, 예컨대 모두 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 하나 이상의 항체 단편을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체의 단편은 서열 번호 2의 가변 중쇄 영역; 서열 번호 22의 가변 경쇄 영역; 서열 번호 2의 가변 중쇄 영역의 프레임워크 영역(서열 번호 3; 서열 번호 5; 서열 번호 7; 및 서열 번호 9); 및 서열 번호 22의 가변 경쇄 영역의 프레임워크 영역(서열 번호 23; 서열 번호 25; 서열 번호 27; 및 서열 번호 29)의 항체 단편 중 1개, 2개, 3개 이상, 예컨대 모두를 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 특히 바람직한 실시형태에서, 항당단백질 항체는 서열 번호 1 및 서열 번호 21을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진 Ab1, 또는 Ab1의 CDR을 포함하고 본 명세서에 기재된 생물학적 활성 중 적어도 하나를 가지는 항체 또는 항체 단편이거나, 결합 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 대해 Ab1과 경쟁하는 항당단백질 항체, 바람직하게는 Ab1의 것과 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 함유하는 것 또는 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질) 상의 Ab1과 동일한 또는 중첩하는 에피토프(들)에 결합하는 항체이다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 실시형태에서, 항체 단편은 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 대한 결합 특이성을 가지는 Fab(단편 항원 결합) 단편을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다. 항체 Ab1과 관련하여, Fab 단편은 바람직하게는 서열 번호 2의 가변 중쇄 서열 및 서열 번호 22의 가변 경쇄 서열 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함한다. 본 발명의 이 실시형태는 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 대한 결합 특이성을 보유하는 서열 번호 2 및/또는 서열 번호 22의 부가, 결실 또는 변이체를 함유하는 Fab를 추가로 포함한다.
본 명세서(하기)에 기재된 본 발명의 일 실시형태에서, Fab 단편은 Ab1의 효소 분해(예를 들어, 파파인)에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 항당단백질 항체, 예컨대 Ab1 또는 이의 Fab 단편은 포유류 세포, 예컨대 CHO, NSO 또는 인간 신장 세포, 균류, 곤충 또는 미생물 시스템, 예컨대 효모 세포(예를 들어, 반수체 또는 이배체 효모, 예컨대 반수체 또는 이배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생성될 수 있다. 적합한 피치아 종은 피치아 파스토리스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
추가적인 실시형태에서, 본 발명은 추가로, Ab1의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 FR, CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 상기 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열, 예컨대 이들 모두 중 하나 이상 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열의 단편, 변이체, 조합에 관한 것이다.
항체 Ab2
일 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, 하기 기재된 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 중쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: QSLEESGGGLVKPEGSLTLTCKASGFSFTGAHYMCWVRQAPGKGLEWIACIYGGSVDITFYASWAKGRFAISKSSSTAVTLQMTSLTAADTATYVCARESGSGWALNLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(서열 번호 41).
일 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, 하기 기재된 가변 중쇄 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 중쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: QSLEESGGGLVKPEGSLTLTCKASGFSFTGAHYMCWVRQAPGKGLEWIACIYGGSVDITFYASWAKGRFAISKSSSTAVTLQMTSLTAADTATYVCARESGSGWALNLWGPGTLVTVSS(서열 번호 42).
일 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, Ab2와 동일한 에피토프 특이성을 보유하고 하기 기재된 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 불변 중쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: GQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(서열 번호 50).
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, 하기 기재된 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: QVLTQTASPVSAAVGGTVTISCQSSQSVENGNWLAWYQQKPGQPPKLLIYLASTLESGVPSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCQGAYSGINVFGGGTEVVVKRTPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC(서열 번호 61).
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, 하기 기재된 가변 경쇄 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: QVLTQTASPVSAAVGGTVTISCQSSQSVENGNWLAWYQQKPGQPPKLLIYLASTLESGVPSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCQGAYSGINVFGGGTEVVVK(서열 번호 62).
일 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, Ab2와 동일한 에피토프 특이성을 보유하고 하기 기재된 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 불변 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: RTPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC(서열 번호 70).
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하고, 서열 번호 41의 중쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역)에 상응하거나, 서열 번호 42의 가변 중쇄 서열을 포함하는 서열 번호 44; 서열 번호 46; 및 서열 번호 48의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개 또는 3개를 포함하고/포함하거나, 서열 번호 61의 경쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역)에 상응하거나, 서열 번호 62의 가변 경쇄 서열을 포함하는 서열 번호 64; 서열 번호 66; 및 서열 번호 68의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개 또는 3개를 추가로 포함하는 항체 또는 항체 단편, 또는 이것에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열의 조합을 함유하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편은 예시화된 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 또는 상기 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열 중 하나 이상, 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명은 서열 번호 41의 중쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 42의 가변 중쇄 서열에 상응하는 서열 번호 43; 서열 번호 45; 서열 번호 47; 및 서열 번호 49의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개, 3개 또는 4개, 및/또는 서열 번호 61의 경쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 62의 가변 경쇄 서열에 상응하는 서열 번호 63; 서열 번호 65; 서열 번호 67; 및 서열 번호 69의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개, 3개 또는 4개를 포함하는 항당단백질 항체 또는 항체 단편, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합 또는 이것에 적어도 80%, 90% 또는 95% 동일한 서열을 추가로 고려한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 FR, CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 상기 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열 중 하나 이상, 예컨대 이들 모두 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항당단백질 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 41 또는 서열 번호 42의 폴리펩타이드 서열 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 폴리펩타이드를 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 단편은 서열 번호 61 또는 서열 번호 62의 폴리펩타이드 서열 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 폴리펩타이드를 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 41의 중쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역) 또는 서열 번호 42의 가변 중쇄 서열에 상응하는 서열 번호 44; 서열 번호 46; 및 서열 번호 48의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개 또는 3개 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 61의 경쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역) 또는 서열 번호 62의 가변 경쇄 서열에 상응하는 서열 번호 64; 서열 번호 66; 및 서열 번호 68의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개 또는 3개 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 41의 중쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 42의 가변 중쇄 서열에 상응하는 서열 번호 43; 서열 번호 45; 서열 번호 47; 및 서열 번호 49의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개, 3개 또는 4개 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 당해 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 61의 경쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 62의 가변 경쇄 서열에 상응하는 서열 번호 63; 서열 번호 65; 서열 번호 67; 및 서열 번호 69의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개, 3개 또는 4개 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 하나 이상의 항체 단편을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체의 단편은 서열 번호 42의 가변 중쇄 영역; 서열 번호 62의 가변 경쇄 영역; 서열 번호 42의 가변 중쇄 영역의 상보성 결정 영역(서열 번호 44; 서열 번호 46; 및 서열 번호 48); 및 서열 번호 62의 가변 경쇄 영역의 상보성 결정 영역(서열 번호 64; 서열 번호 66; 및 서열 번호 68)의 항체 단편 중 1개, 2개, 3개 이상, 예컨대 모두 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 하나 이상의 항체 단편을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체의 단편은 서열 번호 42의 가변 중쇄 영역; 서열 번호 62의 가변 경쇄 영역; 서열 번호 42의 가변 중쇄 영역의 프레임워크 영역(서열 번호 43; 서열 번호 45; 서열 번호 47; 및 서열 번호 49); 및 서열 번호 62의 가변 경쇄 영역의 프레임워크 영역(서열 번호 63; 서열 번호 65; 서열 번호 67; 및 서열 번호 69)의 항체 단편 중 1개, 2개, 3개 이상, 예컨대 모두를 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 특히 바람직한 실시형태에서, 항당단백질 항체는 서열 번호 41 및 서열 번호 61을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진 Ab2, 또는 Ab2의 CDR을 포함하고 본 명세서에 기재된 생물학적 활성 중 적어도 하나를 가지는 항체 또는 항체 단편이거나, 결합 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 대해 Ab2와 경쟁하는 항당단백질 항체, 바람직하게는 Ab2의 것과 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 함유하는 것 또는 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질) 상의 Ab2와 동일한 또는 중첩하는 에피토프(들)에 결합하는 항체이다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 실시형태에서, 항체 단편은 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 대한 결합 특이성을 가지는 Fab(단편 항원 결합) 단편을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다. 항체 Ab2와 관련하여, Fab 단편은 바람직하게는 서열 번호 42의 가변 중쇄 서열 및 서열 번호 62의 가변 경쇄 서열 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함한다. 본 발명의 이 실시형태는 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 대한 결합 특이성을 보유하는 서열 번호 42 및/또는 서열 번호 62의 부가, 결실 또는 변이체를 함유하는 Fab를 추가로 포함한다.
본 명세서(하기)에 기재된 본 발명의 일 실시형태에서, Fab 단편은 Ab2의 효소 분해(예를 들어, 파파인)에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 항당단백질 항체, 예컨대 Ab2 또는 이의 Fab 단편은 포유류 세포, 예컨대 CHO, NSO 또는 인간 신장 세포, 균류, 곤충 또는 미생물 시스템, 예컨대 효모 세포(예를 들어, 반수체 또는 이배체 효모, 예컨대 반수체 또는 이배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생성될 수 있다. 적합한 피치아 종은 피치아 파스토리스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
추가적인 실시형태에서, 본 발명은 추가로, Ab2의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 FR, CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 상기 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열, 예컨대 이들 모두 중 하나 이상 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열의 단편, 변이체, 조합에 관한 것이다.
항체 Ab3
일 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, 하기 기재된 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 중쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: QSLEESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFFFSGAHYMCWVRQAPGQGLEWIGCTYGGSVDITFYASWAKGRFAISKTSSTTVTLQLTSLTAADTATYVCARESGSGWALNLWGQGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(서열 번호 81).
일 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, 하기 기재된 가변 중쇄 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 중쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: QSLEESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFFFSGAHYMCWVRQAPGQGLEWIGCTYGGSVDITFYASWAKGRFAISKTSSTTVTLQLTSLTAADTATYVCARESGSGWALNLWGQGTLVTVSS(서열 번호 82).
일 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, Ab3과 동일한 에피토프 특이성을 보유하고 하기 기재된 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 불변 중쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: GQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(서열 번호 90).
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, 하기 기재된 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: QVLTQTPSPVSAAVGGAVTINCQSSQSVENGNWLGWYQQKPGQPPKLLIYLASTLASGVPSRFTGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCQGAYSGINAFGGGTEVVVKRTPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC(서열 번호 101).
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, 하기 기재된 가변 경쇄 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: QVLTQTPSPVSAAVGGAVTINCQSSQSVENGNWLGWYQQKPGQPPKLLIYLASTLASGVPSRFTGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCQGAYSGINAFGGGTEVVVK(서열 번호 102).
일 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, Ab3과 동일한 에피토프 특이성을 보유하고 하기 기재된 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 불변 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: RTPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC(서열 번호 110).
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하고, 서열 번호 81의 중쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역)에 상응하거나, 서열 번호 82의 가변 중쇄 서열을 포함하는 서열 번호 84; 서열 번호 86; 및 서열 번호 88의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개 또는 3개를 포함하고/하거나, 서열 번호 101의 경쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역)에 상응하거나, 서열 번호 102의 가변 경쇄 서열을 포함하는 서열 번호 104; 서열 번호 106; 및 서열 번호 108의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개 또는 3개를 추가로 포함하는 항체 또는 항체 단편, 또는 이것에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열의 조합을 함유하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편은 예시화된 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 또는 상기 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열 중 하나 이상, 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명은 서열 번호 81의 중쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 82의 가변 중쇄 서열에 상응하는 서열 번호 83; 서열 번호 85; 서열 번호 87; 및 서열 번호 89의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개, 3개 또는 4개, 및/또는 서열 번호 101의 경쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 102의 가변 경쇄 서열에 상응하는 서열 번호 103; 서열 번호 105; 서열 번호 107; 및 서열 번호 109의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개, 3개 또는 4개를 포함하는 항당단백질 항체 또는 항체 단편, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합 또는 이것에 적어도 80%, 90% 또는 95% 동일한 서열을 추가로 고려한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 FR, CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 상기 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열 중 하나 이상, 예컨대 이들 모두 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항당단백질 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 81 또는 서열 번호 82의 폴리펩타이드 서열 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 폴리펩타이드를 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 단편은 서열 번호 101 또는 서열 번호 102의 폴리펩타이드 서열 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 폴리펩타이드를 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 81의 중쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역) 또는 서열 번호 82의 가변 중쇄 서열에 상응하는 서열 번호 84; 서열 번호 86; 및 서열 번호 88의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개 또는 3개 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 101의 경쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역) 또는 서열 번호 102의 가변 경쇄 서열에 상응하는 서열 번호 104; 서열 번호 106; 및 서열 번호 108의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개 또는 3개 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 81의 중쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 82의 가변 중쇄 서열에 상응하는 서열 번호 83; 서열 번호 85; 서열 번호 87; 및 서열 번호 89의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개, 3개 또는 4개 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 해당 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 101의 경쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 102의 가변 경쇄 서열에 상응하는 서열 번호 103; 서열 번호 105; 서열 번호 107; 및 서열 번호 109의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개, 3개 또는 4개 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 하나 이상의 항체 단편을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체의 단편은 서열 번호 82의 가변 중쇄 영역; 서열 번호 102의 가변 경쇄 영역; 서열 번호 82의 가변 중쇄 영역의 상보성 결정 영역(서열 번호 84; 서열 번호 86; 및 서열 번호 88); 및 서열 번호 102의 가변 경쇄 영역의 상보성 결정 영역(서열 번호 104; 서열 번호 106; 및 서열 번호 108)의 항체 단편 중 1개, 2개, 3개 이상, 예컨대 모두 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 하나 이상의 항체 단편을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체의 단편은 서열 번호 82의 가변 중쇄 영역; 서열 번호 102의 가변 경쇄 영역; 서열 번호 82의 가변 중쇄 영역의 프레임워크 영역(서열 번호 83; 서열 번호 85; 서열 번호 87; 및 서열 번호 89); 및 서열 번호 102의 가변 경쇄 영역의 프레임워크 영역(서열 번호 103; 서열 번호 105; 서열 번호 107; 및 서열 번호 109)의 항체 단편 중 1개, 2개, 3개 이상, 예컨대 모두를 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 특히 바람직한 실시형태에서, 항당단백질 항체는 서열 번호 81 및 서열 번호 101을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진 Ab3, 또는 Ab3의 CDR을 포함하고 본 명세서에 기재된 생물학적 활성 중 적어도 하나를 가지는 항체 또는 항체 단편이거나, 결합 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 대해 Ab3과 경쟁하는 항당단백질 항체, 바람직하게는 Ab3의 것과 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 함유하는 것 또는 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질) 상의 Ab3과 동일한 또는 중첩하는 에피토프(들)에 결합하는 항체이다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 실시형태에서, 항체 단편은 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 대한 결합 특이성을 가지는 Fab(단편 항원 결합) 단편을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다. 항체 Ab3과 관련하여, Fab 단편은 바람직하게는 서열 번호 82의 가변 중쇄 서열 및 서열 번호 102의 가변 경쇄 서열 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함한다. 본 발명의 이 실시형태는 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 대한 결합 특이성을 보유하는 서열 번호 82 및/또는 서열 번호 102의 부가, 결실 또는 변이체를 함유하는 Fab를 추가로 포함한다.
본 명세서(하기)에 기재된 본 발명의 일 실시형태에서, Fab 단편은 Ab3의 효소 분해(예를 들어, 파파인)에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 항당단백질 항체, 예컨대 Ab3 또는 이의 Fab 단편은 포유류 세포, 예컨대 CHO, NSO 또는 인간 신장 세포, 균류, 곤충 또는 미생물 시스템, 예컨대 효모 세포(예를 들어, 반수체 또는 이배체 효모, 예컨대 반수체 또는 이배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생성될 수 있다. 적합한 피치아 종은 피치아 파스토리스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
추가적인 실시형태에서, 본 발명은 추가로, Ab3의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 FR, CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 상기 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열, 예컨대 이들 모두 중 하나 이상 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열의 단편, 변이체, 조합에 관한 것이다.
항체 Ab4
일 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, 하기 기재된 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 중쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: QSLEESGGDLVKPGASLTLTCTASGFSFSSGYDMCWVRQAPGKGLEWIACIYPNNPVTYYASWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCGRSDSNGHTFNLWGQGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(서열 번호 121).
일 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, 하기 기재된 가변 중쇄 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 중쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: QSLEESGGDLVKPGASLTLTCTASGFSFSSGYDMCWVRQAPGKGLEWIACIYPNNPVTYYASWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCGRSDSNGHTFNLWGQGTLVTVSS(서열 번호 122).
일 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, Ab4와 동일한 에피토프 특이성을 보유하고 하기 기재된 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 불변 중쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: GQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(서열 번호 130).
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, 하기 기재된 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: DPVMTQTPSSVSAAVGGTVTINCQSSQSVNQNDLSWYQQKPGQPPKRLIYYASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDMQCDDAATYYCQGSFRVSGWYWAFGGGTEVVVKRTPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC(서열 번호 141).
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, 하기 기재된 가변 경쇄 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: DPVMTQTPSSVSAAVGGTVTINCQSSQSVNQNDLSWYQQKPGQPPKRLIYYASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDMQCDDAATYYCQGSFRVSGWYWAFGGGTEVVVK(서열 번호 142).
일 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, Ab4와 동일한 에피토프 특이성을 보유하고 하기 기재된 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 불변 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: RTPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC(서열 번호 150).
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하고, 서열 번호 121의 중쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역)에 상응하거나, 서열 번호 122의 가변 중쇄 서열을 포함하는 서열 번호 124; 서열 번호 126; 및 서열 번호 128의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개 또는 3개를 포함하고/하거나, 서열 번호 141의 경쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역)에 상응하거나, 서열 번호 142의 가변 경쇄 서열을 포함하는 서열 번호 144; 서열 번호 146; 및 서열 번호 148의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개 또는 3개를 추가로 포함하는 항체 또는 항체 단편, 또는 이것에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열의 조합을 함유하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편은 예시화된 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 또는 상기 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열 중 하나 이상, 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다 .
본 발명은 서열 번호 121의 중쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 122의 가변 중쇄 서열에 상응하는 서열 번호 123; 서열 번호 125; 서열 번호 127; 및 서열 번호 129의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개, 3개 또는 4개, 및/또는 서열 번호 141의 경쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 142의 가변 경쇄 서열에 상응하는 서열 번호 143; 서열 번호 145; 서열 번호 147; 및 서열 번호 149의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개, 3개 또는 4개를 포함하는 항당단백질 항체 또는 항체 단편, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합 또는 이것에 적어도 80%, 90% 또는 95% 동일한 서열을 추가로 고려한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 FR, CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 상기 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열 중 하나 이상, 예컨대 이들 모두 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항당단백질 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 121 또는 서열 번호 122의 폴리펩타이드 서열 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 폴리펩타이드를 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 단편은 서열 번호 141 또는 서열 번호 142의 폴리펩타이드 서열 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 폴리펩타이드를 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 121의 중쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역) 또는 서열 번호 122의 가변 중쇄 서열에 상응하는 서열 번호 124; 서열 번호 126; 및 서열 번호 128의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개 또는 3개 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 141의 경쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역) 또는 서열 번호 142의 가변 경쇄 서열에 상응하는 서열 번호 144; 서열 번호 146; 및 서열 번호 148의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개 또는 3개 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 121의 중쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 122의 가변 중쇄 서열에 상응하는 서열 번호 123; 서열 번호 125; 서열 번호 127; 및 서열 번호 129의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개, 3개 또는 4개 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 당해 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 141의 경쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 142의 가변 경쇄 서열에 상응하는 서열 번호 143; 서열 번호 145; 서열 번호 147; 및 서열 번호 149의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개, 3개 또는 4개 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 하나 이상의 항체 단편을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체의 단편은 서열 번호 122의 가변 중쇄 영역; 서열 번호 142의 가변 경쇄 영역; 서열 번호 122의 가변 중쇄 영역의 상보성 결정 영역(서열 번호 124; 서열 번호 126; 및 서열 번호 128); 및 서열 번호 142의 가변 경쇄 영역의 상보성 결정 영역(서열 번호 144; 서열 번호 146; 및 서열 번호 148)의 항체 단편 중 1개, 2개, 3개 이상, 예컨대 모두 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 하나 이상의 항체 단편을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체의 단편은 서열 번호 122의 가변 중쇄 영역; 서열 번호 142의 가변 경쇄 영역; 서열 번호 122의 가변 중쇄 영역의 프레임워크 영역(서열 번호 123; 서열 번호 125; 서열 번호 127; 및 서열 번호 129); 및 서열 번호 142의 가변 경쇄 영역의 프레임워크 영역(서열 번호 143; 서열 번호 145; 서열 번호 147; 및 서열 번호 149)의 항체 단편 중 1개, 2개, 3개 이상, 예컨대 모두를 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 특히 바람직한 실시형태에서, 항당단백질 항체는 서열 번호 121 및 서열 번호 141을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진 Ab4, 또는 Ab4의 CDR을 포함하고 본 명세서에 기재된 생물학적 활성 중 적어도 하나를 가지는 항체 또는 항체 단편이거나, 결합 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 대해 Ab4와 경쟁하는 항당단백질 항체, 바람직하게는 Ab4의 것과 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 함유하는 것 또는 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질) 상의 Ab4와 동일한 또는 중첩하는 에피토프(들)에 결합하는 항체이다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 실시형태에서, 항체 단편은 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 대한 결합 특이성을 가지는 Fab(단편 항원 결합) 단편을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다. 항체 Ab4와 관련하여, Fab 단편은 바람직하게는 서열 번호 122의 가변 중쇄 서열 및 서열 번호 142의 가변 경쇄 서열 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함한다. 본 발명의 이 실시형태는 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 대한 결합 특이성을 보유하는 서열 번호 122 및/또는 서열 번호 142의 부가, 결실 또는 변이체를 함유하는 Fab를 추가로 포함한다.
본 명세서(하기)에 기재된 본 발명의 일 실시형태에서, Fab 단편은 Ab4의 효소 분해(예를 들어, 파파인)에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 항당단백질 항체, 예컨대 Ab4 또는 이의 Fab 단편은 포유류 세포, 예컨대 CHO, NSO 또는 인간 신장 세포, 균류, 곤충 또는 미생물 시스템, 예컨대 효모 세포(예를 들어, 반수체 또는 이배체 효모, 예컨대 반수체 또는 이배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생성될 수 있다. 적합한 피치아 종은 피치아 파스토리스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
추가적인 실시형태에서, 본 발명은 추가로, Ab4의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 FR, CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 상기 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열, 예컨대 이들 모두 중 하나 이상 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열의 단편, 변이체, 조합에 관한 것이다.
항체 Ab5
일 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, 하기 기재된 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 중쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: QQQLLESGGGLVQPEGSLALTCTASGFSFSSGYDMCWVRQPPGKGLEWVGCIYSGDDNDITYYASWARGRFTISNPSSTTVTLQMTSLTVADTATYFCARGHAIYDNYDSVHLWGQGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(서열 번호 161).
일 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, 하기 기재된 가변 중쇄 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 중쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: QQQLLESGGGLVQPEGSLALTCTASGFSFSSGYDMCWVRQPPGKGLEWVGCIYSGDDNDITYYASWARGRFTISNPSSTTVTLQMTSLTVADTATYFCARGHAIYDNYDSVHLWGQGTLVTVSS(서열 번호 162).
일 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, Ab5와 동일한 에피토프 특이성을 보유하고 하기 기재된 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 불변 중쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: GQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(서열 번호 170).
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, 하기 기재된 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: IVMTQTPSSRSVPVGGTVTINCQASEIVNRNNRLAWFQQKPGQPPKLLMYLASTPASGVPSRFRGSGSGTQFTLTISDVVCDDAATYYCTAYKSSNTDGIAFGGGTEVVVKRTPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC(서열 번호 181).
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, 하기 기재된 가변 경쇄 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: IVMTQTPSSRSVPVGGTVTINCQASEIVNRNNRLAWFQQKPGQPPKLLMYLASTPASGVPSRFRGSGSGTQFTLTISDVVCDDAATYYCTAYKSSNTDGIAFGGGTEVVVK(서열 번호 182).
일 실시형태에서, 본 발명은 당단백질, 예컨대 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하고, Ab5와 동일한 에피토프 특이성을 보유하고 하기 기재된 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 불변 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다: RTPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC(서열 번호 190).
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하고, 서열 번호 161의 중쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역)에 상응하거나, 서열 번호 162의 가변 중쇄 서열을 포함하는 서열 번호 164; 서열 번호 166; 및 서열 번호 168의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개 또는 3개를 포함하고/포함하거나, 서열 번호 181의 경쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역)에 상응하거나, 서열 번호 182의 가변 경쇄 서열을 포함하는 서열 번호 184; 서열 번호 186; 및 서열 번호 188의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개 또는 3개를 추가로 포함하는 항체 또는 항체 단편, 또는 이것에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열의 조합을 함유하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편은 예시화된 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 또는 상기 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열 중 하나 이상, 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명은 서열 번호 161의 중쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 162의 가변 중쇄 서열에 상응하는 서열 번호 163; 서열 번호 165; 서열 번호 167; 및 서열 번호 169의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개, 3개 또는 4개, 및/또는 서열 번호 181의 경쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 182의 가변 경쇄 서열에 상응하는 서열 번호 183; 서열 번호 185; 서열 번호 187; 및 서열 번호 189의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개, 3개 또는 4개를 포함하는 항당단백질 항체 또는 항체 단편, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합 또는 이것에 적어도 80%, 90% 또는 95% 동일한 서열을 추가로 고려한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 FR, CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 상기 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열 중 하나 이상, 예컨대 이들 모두 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항당단백질 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 161 또는 서열 번호 162의 폴리펩타이드 서열 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 폴리펩타이드를 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 단편은 서열 번호 181 또는 서열 번호 182의 폴리펩타이드 서열 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 폴리펩타이드를 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 161의 중쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역) 또는 서열 번호 162의 가변 중쇄 서열에 상응하는 서열 번호 164; 서열 번호 166; 및 서열 번호 168의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개 또는 3개 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 181의 경쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역) 또는 서열 번호 182의 가변 경쇄 서열에 상응하는 서열 번호 184; 서열 번호 186; 및 서열 번호 188의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개 또는 3개 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 161의 중쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 162의 가변 중쇄 서열에 상응하는 서열 번호 163; 서열 번호 165; 서열 번호 167; 및 서열 번호 169의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개, 3개 또는 4개 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 당해 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 181의 경쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 182의 가변 경쇄 서열에 상응하는 서열 번호 183; 서열 번호 185; 서열 번호 187; 및 서열 번호 189의 폴리펩타이드 서열 중 1개, 2개, 3개 또는 4개 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 하나 이상의 항체 단편을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체의 단편은 서열 번호 162의 가변 중쇄 영역; 서열 번호 182의 가변 경쇄 영역; 서열 번호 162의 가변 중쇄 영역의 상보성 결정 영역(서열 번호 164; 서열 번호 166; 및 서열 번호 168); 및 서열 번호 182의 가변 경쇄 영역의 상보성 결정 영역(서열 번호 184; 서열 번호 186; 및 서열 번호 188)의 항체 단편 중 1개, 2개, 3개 이상, 예컨대 모두 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 하나 이상의 항체 단편을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체의 단편은 서열 번호 162의 가변 중쇄 영역; 서열 번호 182의 가변 경쇄 영역; 서열 번호 162의 가변 중쇄 영역의 프레임워크 영역(서열 번호 163; 서열 번호 165; 서열 번호 167; 및 서열 번호 169); 및 서열 번호 182의 가변 경쇄 영역의 프레임워크 영역(서열 번호 183; 서열 번호 185; 서열 번호 187; 및 서열 번호 189)의 항체 단편 중 1개, 2개, 3개 이상, 예컨대 모두를 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 특히 바람직한 실시형태에서, 항당단백질 항체는 서열 번호 161 및 서열 번호 181을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진 Ab5, 또는 Ab5의 CDR을 포함하고 본 명세서에 기재된 생물학적 활성 중 적어도 하나를 가지는 항체 또는 항체 단편이거나, 결합 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 대해 Ab5와 경쟁하는 항당단백질 항체, 바람직하게는 Ab5의 것과 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 함유하는 것 또는 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질) 상의 Ab5와 동일한 또는 중첩하는 에피토프(들)에 결합하는 항체이다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 실시형태에서, 항체 단편은 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 대한 결합 특이성을 가지는 Fab(단편 항원 결합) 단편을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다. 항체 Ab5와 관련하여, Fab 단편은 바람직하게는 서열 번호 162의 가변 중쇄 서열 및 서열 번호 182의 가변 경쇄 서열 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열을 포함한다. 본 발명의 이 실시형태는 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 대한 결합 특이성을 보유하는 서열 번호 162 및/또는 서열 번호 182의 부가, 결실 또는 변이체를 함유하는 Fab를 추가로 포함한다.
본 명세서(하기)에 기재된 본 발명의 일 실시형태에서, Fab 단편은 Ab5의 효소 분해(예를 들어, 파파인)에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 항당단백질 항체, 예컨대 Ab5 또는 이의 Fab 단편은 포유류 세포, 예컨대 CHO, NSO 또는 인간 신장 세포, 균류, 곤충 또는 미생물 시스템, 예컨대 효모 세포(예를 들어, 반수체 또는 이배체 효모, 예컨대 반수체 또는 이배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생성될 수 있다. 적합한 피치아 종은 피치아 파스토리스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
추가적인 실시형태에서, 본 발명은 추가로, Ab5의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는, 당단백질(예컨대, 만노실화 단백질)에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 FR, CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 상기 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열, 예컨대 이들 모두 중 하나 이상 또는 이것에 적어도 90% 또는 95% 동일한 서열의 단편, 변이체, 조합에 관한 것이다.
항체 폴리뉴클레오타이드 서열
항체 Ab1
일 실시형태에서, 본 발명은 추가로 당단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 1의 중쇄 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: gaaggtctacaccatgggccctccccgggaggagctgagcagcaggtcggtcagcctgacctgcatgatcaacggcttctacccttccgacatctcggtggagtgggagaagaacgggaaggcagaggacaactacaagaccacgccggccgtgctggacagcgacggctcctacttcctctacagcaagctctcagtgcccacgagtgagtggcagcggggcgacgtcttcacctgctccgtgatgcacgaggccttgcacaaccactacacgcagaagtccatctcccgctctccgggtaaa(서열 번호 11).
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 2의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: caggagcagttggtggagtccgggggaggcctggtccagcctggggcatccctgacactcacctgcacagcttctggattctccttcagtaacaccaattacatgtgctgggtccgccaggctccagggaggggcctggagtgggtcggatgcatgcccgttggttttattgccagcactttctacgcgacctgggcgaaaggccgatccgccatctccaagtcctcgtcgaccgcggtgactctgcaaatgaccagtctgacagtcgcggacacggccacctatttctgtgcgagagaaagcggtagtggctgggcgcttaacttgtggggccaagggaccctggtcaccgtctcgagc(서열 번호 12).
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 10의 불변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: gggcaacctaaggctccatcagtcttcccactggccccctgctgcggggacacaccctctagcacggtgaccttgggctgcctggtcaaaggctacctcccggagccagtgaccgtgacctggaactcgggcaccctcaccaatggggtacgcaccttcccgtccgtccggcagtcctcaggcctctactcgctgagcagcgtggtgagcgtgacctcaagcagccagcccgtcacctgcaacgtggcccacccagccaccaacaccaaagtggacaagaccgttgcgccctcgacatgcagcaagcccacgtgcccaccccctgaactcctggggggaccgtctgtcttcatcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcacgcacccccgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccaggatgaccccgaggtgcagttcacatggtacataaacaacgagcaggtgcgcaccgcccggccgccgctacgggagcagcagttcaacagcacgatccgcgtggtcagcaccctccccatcgcgcaccaggactggctgaggggcaaggagttcaagtgcaaagtccacaacaaggcactcccggcccccatcgagaaaaccatctccaaagccagagggcagcccctggagccgaaggtctacaccatgggccctccccgggaggagctgagcagcaggtcggtcagcctgacctgcatgatcaacggcttctacccttccgacatctcggtggagtgggagaagaacgggaaggcagaggacaactacaagaccacgccggccgtgctggacagcgacggctcctacttcctctacagcaagctctcagtgcccacgagtgagtggcagcggggcgacgtcttcacctgctccgtgatgcacgaggccttgcacaaccactacacgcagaagtccatctcccgctctccgggtaaa(서열 번호 20).
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 21의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: gaccctgtgctgacccagactccatcccccgtgtctgcagctgtgggaggcacagtcaccatcagttgccaggccagtgagagtgttgagagtggcaactggttagcctggtatcagcagaaaccagggcagcctcccaagctcctgatctattatacatccactctggcatctggggtcccatcgcggttcaaaggcagtggatctggggcacacttcactctcaccatcagcggcgtgcagtgtgacgatgctgccacttactactgtcaaggcgctttttatggtgtgaatactttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaacgtacgccagttgcacctactgtcctcctcttcccaccatctagcgatgaggtggcaactggaacagtcaccatcgtgtgtgtggcgaataaatactttcccgatgtcaccgtcacctgggaggtggatggcaccacccaaacaactggcatcgagaacagtaaaacaccgcagaattctgcagattgtacctacaacctcagcagcactctgacactgaccagcacacagtacaacagccacaaagagtacacctgcaaggtgacccagggcacgacctcagtcgtccagagcttcagtaggaagaactgt(서열 번호 31).
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 22의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: gaccctgtgctgacccagactccatcccccgtgtctgcagctgtgggaggcacagtcaccatcagttgccaggccagtgagagtgttgagagtggcaactggttagcctggtatcagcagaaaccagggcagcctcccaagctcctgatctattatacatccactctggcatctggggtcccatcgcggttcaaaggcagtggatctggggcacacttcactctcaccatcagcggcgtgcagtgtgacgatgctgccacttactactgtcaaggcgctttttatggtgtgaatactttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaa(서열 번호 32).
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 30의 불변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: cgtacgccagttgcacctactgtcctcctcttcccaccatctagcgatgaggtggcaactggaacagtcaccatcgtgtgtgtggcgaataaatactttcccgatgtcaccgtcacctgggaggtggatggcaccacccaaacaactggcatcgagaacagtaaaacaccgcagaattctgcagattgtacctacaacctcagcagcactctgacactgaccagcacacagtacaacagccacaaagagtacacctgcaaggtgacccagggcacgacctcagtcgtccagagcttcagtaggaagaactgt(서열 번호 40).
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 1의 중쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역) 또는 서열 번호 2의 가변 중쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 상응하는 서열 번호 14; 서열 번호 16; 및 서열 번호 18의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 1개 이상 및/또는 서열 번호 21의 경쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역) 또는 서열 번호 22의 가변 경쇄 서열에 상응하는 서열 번호 34; 서열 번호 36; 및 서열 번호 38의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 1개 이상, 또는 이들 폴리뉴클레오타이드 서열의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 상기 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열 중 하나 이상, 예컨대 이들 모두를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 1의 중쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 2의 가변 중쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 상응하는 서열 번호 13; 서열 번호 15; 서열 번호 17; 및 서열 번호 19의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 1개 이상 및/또는 서열 번호 21의 경쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 22의 가변 경쇄 서열에 상응하는 서열 번호 33; 서열 번호 35; 서열 번호 37; 및 서열 번호 39의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 1개 이상, 또는 이들 폴리뉴클레오타이드 서열의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 FR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 상기 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열 중 하나 이상, 예컨대 이들 모두의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 항체 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 당단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 1의 중쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 11; 서열 번호 2의 가변 중쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 12; 서열 번호 21의 경쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 31; 서열 번호 22의 가변 경쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 32; 서열 번호 1의 중쇄 서열 또는 서열 번호 2의 가변 중쇄 서열의 상보성 결정 영역(서열 번호 14; 서열 번호 16; 및 서열 번호 18)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 서열 번호 21의 경쇄 서열 또는 서열 번호 22의 가변 경쇄 서열의 상보성 결정 영역(서열 번호 34; 서열 번호 36; 및 서열 번호 38)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 서열 번호 1의 중쇄 서열 또는 서열 번호 2의 가변 중쇄 서열의 프레임워크 영역(서열 번호 13; 서열 번호 15; 서열 번호 17; 및 서열 번호 19)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열 번호 21의 경쇄 서열 또는 서열 번호 22의 가변 경쇄 서열의 프레임워크 영역(서열 번호 33; 서열 번호 35; 서열 번호 37; 및 서열 번호 39)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 중 1개, 2개, 3개 이상, 예컨대 모두를 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 당단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 Fab(단편 항원 결합) 단편을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다. 항체 Ab1과 관련하여, 전장 Ab1 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 1의 중쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 11 및 서열 번호 21의 경쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 31을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 포유류 세포, 예컨대 CHO, NSO, 인간 신장 세포, 또는 균류, 곤충 또는 미생물 시스템, 예컨대 효모 세포, 예컨대 효모 피치아에서의 발현을 위해 발현 벡터로 혼입된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적합한 피치아 종은 피치아 파스토리스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 명세서(하기)에 기재된 본 발명의 일 실시형태에서, Fab 단편은 적합한 숙주에서 전장 폴리뉴클레오타이드의 발현 후 Ab1의 효소 분해(예를 들어, 파파인)에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 항당단백질 항체, 예컨대 Ab1 또는 이의 Fab 단편은 포유류 세포, 예컨대 CHO, NSO 또는 인간 신장 세포, 균류, 곤충 또는 미생물 시스템, 예컨대 효모 세포(예를 들어, 이배체 효모, 예컨대 이배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서의 Ab1 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생성될 수 있다. 적합한 피치아 종은 피치아 파스토리스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
항체 Ab2
일 실시형태에서, 본 발명은 추가로 당단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 41의 중쇄 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: ggtctacaccatgggccctccccgggaggagctgagcagcaggtcggtcagcctgacctgcatgatcaacggcttctacccttccgacatctcggtggagtgggagaagaacgggaaggcagaggacaactacaagaccacgccggccgtgctggacagcgacggctcctacttcctctacagcaagctctcagtgcccacgagtgagtggcagcggggcgacgtcttcacctgctccgtgatgcacgaggccttgcacaaccactacacgcagaagtccatctcccgctctccgggtaaa(서열 번호 51).
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 42의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: cagtcgttggaggagtccgggggaggcctggtcaagcctgagggatccctgacactcacctgcaaagcctctggattctccttcactggcgcccactacatgtgctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtggatcgcatgtatttatggtggtagtgttgatataactttctacgcgagctgggcgaaaggccgattcgccatctccaagtcctcgtcgaccgcggtgactctgcaaatgaccagtctgacagccgcggacacggccacctatgtctgtgcgagagaaagcggtagtggctgggcgcttaacttgtggggcccggggaccctagtcaccgtctcgagc(서열 번호 52).
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 50의 불변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: gggcaacctaaggctccatcagtcttcccactggccccctgctgcggggacacaccctctagcacggtgaccttgggctgcctggtcaaaggctacctcccggagccagtgaccgtgacctggaactcgggcaccctcaccaatggggtacgcaccttcccgtccgtccggcagtcctcaggcctctactcgctgagcagcgtggtgagcgtgacctcaagcagccagcccgtcacctgcaacgtggcccacccagccaccaacaccaaagtggacaagaccgttgcgccctcgacatgcagcaagcccacgtgcccaccccctgaactcctggggggaccgtctgtcttcatcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcacgcacccccgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccaggatgaccccgaggtgcagttcacatggtacataaacaacgagcaggtgcgcaccgcccggccgccgctacgggagcagcagttcaacagcacgatccgcgtggtcagcaccctccccatcgcgcaccaggactggctgaggggcaaggagttcaagtgcaaagtccacaacaaggcactcccggcccccatcgagaaaaccatctccaaagccagagggcagcccctggagccgaaggtctacaccatgggccctccccgggaggagctgagcagcaggtcggtcagcctgacctgcatgatcaacggcttctacccttccgacatctcggtggagtgggagaagaacgggaaggcagaggacaactacaagaccacgccggccgtgctggacagcgacggctcctacttcctctacagcaagctctcagtgcccacgagtgagtggcagcggggcgacgtcttcacctgctccgtgatgcacgaggccttgcacaaccactacacgcagaagtccatctcccgctctccgggtaaa(서열 번호 60).
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 61의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: caagtgctgacccagactgcatcgcccgtgtctgccgctgtgggaggcacagtcaccatcagttgccagtccagtcagagtgttgagaatggcaactggttagcctggtatcagcagaaaccagggcagcctcccaagctcctgatctatctggcatccactctggaatctggggtcccatcgcggttcaaaggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcggcgtacagtgtgacgatgctgccacttactactgtcagggcgcttatagtggtattaatgttttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaacgtacgccagttgcacctactgtcctcctcttcccaccatctagcgatgaggtggcaactggaacagtcaccatcgtgtgtgtggcgaataaatactttcccgatgtcaccgtcacctgggaggtggatggcaccacccaaacaactggcatcgagaacagtaaaacaccgcagaattctgcagattgtacctacaacctcagcagcactctgacactgaccagcacacagtacaacagccacaaagagtacacctgcaaggtgacccagggcacgacctcagtcgtccagagcttcagtaggaagaactgt(서열 번호 71).
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 62의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: caagtgctgacccagactgcatcgcccgtgtctgccgctgtgggaggcacagtcaccatcagttgccagtccagtcagagtgttgagaatggcaactggttagcctggtatcagcagaaaccagggcagcctcccaagctcctgatctatctggcatccactctggaatctggggtcccatcgcggttcaaaggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcggcgtacagtgtgacgatgctgccacttactactgtcagggcgcttatagtggtattaatgttttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaa(서열 번호 72).
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 70의 불변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: cgtacgccagttgcacctactgtcctcctcttcccaccatctagcgatgaggtggcaactggaacagtcaccatcgtgtgtgtggcgaataaatactttcccgatgtcaccgtcacctgggaggtggatggcaccacccaaacaactggcatcgagaacagtaaaacaccgcagaattctgcagattgtacctacaacctcagcagcactctgacactgaccagcacacagtacaacagccacaaagagtacacctgcaaggtgacccagggcacgacctcagtcgtccagagcttcagtaggaagaactgt(서열 번호 80).
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 41의 중쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역) 또는 서열 번호 42의 가변 중쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 상응하는 서열 번호 54; 서열 번호 56; 및 서열 번호 58의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 1개 이상 및/또는 서열 번호 61의 경쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역) 또는 서열 번호 62의 가변 경쇄 서열에 상응하는 서열 번호 74; 서열 번호 76; 및 서열 번호 78 중 1개 이상, 또는 이들 폴리뉴클레오타이드 서열의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 상기 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열 중 하나 이상, 예컨대 이들 모두를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 41의 중쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 42의 가변 중쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 상응하는 서열 번호 53; 서열 번호 55; 서열 번호 57; 및 서열 번호 59의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 1개 이상 및/또는 서열 번호 61의 경쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 62의 가변 경쇄 서열에 상응하는 서열 번호 73; 서열 번호 75; 서열 번호 77; 및 서열 번호 79의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 1개 이상, 또는 이들 폴리뉴클레오타이드 서열의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 FR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 상기 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열 중 하나 이상, 예컨대 이들 모두의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 항체 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 당단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 41의 중쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 51; 서열 번호 42의 가변 중쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 52; 서열 번호 61의 경쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 71; 서열 번호 62의 가변 경쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 72; 서열 번호 41의 중쇄 서열 또는 서열 번호 42의 가변 중쇄 서열의 상보성 결정 영역(서열 번호 54; 서열 번호 56; 및 서열 번호 58)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 서열 번호 61의 경쇄 서열 또는 서열 번호 62의 가변 경쇄 서열의 상보성 결정 영역(서열 번호 74; 서열 번호 76; 및 서열 번호 78)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 서열 번호 41의 중쇄 서열 또는 서열 번호 42의 가변 중쇄 서열의 프레임워크 영역(서열 번호 53; 서열 번호 55; 서열 번호 57; 및 서열 번호 59)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열 번호 61의 경쇄 서열 또는 서열 번호 62의 가변 경쇄 서열의 프레임워크 영역(서열 번호 73; 서열 번호 75; 서열 번호 77; 및 서열 번호 79)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 중 1개, 2개, 3개 이상, 예컨대 모두를 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 당단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 Fab(단편 항원 결합) 단편을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다. 항체 Ab2와 관련하여, 전장 Ab2 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 41의 중쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 51 및 서열 번호 61의 경쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 71을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 포유류 세포, 예컨대 CHO, NSO, 인간 신장 세포, 또는 균류, 곤충 또는 미생물 시스템, 예컨대 효모 세포, 예컨대 효모 피치아에서의 발현을 위해 발현 벡터로 혼입된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적합한 피치아 종은 피치아 파스토리스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 명세서(하기)에 기재된 본 발명의 일 실시형태에서, Fab 단편은 적합한 숙주에서 전장 폴리뉴클레오타이드의 발현 후 Ab2의 효소 분해(예를 들어, 파파인)에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 항당단백질 항체, 예컨대 Ab2 또는 이의 Fab 단편은 포유류 세포, 예컨대 CHO, NSO 또는 인간 신장 세포, 균류, 곤충 또는 미생물 시스템, 예컨대 효모 세포(예를 들어, 이배체 효모, 예컨대 이배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서의 Ab2 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생성될 수 있다. 적합한 피치아 종은 피치아 파스토리스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
항체 Ab3
일 실시형태에서, 본 발명은 추가로 당단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 81의 중쇄 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: ggtctacaccatgggccctccccgggaggagctgagcagcaggtcggtcagcctgacctgcatgatcaacggcttctacccttccgacatctcggtggagtgggagaagaacgggaaggcagaggacaactacaagaccacgccggccgtgctggacagcgacggctcctacttcctctacagcaagctctcagtgcccacgagtgagtggcagcggggcgacgtcttcacctgctccgtgatgcacgaggccttgcacaaccactacacgcagaagtccatctcccgctctccgggtaaa(서열 번호 91).
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 82의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: cagtcgttggaggagtccgggggaggcctggtccagcctgagggatccctgacactcacctgtacagcctctggattcttcttcagtggcgcccactacatgtgctgggtccgccaggctccagggcaggggctggagtggatcggatgcacttatggtggtagtgttgatatcactttctacgcgagctgggcgaaaggccgattcgccatctccaaaacctcgtcgaccacggtgactctgcaactgaccagtctgacagccgcggacacggccacctatgtctgtgcgagagaaagcggtagtggctgggcacttaacttgtggggccaggggaccctcgtcaccgtctcgagc(서열 번호 92).
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 90의 불변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: gggcaacctaaggctccatcagtcttcccactggccccctgctgcggggacacaccctctagcacggtgaccttgggctgcctggtcaaaggctacctcccggagccagtgaccgtgacctggaactcgggcaccctcaccaatggggtacgcaccttcccgtccgtccggcagtcctcaggcctctactcgctgagcagcgtggtgagcgtgacctcaagcagccagcccgtcacctgcaacgtggcccacccagccaccaacaccaaagtggacaagaccgttgcgccctcgacatgcagcaagcccacgtgcccaccccctgaactcctggggggaccgtctgtcttcatcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcacgcacccccgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccaggatgaccccgaggtgcagttcacatggtacataaacaacgagcaggtgcgcaccgcccggccgccgctacgggagcagcagttcaacagcacgatccgcgtggtcagcaccctccccatcgcgcaccaggactggctgaggggcaaggagttcaagtgcaaagtccacaacaaggcactcccggcccccatcgagaaaaccatctccaaagccagagggcagcccctggagccgaaggtctacaccatgggccctccccgggaggagctgagcagcaggtcggtcagcctgacctgcatgatcaacggcttctacccttccgacatctcggtggagtgggagaagaacgggaaggcagaggacaactacaagaccacgccggccgtgctggacagcgacggctcctacttcctctacagcaagctctcagtgcccacgagtgagtggcagcggggcgacgtcttcacctgctccgtgatgcacgaggccttgcacaaccactacacgcagaagtccatctcccgctctccgggtaaa(서열 번호 100).
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 101의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: caggtgctgacccagactccatcccccgtgtctgcagctgtgggaggcgcagtcaccatcaattgccagtccagtcagagtgttgagaatggcaactggttaggctggtatcagcagaaaccagggcagcctcccaagctcctgatctatctggcatccactctggcatctggggtcccttcgcggttcaccggcagcggatctgggacacagttcactctcaccatcagcggcgtgcagtgtgacgatgctgccacttactattgtcaaggcgcttatagtggtattaatgctttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaacgtacgccagttgcacctactgtcctcctcttcccaccatctagcgatgaggtggcaactggaacagtcaccatcgtgtgtgtggcgaataaatactttcccgatgtcaccgtcacctgggaggtggatggcaccacccaaacaactggcatcgagaacagtaaaacaccgcagaattctgcagattgtacctacaacctcagcagcactctgacactgaccagcacacagtacaacagccacaaagagtacacctgcaaggtgacccagggcacgacctcagtcgtccagagcttcagtaggaagaactgt(서열 번호 111).
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 102의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: caggtgctgacccagactccatcccccgtgtctgcagctgtgggaggcgcagtcaccatcaattgccagtccagtcagagtgttgagaatggcaactggttaggctggtatcagcagaaaccagggcagcctcccaagctcctgatctatctggcatccactctggcatctggggtcccttcgcggttcaccggcagcggatctgggacacagttcactctcaccatcagcggcgtgcagtgtgacgatgctgccacttactattgtcaaggcgcttatagtggtattaatgctttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaa(서열 번호 112).
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 110의 불변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: cgtacgccagttgcacctactgtcctcctcttcccaccatctagcgatgaggtggcaactggaacagtcaccatcgtgtgtgtggcgaataaatactttcccgatgtcaccgtcacctgggaggtggatggcaccacccaaacaactggcatcgagaacagtaaaacaccgcagaattctgcagattgtacctacaacctcagcagcactctgacactgaccagcacacagtacaacagccacaaagagtacacctgcaaggtgacccagggcacgacctcagtcgtccagagcttcagtaggaagaactgt(서열 번호 120).
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 81의 중쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역) 또는 서열 번호 82의 가변 중쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 상응하는 서열 번호 94; 서열 번호 96; 및 서열 번호 98의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 1개 이상 및/또는 서열 번호 101의 경쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역) 또는 서열 번호 102의 가변 경쇄 서열에 상응하는 서열 번호 114; 서열 번호 116; 및 서열 번호 118의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 1개 이상, 또는 이들 폴리뉴클레오타이드 서열의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 상기 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열 중 하나 이상, 예컨대 이들 모두를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 81의 중쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 82의 가변 중쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 상응하는 서열 번호 93; 서열 번호 95; 서열 번호 97; 및 서열 번호 99의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 1개 이상 및/또는 서열 번호 101의 경쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 102의 가변 경쇄 서열에 상응하는 서열 번호 113; 서열 번호 115; 서열 번호 117; 및 서열 번호 119의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 1개 이상, 또는 이들 폴리뉴클레오타이드 서열의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 FR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 상기 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열 중 하나 이상, 예컨대 이들 모두의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 항체 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 당단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 81의 중쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 91; 서열 번호 82의 가변 중쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 92; 서열 번호 101의 경쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 111; 서열 번호 102의 가변 경쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 112; 서열 번호 81의 중쇄 서열 또는 서열 번호 82의 가변 중쇄 서열의 상보성 결정 영역(서열 번호 94; 서열 번호 96; 및 서열 번호 98)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 서열 번호 101의 경쇄 서열 또는 서열 번호 102의 가변 경쇄 서열의 상보성 결정 영역(서열 번호 114; 서열 번호 116; 및 서열 번호 118)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 서열 번호 81의 중쇄 서열 또는 서열 번호 82의 가변 중쇄 서열의 프레임워크 영역(서열 번호 93; 서열 번호 95; 서열 번호 97; 및 서열 번호 99)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열 번호 101의 경쇄 서열 또는 서열 번호 102의 가변 경쇄 서열의 프레임워크 영역(서열 번호 113; 서열 번호 115; 서열 번호 117; 및 서열 번호 119)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 중 1개, 2개, 3개 이상, 예컨대 모두를 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 당단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 Fab(단편 항원 결합) 단편을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다. 항체 Ab3과 관련하여, 전장 Ab3 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 81의 중쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 91 및 서열 번호 101의 경쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 111을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 포유류 세포, 예컨대 CHO, NSO, 인간 신장 세포, 또는 균류, 곤충 또는 미생물 시스템, 예컨대 효모 세포, 예컨대 효모 피치아에서의 발현을 위해 발현 벡터로 혼입된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적합한 피치아 종은 피치아 파스토리스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 명세서(하기)에 기재된 본 발명의 일 실시형태에서, Fab 단편은 적합한 숙주에서 전장 폴리뉴클레오타이드의 발현 후 Ab3의 효소 분해(예를 들어, 파파인)에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 항당단백질 항체, 예컨대 Ab3 또는 이의 Fab 단편은 포유류 세포, 예컨대 CHO, NSO 또는 인간 신장 세포, 균류, 곤충 또는 미생물 시스템, 예컨대 효모 세포(예를 들어, 이배체 효모, 예컨대 이배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서의 Ab3 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생성될 수 있다. 적합한 피치아 종은 피치아 파스토리스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
항체 Ab4
일 실시형태에서, 본 발명은 추가로 당단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 121의 중쇄 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: ctacaccatgggccctccccgggaggagctgagcagcaggtcggtcagcctgacctgcatgatcaacggcttctacccttccgacatctcggtggagtgggagaagaacgggaaggcagaggacaactacaagaccacgccggccgtgctggacagcgacggctcctacttcctctacagcaagctctcagtgcccacgagtgagtggcagcggggcgacgtcttcacctgctccgtgatgcacgaggccttgcacaaccactacacgcagaagtccatctcccgctctccgggtaaa(서열 번호 131).
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 122의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: cagtcgttggaggagtccgggggagacctggtcaagcctggggcatccctgacactcacctgcacagcctctggattctccttcagtagcggctacgacatgtgttgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtggatcgcctgtatttaccctaataatcctgtcacttactacgcgagctgggcgaaaggccgattcaccatctccaaaacctcgtcgaccacggtgactctgcaaatgaccagtctgacagccgcggacacggccacctatttctgtgggagatctgatagtaatggtcatacctttaacttgtggggccaaggcaccctcgtcaccgtctcgagc(서열 번호 132).
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 130의 불변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: gggcaacctaaggctccatcagtcttcccactggccccctgctgcggggacacaccctctagcacggtgaccttgggctgcctggtcaaaggctacctcccggagccagtgaccgtgacctggaactcgggcaccctcaccaatggggtacgcaccttcccgtccgtccggcagtcctcaggcctctactcgctgagcagcgtggtgagcgtgacctcaagcagccagcccgtcacctgcaacgtggcccacccagccaccaacaccaaagtggacaagaccgttgcgccctcgacatgcagcaagcccacgtgcccaccccctgaactcctggggggaccgtctgtcttcatcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcacgcacccccgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccaggatgaccccgaggtgcagttcacatggtacataaacaacgagcaggtgcgcaccgcccggccgccgctacgggagcagcagttcaacagcacgatccgcgtggtcagcaccctccccatcgcgcaccaggactggctgaggggcaaggagttcaagtgcaaagtccacaacaaggcactcccggcccccatcgagaaaaccatctccaaagccagagggcagcccctggagccgaaggtctacaccatgggccctccccgggaggagctgagcagcaggtcggtcagcctgacctgcatgatcaacggcttctacccttccgacatctcggtggagtgggagaagaacgggaaggcagaggacaactacaagaccacgccggccgtgctggacagcgacggctcctacttcctctacagcaagctctcagtgcccacgagtgagtggcagcggggcgacgtcttcacctgctccgtgatgcacgaggccttgcacaaccactacacgcagaagtccatctcccgctctccgggtaaa(서열 번호 140).
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 141의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: gaccctgtgatgacccagactccatcctccgtgtctgcagctgtgggaggcacagtcaccatcaattgccagtccagtcagagtgttaatcagaacgacttatcctggtatcagcagaaaccagggcagcctcccaagcgcctgatctattatgcatccactctggcatctggggtctcatcgcggttcaaaggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcgacatgcagtgtgacgatgctgccacttactactgtcaaggcagttttcgtgttagtggttggtactgggctttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaacgtacgccagttgcacctactgtcctcctcttcccaccatctagcgatgaggtggcaactggaacagtcaccatcgtgtgtgtggcgaataaatactttcccgatgtcaccgtcacctgggaggtggatggcaccacccaaacaactggcatcgagaacagtaaaacaccgcagaattctgcagattgtacctacaacctcagcagcactctgacactgaccagcacacagtacaacagccacaaagagtacacctgcaaggtgacccagggcacgacctcagtcgtccagagcttcagtaggaagaactgt(서열 번호 151).
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 142의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: gaccctgtgatgacccagactccatcctccgtgtctgcagctgtgggaggcacagtcaccatcaattgccagtccagtcagagtgttaatcagaacgacttatcctggtatcagcagaaaccagggcagcctcccaagcgcctgatctattatgcatccactctggcatctggggtctcatcgcggttcaaaggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcgacatgcagtgtgacgatgctgccacttactactgtcaaggcagttttcgtgttagtggttggtactgggctttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaa(서열 번호 152).
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 150의 불변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: cgtacgccagttgcacctactgtcctcctcttcccaccatctagcgatgaggtggcaactggaacagtcaccatcgtgtgtgtggcgaataaatactttcccgatgtcaccgtcacctgggaggtggatggcaccacccaaacaactggcatcgagaacagtaaaacaccgcagaattctgcagattgtacctacaacctcagcagcactctgacactgaccagcacacagtacaacagccacaaagagtacacctgcaaggtgacccagggcacgacctcagtcgtccagagcttcagtaggaagaactgt(서열 번호 160).
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 121의 중쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역) 또는 서열 번호 122의 가변 중쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 상응하는 서열 번호 134; 서열 번호 136; 및 서열 번호 138의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 1개 이상 및/또는 서열 번호 141의 경쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역) 또는 서열 번호 142의 가변 경쇄 서열에 상응하는 서열 번호 154; 서열 번호 156; 및 서열 번호 158의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 1개 이상, 또는 이들 폴리뉴클레오타이드 서열의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 상기 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열 중 하나 이상, 예컨대 이들 모두를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 121의 중쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 122의 가변 중쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 상응하는 서열 번호 133; 서열 번호 135; 서열 번호 137; 및 서열 번호 139의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 1개 이상 및/또는 서열 번호 141의 경쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 142의 가변 경쇄 서열에 상응하는 서열 번호 153; 서열 번호 155; 서열 번호 157; 및 서열 번호 159의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 1개 이상, 또는 이들 폴리뉴클레오타이드 서열의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 FR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 상기 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열 중 하나 이상, 예컨대 이들 모두의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 항체 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 당단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 121의 중쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 131; 서열 번호 122의 가변 중쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 132; 서열 번호 141의 경쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 151; 서열 번호 142의 가변 경쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 152; 서열 번호 121의 중쇄 서열 또는 서열 번호 122의 가변 중쇄 서열의 상보성 결정 영역(서열 번호 134; 서열 번호 136; 및 서열 번호 138)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 서열 번호 141의 경쇄 서열 또는 서열 번호 142의 가변 경쇄 서열의 상보성 결정 영역(서열 번호 154; 서열 번호 156; 및 서열 번호 158)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 서열 번호 121의 중쇄 서열 또는 서열 번호 122의 가변 중쇄 서열의 프레임워크 영역(서열 번호 133; 서열 번호 135; 서열 번호 137; 및 서열 번호 139)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열 번호 141의 경쇄 서열 또는 서열 번호 142의 가변 경쇄 서열의 프레임워크 영역(서열 번호 153; 서열 번호 155; 서열 번호 157; 및 서열 번호 159)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 중 1개, 2개, 3개 이상, 예컨대 모두를 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 당단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 Fab(단편 항원 결합) 단편을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다. 항체 Ab4와 관련하여, 전장 Ab4 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 121의 중쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 131 및 서열 번호 141의 경쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 151을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 포유류 세포, 예컨대 CHO, NSO, 인간 신장 세포, 또는 균류, 곤충 또는 미생물 시스템, 예컨대 효모 세포, 예컨대 효모 피치아에서의 발현을 위해 발현 벡터로 혼입된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적합한 피치아 종은 피치아 파스토리스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 명세서(하기)에 기재된 본 발명의 일 실시형태에서, Fab 단편은 적합한 숙주에서 전장 폴리뉴클레오타이드의 발현 후 Ab4의 효소 분해(예를 들어, 파파인)에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 항당단백질 항체, 예컨대 Ab4 또는 이의 Fab 단편은 포유류 세포, 예컨대 CHO, NSO 또는 인간 신장 세포, 균류, 곤충 또는 미생물 시스템, 예컨대 효모 세포(예를 들어, 이배체 효모, 예컨대 이배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서의 Ab4 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생성될 수 있다. 적합한 피치아 종은 피치아 파스토리스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
항체 Ab5
일 실시형태에서, 본 발명은 추가로 당단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 161의 중쇄 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: gcccctggagccgaaggtctacaccatgggccctccccgggaggagctgagcagcaggtcggtcagcctgacctgcatgatcaacggcttctacccttccgacatctcggtggagtgggagaagaacgggaaggcagaggacaactacaagaccacgccggccgtgctggacagcgacggctcctacttcctctacagcaagctctcagtgcccacgagtgagtggcagcggggcgacgtcttcacctgctccgtgatgcacgaggccttgcacaaccactacacgcagaagtccatctcccgctctccgggtaaa(서열 번호 171).
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 162의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: cagcagcagttgctggagtccgggggaggcctggtccagcctgagggatccctggcactcacctgcacagcttctggattctccttcagtagcggctacgacatgtgctgggtccgccagcctccagggaaggggctggagtgggtcggctgcatttatagtggtgatgataatgatattacttattacgcgagctgggcgagaggccgattcaccatctccaacccctcgtcgaccactgtgactctgcaaatgaccagtctgacagtcgcggacacggccacctatttctgtgcgcgaggtcatgctatttatgataattatgatagtgtccacttgtggggccaggggaccctcgtcaccgtctcgagc(서열 번호 172).
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 170의 불변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: gggcaacctaaggctccatcagtcttcccactggccccctgctgcggggacacaccctctagcacggtgaccttgggctgcctggtcaaaggctacctcccggagccagtgaccgtgacctggaactcgggcaccctcaccaatggggtacgcaccttcccgtccgtccggcagtcctcaggcctctactcgctgagcagcgtggtgagcgtgacctcaagcagccagcccgtcacctgcaacgtggcccacccagccaccaacaccaaagtggacaagaccgttgcgccctcgacatgcagcaagcccacgtgcccaccccctgaactcctggggggaccgtctgtcttcatcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcacgcacccccgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccaggatgaccccgaggtgcagttcacatggtacataaacaacgagcaggtgcgcaccgcccggccgccgctacgggagcagcagttcaacagcacgatccgcgtggtcagcaccctccccatcgcgcaccaggactggctgaggggcaaggagttcaagtgcaaagtccacaacaaggcactcccggcccccatcgagaaaaccatctccaaagccagagggcagcccctggagccgaaggtctacaccatgggccctccccgggaggagctgagcagcaggtcggtcagcctgacctgcatgatcaacggcttctacccttccgacatctcggtggagtgggagaagaacgggaaggcagaggacaactacaagaccacgccggccgtgctggacagcgacggctcctacttcctctacagcaagctctcagtgcccacgagtgagtggcagcggggcgacgtcttcacctgctccgtgatgcacgaggccttgcacaaccactacacgcagaagtccatctcccgctctccgggtaaa(서열 번호 180).
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 181의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: atcgtgatgacccagactccatcttccaggtctgtccctgtgggaggcacagtcaccatcaattgccaggccagtgaaattgttaatagaaacaaccgcttagcctggtttcaacagaaaccagggcagcctcccaagctcctgatgtatctggcttccactccggcatctggggtcccatcgcggtttagaggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcgatgtggtgtgtgacgatgctgccacttattattgtacagcatataagagtagtaatactgatggtattgctttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaacgtacgccagttgcacctactgtcctcctcttcccaccatctagcgatgaggtggcaactggaacagtcaccatcgtgtgtgtggcgaataaatactttcccgatgtcaccgtcacctgggaggtggatggcaccacccaaacaactggcatcgagaacagtaaaacaccgcagaattctgcagattgtacctacaacctcagcagcactctgacactgaccagcacacagtacaacagccacaaagagtacacctgcaaggtgacccagggcacgacctcagtcgtccagagcttcagtaggaagaactgt(서열 번호 191).
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 182의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: atcgtgatgacccagactccatcttccaggtctgtccctgtgggaggcacagtcaccatcaattgccaggccagtgaaattgttaatagaaacaaccgcttagcctggtttcaacagaaaccagggcagcctcccaagctcctgatgtatctggcttccactccggcatctggggtcccatcgcggtttagaggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcgatgtggtgtgtgacgatgctgccacttattattgtacagcatataagagtagtaatactgatggtattgctttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaa(서열 번호 192).
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 190의 불변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다: cgtacgccagttgcacctactgtcctcctcttcccaccatctagcgatgaggtggcaactggaacagtcaccatcgtgtgtgtggcgaataaatactttcccgatgtcaccgtcacctgggaggtggatggcaccacccaaacaactggcatcgagaacagtaaaacaccgcagaattctgcagattgtacctacaacctcagcagcactctgacactgaccagcacacagtacaacagccacaaagagtacacctgcaaggtgacccagggcacgacctcagtcgtccagagcttcagtaggaagaactgt(서열 번호 200).
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 161의 중쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역) 또는 서열 번호 162의 가변 중쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 상응하는 서열 번호 174; 서열 번호 176; 및 서열 번호 178의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 1개 이상 및/또는 서열 번호 181의 경쇄 서열의 상보성 결정 영역(CDR 또는 초가변 영역) 또는 서열 번호 182의 가변 경쇄 서열에 상응하는 서열 번호 194; 서열 번호 196; 및 서열 번호 198의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 1개 이상, 또는 이들 폴리뉴클레오타이드 서열의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 상기 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열 중 하나 이상, 예컨대 이들 모두를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 당단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 161의 중쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 162의 가변 중쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 상응하는 서열 번호 173; 서열 번호 175; 서열 번호 177; 및 서열 번호 179의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 1개 이상 및/또는 서열 번호 181의 경쇄 서열의 프레임워크 영역(FR 또는 불변 영역) 또는 서열 번호 182의 가변 경쇄 서열에 상응하는 서열 번호 193; 서열 번호 195; 서열 번호 197; 및 서열 번호 199의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 1개 이상, 또는 이들 폴리뉴클레오타이드 서열의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 FR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 상기 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열 중 하나 이상, 예컨대 이들 모두의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 항체 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 당단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 161의 중쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 171; 서열 번호 162의 가변 중쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 172; 서열 번호 181의 경쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 191; 서열 번호 182의 가변 경쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 192; 서열 번호 161의 중쇄 서열 또는 서열 번호 162의 가변 중쇄 서열의 상보성 결정 영역(서열 번호 174; 서열 번호 176; 및 서열 번호 178)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 서열 번호 181의 경쇄 서열 또는 서열 번호 182의 가변 경쇄 서열의 상보성 결정 영역(서열 번호 194; 서열 번호 196; 및 서열 번호 198)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 서열 번호 161의 중쇄 서열 또는 서열 번호 162의 가변 중쇄 서열의 프레임워크 영역(서열 번호 173; 서열 번호 175; 서열 번호 177; 및 서열 번호 179)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열 번호 181의 경쇄 서열 또는 서열 번호 182의 가변 경쇄 서열의 프레임워크 영역(서열 번호 193; 서열 번호 195; 서열 번호 197; 및 서열 번호 199)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 중 1개, 2개, 3개 이상, 예컨대 모두를 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 당단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 Fab(단편 항원 결합) 단편을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다. 항체 Ab5와 관련하여, 전장 Ab5 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 161의 중쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 171 및 서열 번호 181의 경쇄 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 번호 191을 포함하거나, 대안적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 포유류 세포, 예컨대 CHO, NSO, 인간 신장 세포, 또는 균류, 곤충 또는 미생물 시스템, 예컨대 효모 세포, 예컨대 효모 피치아에서의 발현을 위해 발현 벡터로 혼입된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적합한 피치아 종은 피치아 파스토리스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 명세서(하기)에 기재된 본 발명의 일 실시형태에서, Fab 단편은 적합한 숙주에서 전장 폴리뉴클레오타이드의 발현 후 Ab5의 효소 분해(예를 들어, 파파인)에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 항당단백질 항체, 예컨대 Ab5 또는 이의 Fab 단편은 포유류 세포, 예컨대 CHO, NSO 또는 인간 신장 세포, 균류, 곤충 또는 미생물 시스템, 예컨대 효모 세포(예를 들어, 이배체 효모, 예컨대 이배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서의 Ab5 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생성될 수 있다. 적합한 피치아 종은 피치아 파스토리스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
원하는 단백질의 발현
동종중합체 또는 이종중합체 폴리펩타이드를 포함하는. 원하는 단백질(예를 들어, 재조합 단백질), 예를 들어 항체 또는 항체 단편은 효모 및 섬질 균류 세포에서 발현될 수 있다. 일 실시형태에서, 원하는 단백질은 효모에서 재조합으로 발현되고, 특히 바람직한 효모는 메탄영양 효모 균주, 예를 들어 피치아 파스토리스, 한세눌라 폴리모르파(피치아 안구스타), 피치아 구이렐르모르디, 피치아 메타놀리카, 피치아 이노시토베라 및 기타(예를 들어, 미국 특허 제4,812,405호, 제4,818,700호, 제4,929,555호, 제5,736,383호, 제5,955,349호, 제5,888,768호 및 제6,258,559호(이들 각각은 그 전문이 참고문헌으로 포함됨) 참조)를 포함한다. 다른 예시적인 효모는 아릭시오지마(Arxiozyma); 아스코보트리오지마(Ascobotryozyma); 시테로마이세스(Citeromyces); 데바리오마이세스(Debaryomyces); 데케라(Dekkera); 에레모테시움(Eremothecium); 이사첸키아(Issatchenkia); 카자흐스타니아(Kazachstania); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces); 코다마에아(Kodamaea); 로데로마이세스(Lodderomyces); 파치솔렌(Pachysolen); 피치아; 사카로마이세스; 사투르니스포라(Saturnispora); 테트라피시스포라(Tetrapisispora); 토룰라스포라(Torulaspora); 윌리옵시스(Williopsis); 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces); 야로위아; 로도스포리듐(Rhodosporidium); 칸디다; 한세눌라; 필로바슘(Filobasium); 스포리디오볼루스(Sporidiobolus); 불레라(Bullera); 류코스포리듐(Leucosporidium) 및 필로바시델라(Filobasidella)를 포함한다.
효모 세포는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 유전자 카피 수의 상이한 조합을 함유하는 이배체 또는 사배체 효모 세포의 패널은 개별 아단위 유전자의 다양한 카피 수를 함유하는 세포를 교배시킴으로써(카피 수는 바람직하게는 교배 전에 알려짐) 생성될 수 있다.
일 실시형태에서, 효모 세포는 원하는 단백질 또는 원하는 다중-아단위 단백질의 아단위를 코딩하는 하나 이상의 유전자의 하나 초과의 카피를 포함할 수 있다. 예를 들어, 아단위 유전자의 다수의 카피는 하나 이상의 염색체 유전좌위로 탠덤으로 통합될 수 있다. 탠덤으로 통합된 유전자 카피는 바람직하게는 원하는 단백질 또는 다중-아단위 복합체의 제조를 위해 배양 동안 안정한 카피 수로 보유된다. 예를 들어, 본 출원인이 기재한 선행 작업에서, 유전자 카피 수는 경쇄 및 중쇄 항체 유전자의 3개 내지 4개의 탠덤으로 통합된 카피를 함유하는 피. 파스토리스 균주에 대해 일반적으로 안정하다(U.S. 20130045888 참조).
원하는 단백질 또는 이의 아단위를 코딩하는 하나 이상의 유전자는 바람직하게는 균류 세포의 하나 이상의 염색체 유전좌위로 통합된다. 유전자간 서열, 프로모터 서열, 코딩 서열, 종결 서열, 조절 서열 등을 포함하는 임의의 적합한 염색체 유전좌위는 통합에 사용될 수 있다. 피. 파스토리스에 사용될 수 있는 예시적인 염색체 유전좌위는 PpURA5; OCH1; AOX1; HIS4; 및 GAP를 포함한다. 코딩 유전자는 표적화되기보다는 하나 이상의 랜덤 염색체 유전좌위로 또한 통합될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 염색체 유전좌위는 pGAP 유전좌위, 3'AOX TT 유전좌위 및 HIS4 TT 유전좌위로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가적인 예시적인 실시형태에서, 비상동성 단백질 아단위를 코딩하는 유전자는 하나 이상의 염색체외 구성요소, 예를 들어 하나 이상의 플라스미드 또는 인공 염색체에 함유될 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 원하는 단백질은 예를 들어 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 이상의 동일한 및/또는 비동일한 아단위를 포함하는 다중-아단위 단백질일 수 있다. 추가로, 각각의 아단위는 각각의 다중-아단위 단백질에서 1회 이상 존재할 수 있다. 예를 들어, 다중-아단위 단백질은 다중 특이적 항체, 예컨대 2개의 비동일한 경쇄 및 2개의 비동일한 중쇄를 포함하는 이중특이적 항체일 수 있다. 유전자 카피 수의 상이한 조합을 함유하는 이배체 또는 사배체 효모 세포의 패널은 개별 아단위 유전자의 다양한 카피 수를 함유하는 세포를 교배함으로써 신속히 생성될 수 있다. 이후, 패널에서의 각각의 균주로부터의 항체 제조는 원치 않는 부산물에 대한 특징, 예컨대 원하는 다중-아단위 단백질의 수율 또는 원하는 다중-아단위 단백질의 순도에 기초하여 추가의 사용에 대해 균주를 확인하도록 평가될 수 있다.
다중-아단위 단백질의 아단위는 모노시스트론성 유전자, 폴리시스트론성 유전자, 또는 임의의 이들의 조합으로부터 발현될 수 있다. 각각의 폴리시스트론성 유전자는 동일한 아단위의 다수의 카피를 포함할 수 있거나, 각각의 상이한 아단위의 하나 이상의 카피를 포함할 수 있다.
(배양, 형질전환 및 교배의 방법을 포함하는) 피치아 파스토리스의 조작에 사용될 수 있는 예시적인 방법은 공개 출원, 예컨대 U.S. 20080003643, U.S. 20070298500, 및 U.S. 20060270045, 및 문헌[Higgins, D. R., and Cregg, J. M., Eds. 1998. Pichia Protocols. Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, N.J., 및 Cregg, J. M., Ed., 2007, Pichia Protocols (2nd edition), Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, N.J.](이들 각각은 그 전문이 참고문헌으로 포함됨)에 개시되어 있다.
사용될 수 있는 예시적인 발현 카세트는, 분비 신호를 코딩하는 서열, 이어서 발현하고자 하는 유전자의 서열, 이어서 피. 파스토리스 알콜 옥시다제 I 유전자(AOX1)로부터의 피. 파스토리스 전사 종결 신호를 코딩하는 서열에 융합된, 글라이세르알데하이드 탈수소효소 유전자(GAP 유전자) 프로모터로 이루어진다. 제오신 내성 마커 유전자는 더 높은 수준의 제오신에 내성인 형질전환체를 선택함으로써, 균주에서의 발현 벡터의 다수의 통합된 카피를 함유하는 균주의 농후화의 수단을 제공할 수 있다. 유사하게, G418 또는 카나마이신 내성 마커 유전자는, 더 높은 수준의 게네티신 또는 카나마이신에 내성인 형질전환체를 선택함으로써, 균주에서의 발현 벡터의 다수의 통합된 카피를 함유하는 균주의 농후화의 수단을 제공하도록 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 효모 균주는 영양요구성 피. 파스토리스 또는 다른 피치아 균주, 예를 들어 met1, lys3, ura3 및 ade1, 또는 다른 영양요구변이 관련 유전자에서 돌연변이를 가지는 균주를 포함한다. 바람직한 돌연변이는 임의의 상당한 빈도로 복귀 돌연변이체, 바람직하게는 부분 또는 훨씬 더 바람직하게는 완전 결실 돌연변이체를 생성시킬 수 없다. 바람직하게는, 원영양체 이배체 또는 사배체 균주는 영양요구성 균주의 보완 세트를 교배함으로써 제조된다.
형질전환 전에, 각각의 발현 벡터는 균류 세포에서의 표적 유전좌위로의 벡터의 통합을 지시하기 위해 표적 게놈 유전좌위(예를 들어, GAP 프로모터 서열)에 상동성인 영역 내에 제한 효소 절단에 의해 선형화될 수 있다. 이후, 각각의 벡터의 샘플은 전기천공 또는 다른 방법에 의해 원하는 균주의 배양으로 개별적으로 형질전환될 수 있고, 성공적인 형질전환체는 선택 가능한 마커, 예를 들어 항생제 내성 또는 영양요구변이의 보완에 의해 선택될 수 있다. 단리물은 선별되고, 선택적 조건 하에 단일 콜로니에 대해 스트리킹되고, 이후 각각의 균주로부터 추출된 게놈 DNA에서 써던 블롯(Southern Blot) 또는 PCR 검정에 의해 다중-아단위 복합체(예를 들어, 원하는 항체)의 원하는 단백질 또는 아단위를 코딩하는 유전자의 카피 수를 확인하기 위해 검사될 수 있다. 임의로, 예상된 아단위 유전자 생성물의 발현은 예를 들어 FACS, 웨스턴 블롯(Western Blot), 콜로니 리프트(colony lift) 및 면역블롯, 및 당해 분야에 공지된 다른 수단에 의해 확인될 수 있다. 임의로, 반수체 단리물은 추가적인 비상동성 유전자, 예를 들어 상이한 유전좌위에서 통합된 동일한 아단위의 추가적인 카피, 및/또는 상이한 아단위의 카피를 도입하도록 추가 횟수로 형질전환된다. 이후, 반수체 균주는 다중-단백질 복합체를 합성할 수 있는 이배체 균주(또는 더 높은 배수성의 균주)를 생성하도록 교배된다. 각각의 예상된 아단위 유전자의 존재는 써던 블로팅, PCR, 및 당해 분야에 공지된 다른 검출 수단에 의해 확인될 수 있다. 원하는 다중-단백질 복합체가 항체일 때, 이의 발현은 콜로니 리프트/면역블롯 방법에 의해(Wung et al. Biotechniques 21 808-812 (1996)) 및/또는 FACS에 의해 또한 확인될 수 있다.
이 형질전환 프로토콜은 제1 유전좌위로 표적화되기 보다는 동일한 유전자 또는 상이한 유전자일 수 있는 제2 유전좌위로 비상동성 유전자를 표적화하도록 임의로 반복된다. 제2 유전좌위로 통합되는 작제물이 제1 유전좌위에 의해 코딩된 서열과 동일하거나 매우 유사한 단백질을 코딩할 때, 이의 서열은 제1 유전좌위로의 원치 않는 통합의 가능성을 감소시키도록 변할 수 있다. 예를 들어, 제2 유전좌위로 통합되는 서열은 제1 유전좌위로 통합되는 서열에 대한 프로모터 서열, 종결 서열, 코돈 용법의 차이 및/또는 다른 관용적 서열 차이를 가질 수 있다.
반수체 피. 파스토리스 균주의 형질전환 및 피. 파스토리스 성주기의 유전적 조작은 상기 피치아 프로토콜(1998, 2007)에 기재된 바대로 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 발현 벡터는 형질전환된 효모 균주를 확인하기 위한 선택 가능한 영양요구성 또는 약물 마커를 포함하는 효모 특이적 서열을 추가로 포함할 수 있다. 약물 마커는, 예를 들어 증가한 농도의 약물에서 세포의 집단을 배양하여서, 내성 유전자의 증가한 수준을 발현하는 형질전환체를 선택함으로써, 효모 세포에서 벡터의 카피 수를 증폭시키도록 추가로 사용될 수 있다.
관심 있는 폴리펩타이드 코딩 서열은 효모 세포에서 폴리펩타이드의 발현을 제공하는 전사 및 번역 조절 서열에 통상적으로 작동적으로 연결된다. 이 벡터 성분은 인핸서 구성요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 폴리펩타이드의 분비를 위한 서열, 예를 들어 신호 서열 등이 또한 포함될 수 있다. 발현 벡터가 효모 게놈으로 보통 통합되므로, 효모 복제 기원은 임의이다.
예시적인 실시형태에서, 원하는 단백질 또는 이의 아단위를 코딩하는 하나 이상의 유전자는 유도성 프로모터에 커플링된다. 적합한 예시적인 프로모터는 알콜 옥시다제 1 유전자 프로모터, 폼알데하이드 탈수소효소 유전자(FLD; 미국 공보 제2007/0298500호) 및 당해 분야에 공지된 다른 유도성 프로모터를 포함한다. 알콜 옥시다제 1 유전자 프로모터는 가장 흔한 탄소원, 예컨대 글루코스, 글라이세롤 또는 에탄올에서 효모의 성장 동안 엄격히 억제되지만, 메탄올에서 성장 동안 매우 유도된다(Tschopp 등의 1987년 문헌; 미국 특허 제4,855,231호(Stroman, D. W. 등)). 외래 단백질의 제조를 위해, 균주는 바이오매스를 생성하기 위해 억제 탄소원에서 초기에 성장하고 이후 외래 유전자의 발현을 유도하기 위해 유일한(또는 주요) 탄소원 및 에너지원으로서 메탄올로 이동할 수 있다. 이 조절 시스템의 일 이점은 발현 생성물이 세포에 독성인 외래 유전자에 의해 형질전환된 피. 파스토리스 균주가 억제 조건 하에 성장함으로써 유지될 수 있다는 것이다.
또 다른 예시적인 실시형태에서, 하나 이상의 원하는 유전자는 조절된 프로모터에 커플링될 수 있고, 이의 발현 수준은 적절한 조건 하에 상향조절될 수 있다. 피치아로부터의 적합한 프로모터의 예는 (배지 중의 구리의 수준에 의해 유도된) CUP1, 테트라사이크린 유도성 프로모터, 티아민 유도성 프로모터, AOX1 프로모터(Cregg et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:1316-1323); ICL1 프로모터(Menendez et al. (2003) Yeast 20(13):1097-108); 글라이세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소 프로모터(GAP)(Waterham et al. (1997) Gene 186(1):37-44); 및 FLD1 프로모터(Shen et al. (1998) Gene 216(1):93-102)를 포함한다. GAP 프로모터는 강한 구성적 프로모터이고, CUP1, AOX 및 FLD1 프로모터는 유도성이다. 각각의 상기 참고문헌은 그 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
다른 효모 프로모터는 ADH1, 알콜 탈수소효소 II, GAL4, PHO3, PHO5, Pyk, 및 이로부터 유래한 키메라 프로모터를 포함한다. 추가로, 비효모 프로모터, 예컨대 포유류, 곤충, 식물, 파충류, 양서류, 바이러스 및 조류 프로모터는 본 발명에서 사용될 수 있다. 가장 통상적으로, 프로모터는 포유류 프로모터(발현된 유전자에 잠재적으로 내인성)를 포함하거나, 효모 시스템에서 효율적인 전사를 제공하는 효모 또는 바이러스 프로모터를 포함할 것이다.
관심 있는 폴리펩타이드는 직접적으로뿐만 아니라, 비상동성 폴리펩타이드와의 융합 폴리펩타이드로서, 예를 들어 성숙 단백질 또는 폴리펩타이드의 N 말단에서 특정한 절단 부위를 가지는 신호 서열 또는 다른 폴리펩타이드로서 재조합으로 제조될 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 이것은 벡터로 삽입된 폴리펩타이드 코딩 서열의 일부일 수 있다. 선택된 비상동성 신호 서열은 바람직하게는 균류 세포 내에 이용 가능한 표준 경로 중 하나를 통해 인식되고 처리되는 것이다. 에스. 세레비시아에 알파 인자 프리-프로 신호는 피. 파스토리스로부터의 다양한 재조합 단백질의 분비에서 효과적인 것으로 입증되었다. 다른 효모 신호 서열은 알파 교배 인자 신호 서열, 인버타제 신호 서열, 및 다른 분비된 효모 폴리펩타이드로부터 유래한 신호 서열을 포함한다. 추가로, 이 신호 펩타이드 서열은 이배체 효모 발현 시스템에서 증대된 분비를 제공하도록 조작될 수 있다. 관심 있는 다른 분비 신호는 또한 포유류 신호 서열을 포함하고, 이것은 분비된 단백질에 비상동성일 수 있거나, 분비된 단백질에 네이티브 서열일 수 있다. 신호 서열은 프리펩타이드 서열을 포함하고, 몇몇 경우에 프로펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 면역글로불린 사슬에서 발견되는 신호 서열, 예를 들어 K28 프리프로독소 서열, PHA-E, FACE, 인간 MCP-1, 인간 혈청 알부민 신호 서열, 인간 Ig 중쇄, 인간 Ig 경쇄 등을 포함하는 많은 이러한 신호 서열이 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Hashimoto et. al. Protein Eng 11(2) 75 (1998); 및 Kobayashi et. al. Therapeutic Apheresis 2(4) 257 (1998)](이들 각각은 그 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 포함됨)을 참조한다.
전사는 벡터로 전사 활성자 서열을 삽입함으로써 증가할 수 있다. 이 활성자는 이의 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 작용하는 보통 약 10 내지 300bp의 DNA의 시스 작용 구성요소이다. 전사 인핸서는 인트론 내에 및 코딩 서열 자체 내에 전사 단위에 5' 및 3'에 발견되어 비교적 배향 및 위치 독립적이다. 인핸서는 코딩 서열에 5' 또는 3' 위치에서 발현 벡터로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
임의이지만, 일 실시형태에서, 원하는 단백질 또는 다중-아단위 복합체의 하나 이상의 아단위가 배양 배지로의 발현된 폴리펩타이드의 분비를 제공하는 분비 서열에 작동적으로 연결되거나 융합되어서, 원하는 단백질 또는 다중-아단위 복합체의 수확 및 정제를 수월하게 할 수 있다. 훨씬 더 바람직하게는, 분비 서열은, 예컨대 바람직한 코돈의 선택 및/또는 코돈 선택을 통한 AT 염기 쌍의 백분율의 변경을 통해, 균류 세포(예를 들어, 효모 이배체 세포)로부터의 폴리펩타이드의 최적화 분비를 제공한다. 분비 효율 및/또는 안정성은 분비 서열의 선택에 의해 영향을 받을 수 있고, 최선 분비 서열은 상이한 단백질 사이에 변할 수 있는 것으로 공지되어 있다(예를 들어 문헌[Koganesawa et al., Protein Eng. 2001 Sep;14(9):705-10](그 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 포함됨) 참조). 많은 잠재적으로 적합한 분비 신호는 당해 분야에 공지되어 있고, 특정한 원하는 단백질 또는 다중-아단위 복합체의 수율 및/또는 순도에 대한 이의 효과에 대해 용이하게 시험될 수 있다. 효모 및 다른 종의 분비된 단백질에 존재하는 것, 및 조작된 분비 서열을 포함하는 임의의 분비 서열을 잠재적으로 사용할 수 있다. 문헌[Hashimoto et al., Protein Engineering vol. 11 no. 2 pp.75-77, 1998; Oka et al., Biosci Biotechnol Biochem. 1999 Nov; 63(11):1977-83; Gellissen et al., FEMS Yeast Research 5 (2005) 1079-1096; Ma et al., Hepatology. 2005 Dec;42(6):1355-63; Raemaekers et al., Eur J Biochem. 1999 Oct 1;265(1):394-403; Koganesawa et al., Protein Eng. (2001) 14 (9): 705-710; Daly et al., Protein Expr Purif. 2006 Apr;46(2):456-67 ; Damasceno et al., Appl Microbiol Biotechnol (2007) 74:381-389; 및 Felgenhauer et al., Nucleic Acids Res. 1990 Aug 25;18(16):4927](이들 각각은 그 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 포함됨)을 참조한다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과의 기능상 관계에 위치할 때 "작동적으로 연결"된다. 예를 들어, 신호 서열에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 프리단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동적으로 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 일반적으로, "작동적으로 연결"은 연결된 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우에, 인접하고 리딩 프레임에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 결찰에 의해 또는 대안적으로 당해 분야의 당업자에게 친숙한 PCR/재조합 방법을 통해 달성될 수 있다(Gateway(등록상표) Technology; 인비트로겐(Invitrogen)(캘리포니아주 칼스바드)). 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커는 종래의 실행에 따라 사용될 수 있다. (작동적으로 연결된 서열을 포함하는 핵산을 포함하는) 원하는 핵산은 화학 합성에 의해 또한 제조될 수 있다.
단백질은 분비 신호에 작동적으로 연결되거나 융합되지 않으면서 배양 배지로 또한 분비될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 원하는 폴리펩타이드는, 심지어 분비 신호에 연결되거나 융합되지 않으면서, 피. 파스토리스에서 발현될 때 배양 배지로 분비된다는 것이 입증되었다. 추가로, 단백질은 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 (예를 들어, 단백질이 불량하게 분비된 경우 바람직할 수 있는) 균류 세포로부터 정제될 수 있다.
본 발명이, 변할 수 있는 것처럼, 특정한 방법론, 프로토콜, 세포주, 동물 종 또는 속, 및 기재된 시약으로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용된 전문용어가 오직 특정한 실시형태를 기술할 목적을 위한 것이고, 오직 청구항에 의해 제한되는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는 것으로 또한 이해되어야 한다.
본 명세서에 사용된 바대로, 단수 형태 "일", "및" 및 "이"는, 문맥이 명확히 달리 표시하지 않는 한, 복수 지시어를 포함한다. 따라서, 예를 들어 "세포"에 대한 언급은 복수의 이러한 세포를 포함하고, "단백질"에 대한 언급은 하나 이상의 단백질 및 당해 분야의 당업자에게 공지된 이의 균등물 등에 대한 언급을 포함한다. 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는, 문맥이 명확히 달리 표시하지 않는 한, 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 보통 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "섬질 균류 세포", "섬질 균류 숙주 세포" 및 "섬질 균류"는 상호교환되어 사용되고, 속 아스퍼질러스, 트리초데르마, 페니실륨, 리조푸스, 패실로마이세스(Paecilomyces), 푸사륨, 뉴로스포라 및 클라비셉스(Claviceps)로부터의 임의의 종으로부터의 임의의 세포를 의미하는 것으로 의도된다. 섬질 균류는 트리초데르마 레세이, 아스퍼질러스 종, 아스퍼질러스 니게르, 아스퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 아와모리, 아스퍼질러스 오리자에, 뉴로스포라 크라사, 페니실륨 종, 페니실륨 치리소게눔, 페니실륨 푸르푸로게눔, 페니실륨 푸니쿨로숨, 페니실륨 에머르소니, 리조푸스 종, 리조푸스 미에헤이, 리조푸스 오리자에, 리조푸스 푸실루스, 리조푸스 아르히주스, 파네로차에테 크리소스포륨 및 푸사륨 그라미네아룸을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명에서, 이것은 배양에서 성장할 수 있는 임의의 섬질 균류 세포를 광범위하게 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "효모 세포"는 속 아릭시오지마; 아스코보트리오지마; 시테로마이세스; 데바리오마이세스; 데케라; 에레모테시움; 이사첸키아; 카자흐스타니아; 클루이베로마이세스; 코다마에아; 로데로마이세스; 파치솔렌; 피치아; 사카로마이세스; 사투르니스포라; 테트라피시스포라; 토룰라스포라; 윌리옵시스; 자이고사카로마이세스; 야로위아; 로도스포리듐; 칸디다; 한세눌라; 필로바슘; 스포리디오볼루스; 불레라; 류코스포리듐 및 필로바시델라로부터의 임의의 종으로부터의 임의의 세포를 의미한다. 효모는 칸디다 종, 데바리오마이세스 한세니, 한세눌라 종(오가타에아 종), 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 막시아누스, 리포마이세스 종, 피치아 스티피티스(쉐페르소마이세스 스티피티스), 피치아 종(코마가타엘라 종), 사카로마이세스 세레비시아에, 스키조사카로마이세스 폼베, 사카로마이콥시스 종, 슈반니오마이세스 옥시덴탈리스, 야로위아 리폴리티카 및 피치아 파스토리스(코마가타엘라 파스토리스)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명에서, 이것은 배양에서 성장할 수 있는 임의의 효모 세포를 광범위하게 포함하도록 의도된다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 효모 세포는 속 피치아의 구성원이거나, 또 다른 메틸영양체이다. 본 발명의 추가의 바람직한 실시형태에서, 균류 세포는 속 피치아이고, 피치아 파스토리스, 피치아 메타놀리카 및 한세눌라 폴리모르파 (피치아 안구스타)의 종 중 하나이다. 본 발명의 특히 바람직한 실시형태에서, 속 피치아의 균류 세포는 종 피치아 파스토리스이다.
이러한 종은 반수체, 이배체 또는 다른 배수체 형태로 존재한다. 소정의 배수체의 세포는, 적절한 조건 하에, 그 형태에서 무한한 수의 세대 동안 증식할 수 있다. 이배체 세포는 반수체 세포를 형성하도록 또한 포자형성할 수 있다. 순차적인 교배는 이배체 균주의 추가의 교배 또는 융합을 통해 사배체 균주를 생성시킬 수 있다. 본 발명은, 예를 들어 교배 또는 융합(예를 들어, 스페로플라스트 융합)에 의해 제조된, 반수체 효모, 및 이배체 또는 다른 배수체 효모 세포의 사용을 고려한다.
본 명세서에 사용된 바대로, "반수체 효모 세포"는 이의 일반 게놈(염색체) 보체의 각각의 유전자의 단일 카피를 가지는 세포를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바대로, "배수체 효모 세포"는 이의 일반 게놈(염색체) 보체의 하나 초과의 카피를 가지는 세포를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바대로, "이배체 효모 세포"는 통상적으로 2개의 반수체 세포의 융합(교배)의 과정에 의해 형성된 이의 일반 게놈 보체의 본질적으로 모든 유전자의 2개의 카피(대립유전자)를 가지는 세포를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바대로, "사배체 효모 세포"는 통상적으로 2개의 이배체 세포의 융합(교배)의 과정에 의해 형성된 이의 일반 게놈 보체의 본질적으로 모든 유전자의 4개의 카피(대립유전자)를 가지는 세포를 의미한다. 사배체는 2개, 3개, 4개 이상의 상이한 발현 카세트를 보유할 수 있다. 이러한 사배체는 영양요구성 이배체를 얻기 위해 동형접합체 이주성 a/a 및 알파/알파 이배체의 선택적 교배에 의해 에스. 세레비시아에에서 및 반수체의 순차적인 교배에 의해 피치아에서 얻어질 수 있다. 예를 들어, [met his] 반수체는 이배체 [his]를 얻기 위해 [ade his] 반수체와 교배될 수 있고; [met arg] 반수체는 이배체 [arg]를 얻기 위해 [ade arg] 반수체와 교배될 수 있고; 이배체 [his]는 사배체 원영양체를 얻도록 이배체 [arg]와 교배될 수 있다. 이배체 세포의 이익 및 사용에 대한 참조가 사배체 세포에 또한 적용될 수 있는 것으로 당해 분야에 당업자에 의해 이해될 것이다.
본 명세서에 사용된 바대로, "효모 교배"는 단일 효모 세포를 형성하기 위해 2개의 효모 세포가 융합하는 과정을 의미한다. 융합된 세포는 반수체 세포 또는 더 높은 배수성의 세포(예를 들어, 사배체 세포를 제조하기 위한 2개의 이배체 세포의 교배)일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, "감수분열"은 이배체 효모 세포가 4개의 반수체 포자 생성물을 형성하도록 감수적인 분열을 겪는 과정을 의미한다. 각각의 포자는 이후 발아하고 반수체 영양 성장 세포주를 형성할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, "폴딩"은 폴리펩타이드 및 단백질의 3차원 구조를 의미하고, 여기서 아미노산 잔기 사이의 상호작용은 구조를 안정화시키도록 작용한다. 비공유 상호작용이 구조를 결정하는 데 있어서 중요하지만, 보통 관심 있는 단백질은 2개의 시스테인 잔기에 의해 형성된 분자내 및/또는 분자간 공유 이황화 결합을 가질 것이다. 천연 발생 단백질 및 폴리펩타이드 또는 이의 유도체 및 변이체의 경우, 적절한 폴딩은 통상적으로 최적 생물학적 활성을 발생시키는 배열이고, 리간드 결합, 효소 활성 등과 같은 활성에 대해 검정에 의해 편리하게 모니터링될 수 있다.
몇몇 경우에, 예를 들어 원하는 생성물이 합성 기원인 경우, 생물학적 활성에 기초한 검정은 덜 중요할 것이다. 이러한 분자의 적절한 폴딩은 물리적 특성, 에너지 고려, 모델링 연구 등에 기초하여 결정될 수 있다.
발현 숙주는 폴딩 및 이황화 결합 형성을 증대시키는 하나 이상의 효소, 즉 폴다제, 샤페로닌 등을 코딩하는 서열의 도입에 의해 추가로 변형될 수 있다. 이러한 서열은 당해 분야에 공지된 바와 같은 벡터, 마커 등을 사용하여 효모 숙주 세포에서 구성적으로 또는 유도성으로 발현될 수 있다. 바람직하게는, 원하는 발현 패턴에 충분한 전사 조절 구성요소를 포함하는 서열은 목표한 방법론을 통해 효모 게놈에서 안정하게 통합된다.
예를 들어, 진핵생물 단백질 이황화 아이소머라제(Protein Disulfide Isomerase; PDI)는 단백질 시스테인 산화 및 이황화 결합 이성질체화의 효율적인 촉매일 뿐만 아니라, 샤페론 활성을 나타낸다. PDI의 동시발현은 다수의 이황화 결합을 가지는 활성 단백질의 제조를 수월하게 할 수 있다. BIP(면역글로불린 중쇄 결합 단백질); 사이클로필린; 등의 발현이 또한 관심 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 원하는 단백질 또는 다중-아단위 복합체는 교배에 의해 제조된 효모 균주로부터 발현될 수 있고, 반수체 모 균주의 각각은 구별되는 폴딩 효소를 발현하고, 예를 들어 1개의 균주는 BIP를 발현할 수 있고, 다른 균주는 PDI 또는 이들의 조합을 발현할 수 있다.
용어 "원하는 단백질" 및 "원하는 폴리펩타이드"는 상호교환되어 사용되고, 특정한 1차 구조(즉, 서열)를 포함하는 숙주 효모 또는 섬질 균류 세포에서 발현된 단백질(통상적으로 비상동성 또는 재조합으로 발현된 단백질)을 일반적으로 의미한다. 원하는 단백질은 동종중합체 또는 이종중합체 다중-아단위 단백질 복합체일 수 있다. 예시적인 다합체 재조합 단백질은 다합체 호르몬(예를 들어, 인슐린 패밀리, 렐락신 패밀리 및 다른 펩타이드 호르몬), 성장 인자, 수용체, 항체, 사이토카인, 수용체 리간드, 전사 인자 또는 효소를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
바람직하게는, 원하는 단백질은 항체 또는 항체 단편, 예컨대 인간화 또는 인간 항체 또는 이의 결합 부분이다. 일 양태에서, 인간화 항체는 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 양 또는 소 기원이다. 바람직하게는, 인간화 항체는 토끼 기원이다. 또 다른 양태에서, 항체 또는 항체 단편은 1가, 2가 또는 다가 항체를 포함한다. 더욱 또 다른 양태에서, 항체 또는 항체 단편은 IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IFN-알파, IFN-감마, BAFF, CXCL13, IP-10, CBP, 안지오텐신(안지오텐신 I 및 안지오텐신 II), Nav1.7, Nav1.8, VEGF, PDGF, EPO, EGF, FSH, TSH, hCG, CGRP, NGF, TNF, HGF, BMP2, BMP7, PCSK9 또는 HRG에 특이적으로 결합한다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "분자 크라우딩제"는 거대분자 분자 크라우딩제 및 코스모트로픽 분자 크라우딩제를 포함하는 접근 가능한 용매의 용적을 감소시킬 수 있는 물질을 의미한다. 분자 크라우딩제는 용적 배제를 발생시키는 입체 반발로 인해 용질의 유효 농도를 크게 증가시킬 수 있는 용적 점유 물질을 포함하고, 그래서 용질은 더 적은 용적으로 제한된다. 추가적인 예시적인 분자 크라우딩제는 용적 배제 효과를 발생시키는 구조화 물(즉, 코스모트로프)에 의해 작동하는 것으로 생각되는 더 낮은 분자량 물질을 포함한다. 더 큰 분자가 분자 크라우딩제 분자 또는 구조화 물 사이의 공간에 덜 들어맞으므로, 용적 배제 효과의 영향은 통상적으로 용질의 크기에 따라 증가한다. 분자 크라우딩제는 세포내 조건을 모방한다고 문헌에 기재되어 있고, 여기서 반응 동역학은 물질의 증가한 유효 농도의 결과로서 크게 변경될 수 있다(예를 들어, 문헌[Cheung et al., PNAS, 2005 Mar 29;102(13):4753-8; Ellis, Trends Biochem Sci. 2001 Oct;26(10):597-604; 및 Ellis, Curr Opin Struct Biol. 2001 Feb;11(1):114-9](이의 각각은 본 명세서에 그 전문이 참고문헌으로 포함됨) 참조). 이론에 의해 제한되고자 하는 의도 없이, 세포로부터 배출된 폴리펩타이드(예컨대, 항체)가 세포 표면에서의 분자(예컨대, 포획 시약)와 접촉할 수 있는 속도를 분자 크라우딩제의 존재가 증가시킬 수 있어서, 이를 배출시킨 특정한 세포에 의해 배출된 폴리펩타이드의 포획의 속도를 증가시키는 것으로 생각된다. 또한 이론에 의해 제한되고자 하는 의도 없이, 세포로부터 배출된 폴리펩타이드가 상이한 세포의 근처로 확산할 수 있는 속도를 분자 크라우딩제가 감소시킬 수 있는 것(이것은 "교차 결합" 효과를 감소시킬 것임)으로 생각되고, 여기서 하나의 세포로부터 배출된 폴리펩타이드는 또 다른 세포의 표면에서 포획 시약에 결합할 수 있다. 분자 크라우딩제는 천연 및 합성 분자를 포함한다. 예시적인 거대분자 분자 크라우딩제는 거대분자, 예컨대 중합체(제한 없이, 폴리에틸렌 글라이콜, 폴리프로필렌 글라이콜 및 폴리비닐 알콜 포함), 헤모글로빈, 혈청 알부민(무엇보다도 소 혈청 알부민(BSA) 및 인간 혈청 알부민(HSA) 포함), 난알부민, 덱스트란(예컨대, 덱스트란 70) 및 피콜(Ficoll)(상표명)을 포함한다. 피콜(상표명)은 통상적으로 불활성이고 극성이며, 일반적으로 단백질과 상호작용하지 않는, 중성의, 매우 분지된, 고질량, 친수성 폴리사카라이드의 군을 의미한다. 예시적인 피콜(상표명)은 74kDa의 평균 분자 질량을 가지는 수크로스 에피클로로하이드린 공중합체인 피콜(상표명) 70이다. 추가로, 기재된 바대로, 분자 크라우딩제는 물-물 상호작용의 안정성 및 구조를 증가시킬 수 있는 코스모트로픽 분자, 예컨대 이온 코스모트로프, 예컨대 CO2 -3, SO2 -4, HPO2 -4, 마그네슘(2+), 리튬(1+), 아연(2+) 및 알루미늄(+3), 및 이의 염, 및 비이온 코스모트로프, 예컨대 당(예컨대, 트레할로스 및 글루코스), 및 프롤린 및 tert-뷰탄올을 포함한다. 거대분자 분자 크라우딩제는 약 5% 내지 약 50% w/v의 양(예를 들어, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 또는 약 50% w/v, 또는 사이의 임의의 범위)으로 조성물 중에 포함될 수 있다. "교차 결합" 효과를 감소시킬 수 있는 소정의 분자 크라우딩제의 농도는 예를 들어 본 명세서에서 실시예 10에 기재된 실험 방법론을 이용하여 일상적 실험을 통해 결정될 수 있다.
용어 "항체"는 에피토프에 들어맞고 이를 인식하는 특정한 형상을 가지는 임의의 폴리펩타이드 사슬 함유 분자 구조를 포함하고, 여기서 하나 이상의 비공유 결합 상호작용은 분자 구조와 에피토프 사이의 복합체를 안정화시킨다. 전형적인 항체 분자는 면역글로불린이고, 인간, 설치류, 토끼, 소, 양, 돼지, 개, 다른 포유류, 닭 다른 조류 등과 같은 모든 소스로부터의 면역글로불린의 모든 유형, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD 등은 "항체"인 것으로 생각된다. 본 발명에 따른 출발 물질로서 유용한 항체를 제조하기 위한 바람직한 소스는 토끼이다. 많은 항체 코딩 서열이 기재되어 있고; 기타는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 키워질 수 있다. 이의 예는 키메라 항체, 인간 항체 및 다른 비인간 포유류 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 단쇄 항체, 예컨대 scFv, 카멜바디, 나노바디, IgNAR(상어로부터 유래한 단쇄 항체), 소분자 면역약물(small-modular immunopharmaceuticals; SMIP), 및 항체 단편, 예컨대 Fabs, Fab', F(ab')2 등을 포함한다. 문헌[Protein Sci. 2005 November; 14(11):2901-9. Epub 2005 Sep. 30; Greenberg A S, et al., A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks, Nature. 1995 Mar. 9; 374(6518):168-73; Nuttall S D, et al., Isolation of the new antigen receptor from wobbegong sharks, and use as a scaffold for the display of protein loop libraries, Mol Immunol. 2001 August; 38(4):313-26; Hamers-Casterman C, et al., Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature. 1993 Jun. 3; 363(6428):446-8; Gill D S, et al., Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds, Curr Opin Biotechnol. 2006 December; 17(6):653-8. Epub 2006 Oct. 19]을 참조한다. 각각의 상기 참고문헌은 그 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편은 유전 조작에 의해 제조될 수 있다. 이 기법에서, 다른 방법에서처럼, 항체 생성 세포는 원하는 항원 또는 면역원에 감작화된다. 항체 생성 세포로부터 단리된 메신저 RNA는 PCR 증폭을 이용하여 cDNA를 제조하기 위한 주형으로서 사용된다. 초기 항원 특이성을 보유하는 하나의 중쇄 유전자 및 하나의 경쇄 유전자를 각각 함유하는 벡터의 라이브러리는 발현 벡터로의 증폭된 면역글로불린 cDNA의 적절한 섹션의 삽입에 의해 제조된다. 조합 라이브러리는 중쇄 유전자 라이브러리를 경쇄 유전자 라이브러리와 조합함으로써 구성된다. 이것은 (항체 분자의 Fab 단편 또는 항원 결합 단편을 닮은) 중쇄 및 경쇄를 동시발현하는 클론의 라이브러리를 생성시킨다. 이 유전자를 보유하는 벡터는 숙주 세포로 동시형질감염된다. 항체 유전자 합성이 형질감염된 숙주에서 유도될 때, 중쇄 및 경쇄 단백질은 자가어셈블링하여 항원 또는 면역원에 의해 스크리닝함으로써 검출될 수 있는 활성 항체를 생성한다.
관심 있는 항체 코딩 서열은 네이티브 서열에 의해 코딩된 것, 및 유전자 코드의 축퇴성에 의해 개시된 핵산과 서열이 동일하지 않은 핵산, 및 이의 변이체를 포함한다. 변이체 폴리펩타이드는 아미노산(aa) 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있다. 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환, 또는 비필수 아미노산을 제거하기 위한, 예컨대 글라이코실화 부위를 변경하기 위한, 또는 기능에 필요하지 않은 하나 이상의 시스테인 잔기의 치환 또는 결실에 의해 미스폴딩을 최소화하기 위한 치환일 수 있다. 변이체는 단백질의 특정한 영역(예를 들어, 기능적 도메인, 촉매 아미노산 잔기 등)의 증대된 생물학적 활성을 보유하거나 제거하도록 설계될 수 있다. 변이체는 또한 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드의 단편, 특히 생물학적 활성 단편 및/또는 기능적 도메인에 상응하는 단편을 포함한다. 클로닝된 유전자의 시험관내 돌연변이유발을 위한 기법이 공지되어 있다. 단백질분해적 분해에 대한 이의 내성을 개선하거나, 가용성 특성을 최적화하거나, 이것이 치료제로서 더 적합하게 하도록, 일상적 분자 생물학적 기법을 이용하여 변형된 폴리펩타이드가 또한 본 발명에 포함된다.
키메라 항체는 일 종의 항체 생성 세포로부터 얻어진 가변 경쇄 및 중쇄 영역(VL 및 VH)을 또 다른 종으로부터의 불변 경쇄 및 중쇄 영역과 조합함으로써 재조합 수단에 의해 제조될 수 있다. 통상적으로, 키메라 항체는 주로 인간 도메인을 가지는 항체를 제조하기 위해 설치류 또는 토끼 가변 영역 및 인간 불변 영역을 사용한다. 이러한 키메라 항체의 제조는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, (예를 들어, 미국 특허 제5,624,659호(본 명세서에 그 전문이 참고문헌으로 포함됨)에 기재된 바와 같은) 표준 수단에 의해 달성될 수 있다. 본 발명의 키메라 항체의 인간 불변 영역이 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 불변 영역으로부터 선택될 수 있는 것으로 추가로 고안된다.
인간화 항체는 훨씬 더욱 인간 유사인 면역글로불린 도메인을 함유하고, 동물 유래 항체의 상보성 결정 영역을 오직 통합하도록 조작된다. 이것은 단일클론 항체의 가변 영역의 초가변 루프의 서열을 조심스럽게 조사하고, 이것을 인간 항체 사슬의 구조에 일치시킴으로써 달성된다. 전면적으로 복잡하지만, 상기 과정은 실제로 간단하다. 예를 들어, 미국 특허 제6,187,287호(본 명세서에 참고문헌으로 완전히 포함됨)를 참조한다. 항체를 인간화하는 방법은 등록 미국 특허 제7935340호(이의 개시내용은 본 명세서에 그 전문이 참고문헌으로 포함됨)에 이전에 기재되어 있다. 몇몇 경우에, 활성을 유지하기 위해 추가적인 토끼 프레임워크 잔기가 필요한지의 결정이 필요하다. 몇몇 경우에, 인간화 항체는 친화도 또는 활성의 소실을 최소화하기 위해 보유되는 약간의 중요한 토끼 프레임워크 잔기를 여전히 요한다. 이 경우에, 원하는 활성을 가지도록 인간 생식선 서열로부터의 단일 또는 복수의 프레임워크 아미노산을 원래 토끼 아미노산으로 다시 변화시키는 것이 필요하다. 이 변화는 친화도 및 활성을 보전하도록 어떤 토끼 잔기가 필요한지를 확인하기 위해 실험적으로 결정된다.
전체 면역글로불린(또는 이의 재조합 대응물) 이외에, 에피토프 결합 자리를 포함하는 면역글로불린 단편(예를 들어, Fab', F(ab')2 또는 다른 단편)은 합성될 수 있다. "단편" 또는 최소 면역글로불린은 재조합 면역글로불린 기법을 이용하여 설계될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 사용하기 위한 "Fv" 면역글로불린은 융합 가변 경쇄 영역 및 가변 중쇄 영역을 합성함으로써 제조될 수 있다. 항체의 조합, 예를 들어 2개의 구별되는 Fv 특이성을 포함하는 다이아바디가 또한 관심 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, SMIP(소분자 면역약물), 카멜바디, 나노바디 및 IgNAR은 면역글로불린 단편에 의해 포함된다.
면역글로불린 및 이의 단편은 예를 들어 이팩터 모이어티, 예컨대 화학 링커, 검출 가능한 모이어티, 예컨대 형광성 염료, 효소, 독소, 기질, 생체발광성 재료, 방사능 재료, 화학발광성 모이어티 등, 또는 특이적 결합 모이어티, 예컨대 스트렙타비딘, 아비딘 또는 바이오틴 등을 부가하기 위해 번역 후 변형될 수 있고, 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 추가적인 이팩터 분자의 예는 하기 제공된다.
본 명세서에 사용된 바대로, "절반 항체", "반항체 종" 또는 "H1L1"은 단일 항체 중쇄 및 단일 항체 경쇄를 포함하지만, 제2 항체 중쇄 및 항체 경쇄에 대한 공유 연결이 결여된 단백질 복합체를 의미한다. 2개의 절반 항체는 (완전 항체와 유사한 거동, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된 겉보기 분자량을 제공할 수 있는) 일부 조건 하에 비공유로 회합된 채 있을 수 있다. 유사하게, H2L1은 2개의 항체 중쇄 및 단일 항체 경쇄를 포함하지만, 제2 항체 경쇄에 대한 공유 연결이 결여된 단백질 복합체를 의미하고; 이 복합체는 또 다른 항체 경쇄와 비공유로 또한 회합할 수 있다(그리고, 마찬가지로 완전 항체와 유사한 거동을 제공한다). 완전 항체와 같이, 절반 항체 종 및 H2L1 종은 개별 중쇄 및 경쇄로 환원 조건 하에 해리할 수 있다. 절반 항체 종 및 H2L1 종은 완전 항체보다 더 낮은 겉보기 분자량으로 이동하는 종으로서 비환원 SDS-PAGE 겔에서 검출될 수 있고, 예를 들어 H1L1은 완전 항체의 겉보기 분자량의 대략 절반(예를 들어, 약 75kDa)에서 이동한다.
본 명세서에 사용된 바대로, "연장된 시간 동안 원하는 폴리펩타이드를 안정하게 발현하거나 발현하는 배수체 효모"는 한계치 발현 수준, 통상적으로 적어도 50-500㎎/ℓ(배양에서 약 90시간 후), 바람직하게는 실질적으로 더 높은 수준에서 적어도 수일 내지 1주, 더 바람직하게는 적어도 1달, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 1-6개월, 훨씬 더 바람직하게는 1년 초과 동안 상기 폴리펩타이드를 분비하는 효모 배양을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바대로, "원하는 폴리펩타이드의 원하는 양을 분비하는 배수체 효모 배양"은 안정하게 또는 연장된 기간 동안 적어도 50-500㎎/ℓ, 가장 바람직하게는 500-1000㎎/ℓ 이상을 분비하는 배양을 의미한다.
유전자 코드에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열의 번역이 폴리펩타이드 서열을 생성하는 경우, 폴리뉴클레오타이드 서열은 폴리펩타이드 서열에 "상응"하고(즉, 폴리뉴클레오타이드 서열은 폴리펩타이드 서열을 "코딩"함), 2개의 서열이 동일한 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 경우 1개의 폴리뉴클레오타이드 서열은 또 다른 폴리뉴클레오타이드 서열에 "상응"한다.
DNA 작제물의 "비상동성" 영역 또는 도메인은, 사실상 더 큰 분자와 회합하는 것으로 발견되지 않은, 더 큰 DNA 분자 내에 DNA의 확인 가능한 분절이다. 따라서, 비상동성 영역이 포유류 유전자를 코딩할 때, 유전자는 소스 유기체의 게놈에서 포유류 게놈 DNA를 플랭킹하지 않는 DNA에 의해 보통 플랭킹될 것이다. 비상동성 영역의 또 다른 예는 코딩 서열 자체가 사실상 발견되지 않는 작제물(예를 들어, 게놈 코딩 서열이 인트론을 함유하는 cDNA, 또는 네이티브 유전자와 다른 코돈을 가지는 합성 서열)이다. 대립유전자 변이 또는 천연 발생 돌연변이 사건은 본 명세서에 정의된 바와 같은 DNA의 비상동성 영역을 생성시키지 않는다.
"코딩 서열"은 (유전자 코드의 관점에서) 단백질 또는 펩타이드 서열에 상응하거나 이를 코딩하는 코돈의 인프레임 서열이다. 서열 또는 이의 상보성 서열이 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 경우, 2개의 코딩 서열은 서로에 상응한다. 적절한 조절 서열과 회합된 코딩 서열은 폴리펩타이드로 전사되고 번역될 수 있다. 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 보통 코딩 서열에 3'에 위치할 것이다. "프로모터 서열"은 세포에서 RNA 중합효소에 결합하고 하류(3' 방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터 서열은 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 조절 분자(예를 들어, 전사 인자)의 결합에 대한 추가적인 부위를 통상적으로 함유한다. 코딩 서열은, RNA 중합효소가 세포에서 프로모터 서열에 결합하고 mRNA로 코딩 서열을 전사시킬 때(이것은 이후 결국 코딩 서열에 의해 코딩된 단백질로 번역됨), 프로모터 서열의 "제어 하"에 있거나, 프로모터에 "작동적으로 연결된다".
벡터는 유기체 또는 숙주 세포로 외래 물질, 예컨대 DNA, RNA 또는 단백질을 도입하도록 사용된다. 통상적인 벡터는 (폴리뉴클레오타이드의 경우) 재조합 바이러스 및 (폴리펩타이드의 경우) 리포솜을 포함한다. "DNA 벡터"는, 부착된 분절의 복제를 발생시키도록, 또 다른 폴리뉴클레오타이드 분절이 부착될 수 있는 레플리콘, 예컨대 플라스미드, 파지 또는 코스미드이다. "발현 벡터"는 적절한 숙주 세포에 의해 폴리펩타이드 합성을 지시하는 조절 서열을 함유하는 DNA 벡터이다. 이것은 보통 RNA 중합효소에 결합하고 mRNA의 전사를 개시시키는 프로모터, 및 폴리펩타이드(들)로 mRNA의 번역을 지시하기 위한 개시 신호 및 리보솜 결합 자리를 의미한다. 적절한 부위에서의 및 정확한 리딩 프레임에서의 발현 벡터로의 폴리뉴클레오타이드 서열의 혼입, 이어서 벡터에 의한 적절한 숙주 세포의 형질전환은 상기 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 폴리펩타이드의 제조가 가능하게 한다.
폴리뉴클레오타이드 서열의 "증폭"은 특정한 핵산 서열의 다수의 카피의 시험관내 제조이다. 증폭된 서열은 보통 DNA의 형태이다. 이러한 증폭을 수행하기 위한 다양한 기법은 하기 검토 논문(이들 각각은 그 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 포함됨)에 기재되어 있다: Van Brunt 1990, Bio/Technol., 8(4):291-294; 및 Gill and Ghaemi, Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2008 Mar;27(3):224-43. 중합효소 사슬 반응 또는 PCR은 핵산 증폭의 프로토타입이고, 본 명세서에서 PCR의 사용은 다른 적합한 증폭 기법의 예시인 것으로 생각되어야 한다.
대부분의 척추동물(포유류)에서의 항체의 일반적인 구조는 이제 훌륭히 이해된다(Edelman, G. M., Ann. N.Y. Acad. Sci., 190: 5 (1971)). 종래의 항체는 대략 분자량 23,000달톤의 2개의 동일한 폴리펩타이드 경쇄("경쇄"), 및 분자량 53,000-70,000의 2개의 동일한 중쇄("중쇄")로 이루어진다. 4개의 사슬은 "Y" 구성(여기서, 경쇄는 "Y" 구성의 입에서 시작하는 중쇄를 묶음)에서 이황화 결합에 의해 연결된다. "Y" 구성의 "가지" 부분은 Fab 영역이라 지칭되고; "Y" 구성의 줄기 부분은 FC 영역이라 지칭된다. 아미노산 서열 배열은 "Y" 구성의 상부에서의 N 말단 끝으로부터 각각의 하부에서의 C 말단 끝으로 이어진다. N 말단 끝은 이것을 유발한 항원에 특이성을 가지는 가변 영역을 보유하고, 대략 100개 길이의 아미노산이고, 경쇄 및 중쇄 사이 및 항체마다 약간의 변이가 존재한다.
가변 영역은 각각의 사슬에서 사슬의 남은 길이를 연장하고, 특정한 종류의 항체 내에 항체의 특이성에 따라 변하지 않는 불변 영역(즉, 이것을 유발하는 항원)에 연결된다. 면역글로불린 분자의 종류를 결정하는 불변 영역의 5개의 공지된 주요 종류(감마, 뮤, 알파, 델타 및 엡실론 중쇄 불변 영역에 상응하는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE))가 존재한다. 불변 영역 또는 종류는 보체의 활성화(Kabat, E. A., Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, 2nd Ed., p. 413-436, Holt, Rinehart, Winston (1976)), 및 다른 세포 반응(Andrews, D. W., et al., Clinical Immunobiology, pp 1-18, W. B. Sanders (1980); Kohl, S., et al., Immunology, 48: 187 (1983))을 포함하는 항체의 후속하는 이팩터 기능을 결정하지만; 가변 영역은 이것이 반응하는 항원을 결정한다. 경쇄는 카파 또는 람다로서 분류된다. 각각의 중쇄 종류는 카파 또는 람다 경쇄와 쌍 지을 수 있다. 경쇄 및 중쇄는 서로에 공유 결합하고, 2개의 중쇄의 "꼬리" 부분은, 면역글로불린이 하이브리도마 또는 B 세포에 의해 생성될 때, 공유 이황화 연결에 의해 서로 결합한다.
표현 "가변 영역" 또는 "VR"은 항체를 항원에 결합시키는 데 직접적으로 관여한 항체에서의 경쇄 및 중쇄의 각각의 쌍 내의 도메인을 의미한다. 각각의 중쇄는 일 말단에서 가변 도메인(VH), 이어서 다수의 불변 도메인을 가진다. 각각의 경쇄는 일 말단에서 가변 도메인(VL) 및 이의 다른 말단에서 불변 도메인을 가지고; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인을 따라 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인을 따라 정렬된다.
표현 "상보성 결정 영역", "초가변 영역" 또는 "CDR"은 항체의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역에서 발견된 하나 이상의 초가변 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 의미한다(문헌[Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)] 참조). 이 표현은 Kabat 등에 의해 정의된 바와 같은 초가변 영역("Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat E., et al., US Dept. of Health and Human Services, 1983) 또는 항체의 3차원 구조의 초가변 루프(Chothia and Lesk, J Mol. Biol. 196 901-917 (1987))를 포함한다. 각각의 사슬에서의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 가깝게 근접하게 보유되고, 다른 사슬로부터의 CDR에 의해, 항원 결합 자리의 형성에 기여한다. CDR 내에 항체-항원 상호작용에서 CDR에 의해 사용된 중요한 접촉 잔기를 나타내는 선택도 결정 영역(selectivity determining region; SDR)으로 기재된 선택 아미노산이 존재한다(Kashmiri, S., Methods, 36:25-34 (2005)).
표현 "프레임워크 영역" 또는 "FR"은 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역 내의 하나 이상의 프레임워크 영역을 의미한다(문헌[Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)] 참조). 이 표현은 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역 내의 CDR 사이에 삽입된 아미노산 서열 영역을 포함한다.
표현 "안정한 카피 수"는 연장된 시간 기간(예컨대, 적어도 1일, 적어도 1주 또는 적어도 1개월 이상)에 걸쳐 또는 전파의 세대의 연장된 수(예를 들어, 적어도 30, 40, 50, 75, 100, 200, 500 또는 1000 세대 이상)에 걸쳐 유전자(예컨대, 항체 사슬 유전자)의 카피 수를 실질적으로 유지시키는 숙주 세포를 의미한다. 예를 들어, 소정의 시점 또는 세대의 수에서, 배양물에서의 적어도 50%, 및 바람직하게는 적어도 70%, 75%, 85%, 90%, 95% 이상의 세포가 시작 세포에서처럼 유전자의 동일한 카피 수를 유지할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 숙주 세포는 원하는 단백질을 코딩하거나 원하는 다중-아단위 복합체(예를 들어, 항체)의 각각의 아단위를 코딩하는 유전자의 안정한 카피 수를 함유한다.
표현 "안정하게 발현한다"는 연장된 시간 기간(예컨대, 적어도 1일, 적어도 1주 또는 적어도 1개월 이상)에 걸쳐 또는 전파의 세대의 연장된 수(예를 들어, 적어도 30, 40, 50, 75, 100, 200, 500 또는 1000 세대 이상)에 걸쳐 유전자 또는 단백질(예컨대, 항체)의 발현의 유사한 수준을 유지시키는 숙주 세포를 의미한다. 예를 들어, 소정의 시점 또는 세대의 수에서, 유전자 또는 단백질의 제조의 속도 또는 수율은 초기 제조 속도의 적어도 50%, 및 바람직하게는 적어도 70%, 75%, 85%, 90%, 95% 이상일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 숙주 세포는 원하는 단백질 또는 다중-아단위 복합체(예를 들어, 항체)를 안정하게 발현한다.
원하는 단백질의 회수 및 정제
단일클론 항체는 주요 치료제일 수 있지만, 이의 정제 공정은 인간에서 사용하기에 적합한 생성물을 신뢰도 있게 예측 가능하게 생성할 필요가 있다. 불순물, 예컨대 숙주 세포 단백질, DNA, 외래성 및 내인성 바이러스, 내독소, 응집체 및 다른 종, 예를 들어 당변이체는 통상적으로 원하는 항체 생성물의 허용 가능한 수율을 유지하면서 제어된다. 또한, 정제 공정 동안 도입된 불순물(예를 들어, 삼출된 단백질 A, 수지 및 필터로부터의 추출 가능물, 공정 완충제 및 물질, 예컨대 세제)은 통상적으로, 항체가 치료제로서 사용될 수 있기 전에, 또한 제거된다.
1차 회수 공정
세포 배양으로부터의 항체의 회수에서의 제1 단계는 수확이다. 세포 및 세포 부스러기는 크로마토그래피에 적합한 청징된, 여과된 유체, 즉 수확된 세포 배양 유체(harvested cell culture fluid; HCCF)를 생성하도록 제거된다. 1차 회수에 예시적인 방법은 스케일 및 시설 능력에 따라 원심분리, 심층 여과 및 무균 여과, 응집, 침전 및/또는 다른 이용 가능한 접근법을 포함한다.
원심분리
일 실시형태에서, 세포 및 응집된 부스러기는 원심분리에 의해 브로쓰로부터 제거된다. 원심분리는 파일럿 및 상업적 스케일 제조에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 원심분리는 3% 초과의 고체 백분율(즉, 증가한 수준의 마이크론 이하의 부스러기)로 세포 배양으로부터 수확된 세포 배양 유체를 제공하도록 대규모 제조에서 사용된다.
완전 밀폐 원심분리처럼 표준 비밀폐 디스크-스택 원심분리는 세포 및 큰 세포 부스러기를 제거할 수 있지만, 완전 밀폐 원심분리는 오버플로를 예방하고 전단을 최소화함으로써 이 유닛 조작 동안 생긴 세포 용해물의 양을 예를 들어 적어도 50%로 상당히 감소시킬 수 있다.
원심분리 공정의 청징 효율은 수확 매개변수, 예컨대 원심분리 공급 속도, 관성력(G-force), 보울 지오메트리(bowl geometry), 조작 압력, 배출 빈도 및 원심분리기로의 세포 배양 유체의 이동에 사용된 보조 설비에 의해 영향을 받는다. 배양 공정 동안 및 수확 시 세포 배양 공정 특징, 예컨대 피크 세포 밀도, 전체 세포 밀도 및 배양 생존능력은 분리 성능에 또한 영향을 미칠 수 있다. 원심분리 공정은 원심분리기에서 공급 속도의 스케일링 인자(Q) 및 균등한 침전 영역(Σ)을 사용하여 공급 속도 및 보울 회전 속도를 선택하도록 최적화될 수 있다. 최적화 공정은 마이크론 이하 입자의 침강 및 생성물 수율을 최대화하면서 세포 용해물 및 부스러기 생성을 최소화할 수 있다.
여과
접선 흐름 미세여과는 세포 수확에서 또한 사용될 수 있다. 특히, 세포 배양 유체는 미세다공성 막에 접선으로 흐르고, 압력 추진 여과액 흐름은 더 큰 불용성 세포로부터 가용성 생성물을 분리시킨다. 막 파울링은 막 표면에 걸친 와류 흐름에 의해 생성된 전단 유도 확산 및 관성 리프트에 의해 제한된다.
높은 수율 수확은 일련의 농축 및 정용여과 단계에 의해 달성될 수 있다. 전자에서, 세포 배양 유체의 용적은 감소하여서, 고체 덩어리를 농축시킨다. 이후, 정용여과 단계는 농축된 세포 배양 유체 혼합물로부터 생성물을 세척한다.
예로서, 0.22㎛ 기공 크기는 추가의 청징의 필요 없이 (크로마토그래피에 적합한) 표적 품질의 수확된 세포 배양 유체를 생성하면서 TFF 막에 사용될 수 있다. 대안적으로, TFF 장벽에서 더 개방된 기공 크기는 파울링을 더 잘 관리하도록 사용될 수 있지만; 더 개방인 기공 크기는 TFF 시스템의 하류에서 추가적인 청징 단계(예를 들어, 정상 흐름 심층 여과)를 요할 수 있다. 바람직하게는, TFF는 3% 미만의 백분율 고체로 세포 배양에 사용된다.
심층 필터는 막 필터에서 역량을 유지시키거나 크로마토그래피 칼럼 또는 바이러스 필터를 보호하기 위해 세포 배양 브로쓰의 청징에 또한 사용될 수 있다. 심층 필터는 예를 들어 셀룰로스, 다공성 필터 조제, 예컨대 규조토, 이온 교환 수지 결합제 및 결합 수지(다른 구조 재료를 함께 공유로 결합시키도록 적은 중량 백분율로 존재하여서, 생성된 배지 습식 강도를 제공하고 배지 표면에 양전하를 부여함)로 이루어질 수 있다. 심층 필터는 분리를 실행하도록 크기 배제 및 흡착 결합 둘 다에 의존한다. 예시적인 심층 필터는 대략 2-4㎜ 두께이다.
수확 분야를 위해, 심층 필터는 직접적으로 전체 세포 브로쓰에 의해 또는 1차 분리장치, 예를 들어 TFF 또는 원심분리와 함께 적용될 수 있다. 예를 들어, 전체 세포 브로쓰 심층 필터 수확에 사용될 때, 여과 트레인은 필터의 3개의 스테이지를 함유한다: (1) 전체 세포 및 큰 입자를 제거하도록 10㎛ 이하의 기공 크기를 가지는 조악한 또는 개방된 심층 필터를 가지는 제1 스테이지; (2) 콜로이드성 및 마이크론 이하 입자를 깨끗이 하도록 더 조밀한 심층 필터를 가지는 제2 스테이지; 및 (3) 0.2㎛ 기공 크기 막 필터를 가지는 제3 스테이지. 여과 공정이 일반적으로 선형으로 스케일링하지만, 1.5X 내지 3X 초과의 안전성 인자는 적절한 필터 능력을 보장하도록 각각의 스테이지에 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 예를 들어 원심분리에 의해 제거될 수 있는 입자 크기에 실행상 하한이 있으므로, 심층 필터는 수확된 브로쓰를 추가로 청징하기 위해 원심분리 후 이용된다. 예를 들어, 심층 필터는 2개의 구별되는 층(상류 구역은 하류와 비교하여 더 조악한 등급임)을 포함하고, 0.1 내지 4㎛의 기공 크기 범위를 가질 수 있다. 더 큰 입자는 조악한 등급의 필터 배지에 포획되고, 더 작은 입자는 더 치밀한 배지에 포획되어서, 조기 플러깅을 감소시키고 여과 역량을 증가시킨다.
필터 유형, 기공 크기, 표면적 및 플럭스의 최적화는 랩 벤치 스케일에서 수행되고, 이후 예를 들어 농축물 탁도 및 입자 크기 분포에 기초하여 파일럿 스케일까지 스케일링될 수 있다. 심층 필터 사이징 실험은 여과 스테이지 중 임의의 하나 또는 이의 조합에서 압력 종점을 이용하여 일정한 플럭스에서 일반적으로 수행된다. 바람직하게는, 0.22㎛ 등급 필터는 생물부담을 제어하기 위해 수확 공정의 종료 시 상청액을 여과시키기 위해 사용된다. 0.22㎛ 여과된 상청액은 항체 생성물 관련 변형 프로필을 변경하지 않으면서 수일 이상 동안 2-8℃에서 저장될 수 있다.
이론에 의해 구속됨이 없이, 심층 필터의 흡착 기전이 광범위한 공정 오염물질 및 불순물을 제거하기 위한 정제 도구로서 이의 광범위한 사용을 허용한다고 생각된다. 특히, 심층 필터 및 DNA 분자의 양전하 사이의 정전 상호작용, 및 심층 필터 배지와 DNA 분자 사이의 소수성 상호작용은 DNA의 흡착 감소에서 중요한 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 하전된 심층 필터는 DNA를 제거하도록 사용되고, Zeta Plus(등록상표)(Cuno) 90SP에서의 충전의 수준은 DNA를 제거하는 이의 능력과 상관된다. 추가로, 예로서, 양으로 하전된 심층 필터는 필터의 평균 기공 크기보다 작은 에스체리치아 콜라이 유래 및 다른 내인성 내독소 및 바이러스를 수회 제거하도록 사용되고, Zeta Plus(등록상표)(Cuno) VR 시리즈 심층 필터는 흡착에 의해 봉입된 레트로바이러스 및 비봉입된 파르보바이러스에 결합하는 것으로 발견되었다. 심층 여과는 면역글로불린 용액으로부터 스파이킹된 프리온을 제거하도록 또한 이용되었다. 더구나, 단백질 A 친화도 크로마토그래피 칼럼 전에 심층 여과를 통한 숙주 세포 단백질의 제거는 단백질 A 풀의 pH 조정 동안 침전을 상당히 감소시키는 것으로 밝혀졌다.
응집 및 침전
일 실시형태에서, 침전/응집 기반 전처리 단계는 세포 배양 유체에서의 세포 부스러기 및 콜로이드의 분량을 제거하도록 사용되고, 이것은 기존의 여과 트레인 설비 역량을 초과할 수 있다. 응집은, 세포 오염물질을 청징하여 개선된 청징 효율 및 높은 회수 수율을 생성시키는, 예를 들어 양이온, 중성 및 음이온 중합체에 의한 세포 및 세포 부스러기에 대한 중합체 흡착, 예를 들어 정전 인력을 수반한다. 인산칼슘을 형성하기 위해 등몰량의 포스페이트가 첨가된, 응집 시약, 예를 들어 매우 낮은 수준의 염화칼슘 및 인산칼륨, 예를 들어 20-60mM 염화칼슘은 인산칼슘과 세포, 세포 부스러기 및 불순물과의 공침전에 기여하는 것으로 생각된다.
일 실시형태에서, 개시된 정제 공정은 3mM 최종 농도로의 에틸렌 다이아민 테트라아세트산(EDTA) 및 응집제에 의한 전체 세포 브로쓰의 처리, 원심분리에 의한 세포 및 응집된 부스러기의 후속적인 제거, 이어서 심층 및 0.2㎛ 필터를 통한 청징을 포함한다.
크로마토그래피
생물약제 산업에서, 크로마토그래피는 이의 높은 해상도 때문에 중요하고 널리 사용되는 분리 및 정제 기술이다. 크로마토그래피는 분리를 위해 생물분자 사이의 물리 및 화학 차이를 이용한다. 예를 들어, 단백질 A 크로마토그래피는 오직 적은 비율의 공정 및 생성물 관련 불순물의 제거를 요하는 비교적 순수한 생성물을 생성시키도록 수확을 따를 수 있다. 1개 또는 2개의 추가적인 크로마토그래피 단계, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 혼합 방식 크로마토그래피 및/또는 수산화인회석 크로마토그래피의 통합은 이후 연마 단계로서 사용될 수 있다. 이 단계는 추가적인 바이러스, 숙주 세포 단백질 및 DNA 청소, 및 응집체, 원치 않는 생성물 변이체 종 및 다른 소량 오염물질의 제거를 제공할 수 있다. 마지막으로, 정제된 생성물은 최종 제제 완충제로 농축되고 정용여과될 수 있다.
항체 정제는 혈청(다중클론 항체), 복수 또는 세포주(단일클론 항체)의 세포 배양 상청액으로부터의 항체의 선택적 농후화 또는 특정한 단리를 수반한다. 정제 방법은 매우 대강에서 고도록 특이적인 범위에 이르고, 하기와 같이 분류될 수 있다:
물리화학 분별화 - 통상적인 샘플에서의 항체의 크기, 전하 또는 다른 공유된 화학 특징에 기초한 면역글로불린의 차등 침전, 크기 배제 또는 고상 결합. 이것은 면역글로불린을 포함하는 샘플 단백질의 하위집단을 단리시킨다.
친화도 분별화 - (항원 특이성과 관련 없이 표적 종류의 모든 항체를 정제하는) 면역글로불린에 특이적 친화도를 가지는 부동화 생물학적 리간드(예를 들어, 단백질)에 의한 특정한 항체 종류(예를 들어, IgG)의 결합, 또는 (항체 종류 또는 아이소타입과 관련 없이 항원에 결합하는 모든 항체를 정제하는) 이의 특이적 항원 결합 도메인을 통해 특정한 항원 분자에 결합하는 샘플에서의 오직 이 항체의 친화도 정제.
혈청 면역글로불린의 주요 종류(예를 들어, IgG 및 IgM)는 전체 아미노산 조성 및 가용성 특징을 포함하는 동일한 일반적인 구조를 공유한다. 이 일반적인 특성은, 이 차등적인 물리화학 특성에 기초하여 면역글로불린이 선택되고 농후화될 수 있는, 혈청, 예를 들어 알부민 및 트랜스페린에서 대부분의 다른 풍부한 단백질과 충분히 다르다.
생리화학적 분별화 항체 정제
황산암모늄 침전
황산암모늄 침전은 혈청, 복수 또는 세포 배양 상청액으로부터 항체를 농후화하고 농축시키도록 흔히 사용된다. 친액성 염의 농도가 샘플에서 증가하므로, 단백질 및 다른 거대분자는 침전할 때까지 계속해서 덜 가용성이고, 즉 친액성 효과는 "염석"이라 칭해진다. 항체는 대부분의 다른 단백질 및 혈청의 성분보다 황산암모늄의 더 낮은 농도에서 침전한다.
약 40 내지 약 50% 황산암모늄 포화(100% 포화는 4.32M임)에서, 면역글로불린은 침전하지만, 다른 단백질은 용액 중에 있다. 예를 들어, 문헌[Harlow, E. and Lane, D. (1988). Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, Gagnon, P. (1996)]을 참조한다. 예로서, 동일 용적의 포화 황산암모늄 용액은 중화 항체 샘플에 천천히 첨가되고, 실온 또는 4℃에서 수회 항온처리된다. 상청액의 원심분리 및 제거 후, 항체-펠렛은 완충제, 예컨대 인산염 완충 식염수(PBS) 중에 용해된다.
침전의 선택도, 수율, 순도 및 재현성은 각각 시간, 온도, pH 및 염 첨가의 속도(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 여러 인자에 따라 달라진다. 예를 들어, 문헌[Gagnon, P.S. (1996), Purification Tools for Monoclonal Antibodies, Validated Biosystems, Tucson, AZ]을 참조한다. 황산암모늄 침전은 몇몇 항체 분야에 충분한 정제를 제공할 수 있지만, 칼럼 크로마토그래피 또는 다른 정제 방법 전에 예비 단계로서 대개 수행된다. 부분적으로 정제된 항체 샘플의 사용은 성능을 개선하고 친화도 칼럼의 수명을 연장할 수 있다.
항체 정제 상황에 대한 황산암모늄 이외의 적합한 항체 침전 시약은 예로서 옥톤산, 폴리에틸렌 글라이콜 및 에타크리딘을 포함한다.
많은 화학적으로 기초한, 고상 크로마토그래피 방법은 항체 정제, 특히 상황을 달성하도록 적용되고 최적화된다.
이온 교환 크로마토그래피(Ion Exchange Chromatography; IEC)
이온 교환 크로마토그래피(IEC)는 소정의 완충제 시스템(pH)에서 이의 순 전하에 기초하여 단백질에 결합하도록 양으로 또는 음으로 하전된 수지를 사용한다. 단일클론 항체의 제조를 수반하는 상업적 조작에서 특히 중요한 높은 정도의 특이성을 가지는 표적 항체에 결합하거나 이를 방출하는 IEC에 대한 조건이 결정될 수 있다. 반대로, 항체를 제외한 거의 모든 다른 샘플 성분에 결합하는 조건이 발견되었다. 최적화되면, IEC는 항체 정제를 위한 비용 효과적이고 온화하고 신뢰성 있는 방법이다.
음이온 교환 크로마토그래피는 수지에 부동화된 양으로 하전된 기를 사용한다. 예를 들어, 약한 염기성 기, 예컨대 다이에틸아미노 에틸(DEAE) 또는 다이메틸아미노 에틸(DMAE), 또는 강한 염기성 기, 예컨대 4차 아미노 에틸(Q) 또는 트라이메틸암모늄 에틸(TMAE) 또는 4차 아미노에틸(QAE)은 음이온 교환에서 사용될 수 있다. 예시적인 음이온 교환 배지는 GE Healthcare Q-세파로스(등록상표) FF, Q-세파로스(등록상표) BB, Q-세파로스(등록상표) XL, Q-세파로스(등록상표) HP, 미니 Q, 모노 Q, 모노 P, DEAE 세파로스(등록상표) FF, 소스 15Q, 소스 30Q, 캅토 Q, 스트림라인 DEAE, 스트림라인 QXL; Applied Biosystems Poros HQ 10 및 20㎛ 셀프 팩, Poros HQ 20 및 50㎛, Poros PI 20 및 50㎛, Poros D 50㎛; Tosohaas 토요펄(등록상표) DEAE 650S M 및 C, Super Q 650, QAE 550C; Pall Corporation DEAE Hyper D, Q 세라믹 하이퍼 D, Mustang Q 막 흡수장치; Merck KG2A Fractogel(등록상표) DMAE, FractoPrep DEAE, Fractoprep TMAE, Fractogel(등록상표) EMD DEAE, Fractogel(등록상표) EMD TMAE; Sartorious Sartobind(등록상표) Q 막 흡수장치를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
이온 교환은 공정 관련 불순물(예를 들어, 숙주 세포 단백질, 내인성 레트로바이러스 및 외래성 바이러스, 예컨대 파르보바이러스 또는 슈도라비스 바이러스, DNA, 내독소 및 삼출된 단백질 A), 및 생성물 관련 불순물(예를 들어, 이합체/응집체)을 제거하기에 특히 유용하다. 이것은 항체 및 제거되는 불순물의 pI에 따라 흐름 통과 방식 또는 결합 및 용리 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 불순물이 수지에 결합하고 관심 있는 생성물이 흐르므로, 흐름 통과 방식은 바람직하게는 7.5 초과의 pI를 가지는 항체, 예를 들어 대부분의 인간화 또는 인간 IgG1 및 IgG2 항체로부터 불순물을 제거하기 위해 사용된다. 오직 불순물이 수지 상의 결합 자리를 점유하므로, 칼럼 로딩 역량, 즉 항체의 질량 대 수지의 질량은 꽤 높을 수 있다. 흐름 통과 방식에서의 음이온 교환 크로마토그래피는, 잔류 불순물, 예컨대 숙주 세포 단백질, DNA, 삼출된 단백질 A 및 다양한 바이러스를 제거하기 위해, 2개 또는 3개의 유닛 조작에 의해 설계된 단일클론 항체 정제 공정에서 연마 단계로서 사용될 수 있다. 예로서, 조작 pH는 생성물 로드 및 평형 및 세척 완충제 중에 10mS/cm 이하의 전도도로 약 8 내지 약 8.2이다.
대안적으로, 결합 및 용리 방식은 바람직하게는, 산성 내지 중성 범위의 pI를 가지는 항체, 예를 들어 대부분의 인간화 또는 인간 IgG4로부터의 공정 관련 및 생성물 관련 불순물을 제거하기 위해, 사용된다. 결합 및 용리 방식을 위해, 항체 생성물 풀은 처음에 음이온 교환 칼럼에 로딩되고, 관심 있는 생성물은 이후 단 또는 선형 구배에서 더 높은 염 농도에 의해 용리되어서, 칼럼에 결합된 대부분의 불순물이 남게 한다. 불순물은 세정 또는 재생 단계 동안 칼럼으로부터 용리된다. 일반적으로, 조작 pH는, 항체 분자의 표면에서 순 음전하 또는 더 높은 음전하 수를 얻고, 따라서 크로마토그래피 단계 동안 더 높은 결합 역량을 달성하기 위해, 생성물의 pI 초과이거나 이에 가까워야 한다. 유사하게, 로드에 대한 이온 농도는 바람직하게는 낮은 범위에 있고, pH는 바람직하게는 pH 9 미만이다.
추가로, 약한 분배 크로마토그래피(weak partitioning chromatography; WPC)는 단백질 A 및 음이온 교환을 포함하는 2개의 크로마토그래피 회수 공정이 가능하게 하도록 사용될 수 있다. 일반적으로, 상기 공정은 (흐름 통과 크로마토그래피에서처럼) 등용매로 실행되지만, 0.1 내지 20, 및 바람직하게는 1 내지 3의 항체 분배 계수(Kp)를 획득하면서 생성물 및 불순물 둘 다의 결합이 (흐름 통과 방식과 반대로) 증대되도록 전도도 및 pH가 선택된다. 항체 및 불순물 둘 다는 음이온 교환 수지에 결합하지만, 불순물은 흐름 통과 방식에서보다 훨씬 더 치밀하게 결합하고, 이것은 불순물 제거의 증가를 발생시킬 수 있다. 임상 제조에 대해 예를 들어 90% 평균화된 로드의 종료 시 짧은 세척을 포함하는, 약한 분배 방식의 생성물 수율은 최대화될 수 있다.
양이온 교환 크로마토그래피는 음으로 하전된 작용기에 의해 변형된 수지를 사용한다. 예를 들어, 강한 산성 리간드(예를 들어, 설포프로필, 설포에틸 및 설포아이소뷰틸 기) 또는 약한 산성 리간드(예를 들어, 카복실 기)는 양이온 교환에서 사용될 수 있다. 예시적인 양이온 교환 수지는 GE Healthcare SP-세파로스(등록상표) FF, SP-세파로스(등록상표) BB, SP-세파로스(등록상표) XL, SP-세파로스(등록상표) HP, 미니 S, 모노 S, CM 세파로스(등록상표) FF, 소스 15S, 소스 30S, 캅토 S, MacroCap SP, 스트림라인 SP-XL, 스트림라인 CST-1; Tosohaas Resins Toyopearl(등록상표) Mega Cap TI SP-550 EC, 토요펄(등록상표) Giga Cap S-650M, 토요펄(등록상표) 650S, M 및 C, Toyopeal SP650S, M 및 C, Toyopeal SP550C; JT Baker 수지 카복시-설폰-5, 15 및 40㎛, 설포닉-5, 15 및 40㎛; YMC BioPro S; Applied Biosystems Poros HS 20 및 50㎛, Poros S 10 및 20㎛; Pall Corp S 세라믹 하이퍼 D, CM 세라믹 하이퍼 D; Merck KGgA Resins Fractogel(등록상표) EMD SO3, Fractogel(등록상표) EMD COO-, Fractogel(등록상표) EMD SE Hicap, Fracto Prep SO3; Eshmuno S; Biorad Resin Unosphere S; Sartorius Membrane Sartobind(등록상표) S 막 흡수장치를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
양이온 교환 크로마토그래피는 중성 내지 염기성 범위의 pI 값을 가지는 많은 단일클론 항체, 예를 들어 인간 또는 인간화 IgG1 및 IgG2 하위종류에 대한 정제 공정에 특히 적합하다. 일반적으로, 항체는 로딩 단계 동안 수지에 결합하고, 용리 완충제 중의 증가한 전도도 또는 증가한 pH를 통해 용리된다. 대부분의 음으로 하전된 공정 관련 불순물, 예컨대 DNA, 몇몇 숙주 세포 단백질, 삼출된 단백질 A 및 내독소는 로드 및 세척 분획에서 제거된다. 양이온 교환 크로마토그래피는 표적 항체 생성물, 예컨대 탈아마이드화 생성물, 산화된 종 및 N 말단 절두 형태, 및 고분자량 종으로부터 항체 변이체를 또한 감소시킬 수 있다.
획득된 최대 결합 능력은 로딩 조건, 수지 리간드 및 밀도에 따라 100g/ℓ(수지 용적) 만큼 높을 수 있지만, 불순물 제거는 로딩 밀도에 매우 의존한다. 용리 프로그램의 전개에 관한 음이온 교환 크로마토그래피에 기재된 동일한 원칙은 양이온 교환 크로마토그래피에 또한 적용된다.
용리 조건의 전개는 후속적인 유닛 조작에서 용이하게 공정처리될 수 있는 생성물 풀의 특징 및 불순물 제거와 연결된다. 일반적으로, 선형 염 또는 pH 구배 용리 프로그램은 최고의 용리 조건을 결정하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 선형 구배 용리 조건은 pH 6에서 5mM 내지 250mM NaCl의 범위일 수 있고, 선형 pH 구배 용리 실행은 pH 6 내지 pH 8의 범위일 수 있다.
부동화 금속 킬레이트 크로마토그래피(Immobilized Metal Chelate Chromatography; IMAC)
부동화 금속 킬레이트 크로마토그래피(IMAC)는 3개 이상의 연속적 히스티딘 잔기의 클러스터를 함유하는 단백질 또는 펩타이드에 결합하는 킬레이트-부동화 2가 금속 이온(예를 들어, 니켈 Ni2+)을 사용한다. 이 전략은 말단 6xHis 융합 태그를 함유하도록 조작된 재조합 단백질의 정제에 특히 유용할 수 있다. 포유류 IgG는 부동화 니켈에 의해 결합될 수 있는 히스티딘 클러스터를 보유하는 혈청(또는 단일클론 세포 배양 상청액)에서의 몇몇 풍부한 단백질 중 하나이다. IEC와 같이, 결합 및 용리에 대한 IMAC 조건은 온화하고 신뢰성 있는 항체 정제를 제공하기 위해 특정한 샘플에 최적화될 수 있다. 예를 들어, IMAC는 표지 절차 후 과량의 비접합된 효소로부터 AP 또는 HRP 표지된(효소 접합된) 항체를 분리하도록 사용될 수 있다.
소수성 상호작용 크로마토그래피(Hydrophobic interaction chromatography; HIC)
소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 이의 소수화도에 기초하여 단백질을 분리하고, 전하, 크기 또는 친화도에 기초하여 단백질을 분리시키는 다른 기법에 보완적이다. 예를 들어, 고염 완충제 중에 HIC 칼럼에 로딩된 샘플은, 용액 중의 단백질 분자의 용매화를 감소시켜서, HIC 수지에 공유로 결합하는 샘플 단백질 분자에서 소수성 영역을 노출시킨다. 일반적으로, 분자가 더 소수성일수록, 결합을 촉진하는 데 염이 덜 필요하다. 이후, 감소한 염 농도의 구배는 HIC 칼럼으로부터 샘플을 용리시키기 위해 사용될 수 있다. 특히, 이온 농도가 감소하면서, 분자의 친수성 영역의 노출이 증가하고, 분자는 증가한 소수화도의 차수로 칼럼으로부터 용리한다.
흐름 통과 방식에서의 HIC는 비교적 높은 수율로 많은 백분율의 응집체를 제거하는 데 있어서 효율적일 수 있다. 결합 및 용리 방식에서의 HIC는 항체 생성물로부터 공정 관련 및 생성물 관련 불순물의 효과적인 분리를 제공할 수 있다. 특히, 대부분의 숙주 세포 단백질, DNA 및 응집체는 용리 완충제 중의 적합한 염 농도의 선택 또는 구배 용리 방법의 사용을 통해 항체 생성물로부터 제거될 수 있다.
예시적인 HIC 수지는 GE Healthcare HIC 수지(뷰틸 세파로스(등록상표) 4 FF, 뷰틸-S 세파로스(등록상표) FF, 옥틸 세파로스(등록상표) 4 FF, 페닐 세파로스(등록상표) BB, 페닐 세파로스(등록상표) HP, 페닐 세파로스(등록상표) 6 FF 하이 서브, 페닐 세파로스(등록상표) 6 FF 로우 서브, 소스 15ETH, 소스 15ISO, 소스 15PHE, 캅토 페닐, 캅토 뷰틸, 스트림라인 페닐); Tosohaas HIC 수지(TSK 에터 5PW(20㎛ 및 30㎛), TSK 페닐 5PW(20㎛ 및 30㎛), 페닐 650S, M 및 C, 뷰틸 650S, M 및 C, 헥실-650M 및 C, 에터-650S 및 M, 뷰틸-600M, 슈퍼 뷰틸-550C, 페닐-600M; PPG-600M); Waters HIC Resins(기공 크기 120, 200, 300A를 가지는 YMC-팩 옥틸 칼럼-3, 5, 10P, 15 및 25㎛, 기공 크기 120, 200 및 300A를 가지는 YMC-팩 페닐 칼럼-3, 5, 10P, 15 및 25㎛, 기공 크기 120, 200 및 300A를 가지는 YMC-팩 뷰틸 칼럼-3, 5, 10P, 15 및 25㎛); CHISSO Corporation HIC 수지(셀루핀 뷰틸, 셀루핀 옥틸, 셀루핀 페닐); JT Baker HIC Resin(WP HI-프로필(C3)); Biorad HIC Resins(마크로프렙 t-뷰틸, 마크로프렙 메틸); 및 Applied Biosystems HIC Resin(고밀도 페닐―HP2 20㎛)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어, PPG 600-M은 대략 8x105 달톤의 배제 제한 분자량, 폴리프로필렌 글라이콜 PPG 리간드, 45-90㎛ 입자 크기, 에터 > PPG > 페닐의 관계식에 의해 제공된 소수화도, 및 38㎎/㎖-겔의 동적 결합 역량(MAb: 항 LH)을 특징으로 한다.
일 실시형태에서, 개시된 정제 공정은 친화도 크로마토그래피(예를 들어, 단백질 A) 및 혼합 방식 크로마토그래피(예를 들어, 수산화인회석) 후 연마 정제 단계로서 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 사용한다. 도 1을 참조한다. 바람직하게는, 폴리프로필렌 글라이콜(PPG-600M) 또는 페닐-600M은 HIC 수지이다. 일 실시형태에서, 용리는 20mM 인산나트륨(pH 7), 완충제 중의 약 0.7M 내지 0M 황산나트륨의 선형 구배(0-100%)로서 수행된다. 임의로, 유출물의 OD280은 모니터링되고, 일련의 분획, 예를 들어 수집 용적의 약 ⅓은 추가의 순도 분석을 위해 수집된다. 바람직하게는, 수집된 분획은 전방 측면에서 0.1 OD 내지 후방 측면에서 0.1 OD를 포함한다.
소수성 전하 유도 크로마토그래피(Hydrophobic charge induction chromatography; HCIC)
소수성 전하 유도 크로마토그래피(HCIC)는 낮은 pH에서 이온화하는 리간드의 pH 의존적 거동에 기초한다. 이 기법은 높은 밀도에서 헤테로사이클릭 리간드를 이용하여서, 흡착은 친액성 염의 높은 농도를 필요로 하지 않으면서 소수성 상호작용을 통해 발생할 수 있다. HCIC에서의 흡착은 이온화 가능한 리간드와 결합 단백질 사이의 전하 반발을 생성하기 위해 pH를 낮춤으로써 수월하게 된다. 예시적인 상업적 HCIC 수지는 MEP-하이퍼셀(Pall Corporation)이고, 이것은 작용기로서 4-머캅토에틸 피리딘을 가지는 셀룰로스 기반 매질이다. 리간드는 낮은 pH에서 양전하를 획득한 N-헤테로사이클릭 고리를 가지는 소수성 모이어티이다.
티오친화성 흡착
티오친화성 흡착은 티오에터에 매우 근접한 설폰기에 대한 단백질의 결합을 수반하는 황산암모늄 침전(즉, 친액성 효과) 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)의 특성을 조합한 단백질-리간드 상호작용의 매우 선택적인 유형이다. 엄격한 HIC와 달리, 티오친화성 흡착은 친액성 염의 높은 농도(예를 들어, 염화나트륨과 반대로 황산칼륨)에 따라 달라진다. 예를 들어, 결합은 황산칼륨에 의해 평형화된 통상적인 항체 샘플에 꽤 특이적이다. 비결합 성분이 세척된 후, 항체는 온화한 용리 조건(예를 들어, 50mM 인산나트륨 완충제(pH 7 내지 8))에 의해 용이하게 회수된다. 티오친화성 흡착제(또한 T-겔이라 칭함)는 다양한 동물 종으로부터 면역글로불린에 대한 높은 결합 역량 및 광범위한 특이성을 가지는 설폰-티오에터 리간드를 함유하도록 변형된 6% 비딩된 아가로스이다.
항체의 친화도 정제
친화도 크로마토그래피(또한 친화도 정제라 칭함)는 분자 사이의 특이적 결합 상호작용을 사용한다. 일반적으로, 특정한 리간드는 고체 지지체에 화학적으로 부동화되거나 "커플링"되어서, 복잡한 혼합물이 칼럼 위로 통과할 때, 리간드에 특이적 결합 친화도를 가지는 이 분자가 결합하게 된다. 다른 샘플 성분이 세척된 후, 결합 분자는 지지체로부터 스트리핑되어서, 원래 샘플로부터의 이의 정제를 발생시킨다.
지지체
친화도 정제는 정지상 재료(고상)에 부동화된 리간드와의 결합 상호작용의 차이에 기초하여 용액(이동상) 중의 분자의 분리를 수반한다. 친화도 정제에서의 지지체 또는 매트릭스는 생물특이적 리간드가 공유로 부착된 임의의 재료이다. 통상적으로, 친화도 매트릭스로서 사용되는 재료는 표적 분자가 발견되는 시스템에서 불용성이다. 항상은 아니지만, 보통은, 불용성 매트릭스는 고체이다.
유용한 친화도 지지체는 높은 표면적 대 용적 비율, 리간드의 공유 부착에 용이하게 변형된 화학 기, 최소 비특이적 결합 특성, 우수한 흐름 특징 및 기계적 및 화학적 안정성을 가지는 것이다.
부동화 리간드 또는 활성화 친화도 지지체 화학물질은, 예를 들어 가교결합된 비딩된 아가로스 또는 폴리아크릴아마이드 수지 및 폴리스타이렌 마이크로플레이트를 포함하는, 몇몇 상이한 포맷에서 사용하도록 이용 가능하다.
다공성 겔 지지체는 샘플 분자가, 단백질의 친화도 정제에 또한 유용한, 부동화 리간드의 높은 표면적을 지나 자유로이 흐를 수 있는 헐거운 매트릭스이다. 이 유형의 지지체는 보통, 50-150㎛ 직경 비드로서 용액 중에 생성된(즉, 수화된), 당 또는 아크릴아마이드 기반 중합체 수지이다. 비딩된 포맷은 임의의 크기의 수지 층을 가지는 칼럼을 충전 및 "패킹"하도록 용이하게 분배될 수 있는 습식 슬러리로서 이 수지가 공급되게 한다. 비드가 비드의 표면 주위에 및 이것 사이에 있을 수 있으므로, 비드는 생물분자(단백질 등)가 비드를 통해 및 비드로 자유로이 흐를 수 있도록 극도로 다공성이고 크다. 리간드는 다양한 수단에 의해 비드 중합체(외부 및 내부 표면)에 공유로 부착된다.
예를 들어, 가교결합된 비딩된 아가로스는 통상적으로 4% 및 6% 밀도로 이용 가능하다(즉, 1㎖ 수지 층은 90용적% 초과의 물이다). 비딩된 아가로스는 중력 흐름, 저속 원심분리 및 저압 절차에 적합할 수 있다. 대안적으로, 폴리아크릴아마이드 기반의 비딩된 수지는 일반적으로 압축하지 않고 연동 펌프 또는 다른 액체 크로마토그래피 시스템에 의한 중압 적용에 사용될 수 있다. 다공성 지지체의 유형 둘 다는 일반적으로 낮은 비특이적 결합 특징을 가진다. 이 친화도 크로마토그래피 수지의 물리적 특성의 요약은 하기 표 1에 제공된다.
Figure pct00001
자기 입자는 고체 친화도 지지체의 훨씬 또 다른 유형이다. 이것은 훨씬 더 작아서(통상적으로 1-4㎛ 직경), 효과적인 리간드 부동화 및 친화도 정제에 필요한 충분한 표면적 대 용적 비율을 제공한다. 자기 입자에 의한 친화도 정제는 뱃치식으로 수행되고, 예를 들어 몇몇 마이크로리터의 비드는 묽은 슬러리로서 수백 개의 마이크로리터의 샘플과 혼합된다. 혼합 동안, 비드는 샘플 용액 중에 현탁된 채 있어서, 부동화 리간드에 의해 친화도 상호작용이 일어나게 한다. 결합에 충분한 시간이 제공된 후, 비드는 강한 자석을 사용하여 샘플로부터 수집되고 분리된다. 통상적으로, 단순한 벤치-탑 절차는 마이크로원심분리 관에서 수행되고, 피펫팅 또는 경사여과는 샘플(또는 세척 용액 등)을 제거하도록 사용되지만, 자기 비드는 적합한 자석에 의해 관의 하부 또는 측면에 위치하도록 고정된다.
자기 입자는 고속 자동화에 특히 매우 적합하고, 다공성 수지와 달리, 세포 분리 절차 대신에 사용될 수 있다.
각각의 특이적 친화도 시스템은 소정의 조사 목적을 위해 그 자체의 일련의 조건을 요하고 그 자체의 독특한 도전과제를 제시한다. 그러나, 친화도 정제는 일반적으로 하기 단계를 수반한다:
1. 미정제 샘플을 친화도 지지체와 항온처리하여 샘플에서의 표적 분자가 부동화 리간드에 결합하게 하고;
2. 지지체로부터 비결합 샘플 성분을 세척하고;
3. 완충제 조건을 변경함으로써 부동화 리간드로부터 표적 분자를 용리(해리 및 회수)하여, 결합 상호작용이 더 이상 생기지 않는다.
일반적인 종류의 단백질(예를 들어, 항체)에 결합하는 리간드 또는 흔히 사용된 융합 단백질 태그(예를 들어, 6xHis)는 친화도 정제에 사용하기에 준비된 예비부동화 형태로 상업적으로 구입 가능하다. 대안적으로, 더 특수화된 리간드, 예컨대 관심 있는 특이적 항체 또는 항원은 몇몇 상업적으로 구입 가능한 활성화 친화도 지지체 중 하나를 사용하여 부동화될 수 있고; 예를 들어, 펩타이드 항원은 지지체에 부동화되고, 펩타이드를 인식하는 항체를 정제하도록 사용될 수 있다.
가장 흔히, 리간드는 리간드(예를 들어, 1차 아민, 설프하이드릴, 카복실산, 알데하이드) 상의 특정한 작용기와 지지체 상의 반응성 기 사이의 공유 화학 결합의 형성에 의해 고체 지지체 재료에 직접적으로 "커플링" 또는 부동화된다. 그러나, 간접 커플링 접근법이 또한 가능하다. 예를 들어, GST 태그화 융합 단백질은 처음에 글루타티온-GST 친화도 상호작용을 통해 글루타티온 지지체에 포획되고 이후 이것을 부동화하도록 2차로 화학적으로 가교결합될 수 있다. 이후, 부동화 GST 태그화 융합 단백질은 융합 단백질의 결합 파트너(들)를 친화도 정제하기 위해 사용될 수 있다.
친화도 정제를 위한 결합 및 용리 완충제
단백질:리간드 상호작용을 수반하는 대부분의 친화도 정제 절차는, 특히 항체:항원 또는 네이티브 단백질:단백질 상호작용이 친화도 정제에 대한 기본일 때, 생리학적 pH 및 이온 농도에서 결합 완충제, 예컨대 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline; PBS)를 사용한다. 결합 상호작용이 발생하면, 지지체는 샘플의 비결합 성분을 제거하도록 추가적인 완충제에 의해 세척된다. 비특이적(예를 들어, 단순한 이온) 결합 상호작용은 낮은 수준의 세제의 첨가 또는 결합 및/또는 세척 완충제 중의 염 농도로의 보통의 조정에 의해 최소화될 수 있다. 마지막으로, 용리 완충제(예를 들어, 0.1M 글라이신
Figure pct00002
HCl(pH 2.5-3.0))는 (단백질 구조에 영구적으로 영향을 미치지 않으면서) 결합 상호작용을 파괴하고 표적 분자를 방출하도록 첨가되고, 이 표적 분자는 이후 이의 정제된 형태로 수집된다. 용리 완충제는 pH의 극한치(낮은 또는 높은), 고염(이온 농도), 분자 중 하나 또는 둘 다를 변성시키는 세제 또는 카오트로픽 물질의 사용, 결합 인자의 제거 또는 반대 리간드와의 경쟁에 의해 결합 파트너를 해리시킬 수 있다. 몇몇 경우에, 후속적인 투석 또는 탈염은 용리 완충제로부터 정제된 단백질을 저장 또는 하류 프로세싱에 더 적합한 완충제로 교환하는 데 필요할 수 있다.
추가로, 용리된 단백질 분획이 1/10 용적의 알칼리 완충제, 예를 들어 1M Tris
Figure pct00003
HCl(pH 8.5)의 첨가에 의해 즉시 중화되어야 하므로, 몇몇 항체 및 단백질은 낮은 pH에 의해 손상된다. 단백질의 친화도 정제에 대한 다른 예시적인 용리 완충제는 하기 표 2에 제공된다.
Figure pct00004
항체 정제의 몇몇 방법은 친화도 정제 기법을 수반한다. 친화도 정제에 대한 예시적인 접근법은 황산암모늄에 의한 침전(다른 혈청 단백질로부터의 전체 면역글로불린의 투박한 정제); 결합 및 용리 방식의 (대부분의 종 및 IgG의 하위종류에 결합하는) 부동화 단백질 A, G, A/G 또는 L, 또는 재조합 단백질 A, G, A/G, 또는 L 유도체에 의한 친화도 정제; 및 결합 및 용리 방식의 부동화 항원(미정제 샘플로부터 특이적 항체를 단리하기 위한 친화도 지지체에 공유로 부동화 정제된 항원)에 의한 친화도 정제를 포함한다.
단백질 A, 단백질 G 및 단백질 L은 항체 결합 특성이 잘 규명된 3개의 박테리아 단백질이다. 이 단백질은 재조합으로 제조되고, 다양한 종으로부터의 중요한 항체 유형의 친화도 정제에 일상적으로 사용된다. 이 단백질의 가장 상업적으로 구입 가능한, 재조합 형태는 제거된 불필요한 서열(예를 들어, 단백질 G로부터의 HSA 결합 도메인)을 가지고, 따라서 이의 네이티브 대응물보다 작다. 단백질 A/G라 칭해지는, 단백질 A 및 단백질 G의 유전적으로 조작된 재조합 형태가 또한 이용 가능하다. 모든 4개의 재조합 Ig 결합 단백질은 많은 면역검출 및 면역친화도 분야에서 조사자들에 의해 일상적으로 사용된다.
항체 정제를 달성하기 위해, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G는 지지체, 예를 들어 다공성 수지(예컨대, 비딩된 아가로스) 또는 자기 비드에 공유로 부동화된다. 이 단백질이 몇몇 항체 결합 도메인을 함유하므로, 거의 모든 개별 부동화 분자는, 이의 배향에 상관 없이, 적어도 하나의 기능적 및 비장애 결합 도메인을 유지한다. 더욱이, 단백질이 항원 결합 도메인 이외의 부위에서 항체에 결합하므로, 이 단백질의 부동화 형태는 정제 계획, 예컨대 면역침전에서 사용될 수 있고, 여기서 항체 결합 단백질은 항체를 결합시킴으로써 샘플로부터 항원을 정제하도록 사용되면서, 이것은 이의 항원에 결합된다.
IgG형 항체의 Fc 영역에 대한 단백질 A의 고친화도가 IgG, IgG 단편 및 하위종류의 정제에 대한 기본이다. 일반적으로, 단백질 A 크로마토그래피는 pH 약 6.0 내지 약 8.0에서 칼럼 위로 청징된 세포 배양 상청액의 통과를 수반하여서, 항체는 결합하고, 원치 않는 성분, 예를 들어 숙주 세포 단백질, 세포 배양 배지 성분 및 추정상 바이러스는 칼럼을 통해 흐른다. 임의의 중간 세척 단계는 칼럼으로부터 비특이적으로 결합된 불순물을 제거하도록 수행될 수 있고, pH 약 2.5 내지 pH 약 4.0에서의 생성물의 용리가 후행한다. 용리 단계는 선형 구배 또는 단계 방법 또는 구배 및 단계의 조합으로서 수행될 수 있다. 일 실시형태에서, 용리물은 중화 완충제(예를 들어, 1M Tris(pH 8))에 의해 즉시 중화되고, 이후 예를 들어 5% 염산 또는 1M 수산화나트륨을 사용하여 최종 pH 6.5로 조정된다. 바람직하게는, 중화된 용리물은 후속적인 크로마토그래피 전에 여과된다. 일 실시형태에서, 중화된 용리물은 후속적인 수산화인회석 크로마토그래피 단계 전에 0.2㎛ 필터를 통해 통과한다.
이의 높은 선택도, 높은 유속 및 비용 효과적인 결합 능력 및 공정 관련 불순물, 예컨대 숙주 세포 단백질, DNA, 세포 배양 배지 성분 및 내인성 및 외래성 바이러스 입자의 광범위한 제거를 위한 이의 능력 때문에, 단백질 A 크로마토그래피는 항체 정제 공정에서 제1 단계로서 통상적으로 사용된다. 이 단계 후, 항체 생성물은 프로테아제 및 분해를 야기시킬 수 있는 다른 배지 성분의 제거로 인해 매우 순수하고 더 안정하다.
현재 이의 수지 골격 조성에 기초하여 분류된, 단백질 A 수지의 3개의 주요 유형이 존재한다: 유리 또는 실리카 기반, 예를 들어 AbSolute HiCap(NovaSep), Prosep vA, Prosep vA Ultra(Millipore); 아가로스 기반, 예를 들어 단백질 A 세파로스(등록상표) 패스트 플로우, MabSelect 및 MabSelect SuRe(GE Healthcare); 및 유기 중합체 기반, 예를 들어 폴리스타이렌-다이비닐벤젠 Poros A 및 MabCapture(Applied Biosystems). 바람직하게는, 단백질 A 수지는 아가로스 기반 수지, 즉 MabSelect SuRe 수지이다. 모든 3개의 수지 유형은 높은 농도의 구아니디늄 하이드로클로라이드, 유레아, 환원제 및 낮은 pH에 저항적이다.
큰 규모로 사용된 칼럼 층 높이는 수지 입자 특성, 예컨대 기공 크기, 입자 크기 및 압축성에 기초하여 10 내지 30㎝이다. 바람직하게는, 칼럼 층 높이는 약 25㎝이다. 유속 및 칼럼 치수는 칼럼에서 항체 잔류 시간을 결정한다. 일 실시형태에서, 단백질 A에 사용된 선형 속도는 약 150 내지 약 500㎝/시간, 바람직하게는 약 200㎝/시간 내지 약 400㎝/시간, 더 바람직하게는 약 200㎝/시간 내지 약 300㎝/시간, 가장 바람직하게는 약 250㎝/시간이다. 동적 결합 역량은 수지 1리터당 15-50g의 항체의 범위이고, 유속, 정제되는 특정한 항체 및 사용된 단백질 A 매트릭스에 따라 달라진다. 바람직하게는, 칼럼은 수지 1리터당 45g 이하의 항체가 로딩된다. 단백질 A 수지의 동적 결합 역량을 결정하는 방법은 문헌[Fahrner et al. Biotechnol Appl BioChem. 30:121-128 (1999)]에 의해 기재된다. 더 낮은 로딩 유속은 항체 잔류 시간을 증가시키고 더 높은 결합 역량을 촉진할 수 있다. 이것은 또한 사이클마다 더 긴 처리 시간을 생성시키고, 더 적은 사이클을 요하고, 수확된 세포 배양 유체의 뱃치당 더 적은 완충제를 소모한다.
친화도 정제에 대한 다른 예시적인 접근법은 렉틴 친화도 크로마토그래피를 포함하고, 이것은 흐름 통과 방식(원치 않는 글라이코실화를 가지는 생성물은 지지체에 결합하지만, 원치 않는 글라이코실화를 가지지 않는 생성물은 지지체를 통해 통과함) 또는 결합 및 용리 방식(원하는 글라이코실화를 가지는 생성물은 지지체에 결합하지만, 원하는 글라이코실화를 가지지 않는 생성물은 지지체를 통해 통과함)으로 수행될 수 있다.
더 저등의 진핵생물, 예를 들어 피. 파스토리스에서 발현된 단백질은 오로지 또는 주로 만노스(Man) 잔기로 이루어진 O-올리고사카라이드에 의해 변형될 수 있다. 추가로, 더 저등의 진핵생물, 예를 들어 피. 파스토리스에서 발현된 단백질은 N-올리고사카라이드에 의해 변형될 수 있다. 피. 파스토리스 및 다른 진균에서의 N-글라이코실화는 더 고등의 진핵생물에서와 다르다. 심지어 진균 내에, N-글라이코실화는 다르다. 특히, 피. 파스토리스에서의 N 연결 글라이코실화 경로는 에스. 세레비시아에에서 발견된 것과 실질적으로 다르고, 코어 Man8GN2에 대한 더 짧은 Man(알파 1,6) 연장 및 상당한 Man(알파 1,3) 부가의 분명한 결여는 피. 파스토리스에서의 N 연결 글라이칸의 주요 처리 양상을 나타낸다. 몇몇 사항에서, 피. 파스토리스는 통상적인 포유류 고 만노스 글라이코실화 패턴에 가까울 수 있다. 더구나, 피치아 및 다른 진균은 "인간화 당단백질"을 생성하도록 조작될 수 있다(즉, 포유류에서 발견된 필수 글라이코실화 경로, 예컨대 갈락토실화를 대체할 수 있는 효모 균주를 유전적으로 변형시킴).
단백질 생성물의 원하는 또는 원치 않는 O 연결 및/또는 N 연결 글라이코실화 변형에 기초하여, 하나 이상의 렉틴은 흐름 통과 방식 또는 결합 및 용리 방식에서 친화도 크로마토그래피에 선택될 수 있다. 예를 들어, 원하는 단백질이 특정한 O 연결 및/또는 N 연결 만노스 변형이 결여된 경우(즉, 원하는 단백질은 비변형됨), 만노스 모이어티, 예를 들어 Con A, LCH, GNA, DC-SIGN 및 L-SIGN에 결합하는 렉틴은 흐름 통과 방식으로 친화도 정제에 선택될 수 있어서, 원하는 비변형된 생성물은 지지체를 통해 통과하고, 추가의 정제 또는 처리에 이용 가능하다. 반대로, 원하는 단백질이 특정한 O 연결 및/또는 N 연결 만노스 변형을 함유하는 경우(즉, 원하는 단백질은 비변형됨), 만노스 모이어티, 예를 들어 Con A, LCH, GNA, DC-SIGN 및 L-SIGN에 결합하는 렉틴은 결합 및 용리 방식에서 친화도 정제에 선택될 수 있어서, 원하는 변형된 생성물은 지지체에 결합하고, 원치 않는 비변형된 생성물은 통과한다. 후자의 예에서, 흐름 통과는 버려질 수 있지만, 원하는 변형된 생성물은 추가의 정제 또는 처리에 대해 지지체로부터 용리된다. 동일한 원칙은 균류 발현 시스템에 의해 도입된 다른 글라이코실화 변형을 함유하는 재조합 단백질 생성물에 적용된다.
또 다른 유사 친화도 정제 도구는 '혼합 방식' 크로마토그래피이다. 본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "혼합 방식 크로마토그래피"는 이의 분리를 달성하기 위해 정지상과 분석물질 사이의 상호작용의 하나 초과의 형태를 사용하는 크로마토그래피 방법을 의미하고, 예를 들어 혼합 방식 크로마토그래피에서의 2차 상호작용은 용질의 보유에 기여한다. 혼합 방식 크로마토그래피의 이점은 높은 선택도를 포함하고, 예를 들어 양성, 음성 및 중성 물질은 단일 실행 및 더 높은 로딩 능력에서 분리될 수 있다.
혼합 방식 크로마토그래피는 세라믹 또는 결정질 인회석 매질, 예컨대 수산화인회석(HA) 크로마토그래피 및 불화인회석(FA) 크로마토그래피에서 수행될 수 있다. 다른 혼합 방식 수지는 캅토어드히어, 캅토 MMC(GE Healthcare); HEA 하이퍼셀 및 PPA 하이퍼셀(Pall); 및 토요펄(등록상표) MX-Trp-650M(Tosoh BioScience)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이 크로마토그래피 수지는 더 전통적인 이온 교환 또는 소수성 상호작용 기법에 보완적인 생물분자 선택도를 제공한다.
세라믹 수산화인회석(Ca5(PO4)3OH)2은 단백질, 효소, 핵산, 바이러스 및 다른 거대분자의 분리 및 정제에 사용될 수 있는 인산칼슘의 형태이다. 수산화인회석은 독특한 분리 특성 및 훌륭한 선택도 및 해상도를 가진다. 예를 들어, 이것은 다른 크로마토그래피 및 전기영동 기법에 의해 균일한 것으로 보이는 단백질을 대개 분리시킨다. 염화나트륨 또는 인산나트륨 구배 용리에 의한 세라믹 수산화인회석(CHT) 크로마토그래피는 이합체, 응집체 및 삼출된 단백질 A를 제거하기 위해 단일클론 항체 정제 공정에서 연마 단계로서 사용될 수 있다.
I형 및 II형의 예시적인 수산화인회석(HA) 수착제는 세라믹 및 결정질 재료로부터 선택된다. HA 수착제는 상이한 입자 크기(예를 들어, 1형, Bio-Rad Laboratories)에서 이용 가능하다. 예시적인 실시형태에서, HA 수착제의 입자 크기는 약 10㎛ 내지 약 200㎛, 약 20㎛ 내지 약 100㎛ 또는 약 30㎛ 내지 약 50㎛이다. 특정한 예에서, HA 수착제의 입자 크기는 약 40㎛(예를 들어, CHT, I형)이다.
예시적인 I형 및 II형 불화인회석(FA) 수착제는 세라믹(예를 들어, 비드 유사 입자) 및 결정질 재료로부터 선택된다. 세라믹 FA 수착제는 상이한 입자 크기(예를 들어, 1형 및 2형, Bio-Rad Laboratories)에서 이용 가능하다. 예시적인 실시형태에서, 세라믹 FA 수착제의 입자 크기는 약 20㎛ 내지 약 180㎛, 바람직하게는 약 20 내지 약 100㎛, 더 바람직하게는 약 20㎛ 내지 약 80㎛이다. 일 예에서, 세라믹 FA 매질의 입자 크기는 약 40㎛(예를 들어, 1형 세라믹 FA)이다. 또 다른 예에서, FA 매질은 FA 이외에 HA를 포함한다.
수산화인회석 또는 불화인회석 칼럼으로 샘플을 로딩하기 위해 사용된 유속의 선택, 및 용리 유속은 수산화인회석 또는 불화인회석 흡착제의 유형 및 칼럼 기하구조에 따라 달라진다. 예시적인 일 실시형태에서, 공정 스케일에서, 로딩 흐름 속도는 약 50 내지 약 900㎝/시간, 약 100 내지 약 500㎝/시간, 바람직하게는 약 150 내지 약 300㎝/시간, 더 바람직하게는 약 200㎝/시간으로부터 선택된다.
예시적인 실시형태에서, pH 약 5 내지 pH 약 9, 바람직하게는 pH 약 6 내지 pH 약 8, 더 바람직하게는 pH 약 6.5의 용리 완충제의 pH가 선택된다.
일 실시형태에서, 개시된 정제 공정은 단백질 A 크로마토그래피 후 CHT 수지 상의 수산화인회석(HA) 크로마토그래피를 이용한다. 바람직하게는, 용리는 5mM 인산나트륨 완충제(pH 6.5) 중의 약 0M 내지 1.5M 염화나트륨의 선형 구배(0-100%)로서 수행된다. 용리물의 OD280은 모니터링될 수 있다. 일 실시형태에서, 용리 동안, 피크 최대에 대한 전방 측면에서 0.1 OD로부터의 단일 분획은 수집되고, 이후 일련의 분획, 예를 들어 칼럼 용적의 약 ⅓은 피크 최대로부터 후방 측면에서 0.1 OD로 추가의 순도 분석을 위해 수집된다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 용리는 약 5mM 내지 0.25M 인산나트륨 완충제(pH 6.5)의 선형 구배(0-100%)로서 수행된다. 유출물의 OD280은 모니터링될 수 있다. 용리 동안, 약 1/2 CV의 분획은 추가의 순도 분석을 위해 전방 측면에서 0.1 OD로부터 후방 측면에서 0.1 OD로 수집될 수 있다.
다중클론 항체(예를 들어, 혈청 샘플)는 비특이적 면역글로불린의 동시정제를 막기 위해 항원 특이적 친화도 정제를 요한다. 예를 들어, 마우스 혈청에서의 일반적으로 불과 2-5%의 전체 IgG는 동물을 면역화하기 위해 사용된 항원에 대해 특이적이다. 유용한 항체를 얻기 위해 필요한 정제의 유형(들) 및 정도는 항체에 대한 의도된 용도(들)에 따라 달라진다. 그러나, 표적 항체가 (대부분의 실제 목적을 위해) 제조 샘플에서의 유일한 면역글로불린이므로, 세포주, 예를 들어 하이브리도마 또는 재조합 발현 시스템을 이용하여 개발되고, 복수 또는 세포 배양 상청액으로서 제조된 단일클론 항체는 항원 특이적 친화도 방법을 사용하지 않으면서 완전히 정제될 수 있다.
불순물의 모니터링
생물약제 제품에서의 불순물 및 이의 연관 중간체 및 부형제의 프로파일링은 규제 기대이다. 예를 들어, 미국 식품 의약청의 Genotoxic and Carcinogenic Impurities in Drug Substances and Products: Recommended Approaches를 참조한다. 인간 사용을 위한 의약품에 대한 유럽 의약청(European Medicines Agency; EMEA) 위원회(CHMP)는 또한 Guideline on the Limits of Genotoxic Impurities를 공개하였는데, 이것은 새로운 약물 제품에 대해 그리고 몇몇 경우에 또한 약물 개발 중인 약물 물질에 관해 유럽 당국에 의해 적용된다. 이 가이드라인은, 더 일반적인 접근법에서 불순물을 해결하는, 산업에 대한 국제 규제조화 위원회(International Conference on Harmonization; ICH) 가이드라인: Q3A (R2) Impurities in New Drug Substances, Q3B (R2) Impurities in New Drug Products, and Q3C (R3) Impurities: Residual Solvents를 표시한다.
몇몇 불순물이 약물 제품(즉, 생성물 연관 변이체)과 관련되지만, 기타는 합성, 가공 및 제조 동안 첨가된다. 이 불순물은 몇몇 광범위한 종류에 해당한다: 생성물 연관 변이체; 상류로 도입된 공정 관련 물질; 공정에 걸친 잔류 불순물; 하류로 도입된 공정 관련 잔류 불순물; 및 폐기물로부터 도입된 잔류 불순물.
본 명세서에 사용된 바대로, "생성물 연관 변이체"는 원하는 생성물의 제조에 존재하고 원하는 생성물과 관련된 원하는 생성물(예를 들어, 원하는 다중-아단위 복합체) 이외의 생성물을 의미한다. 예시적인 생성물 연관 변이체는 절두된 또는 신장된 펩타이드를 포함하고, 생성물은 원하는 글라이코실화와 다른 글라이코실화를 가지고(예를 들어, 비글라이코실화 생성물가 원해지는 경우, 임의의 글라이코실화 생성물은 생성물 연관 변이체라 생각될 것임), 복합체는 비정상 화학량론, 부적절한 어셈블리, 비정상 이황화 연결, 비정상 또는 불완전 폴딩, 응집, 프로테아제 절단, 또는 다른 비정상을 가진다. 예시적인 생성물 연관 변이체는 분자 질량(예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 검출됨), 등전점(예를 들어, 등전 포커싱에 의해 검출됨), 전기영동 이동도(예를 들어, 겔 전기영동에 의해 검출됨), 인산화 상태(예를 들어, 질량 분광법에 의해 검출됨), 전하 대 질량 비율(예를 들어, 질량 분광법에 의해 검출됨), 단백질분해 단편의 질량 또는 정체(예를 들어, 질량 분광법 또는 겔 전기영동에 의해 검출됨), 소수화도(예를 들어, HPLC에 의해 검출됨), 전하(예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피에 의해 검출됨), 친화도(예를 들어, 항체의 경우, 원하는 항체가 결합하는 단백질 A, 단백질 G 및/또는 에피토프에 대한 결합에 의해 검출됨), 및 글라이코실화 상태(예를 들어, 항당단백질 항체, 예컨대 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 또는 Ab5에 의해 검출됨) 중 하나 이상의 변경을 나타낼 수 있다. 원하는 단백질이 항체인 경우, 용어 생성물 연관 변이체는 (하기 기재된) 글라이코 중쇄 변이체 및/또는 절반 항체 종을 포함할 수 있다.
예시적인 생성물 연관 변이체는 비정상 이황화 결합을 함유하는 변이체 형태를 포함한다. 예를 들어, 대부분의 IgG1 항체 분자는 전체 16개의 사슬내 및 사슬간 이황화 브릿지에 의해 안정화되고, 이 브릿지는 중쇄 및 경쇄 둘 다에서 IgG 도메인의 폴딩을 안정화시키지만, 사슬간 이황화 브릿지는 중쇄와 경쇄 사이의 회합을 안정화시킨다. 다른 항체 유형은 마찬가지로 특징적인 안정화 사슬내 및 사슬간 이황화 결합을 함유한다. 추가로, 몇몇 항체(본 명세서에 개시된 Ab-A를 함유)는 비정규 이황화 결합이라 불리는 추가적인 이황화 결합을 함유한다. 따라서, 비정상 사슬간 이황화 결합은 추가적인 아단위에 대한 안정화 공유 연결 및/또는 이황화 연결의 부재로 인해 비정상 복잡한 화학량론을 발생시킬 수 있다. 추가로, (사슬간 또는 사슬내이든) 비정상 이황화 결합은 항체의 구조 안정성을 감소시킬 수 있고, 이것은 활성의 감소, 안정성의 감소, 응집체를 형성하는 경향의 증가 및/또는 면역원성의 증가를 발생시킬 수 있다. 비정상 이황화 결합을 함유하는 생성물 연관 변이체는 비환원 변성 SDS-PAGE, 모세관 전기영동, cIEX, 질량 분광법(임의로 유리 시스테인에서 질량 이동을 생성하기 위한 화학 변형으로), 크기 배제 크로마토그래피, HPLC, 광 산란의 변화, 및 당해 분야에 공지된 임의의 다른 적합한 방법을 포함하는 다양한 방식으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 문헌[The Protein Protocols Handbook 2002, Part V, 581-583, DOI: 10.1385/1-59259-169-8:581]을 참조한다.
일반적으로, 투석, 탈염 및 정용여과는 항체를 특정한 완충제로 교환하고 원치 않는 저분자량(MW) 성분을 제거하도록 사용될 수 있다. 특히, 투석 막, 크기 배제 수지 및 고분자량 컷오프(MWCO)를 특징으로 하는 정용여과 장치는 작은 단백질 및 펩타이드로부터 면역글로불린(140kDa 초과)을 분리하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Grodzki, A.C. and Berenstein, E. (2010). Antibody purification: ammonium sulfate fractionation or gel filtration. In: C. Oliver and M.C. Jamur (eds.), Immunocytochemical Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 588:15-26. Humana Press]을 참조한다.
크기 배제 크로마토그래피는 항체 응집체, 단량체 및 단편을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 질량 분광법에 커플링된 크기 배제 크로마토그래피는 항체의 분자량을 측정하기 위해 사용될 수 있다; 항체 접합체, 및 항체 경쇄 및 중쇄.
정제 및 순도 모니터링 방법에서 사용하기 위한 예시적인 크기 배제 수지는 Tosoh Biosciences사제의 TSKgel G3000SW 및 TSKgel G3000SWxl(미국 펜실베니아주 몽고메리빌); Waters사제의 Shodex KW-804, Protein-Pak 300SW 및 BioSuite 250(미국 마이애미주 밀포드); Thermo Scientific사제의 MAbPac(상표명) SEC-1 및 MAbPac TM SCX-10(미국 캘리포니아주 써니베일)을 포함한다.
일 실시형태에서, 크기 배제 크로마토그래피는 정제 공정 동안 불순물 분리를 모니터링하도록 사용된다. 예로서, Tosoh Bioscience사(필라델피아주 킹오브프러시아)의 TSKgel Guard SW x 16 x 40㎜과 연결된, 평형화된 TSKgel GS3000SW 17.8 x 300㎜ 칼럼은, 등용매 방식으로 0.5㎖/분의 유속으로 이동상으로서 100mM 인산나트륨, 200mM 염화나트륨(pH 6.5)을 포함하는 SE-HPLC 완충제를 사용하여, 샘플과 로딩될 수 있다. UV 검출 장치가 구비된 Agilent(캘리포니아주 산타 클라라) 1200 시리즈 HPLC의 사용은 모니터링될 수 있다. 이후, 샘플을 수집하고 원하는 농도, 예를 들어 1㎎/㎖로 희석할 수 있다. 이후, 이의 분획의 희석된 샘플, 예를 들어 30㎕는 SE-HPLC 칼럼으로 로딩될 수 있다. 바람직하게는, 칼럼 성능은 겔 여과 표준품(예를 들어, BioRad)을 사용하여 모니터링된다.
생성물 연관 변이체는 당변이체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바대로, "당변이체"는 때때로 항체 제제에 존재하고 적어도 부분 Fc 서열을 함유하는 글라이코실화 생성물 연관 변이체를 의미한다. 당변이체는 원하는 단백질의 폴리펩타이드 부사슬에 공유 부착된 글라이칸을 함유한다. 당변이체는 원하는 단백질 생성물과 비교하여 "글라이코-헤비" 또는 "글라이코-라이트"일 수 있고, 즉 각각 원하는 단백질과 비교하여 추가적인 글라이코실화 변형을 함유하거나, 원하는 단백질보다 더 적은 글라이코실화 변형을 함유한다. 예시적인 글라이코실화 변형은 N 연결 글라이코실화, O 연결 글라이코실화, C-글라이코실화 및 포스포글라이코실화를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
당변이체는 (일반 폴리펩타이드 사슬에 비해) SDS-PAGE에 의해 관찰 가능한 증가한 또는 감소한 전기영동 이동도, 렉틴 결합 친화도, 항-Fc 항체에 결합하는 항당단백질 항체(예컨대, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 또는 Ab5)에 대한 결합, 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된 바와 같은 당변이체를 함유하는 더 높은 또는 더 낮은 겉보기 분자량의 항체 복합체를 특징으로 한다. 예를 들어, 2011년 8월 31일에 출원된 미국 가출원 제61/525,307호(그 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 포함됨)를 참조한다.
본 명세서에 사용된 바대로, "글라이코실화 불순물"은 원하는 단백질과 상이한 글라이코실화 패턴을 가지는 재료를 의미한다. 글라이코실화 불순물은 원하는 단백질과 동일한 또는 상이한 1차, 2차, 3차 및/또는 4차 구조를 함유할 수 있다. 따라서, 당변이체는 글라이코실화 불순물의 유형이다.
mAb의 글라이코실화를 모니터링하기 위한 분석 방법은 중요한데, 왜냐하면 바이오공정 조건이 예를 들어 고 만노스 유형의 변경, 절두된 형태, 4안테나의 감소 및 3안테나 및 2안테나 구조의 증가, 더 적은 시알릴화된 글라이칸 및 더 적은 글라이코실화를 발생시킬 수 있기 때문이다. 샘플에서의 당변이체의 존재는 당해 분야에 공지된 분석 수단, 예컨대 글라이칸 염색 또는 라벨링, 질량 분광법에 의한 글라이코프로테옴 및 복합당질 분석 및/또는 당단백질 정제 또는 농후화를 이용하여 모니터링될 수 있다. 일 실시형태에서, 당변이체는 항당단백질 항체(예컨대, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 또는 Ab5) 결합 검정, 예를 들어 ELISA, (ForteBio Octet(등록상표)를 사용하여 수행될 수 있는) 광 간섭법, (Farfield AnaLight(등록상표)를 사용하여 수행될 수 있는) 이중 편극 간섭법, (Wyatt DynaPro NanoStar(상표명)를 사용하여 수행될 수 있는) 정적 광 산란, (Wyatt DynaPro NanoStar(상표명)를 사용하여 수행될 수 있는) 동적 광 산란, (Wyatt Calypso II를 사용하여 수행될 수 있는) 조성 구배 다중 각 광 산란, (ProteOn XPR36 또는 Biacore T100을 사용하여 수행될 수 있는) 표면 플라즈몬 공명, 유로퓸 ELISA, 화학전자발광 ELISA, 파 웨스턴 분석, (Mesoscale Discovery를 사용하여 수행될 수 있는) 전자화학발광 또는 다른 결합 검정을 이용하여 분석된다.
일 실시형태에서, 글라이칸 염색 또는 라벨링은 당변이체를 검출하기 위해 사용된다. 예를 들어, 글라이칸 당 기는 과요오드산에 의해 화학적으로 재구조화되어 당 위의 인접 하이드록실을 알데하이드 또는 케톤으로 산화시킬 수 있어서, 이들은 소정의 샘플에서 당단백질을 검출하고 정량화하기에 염료, 예를 들어 과요오드산-쉬프(Schiff)(PAS) 염색에 반응성이다. 과요오드산은 가교결합제에 대해 당을 반응성으로 만들도록 또한 사용될 수 있고, 이것은 검출 또는 정제를 위해 라벨링 분자(예를 들어, 바이오틴) 또는 부동화 지지체(예를 들어, 스트렙타비딘)에 공유로 결합할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 질량 분광법은 샘플에서의 당변이체를 확인하고 정량화하기 위해 사용된다. 예를 들어, 효소 분해는 면역당단백질로부터 올리고사카라이드를 방출하도록 사용될 수 있고, 여기서 올리고사카라이드는 후속하여 형광성 개질제에 의해 유도체화되고, 형광 검출과 커플링된 정상 크로마토그래피에 의해 분할되고, 질량 분광법(예를 들어, MALDI-TOF)에 의해 분석된다. 글라이코프로테오믹스 분석을 위한 기본적인 파이프라인은 당단백질 또는 글라이코펩타이드 농후화, 액체 크로마토그래피(LC)에 의한 다차원 분리, 탠덤 질량 분광법 및 생물정보학을 통한 데이터 분석을 포함한다.
분광 분석은 실험에 따라 예를 들어 엔도글라이카나제 H(엔도 H) 또는 펩타이드-N4-(N-아세틸-베타-글루코스아미닐)아스파라긴 아미다제(PNGase)에 의해 글라이칸의 효소 절단 전에 또는 후에 수행될 수 있다. 추가로, 정량적 비교용 글라이코프로테옴 분석은 세포 배양(SILAC) 시약에서 아미노산에 의한 안정한 동위원소 라벨링에 의한 차등 라벨링에 의해 수행될 수 있다. 더구나, 선택된 반응 모니터링(SRM)에 의한 절대 정량화는 방사성으로 표지된, "무거운" 기준 펩타이드를 사용하여 표적화된 당단백질에서 수행될 수 있다.
일 실시형태에서, 정제 공정 동안 원하는 단백질의 당변이체를 고갈시키거나 선택적으로 농후화시키기 위한 친화도 정제에 대한 렉틴. 렉틴은 구별되는 당 모이어티에 대한 높은 특이성을 가지는 글라이칸 결합 단백질이다. 상업적으로 구입 가능한 렉틴의 비제한적인 목록은 하기 표 3에 제공된다.
Figure pct00005
Figure pct00006
일 실시형태에서, 예를 들어 실행 동안 또는 실행이 완료된 후 발효 공정으로부터 얻은 샘플은 샘플(들)에서의 글라이코실화 불순물의 양 및/또는 유형을 검출하기 위해 항당단백질 항체 (예컨대, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 또는 Ab5) 결합 검정으로 처리된다. 유사하게, 다른 실시형태에서, 정제 공정은 원하는 단백질이 정제된 샘플에서의 글라이코실화 불순물의 양 및/또는 유형을 검출하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 특정한 실시형태에서, 정제 공정에서의 적어도 하나의 크로마토그래피 단계로부터의 용리물의 일부 또는 이의 분획은 항당단백질 항체(예컨대, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 또는 Ab5)와 접촉할 수 있다.
항당단백질 항체(예컨대, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 또는 Ab5) 결합의 수준은 (종래의 크기 배제 크로마토그래피 방법에 기초하여) 용리물 또는 이의 분획에 존재하는 생성물 연관 당변이체 불순물의 수준과 통상적으로 상관되어서, 용리물의 하나 이상의 분획은 당변이체 불순물, 예를 들어 추가의 크로마토그래피 정제에 대한 10% 미만의 당변이체를 가지는 용리물의 선택 분획의 함량에 기초하여 추가의 정제 및 처리에 대해 선택될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 다수의 항당단백질 항체(예컨대, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 또는 Ab5)(즉, 이들 중 2개 이상)는 생성물 연관 당변이체 불순물의 순도를 모니터링하도록 사용될 수 있다.
대안적인 실시형태에서, 소정의 샘플 또는 이의 용리물 또는 분획은 검출된 글라이코실화 불순물의 양 및/또는 유형에 기초하여 버려진다. 훨씬 또 다른 실시형태에서, 소정의 샘플 또는 분획은 검출된 글라이코실화 불순물의 양 및/또는 유형에 기초하여 글라이코실화 불순물을 감소하고/하거나 제거하도록 처리된다. 예시적인 처리는 하기 중 하나 이상을 포함한다: (ⅰ) 글라이코실화를 제거하는 효소 또는 다른 화학 모이어티의 첨가, (ⅱ) 하나 이상의 렉틴 결합 단계를 실행함으로써 글라이코실화 불순물의 제거, (ⅲ) 글라이코실화 불순물을 제거하기 위한 크기 배제 크로마토그래피의 실행.
특정한 실시형태에서, 항당단백질 항체(예컨대, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 또는 Ab5)는 프로브에 접합되고 이후 지지체에 부동화된다. 지지체는 뱃치식이거나 예를 들어 HPLC에 대한 칼럼으로 패키징될 수 있다. 예시적인 프로브는 바이오틴, 알칼리 포스파타제(AP), 겨자무과산화효소(HRP), 루시퍼라제, 플루오레세인(플루오레세인 아이소티오사이아네이트, FITC) 및 로다민(테트라메틸 로다민 아이소티오사이아네이트, TRITC), 녹색 형광성 단백질(GFP) 및 피코빌리단백질(예를 들어, 알로피코사이아닌, 피코사이아닌, 피코에리쓰린 및 피코에리쓰로사이아닌)을 포함한다. 예시적인 지지체는 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘(데글라이코실화 아비딘) 및 자기 비드를 포함한다. 본 발명이 커플링 화학물질에 의해 제한되지 않는다는 것에 주목해야 한다. 바람직하게는, 항당단백질 항체(예컨대, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 또는 Ab5)는 바이오티닐화되고 스트렙타비딘 센서에 부동화된다.
표준 단백질-단백질 상호작용 모니터링 공정은 정제 공정의 다양한 단계로부터의 샘플에서의 항당단백질 항체(예컨대, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 또는 Ab5)와 글라이코실화 불순물 사이의 상호작용을 분석하도록 사용될 수 있다. 예시적인 단백질-단백질 상호작용 모니터링 공정은 (ForteBio Octet(등록상표)를 사용하여 수행될 수 있는) 광 간섭법, (Farfield AnaLight(등록상표)를 사용하여 수행될 수 있는) 이중 편극 간섭법, (Wyatt DynaPro NanoStar(상표명)를 사용하여 수행될 수 있는) 정적 광 산란, (Wyatt DynaPro NanoStar(상표명)를 사용하여 수행될 수 있는) 동적 광 산란, (Wyatt Calypso II를 사용하여 수행될 수 있는) 조성 구배 다중 각 광 산란, (ProteOn XPR36 또는 Biacore T100을 사용하여 수행될 수 있는) 표면 플라즈몬 공명, ELISA, 화학전자발광 ELISA, 유로퓸 ELISA, 파 웨스턴 분석, (Mesoscale Discovery를 사용하여 수행될 수 있는) 화학발광 또는 다른 결합 검정을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
광 간섭법은, 간섭 패턴의 이동(즉, 바이오센서 선단에 결합한 분자의 수의 변화에 의해 생김) 에 기초한 생물분자 상호작용을 측정하여서, 결합 특이성, 결합 및 해리 속도, 또는 농도에 관한 정보를 제공하는, 2개의 표면(바이오센서 선단 상의 부동화 단백질의 층 및 내부 기준 층)으로부터 반사된 백색 광의 간섭 패턴을 분석하는 광학 분석 기법이다.
이중 편극 간섭법은 상부 감지 도파관, 및 교대 직각 편광 레이저 빔에 의해 리프팅된 하부 광학 기준 도파관을 가지는 이중 슬랩 도파관 센서 칩에 기초한다. 2개의 다른 도파관 방식, 구체적으로, 가로 자기(TM) 방식 및 가로 전기(TE) 방식이 생성된다. 방식 둘 다는 상부 감지 도파관 표면에서 표면장을 생성하고, 이 표면과 접촉하는 재료를 프로빙한다. 재료가 센서 표면과 상호작용하면서, 이것은 간섭 무늬의 상 변화를 발생시킨다. 이후, 각각의 방식에 대한 간섭 무늬 패턴은 RI 및 두께 값으로 수확적으로 해상된다. 따라서, 센서는 센서 표면에서 극도로 미묘한 분자 변화를 측정할 수 있다.
정적 광 산란(static light scattering; SLS)은 비침윤성 기법이고, 여기서 용액 중의 단백질 샘플의 절대 분자 질량은 저강도 레이저 광(690㎚)에 대한 노출을 통해 5%보다 우수한 정확도로 실험적으로 결정될 수 있다. 산란된 광의 강도는 각의 함수로서 측정되고, 몰 질량, 제곱 평균 제곱근의 반지름 및 제2 비리얼 계수(A2)를 생성하도록 분석될 수 있다. SLS 실험의 결과는 용액 올리고머 상태(단량체/이합체 등)의 결정 이외에 (예를 들어, 구조 연구를 위해) 단백질 제제 중의 품질 관리로서 사용될 수 있다. SLS 실험은 뱃치 또는 크로마토그래피 방식으로 수행될 수 있다.
동적 광 산란(또한 준탄성 광 산란, QELS 또는 광자상관법(photon correlation spectroscopy; PCS)으로 공지됨)은 (정적 광 산란에 의해 측정된 시간-평균 강도와 비교된) 실시간 강도에 기초한 분자의 유체역학 크기 및 마이크론 이하 입자를 측정하기 위한 기법이다. 매질 중의 입자로부터 산란된 광의 변동(일시적 변동, 통상적으로 마이크로초 내지 ms의 시간 스케일임)은 상관 지연 시간 도메인에서 기록되고 분석된다. 입자는 고체 입자(예를 들어, 금속 산화물, 미네랄 조각 및 라텍스 입자) 또는 현탁액 중의 부드러운 입자(예를 들어, 베시클 및 미셀) 또는 용액 중의 거대분자 사슬(예를 들어, 합성 중합체 및 바이오재료)일 수 있다. 입자의 확산 속도가 소정의 환경에서 이의 크기에 의해 결정되므로, 이의 크기에 대한 정보는 산란된 광의 변동의 속도에 함유된다.
소분자의 산란 강도는 분자량의 제곱에 비례한다. 그러므로, 동적 및 정적 광 산란 기법은 단백질 응집의 개시 및 조건의 미묘한 변화로부터 생긴 단백질 구조의 다른 변화에 매우 민감하다.
조성 구배 다중 각 광 산란(CG-MALS)은 거대분자 상호작용, 예컨대 단백질의 가역적 자가 및 이종 회합, 반응 속도 및 비가역적 응집의 친화도, 또는 비리얼 계수를 규명하기 위해 상이한 조성 또는 농도의 일련의 미분별화 샘플을 이용한다. 이러한 측정은 특정한 가역적 복합체 결합(예를 들어, K d , 화학량론, 자가 및/또는 이종 회합), 비특이적 상호작용(예를 들어, 자가 및 교차 비리얼 계수), 응집 및 다른 시간 의존적 반응(예를 들어, 중지-흐름 동역학 및 t) 및 Zimm 도면(예를 들어, M W , A 2 , A 3 (제2 및 제3 비리얼 계수), 또는 r g 를 결정하기 위한 농도 구배)에 대한 정보를 제공한다.
전체 내부 반사의 조건 하에 편광이 상이한 굴절률의 매질(즉, 센서 표면의 유리(고굴절률) 및 완충제(저굴절률)) 사이의 계면에서 전기 전도(예를 들어, 금) 층을 칠 때 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상이 발생한다. 입사각의 범위를 포함하는 편광의 웨지는 센서 표면의 유리 면에 지향된다. 광이 유리를 칠 때 생성되는 전기장 강도(즉, 소멸파)는 금 층에서의 자유 전자 클라우드와 상호작용하고 이에 의해 흡수되어서, 플라즈몬이라 불리는 전자 전하 밀도 파를 생성하고 반사된 광의 강도의 감소를 발생시킨다. 이 강도 최소가 발생하는 공명 각은 센서 표면의 반대 면에서 금 층에 가까운 용액의 굴절률의 함수이다. 반사된 광은 모니터링 장치, 예를 들어 ProteOn XPR36 또는 Biacore 시스템에 의해 검출된다. 동역학(즉, 복합체 형성(ka) 및 해리(kd)의 속도), 친화도(예를 들어, KD) 및 농도 정보는 플라즈몬 판독에 기초하여 결정될 수 있다.
이것 및 다른 단백질-단백질 상호작용 모니터링 공정으로부터 얻은 정보는 예를 들어 효소/저해제의 결합 친화도 및 화학량론 또는 항체/항원 상호작용 또는 당단백질/렉틴 상호작용을 정량화하기 위해; 단백질-단백질 상호작용에 대한 소분자의 영향을 연구하기 위해; 제제 안정성 및 점도를 개선하는 완충 매개변수를 조정하기 위해; 항체 정제를 최적화하고, 제제에 대한 큰 부형제의 효과를 이해하기 위해; 중합 또는 단백질 회합에 대한 용매 이온 농도, pH 또는 부형제의 영향을 정량화하기 위해; 자가 어셈블리 및 응집의 동역학을 측정하기 위해; 및 광범위한 완충제 조성, 시간 및 온도 스케일에 걸쳐 거대분자 결합 친화도 및 연관 복합체 잡한 화학량론을 규명하기 위해 사용될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, (당변이체 불순물의 양과 상관되는) 항당단백질 항체(예컨대, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 또는 Ab5) 결합의 수준은 임의로 겨자무과산화효소 또는 유로퓸 검출과 함께 ELISA를 사용하여 결정된다.
상류로 도입된 예시적인 공정 관련 불순물은 세포 용해 후 관심 있는 단백질과 발견되는 원치 않는 세포 성분인 핵산(예를 들어, DNA 및 RNA) 및 숙주 세포 단백질(host cell protein; HCP)을 포함한다. 이 공정 관련 불순물은 박테리아 오염을 제어하고 숙주 유기체에서 선택적 압력을 유지시키기 위해 세포-배양 배지에 상류로 첨가된 항생제를 또한 포함한다. 예시적인 항생제는 카나마이신, 암피실린, 페니실린, 암포테리신 B, 테트라사이클린, 황산겐타마이신, 하이그로마이신 B 및 플라스모신을 포함한다.
공정 동안 생긴 예시적인 잔류 불순물은 단계 중 일부가 더 효율적이게 만들고 생성물의 수율을 증가시키는 공정에 걸쳐 첨가된 공정 증대 물질 또는 촉매를 포함한다. 예를 들어, 구아니딘 및 유레아는 발효 생산량의 가용화를 위해 첨가되고, 글루타티온 및 다이티오트레이톨(DTT)은 단백질의 환원 및 재폴딩 동안 사용된다.
하류에 도입된 예시적인 공정 관련 불순물은 공정으로부터 청소되어야 하는 표적 단백질, 및 액체-액체 계면에서 흡착함으로써 표면 장력을 저하시킴으로써 공정 스트림으로부터 단백질, 펩타이드 및 핵산을 분리하는 것을 돕도록 하류 처리 동안 첨가되는 계면활성제(예를 들어, Triton-X, Pluronic, Antifoam-A, B, C, Tween 또는 폴리소르베이트)의 크로마토그래피 정제에 필요한 화학물질 및 시약(예를 들어, 알콜 및 글라이콜)을 포함한다.
폐기물로부터 도입된 예시적인 잔류 불순물은, 과도한 조건(예를 들어, 가혹한 용매 또는 승온) 하에 성분으로부터 추출될 수 있고 약물 제품을 오염시킬 가능성을 가지는 화합물인 "추출물", 및 정상 조건 하에 또는 때때로 가속 조건 하에 제형과의 직접 접촉의 결과로서 성분으로부터 약물 제품 제형으로 여과시키는 화합물인 "여과물"을 포함한다. 여과물은 추출물의 하위집단일 수 있다. 추출물은 사용된 성분이 적절한 정도로 제어되어야 한다. 여과물은 약물 제품에 불순물이 섞이지 않도록 제어되어야 한다.
상기 기재된 본 발명을 추가로 설명하기 위해, 하기 비제한적인 실시예가 제공된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 어떻게 만들고 사용하는지의 완전한 개시내용 및 설명을 당해 분야의 당업자에게 제공하도록 기재되어 있고, 본 발명으로 간주되는 것의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도, 농도 등)와 관련하여 정확성을 보장하도록 노력이 이루어지지만, 약간의 실험 오차 및 편차가 허용되어야 한다. 달리 표시되지 않은 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이고, 온도는 섭씨이고; 압력은 대기압이거나 그 근처이다.
실시예 1: 항당단백질 항체를 생성하기 위한 토끼의 면역화
Ab-A는 (하기 실시예에 추가로 기재된) 피. 파스토리스에서 발현된 인간화 IgG1 항체이다. Ab-A의 약간의 제제는, 이용된 배양 조건 및 정제 단계에 따라, 만노실화 Ab-A의 다양한 검출 가능한 수준을 함유하는 것으로 관찰되었다. 하기 추가로 기재된 바대로, 렉틴 기반 결합 검정 또는 본 명세서에 개시된 항당단백질 항체를 사용하여 이 만노실화 항체를 검출할 수 있었다.
Ab-A 당변이체가 고도로 농후화된 항체 제제를 제조하도록 Ab-A 롯트 2를 제조하였다. 청징된 발효 브로쓰를 단백질 A 친화도 정제, 이어서 세라믹 수산화인회석(CHT) 크로마토그래피로 처리하였다. (만노실화 항체가 고도로 농후화된 것으로 알려진 SE-HPLC 단계로부터의 분획을 정량화함으로써) 분석 SE-HPLC에 의해 상대 당변이체 함량을 결정하도록 분획을 평가하였다. 당변이체가 농후화된 CHT 분획을 등용매 용리 완충제로서 DPBS(Hyclone)를 사용하여 Superdex 200(GE healthcare) 칼럼에서 분취용 겔-여과 크로마토그래피에 의해 추가로 농후화시켰다.
이후, Ab-A 롯트 2를 사용하여 토끼를 면역화하였다. 면역화는 완전 프로인트 보조제(CFA)(Sigma) 중의 100㎍의 키홀-림펫 헤모사이아닌(keyhole limpet hemocyanin; KLH)과 혼합된 100㎍의 항원의 제1 피하(sc) 주사, 이어서 2주 떨어진 2개의 부스트로 이루어지고, 각각은 불완전 프로인트 보조제(IFA)(Sigma) 중에 50㎍과 혼합된 50㎍ 항원을 함유한다. 동물을 55일에 사혈시키고, 혈청 역가를 ELISA (항원 인식)에 의해 결정하였다.
항체 선택 역가 평가
만노실화 단백질에 결합하는 항체를 확인하고 규명하기 위해, 항체 함유 용액을 ELISA에 의해 시험하였다. 간단히 말하면, 뉴트라비딘 코팅된 플레이트(Thermo Scientific)를 실온에서 대략 1시간 동안 또는 대안적으로 4℃에서 밤새 ELISA 완충제(PBS(pH 7.4) 중의 0.5% 어류 피부 젤라틴) 중에 희석된 바이오티닐화 만노실화 항체(웰당 50㎕, 1㎍/㎖)에 의해 코팅하였다. 이후, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 ELISA 완충제에 의해 추가로 차단하고, 세척 완충제(PBS, 0.05% tween 20)를 사용하여 세척하였다. 시험된 혈청 샘플을 ELISA 완충제를 사용하여 연속으로 희석하였다. 50마이크로리터의 희석된 혈청 샘플을 웰로 옮기고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이 항온처리 후, 플레이트를 세척 완충제에 의해 세척하였다. 전개 동안, 염소 항토끼 Fc-특이적 HRP 접합된 다중클론 항체(ELISA 완충제 중에 1:5000 희석)를 웰에 첨가하고, 실온에서 45분 동안 항온처리하였다. 세척 용액에 의한 3회 세척 단계 후, 플레이트를 실온에서 2분 동안 TMB 기질을 사용하여 전개시키고, 반응물을 0.5M HCl을 사용하여 켄칭하였다. 웰 흡광도를 450㎚에서 판독하였다.
조직 수확
허용 가능한 역가가 확립되면, 토끼(들)를 희생시켰다. 비장, 림프절 및 전혈을 수확하고 하기한 바대로 처리하였다:
조직을 절단하고 20㏄ 주사기의 플런저에 의해 70㎛(Fisher)에서 무균 와이어 메쉬를 통해 밀어서 비장 및 림프절을 단일 세포 현탁액으로 처리하였다. 세포를 PBS 중에 수집하였다. 세포를 원심분리에 의해 2회 세척하였다. 마지막 세척 후, 세포 밀도를 트립판 블루에 의해 결정하였다. 이후, 세포를 1500rpm에서 10분 동안 원심분리하고; 상청액을 버렸다. 세포를 FBS(Hyclone) 중의 적절한 용적의 10% 다이메틸 설폭사이드(DMSO, Sigma) 중에 재현탁시키고 1㎖/바이알로 분배하였다. 바이알을 저속 동결 챔버에서 -70℃에서 24시간 동안 저장하고 액체 질소에서 저장하였다.
전혈을 FBS 없이 상기 기재된 저 글루코스 배지의 동일 부와 혼합함으로써 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단리하였다. 35㎖의 전혈 혼합물을 45㎖ 원뿔 관(Corning)으로 8㎖의 림포라이트 래빗(Lympholyte Rabbit)(Cedarlane)에 조심스럽게 레이어링하고, 브레이크 없이 실온에서 2500rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, PBMC 층을 유리 파스퇴르 피펫(VWR)을 사용하여 조심스럽게 제거하고 합하고 깨끗한 50㎖ 바이알에 위치시켰다. 세포를 1500rpm에서 실온에서 10분 동안 원심분리에 의해 상기 기재된 변형 배지에 의해 세척하고, 세포 밀도를 트립판 블루 염색에 의해 결정하였다. 마지막 세척 후, 세포를 적절한 용적의 10% DMSO/FBS 배지 중에 재현탁시키고 상기 기재된 바대로 동결시켰다.
B 세포 선택, 농후화 및 배양 조건
B 세포 배양의 설정 일에, PBMC, 비장세포 또는 림프절 바이알을 사용을 위해 해동시켰다. 바이알을 LN2 탱크로부터 제거하고, 해동까지 37℃ 물 욕에서 위치시켰다. 바이알의 내용물을 15㎖ 원뿔 원심분리 관(Corning)으로 옮기고, 상기 기재된 10㎖의 변형 RPMI를 관에 천천히 첨가하였다. 세포를 2K RPM에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 세포를 10㎖의 새로운 배지 중에 재현탁시켰다. 세포 밀도 및 생존능력을 트립판 블루에 의해 결정하였다.
세포를 하기와 같이 바이오티닐화 만노실화 단백질에 의해 예비혼합하였다. 세포를 다시 세척하고 1E07 세포/80㎕ 배지에서 재현탁시켰다. 바이오티닐화 만노실화 단백질을 5㎍/㎖의 최종 농도로 세포 현탁액에 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. PBF(Ca/Mg 비함유 PBS(Hyclone), 2mM 에틸렌다이아민 테트라아세트산(EDTA), 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)(Sigma-바이오틴 비함유))를 사용하여 2회 10㎖ 세척을 수행하여 비결합 바이오티닐화 만노실화 단백질을 제거하였다. 제2 세척 후, 세포를 1E07 세포/80㎕ PBF에서 재현탁시키고, 10E7 세포마다 20㎕의 MACS(등록상표) 스트렙타비딘 비드(Miltenyi Biotec(캘리포니아주 오번))를 세포 현탁액에 첨가하였다. 세포 및 비드를 4℃에서 15분 동안 항온처리하고, 10E7 세포마다 2㎖의 PBF에 의해 1회 세척하였다.
대안적으로, 만노실화 단백질을 하기와 같이 스트렙타비딘 비드에 예비로딩하였다. 75마이크로리터의 스트렙타비딘 비드(Miltenyi Biotec(캘리포니아주 오번))를 N 말단 바이오티닐화 만노실화 단백질(10㎍/㎖ 최종 농도) 및 300㎕ PBF와 혼합하였다. 이 혼합물을 4℃에서 30분 동안 항온처리하고, 비결합 만노실화 단백질을 MACS(등록상표) 분리 칼럼(Miltenyi Biotec)을 사용하여 1㎖ 세정에 의해 제거하여 비결합 재료를 제거하였다. 이후, 재료를 플런징하고, 이후 1E7 세포마다 100㎕ 중에 상기로부터 세포를 재현탁시키도록 사용하고, 이후 혼합물을 4℃에서 30분 동안 항온처리하고, 10㎖의 PBF에 의해 1회 세척하였다.
프로토콜 둘 다에 대해 하기를 적용하였다: 세척 후, 세포를 500㎕의 PBF 중에 재현탁시키고 치워 두었다. MACS(등록상표) MS 칼럼(Miltenyi Biotec(캘리포니아주 오번))을 자기 스탠드(Miltenyi)에서 500㎖의 PBF에 의해 예비세정하였다. 세포 현탁액을 프리필터를 통해 칼럼에 적용하고, 비결합 분획을 수집하였다. 칼럼을 2.5㎖의 PBF 완충제에 의해 세척하였다. 칼럼을 자석 스탠드로부터 제거하고, 깨끗한 무균 1.5㎖ 에펜도르프 관에 위치시켰다. 1㎖의 PBF 완충제를 칼럼의 상부에 첨가하고, 양성 선택된 세포를 수집하였다. 양성 세포 분획의 수율 및 생존능력을 트립판 블루 염색에 의해 결정하였다. 양성 선택은 평균 1%의 출발 세포 농도를 생성시켰다.
배양에 대한 시딩 수준에서 정보를 제공하도록 파일럿 세포 스크린을 확립하였다. 플레이트를 10개, 25개, 50개, 100개 또는 200개의 농후화된 B 세포/웰에서 시딩하였다. 또한, 각각의 웰은 250㎕/웰의 최종 용적에서 높은 글루코스 변형 RPMI 배지에서 조사된 EL-4.B5 세포(5,000Rad)의 웰당 50K 세포 및 적절한 수준의 활성화 토끼 T 세포 상청액(미국 특허 제출원 공보 제20070269868 참조)(제조에 따라 1-5% 범위)을 함유하였다. 배양물을 4% CO2에서 37℃에서 5 내지 7일 동안 항온처리하였다.
항원-인식(ELISA)에 의한 B 세포 배양 스크리닝
만노실화 단백질에 특이적인 항체를 생성하는 웰을 확인하기 위해, 2단계 절차를 사용하였다. 제1 단계에서, 항원-인식(ELISA)에 의한 혈청 샘플의 역가 결정에 기재된 바와 같은 동일한 프로토콜을 하기 변화로 사용하였다. 간단히 말하면, 뉴트라비딘 코팅된 플레이트를 바이오티닐화 만노실화 단백질(웰당 50㎕, 각각 1㎍/㎖)에 의해 코팅하였다. B 세포 상청액 샘플(50㎕)을 예비 희석 없이 시험하였다. 제2 단계에서, 뉴트라비딘 플레이트를 코딩하도록 만노스가 없는 것을 제외하고는, 제1 단계에서 사용된 것과 동일한 서열의 바이오티닐화 단백질을 사용하였다. 만노실화가 없는 단백질은 포유류 세포(예를 들어, CHO 세포, 인간 신장 세포 또는 기타)를 사용하여 또는 박테리아 발현 시스템을 사용하여 제조될 수 있다. 제2 검정에서의 반응성은 항체 특이성이 만노스 구조보다 단백질에 대한 것이라는 것을 나타낼 것이고, 이러한 항체는 이후 폐기될 것이다.
항원 특이적 B 세포의 단리
관심 있는 웰을 함유하는 플레이트를 -70℃로부터 제거하고, 웰마다 200마이크로리터의 배지(10% RPMI 완전, 55μM BME)의 5회 세척을 이용하여 각각의 웰로부터의 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 원심분리에 의해 펠렛화하고, 상청액을 조심스럽게 제거하였다. 펠렛화된 세포를 100㎕의 배지 중에 재현탁시켰다. 항체 발현 세포를 확인하기 위해, 스트렙타비딘 코팅된 자기 비드(M280 Dynabeads, Invitrogen)를 N 및 C 말단 바이오티닐화 만노실화 단백질 둘 다의 조합에 의해 코팅하였다. 개별 바이오티닐화 만노실화 단백질 롯트를 연속 희석에 의해 최적화하였다. 이후, 대략 4x10E7개의 코팅된 비드를 함유하는 100마이크로리터를 재현탁된 세포와 혼합하였다. 이 혼합물에 배지 중에 희석된 15마이크로리터의 염소 항토끼 H&L IgG-FITC(잭슨 이뮤노리서치)를 첨가하였다.
20마이크로리터의 세포/비드/항토끼 H&L 현탁액을 제거하고, 마이크로리터 액적을 Sigmacote(Sigma)에 의해 이전에 처리된 1웰 유리 슬라이드에 분배하고, 슬라이드마다 총체가 35 내지 40액적이다. 파라핀 오일(JT Baker)의 불투과성 장벽을 액적을 침지하도록 사용하고, 슬라이드를 암소에서 4% CO2 항온처리기에서 37℃에서 90분 동안 항온처리하였다.
항체를 생성하는 특이적 B 세포를 항체 분비에 의해 생성된 세포 주위의 형광성 고리, 비드 연관 바이오티닐화 항원의 인식 및 형광성-IgG 검출 시약에 의한 후속적인 검출에 의해 확인할 수 있다. 관심 있는 세포가 확인되면, 이것을 마이크로조작장치(Eppendorf)를 통해 회수하였다. 항체를 합성하고 분비하는 단일 세포를 원심분리 관으로 옮기고, 드라이아이스를 사용하여 동결시키고 -70℃에서 저장하였다.
항원 특이적 B 세포로부터의 항체 서열의 증폭 및 서열 결정
단일 단리된 B 세포로부터 조합된 RT-PCR 기반 방법을 이용하여 항체 서열을 회수하였다. 제한 효소를 함유하는 프라이머는 표적 면역글로불린 유전자(중쇄 및 경쇄), 예컨대 토끼 면역글로불린 서열의 보존된 및 불변 영역에서 어닐링하도록 설계되고, 2단계 네스팅된 PCR 회수는 항체 서열을 증폭하도록 사용되었다. 각각의 웰로부터의 앰플리콘을 회수 및 크기 통합을 위해 분석하였다. 이후, 서열 클론성을 핑거프린팅하기 위해 생성된 단편을 AluI에 의해 분해하였다. 동일한 서열은 이의 전기영동 분석에서 흔한 단편화 패턴을 나타냈다. 이후, 원래의 중쇄 및 경쇄 앰플리콘 단편을 PCR 프라이머 내에 함유된 제한 효소 부위를 사용하여 분해하고, 발현 벡터로 클로닝하였다. 서브클로닝된 DNA 단편을 함유하는 벡터를 증폭하고 정제하였다. 서브클로닝된 중쇄 및 경쇄의 서열을 발현 전에 검증하였다.
원하는 항원 특이성 및/또는 기능적 특성의 단일클론 항체의 재조합 제조
특이적 B 세포로부터 회수된 항체의 항원 특이성 및 기능적 특성을 결정하기 위해, 원하는 쌍 지은 중쇄 및 경쇄 서열의 발현을 추진시키는 벡터를 CHO 세포, 인간 신장 세포 또는 다른 포유류 세포로 형질감염시켰다.
ELISA에 의한 재조합 항체의 항원-인식
만노실화 폴리펩타이드에 결합하는 능력에 대해 재조합 발현된 항체를 규명하기 위해, 항체 함유 용액을 ELISA에 의해 시험하였다. 모든 항온처리를 실온에서 수행하였다. 간단히 말하면, 뉴트라비딘 플레이트(Thermo Scientific)를 만노실화 폴리펩타이드 함유 용액(PBS 중의 1㎍/㎖)에 의해 2시간 동안 코팅하였다. 이후, 만노실화 바이오티닐화, 폴리펩타이드코팅된 플레이트를 세척 완충제(PBS, 0.05% Tween-20)에 의해 3회 세척하였다. 이후, 플레이트를 차단 용액(PBS, 0.5% 어류 피부 젤라틴, 0.05% Tween-20)을 사용하여 대략 1시간 동안 차단하였다. 이후, 차단 용액을 제거하고, 이후 플레이트를 대략 1시간 동안 시험되는 항원의 희석 시리즈와 항온처리하였다. 이 항온처리의 종료 시, 플레이트를 세척 완충제에 의해 3회 세척하고, 대략 45분 동안 2차 항체 함유 용액(퍼옥시다제 접합 어피니퓨어 Fc 단편 특이적 염소 항토끼 IgG(잭슨 이뮤노리서치))과 추가로 항온처리하고, 3회 세척하였다. 이 시점에, 기질 용액(TMB 퍼옥시다제 기질, BioFx)을 첨가하고, 암소에서 3 내지 5분 동안 항온처리하였다. HCl 함유 용액(0.5M)을 첨가하여 반응을 중단하고, 플레이트-판독기에서 플레이트를 450㎚에서 판독하였다.
실시예 2: 5개의 항당단백질 항체의 클로닝 및 서열분석
5개의 토끼 항당단백질 항체의 가변 중쇄 및 경쇄를 단리된 토끼 B 세포로부터 증폭시키고, 각각을 토끼 IgG 불변 도메인에 의해 인프레임으로 클로닝하였다. 5개 항당단백질 항체는 본 명세서에서 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 및 Ab5라 불리고; 이의 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 서열은 도 1-4에 제공되고, 가변 영역, 프레임워크 영역(FR), 상보성 결정 영역(CDR) 및 불변 도메인의 이의 하위서열 및 서열 번호는 도 5-12에 제공된다. 전장 Ab1 폴리펩타이드는 서열 번호 1의 중쇄 폴리펩타이드 및 서열 번호 21의 경쇄 폴리펩타이드로 이루어진다. 전장 Ab2 폴리펩타이드는 서열 번호 41의 중쇄 폴리펩타이드 및 서열 번호 61의 경쇄 폴리펩타이드로 이루어진다. 전장 Ab3 폴리펩타이드는 서열 번호 81의 중쇄 폴리펩타이드 및 서열 번호 101의 경쇄 폴리펩타이드로 이루어진다. 전장 Ab4 폴리펩타이드는 서열 번호 121의 중쇄 폴리펩타이드 및 서열 번호 141의 경쇄 폴리펩타이드로 이루어진다. 전장 Ab5 폴리펩타이드는 서열 번호 161의 중쇄 폴리펩타이드 및 서열 번호 181의 경쇄 폴리펩타이드로 이루어진다.
실시예 3: 항당단백질 항체의 발현
항체 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 및 Ab5는 배양된 포유류 세포(예를 들어, CHO 세포, 인간 신장 세포주 등)에서 발현된다. 추가로, 항체는 본질적으로 하기한 바대로 피치아 파스토리스에서 발현된다. 임의로 각각의 유전자의 하나 초과의 카피를 함유하는, 적합한 프로모터의 제어 하에 각각의 개별 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 통합 유전자를 함유하는 피. 파스토리스 균주를 제조한다(미국 공보 제2013/0045888호(그 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 포함됨) 참조). 정확한 통합은 써던 블로팅에 의해 검증되고, 항체 발현 및 분비는 웨스턴 블로팅에 의해 검증된다. 항체 제조를 위해, 접종원을 하기 영양소(%w/v)를 함유하는 배지 중에 증식시켰다: 효모 추출물 3%, 무수 덱스트로스 4%, YNB 1.34%, 바이오틴 0.004% 및 100mM 인산칼륨. 발효기에 대해 접종원을 생성하기 위해, 세포를 30℃ 및 300rpm에서 진탕 항온처리기에서 대략 24시간 동안 증식시켰다. 이후, 10% 접종원을 1리터의 무균 성장 배지를 함유하는 Labfors 2.5ℓ 워킹 용적 용기에 첨가하였다. 성장 배지는 하기 영양소를 함유한다: 황산칼륨 18.2g/ℓ, 인산암모늄 일염기성 36.4g/ℓ, 인산칼륨 이염기성 12.8g/ℓ, 황산마그네슘 6수화물 3.72g/ℓ, 시트르산나트륨 2수화물 10g/ℓ, 글라이세롤 40g/ℓ, 효모 추출물 30g/ℓ, PTM1 미량 금속 4.35㎖/ℓ 및 소포제 204 1.67㎖/ℓ. PTM1 미량 금속 용액은 하기 성분을 함유한다: 황산동 5수화물 6g/ℓ, 요오드화나트륨 0.08g/ℓ, 황산망간 수화물 3g/ℓ, 몰리브덴산나트륨 2수화물 0.2g/ℓ, 붕산 0.02g/ℓ, 염화코발트 0.5g/ℓ, 염화아연 20g/ℓ, 황산제1철 7수화물 65g/ℓ, 바이오틴 0.2g/ℓ 및 황산 5㎖/ℓ.
바이오반응기 공정 제어 매개변수를 하기와 같이 설정한다: 교반 1000rpm, 분당 기류 1.35 표준 리터, 온도 28℃ 및 pH를 산화암모늄을 사용하여 (6에서) 조정하였다. 산소 보충이 제공되지 않았다.
초기 글라이세롤이 용존 산소 스파이크에 의해 표시된 바대로 소모될 때까지, 발효 배양을 대략 12 내지 16시간 동안 성장시켰다. 배양물을 용존 산소 스파이크 후 대략 3시간 동안 임의로 기아시켰다. 이 임의의 기아 기간 후, 에탄올의 볼루스 첨가를 반응기에 첨가하여 1% 에탄올(w/v)에 도달하였다. 발효 배양물은 임의로 15 내지 30분 동안 평형화되게 하고, 이후 공급물 첨가는 개시되고 40분 동안 1㎖/분의 일정한 속도로 설정되고, 이후 공급 펌프는 에탄올 센서에 의해 제어되어 에탄올 감지 프로브(Raven Biotech)를 사용하여 실행의 나머지에 대해 1%에서 에탄올의 농도를 유지시켰다. 공급물은 하기 성분으로 이루어진다: 효모 추출물 50g/ℓ, 덱스트로스 1수화물 500g/ℓ, 황산마그네슘 7수화물 3g/ℓ 및 PTM1 미량 금속 12㎖/ℓ. 임의로, 시트르산나트륨 2수화물(0.5g/ℓ)을 또한 공급물에 첨가하였다. 전체 발효 시간은 대략 80-90시간이다.
이후, 항체를 단백질 A 친화도에 의해 정제하였다. 수확된 발효 또는 다른 세포 배양 브로쓰로부터의 청징된 상청액을 동일한 용적의 평형 완충제(20mM 히스티딘, pH 6)에 의해 희석하였다. 이 희석된 브로쓰로부터, 20㎖를 이후 예비평형화된 1㎖ HiTrap MabSelect Sure 칼럼(GE, Piscataway, NJ)으로 로딩하였다. 20 칼럼 용적(CV)의 DPBS를 사용하여 칼럼을 후속하여 세척하였다. 칼럼에 결합한 항체를 2 CV 구배를 사용하여 용리시키고, 8 CV를 100% 용리 완충제(100mM 시트르산 pH 3.0) 중에 유지시켰다. 일 CV 분획을 수집하고, 2M Tris 완충제(pH 8.0)를 사용하여 즉시 중화시켰다. 280nM에서의 흡광도를 측정함으로써 단백질 함유 분획을 결정하고, 단백질 함유 분획을 혼주하고, DPBS로 투석하였다.
항체 순도를 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피(SE-HPLC)에 의해 임의로 결정하였다. 간단히 말하면, UV 검출 장치가 구비된 Agilent(캘리포니아주 산타 클라라) 1200 시리즈 HPLC를 사용하였다. 샘플 분리를 위해, Tosoh Bioscience사(필라델피아주 킹오브프러시아)의 TSKgel Guard SWxl 6x40mM과 연결된 TSKgel GS3000SW l 7.8x300mM 칼럼을 사용하였다. 100mM 인산나트륨, 200mM 염화나트륨(pH 6.5)을 등용매 방식으로 0.5㎖/분의 유속으로 이동상으로서 사용하고, UV 215㎚에서의 흡광도를 모니터링하였다. 샘플의 주입 전에, 안정한 기준선이 달성될 때까지 칼럼을 평형화시켰다. 샘플을 이동상을 사용하여 1㎎/㎖의 농도로 희석하고, 30㎕의 용적을 주입하였다. 칼럼 성능을 모니터링하기 위해, BioRad(Hercules, CA) 겔 여과 표준품을 사용하였다.
실시예 4: 항당단백질 항체를 사용한 ELISA 검정
이 실시예는 ELISA 검정에서 당단백질(구체적으로, 만노스 함유 항체)의 검출을 위한 항체 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 및 Ab5의 사용을 기재한다. 결과는 만노실화 항체의 민감한 검출을 입증하고, Ab1은 더 큰 민감성을 나타내고, 유로퓸 기반 검출은 HRP 기반 검출보다 더 큰 신호전달을 나타낸다.
방법
항원 다운 HRP ELISA
간단히 말하면, 스트렙타비딘 플레이트(Thermo Scientific)를 바이오티닐화 항원 용액(다양한 만노실화의 대조군 항체, PBS 중의 1㎍/㎖)에 의해 1시간 동안 코팅하였다. 이후, 항원 코팅된 플레이트를 세척 완충제(PBS, 0.05% Tween-20)에 의해 3회 세척하였다. 이후, 플레이트를 차단 용액(PBS, 0.5% 어류 피부 젤라틴, 0.05% Tween-20)을 사용하여 대략 1시간 동안 차단하였다. 이후, 차단 용액을 제거하고, 이후 플레이트를 대략 1시간 동안 시험되는 항체의 희석 시리즈와 항온처리하였다. 이 항온처리의 종료 시, 플레이트를 세척 완충제에 의해 3회 세척하고, 대략 45분 동안 2차 항체 함유 용액(Fc 단편 특이적인 퍼옥시다제 접합 어피니퓨어 항토끼 IgG(잭슨 이뮤노리서치))과 추가로 항온처리하고, 3회 세척하였다. 이 시점에, 기질 용액(TMB 퍼옥시다제 기질, BioFx)을 첨가하고, 암소에서 3 내지 5분 동안 항온처리하였다. 0.5M HCl을 첨가하여 반응을 중단하고, 플레이트-판독기에서 플레이트를 450㎚에서 판독하였다.
AGV 항체 다운 겨자무과산화효소(HRP) ELISA
간단히 말하면, 스트렙타비딘 플레이트(Thermo Scientific)를 바이오티닐화 항체 용액(Ab1-5, PBS 중의 1㎍/㎖)에 의해 1시간 동안 코팅하였다. 이후, 항체 코팅된 플레이트를 세척 완충제(PBS, 0.05% Tween-20)에 의해 3회 세척하였다. 이후, 플레이트를 차단 용액(PBS, 0.5% 어류 피부 젤라틴, 0.05% Tween-20)을 사용하여 대략 1시간 동안 차단하였다. 이후, 차단 용액을 제거하고, 이후 플레이트를 대략 1시간 동안 시험되는 항원의 희석 시리즈와 항온처리하였다. 이 항온처리의 종료 시, 플레이트를 세척 완충제에 의해 3회 세척하고, 대략 45분 동안 2차 항체 함유 용액(Fc 단편 특이적인 퍼옥시다제 접합 어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG(잭슨 이뮤노리서치))과 추가로 항온처리하고, 3회 세척하였다. 이 시점에, 기질 용액(TMB 퍼옥시다제 기질, BioFx)을 첨가하고, 암소에서 3 내지 5분 동안 항온처리하였다. 0.5M HCl을 첨가하여 반응을 중단하고, 플레이트-판독기에서 플레이트를 450㎚에서 판독하였다.
항체 다운 유로퓸 ELISA
간단히 말하면, 흰색 스트렙타비딘 플레이트(Thermo Scientific)를 바이오티닐화 항체 용액(Ab1-5, PBS 중의 1㎍/㎖)에 의해 1시간 동안 코팅하였다. 이후, 항체 코팅된 플레이트를 세척 완충제(PBS, 0.05% Tween-20)에 의해 3회 세척하였다. 이후, 플레이트를 차단 용액(PBS, 0.5% 어류 피부 젤라틴, 0.05% Tween-20)을 사용하여 대략 1시간 동안 차단하였다. 이후, 차단 용액을 제거하고, 이후 플레이트를 대략 1시간 동안 시험되는 항원의 희석 시리즈와 항온처리하였다. 이 항온처리의 종료 시, 플레이트를 세척 완충제에 의해 3회 세척하고, 2차 항체 함유 용액(유로퓸 접합된 항-인간 IgG(Cisbio))과 대략 45분 동안 추가로 항온처리하고, 3회 세척하였다. 이 지점에서, 200㎕의 HTRF 완충제(Cisbio)를 첨가하고, 플레이트를 330㎚에서의 여기/620㎚에서의 방출로 판독하였다.
이 실시예에서 시험된 항체는 Ab-A, Ab-B 및 Ab-C이고, 이것은 피. 파스토리스에서 발현된 3개의 상이한 인간화 IgG1 항체이다. 이 실시예에서 시험된 각각의 인간화 항체는 상이한 면역원에 대해 키워지고, 다른 것과 상이한 표적 분자에 특이적으로 결합한다.
결과
도 13은 항체 Ab-A의 상이한 롯트의 글라이코실화를 검출하기 위한 Ab1 및 Ab2를 사용한 ELISA 검정의 결과를 보여준다. 검정 포맷은 겨자무과산화효소(HRP) 검출에 의한 항당변이체(AGV) 항체 다운이었다. 바이오티닐화 항체를 스트렙타비딘 플레이트에 결합시키고, 상이한 Ab-A 롯트가 적정되었다. 2개의 항체 Ab1 및 Ab2는 각각의 시험 샘플과 유사하게 반응하였다. 이 검정 포맷에서, Ab1 및 Ab2의 민감성은, 가능하게는 플레이트 상의 항체 다운에 의한 "초결합도" 효과 및 용액 중의 다점 만노실화 Ab-A로 인해, 비교적 유사하였다.
도 14는 항체 Ab-A 및 Ab-C의 상이한 롯트의 글라이코실화를 검출하기 위한 Ab3, Ab4 및 Ab5를 사용한 ELISA 검정의 결과를 보여준다. 검정 포맷은 스트렙타비딘 플레이트 상의 바이오티닐화 항원 다운이었고, 항당변이체(AGV) 항체가 적정되었다. 항체는 (친화도 차이로 인할 수 있는 약간의 차이가 있지만) 상이한 항원과 유사하게 반응하였다.
도 15는 항체 Ab-A의 상이한 롯트의 글라이코실화를 검출하기 위한 Ab1을 사용한 ELISA 검정의 결과를 보여준다. 검정 포맷은 각각 왼쪽 및 오른쪽 패널에서 겨자무과산화효소(HRP) 또는 유로퓸(Euro) 검출에 의한 항당변이체(AGV) 항체 다운이었다. 바이오티닐화 항체를 스트렙타비딘 플레이트에 결합시키고, 상이한 Ab-A 롯트가 적정되었다. 오른쪽 패널에서, 검출은 (토끼 불변 도메인을 함유하는) Ab1이 아니라 (인간 불변 도메인을 함유하는) Ab-A에 결합하는 유로퓸 표지된 항체에 의했다. 검출에 대한 유로퓸의 사용은 HRP보다 더 큰 민감도를 발생시켰다.
실시예 5: Ab1은 렉틴 DC-SIGN에 의한 결합에 대해 경쟁한다
이 실시예는 Ab1이 당단백질(구체적으로, 만노실화 항체)에 대한 결합에 대해 렉틴 DC-SIGN과 경쟁한다는 것을 입증한다. 결과는 Ab1에 의해 결합된 에피토프가 DC-SIGN에 대한 결합 자리와 적어도 중첩한다는 것을 입증한다.
Ab1에 의해 차단된 DC-SIGN
Ab-A 롯트 2의 샘플(제법이 실시예 1에서 상기 기재된 당단백질 농후화 항체 샘플)을 10㎍/㎖에서 150초 동안 스트렙타비딘 센서(Forte Bio 카탈로그 18-5019호)에 결합된 LC-LC-바이오틴(피어스 카탈로그 21338호)에 의해 바이오티닐화하고, 이후 1500초 동안 1X 동역학 완충제 중에 20㎍/㎖ 또는 0㎍/㎖에서 Ab1에 의해 예비처리로 처리하여 포화를 달성하였다. 이후, 예비처리 신호(도시되지 않음)를 X축 및 Y축 둘 다에서 0으로 정규화하였다. 실험의 다음 단계는 15㎍/㎖에서 DC-SIGN(R&D Systems 카탈로그 161-DC-050호)의 포함을 제외하고는 20㎍/㎖ 및 0㎍/㎖의 동일한 Ab1 농도를 유지시켰다. 이 조건을 500초 동안 유지시키고, 20㎍/㎖에서의 Ab1의 예비처리에 의한 조건에서 겉보기 DC-SIGN 결합 신호가 관찰되지 않았다. Ab1 처리 없이 DC-SIGN 조건에서 강한 신호가 관찰되었다. 이후, 센서는 1X 동역학 완충제 중에 해리 조건으로 이동하였다. DC-SIGN은 결합으로 남아 있는 것으로 보이지만, 예비처리에서 결합된 Ab1에 의한 조건에서, 이의 이전의 수준으로부터 신호가 감퇴하는 것으로 관찰되었다.
결과
도 16에 도시된 바대로, Ab-A 롯트2 코팅된 바이오센서에 대한 DC-SIGN의 결합(상부 회색 선)은 Ab1 예비처리에 의해 불가능하게 되었다(하부 검정 선). 이 결과는 Ab1이 만노실화 단백질 상에 결합하는 에피토프가 DC-SIGN에 대한 결합 자리와 적어도 중첩한다는 것을 입증한다.
실시예 6: 당단백질의 검출을 위한 고속 검정
이 검정은 당단백질의 검출을 위한 고속 HTRF 기반 검정을 기재한다.
방법
AGV HTRF 검정
간단히 말하면, 항체/항원 상호작용을 판독하도록 절반 면적 흰색 96웰 플레이트(Perkin Elmer)를 사용하였다. 항체(3nM), 항원(1nM), 유로퓸 표지된 항-토끼 Fc(1nM 공여자-Cisbio) 및 항-인간 XL665(30nM 수용자-Cisbio)를 웰마다 60㎕로 검정 완충제(Cisbio) 중에 합했다. 샘플을 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 시, 300마이크로초의 지연으로 여기 330nm, 방출 620/665nm에서 플레이트를 판독하였다. 데이터는 665/620의 비율로 기록된다. 이 실시예에서 시험된 항체는 Ab-B 및 Ab-D이고, 이것은 피. 파스토리스에서 발현된 2개의 상이한 인간화 IgG1 항체이다. 이 실시예에서 시험된 각각의 인간화 항체는 상이한 면역원에 대해 키워지고, 다른 것과 상이한 표적 분자에 특이적으로 결합한다.
결과
도 17a-b는 정제 분획에서의 당단백질의 수준을 정량화하기 위한 고속 검정(HTRF)에서의 AGV 항체 Ab1의 사용을 보여준다. Ab-B(도 17a) 및 Ab-D(도 17b)는 칼럼 정제로 처리되고, 당단백질의 상대 양을 결정하도록 AGV 항체를 사용하여 모든 다른 수집된 분획(수평 축에서 숫자 매겨짐)을 평가하였다. 항체의 양은 대조군의 백분율(POC), 구체적으로 Ab-A의 당단백질 농후화 제제(Ab-A 롯트 2)에 대한 당단백질의 양으로 표시된다. 참고로, (비교적 적은 양의 당단백질을 함유하는) Ab-A 롯트 1에 함유된 당단백질의 양은, 대조군의 약 25%의 수준인, 수평 선에 의해 표시된다.
이 검정을 이용하여, 원하는 바대로 당단백질 농후화 또는 당단백질 고갈 제제를 얻도록 분획을 선택하거나 혼주할 수 있다.
실시예 7: 정제 분획에서의 당단백질의 상대 정량화
이 실시예는 당단백질 함유 항체의 크로마토그래피 정제 분획의 당단백질 분석을 입증한다. 항당단백질 항체 Ab1 또는 GNA를 사용하여 당단백질을 검출하였다.
방법
Ab1 또는 GNA를 사용하여 폴리프로필렌 글라이콜(PPG) 칼럼으로부터 용리된 Ab-A의 크로마토그래피 분획을 당단백질 분석으로 처리하였다. 실시예 6에 기재된 HTRF 방법에 의해 Ab1에 기초한 검출을 수행하였다.
GNA 분석을 위해, 표준품에 대한 용액 중의 당변이체의 농도를 결정하도록 바이오티닐화 갈란투스 니발리스(Galanthus nivalis) 응집소를 가지는 스트렙타비딘 바이오센서를 사용하였다. 특히, 표준품에 대한 용액 중의 생물분자의 활성의 수준을 결정하도록 바이오티닐화 갈란투스 니발리스 렉틴(GNL, 또한 GNA라 칭함, 카탈로그 B-1245, Vector Labs(캘리포니아주 벌링게임))에 의해 작용기화된 스트렙타비딘 바이오센서(ForteBio)를 가지는 Octet 간섭계(ForteBio(캘리포니아주 멘로 파크))를 사용하였다. 간단히 말하면, 센서를 1x 동역학 완충제(ForteBio사제의 10x 동역학 완충제의 둘베코 인산염 완충 식염수 중의 1:10 희석, 파트 18-5032호) 중에 예비 습윤시킴으로써 작용기화하고, 이후 바이오티닐화 GNL 렉틴의 희석에 액침시키고, 소정의 시간 동안 진탕 플랫폼에 위치시켰다.
샘플 저장 및 취급: 샘플 및 표준품을 기존의 안정성 데이터에 따라 4℃ 또는 -20℃에서 저장하였다. 검정을 준비하면서, 샘플을 얼음에서 유지시켰다. 동역학 완충제(Forte Bio 카탈로그 18-5032호, 10배 및 1배, PBS + 0.1% BSA, 0.02% Tween20 및 0.05% 나트륨 아자이드 함유)를 4℃에서 저장하였다. GNL을 4℃에서 저장하였다.
센서의 기능화: 스트렙타비딘 센서(Forte Bio 카탈로그 18-5019호, 스트렙타비딘에 의해 코팅된 96 바이오센서의 트레이)를 적어도 5분 동안 1x 동역학 완충제 중에 소킹하였다. 바이오티닐화 GNL을 1x 동역학 완충제로 1/1000 희석하여서 하기 단계에서 계산된 용적을 얻었다. 1x 동역학 완충제를 10x 동역학 완충제 및 Hyclone DPBS +Ca +Mg로부터 제조하였다. 120㎕의 동역학 완충제를 절반 면적 검정 플레이트, 예를 들어 96웰 검정 절반 면적 플레이트 중 및 고 결합(Greiner Bio-One 카탈로그 675076 또는 VWR 카탈로그 82050-044)에 필요한 각각의 센서에 대해 웰마다 분취하였다. 센서를 바이오티닐화 GNL이 있는 플레이트로 옮기고, 플레이트를 적어도 30분 동안 진탕시키면서 항온처리하였다.
센서 및 샘플의 준비: 이 선단에 대한 손상(예를 들어, 스크래핑)이 검정 결과에 영향을 미칠 수 있으므로, 센서의 선단에 대해 특별히 조심하면서 센서를 다중채널 피펫터에 의해 취급하였다. 배지 결합 검정 플레이트를 센서 트레이를 가지는 센서에 사용하였다. 샘플 및 표준품에 대해 별개의 검정 플레이트를 사용하였다. 미공지물, 대조군 및 표준품에 대해 웰마다 150㎕를 첨가하였다. 배지 블랭크 또는 공지된 당변이체 농도를 함유하는 용액은 대조군 샘플로서 임의로 포함될 수 있다. 검정의 각각의 표준 웰에 새로운 센서를 사용하였다. 각각의 센서를 사용 전에 1x 동역학 완충제 중에 세정하였다. 8점의 중복 3배 희석 시리즈는 표준 곡선에 충분하였다. 1x 동역학 완충제를 사용하여 희석을 만들었다. 1x 동역학 완충제를 또한 블랭크 샘플로서 사용하였다.
Octet 조건을 하기와 같이 설정하였다: 정량화 시간(초) 250; 진탕 속도 1000rpm. 샘플 웰 및 센서를 배정함으로써 플레이트를 한정하였다. 특히, 샘플에 상응하는 웰을 선택하고 이의 정체, 예를 들어 "미공지물"을 입력하여 희석 인자 또는 "표준품"으로 입력하여 공지된 농도를 입력함으로써 샘플 웰을 배정하였다. 이 검정에 센서를 재사용하지 않았다. 프로그램은 샘플을 처리하기 전에 지연 및/또는 진탕을 임의로 포함하였다(예를 들어, 플레이트를 300초 동안 200RPM에서 진탕시키면서 30℃로 평화시켰다).
측정을 위한 표준품, 미공지물 및 대조군을 1X 동역학 완충제 중에 희석하고 적절한 바대로 반복검정으로 검정 미량적정 플레이트에서 배열하였다. 샘플 희석에 의한 플레이트를 제조사(ForteBio)에 의해 기재된 바대로 GNL 기능화 센서 및 (예컨대, 단백질 A 센서에 대한) 표준 정량화 검정 방법을 이용하여 Octet에서 판독하였다.
데이터 분석을 ForteBio 분석 소프트웨어 모듈에 의해 수행하였다. 공지된 샘플의 표준 곡선 선형성 및 재현성을 평가하였다. 웰 활성 수준을 상대 단위(RU) 또는 대조군 백분율(POC)이라 칭하는 질량 정규화 비활성 수준을 결정하기 위해 샘플 농도/희석 인자에 적절히 조정하였다.
결과
도 18a-b는 폴리프로필렌 글라이콜(PPG) 칼럼으로부터 용리된 Ab-A의 분획에 함유된 당단백질의 정량화를 보여준다. Ab1 및 GNA은 각각의 분획에 함유된 (대조군의 백분율(POC)로서 표현된) 당단백질의 상대 양을 평가하기 위해 사용되었다. 각각의 분획에 함유된 단백질 질량은 또한 상대 단위(질량 RU)로 나타냈다. 반응성의 유사한 패턴이 Ab1 및 GNA를 사용하여 검출에 나타났다.
결과는 유사한 Ab1 및 GNA이어서, Ab1이 정제 분획에서 당단백질의 존재를 검출하기 위한 실행가능 검출 방법을 제공한다는 것을 나타낸다.
실시예 8: 당단백질 검출을 위한 Ab1 , GNA 및 DC-SIGN의 헤드 대 헤드 비교
이 실시예는 Ab1, GNA 및 DC-SIGN 검출 방법에 의한 항체의 다수의 롯트에서의 당단백질의 검출을 보여준다. 각각의 방법에 의해 검출된 당단백질의 상대 수준은 유사하여서, 당단백질의 존재를 검출하기 위한 Ab1을 사용하는 방법의 적합성을 추가로 확인시켜준다.
방법
샘플 저장 및 취급: 샘플 및 표준품을 기존의 안정성 데이터에 따라 4℃ 또는 -20℃에서 저장하였다. 검정을 준비하면서, 샘플을 얼음에서 유지시켰다. 동역학 완충제(Forte Bio 카탈로그 18-5032호, 10배 및 1배, PBS + 0.1% BSA, 0.02% Tween20 및 0.05% 나트륨 아자이드 함유)를 4℃에서 저장하였다. GNL을 4℃에서 저장하였다.
센서의 기능화: 스트렙타비딘 센서(Forte Bio 카탈로그 18-5019호, 스트렙타비딘에 의해 코팅된 96 바이오센서의 트레이)를 적어도 5분 동안 1x 동역학 완충제 중에 소킹하였다. 바이오티닐화 GNL을 1x 동역학 완충제로 1/1000 희석하여서 하기 단계에서 계산된 용적을 얻었다. 1x 동역학 완충제를 10x 동역학 완충제 및 Hyclone DPBS +Ca +Mg로부터 제조하였다. 120㎕의 동역학 완충제를 절반 면적 검정 플레이트, 예를 들어 96웰 검정 절반 면적 플레이트 중 및 고 결합(Greiner Bio-One 카탈로그 675076 또는 VWR 카탈로그 82050-044)에 필요한 각각의 센서에 대해 웰마다 분취하였다. 센서를 바이오티닐화 GNL이 있는 플레이트로 옮기고, 플레이트를 적어도 30분 동안 진탕시키면서 항온처리하였다.
센서 및 샘플의 준비: 이 선단에 대한 손상(예를 들어, 스크래핑)이 검정 결과에 영향을 미칠 수 있으므로, 센서의 선단에 대해 특별히 조심하면서 센서를 다중채널 피펫터에 의해 취급하였다. 배지 결합 검정 플레이트를 센서 트레이를 가지는 센서에 사용하였다. 샘플 및 표준품에 대해 별개의 검정 플레이트를 사용하였다. 미공지물, 대조군 및 표준품에 대해 웰마다 150㎕를 첨가하였다. 배지 블랭크 또는 공지된 당변이체 농도를 함유하는 용액은 대조군 샘플로서 임의로 포함될 수 있다. 검정의 각각의 표준 웰에 새로운 센서를 사용하였다. 각각의 센서를 사용 전에 1x 동역학 완충제 중에 세정하였다. 8점의 중복 3배 희석 시리즈는 표준 곡선에 충분하였다. 1x 동역학 완충제를 사용하여 희석을 만들었다. 1x 동역학 완충제를 또한 블랭크 샘플로서 사용하였다.
Octet 조건을 하기와 같이 설정하였다: 정량화 시간(초) 250; 진탕 속도 1000rpm. 플레이트를 샘플 웰 및 센서를 배정함으로써 한정하였다. 특히, 샘플에 상응하는 웰을 선택하고 이의 정체, 예를 들어 "미공지물"을 입력하여 희석 인자 또는 "표준품"으로 입력하여 공지된 농도를 입력함으로써 샘플 웰을 배정하였다. 이 검정에 센서를 재사용하지 않았다. 프로그램은 샘플을 프로세싱하기 전에 지연 및/또는 진탕을 임의로 포함하였다(예를 들어, 플레이트를 300초 동안 200RPM에서 진탕시키면서 30℃로 평형화시켰다).
상이한 렉틴, DC-SIGN(R&D Systems 카탈로그 161-DC-050호)을 LC-LC-바이오틴(피어스 카탈로그 21338호)에 의해 바이오티닐화하고, 상기 기재된 바와 같은 유사한 검정에서 사용된 스트렙타비딘 센서를 작용기화하도록 사용하였다.
결과
도 19A-D는 도 18a-b에 도시된 정제로부터의 혼주된 분획의 당단백질 분석의 결과를 보여준다. 도 19A는 도 15에서처럼 유로퓸 기반 항체 다운 ELISA 검정에서 AGV 항체 Ab1을 사용한 상이한 제제(플레이트 상의 Ab1 다운, 용액 중의 0.3㎍/㎖ Ab-A 샘플)에서의 당단백질의 ELISA 검출을 보여준다. 도 19B는 대조군 샘플의 백분율(POC)로서 ELISA 검정을 이용하여 검출된 당단백질의 검출된 수준을 그래프로 예시한다. 도 19C-D는 각각 GNA 또는 DC-SIGN을 사용하여 결정된 동일한 샘플에서의 당단백질의 검출된 수준을 보여준다. 라벨 "fxn12-21" 및 "fxn4-23"은 도 18a-b에 도시된 정제로부터의 숫자 12 내지 21 또는 4 내지 23의 분획의 혼주를 각각 나타낸다.
도 20은, 각각 대조군 샘플의 백분율(POC)로서 표현된, ELISA 검출(왼쪽 패널) 또는 GNA 검정(오른쪽 패널)을 이용한 항체 제제의 당단백질 분석의 결과를 보여준다. 결과는 6개의 시험된 롯트에 걸쳐 정량적으로 유사하고, 상대 피크 높이는 각각에 대해 유사한 패턴을 형성한다.
매우 유사한 프로필이 이 샘플에서 AGV 항체, GNA 및 DC-SIGN 검정에 의해 나타난다. (대조군 값의 백분율로서) 절대 피크 높이의 약간의 차이에도 불구하고, 이 결과는 당단백질의 검출에 대한 Ab1의 사용을 추가로 검증한다.
실시예 9: O- 단백당형 조성 분석
이 실시예는 항체 Ab1, GNA 및 DC-SIGN을 이용하여 얻은 신호와 만노스의 양 사이의 상관관계를 보여준다.
방법
Ab-A의 3개의 롯트를 O-단백당형 분석으로 처리하였다. 각각의 제제에 함유된 모노-, 다이- 및 트라이-만노스의 상대 분량은 일반적으로 Stadheim 등["Use of high-performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection for O-glycan determination in yeast," Nature Protocols, 2008 3:1026]에 의해 기재된 바대로 결정되었다. 각각의 롯트는 실시예 7에 기재된 바와 같은 GNA 및 실시예 8에 기재된 바와 같은 DC-SIGN을 사용하여 당단백질 분석으로 처리되었다. 추가로, 각각의 롯트에 대해, Ab1을 사용한 당단백질 분석은 실시예 6에 기재된 HTRF 방법에 의해 수행되었다. 각각의 검출 방법에 대한 신호는 대조군의 백분율(POC)로서 정량화되었다.
결과
도 21은 AGV, GNA 및 DC-SIGN으로부터의 신호에 대한 O-단백당형 조성 분석의 결과를 보여준다. 표는 각각의 샘플에 대해 당 알콜의 상대 단위, 구체적으로 모노-, 다이- 및 트라이-만노스, 및 GNA, Ab1 및 DC-SIGN 신호의 수준을 보여준다.
결과는 AGV mAb (Ab1), GNA 및 DC-SIGN 결합 검정으로부터 얻은 신호가 서로 그리고 Ab-A 상의 만노스의 양과 상관된다는 것을 보여준다.
실시예 10: Ab1을 사용한 효모 균주의 농후화 및 스크리닝
도입
세포의 낮은 생산성은 재조합 단백질 제조에서 제한 인자일 수 있다. 단리하는 고성능 균주는 생산성을 증가시키기 위한 강력한 접근법을 나타낸다. 돌연변이유발(랜덤 또는 반합리적) 및 재조합 DNA 방법을 포함하는 몇몇 분자 생물학 기법은 유전적 다양성을 생성하도록 사용될 수 있거나, 자발적으로 생긴 균주가 또한 사용될 수 있다. 이러한 기법을 통해 생성된 라이브러리 크기는 통상적으로 매우 커서(>105), 원하는 돌연변이체의 단리가 통상적인 "건초더미에서 바늘찾기" 문제가 되게 한다. 원하는 특성, 예컨대 증가한 생산성을 가지는 변이체를 농후화시키도록 고속 스크리닝을 사용할 수 있다.
이 실시예는 고생성 세포에 대해 농후화된 세포-표면 친화도(또는 "포획") 매트릭스의 사용을 기재한다. 일반적인 조작 원칙은 분비된 항체가 분비 세포(이의 "포획")의 표면에 보유될 수 있어서, 이의 후속적인 검출을 허용한다는 것이다. 형광성 검출 시약의 사용은 세포 분류에 의한 고생성 세포의 농후화를 허용한다. 예시된 포획 매트릭스는 강한 바이오틴-아비딘 상호작용을 이용한다. 세포 표면은 바이오틴 접합 세포 결합 물질, 구체적으로, 항당단백질 항체에 의해 표지된다. 이후, 바이오티닐화 항당단백질 항체에 의해 표지된 세포를 아비딘(또는 스트렙타비딘)과 혼합하여, 분비된 생성물에 결합할 수 있는 바이오티닐화 "포획 항체"에 부착하기 위한 브릿지를 제공한다. 후속하여, 세포는 한정된 조건 하에 이의 생성물을 분비하도록 허용되어서, 세포-표면 포획 매트릭스에 의해 분비된 생성물의 보유(포획)를 발생시킨다. 이후, 유세포계수법을 이용하여 세포를 세척하고 염색하고 분비된 생성물에 대해 평가할 수 있다.
방법
사용된 시약은 하기와 같다: FACS 완충제(PBS와 2% FBS); 1㎎/㎖의 농도의 스톡 용액으로서의 바이오티닐화 Ab1(상기 실시예에 기재됨); 5㎎/㎖의 농도의 스톡 용액으로서의 스트렙타비딘(잭슨 이뮤노리서치 카탈로그 016-000-084호); 1㎎/㎖의 농도의 스톡 용액으로서의 바이오티닐화 당나귀 항-인간 IgG (H+L)㎖* "포획 항체"(잭슨 이뮤노리서치 카탈로그 709-065-149호); 0.5㎎/㎖의 농도의 스톡 용액으로서의 형광성 표지된 당나귀 항-인간 IgG (H+L)㎖* "검출 항체":(잭슨 이뮤노리서치 카탈로그 709-545-149호); 프로피듐 요오다이드 50㎍/㎖(BD Pharmingen 51-66211E); 및 10% PEG8000이 보충된 산 비함유 배지(AFM).
세포를 BYEG 배지 중에 30℃에서 밤새 성장시켰다. 필요한 경우, 선형 범위(0.1 내지 0.9 OD)의 농도를 얻기 위해 희석에 의해 분광광도계를 사용하여 600㎚에서 광학 밀도를 측정함으로써 세포 밀도를 결정하였다. 근사 세포/㎖를 제공하도록 희석 인자 5x109배에 의해 OD600을 곱함으로써 세포 밀도를 계산하였다. 세포를 3000rpm에서 5분 동안 원심분리에 의해 스핀 다운하였다. 세포 펠렛을 200㎕의 FACS 완충제 중에 재현탁시키고 원심분리하고, 이것을 2회 반복하였다. 세포에 1㎕의 바이오티닐화 Ab1(1㎎/㎖)을 첨가하고, 15분 동안 얼음에서 항온처리하였다. 세포를 스핀 다운하고 3000rpm에서 5분 동안 FACS 완충제에 의해 세척하고, 이것을 2회 반복하였다. 세포를 200㎕의 FACS 완충제 중에 재현탁시켰다. 이후, 1㎕의 스트렙타비딘(5㎎/㎖)을 첨가하고 15분 동안 얼음에서 항온처리하였다. 세포를 다시 스핀 다운하고 3000rpm에서 5분 동안 FACS 완충제에 의해 세척하고, 이것을 2회 반복하였다. 세포를 200㎕의 FACS 완충제 중에 재현탁시켰다. 이후, 1㎕의 "포획 항체"(1㎎/㎖)를 첨가하고 30분 동안 얼음에서 항온처리하였다. 세포를 스핀 다운하고 3000rpm에서 5분 동안 FACS 완충제에 의해 세척하고, 이것을 2회 반복하였다. 세포를 10% PEG8000이 보충된 200㎕의 AFM 배지 중에 재현탁시키고, 2개의 관(관 A 및 B)으로 분할하였다. 관 A를 즉시 스핀 다운하고 시작 시점("0시간") 샘플로서 사용하고 즉시 처리하였다. 관 B의 경우, 배지를 24웰 로우 웰 플레이트(LWP)로 옮기고, 진탕 없이, 30℃에서 2시간 또는 4시간 이하 동안 항온처리하여 항체 분비를 허용하였다. 더 높은 기간을 몇몇 경우에 사용하여 더 높은 신호 축적을 허용하고, 이 경우에 배지를 하이드록시유레아에 의해 0.2M으로의 최종 농도로 보충하여 세포 성장을 저해하였다.
이후, 세포를 하기와 같이 처리하였다. 세포를 스핀 다운하고, 3000rpm에서 5분 동안 FACS 완충제에 의해 세척하고, 이것을 2회 반복하였다. 세포를 200㎕의 FACS 완충제 중에 재현탁시켰다. 이후, 30㎕의 검출 항체(0.5㎎/㎖)를 첨가하고 20분 동안 얼음에서 항온처리하였다. 이후, 세포를 스핀 다운하고, 3000rpm에서 5분 동안 FACS 완충제에 의해 세척하고, 이것을 2회 반복하였다. 세포를 200㎕의 FACS 완충제 중에 재현탁시켰다. 최종 세척 후, 0.5㎕의 프로피듐 요오다이드를 첨가하였다. 관을 와류시키고 얼음에서 유지시키고 FACS 분석/분류까지 커버하였다.
세포 분류를 488㎚ 여기를 위한 200mW 아르곤 레이저(Coherent(미국 캘리포니아주 산타 클라라)) 및 96웰 플레이트 또는 FACS 관에 분류하기 위한 자동 세포 침착 유닛이 구비된 BD Influx 유세포분석기(BD Biosciences(미국 캘리포니아주 산 호세))에서 수행하였다. FITC 형광을 표준 528BP 필터를 사용하여 Fl1에서 측정하고, 프로피듐 요오다이드 형광을 610BP 필터에 의해 Fl3에서 측정하였다. 데이터 획득 및 분석을 BD 소프트웨어 및 FlowJo 소프트웨어에 의해 수행하였다.
결과
이 실시예에 사용된 포획 시약의 배열은 도 22에 예시되어 있다. 2개의 상이한 세포 결합제를 시험하여 세포 표면을 바이오티닐화하였다: 바이오티닐화 갈란투스 니발리스 응집소(GNA, Vector Laboratories(캘리포니아주 벌링게임)) 및 만노실화 단백질에 결합하는 바이오티닐화 항체(Ab1). GNA에 의한 세포 표면의 표지는 상호작용이 비교적 약하다는 단점을 가지는 것으로 발견되었고, 비표지된 세포와의 결합 시 표지된 세포로부터의 GNA는 비표지된 세포로 이동하여서, 유세포분석법 프로필에서 형광성 신호에 대한 단일 피크를 생성시키는 것으로 발견되었다(도 23a). 반대로, Ab1은 강하게 및 본질적으로 비가역적으로 세포에 결합하여서, 2개의 출발 세포 집단에 상응하는 2개의 형광성 신호 피크를 생성시키는 것으로 발견되었다(도 23b). 따라서, Ab1과 같은 항당단백질 항체의 사용은 안정한 포획 매트릭스의 구축을 허용한다.
상업적으로 구입한 바이오티닐화 다중클론 항-인간 항혈청(당나귀 항인간 IgG(H+L), 잭슨 이뮤노리서치 카탈로그 709-065-149호)을 세포 표면 상의 바이오티닐화 Ab1과 연결시키기 위한 브릿지로서 스트렙타비딘에 의한 "포획 항체"로서 사용하였다. 이후, 표지된 세포를 제조 배지로 옮기고, 다양한 시간 동안 Ab-A를 분비하도록 허용하였다. 형광성 표지된 "검출 항체"(당나귀 항-인간 IgG (H+L)㎖*, 잭슨 이뮤노리서치 카탈로그 709-545-149호)에 의한 분비되고 포획된 Ab-A의 후속적인 검출 시, 0시간, 0.5시간 또는 2시간 후 처리된 샘플에 대해 항온처리 시간에 의해 지속적으로 증가하는 신호가 관찰되었다(도 24b). 대조군 비생성 "무 균주"는 동일한 시점에 걸쳐 임의의 신호 증가를 나타내지 않았다(도 24a). 이 결과는 분비된 생성물의 성공적인 포획에 대한 형광성 신호의 의존성을 입증한다.
분비된 항체의 교차 결합의 이동
매트릭스 표지된 Ab-A 분비 "제조 균주"와 매트릭스 표지된 비생성 무 균주의 혼합 시, 분비된 생성물의 교차 결합이 관찰되었다(도 25a). 이 결과로부터, 고생성 세포로부터 분비된(그리고 매트릭스에 의해 포획되지 않은) 항체가 확산하고 저분비 또는 비분비 세포 상의 포획 매트릭스에 결합할 수 있어서, 유세포분석법 프로필에서 형광성 신호에 대한 단일 피크를 생성시킨다는 것이 추론되었다. 이러한 교차 결합은 배지의 투과성을 감소시킴으로써 해소되었다. 하나의 시험된 물질은 젤라틴이지만, 10% 만큼 낮은 농도에서도 젤라틴 보충이 세포 생존능력 및 생산성에 심각하게 부정적인 영향을 가진다는 것이 발견되는 것으로 관찰되었다(데이터 비도시). 젤라틴이 산소 및 영양소 흡수에 불리하게 영향을 미친다는 것이 가정되었다. 분자 크라우딩제, 구체적으로 10-15% 폴리에틸렌 글라이콜(PEG8000)에 의한 배지의 보충을 시험하였다. 교차 결합의 방지가 다른 분자 크라우딩제, 예컨대 덱스트란, 피콜, BSA 및 기타에 의해 달성될 수 있는 것으로 고려된다. 상이한 분자량 또는 다른 농도의 PEG 분자를 또한 사용할 수 있었다. 10% PEG8000에 의한 보충은 생산성에 부정적으로 영향을 미치지 않으면서 교차 결합을 제한하는 것으로 발견되었다(도 25b 및 도 25c). 10% PEG8000을 함유하는 배지 중의 비생성 균주("무 균주")와 항체 생성 균주("생성자 균주")의 혼합물의 배양의 결과는 항체 생성 세포로부터 무 세포로의 항체의 제한된 이동을 나타낸다. 동일한 수의 무 세포와 생성자 세포의 혼합물("50:50 혼합물 무효 및 생성자")은 유세포분석법 프로필에서 2개의 형광성 신호 피크를 생성하였지만(도 25b), 90% 무 세포와 10% 생성자 세포의 혼합물("90_10 혼합물 w-PEG")은, 생성자 균주로부터 얻은 피크 형광 강도에 유사한 형광 강도를 보여주는, 세포의 낮은 피크 또는 숄더(shoulder)를 포함하는 형광 신호 분포를 생성시켰다(도 25c). 이 결과는 10% PEG 8000의 포함이 세포 사이의 항체의 이동의 양을 감소시켜서, 소정의 세포에서의 신호의 수준이 그 개별 세포에 의한 항체 제조의 수준을 더 밀접하게 반영한다는 것을 보여준다.
고생성 균주의 농후화
상기 기재된 유세포계수법 가능한 세포-표면 포획 매트릭스 접근법은 2개의 개념 증명 실험에서 혼합 배양 중에 매우 생산성인 세포를 농후화시키도록 사용되었다. 이 실험에서, 상이한 인간화 IgG1 항체(Ab-A, Ab-D, Ab-E 및 Ab-F 중에 2개의 항체)를 생성하는 세포를 한정된 비율로 혼합하고, 더 고생성의 균주를 포획하고 염색하고 농후화하도록 기재된 방법을 사용하였다. 더 고생성의 균주를 실험에서 약 20배 내지 약 150배로 농후화시켰다. 결과는 더 고생성의 균주의 성공적인 농후화가 더 고생성의 세포를 단리하기 위해 스크리닝 검정의 맥락에서 수행될 수 있다는 것을 나타낸다.
제1 실험에서, "고생성" Ab-E 분비 효모 세포를 "저생성" Ab-F 분비 세포의 수의 약 99배로 첨가함으로써 99:1 혼합된 균주 배양물을 제조하였다. Ab-E 분비 세포는 Ab-F 분비 세포보다 훨씬 더 높은 수준의 항체를 분비하는 것으로 이전에 관찰되었다. 제조에서의 이 차이가 이 실시예에 사용된 포획 및 분류 검정에서 검출 가능하다는 것을 확인하기 위해, 배양 중에 0시간 또는 2시간 후 세포를 처리함으로써 개별 균주에 의한 항체 제조를 규명하였다(도 26A). 결과는 Ab-E 생성 세포가 각각의 시점에 더 높은 형광 강도를 나타낸다는 것을 입증하고, 이것은 Ab-E에 의한 더 높은 생성이 이 검정에서 검출 가능하다는 것을 확인시켜준다. 혼합된 배양물을 표면-포획 매트릭스에 의해 표지하고, 10% PEG8000 보충 배지 중에 항체를 분비하도록 하고, 세척하고 검출 항체에 의해 염색하였다. 유세포계수법을 이용하여, 가장 높은 형광 신호를 가지는 세포의 상부 0.25%를 집단으로부터 단리하였다(도 26B). 이후, 선택된 하위집단을 ⅰ) 항생제 무(균주 둘 다(전체 세포)의 성장을 허용함); ⅱ) 350㎎/ℓ의 G418(Ab-F 균주의 성장을 허용함), 및 ⅲ) 200㎎/ℓ의 제오신(Ab-E 균주의 성장을 허용함)에 의해 보충된 YPDS 플레이트에서 플레이팅하였다. 각각의 항체를 발현하는 세포 및 전체 세포의 수를 플레이팅된 세포를 계수 시 결정하였다. 유세포계수법 시, Ab-E 분비 세포의 비율은 전체 세포의 백분율로서 1% 미만으로부터 약 20%로 증가하는 것으로 발견되어서(표 4), 20배 농후화를 나타낸다.
Figure pct00007
제2 실험에서, 저생산성 Ab-A 분비 세포의 수의 약 999배를 함유하는 배양물에 고생성 Ab-D 분비된 세포를 첨가함으로써 99.9:0.1 비율 혼합된 배양물을 제조하였다. Ab-D 분비 세포는 Ab-A 분비 세포보다 훨씬 더 높은 수준의 항체를 분비하는 것으로 이전에 관찰되었다. 제조에서의 이 차이가 이 실시예에서 사용된 포획 및 분류 검정에서 검출 가능하다는 것을 확인하기 위해, 배양 중에 0시간 또는 2시간 후 세포를 처리함으로써 개별 균주에 의한 항체 제조를 규명하였다(도 27). 결과는 Ab-D 생성 세포가 각각의 시점에서 더 높은 형광 강도를 나타낸다는 것을 입증하고, 이것은 Ab-D에 의한 더 높은 생성이 이 검정에서 검출 가능하다는 것을 확인시켜준다. 혼합된 배양물을 표면-포획 매트릭스에 의해 유사하게 표지하고, 10% PEG8000 보충 배지 중에 항체를 분비하도록 하고, 이후 세척하고 염색하였다. 그러나, 유세포분석법 선택 기준은 가장 높은 형광성 신호에 의해 세포의 상부 0.025%를 오직 선택함으로써 더 엄격해졌다. 가설은 엄격한 선택 기준이 더 큰 농후화를 제공한다는 것이다. 이후, ⅰ) 항생제 무(균주(전체 세포) 둘 다의 성장을 허용); ⅱ) 350㎎/ℓ의 G418(Ab-A 균주의 성장을 허용); 또는 ⅲ) 200㎎/ℓ의 제오신(Ab-D 균주의 성장을 허용)에 의해 보충된 YPDS 플레이트에서 선택된 하위집단을 플레이팅하였다. 각각의 항체를 발현하는 세포 및 전체 세포의 수를 플레이팅된 세포의 계수에 기초하여 결정하였다. 유세포분석법 분류 시, Ab-D 분비 세포의 비율은 전체 세포의 비율로서 0.1% 미만으로부터 약 15%로 증가하는 것으로 발견되어서, 약 150배 농후화를 나타낸다(표 5). 이 결과는 더욱 더 엄격한 게이팅 기준이 훨씬 더 큰 배수 농후화를 발생시키고, 더 고생성의 균주가 0.1% 미만의 출발 세포 집단으로 존재할 때에도 효과적이라는 것을 확인시켜준다.
Figure pct00008
결론
결과는 고생성 균주의 성공적인 농후화가 항체 포획 전략, 이어서 항체 검출 및 세포 분류에서 항당단백질 항체, 예컨대 Ab-1을 사용함으로써 유발될 수 있다는 것을 나타낸다. 이 개념 증명 실험에서, 공지된 고생성 및 저생성 균주를 혼합하여서, 농후화는 (항생제 내성 마커에 의해 차별화된) 출발 균주의 농후화를 검출함으로써 용이하게 정량화될 수 있었다. 일 실험에서, 고생성 균주는 분류 후 1% 미만의 출발 집단으로부터 약 20%의 최종 집단(약 20배 농후화를 나타냄)으로 농후화되었다. 또 다른 실험에서, 고생성 균주는 분류 후 0.1% 미만의 출발 집단으로부터 약 15%의 최종 집단(약 150배 농후화를 나타냄)으로 농후화되었다. 이 결과로부터, 고생성 세포를 단리하기 위한 스크리닝 검정의 맥락에서 이 방법이 유발될 수 있는 것으로 예측된다. 예컨대, 화학 돌연변이유발, 발현 라이브러리에 의한 형질전환, 체계적 또는 랜덤 유전자 넉아웃에 의해 유전 변이를 집단으로 도입할 수 있다. 증대된 발현 수준을 생성하는 세포를 회수하고 추가로 처리할 수 있다. 고생성 세포를 유전적으로 균일한 집단을 생성하기 위해 단일 콜로니로부터 성장시킬 수 있거나, 농후화된 세포의 혼합 집단을 사용할 수 있다. 증가한 발현 수준은, 출발 세포 또는 다른 공지된 표준품과 비교하여, 생성된 세포로부터의 발현의 수준을 직접적으로 측정함으로써, 확인될 수 있다. 출발 세포로부터의 유전적 차이는 결정될 수 있고, 증가한 발현을 발생시키는 한정된 유전적 차이를 가지는 세포를 생성하기 위해 제조 균주로 도입될 수 있다.
제조 수준에서 상이한 처리의 효과를 측정하도록 해당 방법을 또한 사용하였다. 예를 들어, 세포를 화학 처리의 차이, 성장 조건, 또는 제조 수준에서 잠재적 영향에 대해 시험되는 다른 조건으로 처리하고, 차등적으로 표지하고, 혼합하고, 이후 상기 포획 및 분류 방법으로 처리할 수 있다. 차등적으로 표지된 세포의 상대 비율은 항체 제조에서의 처리 또는 처리들의 효과를 나타낸다.
실시예 11: 당변이체 수준을 감소시키는 항당단백질 항체의 사용
크로마토그래피 단계에서 항체를 사용하여 당변이체 수준을 감소시키거나 제거하기 위한 AGV 항체, 예컨대 Ab-1의 사용하는 것의 가능성을 평가하기 위해, 2개의 상이한 방법을 이용하여 Ab-1을 크로마토그래피 수지로 부동화하였다. 이후, 이 친화도 수지를 Ab-A의 롯트(롯트 9)에서 당변이체 수준의 감소를 평가하도록 사용하였다.
방법
GE NHS-활성화 세파로스(등록상표) 4 패스트 플로우 수지
예비활성화 수지를 차가운 1mM HCl을 사용하여 제조사 가이드라인에 따라 제조하여 수지를 활성화하고, 5시간 이하 동안 실온에서 온화한 교반 하에 항온처리에 의해 Ab-1에 의해 공유로 작용기화하였다. 커플링 반응을 0.1M의 최종 농도로 Tris(pH 8)의 첨가에 의해 종료시켰다. 작용기화 수지를 0.1M Tris(pH 8) 및 0.1M 아르기닌(pH 4)의 교대 세척에 의해 세정하여 임의의 비커플링된 단백질을 제거하였다. 커플링에 사용된 Ab-1의 양은 침전된 수지의 밀리리터당 0.7 내지 25밀리그램의 범위였다.
피어스 스트렙타비딘 플러스 울트라링크(Pierce Streptavidin Plus Ultralink) 수지
(비드화 폴리아크릴아마이드로 이루어진) 수지를 제조사 가이드라인과 유사한 절차에 따라 제조하였다. 수지를 (칼슘 또는 마그네슘이 없는) DPBS에 의해 세정하였다. Ab-1을 바이오틴:항체의 20:1 또는 40:1 몰 비로 피어스 설포-NHS 바이오틴을 사용하여 바이오티닐화하고, 완충제를 제조사의 추천에 따라 교환하여 유리 바이오틴을 제거하였다. 바이오티닐화 Ab-1을 대략 1시간 동안 실온에서 또는 밤새 4℃에서 또는 실온 및 4℃ 항온처리의 조합의 교반을 이용하여 스트렙타비딘 수지에 의해 항온처리하였다. 커플링에 사용된 Ab-1의 양은 침전된 수지의 밀리리터당 대략 1밀리그램이었다.
샘플에서의 당변이체 수준을 상기 실시예 6에 기재된 바대로 AGV HTRF 검정을 이용하여 측정하였다.
결과
제1 실험에서, 20밀리그램의 Ab-A 롯트 9(세라믹 수산화인회석 칼럼으로부터의 용리물)를 DPBS에 의해 0.5㎎/㎖로 희석시키고, 0.3㎖/분의 유속으로 2㎖의 Ab-1 작용기화 NHS 수지가 충전된 DPBS 평형화 칼럼에 적용하였다. 제2 실험에서, 세라믹 수산화인회석 칼럼으로부터의 20밀리그램의 Ab-A 롯트 9 용리물을 DPBS에 의해 0.5㎎/㎖로 희석시키고, 0.3㎖/분의 유속으로 2.2㎖의 Ab-1 작용기화 Ultralink 수지가 충전된 DPBS 평형화 칼럼에 적용하였다. 이들 수지의 둘 다를 흐름 통과 방식에서 사용하였다. 흐름 통과 분획을 혼주하고, 로딩 재료(Ab-A 롯트 9)에 대한 당변이체 신호를 AGV HTRF 검정을 이용하여 결정하였다.
표 6에 기재된 바대로, 실험 둘 다에서 부동화 Ab-1을 함유하는 칼럼을 통해 Ab-A 롯트 9 재료를 통과시킨 후 당변이체 신호의 상당한 감소가 있었다. 이 결과는 피치아에서 생성된 항체의 제조에서 당변이체의 수준을 감소시키기 위한 크로마토그래피 단계에서의 Ab-1의 사용의 실행가능성을 입증한다. 이 실험에서 Ab-1 항체의 온전한 형태가 사용되지만, 이 접근법은 온전한 항체 대신에 Ab-1의 Fab 또는 scFv 형태를 사용하여 또한 취해질 수 있다. 이 접근법은 상이한 AGV 항체를 사용하여 또한 취해질 수 있다.
Figure pct00009
본 발명의 다양한 예시된 실시형태의 상기 설명은 배타적이거나 본 발명을 개시된 정확한 형태로 제한하도록 의도되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시형태 및 이에 대한 예가 예시적인 목적을 위해 본 명세서에 기재되어 있지만, 당해 분야의 당업자가 인식하는 것처럼, 다양한 균등한 변형이 본 발명의 범위 내에 가능하다. 본 발명의 본 명세서에 제공된 교시내용은 상기 기재된 예 이외에 다른 목적에 적용될 수 있다.
본 발명은 특히 상기 설명 및 실시예에 기재된 것 이외의 방식으로 실행될 수 있다. 본 발명의 많은 변형 및 변경이 상기 교시내용의 견지에서 가능하고, 따라서 첨부된 청구항의 범위 내에 있다.
상기 기재된 설명의 견지에서 본 발명에 이들 및 다른 변경이 만들어질 수 있다. 일반적으로, 하기 청구항에서, 사용된 용어는 명세서 및 청구항에 개시된 구체적인 실시형태로 본 발명을 제한하도록 구성되지 않아야 한다. 따라서, 본 발명은 본 개시내용에 의해 제한되지 않지만, 대신에 본 발명의 범위는 하기 청구항에 의해 완전히 결정되어야 한다.
항원 특이적 B 세포의 클론 집단을 얻는 방법에 관한 소정의 교시내용은 2006년 5월 19일에 출원된 미국 가특허 출원 제60/801,412호 및 미국 특허 출원 공보 제2012/0141982호(이들의 개시내용은 그 전문이 본 명세서에서 참고문헌으로 포함됨)에 개시되어 있다.
항원 결합 친화도를 유지하기 위한 토끼 유래 단일클론 항체의 인간화 및 바람직한 서열 변형과 관련한 소정의 교시내용은 2008년 5월 21일에 출원된 발명의 명칭이 "Novel Rabbit Antibody Humanization Methods and Humanized Rabbit Antibodies"인 국제 공보 제WO/2008/144757호에 대응하는 국제 출원 제PCT/US2008/064421호(이의 개시내용은 그 전문이 본 명세서에서 참고문헌으로 포함됨)에 개시되어 있다.
교배 능력 효모를 사용한 항체 또는 이의 단편 및 상응하는 방법에 관한 소정의 교시내용은 2006년 5월 8일에 출원된 미국 특허 출원 제11/429,053호(미국 특허 출원 공보 제US2006/0270045호)(이의 개시내용은 그 전문이 본 명세서에서 참고문헌으로 포함됨)에 개시되어 있다.
배경, 요약, 상세한 설명 및 실시예에 인용된 각각의 문헌을 포함하는 본 명세서에 인용된 각각의 문헌(특허, 특허 출원, 저널 논문, 요약, 매뉴얼, 책 또는 다른 교시내용 포함)의 전체 개시내용은 본 명세서에 의해 그 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
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acactgacca gcacacagta caacagccac aaagagtaca cctgcaaggt gacccagggc 600 acgacctcag tcgtccagag cttcagtagg aagaactgt 639 <210> 32 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 32 gaccctgtgc tgacccagac tccatccccc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60 atcagttgcc aggccagtga gagtgttgag agtggcaact ggttagcctg gtatcagcag 120 aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tattatacat ccactctggc atctggggtc 180 ccatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg gcacacttca ctctcaccat cagcggcgtg 240 cagtgtgacg atgctgccac ttactactgt caaggcgctt tttatggtgt gaatactttc 300 ggcggaggga ccgaggtggt ggtcaaa 327 <210> 33 <211> 69 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 33 gaccctgtgc tgacccagac tccatccccc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60 atcagttgc 69 <210> 34 <211> 39 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 34 caggccagtg agagtgttga gagtggcaac tggttagcc 39 <210> 35 <211> 45 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 35 tggtatcagc agaaaccagg gcagcctccc aagctcctga tctat 45 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 36 tatacatcca ctctggcatc t 21 <210> 37 <211> 96 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 37 ggggtcccat cgcggttcaa aggcagtgga tctggggcac acttcactct caccatcagc 60 ggcgtgcagt gtgacgatgc tgccacttac tactgt 96 <210> 38 <211> 27 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 38 caaggcgctt tttatggtgt gaatact 27 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 39 ttcggcggag ggaccgaggt ggtggtcaaa 30 <210> 40 <211> 312 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 40 cgtacgccag ttgcacctac tgtcctcctc ttcccaccat ctagcgatga ggtggcaact 60 ggaacagtca ccatcgtgtg tgtggcgaat aaatactttc ccgatgtcac cgtcacctgg 120 gaggtggatg gcaccaccca aacaactggc atcgagaaca gtaaaacacc gcagaattct 180 gcagattgta cctacaacct cagcagcact ctgacactga ccagcacaca gtacaacagc 240 cacaaagagt acacctgcaa ggtgacccag ggcacgacct cagtcgtcca gagcttcagt 300 aggaagaact gt 312 <210> 41 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified 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tccgtgatgc acgaggcctt gcacaaccac tacacgcaga agtccatctc ccgctctccg 1320 ggtaaa 1326 <210> 52 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 52 cagtcgttgg aggagtccgg gggaggcctg gtcaagcctg agggatccct gacactcacc 60 tgcaaagcct ctggattctc cttcactggc gcccactaca tgtgctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg gatcgcatgt atttatggtg gtagtgttga tataactttc 180 tacgcgagct gggcgaaagg ccgattcgcc atctccaagt cctcgtcgac cgcggtgact 240 ctgcaaatga ccagtctgac agccgcggac acggccacct atgtctgtgc gagagaaagc 300 ggtagtggct gggcgcttaa cttgtggggc ccggggaccc tagtcaccgt ctcgagc 357 <210> 53 <211> 87 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 53 cagtcgttgg aggagtccgg gggaggcctg gtcaagcctg agggatccct gacactcacc 60 tgcaaagcct ctggattctc cttcact 87 <210> 54 <211> 18 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 54 ggcgcccact acatgtgc 18 <210> 55 <211> 42 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 55 tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtggatcg ca 42 <210> 56 <211> 54 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 56 tgtatttatg gtggtagtgt tgatataact ttctacgcga gctgggcgaa aggc 54 <210> 57 <211> 93 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 57 cgattcgcca tctccaagtc ctcgtcgacc gcggtgactc tgcaaatgac cagtctgaca 60 gccgcggaca cggccaccta tgtctgtgcg aga 93 <210> 58 <211> 30 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 58 gaaagcggta gtggctgggc gcttaacttg 30 <210> 59 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 59 tggggcccgg ggaccctagt caccgtctcg agc 33 <210> 60 <211> 969 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 60 gggcaaccta aggctccatc agtcttccca ctggccccct gctgcgggga cacaccctct 60 agcacggtga ccttgggctg cctggtcaaa ggctacctcc cggagccagt gaccgtgacc 120 tggaactcgg gcaccctcac caatggggta cgcaccttcc cgtccgtccg gcagtcctca 180 ggcctctact cgctgagcag cgtggtgagc gtgacctcaa gcagccagcc cgtcacctgc 240 aacgtggccc acccagccac caacaccaaa gtggacaaga ccgttgcgcc ctcgacatgc 300 agcaagccca cgtgcccacc ccctgaactc ctggggggac cgtctgtctt catcttcccc 360 ccaaaaccca aggacaccct catgatctca cgcacccccg aggtcacatg cgtggtggtg 420 gacgtgagcc aggatgaccc cgaggtgcag ttcacatggt acataaacaa cgagcaggtg 480 cgcaccgccc ggccgccgct acgggagcag cagttcaaca gcacgatccg cgtggtcagc 540 accctcccca tcgcgcacca ggactggctg aggggcaagg agttcaagtg caaagtccac 600 aacaaggcac tcccggcccc catcgagaaa accatctcca aagccagagg gcagcccctg 660 gagccgaagg tctacaccat gggccctccc cgggaggagc tgagcagcag gtcggtcagc 720 ctgacctgca tgatcaacgg cttctaccct tccgacatct cggtggagtg ggagaagaac 780 gggaaggcag aggacaacta caagaccacg ccggccgtgc tggacagcga cggctcctac 840 ttcctctaca gcaagctctc agtgcccacg agtgagtggc agcggggcga cgtcttcacc 900 tgctccgtga tgcacgaggc cttgcacaac cactacacgc agaagtccat ctcccgctct 960 ccgggtaaa 969 <210> 61 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 61 Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Glu Asn Gly Asn 20 25 30 Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 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accatctcca aagccagagg gcagcccctg 660 gagccgaagg tctacaccat gggccctccc cgggaggagc tgagcagcag gtcggtcagc 720 ctgacctgca tgatcaacgg cttctaccct tccgacatct cggtggagtg ggagaagaac 780 gggaaggcag aggacaacta caagaccacg ccggccgtgc tggacagcga cggctcctac 840 ttcctctaca gcaagctctc agtgcccacg agtgagtggc agcggggcga cgtcttcacc 900 tgctccgtga tgcacgaggc cttgcacaac cactacacgc agaagtccat ctcccgctct 960 ccgggtaaa 969 <210> 101 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 101 Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly 1 5 10 15 Ala Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Glu Asn Gly Asn 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Gly Ile 85 90 95 Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg Thr Pro 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cagttcactc tcaccatcag cggcgtgcag 240 tgtgacgatg ctgccactta ctattgtcaa ggcgcttata gtggtattaa tgctttcggc 300 ggagggaccg aggtggtggt caaacgtacg ccagttgcac ctactgtcct cctcttccca 360 ccatctagcg atgaggtggc aactggaaca gtcaccatcg tgtgtgtggc gaataaatac 420 tttcccgatg tcaccgtcac ctgggaggtg gatggcacca cccaaacaac tggcatcgag 480 aacagtaaaa caccgcagaa ttctgcagat tgtacctaca acctcagcag cactctgaca 540 ctgaccagca cacagtacaa cagccacaaa gagtacacct gcaaggtgac ccagggcacg 600 acctcagtcg tccagagctt cagtaggaag aactgt 636 <210> 112 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 112 caggtgctga cccagactcc atcccccgtg tctgcagctg tgggaggcgc agtcaccatc 60 aattgccagt ccagtcagag tgttgagaat ggcaactggt taggctggta tcagcagaaa 120 ccagggcagc ctcccaagct cctgatctat ctggcatcca ctctggcatc tggggtccct 180 tcgcggttca ccggcagcgg atctgggaca cagttcactc tcaccatcag cggcgtgcag 240 tgtgacgatg ctgccactta ctattgtcaa ggcgcttata gtggtattaa tgctttcggc 300 ggagggaccg aggtggtggt caaa 324 <210> 113 <211> 66 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ttcccaccat ctagcgatga ggtggcaact 60 ggaacagtca ccatcgtgtg tgtggcgaat aaatactttc ccgatgtcac cgtcacctgg 120 gaggtggatg gcaccaccca aacaactggc atcgagaaca gtaaaacacc gcagaattct 180 gcagattgta cctacaacct cagcagcact ctgacactga ccagcacaca gtacaacagc 240 cacaaagagt acacctgcaa ggtgacccag ggcacgacct cagtcgtcca gagcttcagt 300 aggaagaact gt 312 <210> 121 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 121 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Cys Ile Tyr Pro Asn Asn Pro Val Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu 65 70 75 80 Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gly 85 90 95 Arg Ser Asp Ser Asn Gly His Thr Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser 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cuniculus <400> 128 Ser Asp Ser Asn Gly His Thr Phe Asn Leu 1 5 10 <210> 129 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 129 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 130 <211> 323 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 130 Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly 1 5 10 15 Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn 35 40 45 Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys 65 70 75 80 Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala 85 90 95 Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly 100 105 110 Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 115 120 125 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 130 135 140 Asp Asp Pro Glu Val 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tcaccgtctc gagc 354 <210> 133 <211> 87 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 133 cagtcgttgg aggagtccgg gggagacctg gtcaagcctg gggcatccct gacactcacc 60 tgcacagcct ctggattctc cttcagt 87 <210> 134 <211> 18 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 134 agcggctacg acatgtgt 18 <210> 135 <211> 42 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 135 tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtggatcg cc 42 <210> 136 <211> 51 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 136 tgtatttacc ctaataatcc tgtcacttac tacgcgagct gggcgaaagg c 51 <210> 137 <211> 93 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 137 cgattcacca tctccaaaac ctcgtcgacc acggtgactc tgcaaatgac cagtctgaca 60 gccgcggaca cggccaccta tttctgtggg aga 93 <210> 138 <211> 30 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 138 tctgatagta atggtcatac ctttaacttg 30 <210> 139 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 139 tggggccaag gcaccctcgt caccgtctcg agc 33 <210> 140 <211> 969 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 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catctagcga tgaggtggca actggaacag tcaccatcgt gtgtgtggcg 420 aataaatact ttcccgatgt caccgtcacc tgggaggtgg atggcaccac ccaaacaact 480 ggcatcgaga acagtaaaac accgcagaat tctgcagatt gtacctacaa cctcagcagc 540 actctgacac tgaccagcac acagtacaac agccacaaag agtacacctg caaggtgacc 600 cagggcacga cctcagtcgt ccagagcttc agtaggaaga actgt 645 <210> 152 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 152 gaccctgtga tgacccagac tccatcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60 atcaattgcc agtccagtca gagtgttaat cagaacgact tatcctggta tcagcagaaa 120 ccagggcagc ctcccaagcg cctgatctat tatgcatcca ctctggcatc tggggtctca 180 tcgcggttca aaggcagtgg atctgggaca cagttcactc tcaccatcag cgacatgcag 240 tgtgacgatg ctgccactta ctactgtcaa ggcagttttc gtgttagtgg ttggtactgg 300 gctttcggcg gagggaccga ggtggtggtc aaa 333 <210> 153 <211> 69 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 153 gaccctgtga tgacccagac tccatcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60 atcaattgc 69 <210> 154 <211> 36 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 154 cagtccagtc agagtgttaa tcagaacgac ttatcc 36 <210> 155 <211> 45 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 155 tggtatcagc agaaaccagg gcagcctccc aagcgcctga tctat 45 <210> 156 <211> 21 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 156 tatgcatcca ctctggcatc t 21 <210> 157 <211> 96 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 157 ggggtctcat cgcggttcaa aggcagtgga tctgggacac agttcactct caccatcagc 60 gacatgcagt gtgacgatgc tgccacttac tactgt 96 <210> 158 <211> 36 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 158 caaggcagtt ttcgtgttag tggttggtac tgggct 36 <210> 159 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 159 ttcggcggag ggaccgaggt ggtggtcaaa 30 <210> 160 <211> 312 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 160 cgtacgccag ttgcacctac tgtcctcctc ttcccaccat ctagcgatga ggtggcaact 60 ggaacagtca ccatcgtgtg tgtggcgaat aaatactttc ccgatgtcac cgtcacctgg 120 gaggtggatg gcaccaccca aacaactggc atcgagaaca gtaaaacacc 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tgaggtggca actggaacag tcaccatcgt gtgtgtggcg 420 aataaatact ttcccgatgt caccgtcacc tgggaggtgg atggcaccac ccaaacaact 480 ggcatcgaga acagtaaaac accgcagaat tctgcagatt gtacctacaa cctcagcagc 540 actctgacac tgaccagcac acagtacaac agccacaaag agtacacctg caaggtgacc 600 cagggcacga cctcagtcgt ccagagcttc agtaggaaga actgt 645 <210> 192 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 192 atcgtgatga cccagactcc atcttccagg tctgtccctg tgggaggcac agtcaccatc 60 aattgccagg ccagtgaaat tgttaataga aacaaccgct tagcctggtt tcaacagaaa 120 ccagggcagc ctcccaagct cctgatgtat ctggcttcca ctccggcatc tggggtccca 180 tcgcggttta gaggcagtgg atctgggaca cagttcactc tcaccatcag cgatgtggtg 240 tgtgacgatg ctgccactta ttattgtaca gcatataaga gtagtaatac tgatggtatt 300 gctttcggcg gagggaccga ggtggtggtc aaa 333 <210> 193 <211> 66 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 193 atcgtgatga cccagactcc atcttccagg tctgtccctg tgggaggcac agtcaccatc 60 aattgc 66 <210> 194 <211> 39 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 194 caggccagtg aaattgttaa tagaaacaac cgcttagcc 39 <210> 195 <211> 45 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 195 tggtttcaac agaaaccagg gcagcctccc aagctcctga tgtat 45 <210> 196 <211> 21 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 196 ctggcttcca ctccggcatc t 21 <210> 197 <211> 96 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 197 ggggtcccat cgcggtttag aggcagtgga tctgggacac agttcactct caccatcagc 60 gatgtggtgt gtgacgatgc tgccacttat tattgt 96 <210> 198 <211> 36 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 198 acagcatata agagtagtaa tactgatggt attgct 36 <210> 199 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 199 ttcggcggag ggaccgaggt ggtggtcaaa 30 <210> 200 <211> 312 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 200 cgtacgccag ttgcacctac tgtcctcctc ttcccaccat ctagcgatga ggtggcaact 60 ggaacagtca ccatcgtgtg tgtggcgaat aaatactttc ccgatgtcac cgtcacctgg 120 gaggtggatg gcaccaccca aacaactggc atcgagaaca gtaaaacacc gcagaattct 180 gcagattgta cctacaacct cagcagcact ctgacactga ccagcacaca gtacaacagc 240 cacaaagagt acacctgcaa ggtgacccag ggcacgacct cagtcgtcca gagcttcagt 300 aggaagaact gt 312 <210> 201 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 201 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Ala 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 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ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacgcgag agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacgcc 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990 <210> 203 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 203 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 204 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 204 cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg t 321 <210> 205 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 205 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Ala 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 206 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 206 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacgcgag agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacgcc 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990 <210> 207 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 207 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 208 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 208 cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg t 321 <210> 209 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 209 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Ala 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 210 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 210 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacgcgag agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacgcc 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990 <210> 211 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 211 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 212 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Modified antibody sequence <400> 212 cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg t 321

Claims (45)

  1. Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 또는 Ab5로부터 선택된 항당단백질 항체와, 당단백질 상의, 동일한 또는 중첩하는 선형 또는 입체적 에피토프(conformational epitope)(들)에 특이적으로 결합하고/하거나, 당단백질 상의, 동일한 또는 중첩하는 선형 또는 입체적 에피토프(들)에 대한 결합에 대해 경쟁하는, 항당단백질 항체 또는 항체 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 상기 항체 또는 항체 단편은, 상기 항당단백질 항체 Ab1과, 당단백질 상의, 동일한 또는 중첩하는 선형 또는 입체적 에피토프(들)에 특이적으로 결합하고/하거나, 동일한 또는 중첩하는 선형 또는 입체적 에피토프(들)에 대한 결합에 대해 경쟁하고/하거나;
    (b) 상기 항체 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 1가 항체 또는 metMab로부터 선택되고/되거나;
    (c) 상기 항체 단편은 Fab 단편이고/이거나;
    (d) 상기 항체 또는 항체 단편은 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 또는 Ab5로부터 선택된 항당단백질 항체와 동일한 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR)을 포함하고/하거나;
    (e) 상기 항체 또는 항체 단편은 서열 번호 4의 CDR 1 서열, 서열 번호 6의 CDR 2 서열 및 서열 번호 8의 CDR 3 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) 및/또는 서열 번호 24의 CDR 1 서열, 서열 번호 26의 CDR 2 서열 및 서열 번호 28의 CDR 3 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)의 Fab 단편을 포함하고/하거나;
    (f) 상기 항체 또는 항체 단편은 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 또는 Ab5로부터 선택된 항당단백질 항체에 함유된 것과 동일한 VL 및 VH 영역의 각각에서 적어도 2개의 CDR을 포함하고/하거나;
    (g) 상기 항체 또는 항체 단편은 인간화된, 단쇄 또는 키메라 항체를 포함하고/하거나;
    (h) 상기 항체 또는 항체 단편은 토끼 항체 또는 항체 단편이고/이거나;
    (i) 상기 항체 또는 항체 단편은 지지체에 결합하고/하거나;
    (j) 상기 항체 또는 항체 단편은 숙주 동물로부터 단리된 항체 또는 항체 단편에 대한 하나 이상의 아미노산 서열 변형을 포함하고/하거나;
    (k) 상기 항체 또는 항체 단편은 검출 가능한 라벨 또는 치료제에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된, 항당단백질 항체 또는 항체 단편.
  3. 단리된 항당단백질 항체 또는 항체 단편으로서,
    (a) 서열 번호 2, 42, 82, 122 또는 162로부터 선택된 VH 폴리펩타이드 서열, 또는 이것과 적어도 90%의 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체; 및/또는 서열 번호 22, 62, 102, 142 또는 182로부터 선택된 VL 폴리펩타이드 서열, 또는 이것과 적어도 90%의 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체로서, 상기 항당단백질 항체는 하나 이상의 당단백질에 특이적으로 결합하는 것; 또는
    (b) 서열 번호 2, 42, 82, 122 또는 162로부터 선택된 VH 폴리펩타이드 서열, 또는 이것과 적어도 90%의 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체; 및/또는 서열 번호 22, 62, 102, 142 또는 182로부터 선택된 VL 폴리펩타이드 서열, 또는 이것과 적어도 90%의 서열 동일성을 나타내는 이의 변이체로서, 상기 VH 또는 VL 폴리펩타이드에서의 프레임워크(framework; FR) 또는 CDR 잔기 중 하나 이상은 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되어 하나 이상의 당단백질에 특이적으로 결합하는 항당단백질 항체를 생성시키는 것인, 단리된 항당단백질 항체 또는 항체 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편의 하나 이상의 프레임워크(FR) 잔기는 상기 VH 또는 VL 폴리펩타이드에 함유된 CDR이 유래한 모 토끼 항당단백질 항체에서의 상응하는 부위에 존재하는 아미노산에 의해 또는 보존적 아미노산 치환에 의해 치환되고; 임의로
    (a) 상기 VL 폴리펩타이드 서열의 CDR에서의 잔기 중 기껏해야 1개 또는 2개는 변형되고/되거나;
    (b) 상기 VH 폴리펩타이드 서열의 CDR에서의 잔기 중 기껏해야 1개 또는 2개는 변형되고/되거나;
    (c) 상기 항체는 인간화되고/되거나;
    (d) 상기 항체는 키메라이고/이거나;
    (e) 상기 항체는 단쇄 항체를 포함하고/하거나;
    (f) 상기 항체는 인간 Fc를 포함하고/하거나;
    (g) 상기 항체는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터 유래한 하나 이상의 프레임워크 및/또는 불변 도메인 서열을 포함하는, 단리된 항당단백질 항체 또는 항체 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 하나 이상의 당단백질에 특이적으로 결합하고, 임의로 상기 항체는 하나 이상의 만노실화 단백질에 특이적으로 결합하거나, 만노실화 항체 중쇄 또는 경쇄에 특이적으로 결합하는, 단리된 항당단백질 항체 또는 항체 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호 201, 205 또는 209의 서열을 가지는 중쇄 불변 폴리펩타이드를 포함하는 만노실화 인간 IgG1 항체 또는 항체 단편, 또는 이의 만노실화 단편 및/또는 서열 번호 203, 207 또는 211의 서열을 포함하는 만노실화 인간 IgG1 항체 경쇄 불변 폴리펩타이드, 또는 이의 만노실화 단편에 특이적으로 결합하는, 단리된 항당단백질 항체 또는 항체 단편.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는
    (a) 효모 종;
    (b) 칸디다 종(Candida spp.), 데바리오마이세스 한세니(Debaryomyces hansenii), 한세눌라 종(Hansenula spp.)(오가타에아 종(Ogataea spp.)), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus), 리포마이세스 종(Lipomyces spp.), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis)(쉐페르소마이세스 스티피티스(Scheffersomyces stipitis)), 피치아 종(Pichia sp.)(코마가타엘라 종(Komagataella spp.)), 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이콥시스 종(Saccharomycopsis spp.), 슈반니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)(코마가타엘라 파스토리스(Komagataella pastoris))로 이루어진 군으로부터 선택된 효모 종;
    (c) 섬질 균류 종;
    (d) 트리초데르마 레세이(Trichoderma reesei), 아스퍼질러스 종(Aspergillus spp.), 아스퍼질러스 니게르(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 페니실륨 종(Penicillium spp.), 페니실륨 치리소게눔(Penicillium chrysogenum), 페니실륨 푸르푸로게눔(Penicillium purpurogenum), 페니실륨 푸니쿨로숨(Penicillium funiculosum), 페니실륨 에머르소니(Penicillium emersonii), 리조푸스 종(Rhizopus spp.), 리조푸스 미에헤이(Rhizopus miehei), 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae), 리조푸스 푸실루스(Rhizopus pusillus), 리조푸스 아르히주스(Rhizopus arrhizus), 파네로차에테 크리소스포륨(Phanerochaete chrysosporium) 및 푸사륨 그라미네아룸(Fusarium graminearum)으로 이루어진 군으로부터 선택된 섬질 균류 종; 또는
    (e) 피치아 파스토리스에서 생성된 하나 이상의 만노실화 항체 또는 항체 단편에 특이적으로 결합하는, 단리된 항당단백질 항체 또는 항체 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항당단백질 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 핵산 서열 또는 핵산 서열들, 또는 임의로 플라스미드 또는 재조합 바이러스 벡터인, 상기 핵산 서열 또는 서열들을 포함하는 벡터.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체 단편을 발현하는 배양된 또는 재조합 세포로서, 임의로 상기 세포는
    (a) 포유류, 효모, 박테리아, 균류 또는 곤충 세포로부터 선택되고/되거나;
    (b) 효모 세포이고/이거나;
    (c) 이배체 효모 세포이고/이거나;
    (d) 속 피치아의 효모 세포이고/이거나;
    (e) 피치아 파스토리스인, 배양된 또는 재조합 세포.
  10. 샘플에서 당단백질을 검출하는 방법으로서, 상기 샘플을 항당단백질 항체와 접촉시키는 단계, 및 상기 당단백질과 상기 항당단백질 항체와의 결합을 검출하는 단계를 포함하고, 임의로 상기 당단백질은 만노실화된, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 항당단백질 항체는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항당단백질 항체인, 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 당단백질은
    (a) 효모 종에서 생성되거나;
    (b) 칸디다 종, 데바리오마이세스 한세니, 한세눌라 종(오가타에아 종), 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 막시아누스, 리포마이세스 종, 피치아 스티피티스(쉐페르소마이세스 스티피티스), 피치아 종(코마가타엘라 종), 사카로마이세스 세레비시아에, 스키조사카로마이세스 폼베, 사카로마이콥시스 종, 슈반니오마이세스 옥시덴탈리스, 야로위아 리폴리티카 및 피치아 파스토리스(코마가타엘라 파스토리스)로 이루어진 군으로부터 선택된 효모 종에서 생성되거나;
    (c) 섬질 균류 종에서 생성되거나;
    (d) 트리초데르마 레세이, 아스퍼질러스 종, 아스퍼질러스 니게르, 아스퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 아와모리, 아스퍼질러스 오리자에, 뉴로스포라 크라사, 페니실륨 종, 페니실륨 치리소게눔, 페니실륨 푸르푸로게눔, 페니실륨 푸니쿨로숨, 페니실륨 에머르소니, 리조푸스 종, 리조푸스 미에헤이, 리조푸스 오리자에, 리조푸스 푸실루스, 리조푸스 아르히주스, 파네로차에테 크리소스포륨 및 푸사륨 그라미네아룸으로 이루어진 군으로부터 선택된 섬질 균류 종에서 생성되거나;
    (e) 피치아 파스토리스에서 생성된, 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당단백질과 상기 항당단백질 항체와의 결합을 검출하는 상기 단계는
    (a) ELISA 검정(여기서, 임의로 상기 ELISA 검정은 겨자무과산화효소 또는 유로퓸 검출을 이용함)을 포함하고/하거나;
    (b) 상기 항당단백질 항체는 지지체에 결합하고/하거나;
    (c) 상기 검출 단계는 단백질-단백질 상호작용 모니터링 공정을 이용하고/하거나;
    (d) 상기 검출 단계는 광 간섭법, 이중 편극 간섭법, 정적 광 산란, 동적 광 산란, 다중 각 광 산란, 표면 플라즈몬 공명, ELISA, 화학발광성 ELISA, 유로퓸 ELISA, 파 웨스턴(far western) 또는 전장 발광을 이용하는 단백질-단백질 상호작용 모니터링 공정을 이용하는, 방법.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 정제 칼럼으로부터의 다중 분획에서 실행되고, 당단백질의 검출된 수준에 기초하여, 다중 분획은
    (a) 상기 항당단백질 항체에 결합하는 당단백질이 고갈된 정제된 생성물을 제조하도록(여기서, 임의로 상기 정제된 생성물은 약제학적 투여에 적합함); 또는
    (b) 상기 항당단백질 항체에 결합하는 당단백질이 농후한 정제된 생성물을 제조하도록(여기서, 임의로 상기 정제된 생성물은 약제학적 투여에 적합함) 혼주되고,
    임의로 상기 순도는 상기 폴리펩타이드의 전체 질량의 백분율로서 글라이코실화 폴리펩타이드의 질량을 측정함으로써 결정된, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    (a) 상기 검출된 당단백질은 O 연결 글라이코실화의 결과이고/이거나;
    (b) 상기 검출된 당단백질은 폴리펩타이드의 당변이체이고/이거나;
    (c) 상기 검출된 당단백질은 호르몬, 성장 인자, 수용체, 항체, 사이토카인, 수용체 리간드, 전사 인자 또는 효소이고/이거나;
    (d) 상기 검출된 당단백질은 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 임의로 상기 순도는 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드의 전체 질량의 백분율로서 글라이코실화 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 글라이코실화 경쇄 폴리펩타이드의 질량을 측정함으로써 결정되고/되거나;
    (e) 상기 검출된 당단백질은 인간 항체 또는 인간화 항체 또는 이의 단편을 포함하고/하거나;
    (f) 상기 검출된 당단백질은 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 양 또는 소 기원의 항체를 포함하고/하거나;
    (g) 상기 검출된 당단백질은 토끼 기원의 항체를 포함하고/하거나;
    (h) 상기 검출된 당단백질은 1가, 2가 또는 다가 항체를 포함하고/하거나;
    (i) 상기 검출된 당단백질은 IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IFN-알파, IFN-감마, BAFF, CXCL13, IP-10, CBP, 안지오텐신, 안지오텐신 I, 안지오텐신 II, Nav1.7, Nav1.8, VEGF, PDGF, EPO, EGF, FSH, TSH, hCG, CGRP, NGF, TNF, HGF, BMP2, BMP7, PCSK9 또는 HRG에 특이적으로 결합하는 것의 항체를 포함하는, 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    (a) 10% 미만의 당단백질을 포함하는 샘플 또는 이의 용리물 또는 분획은 혼주되고/되거나;
    (b) 5% 미만의 당단백질을 포함하는 샘플 또는 이의 용리물 또는 분획은 혼주되고/되거나;
    (c) 1% 미만의 당단백질을 포함하는 샘플 또는 이의 용리물 또는 분획은 혼주되고/되거나;
    (d) 0.5% 미만의 당단백질을 포함하는 샘플 또는 이의 용리물 또는 분획은 혼주된, 방법.
  17. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    (a) 90% 초과의 당단백질을 포함하는 샘플 또는 이의 용리물 또는 분획은 혼주되거나;
    (b) 95% 초과의 당단백질을 포함하는 샘플 또는 이의 용리물 또는 분획은 혼주되거나;
    (c) 99% 초과의 당단백질을 포함하는 샘플 또는 이의 용리물 또는 분획은 혼주되거나;
    (d) 99.5% 초과의 당단백질을 포함하는 샘플 또는 이의 용리물 또는 분획은 혼주된, 방법.
  18. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 원하는 폴리펩타이드의 순도에 기초하여 상이한 샘플 또는 이의 용리물 또는 분획을 혼주하는 단계를 추가로 포함하고, 임의로
    (a) 91% 초과의 순도를 포함하는 샘플 또는 이의 용리물 또는 분획은 혼주되거나;
    (b) 97% 초과의 순도를 포함하는 샘플 또는 이의 용리물 또는 분획은 혼주되거나;
    (c) 99% 초과의 순도를 포함하는 샘플 또는 이의 용리물 또는 분획은 혼주된, 방법.
  19. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원하는 폴리펩타이드는 크로마토그래피 지지체를 사용하여 정제되고; 임의로
    (a) 친화도 리간드;
    (b) 단백질 A 및/또는 단백질 G;
    (c) 렉틴;
    (d) 혼합 모드 크로마토그래피 지지체;
    (e) 세라믹 수산화인회석, 세라믹 불화인회석, 결정질 수산화인회석, 결정질 불화인회석, 캅토어드히어(CaptoAdhere), 캅토 MMC(Capto MMC), HEA 하이퍼셀(Hypercel), PPA 하이퍼셀 및 토요펄(Toyopearl) MX-Trp-650M으로부터 선택된 혼합 모드 크로마토그래피 지지체;
    (f) 세라믹 수산화인회석을 포함하는 혼합 모드 크로마토그래피 지지체;
    (g) 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체;
    (h) 뷰틸 세파로스(Sepharose) 4 FF, 뷰틸-S 세파로스 FF, 옥틸 세파로스 4 FF, 페닐 세파로스 BB, 페닐 세파로스 HP, 페닐 세파로스 6 FF 하이 서브(High Sub), 페닐 세파로스 6 FF 로우 서브(Low Sub), 소스(Source) 15ETH, 소스 15ISO, 소스 15PHE, 캅토 페닐, 캅토 뷰틸, 스트림라인 페닐(Streamline Phenyl), TSK 에터 5PW(20㎛ 및 30㎛), TSK 페닐 5PW(20㎛ 및 30㎛), 페닐 650S, M 및 C, 뷰틸 650S, M 및 C, 헥실-650M 및 C, 에터-650S 및 M, 뷰틸-600M, 슈퍼 뷰틸-550C, 페닐-600M, PPG-600M; 기공 크기 120, 200, 300A를 가지는 YMC-팩(YMC-Pack) 옥틸 칼럼-3, 5, 10P, 15 및 25㎛, 기공 크기 120, 200 및 300A를 가지는 YMC-팩 페닐 칼럼-3, 5, 10P, 15 및 25㎛, 기공 크기 120, 200 및 300A를 가지는 YMC-팩 뷰틸 칼럼-3, 5, 10P, 15 및 25㎛, 셀루핀 뷰틸, 셀루핀 옥틸, 셀루핀 페닐; WP HI-프로필(C3); 마크로프렙(Macroprep) t-뷰틸 또는 마크로프렙 메틸; 및 고밀도 페닐―HP2 20㎛으로부터 선택된 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체; 및/또는
    (i) 폴리프로필렌 글라이콜(PPG) 600M 또는 페닐 세파로스 HP를 포함하는 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체를 포함하는, 방법.
  20. 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 불순물을 모니터링하기 위해 크기 배제 크로마토그래피에 의해 하나 이상의 샘플의 분석을 추가로 포함하고, 임의로 상기 크기 배제 크로마토그래피 지지체는 GS3000SW인, 방법.
  21. 샘플에서 당단백질의 농도를 감소시키는 방법으로서, (i) 상기 샘플을 항당단백질 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시켜, 상기 항체 또는 단편이 상기 당단백질에 결합하게 하는 단계, 및 (ⅱ) 상기 항체 또는 단편 및 이에 결합된 상기 당단백질을 상기 샘플의 나머지로부터 분리하여, 상기 샘플에서의 당단백질의 농도를 감소시키는 단계를 포함하고, 임의로 상기 샘플은 생체내 투여에 적합한 약제학적 시약을 포함하고/하거나, 임의로 상기 방법은 정제 칼럼으로부터 혼주된 분획에서 실행된, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 항당단백질 항체는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항당단백질 항체인, 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서,
    (a) 효모 종에서 생성되거나;
    (b) 칸디다 종, 데바리오마이세스 한세니, 한세눌라 종(오가타에아 종), 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 막시아누스, 리포마이세스 종, 피치아 스티피티스(쉐페르소마이세스 스티피티스), 피치아 종(코마가타엘라 종), 사카로마이세스 세레비시아에, 스키조사카로마이세스 폼베, 사카로마이콥시스 종, 슈반니오마이세스 옥시덴탈리스, 야로위아 리폴리티카 및 피치아 파스토리스(코마가타엘라 파스토리스)로 이루어진 군으로부터 선택된 효모 종에서 생성되거나;
    (c) 섬질 균류 종에서 생성되거나;
    (d) 트리초데르마 레세이, 아스퍼질러스 종, 아스퍼질러스 니게르, 아스퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 아와모리, 아스퍼질러스 오리자에, 뉴로스포라 크라사, 페니실륨 종, 페니실륨 치리소게눔, 페니실륨 푸르푸로게눔, 페니실륨 푸니쿨로숨, 페니실륨 에머르소니, 리조푸스 종, 리조푸스 미에헤이, 리조푸스 오리자에, 리조푸스 푸실루스, 리조푸스 아르히주스, 파네로차에테 크리소스포륨 및 푸사륨 그라미네아룸으로 이루어진 군으로부터 선택된 섬질 균류 종에서 생성되거나;
    (e) 피치아 파스토리스에서 생성된, 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 항당단백질 항체는 지지체에 결합하거나;
    (b) 상기 항당단백질 항체는 수지를 포함하는 것에 결합하거나;
    (c) 상기 항당단백질 항체는 아가로스, 가교결합된 아가로스, 폴리아크릴아마이드, 이의 유도체를 포함하는 수지, 또는 작용기, 펩타이드, 또는 단백질이 부동화될 수 있는 또 다른 수지 또는 중합체를 포함하는 것에 결합하는, 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 검출된 당단백질은 O 연결 글라이코실화의 결과이고/이거나;
    (b) 상기 검출된 당단백질은 폴리펩타이드의 당변이체이고/이거나;
    (c) 상기 검출된 당단백질은 호르몬, 성장 인자, 수용체, 항체, 사이토카인, 수용체 리간드, 전사 인자 또는 효소이고/이거나;
    (d) 상기 검출된 당단백질은 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 임의로 상기 순도는 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드의 전체 질량의 백분율로서 글라이코실화 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 글라이코실화 경쇄 폴리펩타이드의 질량을 측정함으로써 결정되고/되거나;
    (e) 상기 검출된 당단백질은 인간 항체 또는 인간화 항체 또는 이의 단편을 포함하고/하거나;
    (f) 상기 검출된 당단백질은 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 양 또는 소 기원의 항체를 포함하고/하거나;
    (g) 상기 검출된 당단백질은 토끼 기원의 항체를 포함하고/하거나;
    (h) 상기 검출된 당단백질은 1가, 2가 또는 다가 항체를 포함하고/하거나;
    (i) 상기 검출된 당단백질은 IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IFN-알파, IFN-감마, BAFF, CXCL13, IP-10, CBP, 안지오텐신, 안지오텐신 I, 안지오텐신 II, Nav1.7, Nav1.8, VEGF, PDGF, EPO, EGF, FSH, TSH, hCG, CGRP, NGF, TNF, HGF, BMP2, BMP7, PCSK9 또는 HRG에 특이적으로 결합하는 것의 항체를 포함하는, 방법.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 샘플에서의 당단백질의 농도는 상기 샘플에서의 전체 단백질의 10% 미만으로 감소하거나;
    (b) 상기 샘플에서의 당단백질의 농도는 상기 샘플에서의 전체 단백질의 5% 미만으로 감소하거나;
    (c) 상기 샘플에서의 당단백질의 농도는 상기 샘플에서의 전체 단백질의 1% 미만으로 감소하거나;
    (d) 상기 샘플에서의 당단백질의 농도는 상기 샘플에서의 전체 단백질의 0.5% 미만으로 감소하거나;
    (e) 상기 샘플에서의 당단백질의 농도는 상기 샘플에서의 전체 단백질의 0.10% 미만으로 감소하거나;
    (f) 상기 샘플에서의 당단백질의 농도는 상기 샘플에서의 전체 단백질의 0.01% 미만으로 감소하고;
    임의로 상기 샘플에서의 당단백질의 농도는 글라이코실화 폴리펩타이드의 질량을 측정함으로써 및/또는 상기 샘플에서의 폴리펩타이드의 전체 질량의 백분율로서 결정된, 방법.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원하는 폴리펩타이드는 크로마토그래피 지지체를 사용하여 정제되고; 임의로
    (a) 친화도 리간드;
    (b) 단백질 A 및/또는 단백질 G;
    (c) 렉틴;
    (d) 혼합 모드 크로마토그래피 지지체;
    (e) 세라믹 수산화인회석, 세라믹 불화인회석, 결정질 수산화인회석, 결정질 불화인회석, 캅토어드히어, 캅토 MMC, HEA 하이퍼셀, PPA 하이퍼셀 및 토요펄 MX-Trp-650M으로부터 선택된 혼합 모드 크로마토그래피 지지체;
    (f) 세라믹 수산화인회석을 포함하는 혼합 모드 크로마토그래피 지지체;
    (g) 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체;
    (h) 뷰틸 세파로스 4 FF, 뷰틸-S 세파로스 FF, 옥틸 세파로스 4 FF, 페닐 세파로스 BB, 페닐 세파로스 HP, 페닐 세파로스 6 FF 하이 서브, 페닐 세파로스 6 FF 로우 서브, 소스 15ETH, 소스 15ISO, 소스 15PHE, 캅토 페닐, 캅토 뷰틸, 스트림라인 페닐, TSK 에터 5PW(20㎛ 및 30㎛), TSK 페닐 5PW(20㎛ 및 30㎛), 페닐 650S, M 및 C, 뷰틸 650S, M 및 C, 헥실-650M 및 C, 에터-650S 및 M, 뷰틸-600M, 슈퍼 뷰틸-550C, 페닐-600M, PPG-600M; 기공 크기 120, 200, 300A를 가지는 YMC-팩 옥틸 칼럼-3, 5, 10P, 15 및 25㎛, 기공 크기 120, 200 및 300A를 가지는 YMC-팩 페닐 칼럼-3, 5, 10P, 15 및 25㎛, 기공 크기 120, 200 및 300A를 가지는 YMC-팩 뷰틸 칼럼-3, 5, 10P, 15 및 25㎛, 셀루핀 뷰틸, 셀루핀 옥틸, 셀루핀 페닐; WP HI-프로필(C3); 마크로프렙 t-뷰틸 또는 마크로프렙 메틸; 및 고밀도 페닐―HP2 20㎛으로부터 선택된 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체; 및/또는
    (i) 폴리프로필렌 글라이콜(PPG) 600M 또는 페닐 세파로스 HP를 포함하는 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체를 포함하는, 방법.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 불순물을 모니터링하기 위해 크기 배제 크로마토그래피에 의해 하나 이상의 샘플의 분석을 추가로 포함하고, 임의로 상기 크기 배제 크로마토그래피 지지체는 GS3000SW인, 방법.
  29. 세포에 의해 분비된 폴리펩타이드의 발현의 수준을 검출하는 방법으로서, (ⅰ) 포획 시약을 상기 세포에 결합시키는 단계; (ⅱ) 상기 세포를 배양하는 단계로서, 이로써 상기 분비된 폴리펩타이드는 발현되고 상기 세포로부터 분비되는, 상기 배양 단계; (ⅲ) 상기 세포를 상기 분비된 폴리펩타이드에 결합하는 검출 시약과 접촉시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 검출 시약을 검출하는 단계로서, 이로써 상기 세포에 의해 분비된 폴리펩타이드의 발현의 수준을 검출하는, 상기 검출 단계를 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 포획 시약은 상기 세포에 비가역적으로 결합하는, 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 포획 시약은 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항당단백질 항체를 포함하는, 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 시약은 상기 분비된 폴리펩타이드에 결합하는 결합 모이어티를 추가로 포함하고, 임의로
    (a) 상기 분비된 폴리펩타이드에 특이적인 항체;
    (b) 항-Fc 항체로서, 상기 분비된 폴리펩타이드는 상기 결합 모이어티에 의해 특이적으로 결합된 Fc 영역 또는 이의 단편을 포함하는, 항체; 또는
    (c) 바이오틴을 포함하는, 방법.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 시약은 바이오틴을 포함하고, 상기 결합 모이어티는 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함하거나, 상기 포획 시약은 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함하고, 상기 결합 모이어티는 바이오틴을 포함하고, 상기 포획 시약 및 상기 결합 모이어티는 아비딘 및 바이오틴의 상호작용에 의해 함께 연결된, 방법.
  34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 세포는 효모 세포이거나;
    (b) 상기 세포는 칸디다 종, 데바리오마이세스 한세니, 한세눌라 종(오가타에아 종), 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 막시아누스, 리포마이세스 종, 피치아 스티피티스(쉐페르소마이세스 스티피티스), 피치아 종(코마가타엘라 종), 사카로마이세스 세레비시아에, 스키조사카로마이세스 폼베, 사카로마이콥시스 종, 슈반니오마이세스 옥시덴탈리스, 야로위아 리폴리티카 및 피치아 파스토리스(코마가타엘라 파스토리스)로 이루어진 군으로부터 선택된 종의 효모 세포이거나;
    (c) 상기 세포는 피치아 파스토리스인, 방법.
  35. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 분비된 폴리펩타이드는 O 연결 글라이코실화의 결과이고/이거나;
    (b) 상기 분비된 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 당변이체이고/이거나;
    (c) 상기 분비된 폴리펩타이드는 호르몬, 성장 인자, 수용체, 항체, 사이토카인, 수용체 리간드, 전사 인자 또는 효소이고/이거나;
    (d) 상기 분비된 폴리펩타이드는 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 임의로 상기 순도는 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 경쇄 폴리펩타이드의 전체 질량의 백분율로서 글라이코실화 중쇄 폴리펩타이드 및/또는 글라이코실화 경쇄 폴리펩타이드의 질량을 측정함으로써 결정되고/되거나;
    (e) 상기 분비된 폴리펩타이드는 인간 항체 또는 인간화 항체 또는 이의 단편을 포함하고/하거나;
    (f) 상기 분비된 폴리펩타이드는 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 양 또는 소 기원의 항체를 포함하고/하거나;
    (g) 상기 분비된 폴리펩타이드는 토끼 기원의 항체를 포함하고/하거나;
    (h) 상기 분비된 폴리펩타이드는 1가, 2가 또는 다가 항체를 포함하고/하거나;
    (i) 상기 분비된 폴리펩타이드는 IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IFN-알파, IFN-감마, BAFF, CXCL13, IP-10, CBP, 안지오텐신, 안지오텐신 I, 안지오텐신 II, Nav1.7, Nav1.8, VEGF, PDGF, EPO, EGF, FSH, TSH, hCG, CGRP, NGF, TNF, HGF, BMP2, BMP7, PCSK9 또는 HRG에 특이적으로 결합하는 것의 항체를 포함하는, 방법.
  36. 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ⅱ)는 폴리에틸렌 글라이콜 또는 또 다른 분자 크라우딩제(crowding agent)를 포함하는 배지 중에 수행되고, 임의로
    (a) 상기 폴리에틸렌 글라이콜은 약 1000Da 내지 약 100kDa의 평균 분자량을 가지거나;
    (b) 상기 폴리에틸렌 글라이콜은 약 5000Da 내지 약 15kDa의 평균 분자량을 가지거나;
    (c) 상기 폴리에틸렌 글라이콜은 약 7000Da 내지 약 9000Da의 평균 분자량을 가지거나;
    (d) 상기 폴리에틸렌 글라이콜은 약 8000Da의 평균 분자량을 가지는, 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    (a) 상기 폴리에틸렌 글라이콜은 약 1% 내지 약 20%(w/v)의 농도로 존재하거나;
    (b) 상기 폴리에틸렌 글라이콜은 약 5% 내지 약 15%(w/v)의 농도로 존재하거나;
    (c) 상기 폴리에틸렌 글라이콜은 약 8% 내지 약 12%(w/v)의 농도로 존재하거나;
    (d) 상기 폴리에틸렌 글라이콜은 약 10%(w/v)의 농도로 존재하는, 방법.
  38. 제29항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ⅱ)는 덱스트란, 피콜(Ficoll) 및/또는 BSA 중 하나 이상을 포함하는 배지 중에 수행되는, 방법.
  39. 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 시약은 형광성 모이어티를 포함하는, 방법.
  40. 제29항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ⅳ)는 형광 활성화 세포 분류에 의해 상기 검출 시약을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  41. 제29항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 비균질 집단에서 실행되고, 임의로 상기 방법은 상기 분비된 폴리펩타이드의 증가한 수준을 발현하는 세포에 대해 세포의 상기 비균질 집단을 농후화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 세포의 상기 비균질 집단은 세포 유전적으로 변형된 세포를 포함하고, 임의로
    (a) 상기 유전적으로 변형된 세포는 화학, 방사성 또는 삽입 돌연변이유발에 의해 돌연변이된 세포를 포함하고/하거나;
    (b) 상기 유전적으로 변형된 세포는 유전적 넉아웃 세포의 라이브러리를 포함하고/하거나;
    (c) 상기 유전적으로 변형된 세포는 플라스미드 라이브러리에 의해 형질전환된 세포를 포함하고/하거나;
    (d) 상기 유전적으로 변형된 세포는 cDNA 라이브러리에 의해 형질전환된 세포를 포함하고/하거나;
    (e) 상기 유전적으로 변형된 세포는 고발현 프로모터에 작동적으로 연결된 cDNA 서열을 함유하는 플라스미드를 포함하는 cDNA 라이브러리에 의해 형질전환된 세포를 포함하고/하거나;
    (f) 상기 유전적으로 변형된 세포는 고카피 플라스미드를 포함하는 cDNA 라이브러리에 의해 형질전환된 세포를 포함하고/하거나;
    (g) 상기 유전적으로 변형된 세포는 효모 종으로부터 얻은 게놈 DNA 또는 cDNA를 포함하는 플라스미드 라이브러리에 의해 형질전환된 세포를 포함하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 효모 종은 피치아 파스토리스인, 방법.
  44. 분비된 폴리펩타이드의 증가한 수준을 발현하는 세포로서, 상기 세포는 제29항 내지 제43항 중 어느 한 항의 방법에 의해 검출된, 세포.
  45. 분비된 폴리펩타이드의 발현 수준을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 세포로서, 상기 세포는 제29항 내지 제43항 중 어느 한 항의 방법에 의해 검출된 유전적 변형을 함유하는, 세포.
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