KR20180129791A

KR20180129791A - 혈 중에서 합토글로빈에 결합하여 다가의 면역 복합체를 형성하는 항체를 유효 성분으로 하는 자기 면역 질환 치료제

Info

Publication number: KR20180129791A
Application number: KR1020187027802A
Authority: KR
Inventors: 유코 가토; 료스케 나카노
Original assignee: 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤
Priority date: 2016-03-29
Filing date: 2017-03-28
Publication date: 2018-12-05
Also published as: EP3438261A4; AU2017244763A1; JPWO2017170597A1; EP3438261A1; US20190276521A1; CN108884457A; TW201806615A; CA3019095A1; WO2017170597A1

Abstract

본 발명은, IVIG의 대체로 할 수 있는, Fcγ 수용체에 대하여 높은 결합 활성을 갖는 항체, 해당 항체를 코딩하는 DNA, 해당 DNA를 포함하는 벡터, 해당 벡터를 도입하여 얻어지는 형질 전환체, 해당 형질 전환체를 사용하는 항체의 제조 방법, 해당 항체를 유효 성분으로 하는 자기 면역 질환 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은, 서열 번호 70으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간 합토글로빈의 β쇄를 특이적으로 인식하고, 해당 인간 합토글로빈에 결합하여 다가의 면역 복합체를 형성하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.

Description

혈 중에서 합토글로빈에 결합하여 다가의 면역 복합체를 형성하는 항체를 유효 성분으로 하는 자기 면역 질환 치료제

본 발명은, 혈 중에서 인간 합토글로빈에 결합하여 다가의 면역 복합체를 형성하고, Fcγ 수용체에 대하여 높은 결합 활성을 갖는 항체, 해당 항체를 코딩하는 DNA, 해당 DNA를 포함하는 벡터, 해당 벡터를 도입하여 얻어지는 형질 전환체, 해당 형질 전환체를 사용하는 항체의 제조 방법, 해당 항체를 유효 성분으로 하는 자기 면역 질환 치료제에 관한 것이다.

정맥 주사용 면역 글로불린(Intravenous Immunoglobulin: IVIG)은 건강한 사람의 혈장에서 유래되는 IgG를 고순도로 정제한 혈액 제재이다. 저감마글로불린혈증 또는 무감마글로불린혈증 등에 대해서는 감염 방어를 목적으로 하여 사용되고, 자기 면역 질환에 대해서는 면역 제어를 목적으로 사용되고 있다.

IVIG의 구체적인 예로서는, 예를 들어 타나베 미쓰비시 세이야꾸사의 베노글로불린 IH, 데이진 파마사의 베니론-I, 일본 적십자사의 폴리글로불린 N, 백스터사의 감마가드, 일본 세이야꾸사의 글로베닌-I, CSL 베링사의 프리비젠 등을 들 수 있다.

IVIG의 약효 메커니즘으로서는, 다양한 설이 제창되어 있다. 예를 들어, 마크로파지 세포 표면 상의 Fcγ 수용체(FcγR)의 저해, 마크로파지에 있어서의 FcγR II b의 발현 상승을 통한 탐식 기능의 억제, 시알릴화 항체에 의한 마크로파지에서의 FcγR II b의 발현 상승, B 세포의 증식 억제나 아포토시스 유도, B 세포의 자기 항체 산생 억제, 항이디오타입 항체에 의한 자기 항체의 중화, 자기 항체에 의한 보체 소비의 저해, 사이토카인이나 T 세포의 기능 저해 등이다(비특허문헌 1, 2).

FcγR의 저해에 기초하는 IVIG의 약효는, 예를 들어 면역성 혈소판 감소증[ITP, 특발성(면역성) 혈소판 감소성 자반병이라고도 함]의 치료에 있어서 초래된다. ITP는, 혈소판에 대한 자기 항체에 의해, 옵소닌화된 혈소판이 망내계에서 각종 FcγR을 통해 마크로파지에 탐식됨으로써 발병한다(비특허문헌 1).

따라서, IVIG는, FcγR을 저해함으로써, 혈소판이 탐식되는 것을 저해한다고 되어 있다(비특허문헌 3). 실제로, Macrogenics사의 FcγR III a 항체(제품명 GMA161)는, 개발은 Phase I에서 중단되었으나, ITP에 있어서의 약효가 확인되었다(Clinical Trials. gov NCT00244257)(비특허문헌 4).

IVIG에 의한 FcγR의 저해는, IVIG에 포함되는 항체와 혈청 단백질이 형성하는 각종 면역 복합체(Immune Complex: IC)나, IVIG에 포함되는 항체의 이량체 또는 응집체 등의 성분에 의해 증강된다는 가설도 제창되어 있다(비특허문헌 5).

특히 Lemieux 등은, IVIG에는 자기의 혈청 단백질에 반응하는 성분이 최대로 3％ 정도 포함되어 있고, 해당 성분이 혈청과 혼합되었을 때에 가용성 면역 복합체를 형성하는 것을 개시하고 있다(비특허문헌 6, 7). 또한, 마우스의 ITP 모델에 대하여 가용성 면역 복합체가 IVIG보다도 높은 비활성을 갖는 것이 개시되어 있다(비특허문헌 8).

이들 지견은, IVIG에 포함되는 성분이 혈청 단백질과 결합함으로써, FcγR을 통한 자기 조직에 대한 탐식 기능을 저해하는 면역 제어 효과를 나타내는 것을 시사하고 있다. 실제로, 자기 항체를 정제하여 자기 면역 질환 치료에 사용한다는 개념도 제창되어 있다(특허문헌 1).

또한, 자기 면역 질환에 대한 IVIG의 투여량은, 기본 처방으로 1일 0.4g/kg의 연속 5일간 투여로 매우 고용량인 것이 알려져 있다. 고용량 투여는 혈전증 등의 부작용, 점적에 의한 긴 투여 시간 등의 문제를 초래한다(비특허문헌 9). 따라서, IVIG를 비활성이 높은 유효 성분을 포함하는 약제로 치환하여, 용량을 저감시킬 필요성은 높다고 생각된다.

미국 특허 출원 공개 제2004/0101909호 명세서

Trends in Immunology, 2008. 29(12): p. 608-615 Science. 2006, 313(5787): p. 670-673 이케다 야스오, 최신 의학 별책 혈소판 감소증ㆍ증가증 최신 의학사 ASH Annual Meeting 2006 Abstract 1074 J Clin Invest. 2005, 115(1): p. 25-27 Int Immunol. 2004, 16(7): p. 929-936 Curr Pharm Des. 2006, 12(2): p. 173-179 Br J Haematol. 2004, 127(1): p. 90-96 혈액 프런티어 2007, 17(1): p. 17-19

IVIG에 포함되는 유효 성분을 동정하고, IVIG의 대체로 하는 것은, 고용량의 IVIG를 투여해야 할 자기 면역 질환 치료를 보다 간편하게 할 수 있는 수단으로서 기대되고 있다. 따라서, 본 발명은, IVIG의 대체로 할 수 있는, Fcγ 수용체에 대하여 높은 결합 활성을 갖는 항체, 해당 항체를 코딩하는 DNA, 해당 DNA를 포함하는 벡터, 해당 벡터를 도입하여 얻어지는 형질 전환체, 해당 형질 전환체를 사용하는 항체의 제조 방법, 해당 항체를 유효 성분으로 하는 자기 면역 질환 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, IVIG로부터 유효 성분을 동정할 목적으로, FcγR III a(CD16a)를 고상화한 칼럼을 사용하고, IVIG와 혈청의 혼합액에 포함되는, CD16a에 대한 높은 결합 활성을 갖는 IgG 성분의 분리와 동정을 시도하였다.

그 결과, 높은 재현성으로 높은 해당 결합 활성이 검출되는 IgG 성분으로서, 혈청 단백질인 합토글로빈(Haptoglobin; Hp, 이하 Hp라고 표기하는 경우도 있음)을 인식하는 IgG 성분을 동정하였다. 해당 성분은 IVIG 중의 유효 성분의 하나라고 생각된다.

그래서, 항Hp 항체의 취득을 시도한 바, 해당 항체 및 Hp를 포함하는 면역 복합체를 형성함으로써, IVIG보다도 강하게 CD16a에 결합하는 항Hp 항체의 취득에 성공하여, 본 발명을 완성시켰다.

본 발명은 이하의 (1) 내지 (22)에 관한 것이다.

(1) 서열 번호 70으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간 합토글로빈의 β쇄를 특이적으로 인식하고, 해당 인간 합토글로빈에 결합하여 다가의 면역 복합체를 형성하는 모노클로날 항체.

(2) 이하의 (a) 내지 (d)로부터 선택되는 1의 항체와 경합하여 서열 번호 70으로 표시되는 인간 합토글로빈의 β쇄를 특이적으로 인식하고, 상기 항체가 결합하는 인간 합토글로빈에 포함되는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체.

(a) 상보쇄 결정 영역(complementarity determining region, 이하 CDR이라 기재함) 1 내지 3이 각각 서열 번호 31, 32 및 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄(이하, H쇄라 기재함)를 포함하며, 또한 CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 34, 35 및 36으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄(이하, L쇄라 기재함)를 포함하는 항체

(b) CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 37, 38 및 39로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하며, 또한 CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 40, 41 및 42로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 항체

(c) 서열 번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하며, 또한 서열 번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 항체

(d) 서열 번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하며, 또한 서열 번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 항체

(3) 이하의 (a) 내지 (d)로부터 선택되는 1의 모노클로날 항체.

(a) CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 31, 32 및 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하며, 또한 CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 34, 35 및 36으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 항체

(4) 서열 번호 70으로 표시되는 인간 합토글로빈의 β쇄의 아미노산 서열 중, 적어도 44번째의 Phe 및 49번째의 Glu에 결합하는, (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체.

(5) 서열 번호 70으로 표시되는 인간 합토글로빈의 β쇄의 아미노산 서열 중, 적어도 155번째의 Ser, 156번째의 Thr 및 157번째의 Val에 결합하는, (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체.

(6) 유전자 재조합 항체인, (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체.

(7) 인간형 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로부터 선택되는 유전자 재조합 항체인, (6)에 기재된 모노클로날 항체.

(8) 모노클로날 항체가 형성하는 다가의 면역 복합체가, 인간 Fcγ 수용체 III, 인간 Fcγ 수용체 II 및 인간 Fcγ 수용체 I로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 인간 Fcγ 수용체에 결합하는, (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체.

(9) 모노클로날 항체가 형성하는 다가의 면역 복합체가, 적어도 항체 2 분자 및 인간 합토글로빈 1 분자를 포함하는, (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체.

(10) 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 당쇄의 환원 말단 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되지 않은, (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체.

(11) (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA.

(12) (11)에 기재된 DNA를 함유하는 재조합체 벡터.

(13) (12)에 기재된 재조합체 벡터를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환체.

(14) (13)에 기재된 형질 전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체를 생성 축적시켜, 배양물로부터 해당 항체를 채취하는 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체의 제조 방법.

(15) (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체를 투여하는 것을 포함하는, 자기 면역 질환의 치료 방법.

(16) (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체와 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 자기 면역 질환 치료제.

(17) 인간 합토글로빈에 결합하는 모노클로날 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는 자기 면역 질환 치료제.

(18) 모노클로날 항체가 유전자 재조합 항체인, (17)에 기재된 자기 면역 질환 치료제.

(19) 모노클로날 항체가 인간형 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로부터 선택되는 유전자 재조합 항체인, (18)에 기재된 자기 면역 질환 치료제.

(20) 모노클로날 항체가 인간 합토글로빈에 결합하여 다가의 면역 복합체를 형성하는 항체인, (17) 내지 (19) 중 어느 하나에 기재된 자기 면역 질환 치료제.

(21) 모노클로날 항체가 형성하는 다가의 면역 복합체가, 인간 Fcγ 수용체 III, 인간 Fcγ 수용체 II 및 인간 Fcγ 수용체 I로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 인간 Fcγ 수용체에 결합하는, (17) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 자기 면역 질환 치료제.

(22) 모노클로날 항체가 형성하는 다가의 면역 복합체가, 적어도 항체 2 분자 및 인간 합토글로빈 1 분자를 포함하는, (20) 또는 (21)에 기재된 자기 면역 질환 치료제.

본 발명의 항체는 인간 합토글로빈과 결합하여 다가의 면역 복합체를 형성함으로써, 해당 항체의 Fc 도메인에 있어서 CD16a와 결합하고, 항체 의존성 세포 상해(ADCC) 반응을 IVIG보다도 강력하게 저해한다. 따라서, 본 발명에 의해, 인간 합토글로빈에 결합하는 항체를 유효 성분으로서 함유하는 자기 면역 질환 치료제가 제공된다.

도 1의 A 내지 도 1의 F는 항Hp 항체, 항Hp 항체 및 인간 Hp를 포함하는 면역 복합체, 그리고 IVIG의, CD16a에 대한 결합 활성을 나타낸 것이다. 횡축에 항체 농도(μg/mL)를, 종축에 흡광도(415-490nm)를 나타낸다. 도 1의 A는 항체 #4, 도 1의 B는 항체 #6, 도 1의 C는 항체 #27, 도 1의 D는 항체 #105, 도 1의 E는 항체 #96-6, 도 1의 F는 IVIG의 결합 활성을 나타내고 있고, ■는 항Hp 항체(도 1의 A 내지 도 1의 E) 또는 IVIG(도 1의 F), □는 항Hp 항체 및 인간 Hp를 포함하는 면역 복합체를 나타낸다(도 1의 A 내지 도 1의 F).
도 2는 항Hp 항체의 인간 Hp에 대한 결합 활성을 나타낸 것이다. 횡축에 항체 농도(μg/mL)를, 종축에 흡광도(405nm)를 나타낸다. ■는 항체 #6, □는 항체 #27, ▲는 항체 #105, △는 항체 #96-6, ○는 항DNP 항체를 나타낸다.
도 3의 A 내지 도 3의 E는 항Hp 항체, 항Hp 항체 및 인간 Hp를 포함하는 면역 복합체의, CD32a에 대한 결합 활성을 나타낸 것이다. 횡축에 항체 농도(μg/mL)를, 종축에 흡광도(415-490nm)를 나타낸다. 도 3의 A는 항체 #4, 도 3의 B는 항체 #6, 도 3의 C는 항체 #27, 도 3의 D는 항체 #105, 도 3의 E는 항체 #96-6의 결합 활성을 나타내고, ■는 항Hp 항체, □는 항Hp 항체 및 인간 Hp를 포함하는 면역 복합체를 나타낸다.
도 4는 항Hp 항체(푸코오스 결합형 및 푸코오스 비결합형), 푸코오스 비결합형 항Hp 항체 및 인간 Hp를 포함하는 면역 복합체, 그리고 IVIG에 의한, 항DNP 항체 및 CD16a간의 결합에 대한 저해 활성을 나타낸 것이다. 횡축에 항체 농도(μg/mL)를, 종축에 형광 강도를 나타낸다. ●는 IVIG, ■는 항체 #27, □는 항체 #27의 푸코오스 비결합형, ◇는 항체 #27의 푸코오스 비결합형에 의한 면역 복합체, △는 항체 #105의 푸코오스 비결합형에 의한 면역 복합체, *은 항체 없음을 나타낸다.
도 5는 항Hp 항체(푸코오스 결합형 및 푸코오스 비결합형), 푸코오스 비결합형 항Hp 항체 및 인간 Hp를 포함하는 면역 복합체, 그리고 IVIG에 의한, PBMC를 사용한 ADCC 반응에 대한 저해 활성을 나타낸 것이다. 횡축에 항체 농도(μg/mL)를, 종축에 ADCC(％)를 나타낸다. ●는 IVIG, ■는 항체 #105, □는 항체 #105의 푸코오스 비결합형, △는 항체 #27의 푸코오스 비결합형에 의한 면역 복합체, ◇는 항체 #105의 푸코오스 비결합형에 의한 면역 복합체, *은 항체 없음, -는 인간 Hp만을 나타낸다.
도 6의 A는, 항체 #27, 항체 #105, 항DNP 항체 및 이들 항체의 각종 개변형, 그리고 IVIG에 의한, 건강인 도너 말초 혈액 및 리툭시맙(rituximab)을 사용한 ADCC 반응에 대한 저해 활성을 나타낸 것이다. 종축에 B 세포수에 비례하는 카운트를 나타낸다. 1은 ADCC 미반응된 샘플, 2는 리툭시맙에 의해 ADCC 반응을 행한 샘플, 3 내지 14는 각종 항체 등 존재 하, 리툭시맙에 의해 ADCC 반응을 행한 샘플의 결과를 나타낸다. 각종 항체 등으로서 구체적으로는, 3은 IVIG(3333μg/mL), 4는 항체 #105(250μg/mL), 5는 항체 #27(250μg/mL), 6은 항체 #105의 푸코오스 비결합형(250μg/mL), 7은 항체 #27의 비푸코오스 결합형(250μg/mL), 8은 항DNP 항체의 푸코오스 비결합형(250μg/mL), 9는 Fc 아미노산 개변(S239D, I332E)을 실시한 항체 #105의 푸코오스 비결합형(50μg/mL), 10은 Fc 아미노산 개변(S239D, I332E)을 실시한 항체 #27의 푸코오스 비결합형(50μg/mL), 11은 Fc 아미노산 개변(S239D, I332E)을 실시한 항DNP 항체의 푸코오스 비결합형(50μg/mL), 12는 Fc 아미노산 개변(S239D, I332E)을 실시한 항체 #105의 푸코오스 비결합형(10μg/mL), 13은 Fc 아미노산 개변(S239D, I332E)을 실시한 항체 #27의 푸코오스 비결합형(10μg/mL), 14는 Fc 아미노산 개변(S239D, I332E)을 실시한 항DNP 항체의 푸코오스 비결합형(10μg/mL)을 나타낸다. 도 6의 B는 항체 #4 및 항체 #27의 각종 개변형, 및 IVIG에 의한, 건강인 도너 말초 혈액 및 리툭시맙을 사용한 ADCC 반응에 대한 저해 활성을 나타낸 것이다. 종축에 림프구에서 차지하는 B 세포의 비율을 나타낸다. 1은 ADCC 미반응된 샘플, 2는 리툭시맙에 의해 ADCC 반응을 행한 샘플, 3 내지 8은 각종 항체 등 존재 하에 리툭시맙에 의해 ADCC 반응을 행한 샘플의 결과를 나타낸다. 각종 항체 등으로서 구체적으로는, 3은 IVIG(2000μg/mL), 4는 IVIG(8000μg/mL), 5는 Fc 아미노산 개변(S239D, S298A, I332E)을 실시한 항체 #4의 푸코오스 비결합형(50μg/mL), 6은 Fc 아미노산 개변(S239D, S298A, I332E)을 실시한 항체 #27의 푸코오스 비결합형(50μg/mL), 7은 Fc 아미노산 개변(S239D, S298A, I332E)을 실시한 항체 #4의 푸코오스 비결합형(10μg/mL), 8은 Fc 아미노산 개변(S239D, S298A, I332E)을 실시한 항체 #27의 푸코오스 비결합형(10μg/mL)을 나타낸다.
도 7은, 마우스 면역성 혈소판 감소증(Immune Thrombocytopenia: ITP) 모델에 있어서의 작용을 나타낸 것이다. 종축에 혈소판수(x10³/μL)를 나타낸다. 1은 항혈소판 항체를 투여하지 않은 군, 2는 컨트롤군, 3 및 4는 IVIG를 각각 10, 40mg/head의 용량으로 투여한 군, 5 내지 8은 #105의 푸코오스 비결합형이면서 Fc 아미노산 개변형(G236A, S239D, I332E)을 각각 0.08, 0.4, 2, 10mg/head의 용량으로 투여한 군의 결과를 나타낸다.

인간 합토글로빈은, 하나의 α쇄와 하나의 β쇄를 포함하는 서브유닛(이하, α/β-서브유닛이라 기재함)이 2개 이상 결합한 당 단백질이다. 인간 합토글로빈의 합성 과정은 3단계로 나뉜다.

제1 단계째에서는, 하나의 오픈 리딩 프레임에 코딩되어 있는 α쇄와 β쇄가 연결되어 하나의 폴리펩티드로서 발현한다.

제2 단계째에서는, 폴리펩티드의 α쇄간의 디술피드 결합에 의해 2개 이상의 폴리펩티드에 의해 구성되는 합토글로빈 전구체를 형성한다. 동시에, 폴리펩티드의 분자 내에서도 α쇄와 β쇄 사이에 디술피드 결합을 형성한다.

제3 단계째에서는, 폴리펩티드가 특이적인 단백질 분해에 의해 α쇄와 β쇄로 분리되고, α쇄와 β쇄가 디술피드 결합을 형성한 α/β-서브유닛이 된다. 이상의 과정에 의해, 인간 합토글로빈은, 상기한 α/β-서브유닛이 2개 이상 결합한 구조를 형성한다[Redox Rep., 6, 379(2001)].

본 발명에 있어서의 인간 합토글로빈은, α/β-서브유닛이 4개 결합한 것을 기본 구조로 한다. 이 α쇄와 β쇄를 연결하여 코딩하는 인간 합토글로빈 유전자에는, 2종류의 유전자 다형이 존재하고, 각각 GenBank 액세션 번호 NM_005143.3(서열 번호 67) 또는 NM_001126102.1(서열 번호 68)로 표시된다. 이들 유전자의 차이는 α쇄를 코딩하는 부분에 있고, β쇄를 코딩하는 부분은 동일하다.

구체적으로는, 서열 번호 67에서는, α쇄의 엑손 3 및 엑손 4 영역이 중복되어 있다. 이 중복되어 있는 영역에 시스테인 잔기가 코딩되어 있기 때문에, 서열 번호 67이 번역되어 생성되는 α쇄를 포함하는 합토글로빈은, 디술피드 결합에 의해 α/β-서브유닛이 3개 이상 결합한, 보다 큰 다량체를 형성할 수 있다[J. Biochem. Mol. Biol., 40, 1028(2007)].

α쇄의 아미노산 서열은 GenBank 액세션 번호 NP_005134.1(서열 번호 65)의 19번째로부터 160번째의 아미노산 서열(서열 번호 69) 또는 NP_001119574.1(서열 번호 66)의 19번째로부터 101번째의 아미노산 서열(서열 번호 71)로 표시된다. β쇄의 아미노산 서열은, GenBank 액세션 번호 NP_005134.1(서열 번호 65)의 162번째로부터 406번째의 아미노산 서열(서열 번호 70) 또는 NP_001119574.1(서열 번호 66)의 103번째로부터 347번째의 아미노산 서열(서열 번호 70)로 표시된다.

본 발명의 인간 합토글로빈으로서는, α쇄로서 서열 번호 69 또는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 및 β쇄로서 서열 번호 70으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 합토글로빈 기능을 갖는 폴리펩티드, α쇄로서 서열 번호 69 또는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 및 β쇄로서 서열 번호 70으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, α쇄 및/또는 β쇄의 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 합토글로빈 기능을 갖는 폴리펩티드, α쇄로서 서열 번호 69 또는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 및 β쇄로서 서열 번호 70으로 표시되는 아미노산 서열과, α쇄 및/또는 β쇄가 60％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 합토글로빈 기능을 갖는 폴리펩티드 그리고 α쇄로서 서열 번호 69 또는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 및 β쇄로서 서열 번호 70으로 표시되는 아미노산 서열의 부분 서열을 포함하는 α쇄 및/또는 β쇄의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 합토글로빈 기능을 갖는 폴리펩티드 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 인간 합토글로빈으로서는, 일본 혈액 제제(製劑) 기구가 판매하고 있는 인간 합토글로빈 등을 들 수 있다.

인간 합토글로빈의 기능으로서는, 용혈에 의해 혈액 중에 유리된 헤모글로빈과 특이적으로 결합하여 면역 복합체를 형성하고, 오줌 중에의 유리 헤모글로빈의 상실을 방지함으로써, 체내로부터의 철의 누출이나, 유리 헤모글로빈에 의한 산화적 혈관 장애 및 신장 세뇨관 장애를 방지하는 것을 들 수 있다.

α쇄로서 서열 번호 69 또는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 및 β쇄로서 서열 번호 70으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 얻는 방법으로서는, 부위 특이적 변이 도입법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982), Gene, 34, 315(1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431(1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488(1985)] 등을 사용하여, 예를 들어 서열 번호 69, 70 또는 71로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA, 즉, 인간 합토글로빈을 코딩하는 유전자에, 부위 특이적 변이를 도입함으로써 얻을 수 있다. 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 1개 내지 수십개, 예를 들어 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1개 내지 수개, 예를 들어 1 내지 5개의 아미노산이다.

인간 합토글로빈을 코딩하는 유전자로서는, 서열 번호 67 또는 서열 번호 68로 표시되는 염기 서열을 들 수 있다. 서열 번호 67 또는 서열 번호 68로 표시되는 염기 서열에 있어서, 1 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열을 포함하고, 또한 인간 합토글로빈 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 유전자, 서열 번호 67 또는 서열 번호 68로 표시되는 염기 서열과 적어도 60％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열, 바람직하게는 80％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열, 더욱 바람직하게는 95％ 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하고, 또한 인간 합토글로빈 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 유전자, 및 서열 번호 67 또는 서열 번호 68로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA와 혹독한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 DNA를 포함하고, 또한 인간 합토글로빈 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 유전자 등도 본 발명의 합토글로빈을 코딩하는 유전자에 포함된다.

혹독한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 DNA로서는, 서열 번호 67 또는 서열 번호 68로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA를 프로브에 사용한, 콜로니ㆍ하이브리다이제이션법, 플라크ㆍ하이브리다이제이션법, 서던 블롯ㆍ하이브리다이제이션법 또는 DNA 마이크로어레이법 등에 의해 얻어지는 하이브리다이즈 가능한 DNA를 의미한다.

구체적으로는, 하이브리다이즈한 콜로니 또는 플라크 유래의 DNA 또는 해당 서열을 갖는 PCR산물 또는 올리고 DNA를 고정화한 필터 또는 슬라이드 글래스를 사용하여, 0.7 내지 1.0mol/L의 염화나트륨 존재 하에 65℃에서 하이브리다이제이션[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997), DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University, (1995)]을 행한 후, 0.1 내지 2배 농도의 SSC 용액(1배 농도의 SSC 용액의 조성은, 150mmol/L 염화나트륨, 15mmol/L 시트르산나트륨을 포함함)을 사용하고, 65℃ 조건 하에서 필터 또는 슬라이드 글래스를 세정함으로써 동정할 수 있는 DNA를 들 수 있다.

하이브리다이즈 가능한 DNA로서는, 서열 번호 67 또는 서열 번호 68로 표시되는 염기 서열과 적어도 60％ 이상의 상동성을 갖는 DNA, 바람직하게는 80％ 이상의 상동성을 갖는 DNA, 더욱 바람직하게는 95％ 이상의 상동성을 갖는 DNA를 들 수 있다.

진핵 생물의 단백질을 코딩하는 유전자의 염기 서열에는, 종종 유전자의 다형이 확인된다. 본 발명에 있어서 사용되는 유전자에, 이러한 다형에 의해 염기 서열에 소규모의 변이를 발생한 유전자도, 본 발명에서 사용하는 합토글로빈을 코딩하는 유전자에 포함된다.

본 발명에 있어서의 상동성의 수치는, 특별히 명시한 경우를 제외하고, 당업자에게 공지된 상동성 검색 프로그램을 사용하여 산출되는 수치이면 되지만, 염기 서열에 대해서는, BLAST[J. Mol. Biol., 215, 403(1990)]에 있어서 디폴트의 파라미터를 사용하여 산출되는 수치 등, 아미노산 서열에 대해서는, BLAST2[Nucleic Acids Res., 25, 3389(1997), Genome Res., 7, 649(1997), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html]에 있어서 디폴트의 파라미터를 사용하여 산출되는 수치 등을 들 수 있다.

디폴트의 파라미터로서는, G(Cost to open gap)가 염기 서열인 경우에는 5, 아미노산 서열인 경우에는 11, -E(Cost to extend gap)가 염기 서열인 경우에는 2, 아미노산 서열인 경우에는 1, -q(Penalty for nucleotide mismatch)가 -3, -r(reward for nucleotide match)이 1, -e(expect value)가 10, -W(wordsize)가 염기 서열인 경우에는 11 잔기, 아미노산 서열인 경우에는 3 잔기, -y[Dropoff(X) for blast extensions in bits]가 blastn인 경우에는 20, blastn 이외의 프로그램에서는 7, -X(X dropoff value for gapped alignment in bits)가 15 및 Z(final X dropoff value for gapped alignment in bits)가 blastn인 경우에는 50, blastn 이외의 프로그램에서는 25이다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html).

α쇄로서 서열 번호 69 또는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 및 β쇄로서 서열 번호 70으로 표시되는 아미노산 서열의 부분 서열을 포함하는 폴리펩티드를 얻는 방법으로서는, 예를 들어 서열 번호 69, 70 또는 71로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA의 일부를 결실시키고, 이것을 포함하는 재조합체 벡터를 도입한 형질 전환체를 배양함으로써 제작할 수 있다.

또한, α쇄로서 서열 번호 69 또는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 및 β쇄로서 서열 번호 70으로 표시되는 아미노산 서열의 부분 서열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드도, 전술한 부위 특이적 변이 도입법 등을 사용하여 얻을 수 있다.

또한, α쇄로서 서열 번호 69 또는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 및 β쇄로서 서열 번호 70으로 표시되는 아미노산 서열의 부분 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 α쇄로서 서열 번호 69 또는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 및 β쇄로서 서열 번호 70으로 표시되는 아미노산 서열의 부분 서열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는, 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc)법 또는 t-부틸옥시카르보닐(tBoc)법 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있다.

본 발명의 모노클로날 항체(이하, 본 발명의 항체라고도 함)는 인간 합토글로빈 중, β쇄의 아미노산 서열 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하며, 또한 결합하는 항체이며, 혈 중에서 다가의 면역 복합체를 형성한다.

본 발명에 있어서의 인간 합토글로빈의 입체 구조로서는, α쇄로서 서열 번호 69 또는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 및 β쇄로서 서열 번호 70으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간 합토글로빈이 천연 상태에서 취할 수 있는 구조와 동등한 효능을 갖고 있으면, 어느 구조여도 된다. 인간 합토글로빈이 천연 상태에서 취할 수 있는 입체 구조란, 인간 합토글로빈의 천연형 입체 구조를 말한다.

본 발명에 있어서의 다가의 면역 복합체란, 구체적으로는 적어도 2 분자의 본 발명 항체 및 적어도 1 분자의 인간 합토글로빈을 포함하는 면역 복합체를 들 수 있다. 해당 면역 복합체에 적어도 항체 2 분자 및 인간 합토글로빈 1 분자를 포함함으로써, CD16 및 CD32에 대한 높은 결합 활성을 나타내고, ADCC 반응에 대한 우수한 저해 활성을 나타낸다.

상기 1 분자의 인간 합토글로빈에는, 서열 번호 69 또는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 하나의 α쇄 및 서열 번호 70으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 하나의 β쇄를 포함하는 α/β-서브유닛이 4개 포함된다.

본 발명의 모노클로날 항체 및 인간 합토글로빈이 결합하여 형성되는 다가의 면역 복합체의 분자량은, 5×10⁵ 이상인 것이 바람직하고, 7×10⁵ 이상인 것이 보다 바람직하다. 해당 면역 복합체의 분자량이 5×10⁵ 이상임으로써, CD16 및 CD32에 대한 높은 결합 활성을 나타내고, ADCC 반응에 대한 우수한 저해 활성을 나타낸다.

본 발명의 항체가 다가의 면역 복합체를 형성하는 것은, 예를 들어 HPLC 등을 사용한 겔 여과 크로마토그래피로 확인할 수 있다.

본 발명의 항체가 형성하는 면역 복합체가, 적어도 2 분자의 본 발명 항체 및 적어도 1 분자의 인간 합토글로빈을 포함하는 것은, 면역 복합체의 분자량으로부터 확인할 수 있다. 면역 복합체의 분자량은, 예를 들어 HPLC 등을 사용한 겔 여과 크로마토그래피에 의해 해당 면역 복합체를 분리 및 검출함으로써 측정할 수 있다. 본 발명의 항체 분자량이 약 150kDa인 것, 및 인간 합토글로빈의 분자량이 약 200 내지 220kDa인 것으로부터, 해당 면역 복합체에 포함되는 항체와 항원의 분자수를 산출할 수 있다.

본 발명의 항체로서는, 구체적으로는 서열 번호 70으로 표시되는 인간 합토글로빈의 β쇄의 아미노산 서열 중, 적어도 44번째의 Phe(페닐알라닌) 및 49번째의 Glu(글루탐산)에 결합하는 항체를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 항체로서는, 구체적으로는 서열 번호 70으로 표시되는 인간 합토글로빈의 β쇄의 아미노산 서열 중, 적어도 155번째의 Ser(세린), 156번째의 Thr(트레오닌) 및 157번째의 Val(발린)에 결합하는 항체를 들 수 있다.

상기 항체로서, 구체적으로는 이하의 (a) 또는 (b)의 모노클로날 항체를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 모노클로날 항체로서 보다 구체적으로는, 이하의 (c) 또는 (d)의 모노클로날 항체를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 모노클로날 항체로서는, 상기 모노클로날 항체와 경합하여, 인간 합토글로빈의 아미노산 서열 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하고, 상기 모노클로날 항체가 결합하는 인간 합토글로빈에 포함되는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체를 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 모노클로날 항체와 경합하는 항체란, 본 발명의 모노클로날 항체와 동일하거나 또는 부분적으로 동일한 에피토프(항원 결정기라고도 함)를 가지고, 해당 에피토프에 결합하는 항체를 말한다. 본 발명의 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체란, 본 발명의 모노클로날 항체가 인식하는 인간 합토글로빈의 아미노산 서열과 동일한 서열을 인식하여 결합하는 항체를 말한다.

본 발명의 모노클로날 항체가, 인간 합토글로빈의 아미노산 서열 또는 그의 입체 구조에 결합하는 것은, 방사선 면역 검정, 효소 면역 측정법(ELISA), 웨스턴 블롯법, 면역 조직 염색(IHC)법, 공지된 면역학적 검출법 등, 특정한 항원과 특정 항원에 대한 항체의 결합 활성을 조사하는 방법에 의해 확인할 수 있다.

구체적으로는, FMAT8100HTS 시스템(어플라이드 바이오시스템사제) 등을 사용하는 형광 항체 염색법[Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993)], 플로우 사이토메트리를 사용하는 형광 염색법, Biacore 시스템(GE 헬스 케어사제) 등을 사용한 표면 프라즈몬 공명, ITC(DKSH사제) 등을 사용한 등온 적정 칼로리메트리 등의 방법을 들 수 있다.

본 발명의 모노클로날 항체가 인간 합토글로빈의 아미노산 서열 또는 그의 입체 구조에 결합하는 것을, Biacore 시스템(GE 헬스 케어사제) 등을 사용한 표면 프라즈몬 공명으로 확인하는 경우에는, 항IgG 항체를 센서 칩 CM5에 아민 커플링법에 의해 고정한 후, 해당 항체를 흘려 적당량 결합시키고, 추가로 농도 기지의 복수 농도의 인간 합토글로빈 또는 그의 융합체를 흘려, 결합, 해리를 측정하는 것이 바람직하다.

또한, 기타의 공지된 면역학적 검출법[Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, Third edition, Academic Press(1996), Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988), 단일 클론 항체 실험 매뉴얼, 고단샤 사이언티픽(1987)] 등을 조합하여 확인할 수도 있다.

본 발명의 모노클로날 항체로서는, 하이브리도마에 의해 산생되는 항체 또는 항체 유전자를 포함하는 재조합체 벡터로 형질 전환한 형질 전환체에 의해 산생되는 유전자 재조합 항체를 들 수 있다.

모노클로날 항체란, 단일 클론의 항체 산생 세포가 분비되는 항체이며, 단 하나의 에피토프(항원 결정기라고도 함)를 인식하고, 모노클로날 항체를 구성하는 아미노산 서열(1차 구조)이 균일한 것이 특징이다.

에피토프로서는, 모노클로날 항체가 인식하고, 결합하는 단일의 아미노산 서열 및 해당 아미노산 서열을 포함하는 입체 구조 그리고 번역 후 수식에 의해 수식된 아미노산 서열 및 해당 아미노산 서열을 포함하는 입체 구조 등을 들 수 있다.

번역 후 수식에 의해 수식된 아미노산 서열로서는, O 결합형 당쇄가 부가된 아미노산 서열(당쇄가 OH 치환기를 갖는 트레오닌 및 세린에 결합), N 결합형 당쇄가 부가된 아미노산 서열(NH₂ 치환기를 갖는 글루타민 및 아스파라긴에 결합), 그리고 황산기가 부가된 아미노산 서열(황산 분자가 OH 치환기를 갖는 트레오닌에 결합) 등을 들 수 있다.

본 발명의 모노클로날 항체가 결합하는 인간 합토글로빈의 에피토프는, 인간 합토글로빈의 일부의 도메인을 결실시킨 결손체, 인간 합토글로빈의 일부의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 변이체, 다른 단백질 유래의 도메인과 치환시킨 인간 합토글로빈 변이체 및 인간 합토글로빈의 부분 펩티드 단편 등에 대한, 본 발명의 모노클로날 항체 결합 활성을 조사함으로써 결정할 수 있다.

또한, 본 발명의 모노클로날 항체가 결합하는 인간 합토글로빈의 에피토프는, 단백질 분해 효소로 소화한 인간 합토글로빈에 본 발명의 항체를 첨가하고, 기지의 질량 분석법을 사용한 에피토프 매핑을 행함으로써도 결정할 수 있다.

본 발명의 모노클로날 항체가 결합하는 인간 합토글로빈의 에피토프는, 합토글로빈의 β쇄로서 서열 번호 70으로 표시되는 아미노산 서열 중, 25번째로부터 239번째의 아미노산 서열에 포함된다.

본 발명의 모노클로날 항체가 결합하는 합토글로빈의 에피토프에는, 서열 번호 70으로 표시되는 인간 합토글로빈의 β쇄의 아미노산 서열 중, 적어도 44번째의 Phe 및 49번째의 Glu가 포함된다. 또한, 본 발명의 모노클로날 항체가 결합하는 합토글로빈의 에피토프에는, 서열 번호 70으로 표시되는 인간 합토글로빈의 β쇄의 아미노산 서열 중, 적어도 155번째의 Ser, 156번째의 Thr 및 157번째의 Val이 포함된다.

하이브리도마는, 예를 들어 상기 인간 합토글로빈을 항원으로서 조제하고, 해당 항원을 면역시킨 동물로부터 항원 특이성을 갖는 항체 생산 세포를 유도하고, 추가로 해당 항체 생산 세포와 골수종 세포를 융합시킴으로써 조제할 수 있다. 해당 하이브리도마를 배양하거나 또는 해당 하이브리도마 세포를 동물에 투여하여 해당 동물에서 복수암을 유발하고, 해당 배양액 또는 복수를 분리, 정제함으로써 항합토글로빈 모노클로날 항체를 취득할 수 있다.

항원을 면역시키는 동물로서는, 하이브리도마를 제작하는 것이 가능하다면 어떠한 것도 사용할 수 있지만, 바람직하게는 마우스, 래트, 햄스터, 닭 또는 래빗 등이 사용된다. 또한, 이러한 동물로부터 항체 산생능을 갖는 세포를 취득하고, 해당 세포에 시험관내(in vitro)에서 면역을 실시한 후에, 골수종 세포와 융합하여 제작한 하이브리도마가 생산하는 항체 등도 본 발명의 항체에 포함된다.

본 발명에 있어서 유전자 재조합 항체로서는, 인간형 키메라 항체, 인간형 CDR 이식 항체, 인간 항체 등, 유전자 재조합에 의해 제조되는 항체를 포함한다. 유전자 재조합 항체에 있어서, 모노클로날 항체의 특징을 가지고, 항원성이 낮으며, 혈중 반감기가 연장된 것은, 치료약으로서 바람직하다. 유전자 재조합 항체는, 예를 들어 상기 본 발명의 모노클로날 항체를 유전자 재조합 기술을 사용하여 개변시킨 것을 들 수 있다.

인간형 키메라 항체는, 인간 이외의 동물의 항체 VH 및 VL과 인간 항체의 중쇄 정상 영역(이하, CH라 기재함) 및 경쇄 정상 영역(이하, CL이라 기재함)을 포함하는 항체를 말한다. 본 발명의 인간형 키메라 항체는, 인간 합토글로빈의 아미노산 서열 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하며, 또한 결합하는 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마로부터, VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 취득하고, 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 유전자를 갖는 동물 세포용 재조합체 벡터에 각각 삽입하여 인간형 키메라 항체 재조합체 벡터를 구축하고, 동물 세포에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.

인간형 키메라 항체의 CH로서는, 인간 이뮤노글로불린(이하, hIg라 기재함)에 속하면 어떠한 것이어도 되지만, 바람직하게는 hIgG 클래스의 것이 사용되고, 또한 hIgG 클래스에 속하는 hIgG1, hIgG2, hIgG3 또는 hIgG4와 같은 서브클래스를 모두 사용할 수 있다. 또한, 인간형 키메라 항체의 CL로서는, hIg에 속하면 어느 것이어도 되고, κ 클래스 또는 λ 클래스의 것을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 키메라 항체로서는, 본 발명의 모노클로날 항체와 경합하여, 인간 합토글로빈의 아미노산 서열 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하고, 상기 모노클로날 항체가 결합하는 인간 합토글로빈에 존재하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 키메라 항체를 들 수 있다.

인간형 CDR 이식 항체란, 인간화 항체라고 하는 경우도 있고, 인간 이외 동물 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열이 인간 항체의 VH 및 VL의 적절한 위치에 이식된 항체를 말한다. 본 발명의 인간형 CDR 이식 항체는, 인간 합토글로빈의 아미노산 서열 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하며, 또한 결합하는 인간 이외의 동물의 모노클로날 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열을, 임의의 인간 항체의 VH 및 VL의 프레임워크 영역(이하, FR이라 기재함)에 이식한 V 영역을 코딩하는 cDNA를 구축하고, 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 유전자를 갖는 동물 세포용 재조합체 벡터에 각각 삽입하여 인간형 CDR 이식 항체 재조합체 벡터를 구축하고, 동물 세포에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.

인간형 CDR 이식 항체의 CH로서는, hIg에 속하면 어떠한 것이어도 되지만, 바람직하게는 hIgG 클래스의 것이 사용되고, 또한 hIgG 클래스에 속하는 hIgG1, hIgG2, hIgG3 또는 hIgG4와 같은 서브클래스를 모두 사용할 수 있다. 또한, 인간형 CDR 이식 항체의 CL로서는, hIg에 속하면 어느 것이어도 되고, κ 클래스 또는 λ 클래스의 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 인간형 CDR 이식 항체로서는, 구체적으로는 CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 31 내지 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VH를 포함하며, 또한 CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 34 내지 36으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL을 포함하는 인간화 항체, 및 CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 37 내지 39로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VH를 포함하며, 또한 CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 40 내지 42로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 VL을 포함하는 인간화 항체를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 인간화 항체로서는, 본 발명의 모노클로날 항체와 경합하여, 인간 합토글로빈의 아미노산 서열 또는 그의 입체 구조를 특이적으로 인식하고, 상기 모노클로날 항체가 결합하는 인간 합토글로빈에 존재하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 인간화 항체를 들 수 있다.

인간 항체는 원래 인간 체내에 천연으로 존재하는 항체를 말하지만, 최근의 유전자 공학적, 세포 공학적, 발생 공학적인 기술의 진보에 의해 제작된 인간 항체 파지 라이브러리 및 인간 항체 산생 트랜스제닉 동물로부터 얻어지는 항체 등도 포함된다.

인간 체내에 천연으로 존재하는 항체는, 예를 들어 인간 말초혈 림프구를 단리하고, EB 바이러스 등을 감염시켜 불사화하고 클로닝함으로써, 해당 항체를 산생하는 림프구를 배양할 수 있고, 배양 상청 중으로부터 해당 항체를 정제할 수 있다.

인간 항체 파지 라이브러리는, 인간 B 세포로부터 조제한 항체 유전자를 파지 유전자에 삽입함으로써 Fab, scFv 등의 항체 단편을 파지 표면에 발현시킨 라이브러리이다. 해당 라이브러리로부터, 항원을 고정화시킨 기질에 대한 결합 활성을 지표로 하여 원하는 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 표면에 발현하고 있는 파지를 회수할 수 있다. 해당 항체 단편은, 또한 유전자 공학적 방법에 의해 2개의 완전한 H쇄 및 2개의 완전한 L쇄를 포함하는 인간 항체 분자로도 변환할 수 있다.

인간 항체 산생 트랜스제닉 동물은, 인간 항체 유전자가 세포 내에 내장된 동물을 의미한다. 구체적으로는, 예를 들어 마우스 ES 세포에 인간 항체 유전자를 도입하고, 해당 ES 세포를 마우스의 초기배에 이식 후, 발생시킴으로써 인간 항체 산생 트랜스제닉 마우스를 제작할 수 있다. 인간 항체 산생 트랜스제닉 동물로부터의 인간 항체는, 통상의 인간 이외의 동물에서 행해지고 있는 하이브리도마 제작 방법을 사용하여, 인간 항체 산생 하이브리도마를 취득하고, 배양함으로써 배양 상청 중에 인간 항체를 산생 축적시킴으로써 제작할 수 있다.

본 발명의 인간 항체의 구체예로서는, 항체의 VH가 서열 번호 25 및 항체의 VL이 서열 번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간 항체, 그리고 항체의 VH가 서열 번호 27 및 항체의 VL이 서열 번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간 항체 등을 들 수 있다.

본 발명의 항체가 형성하는 다가의 면역 복합체는, 본 발명의 항체 Fc 영역을 통해 인간 Fcγ 수용체에 결합한다. 따라서, 본 발명의 항체는, 자기 항체가 Fcγ 수용체에 결합함으로써 일으키는 반응을 저해할 수 있다.

본 발명의 항체가 형성하는 다가의 면역 복합체가 결합하는 인간 Fcγ 수용체로서는, 인간 IgG 항체의 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 인간 Fcγ 수용체라면 모두 포함되지만, 예를 들어 인간 Fcγ 수용체 III(CD16), 인간 Fcγ 수용체 II(CD32) 및 인간 Fcγ 수용체 I(CD64)을 들 수 있다. 이들 인간 Fcγ 수용체는, 예를 들어 백혈구나 마크로파지 등의 세포 표면에 발현된다.

인간 Fcγ 수용체 III[J. Exp. Med., 170, 481(1989)]이란, 중쇄 γ를 갖는 인간 IgG 항체의 Fc 영역과 결합하는 활성을 갖는, 인간 세포 표면 상에 발현하는 3종류의 Fcγ 수용체 중, 타입 III의 Fcγ 수용체를 의미한다. 인간 Fcγ 수용체 III에는, 개개의 다른 유전자로 코딩되는 2개의 아이소폼이 존재하고, 인간 Fcγ 수용체 IIIa(CD16a, 알로타입 V158 및 F158을 포함함)와 인간 Fcγ 수용체 IIIb(CD16b, 알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 알로타입 FcγRIIIb-NA2를 포함함)로 분류된다. 본 발명에 있어서 인간 Fcγ 수용체 III에는 모든 아이소폼 또는 알로타입도 포함된다.

인간 Fcγ 수용체 II[J. Exp. Med., 170, 1369(1989)]란, 중쇄 γ를 갖는 인간 IgG 항체의 Fc 영역과 결합하는 활성을 갖는 인간 세포 표면 상에 발현하는 3종류의 Fcγ 수용체 중, 타입 II의 Fcγ 수용체를 의미한다. 인간 Fcγ 수용체 II에는, 개개의 다른 유전자로 코딩되는 3개의 아이소폼이 존재하고, 인간 Fcγ 수용체 IIa(알로타입 H131[H형] 및 R131[R형]을 포함함), 인간 Fcγ 수용체 IIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함함), 인간 Fcγ 수용체 IIc로 분류된다. 본 발명에 있어서 인간 Fcγ 수용체 III에는 모든 아이소폼 또는 알로타입도 포함된다.

인간 Fcγ 수용체 I[J Biol Chem., 266, 13449(1991)]이란, 중쇄 γ를 갖는 인간 IgG 항체의 Fc 영역과 결합하는 활성을 갖는, 인간 세포 표면 상에 발현하는 3종류의 Fcγ 수용체 중, 타입 I의 Fcγ 수용체를 의미한다. 인간 Fcγ 수용체 I에는, 개개의 다른 유전자로 코딩되는 3개의 아이소폼이 존재하고, 인간 Fcγ 수용체 Ia, 인간 Fcγ 수용체 Ib, 인간 Fcγ 수용체 Ic로 분류된다. 본 발명에 있어서 인간 Fcγ 수용체 I에는 모든 아이소폼도 포함된다.

인간 Fcγ 수용체 I은 단량체의 인간 IgG 항체에 결합에 높은 친화성으로 결합하는 것이 알려져 있고, 인간 Fcγ 수용체 II 및 III은 인간 IgG 항체에 대하여, 단량체의 보다 높은 친화성으로 면역 복합체에 결합하는 것이 알려져 있다[Trends in Immunology, 29, 608(2008)]. 따라서, 본 발명의 항체는 면역 복합체의 형성 유무에 의존하지 않고 인간 Fcγ 수용체 I에 결합한다.

본 발명의 항체를 저해할 수 있는, 자기 항체가 Fcγ 수용체에 결합함으로써 일으키는 반응으로서는, 예를 들어 IgG 클래스의 자기 항체가 백혈구나 마크로파지의 세포 표면 상의 Fcγ 수용체에 결합하고, 자기 세포의 상해나 탐식을 야기하는 반응을 들 수 있다. 자기 세포의 상해나 탐식으로서는, 예를 들어 항체 의존성 세포 상해 활성(ADCC 활성)이나 항체 의존성 세포 개재성 파고사이토시스 활성(ADCP 활성)을 들 수 있다.

ADCC 활성이란, 자기 조직에 결합한 자기 항체 분자가, Fc 부분을 통해 Fcγ 수용체를 발현한, 예를 들어 내츄럴 킬러 세포(이하, NK 세포라 표기함) 등에 결합함으로써, 자기 항체 파포린이나 글란자임 등의 세포 상해성 분자의 방출이나 탐식 작용의 항진 등에 의해 발생하는 세포 상해 반응[Clark M, Chemical Immunology, 65, 88(1997); Gorter A 등, Immunol Today, 20, 576(1999)]이다.

또한, ADCP 활성이란, 자기 조직에 결합한 자기 항체 분자가, Fc 부분을 통해 Fcγ 수용체를 발현한, 예를 들어 마크로파지 등에 포착되어, 탐식 및 파괴에 의해 발생하는 자기 조직 상해이다.

본 발명의 항체에는, 항체의 Fc 영역의 아미노산을, Fcγ 수용체와의 결합 활성이 높아지도록 개변한 항체가 포함된다. 구체적으로는, 예를 들어 본 발명의 항체에, 포텔리젠트 기술 및/또는 해당 항체의 Fc 아미노산으로 개변을 실시하는 기술을 조합하여 얻어진 항체는, Hp와 면역 복합체를 형성한 해당 항체의 Fc 도메인이 보다 강하게 CD16a에 결합하고, ADCC 활성을 IVIG보다도 강력하게 저해한다.

항체의 Fc 영역의 아미노산을, Fcγ 수용체와의 결합 활성이 높아지도록 개변한 항체로서는, 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 당쇄의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되지 않은 항체를 들 수 있다.

항체의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 당쇄의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되지 않은 항체로서는, 예를 들어 α1,6-푸코오스 전이 효소 유전자가 결손된 CHO 세포(국제 공개 제2005/035586호, 국제 공개 제02/31140호)를 사용하여 제작되는 항체를 들 수 있다.

종래, 기존 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 당쇄의 구조를, N-글리코시드 결합 당쇄의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되지 않은 구조로 개변시키는 기술은, 기존 항체의 ADCC 활성을 높이기 위해 사용되어 왔다. 그러나, 본 발명의 항체에는, Fcγ 수용체와의 친화성을 높여, Fcγ 수용체를 발현한 NK 세포 등에 결합함으로써, 병태에서 항진하는 ADCC 활성을 저해하는 방법으로서, 이 기술을 사용할 수 있다.

항체의 Fc 영역의 아미노산을, Fcγ 수용체와의 결합 활성이 높아지도록 개변시킨 항체로서는, 예를 들어 미국 특허 제7,317,091호 명세서에 기재된 방법으로 제작된 항체 분자를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 항체는, 항체의 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드의 표면 전하나 조기 엔도솜 내에서의 pH에 있어서의 항원 결합 활성을 개변시킴으로써, 혈중 반감기를 늘릴 수 있다.

항체 분자의 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드의 표면 전하나 조기 엔도솜 내에서의 pH에 있어서의 항원 결합 활성을 개변시켜 혈중 반감기를 늘리는 방법으로서는, 예를 들어 일본 특허 공개 제2013-165716호 공보, 일본 특허 제4961501호 명세서에 기재된 방법을 들 수 있다.

상술한 항체를 구성하는 아미노산 서열에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가되고, 또한 상술한 항체와 동일한 활성을 갖는 모노클로날 항체도, 본 발명의 항체에 포함된다.

결실, 치환, 삽입 또는 부가되는 아미노산의 수는 1개 이상이며 그 수는 특별히 한정되지 않지만, 몰레큘러ㆍ클로닝 제2판, 커런트ㆍ프로토콜즈ㆍ인ㆍ몰레큘러ㆍ바이올로지, Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409(1982), Gene, 34, 315(1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431(1985), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488(1985) 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법 등의 주지된 기술에 의해, 결실, 치환 또는 부가할 수 있는 정도의 수이다. 예를 들어, 1 내지 수십개, 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개이다.

본 발명의 항체의 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가되었다는 것은, 다음의 것을 나타낸다. 즉, 항체의 아미노산 서열 중에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산 잔기의 결실, 부가, 치환 또는 삽입이 있음을 의미한다. 또한, 결실, 부가, 치환 또는 삽입이 동시에 발생하는 경우도 있고, 결실, 부가, 치환 또는 삽입되는 아미노산 잔기는 천연형과 비천연형 모두인 경우도 있다.

천연형 아미노산 잔기로서는, 예를 들어 L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파라긴산, L-글루타민, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, L-시스테인 등을 들 수 있다.

이하에, 서로 치환 가능한 아미노산 잔기의 바람직한 예를 나타낸다. 동일한 무리에 포함되는 아미노산 잔기는 서로 치환 가능이다.

A군: 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, O-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌

B군: 아스파르트산, 글루탐산, 이소아스파르트산, 이소글루탐산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산

C군: 아스파라긴, 글루타민

D군: 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산

E군: 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린

F군: 세린, 트레오닌, 호모세린

G군: 페닐알라닌, 티로신

본 발명의 형질 전환체로서는, 서열 번호 70으로 표시되는 인간 합토글로빈의 β쇄에 특이적으로 인식하고, 해당 인간 합토글로빈에 결합하고, 다가의 면역 복합체를 형성하는 항체 분자를 코딩하는 DNA를 함유하는 재조합체 벡터를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환체이며, 본 발명의 항체를 생산하는 형질 전환체라면 어떠한 형질 전환체라도 포함된다. 숙주 세포로서 구체적으로는, 이하의 (1) 내지 (5) 등을 들 수 있다.

(1) 차이니즈ㆍ햄스터 난소 조직 유래 CHO 세포;

(2) 래트 미엘로마 세포주 YB2/3HL. P2. G11. 16Ag. 20 세포;

(3) 마우스 미엘로마 세포주 NS0 세포;

(4) 마우스 미엘로마 세포주 SP2/0-Ag14 세포;

(5) 시리안 햄스터 신장 조직 유래 BHK 세포;

또한, 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 당쇄의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되지 않은 항체를 생산하는 본 발명의 형질 전환체에는, 국제 공개 제2005/035586호, 국제 공개 제02/31140호에 기재된 방법으로 제작된 당 전이 효소의 저하 또는 결손된 숙주 세포를 사용할 수 있다.

본 발명은, 본 발명의 모노클로날 항체와 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 자기 면역 질환 치료제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, 인간 합토글로빈에 결합하는 모노클로날 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는 자기 면역 질환 치료제에 관한 것이다. 해당 인간 합토글로빈으로서는, α쇄로서 서열 번호 69 또는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 및 β쇄로서 서열 번호 70으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 합토글로빈이 바람직하다.

자기 면역 질환으로서는, 자기 항체에 의한 조직 장애가 관계하는 자기 면역 질환을 들 수 있고, 한정되는 것은 아니지만, 면역성 혈소판 감소성 자반병(특발성 혈소판 감소성 자반병 또는 혈소판 감소증이라고도 함), 가와사키병, ANCA 관련 혈관염, 귈랑바레 증후군, 만성 탈수성 다발성 근신경염, 중증 근무력증, 다초점성 운동신경병증, 관절 류머티즘, 전신성 에리테마토데스, 자기 면역성 용혈성 빈혈, 강피증, 자기 면역성 담마진, 천포창, 굿패스쳐 증후군, 건선성 관절염, 쉐그렌 증후군, 다발성 근염/피부 근염 등의 IVIG 제제가 치료약으로서 사용되는 자기 면역 질환이나, IgG4 관련 질환 등의 자기 항체의 산생이 병태에 관여하고 있는 자기 면역 질환을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 자기 면역 질환 치료제는 자기 항체에 의한 조직 장애가 관계하는 자기 면역 질환의 치료 및/또는 예방에 사용할 수 있다.

본 발명의 치료제는, 유효 성분으로서의 해당 항체 또는 이들의 유도체만을 포함하는 것이어도 되지만, 통상은 약리학적으로 허용되는 1 이상의 담체와 함께 혼합하여, 제제학의 기술 분야에 있어서 공지된 방법에 의해 제조한 의약 제제로서 제공된다.

투여 경로로서는, 치료 시에 가장 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하고, 예를 들어 경구 투여 또는 구강 내, 기도 내, 직장 내, 피하, 근육 내, 정맥 내 또는 복강 내 등의 비경구 투여를 들 수 있다. 투여 형태로서는, 예를 들어 분무제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제, 시럽제, 유제, 좌제, 주사제, 연고 또는 테이프제 등을 들 수 있다.

투여량 또는 투여 횟수는 목적으로 하는 치료 효과, 투여 방법, 치료 기간, 연령 및 체중 등에 따라서 상이하지만, 통상 성인 1일당 10μg/kg 내지 100mg/kg이다.

본 발명의 치료약은 단독으로 사용해도 되고, 적어도 하나의 기타 치료약을 병용해도 된다. 본 발명의 치료약과 기타 치료약의 병용 방법으로서는, 본 발명의 치료약과 병용되는 치료약이, 본 발명의 치료약과 동시에 투여되어도 되고, 연속적으로 투여되어도 된다. 기타 치료약으로서는, 예를 들어 스테로이드, 아스피린, 시클로포스파미드 또는 시클로스포린 등을 들 수 있다.

이하에, 본 발명의 항체 제조 방법 및 질환의 치료 방법에 대해서, 구체적으로 설명한다.

1. 항체의 제조 방법

(1) 항원의 조제

항원이 되는 인간 합토글로빈 또는 인간 합토글로빈을 발현시킨 세포는, 인간 합토글로빈을 형성하는 α쇄 및 β쇄의 전체 길이 또는 그의 부분 길이를 코딩하는 cDNA를 포함하는 재조합체 벡터를, 대장균, 효모, 곤충 세포 또는 동물 세포 등에 도입함으로써 얻을 수 있다. 또한, 인간 합토글로빈을 다량으로 발현하고 있는 각종 인간 배양 세포, 인간 조직 등으로부터 인간 합토글로빈을 정제함으로써도 얻을 수 있다.

또한, 해당 배양 세포 또는 해당 조직 등을 그대로 항원으로서 사용할 수도 있다. 또한, Fmoc법 또는 tBoc법 등의 화학 합성법에 의해 인간 합토글로빈의 부분 서열을 갖는 합성 펩티드를 조제하여, 항원으로서 사용할 수도 있다.

인간 합토글로빈 또는 인간 합토글로빈의 부분 서열을 갖는 합성 펩티드에는, C 말단 또는 N 말단에 FLAG 또는 His 등의 공지된 태그가 부가되어 있어도 된다.

본 발명에서 사용되는 인간 합토글로빈은, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989) 또는 Current Protocols inmolecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997) 등에 기재된 방법 등을 사용하여, 예를 들어 이하의 방법에 의해, 해당 인간 합토글로빈을 코딩하는 DNA를 숙주 세포 중에서 발현시켜 제조할 수 있다.

먼저, 인간 합토글로빈을 형성하는 α쇄 및 β쇄를 코딩하는 부분을 포함하는 완전 길이 cDNA를 적당한 재조합체 벡터의 프로모터 하류에 삽입함으로써, 재조합 벡터를 제작한다. 상기 완전 길이 cDNA 대신에, 완전 길이 cDNA를 바탕으로 하여 조제된, 폴리펩티드를 코딩하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 사용해도 된다. 이어서, 얻어진 해당 재조합 벡터를, 해당 재조합체 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써, 폴리펩티드를 생산하는 형질 전환체를 얻을 수 있다.

재조합체 벡터로서는, 사용하는 숙주 세포에 있어서의 자율 복제 또는 염색체 중으로의 조립이 가능하여, 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 전사할 수 있는 위치에, 적당한 프로모터를 함유하고 있는 것이면 모두 사용할 수 있다.

숙주 세포로서는, 대장균 등의 에스케리키아속 등에 속하는 미생물, 효모, 곤충 세포 또는 동물 세포 등, 목적으로 하는 유전자를 발현할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있다.

대장균 등의 원핵 생물을 숙주 세포로서 사용하는 경우, 재조합체 벡터는, 원핵 생물 중에서 자율 복제가 가능함과 동시에, 프로모터, 리보솜 결합 서열, 인간 합토글로빈을 코딩하는 부분을 포함하는 DNA 및 전사 종결 서열을 포함하는 벡터인 것이 바람직하다. 또한, 해당 재조합체 벡터에는, 전사 종결 서열은 반드시 필요하지는 않지만, 구조 유전자의 바로 아래에 전사 종결 서열을 배치하는 것이 바람직하다. 또한, 해당 재조합체 벡터에는, 프로모터를 제어하는 유전자를 포함하고 있어도 된다.

해당 재조합체 벡터로서는, 리보솜 결합 서열인 샤인ㆍ달가노 서열(SD 서열이라고도 함)과 개시 코돈 사이를 적당한 거리(예를 들어 6 내지 18 염기)로 조절한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 해당 인간 합토글로빈을 코딩하는 DNA의 염기 서열로서는, 숙주 내에서의 발현에 최적인 코돈이 되게 염기를 치환할 수 있고, 이것에 의해 목적으로 하는 인간 합토글로빈의 생산율을 향상시킬 수 있다

재조합체 벡터로서는, 사용하는 숙주 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있지만, 예를 들어 pBTrp2, pBTac1, pBTac2(이상, 로슈ㆍ다이아그노스틱스사), pKK233-2(파마시아사), pSE280(인비트로젠사), pGEMEX-1(프로메가사), pQE-8(퀴아젠사), pKYP10(일본 특허 공개 소58-110600호 공보), pKYP200[Agricultural Biological Chemistry, 48, 669(1984)], pLSA1[Agric Biol. Chem., 53, 277(1989)], pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306(1985)], pBluescript II SK(-)(스트라타진사), pTrs30[대장균 JM109/pTrS30(FERM BP-5407)으로부터 조제], pTrs32[대장균 JM109/pTrS32(FERM BP-5408)로부터 조제], pGHA2[대장균 IGHA2(FERM BP-400)로부터 조제, 일본 특허 공개 소60-221091호 공보], pGKA2[대장균 IGKA2(FERM BP6798)로부터 조제, 일본 특허 공개 소60-221091호 공보], pTerm2(미국 특허 제4,686,191호 명세서, 미국 특허 제4,939,094호 명세서, 미국 특허 제5,160,735호 명세서), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400[J. Bacteriol., 172, 2392(1990)], pGEX(파마시아사), pET 시스템(노바젠사) 또는 pME18SFL3 등을 들 수 있다.

프로모터로서는, 사용하는 숙주 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 어떠한 것이어도 된다. 예를 들어, trp 프로모터(Ptrp), lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터 또는 T7 프로모터 등의, 대장균 또는 파지 등에서 유래되는 프로모터를 들 수 있다. 또한, Ptrp을 2개 직렬시킨 탠덤 프로모터, tac 프로모터, lacT7 프로모터 또는 letI 프로모터 등의 인위적으로 설계 개변된 프로모터 등도 사용할 수 있다.

숙주 세포로서는, 예를 들어 대장균 XL-1Blue, 대장균 XL2-Blue, 대장균 DH1, 대장균 MC1000, 대장균 KY3276, 대장균 W1485, 대장균 JM109, 대장균 HB101, 대장균 No.49, 대장균 W3110, 대장균 NY49 또는 대장균 DH5α 등을 들 수 있다.

숙주 세포로의 재조합체 벡터의 도입 방법으로서는, 사용하는 숙주 세포에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어 칼슘 이온을 사용하는 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110(1972), Gene, 17, 107(1982), Molecular & General Genetics, 168, 111(1979)]을 들 수 있다.

동물 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 재조합체 벡터로서는, 동물 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어 pcDNA I, pcDM8(이상, 프나코시사), pAGE107[일본 특허 공개 평03-22979호 공보; Cytotechnology, 3, 133(1990)], pAS3-3(일본 특허 공개 평2-227075호 공보), pcDM8[Nature, 329, 840(1987)], pcDNA I/Amp, pcDNA3.1, pREP4(이상, 인비트로젠사), pAGE103[J. Biochemistry, 101, 1307(1987)], pAGE210, pME18SFL3, pKANTEX93(국제 공개 제97/10354호), N5KG1val(미국 특허 제6001358호 명세서), INPEP4(Biogen-IDEC사) 및 트랜스포손 벡터(국제 공개 제2010/143698호) 등을 들 수 있다.

프로모터로서는, 동물 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있고, 예를 들어 사이토메갈로 바이러스(CMV)의 극초기(immediate early(IE)) 유전자의 프로모터, SV40의 초기 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 히트 쇼크 프로모터, SRα 프로모터 또는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 프로모터 또는 인핸서를 들 수 있다. 또한, 인간 CMV의 IE 유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 사용해도 된다.

숙주 세포로서는, 예를 들어 인간 백혈병 세포 나말바(Namalwa) 세포, 원숭이 신장 조직 유래 COS 세포, 차이니즈ㆍ햄스터 난소 조직 유래 CHO 세포[Journal of Experimental Medicine, 108, 945(1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275(1968); Genetics, 55, 513(1968); Chromosoma, 41, 129(1973); Methods in Cell Science, 18, 115(1996); Radiation Research, 148, 260(1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216(1980); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275(1968); Cell, 6, 121(1975); Molecular Cellgenetics, Appendix I, II(pp.883-900)], CHO/DG44, CHO-K1(ATCC 번호: CCL-61), DUkXB11(ATCC 번호: CCL-9096), Pro-5(ATCC 번호: CCL-1781), CHO-S(Life Technologies, Cat#11619), Pro-3, 래트 미엘로마 세포주 YB2/3HL. P2. G11. 16Ag. 20 세포(또는 YB2/0 세포라고도 함), 마우스 미엘로마 세포주 NS0 세포, 마우스 미엘로마 세포주 SP2/0-Ag14 세포, 시리안 햄스터 신장 조직 유래 BHK 또는 HBT5637 세포(일본 특허 공개 소63-000299호 공보) 등을 들 수 있다.

숙주 세포로의 재조합체 벡터의 도입 방법으로서는, 동물 세포에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있다. 예를 들어, 일렉트로포레이션법[Cytotechnology, 3, 133(1990)], 인산칼슘법(일본 특허 공개 평02-227075호 공보) 또는 리포펙션법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413(1987)] 등을 들 수 있다.

이상과 같이 하여 얻어지는 인간 합토글로빈을 코딩하는 DNA를 조립한 재조합체 벡터를 보유하는 미생물 또는 동물 세포 등의 유래의 형질 전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 해당 인간 합토글로빈을 생성 축적시켜, 해당 배양물로부터 채취함으로써 인간 합토글로빈을 제조할 수 있다. 해당 형질 전환체를 배지에 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법에 따라서 행할 수 있다.

진핵 생물 유래의 세포에서 발현시킨 경우에는, 당 또는 당쇄가 부가된 인간 합토글로빈을 얻을 수 있다.

유도성 프로모터를 사용한 재조합체 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는, 필요에 따라서 인듀서를 배지에 첨가해도 된다. 예를 들어, lac 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 경우에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 등을, trp 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 경우에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가해도 된다.

동물 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로서는, 예를 들어 일반적으로 사용되고 있는 RPMI1640 배지[The Journal of the American Medical Association, 199, 519(1967)], Eagle의 MEM 배지[Science, 122, 501(1952)], 둘베코 개변 MEM 배지[Virology, 8, 396(1959)], 199 배지[Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1(1950)], 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)) 또는 이들 배지에 소태아 혈청(FBS) 등을 첨가한 배지 등을 들 수 있다. 배양은 통상 pH 6 내지 8, 30 내지 40℃, 5％ CO₂ 존재 하 등의 조건 하에서 1 내지 7일간 행한다. 또한, 배양 중에 필요에 따라서, 카나마이신 또는 페니실린 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.

인간 합토글로빈을 코딩하는 유전자의 발현 방법으로서는, 직접 발현 이외에도, 분비 생산 또는 융합 단백질 발현 등의 방법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]을 사용할 수 있다.

인간 합토글로빈의 생산 방법으로서는, 숙주 세포 내에 생산시키는 방법, 숙주 세포 밖으로 분비시키는 방법 또는 숙주 세포 외막 상에 생산시키는 방법이 있고, 사용하는 숙주 세포 또는 생산시키는 인간 합토글로빈의 구조를 바꿈으로써, 적절한 방법을 선택할 수 있다.

인간 합토글로빈이 숙주 세포 내 또는 숙주 세포 외막 상에 생산되는 경우, 폴슨 등의 방법[J. Biol. Chem., 264, 17619(1989)], 로우 등의 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227(1989), Genes Develop., 4, 1288(1990)], 일본 특허 공개 평05-336963호 공보 또는 국제 공개 제94/23021호 등에 기재된 방법을 사용함으로써, 인간 합토글로빈을 숙주 세포 밖으로 적극적으로 분비시킬 수 있다.

또한, 디히드로엽산 환원 효소 유전자 등을 사용한 유전자 증폭계(일본 특허 공개 평2-227075호 공보)를 이용하여 인간 합토글로빈의 생산량을 상승시킬 수도 있다.

얻어진 인간 합토글로빈은, 예를 들어 이하와 같이 하여 단리, 정제할 수 있다.

인간 합토글로빈이 세포 내에 용해 상태에서 발현된 경우에는, 배양 종료 후에 세포를 원심 분리에 의해 회수하고, 수계 완충액에 현탁 후, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 만톤 가우린 호모게나이저 또는 다이노 밀 등을 사용하여 세포를 파쇄하고, 무세포 추출액을 얻는다.

상기 무세포 추출액을 원심 분리함으로써 얻어지는 상청으로부터, 통상의 단백질 단리 정제법, 즉, 용매 추출법, 유안 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기 용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE)-세파로스, DIAION HPA-75(미쯔비시 가가꾸사) 등의 레진을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-세파로스(Sepharose) FF(파마시아사) 등의 레진을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸세파로스, 페닐세파로스 등의 레진을 사용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 사용한 겔 여과법, 친화성 크로마토그래피법, 크로마토포커싱법 또는 등전점 전기 영동 등의 전기 영동법 등의 방법을 단독 또는 조합하여 사용하고, 정제 샘플을 얻을 수 있다.

인간 합토글로빈이 세포 내에 불용체를 형성하여 발현된 경우에는, 상기와 동일하게 세포를 회수 후 파쇄하고, 원심 분리를 행함으로써, 침전 분획으로서 해당 인간 합토글로빈의 불용체를 회수한다. 회수한 해당 인간 합토글로빈의 불용체를 단백질 변성제로 가용화한다. 해당 가용화액을 희석 또는 투석함으로써, 해당 인간 합토글로빈을 정상적인 입체 구조로 복귀시킨 후, 상기와 동일한 단리 정제법에 의해 폴리펩티드의 정제 샘플을 얻을 수 있다.

인간 합토글로빈 또는 그의 당수식체 등의 유도체가 세포 밖으로 분비된 경우에는, 배양 상청에 있어서 해당 인간 합토글로빈 또는 그의 당수식체 등의 유도체를 회수할 수 있다. 해당 배양물을 상기와 동일하게 원심 분리 등의 방법에 의해 처리함으로써 가용성 분획을 취득하고, 해당 가용성 분획으로부터, 상기와 동일한 단리 정제법을 사용함으로써, 정제 샘플을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서 사용되는 인간 합토글로빈은, Fmoc법 또는 tBoc법 등의 화학 합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 또한, 어드밴스트 켐텍사, 퍼킨ㆍ엘머사, 파마시아사, 프로테인 테크놀로지 인스트루먼트사, 신세셀-베가(Vega)사, 퍼셉티브사 또는 시마즈 세이사쿠쇼사 등의 펩티드 합성기를 이용하여 화학 합성할 수도 있다.

(2) 동물의 면역과 융합용 항체 산생 세포의 조제

3 내지 20주령의 마우스, 래트 또는 햄스터 등의 동물에, (1)에서 얻어지는 항원을 면역시켜, 그 동물의 비장, 림프절, 말초혈 중의 항체 산생 세포를 채취한다. 또한, 면역원성이 낮아 상기 동물에서 충분한 항체값의 상승이 확인되지 않을 경우에는, 합토글로빈 녹아웃 마우스를 피면역 동물로서 사용할 수도 있다. 또한, 인간 항체 산생 동물로부터 항체 산생 세포를 채취할 수도 있다.

면역은 동물의 피하, 미근부, 정맥 내 또는 복강 내에, 예를 들어 프로인드의 완전 아쥬반트 또는 수산화알루미늄 겔과 백일해균 백신 등의 적당한 아쥬반트와 함께 항원을 투여함으로써 행한다. 항원이 부분 펩티드인 경우에는, BSA(소혈청 알부민) 또는 KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin; 키홀 림펫 헤모시아닌) 등의 캐리어 단백질과 콘쥬게이트를 제작하고, 이것을 면역원으로서 사용한다.

항원의 투여는 1회째의 투여 후, 1 내지 4주일 간격으로 1 내지 10회 행한다. 각 투여 후 1 내지 14일째에 안저 정맥총 또는 꼬리 정맥으로부터 채혈하고, 그 혈청의 항체값을 효소 면역 측정법[Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)] 등을 사용하여 측정한다.

항원의 최종 투여 후 3 내지 7일째에, 면역시킨 동물로부터 비장이나 림프절 등의 항체 산생 세포를 포함하는 조직을 적출하고, 항체 산생 세포를 채취한다. 비장 세포를 사용하는 경우에는, 비장을 세단하여 푼 후, 원심 분리하고, 또한 적혈구를 제거하여 융합용 항체 산생 세포를 취득한다.

(3) 골수종 세포의 조제

골수종 세포로서는, 마우스로부터 얻어진 주화 세포를 사용하여, 예를 들어 8-아자구아닌 내성 마우스(BALB/c 유래) 골수종 세포주 P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1(1978)], P3-NS1/1Ag41(NS-1)[European J. Immunology, 6, 511(1976)], SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature, 276, 269(1978)], P3-X63-Ag8653(653)[J. Immunology, 123, 1548(1979)] 또는 P3-X63-Ag8(X63)[Nature, 256, 495(1975)] 등을 사용한다.

해당 골수종 세포는 정상 배지[글루타민, 2-머캅토에탄올, 젠타마이신, FBS 및 8-아자구아닌을 첨가한 RPMI1640 배지]에서 계대하고, 세포 융합의 3 내지 4일 전에 정상 배지에 계대하고, 융합 당일 2×10⁷개 이상의 세포수를 확보한다.

(4) 세포 융합과 모노클로날 항체 산생 하이브리도마의 조제

(2)에서 얻어지는 융합용 항체 산생 세포와 (3)에서 얻어지는 골수종 세포를 최소 필수 배지(Minimum Essential Medium(MEM)) 또는 PBS(인산이나트륨 1.83g, 인산일칼륨 0.21g, 식염 7.65g, 증류수 1리터, pH 7.2)로 잘 세정하고, 세포수가 융합용 항체 산생 세포:골수종 세포=5 내지 10:1이 되도록 혼합하고, 원심 분리한 후, 상청을 제거한다.

침전된 세포군을 잘 푼 후, 폴리에틸렌글리콜-1000(PEG-1000), MEM 배지 및 디메틸술폭시드의 혼합액을 37℃에서 교반하면서 첨가한다. 또한 1 내지 2분간마다 MEM 배지 1 내지 2mL를 수회 첨가한 후, MEM 배지를 첨가하여 전체량이 50mL가 되도록 한다. 원심 분리 후, 상청을 제거한다. 침전된 세포군을 서서히 푼 후, HAT 배지[히포크산틴, 티미딘 및 아미노프테린을 첨가한 정상 배지] 중에 서서히 세포를 현탁시킨다. 이 현탁액을 5％ CO₂ 인큐베이터 중, 37℃에서 7 내지 14일간 배양한다.

배양 후, 배양 상청의 일부를 발취하고, 후술하는 하이브리도마의 선택 방법에 의해, 인간 합토글로빈을 포함하는 항원에 반응하고, 인간 합토글로빈을 포함하지 않는 항원에 반응하지 않는 세포군을 선택한다. 이어서, 한계 희석법에 의해 클로닝을 2회 반복하고[1회째는 HT 배지(HAT 배지로부터 아미노프테린을 제거한 배지), 2회째는 정상 배지를 사용함], 안정되며 강한 항체값이 확인된 것을 모노클로날 항체 산생 하이브리도마로서 선택한다.

(5) 정제 모노클로날 항체의 조제

프리스탄 처리[2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸(Pristane) 0.5mL를 복강 내 투여하고, 2주일 사육함]한 8 내지 10주령의 마우스 또는 누드 마우스에, (4)에서 얻어지는 모노클로날 항체 산생 하이브리도마를 복강 내에 주사한다. 10 내지 21일간 하이브리도마는 복수암화된다. 이 마우스로부터 복수를 채취하고, 원심 분리하여 고형분을 제거 후, 40 내지 50％ 황산암모늄으로 염석하고, 카프릴산 침전법, DEAE-세파로스 칼럼, 단백질 A-칼럼 또는 겔 여과 칼럼에 의한 정제를 행하고, IgG 또는 IgM 분획을 모아, 정제 모노클로날 항체로 한다.

또한, (4)에서 얻어지는 모노클로날 항체 산생 하이브리도마를, 10％ FBS를 첨가한 RPMI1640 배지 등에서 배양한 후, 원심 분리에 의해 상청을 제거하고, 하이브리도마(Hybridoma)-SFM 배지에 현탁시켜, 3 내지 7일간 배양한다. 얻어진 세포 현탁액을 원심 분리하고, 얻어진 상청으로부터 단백질 A-칼럼 또는 단백질 G-칼럼에 의한 정제를 행하고, IgG 분획을 모아, 정제 모노클로날 항체를 얻을 수도 있다. 또한, 하이브리도마-SFM 배지에는 5％ 다이고 GF21을 첨가할 수도 있다.

항체의 서브클래스의 결정은, 서브클래스 타이핑 키트를 사용하여 효소 면역 측정법에 의해 행한다. 단백량의 정량은 로리법 또는 280nm에서의 흡광도로부터 산출한다.

(6) 모노클로날 항체의 선택

모노클로날 항체의 선택은, 이하에 나타내는 바와 같이, 인간 합토글로빈 및 마우스 합토글로빈에 대한 결합 활성을 효소 면역 측정법(ELISA)으로 해석함으로써 행한다.

인간 합토글로빈 또는 마우스 합토글로빈을 96웰 플레이트 등의 플레이트에 분주하고, 해당 단백질을 고상화한 후, 제1 항체로서 혈청, 하이브리도마의 배양 상청 또는 정제 모노클로날 항체 등의 피검 물질을 분주하고, 반응시킨다. 반응 후의 플레이트를, 0.1％ Tween을 포함하는 PBS(이하, PBST라 기재함) 등으로 잘 세정한 후, 제2 항체로서, 비오틴, 효소, 화학 발광 물질 또는 방사선 화합물 등으로 표지한 항이뮤노글로불린 항체를 분주하여 반응시킨다. PBST 등으로 잘 세정한 후, 제2 항체의 표지에 물질에 따른 반응을 행하여, 인간 합토글로빈 또는 마우스 합토글로빈에 대하여 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체를 선택한다.

또한, 본 발명의 모노클로날 항체와 경합하여 인간 합토글로빈 및 마우스 합토글로빈에 결합하는 모노클로날 항체는, 상술한 ELISA를 사용한 결합 반응 검출계에, 피검 항체를 첨가하여 반응시킴으로써 취득할 수 있다. 즉, 피검 항체를 첨가하였을 때에 본 발명의 모노클로날 항체의 결합이 저해되는 항체를 스크리닝함으로써, 인간 합토글로빈 및 마우스 합토글로빈의 아미노산 서열 또는 그의 입체 구조에의 결합에 대해서, 본 발명에서 취득한 모노클로날 항체와 경합하는 모노클로날 항체를 취득할 수 있다.

또한, 본 발명의 모노클로날 항체가 결합하는 인간 합토글로빈 또는 마우스 합토글로빈에 포함되는 에피토프와, 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체는, 상술한 ELISA를 사용한 결합 반응 검출계에서 취득된 항체의 에피토프를 동정하고, 동정한 에피토프의 부분적인 합성 펩티드 또는 에피토프의 입체 구조로 의태시킨 합성 펩티드 등을 제작하고, 면역시킴으로써 취득할 수 있다.

2. 유전자 재조합 항체의 제작

유전자 재조합 항체의 제작예로서, 이하에 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체의 제작 방법을 나타낸다.

(1) 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 구축

유전자 재조합 항체 발현용 벡터는, 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA가 조립된 동물 세포용 재조합체 벡터이며, 동물 세포용 재조합체 벡터에 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA를 각각 클로닝함으로써 구축할 수 있다.

인간 항체의 C 영역은 임의의 인간 항체의 CH 및 CL을 사용할 수 있다. 예를 들어, 인간 항체의 γ1 서브클래스의 CH 및 κ 클래스의 CL 등을 사용한다. 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA에는, cDNA를 사용하지만, 엑손과 인트론을 포함하는 염색체 DNA를 사용할 수도 있다.

동물 세포용 재조합체 벡터에는, 인간 항체의 C 영역을 코딩하는 유전자를 도입하여 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, pAGE107[Cytotechnol., 3, 133(1990)], pAGE103[J. Biochem., 101, 1307(1987)], pHSG274[Gene, 27, 223(1984)], pKCR[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527(1981)], pSG1bd2-4[Cytotechnol., 4, 173(1990)] 또는 pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol., 13, 79(1993)] 등을 사용한다.

동물 세포용 재조합체 벡터 중 프로모터와 인핸서에는, SV40의 초기 프로모터[J. Biochem., 101, 1307(1987)], 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 LTR[Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960(1987)] 또는 면역 글로불린 H쇄의 프로모터[Cell, 41, 479(1985)]와 인핸서[Cell, 33, 717(1983)] 등을 사용한다.

유전자 재조합 항체 발현용 벡터에는, 재조합체 벡터의 구축의 용이성, 동물 세포로의 도입의 용이성, 동물 세포 내에서의 항체 H쇄 및 L쇄의 발현량의 밸런스가 균형을 이루는 등의 점에서, 항체 H쇄 및 L쇄가 동일한 벡터 상에 존재하는 타입(탠덤형)의 재조합체 벡터[J. Immunol. Methods, 167, 271(1994)]를 사용하지만, 항체 H쇄 및 L쇄가 개개의 벡터 상에 존재하는 타입을 사용할 수도 있다. 탠덤형의 재조합체 벡터에는, pKANTEX93(국제 공개 제97/10354호 공보), pEE18[Hybridoma, 17, 559(1998)] 등을 사용한다.

(2) 인간 이외의 동물 유래의 항체 V 영역을 코딩하는 cDNA의 취득 및 아미노산 서열의 해석

비인간 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA의 취득 및 아미노산 서열의 해석은 이하와 같이 하여 행할 수 있다.

비인간 항체를 산생하는 하이브리도마 세포로부터 mRNA를 추출하고, cDNA를 합성한다. 합성한 cDNA를 파지 또는 플라스미드 등의 벡터에 클로닝하여 cDNA 라이브러리를 제작한다.

상기 라이브러리로부터, 마우스 항체의 C 영역 부분 또는 V 영역 부분을 코딩하는 DNA를 프로브로서 사용하여, VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 갖는 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드를 각각 단리한다. 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드 상의 목적으로 하는 마우스 항체의 VH 또는 VL의 전체 염기 서열을 각각 결정하여, 염기 서열로부터 VH 또는 VL의 전체 아미노산 서열을 각각 추정한다.

비인간 항체를 산생하는 하이브리도마 세포를 제작하는 인간 이외의 동물에는, 마우스, 래트, 햄스터 또는 래빗 등을 사용하지만, 하이브리도마 세포를 제작하는 것이 가능하면, 어떠한 동물도 사용할 수 있다.

하이브리도마 세포로부터의 전체 RNA의 조제에는, 티오시안산구아니딘-트리플루오로아세트산세슘법[Methods in Enzymol., 154, 3(1987)] 또는 RNA 이지 키트(easy kit)(퀴아젠사) 등의 키트를 사용한다.

전체 RNA로부터의 mRNA의 조제에는, 올리고(dT) 고정화 셀룰로오스 칼럼법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)] 또는 Oligo-dT30<Super>mRNA 정제 키트(Purification Kit)(다카라 바이오사) 등의 키트 등을 사용한다. 또한, 패스트 트랙 mRNA 단리 키트(Fast Track mRNA Isolation Kit)(인비트로젠사) 또는 퀵프렙 mRNA 정제 키트(QuickPrep mRNA Purification Kit)(GE 헬스 케어 바이오사이언스사) 등의 키트를 사용하여 하이브리도마 세포로부터 mRNA를 조제할 수도 있다.

cDNA의 합성 및 cDNA 라이브러리의 제작에는, 공지된 방법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), Current Protocols inmolecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons(1987-1997)], cDNA 합성 및 플라스미드 클로닝을 위한 슈퍼스크립트 플라스미드 시스템(SperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning)(인비트로젠사) 또는 ZAP-cDNA 합성 키트(Synthesis Kit)(스트라타진사) 등의 키트 등을 사용한다.

cDNA 라이브러리의 제작 시, 하이브리도마 세포로부터 추출한 mRNA를 주형으로 하여 합성한 cDNA를 도입하는 벡터에는, 해당 cDNA를 조립할 수 있는 벡터라면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, ZAP ExPress[Strategies, 5, 58(1992)], pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research, 17, 9494(1989)], λZAPII(스트라타진사), λgt10, λgt11[DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49(1985)], Lambda BlueMid(Clontech사), λEx Cell, pT7T3-18U(파마시아사), pcD2[Mol. Cell. Biol., 3, 280(1983)] 또는 pUC18[Gene, 33, 103(1985)] 등을 사용한다.

파지 또는 플라스미드 벡터에 의해 구축되는 cDNA 라이브러리를 도입하는 대장균에는, 해당 cDNA 라이브러리를 도입, 발현 및 유지할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, XL-1Blue MRF[Strategies, 5, 81(1992)], C600[Genetics, 39, 440(1954)], Y1088, Y1090[Science, 222, 778(1983)], NM522[J. Mol. Biol., 166, 1(1983)], K802[J. Mol. Biol., 16, 118(1966)] 또는 JM105[Gene, 38, 275(1985)] 등을 사용한다.

cDNA 라이브러리로부터의 비인간 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA 클론의 선택에는, 동위 원소 또는 형광 표지한 프로브를 사용한 콜로니ㆍ하이브리다이제이션법 또는 플라크ㆍ하이브리다이제이션법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)] 등을 사용한다.

또한, 프라이머를 조제하고, mRNA로부터 합성한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, 폴리메라아제 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)법[이하, PCR법이라 기재함, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), Current Protocols inmolecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons(1987-1997)]을 행함으로써 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 조제할 수도 있다.

선택된 cDNA를, 적당한 제한 효소 등으로 절단 후, pBluescript SK(-)(스트라타진사) 등의 플라스미드에 클로닝하고, 통상 사용되는 염기 서열 해석 방법 등에 의해 해당 cDNA의 염기 서열을 결정한다. 염기 서열 해석 방법에는, 예를 들어 디데옥시법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463(1977)] 등의 반응을 행한 후, ABI PRISM3700(PE 바이오시스템즈사) 또는 A. L. F. DNA 시퀀서(파마시아사) 등의 염기 서열 자동 분석 장치 등을 사용한다.

결정된 염기 서열로부터 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열을 각각 추정하고, 기지의 항체의 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열[A.L.F.DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)]과 비교함으로써, 취득한 cDNA가 분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열을 코딩하고 있는지를 각각 확인한다.

분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열에 대해서는, 기지의 항체의 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열[A.L.F.DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)]과 비교함으로써, 분비 시그널 서열의 길이 및 N 말단 아미노산 서열을 추정할 수 있고, 나아가 그들이 속하는 서브그룹을 알 수 있다. 또한, VH 및 VL의 각 CDR의 아미노산 서열에 대해서도, 기지의 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열[A.L.F.DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)]과 비교함으로써 발견할 수 있다.

또한, 얻어진 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열을 사용하여, 예를 들어 SWISS-PROT 또는 PIR-Protein 등의 임의의 데이터베이스에 대하여 BLAST법[J. Mol. Biol., 215, 403(1990)] 등의 상동성 검색을 행하고, VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열이 신규의 것인지를 확인할 수 있다.

(3) 인간형 키메라 항체 발현용 재조합체 벡터의 구축

(1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 상류에, 각각 비인간 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 각각 클로닝함으로써, 인간형 키메라 항체 발현용의 재조합체 벡터를 구축할 수 있다.

비인간 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA의 3' 말단측과, 인간 항체의 CH 또는 CL의 5' 말단측을 연결하기 위해서, 연결 부분의 염기 서열이 적절한 아미노산을 코딩하며, 또한 적당한 제한 효소 인식 서열이 되게 설계한 VH 및 VL의 cDNA를 제작한다.

제작된 VH 및 VL의 cDNA를, (1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 상류에 그들이 적절한 형태로 발현하도록 각각 클로닝하고, 인간형 키메라 항체 발현용의 재조합체 벡터를 구축한다.

또한, 비인간 항체 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를, 적당한 제한 효소의 인식 서열을 양단에 갖는 합성 DNA를 사용하여 PCR법에 의해 각각 증폭시키고, (1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터에 클로닝할 수도 있다.

(4) 인간화 항체의 V 영역을 코딩하는 cDNA의 구축

인간화 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA는, 이하와 같이 하여 구축할 수 있다.

비인간 항체의 VH 또는 VL의 CDR의 아미노산 서열을 이식하는 인간 항체의 VH 또는 VL의 FR의 아미노산 서열을 각각 선택한다. 선택하는 FR의 아미노산 서열에는, 인간 항체 유래의 것이면 어느 것이라도 사용할 수 있다.

예를 들어, 프로테인 데이터 뱅크(Protein Data Bank) 등의 데이터베이스에 등록되어 있는 인간 항체의 FR의 아미노산 서열 또는 인간 항체의 FR의 각 서브그룹의 공통 아미노산 서열[A.L.F.DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)] 등을 사용한다. 항체의 결합 활성의 저하를 억제하기 위해서, 원래 항체의 VH 또는 VL의 FR의 아미노산 서열과 가능한 한 높은 상동성(적어도 60％ 이상)의 FR의 아미노산 서열을 선택한다.

이어서, 선택한 인간 항체의 VH 또는 VL의 FR의 아미노산 서열에, 원래의 항체의 CDR의 아미노산 서열을 각각 이식하고, 인간화 항체의 VH 또는 VL의 아미노산 서열을 각각 설계한다. 설계한 아미노산 서열을 항체의 유전자 염기 서열에 보이는 코돈의 사용 빈도[A. L. F. DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)]를 고려하여 DNA 서열로 변환하고, 인간화 항체의 VH 또는 VL의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 각각 설계한다.

설계한 DNA 서열에 기초하여, 100 염기 전후의 길이를 포함하는 몇개의 합성 DNA를 합성하고, 그들을 사용하여 PCR 반응을 행한다. 이 경우, PCR 반응에서의 반응 효율 및 합성 가능한 DNA의 길이로부터, 바람직하게는 H쇄, L쇄 각각에 대하여 각 6개의 합성 DNA를 설계한다.

또한, 양단에 위치하는 합성 DNA의 5' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, 용이하게 인간화 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를, (1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터에 클로닝할 수 있다.

PCR 반응 후, 증폭 산물을 pBluescript SK(-)(스트라타진사) 등의 플라스미드에 각각 클로닝하고, (2)에 기재된 방법과 동일한 방법에 의해, 염기 서열을 결정하고, 원하는 인간화 항체의 H쇄 전체 길이 또는 L쇄 전체 길이의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 갖는 플라스미드를 취득한다.

또는, 설계한 DNA 서열에 기초하여, VH 전체 길이 및 VL 전체 길이를 각각 하나의 장쇄 DNA로서 합성한 것을, 상기 PCR 증폭 산물 대신에 사용할 수도 있다. 또한, 합성 장쇄 DNA의 양단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, 인간화 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를, (1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터에 용이하게 클로닝할 수 있다.

(5) 인간화 항체의 V 영역의 아미노산 서열의 개변

인간화 항체는, 비인간 항체의 VH 및 VL의 CDR만을 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에 이식한 것만으로는, 그 항원 결합 활성은 원래의 비인간 항체에 비해 저하된다[BIO/TECHNOLOGY, 9, 266(1991)].

인간화 항체에서는, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열 중에서, 직접 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기, CDR의 아미노산 잔기와 상호 작용하는 아미노산 잔기 및 항체의 입체 구조를 유지하고, 간접적으로 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기를 동정하고, 그들 아미노산 잔기를 원래의 비인간 항체의 아미노산 잔기로 치환함으로써, 저하된 항원 결합 활성을 상승시킬 수 있다.

항원 결합 활성에 관한 FR의 아미노산 잔기를 동정하기 위해서, X선 결정 해석[J. Mol. Biol., 112, 535(1977)] 또는 컴퓨터 모델링[Protein Engineering, 7, 1501(1994)] 등을 사용함으로써, 항체의 입체 구조의 구축 및 해석을 행할 수 있다. 또한, 각각의 항체에 대하여 수종의 개변체를 제작하고, 각각의 항원 결합 활성과의 상관을 검토하는 것을 반복하고, 시행 착오함으로써 필요한 항원 결합 활성을 갖는 개변 인간화 항체를 취득할 수 있다.

인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 잔기는, 개변용 합성 DNA를 사용하여 (4)에 기재된 PCR 반응을 행함으로써, 개변시킬 수 있다. PCR 반응 후의 증폭 산물에 대해서 (2)에 기재된 방법에 의해, 염기 서열을 결정하고, 목적으로 하는 개변이 실시된 것을 확인한다.

(6) 인간화 항체 발현용 재조합체 벡터의 구축

(1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 상류에, 구축한 유전자 재조합 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 각각 클로닝하여, 인간화 항체 발현용 재조합체 벡터를 구축할 수 있다.

예를 들어, (4) 및 (5)에서 얻어지는 인간화 항체의 VH 또는 VL을 구축할 때에 사용하는 합성 DNA 중, 양단에 위치하는 합성 DNA의 5' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, (1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 상류에 그들이 적절한 형태로 발현하게 각각 클로닝한다.

(7) 유전자 재조합 항체의 일과성 발현

(3) 및 (6)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 재조합체 벡터 또는 그들을 개변한 재조합체 벡터를 사용하여 유전자 재조합 항체의 일과성 발현을 행하고, 제작한 다종류의 인간화 항체의 항원 결합 활성을 효율적으로 평가할 수 있다.

재조합체 벡터를 도입하는 숙주 세포에는, 유전자 재조합 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포라면, 어떠한 세포라도 사용할 수 있지만, 예를 들어 COS-7 세포(ATCC 번호: CRL1651)를 사용한다[Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, 283(1991)].

COS-7 세포로의 재조합체 벡터의 도입에는, DEAE-덱스트란법[Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press(1991)] 또는 리포펙션법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413(1987)] 등을 사용한다.

재조합체 벡터의 도입 후, 배양 상청 중의 유전자 재조합 항체의 발현량 및 항원 결합 활성은 효소 면역 항체법[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Thiral Antibodies-Principles and Press(1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988), 단일 클론 항체 실험 매뉴얼, 고단샤 사이언티픽(1987)] 등을 사용하여 측정한다.

(8) 유전자 재조합 항체를 안정적으로 발현하는 형질 전환체의 취득과 유전자 재조합 항체의 조제

(3) 및 (6)에서 얻어진 유전자 재조합 항체 발현용 재조합체 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입함으로써 유전자 재조합 항체를 안정적으로 발현하는 형질 전환체를 얻을 수 있다.

숙주 세포로의 재조합체 벡터의 도입에는, 일렉트로포레이션법[일본 특허 공개 평02-257891호 공보, Cytotechnology, 3, 133(1990)] 등을 사용한다.

재조합체 벡터를 도입하는 숙주 세포에는, 유전자 재조합 항체를 발현시킬 수 있는 숙주 세포라면, 어떠한 세포라도 사용할 수 있다. 예를 들어, CHO-K1(ATCC 번호: CCL-61), DUkXB11(ATCC 번호: CCL-9096), Pro-5(ATCC 번호: CCL-1781), CHO-S(Life Technologies, Cat#11619), 래트 미엘로마 세포 YB2/3HL. P2. G11. 16Ag. 20(또는 YB2/0이라고도 함), 마우스 미엘로마 세포 NS0, 마우스 미엘로마 세포 SP2/0-Ag14(ATCC 번호: CRL1581), 마우스 P3-X63-Ag8653 세포(ATCC 번호: CRL1580), 디히드로엽산 환원 효소 유전자(Dihydroforate Reductase, 이하 DHFR이라 표기함)가 결손된 CHO 세포[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216(1980)], 렉틴 내성을 획득한 Lec13[Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 55(1986)], α1,6-푸코오스 전이 효소 유전자가 결손된 CHO 세포(국제 공개 제2005/035586호, 국제 공개 제02/31140호), 래트 YB2/3HL. P2. G11. 16Ag. 20 세포(ATCC 번호: CRL1662) 등을 사용한다.

또한, 세포 내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 등의 단백질 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코오스의 1위치가 α 결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소 등의 단백질 또는 세포 내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질 등의 활성이 저하 또는 결실된 숙주 세포, 예를 들어 α1,6-푸코오스 전이 효소 유전자가 결손된 CHO 세포(국제 공개 제2005/035586호, 국제 공개 제02/31140호) 등을 사용할 수도 있다.

재조합체 벡터의 도입 후, 유전자 재조합 항체를 안정적으로 발현하는 형질 전환체는, G418 황산염 등의 약제를 포함하는 동물 세포 배양용 배지에서 배양함으로써 선택한다(일본 특허 공개 평02-257891호 공보).

동물 세포 배양용 배지에는, RPMI1640 배지(인비트로젠사), GIT 배지(닛본 세이야꾸사), EX-CELL301 배지(제이알에이치사), IMDM 배지(인비트로젠사), 하이브리도마-SFM 배지(인비트로젠사) 또는 이들 배지에 FBS 등의 각종 첨가물을 첨가한 배지 등을 사용한다.

얻어진 형질 전환체를 배지 중에서 배양함으로써 배양 상청 중에 유전자 재조합 항체를 발현 축적시킨다. 배양 상청 중의 유전자 재조합 항체의 발현량 및 항원 결합 활성은 ELISA법 등에 의해 측정할 수 있다. 또한, DHFR 증폭계(일본 특허 공개 평02-257891호 공보) 등을 이용하여, 형질 전환체가 산생하는 유전자 재조합 항체의 발현량을 상승시킬 수 있다.

유전자 재조합 항체는, 형질 전환체의 배양 상청으로부터 단백질 A-칼럼을 사용하여 정제한다[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]. 또한, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피 및 한외 여과 등의 단백질의 정제에서 사용되는 방법을 조합할 수도 있다.

정제한 유전자 재조합 항체의 H쇄, L쇄 또는 항체 분자 전체의 분자량은, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법[Nature, 227, 680(1970)] 또는 웨스턴 블로팅법[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)] 등을 사용하여 측정할 수 있다.

3. 정제 모노클로날 항체의 활성 평가

정제한 본 발명의 모노클로날 항체의 활성 평가, 예를 들어 인간 합토글로빈에 대한 결합 활성은, 전술한 1. (6)에 기재된 ELISA를 사용한 결합 반응 검출계를 사용하여 측정할 수 있다.

4. 항체의 이펙터 활성을 제어하는 방법

본 발명의 모노클로날 항체의 이펙터 활성을 제어하는 방법으로서는, 항체의 Fc 영역의 297번째의 아스파라긴(Asn)에 결합하는 N-글리코시드 결합 당쇄의 환원 말단 N=아세틸글루코사민(GlcNAc)에 α1,6 결합하는 푸코오스(코어 푸코오스라고도 함)의 양을 제어하는 방법(국제 공개 제2005/035586호, 국제 공개 제2002/31140호, 국제 공개 제00/61739호) 또는 항체의 Fc 영역의 아미노산 잔기를 개변함으로써 제어하는 방법 등이 알려져 있다. 본 발명의 모노클로날 항체에는, 어느 방법을 사용해도 이펙터 활성을 제어할 수 있다.

이펙터 활성이란, 항체의 Fc 영역을 통해 야기되는 항체 의존성의 활성을 말하고, ADCC 활성, CDC 활성, 또는 마크로파지 또는 수지장 세포 등의 식세포에 의한 ADCP 활성 등이 알려져 있다.

이펙터 활성의 측정법으로서, 예를 들어 ADCC 활성에 대해서는, 표적으로서 염증성 세포, 이펙터로서 인간 말초혈 단핵구(PBMC), 그리고 염증성 세포 특이적인 항체를 혼합하고, 4시간 정도 인큐베이션한 후, 세포 장애의 지표로서 유리되어 온 락트산탈수소 효소(LDH)를 이펙터 활성으로서 측정할 수 있다. 또는, 인간 PBMC에, 예를 들어 CD20과 같은 혈액 세포 특이적인 항원을 인식하는 항체를 혼합하고, 인큐베이션한 후, 유리 LDH나 플로우 사이토메트리에 의한 해당 세포수의 감소를, 이펙터 활성으로서 측정할 수 있다.

항체의 Fc의 N 결합 복합형 당쇄의 코어 푸코오스의 함량을 제어함으로써, 항체의 이펙터 활성을 증가 또는 저하시킬 수 있다. 항체의 Fc에 결합되어 있는 N 결합 복합형 당쇄에 결합하는 푸코오스의 함량을 저하시키는 방법으로서는, α1,6-푸코오스 전이 효소 유전자가 결손된 CHO 세포를 사용하여 항체를 발현함으로써, 푸코오스가 결합되지 않은 항체를 취득할 수 있다. 푸코오스가 결합되지 않은 항체(이하, 푸코오스 비결합형이라고도 함)는, 푸코오스가 결합되어 있는 항체(이하, 푸코오스 결합형이라고도 함)에 비해, CD16a에 대하여 높은 결합 활성을 갖는다. 또한, 그것에 수반하여, 높은 ADCC 활성을 갖는 것이 알려져 있다.

한편, 항체의 Fc에 결합되어 있는 N 결합 복합형 당쇄에 결합하는 푸코오스의 함량을 증가시키는 방법으로서는, α1,6-푸코오스 전이 효소 유전자를 도입한 숙주 세포를 사용하여 항체를 발현시킴으로써, 푸코오스가 결합되어 있는 항체를 취득할 수 있다. 푸코오스가 결합되어 있는 항체는, 푸코오스가 결합되지 않은 항체에 비해, CD16a에 대하여 낮은 결합 활성을 갖는다. 또한, 그것에 수반하여, 낮은 ADCC 활성을 갖는다.

또한, 항체의 Fc 영역의 아미노산 잔기를 개변함으로써 ADCC 활성 또는 CDC 활성을 증가 또는 저하시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2007/0148165호 명세서에 기재된 Fc 영역의 아미노산 서열을 사용함으로써 항체의 CDC 활성을 증가시킬 수 있다.

또한, 미국 특허 제6,737,056호 명세서, 미국 특허 제7,297,775호 명세서 또는 미국 특허 제7,317,091호 명세서에 기재된 아미노산 개변을 행함으로써, ADCC 활성 또는 CDC 활성을 증가시킬 수도 저하시킬 수도 있다. 상술한 방법을 조합하여, 하나의 항체에 사용함으로써, 항체의 이펙터 활성이 제어된 항체를 취득할 수 있다.

5. 본 발명의 모노클로날 항체를 사용한 질환의 치료 방법

본 발명의 항체는, 자기 항체에 의한 조직 상해가 관계하는 자기 면역 질환의 치료에 사용할 수 있다.

자기 면역 질환으로서는, 자기 항체에 의한 조직 장애가 관계하는 자기 면역 질환을 들 수 있고, 한정되는 것은 아니지만, 면역성 혈소판 감소성 자반병, 가와사키병, ANCA 관련 혈관염, 귈랑바레 증후군, 만성 탈수성 다발성 근신경염, 중증 근무력증, 다초점성 운동신경병증, 관절 류머티즘, 전신성 에리테마토데스, 자기 면역성 용혈성 빈혈, 강피증, 자기 면역성 담마진, 천포창, 굿패스쳐 증후군, 건선성 관절염, 쉐그렌 증후군, 다발성 근염/피부 근염 등의 IVIG 제제가 치료약으로서 사용되는 자기 면역 질환이나, IgG4 관련 질환 등의 자기 항체의 산생이 병태에 관여하고 있는 자기 면역 질환을 들 수 있다.

투여 경로로서는, 예를 들어 경구 투여 또는 구강 내, 기도 내, 직장 내, 피하, 근육 내, 정맥 내 또는 복강 내 등의 비경구 투여를 들 수 있다. 투여 형태로서는, 예를 들어 분무제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제, 시럽제, 유제, 좌제, 주사제, 연고 또는 테이프제 등을 들 수 있다.

경구 투여에 적당한 제제로서는, 예를 들어 유제, 시럽제, 캡슐제, 정제, 산제 또는 과립제 등을 들 수 있다.

유제 또는 시럽제와 같은 액체 조제물은, 물, 자당, 소르비톨 또는 과당 등의 당류, 폴리에틸렌글리콜 또는 프로필렌글리콜 등의 글리콜류, 호마유, 올리브유 또는 대두유 등의 기름류, p-히드록시벤조산에스테르류 등의 방부제 또는 스트로베리 플레이버 또는 페퍼민트 등의 플레이버류 등을 첨가제로서 사용하여 제조한다.

캡슐제, 정제, 산제 또는 과립제 등은, 유당, 포도당, 자당 또는 만니톨 등의 부형제, 전분 또는 알긴산나트륨 등의 붕괴제, 스테아르산마그네슘 또는 탈크 등의 활택제, 폴리비닐알코올, 히드록시프로필셀룰로오스 또는 젤라틴 등의 결합제, 지방산에스테르 등의 계면 활성제 또는 글리세린 등의 가소제 등을 첨가제로서 사용하여 제조한다.

비경구 투여에 적당한 제제로서는, 예를 들어 주사제, 좌제 또는 분무제 등을 들 수 있다.

주사제는 염 용액, 포도당 용액 또는 그 양자의 혼합물를 포함하는 담체 등을 사용하여 제조한다.

좌제는 카카오 버터, 수소화 지방 또는 카르복실산 등의 담체를 사용하여 제조한다.

분무제는, 수용자의 구강 및 기도 점막을 자극하지 않고, 또한 본 발명의 모노클로날 항체 또는 해당 항체 단편을 미세한 입자로서 분산시켜, 흡수를 용이하게 하는 담체 등을 사용하여 제조한다. 담체로서는, 예를 들어 유당 또는 글리세린 등을 사용한다. 또한, 에어로졸 또는 드라이 파우더로서 제조할 수도 있다.

또한, 상기 비경구제에 있어서도, 경구 투여에 적당한 제제에서 첨가제로서 예시한 성분을 첨가할 수도 있다.

이하에, 실시예에 의해 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

실시예

[실시예 1] 가용성 CD16a의 제작

(1) 인간 말초혈 단핵구 cDNA의 제작

건강인의 정맥혈 30mL를 채취하고, 헤파린나트륨(시미즈 세이야꾸사) 0.5mL를 첨가하여 온화하게 혼화한 후, 생리적 식염수(오츠카 세이야쿠사) 30mL와 혼합하였다. 림포프렙(Lymphoprep)(NYCOMED PHARMA AS사) 4mL에 대하여, 해당 혼합액 10mL를 온화하게 중층하여, 실온 하에 2000rpm으로 30분간의 원심 분리를 행하였다.

분리된 단핵구 분획을 각 원심관으로부터 모아서 혼합하고, 10％ FBS(GIBCO사)를 포함하는 RPMI1640(GIBCO사)[이하, RPMI1640-FBS(10)] 30mL에 현탁시켜, 실온 하에 1200rpm으로 15분간의 원심 분리를 행하였다.

원심 분리 후, 상청을 제거하고, 해당 세포를 RPMI1640-FBS(10) 20mL에 현탁시켰다. 이 세정 조작을 2회 반복한 후, RPMI1640-FBS(10)를 사용하여 2×10⁶개/mL의 말초혈 단핵구 현탁액을 조제하였다.

조제한 말초혈 단핵구 현탁액 5mL에 대해서, 실온 하에 800rpm으로 5분간의 원심 분리를 행하였다. 원심 분리 후, 상청을 제거하고, 5mL의 PBS(Phosphate buffered saline; 포스페이트 완충 염수)에 현탁시켜, 실온 하에 800rpm으로 5분간의 원심 분리를 행하였다.

원심 분리 후, 상청을 제거하고, 얻어진 펠릿으로부터, QIAamp RNA Blood Mini Kit(퀴아젠사)를 사용하여, 첨부서에 따라서 토탈 RNA(total RNA)를 조제하였다.

얻어진 토탈 RNA 2μg으로부터, SUPERSCRIPT(상표) 제1 가닥 cDNA 합성을 위한 선행 증폭 시스템(Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis)(Life Technologies사)를 사용하여, 첨부서에 따라서 cDNA를 조제하였다.

(2) 인간 CD16a를 코딩하는 cDNA의 취득

인간 CD16a(이하, CD16a라 표기함)의 cDNA의 취득은 이하와 같이 행하였다.

먼저, CD16a의 cDNA의 염기 서열[J. Exp. Med., 170, 481(1989)]로부터, 번역 개시 코돈을 포함하는 특이적인 정방향 프라이머(서열 번호 1로 나타냄) 및 번역 종지 코돈을 포함하는 특이적인 역방향 프라이머(서열 번호 2로 나타냄)를 설계하였다.

이어서, 실시예 1(1)에서 조제한 인간 말초혈 단핵구 유래 cDNA를 주형으로 하여, 상기 2종류의 프라이머(서열 번호 1 및 2)를 사용하여, PCR을 행하였다. PCR은 DNA 폴리메라아제 ExTaq(다카라 바이오사)에 첨부된 설명서에 기초하여 행하였다.

PCR 후, 반응액을 QIAquick PCR 정제 키트(퀴아젠사)를 사용하여, 첨부서를 따라서 정제하였다. 제한 효소 EcoRI(다카라 바이오사) 및 BamHI(다카라 바이오사)로 소화 후, 0.8％ 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하여, 특이적 증폭 DNA 단편(약 800bp)을 회수하였다.

한편, 플라스미드 pBluescript II SK(-) 2.5μg(Stratagene사)을 제한 효소 EcoRI(다카라 바이오사) 및 BamHI(다카라 바이오사)로 소화 후, 0.8％ 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하여, 약 2.9kbp의 DNA 단편을 회수하였다.

이들 약 800bp의 DNA 단편과 약 2.9kbp의 단편을 DNA 라이게이션 키트(Ligation Kit) Ver.2.0(다카라 바이오사)을 사용하여 연결하고, 대장균 DH5α주(TOYOBO사)를 형질 전환하여, 인간 CD16a의 아미노산 서열의 176번째가 발린[이하, CD16a(V)라 표기함]인 cDNA(서열 번호 3)를 코딩하는 DNA를 포함하는 플라스미드 pBs CD16a(V)를 취득하였다.

(3) 가용성 CD16a를 코딩하는 cDNA의 취득

CD16a의 세포 외 영역(서열 번호 4의 1 내지 193번째)과 C 말단에 히스티딘 태그(6개의 His가 연속된 아미노산 서열)를 갖는 가용성 CD16a(V)[이하, 가용성 CD16a(V)]를 코딩하는 cDNA는, 이하와 같이 구축하였다.

먼저, CD16a(V)의 cDNA의 염기 서열(서열 번호 3)로부터, 세포 외 영역에 특이적인 프라이머 FcgR3-1(서열 번호 5)을 설계하였다. 이어서, pBs CD16a(V)를 5ng과 DNA 폴리메라아제 ExTaq(다카라 바이오사)를 사용하여, 실시예 1(2)와 동일하게 하여 PCR을 행하였다.

PCR 후, 반응액을 QIAquick PCR 정제 키트(퀴아젠사)를 사용하여, 첨부서를 따라서 정제하여 멸균수에 용해시켰다. 제한 효소 PstI(다카라 바이오사) 및 BamHI(다카라 바이오사)로 소화 후, 0.8％ 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하여, 특이적 증폭 DNA 단편(약 110bp)을 회수하였다.

한편, pBs CD16a(V) 2.5μg을 제한 효소 PstI(다카라 바이오사) 및 BamHI(다카라 바이오사)로 소화 후, 0.8％ 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하여, 약 3.5kbp의 단편을 회수하였다. 이들 약 110bp의 DNA 단편과 약 3.5kbp의 단편을 DNA 라이게이션 키트 Ver.2.0(다카라 바이오사)을 사용하여 연결하고, 대장균 DH5α주(TOYOBO사)를 형질 전환하여, 히스티딘 태그 융합 가용성 CD16a(서열 번호 6)를 코딩하는 플라스미드 pBssCD16a(V)-His를 취득하였다.

(4) 가용성 CD16a의 재조합체 벡터의 구축

실시예 1(3)에서 얻어진 플라스미드 pBssCD16a(V)-His 3.0μg을 제한 효소 EcoRI(다카라 바이오사) 및 BamHI(다카라 바이오사)로 소화 후, 0.8％ 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하여, 약 620bp의 단편을 회수하였다.

한편, 국제 공개 제97/10354호에 기재된 플라스미드 pKANTEX93 2.0μg을 제한 효소 EcoRI(다카라 바이오사) 및 BamHI(다카라 바이오사)로 소화 후, 0.8％ 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하여, 약 10.7kbp의 단편을 회수하였다.

이들 약 620bp의 DNA 단편과 약 10.7kbp의 단편을 DNA 라이게이션 키트 Ver.2.0(다카라 바이오사)을 사용하여 연결하고, 대장균 DH5α주(TOYOBO사)를 형질 전환하여, 히스티딘 태그 융합 가용성 CD16a를 코딩하는 재조합체 벡터 pKANTEX sCD16a(V)-His를 취득하였다.

(5) 가용성 CD16a의 안정 생산 세포의 제작

실시예 1(4)에서 구축한 재조합체 벡터 pKANTEX sCD16a(V)-His를 래트 미엘로마 YB2/0 세포[ATCC CRL-1662, J. Cell. Biol., 93, 576(1982)]에 도입하고, 가용성 CD16a의 안정 생산 세포를 이하와 같이 제작하였다.

제한 효소 AatII로 소화하고, 선상화한 pKANTEX sCD16a(V)-His 10μg을 일렉트로포레이션법[Cytotechnology, 3, 133(1990)]에 의해 4×10⁶개의 YB2/0 세포에 도입 후, 10％ FBS를 포함하는 하이브리도마-SFM 배지(Life Technologie사)[이하, 하이브리도마-SFM-FBS(10)] 40mL에 현탁시키고, 96웰 배양용 플레이트(스미토모 베이크라이트사)에 200μL/웰씩 분주하였다.

5％ CO₂ 인큐베이터 내에서 37℃, 24시간 배양한 후, G418을 1.0mg/mL가 되게 첨가하여 1 내지 2주일 배양하였다. MTX 농도를 50nmol/L로부터 순차 상승시켜, 최종적으로 1.0mg/mL의 G418 및 200nmol/L의 MTX를 포함하는 하이브리도마-SFM-FBS(10) 배지에서 증식 가능하며, 또한 가용성 CD16a를 고생산하는 형질 전환 세포를 얻었다.

(6) 가용성 CD16a의 정제

실시예 1(5)에서 얻어진 가용성 CD16a(V)를 생산하는 형질 전환 세포를, G418을 1.0mg/mL, MTX를 200nmol/L로 포함하는 하이브리도마-SFM-GF(5)[5％ Daigo's GF21(와코 쥰야쿠사)을 포함하는 하이브리도마-SFM 배지(Life Technologie사)]에 3×10⁵ 세포/mL가 되게 현탁시키고, 182cm² 플라스크(Greiner사)에 50mL 분주하였다.

5％ CO₂ 인큐베이터 내에서 37℃로 4일간 배양하고, 배양 상청을 회수하였다. 배양 상청으로부터 Ni-NTA agarose(퀴아젠사) 칼럼을 사용하여, 첨부서에 따라서 가용성 CD16a(V)를 정제하였다.

[실시예 2] IVIG 중의 높은 CD16a 결합 활성을 갖는 성분의 분리와 분석

(1) 높은 CD16a 결합 활성을 갖는 성분의 분리

0.25mg의 His-CD16a를, HiTrap NHS-활성화(activated) HP 칼럼(GE 헬스 케어사)에 첨부서를 따라서 고상화하였다. 그 때, 미반응된 활성화 에스테르기는 0.5mol/L Tris-HCl(pH 8.0)을 블로킹용 완충액으로서 사용하여 블로킹하고, CD16a를 고상화하지 않고 블로킹만 행한 칼럼을 컨트롤 칼럼으로 하였다.

2배 희석 혈청 2.4mL에 50mg/ml IVIG 100μL를 첨가하여(최종 농도 1mg/ml), 실온에서 1시간 회전 혼화하였다. 거기에 경합 항체로서 0.5mg/mL 젠코르(Xencor)형 항Gal 항체 2.5mL를 첨가하여(최종 농도 0.25mg/mL), 로드 샘플로 하였다.

CD16a 고상화 칼럼 또는 컨트롤 칼럼에, 로드 샘플 2mL를 어플라이하였다. 그냥 통과된 분획을 재차 어플라이 하는 조작을 2회 반복하였다. 4mL의 0.1％ Tween을 포함하는 PBS(Phosphate buffered saline)(이하, PBST라 기재함)로 7회(합계 28ml) 세정하고, 0.5mol/L NaCl을 포함하는 4mL의 PBS로 3회 용출시켰다.

(2) 용출 분획의 분석

(i) SDS-PAGE에 의한 분리

1회째의 용출 분획 중 1.7ml를 41μL까지 농축시킨 후, 머캅토에탄올을 포함하는 환원 조건의 샘플 완충액을 사용하여 희석하여 90℃에서 5분간 가열하였다. 가열 후, 절반의 액량을 사용하여, 12％ 아크릴아미드 겔을 사용하여 전기 영동(농축 겔 20mA 1시간, 분리 겔 40mA 1시간)을 행한 후, SYPRO 루비 프로테인 겔 스테인(Ruby protein gel stain)(인비트로젠사)을 사용하여 염색하였다.

그 결과, 컨트롤과의 차가 있고, 또한 분석에 필요로 하는 충분한 단백질량의 밴드가 확인되었다.

(ii) 겔 내 소화

목적으로 하는 밴드를 잘라내어 1mm x 1mm로 절단하고, 환원용 완충액[10mM DTT(나카라이테스크사), 25mmol/L NH₄HCO₃]을 첨가하여 56℃에서 1시간 환원시켰다. 상청을 제거한 후 알킬화용 완충액[5mmol/L IAA(나카라이테스크사), 25mmol/L NH₄HCO₃]을 첨가하여 암소에서 실온으로 1시간 반응시켰다.

겔편을 25mmol/L NH₄HCO₃으로 세정 후, 50％ 아세토니트릴(와코 쥰야꾸 고교사)을 포함하는 25mmol/L NH₄HCO₃에 의한 세정을 2회 더 행하여 원심 농축기로 완전히 건조시켰다. 거기에 트립신(Trypsin) 용액[트립신(Promega사)이 20μL당 18ng이 되게 25mmol/L NH₄HCO₃으로 희석한 용액]을 20μL 첨가하여 4℃에서 30분 정치한 후, 25mmol/L NH₄HCO₃을 80μL 첨가하여 와류(vortex)시키고, 37℃에서 16시간, 트립신으로 소화하였다.

반응액 상청을, 50％ 아세토니트릴을 포함하는 5％ 포름산이 상청의 1/100양 들어간 튜브에 회수하고, 물과 50％ 아세토니트릴을 포함하는 5％ 포름산으로, 겔편으로부터 펩티드를 추출하였다. 추출액을 회수 후, 해당 액에 포함되는 아세토니트릴을 원심 농축기로 제거하여, 분석 샘플로 하였다.

(iii) LC-MS/MS

분석 샘플을 LC-MS/MS(HPLC; Magic 2002, Michrome BioResources사, 칼럼; MonoCap C18 Nano-flow, 0.2×50mm, 지엘 사이언스사, MS; LTQ Orbitrap XL, Thermo Fisher Scientific사)로 분석하였다.

먼저, 항체 H쇄에 상당하는 분자량 51kDa의 밴드(이하 51k-H라 기재함)의 분석에 있어서, 332Ile→Glu의 변이를 포함하는 젠코르형 펩티드(m/z=838.504, z=1, ALPAPEEK) 또는 변이를 포함하지 않는 비젠코르형 펩티드(m/z=854.462, z=1, ALPAPIEK)의 MS 피크의 시그널 강도를 산출함으로써, 용출 분획에 포함되는 젠코르형 항체의 비율을 산출하였다.

MS 데이터의 해석은 해석 소프트웨어 Xcalibur Qual Browser(Thermo Fisher Scientific사)를 사용하였다. 그 결과, 젠코르형 펩티드의 시그널 강도가 4.07×10⁶, 비젠코르형 펩티드의 시그널 강도가 1.06×10⁶이며, 시그널 강도의 비교로부터 약 8할이 젠코르형 항체, 약 2할이 비젠코르형 항체라고 생각되었다.

용출 분획에 포함되는 약 2할의 비젠코르형 항체는 IVIG 중에 포함되는 회합체나 혈청 단백질과 IVIG 중의 자기 반응 성분의 면역 복합체 등, 젠코르형 항체로 치환되어 결합한 젠코르형 항체와 동등 이상의 CD16a 결합 활성을 갖는 성분이라고 생각되었다.

이어서, 면역 복합체를 구성하는 혈청 단백질의 동정을 시도하였다. SDS-PAGE에 의한 분리에 있어서, 컨트롤과의 차가 있고, 또한 분석에 사용하는 데 충분한 단백질량의 밴드 7개에 대해서, LC-MS/MS에 의한 분석을 하였다.

분석 결과를 질량 분석 해석 검색 엔진 MASCOT(Matrix science사)를 사용하여 해석하고, 단백질의 동정을 행하였다. 그 결과, 고스코어의 밴드는 H쇄의 단편ㆍ중합체 유래라고 생각되었다. 분자량 43kDa의 밴드로부터 인간 Hp가 동정되었다.

[실시예 3] 인간 항체 산생 동물에의 면역

인간 Hp에 대한 모노클로날 항체를 취득하기 위해서, 인간 항체 산생 동물 2마리에 아쥬반트로 혼합한 인간 Hp(ATHENS RESEARCH&TECHNOLOGY사, 혼합 유형(mixed type))를 3주일 내지 4주일마다 합계 5회 면역시켰다. 항체값은, 면역 후 약 10일 후에, 인간 및 마우스 Hp에 대한 결합 활성을 ELISA에 의해 해석하고, 2마리 모두 결합 활성을 나타냈다.

[실시예 4] 하이브리도마의 제작

3회 내지 5회 면역 후, 외과적으로 림프 조직을 적출하여, 세포 융합에 제공하였다. 먼저, 적출한 림프 조직을 DMEM 배지(인비트로젠사)에 현탁시키고, 조직을 갈아 으깨어, DMEM 배지로 세정하였다. 얻어진 세포를 마우스 미엘로마 세포주 Sp2/0과 혼합하고, DMEM 배지로 세정하였다.

원심 분리에 의해 상청을 제거한 후, 미리 37℃로 따뜻하게 한 PEG1500(Roche Diagnostics사) 1mL를 6초마다 100μL씩 첨가하였다. 첨가 후 2분간, 손으로 따뜻하게 하면서 현탁액을 혼합하였다.

그 후, 4분간에 걸쳐 4ml의 37℃로 따뜻하게 한 DMEM 배지를 첨가하고, 1분간에 걸쳐 10mL의 배지를 더 첨가하였다. 현탁액을 37℃의 온욕에서 5분간 따뜻하게 한 후, 실온 1200rpm으로 5분간 원심하였다. 원심 분리 후, 세포를 DMEM 배지에 현탁시키고, 96웰 플레이트(BD사)에 파종하여 배양하였다. 다음날 이후, 약제 선택 배지에서 약 1주일 배양하였다.

[실시예 5] 하이브리도마 스크리닝

실시예 4에서 제작한 하이브리도마의 배양 상청 인간 Hp 및 마우스 Hp에 대한 결합 활성을 효소 결합 면역 흡착법(ELISA)에 의해 해석하였다. 먼저, 96웰 플레이트(MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE, Thermo Fisher Scientific사)에, 인간 Hp(ATHENS RESEARCH&TECHNOLOGY사, 혼합 유형) 또는 마우스 Hp(Life Diagnotics사)를 PBS로 10μg/mL로 조제한 것을 50μL/웰씩 분주하고, 4℃에서 밤새 정치하여 흡착시켰다.

고상화 액을 제거한 후, 1％ 소혈청알부민(bovine serum albumin(BSA))을 포함하는 PBS(이하, BSA-PBS라 기재함)를 100μL/웰씩 분주하여 실온에서 1시간 정치하여 블로킹하고, PBST로 3회 세정하였다. 다음으로 하이브리도마의 배양 상청을 50μL/웰씩 분주하여 실온에서 1시간 정치하였다.

이 플레이트를 PBST로 3회 세정한 후, 1％ BSA-PBS로 희석한 염소 항 인간(Goat anti Human) IgG(H&L)-HRP(American Qualex사)를 50μL/웰씩 분주하여 실온에서 1시간 정치하였다.

이 플레이트를 PBST로 3회 세정하고, ABTS를 50μL/웰씩 분주하여 발색시켰다. 적당한 발색이 얻어진 시점에서, 1％ SDS(도데실황산나트륨)를 50μL/웰씩 분주하고, 샘플 파장 415nm, 레퍼런스 파장 490nm에 있어서의 흡광도를, 플레이트 리더를 사용하여 측정하였다.

[실시예 6] 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자의 클로닝

인간 Hp와 마우스 Hp의 양쪽에 대하여 반응이 보인 웰의 하이브리도마에 대해서, RN이지 플러스 마이크로 키트(Rneasy Plus Micro Kit)(퀴아젠사)를 사용하여, 첨부서에 따라서 토탈 RNA를 조제하였다. 얻어진 토탈 RNA로부터, SMARTer RACE cDNA 증폭 키트(amplification kit)(Clontech사)를 사용하여, 첨부서에 따라서 cDNA를 조제하였다.

얻어진 cDNA를 주형으로, 프라이머 hhiu1(서열 번호 7) 및 hhiu3(서열 번호 8)을 사용하여, 인간 IgG 중쇄 유전자를, 프라이머 hk2(서열 번호 9) 및 hk5(서열 번호 10)를 사용하여, 인간 경쇄(κ쇄) 유전자를 각각 PCR에 의해 증폭시켰다. 증폭시킨 유전자를 서브 클로닝하여, 염기 서열을 해석하였다.

그 결과, 클론 #4, #6, #27, #105 및 #96-6에 대하여 시그널 서열을 제외한 VH 및 VL의 염기 서열 및 아미노산 서열을 동정하였다. 클론 #4의 VH 및 VL의 각각의 염기 서열을 서열 번호 11 및 12 그리고 각각의 아미노산 서열을 서열 번호 21 및 22, 클론 #6의 VH 및 VL의 각각의 염기 서열을 서열 번호 13 및 14 그리고 각각의 아미노산 서열을 서열 번호 23 및 24, 클론 #27의 VH 및 VL의 각각의 염기 서열을 서열 번호 15 및 16 그리고 각각의 아미노산 서열을 서열 번호 25 및 26, 클론 #105의 VH 및 VL 각각의 염기 서열을 서열 번호 17 및 18 그리고 각각의 아미노산 서열을 서열 번호 27 및 28, 클론 #96-6의 VH 및 VL의 각각의 염기 서열을 서열 번호 19 및 20 그리고 각각의 아미노산 서열을 서열 번호 29 및 30으로 나타내었다.

또한, 클론 #27의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 서열 번호 31, 32 및 33으로, 클론 #27의 VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 서열 번호 34, 35 및 36으로, 클론 #105의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 서열 번호 37, 38 및 39로, 클론 #105의 VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 서열 번호 40, 41 및 42로 나타냈다.

[실시예 7] 인간 IgG1형 항Hp 항체 발현용 재조합체 벡터의 구축

인간 IgG1형 항Hp 항체 발현용 재조합체 벡터는, 실시예 6에서 결정된 항Hp 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 유전자를, 각각 인간 IgG1 중쇄 및 κ쇄 정상 영역 유전자에 연결함으로써 제작하였다.

재조합체 벡터로서는, 인간 IgG1 중쇄 재조합체 벡터 pFUSEss-CHIg-hG1(InvivoGen사) 및 인간 IgG1κ쇄 재조합체 벡터 pFUSE2ss-CLIg-hk(InvivoGen사)를 사용하였다.

실시예 5에서 얻어진 전사 산물로부터, 중쇄 가변 영역 유전자는 제한 효소 EcoRI와 BsiWI 사이트간에, 경쇄 가변 영역 유전자는 제한 효소 EcoRI와 NheI 사이트간에, CloneEZ(등록 상표) PCR 클로닝 키트(Cloning Kit)(GenScript사)를 사용하여 삽입하였다. 대장균 DH5α 적격 세포(TOYOBO사)로 형질 전환하고, 배양, 플라스미드 추출, 시퀀스 확인을 실시함으로써, 인간 IgG1형 항Hp 항체 발현용 재조합체 벡터를 제작하였다.

형질 전환한 대장균의 배양에는, 중쇄 재조합체 벡터는 최종 농도 50μg/mL의 Zeocin(인비트로젠사)을 첨가한 배지 LB Broth(Difco사)를 사용하여, κ쇄 재조합체 벡터는 Fast-Media Blas TB(InvivoGen사)를 사용하였다.

[실시예 8] 항Hp 항체의 일과성 발현

인간 IgG1형 항Hp 항체의 일과성 발현주를 제작하기 위해서, 숙주 세포에 실시예 7에서 제작된 재조합체 벡터를 도입하였다. 숙주 세포로서는, 프리스타일(Freestyle) 293F 세포(인비트로젠사)를 사용하였다.

플라스미드 도입은 293 펙틴 형질감염 시약(Fectin Transfection Reagent)(인비트로젠사)를 사용하여, 첨부서를 따라서 행하였다. 인간 IgG1형 항Hp 항체 재조합체 벡터로서, 실시예 7에서 제작한, 중쇄 재조합체 벡터와 κ쇄 재조합체 벡터를 2:3으로 혼합한 것을 사용하였다. 회수한 배양 상청을 원심 분리하고, 얻어진 배양 상청을 0.22㎛ 필터를 사용하여 여과함으로써, 인간 IgG1형 항Hp 항체를 포함하는 배양 상청을 조제하였다.

[실시예 9] 항Hp 항체의 정제

실시예 8에서 얻어진 인간 IgG1형 항Hp 항체 일과성 발현주를, 프리스타일 293 발현 배지(expression medium)(인비트로젠사)에 현탁시키고, 삼각 플라스크에서 6일간 배양한 후, 배양 상청을 회수하였다. 조제한 배양 상청으로부터 MabSelect SuRe(GE 헬스 케어사)를 사용하여, 인간 IgG1형 항Hp 항체를 정제하였다.

먼저, 배양 상청을 칼럼에 통과시키고, 세정용 완충액(0.15mol/L NaCl, 0.2mol/L 붕산 Na/pH 7.5)으로 칼럼을 세정한 후, pH 3.5의 용출용 완충액(0.1mol/L 시트르산 Na/pH 3.5)으로 용출시켰다.

용출된 프랙션은 빠르게 중화용 완충액(1mol/L Tris-HCl/pH 8.5)으로 중화시켰다. 각각의 프랙션의 280nm의 흡광도(A₂₈₀)를 측정하고, 측정값이 높은 연속 프랙션을 항체 분획으로서 회수하였다.

Econo-Pac 10DG 컬럼(columns)(BIO-RAD사)을 사용하여, PBS로 완충액을 교환하고, 0.22㎛의 필터를 통과시킨 것을 정제 단백질로 하였다. 280nm의 흡광 계수를 1.4로 하여, 농도를 산출하였다.

[실시예 10] CD16a 결합 활성(ELISA)

실시예 9에서 제작한 항Hp 항체(#4, #6, #27, #105 및 #96-6)를 사용하여, 항Hp 항체와 인간 Hp의 면역 복합체의 CD16a 결합 활성을 ELISA로 측정하였다. 96웰 플레이트(MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE, Thermo Fisher Scientific사)에, 항Tetra-His 항체(퀴아젠사)를 PBS로 5μg/mL로 조제한 것을 50μL/웰씩 분주하고, 4℃에서 밤새 정치하여 흡착시켰다.

고상화 액을 제거한 후, 1％ BSA-PBS를 100μL/웰씩 분주하여 실온에서 1시간 정치하여 블로킹하고, PBST로 5회 세정하였다. 다음으로 실시예 1에서 제작한 가용성 CD16a를 5μg/mL가 되게 1％ BSA-PBS로 희석한 것을 50μL/웰씩 분주하여 실온에서 2시간 반응시키고, PBST로 5회 세정하였다.

항Hp 항체와 인간 Hp의 혼합 용액(이하, IC라 기재하는 경우도 있음)을, 1％ BSA-PBS로 희석한 후에 실온에서 1시간 정치하여 조제하였다. 농도는 항Hp 항체를 150kDa, 인간 Hp를 200kDa로 하였을 때, 항Hp 항체와 인간 Hp의 몰비가 1:2가 되게 첨가하였다. 적절히 1％ BSA-PBS로 희석한 혼합 용액을 50μL/웰씩 분주하여 실온에서 1시간 반응시켰다.

이 플레이트를 PBST로 5회 세정한 후, 1％ BSA-PBS로 희석한 염소 항 인간 IgG(H&L)-HRP(American Qualex사)를 50μL/웰씩 분주하여 실온에서 1시간 정치하였다.

이 플레이트를 PBST로 5회 세정하고, ABTS를 50μL/웰씩 분주하여 발색시켰다. 적당한 발색이 얻어진 시점에서, 1％ SDS를 50μL/웰씩 분주하고, 샘플 파장 415nm, 레퍼런스 파장 490nm에 있어서의 흡광도를, 플레이트 리더를 사용하여 측정하였다.

그 결과, IVIG의 EC50값이 1.06μg/mL였던 것에 비해, 각 항체 단독에서의 EC₅₀값은, #4는 1.99μg/mL, #6은 0.805μg/mL, #27은 0.763μg/mL, #105는 0.405μg/mL, #96-6은 0.473μg/mL였다. 모든 항Hp 항체가 IVIG에 비해, CD16a에 대한 결합 활성이 높은 것이 명백해졌다(도 1의 A 내지 도 1의 F).

또한, 놀랍게도, 각 항체를 인간 Hp와 혼합하였을 때의 EC₅₀값은, #4는 0.298μg/mL인 것에 비해, #6은 0.0664μg/mL, #27은 0.0490μg/mL, #105는 0.0540μg/mL, #96-6은 0.0459μg/mL였다. 이것은 항체를 인간 Hp와 혼합함으로써, 인간 Hp와 면역 복합체가 형성되어, CD16a에 대한 결합 활성이 항진된 것을 나타내었다(도 1의 A 내지 도 1의 E).

[실시예 11] 안정 발현에 의한 항Hp 항체의 제작

이하에 기재하는 방법으로 항Hp 항체(#4, #6, #27, #105 및 #96-6)를 제작하였다.

(1) 안정 발현용의 항Hp 항체 발현용 재조합체 벡터의 구축

재조합체 벡터로서는, 인간 IgG1κ의 정상 영역 유전자를 포함하는 재조합체 벡터로서 pDELTA를 사용하였다. 중쇄 가변 영역 유전자는 제한 효소 NotI와 ApaI의 사이트간에, 경쇄 가변 영역 유전자는 제한 효소 EcoRI와 BsiWI 사이트간에, 인-퓨전(in-Fusion) HD 클로닝 키트(Clontech사)를 사용하여 삽입하고, 안정 발현용 항Hp 항체 발현용 재조합체 벡터를 제작하였다.

대장균 DH5α 적격 세포로 형질 전환하고, 배양, 플라스미드 추출, 시퀀스 확인을 실시함으로써, 재조합체 벡터를 제작하였다. PCR에는, 주형으로서 실시예 7에서 제작된 인간 IgG1형 항Hp 항체 발현용 재조합체 벡터를, PCR 프라이머로서 서열 번호 43-62로 나타내는 프라이머를 사용하였다.

(2) 푸코오스 결합형 항체의 제작

푸코오스 결합형 항Hp 항체의 안정 발현주를 제작하기 위해서, 숙주 세포에 실시예 11(1)에서 제작한 재조합체 벡터를 도입하였다. 숙주 세포로서 CHO-K1 세포를 사용하였다. 일렉트로포레이션법에 의한 재조합체 벡터의 세포로의 유전자 도입, 배양, 약제 선발은 일반적인 방법으로 행하였다. 배양 일주일간에 한번, 약제를 넣은 배지를 교환하고, 생세포의 비율이 98％ 정도로 회복된 것을 안정 발현 벌크주로 하였다.

이 안정 발현주를 8mmol/L Gln 및 50μg/mL 겐타마이신(나카라이테스크사)을 포함하는 CHO 세포를 위한 EX-CELL 325PF CHO 무혈청 배지(EX-CELL 325PF CHO Serum-Free Medium for CHO Cells)(Sigma-Aldrich사) 등의 배지에 3x10⁵cells/mL가 되게 현탁시켜 14일간 배양 후, 배양 상청을 회수하였다. 배양 상청으로부터 실시예 9에 기재된 방법으로 항Hp 항체를 정제하였다.

(3) 푸코오스 비결합형 항체의 제작

푸코오스 비결합형 항Hp 항체의 안정 발현주를 제작하기 위해서, 숙주 세포에 실시예 11(1)에서 제작한 재조합체 벡터를 도입하였다. 숙주 세포로서 FUT8 녹아웃 CHO 세포(국제 공개 제2005/035586호, 국제 공개 제02/31140호)를 사용하고, 그 후의 조작은 실시예 11(2)에 기재된 방법에 준하여 실시하였다.

(4) 음성 대조 항체 DNP 항체의 제작

음성 대조 항체인 디니트로페닐히드라진(dinitrophenylhydrazine(DNP)) 항체는 공지된 방법(Motoki K et. al., Clin. Cancer Res.11, 3126-3135, 2005)에 준하여 제작하였다.

[실시예 12] Fc 아미노산 개변형의 항Hp 항체의 제작

재조합체 벡터는, 아미노산 개변(S239D, I332E)을 포함하는 인간 IgG1의 Fc 영역 유전자 서열(서열 번호 63)(이하, hCg1 Xen 239 332라 약기하는 경우도 있음)의 합성 DNA(GENEWIZ사)를, 실시예 11(1)에서 제작한 재조합체 벡터의 제한 효소 NheI와 BamHI 사이트 사이에 삽입함으로써 제작하였다. 또한, 당해 재조합체 벡터는 NheI가 아니라, ApaI를 사용해도 제작할 수 있었다.

그 후의 조작을, 실시예 11(3)에 기재된 방법에 준하여 행함으로써, 푸코오스 비결합형이면서 Fc 아미노산 개변형의 항Hp 항체를 제작하였다. 동일한 방법으로, 3군데의 Fc 아미노산 개변(S239D, S298A, I332E)을 실시한 푸코오스 비결합형이면서 Fc 아미노산 개변형의 항Hp 항체를 제작하였다.

[실시예 13] 항Hp 항체의 항원 결합 활성

실시예 9에서 제작한 항Hp 항체(#4, #6, #27, #105 및 #96-6)를 사용하여, 항Hp 항체의 인간 Hp에 대한 결합 활성을 ELISA에 의해 해석하였다. 먼저, 96웰 플레이트(MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE, Thermo Fisher Scientific사)에, 인간 Hp(일본 혈액 제제 기구)를 PBS로 5μg/mL로 조제한 것을 50μL/웰씩 분주하고, 4℃에서 밤새 정치하여 흡착시켰다.

고상화 액을 제거한 후, 1％ BSA-PBS를 100μL/웰씩 분주하여 실온에서 1시간 정치하여 블로킹하고, PBST로 3회 세정하였다. 다음으로 1％ BSA-PBS로 적당한 농도가 되도록 희석한 항Hp 항체를 50μL/웰씩 분주하여 실온에서 1시간 정치하였다. 그 후의 조작은, 플레이트 리더에 의한 흡광도 측정(샘플 파장 405nm) 이외에는, 실시예 5에 기재된 방법에 준하여 실시하였다.

그 결과, #6, #27, #105 및 #96-6의 4 항체는 모두 인간 Hp에 대하여 높은 결합 활성을 나타냈다(도 2). 또한, #4도 이들 4 항체와 동등한 결합 활성을 나타냈다. 이어서, 웨스턴 블로팅에 의해, 실시예 9에서 제작한 항Hp 항체(#4, #6, #27, #105 및 #96-6)가 인간 Hp 중, α쇄 또는 β쇄 중 어느 것에 대하여 결합 활성을 가지는지를 해석하였다. 먼저, 머캅토에탄올을 포함하는 환원 조건의 샘플 완충액을 사용하여 조제한 인간 Hp를 SDS-PAGE 전기 영동으로 분리한 후, PVDF막에 블롯하였다. 각 항Hp 항체와 반응시킨 후, 결합되어 있는 항체를 염소 항 인간 IgG(H&L)-HRP(American Qualex사)로 검출하였다.

그 결과, #4, #6, #27, #105 및 #96-6의 5 항체는, 모두 β쇄에 대한 특이적인 결합 활성을 나타냈다. 이상으로부터, #4, #6, #27, #105 및 #96-6의 5 항체는, 모두 β쇄를 특이적으로 인식하여 인간 Hp에 결합하는 항체인 것을 알았다.

[실시예 14] 항Hp 항체와 인간 Hp의 면역 복합체의 분자량 해석

항Hp 항체와 인간 Hp가 결합하여, 면역 복합체를 형성하고 있음을 확인하기 위해서, HPLC(Prominence, 시마즈 세이사쿠쇼)를 사용한 겔 여과 크로마토그래피(크기 배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography, SEC))(칼럼; BioSep SEC-s4000, 7.8×300mm, phenomenex사)에 의한 분석을 하였다.

이동상[50mmol/L 인산 완충액(pH 7.0, 500mmol/L NaCl)]으로 칼럼을 평형화하고, 항Hp 항체와 인간 Hp(일본 혈액 제제 기구)가 각각 0.5mg/mL와 1.3mg/mL가 되게 PBS로 희석하여 혼합하고, 37℃에서 16시간 정치하였다.

혼합액 50μL에 포함되는 성분을 유속 0.5mL/min으로 분리 후, 파장 280nm에서 검출되는 각 피크에 대해서, 다각도 광산란 검출기(Multi Angle Light Scattering; MALS)(miniDAWN TREOS, Wyatt Technology사)에 의해 검출되는 산란 강도의 최댓값을 사용하여 분자량을 산출하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.

그 결과, 혼합액을 분석하였을 때는, 항Hp 항체 또는 인간 Hp를 각각 단독으로 분석한 경우보다도, 용출 시간이 빠른 고분자량의 피크가 검출되고, 이 피크는 항Hp 항체 및 인간 Hp를 포함하는 면역 복합체를 형성하고 있음이 시사되었다.

상기한 바와 같이, Hp는 α/β-서브유닛이 몇개 포함되는지에 의해, 복수의 분자량의 구조를 취할 수 있다. MALS에 의한 분자량 해석에 있어서, 인간 Hp의 분자량은 206×10³으로 산출되었다. 따라서, 여기에서 사용한 인간 Hp의 주성분은 α/β-서브유닛이 4개 포함되는 것이라고 추정되었다[J Sep Sci., 32, 1224(2009)].

또한, 표 1에 나타낸 바와 같이, 면역 복합체의 분자량은 #4가 형성하는 면역 복합체와 비교하여, #6, #27, #105 및 #96-6이 형성하는 면역 복합체쪽이 컸다.

또한, 항체의 분자량을 150×10³으로 하여, 면역 복합체에 포함되는 항체 및 인간 Hp의 분자수를 추정하였다. 그 결과, #4가 형성하는 면역 복합체에서는 항체 1 분자 및 인간 Hp 1 분자를 포함한다고 추정되었다. 한편, #27이 형성하는 면역 복합체에서는 항체 2 분자 및 인간 Hp 1 분자, #6, #105 및 #96-6이 형성하는 면역 복합체에서는 항체 2 분자 및 인간 Hp2 분자 이상을 포함한다고 추정되었다.

[실시예 15] CD32a 결합 활성(ELISA)

(1) 가용성 CD32a의 제작

실시예 1에 기재된 방법에 준하여, 히스티딘 태그 융합 가용성 CD32a를 제작하였다. 아미노산 서열을 서열 번호 64로 나타낸다.

(2) 항Hp 항체와 인간 Hp의 면역 복합체의 CD32a 결합 활성

실시예 15(1)에서 제작한 가용성 CD32a를 사용하여, 실시예 10과 동일한 방법으로 항Hp 항체와 인간 Hp의 면역 복합체의 CD32a 결합 활성을 해석하였다.

그 결과, 실시예 10에 있어서, 항체를 인간 Hp와 혼합함으로써, 인간 Hp와 면역 복합체가 형성되고, CD16a에 대한 결합 활성이 항진된 항체 중 4 항체(#6, #27, #105 및 #96-6)는, CD32a에 대한 결합 활성 해석에 있어서도, 인간 Hp와 혼합함으로써, CD32a에 대한 결합 활성의 항진을 나타냈다. 한편, #4는 활성의 항진을 나타내지 않았다(도 3).

[실시예 16] CD16a와 항DNP 항체의 결합에 대한 저해 활성

(1) CD16a의 재조합체 벡터의 구축

실시예 1(2)에서 제작한, 전체 길이 CD16a(V)(서열 번호 4)를 코딩하는 cDNA를 포함하는, 플라스미드 pBs CD16a(V) 5.0μg을 제한 효소 NotI(다카라 바이오사) 및 BamHI(다카라 바이오사)로 소화 후, 1.5％ 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하여, 약 800bp의 DNA 단편을 회수하였다.

한편, 국제 공개 제97/10354호에 기재된 플라스미드 pKANTEX93 10μg을 제한 효소 NotI I(다카라 바이오사) 및 BamHI I(다카라 바이오사)로 소화 후, 1.5％ 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하여, 약 11.7kbp의 DNA 단편을 회수하였다. 이들 약 800bp의 DNA 단편과 약 11.7kbp의 DNA 단편을 DNA 라이게이션 키트 Ver.2.0(다카라 바이오사제)으로 연결하고, 대장균 DH5α주(TOYOBO사)를 형질 전환하여, 전체 길이 CD16a(V)를 코딩하는 재조합체 벡터 pKANTEX CD16a(V)를 취득하였다.

(2) CD16a 발현 세포의 제작

실시예 16(1)에서 구축한 전체 길이 CD16a(V)를 코딩하는 재조합체 벡터 pKANTEX CD16a(V)를 DHFR 유전자 결손 CHO 세포 DG44주(CHO/DG44 세포)에 도입하고, CD16a의 안정 생산 세포를 이하와 같이 제작하였다.

pKANTEX CD16a(V)를 일렉트로포레이션법에 의해 CHO/DG44 세포에 유전자 도입하였다. 실시예 1(5)에 기재된 방법과 동일하게 MTX 농도를 순차 상승시켜, 최종적으로 0.5mg/mL의 G418 및 500nmol/L의 MTX 및 10％ FBS(GIBCO사)를 포함하는 IMDM(GIBCO사)에서 증식 가능하며, 또한 CD16a를 고발현하는 형질 전환 세포를 얻었다.

얻어진 형질 전환 세포를 0.02％ EDTA 용액(나카라이테스크사)으로 박리하고, PBS(phosphate buffered saline)로 세정한 후, FCM용 완충액 1(2％ FBS, 0.05％ NaN₃ 및 1mmol/L EDTA를 포함하는 PBS)로 현탁시켰다.

이어서, 2×10⁵cells/well이 되게 96웰 U 바닥 플레이트(Falcon사)에 파종하여 PE 표지 항인간 CD16 항체(BD 바이오사이언스사)로 염색, 세정 후에, 세포를 FCM용 완충액 1로 현탁시켜, 형광 강도를 플로우 사이토미터(BD 바이오사이언스사, FACS CantoII)로 해석하고, CD16a가 고발현되고 있음을 확인하였다.

(3) CD16a와 항DNP 항체의 결합에 대한 저해 활성

실시예 11에서 제작한 항Hp 항체(푸코오스 결합형 및 푸코오스 비결합형), 푸코오스 비결합형 항Hp 항체 및 인간 Hp를 포함하는 면역 복합체, 그리고 IVIG를 사용하여, CD16a와 항DNP 항체의 결합에 대한 저해 활성을 검토하였다.

실시예 16(2)에서 제작된 CD16a 발현 세포를 1.2×10⁵cells/웰이 되게 96웰 플레이트에 파종하였다. 이어서, 실시예 11에서 제작한 항Hp 항체(푸코오스 결합형 및 푸코오스 비결합형), 푸코오스 비결합형 항Hp 항체 및 인간 Hp를 포함하는 면역 복합체, 그리고 IVIG를, FCM용 완충액 1로 희석한 후, 실온에서 1시간 정치하여 피검체로 하였다.

푸코오스 비결합형 항Hp 항체 및 인간 Hp를 포함하는 면역 복합체는, 항Hp 항체를 150kDa, 인간 Hp를 200kDa로 하였을 때, 항Hp 항체와 인간 Hp의 몰비가 1:2가 되게 조제하였다. 이들 피검체를, 먼저 세포를 파종한 플레이트에 10μL/웰 첨가하여, 4℃에서 5분간 반응시켰다.

별도로, 실시예 11(4)에서 제작한 항DNP 항체와 DNP(2-4-디니트로페놀)-BSA 프로테인 비오틴 컨쥬게이트(Protein Biotin Conjugate)(Alpha Diagnotics사)가 모두 0.05mg/mL가 되게 혼합하고, 실온에서 1시간 정치함으로써 항DNP 항체 용액으로 하였다.

피검체를 첨가하여 4℃에서 5분간 반응시킨 상기 플레이트에, 경합 항체로서 항DNP 항체 용액을 10μL/웰 첨가하고, 4℃에서 3시간 반응시켰다. FCM용 완충액 1로 이 플레이트를 세정 후, 스트렙타비딘(streptavidin), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647 컨쥬케이트(Molecular Probes사)를 사용하여, 결합되어 있는 항DNP 항체를 검출함으로써, CD16a 결합 저해 활성을 검토하였다.

그 결과, IC₅₀값은 #27의 푸코오스 결합형과 #27의 푸코오스 비결합형, 각각 238μg/mL와 53.8μg/mL가 되고, 푸코오스 비결합형으로 함으로써 보다 강한 저해 활성을 나타냈다.

또한, 놀랍게도, #27의 푸코오스 비결합형 또는 #105의 푸코오스 비결합형을 인간 Hp와 각각 혼합하여 면역 복합체를 형성시키면, IC₅₀값은 각각 11.7μg/mL와 7.92μg/mL가 되고, 면역 복합체 형성에 의해 더욱 강한 결합 저해 활성을 나타냈다. IVIG의 IC₅₀값은 540μg/mL였다.

이로부터, #27 또는 #105에 의한, CD16a와 항DNP 항체의 결합에 대한 저해 활성은, #27 및 #105를 각각 푸코오스 비결합형으로 개변함으로써, 또한 각각이 인간 Hp와 면역 복합체 형성함으로써, 대폭 항진되는 것이 명백해졌다(도 4).

[실시예 17] PBMC를 사용한 ADCC 반응에 대한 저해 활성

PBMC를 사용한 ADCC 반응에 있어서의, 항Hp 항체 및 면역 복합체화한 항Hp 항체에 의한 저해 활성을 검토하였다. ADCC 활성은 국제 공개 제2007/011041호에 기재된 방법에 준하여 측정하였다.

표적 세포로서 Her2 양성 인간 유방암 세포 SK-BR-3을 사용하고, 이펙터 세포에는 건강인 도너 유래의 동결 PBMC(Lonza사)를 사용하였다. 표적 세포는 100ng/mL의 시판 항Her2 항체 헤르셉틴(Herceptin)으로 옵소닌화하였다. 표적 세포에 대한 이펙터 세포의 비는 1:20으로 실험을 행하였다.

먼저, 실시예 11에서 제작한 항Hp 항체(푸코오스 결합형 및 푸코오스 비결합형), 푸코오스 비결합형 항Hp 항체 및 인간 Hp를 포함하는 면역 복합체, 그리고 IVIG를, 5％ FBS를 포함하는 RPMI1640으로 희석한 후에 실온에서 1시간 정치하여 피검체로 하였다. 푸코오스 비결합형 항Hp 항체 및 인간 Hp를 포함하는 면역 복합체는, 항Hp 항체를 150kDa, 인간 Hp를 200kDa로 하였을 때, 항Hp 항체와 인간 Hp의 몰비가 1:2가 되게 조제하였다.

이어서, 96웰 U 바닥 플레이트(Falcon사)에, 헤르셉틴, 피검체, 이펙터 세포, 표적 세포의 순서대로 첨가하여 37℃(5％ CO₂)에서 4시간 반응시켰다. 반응 후, 플레이트를 원심 분리하고, 상청 중의 락트산탈수소 효소(LDH) 활성을, LDH-Cytotoxic Test(와코 쥰야쿠사)를 사용하여, 첨부된 설명서에 따라서 측정하였다. ADCC(％)는 이하의 식에 의해 산출하였다.

ADCC(％)=100×(S-Ab)/(Max-T)

S=샘플 반응 웰 흡광도-배지 웰 흡광도

Ab=항체 무첨가 웰 흡광도-배지 웰 흡광도

T=표적 웰 흡광도-배지 웰 흡광도

Max=100％ 반응 웰 흡광도-100％ 반응 대조 웰 흡광도

그 결과, #27의 푸코오스 비결합형 또는 #105의 푸코오스 비결합형을 인간 Hp와 혼합하여 각각 면역 복합체를 형성시키면, IVIG 및 #27의 푸코오스 비결합형과 비교하여 저농도로부터 ADCC 활성을 저해하는 작용을 나타냈다. 이로부터, ADCC 활성은, 면역 복합체 형성에 의해 대폭 감약되는 것이 명백해졌다(도 5). #6 및 #96-6에 대해서도, 동일하게 본 평가계에 제공함으로써 높은 저해 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

[실시예 18] 건강인 도너의 말초 혈액을 사용한 ADCC 반응의 저해 활성

(1) 푸코오스 비결합형 리툭시맙의 제작

푸코오스 비결합형 항CD20 항체 리툭시맙(미국 특허 제5,736,137호 명세서)는, 공지된 방법(Masuda K et. al., Mol. Immunol.44, 3122-3131, 2007)에 준하여 제작하였다.

(2) 건강인 도너의 말초 혈액을 사용한 ADCC 반응의 저해 활성

건강인 도너의 말초 혈액을 사용한 ADCC 반응에 있어서의, 항Hp 항체의 저해 활성을 검토하였다. 건강인 도너의 말초 혈액을 사용한 ADCC 반응은, 공지된 방법(Masuda K et.al., Mol. Immunol. 44, 3122-3131, 2007)에 준하여 측정하였다.

먼저, 실시예 11 및 실시예 12에서 제작한 항Hp 항체, 항DNP 항체, 및 이들 항체의 각종 개변형, 그리고 IVIG를, RPMI1640으로 최종 농도의 15배로 조제하여 피검체로 하였다.

이어서, 48웰 플레이트(greiner bio-one사)의 각 웰에, 피검체 30μL와 건강인 도너의 말초 혈액을 390μL 각각 분주하였다. 37℃(5％ CO₂)에서 30분간 배양 후, (1)에서 제작된 푸코오스 비결합형 리툭시맙을, 최종 농도가 1μg/mL가 되게 RPMI1640으로 희석하여 각 웰에 30μL씩 분주하였다.

ADCC 미반응된 웰에는, 푸코오스 비결합형 리툭시맙 대신에 RPMI1640을, 피검체 비존재 하에서 푸코오스 비결합형 리툭시맙에 의한 ADCC 반응을 행한 웰에는, 피검체 대신에 RPMI1640을 분주하였다. 48웰 플레이트를 37℃(5％ CO₂)에서 20시간 배양 후, B 세포수를 카운트하였다.

구체적으로는, 각 웰로부터 150μL를 분취하고, 유동 세포측정을 위한 카운트브라이트 앱솔루트 카운팅 비즈(CountBright Absolute Counting Beads, for flow cytometry)(Molecular Probes사)를 30μL/샘플로 첨가한 후, 용혈용 용액[10×RBC 용해 완충제(Lysis buffer)(e-bioscience사)를 멸균수로 10배로 희석한 것]을 사용하여 첨부서에 따라서 용혈 조작을 하였다.

원심 분리 후, 상청을 버리고, 침전 잔사로서 얻어진 세포를 96웰 U 바닥 플레이트(Falcon사)로 옮기고, FCM용 완충액 2(0.05％ NaN₃ 및 1mmol/L EDTA를 포함하는 1％ BSA-PBS) 75μL에 현탁시켰다.

FcR 차단 시약(Blocking Reagent), 휴먼(human)(밀테니 바이오텍사)을 5μL/웰씩 분주하고, 4℃에서 5분간 정치한 후, FCM용 완충액 2로 희석한 APC 마우스 항-인간(Mouse Anti-Human) CD19(BD 바이오사이언스사), PE 마우스 항-인간 CD2(BD 바이오사이언스사)를 더 첨가하고, 4℃에서 30분 이상 반응을 행하였다.

사세포는 405nm 여기용 라이브/데드 고정성 바이올렛 사멸 세포 염색 키트(LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit, for 405nm excitation)(Molecular Probes사)를 사용하여 첨부된 설명서를 따라서 염색하였다. 다시 세포를 세정한 후, FCM용 완충액 2에 현탁시키고, 형광 강도를 플로우 사이토메트리(BD 바이오사이언스사, FACS CantoII)를 사용하여 해석하였다. B 세포를 FSC-SSC 전개의 림프구 분획에 있어서의 LIVE/DEAD 음성, CD19 양성, CD2 음성 분획으로서 검출하였다.

ADCC 활성은, 카운트브라이트 앱솔루트 카운팅 비즈 2400개당 B 세포수를 해석하는 방법 또는 림프구 분획에 있어서의 LIVE/DEAD 음성, CD19 양성의 비율을 해석하는 방법 중 어느 것에 의해 평가하였다.

그 결과, #27의 푸코오스 비결합형 및 #105의 푸코오스 비결합형은, Fc 도메인이 동일한 구조를 갖는 항DNP 항체의 푸코오스 비결합형보다도, 높은 ADCC 반응에 대한 저해 활성을 나타내는 것이 명백해졌다. 그 저해 활성은 IVIG와 비교하여 대폭 높았다. 또한, Fc 아미노산 개변(S239D, I332E)을 실시한 항Hp 항체의 푸코오스 비결합형은, 더욱 높은 저해 활성을 나타냈다(도 6의 A).

항DNP 항체는, 본 발명의 항Hp 항체와 달리, 말초 혈액 내에 리간드를 포함하지 않고, 단량체로 존재한다고 생각된다. 따라서, 이들 결과는, 본 발명의 항Hp 항체가, 혈액 중에서 인간 Hp와 면역 복합체를 형성함으로써, 높은 저해 활성을 발휘할 수 있음을 시사하고 있다.

이상의 결과로부터, ADCC 반응에 대한 저해 활성은, 면역 복합체 형성과 포테리젠트 기술에 더하여, Fc 아미노산 개변을 조합함으로써, 현저하게 항진되는 것이 명백해졌다(도 6의 A).

Fc 아미노산 개변(S239D, S298A, I332E)을 실시한 #27의 푸코오스 비결합형은, 도 6의 A의 실험과 동일하게 높은 저해 활성을 나타냈다. 이로부터, ADCC 반응에 대한 저해 활성은, Fc 아미노산 개변(S239D, S298A, I332E)에 의해서도, 현저하게 항진되는 것이 명백해졌다.

한편, Fc 아미노산 개변(S239D, S298A, I332E)을 실시한 #4의 푸코오스 비결합형에서는 저해 활성의 정도는 낮았다. 이로부터, 항Hp 항체의 클론에 의해 그 저해 활성이 상이한 것이 명백해졌다. 실시예 14의 결과도 함께 고찰하면, 높은 저해 활성을 발휘하는 데 있어서, 인간 Hp와 항Hp 항체의 면역 복합체에 포함되는 항체수가 2개 이상인 것이 중요하다고 생각되었다(도 6의 B).

[실시예 19] 인간 Hp와 항Hp 항체의 결합에 대한 작용

(1) 효소 표지 항체의 제작

실시예 11(2)에서 제작한 항Hp 항체(#6, #105 및 #96-6) 및 항Hp 래빗 폴리클로날 항체(록랜드 이뮤노케미칼사)(이하, 항Hp 폴리클로날 항체라 기재함)를 퍼옥시다제 표지 키트(Peroxidase Labeling Kit)-NH₂(도진 가가꾸 겡큐쇼사)를 사용하고, 첨부된 설명서에 기초하여 표지하였다. 각 항Hp 항체 200μg의 용매를 여과 튜브(Filtration Tube)를 사용하여 세정용 완충액으로 치환한 후, NH₂-반응성 퍼옥시다제를 첨가하고, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 그 후, 표지 항체의 용매를 세정용 완충액으로 다시 치환하였다.

(2) 인간 Hp와 취득한 항Hp 항체의 결합에 대한 작용

인간 Hp와 실시예 19(1)에서 제작한 표지 항Hp 항체(#6, #105 및 #96-6)의 결합에 대한 #27 및 #105의 작용을 평가하였다. 96웰 플레이트(MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE, Thermo Fisher Scientific사)에, 인간 Hp를 PBS로 5μg/mL로 조제한 것을 50μL/웰씩 분주하고, 4℃에서 밤새 정치하여 흡착시켰다.

고상화 액을 제거한 후, 1％ BSA-PBS를 100μL/웰씩 분주하여 실온에서 1시간 정치하여 블로킹하고, PBST로 3회 세정하였다. 다음으로 1％ BSA-PBS로 20μg/mL가 되게 희석한 항Hp 항체(#27, #105, #6 또는 #96-6) 또는 대조 항체로서 항DNP 항체(실시예 11(4)에서 제작) 또는 항Hp 폴리클로날 항체를 50μL/웰씩 분주하여 실온에서 10분간 정치하였다.

그 후, 1％ BSA-PBS로 희석한 표지 항Hp 항체(#6, #105 또는 #96-6)[실시예 19(1)에서 제작]를 50μL/웰씩 분주하여 실온에서 1시간 정치하였다. 이 플레이트를 PBST로 3회 세정하고, ABTS를 50μL/웰씩 분주하여 발색시켰다. 적당한 발색이 얻어진 시점에서, 1％ SDS를 50μL/웰씩 분주하고, 샘플 파장 415nm, 레퍼런스 파장 490nm에 있어서의 흡광도를, 플레이트 리더를 사용하여 측정하였다.

결과를 표 2에 나타낸다. 표 2 내의 + 및 -는, 흡광도가 0.5 이상인 경우를 +로 하고, 0.5 미만인 경우를 -로서 나타냈다. 인간 Hp와 표지 항Hp 항체(#6, #105 또는 #96-6)의 결합은, 항DNP 항체의 첨가에서는 저해되지 않은 한편, 각각의 미표지체의 항Hp 항체의 첨가 및 항Hp 폴리클로날 항체의 첨가에 의해 저해되어, 본 평가계로 경합의 유무를 평가할 수 있음을 미리 확인하였다.

표 2에 나타낸 바와 같이, 인간 Hp와 표지 항Hp 항체(#6, #105 또는 #96-6)의 결합은 #27의 첨가에 의해 저해되지 않았다. 이것은, #27이 인식하는 인간 Hp의 에피토프는, #6, #105 및 #96-6의 에피토프와는 상이한 것을 시사하고 있다. 또한, 인간 Hp와 #6 또는 #96-6의 결합은 #105의 첨가로 저해되지 않았다. 이것은, #105의 에피토프는, #27뿐만 아니라 #6 및 #96-6의 에피토프와도 상이한 것을 시사하고 있다.

(3) 인간 Hp와 시판 항Hp 항체의 결합에 대한 작용

(i) 인간 Hp와 시판 항Hp 항체의 결합성

시판되고 있는 항Hp 마우스 항체 3클론을 사용하여, 인간 Hp에 대한 결합성을 평가하였다. 먼저, 실시예 19(2)에 기재된 방법에 준하여, 96웰 플레이트에 인간 Hp를 고상화하고, 블로킹하였다. 블로킹 후, 1％ BSA-PBS에 의해 1μg/mL로 희석한 시판 항Hp 항체 2B11(LifeSpan BioSciences사)(이하, 시판 2B11 항체라 기재함), 2F4(Santa Cruz사)(이하, 시판 2F4 항체라 기재함) 또는 F8(Santa Cruz사)(이하, 시판 F8 항체라 기재함), 및 대조 항체로서 마우스 IgG1형 아이소타입 컨트롤 항체 또는 표지 항Hp 폴리클로날 항체[실시예 19(1)에서 제작]를, 각각 50μL/웰씩 분주하여 실온에서 1시간 정치하였다.

이 플레이트를 PBST로 3회 세정한 후, 1％ BSA-PBS로 희석한 래빗 항-마우스(Rabbit anti-Mouse) IgG-HRP(Dako사)를 50μL/웰씩 분주하여 실온에서 1시간 정치하였다. 이 후의, 발색 및 흡광도의 측정은 실시예 5에 기재된 방법에 준하여 실시하였다. 그 결과, 시판 2B11 항체 및 시판 2F4 항체는 인간 Hp에 대한 결합성을 나타냈지만, 시판 F8 항체는 인간 Hp에 대한 결합성을 거의 나타내지 않았다. 이로부터, 시판 2B11 항체 및 시판 2F4 항체를 사용하여 다른 평가를 실시하였다.

(ii) 소 Hp 또는 마우스 Hp와 시판 항Hp 항체의 결합성

시판 2B11 항체 및 시판 2F4 항체의, 소 Hp(Life Diagnostics사) 및 마우스 Hp에 대한 결합성을, #27 및 #105의 소 Hp 및 마우스 Hp에 대한 결합성과 비교하였다. 먼저, 실시예 19(2)에 기재된 방법에 준하여, 96웰 플레이트에 인간 Hp, 소 Hp 또는 마우스 Hp를 고상화하고, 블로킹하였다.

블로킹 후, 1％ BSA-PBS에 의해 1μg/mL로 희석한 항Hp 항체(#27 또는 #105), 시판 항Hp 항체(시판 2B11 항체 또는 시판 2F4 항체) 또는 대조 항체(항DNP 항체, 마우스 IgG1형 아이소타입 컨트롤 항체 또는 표지 항Hp 폴리클로날 항체)를 50μL/웰씩 분주하여 실온에서 1시간 정치하였다.

이 플레이트를 PBST로 3회 세정한 후, 1％ BSA-PBS에 의해 희석한 염소 항 인간 IgG(H&L)-HRP 또는 래빗 항-마우스 IgG-HRP를 50μL/웰씩 분주하여 실온에서 1시간 정치하였다. 이 플레이트를 PBST로 3회 세정하고, TMB(Dako사)를 50μL/웰씩 분주하여 발색시켰다. 적당한 발색이 얻어진 시점에서, 0.5mol/L H₂SO₄(와코 쥰야쿠사)를 50μL/웰씩 분주하고, 450nm에 있어서의 흡광도를 측정하였다.

결과를 표 3에 나타낸다. 항Hp 항체(#27 또는 #105)를 반응시킨 웰의 흡광도에 대해서는, 항DNP 항체를 반응시킨 웰의 흡광도를 뺀 값을 구하였다. 또한, 시판 항Hp 항체(시판 2B11 항체 또는 시판 2F4 항체)를 반응시킨 웰의 흡광도에 대해서는, 마우스 IgG1형 아이소타입 컨트롤 항체를 반응시킨 웰의 흡광도를 뺀 값을 구하였다. 그 값이 1 이상인 경우를 +로 하고, 1 미만인 경우를 -로 하여 표 내에 나타냈다. 항Hp 폴리클로날 항체와 인간 Hp, 소 Hp 및 마우스 Hp의 결합으로부터, 항원이 고상화되어 있음을 미리 확인하였다.

표 3에 나타낸 바와 같이, #27, #105 및 시판 2F4 항체는 소 Hp에 결합하지 않은 것에 비해, 시판 2B11 항체는 소 Hp에도 결합하였다. 이로부터, 시판 2B11 항체는 인간-소에서 상동의 아미노산 잔기에 결합되어 있음에 비해, #27, #105 및 시판 2F4 항체는 인간-소에서 비상동의 아미노산 잔기에 결합하는 것이 나타났고, #27 및 #105는 시판 2B11 항체와 다른 에피토프를 인식하고 있음이 명백해졌다.

또한, #27 및 #105는 마우스 Hp에 결합한 것에 비해, 시판 2F4 항체는 마우스 Hp에 결합하지 않았다. 이로부터, #27 및 #105는, 시판 2F4 항체와 동일하게 인간-소에서 비상동의 아미노산 잔기를 인식하는 것이 명백해졌다. 또한, #27 및 #105가 인간-마우스에서 상동의 아미노산 잔기에 결합하는 것에 비해, 시판 2F4 항체는 인간-마우스에서 비상동의 아미노산 잔기에 결합되어 있음이 나타났고, #27 및 #105는 시판 2F4 항체와 다른 에피토프를 인식하고 있음이 명백해졌다.

(iii) 경합 ELISA

#27 및 #105가 시판 2F4 항체와 다른 에피토프를 인식하는 것을 다른 방법으로 평가할 목적으로, 인간 Hp와 시판 2F4 항체의 결합에 대한 #27 및 #105의 작용을 평가하였다. 실시예 19(1)에 기재된 방법에 준하여, 96웰 플레이트에 인간 Hp를 고상화하고, 블로킹한 후, 1％ BSA-PBS로 20μg/mL가 되게 희석한 항Hp 항체(#27 또는 #105), 또는 대조 항체로서 항DNP 항체 혹은 항Hp 폴리클로날 항체를 50μL/웰씩 분주하여 실온에서 10분간 정치하였다.

계속해서 1％ BSA-PBS로 500배로 희석한 시판 2F4 항체를 50μL/웰씩 분주하여 실온에서 1시간 정치하였다. 이 플레이트를 PBST로 3회 세정한 후, 1％ BSA-PBS로 희석한 래빗 항-마우스 IgG HRP(Dako사)를 50μL/웰씩 분주하여 실온에서 1시간 정치하였다. 이 후의, 발색 및 흡광도의 측정은 실시예 5에 기재된 방법에 준하여 실시하였다.

결과를 표 4에 나타낸다. 표 4 내의 + 및 -는, 흡광도가 0.5 이상인 경우를 +로 하고, 0.5 미만인 경우를 -로 하였다. 인간 Hp와 시판 2F4 항체의 결합은 항DNP 항체의 첨가에서는 저해되지 않은 한편, 항Hp 폴리클로날 항체의 첨가에 의해 저해되었다. 본 결과에 의해, 본 평가계로 경합의 유무를 평가할 수 있음을 미리 확인하였다.

표 4에 나타낸 바와 같이, 인간 Hp와 시판 2F4 항체의 결합은 #27 또는 #105의 첨가에서 저해되지 않고, 실시예 19(3)(ii)와 동일하게 #27 및 #105는 시판 2F4 항체와는 다른 에피토프를 인식하는 것이 명백해졌다.

[실시예 20] 취득한 항Hp 항체의 에피토프 해석

(1) 인간 Hp/소 Hp 키메라 단백질의 제작

실시예 13에 기재된 바와 같이, #27 및 #105는 인간 Hp의 β쇄를 인식하고 있음이 시사되었다. #27 및 #105가 인간 Hpβ쇄 중 어느 아미노산을 인식하고 있는지를 밝히고, 시판 2F4 항체의 에피토프와 비교할 목적으로, 에피토프 해석을 행하였다.

실시예 19(3)(ii)에 기재된 바와 같이, #27 및 #105는 소 Hp에 결합하지 않고, 마우스 Hp에 결합하였다. 본 결과에 기초하여, 인간 Hpβ쇄(서열 번호 70)의 아미노산 잔기를 일부 소의 아미노산 잔기로 치환한 키메라 Hpβ쇄를 복수 설계하였다. 구체적으로는, 인간 Hp의 아미노산 서열(서열 번호 65), 소 Hp의 아미노산 서열(서열 번호 73) 및 마우스 Hp의 아미노산 서열(서열 번호 74)을 비교하여, 인간 Hpβ쇄(서열 번호 70) 중, 인간-소에서 비상동이면서 인간-마우스에서 상동인 아미노산 잔기를 추출하였다. 또한, 추출한 해당 잔기를 대응하는 소 Hp의 아미노산 잔기로 치환하였다.

또한, 키메라 Hpβ쇄의 발현용 재조합 벡터는, 5' 말단으로부터 인간 Hpα쇄(서열 번호 71), 키메라 Hpβ쇄, 히스티딘 태그의 순서대로 코딩되도록 설계하였다. 이에 의해, 키메라 Hpβ쇄는, C 말단측에 히스티딘 태그가 결합하고, 또한 인간 Hpα쇄가 디술피드 결합으로 연결된 형태로 발현된다(이하 키메라 A 내지 F라 표기함).

제작한 키메라 A 내지 F에 있어서, 치환한 아미노산 잔기의 위치와 종류를 표 5에 나타낸다. 제작한 키메라 A 내지 F의 아미노산 서열을 서열 번호 75 내지 80으로, 키메라 A 내지 F의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 합성 DNA(파스맥사 또는 GENEWIZ사)의 염기 서열을 서열 번호 81 내지 86으로 나타낸다.

키메라 A 내지 F의 발현용 재조합체 벡터는, pCI 벡터의 제한 효소 EcoRI와 SalI 사이트 사이에, 합성 DNA(서열 번호 81 내지 86)를 인-퓨전 HD 클로닝 키트를 사용하여 삽입함으로써 제작하였다. 또한, 아미노산 치환을 실시하지 않은 인간 Hpβ쇄(서열 번호 70)에 대해서도, 키메라 단백질과 동일하게 발현용 재조합 벡터를 제작하였다.

제작한 재조합체 인간 Hp의 아미노산 서열을 서열 번호 87로, 합성 DNA의 서열을 서열 번호 88로 나타낸다. 에피펙타민(ExpiFectamin) 293 형질감염 키트(Transfection Kit)(Gibco사)를 사용하고, 설명서를 따라서 일과성 발현에 의해 키메라 A 내지 F 및 재조합체 인간 Hp를 제작하였다.

숙주 세포에는 Expi293F(Life technologies사)를 배양용 배지에는 Expi293 발현 배지(Gibco사)를 사용하였다. 회수한 배양 상청으로부터, 컴플리트 His-태그 정제 수지(cOmplete His-Tag Purification Resin)(Roche사)를 사용하여, 첨부된 설명서를 따라서 키메라 A 내지 F 및 재조합체 인간 Hp를 정제하였다.

(2) 인간 Hp/소 Hp 키메라 단백질에 대한 결합성

실시예 20(1)에서 제작한 키메라 A 내지 F에 대한 #27 및 #105의 결합성을 평가하였다. 96웰 플레이트에, 키메라 A 내지 F, 재조합체 인간 Hp 및 소 Hp를 실시예 5에 기재된 방법에 준하여 고상화하고, 블로킹하였다. 블로킹한 후, 1％ BSA-PBS에 의해 희석한 항Hp 항체(#27 또는 #105), 시판 2F4 항체 또는 대조 항체(항DNP 항체, 마우스 IgG1형 아이소타입 컨트롤 항체 혹은 표지 항Hp 폴리크로 항체)를 50μL/웰씩 분주하여 실온에서 1시간 정치하였다.

이 플레이트를 PBST로 3회 세정한 후, 1％ BSA-PBS로 희석한 염소 항 인간 IgG(H&L)-HRP 또는 래빗 항-마우스 IgG-HRP를 50μL/웰씩 분주하여 실온에서 1시간 정치하였다. 이 후의, 발색 및 흡광도의 측정은 실시예 5에 기재된 방법에 준하여 실시하였다. 각 항Hp 항체와 재조합체 인간 Hp를 반응시킨 웰의 흡광도를 1로 하여, 샘플 반응 웰의 흡광도로부터 비를 산출하였다.

결과를 표 6에 나타낸다. 표 6 내의 + 및 -는, 흡광도의 비가 0.5 이상인 경우를 +, 0.5 미만인 경우를 -로서 나타냈다. 항DNP 항체 및 마우스 IgG1형 아이소타입 컨트롤 항체는 어느 고상화 항원과도 결합하지 않는 것을 미리 확인하였다. 또한, 항Hp 폴리클로날 항체가 모든 고상화 항원에 대하여 결합성을 나타냄으로써, 항원이 고상화되어 있음도 확인하였다.

표 6에 나타낸 바와 같이, #27의 키메라 F에 대한 결합성이 특이적으로 저하되어 있으며, #105의 키메라 A에 대한 결합성도 특이적으로 저하되어 있었다. 이로부터, #27은 에피토프에 적어도 F44 및 E49를 포함하는 것, 및 #105는 에피토프에 적어도 S155, T156 및 V157을 포함하는 것이 명백해졌다. 한편, 시판 2F4 항체는 키메라 A 내지 F 모두에 대해서도 높은 결합성을 나타낸 점에서, #27 및 #105의 에피토프인 아미노산 잔기가, 시판 2F4 항체의 에피토프에는 포함되지 않는 것이 명백해졌다.

(3) 인간 Hp/마우스 Hp 키메라 단백질의 제작

시판 2F4 항체의 에피토프를 명확하게 하여, #27 및 #105의 에피토프와 비교할 목적으로, 시판 2F4 항체의 에피토프 해석을 행하였다. 실시예 19(3)(ii)에 기재된 바와 같이, 시판 2F4 항체는 소 Hp 및 마우스 Hp에 결합하지 않았다.

본 결과에 기초하여, 인간 Hpβ쇄(서열 번호 70)의 아미노산 잔기를 일부 마우스의 아미노산 잔기로 치환한 키메라 Hpβ쇄를 복수 설계하였다. 구체적으로는, 인간 Hp의 아미노산 서열(서열 번호 65), 소 Hp의 아미노산 서열(서열 번호 73) 및 마우스 Hp의 아미노산 서열(서열 번호 74)을 비교하여, 인간 Hpβ쇄(서열 번호 70) 중, 인간-소에서 비상동이면서 인간-마우스에서도 비상동인 아미노산 잔기를 추출하였다. 또한, 추출한 해당 잔기를 대응하는 마우스 Hp의 아미노산 잔기로 치환하였다.

또한, 키메라 Hpβ쇄는, 실시예 20(1)에 기재된 방법과 동일하게, C 말단측에 히스티딘 태그를 결합하고, 또한 인간 Hpα쇄(서열 번호 71)가 디술피드 결합으로 연결된 형태로 발현된다(이하 키메라 G 내지 K라 표기함).

제작한 키메라 G 내지 K에 있어서, 치환한 아미노산 잔기의 위치와 종류를 표 7에 나타낸다. 제작한 키메라 G 내지 K의 아미노산 서열을 서열 번호 89 내지 93으로, 합성 DNA의 염기 서열을 서열 번호 94 내지 98로 나타낸다.

(4) 인간 Hp/마우스 Hp 키메라 단백질에 대한 결합성

실시예 20(2)에 기재된 방법에 준하여, 실시예 20(3)에서 제작한 키메라 G 내지 K에 대한 시판 2F4 항체의 결합성을 평가하였다. 결과를 표 8에 나타낸다. 각 항Hp 항체와 재조합체 인간 Hp를 반응시킨 웰의 흡광도를 1로 하여, 샘플 반응 웰의 흡광도로부터 비를 산출하였다.

표 8 내의 + 및 -는, 흡광도의 비가 0.5 이상인 경우를 +, 0.5 미만인 경우를 -로서 나타냈다. 항DNP 항체 및 마우스 IgG1형 아이소타입 컨트롤 항체는 어느 고상화 항원과도 결합하지 않음을 미리 확인하였다. 또한, 항Hp 폴리클로날 항체가 모든 고상화 항원에 대하여 결합성을 나타냄으로써, 항원이 고상화되어 있음도 확인하였다.

표 8에 나타내는 바와 같이, 시판 2F4 항체의 키메라 K에 대한 결합성이 특이적으로 저하되어 있었다. 이로부터, 시판 2F4 항체는 에피토프에 Q147, I149, R150 및 P163을 포함하는 것이 명백해졌다. 한편, #27 및 #105는 키메라 G 내지 K 중 어느 것에 대해서도 높은 결합성을 나타내고, 시판 2F4 항체의 에피토프인 아미노산 잔기가, #27 및 #105의 에피토프에는 포함되지 않는 것이 명백해졌다.

#27 및 #105의 에피토프[실시예 20(2)에서 동정] 및 시판 2F4 항체의 에피토프를 표 9에 나타낸다.

이상의 결과로부터, 시판 2F4 항체의 에피토프는 #27 및 #105의 에피토프와 상이한 것이 명백해졌다.

[실시예 21] 푸코오스 비결합형이면서 CD16a/CD32a 고친화성 Fc 아미노산 개변형의 항Hp 항체의 제작

재조합체 벡터는, 아미노산 개변(G236A, S239D, I332E)을 포함하는 인간 IgG1의 Fc 영역 유전자 서열(서열 번호 72, 이하 hCg1 Xen236 239 332라 약기하는 경우도 있음)의 합성 DNA(GENEWIZ사)를, 실시예 11(1)에서 제작한 재조합체 벡터의 ApaI와 BamHI 사이트 사이에 삽입함으로써 제작하였다. 그 후의 조작을, 실시예 11(3)에 기재된 방법에 준하여 행함으로써, 푸코오스 비결합형이면서 CD16a/CD32a 고친화성 Fc 아미노산 개변형의 항Hp 항체를 제작하였다.

[실시예 22] 마우스 면역성 혈소판 감소증(Immune Thrombocytopenia: ITP) 모델에 있어서의 작용

(1) 항마우스 혈소판 항체의 제작

재조합체 벡터로서는, 마우스 IgG2bκ의 정상 영역 유전자를 삽입한 pCI 벡터를 사용하였다. 혈소판 감소 등의 전신성 자기 면역 질환 증상을 나타내는 NZW x BXSB F1 마우스로부터 클로닝된 항마우스 혈소판 항체 클론 6A6[Mizutani H et al., Blood. 82(3), 837-844, 1993]의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 유전자를 인-퓨전 HD 클로닝 키트를 사용하여 삽입하였다.

대장균 DH5α 적격 세포로 형질 전환하고, 배양, 플라스미드 추출, 시퀀스 확인을 실시함으로써, 마우스 IgG2b형 항마우스 혈소판 6A6 항체 발현용 재조합체 벡터를 제작하였다. 에피펙타민 293 형질감염 키트(Gibco사)를 사용하고, 설명서를 따라서 일과성 발현에 의해 항체를 제작하였다. 배양 상청의 회수 및 항체의 정제는 항체 정제용 레진으로서 Ab-Capcher(프로테노바사)를 사용하여, 실시예 8 및 실시예 9에 기재된 방법에 준하여 행하였다.

(2) 마우스 면역성 혈소판 감소증(Immune Thrombocytopenia: ITP) 모델에 있어서의 작용

마우스 ITP 모델에 있어서의 항혈소판 항체에 의한 혈소판 감소에 대한, #105의 푸코오스 비결합형이면서 Fc 아미노산 개변형(G236A, S239D, I332E)에 의한 저해 작용을 평가하였다. 마우스 ITP 모델의 병태 야기는 공지된 방법[Mizutani H et al., Blood. 82(3), 837-844, 1993]에 준하여 실시하였다.

웅성 Crl: CD1(Icr) 마우스(니혼 찰스·리버사)를 구입하고, 6주령(체중 30g 전후)으로 사용하였다. 8군(각 군 n=5)으로 나눈 마우스에, 실시예 21에서 제작한 #105의 푸코오스 비결합형이면서 Fc 아미노산 개변형(G236A, S239D, I332E) 또는 IVIG를 PBS로 조제한 것을, 각각 0.08, 0.4, 2, 10mg/head(#105의 푸코오스 비결합형이면서 Fc 아미노산 개변형) 및 10, 40mg/head(IVIG)의 용량으로 복강 내 투여하였다.

컨트롤군에는 PBS를 투여하였다. 피검체 투여 30분 후에 실시예 22(1)에서 제작한 항마우스 혈소판 6A6 항체를 10μg/head의 용량으로 정맥 내 투여하고, 혈소판 감소를 야기하였다. 야기하지 않은 경우의 혈소판수를 파악하기 위한 대조 군에는, 항마우스 혈소판 6A6 항체 대신에 PBS를 투여하였다. 항마우스 혈소판 6A6 항체를 투여한 24시간 후에 이소플루란 마취 하에서 복대정맥으로부터 채혈하고, EDTA 투입 체혈관에 넣고, ADVIA 120 헤마톨로지 시스템(Hematology System)(SIEMES사)을 사용하여 혈소판수를 측정하였다.

그 결과, #105의 푸코오스 비결합형이면서 Fc 아미노산 개변형(G236A, S239D, I332E)의 투여에 의해, 용량 의존적으로 항마우스 혈소판 6A6 항체에 의한 혈소판 감소를 억제하였다. 또한, #105의 푸코오스 비결합형이면서 Fc 아미노산 개변형(G236A, S239D, I332E)은 IVIG보다도 낮은 용량으로, IVIG와 동등 이상의 작용을 나타냈다(도 7).

본 발명을 특정한 양태를 참조하여 상세하게 설명하였지만, 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않고 각종 변경 및 수정이 가능한 것은, 당업자에게 있어서 명확하다. 또한, 본 출원은 2016년 3월 29일자로 출원된 일본 특허 출원(일본 특허 출원 제2016-066829)에 기초하고 있으며, 그 전체가 인용에 의해 원용된다. 또한, 여기에 인용되는 모든 참조는 전체로서 도입된다.

서열 번호 1: 인간 CD16a 클로닝용 PCR 정방향 프라이머의 염기 서열
서열 번호 2: 인간 CD16a 클로닝용 PCR 역방향 프라이머의 염기 서열
서열 번호 3: 인간 CD16a(V)의 염기 서열
서열 번호 4: 인간 CD16a의 아미노산 서열
서열 번호 5: 가용성 인간 CD16a 재조합체 벡터 제작용 프라이머 FcgR3-1의 염기 서열
서열 번호 6: 히스티딘 태그 융합 가용성 CD16a의 아미노산 서열
서열 번호 7: 프라이머 hhiu1의 염기 서열
서열 번호 8: 프라이머 hhiu3의 염기 서열
서열 번호 9: 프라이머 hk2의 염기 서열
서열 번호 10: 프라이머 hk5의 염기 서열
서열 번호 11: #4-VH의 염기 서열
서열 번호 12: #4-VL의 염기 서열
서열 번호 13: #6-VH의 염기 서열
서열 번호 14: #6-VL의 염기 서열
서열 번호 15: #27-VH의 염기 서열
서열 번호 16: #27-VL의 염기 서열
서열 번호 17: #105-VH의 염기 서열
서열 번호 18: #105-VL의 염기 서열
서열 번호 19: #96-6-VH의 염기 서열
서열 번호 20: #96-6-VL의 염기 서열
서열 번호 21: #4-VH의 아미노산 서열
서열 번호 22: #4-VL의 아미노산 서열
서열 번호 23: #6-VH의 아미노산 서열
서열 번호 24: #6-VL의 아미노산 서열
서열 번호 25: #27-VH의 아미노산 서열
서열 번호 26: #27-VL의 아미노산 서열
서열 번호 27: #105-VH의 아미노산 서열
서열 번호 28: #105-VL의 아미노산 서열
서열 번호 29: #96-6-VH의 아미노산 서열
서열 번호 30: #96-6-VL의 아미노산 서열
서열 번호 31: #27-VH CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 32: #27-VH CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 33: #27-VH CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 34: #27-VL CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 35: #27-VL CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 36: #27-VL CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 37: #105-VH CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 38: #105-VH CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 39: #105-VH CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 40: #105-VL CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 41: #105-VL CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 42: #105-VL CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 43: #4-VH 유전자 증폭용 PCR 정방향 프라이머의 염기 서열
서열 번호 44: #4-VH 유전자 증폭용 PCR 역방향 프라이머의 염기 서열
서열 번호 45: #4-VL 유전자 증폭용 PCR 정방향 프라이머의 염기 서열
서열 번호 46: #4-VL 유전자 증폭용 PCR 역방향 프라이머의 염기 서열
서열 번호 47: #6-VH 유전자 증폭용 PCR 정방향 프라이머의 염기 서열
서열 번호 48: #6-VH 유전자 증폭용 PCR 역방향 프라이머의 염기 서열
서열 번호 49: #6-VL 유전자 증폭용 PCR 정방향 프라이머의 염기 서열
서열 번호 50: #6-VL 유전자 증폭용 PCR 역방향 프라이머의 염기 서열
서열 번호 51: #27-VH 유전자 증폭용 PCR 정방향 프라이머의 염기 서열
서열 번호 52: #27-VH 유전자 증폭용 PCR 역방향 프라이머의 염기 서열
서열 번호 53: #27-VL 유전자 증폭용 PCR 정방향 프라이머의 염기 서열
서열 번호 54: #27-VL 유전자 증폭용 PCR 역방향 프라이머의 염기 서열
서열 번호 55: #105-VH 유전자 증폭용 PCR 정방향 프라이머의 염기 서열
서열 번호 56: #105-VH 유전자 증폭용 PCR 역방향 프라이머의 염기 서열
서열 번호 57: #105-VL 유전자 증폭용 PCR 정방향 프라이머의 염기 서열
서열 번호 58: #105-VL 유전자 증폭용 PCR 역방향 프라이머의 염기 서열
서열 번호 59: #96-6-VH 유전자 증폭용 PCR 정방향 프라이머의 염기 서열
서열 번호 60: #96-6-VH 유전자 증폭용 PCR 역방향 프라이머의 염기 서열
서열 번호 61: #96-6-VL 유전자 증폭용 PCR 정방향 프라이머의 염기 서열
서열 번호 62: #96-6-VL 유전자 증폭용 PCR 역방향 프라이머의 염기 서열
서열 번호 63: 합성 DNA(hCg1 Xen 239 332)의 염기 서열
서열 번호 64: 가용성 CD32a의 아미노산 서열
서열 번호 65: 인간 합토글로빈의 아미노산 서열 다형 1(NP_005134.1)
서열 번호 66: 인간 합토글로빈의 아미노산 서열 다형 2(NP_001119574.1)
서열 번호 67: 인간 합토글로빈의 유전자 서열 다형 1(NM_005143.3)
서열 번호 68: 인간 합토글로빈의 유전자 서열 다형 2(NM_001126102.1)
서열 번호 69: 시그널 서열을 포함하지 않는 인간 합토글로빈 다형 1(NP_005134.1) α쇄의 아미노산 서열
서열 번호 70: 인간 합토글로빈 β쇄의 아미노산 서열
서열 번호 71: 시그널 서열을 포함하지 않는 인간 합토글로빈 다형 2(NP_001119574.1) α쇄의 아미노산 서열
서열 번호 72: 합성 DNA(hCg1 Xen 236 239 332)의 염기 서열
서열 번호 73: 소 합토글로빈의 아미노산 서열
서열 번호 74: 마우스 합토글로빈의 아미노산 서열
서열 번호 75: 키메라 A의 아미노산 서열
서열 번호 76: 키메라 B의 아미노산 서열
서열 번호 77: 키메라 C의 아미노산 서열
서열 번호 78: 키메라 D의 아미노산 서열
서열 번호 79: 키메라 E의 아미노산 서열
서열 번호 80: 키메라 F의 아미노산 서열
서열 번호 81: 키메라 A의 염기 서열
서열 번호 82: 키메라 B의 염기 서열
서열 번호 83: 키메라 C의 염기 서열
서열 번호 84: 키메라 D의 염기 서열
서열 번호 85: 키메라 E의 염기 서열
서열 번호 86: 키메라 F의 염기 서열
서열 번호 87: 재조합 인간 Hp의 아미노산 서열
서열 번호 88: 재조합 인간 Hp의 염기 서열
서열 번호 89: 키메라 G의 아미노산 서열
서열 번호 90: 키메라 H의 아미노산 서열
서열 번호 91: 키메라 I의 아미노산 서열
서열 번호 92: 키메라 J의 아미노산 서열
서열 번호 93: 키메라 K의 아미노산 서열
서열 번호 94: 키메라 G의 염기 서열
서열 번호 95: 키메라 H의 염기 서열
서열 번호 96: 키메라 I의 염기 서열
서열 번호 97: 키메라 J의 염기 서열
서열 번호 98: 키메라 K의 염기 서열

SEQUENCE LISTING <110> Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. <120> Therapeutic agent for treatment of autoimmune diseases containing antibody binding to haptoglobin and forming immune complexes as an effective component <130> W522557 <150> JP2016-066829 <151> 2016-3-29 <160> 98 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> hCD16a-F <400> 1 taaatagaat tcggcatcat gtggcagctg ct 32 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> hCD16a-R <400> 2 aataaaggat cctggggtca tttgtcttga gggt 34 <210> 3 <211> 765 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgtggcagc tgctcctccc aactgctctg ctacttctag tttcagctgg catgcggact 60 gaagatctcc caaaggctgt ggtgttcctg gagcctcaat ggtacagggt gctcgagaag 120 gacagtgtga ctctgaagtg ccagggagcc tactcccctg aggacaattc cacacagtgg 180 tttcacaatg agagcctcat ctcaagccag gcctcgagct acttcattga cgctgccaca 240 gtcgacgaca gtggagagta caggtgccag acaaacctct ccaccctcag tgacccggtg 300 cagctagaag tccatatcgg ctggctgttg ctccaggccc ctcggtgggt gttcaaggag 360 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Val His Asp 290 295 300 Leu Glu Glu Asp Thr Trp Tyr Ala Thr Gly Ile Leu Ser Phe Asp Lys 305 310 315 320 Ser Cys Ala Val Ala Glu Tyr Gly Val Tyr Val Lys Val Thr Ser Ile 325 330 335 Gln Asp Trp Val Gln Lys Thr Ile Ala Glu Asn Val Asp His His His 340 345 350 His His His 355 <210> 93 <211> 355 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> chimeraK_AA <400> 93 Met Ser Ala Leu Gly Ala Val Ile Ala Leu Leu Leu Trp Gly Gln Leu 1 5 10 15 Phe Ala Val Asp Ser Gly Asn Asp Val Thr Asp Ile Ala Asp Asp Gly 20 25 30 Cys Pro Lys Pro Pro Glu Ile Ala His Gly Tyr Val Glu His Ser Val 35 40 45 Arg Tyr Gln Cys Lys Asn Tyr Tyr Lys Leu Arg Thr Glu Gly Asp Gly 50 55 60 Val Tyr Thr Leu Asn Asn Glu Lys Gln Trp Ile Asn Lys Ala Val Gly 65 70 75 80 Asp Lys Leu Pro Glu Cys Glu Ala Val Cys Gly Lys Pro Lys Asn Pro 85 90 95 Ala Asn Pro Val Gln Arg Ile Leu Gly Gly His Leu Asp Ala Lys Gly 100 105 110 Ser Phe Pro Trp Gln Ala Lys Met Val Ser His His Asn Leu Thr Thr 115 120 125 Gly Ala Thr Leu Ile Asn Glu Gln Trp Leu Leu Thr Thr Ala Lys Asn 130 135 140 Leu Phe Leu Asn His Ser Glu Asn Ala Thr Ala Lys Asp Ile Ala Pro 145 150 155 160 Thr Leu Thr Leu Tyr Val Gly Lys Lys Gln Leu Val Glu Ile Glu Lys 165 170 175 Val Val Leu His Pro Asn Tyr Ser Gln Val Asp Ile Gly Leu Ile Lys 180 185 190 Leu Lys Gln Lys Val Ser Val Asn Glu Arg Val Met Pro Ile Cys Leu 195 200 205 Pro Ser Lys Asp Tyr Ala Glu Val Gly Arg Val Gly Tyr Val Ser Gly 210 215 220 Trp Gly Arg Asn Ala Asn Phe Lys Phe Thr Asp His Leu Lys Tyr Val 225 230 235 240 Met Leu Pro Val Ala Asp Gln Asp Lys Cys Val Val His Tyr Glu Gly 245 250 255 Ser Thr Val Pro Glu Lys Lys Thr Leu Lys Ser Pro Val Gly Val Gln 260 265 270 Pro Ile Leu Asn Glu His Thr Phe Cys Ala Gly Met Ser Lys Tyr Gln 275 280 285 Glu Asp Thr Cys Tyr Gly Asp Ala Gly Ser Ala Phe Ala Val His Asp 290 295 300 Leu Glu Glu Asp Thr Trp Tyr Ala Thr Gly Ile Leu Ser Phe Asp Lys 305 310 315 320 Ser Cys Ala Val Ala Glu Tyr Gly Val Tyr Val Lys Val Thr Ser Ile 325 330 335 Gln Asp Trp Val Gln Lys Thr Ile Ala Glu Asn Val Asp His His His 340 345 350 His His His 355 <210> 94 <211> 1105 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> chimeraG_DNA <400> 94 ctagcctcga gaattcccac catgtccgca ctcggggctg tgattgccct tctcctttgg 60 ggacagttgt ttgcagtaga tagcggtaac gacgttacag atatcgcgga tgacggttgc 120 cctaaacccc ctgagattgc acacggttat gtagaacatt cagtgaggta tcaatgtaaa 180 aactactaca aactgcgaac cgaaggggat ggagtttata cattgaacaa tgaaaagcag 240 tggattaaca aggctgtagg tgataagttg cctgagtgtg aagccgtgtg cgggaagcct 300 aagaacccgg cgaaccccgt acagagaata attggagggt ctcttgatgc aaagggatca 360 ttcccgtggc aggccaaaat ggtgtctcac cacaacctta caaccggtgc aaccctgatc 420 aatgaacaat ggctcttgac gactgcgaag aacttgtttt tgaatcatag cgagaacgcc 480 acagcaaagg acatagctcc taccctcacg ctttacgtgg gcaaaaagca gcttgtagag 540 atagaaaagg tcgtattgca ccctaattac tcacaagtag acatcggact tattaagctt 600 aagcaaaagg tgtccgtaaa tgaacgagtc atgcccatct gtctgccgtc taaagattac 660 gccgaggttg gcagggtggg atacgtgtcc gggtgggggc gaaacgccaa cttcaagttc 720 accgatcatc tcaagtatgt catgcttcct gtagccgatc aggatcagtg catacgacac 780 tacgagggga gcacggtccc agagaaaaaa acacctaaat ctcccgtcgg ggtccaacca 840 atactcaacg aacatacatt ttgcgccggt ctttccaagt atcaagaaga cacctgctac 900 ggtgatgccg gtagtgcttt tgctgtgcat gatcttgagg aggacacctg gtatgcgaca 960 gggattctca gttttgacaa gtcttgtgca gtggctgaat atggggtgta cgtcaaagtc 1020 acgtccatcc aggactgggt ccagaaaact attgctgaga acgtggacca tcatcatcac 1080 caccactgag tcgacccggg cggcc 1105 <210> 95 <211> 1105 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> chimeraH_DNA <400> 95 ctagcctcga gaattcccac catgtccgca ctcggggctg tgattgccct tctcctttgg 60 ggacagttgt ttgcagtaga tagcggtaac gacgttacag atatcgcgga tgacggttgc 120 cctaaacccc ctgagattgc acacggttat gtagaacatt cagtgaggta tcaatgtaaa 180 aactactaca aactgcgaac cgaaggggat ggagtttata cattgaacaa tgaaaagcag 240 tggattaaca aggctgtagg tgataagttg cctgagtgtg aagccgtgtg cgggaagcct 300 aagaacccgg cgaaccccgt acagagaata ctcggagggc accttgatgc aaagggatca 360 ttcccgtggc aggccaaaat ggtgtctcga cacaacctta caaccggtgc aaccctgatc 420 aatgaacaat ggctcttgac gactgcgaag aacttgtttt tgaatcatag cgagaacgcc 480 agtgcaaagg acatagctcc taccctcacg ctttacgtgg gcaaaaagca gcttgtagag 540 atagaaaagg tcgtattgca ccctaatcat tcagtagtag acatcggact tattaagctt 600 aagcaaaagg tgtccgtaaa tgaacgagtc atgcccatct gtctgccgtc taaagattac 660 gccgaggttg gcagggtggg atacgtgtcc gggtgggggc gaaacgccaa cttcaagttc 720 accgatcatc tcaagtatgt catgcttcct gtagccgatc aggatcagtg catacgacac 780 tacgagggga gcacggtccc agagaaaaaa acacctaaat ctcccgtcgg ggtccaacca 840 atactcaacg aacatacatt ttgcgccggt atgtccaagt atcaagaaga cacctgctac 900 ggtgatgccg gtagtgcttt tgctgtgcat gatcttgagg aggacacctg gtatgcgaca 960 gggattctca gttttgacaa gtcttgtgca gtggctgaat atggggtgta cgtcaaagtc 1020 acgtccatcc aggactgggt ccagaaaact attgctgaga acgtggacca tcatcatcac 1080 caccactgag tcgacccggg cggcc 1105 <210> 96 <211> 1105 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> chimeraI_DNA <400> 96 ctagcctcga gaattcccac catgtccgca ctcggggctg tgattgccct tctcctttgg 60 ggacagttgt ttgcagtaga tagcggtaac gacgttacag atatcgcgga tgacggttgc 120 cctaaacccc ctgagattgc acacggttat gtagaacatt cagtgaggta tcaatgtaaa 180 aactactaca aactgcgaac cgaaggggat ggagtttata cattgaacaa tgaaaagcag 240 tggattaaca aggctgtagg tgataagttg cctgagtgtg aagccgtgtg cgggaagcct 300 aagaacccgg cgaaccccgt acagagaata ctcggagggc accttgatgc aaagggatca 360 ttcccgtggc aggccaaaat ggtgtctcac cacaacctta caaccggtgc aaccctgatc 420 aatgaacaat ggctcttgac gactgcgaag aacttgtttt tgaatcatag cgagaacgcc 480 acagcaaagg acatagctcc taccctcacg ctttacgtgg gcaaaaacca gcttgtagag 540 atagaaaagg tcgtattgca ccctaattac tcacaagtag acatcggact tattaagctt 600 aagcaaaagg tgtccgtaaa tgaacgagtc atgcccatct gtctgccgtc taaagattac 660 gccgaggttg gcagggtggg atacgtgtcc gggtgggggc gaaacgccaa cttccgattc 720 accgatcatc tcaagtatgt catgcttcct gtagccgatc aggatcagtg catacgacac 780 tacgagggga gcacggtccc agagaaaaaa acacctaaat ctcccgtcgg ggtccaacca 840 atactcaacg aacatacatt ttgcgccggt atgtccaagt atcaagaaga cacctgctac 900 ggtgatgccg gtagtgcttt tgctgtgcat gatcttgagg aggacacctg gtatgcgaca 960 gggattctca gttttgacaa gtcttgtgca gtggctgaat atggggtgta cgtcaaagtc 1020 acgtccatcc aggactgggt ccagaaaact attgctgaga acgtggacca tcatcatcac 1080 caccactgag tcgacccggg cggcc 1105 <210> 97 <211> 1105 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> chimeraJ_DNA <400> 97 ctagcctcga gaattcccac catgtccgca ctcggggctg tgattgccct tctcctttgg 60 ggacagttgt ttgcagtaga tagcggtaac gacgttacag atatcgcgga tgacggttgc 120 cctaaacccc ctgagattgc acacggttat gtagaacatt cagtgaggta tcaatgtaaa 180 aactactaca aactgcgaac cgaaggggat ggagtttata cattgaacaa tgaaaagcag 240 tggattaaca aggctgtagg tgataagttg cctgagtgtg aagccgtgtg cgggaagcct 300 aagaacccgg cgaaccccgt acagagaata ctcggagggc accttgatgc aaagggatca 360 ttcccgtggc aggccaaaat ggtgtctcac cacaacctta caaccggtgc aaccctgatc 420 aatgaacaat ggctcttgac gactgcgaag aacttgtttt tgaatcatag cgagaacgcc 480 acagcaaagg acatagctcc taccctcacg ctttacgtgg gcaaaaagca gcttgtagag 540 atagaaaagg tcgtattgca ccctaattac tcacaagtag acatcggact tattaagctt 600 aagcaaaagg tgtccgtaaa tgaacgagtc atgcccatct gtctgccgtc taaagattac 660 gccgccgttg gcagggtggg atacgtgtcc gggtgggggc gaaacgccaa cttcaagttc 720 accgatcatc tcaagtatgt catgcttcct gtagccgatc aggataagtg catacgacac 780 tacgagggga gcacggtccc agagaaaaaa acacctaaat ctcccgtcgg ggtccaacca 840 atactcaacg aacatacatt ttgcgccggt ctttccaagt atcaagaaga cacctgctac 900 ggtgatgccg gtagtgcttt tgctgtgcat gatcttgagg aggacacctg gtatgcgaca 960 gggattctca gttttgacaa gtcttgtgca gtggctgaat atggggtgta cgtcaaagtc 1020 acgtccatcc aggactgggt ccagaaaact attgctgaga acgtggacca tcatcatcac 1080 caccactgag tcgacccggg cggcc 1105 <210> 98 <211> 1105 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> chimeraK_DNA <400> 98 ctagcctcga gaattcccac catgtccgca ctcggggctg tgattgccct tctcctttgg 60 ggacagttgt ttgcagtaga tagcggtaac gacgttacag atatcgcgga tgacggttgc 120 cctaaacccc ctgagattgc acacggttat gtagaacatt cagtgaggta tcaatgtaaa 180 aactactaca aactgcgaac cgaaggggat ggagtttata cattgaacaa tgaaaagcag 240 tggattaaca aggctgtagg tgataagttg cctgagtgtg aagccgtgtg cgggaagcct 300 aagaacccgg cgaaccccgt acagagaata ctcggagggc accttgatgc aaagggatca 360 ttcccgtggc aggccaaaat ggtgtctcac cacaacctta caaccggtgc aaccctgatc 420 aatgaacaat ggctcttgac gactgcgaag aacttgtttt tgaatcatag cgagaacgcc 480 acagcaaagg acatagctcc taccctcacg ctttacgtgg gcaaaaagca gcttgtagag 540 atagaaaagg tcgtattgca ccctaattac tcacaagtag acatcggact tattaagctt 600 aagcaaaagg tgtccgtaaa tgaacgagtc atgcccatct gtctgccgtc taaagattac 660 gccgaggttg gcagggtggg atacgtgtcc gggtgggggc gaaacgccaa cttcaagttc 720 accgatcatc tcaagtatgt catgcttcct gtagccgatc aggataagtg cgttgtccac 780 tacgagggga gcacggtccc agagaaaaaa acactgaaat ctcccgtcgg ggtccaacca 840 atactcaacg aacatacatt ttgcgccggt atgtccaagt atcaagaaga cacctgctac 900 ggtgatgccg gtagtgcttt tgctgtgcat gatcttgagg aggacacctg gtatgcgaca 960 gggattctca gttttgacaa gtcttgtgca gtggctgaat atggggtgta cgtcaaagtc 1020 acgtccatcc aggactgggt ccagaaaact attgctgaga acgtggacca tcatcatcac 1080 caccactgag tcgacccggg cggcc 1105

Claims

서열 번호 70으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간 합토글로빈의 β쇄를 특이적으로 인식하고, 해당 인간 합토글로빈에 결합하여 다가의 면역 복합체를 형성하는 모노클로날 항체.
이하의 (a) 내지 (d)로부터 선택되는 1의 항체와 경합하여 서열 번호 70으로 표시되는 인간 합토글로빈의 β쇄를 특이적으로 인식하고, 상기 항체가 결합하는 인간 합토글로빈에 포함되는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체.
(a) 상보쇄 결정 영역(complementarity determining region, 이하 CDR이라 기재함) 1 내지 3이 각각 서열 번호 31, 32 및 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄(이하, H쇄라 기재함)를 포함하며, 또한 CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 34, 35 및 36으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄(이하, L쇄라 기재함)를 포함하는 항체
(b) CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 37, 38 및 39로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하며, 또한 CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 40, 41 및 42로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 항체
(c) 서열 번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하며, 또한 서열 번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 항체
(d) 서열 번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하며, 또한 서열 번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 항체
이하의 (a) 내지 (d)로부터 선택되는 1의 모노클로날 항체.
(a) CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 31, 32 및 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하며, 또한 CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 34, 35 및 36으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 항체
(b) CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 37, 38 및 39로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하며, 또한 CDR1 내지 3이 각각 서열 번호 40, 41 및 42로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 항체
(c) 서열 번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하며, 또한 서열 번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 항체
(d) 서열 번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 H쇄를 포함하며, 또한 서열 번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 L쇄를 포함하는 항체
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 70으로 표시되는 인간 합토글로빈의 β쇄의 아미노산 서열 중, 적어도 44번째의 Phe 및 49번째의 Glu에 결합하는 모노클로날 항체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 70으로 표시되는 인간 합토글로빈의 β쇄의 아미노산 서열 중, 적어도 155번째의 Ser, 156번째의 Thr 및 157번째의 Val에 결합하는 모노클로날 항체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 재조합 항체인 모노클로날 항체.
제6항에 있어서, 인간형 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로부터 선택되는 유전자 재조합 항체인 모노클로날 항체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체가 형성하는 다가의 면역 복합체가, 인간 Fcγ 수용체 III, 인간 Fcγ 수용체 II 및 인간 Fcγ 수용체 I로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 인간 Fcγ 수용체에 결합하는 모노클로날 항체.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체가 형성하는 다가의 면역 복합체가, 적어도 항체 2 분자 및 인간 합토글로빈 1 분자를 포함하는 모노클로날 항체.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 당쇄의 환원 말단 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되지 않은 모노클로날 항체.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA.
제11항에 기재된 DNA를 함유하는 재조합체 벡터.
제12항에 기재된 재조합체 벡터를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환체.
제13항에 기재된 형질 전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체를 생성 축적시켜, 배양물로부터 해당 항체를 채취하는 것을 특징으로 하는 모노클로날 항체의 제조 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체를 투여하는 것을 포함하는 자기 면역 질환의 치료 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체와 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 자기 면역 질환 치료제.
인간 합토글로빈에 결합하는 모노클로날 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는 자기 면역 질환 치료제.
제17항에 있어서, 모노클로날 항체가 유전자 재조합 항체인 자기 면역 질환 치료제.
제18항에 있어서, 모노클로날 항체가 인간형 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로부터 선택되는 유전자 재조합 항체인 자기 면역 질환 치료제.
제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체가 인간 합토글로빈에 결합하여 다가의 면역 복합체를 형성하는 항체인 자기 면역 질환 치료제.
제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체가 형성하는 다가의 면역 복합체가 인간 Fcγ 수용체 III, 인간 Fcγ 수용체 II 및 인간 Fcγ 수용체 I로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 인간 Fcγ 수용체에 결합하는 자기 면역 질환 치료제.
제20항 또는 제21항에 있어서, 모노클로날 항체가 형성하는 다가의 면역 복합체가, 적어도 항체 2 분자 및 인간 합토글로빈 1 분자를 포함하는 자기 면역 질환 치료제.