TWI793395B - 結合ｐｄ-ｌ１和ｏｘ４０的雙特異性抗體 - Google Patents

Abstract

本發明提供了一種新型的經人工設計的抗體分子，特別是抗PD-L1/OX40雙特異性抗體分子，其能同時結合PD-L1和OX40。

Description

結合PD-L1和OX40的雙特異性抗體

本發明總體上涉及免疫學和抗體工程領域。具體而言，本發明涉及新型的經人工設計的雙特異性抗體分子，特別是同時結合PD-L1和OX40的雙特異性抗體、編碼所述抗體分子或其各條鏈的多核苷酸、包含所述多核苷酸的載體、包含所述多核苷酸或載體的宿主細胞、包含所述抗體分子的免疫綴合物和醫藥組成物、以及所述抗體分子在疾病的免疫治療、預防和/或診斷上的用途。

抗體分子能夠與其相應的抗原發生靶向性的特異性結合，正日益成為針對各種疾病(例如，癌症、自身免疫病、炎性疾病、感染性疾病等)的重要的治療劑、預防劑和/或診斷劑。但是，僅針對一種靶點的單特異性抗體在臨床應用上存在一些局限性。患者在接受單特異性抗體治療後可能產生耐藥性或無應答。隨著對癌症和其他多種疾病的研究，認識到了往往有多種信號轉導通路參與疾病的發生和發展，單一靶點的免疫療法在許多疾病中通常並不足以發揮對疾病的治療作用。

由於多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)能夠特異性結合不同抗原，能夠設計為同時作用於兩種或多種不同介質的信號轉導通路。這些優勢特性為多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)開闢了廣闊的應用前景。

已經藉由抗體工程開發了大量富於想像力的多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)樣式並且研究了它們在疾病應用上的適用性(Brinkmann U.和Kontermann R.E.,The making of bispecific antibodies，Mabs,2017,9(2)：182-212)。

多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)根據不同的組成部分以及構建方式，可以分為許多種類。例如，根據多特異性抗體結構的左右基本上對稱性，可分為對稱結構和不對稱結構；根據多特異性抗體有無IgG的Fc區，可分為有Fc區的抗體樣式和無Fc區的抗體樣式；根據多特異性抗體中抗原結合位點的數量可分為二價、三價、四價或更多價的抗體等。

現有技術中的多特異性抗體樣式在製備和應用中各有利弊，例如，雖然Blinatumomab可以藉由重組中國倉鼠卵巢(CHO)細胞進行大規模培養生產，但是容易形成聚集物、在體內半衰期很短，實際使用的時候需要額外配備連續輸液裝置；Catumaxomab生產工藝複雜且鼠異源抗體比較容易在人體產生免疫原性問題。

因此，本領域仍然需要可供選擇的具有改善性能的多特異性抗體，特別是雙特異性抗體。本發明提供了一種新的多特異性抗體樣式，所述抗體易於在體外的培養細胞中有效表達，不需要複雜的生產工藝。同時，所述的雙特異性抗體能夠同時結合不同的抗原，特別是OX40和PD-L1，保持各抗原結合位點與相應的不同表位結合的結合活性，以及其他性質。進一步地，本發明的雙特 異性抗體樣式是物理穩定的和生物學穩定的，這允許該抗體具有更好的生產性和可發展性。

本文公開了藉由抗體工程方法構建的一種新型的雙特異性抗體分子。

因此，在一個方面，本發明提供了具有以下一個或多個特性的雙特異性抗體分子：

(a)以高親和力與一種或兩種抗原特異性結合；

(b)易於在體外的培養細胞中表達，且抗體分子的各條鏈之間能夠正確偶合或配對；

(c)具有良好的物理穩定性，特別地，具有良好的長期熱穩定性；且能長時間保持生物學活性；

(d)在與一種或兩種抗原特異性結合後，藉由調節(例如，抑制或者激活)各抗原所參與的信號傳導通路來發揮生物學功能；

(e)發揮效應子功能；

(f)具有更好的抗腫瘤活性。

在一個實施方案中，本發明的抗體分子包含全抗體部分和單結構域抗體部分，後者藉由接頭連接於全抗體部分的重鏈恆定區的C端。

在一個實施方案中，本發明的抗體分子包含以下部分或由其組成：

式(I)的多肽鏈(肽鏈#1)：

VH-CH1-Fc-X-VHH；和

式(II)的多肽鏈(肽鏈#2)：

VL-CL；

其中：

VH表示重鏈可變區；

CH表示重鏈恆定區結構域；

Fc包含CH2、CH3，以及視需要的CH4；

CH1、CH2、CH3和CH4分別表示重鏈恆定區的結構域1、2、3和4，

X可以不存在，或者在存在時表示接頭，例如柔性接頭；

VHH表示單結構域抗原結合位點，例如單結構域抗體；

VL表示輕鏈可變區；

CL表示輕鏈恆定區；

視需要地，CH1和Fc之間還存在鉸鏈區。

在一個實施方案中，本發明的抗體分子包含至少一條式(I)的多肽鏈和一條式(II)的多肽鏈。較佳地，本發明的抗體分子包含兩條(例如相同的)式(I)的多肽鏈和兩條(例如相同的)式(II)的多肽鏈。

在一個實施方案中，本發明的抗體分子的結構如第1圖所示。

在一個實施方案中，本發明的抗體分子或其片段具有2個或4個抗原結合位點，其結合2個、3個或4個不同的抗原，或相同的抗原。在一個實施方案中，式(I)中的VH和式(II)中的VL形成一個抗原結合位點，式(I)的VHH構成一個抗原結合位點(單結構域抗原結合位點)。

在一個實施方案中，不同抗原結合位點結合相同的抗原上的相同表位，或不同表位。

在一個實施方案中，本發明抗體分子中的式(I)中的接頭X是柔性接頭，例如具有單獨或組合的甘胺酸和/或絲胺酸殘基的接頭。在一個實施方案中，所述接頭包含胺基酸序列(Gly₄Ser)n，其中n是等於或大於1的正整數，例如，n是1-7中的正整數，例如，n是2，3，4，5，6。在一個實施方案中，n是1、2、3或4。

在一個實施方案中，由式(I)中的VH和式(II)中的VL形成的抗原結合位點是來自人的或人源化的，或嵌合的。

在一個實施方案中，本發明抗體分子中的單結構域抗原結合位點(VHH)是天然缺乏輕鏈的抗體的重鏈可變結構域(例如，駱駝科(Camelidae)物種中天然存在的重鏈抗體的重鏈可變結構域)或魚類中稱為新型抗原受體(new antigen receptor,NAR)的免疫球蛋白(如鯊魚血清中天然存在的IgNAR)中的VH樣單結構域、或衍生自它們的經重組的單結構域抗原結合位點(例如，駱駝化的人VH結構域或人源化的駱駝科抗體重鏈可變結構域)。在一個較佳的實施方案中，本發明抗體分子中的所述單結構域抗原結合位點選自駱駝科物種中天然存在的重鏈抗體的重鏈可變結構域、駱駝化的人VH結構域和人源化的駱駝科抗體重鏈可變結構域。

在一個實施方案中，本發明抗體分子中式(I)的肽鏈中的VHH分子可以衍生自駱駝科物種(例如駱駝、羊駝、單峰駝、駝羊和原駝)中產生的抗體。除駱駝科之外的其他物種也可以產生天然缺乏輕鏈的重鏈抗體，這類重鏈抗體的VHH也處於本發明的範圍內。

在一個實施方案中，CH1和Fc來自抗體重鏈，或其衍生物。

在一個實施方案中，式(I)的“CH1-Fc”為IgG的形式，例如IgG1、IgG2或IgG4的形式。在一個實施方案中，所述重鏈恆定結構域來自IgG2。將理解，可以對恆定結構域中的Fc進行突變，以實現穩定抗體的作用，或增強效應子功能的作用。例如在一個具體實施方案中，所述效應子功能是抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)。在一個實施方案中，所述胺基酸突變存在於CH2結構域，例如，所述抗體分子包含在第234和235位置(EU編號，根據Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的EU索引進行編號)處的胺基酸置換。在一個具體實施方案中，所述胺基酸置換是L234A和L235A。

在一個實施方案中，在CH1和CL之間存在二硫鍵。在一個實施方案中，如果包含兩條式(I)多肽鏈，則在兩個式(I)多肽鏈的CH1和CH2之間的鉸鏈區之間存在二硫鍵，二硫鍵的數量依據抗體恆定結構域所來源IgG形式不同而可變化，在一些實施方案中，鉸鏈區之間存在2個或4個二硫鍵。

在一個實施方案中，式(II)的輕鏈恆定結構域CL來自κ或λ。

在一個實施方案中，由式(I)的VH和式(II)的VL形成的結合位點對第一抗原是特異性的，在一個實施方案中，第一抗原是OX40。

在一個實施方案中，由式(I)的VHH形成的結合位點對第二抗原是特異性的，在一個實施方案中，第二抗原是PD-L1。

不特別地限制本發明的抗體分子特異性結合的抗原類型，抗原可以是例如細胞因子、生長因子、激素、信號傳導蛋白、炎性介質、配體、細胞表面受體或其片段。在一個實施方案中，本發明的抗體分子特異性結合的抗原選自 腫瘤相關抗原、免疫檢查點分子、血管新生誘導因子、腫瘤壞死因子受體超家族成員和免疫系統中的共刺激分子，以及這些分子的配體和/或受體，例如，OX40、CD47、PD1、PD-LI、PD-L2、LAG-3、4-1BB(CD137)、VEGF和GITR。

在一個實施方案中，式(I)的VH-CH1-Fc構成全抗體部分的重鏈，式(II)的VL-CL構成全抗體部分的輕鏈。

在一個實施方案中，式(II)的VHH構成單結構域抗體。

在一個實施方案中，本發明的抗體還涵蓋其抗原結合片段，例如Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、單鏈抗體(例如scFv)或(Fab’)₂、單結構域抗體、雙抗體(dAb)或線性抗體。

在一個方面，本發明提供了編碼本發明抗體分子中的任意一條或者多條多肽鏈的核酸，包含所述核酸的載體，包含所述核酸或載體的宿主細胞。

在一個方面，本發明提供了包含編碼本發明抗體分子中的任意一條或者多條多肽鏈的多核苷酸的載體，較佳地表達載體，例如pXC載體或pTT5載體，例如pXC17.4或pXC18.4。在一個實施方案中，表達載體被構建為雙基因表達載體pXC載體。

在一個方面，本發明提供了用於產生本發明抗體分子或其片段的方法。

在一些實施方案中，本發明提供了包含本發明抗體的免疫綴合物、醫藥組成物、試劑盒、組合產品或製品。

在一些實施方案中，本發明的抗體、醫藥組成物或免疫綴合物或組合產品或試劑盒用於預防或治療疾病，如自身免疫病、炎性疾病、感染、腫瘤、T細胞功能障礙性疾病等。例如，所述疾病是腫瘤(例如癌症)或感染。在一些實 施方案中，腫瘤是腫瘤免疫逃逸。較佳地，腫瘤是例如結腸癌或結直腸癌或直腸癌或肺癌。在另一方面中，本發明涉及預防或治療受試者或個體疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本文所述的任何抗體或其片段、醫藥組成物或免疫綴合物或組合產品或試劑盒。例如，所述疾病是腫瘤(例如癌症)或感染。在一些實施方案中，腫瘤是腫瘤免疫逃逸。在一個實施方案中，腫瘤是例如結腸癌或結直腸癌或直腸癌或肺癌。在另一方面，本發明還涉及本文所述的任何抗體或其片段或免疫綴合物製備用於在受試者中治療腫瘤(例如癌症)或感染的藥物或醫藥組成物或試劑盒或組合產品的用途。在一些實施方案中，腫瘤是腫瘤免疫逃逸。在一個實施方案中，腫瘤是例如結腸癌或結直腸癌或直腸癌或肺癌。

本發明還涉及在樣品中檢測抗原的方法。

本發明還涵蓋本文所述的任何實施方案的任意組合。本文所述的任何實施方案或其任何組合適用於本文所述的發明的任何和所有抗體或其片段或免疫綴合物或醫藥組成物或組合產品或試劑盒、方法和用途。

結合以下圖式一起閱讀時，將更好地理解以下詳細描述的本發明的較佳實施方案。出於說明本發明的目的，圖中顯示了目前較佳的實施方案。然而，應當理解本發明不限於圖中所示實施方案的精確安排和手段。

第1A圖及第1B圖例示了本發明雙特異性抗體的結構。

第2圖顯示了利用大小排阻層析(size exclusion chromatography；SEC)檢測的本發明製備的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體的純度。

第3圖顯示了本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體、以及作為對照的抗OX40抗體ADI-20057和IgG2與過量表達人OX40的CHO細胞(CHO-OX40細胞)的結合。圖中橫軸表示抗體濃度、縱軸表示平均螢光強度(MFI)。

第4圖顯示了本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體、以及作為對照的抗PD-L1人源化Nb-Fc和IgG2與過量表達人PD-L1的CHO細胞(CHO-PD-L1細胞)的結合。圖中橫軸表示抗體濃度、縱軸表示平均螢光強度(MFI)。

第5圖顯示了本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體，以及其他抗體和對照(抗PD-L1人源化Nb-Fc、ADI-20057、抗PD-L1人源化Nb-Fc+ADI-20057和IgG2)對過量表達OX40的CHO細胞(CHO-OX40)和過量表達PD-L1的CHO細胞(CHO-PD-L1)的同時結合作用。

第6圖顯示了本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體以及作為對照的抗OX40抗體ADI-20057和IgG2和人T細胞的結合。

第7圖顯示了差示掃描螢光法(DSF)測定的本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體的結果。

第8圖顯示了本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體有效解除PD1/PD-L1相互作用對NFAT信號通路的阻斷效應，進而獲得了螢光信號。還檢測了作為對照的抗PD-L1人源化Nb-Fc和IgG2的作用。

第9圖顯示了本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體、以及作為對照的ADI-20057、波佳利珠單抗(Pogalizumab)和IgG2對人OX40配體與OX40結合的阻斷作用，證明本發明的雙特異性抗體對該結合沒有阻斷作用。

第10圖顯示了本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體、以及作為對照的ADI-20057、波佳利珠單抗(Pogalizumab)和IgG2對人OX40配體與OX40結合的 作用，證明本發明的雙特異性抗體不阻斷人OX40配體與OX40的結合，並且有效增強OX40配體介導的OX40信號通路激活作用。

第11圖顯示了基於螢光素酶報告基因法檢測的本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體以及作為對照的ADI-20057和IgG2對OX40介導的信號通路的激活作用。

第12圖顯示了本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體對PD-L1依賴的OX40介導的信號通路的作用。其中使用不表達PD-L1的Raji細胞。還檢測了抗PD-L1人源化Nb-Fc、ADI-20057、抗PD-L1人源化Nb-Fc+ADI-20057、波佳利珠單抗(Pogalizumab)和IgG2的作用。

第13圖顯示了本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體對PD-L1依賴的OX40介導的信號通路的激活作用。其中使用高表達PD-L1的Raji細胞，證明本發明的抗體在PD-L1表達的細胞的存在下，具有更好的OX40介導的信號通路激活作用。還檢測了抗PD-L1人源化Nb-Fc、ADI-20057、抗PD-L1人源化Nb-Fc+ADI-20057、波佳利珠單抗(Pogalizumab)和IgG2的作用。

第14圖顯示了本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體對PD-L1依賴的OX40介導的信號通路的激活作用。其中使用表面表達PD-L1的人肺癌細胞NCI-H292，證明本發明的抗體在天然表達PD-L1的腫瘤細胞的存在下，具有更好的OX40介導的信號通路激活作用。還檢測了抗PD-L1人源化Nb-Fc、ADI-20057、抗PD-L1人源化Nb-Fc+ADI-20057的作用。

第15圖顯示了本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體對人T細胞的激活作用。還檢測了抗PD-L1人源化Nb-Fc、ADI-20057、抗PD-L1人源化NNb-Fc+ADI-20057和IgG2的作用。

第16圖顯示了本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體以及其他抗體和對照對LoVo細胞荷瘤的NPG小鼠模型的腫瘤抑制作用。

第17圖顯示了本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體以及其他抗體和對照對LoVo細胞荷瘤的NPG小鼠模型給藥後的體重的影響。

第18圖顯示了低劑量組的本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體以及其他抗體和對照對NCI-H292細胞荷瘤的NOG小鼠模型的腫瘤抑制作用。

第19圖顯示了中劑量組的本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體以及其他抗體和對照對NCI-H292細胞荷瘤的NOG小鼠模型的腫瘤抑制作用。

第20圖顯示了高劑量組的本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體以及其他抗體和對照對NCI-H292細胞荷瘤的NOG小鼠模型的腫瘤抑制作用。

第21圖顯示了本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體以及其他抗體和對照對NCI-H292細胞荷瘤的NOG小鼠模型給藥後的體重的影響。

發明詳述

除非另外限定，否則本文中所用的全部技術與科學術語具有如本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。本文所提及的全部出版物、專利申請、專利和其他參考文獻藉由引用的方式完整地併入。此外，本文中所述的材料、方法和例子僅是說明性的並且不意在是限制性的。本發明的其他特徵、目的和優點將從本說明書及圖式並且從後附的權利要求書中顯而易見。

縮寫

除非另外說明，否則本說明書中的縮寫具有以下含義：

使用以下縮寫：

I‧定義

為了解釋本說明書，將使用以下定義，並且只要適當，以單數形式使用的術語也可以包括複數，並且反之亦然。要理解，本文所用的術語僅是為了描述具體的實施方案，並且不意欲是限制性的。

術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小5%的下限和比指定數字數值大5%的上限的範圍內的數字數值。

如本文所用，術語“和/或”意指可選項中的任一項或可選項的兩項或多項。

在本文中，當使用術語“包含”或“包括”時，除非另有指明，否則也涵蓋由所述及的要素、整數或步驟組成的情形。例如，當提及“包含”某個具體序列的抗體可變區時，也旨在涵蓋由該具體序列組成的抗體可變區。

術語“抗體”在本文中以最廣意義使用，指包含抗原結合位點的蛋白質，涵蓋各種結構的天然抗體和人工抗體，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、單鏈抗體、完整抗體和抗體片段。

術語“全抗體”、“全長抗體”、“完全抗體”和“完整抗體”在本文中可互換地用來指天然存在的包含由二硫鍵相互連接的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的糖蛋白。每條重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。重 鏈恆定區由3個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH區和VL區可以進一步再劃分為超變區(為互補決定區(CDR)，其間插有較保守的區域(為構架區(FR))。每個VH和VL由三個CDR和4個FR組成，從胺基端到羧基端以如下順序排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是顯示出多種效應子功能。

“抗體片段”指與完整抗體不同的分子，其包含完整抗體的一部分且結合完整抗體所結合的抗原。抗體片段的例子包括但不限於Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體(例如scFv)；單結構域抗體；雙價或雙特異性抗體或其片段；駱駝科抗體；和由抗體片段形成的雙特異性抗體或多特異性抗體。

如本文所用，術語“表位”指抗原(例如，人OX40或PD-L1)中與抗體分子特異性相互作用的部分。

與參照抗體“結合相同或重疊表位的抗體”是指這樣的抗體，其在競爭測定中阻斷50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的所述參照抗體與其抗原的結合，反言之，參照抗體在競爭測定中阻斷50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的該抗體與其抗原的結合。

與參照抗體競爭結合其抗原的抗體是指這樣的抗體，其在競爭測定中阻斷50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的所述參照抗體與其抗原的結合。反言之，參照抗體在競爭測定中阻斷50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的該抗體與其抗原的結合。眾多類型的競爭性結合測定可用於確定一種抗體是否與另一種競爭，這些測定例如：固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固 相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭測定(參見例如Stahli等，1983，Methods in Enzymology 9：242-253)。

抑制(例如競爭性抑制)參照抗體與其抗原的結合的抗體是指這樣的抗體，其抑制50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的所述參照抗體與其抗原的結合。反言之，參照抗體抑制50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的該抗體與其抗原的結合。抗體與其抗原的結合可以親和力(例如平衡解離常數)衡量。測定親和力的方法是本領域已知的，例如ForteBio親和力測定。

與參照抗體顯示相同或相似的結合親和力和/或特異性的抗體是指這樣的抗體，其能夠具有參照抗體的至少50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的結合親和力和/或特異性。這可以藉由本領域已知的任何測定結合親和力和/或特異性的方法進行測定。

“互補決定區”或“CDR區”或“CDR”是抗體可變結構域中在序列上高變並且形成在結構上確定的環(“超變環”)和/或含有抗原接觸殘基(“抗原接觸點”)的區域。CDR主要負責與抗原表位結合。重鏈和輕鏈的CDR通常被稱作CDR1、CDR2和CDR3，從N-端開始順序編號。位於抗體重鏈可變結構域內的CDR被稱作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位於抗體輕鏈可變結構域內的CDR被稱作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一個給定的輕鏈可變區或重鏈可變區胺基酸序列中，各CDR的精確胺基酸序列邊界可以使用許多公知的抗體CDR指派系統的任一種或其組合確定，所述指派系統包括例如：基於抗體的三維結構和CDR環的拓撲學的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342：877-883，Al-Lazikani等人，“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))，基於抗體序列可變性的Kabat (Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，國際ImMunoGeneTics database(IMGT)(在萬維網上imgt.cines.fr/上)，以及基於利用大量晶體結構的近鄰傳播聚類(affinity propagation clustering)的North CDR定義。

例如，根據不同的CDR確定方案，每一個CDR的殘基如下所述。

CDR也可以基於與參考CDR序列(例如本發明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat編號位置而確定。

除非另有說明，否則在本發明中，術語“‘CDR”或“CDR序列”涵蓋以上述任一種方式確定的CDR序列。

除非另有說明，否則在本發明中，當提及抗體可變區中的殘基位置(包括重鏈可變區殘基和輕鏈可變區殘基)時，是指根據Kabat編號系統(Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))的編號位置。

在一個實施方案中，本發明抗體的CDR藉由Kabat規則確定邊界，或藉由AbM規則確定，或藉由其組合確定規則。

在本發明的一個實施方案中，本發明抗體分子式(I)中的VH和VHH的HCDR1是藉由AbM規則確定，HCDR2和HCDR3是藉由Kabat規則確定，式(II)中的VL CDR是藉由Kabat規則確定。

具有不同特異性(即，針對不同抗原的不同結合位點)的抗體具有不同的CDR。然而，儘管CDR在抗體與抗體之間是不同的，但是CDR內只有有限數量的胺基酸位置直接參與抗原結合。使用Kabat,Chothia,AbM和Contact方法中的至少兩種，可以確定最小重疊區域，從而提供用於抗原結合的“最小結合單位”。最小結合單位可以是CDR的一個子部分。正如本領域技術人員明瞭，藉由抗體的結構和蛋白折疊，可以確定CDR序列其餘部分的殘基。因此，本發明也考慮本文所給出的任何CDR的變體。例如，在一個CDR的變體中，最小結合單位的胺基酸殘基可以保持不變，而根據Kabat或Chothia定義的其餘CDR殘基可以被保守胺基酸殘基替代。

“IgG形式的抗體”是指抗體的重鏈恆定區所屬於的IgG形式。所有同一型的抗體的重鏈恆定區都是相同的，不同型的抗體之間的重鏈恆定區不同。例如，IgG4形式的抗體是指其重鏈恆定區來自IgG4。

本文所述的術語“單結構域抗體”通常指這樣的抗體，其僅由一個重鏈可變區組成，具有與抗原結合的活性，即從C端到N端僅包含一條鏈：FR4-VHHCDR3-FR3-VHHCDR2-FR2-VHHCDR1-FR1的抗體，可來自駱駝科重鏈抗 體的重鏈可變結構域、魚類IgNAR的VH樣單結構域(v-NAR))，其可以天然產生或由基因工程技術產生。單結構域抗體的實例包括源自駱駝科(美洲駝和駱駝)和軟骨魚(例如護士鯊)的單結構域抗體(WO 2005/035572)。

術語“駱駝化的人VH結構域”是指將衍生自駱駝科VHH的關鍵元件轉移到人VH結構域上導致人VH結構域不再需要與VL結構域配對來識別靶抗原，經駱駝化的人VH結構域單獨即可賦予抗原結合特異性。

如本文所用的術語“結合位點”或“抗原結合位點”表示抗體分子中與抗原實際結合的區域，包括由抗體輕鏈可變結構域(VL)和抗體重鏈可變結構域(VH)組成的VH/VL對、衍生自駱駝科重鏈抗體的重鏈可變結構域、來自鯊魚科動物的IgNAR的VH樣單結構域(v-NAR)、駱駝化的人VH結構域、人源化的駱駝科抗體重鏈可變結構域。在本發明的一個實施方案中，本發明的抗體分子包含至少四個抗原結合位點，例如，包含兩個單結構域抗體抗原結合位點(例如，VHH)和兩個VH/VL對形成的抗原結合位點。

術語“單結構域抗原結合位點”表示抗體分子的以單個可變結構域(例如，重鏈可變結構域(VH))與抗原結合的區域。在本發明的一個實施方案中，本發明的單結構域抗原結合位點可構成單結構域抗體。在一個實施方案中，本發明的抗體分子包含兩個單結構域抗原結合位點，分別結合相同或不同的抗原。在本發明的另一個實施方案中，本發明的抗體分子包含兩個單結構域抗原結合位點，分別結合相同或不同的抗原表位。

如本文所用，術語“多特異性”抗體指具有至少兩個抗原結合位點的抗體，所述至少兩個抗原結合位點中的每一個抗原結合位點與相同抗原的不同表位或與不同抗原的不同表位結合。本文提供的抗體通常是多特異性抗體，例 如雙特異性抗體。多特異性抗體是對至少兩個不同抗原表位具有結合特異性的抗體。在一個實施方案中，本文提供了這樣的雙特異性抗體，其具有針對第一抗原和第二抗原的結合特異性。

術語“免疫球蛋白分子”指具有天然存在抗體的結構的蛋白質。例如，IgG類免疫球蛋白是由二硫鍵鍵合的兩條輕鏈和兩條重鏈組成的約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白。從N端至C端，每條免疫球蛋白重鏈具有一個重鏈可變區(VH)，也稱作重鏈可變結構域，隨後是三個重鏈恆定區的結構域(CH1、CH2和CH3)。類似地，從N端至C端，每條免疫球蛋白輕鏈具有一個輕鏈可變區(VL)，也稱作輕鏈可變結構域，隨後是一個輕鏈恆定結構域(CL)。免疫球蛋白的重鏈可以歸屬5個類別之一，稱作α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中某些類別可以進一步劃分成亞類，例如γ₁(IgG1)、γ₂(IgG2)、γ₃(IgG₃)、γ₄(IgG₄)、α₁(IgA₁)和α₂(IgA₂)。免疫球蛋白的輕鏈可以基於其恆定結構域的胺基酸序列而劃分成兩種類型之一，稱作κ和λ。免疫球蛋白基本上由借助免疫球蛋白鉸鏈區連接的兩個Fab分子和一個Fc結構域組成。

術語“效應子功能”指隨免疫球蛋白同種型變動的歸因於免疫球蛋白Fc區的那些生物學活性。免疫球蛋白效應子功能的例子包括：C1q結合和補體依賴的細胞毒性(CDC)、Fc受體結合作用、抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)、抗體依賴的細胞吞噬作用(ADCP)、細胞因子分泌、免疫複合物介導的抗原呈遞細胞攝取抗原、下調細胞表面受體(例如B細胞受體)和B細胞活化。

術語“嵌合抗體”是這樣的抗體分子，其中(a)將恆定區或其部分改變、替換或交換，從而抗原結合位點與不同的或改變的類別、效應子功能和/或物種的恆定區或賦予嵌合抗體新性能的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、 生長因子、藥物)等連接；或(b)將可變區或其部分用具有不同或改變的抗原特異性的可變區改變、替換或交換。例如，小鼠抗體可以藉由將其恆定區更換為來自人免疫球蛋白的恆定區進行修飾。由於更換為人類恆定區，該嵌合抗體可以保留其在識別抗原方面的特異性，同時如與原始小鼠抗體相比，具有在人類中降低的抗原性。

“人源化”抗體是一種保留非人類抗體(例如小鼠單株抗體)的抗原特異性反應性，同時作為治療藥對人施用時免疫原性較低的抗體。這可以例如藉由保留非人類抗原結合位點並且抗體的剩餘部分替換成它們的人類相應部分(即，恆定區以及可變區中不參與結合的部分為人類抗體的相應部分)來實現。參見，例如Padlan,Anatomy of the antibody molecule，Mol.Immun.,1994，31：169-217。人類抗體工程化技術的其他例子包括但不限於US 5,766,886中公開的Xoma技術。

“人抗體”指具有這樣的胺基酸序列的抗體，所述胺基酸序列對應於下述抗體的胺基酸序列，所述抗體由人或人細胞生成或來源於非人來源，其利用人抗體庫或其它人抗體編碼序列。人抗體的這種定義明確排除包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。

術語“...價”抗體指抗體分子中存在的抗原結合位點的數目。“二價”、“三價”和“四價”抗體指抗體分子中分別存在2個抗原結合位點、3個抗原結合位點和4個抗原結合位點。在一個實施方案中，本文中報道的雙特異性抗體是“四價的”。

術語“柔性接頭”或“接頭”是指由胺基酸組成的連接肽，例如單獨或組合使用的甘胺酸和/或絲胺酸殘基，以連接抗體中的各個可變結構域。在一 個實施方案中，柔性接頭是Gly/Ser連接肽，包括胺基酸序列(Gly₄Ser)n，其中n是等於或大於1的正整數，例如，n是1-7中的正整數，例如2、3或4。在一個實施方案中，所述柔性接頭是(Gly₄Ser)₂(SEQ ID NO：5)。還包括在本發明範圍內的是WO2012/138475中描述的接頭，其藉由引用併入本文。

如本文所用，術語“結合”或“特異性結合”意指結合作用對抗原是選擇性的並且可以與不想要的或非特異的相互作用區別。抗原結合位點與特定抗原結合的能力可以藉由酶聯免疫吸附測定法(ELISA)或本領域已知的常規結合測定法測定。

術語“抗原”是指引發免疫應答的分子。這種免疫應答可能涉及抗體產生或特異性免疫細胞的活化，或兩者兼有。技術人員將理解，任何大分子，包括基本上所有的蛋白質或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重組或基因組DNA。在本文的一些實施方案中，第一抗原、第二抗原是兩種不同的抗原。

術語“腫瘤相關抗原”或“癌症抗原”可互換地指與正常細胞相比，較佳在癌細胞表面完全或作為片段(例如，MHC/肽)表達的分子(通常為蛋白質、碳水化合物或脂質)，並且所述分子可用在藥劑對癌細胞的優先靶向中。在一些實施方案中，腫瘤相關抗原是與正常細胞相比在腫瘤細胞中過表達的細胞表面分子，例如與正常細胞相比1倍過量表達、2倍過量表達、3倍過量表達或更多倍過量表達。在一些實施方案中，腫瘤相關抗原是在腫瘤細胞中不適當地合成的細胞表面分子，例如與正常細胞上表達的分子相比含有缺失、添加或突變的分子。在一些實施方案中，腫瘤相關抗原僅在腫瘤細胞的細胞表面完整表達或作為片段表達，並且不在正常細胞的表面上合成或表達。

術語“細胞因子”是由一種細胞群釋放，作為細胞間介質作用於另一細胞的蛋白質的通稱。此類細胞因子的例子有淋巴因子、單核因子、介白素(IL)，諸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15；腫瘤壞死因子，諸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)和γ-干擾素。如本文中使用的，術語細胞因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養物的蛋白質及天然序列細胞因子的生物學活性等效物，包括藉由人工合成產生的小分子實體，及其藥劑學可接受的衍生物和鹽。

“免疫綴合物”是與一個或多個其它物質(包括但不限於細胞毒性劑或標記)綴合的抗體。

如本文中使用的，術語“OX40”指來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物諸如靈長類(例如人、猴、食蟹猴)和齧齒類(例如小鼠和大鼠)的任何天然OX40，除非另有說明。該術語涵蓋“全長”，未加工的OX40以及因細胞中的加工所致的任何形式的OX40。該術語還涵蓋OX40的天然發生變體，例如剪接變體或等位變體。

“OX40活化”指OX40受體的活化。通常，OX40活化導致信號轉導。

本文所用的術語“抗OX40抗體”、“抗OX40”、“OX40抗體”或“結合OX40的抗體”是指這樣的抗體，所述抗體能夠以足夠的親合力結合(人或猴)OX40蛋白或其片段以致所述抗體可以用作靶向(人或猴)OX40中的診斷劑和/或治療劑。在一個實施方案中，抗OX40抗體與非(人或猴)OX40蛋白結合的程度低於所述抗體與(人或食蟹猴)OX40結合的約10%、約20%、約30%、約40%、 約50%、約60%、約70%、約80%或約90%或以上，如例如藉由放射性免疫測定(RIA)或生物膜干涉測定法或MSD測定法或SPR測定法測量的。

如本文所用的術語“程序性細胞死亡1配體1”、“PD-L1“、“程序性死亡配體1”、“分化簇274”、“CD274”或“B7同系物1”是指來自任何脊椎動物來源的任何天然PD-L1，所述任何脊椎動物來源包括哺乳動物，諸如靈長類(例如，人)和齧齒類(例如，小鼠和大鼠)。所述術語涵蓋“全長”、未加工的PD-L1以及由細胞中的加工所產生的任何形式的PD-L1。PD-L1可作為跨膜蛋白或作為可溶性蛋白存在。所述術語還涵蓋天然存在的PD-L1的變體，例如剪接變體或等位基因變體。PD-L1的基本結構包括4個結構域：胞外Ig樣V型結構域和Ig樣C2型結構域、跨膜結構域以及細胞質結構域。可在NCBI Gene ID No.29126下找到關於人PD-L1基因(包括基因組DNA序列)的另外信息。可在NCBI Gene ID No.60533下找到關於小鼠PD-L1基因(包括基因組DNA序列)的另外信息。示例性全長人PD-L1蛋白的胺基酸序列可例如在NCBI登錄號NP_001254653或UniProt登錄號Q9NZQ7下找到，而可例如在NCBI登錄號NP_068693或Uniprot登錄號Q9EP73下找到示例性全長小鼠PD-L1蛋白序列。

本文所用的術語“抗PD-L1抗體”、“抗PD-L1”、“PD-L1抗體”或“結合PD-L1的抗體”是指這樣的抗體，所述抗體能夠以足夠的親和力結合PD-L1蛋白或其片段。在一個實施方案中，抗PD-L1抗體與非PD-L1蛋白結合的程度低於所述抗體與PD-L1結合的約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%或約90%或以上，如例如藉由放射性免疫測定(RIA)或生物光干涉測定法或MSD測定法測量的。

術語“抑制劑”或“拮抗劑”包括使所給出分子的某些參數(例如，活性)降低的物質。例如，這個術語包括使得所給出的分子被抑制至少5%、10%、20%、30%、40%或更多的活性(例如，PD-L1活性)的物質。因此，抑制作用不必是100%。

術語“激活劑”包括使所給出分子的某些參數(例如，活性)增加的物質。例如，這個術語包括使得所給出的分子被增加至少5%、10%、20%、30%、40%或更多的活性(例如，OX40活性)的物質。因此，激活作用不必是100%。

“功能性Fc區”擁有天然序列Fc區的“效應器功能”。例示性的“效應器功能”包括C1q結合；CDC；Fc受體結合；ADCC；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)下調等。此類效應器功能一般要求Fc區與結合結構域(例如抗體可變域)聯合，而且可以使用多種測定法來評估，例如本文所公開的那些。

“效應子功能”指那些可歸於抗體Fc區且隨抗體同種型而變化的生物學活性。抗體效應子功能的實例包括：C1q結合和補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)下調；和B細胞活化。

“人效應細胞”指表達一種或多種FcR並行使效應器功能的白細胞。在某些實施方案中，該細胞至少表達Fc使效應器功並行使ADCC效應器功能。介導ADCC的人白細胞的例子包括外周血單個核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞。效應細胞可以從其天然來源分離，例如血液。

術語“有效量”指本發明的抗體或片段或綴合物或組合物的這樣的量或劑量，其以單一或多次劑量施用患者後，在需要治療或預防的患者中產生預期效果。有效量可以由作為本領域技術人員的主治醫師藉由考慮以下多種因素來容易地確定：諸如哺乳動物的物種；它的大小、年齡和一般健康；涉及的具體疾病；疾病的程度或嚴重性；個體患者的應答；施用的具體抗體；施用模式；施用製劑的生物利用率特徵；選擇的給藥方案；和任何伴隨療法的使用。

“治療有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段，有效實現所需治療結果的量。抗體或抗體片段或其綴合物或組合物的治療有效量可以根據多種因素如疾病狀態、個體的年齡、性別和重量和抗體或抗體部分在個體中激發所需反應的能力而變動。治療有效量也是這樣的一個量，其中抗體或抗體片段或其綴合物或組合物的任何有毒或有害作用不及治療有益作用。相對於未治療的對象，“治療有效量”較佳地抑制可度量參數(例如腫瘤生長率)至少約20%、更較佳地至少約40%、甚至更較佳地至少約50%、60%或70%和仍更較佳地至少約80%。可以在預示人腫瘤中的功效的動物模型系統中評價化合物抑制可度量參數(例如，癌症)的能力。可選地，可以藉由檢驗化合物抑制的能力評價組合物的這種特性，所述抑制在體外藉由熟練技術人員已知的測定法。

“預防有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段，有效實現所需預防結果的量。通常，由於預防性劑量在對象中在疾病較早階段之前或在疾病較早階段使用，故預防有效量將小於治療有效量。

“Fab”片段包括重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，並且還包括輕鏈的恆定結構域以及重鏈的第一恆定結構域(CH1)。Fab’片段因在重鏈CH1結構域的羧基末端增加了一些殘基(包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱胺酸)而 與Fab片段不同。Fab’-SH是對其中恆定結構域的半胱胺酸殘基攜帶一個游離硫醇基的Fab’的稱謂。F(ab’)₂抗體片段最初是作為成對Fab’片段生成的，在Fab’片段之間具有鉸鏈半胱胺酸。抗體片段的其它化學偶聯也是已知的。

術語“Fc區”在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈的C端區域，所述區域包含至少一部分的恆定區。該術語包括天然序列Fc區和變體Fc區。在某些實施方案中，人IgG重鏈Fc區從Cys226或Pro230延伸至重鏈的羰基端。然而，Fc區的C端賴胺酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外說明，Fc區或恆定區中的胺基酸殘基的編號是根據EU編號系統，其也被稱為EU索引，如在Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。

術語“可變區”或“可變結構域”是指參與抗體與抗原結合的抗體重或輕鏈的結構域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變結構域通常具有相似的結構，其中每個結構域包含四個保守的構架區(FR)和三個互補決定區(CDR)。(參見，例如，Kindt等Kuby Immunology，6^th ed.，W.H.Freeman and Co.91頁(2007))。單個VH或VL結構域可以足以給予抗原結合特異性。此外，可以使用來自與特定抗原結合的抗體的VH或VL結構域來分離結合所述抗原的抗體，以分別篩選互補VL或VH結構域的文庫。參見，例如，Portolano等，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等，Nature 352：624-628(1991)。

術語“宿主細胞”指已經向其中引入外源多核苷酸的細胞，包括這類細胞的子代。宿主細胞包括“轉化體”和“轉化的細胞”，這包括原代轉化的細胞和從其衍生的子代，而不考慮傳代的數目。後代在核酸內容上可能與親本細胞不完全相同，而是可以包含突變。本文中包括在最初轉化的細胞中篩選或選擇的具 有相同功能或生物學活性的突變體後代。宿主細胞是可以用來產生本發明抗體分子的任何類型的細胞系統，包括真核細胞，例如，哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞；和原核細胞，例如，大腸桿菌細胞。宿主細胞包括培養的細胞，也包括轉基因動物、轉基因植物或培養的植物組織或動物組織內部的細胞。

術語“抗腫瘤作用”指可以藉由多種手段展示的生物學效果，包括但不限於例如，腫瘤體積減少、腫瘤細胞數目減少、腫瘤細胞增殖減少或腫瘤細胞存活減少。

術語“腫瘤”和“癌症”在本文中互換地使用，涵蓋實體瘤和液體腫瘤。

術語“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳動物中特徵通常為細胞生長不受調節的生理疾患。在某些實施方案中，適合於藉由本發明的抗體來治療的癌症包括肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌，包括那些癌症的轉移性形式。

術語“腫瘤”指所有贅生性(neoplastic)細胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。術語“癌症”、“癌性”和“腫瘤”在本文中提到時並不互相排斥。

本文所使用的術語“標記”是指被直接或間接綴合或融合至試劑(諸如多核苷酸探針或抗體)並且促進其所綴合或融合的試劑的檢測的化合物或組合物。標記本身可以是可檢測的(例如，放射性同位素標記或螢光標記)或在酶促標記的情況下可以催化可檢測的受質化合物或組合物的化學改變。術語旨在涵蓋藉由將可檢測物質偶聯(即，物理連接)至探針或抗體來直接標記探針或抗體，以及藉由與直接被標記的另一種試劑反應來間接標記探針或抗體。間接標記 的實例包括使用螢光標記的二級抗體進行的一級抗體的檢測和具有生物素的DNA探針的末端標記，使得其可以用螢光標記的鏈黴抗生素蛋白來檢測。

“個體”或“受試者”包括哺乳動物。哺乳動物包括但不限於，家養動物(例如，牛，羊，貓，狗和馬)，靈長類動物(例如，人和非人靈長類動物如猴)，兔，以及齧齒類動物(例如，小鼠和大鼠)。在一些實施方案中，個體或受試者是人。

“分離的”抗體是這樣的抗體，其已經與其天然環境的組分分離。在一些實施方案中，將抗體純化至超過95%或99%純度，如藉由例如電泳(例如，SDS-PAGE，等電聚焦(IEF)，毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或反相HPLC)確定的。對於用於評估抗體純度的方法的綜述，參見，例如，Flatman等，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。

“分離的”核酸是指這樣的核酸分子，其已經與其天然環境的組分分離。分離的核酸包括包含在通常包含該核酸分子的細胞中的核酸分子，但是該核酸分子存在於染色體外或在不同於其天然染色體位置的染色體位置處。

如下進行序列之間序列同一性的計算。

為確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列的同一性百分數，將所述序列出於最佳比較目的比對(例如，可以為了最佳比對而在第一和第二胺基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以為比較目的而拋棄非同源序列)。在一個較佳實施方案中，為比較目的，所比對的參考序列的長度是至少30%、較佳地至少40%、更佳地至少50%、60%和甚至更佳地至少70%、80%、90%、100%的參考序列長度。隨後比較在對應胺基酸位置或核苷酸位置處的胺基酸殘基或 核苷酸。當第一序列中的位置由第二序列中對應位置處的相同胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則所述分子在這個位置處是相同的。

可以利用數學算法實現兩個序列間的序列比較和同一性百分數的計算。在一個較佳實施方案中，使用已經集成至GCG軟體包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48：444-453)算法(在http：//www.gcg.com可獲得)，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣和空位權重16、14、12、10、8、6或4和長度權重1、2、3、4、5或6，確定兩個胺基酸序列之間的同一性百分數。在又一個較佳的實施方案中，使用GCG軟體包中的GAP程序(在http：//www.gcg.com可獲得)，使用NWSgapdna.CMP矩陣和空位權重40、50、60、70或80和長度權重1、2、3、4、5或6，確定兩個核苷酸序列之間的同一性百分數。特別佳的參數集合(和除非另外說明否則應當使用的一個參數集合)是採用空位罰分12、空位延伸罰分4和移碼空位罰分5的Blossum 62評分矩陣。

還可以使用PAM120加權餘數表、空位長度罰分12，空位罰分4)，利用已經併入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法，((1989)CABIOS,4：11-17)確定兩個胺基酸序列或核苷酸序列之間的同一性百分數。

額外地或備選地，可以進一步使用本文所述的核酸序列和蛋白質序列作為“查詢序列”以針對公共數據庫執行檢索，以例如鑒定其他家族成員序列或相關序列。

如本文所用，術語“在低嚴格性、中等嚴格性、高嚴格性或極高嚴格性條件下雜交”描述了雜交和洗滌條件。進行雜交反應的指導可以在藉由引用方式併入的Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989), 6.3.1-6.3.6中找到。參考文獻中描述了含水方法和非含水方法並且可以使用任一方法。本文中提及的特異性雜交條件如下：1)低嚴格性雜交條件是在約45℃於6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，隨後至少在50℃(對於低嚴格性條件，可以增加洗滌的溫度至55℃)於0.2X SSC，0.1% SDS中洗滌兩次；2)中等嚴格性雜交條件是在約45℃於6 X SSC中、隨後在60℃在0.2 X SSC、0.1% SDS中洗滌一次或多次；3)高嚴格性雜交條件是在約45℃在6 X SSC中、隨後在65℃於0.2X SSC、0.1% SDS中洗滌一次或多次；並且較佳地4)極高嚴格性雜交條件是在65℃於0.5M磷酸鈉、7%SDS中、隨後在65℃於0.2X SSC、0.1% SDS中洗滌一次或多次。極高嚴格性條件(4)是較佳的條件和除非另外說明，否則應當使用的一個條件。

術語“醫藥組成物”指這樣的組成物，其以允許包含在其中的活性成分的生物學活性有效的形式存在，並且不包含對施用所述組合物的受試者具有不可接受的毒性的另外的成分。

術語“藥用輔料”指與活性物質一起施用的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全的))、載體、賦形劑或穩定劑等。

用於本文時，“治療”指減緩、中斷、阻滯、緩解、停止、降低、或逆轉已存在的症狀、病症、病況或疾病的進展或嚴重性。想要的治療效果包括但不限於防止疾病出現或復發、減輕症狀、減小疾病的任何直接或間接病理學後果、防止轉移、降低病情進展速率、改善或緩和疾病狀態，以及緩解或改善預後。在一些實施方案中，本發明的抗體分子用來延緩疾病發展或用來減慢疾病的進展。

用於本文時，“預防”包括對疾病或病症或特定疾病或病症的症狀的發生或發展的抑制。在一些實施方式中，具有癌症家族病史的受試者是預防性方案的候選。通常，在癌症的背景中，術語“預防”是指在癌症的病徵或症狀發生前，特別是在具有癌症風險的受試者中發生前的藥物施用。

本文所述的術語“治療劑”涵蓋在預防或治療疾病，例如腫瘤(例如癌症)和感染中有效的任何物質，包括抗血管發生劑、化療劑、細胞毒性劑、疫苗、其它抗體、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑。

“化療劑”包括在治療癌症中有用的化學化合物，包括但不限於抗腫瘤劑，包括烷化劑；抗代謝物；天然產物；抗生素；酶；雜類試劑；激素和拮抗劑；抗雌激素；抗雄激素；以及非類固醇抗雄激素等。

本文使用的術語“免疫調節劑”指抑制或調節免疫應答的天然或合成活性劑或者藥物。免疫應答可以是體液應答或細胞應答。

術語“小分子藥物”是指低分子量的能夠調節生物過程的有機化合物。

如本文所用，術語“細胞毒性劑”指抑制或阻止細胞功能和/或造成細胞死亡或破壞的物質。

術語“抗感染活性劑”包括在施用濃度和給藥間隔下特異性抑制或消除微生物生長但對宿主不致命的任何分子，所述微生物諸如病毒、細菌、真菌或原生動物，例如寄生蟲。用於本文時，術語抗感染活性劑包括抗生素、抗細菌劑、抗病毒劑、抗真菌劑和抗原生動物劑。在一個具體方面中，抗感染活性劑在施用濃度和給藥間隔對宿主是無毒的。

抗細菌的抗感染活性劑或抗細菌劑可廣泛的分類為殺菌的(即，直接殺死)或抑菌的(即，阻止分裂)。抗菌的抗感染活性劑可進一步再分類為窄譜抗菌劑(即，僅影響小類細菌亞型，例如，革蘭氏陰性等)或廣譜抗菌劑(即，影響廣泛種類)。

術語“抗病毒劑”包括抑制或消除病毒生長、致病和/或存活的任何物質。

術語“抗真菌劑”包括抑制或消除真菌生長、致病和/或存活的任何物質。

術語“抗原生動物劑”包括抑制或消除原生動物生物體(例如寄生蟲)生長、發病和/或存活的任何物質。

術語“功能障礙”在免疫功能障礙的背景中指降低的對抗原性刺激的免疫響應性的狀態。如本文中使用的，術語“功能障礙”還包括對抗原識別的不感受或不響應，特別地，將抗原識別轉化成下游T細胞效應器功能，諸如增殖，細胞因子生成(例如γ干擾素)和/或靶細胞殺傷的能力受損。

“激活T細胞”意指誘導，引起或刺激效應或記憶T細胞具有更新，持續或放大的生物學功能。增強T細胞功能的例子包括：相對於干預前的此類水平，升高的來自CD8⁺效應T細胞的γ-干擾素(例如IFNg)或白細胞介素(例如IL-2)分泌，升高的來自CD4⁺記憶和/或效應T細胞的γ-干擾素(例如IFNg)或白細胞介素(例如IL-2)分泌，升高的CD4⁺效應和/或記憶T細胞增殖，升高的CD8⁺效應T細胞增殖，升高的抗原響應性(例如清除)。在一個實施方案中，增強的水平是至少50%，或者60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、2倍、3倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、 50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、160倍或更高。測量此增強的方式是本領域普通技術人員已知的。

“腫瘤免疫逃逸”指腫瘤逃避免疫識別和清除的過程。如此，作為治療概念，腫瘤免疫在此類逃避減弱時得到“治療”，並且腫瘤被免疫系統識別並攻擊。腫瘤識別的例子包括腫瘤結合，腫瘤收縮和腫瘤清除。

“免疫原性”指特定物質引發免疫應答的能力。腫瘤是免疫原性的，並且增強腫瘤免疫原性有助於藉由免疫應答清除腫瘤細胞。

如本文中使用的，“抗體的激動劑活性”指抗體能活化它所結合的抗原的生物學活性。

“抗血管發生劑”指阻斷或在某種程度上干擾血管發育的化合物。抗血管發生劑可以是例如結合涉及促進血管發生的生長因子或生長因子受體的小分子或抗體。

術語“組合產品”是指一種劑量單位形式的固定組合或非固定組合或用於組合施用的部分的試劑盒，其中兩種或更多種治療劑可以獨立地在同一時間同時施用或在一定時間間隔內分開施用，尤其是在這些時間間隔允許組合伴侶展示協作，例如，協同效應時。術語“固定組合”是指本發明抗體和組合伴侶(例如其他治療劑)以單一實體或劑量的形式同時施用於患者。術語“非固定組合”意指本發明抗體和組合伴侶(例如其他治療劑)作為分開的實體同時、並行或依次施用於患者，沒有特定的時間限制，其中這樣的施用提供了患者體內兩種治療劑的治療有效水平。後者也適用於雞尾酒療法，例如施用三種或更多種治療劑。在一個較佳的實施方案中，藥物組合是非固定組合。

術語“組合療法”或“聯合療法”是指施用兩種或更多種治療劑以治療如本公開所述的癌症或感染。這種施用包括以基本上同時的方式共同施用這些治療劑，例如以具有固定比例的活性成分的單一膠囊。或者，這種施用包括對於各個活性成分在多種或在分開的容器(例如片劑、膠囊、粉末和液體)中的共同施用或分開施用或依次施用。粉末和/或液體可以在施用前重構或稀釋至所需劑量。在一些實施方案中，施用還包括以大致相同的時間，或在不同的時間以順序的方式，使用每種類型的治療劑。在任一情況下，治療方案將提供藥物組合在治療本文所述的病症或病狀中的有益作用。

術語“載體”當在本文中使用時是指能夠增殖與其相連的另一個核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複製核酸結構的載體以及結合到已經引入其的宿主細胞的基因組中的載體。一些載體能夠指導與其有效相連的核酸的表達。這樣的載體在本文中被稱為“表達載體”。

“受試者/患者樣品”指從患者或受試者得到的細胞或流體的集合。組織或細胞樣品的來源可以是實體組織，像來自新鮮的、冷凍的和/或保存的器官或組織樣品或活檢樣品或穿刺樣品；血液或任何血液組分；體液，諸如腦脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或間隙液；來自受試者的妊娠或發育任何時間的細胞。組織樣品可能包含在自然界中天然不與組織混雜的化合物，諸如防腐劑、抗凝劑、緩衝劑、固定劑、營養物、抗生素等等。腫瘤樣品的例子在本文中包括但不限於腫瘤活檢、細針吸出物、支氣管灌洗液、胸膜液(胸水)、痰液、尿液、手術標本、循環中的腫瘤細胞、血清、血漿、循環中的血漿蛋白質、腹水、衍生自腫瘤或展現出腫瘤樣特性的原代細胞培養物或細胞系，以及保存的腫瘤樣品，諸如福爾馬林固定的、石蠟包埋的腫瘤樣品或冷凍的腫瘤樣品。

術語“包裝插頁”用於指治療產品的商業包裝中通常包含的用法說明書，其含有關於涉及此類治療產品應用的適應症，用法，劑量，施用，聯合療法，禁忌症和/或警告的信息。

II.本發明的抗體分子

本發明提供了一種新型的抗體分子，其能夠用於多種疾病的免疫治療、預防和/或診斷。本發明的抗體分子包含至少2個、3個或4個抗原結合位點，其能夠作為單特異性抗體或雙特異性抗體或多特異性抗體發揮作用，較佳地，其能夠作為雙特異性抗體發揮作用。

在一個實施方案中，本發明抗體分子中式(I)的單結構域抗原結合位點(VHH)是能夠以較高親和力特異性結合靶抗原表位的單個重鏈可變結構域，例如，衍生自駱駝科重鏈抗體的重鏈可變結構域、來自鯊魚科動物的IgNAR的v-NAR、駱駝化的人VH結構域、人源化的駱駝科抗體重鏈可變結構域、和它們的經重組的單結構域。在一個實施方案中，本發明抗體分子中的單結構域抗原結合位點是衍生自駱駝科重鏈抗體的重鏈可變結構域、駱駝化的人VH結構域和/或人源化的駱駝科抗體重鏈可變結構域。現有技術中已經對從駱駝科物種(例如駱駝、羊駝、單峰駝、駝羊和原駝)獲得的抗體蛋白的大小、結構和針對人類受試者的抗原性進行了表徵。在自然界中來自駱駝科哺乳動物家族的某些IgG抗體缺少輕鏈，並且因此在結構上區別於來自其他動物的具有兩條重鏈和兩條輕鏈的常見四鏈抗體結構。參見PCT/EP 93/02214(1994年3月3日公佈的WO 94/04678)。

可以藉由基因工程方法獲得駱駝科重鏈抗體的對靶抗原具有高親和力的重鏈可變結構域VHH。參見例如1998年6月2日授予的美國專利號 5,759,808。與其他非人源抗體片段一樣，駱駝科VHH的胺基酸序列可以重組地改變以獲得更逼真模仿人序列的序列，即，“人源化”，由此降低駱駝科VHH對人類的抗原性。另外，也可以將衍生自駱駝科VHH的關鍵元件轉移到人VH結構域上，獲得駱駝化的人VH結構域。VHH的分子量是人IgG分子的分子量的十分之一，並且具有僅數奈米的物理直徑。VHH本身具有極高的熱穩定性、對極端pH和蛋白酶解消化穩定和抗原性低，因此，在本發明抗體分子的一個實施方案中，式(I)中的VHH作為構建模塊對本發明抗體分子的穩定性、對人受試者的低抗原性做出了貢獻。

在一個實施方案中，本發明抗體分子式(I)中的VHH特異性結合PD-L1(例如人PD-L1)。

在一個實施方案中，本發明抗體分子式(I)中的特異性結合PD-L1的VHH包含

(i)SEQ ID NO：6中所含的三個互補決定區域(VHH CDR)，或

(ii)相對於(i)的序列，在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列。

在較佳的實施方案中，本發明抗體分子式(I)中的特異性結合PD-L1的VHH包含：

互補決定區域(CDR)VHH CDR1、VHH CDR2和VHH CDR3，其中VHH CDR1包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成，或者VHH CDR1包含與SEQ ID NO：10的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列；VHH CDR2包含SEQ ID NO：11的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成，或者VHH CDR2包含與SEQ ID NO：11 的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列；VHH CDR3包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成，或者VHH CDR3包含與SEQ ID NO：12的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。

在較佳的實施方案中，本發明抗體分子式(I)中的特異性結合PD-L1的VHH包含或由其組成：

(i)SEQ ID NO：6所示的序列，

(ii)與SEQ ID NO：6的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，或

(iii)與SEQ ID NO：6的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列，較佳地，所述胺基酸改變不發生在CDR區中。

在一個實施方案中，式(I)的VH和式(II)的VL構成的抗原結合位點特異性結合OX40，例如人OX40。

在一些具體的實施方案中，在本發明抗體分子中，式(I)中的VH包含

(i)如SEQ ID NO：2所示的重鏈可變區VH的3個互補決定區HCDR，或

(ii)相對於(i)的序列，在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列，和/或

式(II)中的VL包含

(i)如SEQ ID NO：8所示的輕鏈可變區VL的3個互補決定區LCDR，或

(ii)相對於(i)的序列，在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列。

在一些實施方案中，在本發明的抗體分子中，式(I)中的VH包含

互補決定區域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成，或者HCDR1包含與SEQ ID NO：13的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成，或者HCDR2包含與SEQ ID NO：14的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成，或者HCDR3包含與SEQ ID NO：15的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列；

和/或

式(II)中的VL包含

互補決定區域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成，或者LCDR1包含與SEQ ID NO：16的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成，或者LCDR2包含與SEQ ID NO：17的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列；LCDR3包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成，或者LCDR3包含與 SEQ ID NO：18的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。

在一些實施方案中，在本發明的抗體分子中，

(a)式(I)中的VH

(i)包含與SEQ ID NO：2的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由其組成；或者

(ii)包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列或由其組成；或者

(iii)包含與SEQ ID NO：2的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由其組成，較佳地，所述胺基酸改變不發生在CDR區中；

和/或

(b)式(II)中的VL

(i)包含與SEQ ID NO：8的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由其組成；

(ii)包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列或由其組成；或者

(iii)包含與SEQ ID NO：8的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由其組成，較佳地，所述胺基酸改變不發生在CDR區中。

在一些實施方案中，本發明抗體分子式(I)的Fc來自IgG1、IgG2或IgG4。在一些實施方案中，所述Fc來自IgG2。在一些實施方案中，Fc

(i)包含與SEQ ID NO：4的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由其組成；

(ii)包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列或由其組成；或者

(iii)包含與SEQ ID NO：4的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由其組成。

在一些實施方案中，本發明抗體分子式(I)的CH1來自來自IgG1、IgG2或IgG4。在一些實施方案中，CH1來自IgG2。在一些實施方案中，CH1

(i)包含與SEQ ID NO：3的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由其組成；

(ii)包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列或由其組成；或者

(iii)包含與SEQ ID NO：3的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由其組成。

在一些實施方案中，本發明抗體分子式(I)的CL

(i)包含與SEQ ID NO：9的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由其組成；

(ii)包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列或由其組成；或者

(iii)包含與SEQ ID NO：9的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由其組成。

在一些實施方案中，本發明抗體分子式(I)的X是柔性接頭，例如具有單獨或組合的甘胺酸和/或絲胺酸殘基的接頭。在一個實施方案中，所述接頭包含胺基酸序列(Gly₄Ser)n，其中n是等於或大於1的正整數，例如，n是1-7中的正整數，例如，n是2，3，4，5，6。在一個實施方案中，n是1、2、3或4。在一個實施方案中，X具有SEQ ID NO：5所示的序列。

在一些實施方案中，在本發明的抗體分子中，

(a)式(I)中的VH-CH1-Fc

(i)包含與SEQ ID NO：19的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由其組成；

(ii)包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列或由其組成；或者

(iii)包含與SEQ ID NO：19的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列，較佳地，所述胺基酸改變不發生在重鏈的CDR區中，更佳地，所述胺基酸改變不發生在重鏈可變區中；

和/或

(b)式(II)的VL-CL

(i)包含與SEQ ID NO：7的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由其組成；

(ii)包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列或由其組成；或者

(iii)包含與SEQ ID NO：7的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳 胺基酸保守置換)的胺基酸序列，較佳地，所述胺基酸改變不發生在輕鏈的CDR區中，更佳地，所述胺基酸改變不發生在輕鏈可變區中。

在一些實施方案中，本發明抗體分子在式(I)的VH或式(II)的VL的N端還包含信號肽序列，例如METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO：22)。

在本發明的較佳的實施方案中，本發明涉及這樣的抗體分子，其中式(I)的多肽鏈包含SEQ ID NO：1所示的序列，或包含與其具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列；和/或其中式(II)的多肽鏈包含SEQ ID NO：7所示的序列，或包含與其具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。

在一個實施方案中，本發明的抗體包含全抗體部分作為其一部分。在一些實施方案中，本發明的全抗體部分包含式(I)鏈的VH-CH1-Fc，以及式(II)鏈的VL-CL。其中VH構成全抗體部分的重鏈可變區，CH1-Fc構成全抗體部分的重鏈恆定區，二者一起構成全抗體部分的重鏈；VL構成全抗體部分的輕鏈可變區，CL構成全抗體部分的輕鏈恆定區，二者一起構成全抗體部分的輕鏈。

在一些實施方案中，全抗體部分是人抗體。在一些實施方案中，全抗體部分是IgG1形式的抗體或IgG2形式的抗體或IgG4形式的抗體。在一些實施方案中，全抗體部分可獨立地構成單株抗體。在一些實施方案中，全抗體部分是人源化的。在一些實施方案中，全抗體部分是嵌合抗體。在一些實施方案中，至少部分的全抗體部分的框架序列是人共有框架序列。

在一個具體的實施方案中，全抗體部分是的抗OX40抗體。

在本發明的一個實施方案中，本文所述的胺基酸改變包括胺基酸的置換、插入或缺失。較佳的，本文所述的胺基酸改變為胺基酸置換，較佳地保守置換。

在較佳的實施方案中，本發明所述的胺基酸改變發生在CDR外的區域(例如在FR中)。更佳地，本發明所述的胺基酸改變發生在重鏈可變區外和/或輕鏈可變區外的區域。

在一些實施方案中，置換為保守性置換。保守置換是指一個胺基酸經相同類別內的另一胺基酸置換，例如一個酸性胺基酸經另一酸性胺基酸置換，一個鹼性胺基酸經另一鹼性胺基酸置換，或一個中性胺基酸經另一中性胺基酸置換。示例性的置換如下表A所示：

表A

在某些實施方案中，本文中所提供的抗體經改變以增加或降低抗體糖基化的程度。對抗體的糖基化位點的添加或缺失可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點而方便地實現。

舉例而言，可實施一或多種胺基酸置換以消除一或多個可變區構架糖基化位點，由此消除該位點處的糖基化。這類無糖基化可增加抗體對抗原的親和力。例如參見美國專利第5,714,350號及第6,350,861號。可製備具有改變類型的糖基化的抗體，例如具有減小量的岩藻糖基殘基的低岩藻糖化抗體或具有增加的等分GlcNac結構的抗體。這類改變的糖基化模式已顯示可增加抗體的ADCC能力。可藉由例如在具有改變的糖基化體系的宿主細胞中表達抗體來實現這類糖類修飾。備選地，可使用岩藻糖苷酶切除抗體的岩藻糖殘基；舉例而言，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶自抗體去除岩藻糖基殘基(Tarentino等人(1975)Biochem.14：5516-23)。

在某些實施方案中，可在本文中所提供抗體的Fc區中引入一個或多個胺基酸修飾，以此產生Fc區變體，以便增強例如抗體治療癌症或細胞增殖性疾病的有效性。Fc區的修飾包括胺基酸變化(置換、缺失和插入)、糖基化或去糖基化、和添加多個Fc。對Fc的修飾還可以改變治療性抗體中的抗體的半衰期，從而實現更低頻率的給藥和因而增加的方便和減少的材料使用。參見Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731，734-735頁。

在一個實施方案中，可以改變抗體的半胱胺酸殘基數目以修飾抗體特性。例如對CH1的鉸鏈區實施修飾，從而改變(例如增加或降低)鉸鏈區中的半胱胺酸殘基的數目。此辦法進一步闡述於美國專利第5,677,425號中。可以 改變CH1的鉸鏈區中半胱胺酸殘基的數目以例如促進輕鏈及重鏈的裝配或增加或降低抗體的穩定性。

視需要地，本發明的抗體包括對抗體鏈的翻譯後修飾。示例性的翻譯後修飾包括二硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作，如以標記組分綴合。

在本發明的一個實施方案中，本發明所述抗體或片段用經工程改造的酵母N-連接的聚糖或CHO N-連接的聚糖糖基化。

在某些實施方案中，本文中所提供的抗體可進一步經修飾為含有本領域中已知且輕易獲得的其他非蛋白質部分。適合抗體衍生作用的部分包括，但不限於，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實例包括，但不限於，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二烷、聚-1,3,6-三烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。

本發明所涵蓋的另一種對本文所述抗體或其片段的修飾是聚乙二醇化(pegylation)。可對抗體實施聚乙二醇化以例如增加抗體的生物(例如血清)半衰期。如本文中所使用，術語“聚乙二醇”意圖涵蓋已用於衍生化其他蛋白質的PEG的任一形式，例如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇-馬來醯亞胺。在某些實施方案中，要聚乙二醇化的抗體是無糖基化抗體。本領域中已知使蛋白質聚乙二醇化的方法且可將其應用於本發明的抗體，例如參見EP 0154316及EP 0401384。

在一些實施方案中，本發明的抗體分子是人源化的。用於使抗體人源化的不同方法是技術人員已知的，如由Almagro&Fransson綜述的，其內容藉由提述完整併入本文(Almagro JC和Fransson J(2008)Frontiers inBioscience13：1619-1633)。

在一些實施方案中，本發明的抗體分子是人抗體或人源化抗體。可使用本領域中已知的各種技術來製備人抗體或人源化抗體。

在一些實施方案中，本發明的抗體分子是嵌合抗體。

在一些實施方案中，至少部分的本發明的抗體分子的框架序列是人共有框架序列。

在一個實施方案中，本發明的本發明的抗體分子還涵蓋其抗體片段，例如以下的抗體片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、單鏈抗體(例如scFv)或(Fab’)₂、或線性抗體。

在一些實施方案中，本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體具有如下一種或多種性質：

(1)本發明的雙特異性抗體或其片段以高親和力同時結合兩種人抗原，例如，以以下平衡解離常數(K_D)與人OX40結合，所述K_D小於或等於大約150nM、140nM、130nM、120nM、110nM或100nM，在一些實施方案中，所述K_D在大約90nM或95nM以上；且同時，以以下平衡解離常數(K_D)與人PD-L1結合，所述K_D小於或等於大約10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、或4nM，在一些實施方案中，所述K_D在大約1nM、2nM、3nM或3.5nM以上；在一些實施方案中，抗體結合親和力是使用SPR測定法測定的。

(2)本發明的雙特異性抗體或其片段以高親和力同時結合兩種猴抗原，例如，以以下平衡解離常數(K_D)與猴OX40結合，所述K_D小於或等於大約50nM、40nM、30nM、25nM、24nM、23nM或22nM，在一些實施方案中，所述K_D在大約10nM或15nM或20nM以上；且同時，以以下平衡解離常數(K_D)與猴PD-L1結合，所述K_D小於或等於大約50nM、40nM、30nM、20nM、15nM、14nM或13nM，在一些實施方案中，所述K_D在大約10nM、11nM或12nM以上；在一些實施方案中，抗體結合親和力是使用生物膜層干涉技術法測定(例如ForteBio親和力測定)測定的。

(2)本發明的抗體或其片段結合表達人PD-L1的細胞，例如，以小於或等於大約10nM、9nM、8.9nM或8.8nM的EC50(在一些實施方案中，所述EC50在大約7nM、8nM或8.5nM以上)，且同時，結合表達人OX40的細胞，例如，以小於或等於大約10nM、9nM、8.9nM、8.8nM、8.7nM、8.6nM或8.5nM的EC50(在一些實施方案中，所述EC50在大約7nM或8nM以上)。在一些實施方案中，所述結合用流式細胞術(例如FACS)測定。在一些實施方案中，表達人OX40的細胞為表達人OX40的CHO細胞和/或表達人PD-L1的細胞為表達人PD-L1的CHO細胞。在一些實施方案中，本發明的抗體或其片段誘導表達人OX40的細胞與表達人PD-L1的細胞的交聯。

(3)本發明的抗體或其片段與人T細胞結合，以小於或等於大約5nM、4.5nM、4.4nM、4.3nM、4.2nM或4.1nM的EC50(在一些實施方案中，EC50在3或3.5或4nM以上)。在一些實施方案中，所述結合用流式細胞術(例如FACS)測定。

(4)本發明的抗體或其片段具有良好的熱穩定性，例如長期熱穩定性。在一些實施方案中，例如在加速穩定性測試中，例如在40℃耐受，例如耐受至少30 天。在一些實施方案中，在加速穩定性測試中，在例如40℃放置至少10天、20天或30天，抗體保持其單體主峰純度的至少95%、96%、97%、98%或99%。在一些實施方案中，所述抗體或其片段藉由差式掃描螢光法測定的Tm大於或等於大約60℃、61℃、62℃或63℃。

(5)本發明的抗體或其片段阻斷PD-L1(例如人PD-L1)的相關活性。在一些實施方案中，PD-L1的相關活性是PD-L1與PD-1的結合或PD-L2與PD-1的結合。在一些實施方案中，本發明的抗體或其片段在MOA(mechanisms of action)測定(功能性生物活性檢測系統，例如來自Promega)中抑制PD-L1與PD-1的結合。在一些實施方案中，在螢光素酶報告基因檢測系統中，本發明的抗體解除PD-1/PD-L1相互作用對NFAT信號通路的抑制，例如以小於或等於大約1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM或0.5nM的EC50(在一些實施方案中，EC50大於或等於大約0.3nM或0.35nM或0.4nM)。

(6)本發明的抗體或其片段不阻斷人OX40配體與OX40的結合。在一些實施方案中，所述抗體或其片段的阻斷低於現有的抗體，例如pogalizumab。在一些實施方案中，所述抗體或其片段完全不阻斷人OX40配體與OX40的結合，例如與IgG相當。

(7)本發明的抗體或其片段有效激活OX40信號通路，例如OX40或OX40配體介導的信號通路和/或其下游信號通路(例如NFkB信號通路)。

(8)本發明的抗體或其片段具有PD-L1(例如人PD-L1)依賴的有效激活OX40信號通路的能力。在一些實施方案中，本發明的抗體或其片段在表達(例如天然表達或工程化表達)PD-L1的細胞(例如腫瘤細胞)存在下，有效激活OX40信號通 路，在一些實施方案中，所述信號通路包括例如OX40或OX40配體介導的信號通路和/或其下游信號通路(例如NFkB信號通路)。

(9)本發明的抗體或其片段有效激活T細胞(例如CD4+T細胞)，例如其激活效果強於抗PD-L1抗體或抗OX40抗體或二者聯用。

(10)本發明的抗體具有更好的腫瘤抑制效果。

在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段具有以下一個或多個特性：

(i)顯示與本發明抗體(例如包含SEQ ID NO：1作為式(I)的肽鏈且包含SEQ ID NO：7作為式(II)的肽鏈)對OX40和PD-L1相同或相似的結合親和力和/或特異性；

(ii)抑制(例如，競爭性抑制)本發明抗體(例如包含SEQ ID NO：1作為式(I)的肽鏈且包含SEQ ID NO：7作為式(II)的肽鏈)與OX40和PD-L1的結合；

(iii)與本發明抗體(例如包含SEQ ID NO：1作為式(I)的肽鏈且包含SEQ ID NO：7作為式(II)的肽鏈)結合相同或重疊的表位；

(iv)與本發明抗體(例如包含SEQ ID NO：1作為式(I)的肽鏈且包含SEQ ID NO：7作為式(II)的肽鏈)競爭結合OX40和PD-L1；

(v)具有本發明抗體(例如包含SEQ ID NO：1作為式(I)的肽鏈且包含SEQ ID NO：7作為式(II)的肽鏈)的一個或多個生物學特性。

III‧免疫綴合物

在一些實施方案中，本發明還涵蓋與其他物質綴合的抗體(“免疫綴合物”)。在一些實施方案中，其它物質例如治療劑或標記，如細胞毒性劑或免疫抑制劑或 化療劑。細胞毒性劑包括任何對細胞有害的藥劑。適合於形成免疫綴合物的細胞毒性劑(例如化療劑)的例子是本領域中已知的。

另外，本發明的抗體分子可以與標記序列(如肽)綴合以促進純化。在較佳的實施方案中，標記胺基酸序列是六組胺酸肽，如pQE載體(QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311)等中提供的標簽，它們中的許多是可商業獲得的。如Gentz等人，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824中所述，例如，六組胺酸提供融合蛋白的便利純化。用於純化的其他肽標簽包括但不限於血凝素(“HA”)標簽，其對應於源自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人，1984,Cell 37：767)和“flag”標簽。

在其他實施方案中，本發明的抗體分子與診斷劑或可檢測劑綴合。這類抗體可以作為臨床檢驗方法的部分(如確定特定療法的效力)，用於監測或預測疾病或病症的發作、形成、進展和/或嚴重性。可以藉由將抗體與可檢測物質偶聯實現這類診斷和檢測，所述可檢測物質包括但不限於多種酶；輔基；螢光物質；發光物質；放射性物質；和用於各種正電子發射成像術中的正電子發射金屬和非放射性順磁金屬離子。

另外，本發明的抗體分子可以與調節給定生物學反應的治療性部分或藥物部分綴合。治療性部分或藥物部分不得解釋為限於經典的化學治療藥。例如，藥物部分可以是擁有所需生物學活性的蛋白質、肽或多肽。這類蛋白質可以例如包括毒素；蛋白質或生物學反應調節物。

另外，本發明的抗體分子可以綴合至治療性部分如放射性金屬離子或可用於使放射金屬離子綴合至多肽的大環螯合劑。

用於治療性部分與抗體綴合的技術是熟知的，參見，例如Arnon等人，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，引自Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(編著)，第243-256頁(Alan R.Liss,Inc.1985)。

抗體也可以連接至固相支持物，所述支持物特別可用於免疫測定法或靶抗原的純化。此類固相支持物包括但不限於玻璃、纖維素、聚丙烯醯胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。

在一些實施方案中，所述免疫綴合物用於預防或治療疾病，如自身免疫病、炎性疾病、感染、腫瘤、T細胞功能障礙性疾病等。例如，所述疾病是腫瘤(例如癌症)或感染。在一些實施方案中，腫瘤是腫瘤免疫逃逸。較佳地，腫瘤是例如結腸癌或結直腸癌或直腸癌或肺癌。

IV.本發明的核酸以及包含其的宿主細胞

在一方面，本發明提供了編碼以上任何抗體或其片段或其任一條鏈的核酸。在一個實施方案中，提供包含所述核酸的載體。在一個實施方案中，載體是表達載體。在一個實施方案中，提供包含所述核酸或所述載體的宿主細胞。在一個實施方案中，宿主細胞是真核的。在另一個實施方案中，宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞(例如CHO細胞或293細胞)或適用於製備抗體或其抗原結合片段的其它細胞。在另一個實施方案中，宿主細胞是原核的。

例如，本發明的核酸包含編碼選自SEQ ID NO：1-9中任一項所示胺基酸序列的核酸，或編碼與選自SEQ ID NO：1-9中任一項所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列的核酸。

本發明還涵蓋與下述核酸在嚴格性條件下雜交的核酸或與下述核酸具有一個或多個置換(例如保守性置換)、缺失或插入的核酸：包含編碼選自SEQ ID NO：1-9中任一項所示胺基酸序列的核酸序列的核酸；或包含編碼與選自SEQ ID NO：1-9中任一項所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列的核酸序列的核酸。

在一個實施方案中，提供包含所述核酸的一個或多個載體。在一個實施方案中，載體是表達載體，例如真核表達載體。載體包括但不限於病毒、質粒、粘粒、λ噬菌體或酵母人工染色體(YAC)。例如pXC載體或pTT5載體，例如pXC17.4或pXC18.4。在一個實施方案中，表達載體被構建為雙基因表達載體。

一旦已經製備了用於表達的表達載體或DNA序列，則可以將表達載體轉染或引入適宜的宿主細胞中。多種技術可以用來實現這個目的，例如，原生質體融合、磷酸鈣沉澱、電穿孔、逆轉錄病毒的轉導、病毒轉染、基因槍、基於脂質的轉染或其他常規技術。在原生質體融合的情況下，將細胞在培養基中培育並且篩選適宜的活性。用於培養所產生的轉染細胞和用於回收產生的抗體分子的方法和條件是本領域技術人員已知的並且可以基於本說明書和現有技術已知的方法，根據使用的特定表達載體和哺乳動物宿主細胞變動或優化。

另外，可以藉由引入允許選擇已轉染的宿主細胞的一個或多個標記物，選出已經穩定將DNA摻入至其染色體中的細胞。標記物可以例如向營養缺陷型宿主提供原養型、殺生物抗性(例如，抗生素)或重金屬(如銅)抗性等。可選擇標記基因可以與待表達的DNA序列直接連接或藉由共轉化引入相同的細胞 中。也可能需要額外元件以便最佳合成mRNA。這些元件可以包括剪接信號，以及轉錄啟動子、增強子和終止信號。

在一個實施方案中，提供了包含一種或多種本發明多核苷酸的宿主細胞。在一些實施方案中，提供了包含本發明表達載體的宿主細胞。在一些實施方案中，宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞或適用於製備抗體或其抗原結合片段的其它細胞。

合適的宿主細胞包括原核微生物，如大腸桿菌。宿主細胞還可以是真核微生物如絲狀真菌或酵母，或各種真核細胞，例如昆蟲細胞等。也可以將脊椎動物細胞用作宿主。例如，可以使用被改造以適合於懸浮生長的哺乳動物細胞系。有用的哺乳動物宿主細胞系的例子包括SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7)；人胚腎系(HEK 293或293F細胞)、293細胞、幼倉鼠腎細胞(BHK)、猴腎細胞(CV1)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76)、人宮頸癌細胞(HELA)、犬腎細胞(MDCK)、布法羅大鼠肝臟細胞(BRL 3A)、人肺細胞(W138)、人肝臟細胞(Hep G2)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)、CHOK1SV細胞、CHOK1SV GS-KO細胞、CHOS細胞、NSO細胞、骨髓瘤細胞系如Y0、NS0、P3X63和Sp2/0等。適於產生蛋白質的哺乳動物宿主細胞系的綜述參見例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編著，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268頁(2003)。在一個較佳的實施方案中，所述宿主細胞是CHO細胞，例如CHOS細胞CHOK1SV細胞或CHOK1SV GS-KO，或所述宿主細胞是293細胞，例如HEK293細胞。

V.本發明的抗體分子的生產和純化

在一個實施方案中，本發明提供製備本發明抗體分子或其片段(較佳的抗原結合片段)的方法，其中所述方法包括在適於表達編碼本發明抗體分子或其片段(較佳的抗原結合片段)的核酸的條件下培養所述宿主細胞，以及視需要地分離所述抗體或其片段(較佳地抗原結合片段)。在某個實施方案中，所述方法還包括從宿主細胞回收本發明抗體分子或其片段(較佳地抗原結合片段)。

在一個實施方案中，提供了製備本發明抗體分子的方法，其中所述方法包括，在適合抗體表達的條件下，培養包含編碼所述抗體(例如任意一條多肽鏈和/或多條多肽鏈)的核酸或包含所述核酸的表達載體的宿主細胞，如上文所提供的，和視需要地從所述宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收所述抗體。

為了重組產生本發明抗體分子，分離編碼抗體(例如上文所描述的抗體，例如任意一條多肽鏈和/或多條多肽鏈)的核酸，並將其插入一個或多個載體，用於在宿主細胞中進一步克隆和/或表達。此類核酸易於使用常規規程分離和測序(例如藉由使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針進行)。

如本文所述製備的抗體分子可以藉由已知的現有技術如高效液相色譜、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析、大小排阻層析等純化。用來純化特定蛋白質的實際條件還取決於淨電荷、疏水性、親水性等因素，並且這些對本領域技術人員是顯而易見的。可以藉由多種熟知分析方法中的任一種方法確定本發明的抗體分子的純度，所述熟知分析方法包括大小排阻層析、凝膠電泳、高效液相色譜等。

VI.測定法

可以藉由本領域中已知的多種測定法對本文中提供的抗體分子鑒定，篩選，或表徵其物理/化學特性和/或生物學活性。一方面，對本發明的抗體測試其抗原結合活性，例如藉由已知的方法諸如ELISA，Western印跡等來進行。可使用本領域已知方法來測定對所結合抗原的結合，本文中公開了例示性方法，例如生物膜層干涉技術和SPR。

本發明還提供了用於鑒定具有生物學活性的抗體的測定法。生物學活性可以包括例如結合抗原，對細胞表面抗原的結合、對抗原的抑制或激活作用等。還提供在體內和/或在體外具有此類生物學活性的抗體。

在某些實施方案中，對本發明的抗體測試此類生物學活性。

本發明還提供用於鑒定抗體的性質，例如成藥性相關性質的方法。所述成藥性相關性質包括例如熱穩定性，例如長期熱穩定性。

供任何上述體外測定法使用的細胞包括天然表達抗原或經改造而表達抗原的細胞系。此類細胞還包括表達抗原的細胞系和並非正常情況下表達抗原的編碼抗原的DNA轉染的細胞系。

可以理解的是，能夠使用本發明的免疫綴合物替換或補充本發明的抗體分子來進行任何上述測定法。

可以理解的是，能夠使用本發明的抗體分子和別的活性劑來進行任何上述測定法。

在一些實施方案中，所述抗原為PD-L1(例如人PD-L1)和/或OX40(例如人OX40或猴OX40)。

VII.醫藥組成物和藥物製劑

在一些實施方案中，本發明提供包含本文所述的任何抗體分子或其片段(較佳地其抗原結合片段)或其免疫綴合物的組成物，較佳地組合物為醫藥組成物。在一個實施方案中，所述組成物還包含藥用輔料。在一個實施方案中，組成物，例如，醫藥組成物，包含本發明的抗體分子或其片段或其免疫綴合物，以及一種或多種其它治療劑(例如抗血管發生劑、化療劑、細胞毒性劑、疫苗、其它抗體、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑)的組合。

在一些實施方案中，所述組成物用於預防或治療疾病，如自身免疫病、炎性疾病、感染、腫瘤、T細胞功能障礙性疾病等。例如，所述疾病是腫瘤(例如癌症)或感染。在一些實施方案中，腫瘤是腫瘤免疫逃逸。較佳地，腫瘤是例如結腸癌或結直腸癌或直腸癌或肺癌。

本發明還包括包含本發明抗體或其免疫綴合物的組成物(包括醫藥組成物或藥物製劑)和/或包含編碼本發明抗體的多核苷酸的組成物(包括醫藥組成物或藥物製劑)。在某些實施方案中，組合物包含一種或多種本發明抗體或其片段或一種或多種編碼一種或多種本發明抗體或其片段的多核苷酸。

這些組成物還可以包含合適的藥用輔料，如本領域中已知的藥用載體、藥用賦形劑，包括緩衝劑。

如本文所用，“藥用載體”包括生理上相容的任何和全部溶劑、分散介質、等滲劑和吸收延遲劑等。適用於本發明的藥用載體可以是無菌液體，如水和油，包括那些石油、動物、植物或合成來源的，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當靜脈內施用醫藥組成物時，水是較佳的載體。還可以將鹽水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液體載體，特別是用於可注射溶液。

合適的賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、乾燥的脫脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。對於賦形劑的使用及其用途，亦參見“Handbook of PharmaceuticalExcipients”，第五版，R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,PharmaceuticalPress,London,Chicago。

若期望的話，所述組成物還可以含有少量的潤濕劑或乳化劑，或pH緩衝劑。這些組成物可以採用溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉末、持續釋放配製劑等的形式。口服配製劑可以包含標準藥用載體和/或賦形劑，如藥用級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精。

本發明的組成物可以處於多種形式。這些形式例如包括液體、半固體和固體劑型，如液態溶液劑(例如，可注射用溶液劑和可輸注溶液劑)、分散體劑或混懸劑、脂質體劑和栓劑。較佳的形式取決於預期的施用模式和治療用途。常見的較佳組成物處於可注射用溶液劑或可輸注溶液劑形式。較佳的施用模式是腸胃外(例如，靜脈內、皮下、腹腔(i.p.)、肌內)注射。在一個較佳實施方案中，藉由靜脈內輸注或注射施用抗體分子。在另一個較佳實施方案中，藉由肌內、腹腔或皮下注射施用抗體分子。

可以藉由將具有所需純度的本發明的抗體與一種或多種視需要的藥用輔料(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.編(1980))混合來製備包含本文所述的抗體的藥物製劑，較佳地以凍乾製劑或水溶液的形式。

示例性的凍乾抗體製劑描述於美國專利號6,267,958。水性抗體製劑包括美國專利號6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，後一種製劑包括組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。

本發明的醫藥組成物或製劑還可以包含超過一種活性成分，所述活性成分是被治療的特定適應證所需的，較佳具有不會不利地彼此影響的互補活性的那些活性成分。例如，理想的是還提供其它治療劑，例如抗血管發生劑、化療劑、細胞毒性劑、疫苗、其它抗體、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑等。所述活性成分以對於目的用途有效的量合適地組合存在。

在一些實施方案中，治療劑選自以下類別(i)-(iii)中的一個、兩個或全部類別：(i)增強抗原呈遞(例如，腫瘤抗原呈遞)的藥物；(ii)增強效應細胞反應(例如，B細胞和/或T細胞活化和/或動員)的藥物；或(iii)減少免疫抑制的藥物。

可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑的合適實例包括含有抗體的固體疏水聚合物的半滲透基質，所述基質呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。

本發明的醫藥組成物適於靜脈內、肌內、皮下、腸胃外、直腸、脊髓或表皮施用(例如，藉由注射或輸注)。

治療性組合物一般應當是無菌的並且在製造和儲存條件下穩定。可以將組合物配製為溶液、微乳液、分散體、脂質體或凍乾形式。可以藉由將活性化合物(即抗體分子)以要求的量加入適宜的溶劑中，隨後過濾消毒，製備無菌可注射溶液劑。通常，藉由將所述活性化合物併入無菌溶媒中來製備分散體，所述無菌溶媒含有基礎分散介質和其他成分。可以使用包衣劑如卵磷脂等。在分散體的情況下，可以藉由使用表面活性劑來維持溶液劑的適宜流動性。可以藉由在 組合物中包含延遲吸收的物質例如單硬脂酸鹽和明膠而引起可注射組合物的延長吸收。

包含本文所述抗體分子的試劑盒也處於本發明的範圍內。試劑盒可以包含一個或多個其他要素，例如包括：包裝插頁；其他試劑，例如標記物或用於偶聯的試劑；可藥用載體；和用於施用至受試者的裝置或其他材料。

VIII.組合產品或試劑盒

在一些實施方案中，本發明還提供了組合產品，其包含本發明的抗體或其抗原結合片段，或其免疫綴合物，以及一種或多種其它治療劑(例如抗血管發生劑、化療劑、其他抗體、細胞毒性劑、疫苗、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑等)。

在一些實施方案中，所述組合產品用於用於預防或治療疾病，如自身免疫病、炎性疾病、感染、腫瘤、T細胞功能障礙性疾病等。例如，所述疾病是腫瘤(例如癌症)或感染。在一些實施方案中，腫瘤是腫瘤免疫逃逸。較佳地，腫瘤是例如結腸癌或結直腸癌或直腸癌或肺癌。

在一些方案中，所述組合產品中的兩種或多種成分可以依次、分開或同時聯合施用給受試者。

在一些實施方案中，本發明還提供了包含本發明的抗體、醫藥組成物、免疫綴合物或組合產品的試劑盒，以及視需要的指導施用的包裝插頁。

在一些實施方案中，本發明還提供了包含本發明的抗體、醫藥組成物、免疫綴合物、組合產品的藥物製品，視需要地，所述藥物製品還包括指導施用的包裝插頁。

IX.本發明的抗體分子的用途

在一個方面，本發明涉及使用本發明的抗體分子體內用來治療或預防需要在受試者中調節免疫應答的疾病，從而抑制或減少相關疾病如癌性腫瘤、自身免疫病、炎性疾病、感染、T細胞功能障礙性疾病的出現或復發。可以單獨使用本發明的抗體分子。備選地，抗體分子可以與其他療法(例如治療劑/預防劑/治療方式)組合施用。當本發明的抗體分子與一種或多種其他藥物組合施用時，這種組合可以按任何順序依次施用、分開或者同時施用。

因此，在一個實施方案中，本發明提供一種調節受試者中免疫應答的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效量的本文所述的抗體分子。在另一個實施方案中，本發明提供一種防止受試者中疾病出現或者復發的方法，所述方法包括向受試者施用預防有效量的本文所述的抗體分子。

在一些實施方案中，所述疾病是患者中具有(例如升高水平的，例如核酸或蛋白質水平的)PD-L1或PD-1或PD-L2的疾病。在一些實施方案中，所述疾病是患者中具有(例如升高水平的，例如核酸或蛋白質水平的)PD-L1或PD-1或PD-L2的疾病，例如癌症。在一些實施方案中，所述疾病是具有T細胞功能障礙的疾病。在一些實施方案中，所述疾病是具有降低水平的(例如核酸或蛋白質水平)的OX40的疾病，例如OX40表達或活性降低的疾病。

在一些實施方案中，所述疾病是將受益於抑制核酸或蛋白質水平的PD-L1或PD-1或PD-L2的疾病。在一些實施方案中，所述疾病受益於阻斷PD-1與PD-L1的結合，或PD-1與PD-L2的結合。在一些實施方案中，所述疾病受益於激活OX40活性，例如激活OX40信號通路，和或激活T細胞。

在一些實施方案中，本發明涉及在個體中抑制抗原作用和/或激活抗原活性或激活抗原介導的信號通路的方法，該方法包括向對象施用有效量的 本文公開的抗體分子(例如，抗PD-L1/OX40抗體)或醫藥組成物或免疫綴合物或組合產品或試劑盒。在一些實施方案中，所述抗原為OX40(例如人OX40)和/或PD-L1(例如人PD-L1)。在一些實施方案中，抑制抗原作用是指阻斷PD-1與PD-L1的結合，或阻斷PD-1與PD-L2的結合。在一些實施方案中，激活抗原活性或激活抗原介導的信號通路是指激活OX40信號通路。

在一個具體的實施方案中，本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體能夠活化T細胞(例如CD4+T細胞)，例如增強T效應細胞的免疫刺激/效應功能和/或使這些細胞增殖和/或下調T調節細胞的免疫抑制功能。在一些實施方案中，所述抗體能夠引起抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。

在一個具體的實施方案中，本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體增強CD4+效應T細胞功能，例如藉由提高CD4+效應T細胞增殖和/或提高CD4+效應T細胞的細胞因子生成。在一些實施方案中，該細胞因子是γ-干擾素，例如IFNg或白細胞介素，例如IL-2。

在一些實施方案中，本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體或其片段提高腫瘤內(浸潤性)CD4+效應T細胞的數目(例如CD4+效應T細胞的總數，或例如CD45+細胞中CD4+細胞的百分比)。在一些實施方案中，本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體或其片段提高表達γ-干擾素的腫瘤內(浸潤性)CD4+效應T細胞的數目(例如表達γ-干擾素的CD4+效應T細胞的總數，或例如總CD4+細胞中表達γ-干擾素的CD4+細胞的百分比)。

在一些實施方案中，本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體或其片段增強記憶T細胞功能，例如藉由提高記憶T細胞增殖和/或提高記憶細胞的 細胞因子生成。在一些實施方案中，該細胞因子是γ-干擾素(例如IFNg)或白細胞介素(例如IL-2)。

在另一方面中，本發明涉及預防或治療受試者的腫瘤(例如癌症)的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本文公開的抗體分子或醫藥組成物或免疫綴合物或組合產品或試劑盒。在一些實施方案中，腫瘤是腫瘤免疫逃逸。在一些實施方案中，所述腫瘤是癌症。

在另一方面中，本發明涉及預防或治療受試者的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本文公開的抗體分子或醫藥組成物或免疫綴合物或組合產品或試劑盒。

在另一方面中，本發明涉及預防或治療受試者的自身免疫性疾病和/或炎性疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本文公開的抗體分子或醫藥組成物或免疫綴合物或組合產品或試劑盒。

受試者可以是哺乳動物，例如，靈長類，較佳地，高級靈長類，例如，人類(例如，患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的風險的患者)。在一個實施方案中，受試者患有本文所述疾病(例如，如本文所述的腫瘤或感染或自身免疫性疾病)或具有患有本文所述疾病的風險。在某些實施方案中，受試者接受或已經接受過其它治療，例如化療治療和/或放射療法。備選地或組合下，受試者因感染而免疫受損或具有因感染而免疫受損的風險。

在一些實施方案中，用抗體分子治療和/或預防的癌包括但不限於實體瘤、血液學癌及轉移性病灶。在一個實施方案中，癌是實體瘤。實體瘤的例子包括惡性腫瘤。癌症可以處於早期、中期或晚期或是轉移性癌。

在本發明的任何方法的一些實施方案中，本文所述的癌症展示人效應細胞(例如受到人效應細胞浸潤)。用於檢測人效應細胞的是方法本領域公知的，包括例如藉由IHC。在一些實施方案中，該癌症展示高水平的人效應細胞。在一些實施方案中，人效應細胞是NK細胞，巨噬細胞，單核細胞中的一項或多項。在本發明的任何方法的一些實施方案中，本文所述的癌症展示表達FcR的細胞(例如受到表達FcR的細胞浸潤)。用於檢測FcR的方法是本領域公知的，包括例如藉由IHC。在一些實施方案中，該癌症展示高水平的表達FcR的細胞。在一些實施方案中，FcR是FcγR。在一些實施方案中，FcR是活化性FcγR。

本文公開的方法和組成物可用於治療與前述癌症相關的轉移性病灶。

在一些實施方案中，所述腫瘤是需要激活T細胞的腫瘤，例如癌症，例如具有T細胞功能障礙的腫瘤或癌症。在一些實施方案中，所述腫瘤是表達(例如升高水平的)PD-L1的腫瘤，例如癌症。在一些實施方案中，所述腫瘤是OX40的表達或活性被降低的腫瘤。在一些實施方案中，所述腫瘤是受益於OX40信號通路激活的腫瘤，例如癌症。

在一些實施方案中，用抗體分子治療和/或預防的感染性疾病包括目前不存在有效疫苗的病原體或常規疫苗對其未及完全有效的病原體。本發明例示的抗體分子對PD-L1阻斷作用特別可用來對抗隨感染過程推移出現變異抗原的病原體所建立的感染。這些變異抗原在施用本發明抗體時能夠被視為外來抗原，由此，本發明例示的抗體分子能夠藉由PD-L1激發不受負向信號抑制的強烈T細胞反應。

在一些實施方案中，用本發明的抗體分子治療和/或預防炎性和自身免疫性疾病及移植物抗宿主病(GvHD)，來下調免疫系統。

在其他方面，本發明提供抗體分子或其片段或其免疫綴合物或組成物或組合產品或試劑盒在生產或製備藥物中的用途，所述藥物用於治療本文提及的相關疾病或病症。

在一些實施方案中，本發明的抗體或抗體片段或免疫綴合物或組成物或組合產品或試劑盒會延遲病症和/或與病症相關的症狀的發作。

在一些實施方案中，本發明的抗體或醫藥組成物或免疫綴合物或組合產品或試劑盒還能與一種或多種其它療法例如治療方式和/或其它治療劑組合施用，用於本文所述的預防和/或治療。

在一些實施方案中，治療方式包括外科手術；放射療法、局部照射或聚焦照射等。

在一些實施方案中，治療劑選自抗血管發生劑、化療劑、細胞毒性劑、疫苗、其它抗體、抗感染活性劑或免疫調節劑。

示例性的疫苗包括但不限於癌症疫苗。疫苗可以是基於DNA的疫苗、基於RNA的疫苗或基於病毒轉導的疫苗。癌症疫苗可以是預防性的或治療性的。

示例性的抗感染活性劑包括但不限於，抗病毒劑、抗真菌劑、抗原生動物劑、抗細菌劑。

在進一步的一些實施方案中，本發明的抗體或其片段還能與酪胺酸激酶抑制劑組合使用。

在本發明的任何方法的一些實施方案中，本發明的抗體或其片段的施用與腫瘤抗原的施用組合。抗原可以例如是腫瘤抗原、病毒抗原、細菌性抗原或來自病原體的抗原。在一些實施方案中，腫瘤抗原包含蛋白質。在一些實施方案中，腫瘤抗原包含核酸。在一些實施方案中，腫瘤抗原是腫瘤細胞。

在一些實施方案中，本發明的抗體或其片段可以與抗腫瘤劑聯合施用。

在一些實施方案中，本發明的抗體或其片段可以與細胞因子聯合施用。細胞因子可以作為與本發明的抗體分子的融合分子施用，或作為單獨的組合物施用。在一個實施方案中，本發明的抗體與一種、兩種、三種或更多種細胞因子(例如，作為融合分子或作為單獨組合物)組合施用。

在一些實施方案中，本發明的抗體或其片段可以與本領域常規的癌症療法組合，常規的癌症療法包括但不限於：(i)放射療法或用電離輻射殺死癌細胞並縮小腫瘤。放射療法可經體外放射治療(EBRT)或經內部近距離放射療法施用；(ii)化學療法，或應用細胞毒藥物，其一般影響快速分裂的細胞；(iii)靶向療法，或特異性影響癌細胞蛋白去調節的藥劑；(iv)免疫療法，或增強宿主免疫應答(例如，疫苗)；(v)激素療法，或阻斷激素(例如，當腫瘤是激素敏感的時候)，(vi)血管發生抑制劑，或阻斷血管形成和生長，和(vii)姑息護理，或這樣的治療，其涉及改善護理質量以降低疼痛、噁心、嘔吐、腹瀉和出血。

在一些實施方案中，本發明的抗體或其片段可以與增強宿主免疫功能的常規方法組合。

上文所述的各種組合療法可以進一步組合以用於治療。

此類組合療法涵蓋組合施用(其中兩種或更多種治療劑包含在同一配製劑或分開的配製劑中)，和分開施用，在該情況中，可以在施用別的療法，例如治療方式和/或治療劑之前，同時，和/或之後發生本發明的抗體的施用。抗體分子和/或其他療法，例如治療劑或治療方式可以在活動性疾病期間或在緩解或活動度更小的疾病期間施用。抗體分子可以在其他治療前、與其他治療同時、治療後或在疾病緩解期間施用。

在一個實施方案中，本發明的抗體的施用和別的療法(例如治療方式或治療劑)的施用彼此在約一個月內，或約一，兩或三週內，或約1，2，3，4，5，或6天內發生。

可以理解的是，能夠使用本發明的免疫綴合物或組成物或組合產品或試劑盒替換或補充本發明的抗體來進行任何治療。

本發明的抗體(以及包含其的醫藥組成物或免疫綴合物，以及任何另外的治療劑)可以藉由任何合適的方法給藥，包括腸胃外給藥，肺內給藥和鼻內給藥，並且，如果局部治療需要，病灶內給藥。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下給藥。在一定程度上根據用藥是短期或長期性而定，可藉由任何適合途徑，例如藉由注射，例如靜脈內或皮下注射用藥。本文中涵蓋各種用藥時程，包括，但不限於，單次給藥或在多個時間點多次給藥、推注給藥及脈衝輸注。

為了預防或治療疾病，本發明的抗體的合適劑量(當單獨或與一種或多種其他的治療劑組合使用時)將取決於待治療疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴重性和進程、所述抗體是以預防目的施用還是以治療目的施用、以前的治 療、患者的臨床病史和對所述抗體的應答，和主治醫師的判斷力。所述抗體以一次治療或經過一系列治療合適地施用於患者。

可以由技術人員確定本發明抗體分子的劑量和治療方案。在一些實施方案中，調整劑量方案以提供最佳的所需反應(例如，治療反應)。例如，可以施用單次團注，可以隨時間推移施用幾個分開的劑量或可以如治療情況的危急性所示，按比例減少或增加該劑量。特別有利的是以劑量單位形式配製腸胃外組合物以易於劑量的施用和均勻性。如本文所用的劑量單位形式指適合作為用於待治療對象的單一劑量的物理分立的單元；每個單元含有預定量的活性化合物，所述的預定量經計算與所要求的藥用載體結合時產生所需的治療效果。用於本發明劑量單位形式的規格直接取決於(a)活性化合物的獨特特徵和待實現的特定治療效果，以及(b)混合這種活性化合物用於個體中敏感性治療的領域內所特有的限制。

X.用於診斷和檢測的方法和組合物

在某些實施方案中，本文中提供的任何抗體或其抗原結合片段可以用於檢測其所結合抗原在生物樣品中的存在。術語“檢測”用於本文中時，包括定量或定性檢測，示例性的檢測方法可以涉及免疫組織化學、免疫細胞化學、流式細胞術(例如，FACS)、抗體分子複合的磁珠、ELISA測定法、PCR-技術(例如，RT-PCR)。在某些實施方案中，生物樣品是血、血清或生物來源的其他液體樣品。在某些實施方案中，生物樣品包含細胞或組織。在一些實施方案中，生物樣品來自過度增生性或癌性病灶。

在一個方面，本發明提供了體外或體內檢測生物樣品，例如血清、精液或尿或組織活檢樣品(例如，來自過度增生性或癌性病灶)中存在相關抗原的 診斷方法。該診斷方法包括：(i)在允許相互作用發生的條件下使樣品(和視需要地，對照樣品)與如本文所述的抗體分子接觸或向受試者施用所述抗體分子和(ii)檢測所述抗體分子和樣品(和視需要地，對照樣品)之間複合物的形成。複合物的形成表示存在相關抗原，並且可以顯示本文所述治療和/或預防的適用性或需求。

在一個實施方案中，可以使用本發明抗體診斷疾病，例如評價(例如，監測)對象中本文所述疾病(例如，腫瘤或感染)的治療或進展、其診斷和/或分期。在某些實施方案中，提供標記的本發明的抗體。標記包括但不限於，被直接檢測的標記或部分(如螢光標記、發色團標記、電子緻密標記、化學發光標記和放射性標記)，以及被間接檢測的部分，如酶或配體，例如，藉由酶促反應或分子相互作用。示例性標記包括但不限於，放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，螢光團如稀土螯合物或螢光素及其衍生物，羅丹明及其衍生物，丹醯(dansyl)，傘形酮(umbelliferone)，螢光素酶(luceriferase)，例如，螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶(美國專利號4,737,456)，螢光素，2,3-二氫酞嗪二酮，辣根過氧化物酶(HR)，鹼性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖澱粉酶，溶解酶，糖類氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，雜環氧化酶如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，以及利用過氧化氫氧化染料前體的酶如HR，乳過氧化物酶，或微過氧化物酶(microperoxidase)，生物素/親和素，自旋標記，噬菌體標記，穩定的自由基等等。

在本文中提供的任何發明的一些實施方案中，樣品是在用本發明的抗體治療之前獲得的。在一些實施方案中，樣品是在癌症已經轉移之後獲得的。在一些實施方案中，樣品是福爾馬林固定、石蠟包膜(FFPE)的。在一些實施 方案中，樣品是活檢(例如芯活檢)，手術標本(例如來自手術切除的標本)，或細針吸出物。

在一些實施方案中，在治療之前，例如，在起始治療之前或在治療間隔後的某次治療之前檢測相關抗原。

在一些實施方案中，體內確定相關抗原的水平和/或分佈，例如，以非侵入方式確定(例如，藉由使用合適的成像技術(例如，正電子發射斷層攝影術(PET)掃描)檢測可檢測物標記的本發明抗體分子。在一個實施方案中，例如，藉由檢測用PET試劑(例如，¹⁸F-氟脫氧葡萄糖(FDG))以可檢測方式標記的本發明抗體分子，體內測定相關抗原的水平和/或分佈。

在一個實施方案中，本發明提供了包含本文所述抗體分子和使用說明書的診斷試劑盒。

在一些實施方案中，提供了一種治療疾病的方法，所述方法包括：對受試者(例如，樣品)(例如，包含癌細胞的受試者樣品)檢驗相關抗原的存在，因而確定其值，將該值與對照值(例如健康個體中的相關抗原的值)比較，並且如果大於對照值，則向受試者施用治療有效量的視需要與一種或多種其他療法組合的本發明的抗體，因而治療疾病。

在一些實施方案中，抗原是PD-L1(例如人PD-L1)和/或OX40(例如人OX40)。

能夠理解的是，在本發明各部分中描述的各個實施方案，例如疾病、治療劑、治療方式和施用等同樣適用於本發明的其他部分的實施方案，或可以與其他部分的實施方案組合。在本發明各部分中描述的適用於抗體分子的性 質、用途、和方法等實施方案，同樣適用於包含抗體的組t/6物、綴合物、組合產品和試劑盒等。

描述以下實施例以輔助對本發明的理解。不意在且不應當以任何方式將實施例解釋成限制本發明的保護範圍。

實施例1.抗PD-L1/OX40雙特異性抗體構建

本實施例利用分子克隆技術，構建了抗PD-L1/OX40雙特異性抗體。該雙特異性抗體形式含有四條多肽鏈，並且可以和兩種抗原結合，抗原A為OX40，抗原B為PD-L1。用於構建雙特異性抗體的親本抗體為抗OX40單株抗體(IgG2形式的ADI-20057，中國發明專利申請號：201710185399.9；抗PD-L1奈米抗體人源化Nb-Fc(中國發明專利申請號：PCT/CN2017/095884)。構建方法如下：抗體的結構如第1A圖所示，由左右對稱的四條多肽鏈組成，其中左半部分由肽鏈#1和肽鏈#2組成，右半部分同樣由肽鏈#1和肽鏈#2組成。其中肽鏈#1和肽鏈#2的結構如第1B圖所示。下面對這抗PD-L1/OX40雙特異性抗體進行描述。抗PD-L1/OX40雙特異性抗體左半部分的SEQ ID NO：1所示的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體肽鏈#1胺基酸序列從N端至C端包含SEQ ID NO：2所示的抗OX40抗體ADI-20057 VH胺基酸序列、SEQ ID NO：3所示的CH1胺基酸序列、SEQ ID NO：4所示的Fc胺基酸序列、SEQ ID NO：5所示的(G4S)₂柔性連接肽鏈胺基酸序列、以及SEQ ID NO：6所示的抗PD-L1單域抗體胺基酸序列。抗PD-L1/OX40雙特異性抗體的左半部分的SEQ ID NO：7所示的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體肽鏈#2胺基酸序列從N端至C端包含SEQ ID NO：8所示的抗OX40抗體ADI-20057 VL胺基酸序列和SEQ ID NO：9所示的CL胺基酸序列。

SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6中斜體加粗段序列為本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體的CDR區(其中在VHH和VH區的HCDR1利用AbM規則定義；HCDR2&3利用Kabat規則定義；LCDR：利用Kabat規則定義)。具體的序列信息見序列表。

實施例2.抗PD-L1/OX40雙特異性抗體蛋白的表達、純化

在本實施例中，將編碼實施例1中構建的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體的肽鏈#1、肽鏈#2的核苷酸序列分別藉由多克隆位點連接入市售的真核表達載體pXC載體，在真核細胞中進行表達和純化，獲得了抗PD-L1/OX40雙特異性抗體。具體操作如下。

本實施例中，委託蘇州金唯智生物科技有限公司(Genewiz)合成了抗PD-L1/OX40雙特異性抗體、IgG2對照抗體的各肽鏈的編碼核苷酸序列。使用合適的限制性內切酶和連接酶將所合成的編碼肽鏈的核苷酸序列分別連接入載體，其中抗PD-L1/OX40雙特異性抗體的兩條肽鏈的編碼DNA序列被分別構建入真核表達載體Double-GeneVectors(pXC17.4,pXC18.4)(購自Lonza公司)並測序驗證序列正確性，獲得了分別含有所述編碼肽鏈的核苷酸序列的重組載體。肽鏈#1、#2用電轉染的方法轉入CHOK1SV GS-KO Cell line(購自Lonza公司)細胞構建蛋白表達細胞株後進行蛋白表達，蛋白表達過程如下：

1)取所需CHOK1SVGS-KO Cell line(Lonza)蛋白表達細胞株，將其傳代培養於CD CHO Medium(GIBCO，10743-029)，培養至細胞密度為0.8×10⁶個細胞/ml；

2)過夜培養後隔一天補加培養物體積5/100的200g/L的FEED(Sigma，H6784-100G)，並且補充葡萄糖(D(+)-Glucose anhydrous，Merck，1.37048.5000)至終濃度5g/L；

3)連續培養至第14天或者細胞活力

60%時，收集培養物，以7500轉/分鐘離心30分鐘，取細胞上清，用以純化。

細胞培養上清藉由親和層析方法純化目的雙特異性抗體蛋白。具體過程如下：

1)親和純化：選用MabSelect SuRe(GE Healthcare，目錄號：17-5438-03)親和層析柱，並置於AKTApure系統(GE Healthcare)內。用0.1M NaOH將AKTA系統除內毒(過夜)。收樣當天將細胞7500rpm/min離心30min，使用SARTOPORE(Sartorius，5441307H4)過濾。純化前用5倍柱體積的Binding Buffer(Tris 20mM，NaCl 150mM，pH 7.2)清洗系統以及平衡柱子。將需要純化的上述過濾後的上清藉由柱子。用5~10倍柱體積Binding Buffer再平衡，使用AKTApure系統配備的紫外檢測裝置監測至紫外走平。用Elution Buffer(檸檬酸+檸檬酸鈉100mM，pH 3.5)洗脫抗體，根據紫外吸收值來收集樣品。每1ml的收集液加80μl的Neutralizing Buffer(Tris-HCl 2M)中和備用；

2)更換緩衝液：按照大小排阻層析(size exclusion chromatography；SEC)檢測收集的各級分管中樣品的純度，將純度大於95%的樣品合併。將合併後的溶液使用15ml超濾離心管離心，4500rpm，30min。使用PBS將蛋白稀釋後繼續離心，4500rpm，30min，重複2次，以更換緩衝液。將更換緩衝液後的抗體合併，測抗體濃度。

純化後的蛋白利用SEC檢測純度，結果如第2圖所示。經過兩步純化後，本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體純度較高，其單體主峰純度分別為100.00%，適合後期開發。

本實施例中，Pogalizumab是在HEK293細胞進行蛋白表達的人IgG1 OX40抗體，其利用來自建議的INN：列表114(參見http：//www.who.int/medicines/publications/druginformation/innlists/PL114.pdf)的重鏈和輕鏈序列。委託蘇州金唯智生物科技有限公司(Genewiz)合成了抗體上述各肽鏈的編碼核苷酸序列。使用合適的限制性內切酶和連接酶將所合成的編碼肽鏈的核苷酸序列分別連接入載體pTT5中，獲得了分別含有所述編碼肽鏈的核苷酸序列的重組載體。

用Polyethyleneimine(PEI)轉染的方法轉入HEK293細胞進行蛋白表達，轉染過程如下：

1)根據所需轉染體積將HEK293細胞(購自Invitrogen公司)傳代培養於Expi293細胞培養液(購自Invitrogen公司)中。轉染前一天離心細胞培養物，獲得細胞沉澱，用新鮮的Expi293細胞培養液懸浮細胞，將細胞密度調整為1×10⁶個細胞/ml。繼續培養HEK293細胞，使得轉染當天的培養物中細胞密度約為2×10⁶個細胞/ml；

2)取HEK293細胞懸浮液終體積1/10的F17培養基(購自Gibco公司，產品目錄號A13835-01)作為轉染緩衝液。向每毫升轉染緩衝液中加入200μg的1：1摩爾比率的上述製備的分別包含各條鏈的核苷酸序列的重組質粒，混勻；

3)加30μg的PEI(Polysciences，23966)到質粒中，混勻後室溫孵10min。將混合物輕柔倒入HEK293細胞懸浮液中。輕輕混勻，置於8%CO₂、36.5℃過夜培養；

4)過夜培養後，向培養瓶中補加轉染後培養物體積1/50的濃度為200g/L的FEED(Sigma，目錄號：H6784-100G)和轉染後培養物體積1/50的濃度為200g/L 的葡萄糖溶液，輕輕混勻，置於8%CO₂、36.5℃繼續培養。20小時後，加入VPA(Gibco，目錄號：11140-050)至終濃度為2mM/L；

5)連續培養至第7天或者細胞活力

60%時，收集培養物，以7500轉/分鐘離心30分鐘，取細胞上清，用以純化；

細胞培養上清藉由親和層析方法純化目的雙特異抗體蛋白。具體過程如下：

1)親和純化：選用MabSelect SuRe(GE Healthcare，目錄號：17-5438-03)親和層析柱，並置於AKTApure系統(GE Healthcare)內。用0.1M NaOH將AKTA系統(GE Healthcare)除內毒(過夜)。收樣當天將細胞7500rpm/min離心30min，使用SARTOPORE(Sartorius，5441307H4)過濾。純化前用5倍柱體積的Binding Buffer(Tris 20mM，NaCl 150mM，pH7.2)清洗系統以及平衡柱子。將需要純化的上述過濾後的上清藉由柱子。用5~10倍柱體積Binding Buffer再平衡，使用AKTApure系統配備的紫外檢測裝置監測至紫外走平。用Elution Buffer(檸檬酸+檸檬酸鈉100mM，pH 3.5)洗脫抗體，根據紫外吸收值來收集樣品。每1ml的收集液加80μl的Neutralizing Buffer(Tris-HCl 2M)中和備用；

2)更換緩衝液：按照大小排阻層析(size exclusion chromatography；SEC)檢測收集的各級分管中樣品的純度，將純度大於95%的樣品合併。將合併後的溶液使用15ml超濾離心管離心，4500rpm，30min。使用PBS將蛋白稀釋後繼續離心，4500rpm，30min，重複2次，以更換緩衝液。將更換緩衝液後的抗體合併，測抗體濃度。

應用已知的方法製備抗OX40單株抗體(IgG2形式的ADI-20057，參見中國發明專利申請號：201710185399.9；抗PD-L1奈米抗體人源化Nb-Fc(參 見中國發明專利申請號：PCT/CN2017/095884)，並同樣進行上述純化，獲得ADI-20057和抗PD-L1人源化Nb-Fc，用於後續實驗。

實施例3.抗PD-L1/OX40雙特異性抗體和抗原的結合活性檢測

實施例3.1.測定抗PD-L1/OX40雙特異性抗體的親和力的SPR測定

採用表面等離子共振法(SPR)測定本發明抗體結合人PD-L1或人OX40的平衡解離常數(K_D)。基於SPR原理，當一束偏振光以一定的角度入射到棱鏡端面，在棱鏡與金膜的界面將產生表面等離子波，引起金屬膜內自由電子產生共振，即表面等離子共振。分析時，先在傳感芯片表面固定一層生物分子識別膜，然後將待測樣品流過芯片表面，若樣品中有能夠與芯片表面的生物分子識別膜相互作用的分子，會引起金膜表面折射率變化，最終導致SPR角變化，藉由檢測SPR角度變化，獲得被分析物的親和力、動力學常數等信息。

本實施例藉由Biacore(GE Healthcare，T200)測定抗PD-L1/OX40雙特異性抗體的K_D，具體方法如下：抗體被抗人Fc抗體捕獲到芯片之後，藉由檢測抗原與被捕獲的抗體之間的結合與解離獲得親和力及動力學常數。該方法包括芯片製備和親和力檢測。測定過程使用10倍稀釋後的10×HBS-EP+(BR-1006-69,GE Healthcare)作為實驗緩衝液。芯片製備過程使用胺基偶聯試劑盒(BR-1006-33,GE Healthcare)，將其中的抗人Fc抗體偶聯在CM5芯片(29-1496-03,GE Healthcare)表面，具體過程為：首先將50mM N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)與200mM 1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)新鮮混勻並注入芯片雙通道，活化7分鐘。然後將抗人Fc抗體稀釋於10mM Acetate(pH 5.0)中，注入CM5芯片雙通道，使蛋白共價偶聯在芯片通道表面，偶聯高度約6000 RU。最後注入1M乙醇胺，對剩餘的活化位點進行封閉7分鐘。親和力檢測每個循環包括捕獲抗體、結合一種濃度抗原及芯片再生：

捕獲抗體：首先將如實施例2製備並純化的抗體稀釋為0.5μg/mL，以10μL/min的流速，捕獲在CM5芯片第二通道，捕獲時間30s。

結合抗原：根據SPR的最佳濃度範圍，使用實驗緩衝液，將兩倍梯度稀釋後的抗原(介於0.15nM-20nM)(人PD-L1(ACRO，PD1-H5229)、人OX40(ACRO，OXO-H5224))，從低濃度到高濃度的順序，注入CM5芯片雙通道，結合時間180s，解離時間600s。

芯片再生：在進行下一個抗體測定前，使用10mM Glycine pH 1.5(BR-1003-54,GE Healthcare)對芯片進行再生。

數據結果使用1：1結合模型進行動力學的分析。

檢測結果如表1及表2所示，本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體可以和人PD-L1及人OX40蛋白結合，且維持了親本抗體ADI-20057和抗PD-L1人源化Nb-Fc與各相應抗原的親和力常數。

表1.藉由SPR測定法確定的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體對人OX40的親和力

表2.藉由SPR測定法確定的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體對人PD-L1的親和力

實施例3.2.測定抗PD-L1/OX40雙特異性抗體與猴抗原的親和力ForteBio測定

本實施例利用Octet Red96系統(ForteBio公司生產)，藉由動力學結合測定法確定本發明的上述示例性抗PD-L1/OX40雙特異性抗體結合OX40和PD-L1的平衡解離常數(K_D)。按照文獻中報導的方法(Estep,P等人，High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013，5(2)：p.270-278)進行ForteBio親和力測定。實驗過程如下：

1)準備傳感器：實驗開始前半個小時，根據樣品數量，取合適數量的AHQ傳感器(Pall，1506091)浸泡於SD buffer(PBS 1×，BSA 0.1%，Tween-20 0.05%)中預濕20分鐘；

2)實驗過程：向96孔黑色聚苯乙烯半量微孔板(Greiner)的孔中分別加入100μl的SD緩衝液作為空白對照(用於扣除背景)、100μl 100nM純化的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體和作為對照的抗PD-L1人源化Nb-Fc抗體、抗OX40抗體抗體ADI-20057、100μl稀釋於SD緩衝液中作為抗原的猴PD-L1(ACRO，PD1-C52H4)、猴OX40(ACRO，OX0-C5220)的溶液。將抗人IgG Fc生物傳感器AHQ浸沒於分別含所述抗體溶液的孔中，在室溫浸沒600秒上樣。隨後將傳感 器在SD緩衝液中洗滌至達到基線，然後浸沒於含100ul抗原溶液的孔中，監測抗體與抗原的結合。隨後將傳感器轉移至含有100ul SD緩衝液的孔，監測抗體解離(設置運行步驟及時間：Baseline、Loading~1nm、Baseline、Association和Dissociation時間取決於樣品結合、解離速度)。轉速為400轉/分鐘，溫度為30℃。藉由Octet分析軟體(ForteBio)擬合經背景校正的結合曲線和解離曲線，產生結合(K_on)和解離(k_dis)速率常數，它們隨後用來計算平衡解離常數(K_D)。

檢測結果如表3和表4示，本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體可以和猴PD-L1及猴OX40結合，且維持了親本抗體ADI-20057和抗PD-L1人源化Nb-Fc與各相應抗原的親和力常數。

表3.藉由ForteBio動力學結合測定法確定的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體對猴OX40的結合親和力

表4.藉由ForteBio動力學結合測定法確定的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體對猴PD-L1的結合親和力

實施例3.3.本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體與過量表達人OX40或人PD-L1的CHO細胞的結合分析

為了驗證本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體是否可以和細胞表面表達的抗原相結合，本實施例利用流式細胞技術檢測了抗PD-L1/OX40雙特異性抗體和過表達人OX40或人PD-L1的CHO細胞的結合，實驗過程如下：

1)細胞準備：將攜帶純株至多選殖位點MCS的人OX40 cDNA(SinoBiological Inc)的pCHO1.0載體(Invitrogen)轉染至中國倉鼠卵巢癌細胞(CHO)(Invitrogen)，經壓力篩選獲得穩定表達人OX40的CHO細胞(CHO-OX40細胞)，將攜帶純株至多選殖位點MCS的人PD-L1 cDNA(SinoBiological Inc)的pCHO1.0載體(Invitrogen)轉染至中國倉鼠卵巢癌細胞(CHO)(Invitrogen)，經壓力篩選獲得穩定表達人PD-L1的CHO細胞(CHO-PD-L1細胞)，將CHO-PD-L1/CHO-OX40細胞計數，並稀釋至2×10⁶個細胞/ml，向U型底96孔板中加入100μl/孔；

2)檢測步驟：400g，5min，離心，去除細胞培養基。將梯度稀釋的樣品(雙特異性抗體、抗PD-L1抗體及抗OX40抗體)加入U型板並重懸細胞，每孔加100μl，冰上靜置30min。400g，5min去除上清，PBS洗細胞1遍移除未結合的抗體。400g，5min去除PBS，每孔加入100μl 1：200稀釋的PE-抗人Fc抗體(SOUTHERN BIOTECH,2040-09)。冰上避光孵育30min。400g，5min去除上清，PBS洗細胞1遍，移除未綴合的抗體。用100μl PBS重懸細胞，流式細胞儀(BD，ACCURIC6)檢測抗體與細胞的結合。

檢測結果如第3圖所示，本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體能夠和細胞表面的表達的人OX40結合，結合EC50為8.463nM，和親本抗OX40抗體ADI-20057的結合能力(EC50為4.710nM)相似。如第4圖所示，本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體能夠和細胞表面的表達的人PD-L1結合，結合EC50為8.732nM，和親本抗體抗PD-L1人源化Nb-Fc的結合能力(EC50為9.651nM)相似。

實施例3.4.本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體同時結合過量表達人OX40的CHO細胞和過量表達人PD-L1的CHO細胞的分析

為了驗證本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體是否可以同時與來自不同細胞上的靶抗原結合，本實施例利用流式細胞技術，檢測了雙特異性抗體誘導的不同細胞交聯情況。具體實驗過程如下：

1)將如實施例3.3所述獲得的CHO-PD-L1和CHO-OX40細胞經400g，離心5min去除培養基，PBS洗一遍，再用PBS重懸細胞，計數後，調整細胞密度為2×10⁶個/ml；將CHO-PD-L1和CHO-OX40細胞分別按照1：5000加入 CellTraclker^TM Deep Red(Thermo,C34565)和Cell Trace CFSE(Invitrogen,C34554)染料，於37℃放置30分鐘。400g離心5min後，去掉上清，用PBS洗一次細胞；

2)將梯度稀釋的樣品(雙特異性抗體、抗PD-L1抗體及抗OX40抗體和IgG2對照(序列見序列表))分別加入U型底96孔板和染色後的CHO-PD-L1細胞，混合(細胞終密度為1.5×10⁶個/ml)。將U型底96孔板於4℃放置30min後取出，400g，離心5min，PBS洗四次，並用PBS重懸細胞；

3)向2)中的上述細胞中加入上述1)中染色後的CHO-OX40細胞(細胞終密度為1×10⁶個/ml)，於室溫放置1小時後進行流式細胞儀(BD，ACCURIC6)檢測。通道2及通道4雙陽性細胞的比例可反映出由抗PD-L1/OX40雙特異性抗體引起的細胞交聯情況。

FACS檢測結果如第5圖所示，本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體能夠誘導CHO-PD-L1細胞和CHO-OX40細胞的交聯，由此表明本發明的雙特異性抗體能夠同時結合來自不同細胞表面的靶抗原。

實施例4本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體的人T細胞結合檢測

為了驗證本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體是否可以和人T細胞相結合，本實施例利用流式細胞技術檢測了抗PD-L1/OX40雙特異性抗體和人T細胞的結合能力，實驗過程如下：

1)細胞準備：復蘇人的PBMC細胞(ALLCELLS，PB005F)，使用Human T cell enrichment kit(STEMCELL，19051)分離出CD4+細胞，按照CD4+：anti-CD3/CD28 Beads=1：1加入Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Gibco，11131D)，刺激3天；

2)檢測步驟：將1)中的細胞培養物進行400g，5min，離心，去除細胞培養基，用PBS重懸細胞，計數後，調整細胞密度為2×10⁶個/ml，向U型底96孔板中加入100μl/孔。將梯度稀釋的樣品(抗PD-L1/OX40雙特異性抗體、ADI-20057和IgG2對照)加入U型板，並混勻，每孔加100μl，冰上靜置30min。400g，5min離心去除上清，PBS洗細胞1遍。400g，5min離心去除PBS，每孔加入100μl 1：200稀釋的PE-抗人Fc抗體(SOUTHERN BIOTECH,2040-09)。冰上避光孵育30min。400g，5min離心去除上清，PBS洗細胞1遍。用100μl PBS重懸細胞，流式細胞儀(BD，ACCURIC6)檢測。

檢測結果如第6圖所示，本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體能夠和人T細胞結合，結合EC50為4.062nM，和親本抗OX40抗體ADI-20057的結合能力(EC50為2.571nM)相似。

實施例5本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體的加速穩定性檢測

為了確認雙特異性抗體的穩定性，本實施例藉由檢測製備的一批抗體在40℃放置0、1、3、7、10、20、30天之後的純度的變化，從而評價了抗體的長期熱穩定性。實驗方法如下：

1、濃縮前述獲得的抗體樣品至10mg/ml(溶於PBS中)，分裝於EP管中，200μl/管，避光置於40℃。

2、在第0、1、3、7、10、20、30天各取一管利用大小排阻層析(size exclusion chromatography；SEC)檢測其單體主峰純度。

實驗結果如表5所示。本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體在40℃放置30天，其單體主峰比例降低幅度僅為1.28%。結果表明，本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體具有較好的穩定性，適合用於後期開發。

表5.雙特異性抗體40℃培養時單體主峰比例變化

實施例6本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體的T _m 檢測

差示掃描螢光法(DSF)可根據圖譜中的螢光變化過程提供有關結構穩定性的信息，檢測蛋白的構型變化。螢光曲線絕對值最大時對應的溫度為該蛋白的Tm。本實施例利用DSF法，測定了本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體的T_m值，實驗過程如下：

1)用PBS稀釋前述製備的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體樣品至1mg/ml。用PBS將SYPRO Orange蛋白凝膠染色(GIBCO，S6650)稀釋50倍，即4μl SYPRO Orange蛋白凝膠染色母液加196μl PBS；

2)在96孔PCR板中加樣：50μl稀釋後抗體樣品+10μl SYPRO Orange蛋白凝膠染色稀釋液(步驟1)中獲得的)+40μl水。置於7500real time PCR system(Applied Biosystems，AB/7500)進行檢測。

實驗結果如表6和第7圖所示，本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體的Tm大於60℃，適合用於後期開發。

表6.雙特異性抗體Tm值測定結果

實施例7基於螢光素酶報告基因檢測抗PD-L1/OX40雙特異性抗體的抗PD-L1活性

為了確定抗PD-L1/OX40雙特異性抗體是否可以解除對PD-1/PD-L1相互作用對NFAT信號通路的抑制作用，本實施例使用螢光素酶報告基因檢測細胞株(Promega,CS187109)，藉由檢測螢光素酶的表達反應出雙特異性抗體對PD-1/PD-L1相互作用的抑制能力，詳細實驗過程如下：

考慮到對抗體的探索應該建立在對其作用機制(mechanisms of action；MOA)的瞭解和生物學活性的基礎上，本實施例使用PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay,Cell Propagation Model(Promega公司)，研究了本發明的雙特異性抗體的抗PD-L1生物學活性。

Promega公司的PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay是一種生物學相關的基於MOA的測定法，用於測定能夠阻斷PD-1/PD-L1相互作用的抗體的效力和穩定性。該測定法由兩種基因工程細胞系組成：

˙PD-1效應細胞：穩定表達人PD-1和由活化的T細胞的核因子(nuclear factor of activated T cells；NFAT)誘導表達螢光素酶的Jurkat T細胞。

˙PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞：穩定表達人PD-L1和以抗原非依賴性方式活化相應TCR的細胞表面蛋白的CHO-K1細胞。

PD-1與PD-L1結合可以阻斷NFAT下游信號的轉導，從而抑制螢光素酶的表達，當加入PD-1抗體或者PD-L1抗體時，這種阻斷效應被反轉，螢光素酶表達，從而檢測到螢光信號。該檢測法靈敏度、特異性、準確度都很好，且穩定性很好。

根據製造商的產品說明書進行檢測。

1)活性檢測前一天鋪PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞：棄培養上清，PBS清洗一次，加入適量胰酶(Gibco,25200072)，37℃，5% CO₂孵育3-5min，用四倍體積的含10% FBS(HyClone,SH30084.03)的RPMI1640(Gibco,22400-071)培養基終止消化，收集細胞，取少量細胞混合液測定細胞濃度，取所需體積細胞，400g，離心10min，棄上清，含10% FBS(HyClone,SH30084.03)的RPMI1640(Gibco,22400-071)培養基作為assay buffer重懸細胞，使得細胞密度為4×10⁵個細胞/ml。將細胞加入96孔白色細胞培養板(Nunclon，136101)100μL/孔，邊孔加入PBS，200μl/孔。細胞於二氧化碳培養箱中37℃，5% CO₂培養箱中培養過夜；

2)取無菌96孔板(Nunclon，442404)，待測樣品(抗PD-L1/OX40雙特異性抗體、抗PD-L1人源化Nb-Fc和IgG2對照)稀釋為400nM為起始濃度，第二個濃度點2至第10濃度點3倍連續稀釋，共12個濃度點；

3)取PD-1效應細胞，計數，400g，離心5min，用assay buffer重懸細胞，使得細胞濃度為1.25×10⁶個細胞/ml，取96白色細胞培養板(NUNC，136101)，每孔加入100μl細胞；

4)從培養箱中取出步驟1)中的白色細胞培養板，棄95μl/孔，依次加入步驟2)中稀釋好的抗體40μl以及步驟3)中的Jurkat/PD-1細胞，每孔40μl；

5)將步驟4)中獲得的培養板於二氧化碳培養箱中37℃，5% CO₂培養條件下培養6小時；

6)取出步驟5)中的白色細胞培養板，室溫靜置5-10min；

7)將Bio-Glo^TM緩衝液(Promega，G7940)融化，加入Bio-Glo^TM受質(Promega，G7940)，混勻。將所獲得的Bio-Glo^TM試劑以80μl/孔加入上述培養6小時後的檢測板(步驟6)中獲得的)的孔中。室溫放置5至10分鐘；

8)用Spectra Max I3酶標儀(Thermo，Maxi3)，收集全波長化學發光，每孔收集時間為1000ms。

實驗結果如第8圖所示，本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體可以有效解除PD1/PD-L1相互作用對NFAT信號通路的阻斷效應，且活性與抗PD-L1人源化Nb-Fc相似(抗PD-L1/OX40雙特異性抗體的EC50為0.4085，抗PD-L1人源化Nb-Fc的EC50為0.4271)。

實施例8本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體對人OX40配體與CHO細胞上的人OX40相互作用的不阻斷

為了驗證本發明的雙特異性抗體是否阻斷人OX40配體與人OX40結合，本實施例利用流式細胞技術檢測了雙特異性抗體不阻斷人OX40配體與表達人OX40的CHO細胞結合的能力，實驗過程如下：

1)對Human OX40 Ligand Fc Tag(ACRO，OXL-H526X-1MG)的生物素標記按照EZ-Link Sulfo-NHS-LC-BiotinNoWeighFormat(PIERCE，21327)使用說明書操作，以及脫鹽按照2ml Zeba^TM離心式脫鹽柱(PIERCE，89890)使用說明書操作；

2)細胞準備：吸取實施例3.3所獲得的CHO-OX40細胞到50ml離心管中，血球計數板計數，取2.4×10⁷個細胞/ml於新的50ml離心管中，400g，5min，離心，去除上清，用20ml PBS重懸細胞後，再次離心5分鐘，去除上清，用5ml PBS重懸細胞；

3)將2)中處理好的CHO-OX40細胞每孔50μl加入到96孔U底血凝板中備用；

4)梯度濃度樣品溶液配製：將3.2ml PBS加入生物素標記的Human OX40 Ligand Fc Tag(Biotin-Human OX40 Ligand Fc Tag)96μl，混勻，配置成Biotin-Human OX40 Ligand Fc Tag PBS混合液。用Biotin-Human OX40 Ligand Fc Tag PBS混合液將抗體樣品(抗PD-L1/OX40雙特異性抗體、ADI-20057、Pogalizumab和IgG2對照)稀釋，以2000nM為起始濃度，後面11個濃度點3倍連續稀釋，共12個濃度點；

5)將配置好的梯度濃度樣品按每孔50μl加入到3)中獲得的96孔U底血凝板中，混勻，4℃，孵育30分鐘；

6)將5)中獲得的細胞培養物400g，5min，離心，去除上清，每孔加入150μl PBS，之後再400g，5min，離心，去除上清，反復重複三次；

7)將6)中獲得的96孔U底血凝板每孔加入1：200稀釋的Streptavidin-R-phycoerythrin(SAPE)(THERMO，S21388)100μl，4℃，30min；

8)向7)中獲得的96孔U底血凝板每孔加入150μl PBS，400g，5min，離心，去除上清，反復重複兩次；

9)將8)中獲得的96孔U底血凝板中的細胞用100μl PBS重懸，細胞流式儀(BD，ACCURIC6)檢測。

檢測結果如第9圖所示，在所述實驗中，Pogalizumab在大於約1nM或更高的濃度下容易的阻斷了人OX40配體與OX40的結合，然而我們發現本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體並未顯示出阻斷效應，類似於IgG對照。

實施例9基於螢光素酶報告基因的檢測抗PD-L1/OX40雙特異性抗體的OX40阻斷測定法

可以藉由測量抗體阻斷OX40配體介導的OX40活化的性能來評估本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體的非阻斷活性。

測量NFkB介導的轉錄活化來評估本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體的抗OX40抗體的激活劑活性。用Anti-HumanCD3(BD，555329)，Anti-Human CD28(BD，555725)加上溶液中的抗體活化過表達人OX40(購自Sino)和NFkB-螢光素酶構建體(NFkB啟動子-luc，Promega)的Jurkat細胞(美國ATCC)(Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep)，然後加入Bio-Glo^TM試劑顯色。具體實驗過程如下：

溶液配製：(1)Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep細胞完全培養基：RPIM-1640(90%)(Gibco，22400-071)，FBS(10%)(HyClone，SH30084.03)，Hygromycin B(200μg/ml)(INVITROGEN，10687010)，Puromycin(2μg/ml)(GBICO，A11138-02)；

(2)分析緩衝液A：RPIM-1640(90%)，FBS(10%)，Anti-Human CD3(4μg/ml)，Anti-Human CD28(16μg/ml)，20μg/ml Human OX40 Ligand Fc Tag，現配現用；

(3)分析緩衝液B：RPIM-1640(90%)，FBS(10%)，Anti-Human CD3(4μg/ml)，Anti-Human CD28(16μg/ml)，現配現用。

實驗步驟：

1)Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep細胞處理：取對數生長期的Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep細胞計數，400g，離心5min，用完全培養基重懸細胞並調整細胞密度至8×10⁶個/ml備用；

2)梯度濃度樣品溶液配製：用處理好的分析緩衝液A將待測抗體樣品和對照稀釋為200nM為起始濃度，第二個濃度點2至第10濃度點3倍連續稀釋，共9個濃度點。用處理好的分析緩衝液B作為對照組；

3)加樣：在白色不透明細胞培養板中每孔加入1)中處理好的細胞懸液50μl以及2)中稀釋好的抗體樣品50μl以及對照樣品50μl，將細胞板置於二氧化碳培養箱中37℃，5% CO₂條件下培養12小時；

4)顯色：將Bio-Glo^TM緩衝液(Promega，G7940)融化，加入Bio-Glo^TM受質(Promega，G7940)，混勻，獲得Bio-Glo^TM檢測試劑。將所獲得的Bio-GloTM檢測試劑以80μl/孔加入上述3)中培養12小時後的檢測板的孔中。室溫放置5至10分鐘，讀取螢光信號值。

5)讀板：用Spectra Max I3酶標儀(Thermo，Max i3)，收集全波長化學發光，每孔收集時間為1000ms。

實驗結果如第10圖所示，Pogalizumab在大於約0.4nM或更高的濃度下容易阻斷基於OX40配體介導的OX40信號通路的激活。然而我們驚奇的 發現，本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體及其親本抗OX40抗體增加了螢光素酶的水平，表明其具有非OX40配體阻斷屬性並且對OX40受體聚集具有貢獻。

本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體有效增強OX40配體介導的OX40信號通路激活作用，EC50=1.993nM，且與親本抗OX40抗體的活化效果相似(EC50=2.326nM)。

實施例10基於螢光素酶報告基因法檢測抗PD-L1/OX40雙特異性抗體對OX40介導的信號通路的激活作用

為了檢測雙特異性抗體的體外生物學活性，本實施例使用信達生物製藥(蘇州)有限公司的Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep穩定細胞株(構建過程見實施例9)，藉由加入Raji細胞(ATCC，CCL-86TM)增強OX40特異性抗體的激活作用，同時在細胞反應體系中加入Anti-Human CD3(BD，555329)和Anti-Human CD28(BD，555725)，由此激活下游NFκB螢光素酶報告基因的表達，然後加入螢光素酶的受質裂解細胞並產生螢光，藉由螢光的強弱來反映抗OX40抗體的生物學活性。

詳細實驗過程如下：

溶液配製：(1)Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep細胞完全培養基：RPIM-1640(90%)(Gibco，22400-071)，FBS(10%)(HyClone，SH30084.03)，Hygromycin B(200μg/ml)(INVITROGEN，10687010)，Puromycin(2μg/ml)(GBICO，A11138-02)；

(2)分析緩衝液：RPIM-1640(90%)，FBS(10%)，Anti-Human CD3(10μg/ml)(BD，555329)，Anti-Human CD28(10μg/ml)(BD，555725)，現配現用；

(3)Raji完全培養基：RPIM-1640(90%)(Gibco，22400-071)，FBS(10%)(HyClone，SH30084.03)。

實驗步驟：

1)Raji細胞處理：取Raji細胞計數，400g，離心5min，用分析緩衝液重懸細胞並調整細胞密度至2.0×10⁶個/ml備用；

2)將處理的1)中獲得Raji細胞按照實驗佈局25μl/孔加入到白色不透明細胞培養板中，之後將處理的Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep細胞(步驟同實施例9實驗步驟1))按照實驗佈局25μl/孔加入到上述白色不透明細胞培養板中，輕輕水平搖勻，放置於37℃，5% CO₂培養箱中備用；

3)梯度濃度樣品溶液配製：用分析緩衝液將抗體樣品(抗PD-L1/OX40雙特異性抗體、ADI-20057和IgG2對照)稀釋，以800nM為起始濃度，第二個濃度點2至第12濃度點3倍連續稀釋，共12個濃度點；

4)加樣：樣品組設置3個複孔，將各個濃度樣品(50μl)分別加入到2)中獲得的白色不透明細胞培養板中(每個濃度樣品一式三份加入)，將細胞板置於二氧化碳培養箱中37℃，5% CO₂條件下培養16小時；

5)顯色：將Bio-Glo^TM緩衝液(Promega，G7940)融化，加入Bio-Glo^TM受質(Promega，G7940)，混勻獲得Bio-Glo^TM檢測試劑。將所獲得的Bio-Glo^TM檢測試劑以80μl/孔加入上述培養16小時後的4)中獲得的檢測板的孔中。室溫放置5至10分鐘，讀取螢光信號值。

6)讀板：用Spectra Max I3酶標儀(Thermo，Max i3)，收集全波長化學發光，每孔收集時間為1000ms。

結果如第11圖所示，本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體可以激活OX40信號通路，激活EC50=0.6712nM，且與親本的激活效果(EC50=0.1455nM)相似。

實施例11本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體介導PD-L1依賴的激活OX40介導的信號通路的檢測

實施例11.1本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體在高表達PD-L1 Raji細胞存在的情況下激活OX40介導的信號通路生物活性

為了檢測本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體在高表達PD-L1Raji細胞存在的情況下，激活OX40介導的信號通路生物活性。將攜帶克隆至多克隆位點MCS的人PD-L1 cDNA(Sino Biological)的pCHO1.0載體(Invitrogen)轉染入Raji(ATCC，CCL-86TM)宿主細胞，經壓力篩選獲得穩定表達人PD-L1的Raji細胞(Raji-PD-L1細胞)。本實施例利用該細胞株檢測了抗PD-L1/OX40雙特異性抗體在Raji-PD-L1存在的情況下對OX40下游的NFkB信號通路的特異性激活作用。

溶液配製：(1)Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep細胞完全培養基：RPIM-1640(90%)，FBS(10%)，Hygromycin B(200μg/ml)，Puromycin(2μg/ml)。

(2)分析緩衝液：RPIM-1640(90%)，FBS(10%)，現配現用。

(3)Raji完全培養基：RPIM-1640(90%)，FBS(10%)。

實驗步驟：

1)取少量細胞懸液，用細胞計數板測定細胞密度，對細胞培養物進行400g，離心10min，去掉上清，加入分析緩衝液溫和的重懸細胞，將Jurkat-OX40-NFkB- Luc-Rep細胞密度調整至4×10⁵個細胞/ml；將Raji細胞密度調整至1.2×10⁵個細胞/ml；將Raji-PD-L1細胞密度1.2×10⁵個細胞/ml；

2)將1)中獲得的細胞懸液移置加樣槽中，取96孔白色細胞培養板。第一孔加入66.5μL的1)中處理好的Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep(構建過程見實施例9)和Raji細胞懸液(或Raji-PD-L1細胞懸液)，第二孔至第十二孔加入50μL的1)中處理好的Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep細胞和Raji細胞懸液(或Raji-PD-L1)；

3)加樣：第一孔加入待測抗體，稀釋為25nM為起始濃度，第二個濃度點2至第12濃度點4倍連續稀釋，共12個濃度點；

4)將細胞板置於二氧化碳培養箱中37℃，5% CO₂條件下培養16小時；

5)將Bio-Glo^TM緩衝液(Promega，G7940)融化，加入Bio-Glo^TM檢測受質(Promega，G7940)，混勻獲得。將所獲得的Bio-Glo^TM檢測試劑以80μl/孔加入上述培養16小時後的檢測板的孔中。室溫放置5至10分鐘，用Spectra Max I3酶標儀(Thermo，Max i3)，收集全波長化學發光，每孔收集時間為1000ms。

實驗結果見第12圖和第13圖。如第12圖所示，在沒有PD-L1表達的細胞反應體系中，本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體與抗OX40抗體(ADI-20057)單獨使用、抗PD-L1抗體(抗PD-L1人源化Nb-Fc)單獨使用、抗OX40抗體(ADI-20057)和抗PD-L1抗體(抗PD-L1人源化Nb-Fc)聯合使用，均無法激活OX40下游的NFkB信號通路。

然而我們驚奇的發現，在有PD-L1表達的細胞體系中(實驗結果如第13圖所示)，本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體具有比抗OX40抗體、抗PD-L1抗體單獨使用、抗OX40抗體和抗PD-L1抗體聯合使用、Pogalizumab相比更加顯著的NFkB信號通路的激活作用。本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性 抗體顯示出了在PD-L1表達的細胞存在的情況下，能夠更好的激活OX40下游的NFkB信號通路。

實施例11.2本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體在腫瘤細胞存在的情況下對OX40下游的NFkB信號通路的特異性的激活作用

人體內腫瘤細胞表面表達PD-L1蛋白，大多數抗PD-L1單株抗體會結合到腫瘤細胞上。本實施例將信達生物製藥(蘇州)有限公司的Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep細胞株(構建過程見實施例9)和腫瘤細胞NCI-H292人肺癌細胞(ATCC，CRL-1848)共同孵育，檢測了本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體在腫瘤細胞存在的情況下是否具有對OX40下游的NFkB信號通路的特異性的激活作用。具體實驗過程如下：

溶液配製：(1)Jurkat-OX40-NFκB-luc細胞完全培養基：RPIM-1640(90%)，FBS(10%)，Hygromycin B(200μg/ml)，Puromycin(2μg/ml)。

(2)分析緩衝液：RPIM-1640(90%)，FBS(10%)，現配現用。

(3)NCI-H292人肺癌細胞完全培養基：RPIM-1640(90%)，FBS(10%)。

實驗步驟：

1)NCI-H292人肺癌細胞處理：取NCI-H292細胞計數，1000rpm/min離心5min，用分析緩衝液重懸細胞並調整細胞密度至1.6×10⁶個/ml備用；

2)Jurkat-OX40-NFκB-luc細胞處理：取對數生長期的Jurkat-OX40-NFκB-luc細胞計數，400g，離心5min，用分析緩衝液重懸細胞並調整細胞密度至0.8×10⁶個/ml備用；

3)將處理的NCI-H292人肺癌細胞按照實驗佈局25μl/孔加入到白色不透明細胞培養板中，之後將處理的Jurkat-OX40-NFκB-luc細胞按照實驗佈局25μl/孔 加入到上述白色不透明細胞培養板中，輕輕水平搖勻，放置於37℃，5% CO₂培養箱中備用；

4)梯度濃度樣品溶液配製：用分析緩衝液將抗體樣品(如前所述製備的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體、ADI-20057、抗PD-L1人源化Nb-Fc、ADI-20057+抗PD-L1人源化Nb-Fc)稀釋為20nM為起始濃度，第二個濃度點2至第12濃度點3倍連續稀釋，共12個濃度點；

5)加樣：樣品組設置3個複孔，將各個濃度樣品(50μl)分別加入到3)中獲得白色不透明細胞培養板中(每個濃度樣品孔一式三份)，將細胞板置於二氧化碳培養箱中37℃，5% CO₂條件下培養16小時；

6)顯色：將Bio-Glo^TM緩衝液(Promega，G7940)融化，加入Bio-Glo^TM受質(Promega，G7940)，混勻獲得Bio-Glo^TM檢測試劑。將所獲得的Bio-Glo^TM檢測試劑以80μl/孔加入上述培養16小時後的檢測板的孔中。室溫放置5至10分鐘，用Spectra Max I3酶標儀(Thermo，Max i3)，收集全波長化學發光，每孔收集時間為1000ms。

實驗結果如第14圖所示，在NCI-H292人肺癌細胞的細胞反應體系中，抗OX40抗體(ADI-20057)單獨使用、抗PD-L1抗體(抗PD-L1人源化Nb-Fc)單獨使用、抗OX40抗體和抗PD-L1抗體聯合(ADI-20057+抗PD-L1人源化Nb-Fc)使用，均無法激活OX40下游的NFkB信號通路。然而我們驚奇的發現，本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體具有比抗OX40抗體、抗PD-L1抗體單獨使用、抗OX40抗體和抗PD-L1抗體聯合使用更加顯著的NFkB信號通路的激活作用。雙特異性抗體在天然表達PD-L1的腫瘤細胞存在的情況下，能夠更好的激活OX40下游的NFkB信號通路能力。

實施例12本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體對人T細胞的激活作用檢測

為了檢測雙特異性抗體的體外生物學活性，本實施例檢測了在體外，雙特異性抗體對人T細胞的激活作用，詳細實驗過程如下：

復蘇人的PBMC細胞(ALLCELLS，PB005F)，靜置3小時貼壁後即為單核細胞，添加10ml AIM V® Medium CTS(GIBCO，A3021002)培養基，加入IL4(20ng/ml)(R&D，204-IL)，GM-CSF(10ng/ml)(R&D，215-GM)誘導單核細胞分化為DC細胞，培養至第5天，向細胞培養物中添加誘導DC成熟的細胞因子TNFα(1000U/ml,10ng/ml)(R&D，210-TA)，RhIL-1β(5ng/ml)(R&D，201-LB)，RhIL-6(10ng/ml)(R&D，206-IL)，1μM PGE(Tocris，2296)，二氧化碳培養箱中37℃，5% CO₂培養條件下繼續培養2天，作為淋巴細胞混合反應(MLR)的成熟DC細胞(moDC)；

復蘇人的PBMC細胞(ALLCELLS，PB005F)，按照Human CD4+T細胞enrichment kit(STEMCELL，19052)的說明書，實施CD4+細胞分離。簡而言之，上述將PBMC靜置培養2小時後吸取的懸浮細胞液置於20ml離心管中，300g離心10分鐘，向細胞沉澱物中加入500μl試劑盒中配備的分離液和100μl試劑盒中配備的純化抗體，4℃孵育20分鐘，用分離液清洗一次，再加入500μl試劑盒中配備的珠緩衝液孵育15分鐘，磁場去除珠，用AIM V® Medium CTS(GIBCO，A3021002)培養基洗一次，使用8m lAIM V® Medium CTS(GIBCO，A3021002)培養基，37℃、5% CO₂培養獲得的CD4+細胞。按照CD4+：anti-CD3/CD28 Beads=1：1加入Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 (INVITROGEN，11131D)，二氧化碳培養箱中37℃，5% CO₂培養條件下培養3天，對CD4+細胞實施珠刺激；

將上述分離的成熟DC細胞與經珠刺激的CD4+細胞混合，每孔體積200μl，DC細胞12000個，CD4+細胞120000個，加入Staphylococcal enterotoxin E超抗原(Toxin technology，ET404)，1ng/ml，加入抗體樣品(如前所述製備的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體、ADI-20057、抗PD-L1人源化Nb-Fc、ADI-20057+抗PD-L1人源化Nb-Fc和IgG2對照)，100nM為起始濃度，3倍稀釋，共十個濃度點。混合培養3天，使用根據cisbio IL2檢測試劑盒(CISBIO，62HIL02PEG)檢測每個樣品中的IL2表達量，不同抗體IL2表達量反應了對T細胞的激活能力。

結果如第15圖所示，本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體可以在體外激活T細胞，其激活效果比抗OX40抗體(ADI-20057)、抗PD-L1抗體(抗PD-L1人源化Nb-Fc)單獨使用、抗OX40抗體和抗PD-L1抗體聯合(ADI-20057+抗PD-L1人源化Nb-Fc)使用更強。

實施例13本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體的體內抗腫瘤作用

實施例13.1.本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體在LoVo細胞荷瘤的NPG小鼠模型體內抗腫瘤作用

在本實施例中，藉由使用LoVo(ATCC，CAT# CCL-229TM)細胞與PBMC(All Cells，PB005F)細胞混合接種NPG小鼠來產生荷瘤小鼠，並測定了本發明的抗OX40/PD-L1雙特異抗體的抗腫瘤作用。

NPG小鼠：

雌性NPG小鼠(18g/35天齡)購自北京維通達實驗動物技術有限公司。等級為SPF級，數量為75隻，質檢單位為北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證編號為NO.11806300011459。所述小鼠在到達後馴化檢疫7天，隨後開始研究。

培養細胞和接種小鼠：

細胞：LoVo：ATCC CAT# CCL-229TM Lot# 60380843

PBMC：All Cells Lot# 3000417

將LoVo細胞進行常規傳代培養用於後續體內實驗。提前一天復蘇PBMC細胞，第二天離心收集PBMC細胞懸液。LoVo細胞進行常規傳代培養用於後續體內實驗，離心收集細胞，以PBS(1×)分散LoVo細胞。將LoVo細胞與PBMC細胞4：1混合，以PBS(1×)分散，即LoVo細胞密度為12.5×10⁶個/ml，PBMC細胞密度為3.125×10⁶個/ml。小鼠右側背部剃毛，在第0天取0.2ml混合細胞懸液皮下接種至NPG小鼠右側腹部區域中來建立LoVo荷瘤人源化小鼠模型。

給藥：腫瘤細胞接種3天後隨機分組(每組5-7隻小鼠)，給藥劑量和方式如表7所示，使用h-IgG(購自Equitech-Bio)作為陰性對照。分別在接種後第3、7、10、14天給藥，每週2次監測小鼠瘤體積與體重。監測至31天後結束。h-IgG對照組給藥前腫瘤平均體積為46mm³。接種後第28天計算相對腫瘤抑制率(TGI%)，計算公式如下：TGI%=100%×(h-IgG對照組腫瘤體積-治療組腫瘤體積)/(h-IgG對照組腫瘤體積-h-IgG對照組初始腫瘤體積)。

腫瘤體積測定：採用遊標卡尺測定腫瘤的最大長軸(L)和最大寬軸(W)，腫瘤體積按如下公式計算：V=L×W²/2。採用電子天平測定體重。在整個研 究期間，當腫瘤達到端點(腫瘤體積>3000mm³)時或當小鼠具有>20%體重減輕時，使小鼠安樂死。

表7.實驗設計表

實驗結果見第16圖和第17圖和表8可見本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體的腫瘤抑制效果明顯優於單抗(抗PD-L1人源化Nb-Fc，ADI-20057)以及抗PD-L1人源化Nb-Fc與ADI-20057的聯合用藥。

表8.第28天腫瘤抑制率

實施例13.2.本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體在NCI-H292細胞荷瘤的NOG小鼠模型體內抗腫瘤作用

本實施例採用PBMC細胞接種後，再用NCI-H292細胞(ATCC，CRL-1848)接種NOG小鼠，測定本發明的抗PD-L1/OX40雙特異性抗體的抗腫瘤作用。

NOG小鼠：雌性NOG小鼠(15-18g)購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。等級為SPF級，數量110隻，質檢單位為北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證編號為NO.11400700339672小鼠在到達後馴化7天，隨後開始研究。

將NCI-H292細胞進行常規傳代培養用於後續體內實驗。復蘇PBMC細胞(All Cells，PB005F)，離心收集PBMC細胞懸液，以PBS(1×)分散PBMC細胞，製備成細胞濃度為12.5×10⁶個/ml細胞懸液。在第0天取0.2ml細胞懸液皮下接種至NOG小鼠眼眶靜脈。在第5天離心收集NCI-H292細胞，以PBS(1×)分散NCI-H292細胞，製備成細胞濃度為25×10⁶個/ml細胞懸液。取0.2ml細胞懸液皮下接種至NOG小鼠右側腹部區域中來建立NCI-H292荷瘤小鼠模型。

給藥：

腫瘤細胞接種1天後隨機分組(每組5-9隻小鼠)分組，給藥劑量和方式如表9所示，h-IgG(購自Equitech-Bio)作為陰性對照，分別在接種後第1、4、8、11天給藥，每週2次監測小鼠瘤體積與體重。監測至26天後結束。接種後第25天計算相對腫瘤抑制率(TGI%)，計算公式如下：TGI%=100%×(h-IgG對照組腫瘤體積-治療組腫瘤體積)/(h-IgG對照組腫瘤體積-h-IgG對照組初始腫瘤體積)。h-IgG對照組給藥前腫瘤平均體積為78mm³。腫瘤體積測定：採用遊標卡尺測定腫瘤的最大長軸(L)和最大寬軸(W)，腫瘤體積按如下公式計算：V=L×W²/2。在整個研 究期間，當腫瘤達到端點(腫瘤體積>3000mm³)時或當小鼠具有>20%體重減輕時，使小鼠安樂死。

表9.實驗設計表

腫瘤抑制率結果如第18圖至第20圖和表10所示：如第18圖所示，在接種後第25天，低劑量組與h-IgG對照對比，抗PD-L1人源化Nb-Fc 0.01mg/kg和ADI-20057 0.02mg/kg單藥抑制率分別為20%和37%。抗PD-L1人源化Nb-Fc與ADI-20057 0.01+0.02mg/kg聯合用藥沒有明顯的腫瘤抑制；抗PD- L1/OX40雙特異性抗體0.023mg/kg的腫瘤抑制率62%。抗PD-L1/OX40雙特異性抗體0.023mg/kg的抑瘤效果比較好。

如第19圖和表10所示，中劑量組與h-IgG對照對比，抗PD-L1人源化Nb-Fc 0.1mg/kg和ADI-20057 0.2mg/kg單藥抑制率分別為48%和38%。抗PD-L1人源化Nb-Fc與ADI-20057 0.1+0.2mg/kg聯合用藥的腫瘤抑制率為45%；抗PD-L1/OX40雙特異性抗體0.23mg/kg的腫瘤抑制率90%。抗PD-L1/OX40雙特異性抗體0.23mg/kg的抑瘤效果強於單藥和聯合用藥。

如第20圖和表10所示，高劑量組與hIgG對比，抗PD-L1人源化Nb-Fc 1mg/kg和ADI-20057 2mg/kg單藥抑制率分別為51%和47%。抗PD-L1人源化Nb-Fc與ADI-20057 1+2mg/kg聯合用藥的腫瘤抑制率為59%；抗PD-L1/OX40雙特異性抗體2.3mg/kg的腫瘤抑制率94%。抗PD-L1/OX40雙特異性抗體2.3mg/kg的抑瘤效果最好，腫瘤抑制效果強於單藥和聯合用藥。高劑量組較於中劑量和低劑量組抑瘤效果更好，具有劑量依賴效應。

同時我們對小鼠體重進行檢測，結果如圖21所示，小鼠體重後期有輕微差異。

表10.第25天腫瘤抑制率

表11.示例性抗PD-L1/OX40雙特異性抗體和對照的序列信息

表12序列：

<110> 信達生物製藥(蘇州)有限公司

<120> 結合PD-L1和OX40的雙特異性抗體

<130> PF 190841PCT

<160> 21

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 590

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成構築物

<400> 1

<210> 2

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築物

<400> 2

<210> 3

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築物

<400> 3

<210> 4

<211> 223

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築物

<400> 4

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築物

<400> 5

<210> 6

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築物

<400> 6

<210> 7

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築物

<400> 7

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築物

<400> 8

<210> 9

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築物

<400> 9

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築物

<400> 10

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築物

<400> 11

<210> 12

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築物

<400> 12

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築物

<400> 13

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築物

<400> 14

<210> 15

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築物

<400> 15

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築物

<400> 16

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築物

<400> 17

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築物

<400> 18

<210> 19

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築物

<400> 19

<210> 20

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築物

<400> 20

<210> 21

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築物

<400> 21

Claims (22)

1. 一種結合OX40和PD-L1的雙特異性抗體分子或其抗原結合片段，其包含以下肽鏈或由其組成：(i)式(I)的多肽鏈：VH-CH1-Fc-X-VHH；和(ii)式(II)的多肽鏈：VL-CL；其中：VH表示重鏈可變區，其包含互補決定區域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3；CH表示重鏈恆定區；Fc包含CH2、CH3，以及CH4；CH1、CH2、CH3和CH4分別表示重鏈恆定區的結構域1、2、3和4；X可以不存在，或者在存在時表示接頭；VHH表示單結構域抗原結合位點，其包含互補決定區域(CDR)VHH CDR1、VHH CDR2和VHH CDR3，其中VHH CDR1包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成；VHH CDR2包含SEQ ID NO：11的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成；VHH CDR3包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成；VL表示輕鏈可變區，其包含互補決定區域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3；CL表示輕鏈恆定區；CH1和Fc之間存在鉸鏈區； 其中，式(I)中的VH-CH1-Fc包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列或由其組成；和式(II)的VL-CL包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列或由其組成；其中由VH和VL形成的抗原結合位點對OX40是特異性的，且由VHH形成的抗原結合位點對PD-L1是特異性的。
2. 如申請專利範圍第1項所述的抗體分子或其抗原結合片段，其包含1條或2條式(I)的多肽鏈和1條或2條式(II)的多肽鏈，或由所述多肽鏈組成。
3. 如申請專利範圍第1或2項所述的抗體分子或其抗原結合片段，其中所述抗體或其片段是人抗體或人源化抗體，或嵌合抗體。
4. 如申請專利範圍第1或2項中任一項所述的抗體分子或其抗原結合片段，其中式(I)的“CH1-Fc”為IgG的形式和/或式(II)的CL來自κ或λ。
5. 如申請專利範圍第4項所述的抗體分子或其抗原結合片段，其中IgG的形式為IgG1、IgG2或IgG4的形式。
6. 如申請專利範圍第1或2項所述的抗體分子或其抗原結合片段，其中OX40為人OX40或猴OX40；和/或其中PD-L1為人PD-L1。
7. 如申請專利範圍第1或2項所述的抗體分子或其抗原結合片段，其中式(I)中的VHH包含SEQ ID NO：6所示的序列或由其組成。
8. 如申請專利範圍第1或2項所述的抗體分子或其抗原結合片段，其中式(I)的多肽鏈包含SEQ ID NO：1所示的序列或由其組成；和其中式(II)的多肽鏈包含SEQ ID NO：7所示的序列或由其組成。
9. 一種分離的核酸，其編碼如申請專利範圍第1至8項中任一項所述的抗體分子或其抗原結合片段。
10. 一種包含如申請專利範圍第9項所述的核酸的表達載體。
11. 如申請專利範圍第10項所述的表達載體，其中所述表達載體為pXC載體或pTT5載體。
12. 一種包含如申請專利範圍第9所述的核酸或如申請專利範圍第10或11項所述的表達載體的宿主細胞，所述宿主細胞是293細胞或CHO細胞。
13. 一種免疫綴合物，其包含如申請專利範圍第1至8項中任一項所述的抗體分子或其抗原結合片段和其它物質，其中所述其它物質為治療劑或標記。
14. 如申請專利範圍第13項所述的免疫綴合物，其中所述治療劑為細胞毒性劑或抗血管發生劑。
15. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至8項中任一項所述的抗體分子或其抗原結合片段或者如申請專利範圍第13或14項所述的免疫綴合物，以及藥用輔料。
16. 一種組合產品，其包含如申請專利範圍第1至8項中任一項所述的抗體分子或其抗原結合片段或如申請專利範圍第13或14項所述的免疫綴合物，以及一種或多種其它治療劑。
17. 如申請專利範圍第16項所述的組合產品，其中所述治療劑為抗血管發生劑、化療劑、細胞毒性劑、疫苗、其它抗體、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑。
18. 一種使用如申請專利範圍第1至8項中任一項所述的抗體分子或其抗原結合片段或如申請專利範圍第13或14項所述的免疫綴合物於製備藥物中的用途，其中所述藥物用於在受試者中預防或治療疾病，其中所述疾病為自身免疫病、炎性疾病、感染、癌症、或T細胞功能障礙性疾病。
19. 如申請專利範圍第18項所述的用途，其中所述癌症為具有升高的表達水平的PD-1、PD-L1或PD-L2和/或具有降低的表達水平或活性的OX40的癌症。
20. 如申請專利範圍第18項所述的用途，其中所述癌症為結腸癌或直腸癌或結直腸癌或肺癌。
21. 如申請專利範圍第18至20項中任一項所述的用途，其中所述藥物與一種或多種其它療法聯合，所述療法包括治療方式和/或其它治療劑。
22. 如申請專利範圍第21項所述的用途，其中所述治療方式包括手術治療和/或放射療法，或者所述治療劑選自抗血管發生劑、化療劑、細胞毒性劑、疫苗、其它抗體、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑。

Images