[go: up one dir, main page]

KR20170039307A - 암 치료에 사용하기 위한 항-cd123 키메라 항원 수용체 (car) - Google Patents

암 치료에 사용하기 위한 항-cd123 키메라 항원 수용체 (car) Download PDF

Info

Publication number
KR20170039307A
KR20170039307A KR1020177007130A KR20177007130A KR20170039307A KR 20170039307 A KR20170039307 A KR 20170039307A KR 1020177007130 A KR1020177007130 A KR 1020177007130A KR 20177007130 A KR20177007130 A KR 20177007130A KR 20170039307 A KR20170039307 A KR 20170039307A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
cell
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
KR1020177007130A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102616429B1 (ko
Inventor
제니퍼 브로그돈
사르 길
데이비드 글래스
사드 켄더리안
안드레아스 뢰브
조안 마닉
마이클 밀론
레온 머피
데이비드 엘. 포터
마르코 루엘라
용치앙 왕
치롱 우
지콴 장
Original Assignee
노파르티스 아게
더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 노파르티스 아게, 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 filed Critical 노파르티스 아게
Publication of KR20170039307A publication Critical patent/KR20170039307A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102616429B1 publication Critical patent/KR102616429B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/44—Antibodies bound to carriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/421—Immunoglobulin superfamily
    • A61K40/4211—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/4214—Receptors for cytokines
    • A61K40/4217—Receptors for interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/10—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by the structure of the chimeric antigen receptor [CAR]
    • A61K2239/11—Antigen recognition domain
    • A61K2239/13—Antibody-based
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/10—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by the structure of the chimeric antigen receptor [CAR]
    • A61K2239/21—Transmembrane domain
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/10—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by the structure of the chimeric antigen receptor [CAR]
    • A61K2239/22—Intracellular domain
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)

Abstract

본 발명은 CD123의 발현과 연관된 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 CD123에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR), 그를 코딩하는 벡터, 및 CD123 CAR을 포함하는 재조합 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CD123 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 유전자 변형된 세포를 투여하는 방법을 포함한다.

Description

암 치료에 사용하기 위한 항-CD123 키메라 항원 수용체 (CAR) {ANTI-CD123 CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR (CAR) FOR USE IN CANCER TREATMENT}
본 출원은 2014년 8월 19일에 출원된 PCT 출원 번호 PCT/CN2014/084696, 및 2014년 11월 6일에 출원된 PCT 출원 번호 PCT/CN2014/090508을 우선권 주장한다. 이들 출원의 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2015년 8월 18일에 생성된 상기 ASCII 카피는 N2067-7064WO5_SL.txt로 명명되고, 625,588 바이트 크기이다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 분화 클러스터 123 단백질 (CD123)의 발현과 연관된 질환을 치료하기 위한, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)의 용도에 관한 것이다.
급성 골수성 백혈병 (AML)을 갖는 대부분의 환자는 표준 요법을 사용하여 치유불가능하고 (Mrozek et al., 2012, J Clin Oncol, 30:4515-23), 재발성 또는 불응성 AML (RR-AML)을 갖는 환자는 특히 불량한 예후를 갖는다 (Kern et al., 2003, Blood 2003, 101:64-70; Wheatley et al., 1999, Br J Haematol, 107:69-79).
유전자 조작은 선택 표적에 대해 T 세포 특이성을 부여할 수 있다. T 세포는 신호전달 분자와 함께 항체의 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 코딩하는 유전 물질로 형질도입되어, 그에 의해 상보성 결정 영역 (CDR)을 사용하여 비-MHC 제한된 방식으로 세포 표면 항원을 인식할 수 있다. 이들 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포로 명명된다. 다양한 악성종양에서 적어도 20종의 상이한 표면 분자를 표적화하기 위한 전임상 및 임상 시도는 일부 활성을 제시한 바 있지만, 이는 종종 주입된 CAR T 세포 생성물의 불량한 지속성에 의해 제한되었다 (Sadelain et al., 2009, Curr Opin Immunol 2009, 21:215-23). 진행성 CLL 및 ALL을 갖는 환자에서의 항-CD19 재지시된 T 세포를 사용한 최근의 성공은 (Porter et al., 2011, N Engl J Med, 365:725-33; Kalos et al., 2011, Science Transl Med, 3:95ra73; Grupp and Kalos, 2013, N Engl J Med, 368:1509-18) 이들 세포가 단일 주입 후 대량의 종양 부담을 근절할 수 있음을 입증하였고, 완화는 지금까지 최대 3년 지속되어 CAR T 세포 요법의 극적인 잠재력을 강조한다. 동물 모델에서 AML을 표적화하는 전임상 시도는 거의 존재하지 않지만 (Marin et al., 2010, Haematologica, 95:2144-52; Tettamanti et al., 2013, Br J Haematol, 161:389-401), 최근에 공개된 소규모 임상 시험은 T 세포를 생산하여 공격성 악성종양을 갖는 환자에게 주입하는 것이 실현가능하다는 것을 입증하였다 (Ritchie et al., 2013, Mol Ther, 21:2122-9). 유전자 변형된 T 세포 상의 키메라 항원 수용체가 표적화 세포를 인식하고 파괴하는 능력 이외에, 성공적인 치료 T 세포 요법은 시간 경과에 따라 증식 및 지속되는 능력을 가지며 재발을 추가로 모니터링하는 것을 필요로 한다. T 세포는 무반응, 억제 또는 소진으로 인해 가변적으로 효과적일 수 있지만, 숙련된 진료의는 현 시점에 이들 특색에 대해 제한된 제어를 갖는다. 유효하기 위해서는, CAR 형질전환된 환자 T 세포는 항원에 반응하여 증식하는 능력이 지속 및 유지될 필요가 있다. ALL 환자 T 세포는 뮤린 scFv를 포함하는 CART19를 사용하여 이를 수행할 수 있는 것으로 제시된 바 있다 (예를 들어, 문헌 [Grupp et al., NEJM 368:1509-1518 (2013)] 참조).
제1 측면에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 단리된 핵산 분자이며, 여기서 CAR은 CD123 결합 도메인 (예를 들어, 인간 또는 인간화 CD123 결합 도메인), 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동자극 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자를 특색으로 한다. 한 실시양태에서, CAR은 본원에 기재된 CD123 결합 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 인간 또는 인간화 CD123 결합 도메인), 본원에 기재된 막횡단 도메인, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동자극 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인)을 포함한다.
한 실시양태에서, 코딩된 CD123 결합 도메인은 본원에 기재된 CD123 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3), 및/또는 본원에 기재된 CD123 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하고, 예를 들어 CD123 결합 도메인은 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 LC CDR 및 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 HC CDR을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 CD123 결합 도메인 (예를 들어, 인간 또는 인간화 CD123 결합 도메인)은 본원에 기재된 (예를 들어, 표 2, 6 또는 9에서의) 경쇄 가변 영역 및/또는 본원에 기재된 (예를 들어, 표 2, 6 또는 9에서의) 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 CD123 결합 도메인은 표 2, 6 또는 9의 아미노산 서열의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 scFv이다. 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 표 2, 6 또는 9에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 2, 6 또는 9의 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 표 2, 6 또는 9에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 2, 6 또는 9의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 실시양태에서, 코딩된 CD123 결합 도메인은 표 2, 6 또는 9에 열거된 임의의 CD123 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3을 포함한다. 실시양태에서, CD33 결합 도메인은 추가로 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 포함한다. 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 표 2, 6 또는 9에 열거된 임의의 CD123 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 코딩된 CD123 결합 도메인은 표 2 또는 9에 열거된 임의의 CD123 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3 중 1, 2개 또는 모두, 및 표 2, 6 또는 9에 열거된 임의의 CD123 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3 중 1, 2개 또는 모두를 포함한다.
한 실시양태에서, 코딩된 CD123 결합 도메인은 서열식별번호(SEQ ID NO): 157-160, 184-215, 478, 480, 483, 및 485로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 CD123 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 서열식별번호: 157-160, 184-215, 478, 480, 483, 및 485의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 157-160, 184-215, 478, 480, 483, 및 485의 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 코딩된 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 216-219 또는 243-274로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 216-219 또는 243-274의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 216-219 또는 243-274에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 코딩된 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 478, 480, 483, 또는 485의 중쇄 가변 영역에 상응하는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 478, 480, 483, 또는 485의 상응하는 부분의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 478, 480, 483, 또는 485의 상응하는 부분에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 코딩된 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 275-278 또는 302-333으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 275-278 또는 302-333의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 275-278 또는 302-333에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 코딩된 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 478, 480, 483, 또는 485의 경쇄 가변 영역에 상응하는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 478, 480, 483, 또는 485의 상응하는 부분의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 478, 480, 483, 또는 485의 상응하는 부분에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, scFv를 코딩하는 핵산 분자는 서열식별번호: 479, 481, 482, 484로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 핵산 분자는 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 상기 뉴클레오티드 서열은 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역에 상응하는 서열식별번호: 479, 481, 482, 및 484로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열의 부분, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 핵산 분자는 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 코딩된 아미노산 서열은 서열식별번호: 157-160으로 이루어진 군, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 핵산 분자는 서열식별번호: 184-215로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 scFv를 코딩한다. 한 실시양태에서, 핵산 분자는 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하며, 여기서 코딩된 아미노산 서열은 서열식별번호: 184-215로 이루어진 군, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 코딩된 CD123 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 3 또는 4 (서열식별번호: 26)이다. scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은, 예를 들어 임의의 하기 배향: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역일 수 있다.
한 실시양태에서, 코딩된 CAR은 단백질, 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인을 포함하는 막횡단 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 막횡단 도메인은 서열식별번호: 6의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 막횡단 도메인은 서열식별번호: 6의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 포함하지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 포함하는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 17의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 코딩된 CD123 결합 도메인은 힌지 영역, 예를 들어 본원에 기재된 힌지 영역에 의해 막횡단 도메인에 연결된다. 한 실시양태에서, 코딩된 힌지 영역은 서열식별번호: 2, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 힌지 영역을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 13의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 추가로 공동자극 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 공동자극 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 코딩된 공동자극 도메인은, 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 MHC 부류 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터의 기능적 신호전달 도메인이다.
한 실시양태에서, 4-1BB의 코딩된 공동자극 도메인은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 공동자극 도메인은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CD28의 코딩된 공동자극 도메인은 서열식별번호: 43의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 공동자극 도메인은 서열식별번호: 43의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 43의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CD28의 공동자극 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 44의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CD27의 코딩된 공동자극 도메인은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 공동자극 도메인은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 8의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CD27의 공동자극 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 19의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, ICOS의 코딩된 공동자극 도메인은 서열식별번호: 45의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, ICOS의 코딩된 공동자극 도메인은 서열식별번호: 45의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 45의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, ICOS의 공동자극 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 46의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 코딩된 1차 신호전달 도메인은 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 실시양태에서, CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인은 서열식별번호: 9 (돌연변이체 CD3 제타) 또는 서열식별번호: 10 (야생형 인간 CD3 제타)의 아미노산 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB의 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 7의 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 CD3 제타 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 7의 서열 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열, 및/또는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 21의 CD3 제타 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 CD27의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, CD27의 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 CD3 제타 아미노산 서열을 포함하다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 8의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 8의 서열 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다. 한 실시양태에서, CD27의 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 19의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열, 및/또는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 21의 CD3 제타 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 CD28의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, CD28의 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 43의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 CD3 제타 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 43의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 43의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 43의 서열 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다. 한 실시양태에서, CD28의 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 44의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열, 및/또는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 21의 CD3 제타 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 ICOS의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, ICOS의 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 45의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 CD3 제타 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 45의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 45의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 45의 서열 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다. 한 실시양태에서, ICOS의 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 46의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열, 및/또는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 21의 CD3 제타 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 리더 서열, 예를 들어 본원에 기재된 리더 서열, 예를 들어 서열식별번호: 1의 아미노산 서열; 본원에 기재된 CD123 결합 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함하는 CD123 결합 도메인, 예를 들어 표 2, 6 또는 9에 기재된 인간 또는 인간화 CD123 결합 도메인, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열; 본원에 기재된 힌지 영역, 예를 들어 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 영역; 본원에 기재된 막횡단 도메인, 예를 들어 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 막횡단 도메인; 및 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR 구축물을 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 공동자극 도메인 (예를 들어, 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB 공동자극 도메인 또는 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CD27 공동자극 도메인), 및/또는 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 1차 신호전달 도메인 (예를 들어, 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열을 포함하는 CD3 제타 자극 도메인)을 포함한다. 한 실시양태에서, CAR 구축물을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 서열식별번호: 12의 핵산 서열, 또는 그에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩된 리더 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열식별번호: 98, 서열식별번호: 99, 서열식별번호: 100, 서열식별번호: 101, 서열식별번호: 125, 서열식별번호: 126, 서열식별번호: 127, 서열식별번호: 128, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 서열식별번호: 149, 서열식별번호: 150, 서열식별번호: 151, 서열식별번호: 152, 서열식별번호: 153, 서열식별번호: 154, 서열식별번호: 155, 또는 서열식별번호: 156의 CAR 아미노산 서열; 또는 서열식별번호: 98, 서열식별번호: 99, 서열식별번호: 100, 서열식별번호: 101, 서열식별번호: 125, 서열식별번호: 126, 서열식별번호: 127, 서열식별번호: 128, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 서열식별번호: 149, 서열식별번호: 150, 서열식별번호: 151, 서열식별번호: 152, 서열식별번호: 153, 서열식별번호: 154, 서열식별번호: 155, 또는 서열식별번호: 156의 아미노산 서열의 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산; 또는 서열식별번호: 98, 서열식별번호: 99, 서열식별번호: 100, 서열식별번호: 101, 서열식별번호: 125, 서열식별번호: 126, 서열식별번호: 127, 서열식별번호: 128, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 서열식별번호: 149, 서열식별번호: 150, 서열식별번호: 151, 서열식별번호: 152, 서열식별번호: 153, 서열식별번호: 154, 서열식별번호: 155, 또는 서열식별번호: 156의 아미노산 서열에 대해 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함한다 (예를 들어 그로 이루어진다).
한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 66, 서열식별번호: 67, 서열식별번호: 68, 서열식별번호: 69, 서열식별번호: 70, 서열식별번호: 71, 서열식별번호: 72, 서열식별번호: 73, 서열식별번호: 74, 서열식별번호: 75, 서열식별번호: 76, 서열식별번호: 77, 서열식별번호: 78, 서열식별번호: 79, 서열식별번호: 80, 서열식별번호: 81, 서열식별번호: 82, 서열식별번호: 83, 서열식별번호: 84, 서열식별번호: 85, 서열식별번호: 86, 서열식별번호: 87, 서열식별번호: 88, 서열식별번호: 89, 서열식별번호: 90, 서열식별번호: 91, 서열식별번호: 92, 서열식별번호: 93, 서열식별번호: 94, 서열식별번호: 95, 서열식별번호: 96, 또는 서열식별번호: 97의 핵산 서열 또는 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 66, 서열식별번호: 67, 서열식별번호: 68, 서열식별번호: 69, 서열식별번호: 70, 서열식별번호: 71, 서열식별번호: 72, 서열식별번호: 73, 서열식별번호: 74, 서열식별번호: 75, 서열식별번호: 76, 서열식별번호: 77, 서열식별번호: 78, 서열식별번호: 79, 서열식별번호: 80, 서열식별번호: 81, 서열식별번호: 82, 서열식별번호: 83, 서열식별번호: 84, 서열식별번호: 85, 서열식별번호: 86, 서열식별번호: 87, 서열식별번호: 88, 서열식별번호: 89, 서열식별번호: 90, 서열식별번호: 91, 서열식별번호: 92, 서열식별번호: 93, 서열식별번호: 94, 서열식별번호: 95, 서열식별번호: 96, 또는 서열식별번호: 97의 핵산 서열에 대해 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다 (예를 들어 그로 이루어진다).
한 측면에서, 본 발명은 CD123 결합 도메인을 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이며, 여기서 CD123 결합 도메인은 본원에 기재된 CD123 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3), 및/또는 본원에 기재된 CD123 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하고, 예를 들어 인간 또는 인간화 CD123 결합 도메인은 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 LC CDR 및 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 HC CDR을 포함한다.
다른 실시양태에서, 코딩된 CD123 결합 도메인은 표 2, 6 또는 9에 열거된 임의의 CD123 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3을 포함한다. 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 추가로 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 포함한다. 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 표 2, 6 또는 9에 열거된 임의의 CD123 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 코딩된 CD123 결합 도메인은 표 2, 6 또는 9에 열거된 임의의 CD123 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3 중 1, 2개 또는 모두, 및 표 2, 6 또는 9에 열거된 임의의 CD123 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3 중 1, 2개 또는 모두를 포함한다.
한 실시양태에서, 코딩된 CD123 결합 도메인은 본원에 기재된 (예를 들어, 서열식별번호: 275-278 또는 302-333에서의) 경쇄 가변 영역 및/또는 본원에 기재된 (예를 들어, 서열식별번호: 216-219 또는 243-274에서의) 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 157-160, 184-215, 478, 480, 483 또는 485에서의 아미노산 서열의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 scFv이다. 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 서열식별번호: 275-278 또는 302-333에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 275-278 또는 302-333의 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 서열식별번호: 216-219 또는 243-274에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 216-219 또는 243-274에서의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 코딩된 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 157, 서열식별번호: 158, 서열식별번호: 159, 서열식별번호: 160, 서열식별번호: 184, 서열식별번호: 185, 서열식별번호: 186, 서열식별번호: 187, 서열식별번호: 188, 서열식별번호: 189, 서열식별번호: 190, 서열식별번호: 191, 서열식별번호: 192, 서열식별번호: 193, 서열식별번호: 194, 서열식별번호: 195, 서열식별번호: 196, 서열식별번호: 197, 서열식별번호: 198, 서열식별번호: 199, 서열식별번호: 200, 서열식별번호: 201, 서열식별번호: 202, 서열식별번호: 203, 서열식별번호: 204, 서열식별번호: 205, 서열식별번호: 206, 서열식별번호: 207, 서열식별번호: 208, 서열식별번호: 209, 서열식별번호: 210, 서열식별번호: 211, 서열식별번호: 212, 서열식별번호: 213, 서열식별번호: 214, 서열식별번호: 215, 서열식별번호: 478, 서열식별번호: 480, 서열식별번호: 483 및 서열식별번호: 485로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 CD123 결합 도메인은 scFv이고, 본원, 예를 들어 표 2, 6 또는 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역은 링커, 예를 들어 본원에 기재된 링커를 통해 본원, 예를 들어 표 2, 6 또는 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 부착된다. 한 실시양태에서, 코딩된 CD123 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 4 (서열식별번호: 26)이다. scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은, 예를 들어 임의의 하기 배향: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역일 수 있다.
폴리펩티드
또 다른 측면에서, 본 발명은 핵산 분자에 의해 코딩된 단리된 폴리펩티드 분자에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드 분자는 서열식별번호: 98, 서열식별번호: 99, 서열식별번호: 100, 서열식별번호: 101, 서열식별번호: 125, 서열식별번호: 126, 서열식별번호: 127, 서열식별번호: 128, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 서열식별번호: 149, 서열식별번호: 150, 서열식별번호: 151, 서열식별번호: 152, 서열식별번호: 153, 서열식별번호: 154, 서열식별번호: 155, 및 서열식별번호: 156으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 상기 서열 중 임의의 것의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 상기 서열 중 임의의 것에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CD123 결합 도메인 (예를 들어, CD123에 특이적으로 결합하는 인간 또는 인간화 항체 또는 항체 단편), 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동자극 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 단리된 키메라 항원 수용체 (CAR) 분자 (예를 들어, 폴리펩티드)에 관한 것이다. 한 실시양태에서, CAR은 본원에 기재된 CD123 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 CD123에 특이적으로 결합하는 인간 또는 인간화 항체 또는 항체 단편), 본원에 기재된 막횡단 도메인, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 공동자극 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인)을 포함한다.
한 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 본원에 기재된 CD123 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3), 및/또는 본원에 기재된 CD123 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하고, 예를 들어 CD123 결합 도메인은 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 LC CDR 및 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 HC CDR을 포함한다. 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 본원에 기재된 (예를 들어, 표 2, 6 또는 9에서의) 경쇄 가변 영역 및/또는 본원에 기재된 (예를 들어, 표 2, 6 또는 9에서의) 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 표 2, 6 또는 9에 열거된 아미노산 서열의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 scFv이다. 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 표 2, 6 또는 9에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 2, 6 또는 9에 제공된 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 표 2, 6 또는 9에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 2, 6 또는 9에 제공된 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 표 2, 6 또는 9에 제공된 임의의 CD123 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3을 포함한다. 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 추가로 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 포함한다. 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 표 2, 6 또는 9에 열거된 임의의 CD123 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 표 2, 6 또는 9에 열거된 임의의 CD123 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3 중 1, 2개 또는 모두, 및 표 2, 6 또는 9에 열거된 임의의 CD123 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3 중 1, 2개 또는 모두를 포함한다.
한 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 157, 서열식별번호: 158, 서열식별번호: 159, 서열식별번호: 160, 서열식별번호: 184, 서열식별번호: 185, 서열식별번호: 186, 서열식별번호: 187, 서열식별번호: 188, 서열식별번호: 189, 서열식별번호: 190, 서열식별번호: 191, 서열식별번호: 192, 서열식별번호: 193, 서열식별번호: 194, 서열식별번호: 195, 서열식별번호: 196, 서열식별번호: 197, 서열식별번호: 198, 서열식별번호: 199, 서열식별번호: 200, 서열식별번호: 201, 서열식별번호: 202, 서열식별번호: 203, 서열식별번호: 204, 서열식별번호: 205, 서열식별번호: 206, 서열식별번호: 207, 서열식별번호: 208, 서열식별번호: 209, 서열식별번호: 210, 서열식별번호: 211, 서열식별번호: 212, 서열식별번호: 213, 서열식별번호: 214, 서열식별번호: 215, 서열식별번호: 478, 서열식별번호: 480, 서열식별번호: 483 및 서열식별번호: 485로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열; 또는 상기 서열 중 임의의 것에 대해 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열; 또는 상기 서열 중 임의의 것에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 scFv이고, 및 본원, 예를 들어 표 2, 6 또는 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역은 링커, 예를 들어 본원에 기재된 링커를 통해 본원, 예를 들어 표 2, 6 또는 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 부착된다. 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 4 (서열식별번호: 26)이다. scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은, 예를 들어 임의의 하기 배향: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역일 수 있다.
한 실시양태에서, 단리된 CAR 분자는 단백질, 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 6의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 6의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 힌지 영역, 예를 들어 본원에 기재된 힌지 영역에 의해 막횡단 도메인에 연결된다. 한 실시양태에서, 코딩된 힌지 영역은 서열식별번호: 2, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 CAR 분자는 추가로 공동자극 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 공동자극 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 CAR 분자의 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 단리된 CAR 분자의 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 단리된 CAR 분자의 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 MHC 부류 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 4-1BB의 공동자극 도메인은 서열식별번호: 7의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CD28의 공동자극 도메인은 서열식별번호: 43의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 서열식별번호: 43의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 43의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CD27의 공동자극 도메인은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 8의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, ICOS의 공동자극 도메인은 서열식별번호: 45의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 서열식별번호: 45의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 45의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
실시양태에서, 1차 신호전달 도메인은 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 실시양태에서, CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인은 서열식별번호: 9 (돌연변이체 CD3 제타) 또는 서열식별번호: 10 (야생형 인간 CD3 제타), 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다.
한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD27의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, CD27의 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 CD3 제타 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 8의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 8의 서열 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다.
한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD28의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, CD28의 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 43의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 CD3 제타 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 43의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 43의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 43의 서열 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다.
한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 ICOS의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, ICOS의 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 45의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 CD3 제타 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 45의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 381의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 45의 서열 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다.
한 실시양태에서, 단리된 CAR 분자는 추가로 리더 서열, 예를 들어 본원에 기재된 리더 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 리더 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 리더 서열, 예를 들어 본원에 기재된 리더 서열, 예를 들어 서열식별번호: 1 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 리더 서열, 본원에 기재된 CD123 결합 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함하는 CD123 결합 도메인, 예를 들어 표 2 또는 6에 기재된 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열의 CD123 결합 도메인, 힌지 영역, 예를 들어 본원에 기재된 힌지 영역, 예를 들어 서열식별번호: 2 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 힌지 영역, 막횡단 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 막횡단 도메인, 예를 들어 서열식별번호: 6의 서열 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 막횡단 도메인, 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동자극 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 단리된 CAR 분자에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 공동자극 도메인, 예를 들어 서열식별번호: 7의 서열 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인, 및/또는 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 CD3 제타 자극 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 공동자극 도메인, 예를 들어 서열식별번호: 7의 서열을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인, 및/또는 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열을 갖는 CD3 제타 자극 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 CAR 분자는 서열식별번호: 98, 서열식별번호: 99, 서열식별번호: 100, 서열식별번호: 101, 서열식별번호: 125, 서열식별번호: 126, 서열식별번호: 127, 서열식별번호: 128, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 서열식별번호: 149, 서열식별번호: 150, 서열식별번호: 151, 서열식별번호: 152, 서열식별번호: 153, 서열식별번호: 154, 서열식별번호: 155, 및 서열식별번호: 156의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 98, 서열식별번호: 99, 서열식별번호: 100, 서열식별번호: 101, 서열식별번호: 125, 서열식별번호: 126, 서열식별번호: 127, 서열식별번호: 128, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 서열식별번호: 149, 서열식별번호: 150, 서열식별번호: 151, 서열식별번호: 152, 서열식별번호: 153, 서열식별번호: 154, 서열식별번호: 155, 및 서열식별번호: 156의 아미노산 서열의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 또는 30개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 60, 50 또는 40개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 98, 서열식별번호: 99, 서열식별번호: 100, 서열식별번호: 101, 서열식별번호: 125, 서열식별번호: 126, 서열식별번호: 127, 서열식별번호: 128, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 서열식별번호: 149, 서열식별번호: 150, 서열식별번호: 151, 서열식별번호: 152, 서열식별번호: 153, 서열식별번호: 154, 서열식별번호: 155, 및 서열식별번호: 156의 아미노산 서열에 대해 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다 (예를 들어 그로 이루어진다).
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 CD123 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3), 및/또는 본원에 기재된 CD123 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하는 CD123 결합 도메인, 예를 들어 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 LC CDR 및 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 HC CDR (예를 들어, 표 3, 7, 10 또는 12에 따른 1, 2 또는 3개의 HC CDR; 및/또는 표 4, 8, 11 또는 13에 따른 1, 2 또는 3개의 LC CDR)을 포함하는 CD123 결합 도메인에 관한 것이다.
다른 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 표 2, 6 또는 9에 열거된 임의의 CD123 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3을 포함한다. 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 추가로 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 포함한다. 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 표 2, 6 또는 9에 열거된 임의의 CD123 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 표 2, 6 또는 9에 열거된 임의의 CD123 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3 중 1, 2개 또는 모두, 및 표 2, 6 또는 9에 열거된 임의의 CD123 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3 중 1, 2개 또는 모두를 포함한다.
한 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 본원에 기재된 (예를 들어, 서열식별번호: 275-278 또는 302-333에서의) 경쇄 가변 영역 및/또는 본원에 기재된 (예를 들어 서열식별번호: 216-219 또는 243-274에서의) 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 157-160, 184-215, 478, 480, 483 또는 485의 아미노산 서열의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 scFv이다. 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 서열식별번호: 275-278 또는 302-333에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 275-278 또는 302-333에서의 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 서열식별번호: 216-219 또는 243-274에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 216-219 또는 243-274에서의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 157, 서열식별번호: 158, 서열식별번호: 159, 서열식별번호: 160, 서열식별번호: 184, 서열식별번호: 185, 서열식별번호: 186, 서열식별번호: 187, 서열식별번호: 188, 서열식별번호: 189, 서열식별번호: 190, 서열식별번호: 191, 서열식별번호: 192, 서열식별번호: 193, 서열식별번호: 194, 서열식별번호: 195, 서열식별번호: 196, 서열식별번호: 197, 서열식별번호: 198, 서열식별번호: 199, 서열식별번호: 200, 서열식별번호: 201, 서열식별번호: 202, 서열식별번호: 203, 서열식별번호: 204, 서열식별번호: 205, 서열식별번호: 206, 서열식별번호: 207, 서열식별번호: 208, 서열식별번호: 209, 서열식별번호: 210, 서열식별번호: 211, 서열식별번호: 212, 서열식별번호: 213, 서열식별번호: 214, 서열식별번호: 215, 서열식별번호: 478, 서열식별번호: 480, 서열식별번호: 483, 및 서열식별번호: 485로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 scFv이고, 본원, 예를 들어 표 2, 6 또는 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역은 링커, 예를 들어 본원에 기재된 링커를 통해 본원, 예를 들어 표 2, 6 또는 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 부착된다. 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 4 (서열식별번호: 26)이다. scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은, 예를 들어 임의의 하기 배향: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역일 수 있다.
핵산, 벡터 및 세포
본원에 기재된 핵산 분자는 DNA 분자, RNA 분자, 또는 그의 조합일 수 있다. 한 실시양태에서, 핵산 분자는 본원에 기재된 바와 같은 CAR 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA이다. 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 상기 핵산 분자 중 임의의 것을 포함하는 벡터이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 핵산 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 벡터는 DNA 분자 또는 RNA 분자 (예를 들어, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 한 실시양태에서, 벡터는 추가로 프로모터를 포함한다. 한 실시양태에서, 프로모터는 EF-1 프로모터이다. 한 실시양태에서, EF-1 프로모터는 서열식별번호: 11의 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 프로모터는 PGK 프로모터, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 말단절단된 PGK 프로모터이다.
한 실시양태에서, 벡터는 시험관내 전사되는 벡터, 예를 들어 본원에 기재된 핵산 분자의 RNA를 전사하는 벡터이다. 한 실시양태에서, 벡터 내의 핵산 서열은 추가로 폴리(A) 테일, 예를 들어 본원에 기재된 폴리 A 테일을 포함한다 (예를 들어, 약 150개의 아데노신 염기를 포함한다 (서열식별번호: 705)). 한 실시양태에서, 벡터 내의 핵산 서열은 추가로 3' UTR, 예를 들어 인간 베타-글로불린으로부터 유래된 3' UTR의 적어도 1개의 반복부를 포함하는 예를 들어 본원에 기재된 3' UTR을 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터 내의 핵산 서열은 추가로 프로모터, 예를 들어 T2A 프로모터를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 핵산 분자 또는 벡터를 포함하거나, 또는 본원에 기재된 바와 같은 CAR 폴리펩티드를 발현하는 세포에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 세포는 본원에 기재된 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포 (예를 들어, 인간 T 세포 또는 NK 세포, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 인간 T 세포 또는 NK 세포, 또는 그의 세포 집단)이다. 한 실시양태에서, 인간 T 세포는 CD8+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 CAR 핵산 또는 폴리펩티드를 발현하거나, 또는 일부 시점에 CAR 핵산 또는 폴리펩티드를 발현하였다 (예를 들어, CAR 분자를 일시적으로 발현하였다).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포 (예를 들어, CAR-발현 세포)는 또 다른 작용제, 예를 들어 CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제를 추가로 발현할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 작용제는 억제 분자 또는 그의 도메인을 포함하는 키메라 분자일 수 있다. 억제 분자의 예는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR (예를 들어, TGFR베타)를 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 분자는 양성 신호를 세포에 제공하는 제2 폴리펩티드, 예를 들어 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인과 회합된 제1 폴리펩티드, 예를 들어 억제 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 작용제는 예를 들어 억제 분자, 예컨대 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR (예를 들어, TGFR베타) 또는 이들 중 임의의 것의 단편 (예를 들어, 이들 중 임의의 것의 세포외 도메인의 적어도 일부)의 제1 폴리펩티드, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동자극 도메인 (예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 예를 들어 41BB, CD27 또는 CD28) 및/또는 1차 신호전달 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인)포함)인 제2 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 작용제는 PD1 또는 그의 단편 (예를 들어, PD1의 세포외 도메인의 적어도 일부)의 제1 폴리펩티드, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 CD28 신호전달 도메인 및/또는 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인)의 제2 폴리펩티드를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 면역 이펙터 세포 내로 본원에 기재된 핵산 분자 (예를 들어, RNA 분자, 예를 들어 mRNA), 또는 CAR, 예를 들어 본원에 기재된 CAR을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 도입하는 것, 예를 들어 형질도입하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 세포 (예를 들어, 외인성 RNA를 일시적으로 발현하는 RNA-조작된 세포)의 집단을 생성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포 내로 본원에 기재된 바와 같은 RNA (예를 들어, 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA; 본원에 기재된 바와 같은 CAR 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA 서열)를 도입하는 것을 포함한다. 실시양태에서, RNA는 CAR 폴리펩티드를 일시적으로 발현한다. 한 실시양태에서, 세포는 본원에 기재된 바와 같은 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포, 또는 세포 집단)이다.
치료 용도
또 다른 측면에서, 본 발명은 포유동물에게 CAR 분자를 발현하는 세포, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에 항종양 면역을 제공하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 세포는 자가 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 동종 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포이다. 한 실시양태에서, 포유동물은 인간, 예를 들어 혈액암을 갖는 환자이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CD123의 발현과 연관된 질환 (예를 들어, 증식성 질환, 전암성 상태, 또는 CD123의 발현과 연관된 비-암 관련 적응증)을 갖는 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상기 포유동물에게 CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 포유동물은 인간, 예를 들어 혈액암을 갖는 환자이다.
한 실시양태에서, 질환은 본원에 기재된 질환이다. 한 실시양태에서, CD123 발현과 연관된 질환은 증식성 질환, 예컨대 암 또는 악성종양; 전암성 상태, 예컨대 골수이형성증, 골수이형성 증후군 또는 전백혈병; 또는 CD123의 발현과 연관된 비-암 관련 적응증으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 질환은 혈액암이다. 다른 실시양태에서, 질환은 급성 골수성 백혈병 (AML), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 급성 림프모구성 B-세포 백혈병 (B-세포 급성 림프성 백혈병, BALL), 및 급성 림프모구성 T-세포 백혈병 (T-세포 급성 림프성 백혈병, TALL)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 급성 백혈병; 골수이형성 증후군; 골수증식성 신생물; 조직구성 장애 (예를 들어, 비만 세포 장애 또는 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물); 비만 세포 장애, 예를 들어 전신 비만세포증 또는 비만 세포 백혈병; 만성 골수성 백혈병 (CML); 및 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, CD123 발현과 연관된 질환은 비정형 및/또는 비-전형적 암, 악성종양, 전암성 상태 또는 CD123을 발현하는 증식성 질환; 및 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서, 질환은 급성 골수성 백혈병 (AML), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 급성 림프모구성 B-세포 백혈병 (B-세포 급성 림프성 백혈병, BALL), 급성 림프모구성 T-세포 백혈병 (T-세포 급성 림프성 백혈병, TALL), B-세포 전림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 (CML), 모발상 세포 백혈병, 호지킨 림프종, 비만 세포 장애, 조직구성 장애, 골수이형성 증후군, 골수증식성 신생물, 형질 세포 골수종, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 또는 그의 조합 중 1종 이상으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 질환은 백혈병, 예를 들어 ALL (예를 들어, 재발성 및 불응성 ALL) 또는 AML이다. 다른 실시양태에서, 질환은 CD19-음성 암, 예를 들어 CD19-음성 재발성 암이다.
임의의 상기 방법의 일부 실시양태에서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단은 본원에 기재된 바와 같은 CAR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터를 포함한다.
임의의 상기 방법의 다른 실시양태에서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단은 본원에 기재된 바와 같은 CAR 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포는 CAR-발현 RNA-조작된 세포의 집단, 예를 들어 일시적으로 발현하는 세포의 집단이다.
임의의 상기 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 1회 이상의 용량의 세포 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 CAR 핵산 또는 CAR 폴리펩티드를 함유하는 면역 세포)를 포유동물 (예를 들어 암, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 혈액암 (예를 들어, AML 또는 ALL)을 갖는 포유동물)에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 1회 이상의 용량의 CAR 세포 (예를 들어, CD123 CAR 세포)는 적어도 약 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 또는 5 x 109개의 세포를 포함한다.
한 실시양태에서, 최대 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2회의 용량의 세포가 투여된다. 다른 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6회 용량의 세포가, 예를 들어 1, 2, 3, 4주 또는 그 초과의 치료 간격으로 포유동물에게 투여된다. 한 실시양태에서, 최대 6회 용량이 2주 내에 투여된다. 용량은 동일 또는 상이할 수 있다. 한 실시양태에서, 보다 낮은 용량이 초기에 투여되고, 이어서 1회 이상의 보다 높은 용량이 투여된다. 하나의 예시적 실시양태에서, 보다 낮은 용량은 약 1x105 내지 1x109개 세포/kg, 또는 1x106 내지 1x108개 세포/kg이고; 보다 높은 용량은 약 2x105 내지 2x109개 세포/kg 또는 2x106 내지 2x108개 세포/kg이며, 이어서 3-6회 용량의 약 4x105 내지 4x109개 세포/kg, 또는 4x106 내지 4x108개 세포/kg이 이어진다.
한 실시양태에서, 1회 이상의 용량의 세포가 1종 이상의 림프구고갈 요법, 예를 들어 림프구고갈 화학요법 후에 투여된다. 한 실시양태에서, 림프구고갈 요법은 화학요법 (예를 들어, 시클로포스파미드)을 포함한다.
한 실시양태에서, 1회 이상의 용량에 이어서 세포 이식, 예를 들어 동종 조혈 줄기 세포 이식이 이어진다. 예를 들어, 동종 조혈 줄기 세포 이식은 약 20 내지 약 35일, 예를 들어 약 23 내지 33일에 일어난다.
일부 실시양태에서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포 (예를 들어, 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포)의 집단은 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 치료제 또는 절차와 조합되어 투여된다.
한 실시양태에서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포 (예를 들어, 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포)의 집단은 CAR 분자를 발현하는 세포의 효능을 증가시키는 작용제, 예를 들어 본원에 기재된 작용제와 조합되어 투여된다.
한 실시양태에서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포 (예를 들어, 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포)의 집단은 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제와 조합되어 투여된다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 낮은, 면역 증진 용량 (예를 들어, 면역계를 완전히 억제하기에 불충분하지만 면역 기능을 개선시키기에는 충분한 용량)을 사용한 처리는 PD-1 양성 T 세포의 감소 또는 PD-1 음성 세포의 증가를 동반하는 것으로 여겨진다. PD-1 양성 T 세포는 PD-1 리간드, 예를 들어 PD-L1 또는 PD-L2를 발현하는 세포에 의한 관여에 의해 고갈될 수 있지만, PD-1 음성 T 세포는 그렇지 않다.
한 실시양태에서, 이러한 접근법은 대상체에서 본원에 기재된 CAR 세포의 성능을 최적화하는데 사용될 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 한 실시양태에서, 내인성, 비-변형된 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 성능이 개선된 것으로 여겨진다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 한 실시양태에서, CD123 CAR 발현 세포의 성능이 개선된 것으로 여겨진다. 다른 실시양태에서, CAR을 발현하도록 조작된 바 있거나 조작될 세포, 예를 들어 T 세포는 PD1 음성 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)의 수를 증가시키거나, 또는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포/ PD1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 비를 증가시키는 양의 mTOR 억제제와 접촉시키는 것에 의해 생체외 처리될 수 있다.
한 실시양태에서, 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 억제제, 예를 들어 RAD001, 또는 촉매 억제제의 투여는 본원에 기재된 CAR 발현 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 투여 전에 개시된다. 한 실시양태에서, CAR 세포는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 수준, 또는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포/PD1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 비가 적어도 일시적으로 증가하도록 mTOR 억제제의 충분한 시간 또는 충분한 투여 후에 투여된다.
한 실시양태에서, CAR을 발현하도록 조작될 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)는 대상체 내의 또는 대상체로부터 수거된 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 수준, 또는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포/PD1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 비가 적어도 일시적으로 증가하도록 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제의 충분한 시간 후에 또는 충분한 투여 후에 수거된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 대상체의 치료에 사용하기 위한 mTOR 억제제를 제공하며, 여기서 상기 mTOR 억제제는 상기 대상체의 면역 반응을 증진시키고, 여기서 상기 대상체는 본원에 기재된 바와 같은 CD123 CAR을 발현하는 면역 이펙터 세포를 제공받은 바 있거나, 제공받고 있거나, 또는 제공받을 예정이다.
또 다른 실시양태에서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포 (예를 들어, 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포)의 집단은 CAR 분자를 발현하는 세포의 투여와 연관된 1종 이상의 부작용을 개선시키는 작용제, 예를 들어 본원에 기재된 작용제와 조합되어 투여된다.
한 실시양태에서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포 (예를 들어, 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포)의 집단은 CD123과 연관된 질환을 치료하는 작용제, 예를 들어 본원에 기재된 작용제와 조합되어 투여된다.
한 실시양태에서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포 (예를 들어, 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포)의 집단은 화학요법, 표적화 항암 요법, 종양용해 약물, 세포독성제, 시토카인, 외과적 절차, 방사선 절차, 공동자극 분자의 효능제, 면역 체크포인트 분자의 억제제, 백신 또는 제2 CAR-기반 면역요법 중 1종 이상으로부터 선택된 제2 치료제 또는 절차와 조합되어 투여된다.
한 실시양태에서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포 (예를 들어, 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포)의 집단은 공동자극 분자의 효능제, 예를 들어 MHC 부류 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 중 1종 이상으로부터 선택된 공동자극 분자의 효능제와 조합되어 투여된다.
다른 실시양태에서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포 (예를 들어, 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포)의 집단은 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, TGFR (예를 들어, TGFR 베타), 또는 그의 조합 중 1종 이상으로부터 선택된 면역 체크포인트 분자의 억제제와 조합되어 투여된다.
한 실시양태에서, 면역 체크포인트 분자의 억제제 또는 공동자극 분자의 효능제는 항체 분자, 예를 들어 단일특이적 항체 분자 또는 이중특이적 항체 분자이다. 예를 들어, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단은 PD-1 억제제, TIM-3 억제제, CEACAM-1 억제제 또는 그의 조합과 조합되어 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제 및 TIM-3 억제제는 조합되어 투여된다. 다른 실시양태에서, TIM-3 억제제 및 CEACAM-1 억제제는 조합되어 투여된다.
일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 분자의 억제제는 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단의 투여에 후속하여, 예를 들어 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단의 투여의 약 3-7일 후에 투여된다.
본원의 실시예에 기재된 바와 같이, CAR123-발현 면역 이펙터 세포는 CD19-음성 재발 (예를 들어, CD19-음성 B-ALL)에 대한 유효 치료인 것으로 제시된 바 있다. 이론에 얽매이지는 않지만, CAR123- 및 CD19 억제 (예를 들어, CAR19-발현 면역 이펙터 세포)의 조합 접근법을 사용하여 CD19-양성 질환을 치료하는 한편, 항원-상실 재발을 지연시키거나 예방할 수 있다.
따라서, 임의의 상기 방법의 또 다른 실시양태에서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단은 CD19 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 CD19 억제제와 조합되어 투여된다.
일부 실시양태에서, CD19 억제제는 CD19 CAR-발현 세포 또는 항-CD19 항체 분자이다. 한 실시양태에서, 질환은 백혈병, 예를 들어 ALL (예를 들어, 재발성 및 불응성 ALL)이다. 다른 실시양태에서 질환은 AML이다. 다른 실시양태에서, 질환은 CD19-음성 암, 예를 들어 CD19-음성 재발성 암이다.
대안적으로 또는 임의의 상기 방법과 조합하여, 포유동물, 예를 들어 인간에서 CD19-음성 재발을 예방하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 유효량의 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포 (예를 들어, 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포)의 집단을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 CD19 억제제, 예를 들어 CD19 CAR-발현 세포를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 질환은 백혈병, 예를 들어 급성 림프모구성 백혈병 (예를 들어, 재발성 및 불응성 ALL), 또는 AML이다.
일부 실시양태에서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단은 CD19 억제제의 투여 전, 그와 동시에 또는 공동으로, 또는 그 후에 투여된다. 한 실시양태에서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단은 CD19의 투여 후에 투여된다. 다른 실시양태에서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단은 CD19 억제제와 공동으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단은 CD19 CAR 및 CD123 CAR (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 CAR)을 발현한다.
이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 특정 백혈병성 세포 (예를 들어, B-ALL 모세포)는 CD19 및 CD123을 공동-발현하는 것으로 발견된 바 있는 한편, 조혈 줄기 세포 (HSC)는 전형적으로 CD123-양성 (CD123+)이지만 CD19-음성 (CD19-)이다. CD19 및 CD123을 공동-발현하는 백혈병성 세포 (예를 들어, B-ALL 모세포)를 표적화하는 한편 HSC는 보존하기 위해, 기능적 세포내 도메인이 CAR19와 CAR123 사이에 분리된 스플릿 CAR을 사용할 수 있다. 이러한 CAR 분자는 CD19 또는 CD123 중 하나를 발현하는 세포 (예를 들어 HSC)와 대조적으로, 표적 세포가 CD19 및 CD123을 공동-발현하는 경우에 (예를 들어, B-ALL 모세포) 면역 세포의 완전 활성화를 우선적으로 유발할 것이다.
따라서, 일부 실시양태에서, CD19 CAR 및 CD123 CAR이 CD19 또는 CD123 중 하나를 발현하는 표적 세포 (예를 들어, 조혈 줄기 세포)에 결합한 경우의 활성화와 비교하여 CD19 CAR 및 CD123 CAR 둘 다가 표적 세포, 예를 들어 표적 CD19+CD123+ 세포 (예를 들어, B-ALL 모세포)에 결합한 경우에 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단의 완전 활성화가 일어나도록, CD19 CAR 또는 CD123 CAR은 스플릿 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, CD123CAR은 공동자극 도메인, 예를 들어 4-1BB 신호전달 도메인을 포함하고, CD19 CAR은 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, CD123CAR은 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하고, CD19 CAR은 공동자극 도메인, 예를 들어 4-1BB 신호전달 도메인을 포함한다. CD123CAR 및 CD19 CAR은 임의로, 예를 들어 1개 이상의 펩티드 절단 부위, 예컨대 P2A에 연결될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 세포 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 면역 이펙터 세포)로 처리한 후 T 세포 고갈제를 투여하여 CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123CAR-발현 세포)를 감소 (예를 들어, 고갈)시키는 것을 추가로 포함한다. 이러한 T 세포 고갈제는 CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123CAR-발현 세포)를 효과적으로 고갈시켜 독성을 완화시키기 위해 사용될 수 있다.
예를 들어, 대안적으로 또는 본원에 개시된 방법과 조합하여, CAR 요법 (예를 들어, 본원에 개시된 CAR123 요법) 후에 CAR-발현 세포를 감소 (예를 들어, 고갈)시키는 방법이 개시된다. 상기 방법은 포유동물에게 T 세포 고갈제를, CAR-발현 세포를 감소 (예를 들어, 고갈)시키기 위한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 고갈제는 포유동물을 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단 (예를 들어, CAR-발현 세포의 집단)으로 처리하여 세포 (예를 들어, CAR-발현 세포)를 감소 (예를 들어, 고갈)시킨 후에 투여된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 세포, 예를 들어 조혈 줄기 세포, 또는 골수를 포유동물 내로 이식하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 포유동물은 백혈병, 예를 들어 급성 림프모구성 백혈병을 갖는다.
일부 실시양태에서, T 세포 고갈제는 세포, 예를 들어 본원에 기재된 면역 이펙터 세포의 집단의 투여의 1, 2, 3, 4 또는 5주 후에 투여된다.
한 실시양태에서, T 세포 고갈제는, 예를 들어 항체 의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체-유도 세포 사멸을 유도함으로써 CAR-발현 세포를 고갈시키는 작용제이다. 예를 들어, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 또한 세포 사멸, 예를 들어 ADCC 또는 보체-유도 세포 사멸을 유도할 수 있는 분자에 의해 인식되는 항원 (예를 들어, 표적 항원)을 발현할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 CAR 발현 세포는 또한 항체 또는 항체 단편에 의해 표적화될 수 있는 표적 단백질 (예를 들어, 수용체)을 발현할 수 있다. 이러한 표적 단백질의 예는 EpCAM, VEGFR, 인테그린 (예를 들어, 인테그린 ανβ3, α4, αI¾β3, α4β7, α5β1, ανβ3, αν), TNF 수용체 슈퍼패밀리의 구성원 (예를 들어, TRAIL-R1, TRAIL-R2), PDGF 수용체, 인터페론 수용체, 폴레이트 수용체, GPNMB, ICAM-1, HLA-DR, CEA, CA-125, MUC1, TAG-72, IL-6 수용체, 5T4, GD2, GD3, CD2, CD3, CD4, CD5, CD11 , CD11a/LFA-1, CD15, CD18/ITGB2, CD19, CD20, CD22, CD23/lgE 수용체, CD25, CD28, CD30, CD33, CD38, CD40, CD41, CD44, CD51, CD52, CD62L, CD74, CD80, CD125, CD147/바시긴, CD152/CTLA-4, CD154/CD40L, CD195/CCR5, CD319/SLAMF7, 및 EGFR, 및 그의 말단절단된 버전 (예를 들어, 1개 이상의 세포외 에피토프가 보존되어 있으나 세포질 도메인 내의 1개 이상의 영역이 결여된 버전)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, CAR 발현 세포는 CAR 및 표적 단백질을 공동-발현하고, 예를 들어 표적 단백질을 자연 발현하거나 표적 단백질을 발현하도록 조작된다. 예를 들어, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단은 CAR 핵산 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 CAR 핵산) 및 표적 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 (예를 들어, 벡터)을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, T 세포 고갈제는 CD52 억제제, 예를 들어 항-CD52 항체 분자, 예를 들어 알렘투주맙이다.
다른 실시양태에서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단은 본원에 기재된 바와 같은 CAR 분자 (예를 들어, CD123CAR) 및 T 세포 고갈제에 의해 인식되는 표적 단백질을 발현한다. 한 실시양태에서, 표적 단백질은 CD20이다. 표적 단백질이 CD20인 실시양태에서, T 세포 고갈제는 항-CD20 항체, 예를 들어 리툭시맙이다.
임의의 상기 방법의 추가 실시양태에서, 방법은 세포, 예를 들어 조혈 줄기 세포 또는 골수를 포유동물 내로 이식하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포 이식 전에 포유동물을 조건화하는 방법을 특색으로 한다. 상기 방법은 포유동물에게 본원에 기재된 바와 같은 CAR 핵산 또는 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 포함하는 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 이식은 줄기 세포 이식, 예를 들어 조혈 줄기 세포 이식 또는 골수 이식이다. 다른 실시양태에서, 세포 이식 전에 대상체를 조건화하는 것은 대상체에서 CD123-발현 세포, 예를 들어 CD123-발현 정상 세포 또는 CD123-발현 암 세포의 수를 감소시키는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 의약으로서 사용하기 위한 (예를 들어, CD123의 발현과 연관된 질환의 치료에 사용하기 위한) 본 발명의 CAR을 코딩하는 단리된 핵산 분자, 본 발명의 CAR의 단리된 폴리펩티드 분자, 본 발명의 CAR을 포함하는 벡터, 및 본 발명의 CAR을 포함하는 세포에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CD123을 발현하는 질환, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 CD123을 발현하는 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 CAR을 코딩하는 단리된 핵산 분자, 본 발명의 CAR의 단리된 폴리펩티드 분자, 본 발명의 CAR을 포함하는 벡터, 및 본 발명의 CAR을 포함하는 세포에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 질환은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 혈액암이다. 일부 실시양태에서, 질환은 급성 골수성 백혈병 (AML), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 급성 림프모구성 B-세포 백혈병 (B-세포 급성 림프성 백혈병, BALL), 및 급성 림프모구성 T-세포 백혈병 (T-세포 급성 림프성 백혈병, TALL)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 급성 백혈병; 골수이형성 증후군; 골수증식성 신생물; 조직구성 장애 (예를 들어, 비만 세포 장애 또는 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물); 비만 세포 장애, 예를 들어 전신 비만세포증 또는 비만 세포 백혈병; 만성 골수성 백혈병 (CML); 또는 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물로부터 선택된다.
상기 언급된 조성물 및 방법의 추가의 특색 및 실시양태는 하기 중 1개 이상을 포함한다:
특정 실시양태에서, CD123 CAR 분자 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 CD123 CAR 핵산 또는 CD123 CAR 폴리펩티드), 또는 본원에 기재된 바와 같은 CD123 결합 도메인은 표 3에 제공된 중쇄 가변 영역으로부터의 1, 2 또는 3개의 CDR (예를 들어, HC CDR1, HC CDR2 및/또는 HC CDR3); 및/또는 표 4에 제공된 경쇄 가변 영역으로부터의 1, 2 또는 3개의 CDR (예를 들어, LC CDR1, LC CDR2 및/또는 LC CDR3) (예를 들어, 표 3 또는 4에 제공된 CAR123-1, CAR123-2, CAR123-3, CAR123-4의 1, 2 또는 3개의 HC CDR1, HC CDR2 또는 HC CDR3, 및/또는 1, 2 또는 3개의 LC CDR1, LC CDR2 또는 LC CDR3); 또는 상기 서열 중 임의의 것과 실질적으로 동일한 서열 (예를 들어, 95-99% 동일, 또는 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 변화, 예를 들어 치환 (예를 들어, 보존적 치환))을 포함한다.
특정 실시양태에서, CD123 CAR 분자 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 CD123 CAR 핵산 또는 CD123 CAR 폴리펩티드), 또는 본원에 기재된 바와 같은 항-CD123 항원 결합 도메인은 표 10에 제공된 중쇄 가변 영역으로부터의 1, 2 또는 3개의 CDR (예를 들어, HC CDR1, HC CDR2 및/또는 HC CDR3); 및/또는 표 11에 제공된 경쇄 가변 영역으로부터의 1, 2 또는 3개의 CDR (예를 들어, 표 10 또는 11에 제공된 CAR123-1, CAR123-2, CAR123-3, CAR123-4의 1, 2 또는 3개의 HC CDR1, HC CDR2 또는 HC CDR3, 및/또는 1, 2 또는 3개의 LC CDR1, LC CDR2 또는 LC CDR3); 또는 상기 서열 중 임의의 것과 실질적으로 동일한 서열 (예를 들어, 95-99% 동일, 또는 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 변화, 예를 들어 치환 (예를 들어, 보존적 치환))을 포함한다.
특정 실시양태에서, CD123 CAR 분자 또는 항-CD123 항원 결합 도메인은 표 12에 제공된 중쇄 가변 영역으로부터의 1, 2 또는 3개의 CDR (예를 들어, HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3); 및/또는 표 13에 제공된 경쇄 가변 영역으로부터의 1, 2 또는 3개의 CDR (예를 들어, 표 12 또는 13에 제공된 CAR123-1, CAR123-2, CAR123-3, CAR123-4의 1, 2 또는 3개의 HC CDR1, HC CDR2 또는 HC CDR3, 및/또는 1, 2 또는 3개의 LC CDR1, LC CDR2 또는 LC CDR3); 또는 상기 서열 중 임의의 것과 실질적으로 동일한 서열 (예를 들어, 95-99% 동일, 또는 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 변화, 예를 들어 치환 (예를 들어, 보존적 치환))을 포함한다.
특정 실시양태에서, CD123 CAR 분자 또는 항-CD123 항원 결합 도메인은
(i) 표 2, 6 또는 9에 열거된 임의의 CD123 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3, 또는 표 4, 8, 11 또는 13에서의 LC CDR; 및/또는
(ii) 표 2, 6 또는 9에 열거된 임의의 CD123 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3, 또는 표 3, 7, 10 또는 12에서의 HC CDR
을 포함한다.
특정 실시양태에서, CD123 CAR 분자 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 CD123 CAR 핵산 또는 CD123 CAR 폴리펩티드) 또는 본원에 기재된 바와 같은 항-CD123 항원 결합 도메인은
(1) 하기 중 하나로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 경쇄 (LC) CDR:
(i) CAR123-1의 서열식별번호: 418의 LC CDR1, 서열식별번호: 446의 LC CDR2 및 서열식별번호: 474의 LC CDR3;
(ii) CAR123-2의 서열식별번호: 419의 LC CDR1, 서열식별번호: 447의 LC CDR2 및 서열식별번호: 475의 LC CDR3;
(iii) CAR123-3의 서열식별번호: 420의 LC CDR1, 서열식별번호: 448의 LC CDR2 및 서열식별번호: 476의 LC CDR3;
(iv) CAR123-4의 서열식별번호: 421의 LC CDR1, 서열식별번호: 449의 LC CDR2 및 서열식별번호: 477의 LC CDR3; 및/또는
(2) 하기 중 하나로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 중쇄 (HC) CDR:
(i) CAR123-1의 서열식별번호: 334의 HC CDR1, 서열식별번호: 362의 HC CDR2 및 서열식별번호: 390의 HC CDR3;
(ii) CAR123-2의 서열식별번호: 335의 HC CDR1, 서열식별번호: 363의 HC CDR2 및 서열식별번호: 391의 HC CDR3;
(iii) CAR123-3의 서열식별번호: 336의 HC CDR1, 서열식별번호: 364의 HC CDR2 및 서열식별번호: 392의 HC CDR3;
(iv) CAR123-4의 서열식별번호: 337의 HC CDR1, 서열식별번호: 365의 HC CDR2 및 서열식별번호: 393의 HC CDR3
을 포함한다.
특정 실시양태에서, CD123 CAR 분자 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 CD123 CAR 핵산 또는 CD123 CAR 폴리펩티드), 또는 본원에 기재된 바와 같은 항-CD123 항원 결합 도메인은
(1) 하기 중 하나로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 경쇄 (LC) CDR:
(i) CAR123-1의 서열식별번호: 501의 LC CDR1, 서열식별번호: 506의 LC CDR2 및 서열식별번호: 511의 LC CDR3;
(ii) CAR123-2의 서열식별번호: 502의 LC CDR1, 서열식별번호: 507의 LC CDR2 및 서열식별번호: 512의 LC CDR3;
(iii) CAR123-3의 서열식별번호: 503의 LC CDR1, 서열식별번호: 508의 LC CDR2 및 서열식별번호: 513의 LC CDR3;
(iv) CAR123-4의 서열식별번호: 504의 LC CDR1, 서열식별번호: 509의 LC CDR2 및 서열식별번호: 514의 LC CDR3; 및/또는
(2) 하기 중 하나로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 중쇄 (HC) CDR:
(i) CAR123-1의 서열식별번호: 486의 HC CDR1, 서열식별번호: 491의 HC CDR2 및 서열식별번호: 496의 HC CDR3;
(ii) CAR123-2의 서열식별번호: 487의 HC CDR1, 서열식별번호: 492의 HC CDR2 및 서열식별번호: 497의 HC CDR3;
(iii) CAR123-3의 서열식별번호: 488의 HC CDR1, 서열식별번호: 493의 HC CDR2 및 서열식별번호: 498의 HC CDR3;
(iv) CAR123-4의 서열식별번호: 489의 HC CDR1, 서열식별번호: 494의 HC CDR2 및 서열식별번호: 499의 HC CDR3
을 포함한다.
특정 실시양태에서, CD123 CAR 분자 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 CD123 CAR 핵산 또는 CD123 CAR 폴리펩티드), 또는 본원에 기재된 바와 같은 항-CD123 항원 결합 도메인은
(1) 하기 중 하나로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 경쇄 (LC) CDR:
(i) CAR123-1의 서열식별번호: 531의 LC CDR1, 서열식별번호: 536의 LC CDR2 및 서열식별번호: 541의 LC CDR3;
(ii) CAR123-2의 서열식별번호: 532의 LC CDR1, 서열식별번호: 537의 LC CDR2 및 서열식별번호: 542의 LC CDR3;
(iii) CAR123-3의 서열식별번호: 533의 LC CDR1, 서열식별번호: 538의 LC CDR2 및 서열식별번호: 543의 LC CDR3;
(iv) CAR123-4의 서열식별번호: 534의 LC CDR1, 서열식별번호: 539의 LC CDR2 및 서열식별번호: 544의 LC CDR3; 및/또는
(2) 하기 중 하나로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 중쇄 (HC) CDR:
(i) CAR123-1의 서열식별번호: 516의 HC CDR1, 서열식별번호: 521의 HC CDR2 및 서열식별번호: 526의 HC CDR3;
(ii) CAR123-2의 서열식별번호: 517의 HC CDR1, 서열식별번호: 522의 HC CDR2 및 서열식별번호: 527의 HC CDR3;
(iii) CAR123-3의 서열식별번호: 518의 HC CDR1, 서열식별번호: 523의 HC CDR2 및 서열식별번호: 528의 HC CDR3;
(iv) CAR123-4의 서열식별번호: 519의 HC CDR1, 서열식별번호: 524의 HC CDR2 및 서열식별번호: 529의 HC CDR3
을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은 하기 기재된다. 본원에 언급된 모든 공개, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 또한, 물질, 방법 및 예는 단지 예시를 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 표제, 하위-표제 또는 숫자화 또는 문자화 요소, 예를 들어 (a), (b), (i) 등은 단지 읽기의 용이성을 위해 제시된다. 본 문서에서 표제 또는 숫자화 또는 문자화 요소의 사용은 단계 또는 요소가 알파벳 순서로 수행될 것 또는 단계 또는 요소가 반드시 서로 개별적일 것을 요구하지 않는다. 본 발명의 다른 특색, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 도면으로부터, 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
본 발명의 바람직한 실시양태의 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명을 예시하기 위한 목적으로, 현재 바람직한 도면 실시양태로 제시된다. 그러나, 본 발명은 도면에 제시된 실시양태의 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
도 1은 검출 시약으로서 단백질 L을 사용하여 FACS에 의해 평가되고 비형질도입된 (CAR 음성) 세포에서의 신호 수준을 초과하는 신호를 제시하는 세포의 백분율로서 보고된 바와 같은, 항-CD123 CAR 구축물로 형질도입된 JNL 세포에서의 CAR 발현의 그래프 표현을 제시한다.
도 2a, 2b, 및 2c를 포함하는 도 2는 JNL 세포에서의 CD123 CAR 활성의 그래프 표현을 제시한다. 항-CD123 CAR 구축물을 NFAT 프로모터에 의해 구동되는 루시페라제 리포터를 함유하는 Jurkat 세포주 (JNL 세포로 명명됨)를 사용하여 활성에 대해 평가하였다. CAR 활성은 이러한 NFAT-구동 리포터의 활성화로서 측정하였다.
도 3은 1차 T-세포에서의 CD123 CAR 발현의 그래프 표현을 제시한다. 형질도입된 세포 (세포 표면 상에서 항-CD123 CAR을 발현함)의 백분율 및 그의 발현의 상대 형광 강도를 BD LSR포르테사(BD LSRFortessa) 또는 BD-FACS칸토(BD-FACSCanto) 상에서 검출 시약으로서 단백질 L을 사용하여 유동 세포측정 분석에 의해 결정하였다. 비염색된 세포를 초과하는 신호에 대한 그러한 FACS로부터의 상대 형광 강도의 게이팅 히스토그램 플롯은 형질도입된 T 세포의 백분율을 제시한다. 형질도입은 12-42%의 CAR 양성 세포의 범위를 생성하였다.
도 4는 CD123-CART-매개 세포 사멸의 그래프 표현을 제시한다. T 세포 사멸은 루시페라제를 안정적으로 발현하는 CD123-발현 MOLM13 급성 골수 백혈병 세포에 대해 지시되었다. 비형질도입된 T 세포는 비-특이적 배경 사멸 수준을 결정하기 위해 사용되었다. CART-CD123의 세포용해 활성은 이펙터가 항-CD123 키메라 수용체를 발현하는 T 세포로서 정의되는 경우에 4:1의 이펙터:표적 세포 비 및 T 세포의 2-배 하향 희석의 범위에 걸쳐 측정되었다. 검정은 적절한 수의 T 세포를 불변 수의 표적 세포와 혼합함으로써 개시하였다. 20시간 후에 엔비전(EnVision) 기기 상에서 브라이트-글로(Bright-Glo)™ 루시페라제 검정을 사용하여 루시페라제 신호를 측정하였다.
도 5a 및 5b는 CD123-CAR에 의한 T 세포의 형질도입 효율을 제시한다. 도 5a는 1172 및 1176에 의한 T 세포의 형질도입 효율을 제시한다. 도 5b는 CD123 CAR 2-4에 의한 T 세포의 형질도입 효율을 제시한다.
도 6은 CD4:CD8 비를 결정하기 위한 CD123 CAR 2-4 및 1172 및 1176의 유동 세포측정법을 제시한다.
도 7 (도 7i, 7ii, 및 7iii에 제공됨)은 CD123+ 종양 세포에의 노출 시 CD123 CAR 2-4 및 1172 및 1176의 탈과립화를 제시한다.
도 8은 종양 표적 세포 (MOLM14)에 대한 CART 세포 (NVS 2-4, 1172 및 1176 클론)의 세포독성을 평가하기 위한 루시페라제 검정의 그래프 표현을 제시한다.
도 9는 D6 (CART 주사 전) 및 제13일 (NVS 2-4, 1172 또는 1176 클론의 주사 6일 후) 또는 제20일에 루시페라제 발현 MOLM14 세포로 주사된 NSG 마우스에서의 종양 부담의 비교를 제시한다.
도 10은 호지킨 림프종 세포주 HDLM-2에서의 CD30 및 CD123의 발현을 제시한다.
도 11a 및 11b는 T2A 공동발현에 의한 CD123의 대용물 마커인 dsRed를 검출하는 것을 통한, pELNS 항-CD123-41BB-CD3ζ로 형질도입된 T-세포에서의 CD123 CAR 발현을 제시한다. dsRed는 유동 세포측정법을 통해 검출되었다.
도 12는 4종의 호지킨 림프종 세포주 (HDLM2, KMH2, L428, SUPHD1), CD123+ MOLM14 (양성 대조군) 및 A375 (음성 대조군)에서의 CD123 발현에 대한 Q-PCR을 제시한다. GUSB는 하우스키핑 유전자로서 사용되었다. Ct 역치는 40이었다.
도 13은 호지킨 림프종에 대한 생체내 모델에 대한 IL3 항체의 효과를 제시한다. IL-3을 비롯한 인간 시토카인을 과다발현하는 NOD-SCID-γ-쇄 KO 마우스 (NSG-S 마우스)에 루시페라제-발현 HDLM-2 세포주를 생착시켰다. i.v. 주사 후, 신생물성 세포가 파종성 연부 조직 덩이를 점차적으로 형성하였다. 중화 항-IL3 항체의 연속 주사는 종양의 성장을 늦추었다.
도 14는 CD107a 탈과립화 검정을 제시한다. 비형질도입된 T 세포 (UTD) 또는 CART123을 항-CD28, 항-CD49d 항체 및 모넨신의 존재 하에 HDLM-2 (CD123+ HL 세포주)와 5 표적 세포 대 1 T 세포의 비로 4시간 동안 인큐베이션하였다. 항-CD30 CAR T 세포를 추가의 대조군으로서 사용하였다. 유동 세포측정법에 의해 검출된 바와 같이, CART123은 CD107a 탈과립화를 증가시키는 것으로 제시되었지만 UTD는 그렇지 않았다.
도 15는 도 20에 제시된 탈과립화 검정의 그래프 표현을 제시한다.
도 16은 CD123 CAR 발현 T 세포가 세포질내 시토카인 생산 (IL-2, TNF)에서 유의한 증가를 제시한다는 것을 입증한다.
도 17은 CART123이 루시페라제 기반 24시간 사멸 검정에서 생물발광 방출에서의 감소에 의해 제시되는 바와 같이 용량 의존성 사멸을 제시하였지만 UTD는 그렇지 않다는 것을 입증한다. T 세포를 루시페라제+ HDML-2 세포와 상이한 비 (0.3:1 - 10:1)로 공동-인큐베이션하였다.
도 18은 CART123 및 CART30 세포가 증식 검정에서 호지킨 림프종 세포주와 공동-배양한 경우에 강건한 증식을 제시하였지만 UTD는 그렇지 않다는 것을 제시한다. T 세포를 5-일 T 세포 증식 검정에서 HL 세포주 (CD123+) 또는 대조군 (Jurkat CD123-, MOLM-14 CD123+) 또는 PMA/이오노마이신 (양성 대조군) 또는 세포 배지 (음성 대조군)와 인큐베이션하였다.
도 19a, 19b, 19c, 및 19d를 포함하는 도 19는 CART123이 IFNg (도 19a), IL-2 (도 19b), TNFa (도 19c), 및 MIP1b (도 19d) 루미넥스 MFI의 강건한 생산을 유도한다는 것을 제시한다.
도 20은 호지킨 림프종의 생체내 모델의 개략적 표현을 제시한다. 1백만개의 루시페라제+ HDLM-2 세포를 제0일에 i.v. 주사하였다. 이어서 연속 생물발광 영상화 (BLI)를 수행하여 종양 수준을 관찰하였다. 낮은 수준의 종양이 제7일에 관찰되었고, 이어서 대략 6주에 걸쳐 인간 질환의 무통성 속성을 재현하는 종양 부담에서의 점진적 증가가 이어졌다. 종양 부담이 기준선보다 20-배 더 높아진 때인 제43일에, 마우스를 1백5십만개의 CART123 세포 또는 대조군 T 세포로 처리하였다.
도 21은 도 28의 개략도에 따라 CART123 세포, 대조군 T 세포로 처리되거나 비처리된 마우스에서의 주사 이후 일에 HDLM-2를 검출하기 위한 BLI를 제시한다.
도 22는 도 28에 제시된 개략도에 따라 처리된 마우스의 생존, 14일 내의 파종성 종양의 CART123 유도된 완전 및 지속적 근절을 제시하며, 이는 6개월에 100% 재발-부재 및 100% 전체 생존으로 이어진다.
도 23은 종양 제거와, 연속 말초 혈액 채혈 중 유동 세포측정법에 의해 검출된 바와 같은 광범위한 CAR T 세포 확장 사이의 연관성을 제시한다. 확장된 T 세포는 대략 50% CD8 및 50% CD4 세포였다. T 세포 수는 종양 부담이 감소함에 따라 시간의 경과에 따라 축소되었다.
도 24a, 24b, 및 24c를 포함하는 도 24는 표적 세포 MOLM13, PL21, 및 U87과 표시된 비로 배양한 경우에 CAR123 구축물 (CD123-2, CD123-3, 및 CD123-4)을 발현하는 T 세포로부터의 시토카인 생산을 제시하는 막대 그래프이다. 도 24a는 IL-2의 생산을 제시하고; 도 24b는 IFN-감마의 생산을 제시하고; 도 24c는 TNF-알파의 생산을 제시한다.
도 25는 표적 세포 MOLM13 (CD123을 발현함), K562-인간 CD123 (인간 CD123을 발현함), 또는 K562 (CD123을 발현하지 않음)의 존재 하에 배양한 경우에 CAR123-2 (LV CAR123-2) 또는 대조군 항-GH를 발현하는 렌티바이러스 형질도입된 T 세포의 증식 능력을 제시하는 막대 그래프이다.
도 26a, 26b, 및 26c를 포함하는 도 26은 CAR123 CAR (LV CAR123-2) 또는 대조군 (항-GH)을 발현하는 렌티바이러스 형질도입된 T 세포 또는 비형질도입된 세포 (UTD)가 다양한 표적 세포:이펙터 세포 비에서 표적 세포를 사멸하는 능력을 제시하며, 여기서 표적 세포는 CD123-발현 MOLM13 (도 26a) 또는 PL21 (도 26b) 세포, 또는 CD123-음성 U87 세포 (도 26c)이다.
도 27a 및 27b를 포함하는 도 27은 표적 세포 MOLM13 (CD123을 발현함) 및 U87 (CD123을 발현하지 않음)의 존재 하에 배양한 경우에 CAR123 (LV CAR123-2) 또는 대조군 (항-GH)을 발현하는 렌티바이러스 형질도입된 T 세포로부터의 시토카인 생산을 제시하는 그래프이다. 도 27a는 IFNγ 및 TNFα의 시토카인 생산을 제시하고; 도 27b는 IL-2의 시토카인 생산을 제시한다.
도 28은 호지킨 림프종의 생체내 마우스 모델에서의 종양 부담을 제시하며, 여기서 종양을 보유하는 마우스에게 다양한 CAR123 구축물: 1172, 1176, NVS2 (본원에서 CAR123-2로도 지칭됨), NVS3 (본원에서 CAR123-3으로도 지칭됨), 및 NVS4 (본원에서 CAR123-4로도 지칭됨)를 발현하는 T 세포를 투여하였다. 제6일, 제14일, 제20일, 및 제27일에 종양 부담을 측정하였고, 이는 생물발광 영상화 (BLI)에 의해 나타내어졌다.
도 29는 생체내 마우스 모델에서의 종양 부담을 제시하며, 여기서 종양을 보유하는 마우스에게 렌티바이러스 벡터로부터 도입된 CAR123-2 (CART123 LV), RNA로서 도입된 CAR123-2 (CART123 RNA (NVS)), 및 RNA로서 도입된 도구 CAR123 (CART123 RNA (Penn))을 발현하는 T 세포를 투여하였다. 비형질도입된 T 세포를 대조군으로서 사용하였다 (UTD). 종양 부담은 생물발광 영상화 (BLI) 단위에 의해 나타내어진다.
도 30a, 30b, 30c, 및 30d를 포함하는 도 30은 생체내 마우스 모델에서의 종양의 생물발광 영상화를 제시한다. 도 30a는 비형질도입된 세포가 투여된 마우스를 제시하고; 도 30b는 RNA CAR123-2를 발현하는 T 세포가 투여된 마우스를 제시하고; 도 30c는 CAR123-2를 발현하는 렌티바이러스 형질도입된 T 세포가 투여된 마우스를 제시하고; 도 30d는 RNA 도구 CAR123을 발현하는 T 세포가 투여된 마우스를 제시한다.
도 31a, 31b, 31c, 31d, 31e, 및 31f를 포함하는 도 31은 CD123이 CART19 처리 후에 발생한 CD19-neg B-세포 급성 림프모구성 백혈병 재발에서 고도로 발현된다는 것을 제시한다. 도 31a는 42종의 재발성/불응성 ALL 샘플에서의 CD123의 발현을 CD19와 비교하여 제시한다. 도 31b는 B-ALL 모세포에서의 CD123 및 CD19 공동-발현을 제시한다. 모세포 (SSC 저, 단일선, 생, CD45dim)에 대해 게이팅하였다. 도 31c는 백혈병 줄기 세포 (LSC)에 대한 게이팅 전략을 제시한다. CD123은 이러한 하위세트에서 고도로 발현된다. 도 31d는 CD123 및 CD19 공동-발현 및 FISH 분석으로부터의 결과를 제시한다. 도 31e 및 31f는 기준선에서의 또는 재발 후의 CD19 및 CD123 발현의 비교를 제시한다.
도 32a, 32b, 32c, 32d, 32e, 및 32f를 포함하는 도 32는 CD19 CAR (CAR19) 또는 CD123 CAR (CAR123)을 발현하는 T 세포를 사용한 다양한 시험관내 검정으로부터의 결과를 제시한다. 도 32a는 CD19 및 CD123 발현을 제시하고; 도 32b는 CD107a 탈과립화 검정을 제시하고; 도 32c는 표적화된 세포 사멸에 대한 능력을 제시하고; 도 32d 및 e는 증식 능력을 제시하고; 도 32f는 표시된 시토카인에 대한 시토카인 생산을 제시한다.
도 33a, 33b, 및 33c를 포함하는 도 33은 CD19 CAR (CAR19) 또는 CD123 CAR (CAR123)을 발현하는 CART 세포가 생체내 마우스 모델에서 항종양 효과를 갖는다는 것을 제시한다. 도 33a는 생물발광 영상화에 의해 나타내어지는 종양 부담을 제시하고; 도 33b는 CART 요법을 제공받은 마우스의 전체 생존 곡선을 제시하고; 도 33c는 말초 혈액에서의 CART123 세포의 확장을 제시한다.
도 34a, 34b, 34c, 34d, 34e, 및 34f를 포함하는 도 34는 CART123이 항원-상실 재발의 생체내 마우스 모델에서 활성이라는 것을 제시한다. 도 34a는 실험 개요를 제시하고; 도 34b는 CD19 발현과 관련하여 (상부 그래프) 및 CART19 요법을 사용한 처리에 대한 반응으로 (하부 그래프) 기준선 및 재발 질환에서의 생물발광 영상화에 의해 나타내어진 바와 같은 질환 진행을 제시하고; 도 34c는 비형질도입된 T 세포 또는 CART19 세포가 투여된 마우스의 생물발광 영상을 제시하고; 도 34d는 CART19 또는 CART123을 사용하여 처리하는 것에 대한 실험 개요를 제시하고; 도 34e는 질환 진행을 제시하고; 도 34f는 처리된 마우스의 전체 생존을 제시한다.
도 35a, 35b, 및 35c를 포함하는 도 35는 이종이식편 마우스의 두개골 골수에서의 ALL-CART 상호작용을 제시한다. 도 35a는 실험 개요를 제시하고; 도 35b는 CD19 및 CD123 또는 CD123 단독을 발현하도록 조작된 ALL 종양과 상호작용하는 CART19 세포 및 CART123 세포의 대표적인 다광자 XY 평면 영상을 제시하고 (운동성 세포는 파선 원형으로 표시되고, 비-운동성 세포는 화살표로 표시됨); 도 35c는 현미경검사 영상의 그래프 표현이다.
도 36a, 36b, 및 36c를 포함하는 도 36은 CART19 및 CART123을 사용한 CD19-neg 재발의 예방을 제시한다. 도 36a는 실험 개요를 제시하고; 도 36b는 비형질도입된 T 세포 (상부 그래프), CART19 (중간 그래프), 또는 CART19 및 CART123의 조합 (하부 그래프)을 사용하여 처리된 마우스의 질환 진행 (BLI에 의해 나타내어진 바와 같은 종양 부담)을 제시하고; 도 36c는 이러한 실험으로부터의 전체 생존을 제시한다.
도 37a 및 37b를 포함하는 도 37은 CAR19 및 CAR123 둘 다를 발현하는 T 세포 (도 37a) 및 탈과립화 검정으로부터의 결과 (도 37b)를 제시한다.
도 38a 및 38b를 포함하는 도 38은 ALL 모세포의 특징을 제시한다. 도 38a는 다양한 마커 CD19, CD123, CD10, CD34, 및 CD20의 발현을 제시하고; 도 38b는 CD19-CD123+ 세포를 분류하기 위한 게이팅 전략을 제시한다.
도 39a, 39b, 39c, 및 39d를 포함하는 도 39는 CART123의 항백혈병 활성을 제시한다. 도 39a는 NALM6 세포 상에서의 CD19 및 CD123의 발현을 제시하고; 도 39b는 CART19 또는 CART123 요법에 대한 반응으로 종양 부담을 제시하고 (BLI에 의해 나타내어진 바와 같음); 도 39c는 CART19 또는 CART123이 투여된 마우스의 전체 생존을 제시하고; 도 39d는 다양한 용량의 CART123이 투여된 마우스의 전체 생존을 제시한다.
도 40a 및 40b를 포함하는 도 40은 항원-상실 재발의 생체내 모델의 특징화를 제시한다. 도 40a는 CD19 음성 재발 질환에서의 CD123의 발현을 제시하고; 도 40b는 시험관내 기준선 또는 재발 세포와 배양한 경우의 CART19 또는 CART123 세포의 탈과립화 검정을 제시한다.
도 41a, 41b 및 41c를 포함하는 도 41은 원발성 AML 세포 상에서의 PD1 L1 (도 41a), 및 T 세포 상에서의 PD1 (도 41b) 및 TIM3 (도 41c)의 발현을 제시한다.
도 42a, 42b, 42c, 및 42d를 포함하는 도 42는 CD8+ T 세포 상에서의 면역 체크포인트 PD1 (도 42a), TIM3 (도 42b), LAG3 (도 42c), 및 CTLA4 (도 42d)의 발현을 제시한다.
도 43은 AML 기준선 (좌측) 및 재발 (우측) 샘플 상에서의 TIM3 발현의 유동 세포측정 분석을 제시한다.
도 44는 비형질도입된 (UTD) 세포를 사용한 처리와 비교하여 CART123 처리 후의 종양 부담을 제시한다 (생물발광 영상화, 광자/sec에 의해 나타내어짐).
도 45는 완화 상태 또는 재발 후 CD123 처리 후의 이종이식편의 T 세포 상에서의 TIM3 및 PD1의 발현을 제시한다.
도 46a 및 46b를 포함하는 도 46은 체크포인트 억제제, 예를 들어 PD1, TIM3의 억제제, PD1 및 TIM3 억제제의 조합, 또는 TIM3 및 CEACAM-1 억제제의 조합과 공동배양한 후의 재발 마우스로부터의 골수의 특징화를 제시한다. GMCSF, IFNg, Ki67, 및 MIP1b를 발현하는 T 세포의 백분율을 PMA/IONO의 부재 (도 46a) 또는 존재 (도 46b) 하에 검출하였다.
도 47은 AML 이종이식편을 비형질도입된 세포 및 PD1 억제제 또는 TIM3 억제제로 처리하는 것에 대한 실험 개요를 제시한다.
도 48은 도 47에 도시된 실험의 경우의 종양 부담을 제시한다 (BLI, 광자/sec에 의해 나타내어짐).
도 49는 AML 이종이식편을 CART123으로 TIM3 및/또는 PD1 억제제와 조합하여 처리하는 것에 대한 실험 개요를 제시한다.
도 50a, 50b, 50c, 및 50d를 포함하는 도 50은 도 49에 도시된 실험의 경우의 종양 부담을 제시한다 (BLI, 광자/sec에 의해 나타내어짐). 도 50a는 CART123을 CART123 및 PD1 억제제의 조합과 비교하고; 도 50b는 CART123을 CART123 및 PD1 억제제 및 TIM3 억제제의 조합과 비교하고; 도 50c는 CART123을 CART123 및 TIM3 억제제의 조합과 비교하고, 도 50d는 도 50a-c에 표시된 데이터에 대한 대표적인 플롯을 제시한다.
도 51a, 51b, 51c, 51d, 및 51e를 포함하는 도 51은 단일 벡터 상에서의 다양한 구성을 제시하며, 예를 들어 여기서 U6 조절 shRNA는 EF1 알파 조절 CAR 코딩 요소의 상류 또는 하류에 있다. 도 51a 및 51b에 도시된 예시적인 구축물에서, 전사는 U6 및 EF1 알파 프로모터를 통해 동일한 방향으로 일어난다. 도 51c 및 51d에 도시된 예시적인 구축물에서, 전사는 U6 및 EF1 알파 프로모터를 통해 상이한 방향으로 일어난다. 도 51e에서, shRNA (및 상응하는 U6 프로모터)는 제1 벡터 상에 존재하고, CAR (및 상응하는 EF1 알파 프로모터)은 제2 벡터 상에 존재한다.
도 52는 2종의 예시적인 RCAR 구성의 구조를 도시한다. 항원 결합 구성원은 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 스위치 도메인을 포함한다. 세포내 결합 구성원은 스위치 도메인, 공동-자극 신호전달 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함한다. 2종의 구성은 본원에 기재된 제1 및 제2 스위치 도메인이 항원 결합 구성원 및 세포내 결합 구성원과 관련하여 상이한 배향으로 존재할 수 있음을 입증한다. 다른 RCAR 구성이 본원에 추가로 기재되어 있다.
도 53은 CAR-발현, 형질도입된 T 세포의 증식이 세포 배양 시스템에서 낮은 용량의 RAD001에 의해 증진된다는 것을 제시한다. CART를 상이한 농도의 RAD001의 존재 하에 Nalm-6 세포와 공동-배양하였다. CAR-양성 CD3-양성 T 세포 (흑색) 및 총 T 세포 (회색)의 수를 공동-배양 4일 후에 평가하였다.
도 54는 0.3, 1, 3, 및 10 mg/kg (mpk)으로의 매일 RAD001 투여 또는 비히클 투여에 의한 NALM6-luc 세포의 종양 성장 측정을 도시한다. 원형은 비히클을 나타내고; 사각형은 10 mg/kg 용량의 RAD001을 나타내고; 삼각형은 3 mg/kg 용량의 RAD001을 나타내고, 역삼각형은 1 mg/kg 용량의 RAD001을 나타내고; 다이아몬드형은 0.3 mg/kg 용량의 RAD001을 나타낸다.
도 55a 및 55b를 포함하는 도 55는 NALM6 종양을 갖는 NSG 마우스의 혈액 중 RAD001의 양을 제시하는 약동학 곡선을 제시한다. 도 55a는 RAD001의 최초 용량 후 제0일 PK를 제시한다. 도 55b는 최종 RAD001 용량 후 제14일 PK를 제시한다. 다이아몬드형은 10 mg/kg 용량의 RAD001을 나타내고; 사각형은 1 mg/kg 용량의 RAD001을 나타내고; 삼각형은 3 mg/kg 용량의 RAD001을 나타내고; x형은 10 mg/kg 용량의 RAD001을 나타낸다.
도 56a 및 56b를 포함하는 도 56은 RAD001 투여의 존재 및 부재 하에서의 인간화 CD19 CART 세포의 생체내 증식을 제시한다. 매일 낮은 용량의 RAD001 (0.003 mg/kg)은 huCAR19 증식의 정상 수준을 초과하는 CAR T 세포 증식에서의 증진으로 이어진다. 도 56a는 CD4+ CAR T 세포를 제시하고; 도 56b는 CD8+ CAR T 세포를 제시한다. 원형은 PBS를 나타내고; 사각형은 huCTL019를 나타내고; 삼각형은 huCTL019와 3 mg/kg RAD001을 나타내고; 역삼각형은 huCTL019와 0.3 mg/kg RAD001을 나타내고; 다이아몬드형은 huCTL019와 0.03 mg/kg RAD001을 나타내고; 원형은 huCTL019와 0.003 mg/kg RAD001을 나타낸다.
도 57은 CART123 활성을 종료시키기 위한 전략에서의 CAR123 및 CD20을 발현하는 렌티바이러스 벡터의 벡터 지도이며, 여기서 CAR123 서열 및 CD20 서열은 P2A 서열에 의해 연결된다.
도 58은 CART123을 CART123 P2A CD20 세포와 비교한 CD107 탈과립화 검정의 결과를 제시한다.
도 59a, 59b, 59c, 및 59d를 포함하는 도 59는 CART123 P2A CD20 세포와 비교하여 CART123 세포에 의한 GM-CSF (도 59a), TNF알파 (도 59b), IFN감마 (도 59c), 및 IL-2 (도 59d)의 생산을 제시한다.
도 60은 표시된 이펙터:표적 세포 비로 인큐베이션된 경우의 CART123 세포의 세포독성 능력 (% 특이적 용해에 의해 나타내어진 바와 같음)을 CART123 P2A CD20 세포와 비교하여 제시한다.
도 61a 및 61b를 포함하는 도 61은 CART123 세포 (도 61a) 및 CART123 P2A CD20 세포 (도 61b)에 대한 표시된 용량의 리툭시맙에 의한 처리 후의 T 세포 고갈을 제시한다.
도 62는 15% 보체의 존재 하에 CART123 P2A CD20 세포에 대한 리툭시맙의 표시된 용량으로의 처리 후의 T 세포 고갈을 제시한다.
도 63a 및 63b를 포함하는 도 63은 CAR19 및 CAR123 둘 다를 발현하는 이중 CART 세포에 대한 전략을 입증한다. 도 63a는 P2A 서열을 통해 연결된, CAR19 및 CAR123을 함유하는 벡터 지도이다. 도 63b는 CAR19, CAR123 (Q3), 및 CAR19 (Q1) 및 CAR123 (Q2) 둘 다를 발현하는 세포의 백분율을 제시한다.
도 64a 및 64b를 포함하는 도 64는 CAR19 및 CAR123 둘 다를 발현하는 스플릿 CART 세포를 위한 전략을 입증한다. 도 64a는 P2A 서열을 통해 연결된 CAR19 및 CAR123을 함유하는 벡터 지도이다. CAR19는 CD3제타 도메인을 포함하는 한편, CAR123은 4-1BB 도메인을 포함한다. 도 64b는 CAR19, CAR123 (Q3), 및 CAR19 (Q1) 및 CAR123 (Q2) 둘 다를 발현하는 세포의 백분율을 제시한다.
도 65는 원발성 HSC, AML, 및 BPDCN 샘플 상에서의 CD123의 발현을 제시한다.
도 66a 및 66b를 포함하는 도 66은 CD123-발현 표적 세포의 존재 하에 표시된 이펙터:표적 비로 인큐베이션한 경우의 CART123 클론 32716 (도 66a) 및 26292 (도 66b)에 대한 세포독성 검정을 제시한다.
도 67은 BPDCN과 비교하여 HSC와 인큐베이션한 경우의 CART123 세포에 대한 CD107 탈과립화 검정을 제시한다.
도 68a 및 68b를 포함하는 도 68은 대조군으로서 이소형 항체 (도 68a) 또는 CD123 항체 (도 68b)에 의한 염색에 의해 검출된 바와 같은, 비만 세포 백혈병/전신 비만세포증을 갖는 환자의 혈액으로부터의 단핵 세포 상에서의 CD123 발현을 제시한다.
도 69a 및 69b를 포함하는 도 69는 CART123 세포를 PMA 및 이오노마이신과 단독으로 (도 69a) 또는 비만 세포 백혈병/전신 비만세포증을 갖는 환자의 혈액으로부터의 단핵 세포와 (도 69b) 배양한 경우의 CD107 탈과립화 검정을 제시한다.
도 70은 불응성 또는 재발성 AML을 갖는 대상체에서 RNA CART123을 투여하는 것에 대한 임상 연구에서의 대상체 코호트 1에 대한 실험 개요를 제시한다.
도 71은 불응성 또는 재발성 AML을 갖는 대상체에서 RNA CART123을 투여하는 것에 대한 임상 연구에서 대상체 코호트 2에 대한 실험 개요를 제시한다. 이들 환자는 CART 요법에 더하여 림프구고갈 화학요법의 투여를 제공받는다.
도 72a, 72b, 및 72c를 포함하는 도 72는 MOLM14 이종이식편 모델에서 렌티바이러스 형질도입된 CART123 세포로 처리한 후 항-CD52 항체 알렘투주맙을 사용한 T 세포 절제의 결과를 제시한다. CART123 세포 또는 비형질도입된 (UTD) 세포를 제1주에 마우스에게 투여하였다. CART123 세포를 제공받은 마우스에게 알렘투주맙을 제2주, 제3주, 또는 제4주에 투여하고, 종양 부담을 24주 동안 평가하였다. "MOLM14" 재챌린지를 12주에 도입하였다. 도 72a는 생물발광 영상화 (광자/sec)에 의해 검출된 바와 같은 종양 부담을 제시하고; 도 72b는 말초 혈액에서 검출된 CART 세포의 퍼센트를 제시하고; 도 72c는 전체 생존을 제시한다.
도 73a 및 73b를 포함하는 도 73은 소아 AML 이종이식편 모델에서 렌티바이러스 형질도입된 CART123 세포로 처리한 후 알렘투주맙을 사용한 T 세포 절제의 결과를 제시한다. CART123 세포 또는 비형질도입된 (UTD) 세포를 원발성 AML 세포 생착 6주 후에 마우스에게 투여하였다 (제0주). CART123 처리를 제공받은 마우스에게 알렘투주맙을 제4주에 투여하였다. 도 73a는 생물발광 영상화 (광자/sec)에 의해 검출된 바와 같은 종양 부담을 제시하고; 도 73b는 말초 혈액에서 검출된 CART 세포의 퍼센트를 제시한다.
도 74a 및 74b를 포함하는 도 74는 도 73에서 수행된 바와 같은 CART123 및 알렘투주맙으로 처리한 후 비장 (도 74a) 및 골수 (도 74b)에서의 AML 세포의 분석을 제시한다.
도 75는 AML 이종이식편 모델에서 종양 부담 (생물발광 영상화; 광자/sec에 의해 나타내어짐)에 대한 3종의 종결 전략: (1) 알렘투주맙 처리에 의한 CART 세포 절제; (2) T 세포에서의 CAR/CD20 공동-발현 및 리툭시맙에 의한 절제; 및 (3) RNA-전기천공된 CART 세포의 비교를 제시한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
단수형태 용어는 문장의 하나 또는 하나 초과 (즉, 적어도 하나)의 문법적 대상을 지칭한다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
용어 "약"은, 측정가능한 값, 예컨대 양, 시간 기간 등을 언급하는 경우에 명시된 값으로부터 ±20%, 또는 일부 경우에 ±10%, 또는 일부 경우에 ±5%, 또는 일부 경우에 ±1%, 또는 일부 경우에 ±0.1%의 변동을 포괄하는 것으로 의도되고, 이는 이러한 변동이 개시된 방법의 수행에 적절하기 때문이다.
용어 "키메라 항원 수용체" 또는 대안적으로 "CAR"은 적어도 세포외 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 하기 정의되는 바와 같은 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 신호전달 도메인 (본원에서 "세포내 신호전달 도메인"으로도 지칭됨)을 포함하는 재조합 폴리펩티드 구축물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드 구축물 내의 도메인은 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 있고, 예를 들어 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드 구축물 내의 도메인은 서로 인접하지 않고, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 RCAR에 제공된 바와 같이, 예를 들어 상이한 폴리펩티드 쇄 내에 있다.
한 측면에서, CAR의 자극 분자는 T 세포 수용체 복합체와 회합된 제타 쇄이다. 한 측면에서, 세포질 신호전달 도메인은 1차 신호전달 도메인 (예를 들어, CD3-제타의 1차 신호전달 도메인)을 포함한다. 한 측면에서, 세포질 신호전달 도메인은 하기 정의된 바와 같은 적어도 1개의 공동자극 분자로부터 유래된 1개 이상의 기능적 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 한 측면에서, 공동자극 분자는 4-1BB (즉, CD137), CD27, ICOS 및/또는 CD28로부터 선택된다. 한 측면에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 막횡단 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 막횡단 도메인 및 공동-자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 막횡단 도메인 및 하나 이상의 공동-자극 분자(들)로부터 유래된 2개의 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 막횡단 도메인 및 하나 이상의 공동-자극 분자(들)로부터 유래된 적어도 2개의 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 CAR 융합 단백질의 아미노-말단 (N-ter)에서 임의적인 리더 서열을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인의 N-말단에 리더 서열을 추가로 포함하고, 여기서 리더 서열은 CAR의 세포 프로세싱 및 세포 막으로의 국재화 동안 항원 인식 도메인 (예를 들어, aa scFv)으로부터 임의로 절단된다.
특이적 종양 마커 X (여기서 X는 본원에 기재된 바와 같은 종양 마커일 수 있음)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 (예를 들어 scFv, 단일 도메인 항체, 또는 TCR (예를 들어, TCR 알파 결합 도메인 또는 TCR 베타 결합 도메인))을 포함하는 CAR은 또한 XCAR로 지칭된다. 예를 들어, CD123에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR은 CD123 CAR로 지칭된다. CAR은 임의의 세포, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)에서 발현될 수 있다.
용어 "신호전달 도메인"은 정보를 세포 내로 전달함으로써 제2 메신저를 생성하거나 또는 이러한 메신저에 반응하여 이펙터로서 기능함으로써 규정된 신호전달 경로를 통해 세포 활성을 조절하는 작용을 하는 단백질의 기능적 부분을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "IL-3 수용체의 알파 서브유닛," "IL3Rα," "CD123," "IL3Rα 쇄" 및 "IL3Rα 서브유닛"은 백혈병 전구체 세포 상에서 검출가능한 것으로 공지된 항원 결정기를 상호교환가능하게 지칭한다. 인간 및 뮤린 아미노산 및 핵산 서열은 공중 데이터베이스, 예컨대 진뱅크(GenBank), 유니프롯(UniProt) 및 스위스-프롯(Swiss-Prot)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 인간 IL3Rα의 아미노산 서열은 수탁 번호 NP 002174에서 확인할 수 있고, 인간 IL3Rα를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 NM 005191에서 확인할 수 있다. 한 측면에서, CAR의 항원-결합 부분은 CD123 단백질의 세포외 도메인 내의 에피토프를 인식하고 결합한다. 한 측면에서, CD123 단백질은 암 세포 상에서 발현된다. 본원에 사용된 "CD123"은 전장 야생형 CD123의 돌연변이, 예를 들어 점 돌연변이, 단편, 삽입, 결실 및 스플라이스 변이체를 포함하는 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 항원에 특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린 분자로부터 유래된 단백질, 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날, 다중 또는 단일 쇄, 또는 무손상 이뮤노글로불린일 수 있고, 천연 공급원으로부터 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 항체는 이뮤노글로불린 분자의 사량체일 수 있다.
용어 "항체 단편"은 무손상 항체 또는 그의 재조합 변이체의 적어도 한 부분를 지칭하고, 표적, 예컨대 항원에 대한 항체 단편의 인식 및 특이적 결합을 부여하는데 충분한 항원 결합 도메인, 예를 들어 무손상 항체의 항원 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, scFv 항체 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체, 예컨대 sdAb (VL 또는 VH), 낙타류 VHH 도메인, 및 항체 단편, 예컨대 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편으로부터 형성된 다중-특이적 항체, 및 단리된 CDR 또는 항체의 다른 에피토프 결합 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 항원 결합 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 나노바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv 내에 혼입될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005] 참조). 항원 결합 단편은 또한, 피브로넥틴 유형 III (Fn3)과 같이, 폴리펩티드를 기반으로 하는 스캐폴드 내로 그라프팅될 수 있다 (피브로넥틴 폴리펩티드 미니바디를 기재한 미국 특허 번호 6,703,199 참조).
용어 "scFv"는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 1개의 항체 단편 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 1개의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭하며, 여기서 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 짧은 가요성 폴리펩티드 링커를 통해 인접하여 연결되고, 단일 쇄 폴리펩티드로서 발현될 수 있고, 여기서 scFv는 그것이 유래된 무손상 항체의 특이성을 보유한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 scFv는 VL 및 VH 가변 영역을 임의의 순서로 가질 수 있고, 예를 들어 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단 단부와 관련하여, scFv는 VL-링커-VH를 포함할 수 있거나 또는 VH-링커-VL을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항원 특이성 및 결합 친화도를 부여하는 항체 가변 영역 내의 아미노산의 서열을 지칭한다. 예를 들어, 일반적으로, 각 중쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR (예를 들어, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3) 및 각 경쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR (LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)이 존재한다. 주어진 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌 [Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("카바트(Kabat)" 넘버링 스킴), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 ("코티아(Chothia)" 넘버링 스킴)]에 기재된 것을 비롯하여 널리 공지된 다수의 스킴 중 임의의 것 또는 그의 조합을 사용하여 결정될 수 있다. 카바트 넘버링 스킴 하에, 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 도메인 (VH)에서의 CDR 아미노산 잔기는 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) 및 95-102 (HCDR3)로 넘버링되고; 경쇄 가변 도메인 (VL)에서의 CDR 아미노산 잔기는 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) 및 89-97 (LCDR3)로 넘버링된다. 코티아 넘버링 스킴 하에, 일부 실시양태에서, VH에서의 CDR 아미노산은 26-32 (HCDR1), 52-56 (HCDR2) 및 95-102 (HCDR3)로 넘버링되고; VL에서의 CDR 아미노산 잔기는 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) 및 91-96 (LCDR3)으로 넘버링된다. 조합된 카바트 및 코티아 넘버링 스킴에서, 일부 실시양태에서, CDR은 카바트 CDR, 코티아 CDR, 또는 둘 다의 일부인 아미노산 잔기에 상응된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, CDR은 VH, 예를 들어 포유동물 VH, 예를 들어 인간 VH에서 아미노산 잔기 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2), 및 95-102 (HCDR3)에 상응하고; VL, 예를 들어 포유동물 VL, 예를 들어 인간 VL에서 아미노산 잔기 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2), 및 89-97 (LCDR3)에 상응한다.
항체 또는 그의 항체 단편을 포함하는 본 발명의 CAR 조성물의 부분은, 항원 결합 도메인이 예를 들어 단일 도메인 항체 단편 (sdAb), 단일 쇄 항체 (scFv), 및 인간화 또는 인간 항체를 비롯한 인접 폴리펩티드 쇄의 부분으로서 발현되는 다양한 형태로 존재할 수 있다 (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). 한 측면에서, 본 발명의 CAR 조성물의 항원 결합 도메인은 항체 단편을 포함한다. 추가 측면에서, CAR은 scFv를 포함하는 항체 단편을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "결합 도메인" 또는 "항체 분자" (본원에서 "항-표적 (예를 들어, CD123) 결합 도메인"으로도 지칭됨)는 적어도 1개의 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 단백질, 예를 들어 이뮤노글로불린 쇄 또는 그의 단편을 지칭한다. 용어 "결합 도메인" 또는 "항체 분자"는 항체 및 항체 단편을 포괄한다. 한 실시양태에서, 항체 분자는 다중특이적 항체 분자이고, 예를 들어 이는 복수개의 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열을 포함하며, 여기서 복수개 중 제1 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열은 제1 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖고, 복수개 중 제2 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열은 제2 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는다. 한 실시양태에서, 다중특이적 항체 분자는 이중특이적 항체 분자이다. 이중특이적 항체는 2개 이하의 항원에 대해 특이성을 갖는다. 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다.
용어 "항체 중쇄"는 그의 자연 발생 입체형태로 항체 분자에 존재하고 통상적으로 항체가 속하는 부류를 결정하는, 폴리펩티드 쇄의 2개의 유형 중 더 큰 것을 지칭한다.
용어 "항체 경쇄"는 그의 자연 발생 입체형태로 항체 분자에 존재하는 폴리펩티드 쇄의 2개의 유형 중 더 작은 것을 지칭한다. 카파 (κ) 및 람다 (λ) 경쇄는 2개의 주요 항체 경쇄 이소형을 지칭한다.
용어 "재조합 항체"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체, 예컨대 예를 들어 박테리오파지 또는 효모 발현 시스템에 의해 발현된 항체를 지칭한다. 상기 용어는 또한 항체를 코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성된 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 하고, DNA 분자는 항체 단백질, 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현하며, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 관련 기술분야에서 이용가능하고 널리 공지된 재조합 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득된다.
용어 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 분자를 지칭한다. 이러한 면역 반응은 항체 생산, 또는 특이적 면역학적-적격 세포의 활성화, 또는 둘 다를 수반할 수 있다. 통상의 기술자는 실질적으로 모든 단백질 또는 펩티드를 비롯한 임의의 거대분자가 항원으로서의 역할을 할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 따라서, 통상의 기술자는 면역 반응을 도출하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가, 본원에 사용된 용어 "항원"을 코딩함을 이해할 것이다. 또한, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 코딩될 필요는 없음을 이해할 것이다. 본 발명은 1개 초과의 유전자의 부분적인 뉴클레오티드 서열의 사용을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니고, 이들 뉴클레오티드 서열은 목적하는 면역 반응을 도출하는 폴리펩티드를 코딩하기 위해 다양한 조합으로 배열됨이 분명하다. 또한, 통상의 기술자는 항원이 "유전자"에 의해 코딩될 필요가 전혀 없음을 이해할 것이다. 항원은 합성되어 생성될 수 있거나 또는 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있거나, 또는 폴리펩티드 이외의 거대분자일 수 있음이 분명하다. 이러한 생물학적 샘플은 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 다른 생물학적 성분을 갖는 유체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "항종양 효과"는, 예를 들어 종양 부피의 감소, 종양 세포의 수의 감소, 전이의 수의 감소, 기대 수명의 증가, 종양 세포 증식의 감소, 종양 세포 생존의 감소, 또는 암성 상태와 연관된 다양한 생리학적 증상의 호전을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 다양한 수단에 의해 나타내질 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항종양 효과"는 또한 먼저 종양 발생의 예방에서 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 나타내질 수 있다.
용어 "항암 효과"는, 예를 들어 종양 부피의 감소, 암 세포의 수의 감소, 전이의 수의 감소, 기대 수명의 증가, 암 세포 증식의 감소, 암 세포 생존의 감소, 또는 암성 상태와 연관된 다양한 생리학적 증상의 호전을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 다양한 수단에 의해 나타내질 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항암 효과"는 또한 먼저 암 발생의 예방에서 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 나타내질 수 있다. 용어 "항종양 효과"는, 예를 들어 종양 부피의 감소, 종양 세포의 수의 감소, 종양 세포 증식의 감소, 또는 종양 세포 생존의 감소를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 다양한 수단에 의해 나타내질 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다.
용어 "자가"는 이후 개체에게 재도입될 예정인, 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "동종"은 물질이 도입되는 개체와 동일한 종의 상이한 동물로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 2종 이상의 개체는 1개 이상의 유전자좌에서의 유전자가 동일하지 않을 때 서로 동종인 것으로 언급된다. 일부 측면에서, 동일한 종의 개체로부터의 동종 물질은 항원과 상호작용하기에 유전적으로 충분히 다를 수 있다.
용어 "이종"은 상이한 종의 동물로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "분리반출술"은 공여자 또는 환자의 혈액을 공여자 또는 환자에서 제거하고, 선택된 특정한 구성성분(들)을 분리하는 장치를 통과시켜, 나머지를 예를 들어 재수혈에 의해 공여자 또는 환자의 순환으로 되돌리는 기술분야-인식 체외 방법을 지칭한다. 따라서, 문맥상 "분리반출술 샘플"은 분리반출술을 사용하여 수득된 샘플을 지칭한다.
용어 "조합물"은 하나의 투여 단위 형태의 고정 조합물, 또는 본 발명의 화합물과 조합 파트너 (예를 들어 하기 기재된 바와 같은 또 다른 약물, "치료제" 또는 "공동-작용제"로도 지칭됨)가 동시에 독립적으로, 또는 시간 간격 내에 개별적으로 (특히 이들 시간 간격이 조합 파트너가 협동 효과, 예를 들어 상승작용적 효과를 제시하도록 하는 경우) 투여될 수 있는 조합 투여를 지칭한다. 단일 성분은 키트 내에 또는 개별적으로 패키징될 수 있다. 성분 (예를 들어, 분말 또는 액체) 중 하나 또는 둘 다는 투여 전에 목적하는 용량으로 재구성되거나 희석될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "공-투여" 또는 "조합 투여" 등은 선택된 조합 파트너를 그를 필요로 하는 단일 대상체 (예를 들어 환자)에게 투여하는 것을 포괄하는 것으로 의도되고, 작용제들이 반드시 동일한 투여 경로에 의해 또는 동시에 투여되지는 않는 것인 치료 요법을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 용어 "제약 조합물"은, 1종 초과의 활성 성분의 혼합 또는 조합으로부터 생성된 생성물을 의미하고, 활성 성분의 고정 및 비-고정 조합물 둘 다를 포함한다. 용어 "고정 조합물"은 활성 성분, 예를 들어 본 발명의 화합물 및 조합 파트너가 둘 다 단일 엔티티 또는 투여 형태로 환자에게 동시에 투여되는 것을 의미한다. 용어 "비-고정 조합물"은 활성 성분, 예를 들어 본 발명의 화합물 및 조합 파트너가 둘 다 별개의 엔티티로서 동시에, 공동으로, 또는 특정 시간 제한을 두지 않고 순차적으로 환자에게 투여되는 것을 의미하며, 여기서 이러한 투여는 환자의 신체에서 2종의 화합물을 치료 유효 수준으로 제공한다. 후자는 또한 칵테일 요법, 예를 들어 3종 이상의 활성 성분의 투여에 적용된다.
용어 "암"은 이상 세포의 신속 및 비제어 성장을 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 암 세포는 국부로 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 확산될 수 있다. 다양한 암의 예가 본원에 기재되어 있고, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 용어 "종양" 및 "암"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 예를 들어 둘 다의 용어는 고형 및 액상, 예를 들어 미만성 또는 순환성 종양을 포괄한다. 본원에 사용된 용어 "암" 또는 "종양"은 전암성, 뿐만 아니라 악성 암 및 종양을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "로부터 유래된"은 제1 및 제2 분자 사이의 관계를 나타낸다. 이는 일반적으로 제1 분자 및 제2 분자 사이의 구조적 유사성을 지칭하고, 제2 분자로부터 유래된 제1 분자에 대해 방법 또는 공급원 제한을 내포하거나 포함하지 않는다. 예를 들어, CD3제타 분자로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인의 경우에, 세포내 신호전달 도메인은 필요한 기능, 즉 적절한 조건 하에 신호를 생성하는 능력을 갖도록 충분한 CD3제타 구조를 보유한다. 이는 세포내 신호전달 도메인을 생성하는 특정한 방법에 대한 제한을 내포하거나 포함하지 않고, 예를 들어 세포내 신호전달 도메인을 제공하기 위해 반드시 CD3제타 서열로 출발하여, 원치않는 서열을 결실시키거나 또는 돌연변이를 부과하여 세포내 신호전달 도메인에 도달해야한다는 것을 의미하지 않는다.
본원에 사용된 어구 "CD123의 발현과 연관된 질환"은 예를 들어 증식성 질환, 예컨대 암 또는 악성종양; 전암성 상태, 예컨대 골수이형성증, 골수이형성 증후군 또는 전백혈병; 또는 CD123 (예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체 CD123)을 발현하는 세포와 연관된 비-암 관련 적응증을 비롯한, CD123의 발현과 연관된 질환 또는 CD123 (예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체 CD123)을 발현하는 세포와 연관된 상태를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 한 측면에서, CD123 (예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체 CD123)의 발현과 연관된 암은 혈액암이다. 한 측면에서, 질환은 AML, ALL, 모발상 세포 백혈병, 전림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 (CML), 호지킨 림프종, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 림프모구성 B-세포 백혈병 (B-세포 급성 림프성 백혈병, BALL), 급성 림프모구성 T-세포 백혈병 (T-세포 급성 림프성 백혈병, TALL); 골수이형성 증후군; 골수증식성 신생물; 조직구성 장애 (예를 들어, 비만 세포 장애 또는 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물); 비만 세포 장애, 예를 들어 전신 비만세포증 또는 비만 세포 백혈병 등을 포함한다. CD123 발현의 발현과 연관된 추가의 질환은, 예를 들어 비정형 및/또는 비-전형적 암, 악성종양, 전암성 상태 또는 CD123의 발현과 연관된 증식성 질환을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. CD123의 발현과 연관된 비-암 관련 적응증이 또한 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 종양 항원 (예를 들어, CD123- 또는 CD19-)-발현 세포는 종양 항원을 코딩하는 mRNA를 발현하거나 또는 임의의 시점에 발현하였다. 실시양태에서, 종양 항원 (예를 들어, CD123- 또는 CD19-)-발현 세포는 종양 항원 단백질 (예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체)을 생산하고, 종양 항원 단백질은 정상 수준 또는 감소된 수준으로 존재할 수 있다. 한 실시양태에서, 종양 항원 (예를 들어, CD123- 또는 CD19-)-발현 세포는 한 시점에 검출가능한 수준의 종양 항원 단백질을 생산하였고, 후속해서 실질적으로 전혀 검출불가능한 종양 항원 단백질을 생산하였다.
용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체 또는 항체 단편의 결합 특징에 유의한 영향을 미치거나 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 관련 기술분야에 공지된 표준 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 본 발명의 항체 또는 항체 단편 내에 도입될 수 있다. 보존적 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 관련 기술분야에서 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 발명의 CAR 내의 1개 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변경된 CAR은 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 시험될 수 있다.
용어 "자극"은 자극 분자 (예를 들어, TCR/CD3 복합체)가 그의 동족 리간드와 결합하여 신호 전달 사건, 예컨대 비제한적으로 TCR/CD3 복합체를 통한 신호 전달을 매개함으로써 유도되는 1차 반응을 지칭한다. 자극은 특정 분자의 변경된 발현, 예컨대 TGF-β의 하향조절 및/또는 세포골격 구조의 재조직화 등을 매개할 수 있다.
용어 "자극 분자"는 T 세포 신호전달 경로의 적어도 일부 측면에 대한 자극 방식에서 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호전달 서열(들)을 제공하는 T 세포에 의해 발현되는 분자를 지칭한다. 한 측면에서, 1차 신호는 예를 들어 펩티드로 로딩된 MHC 분자와 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 개시되고, 이것은 증식, 활성화, 분화 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 T 세포 반응의 매개로 이어진다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열 ("1차 신호전달 도메인"으로도 지칭됨)은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 본 발명에서 특히 유용한 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 ("ICOS"로도 공지됨), FcεRI, CD66d, DAP10, 및 DAP12로부터 유래된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 특정 CAR에서, 본 발명의 임의의 1종 이상의 CAR 내의 세포내 신호전달 도메인은 세포내 신호전달 서열, 예를 들어 CD3-제타의 1차 신호전달 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 CAR에서, CD3-제타의 1차 신호전달 서열은 서열식별번호: 9로서 제공된 서열, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기이다. 본 발명의 특정 CAR에서, CD3-제타의 1차 신호전달 서열은 서열식별번호: 10에 제공된 서열, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기이다.
용어 "항원 제시 세포" 또는 "APC"는 그의 표면 상에 주요 조직적합성 복합체 (MHC)와 복합체화된 외래 항원을 디스플레이하는 면역계 세포, 예컨대 보조 세포 (예를 들어, B-세포, 수지상 세포 등)를 지칭한다. T-세포는 그의 T-세포 수용체 (TCR)를 사용하여 이들 복합체를 인식할 수 있다. APC는 항원을 프로세싱하고, 이를 T-세포에 제시한다.
본원에 사용된 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 분자의 세포내 부분을 지칭한다. 세포내 신호전달 도메인은 CAR 함유 세포, 예를 들어 CART 세포 또는 CAR-발현 NK 세포의 면역 이펙터 기능을 촉진하는 신호를 생성할 수 있다. 예를 들어 CART 세포 또는 CAR-발현 NK 세포에서 면역 이펙터 기능의 예는 시토카인의 분비를 비롯하여 세포용해 활성 및 헬퍼 활성을 포함한다. 실시양태에서, 세포내 신호 도메인은 이펙터 기능 신호를 전달하고, 세포가 전문화된 기능을 수행하도록 지시한다. 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 많은 경우에서 전체 쇄를 사용할 필요는 없다. 세포내 신호전달 도메인의 말단절단된 부분이 사용되는 정도로, 이러한 말단절단된 부분은 이펙터 기능 신호를 전달하는 한 무손상 쇄 대신 사용될 수 있다. 용어 세포내 신호전달 도메인은 따라서 이펙터 기능 신호를 전달하는데 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 말단절단된 부분을 포함하는 것으로 의도된다.
한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 1차 세포내 신호전달 도메인은 1차 자극, 또는 항원 의존성 자극을 담당하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 공동자극 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 신호, 또는 항원 비의존성 자극을 담당하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 예를 들어, CAR-발현 면역 이펙터 세포, 예를 들어 CART 세포 또는 CAR-발현 NK 세포의 경우에, 1차 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 수용체의 세포질 서열을 포함할 수 있고, 공동자극 세포내 신호전달 도메인은 보조-수용체 또는 공동자극 분자로부터의 세포질 서열을 포함할 수 있다.
1차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 CD3 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 ("ICOS"), FcεRI, CD66d, DAP10 및 DAP12로부터 유래된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "제타" 또는 대안적으로 "제타 쇄", "CD3-제타" 또는 "TCR-제타"는 진뱅크 수탁 번호 BAG36664.1로서 제공된 단백질 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기로서 정의되고, "제타 자극 도메인" 또는 대안적으로 "CD3-제타 자극 도메인" 또는 "TCR-제타 자극 도메인"은 T 세포 활성화를 위해 필요한 초기 신호를 기능적으로 전달하기에 충분한 제타 쇄의 세포질 도메인으로부터의 아미노산 잔기로서 정의된다. 한 측면에서, 제타의 세포질 도메인은 진뱅크 수탁 번호 BAG36664.1의 잔기 52 내지 164, 또는 그의 기능적 오르토로그인 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기를 포함한다. 한 측면에서, "제타 자극 도메인" 또는 "CD3-제타 자극 도메인"은 서열식별번호: 9로서 제공된 서열이다. 한 측면에서, "제타 자극 도메인" 또는 "CD3-제타 자극 도메인"은 서열식별번호: 10으로서 제공된 서열이다.
용어 "공동자극 분자"는 공동자극 리간드에 특이적으로 결합하여, T 세포에 의한 공동자극 반응, 예컨대 비제한적으로 증식을 매개하는 T 세포 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 공동자극 분자는 효율적인 면역 반응에 필요한 항원 수용체 이외의 다른 세포 표면 분자 또는 그의 리간드이다. 공동자극 분자는 MHC 부류 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
공동자극 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 분자의 세포내 부분을 지칭한다.
세포내 신호전달 도메인은 그것이 유래된 분자의 전체 세포내 부분, 또는 전체 천연 세포내 신호전달 도메인, 또는 그의 기능적 단편을 포함할 수 있다.
용어 "4-1BB"는 진뱅크 수탁 번호 AAA62478.2로서 제공된 아미노산 서열, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기를 갖는 TNFR 수퍼패밀리의 구성원을 지칭하고; "4-1BB 공동자극 도메인"은 진뱅크 수탁 번호 AAA62478.2의 아미노산 잔기 214-255, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기로서 정의된다. 한 측면에서, "4-1BB 공동자극 도메인"은 서열식별번호: 7로서 제공된 서열 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기이다.
본원에 사용된 용어 "면역 이펙터 세포"는 면역 반응, 예를 들어 면역 이펙터 반응의 촉진에 관여하는 세포를 지칭한다. 면역 이펙터 세포의 예는 T 세포, 예를 들어 알파/베타 T 세포 및 감마/델타 T 세포, B 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 자연 킬러 T (NKT) 세포, 비만 세포 및 골수-유래 식세포를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "면역 이펙터 기능 또는 면역 이펙터 반응"은, 예를 들어 표적 세포의 면역 공격을 증진시키거나 촉진하는 면역 이펙터 세포의 기능 또는 반응을 지칭한다. 예를 들어, 면역 이펙터 기능 또는 반응은 표적 세포의 사멸, 또는 성장 또는 증식의 억제를 촉진하는 T 또는 NK 세포의 특성을 지칭한다. T 세포의 경우에, 1차 자극 및 공동자극은 면역 이펙터 기능 또는 반응의 예이다.
용어 "이펙터 기능"은 세포의 전문화된 기능을 지칭한다. T 세포의 이펙터 기능은, 예를 들어 시토카인의 분비를 비롯하여 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다.
용어 "코딩하는"은 뉴클레오티드 (예를 들어, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 규정된 서열 또는 아미노산의 규정된 서열 및 그로부터 생성된 생물학적 특성을 갖는, 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 기능하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA 내의 뉴클레오티드의 특정 서열의 고유한 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자, cDNA, 또는 RNA는 그러한 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생산할 경우에 단백질을 코딩한다. 그의 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 통상적으로 서열 목록에서 제공되는 코딩 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비-코딩 가닥 둘 다는 그러한 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 산물을 코딩하는 것으로서 지칭될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은, 서로 축중성 버전이고 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어구 단백질 또는 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 또한 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도로 인트론을 포함할 수 있다.
용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 본원에 기재된 바와 같이 특정한 생물학적 결과를 달성하는데 유효한 화합물, 제제, 물질, 또는 조성물의 양을 지칭한다.
용어 "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터의, 또는 그 내부에서 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템의 외부로부터 도입되거나 외부에서 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "발현"은 프로모터에 의해 유도되는 특정한 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 지칭한다.
용어 "전달 벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포의 내부에 전달하기 위해 사용될 수 있는 물질의 조성물을 지칭한다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 친양쪽성 화합물과 회합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 및 바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 수많은 벡터가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "전달 벡터"는 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 또한 핵산의 세포 내로의 전달을 용이하게 하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물, 예컨대 예를 들어 폴리리신 화합물, 리포솜 등을 추가로 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 전달 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "발현 벡터"는 발현시킬 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코스미드, 플라스미드 (예를 들어, 네이키드이거나 또는 리포솜 내에 포함됨) 및 바이러스 (예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-연관 바이러스)를 포함하는 관련 기술분야에 공지된 모든 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 핵산 분자를 전달하고/거나 발현하는데 사용될 수 있는 임의의 비히클을 지칭한다. 이는 본원에 기재된 바와 같은 전달 벡터 또는 발현 벡터일 수 있다.
용어 "렌티바이러스"는 레트로비리다에(Retroviridae) 패밀리의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스 중에서 특유한 것이고; 유의한 양의 유전자 정보를 숙주 세포의 DNA 내로 전달할 수 있고, 따라서 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV, 및 FIV가 렌티바이러스의 모든 예이다.
용어 "렌티바이러스 벡터"는 특히 문헌 [Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)]에서 제공되는 바와 같은 자기-불활성화 렌티바이러스 벡터를 비롯한, 렌티바이러스 게놈의 적어도 일부로부터 유래된 벡터를 지칭한다. 임상에서 사용될 수 있는 렌티바이러스 벡터의 다른 예는, 예를 들어 옥스포드 바이오메디카(Oxford BioMedica)로부터의 렌티벡터(LENTIVECTOR)® 유전자 전달 기술, 렌티겐(Lentigen)으로부터의 렌티맥스(LENTIMAX)™ 벡터 시스템 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 비임상 유형의 렌티바이러스 벡터가 또한 이용가능하고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다.
용어 "상동성" 또는 "동일성"은 2개의 중합체 분자 사이, 예를 들어 2개의 핵산 분자, 예컨대, 2개의 DNA 분자 또는 2개의 RNA 분자 사이, 또는 2개의 폴리펩티드 분자 사이의 서브유닛 서열 동일성을 지칭한다. 2개의 분자 둘 다 내의 서브유닛 위치가 동일한 단량체 서브유닛에 의해 점유된 경우; 예를 들어, 각각의 2개의 DNA 분자 내의 위치가 아데닌에 의해 점유된 경우에, 이들은 그 위치에서 상동이거나 동일하다. 2개의 서열 사이의 상동성은 매칭되는 또는 상동성 위치의 수의 직접적인 함수이고; 예를 들어, 2개의 서열 내의 위치의 절반 (예를 들어, 중합체 10개 서브유닛 길이 내의 5개의 위치)이 상동성일 경우에, 2개의 서열은 50% 상동성이고; 90%의 위치 (예를 들어, 10개 중 9개)가 매칭되거나 상동성일 경우에, 2개의 서열은 90% 상동성이다.
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대개, 인간화 항체 및 그의 항체 단편은 수용자의 상보성-결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체 또는 항체 단편)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체/항체 단편은 수용자 항체에서도, 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도, 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 또는 항체 단편 성능을 추가로 정밀화하고 최적화할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체 또는 그의 항체 단편은 적어도 하나의, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 이뮤노글로불린의 그것에 상응하고, FR 영역의 모든 또는 유의한 부분은 인간 이뮤노글로불린 서열의 그것이다. 인간화 항체 또는 항체 단편은 또한 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 그것을 포함할 수 있다. 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌 [Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992]을 참조한다.
"완전 인간"은 전체 분자가 인간 기원이거나 또는 항체 또는 이뮤노글로불린의 인간 형태와 동일한 아미노산 서열로 이루어진 이뮤노글로불린, 예컨대 항체 또는 항체 단편을 지칭한다.
용어 "단리된"은 천연 상태로부터 변경되거나 제거됨을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 천연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 그의 천연 상태의 공존하는 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 또는 예를 들어 숙주 세포와 같은 비-천연 환경에 존재할 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 통상적으로 발생하는 핵산 염기에 대해 하기 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 시토신을 지칭하고, "G"는 구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하고, "U"는 우리딘을 지칭한다.
용어 "작동가능하게 연결된" 또는 "전사 제어"는 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭하며, 후자의 발현을 야기한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열은 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 위치하는 경우에 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 서로 인접할 수 있고, 예를 들어 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하기 위해 필요한 경우에, 동일한 리딩 프레임 내에 존재한다.
용어 면역원성 조성물의 "비경구" 투여는, 예를 들어 피하 (s.c.), 정맥내 (i.v.), 근육내 (i.m.), 또는 흉골내 주사, 종양내, 또는 주입 기술을 포함한다.
용어 "핵산," "폴리뉴클레오티드," 또는 "핵산 분자"는 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA), 또는 그의 DNA 또는 RNA의 조합, 및 단일- 또는 이중-가닥 형태로의 그의 중합체를 지칭한다. 용어 "핵산"은 유전자, cDNA 또는 mRNA를 포함한다. 한 실시양태에서, 핵산 분자는 합성 (예를 들어, 화학적으로 합성됨) 또는 재조합이다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 이 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 유사체 또는 유도체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 또한 명확하게 나타낸 서열 뿐만 아니라 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축중성 코돈 치환), 대립유전자, 오르토로그, SNP, 및 상보적 서열을 함축적으로 포괄한다. 구체적으로, 축중성 코돈 치환은 1개 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다 (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 상호교환가능하게 사용되고, 펩티드 결합에 의해 공유 연결된 아미노산 잔기를 포함하는 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유하여야 하고, 단백질 또는 펩티드 서열을 구성할 수 있는 아미노산의 최대 수에 대한 제한은 존재하지 않는다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 상기 용어는 관련 기술분야에서 예를 들어 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로도 통상적으로 지칭되는 짧은 쇄, 및 많은 종류가 존재하는, 일반적으로 관련 기술분야에서 단백질로 지칭되는 더 긴 쇄 둘 다를 지칭한다. "폴리펩티드"는 특히, 예를 들어 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 또는 그의 조합을 포함한다.
용어 "프로모터"는 폴리뉴클레오티드 서열의 특이적 전사를 개시하는데 필요한, 세포의 합성 기구 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열을 지칭한다.
용어 "프로모터/조절 서열"은 프로모터/조절 서열에 작동가능하게 연결된 유전자 산물의 발현을 위해 필요한 핵산 서열을 지칭한다. 일부 경우에, 이 서열은 코어 프로모터 서열일 수 있고, 다른 예에서 이 서열은 또한 인핸서 서열, 및 유전자 산물의 발현을 위해 필요한 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은 예를 들어 조직 특이적 방식으로 유전자 산물을 발현하는 것일 수 있다.
용어 "구성적" 프로모터는, 유전자 산물을 코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 경우에 유전자 산물이 세포의 대부분의 또는 모든 생리학적 조건 하에 세포에서 생산되도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "유도성" 프로모터는, 유전자 산물을 코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 경우에 실질적으로 프로모터에 상응하는 유도인자가 세포에 존재할 때에만 유전자 산물이 세포에서 생산되도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "조직-특이적" 프로모터는, 유전자에 의해 코딩되거나 특정되는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 경우에 실질적으로 세포가 프로모터에 상응하는 조직 유형의 세포인 경우에만 유전자 산물이 세포에서 생산되도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "암 연관 항원" 또는 "종양 항원"은 상호교환가능하게, 전체로 또는 단편 (예를 들어, MHC/펩티드)으로서 암 세포의 표면 상에서 발현되고 약리학적 작용제의 암 세포에 대한 우선적인 표적화에 유용한 분자 (전형적으로 단백질, 탄수화물 또는 지질)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 종양 항원은 정상 세포 및 암 세포 둘 다에 의해 발현되는 마커, 예를 들어 계열 마커, 예를 들어 B 세포 상의 CD19 또는 CD123이다. 일부 실시양태에서, 종양 항원은 정상 세포와 비교하여 암 세포에서 과다발현, 예를 들어 정상 세포와 비교하여 1-배 과다 발현, 2-배 과다 발현, 3-배 과다 발현 또는 그 초과로 과다발현되는 세포 표면 분자이다. 일부 실시양태에서, 종양 항원은 암 세포에서 부적절하게 합성된 세포 표면 분자, 예를 들어 정상 세포 상에서 발현되는 분자와 비교하여 결실, 부가 또는 돌연변이를 함유하는 분자이다. 일부 실시양태에서, 종양 항원은 전체로 또는 단편 (예를 들어, MHC/펩티드)으로서 암 세포의 세포 표면에서 독점적으로 발현되고 정상 세포의 표면에서는 합성되거나 발현되지 않을 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 MHC 제시 펩티드에 결합하는 항원 결합 도메인 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편)을 포함하는 CAR을 포함한다. 정상적으로는, 내인성 단백질로부터 유래된 펩티드는 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 부류 I 분자의 포켓을 채우고, CD8+ T 림프구 상의 T 세포 수용체 (TCR)에 의해 인식된다. MHC 부류 I 복합체는 모든 유핵 세포에서 구성적으로 발현된다. 암에서, 바이러스-특이적 및/또는 종양-특이적 펩티드/MHC 복합체는 면역요법을 위한 세포 표면 표적의 고유한 부류를 제시한다. 인간 백혈구 항원 (HLA)-A1 또는 HLA-A2와 관련하여 바이러스 또는 종양 항원으로부터 유래된 TCR-유사 항체 표적화 펩티드가 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21):1601-1608 ; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100] 참조). 예를 들어, TCR-유사 항체는 라이브러리, 예컨대 인간 scFv 파지 디스플레이된 라이브러리의 스크리닝으로부터 확인될 수 있다.
scFv와 관련하여 사용된 용어 "가요성 폴리펩티드 링커" 또는 "링커"는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역을 함께 연결하기 위해 단독으로 또는 조합되어 사용되는 아미노산, 예컨대 글리신 및/또는 세린 잔기로 이루어진 펩티드 링커를 지칭한다. 한 실시양태에서, 가요성 폴리펩티드 링커는 Gly/Ser 링커이고, 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Ser)n (서열식별번호: 38)을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수이다. 예를 들어, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5 및 n=6, n=7, n=8, n=9 및 n=10이다. 한 실시양태에서, 가요성 폴리펩티드 링커는 (Gly4 Ser)4 (서열식별번호: 27) 또는 (Gly4 Ser)3 (서열식별번호: 28)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또 다른 실시양태에서, 링커는 (Gly2Ser), (GlySer) 또는 (Gly3Ser) (서열식별번호: 29)의 다중 반복부를 포함한다. 또한, 본원에 참조로 포함되는 WO2012/138475에 기재된 링커가 본 발명의 범주 내에 포함된다.
본원에 사용된 5' 캡 (RNA 캡, RNA 7-메틸구아노신 캡 또는 RNA m7G 캡으로도 불림)은 전사 개시 직후에 진핵 메신저 RNA의 "전면" 또는 5' 말단에 부가된 변형된 구아닌 뉴클레오티드이다. 5' 캡은 제1 전사되는 뉴클레오티드에 연결된 말단 기로 이루어진다. 그의 존재는 리보솜에 의한 인식 및 RNase로부터의 보호를 위해 중요하다. 캡 부가는 전사와 커플링되고, 각각 서로 영향을 미치도록 공동-전사 방식으로 발생한다. 전사 개시 직후에, 합성 중인 mRNA의 5' 말단은 RNA 폴리머라제와 회합된 캡-합성 복합체에 의해 결합된다. 이러한 효소 복합체는 mRNA 캡핑에 필요한 화학 반응을 촉매한다. 합성은 다단계 생화학적 반응으로서 진행된다. 캡핑 모이어티는 mRNA의 기능성, 예컨대 그의 안정성 또는 번역 효율을 조정하도록 변형될 수 있다.
본원에 사용된 "시험관내 전사된 RNA"는 시험관내에서 합성된 RNA, 바람직하게는 mRNA를 지칭한다. 일반적으로, 시험관내 전사된 RNA는 시험관내 전사 벡터로부터 생성된다. 시험관내 전사 벡터는 시험관내 전사된 RNA를 생성하기 위해 사용되는 주형을 포함한다.
본원에 사용된 "폴리(A)"는 폴리아데닐화에 의해 mRNA에 부착된 일련의 아데노신이다. 일시적 발현을 위한 구축물의 바람직한 실시양태에서, 폴리A는 50 내지 5000개 (서열식별번호: 30), 바람직하게는 64개 초과, 보다 바람직하게는 100개 초과, 가장 바람직하게는 300 또는 400개 초과이다. 폴리(A) 서열은 mRNA 기능성, 예컨대 국재화, 안정성 또는 번역 효율을 조정하기 위해 화학적으로 또는 효소적으로 변형될 수 있다.
본원에 사용된 "폴리아데닐화"는 폴리아데닐릴 모이어티, 또는 그의 변형된 변이체의 메신저 RNA 분자에 대한 공유 연결을 지칭한다. 진핵 유기체 내에서, 대부분의 메신저 RNA (mRNA) 분자는 3' 말단에서 폴리아데닐화된다. 3' 폴리(A) 테일은 효소, 폴리아데닐레이트 폴리머라제의 작용을 통해 프리-mRNA에 부가된 아데닌 뉴클레오티드 (종종 수백 개)의 긴 서열이다. 고등 진핵생물에서, 폴리(A) 테일은 특정 서열, 폴리아데닐화 신호를 함유하는 전사체 상에 부가된다. 폴리(A) 테일 및 그에 결합된 단백질은 mRNA를 엑소뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호하는 것을 돕는다. 폴리아데닐화는 또한 전사 종결, mRNA의 핵으로부터의 유출, 및 번역에 중요하다. 폴리아데닐화는 DNA의 RNA로의 전사 직후에 핵에서 일어나지만, 추가로 세포질에서 추후 일어날 수도 있다. 전사가 종결된 후에, mRNA 쇄는 RNA 폴리머라제와 연관된 엔도뉴클레아제 복합체의 작용을 통해 절단된다. 절단 부위는 통상적으로 절단 부위 근처의 염기 서열 AAUAAA의 존재를 특징으로 한다. mRNA가 절단된 후에, 아데노신 잔기는 절단 부위의 자유 3' 말단에 부가된다.
본원에 사용된 "일시적"은 수시간, 수일 또는 수주의 기간 동안의 비-통합된 트랜스진의 발현을 지칭하고, 여기서 발현 기간은 게놈 내로 통합되거나 숙주 세포 내의 안정한 플라스미드 레플리콘 내에 함유된 경우에 유전자의 발현을 위한 시간 미만이다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 1종 이상의 요법 (예를 들어, 1종 이상의 치료제, 예컨대 본 발명의 CAR)의 투여로부터 생성된 증식성 장애의 진행, 중증도 및/또는 지속기간의 감소 또는 호전, 또는 증식성 장애의 1종 이상의 증상 (바람직하게는, 1종 이상의 식별식별가능한 증상)의 호전을 지칭한다. 구체적 실시양태에서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 환자에 의해 반드시 식별가능하지 않을 수 있는 증식성 장애의 적어도 하나의 측정가능한 물리적 파라미터, 예컨대 종양의 성장의 호전을 지칭한다. 다른 실시양태에서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은, 예를 들어 식별가능한 증상의 안정화에 의해 물리적으로, 예를 들어 물리적 파라미터의 안정화에 의해 생리학적으로, 또는 둘 다로의 증식성 장애의 진행의 억제를 지칭한다. 다른 실시양태에서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 종양 크기 또는 암성 세포 카운트의 감소 또는 안정화를 지칭한다.
용어 "신호 전달 경로"는 신호를 세포의 한 부분으로부터 세포의 또 다른 부분으로의 전달에 소정의 역할을 하는 다양한 신호 전달 분자 사이의 생화학적 관계를 지칭한다. 어구 "세포 표면 수용체"는 신호를 수신하고 세포막을 가로질러 신호를 전달할 수 있는 분자 및 분자의 복합체를 포함한다.
용어 "대상체"는 면역 반응이 도출될 수 있는 살아있는 유기체 (예를 들어, 포유동물, 인간)를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "실질적으로 정제된" 세포는 다른 세포 유형이 본질적으로 없는 세포를 지칭한다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 그의 자연 발생 상태에서 정상적으로 회합되어 있는 다른 세포 유형으로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 경우에, 실질적으로 정제된 세포의 집단은 균질한 세포 집단을 지칭한다. 다른 경우에, 이 용어는 단순히 그의 천연 상태에서 자연적으로 회합되어 있는 세포로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 측면에서, 세포는 시험관내에서 배양된다. 다른 측면에서, 세포는 시험관내에서 배양되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 치료법을 의미한다. 치료 효과는 질환 상태의 감소, 억제, 완화, 또는 근절에 의해 수득된다.
본원에 사용된 용어 "예방"은 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적 치료를 의미한다.
본 발명의 문맥에서, "종양 항원" 또는 "과다증식성 장애 항원" 또는 "과다증식성 장애와 연관된 항원"은 특정 과다증식성 장애에 공통적인 항원을 지칭한다. 특정 측면에서, 본 발명의 과다증식성 장애 항원은 원발성 또는 전이성 흑색종, 흉선종, 림프종, 육종, 폐암, 간암, 비-호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 백혈병, 자궁암, 자궁경부암, 방광암, 신장암 및 선암종, 예컨대 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 암으로부터 유래된다.
용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염된, 형질전환된 또는 형질도입된 세포이다. 세포는 1차 대상체 세포 및 그의 자손을 포함한다.
용어 "특이적으로 결합한다"는 샘플 내에 존재하는 동족 결합 파트너 (예를 들어, T 세포 상에 제시된 자극 및/또는 공동자극 분자) 단백질을 인식하고 결합하지만 샘플 내의 다른 분자는 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는 항체 또는 리간드를 지칭한다.
본원에 사용된 "조절성 키메라 항원 수용체 (RCAR)"는 면역 이펙터 세포에서의 경우에 세포에게 표적 세포, 전형적으로 암 세포에 대한 특이성 및 조절성 세포내 신호 생성을 제공하는, 가장 단순한 실시양태에서 전형적으로 2개의, 폴리펩티드의 세트를 지칭한다. 일부 실시양태에서, RCAR은 적어도 세포외 항원 결합 도메인, 막횡단, 및 CAR 분자와 관련하여 본원에 정의된 바와 같은 자극 분자 및/또는 공동자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 신호전달 도메인 (본원에서 "세포내 신호전달 도메인"으로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 실시양태에서, RCAR에서 폴리펩티드의 세트는 서로 인접해있지 않고, 예를 들어 상이한 폴리펩티드 쇄 내에 있다. 일부 실시양태에서, RCAR은 이량체화 분자의 존재 시 폴리펩티드를 서로 커플링시킬 수 있는, 예를 들어 항원 결합 도메인을 세포내 신호전달 도메인에 커플링시킬 수 있는 이량체화 스위치를 포함한다. 일부 실시양태에서, RCAR은 본원에 기재된 바와 같은 세포 (예를 들어, 면역 이펙터 세포), 예를 들어 RCAR-발현 세포 (본원에서 "RCARX 세포"로도 지칭됨)에서 발현된다. 한 실시양태에서 RCARX 세포는 T 세포이고, RCART 세포로 지칭된다. 한 실시양태에서, RCARX 세포는 NK 세포이고, RCARN 세포로 지칭된다. RCAR은 RCAR-발현 세포에게 표적 세포, 전형적으로 암 세포에 대한 특이성, 및 조절성 세포내 신호 생성 또는 증식을 제공할 수 있고, 이는 RCAR-발현 세포의 면역 이펙터 특성을 최적화할 수 있다. 실시양태에서, RCAR 세포는 적어도 부분적으로는, 항원 결합 도메인에 의해 결합된 항원을 포함하는 표적 세포에 대한 특이성을 제공하기 위해 항원 결합 도메인에 의존한다.
본원에 사용된 용어 "막 앵커" 또는 "막 테더링 도메인"은 세포외 또는 세포내 도메인을 형질 막에 고정시키기에 충분한 폴리펩티드 또는 모이어티, 예를 들어 미리스토일 기를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "스위치 도메인"은, 예를 들어 RCAR을 언급하는 경우에, 이량체화 분자의 존재 하에 또 다른 스위치 도메인과 회합하는 엔티티, 전형적으로 폴리펩티드-기반 엔티티를 지칭한다. 회합은 제1 스위치 도메인에 연결된, 예를 들어 그에 융합된 제1 엔티티, 및 제2 스위치 도메인에 연결된, 예를 들어 그에 융합된 제2 엔티티의 기능적 커플링을 생성한다. 제1 및 제2 스위치 도메인은 집합적으로 이량체화 스위치로서 지칭된다. 실시양태에서, 제1 및 제2 스위치 도메인은 서로 동일하고, 예를 들어 이들은 동일한 1차 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 집합적으로 동종이량체화 스위치로 지칭된다. 실시양태에서, 제1 및 제2 스위치 도메인은 서로 상이하고, 예를 들어 이들은 상이한 1차 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 집합적으로 이종이량체화 스위치로 지칭된다. 실시양태에서, 스위치는 세포내 존재한다. 실시양태에서, 스위치는 세포외 존재한다. 실시양태에서, 스위치 도메인은 폴리펩티드-기반 엔티티, 예를 들어 FKBP 또는 FRB-기반 엔티티이고, 이량체화 분자는 소분자, 예를 들어 라파로그이다. 실시양태에서, 스위치 도메인은 폴리펩티드-기반 엔티티, 예를 들어 myc 펩티드에 결합하는 scFv이고, 이량체화 분자는 폴리펩티드, 그의 단편, 또는 폴리펩티드의 다량체, 예를 들어 myc 리간드 또는 1개 이상의 myc scFv에 결합하는 myc 리간드의 다량체이다. 실시양태에서, 스위치 도메인은 폴리펩티드-기반 엔티티, 예를 들어 myc 수용체이고, 이량체화 분자는 항체 또는 그의 단편, 예를 들어 myc 항체이다.
본원에 사용된 용어 "이량체화 분자"는, 예를 들어 RCAR을 언급하는 경우에, 제1 스위치 도메인과 제2 스위치 도메인의 회합을 촉진하는 분자를 지칭한다. 실시양태에서, 이량체화 분자는 대상체에서 자연 발생되지 않거나, 또는 유의한 이량체화를 야기할 농도로 발생되지 않는다. 실시양태에서, 이량체화 분자는 소분자, 예를 들어 라파마이신 또는 라파로그, 예를 들어 RAD001이다.
용어 "생물학적 등가"는 참조 용량 또는 참조량의 참조 화합물 (예를 들어, RAD001)에 의해 생성된 효과와 동등한 효과를 생성하는데 요구되는 참조 화합물 (예를 들어, RAD001) 이외의 작용제의 양을 지칭한다. 한 실시양태에서, 효과는 예를 들어 P70 S6 키나제 억제에 의해 측정된 바와 같은, 예를 들어 생체내 또는 시험관내 검정에서 평가된 바와 같은, 예를 들어 본원에 기재된 검정, 예를 들어 불레이(Boulay) 검정에 의해 측정된 바와 같은 mTOR 억제 수준, 또는 웨스턴 블롯에 의한 인산화 S6 수준의 측정이다. 한 실시양태에서, 효과는 세포 분류에 의해 측정된 바와 같은 PD-1 양성/PD-1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 비의 변경이다. 한 실시양태에서, mTOR 억제제의 생물학적 등가 양 또는 용량은 참조 용량 또는 참조량의 참조 화합물과 동일한 수준의 P70 S6 키나제 억제를 달성하는 양 또는 용량이다. 한 실시양태에서, mTOR 억제제의 생물학적 등가 양 또는 용량은 참조 용량 또는 참조량의 참조 화합물과 동일한 수준의 PD-1 양성/PD-1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 비의 변경을 달성하는 양 또는 용량이다.
용어 "낮은, 면역 증진 용량"이 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제제, 예를 들어 RAD001 또는 라파마이신, 또는 촉매 mTOR 억제제와 함께 사용된 경우에, 이는 예를 들어 P70 S6 키나제 활성의 억제에 의해 측정된 바와 같이 부분적이지만 전적이지는 않게 mTOR 활성을 억제하는 mTOR 억제제의 용량을 지칭한다. 예를 들어, P70 S6 키나제의 억제에 의해 mTOR 활성을 평가하는 방법이 본원에서 논의된다. 용량은 완전 면역 억제를 발생시키는데는 불충분하지만, 면역 반응을 증진시키는데 충분하다. 한 실시양태에서, 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제는 PD-1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 개수의 감소 및/또는 PD-1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 개수의 증가, 또는 PD-1 음성 T 세포/PD-1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 비의 증가를 발생시킨다.
한 실시양태에서, 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제는 나이브 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 개수의 증가를 발생시킨다. 한 실시양태에서, 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제는 하기:
예를 들어 기억 T 세포, 예를 들어 기억 T 세포 전구체 상에서의 하기 마커: CD62L고, CD127고, CD27+, 및 BCL2 중 1개 이상의 발현의 증가;
예를 들어 기억 T 세포, 예를 들어 기억 T 세포 전구체 상에서의 KLRG1의 발현의 감소; 및
기억 T 세포 전구체, 예를 들어 하기 특징 중 어느 하나 또는 그의 조합을 갖는 세포의 개수의 증가: 증가된 CD62L고, 증가된 CD127고, 증가된 CD27+, 감소된 KLRG1, 및 증가된 BCL2
중 1종 이상을 발생시키며, 여기서 임의의 상기 기재된 변화는, 예를 들어 비-처리 대상체와 비교하여, 예를 들어 적어도 일시적으로 발생한다.
본원에 사용된 "불응성"은 치료에 반응하지 않는 질환, 예를 들어 암을 지칭한다. 실시양태에서, 불응성 암은 치료의 시작 전 또는 시작 시 치료에 저항성일 수 있다. 다른 실시양태에서, 불응성 암은 치료 동안 저항성이 될 수 있다. 불응성 암은 또한 저항성 암으로도 불린다.
본원에 사용된 "재발성" 또는 "재발"은 개선 또는 반응의 기간 후, 예를 들어 요법, 예를 들어 암 요법의 선행 치료 후 질환 (예를 들어, 암) 또는 질환, 예컨대 암의 징후 및 증상의 복귀 또는 재출현을 지칭한다. 반응의 초기 기간은 특정 역치 미만, 예를 들어 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만으로 떨어진 암 세포의 수준을 수반할 수 있다. 재출현은 특정 역치 초과, 예를 들어 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 초과로 상승한 암 세포의 수준을 수반할 수 있다. 예를 들어 B-ALL과 관련하여, 예를 들어 재출현은 완전 반응 후 혈액, 골수 (> 5%), 또는 임의의 수질외 부위에서 예를 들어 모세포의 재출현을 수반할 수 있다. 이와 관련하여 완전 반응은 < 5% BM 모세포를 수반할 수 있다. 보다 일반적으로, 한 실시양태에서, 반응 (예를 들어, 완전 반응 또는 부분 반응)은 검출가능한 MRD (최소 잔류 질환)의 부재를 수반할 수 있다. 한 실시양태에서, 반응성의 초기 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일; 적어도 1, 2, 3, 또는 4주; 적어도 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 또는 12개월; 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5년 지속된다.
일부 실시양태에서, CD19 억제제, 예를 들어 CD19 CAR 요법을 포함하는 요법은 치료에 대해 재발성 또는 불응성일 수 있다. 재발성 또는 저항성은 CD19 상실 (예를 들어, 항원 상실 돌연변이) 또는 CD19의 수준을 감소시키는 다른 CD19 변경 (예를 들어, CD19-음성 클론의 클론 선택에 의해 유발됨)에 의해 유발될 수 있다. 이러한 CD19 상실 또는 변경을 보유하는 암은 본원에서 "CD19-음성 암" 또는 "CD19-음성 재발성 암"으로 지칭된다. CD19-음성 암은 CD19의 100% 상실을 가질 필요는 없지만, 암이 재발하거나 불응성이 되도록 CD19 요법의 유효성을 감소시키는데 충분한 감소를 가질 필요는 있는 것으로 이해되어야 할 것이다. 일부 실시양태에서, CD19-음성 암은 CD19 CAR 요법으로부터 발생한다.
범위: 본 개시내용에 걸쳐, 본 발명의 다양한 측면은 범위 포맷으로 제시될 수 있다. 범위 포맷의 기재는 단지 편의 및 간결함을 위한 것임을 이해하여야 하고, 본 발명의 범주에 대한 불변의 제한으로서 해석되지 않아야 한다. 따라서, 범위의 기재는 구체적으로 개시된 모든 가능한 하위범위 뿐만 아니라 그러한 범위 내의 개별 수치 값을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 범위, 예컨대 1 내지 6의 기재는 구체적으로 개시된 하위범위, 예컨대 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등, 뿐만 아니라 그러한 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 또 다른 예로서, 95-99% 동일성과 같은 범위는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 것을 포함하고, 하위범위, 예컨대 96-99%, 96-98%, 96-97%, 97-99%, 97-98% 및 98-99% 동일성을 포함한다. 이것은 범위의 폭에 상관없이 적용된다.
설명
CD123 키메라 항원 수용체 (CAR)를 사용한 질환, 예컨대 암의 치료 또는 예방을 위한 물질의 조성물 및 사용 방법이 본원에 제공된다.
한 측면에서, 본 발명은 CD123 단백질 또는 그의 단편에 대한 특이적 결합을 위해 조작된 항체 또는 항체 단편을 포함하는 수많은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 CAR을 발현하도록 조작된 세포 (예를 들어 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)를 제공하고, 여기서 CAR-발현 세포 (예를 들어, "CART" 또는 CAR-발현 NK 세포)는 항종양 특성을 나타낸다. 한 측면에서, 세포는 CAR로 형질전환되고, CAR의 적어도 일부가 세포 표면 상에 발현된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예를 들어 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)는 CAR을 코딩하는 바이러스 벡터로 형질도입된다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 이러한 실시양태에서, 세포는 CAR을 안정하게 발현할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포 (예를 들어 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)는 CAR을 코딩하는 핵산, 예를 들어 mRNA, cDNA, DNA로 형질감염된다. 일부 이러한 실시양태에서, 세포는 CAR을 일시적으로 발현할 수 있다.
한 측면에서, CAR의 CD123 결합 도메인, 예를 들어 인간 또는 인간화 CD123 결합 도메인은 scFv 항체 단편이다. 한 측면에서, 이러한 항체 단편은 동등한 결합 친화도를 보유한다는 점에서, 예를 들어 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 IgG 항체와 대등한 효능으로 동일한 항원에 결합한다는 점에서 기능적이다. 한 측면에서, 이러한 항체 단편은 통상의 기술자가 이해할 바와 같이 면역 반응의 활성화, 그의 표적 항원으로부터 신호-전달 발생의 억제, 키나제 활성의 억제 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는 생물학적 반응을 제공한다는 점에서 기능적이다.
일부 측면에서, 본 발명의 항체는 키메라 항원 수용체 (CAR) 내로 혼입된다. 한 측면에서, CAR은 서열식별번호: 98-101, 및 125-156으로서 본원에 제공된 폴리펩티드 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명의 CAR의 부분인 CD123 결합 도메인, 예를 들어 인간화 또는 인간 CD123 결합 도메인은 그의 서열이 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 트랜스진에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 본 발명의 전체 CAR 구축물은 그의 전체 서열이 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 트랜스진에 의해 코딩된다. 코돈 최적화는 코딩 DNA 내의 동의 코돈 (즉, 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈)의 발생 빈도가 상이한 종에서 편향된다는 발견을 지칭한다. 이러한 코돈 축중성은 동일한 폴리펩티드가 다양한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있도록 한다. 다양한 코돈 최적화 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 적어도 미국 특허 번호 5,786,464 및 6,114,148에 개시된 방법을 포함한다.
한 측면에서, CAR의 항원 결합 도메인은 인간 CD123 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 한 측면에서, CAR의 항원 결합 도메인은 인간화 CD123 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 한 측면에서, CAR의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하는 인간 CD123 항체 단편을 포함한다. 한 측면에서, CAR의 항원 결합 도메인은 인간 CD123 scFv이다. 한 측면에서, CAR의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하는 인간화 CD123 항체 단편을 포함한다. 한 측면에서, CAR의 항원 결합 도메인은 인간화 CD123 scFv를 포함한다.
한 측면에서, CAR123 결합 도메인은 서열식별번호: 157-160 및 184-215에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, scFv 부분은 인간이다. 한 측면에서, 인간 CAR123 결합 도메인은 서열식별번호: 157-160에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 157에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 158에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 159에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 160에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 478에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 480에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 483에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 485에 제공된 scFv 부분을 포함한다.
한 측면에서 scFv 부분은 인간화이다. 한 측면에서, 인간화 CAR123 결합 도메인은 서열식별번호: 184-215에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 184에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 185에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 186에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 187에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 188에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 189에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 190에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 191에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 192에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 193에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 194에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 195에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 196에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 197에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 198에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 199에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 200에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 201에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 202에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 203에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 204에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 205에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 206에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 207에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 208에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 209에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 210에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 211에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 212에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 213에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 214에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 215에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 556-587에 제공된 scFv 부분을 포함한다.
또한, 본 발명은 CD123 CAR 조성물, 및 다른 질환 중에서, CD123을 발현하는 세포 또는 조직을 수반하는 암 또는 임의의 악성종양 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 의약 또는 방법에서의 그의 용도를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명의 CAR은 CD123-발현 정상 세포를 근절시키기 위해 사용될 수 있고, 이에 의해 세포 이식 전 세포 조건화 요법으로서 사용하기 위해 적용가능할 수 있다. 한 측면에서, CD123-발현 정상 세포는 CD123-발현 골수 전구세포이고, 세포 이식은 줄기 세포 이식이다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 키메라 항원 수용체를 발현하도록 조작된 세포 (예를 들어 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포) (예를 들어, CAR-발현 면역 이펙터 세포, 예를 들어 CART 또는 CAR-발현 NK 세포)를 제공하며, 여기서 세포 (예를 들어 "CART")는 항종양 특성을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 CD123 결합 도메인을 포함하고 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포 내로 조작된 CD123-CAR, 및 입양 요법을 위한 그의 사용 방법을 제공한다.
한 측면에서, CD123-CAR은 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 CD137 (4-1BB) 신호전달 도메인, CD28 신호전달 도메인, CD3제타 신호 도메인, 및 그의 임의의 조합의 군으로부터 선택된 적어도 1개의 세포내 도메인을 포함한다. 한 측면에서, CD123-CAR은 CD137 (4-1BB) 또는 CD28 이외의 1개 이상의 공동자극 분자(들)로부터의 적어도 1개의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
키메라 항원 수용체 (CAR)
본 발명은 CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 DNA 구축물을 포괄하며, 여기서 CAR은 CD123 또는 그의 단편, 예를 들어 인간 CD123에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 (예를 들어, 항체, 항체 단편)을 포함하고, 여기서 CD123 결합 도메인 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편)의 서열은, 예를 들어, 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열과 인접하고, 동일한 리딩 프레임 내에 존재한다. 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 신호전달 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 제타 쇄를 포함할 수 있다. 공동자극 신호전달 도메인은 공동자극 분자의 세포내 도메인의 적어도 일부를 포함하는 CAR의 일부를 지칭한다.
구체적 측면에서, 본 발명의 CAR 구축물은 서열식별번호: 157-160,184-215, 478, 480, 483, 485, 및 556-587로 이루어진 군으로부터 선택된 scFv 도메인을 포함하며, 여기서 scFv는 서열식별번호: 1에 제공된 바와 같은 임의적인 리더 서열이 선행하고, 이어서 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 5에 제공된 바와 같은 임의적인 힌지 서열, 서열식별번호: 6에 제공된 바와 같은 막횡단 영역, 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 8을 포함하는 세포내 신호전달 도메인 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10을 포함하는 CD3 제타 서열이 뒤따를 수 있으며, 예를 들어 여기서 도메인은 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재하여 단일 융합 단백질을 형성한다. 일부 실시양태에서, scFv 도메인은 서열식별번호: 157-160, 478, 480, 483, 및 485로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 scFv 도메인이다. 일부 실시양태에서, scFv 도메인은 서열식별번호: 184-215 및 556-587로 이루어진 군으로부터 선택된 인간화 scFv 도메인이다. 또한, 서열식별번호: 157-160, 184-215, 478, 480, 483, 485, 및 556-587로 이루어진 군으로부터 선택된 각각의 scFv 단편의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 본 발명에 포함된다. 또한, 서열식별번호: 157-160, 184-215, 478, 480, 483, 485, 및 556-587로 이루어진 군으로부터 선택된 각각의 scFv 단편, 및 서열식별번호: 1, 2, 및 6-9의 각각의 도메인의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 플러스 본 발명의 코딩된 CD123 CAR이 본 발명에 포함된다.
한 측면에서, 예시적인 CD123CAR 구축물은 임의적인 리더 서열, 세포외 항원 결합 도메인, 힌지, 막횡단 도메인, 및 세포내 자극 도메인을 포함한다. 한 측면에서, 예시적인 CD123CAR 구축물은 임의적인 리더 서열, 세포외 항원 결합 도메인, 힌지, 막횡단 도메인, 세포내 공동자극 도메인 및 세포내 자극 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 전장 CD123 CAR 서열은 또한 표 2 또는 6에 제시된 바와 같이, 서열식별번호: 98-101 및 125-156으로서 본원에 제공된다.
예시적인 리더 서열은 서열식별번호: 1로서 제공된다. 예시적인 힌지/스페이서 서열은 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 5로서 제공된다. 예시적인 막횡단 도메인 서열은 서열식별번호: 6으로서 제공된다. 4-1BB 단백질의 세포내 신호전달 도메인의 예시적인 서열은 서열식별번호: 7로서 제공된다. CD27의 세포내 신호전달 도메인의 예시적인 서열은 서열식별번호: 8로서 제공된다. 예시적인 CD3제타 도메인 서열은 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10으로서 제공된다. CD28의 세포내 신호전달 도메인의 예시적인 서열은 서열식별번호: 43으로서 제공된다. ICOS의 세포내 신호전달 도메인의 예시적인 서열은 서열식별번호: 45로서 제공된다.
한 측면에서, 본 발명은 CAR을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 구축물을 포괄하며, 여기서 핵산 분자는 예를 들어 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열과 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는, 예를 들어 본원에 기재된 CD123 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 157-160, 184-215, 478, 480, 483, 485, 및 556-587 중 1개 이상으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 157-160, 478, 480, 483, 및 485로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 CD123 결합 도메인이다. 일부 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 184-215 및 556-587로 이루어진 군으로부터 선택된 인간화 CD123 결합 도메인이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 157이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 158이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 159이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 160이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 184이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 185이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 186이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 187이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 188이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 189이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 190이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 191이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 192이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 193이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 194이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 195이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 196이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 197이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 198이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 199이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 200이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 201이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 202이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 203이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 204이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 205이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 206이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 207이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 208이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 209이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 210이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 211이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 212이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 213이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 213이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 215이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 478이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 480이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 483이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 485이다.
한 측면에서, 본 발명은 CAR을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 구축물을 포괄하며, 여기서 핵산 분자는 CD123 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 예를 들어 여기서 서열은 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열과 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재한다. CAR에 사용될 수 있는 예시적인 세포내 신호전달 도메인은, 예를 들어 CD3-제타, CD28, 4-1BB, ICOS 등의 1개 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, CAR은 CD3-제타, CD28, 4-1BB, ICOS 등의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 39-42 및 66-97 중 1개 이상으로부터 선택된다. 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 39를 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 40을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 41을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 42를 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 66을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 67을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 68을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 69를 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 70을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 71을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 72를 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 73을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 74를 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 75를 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 76을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 77을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 78을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 79를 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 80을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 81을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 82를 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 83을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 84를 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 85를 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 86을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 87을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 88을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 89를 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 90을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 91을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 92를 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 93을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 94를 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 95를 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 96을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 97을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 목적하는 분자를 코딩하는 핵산 서열은 관련 기술분야에 공지된 재조합 방법을 사용하여, 예컨대 예를 들어 유전자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝함으로써, 이를 포함하는 것으로 공지된 벡터로부터 유전자를 유도함으로써, 또는 표준 기술을 사용하여 이를 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접 단리함으로써 수득할 수 있다. 대안적으로, 관심 핵산은 클로닝하기 보다는 합성적으로 생산할 수 있다.
본 발명은 세포 내로 직접 형질도입될 수 있는 CAR을 발현하는 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터 구축물을 포함한다.
본 발명은 또한 세포 내로 직접 형질감염될 수 있는 RNA 구축물을 포함한다. 형질감염에 사용하기 위한 mRNA를 생성하는 방법은 특수하게 설계된 프라이머를 사용한 주형의 시험관내 전사 (IVT)에 이은 폴리A 첨가를 수반하며, 이는 3' 및 5' 비번역 서열 ("UTR"), 5' 캡 및/또는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 발현시킬 핵산, 및 폴리A 테일을 함유하는, 전형적으로 50-2000개 염기 길이의 구축물 (서열식별번호: 35)을 생산한다. 이와 같이 생산된 RNA는 상이한 유형의 세포를 효율적으로 형질감염시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 주형은 CAR에 대한 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, RNA CAR 벡터는 전기천공에 의해 T 세포 내로 형질도입된다.
항원 결합 도메인
한 측면에서, 본 발명의 CAR은 표적-특이적 결합 요소를 포함하며, 이는 달리 항원 결합 도메인으로서 지칭된다. 모이어티의 선택은 표적 세포의 표면을 규정하는 리간드의 유형 및 수에 따라 달라진다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 특정한 질환 상태와 연관된 표적 세포 상에서 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인식하도록 선택될 수 있다.
한 측면에서, CAR-매개 T-세포 반응은 목적하는 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 CAR 내로 조작하는 방식에 의해 관심 항원으로 지시될 수 있다.
한 측면에서, 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR의 일부는 CD123 또는 그의 단편을 표적화하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 측면에서, 항원 결합 도메인은 인간 CD123 또는 그의 단편을 표적화한다.
항원 결합 도메인은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 및 단일-도메인 항체, 예컨대 중쇄 가변 도메인 (VH), 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 낙타류 유래 나노바디의 가변 도메인 (VHH)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 그의 기능적 단편, 및 항원 결합 도메인으로 기능하는 것으로 관련 기술분야에 공지된 대안적 스캐폴드, 예컨대 재조합 피브로넥틴 도메인 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 항원에 결합하는 임의의 도메인일 수 있다. 일부 경우에, 항원 결합 도메인은, CAR이 궁극적으로 사용될 종과 동일한 종으로부터 유래되는 것이 유익하다. 예를 들어, 인간에서 사용하기 위해, CAR의 항원 결합 도메인은 항체 또는 항체 단편의 항원 결합 도메인에 대한 인간 또는 인간화 잔기를 포함하는 것이 유익할 수 있다.
일부 경우에, 항원 결합 도메인은, CAR이 궁극적으로 사용될 종과 동일한 종으로부터 유래되는 것이 유익하다. 예를 들어, 인간에서 사용하기 위해, CAR의 항원 결합 도메인은 항체 또는 항체 단편의 항원 결합 도메인에 대한 인간 또는 인간화 잔기를 포함하는 것이 유익할 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 항원 결합 도메인은 인간 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 CD123 결합 도메인은 본원에 기재된 인간 CD123 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3), 및/또는 본원에 기재된 인간 CD123 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하고, 예를 들어 인간 CD123 결합 도메인은 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 LC CDR 및 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 HC CDR을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 CD123 결합 도메인은 본원에 기재된 인간 CD123 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하고, 예를 들어 인간 CD123 결합 도메인은 각각이 본원에 기재된 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함하는 2개의 가변 중쇄 영역을 갖는다. 한 실시양태에서, 인간 CD123 결합 도메인은 본원에 기재된 (예를 들어, 표 2 또는 9에서의) 인간 경쇄 가변 영역 및/또는 본원에 기재된 (예를 들어, 표 2 또는 9에서의) 인간 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 CD123 결합 도메인은 본원에 기재된 (예를 들어, 표 2 또는 9에서의) 인간 중쇄 가변 영역, 예를 들어 본원에 기재된 (예를 들어, 표 2 또는 9에서의) 적어도 2개의 인간 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 표 2 또는 9의 아미노산 서열의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 scFv이다. 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 표 2 또는 9에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 2의 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 표 2 또는 9에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 2 또는 9의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 157-160, 478, 480, 483, 및 485로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 CD123 결합 도메인은 scFv이고, 본원, 예를 들어 표 2 또는 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역은 링커, 예를 들어 본원에 기재된 링커를 통해 본원, 예를 들어 표 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 부착된다. 한 실시양태에서, 인간 CD123 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 3 또는 4 (서열식별번호: 26)이다. scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은, 예를 들어 임의의 하기 배향: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역으로 존재할 수 있다.
일부 측면에서, 비-인간 항체는 인간화되고, 항체의 특정 서열 또는 영역은 인간에서 자연적으로 생산되는 항체 또는 그의 단편에 대한 유사성을 증가시키도록 변형된다. 따라서, 한 측면에서, 항원 결합 도메인은 인간화 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 본원에 기재된 인간화 CD123 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3), 및/또는 본원에 기재된 인간화 CD123 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하고, 예를 들어 인간화 CD123 결합 도메인은 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 LC CDR 및 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 HC CDR을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 본원에 기재된 인간화 CD123 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하고, 예를 들어 인간화 CD123 결합 도메인은 본원에 기재된 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 각각 포함하는 2개의 가변 중쇄 영역을 갖는다. 한 실시양태에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 본원에 기재된 인간화 경쇄 가변 영역 (예를 들어, 표 6에서의) 및/또는 본원에 기재된 인간화 중쇄 가변 영역 (예를 들어, 표 6에서의)을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 본원에 기재된 인간화 중쇄 가변 영역 (예를 들어, 표 6에서의), 예를 들어 본원에 기재된 적어도 2개의 인간화 중쇄 가변 영역 (예를 들어, 표 6에서의)을 포함한다. 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 표 6의 아미노산 서열의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 scFv이다. 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 표 4에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 6의 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 표 6에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 6의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 184-215 및 302-333으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 scFv이고, 본원, 예를 들어 표 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역은 링커, 예를 들어 본원에 기재된 링커를 통해 본원, 예를 들어 표 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 부착된다. 한 실시양태에서, 인간화 CD123 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 3 또는 4 (서열식별번호: 26)이다. scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은, 예를 들어 임의의 하기 배향: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역으로 존재할 수 있다.
인간화 항체는 CDR-그라프팅 (예를 들어, 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 유럽 특허 번호 EP 239,400; 국제 공개 번호 WO 91/09967; 및 미국 특허 번호 5,225,539, 5,530,101, 및 5,585,089 참조), 베니어링 또는 재표면화 (예를 들어, 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 유럽 특허 번호 EP 592,106 및 EP 519,596; 문헌 [Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; 및 Roguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973] 참조), 쇄 셔플링 (예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,565,332 참조), 및 예를 들어 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개 번호 US2005/0042664, 미국 특허 출원 공개 번호 US2005/0048617, 미국 특허 번호 6,407,213, 미국 특허 번호 5,766,886, 국제 공개 번호 WO 9317105, 문헌 [Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994), 및 Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994)]에 개시된 기술을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 종종, 프레임워크 영역 내의 프레임워크 잔기는 항원 결합을 변경하기 위해, 예를 들어 개선시키기 위해 CDR 공여자 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환될 것이다. 이들 프레임워크 치환은 관련 기술분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR과 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링 및 특정한 위치에서 비통상적인 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해 확인된다. (예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,585,089 (Queen et al.); 및 문헌 [Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323] 참조).
인간화 항체 또는 항체 단편은 비인간인 공급원으로부터의 것에 남아있는 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기로 지칭되고, 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 유래된다. 본원에 제공된 바와 같이, 인간화 항체 또는 항체 단편은 비인간 이뮤노글로불린 분자로부터의 1개 이상의 CDR 및 프레임워크 영역을 포함하며, 여기서 프레임워크를 포함하는 아미노산 잔기는 완전히 또는 대부분 인간 배선으로부터 유래된다. 항체 또는 항체 단편의 인간화를 위한 다수의 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 인간 항체의 상응하는 서열을 치환함으로써, 즉 CDR-그라프팅 (EP 239,400; PCT 공개 번호 WO 91/09967; 및 미국 특허 번호 4,816,567; 6,331,415; 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 6,548,640, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 의해 본질적으로 윈터(Winter)와 그의 동료들의 방법에 따라 수행될 수 있다 (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)). 이러한 인간화 항체 및 항체 단편에서, 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 작은 부분이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된 바 있다. 인간화 항체는 종종 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 프레임워크 (FR) 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다. 항체 및 항체 단편의 인간화는 또한 베니어링 또는 재표면화 (EP 592,106; EP 519,596; 문헌 [Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); 및 Roguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)]) 또는 쇄 셔플링 (미국 특허 번호 5,565,332)에 의해 달성될 수 있고, 상기 참고문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
인간화 항체의 제조에 사용될 경쇄 및 중쇄 둘 다의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시킨다. 소위 "최적-피트" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 이어서, 설치류의 것과 가장 가까운 인간 서열이 인간화 항체를 위한 인간 프레임워크 (FR)로서 수용된다 (문헌 [Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)], 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정한 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정한 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크가 여러 개의 상이한 인간화 항체에 대해 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역, 예를 들어 모든 4개의 프레임워크 영역은 VH4_4-59 배선 서열로부터 유래된다. 한 실시양태에서, 프레임워크 영역은 예를 들어 상응하는 뮤린 서열에서의 아미노산으로부터 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형, 예를 들어 치환을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역, 예를 들어 모든 4개의 프레임워크 영역은 VK3_1.25 배선 서열로부터 유래된다. 한 실시양태에서, 프레임워크 영역은 예를 들어 상응하는 뮤린 서열에서의 아미노산으로부터 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형, 예를 들어 치환을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 항체 단편을 포함하는 본 발명의 CAR 조성물의 부분은 표적 항원에 대한 고친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하면서 인간화된다. 본 발명의 한 측면에 따르면, 인간화 항체 및 항체 단편은 모 및 인간화 서열의 3-차원 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 산물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3-차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 친숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3-차원 입체형태적 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이의 검사는 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 예를 들어 후보 이뮤노글로불린이 표적 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 목적하는 항체 또는 항체 단편 특징, 예컨대 표적 항원에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 수용자 및 유입 서열로부터 선택 및 조합될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적으로 및 가장 실질적으로 관여한다.
인간화 항체 또는 항체 단편은 원래의 항체와 유사한 항원 특이성, 예를 들어 본 발명에서 인간 CD123 또는 그의 단편에 결합하는 능력을 보유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체 단편은 인간 CD123 또는 그의 단편에 대한 개선된 친화도 및/또는 결합 특이성을 가질 수 있다.
한 측면에서, 항원 결합 도메인 부분은 서열식별번호: 157-160,184-215, 478, 480, 483, 485, 및 556-587로부터 선택된 1개 이상의 서열을 포함한다. 한 측면에서, 인간 CD123 결합 도메인을 포함하는 CD123 CAR은 서열식별번호: 157-160, 478, 480, 483, 및 485로부터 선택된 1개 이상의 서열로부터 선택된다. 한 측면에서, 인간화 CD123 결합 도메인을 포함하는 CD123 CAR은 서열식별번호: 184-215 및 556-587로부터 선택된 1개 이상의 서열로부터 선택된다.
한 측면에서, CD123 결합 도메인은 항체 또는 항체 단편의 특정한 기능적 특색 또는 특성을 특징으로 한다. 예를 들어, 한 측면에서, 항원 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 CAR 조성물의 부분은 인간 CD123 또는 그의 단편에 특이적으로 결합한다. 한 측면에서, 본 발명은 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항원 결합 도메인에 관한 것이며, 여기서 항체 결합 도메인은 CD123 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하고, 여기서 항체 또는 항체 단편은 서열식별번호: 157-160, 184-215, 478, 480, 483, 485, 및 556-587의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄를 포함한다. 한 측면에서, 항원 결합 도메인은 서열식별번호: 157-160, 184-215, 478, 480, 483, 485, 및 556-587로부터 선택된 scFv의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 측면에서, scFv는 리더 서열과 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재한다. 한 측면에서, 리더 서열은 서열식별번호: 1로서 제공된 폴리펩티드 서열이다.
한 측면에서, CD123 결합 도메인은 단편, 예를 들어 단일 쇄 가변 단편 (scFv)이다. 한 측면에서, CD123 결합 도메인은 Fv, Fab, (Fab')2, 또는 이중-기능적 (예를 들어, 이중-특이적) 하이브리드 항체이다 (예를 들어, 문헌 [Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)]). 한 측면에서, 본 발명의 항체 및 그의 단편은 야생형 또는 증진된 친화도로 CD123 단백질 또는 그의 단편에 결합한다.
일부 경우에, 인간 scFv는 디스플레이 라이브러리로부터 유래될 수 있다. 디스플레이 라이브러리는 엔티티의 집단이고; 각각의 엔티티는 접근가능한 폴리펩티드 성분 및 폴리펩티드 성분을 코딩하거나 확인하는 회수가능한 성분을 포함한다. 폴리펩티드 성분은 상이한 아미노산 서열이 나타내어지도록 다양하다. 폴리펩티드 성분은 임의의 길이, 예를 들어 3개의 아미노산으로부터 300개 초과의 아미노산까지일 수 있다. 디스플레이 라이브러리 엔티티는 1개 초과의 폴리펩티드 성분, 예를 들어 Fab의 2개의 폴리펩티드 쇄를 포함할 수 있다. 하나의 예시적 실시양태에서, 디스플레이 라이브러리를 사용하여 인간 CD123 결합 도메인을 확인할 수 있다. 선택에서, 라이브러리의 각각의 구성원의 폴리펩티드 성분은 CD123 또는 그의 단편에 의해 프로빙되고, 폴리펩티드 성분이 CD123에 결합하는 경우에, 디스플레이 라이브러리 구성원은 전형적으로 지지체 상에서의 체류에 의해 확인된다.
체류된 디스플레이 라이브러리 구성원은 지지체로부터 회수되어 분석된다. 분석은 유사한 또는 비유사한 조건 하에서의 증폭 및 후속 선택을 포함할 수 있다. 예를 들어, 양성 및 음성 선택이 교대로 실시될 수 있다. 분석은 또한 폴리펩티드 성분, 즉 항-CD123 결합 도메인의 아미노산 서열의 결정, 및 상세한 특징화를 위한 폴리펩티드 성분의 정제를 포함할 수 있다.
다양한 포맷이 디스플레이 라이브러리에 대해 사용될 수 있다. 예는 파지 디스플레이를 포함한다. 파지 디스플레이에서, 단백질 성분은 전형적으로 박테리오파지 코트 단백질에 공유 연결된다. 연결은 코트 단백질에 융합된 단백질 성분을 코딩하는 핵산의 번역으로부터 발생한다. 연결은 가요성 펩티드 링커, 프로테아제 부위, 또는 정지 코돈의 억제의 결과로서 혼입된 아미노산을 포함할 수 있다. 파지 디스플레이는, 예를 들어 U.S. 5,223,409; 문헌 [Smith (1985) Science 228:1315-1317]; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; 문헌 [de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem 274:18218-30; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20; Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8 및 Hoet et al. (2005) Nat Biotechnol. 23(3)344-8]에 기재되어 있다. 단백질 성분을 디스플레이하는 박테리오파지는 표준 파지 정제용 방법, 예를 들어 성장 배지로부터의 PEG 침전을 사용하여 성장 및 수거될 수 있다. 개별 디스플레이 파지의 선택 후에, 선택된 단백질 성분을 코딩하는 핵산은 증폭 후에 선택된 파지로 감염된 세포로부터 또는 파지 그 자체로부터 단리될 수 있다. 개별 콜로니 또는 플라크를 골라내고, 핵산을 단리하고, 서열분석할 수 있다.
다른 디스플레이 포맷은 세포 기반 디스플레이 (예를 들어, WO 03/029456 참조), 단백질-핵산 융합 (예를 들어, US 6,207,446 참조), 리보솜 디스플레이 (예를 들어, 문헌 [Mattheakis et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022 and Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol. 18:1287-92; Hanes et al. (2000) Methods Enzymol. 328:404-30; 및 Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods. 231(1-2):119-35] 참조), 및 이. 콜라이(E. coli) 주변세포질 디스플레이 (2005 Nov 22;PMID: 16337958)를 포함한다.
일부 경우에, scFv는 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al., (1988) Science 242:423-426 및 Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조). scFv 분자는 가요성 폴리펩티드 링커를 사용하여 VH 및 VL 영역을 함께 연결함으로써 생산될 수 있다. scFv 분자는 최적화된 길이 및/또는 아미노산 조성을 갖는 링커 (예를 들어, Ser-Gly 링커)를 포함한다. 링커 길이는 scFv의 가변 영역이 폴딩하고 상호작용하는 방식에 크게 영향을 미칠 수 있다. 실제로, 짧은 폴리펩티드 링커가 사용되면 (예를 들어, 5-10개 아미노산), 쇄내 폴딩이 방지된다. 쇄간 폴딩은 또한 2개의 가변 영역을 함께 모아 기능적 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 필요하다. 링커 배향 및 크기의 예에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448], 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794, 및 PCT 공개 번호 WO2006/020258 및 WO2007/024715를 참조하고, 이는 본원에 참조로 포함된다.
scFv는 그의 VL 및 VH 영역 사이에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개, 또는 그 초과의 아미노산 잔기의 링커를 포함할 수 있다. 링커 서열은 임의의 자연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커 서열은 아미노산 글리신 및 세린을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 링커 서열은 글리신 및 세린 반복부의 세트, 예컨대 (Gly4Ser)n을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수이다 (서열식별번호: 25). 한 실시양태에서, 링커는 (Gly4Ser)4 (서열식별번호: 27) 또는 (Gly4Ser)3 (서열식별번호: 28)일 수 있다. 링커 길이의 변동은 활성을 유지 또는 증진시켜 활성 연구에서 우월한 효능을 유도할 수 있다.
예시적인 CD123 CAR 구축물 및 항원 결합 도메인
본원에 개시된 예시적인 CD123 CAR 구축물은 임의로 임의적인 리더 서열 (예를 들어, 각각 예시적인 리더 아미노산 및 뉴클레오티드 서열에 대해 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 12)이 선행하는 scFv (예를 들어, 본원의 표 2, 6 및 9에 개시된 바와 같은 인간 scFv)를 포함한다. 인간 scFv 단편의 서열 (서열식별번호: 157-160의 아미노산 서열)이 본원의 표 2에 제공된다. 리더 서열이 없는 인간 scFv 단편의 서열은 본원의 표 9에 제공된다 (뉴클레오티드 서열에 대해 서열식별번호: 479, 481, 482, 및 484, 및 아미노산 서열에 대해 서열식별번호: 478, 480, 483, 및 485). CD123 CAR 구축물은 추가로 임의적인 힌지 도메인, 예를 들어 CD8 힌지 도메인 (예를 들어, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열식별번호: 13의 핵산 서열에 의해 코딩됨); 막횡단 도메인, 예를 들어 CD8 막횡단 도메인 (예를 들어, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열식별번호: 17의 뉴클레오티드에 의해 코딩됨); 세포내 도메인, 예를 들어 4-1BB 세포내 도메인 (예를 들어, 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드에 의해 코딩됨); 및 기능적 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3 제타 도메인 (예를 들어, 서열식별번호: 9 또는 10의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열식별번호: 20 또는 21의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩됨)을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 도메인은 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재하여 단일 융합 단백질을 형성한다. 다른 실시양태에서, 도메인은 별개의 폴리펩티드로, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 RCAR 분자로 존재한다.
특정 실시양태에서, 전장 CD123 CAR 분자는 표 2, 6 또는 9에 제공된 CD123-1, CD123-2, CD123-3, CD123-4, hzCD123-1, hzCD123-2, hzCD123-3, hzCD123-4, hzCD123-5, hzCD123-6, hzCD123-7, hzCD123-8, hzCD123-9, hzCD123-10, hzCD123-11, hzCD123-12, hzCD123-13, hzCD123-14, hzCD123-15, hzCD123-16, hzCD123-17, hzCD123-18, hzCD123-19, hzCD123-20, hzCD123-21, hzCD123-22, hzCD123-23, hzCD123-24, hzCD123-25, hzCD123-26, hzCD123-27, hzCD123-28, hzCD123-29, hzCD123-30, hzCD123-31, 또는 hzCD123-32, 또는 그와 실질적으로 (예를 들어, 95-99%) 동일한 서열의 아미노산 서열을 포함하거나, 그의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.
특정 실시양태에서, CD123 CAR 분자 또는 CD123 항원 결합 도메인은 표 2, 6 또는 9에 제공된 CD123-1, CD123-2, CD123-3, CD123-4, hzCD123-1, hzCD123-2, hzCD123-3, hzCD123-4, hzCD123-5, hzCD123-6, hzCD123-7, hzCD123-8, hzCD123-9, hzCD123-10, hzCD123-11, hzCD123-12, hzCD123-13, hzCD123-14, hzCD123-15, hzCD123-16, hzCD123-17, hzCD123-18, hzCD123-19, hzCD123-20, hzCD123-21, hzCD123-22, hzCD123-23, hzCD123-24, hzCD123-25, hzCD123-26, hzCD123-27, hzCD123-28, hzCD123-29, hzCD123-30, hzCD123-31, 또는 hzCD123-32의 scFv 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 CD123-1, CD123-2, CD123-3, CD123-4, hzCD123-1, hzCD123-2, hzCD123-3, hzCD123-4, hzCD123-5, hzCD123-6, hzCD123-7, hzCD123-8, hzCD123-9, hzCD123-10, hzCD123-11, hzCD123-12, hzCD123-13, hzCD123-14, hzCD123-15, hzCD123-16, hzCD123-17, hzCD123-18, hzCD123-19, hzCD123-20, hzCD123-21, hzCD123-22, hzCD123-23, hzCD123-24, hzCD123-25, hzCD123-26, hzCD123-27, hzCD123-28, hzCD123-29, hzCD123-30, hzCD123-31, 또는 hzCD123-32, 또는 상기 서열 중 임의의 것과 실질적으로 동일한 서열 (예를 들어, 95-99% 동일, 또는 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 변화)의 scFv 아미노산 서열을 포함하거나, 그의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.
특정 실시양태에서, CD123 CAR 분자 또는 CD123 항원 결합 도메인은 표 2 또는 6에 제공된 CD123-1, CD123-2, CD123-3, CD123-4, hzCD123-1, hzCD123-2, hzCD123-3, hzCD123-4, hzCD123-5, hzCD123-6, hzCD123-7, hzCD123-8, hzCD123-9, hzCD123-10, hzCD123-11, hzCD123-12, hzCD123-13, hzCD123-14, hzCD123-15, hzCD123-16, hzCD123-17, hzCD123-18, hzCD123-19, hzCD123-20, hzCD123-21, hzCD123-22, hzCD123-23, hzCD123-24, hzCD123-25, hzCD123-26, hzCD123-27, hzCD123-28, hzCD123-29, hzCD123-30, hzCD123-31, 또는 hzCD123-32, 또는 상기 서열 중 임의의 것과 실질적으로 동일한 서열 (예를 들어, 95-99% 동일, 또는 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 변화)의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, CD123 CAR 분자 또는 CD123 항원 결합 도메인은 표 3 또는 7에 제공된 중쇄 가변 영역으로부터의 1, 2 또는 3개의 CDR (예를 들어, HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3); 및/또는 표 4 또는 8에 제공된 CD123-1, CD123-2, CD123-3, CD123-4, hzCD123-1, hzCD123-2, hzCD123-3, hzCD123-4, hzCD123-5, hzCD123-6, hzCD123-7, hzCD123-8, hzCD123-9, hzCD123-10, hzCD123-11, hzCD123-12, hzCD123-13, hzCD123-14, hzCD123-15, hzCD123-16, hzCD123-17, hzCD123-18, hzCD123-19, hzCD123-20, hzCD123-21, hzCD123-22, hzCD123-23, hzCD123-24, hzCD123-25, hzCD123-26, hzCD123-27, hzCD123-28, hzCD123-29, hzCD123-30, hzCD123-31, 또는 hzCD123-32의 경쇄 가변 영역으로부터의 1, 2 또는 3개의 CDR (예를 들어, LCDR1, LCDR2 및/또는 LCDR3); 또는 상기 서열 중 임의의 것과 실질적으로 동일한 서열 (예를 들어, 95-99% 동일, 또는 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 변화)을 포함한다.
특정 실시양태에서, CD123 CAR 분자 또는 CD123 항원 결합 도메인은 표 10에 제공된 중쇄 가변 영역으로부터의 1, 2 또는 3개의 CDR (예를 들어, HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3); 및/또는 표 11에 제공된 CD123-1, CD123-2, CD123-3, CD123-4, hzCD123-1, hzCD123-2, hzCD123-3, hzCD123-4, hzCD123-5, hzCD123-6, hzCD123-7, hzCD123-8, hzCD123-9, hzCD123-10, hzCD123-11, hzCD123-12, hzCD123-13, hzCD123-14, hzCD123-15, hzCD123-16, hzCD123-17, hzCD123-18, hzCD123-19, hzCD123-20, hzCD123-21, hzCD123-22, hzCD123-23, hzCD123-24, hzCD123-25, hzCD123-26, hzCD123-27, hzCD123-28, hzCD123-29, hzCD123-30, hzCD123-31, 또는 hzCD123-32의 경쇄 가변 영역으로부터의 1, 2 또는 3개의 CDR (예를 들어, LCDR1, LCDR2 및/또는 LCDR3); 또는 상기 서열 중 임의의 것과 실질적으로 동일한 서열 (예를 들어, 95-99% 동일, 또는 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 변화)을 포함한다.
특정 실시양태에서, CD123 분자 또는 CD123 항원 결합 도메인은 표 12에 제공된 중쇄 가변 영역으로부터의 1, 2 또는 3개의 CDR (예를 들어, HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3); 및/또는 표 13에 제공된 CD123-1, CD123-2, CD123-3, CD123-4, hzCD123-1, hzCD123-2, hzCD123-3, hzCD123-4, hzCD123-5, hzCD123-6, hzCD123-7, hzCD123-8, hzCD123-9, hzCD123-10, hzCD123-11, hzCD123-12, hzCD123-13, hzCD123-14, hzCD123-15, hzCD123-16, hzCD123-17, hzCD123-18, hzCD123-19, hzCD123-20, hzCD123-21, hzCD123-22, hzCD123-23, hzCD123-24, hzCD123-25, hzCD123-26, hzCD123-27, hzCD123-28, hzCD123-29, hzCD123-30, hzCD123-31, 또는 hzCD123-32의 경쇄 가변 영역으로부터의 1, 2 또는 3개의 CDR (예를 들어, LCDR1, LCDR2 및/또는 LCDR3); 또는 상기 서열 중 임의의 것과 실질적으로 동일한 서열 (예를 들어, 95-99% 동일, 또는 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 변화)을 포함한다.
scFv 도메인의 CDR 서열의 서열은 중쇄 가변 도메인에 대해 표 3, 7, 10 및 12에 및 경쇄 가변 도메인에 대해 표 4, 8, 11 및 13에 제시된다. "ID"는 각각의 CDR에 대한 각각의 서열식별번호를 의미한다.
표 3, 4, 7 및 8에 제공된 CDR은 카바트 및 코티아 넘버링 스킴의 조합에 따른다.
<표 3> 중쇄 가변 도메인 CDR
Figure pct00001
<표 4> 경쇄 가변 도메인 CDR
Figure pct00002
<표 7> 중쇄 가변 도메인 CDR
Figure pct00003
<표 8> 경쇄 가변 도메인 CDR
Figure pct00004
<표 10> 카바트 넘버링 스킴 (Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)에 따른 중쇄 가변 도메인 CDR
Figure pct00005
<표 11> 카바트 넘버링 스킴 (Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)에 따른 경쇄 가변 도메인 CDR
Figure pct00006
<표 12> 코티아 넘버링 스킴 (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948)에 따른 중쇄 가변 도메인 CDR
Figure pct00007
<표 13> 코티아 넘버링 스킴 (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948)에 따른 경쇄 가변 도메인 CDR
Figure pct00008
실시양태에서, CD123 단일 쇄 가변 단편은 세포내 CD3제타 도메인 및 4-1BB의 세포내 공동-자극 도메인을 갖는 렌티바이러스 CAR 발현 벡터 내에서 생성 및 클로닝된다. 예시적인 완전 인간 CD123 scFv의 명칭이 표 1에 제시된다. 예시적인 인간화 CD123 scFv의 명칭이 표 5에 제시된다.
<표 1> CAR-CD123 구축물
Figure pct00009
<표 5> CAR-CD123 구축물
실시양태에서, VL 및 VH 도메인이 scFv에서 출현하는 순서는 다양하고 (즉, VL-VH, 또는 VH-VL 배향), 여기서 "G4S" (서열식별번호: 25) 서브유닛의 3 또는 4개의 카피 (여기서 각각의 서브유닛은 서열 GGGGS (서열식별번호: 25)를 포함함) (예를 들어, (G4S)3 (서열식별번호: 28) 또는 (G4S)4(서열식별번호: 27))는 가변 도메인과 연결되어 표 2, 표 6 및 표 9에 제시된 바와 같은 전체 scFv 도메인을 생성한다.
CD123 scFv 도메인 및 CD123 CAR 분자의 아미노산 및 핵산 서열이 표 2, 표 6, 및 표 9에 제공된다. 각각의 scFv에 대한 가변 중쇄 및 가변 경쇄에 대한 아미노산 서열이 또한 표 2 및 표 6에 제공된다. 리더 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 12의 뉴클레오티드 서열)의 존재 하의 scFv 단편 (서열식별번호: 157-160, 및 184-215) 및 리더 서열 부재 하의 scFv 단편 (서열식별번호: 478, 480, 483, 485, 및 556-587)이 또한 본 발명에 포괄된다는 것을 주목한다.
리더 (아미노산 서열) (서열식별번호: 1)
Figure pct00011
리더 (핵산 서열) (서열식별번호: 12)
Figure pct00012
CD8 힌지 (아미노산 서열) (서열식별번호: 2)
Figure pct00013
CD8 힌지 (핵산 서열) (서열식별번호: 13)
Figure pct00014
CD8 막횡단 (아미노산 서열) (서열식별번호: 6)
Figure pct00015
CD8 막횡단 (핵산 서열) (서열식별번호: 17)
Figure pct00016
4-1BB 세포내 도메인 (아미노산 서열) (서열식별번호: 7)
Figure pct00017
4-1BB 세포내 도메인 (핵산 서열) (서열식별번호: 18)
Figure pct00018
CD28 세포내 도메인 (아미노산 서열) (서열식별번호: 43)
Figure pct00019
CD28 세포내 도메인 (뉴클레오티드 서열) (서열식별번호: 44)
Figure pct00020
ICOS 세포내 도메인 (아미노산 서열) (서열식별번호: 45)
Figure pct00021
ICOS 세포내 도메인 (뉴클레오티드 서열) (서열식별번호: 46)
Figure pct00022
CD3 제타 도메인 (아미노산 서열) (서열식별번호: 9)
Figure pct00023
CD3 제타 (핵산 서열) (서열식별번호: 20)
Figure pct00024
CD3 제타 도메인 (아미노산 서열; NCBI 참조 서열 NM_000734.3) (서열식별번호: 10)
Figure pct00025
CD3 제타 (핵산 서열; NCBI 참조 서열 NM_000734.3); (서열식별번호: 21)
Figure pct00026
IgG4 힌지 (아미노산 서열) (서열식별번호: 36)
Figure pct00027
IgG4 힌지 (뉴클레오티드 서열) (서열식별번호: 37)
Figure pct00028
실시양태에서, 표 2 및 6에서의 이들 클론은 모두 CD3제타 쇄로부터 유래된 공동-자극 도메인의 신호 도메인 내에 Q/K 잔기 변화를 함유하였다.
<표 2> 예시적인 CD123 CAR 서열
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
<표 6> 인간화 CD123 CAR 서열
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 분자는 CD123에 특이적으로 결합하지만 리더 서열, 예를 들어 아미노산 서열 서열식별번호: 1은 함유하지 않는 scFv를 포함한다. 하기 표 9는 리더 서열 서열식별번호: 1을 함유하지 않는 CD123 scFv 서열에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
<표 9> CD123 CAR scFv 서열
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
실시양태에서, CAR scFv 단편은 이어서 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝되어 단일 코딩 프레임 내에서, 발현을 위한 EF1 알파 프로모터 (서열식별번호: 11)를 사용하여 전장 CAR 구축물을 생성하였다.
EF1 알파 프로모터
Figure pct00070
Gly/Ser (서열식별번호: 25)
Figure pct00071
Gly/Ser (서열식별번호: 26): 이 서열은 1-6개의 "Gly Gly Gly Gly Ser" 반복 단위를 포괄할 수 있다
Figure pct00072
Gly/Ser (서열식별번호: 27)
Figure pct00073
Gly/Ser (서열식별번호: 28)
Figure pct00074
Gly/Ser (서열식별번호: 29)
Figure pct00075
폴리A: (A)5000 (서열식별번호: 30)
이 서열은 50-5000개의 아데닌을 포괄할 수 있다.
폴리A: (T)100 (서열식별번호: 31)
폴리A: (T)5000 (서열식별번호: 32)
이 서열은 50-5000개의 티민을 포괄할 수 있다.
폴리A: (A)5000 (서열식별번호: 33)
이 서열은 100-5000개의 아데닌을 포괄할 수 있다.
폴리A: (A)400 (서열식별번호: 34)
이 서열은 100-400개의 아데닌을 포괄할 수 있다.
폴리A: (A)2000 (서열식별번호: 35)
이 서열은 50-2000개의 아데닌을 포괄할 수 있다.
Gly/Ser (서열식별번호: 709): 이 서열은 1-10개의 "Gly Gly Gly Ser" 반복 단위를 포괄할 수 있다
Figure pct00076
CAR scFv 단편은 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝되어 단일 코딩 프레임 내에서, 발현을 위한 EF1 알파 프로모터 (서열식별번호: 11)를 사용하여 전장 CAR 구축물을 생성할 수 있다.
CAR 구축물은 하기 서열: GGGGS (서열식별번호: 25); 1-6개의 "Gly Gly Gly Gly Ser" 반복 단위를 포괄하는 것, 예를 들어 GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS (서열식별번호: 26); GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS (서열식별번호: 27); GGGGSGGGGS GGGGS (서열식별번호: 28); GGGS (서열식별번호: 29); 또는 1-10개의 "Gly Gly Gly Ser" 반복 단위를 포괄하는 것, 예를 들어 GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS (서열식별번호: 709) 중 1개 이상을 갖는 Gly/Ser 링커를 포함할 수 있다. 실시양태에서, CAR 구축물은 폴리 A 서열, 예를 들어 50-5000개 또는 100-5000개의 아데닌을 포괄하는 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 34 또는 서열식별번호: 35), 또는 50-5000개의 티민을 포괄하는 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32)을 포함한다. 대안적으로, CAR 구축물은 예를 들어 서열 GSTSGSGKPGSGEGSTKG (서열식별번호: 704)를 포함하는 링커를 포함할 수 있다.
이중특이적 CAR
한 실시양태에서, 다중특이적 항체 분자는 이중특이적 항체 분자이다. 이중특이적 항체는 2개 이하의 항원에 대해 특이성을 갖는다. 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 동일한 항원, 예를 들어 동일한 단백질 (또는 다랑체 단백질의 서브유닛) 상에 존재한다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 중첩된다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 중첩되지 않는다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 상이한 항원, 예를 들어 상이한 단백질 (또는 다랑체 단백질의 상이한 서브유닛) 상에 존재한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 중쇄 가변 도메인 서열 및 경쇄 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 중쇄 가변 도메인 서열 및 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체 또는 그의 단편, 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 scFv 또는 그의 단편, 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 scFv 또는 그의 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체 분자는 다중-특이적 (예를 들어, 이중특이적 또는 삼중특이적) 항체 분자이다. 이중특이적 또는 이종이량체 항체 분자를 생성하기 위한 프로토콜은 관련 기술분야에 공지되어 있고; 예를 들어 US 5731168에 기재된 "노브 인 홀" 접근법; 예를 들어 WO 09/089004, WO 06/106905 및 WO 2010/129304에 기재된 정전기적 스티어링 Fc 쌍형성; 예를 들어 WO 07/110205에 기재된 바와 같은 가닥 교환 조작된 도메인 (SEED) 이종이량체 형성; 예를 들어 WO 08/119353, WO 2011/131746, 및 WO 2013/060867에 기재된 바와 같은 Fab 아암 교환; 예를 들어 US 4433059에 기재된 바와 같은, 아민-반응성 기 및 술프히드릴 반응성 기를 갖는 이종이관능성 시약을 사용하여 이중특이적 구조를 생성하는 항체 가교에 의한 이중 항체 접합체; 예를 들어 US 4444878에 기재된 바와 같은, 2개의 중쇄 사이의 디술피드 결합의 환원 및 산화 주기를 통해 상이한 항체로부터 절반 항체 (중쇄-경쇄 쌍 또는 Fab)를 재조합시킴으로써 생성된 이중특이적 항체 결정기; 삼관능성 항체, 예를 들어 US5273743에 기재된 바와 같은, 예를 들어 술프히드릴 반응성 기를 통해 가교된 3개의 Fab' 단편; 생합성 결합 단백질, 예를 들어 US5534254에 기재된 바와 같은, 예를 들어 C-말단 꼬리를 통해, 바람직하게는 디술피드 또는 아민-반응성 화학적 가교를 통해 가교된 scFv의 쌍; 이중기능적 항체, 예를 들어 US5582996에 기재된 바와 같은, 예를 들어 불변 도메인을 대체한 류신 지퍼 (예를 들어, c-fos 및 c-jun)를 통해 이량체화된 상이한 결합 특이성을 갖는 Fab 단편; 이중특이적 및 올리고특이적 1가- 및 올리고가 수용체, 예를 들어 US5591828에 기재된 바와 같은, 예를 들어 한 항체의 CH1 영역과 전형적으로 경쇄와 회합된 다른 항체의 VH 영역 사이에 폴리펩티드 스페이서를 통해 연결된 2개의 항체 (2개의 Fab 단편)의 VH-CH1 영역; 이중특이적 DNA-항체 접합체, 예를 들어 US5635602에 기재된 바와 같은, 예를 들어 DNA의 이중 가닥 조각을 통한 항체 또는 Fab 단편의 가교; 이중특이적 융합 단백질, 예를 들어 US5637481에 기재된 바와 같은, 예를 들어 2개의 scFv를, 이들과 전체 불변 영역 사이의 친수성 나선 펩티드 링커와 함께 함유하는 발현 구축물; 다가 및 다중특이적 결합 단백질, 예를 들어 US5837242에 기재된 바와 같은, 예를 들어 일반적으로 디아바디로 불리는, Ig 중쇄 가변 영역의 결합 영역을 갖는 제1 도메인, 및 Ig 경쇄 가변 영역의 결합 영역을 갖는 제2 도메인을 갖는 폴리펩티드의 이량체 (이중특이적, 삼중특이적 또는 사중특이적 분자를 생성하는 보다 고차원의 구조가 또한 포괄됨); 예를 들어 US5837821에 기재된 바와 같은, 연결된 VL 및 VH 쇄가, 이량체화되어 이중특이적/다가 분자를 형성할 수 있는 항체 힌지 영역 및 CH3 영역에 펩티드 스페이서에 의해 추가로 연결된, 미니바디 구축물; 예를 들어 US5844094에 기재된 바와 같은, 이중특이적 디아바디를 형성하기 위한 이량체, 삼량체 및 사량체를 형성할 수 있는, 짧은 펩티드 링커 (예를 들어, 5 또는 10개 아미노산)를 사용하거나 또는 링커가 전혀 없이 어느 하나의 배향으로 연결된 VH 및 VL 도메인; 예를 들어 US5864019에 기재된 바와 같은, 일련의 FV (또는 scFv)를 형성하기 위해 VL 도메인과 추가로 회합된, C-말단에서 가교가능한 기에 의해 펩티드 연결에 의해 연결된 VH 도메인 (또는 패밀리 구성원 내의 VL 도메인)의 스트링; 및 예를 들어 US5869620에 기재된 바와 같은, scFV 또는 디아바디 유형 포맷 둘 다를 사용하여, 예를 들어 동종2가, 이종2가, 3가 및 4가 구조를 형성하기 위해 비-공유 또는 화학적 가교를 통해 다가 구조로 조합된, 펩티드 링커를 통해 연결된 VH 및 VL 도메인 둘 다를 갖는 단일 쇄 결합 폴리펩티드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 추가의 예시적인 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 그의 제조 방법은, 예를 들어 US5910573, US5932448, US5959083, US5989830, US6005079, US6239259, US6294353, US6333396, US6476198, US6511663, US6670453, US6743896, US6809185, US6833441, US7129330, US7183076, US7521056, US7527787, US7534866, US7612181, US2002004587A1, US2002076406A1, US2002103345A1, US2003207346A1, US2003211078A1, US2004219643A1, US2004220388A1, US2004242847A1, US2005003403A1, US2005004352A1, US2005069552A1, US2005079170A1, US2005100543A1, US2005136049A1, US2005136051A1, US2005163782A1, US2005266425A1, US2006083747A1, US2006120960A1, US2006204493A1, US2006263367A1, US2007004909A1, US2007087381A1, US2007128150A1, US2007141049A1, US2007154901A1, US2007274985A1, US2008050370A1, US2008069820A1, US2008152645A1, US2008171855A1, US2008241884A1, US2008254512A1, US2008260738A1, US2009130106A1, US2009148905A1, US2009155275A1, US2009162359A1, US2009162360A1, US2009175851A1, US2009175867A1, US2009232811A1, US2009234105A1, US2009263392A1, US2009274649A1, EP346087A2, WO0006605A2, WO02072635A2, WO04081051A1, WO06020258A2, WO2007044887A2, WO2007095338A2, WO2007137760A2, WO2008119353A1, WO2009021754A2, WO2009068630A1, WO9103493A1, WO9323537A1, WO9409131A1, WO9412625A2, WO9509917A1, WO9637621A2, WO9964460A1에서 발견된다. 상기 참조된 출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
이중특이적 항체 분자의 각각의 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, scFv) 내에서, VH는 VL의 상류 또는 하류일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상류 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, scFv)은 그의 VL (VL1)의 상류의 그의 VH (VH1)와 배열되고, 하류 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, scFv)은 그의 VH (VH2)의 상류의 그의 VL (VL2)과 함께 배열되어, 전체적인 이중특이적 항체 분자는 배열 VH1-VL1-VL2-VH2를 갖는다. 다른 실시양태에서, 상류 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, scFv)은 그의 VH (VH1)의 상류의 그의 VL (VL1)과 배열되고, 하류 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, scFv)은 그의 VL (VL2)의 상류의 그의 VH (VH2)와 배열되어, 전체적인 이중특이적 항체 분자는 배열 VL1-VH1-VH2-VL2를 갖는다. 임의로, 링커는 2개의 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, scFv) 사이, 예를 들어 구축물이 VH1-VL1-VL2-VH2로 배열된 경우에 VL1과 VL2 사이, 또는 구축물이 VL1-VH1-VH2-VL2로 배열된 경우에 VH1과 VH2 사이에 배치된다. 링커는 본원에 기재된 바와 같은 링커, 예를 들어 (Gly4-Ser)n 링커일 수 있고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 4 (서열식별번호: 64)이다. 일반적으로, 2개의 scFv 사이의 링커는 2개의 scFv의 도메인 사이의 쌍형성오류를 피하기 위해 충분히 길어야 한다. 임의로, 링커는 제1 scFv의 VL과 VH 사이에 배치된다. 임의로, 링커는 제2 scFv의 VL과 VH 사이에 배치된다. 다중 링커를 갖는 구축물에서, 링커 중 임의의 2개 이상은 동일하거나 상이할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 이중특이적 CAR은 VL, VH, 및 임의로 1개 이상의 링커를 본원에 기재된 바와 같은 배열로 포함한다.
한 측면에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열 (예를 들어 CD123에 대해 결합 특이성을 갖는 scFv, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어 표 2, 표 6 또는 표 9에 기재된 바와 같은 scFv 포함, 또는 본원에 기재된 CD123 scFv로부터의 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 CDR 포함), 및 상이한 항원 상의 제2 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 제2 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다. 일부 측면에서 제2 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열은 AML 세포 상에 발현된 항원, 예를 들어 CD123 이외의 항원에 대해 결합 특이성을 갖는다. 예를 들어, 제2 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열은 CLL-1에 대해 결합 특이성을 갖는다. 또 다른 예로서, 제2 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열은 CD33에 대해 결합 특이성을 갖는다. 또 다른 예로서, 제2 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열은 CD34에 대해 결합 특이성을 갖는다. 또 다른 예로서, 제2 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열은 FLT3에 대해 결합 특이성을 갖는다. 예를 들어, 제2 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열은 폴레이트 수용체 베타에 대해 결합 특이성을 갖는다. 일부 측면에서, 제2 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열은 B-세포 상에 발현된 항원, 예를 들어 CD19, CD20, CD22 또는 ROR1에 대해 결합 특이성을 갖는다.
키메라 TCR
한 측면에서, 본 발명의 CD123 항체 및 항체 단편 (예를 들어, 표 2, 6 또는 9에 개시된 것)은 T 세포 수용체 ("TCR") 쇄, 예를 들어 TCR 알파 또는 TCR 베타 쇄의 1개 이상의 불변 도메인에 그라프팅되어 CD123에 특이적으로 결합하는 키메라 TCR을 생성할 수 있다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 키메라 TCR은 항원 결합 시 TCR 복합체를 통해 신호를 전달할 것으로 여겨진다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 CD123 scFv는 TCR 쇄, 예를 들어 TCR 알파 쇄 및/또는 TCR 베타 쇄의 불변 도메인, 예를 들어 세포외 불변 도메인의 적어도 일부, 막횡단 도메인 및 세포질 도메인에 그라프팅될 수 있다. 또 다른 예로서, CD123 항체 단편, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 VL 도메인은 TCR 알파 쇄의 불변 도메인에 그라프팅될 수 있고, CD123 항체 단편, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 VH 도메인은 TCR 베타 쇄의 불변 도메인에 그라프팅될 수 있다 (또는 대안적으로, VL 도메인은 TCR 베타 쇄의 불변 도메인에 그라프팅될 수 있고, VH 도메인은 TCR 알파 쇄에 그라프팅될 수 있음). 또 다른 예로서, CD123 항체 또는 항체 단편의 CDR, 예를 들어 표 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12 또는 13에 기재된 바와 같은 CD123 항체 또는 항체 단편의 CDR은 TCR 알파 및/또는 베타 쇄에 그라프팅되어 CD123에 특이적으로 결합하는 키메라 TCR을 생성할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 LCDR은 TCR 알파 쇄의 가변 도메인에 그라프팅될 수 있고, 본원에 개시된 HCDR은 TCR 베타 쇄의 가변 도메인에 그라프팅될 수 있거나, 또는 그 반대이다. 이러한 키메라 TCR은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Willemsen RA et al., Gene Therapy 2000; 7: 1369-1377; Zhang T et al., Cancer Gene Ther 2004; 11: 487-496; Aggen et al., Gene Ther. 2012 Apr;19(4):365-74]).
안정성 및 돌연변이
CD123 결합 도메인, 예를 들어 scFv 분자 (예를 들어, 가용성 scFv)의 안정성은 통상적인 대조군 scFv 분자 또는 전장 항체의 생물물리학적 특성 (예를 들어, 열적 안정성)을 참조하여 평가될 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 scFv는 기재된 검정에서 대조군 결합 분자 (예를 들어 통상적인 scFv 분자)보다 약 0.1, 약 0.25, 약 0.5, 약 0.75, 약 1, 약 1.25, 약 1.5, 약 1.75, 약 2, 약 2.5, 약 3, 약 3.5, 약 4, 약 4.5, 약 5, 약 5.5, 약 6, 약 6.5, 약 7, 약 7.5, 약 8, 약 8.5, 약 9, 약 9.5, 약 10℃, 약 11℃, 약 12℃, 약 13℃, 약 14℃, 또는 약 15℃ 더 큰 열적 안정성을 갖는다.
CD123 결합 도메인, 예를 들어 scFv의 개선된 열적 안정성은 후속적으로 전체 CART123 구축물에 부여되어, CART123 구축물의 개선된 치료 특성으로 이어진다. CD123 결합 도메인, 예를 들어 scFv의 열적 안정성은 통상적인 항체와 비교하여 적어도 약 2℃ 또는 3℃ 개선될 수 있다. 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 통상적인 항체와 비교하여 1℃ 개선된 열적 안정성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, CD123 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 통상적인 항체와 비교하여 2℃ 개선된 열적 안정성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, scFv는 통상적인 항체와 비교하여 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15℃ 개선된 열적 안정성을 갖는다. 비교는, 예를 들어 본원에 개시된 scFv 분자와 전장 항체 사이에 이루어질 수 있다. 열적 안정성은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, Tm이 측정될 수 있다. Tm 측정 방법 및 단백질 안정성을 결정하는 다른 방법이 하기에 보다 상세하게 기재되어 있다.
scFv에서의 돌연변이는 scFv의 안정성을 변경시키고, scFv 및 CART123 구축물의 전체적인 안정성을 개선시킨다. 인간화 또는 인간 scFv의 안정성은 Tm, 온도 변성 및 온도 응집과 같은 측정을 사용하여 결정된다.
돌연변이체 scFv의 결합 능력은 실시예에 기재된 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
한 실시양태에서, CD123 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 돌연변이된 scFv가 CART123 구축물에 대해 개선된 안정성을 부여하도록 적어도 1개의 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CD123 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 돌연변이된 scFv가 CART123 구축물에 대해 개선된 안정성을 부여하도록 인간화 과정으로부터 발생한 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 돌연변이를 포함한다.
단백질 안정성의 평가 방법
항원 결합 도메인의 안정성은 예를 들어 하기 기재된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 방법은 가장 덜 안정한 도메인이 먼저 언폴딩되거나 또는 협동적으로 언폴딩되는 다중도메인 유닛 (예를 들어, 단일 언폴딩 전이를 나타내는 다중도메인 단백질)의 전체적인 안정성 역치를 제한하는 다중 열적 언폴딩 전이의 결정을 가능하게 한다. 가장 덜 안정한 도메인은 수많은 추가의 방식으로 확인될 수 있다. 돌연변이유발은 도메인이 전체 안정성을 제한하는지 프로빙하기 위해 수행될 수 있다. 추가로, 다중도메인 단백질의 프로테아제 저항성은, 가장 덜 안정한 도메인이 DSC 또는 다른 분광학적 방법을 통해 본질적으로 언폴딩되는 것으로 공지된 조건 하에 수행될 수 있다 (Fontana, et al., (1997) Fold. Des., 2: R17-26; Dimasi et al. (2009) J. Mol. Biol. 393: 672-692). 가장 덜 안정한 도메인이 확인되면, 이러한 도메인 (또는 그의 부분)을 코딩하는 서열을 방법에서 시험 서열로서 사용할 수 있다.
a) 열적 안정성
조성물의 열적 안정성은 관련 기술분야에 공지된 많은 비-제한적 생물물리학적 또는 생화학적 기술을 사용하여 분석될 수 있다. 특정 실시양태에서, 열적 안정성은 분석적 분광분석법에 의해 평가된다.
예시적인 분석적 분광분석 방법은 시차 주사 열량측정 (DSC)이다. DSC는 대부분의 단백질 또는 단백질 도메인의 언폴딩을 수반하는 열 흡광도에 감수성인 열량계를 사용한다 (예를 들어, 문헌 [Sanchez-Ruiz, et al., Biochemistry, 27: 1648-52, 1988] 참조). 단백질의 열적 안정성을 결정하기 위해, 단백질의 샘플을 열량계 내로 삽입하고, 온도를 Fab 또는 scFv가 언폴딩될 때까지 상승시킨다. 단백질이 언폴딩되는 온도는 전체적인 단백질 안정성을 나타낸다.
또 다른 예시적인 분석적 분광분석 방법은 원형 이색성 (CD) 분광분석법이다. CD 분광측정법은 증가하는 온도의 함수로서 조성물의 광학 활성을 측정한다. 원형 이색성 (CD) 분광분석법은 구조적 비대칭으로 인해 발생하는 좌선회 편광 대 우선회 편광의 흡수에서의 차이를 측정한다. 불규칙적 또는 언폴딩된 구조는 규칙적 또는 폴딩된 구조의 것과 매우 상이한 CD 스펙트럼을 생성한다. CD 스펙트럼은 증가하는 온도의 변성 효과에 대한 단백질의 감수성을 반영하고, 따라서 단백질의 열적 안정성을 나타낸다 (문헌 [van Mierlo and Steemsma, J. Biotechnol., 79(3):281-98, 2000] 참조).
열적 안정성을 측정하기 위한 또 다른 예시적인 분석적 분광분석 방법은 형광 방출 분광분석법이다 (상기 문헌 [van Mierlo and Steemsma] 참조). 열적 안정성을 측정하기 위한 또 다른 예시적인 분석적 분광분석 방법은 핵 자기 공명 (NMR) 분광분석법이다 (예를 들어 상기 문헌 [van Mierlo and Steemsma] 참조).
조성물의 열적 안정성은 생화학적으로 측정될 수 있다. 열적 안정성을 평가하기 위한 예시적인 생화학적 방법은 열 챌린지 검정이다. "열 챌린지 검정"에서, 조성물은 설정된 시간 동안 소정의 범위의 상승된 온도에 적용된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 시험 scFv 분자 또는 scFv 분자를 포함하는 분자는 소정의 범위의 증가하는 온도에, 예를 들어 1-1.5시간 동안 적용된다. 이어서, 단백질의 활성이 관련 생화학적 검정에 의해 검정된다. 예를 들어, 단백질이 결합 단백질 (예를 들어 scFv 또는 scFv-함유 폴리펩티드)인 경우에, 결합 단백질의 결합 활성은 기능적 또는 정량적 ELISA에 의해 결정될 수 있다.
이러한 검정은 이. 콜라이 및 고처리량 스크리닝을 사용하여 고처리량 포맷 및 실시예에 개시된 포맷으로 수행될 수 있다. CD123 결합 도메인, 예를 들어 scFv 변이체의 라이브러리는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. CD123 결합 도메인, 예를 들어 scFv 발현이 유도될 수 있고, CD123 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 열 챌린지에 적용될 수 있다. 챌린지된 시험 샘플은 결합에 대해 검정될 수 있고, 안정한 CD123 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 스케일-업되어 추가로 특징화될 수 있다.
열적 안정성은 임의의 상기 기술 (예를 들어 분석적 분광분석 기술)을 사용하여 조성물의 용융 온도 (Tm)를 측정함으로써 평가된다. 용융 온도는 조성물의 분자의 50%가 폴딩된 상태로 존재하는 열 전이 곡선의 중간점에서의 온도이다 (예를 들어, 문헌 [Dimasi et al. (2009) J. Mol Biol. 393: 672-692] 참조). 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인, 예를 들어 scFv에 대한 Tm 값은 약 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 80℃, 81℃, 82℃, 83℃, 84℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃, 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃이다. 한 실시양태에서, IgG에 대한 Tm 값은 약 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 80℃, 81℃, 82℃, 83℃, 84℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃, 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃이다. 한 실시양태에서, 다가 항체에 대한 Tm 값은 약 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 80℃, 81℃, 82℃, 83℃, 84℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃, 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃이다.
열적 안정성은 또한 분석적 열량측정 기술 (예를 들어 DSC)을 사용하여 조성물의 비열 또는 열 용량 (Cp)을 측정함으로써 평가된다. 조성물의 비열은 1mol의 물의 온도를 1℃ 상승시키기 위해 필요한 에너지 (예를 들어 kcal/mol 단위)이다. 큰 Cp는 변성된 또는 불활성 단백질 조성물의 특징이다. 조성물의 열 용량의 변화 (ΔCp)는 그의 열 전이 전 및 후에 조성물의 비열을 결정함으로써 측정된다. 열적 안정성은 또한 언폴딩의 깁스(Gibbs) 자유 에너지 (ΔG), 언폴딩의 엔탈피 (ΔH), 또는 언폴딩의 엔트로피 (ΔS)를 비롯한 열역학적 안정성의 다른 파라미터를 측정하거나 결정함으로써 평가될 수 있다. 상기 생화학적 검정 중 1종 이상 (예를 들어 열 챌린지 검정)이, 조성물의 50%가 그의 활성 (예를 들어 결합 활성)을 보유하는 온도 (즉, TC 값)를 결정하는데 사용된다.
또한, CD123 결합 도메인, 예를 들어 scFv에 대한 돌연변이는 비돌연변이된 CD123 결합 도메인, 예를 들어 scFv와 비교하여 CD123 결합 도메인, 예를 들어 scFv의 열적 안정성을 변경시킨다. 인간화 또는 인간 CD123 결합 도메인, 예를 들어 scFv가 CART123 구축물 내로 혼입된 경우에, CD123 결합 도메인, 예를 들어 인간화 또는 인간 scFv는 전체적인 CD123 CART 구축물에 열적 안정성을 부여한다. 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 CD123 결합 도메인, 예를 들어 scFv에 열적 안정성을 부여하는 단일 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CD123 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 CD123 결합 도메인, 예를 들어 scFv에 열적 안정성을 부여하는 다중 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인, 예를 들어 scFv 내의 다중 돌연변이는 CD123 결합 도메인, 예를 들어 scFv의 열적 안정성에 대해 상가적 효과를 갖는다.
b) % 응집
조성물의 안정성은 그의 응집 성향을 측정함으로써 결정될 수 있다. 응집은 수많은 비-제한적인 생화학적 또는 생물물리학적 기술에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 크로마토그래피, 예를 들어 크기-배제 크로마토그래피 (SEC)를 사용하여 조성물의 응집이 평가될 수 있다. SEC는 분자를 크기를 기초로 하여 분리한다. 칼럼은, 이온 및 소분자는 그의 내부에 수용하지만 큰 것은 수용하지 않을 중합체 겔의 반-고체 비드로 채워진다. 단백질 조성물이 칼럼의 상단에 적용되는 경우에, 치밀하게 폴딩된 단백질 (즉, 비-응집된 단백질)은 큰 단백질 응집체에 이용가능한 것보다 더 큰 부피의 용매 전반에 분포된다. 그 결과, 큰 응집체는 칼럼을 통해 보다 신속하게 이동하고, 이러한 방식으로 혼합물이 그의 성분으로 분리되거나 분획화될 수 있다. 각각의 분획은 겔로부터 용리됨에 따라 별개로 정량화될 수 있다 (예를 들어 광 산란에 의해). 따라서, 조성물의 % 응집은 분획의 농도를 겔에 적용된 단백질의 총 농도와 비교함으로써 결정될 수 있다. 안정한 조성물은 칼럼으로부터 본질적으로 단일 분획으로서 용리되고, 용리 프로파일 또는 크로마토그램에서 본질적으로 단일 피크로서 출현한다.
c) 결합 친화도
조성물의 안정성은 그의 표적 결합 친화도를 결정함으로써 평가될 수 있다. 결합 친화도를 결정하기 위한 매우 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 결합 친화도를 결정하기 위한 예시적인 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용한다. 표면 플라즈몬 공명은 예를 들어 비아코어(BIAcore) 시스템 (파마시아 바이오센서 아베(Pharmacia Biosensor AB), 스웨덴 웁살라 및 미국 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하여 바이오센서 매트릭스 내에서 단백질 농도에서의 변경을 검출함으로써 실시간 생물특이적 상호작용의 분석을 가능하게 하는 광학 현상이다. 추가의 설명에 대해서는, 문헌 [Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., i (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; 및 Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277]을 참조한다.
한 측면에서, CAR의 항원 결합 도메인은 본원에 기재된 항원 결합 도메인 아미노산 서열과 상동성인 아미노산 서열을 포함하고, 항원 결합 도메인은 본원에 기재된 CD123 항체 단편의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 하나의 구체적 측면에서, 본 발명의 CAR 조성물은 항체 단편을 포함한다. 추가 측면에서, 그러한 항체 단편은 scFv를 포함한다.
다양한 측면에서, CAR의 항원 결합 도메인은 1개 또는 둘 다의 가변 영역 (예를 들어, VH 및/또는 VL) 내의, 예를 들어 1개 이상의 CDR 영역 내의 및/또는 1개 이상의 프레임워크 영역 내의 1개 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 조작된다. 하나의 구체적 측면에서, 본 발명의 CAR 조성물은 항체 단편을 포함한다. 추가 측면에서, 그러한 항체 단편은 scFv를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은, 아미노산 서열은 변경되지만 (예를 들어, 야생형으로부터) 목적하는 활성은 변경되지 않도록 추가로 변형될 수 있음을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다. 예를 들어, "비필수" 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환으로 이어지는 추가의 뉴클레오티드 치환이 단백질에 대해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 분자 내 비필수 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 아미노산의 스트링은 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 조성에서 상이한 구조적으로 유사한 스트링으로 대체될 수 있고, 예를 들어 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 보존적 치환이 이루어질 수 있다.
유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 관련 기술분야에 정의되어 있고, 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 퍼센트 동일성은 동일한 2개 이상의 서열을 지칭한다. 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 또는 수동 정렬 및 시각적 검사에 의해 측정된 바와 같은 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대 상응을 위해 비교 및 정렬했을 때, 2개의 서열이 명시된 백분율의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 가질 경우에 (예를 들어, 명시된 영역에 걸쳐, 또는 명시되지 않은 경우에 전체 서열에 걸쳐 60% 동일성, 임의로 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성), 2개의 서열은 "실질적으로 동일하다". 임의로, 동일성은 길이가 적어도 약 50개 뉴클레오티드 (또는 10개 아미노산)인 영역에 걸쳐, 또는 보다 바람직하게는 길이가 100 내지 500 또는 1000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 (또는 20, 50, 200개 또는 그 초과의 아미노산)인 영역에 걸쳐 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 1개의 서열은 시험 서열이 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우에, 시험 및 참조 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요한 경우에 하위서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 또는 대안적 파라미터가 지정될 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터를 기초로 하여 참조 서열 대비 시험 서열의 퍼센트 서열 동일성을 계산한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어 문헌 [Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국부 상동성 알고리즘에 의해, 문헌 [Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌 [Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행 (위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해, 또는 수동 정렬 및 시각적 검사에 의해 (예를 들어, 문헌 [Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology] 참조)에 의해 수행될 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기 위해 적합한 알고리즘의 2가지 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이고, 이것은 각각 문헌 [Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; 및 Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물 정보 센터를 통해 공중 이용가능하다.
2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 또한 PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하는, ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합된 문헌 [E. Meyers and W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17)]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 Blossom 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 (www.gcg.com에서 이용가능) 내의 GAP 프로그램에 통합된 문헌 [Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453] 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 기능적으로 동등한 분자를 생성하는 출발 항체 또는 단편 (예를 들어, scFv) 아미노산 서열의 변형을 고려한다. 예를 들어, CAR 내에 포함된 CD123 결합 도메인, 예를 들어 scFv의 VH 또는 VL은 CD123 결합 도메인, 예를 들어 scFv의 출발 VH 또는 VL 프레임워크 영역의 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 보유하도록 변형될 수 있다. 본 발명은 기능적으로 동등한 분자를 생성하기 위해 전체 CAR 구축물의 변형, 예를 들어 CAR 구축물의 다양한 도메인의 1개 이상의 아미노산 서열의 변형을 고려한다. CAR 구축물은 출발 CAR 구축물의 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 보유하도록 변형될 수 있다.
막횡단 도메인
막횡단 도메인과 관련하여, 다양한 실시양태에서, CAR은 CAR의 세포외 도메인에 부착된 막횡단 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 막횡단 도메인은 막횡단 영역에 인접한 1개 이상의 추가의 아미노산, 예를 들어 막횡단 도메인이 유래된 단백질의 세포외 영역과 회합된 1개 이상의 아미노산 (예를 들어, 세포외 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 최대 15개의 아미노산) 및/또는 막횡단 도메인이 유래된 단백질의 세포내 영역과 회합된 1개 이상의 추가의 아미노산 (예를 들어, 세포내 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 최대 15개의 아미노산)을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 막횡단 도메인은 사용된 CAR의 다른 도메인 중 1개와 회합된 것이다. 일부 경우에, 막횡단 도메인은 이러한 도메인이 동일 또는 상이한 표면 막 단백질의 막횡단 도메인에 결합하는 것을 피하기 위해, 예를 들어 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 선택될 수 있거나 또는 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다. 한 측면에서, 막횡단 도메인은 CAR-발현 세포, 예를 들어 CART 세포, 세포 표면 상의 또 다른 CAR과 동종이량체화가 가능하다. 상이한 측면에서, 막횡단 도메인의 아미노산 서열은 동일한 CAR-발현 세포, 예를 들어 CART 세포에 존재하는 천연 결합 파트너의 결합 도메인과의 상호작용을 최소화하기 위해 변형되거나 치환될 수 있다.
막횡단 도메인은 천연 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우에, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 한 측면에서, 막횡단 도메인은 CAR이 표적에 결합할 때마다 세포내 도메인(들)에 신호전달을 할 수 있다. 본 발명에서 특히 유용한 막횡단 도메인은 적어도 예를 들어 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8 (예를 들어, CD8 알파, CD8 베타), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154의 막횡단 영역(들)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 적어도, 예를 들어 KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R α, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKG2D, NKG2C, 및 CD19의 막횡단 영역(들)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 막횡단 도메인은 힌지, 예를 들어 인간 단백질로부터의 힌지를 통해 CAR의 세포외 영역, 예를 들어 CAR의 항원 결합 도메인에 부착될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 힌지는 인간 Ig (이뮤노글로불린) 힌지, 예를 들어 IgG4 힌지 또는 CD8a 힌지일 수 있다. 한 실시양태에서, 힌지 또는 스페이서는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 6의 막횡단 도메인을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다).
한 측면에서, 힌지 또는 스페이서는 IgG4 힌지를 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 힌지 또는 스페이서는 하기 아미노산 서열의 힌지를 포함한다:
Figure pct00077
일부 실시양태에서, 힌지 또는 스페이서는 하기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 힌지를 포함한다:
Figure pct00078
한 측면에서, 힌지 또는 스페이서는 IgD 힌지를 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 힌지 또는 스페이서는 하기 아미노산 서열의 힌지를 포함한다:
Figure pct00079
일부 실시양태에서, 힌지 또는 스페이서는 하기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 힌지를 포함한다:
Figure pct00080
한 측면에서, 막횡단 도메인은 재조합일 수 있고, 이 경우에 이는 소수성 잔기, 예컨대 류신 및 발린을 우세하게 포함할 것이다. 한 측면에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체가 재조합 막횡단 도메인의 각각의 말단에서 발견될 수 있다.
임의로, 2 내지 10개 아미노산 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커는 CAR의 막횡단 도메인과 세포질 영역 사이에 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중체는 특히 적합한 링커를 제공한다. 예를 들어, 한 측면에서, 링커는 GGGGSGGGGS (서열식별번호: 5)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC (서열식별번호: 16)의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.
한 측면에서, 힌지 또는 스페이서는 KIR2DS2 힌지를 포함한다.
세포질 도메인
본 발명의 CAR의 세포질 도메인 또는 영역은 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 CAR이 도입된 면역 세포의 정상 이펙터 기능 중 적어도 1종을 활성화할 수 있다.
본 발명의 CAR에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 예는 항원 수용체 관여 후에 신호 전달을 개시하기 위해 함께 작용하는 T 세포 수용체 (TCR) 및 보조-수용체의 세포질 서열, 뿐만 아니라 동일한 기능적 능력을 갖는 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 임의의 재조합 서열을 포함한다.
TCR을 통해 생성된 신호 단독은 T 세포의 완전한 활성화를 위해 불충분하고 2차 및/또는 공동자극 신호가 또한 필요함이 공지되어 있다. 따라서, T 세포 활성화는 세포질 신호전달 서열의 2개의 별개의 부류에 의해 매개된다고 언급될 수 있다: TCR을 통해 항원-의존성 1차 활성화를 개시하는 것 (1차 세포내 신호전달 도메인) 및 2차 또는 공동자극 신호를 제공하기 위해 항원-비의존성 방식으로 작용하는 것 (2차 세포질 도메인, 예를 들어 공동자극 도메인).
1차 신호전달 도메인은 TCR 복합체의 1차 활성화를 자극 방식으로 또는 억제 방식으로 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호전달 모티프를 함유할 수 있다.
본 발명에 특히 유용한 1차 세포내 신호전달 도메인을 함유하는 ITAM의 예는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 ("ICOS"으로도 공지됨), FcεRI, DAP10, DAP12 및 CD66d의 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3-제타의 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 1차 신호전달 도메인은 천연 ITAM 도메인과 비교하여 변경된 (예를 들어, 증가된 또는 감소된) 활성을 갖는 변형된 ITAM 도메인, 예를 들어 돌연변이된 ITAM 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 1차 신호전달 도메인은 변형된 ITAM-함유 1차 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 최적화된 및/또는 말단절단된 ITAM-함유 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 1차 신호전달 도메인은 1, 2, 3 또는 4개 또는 그 초과의 ITAM 모티프를 포함한다.
본 발명에 특히 유용한 1차 세포내 신호전달 도메인을 함유하는 분자의 추가의 예는 DAP10, DAP12, 및 CD32의 것을 포함한다.
CAR의 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3-제타 신호전달 도메인을 단독으로 포함할 수 있거나, 또는 본 발명의 CAR과 관련하여 유용한 임의의 다른 목적하는 세포내 신호전달 도메인(들)과 조합될 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3 제타 쇄 부분 및 공동자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 공동자극 신호전달 도메인은 공동자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 부분을 지칭한다. 공동자극 분자는 항원 수용체 이외의 세포 표면 분자 또는 림프구의 항원에 대한 효율적인 반응을 위해 필요한 그의 리간드이다. 이러한 분자의 예는 MHC 부류 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다. 예를 들어, CD27 공동자극은 시험관내에서 인간 CART 세포의 확장, 이펙터 기능, 및 생존을 증진시키고, 생체내에서 인간 T 세포 지속성 및 항종양 활성을 증대시키는 것으로 입증된 바 있다 (Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706).
본 발명의 CAR의 세포질 부분 내의 세포내 신호전달 서열은 서로 무작위로 또는 명시된 순서로 연결될 수 있다. 임의로, 예를 들어 2 내지 10개 아미노산 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산) 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커는 세포내 신호전달 서열 사이에 연결을 형성할 수 있다. 한 실시양태에서, 글리신-세린 이중체가 적합한 링커로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 단일 아미노산, 예를 들어 알라닌, 글리신이 적합한 링커로서 사용될 수 있다.
한 측면에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 공동자극 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 한 실시양태에서, 2개 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 공동자극 신호전달 도메인은 링커 분자, 예를 들어 본원에 기재된 링커 분자에 의해 분리된다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 분자는 글리신 잔기이다. 일부 실시양태에서, 링커는 알라닌 잔기이다.
한 측면에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 한 측면에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 한 측면에서, 4-1BB의 신호전달 도메인은 서열식별번호: 7의 신호전달 도메인이다. 한 측면에서, CD3-제타의 신호전달 도메인은 서열식별번호: 9 (돌연변이체 CD3-제타) 또는 서열식별번호: 10 (야생형 인간 CD3-제타)의 신호전달 도메인이다.
한 측면에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD27의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 한 측면에서, CD27의 신호전달 도메인은 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00081
한 측면에서, CD27의 신호전달 도메인은 하기의 핵산 서열에 의해 코딩된다:
Figure pct00082
한 측면에서, CD27의 신호전달 도메인은 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00083
한 측면에서, CD27의 신호전달 도메인은 하기의 핵산 서열에 의해 코딩된다:
Figure pct00084
한 측면에서, 세포내는 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 한 측면에서, CD28의 신호전달 도메인은 서열식별번호: 379의 아미노산 서열을 포함한다. 한 측면에서, CD28의 신호전달 도메인은 서열식별번호: 380의 핵산 서열에 의해 코딩된다.
한 측면에서, 세포내는 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 ICOS의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 한 측면에서, CD28의 신호전달 도메인은 서열식별번호: 381의 아미노산 서열을 포함한다. 한 측면에서, ICOS의 신호전달 도메인은 서열식별번호: 382의 핵산 서열에 의해 코딩된다.
한 측면에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 제2 CAR, 예를 들어, 예를 들어 동일한 표적 (CD123) 또는 상이한 표적 (예를 들어, CD19, CD33, CLL-1, CD34, FLT3, 또는 폴레이트 수용체 베타)에 대한 상이한 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 CAR을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 제2 CAR은 급성 골수성 백혈병 세포 상에서 발현된 표적, 예컨대 예를 들어, CD19, CD33, CLL-1, CD34, FLT3, 또는 폴레이트 수용체 베타에 대한 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, CAR-발현 세포는 제1 항원을 표적화하고 공동자극 신호전달 도메인을 갖지만 1차 신호전달 도메인은 갖지 않는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR, 및 제2의 상이한 항원을 표적화하고 1차 신호전달 도메인을 갖지만 공동자극 신호전달 도메인은 갖지 않는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함한다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 공동자극 신호전달 도메인, 예를 들어 4-1BB, CD28, CD27, ICOS, 또는 OX-40을 제1 CAR에, 및 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3 제타를 제2 CAR에 배치하면, CAR 활성을 둘 다의 표적이 발현되는 세포로 제한할 수 있다. 한 실시양태에서, CAR 발현 세포는 CD123 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 공동자극 도메인을 포함하는 제1 CD123 CAR, 및 CD123 이외의 항원 (예를 들어, AML 세포 상에서 발현된 항원, 예를 들어 CD19, CD33, CLL-1, CD34, FLT3, 또는 폴레이트 수용체 베타)을 표적화하고 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CAR 발현 세포는 CD123 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CD123 CAR, 및 CD123 이외의 항원 (예를 들어, AML 세포 상에서 발현된 항원, 예를 들어 CD19, CD33, CLL-1, CD34, FLT3, 또는 폴레이트 수용체 베타)을 표적화하고 항원에 대한 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 공동자극 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함한다.
한 실시양태에서, CAR-발현 세포는 본원에 기재된 CD123 CAR 및 억제 CAR을 포함한다. 한 실시양태에서, 억제 CAR은, 암 세포 상에서는 발견되지 않지만 정상 세포, 예를 들어 CD123을 또한 발현하는 정상 세포 상에서는 발견되는 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 억제 CAR은 억제 분자의 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다. 예를 들어, 억제 CAR의 세포내 도메인은 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR (예를 들어, TGFR 베타)의 세포내 도메인일 수 있다.
한 실시양태에서, CAR-발현 세포가 2개 이상의 상이한 CAR을 포함하는 경우에, 상이한 CAR의 항원 결합 도메인은 항원 결합 도메인이 서로 상호작용하지 않도록 하는 것일 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 CAR을 발현하는 세포는 제1 CAR의 항원 결합 도메인을, 예를 들어 제2 CAR의 항원 결합 도메인과 회합을 형성하지 않는 단편, 예를 들어 scFv로서 가질 수 있고, 예를 들어 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 VHH이다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 그의 상보성 결정 영역이 단일 도메인 폴리펩티드의 일부인 분자를 포함하는 단일 도메인 항원 결합 (SDAB) 분자를 포함한다. 예는 중쇄 가변 도메인, 자연적으로 경쇄가 결여된 결합 분자, 통상적인 4-쇄 항체로부터 유래된 단일 도메인, 조작된 도메인 및 항체로부터 유래된 것 이외의 단일 도메인 스캐폴드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. SDAB 분자는 임의의 관련 기술 분야의 것, 또는 임의의 미래의 단일 도메인 분자일 수 있다. SDAB 분자는 마우스, 인간, 낙타, 라마, 칠성장어, 어류, 상어, 염소, 토끼, 및 소를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 이 용어는 또한 낙타과 및 상어 이외의 종으로부터의 자연 발생 단일 도메인 항체 분자를 포함한다.
한 측면에서, SDAB 분자는 어류에서 발견된 이뮤노글로불린의, 예컨대 예를 들어 상어의 혈청에서 발견된 신규 항원 수용체 (NAR)로서 공지된 이뮤노글로불린 이소형으로부터 유래된 가변 영역으로부터 유래될 수 있다. NAR의 가변 영역으로부터 유래된 단일 도메인 분자 ("IgNAR")를 생산하는 방법은 WO 03/014161 및 문헌 [Streltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909]에 기재되어 있다.
또 다른 측면에 따르면, SDAB 분자는 경쇄가 결여된 중쇄로서 공지된 자연 발생 단일 도메인 항원 결합 분자이다. 이러한 단일 도메인 분자는 예를 들어 WO 9404678 및 문헌 [Hamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448]에 개시되어 있다. 명확성을 위해, 자연적으로 경쇄가 결여된 중쇄 분자로부터 유래된 이러한 가변 도메인은 4쇄 이뮤노글로불린의 통상적인 VH와 구별하기 위해 본원에서 VHH 또는 나노바디로 공지된다. 이러한 VHH 분자는 낙타과 종으로부터, 예를 들어 낙타, 라마, 단봉낙타, 알파카 및 구아나코에서 유래될 수 있다. 낙타과 외에도 다른 종이 자연적으로 경쇄가 결여된 중쇄 분자를 생산할 수 있고; 이러한 VHH는 본 발명의 범주 내에 포함된다.
SDAB 분자는 재조합, CDR-그라프팅, 인간화, 낙타화, 탈-면역화 및/또는 시험관내 생성될 (예를 들어, 파지 디스플레이에 의해 선택될) 수 있다.
또한, 예를 들어 수용체의 항원 결합 도메인 사이의 상호작용은 항원 결합 도메인 중 1종 이상이 그의 동족 항원에 결합하는 능력을 억제하기 때문에, 항원 결합 도메인을 포함하는 복수의 키메라 막 포매된 수용체를 갖는 세포는 바람직하지 않을 수 있는 것으로 밝혀진 바 있다. 따라서, 이러한 상호작용을 최소화하는 항원 결합 도메인을 포함하는 제1 및 제2 비-자연 발생 키메라 막 포매된 수용체를 갖는 세포가 본원에 개시된다. 또한, 이러한 상호작용을 최소화하는 항원 결합 도메인을 포함하는 제1 및 제2 비-자연 발생 키메라 막 포매된 수용체를 코딩하는 핵산, 뿐만 아니라 이러한 세포 및 핵산의 제조 및 사용 방법이 본원에 개시된다. 한 실시양태에서, 상기 제1 및 상기 제2 비-자연 발생 키메라 막 포매된 수용체 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하고, 다른 것은 단일 VH 도메인, 예를 들어 낙타류, 상어, 또는 칠성장어 단일 VH 도메인, 또는 인간 또는 마우스 서열로부터 유래된 단일 VH 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제1 및 제2 CAR을 포함하며, 여기서 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 포함하지 않다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv이고, 다른 것은 scFv가 아니다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 단일 VH 도메인, 예를 들어 낙타류, 상어, 또는 칠성장어 단일 VH 도메인, 또는 인간 또는 마우스 서열로부터 유래된 단일 VH 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 나노바디를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 낙타류 VHH 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하고, 다른 것은 단일 VH 도메인, 예를 들어 낙타류, 상어, 또는 칠성장어 단일 VH 도메인, 또는 인간 또는 마우스 서열로부터 유래된 단일 VH 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하고, 다른 것은 나노바디를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하고, 다른 것은 낙타류 VHH 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포의 표면 상에 존재하는 경우에, 상기 제1 CAR의 항원 결합 도메인의 그의 동족 항원에 대한 결합은 상기 제2 CAR의 존재에 의해 실질적으로 감소되지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 제2 CAR의 존재 하에서의 상기 제1 CAR의 항원 결합 도메인의 그의 동족 항원에 대한 결합은 상기 제2 CAR의 부재 하에서의 상기 제1 CAR의 항원 결합 도메인의 그의 동족 항원에 대한 결합의 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다.
일부 실시양태에서, 세포의 표면 상에 존재하는 경우에, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 둘 다 scFv 항원 결합 도메인인 경우보다 더 낮은 정도로 서로 회합한다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 둘 다 scFv 항원 결합 도메인인 경우보다 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 더 낮은 정도로 서로 회합한다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 또 다른 작용제, 예를 들어 CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제를 추가로 발현할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 작용제는 억제 분자를 억제하는 작용제일 수 있다. 억제 분자, 예를 들어 PD1은 일부 실시양태에서 면역 이펙터 반응을 일으키는 CAR-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 억제 분자의 예는 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR (예를 들어, TGFR 베타)을 포함한다. 한 실시양태에서, 억제 분자를 억제하는 작용제는, 예를 들어 본원에 기재된 분자, 예를 들어 양성 신호를 세포에 제공하는 제2 폴리펩티드, 예를 들어 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인과 회합된 제1 폴리펩티드, 예를 들어 억제 분자를 포함하는 작용제이다. 한 실시양태에서, 작용제는 예를 들어 억제 분자, 예컨대 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR (예를 들어, TGFR 베타), 또는 이들 중 임의의 것의 단편 (예를 들어, 이들 중 임의의 것의 세포외 도메인의 적어도 일부)의 제1 폴리펩티드, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동자극 도메인 (예를 들어 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어 41BB, CD27, 또는 CD28) 및/또는 1차 신호전달 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인) 포함)인 제2 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 작용제는 PD1 또는 그의 단편 (예를 들어, PD1의 세포외 도메인의 적어도 일부)의 제1 폴리펩티드, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 CD28 신호전달 도메인 및/또는 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인)의 제2 폴리펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 예를 들어 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO 2013/019615에 기재된 바와 같은 스위치 공동자극 수용체를 포함한다. PD1은 CD28, CTLA-4, ICOS, 및 BTLA를 또한 포함하는 CD28 패밀리의 수용체의 억제 구성원이다. PD-1은 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수 세포 상에서 발현된다 (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). PD1에 대한 2개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2는 PD1에 결합 시 T 세포 활성화를 하향조절하는 것으로 제시된 바 있다 (Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1은 인간 암에서 풍부하다 (Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). 면역 억제는 PD1과 PD-L1의 국부 상호작용을 억제함으로써 역전될 수 있다.
한 실시양태에서, 작용제는 억제 분자의 세포외 도메인 (ECD)을 포함하고, 예를 들어 프로그램화된 사멸 1 (PD1)은 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인, 예컨대 41BB 및 CD3 제타에 융합될 수 있다 (본원에서 PD1 CAR로도 지칭됨). 한 실시양태에서, PD1 CAR은 본원에 기재된 CD123 CAR과 조합되어 사용되는 경우에 CAR-발현 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 지속성을 개선시킨다. 한 실시양태에서, CAR은 서열식별번호: 24에 밑줄로 표시한 PD1의 세포외 도메인을 포함하는 PD1 CAR이다. 한 실시양태에서, PD1 CAR은 서열식별번호: 24의 아미노산 서열을 포함한다.
Figure pct00085
한 실시양태에서, PD1 CAR은 하기 제공된 아미노산 서열 (서열식별번호: 22)을 포함한다.
Figure pct00086
한 실시양태에서, 작용제는 PD1 CAR, 예를 들어 본원에 기재된 PD1 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, PD1 CAR에 대한 핵산 서열이 하기 제시되고, 여기서 PD1 ECD는 하기 서열식별번호: 23에서 밑줄로 표시된다.
Figure pct00087
또 다른 측면에서, 본 발명은 CAR-발현 세포, 예를 들어 CART 세포 또는 CAR-발현 NK 세포의 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, CAR-발현 세포의 집단은 상이한 CAR을 발현하는 세포의 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, CAR-발현 세포 (예를 들어, CART 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)의 집단은 본원에 기재된 CD123 결합 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 제1 세포, 및 제1 세포에 의해 발현된 CAR 내의 CD123 결합 도메인과 상이한, 상이한 CD123 결합 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 CD123 결합 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 제2 세포를 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, CAR-발현 세포의 집단은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 CD123 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제1 세포, 및 CD123 이외의 표적 (예를 들어, CD33, CD34, CLL-1, FLT3, 또는 폴레이트 수용체 베타)에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제2 세포를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, CAR-발현 세포의 집단은 예를 들어 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제1 세포, 및 2차 신호전달 도메인, 예를 들어 공동자극 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제2 세포를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 집단 내의 적어도 1종의 세포는 본원에 기재된 CD123 도메인을 갖는 CAR을 발현하고 제2 세포는 또 다른 작용제, 예를 들어 CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제를 발현하는 세포의 집단을 제공한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 작용제는 억제 분자를 억제하는 작용제일 수 있다. 억제 분자는 예를 들어 일부 실시양태에서 면역 이펙터 반응을 일으키는 CAR-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 억제 분자의 예는 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR (예를 들어, TGFR 베타)을 포함한다. 한 실시양태에서, 억제 분자를 억제하는 작용제는, 예를 들어 본원에 기재된 분자, 예를 들어 양성 신호를 세포에 제공하는 제2 폴리펩티드, 예를 들어 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인과 회합된 제1 폴리펩티드, 예를 들어 억제 분자를 포함하는 작용제이다. 한 실시양태에서, 작용제는 예를 들어 억제 분자, 예컨대 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR (예를 들어, TGFR 베타), 또는 이들 중 임의의 것의 단편 (예를 들어, 이들 중 임의의 것의 세포외 도메인의 적어도 일부)의 제1 폴리펩티드, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동자극 도메인 (예를 들어 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어 41BB, CD27, 또는 CD28) 및/또는 1차 신호전달 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인) 포함)인 제2 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 작용제는 PD1 또는 그의 단편 (예를 들어, PD1의 세포외 도메인의 적어도 일부)의 제1 폴리펩티드, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 CD28 신호전달 도메인 및/또는 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인)의 제2 폴리펩티드를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 CAR-발현 세포, 예를 들어 CART 세포 또는 CAR-발현 NK 세포의 집단, 예를 들어 상이한 CAR을 발현하는 세포의 혼합물을 또 다른 작용제, 예를 들어 키나제 억제제, 예컨대 본원에 기재된 키나제 억제제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 집단 내의 적어도 1종의 세포가 본원에 기재된 바와 같은 항암 연관 항원 결합 도메인을 갖는 CAR을 발현하고, 제2 세포는 또 다른 작용제, 예를 들어 CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제를 발현하는 것인 세포의 집단을 또 다른 작용제, 예를 들어 키나제 억제제, 예컨대 본원에 기재된 키나제 억제제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
자연 킬러 세포 수용체 (NKR) CAR
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 분자는 자연 킬러 세포 수용체 (NKR)의 1종 이상의 성분을 포함하며, 그에 의해 NKR-CAR을 형성한다. NKR 성분은 임의의 하기 자연 킬러 세포 수용체: 킬러 세포 이뮤노글로불린-유사 수용체 (KIR), 예를 들어, KIR2DL1, KIR2DL2/L3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, DIR2DS5, KIR3DL1/S1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR2DP1, 및 KIR3DP1; 천연 세포독성 수용체 (NCR), 예를 들어, NKp30, NKp44, NKp46; 면역 세포 수용체의 신호전달 림프구 활성화 분자 (SLAM) 패밀리, 예를 들어, CD48, CD229, 2B4, CD84, NTB-A, CRACC, BLAME, 및 CD2F-10; Fc 수용체 (FcR), 예를 들어, CD16, 및 CD64; 및 Ly49 수용체, 예를 들어 LY49A, LY49C로부터의 막횡단 도메인, 힌지 도메인, 또는 세포질 도메인일 수 있다. 본원에 기재된 NKR-CAR 분자는 어댑터 분자 또는 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 DAP12와 상호작용할 수 있다. NKR 성분을 포함하는 CAR 분자의 예시적인 구성 및 서열은 국제 공개 번호 WO2014/145252에 기재되어 있고, 그 내용은 본원에 참조로 포함된다.
스플릿 CAR
일부 실시양태에서, CAR-발현 세포는 스플릿 CAR을 사용한다. 스플릿 CAR 접근법은 본원에 참조로 포함되는 공개 WO2014/055442 및 WO2014/055657에 보다 상세하게 기재되어 있다. 간략하게, 스플릿 CAR 시스템은 제1 항원 결합 도메인 및 공동자극 도메인 (예를 들어, 41BB)을 갖는 제1 CAR을 발현하는 세포를 포함하고, 세포는 또한 제2 항원 결합 도메인 및 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, CD3 제타)을 갖는 제2 CAR을 발현한다. 세포가 제1 항원을 만난 경우에, 공동자극 도메인이 활성화되고 세포는 증식한다. 세포가 제2 항원을 만난 경우에, 세포내 신호전달 도메인이 활성화되고 세포-사멸 활성이 개시된다. 따라서, CAR-발현 세포는 오직 둘 다의 항원의 존재 하에서만 활성화된다. 실시양태에서 제1 항원 결합 도메인은 CD123을 인식하고, 예를 들어 본원에 기재된 항원 결합 도메인을 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 급성 골수성 백혈병 세포 상에서 발현된 항원, 예를 들어 CLL-1, CD33, CD34, FLT3, 또는 폴레이트 수용체 베타를 인식한다. 실시양태에서 제1 항원 결합 도메인은 CD123을 인식하고, 예를 들어 본원에 기재된 항원 결합 도메인을 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 B-세포 상에서 발현된 항원, 예를 들어 CD19, CD20, CD22 또는 ROR1을 인식한다.
키메라 항원 수용체를 조절하기 위한 전략
CAR 활성을 조절할 수 있는 많은 방식이 존재한다. 일부 실시양태에서, CAR 활성이 제어될 수 있는 조절성 CAR (RCAR)은 CAR 요법의 안전성 및 효능을 최적화하는데 바람직하다. 예를 들어, 이량체화 도메인에 융합된 카스파제를 사용하여 예를 들어 아폽토시스를 유도하는 것 (예를 들어, 문헌 [Di et al., N Engl. J. Med. 2011 Nov. 3; 365(18):1673-1683] 참조)은 본 발명의 CAR 요법에서 안전성 스위치로서 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, CAR-발현 세포는 또한 유도성 카스파제-9 (i카스파제-9) 분자를 발현할 수 있고, 이는 이량체화 약물 (예를 들어, 리미두시드 (AP1903 (벨리쿰 파마슈티칼스(Bellicum Pharmaceuticals)) 또는 AP20187 (아리아드(Ariad))로도 불림)의 투여 시, 카스파제-9의 활성화 및 세포의 아폽토시스로 이어진다. i카스파제-9 분자는 CID의 존재 하에 이량체화를 매개하는 이량체화 (CID) 결합 도메인의 화학적 유도제를 함유한다. 이는 CAR-발현 세포의 유도적 및 선택적 고갈을 발생시킨다. 일부 경우에, i카스파제-9 분자는 CAR-코딩 벡터(들)와 별개의 핵산 분자에 의해 코딩된다. 일부 경우에, i카스파제-9 분자는 CAR-코딩 벡터와 동일한 핵산 분자에 의해 코딩된다. i카스파제-9는 CAR-발현 세포의 임의의 독성을 피하기 위한 안전성 스위치를 제공할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Song et al. Cancer Gene Ther. 2008; 15(10):667-75; Clinical Trial Id. No. NCT02107963; 및 Di Stasi et al. N. Engl. J. Med. 2011; 365:1673-83]을 참조한다.
본 발명의 CAR 요법을 조절하기 위한 대안적 전략은 예를 들어 항체 의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 유도함으로써, 예를 들어 CAR-발현 세포를 결실시킴으로써 CAR 활성을 비활성화시키거나 턴 오프하는 소분자 또는 항체를 이용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 또한 세포 사멸, 예를 들어 ADCC 또는 보체-유도 세포 독성을 유도할 수 있는 분자에 의해 인식되는 항원을 발현할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 CAR 발현 세포는 또한 항체 또는 항체 단편에 의해 표적화될 수 있는 수용체를 발현할 수 있다. 이러한 수용체의 예는 EpCAM, VEGFR, 인테그린 (예를 들어, 인테그린 ανβ3, α4, αI¾β3, α4β7, α5β1, ανβ3, αν), TNF 수용체 슈퍼패밀리의 구성원 (예를 들어, TRAIL-R1 , TRAIL-R2), PDGF 수용체, 인터페론 수용체, 폴레이트 수용체, GPNMB, ICAM-1 , HLA-DR, CEA, CA-125, MUC1 , TAG-72, IL-6 수용체, 5T4, GD2, GD3, CD2, CD3, CD4, CD5, CD1 1 , CD1 1 a/LFA-1 , CD15, CD18/ITGB2, CD19, CD20, CD22, CD23/lgE 수용체, CD25, CD28, CD30, CD33, CD38, CD40, CD41, CD44, CD51, CD52, CD62L, CD74, CD80, CD125, CD147/바시긴, CD152/CTLA-4, CD154/CD40L, CD195/CCR5, CD319/SLAMF7, 및 EGFR, 및 그의 말단절단된 버전 (예를 들어, 1개 이상의 세포외 에피토프는 보존되었지만 세포질 도메인 내 1개 이상의 영역이 결여된 버전)을 포함한다.
예를 들어, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 또한 신호전달 능력은 결여되었지만 ADCC를 유도할 수 있는 분자, 예를 들어 세툭시맙 (에르비툭스(ERBITUX)®)에 의해 인식되는 에피토프를 보유하는 말단절단된 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)를 발현할 수 있어서, 세툭시맙의 투여는 ADCC를 유도하고 이어서 CAR-발현 세포를 고갈시킨다 (예를 들어, WO2011/056894, 및 문헌 [Jonnalagadda et al., Gene Ther. 2013; 20(8)853-860] 참조). 또 다른 전략은 본원에 기재된 CAR-발현 세포에서 CD32 및 CD20 항원 둘 다로부터의 표적 에피토프를 합한 고도로 치밀한 마커/자살 유전자를 발현시키는 것을 포함하고, 이는 리툭시맙에 결합하고, 예를 들어 ADCC에 의해 CAR-발현 세포의 선택적 고갈을 발생시킨다 (예를 들어, 문헌 [Philip et al., Blood. 2014; 124(8)1277-1287] 참조). 본원에 기재된 CAR-발현 세포를 고갈시키는 다른 방법은 예를 들어 ADCC를 유도함으로써 파괴를 위해 성숙한 림프구, 예를 들어 CAR-발현 세포에 선택적으로 결합하고 표적화하는 모노클로날 항-CD52 항체인 캄파트(CAMPATH)의 투여를 포함한다. 다른 실시양태에서, CAR-발현 세포는 CAR 리간드, 예를 들어 항-이디오타입 항체를 사용하여 선택적으로 표적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-이디오타입 항체는 이펙터 세포 활성, 예를 들어 ADCC 또는 ADC 활성을 유발하여 CAR-발현 세포의 수를 감소시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, CAR 리간드, 예를 들어 항-이디오타입 항체는 세포 사멸을 유도하는 작용제, 예를 들어 독소에 커플링되어 CAR-발현 세포의 수를 감소시킬 수 있다. 대안적으로, CAR 분자 그 자체가 활성이 조절될 수 있도록, 예를 들어 하기 기재된 바와 같이 턴 온 및 오프될 수 있도록 구성될 수 있다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 또한 T 세포 고갈제에 의해 인식되는 표적 단백질을 발현할 수 있다. 한 실시양태에서, 표적 단백질은 CD20이고, T 세포 고갈제는 항-CD20 항체, 예를 들어 리툭시맙이다. 이러한 실시양태에서, T 세포 고갈제는 CAR-발현 세포를 감소 또는 제거하는 것, 예를 들어 CAR 유도된 독성을 완화시키는 것이 바람직하다면 투여된다. 다른 실시양태에서, T 세포 고갈제는 항-CD52 항체, 예를 들어 본원의 실시예에 기재된 바와 같은 알렘투주맙이다.
다른 실시양태에서, RCAR은 가장 단순한 실시양태에서 전형적으로 2개인 폴리펩티드의 세트를 포함하며, 여기서 본원에 기재된 표준 CAR의 성분, 예를 들어 항원 결합 도메인 및 세포내 신호전달 도메인은 개별 폴리펩티드 또는 구성원 상에 분할된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 세트는 이량체화 분자의 존재 시 폴리펩티드를 서로 커플링시킬 수 있는, 예를 들어 항원 결합 도메인을 세포내 신호전달 도메인에 커플링시킬 수 있는 이량체화 스위치를 포함한다. 이러한 조절성 CAR의 추가의 설명 및 예시적인 구성이 본원, 및 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 공개 번호 WO 2015/090229에서 제공된다.
한 측면에서, RCAR은 2개의 폴리펩티드 또는 구성원: 1) 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 구성원, 및 제1 스위치 도메인; 2) 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 본원에 기재된 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 구성원, 및 제2 스위치 도메인을 포함한다. 임의로, RCAR은 본원에 기재된 막횡단 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 세포내 신호전달 구성원에, 항원 결합 구성원에, 또는 둘 다에 배치될 수 있다. (달리 나타내지 않는 한, RCAR의 구성원 또는 요소가 본원에 기재된 경우에, 순서는 제공된 바와 같을 수 있지만, 다른 순서가 또한 포함된다. 다시 말해서, 한 실시양태에서 순서는 텍스트에 제시된 바와 같지만, 다른 실시양태에서 순서는 상이할 수 있다. 예를 들어, 막횡단 영역의 한 측면 상의 요소의 순서는 예와 상이할 수 있고, 예를 들어 세포내 신호전달 도메인에 대해 스위치 도메인의 배치는 상이하고, 예를 들어 반대로 될 수 있다).
한 실시양태에서, 제1 및 제2 스위치 도메인은 세포내 또는 세포외 이량체화 스위치를 형성할 수 있다. 한 실시양태에서, 이량체화 스위치는 예를 들어 제1 및 제2 스위치 도메인이 동일한 동종이량체화 스위치, 또는 예를 들어 제1 및 제2 스위치 도메인이 서로 상이한 이종이량체화 스위치일 수 있다.
실시양태에서, RCAR은 "다중 스위치"를 포함할 수 있다. 다중 스위치는 이종이량체화 스위치 도메인 또는 동종이량체화 스위치 도메인을 포함할 수 있다. 다중 스위치는 제1 구성원, 예를 들어 항원 결합 구성원, 및 제2 구성원, 예를 들어 세포내 신호전달 구성원 상에 독립적으로 복수의, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 스위치 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 구성원은 복수의 제1 스위치 도메인, 예를 들어 FKBP-기반 스위치 도메인을 포함할 수 있고, 제2 구성원은 복수의 제2 스위치 도메인, 예를 들어 FRB-기반 스위치 도메인을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 구성원은 제1 및 제2 스위치 도메인, 예를 들어 FKBP-기반 스위치 도메인 및 FRB-기반 스위치 도메인을 포함할 수 있고, 제2 구성원은 제1 및 제2 스위치 도메인, 예를 들어 FKBP-기반 스위치 도메인 및 FRB-기반 스위치 도메인을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 세포내 신호전달 구성원은 1개 이상의 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 1차 세포내 신호전달 도메인 및 1개 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 항원 결합 구성원은 1개 이상의 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 1개 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 항원 결합 구성원은 본원에 기재된, 예를 들어 4-1BB, CD28, CD27, ICOS, 및 OX40으로부터 선택된 복수의, 예를 들어 2 또는 3개의 공동자극 신호전달 도메인을 포함하고, 실시양태에서 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 항원 결합 구성원은 세포외로부터 세포내 방향으로 하기 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다: 4-1BB-CD27; 4-1BB-CD27; CD27-4-1BB; 4-1BB-CD28; CD28-4-1BB; OX40-CD28; CD28-OX40; CD28-4-1BB; 또는 4-1BB-CD28. 이러한 실시양태에서, 세포내 결합 구성원은 CD3제타 도메인을 포함한다. 하나의 이러한 실시양태에서, RCAR은 (1) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 2개의 공동자극 도메인 및 제1 스위치 도메인을 포함하는 항원 결합 구성원; 및 (2) 막횡단 도메인 또는 막 테더링 도메인 및 적어도 1개의 1차 세포내 신호전달 도메인, 및 제2 스위치 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
한 실시양태는 항원 결합 구성원이 CAR 세포의 표면에 테더링되지 않은 RCAR을 제공한다. 이는 세포를 항원 결합 구성원을 코딩하는 서열로 형질전환시키지 않으면서, 세포내 신호전달 구성원을 갖는 세포가 1개 이상의 항원 결합 도메인과 편리하게 쌍형성되도록 한다. 이러한 실시양태에서, RCAR은 1) 제1 스위치 도메인, 막횡단 도메인, 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 1차 세포내 신호전달 도메인, 및 제1 스위치 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 구성원; 및 2) 항원 결합 도메인, 및 제2 스위치 도메인을 포함하는 항원 결합 구성원 (여기서 항원 결합 구성원은 막횡단 도메인 또는 막 테더링 도메인을 포함하지 않고, 임의로, 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않음)을 포함한다. 일부 실시양태에서, RCAR은 3) 제2 항원 결합 도메인, 예를 들어 항원 결합 도메인에 의해 결합되는 것과 상이한 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인; 및 제2 스위치 도메인을 포함하는 제2 항원 결합 구성원을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 항원 결합 구성원이 이중특이적 활성화 및 표적화 능력을 포함하는 RCAR이 본원에 제공된다. 이러한 실시양태에서, 항원 결합 구성원은 복수의, 예를 들어 2, 3, 4, 또는 5개의 항원 결합 도메인, 예를 들어 scFv를 포함할 수 있고, 여기서 각각의 항원 결합 도메인은 표적 항원, 예를 들어 상이한 항원 또는 동일한 항원, 예를 들어 동일한 항원 상의 동일한 또는 상이한 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, 복수의 항원 결합 도메인은 탠덤으로 존재하고, 임의로 링커 또는 힌지 영역이 각각의 항원 결합 도메인 사이에 배치된다. 적합한 링커 및 힌지 영역이 본원에 기재되어 있다.
한 실시양태는 증식의 전환을 가능하게 하는 구성을 갖는 RCAR을 제공한다. 이러한 실시양태에서, RCAR은 1) 임의로, 막횡단 도메인 또는 막 테더링 도메인; 예를 들어 4-1BB, CD28, CD27, ICOS, 및 OX40으로부터 선택된 1개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인, 및 스위치 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 구성원; 및 2) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 1차 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3제타 도메인을 포함하는 항원 결합 구성원 (여기서 항원 결합 구성원은 스위치 도메인을 포함하지 않거나, 또는 세포내 신호전달 구성원 상의 스위치 도메인과 이량체화하는 스위치 도메인을 포함하지 않음)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항원 결합 구성원은 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 구성원은 동종이량체화 스위치로부터의 스위치 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 구성원은 이종이량체화 스위치의 제1 스위치 도메인을 포함하고, RCAR은 이종이량체화 스위치의 제2 스위치 도메인을 포함하는 제2 세포내 신호전달 구성원을 포함한다. 이러한 실시양태에서, 제2 세포내 신호전달 구성원은 세포내 신호전달 구성원과 동일한 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 이량체화 스위치는 세포내에 존재한다. 한 실시양태에서, 이량체화 스위치는 세포외에 존재한다.
본원에 기재된 임의의 RCAR 구성에서, 제1 및 제2 스위치 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 FKBP-FRB-기반 스위치를 포함한다.
또한, 본원에 기재된 RCAR을 포함하는 세포가 본원에 제공된다. RCAR을 발현하도록 조작된 임의의 세포가 RCARX 세포로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서 RCARX 세포는 T 세포이고, RCART 세포로서 지칭된다. 한 실시양태에서, RCARX 세포는 NK 세포이고, RCARN 세포로서 지칭된다.
또한, RCAR 코딩 서열을 포함하는 핵산 및 벡터가 본원에 제공된다. RCAR의 다양한 요소를 코딩하는 서열은 동일한 핵산 분자, 예를 들어 동일한 플라스미드 또는 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터 상에 배치될 수 있다. 한 실시양태에서, (i) 항원 결합 구성원을 코딩하는 서열 및 (ii) 세포내 신호전달 구성원을 코딩하는 서열은 동일한 핵산, 예를 들어 벡터 상에 존재할 수 있다. 상응하는 단백질의 생산은, 예를 들어 개별 프로모터의 사용에 의해, 또는 비시스트론 전사 산물 (단일 번역 산물의 절단에 의해 또는 2개의 개별 단백질 산물의 번역에 의해 2개의 단백질의 생산을 발생시킬 수 있음)의 사용에 의해 달성될 수 있다. 한 실시양태에서, 절단가능한 펩티드를 코딩하는 서열, 예를 들어 P2A 또는 F2A 서열은 (i)과 (ii) 사이에 배치된다. 한 실시양태에서, IRES, 예를 들어 EMCV 또는 EV71 IRES를 코딩하는 서열이 (i)과 (ii) 사이에 배치된다. 이들 실시양태에서, (i) 및 (ii)는 단일 RNA로서 전사된다. 한 실시양태에서, (i) 및 (ii)가 개별 mRNA로서 전사되도록, 제1 프로모터는 (i)에 작동가능하게 연결되고, 제2 프로모터는 (ii)에 작동가능하게 연결된다.
대안적으로, RCAR의 다양한 요소를 코딩하는 서열은 상이한 핵산 분자, 예를 들어 상이한 플라스미드 또는 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터 상에 배치될 수 있다. 예를 들어, (i) 항원 결합 구성원을 코딩하는 서열은 제1 핵산, 예를 들어 제1 벡터 상에 존재할 수 있고, (ii) 세포내 신호전달 구성원을 코딩하는 서열은 제2 핵산, 예를 들어 제2 벡터 상에 존재할 수 있다.
이량체화 스위치
이량체화 스위치는 비-공유 또는 공유일 수 있다. 비-공유 이량체화 스위치에서, 이량체화 분자는 스위치 도메인 사이의 비-공유 상호작용을 촉진한다. 공유 이량체화 스위치에서, 이량체화 분자는 스위치 도메인 사이의 공유 상호작용을 촉진한다.
한 실시양태에서, RCAR은 FKBP/FRAP 또는 FKBP/FRB-기반 이량체화 스위치를 포함한다. FKBP12 (FKBP 또는 FK506 결합 단백질)는 천연 생성물 면역억제 약물인 라파마이신에 대한 초기 세포내 표적으로서 기능하는 풍부한 세포질 단백질이다. 라파마이신은 FKBP 및 대형 PI3K 상동체 FRAP (RAFT, mTOR)에 결합한다. FRB는 FKBP-라파마이신 복합체에 결합하는데 충분한 FRAP의 93개의 아미노산 부분이다 (Chen, J., Zheng, X. F., Brown, E. J. & Schreiber, S. L. (1995) Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 4947-51.)
실시양태에서, FKBP/FRAP, 예를 들어 FKBP/FRB 기반 스위치는 이량체화 분자, 예를 들어 라파마이신 또는 라파마이신 유사체를 사용할 수 있다.
FKBP의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00088
실시양태에서, FKBP 스위치 도메인은 라파마이신 또는 라파로그의 존재 하에 FRB 또는 그의 단편 또는 유사체에 결합하는 능력을 갖는 FKBP의 단편, 예를 들어 하기인, 서열식별번호: 588의 밑줄친 부분을 포함할 수 있다:
Figure pct00089
FRB의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00090
본원에 사용된 용어 "FKBP/FRAP, 예를 들어 FKBP/FRB 기반 스위치"는 라파마이신 또는 라파로그, 예를 들어 RAD001의 존재 하에 FRB, 또는 그의 단편 또는 유사체에 결합하는 능력을 갖는 FKBP 단편 또는 그의 유사체를 포함하고, 서열식별번호: 54 또는 55의 FKBP 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖거나 또는 그와 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 잔기만큼 상이한 제1 스위치 도메인; 및 라파마이신 또는 라파로그의 존재 하에 FRB, 또는 그의 단편 또는 유사체에 결합하는 능력을 갖는 FRB 단편 또는 그의 유사체를 포함하고, 서열식별번호: 56의 FRB 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖거나 또는 그와 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 잔기만큼 상이한 제2 스위치 도메인을 포함하는 이량체화 스위치를 지칭한다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 RCAR은 서열식별번호: 588 (또는 서열식별번호: 589)에 개시된 아미노산 잔기를 포함하는 1개의 스위치 도메인 및 서열식별번호: 590에 개시된 아미노산 잔기를 포함하는 1개의 스위치 도메인을 포함한다.
실시양태에서, FKBP/FRB 이량체화 스위치는 FRB-기반 스위치 도메인, 예를 들어 변형된 FRB 스위치 도메인, FKBP-기반 스위치 도메인과 이량체화 분자, 예를 들어 라파마이신 또는 라파로그, 예를 들어 RAD001 사이에 변경된, 예를 들어 증진된 복합체 형성을 나타내는 변형된 FRB 스위치 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 변형된 FRB 스위치 도메인은 아미노산 위치(들) L2031, E2032, S2035, R2036, F2039, G2040, T2098, W2101, D2102, Y2105, 및 F2108에서의 돌연변이로부터 선택된, 1개 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 돌연변이를 포함하며, 여기서 야생형 아미노산은 임의의 다른 자연-발생 아미노산으로 돌연변이된다. 한 실시양태에서, 돌연변이체 FRB는 E2032에서 돌연변이를 포함하고, 여기서 E2032는 페닐알라닌 (E2032F), 메티오닌 (E2032M), 아르기닌 (E2032R), 발린 (E2032V), 티로신 (E2032Y), 이소류신 (E2032I), 예를 들어 서열식별번호: 591, 또는 류신 (E2032L), 예를 들어 서열식별번호: 592로 돌연변이된다. 한 실시양태에서, 돌연변이체 FRB는 T2098에서 돌연변이를 포함하고, 여기서 T2098은 페닐알라닌 (T2098F) 또는 류신 (T2098L), 예를 들어 서열식별번호: 593으로 돌연변이된다. 한 실시양태에서, 돌연변이체 FRB는 E2032 및 T2098에서 돌연변이를 포함하고, 여기서 E2032는 임의의 아미노산으로 돌연변이되고, 여기서 T2098은 임의의 아미노산, 예를 들어 서열식별번호: 594로 돌연변이된다. 한 실시양태에서, 돌연변이체 FRB는 E2032I 및 T2098L 돌연변이, 예를 들어 서열식별번호: 595를 포함한다. 한 실시양태에서, 돌연변이체 FRB는 E2032L 및 T2098L 돌연변이, 예를 들어 서열식별번호: 596을 포함한다.
<표 14> 이량체화 분자에 대해 증가된 친화도를 갖는 예시적인 돌연변이체 FRB
Figure pct00091
다른 적합한 이량체화 스위치는 GyrB-GyrB 기반 이량체화 스위치, 지베렐린-기반 이량체화 스위치, 태그/결합제 이량체화 스위치, 및 할로-태그/스냅-태그 이량체화 스위치를 포함한다. 본원에 제공된 안내에 따라, 이러한 스위치 및 관련 이량체화 분자는 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
이량체화 분자
스위치 도메인 사이의 회합은 이량체화 분자에 의해 촉진된다. 이량체화 분자의 존재 하에, 스위치 도메인 사이의 상호작용 또는 회합은 제1 스위치 도메인과 회합된, 예를 들어 융합된 폴리펩티드와 제2 스위치 도메인과 회합된, 예를 들어 융합된 폴리펩티드 사이의 신호 전달을 허용한다. 비-제한적 수준의 이량체화 분자의 존재 하에, 신호 전달은 예를 들어 본원에 기재된 시스템에서 측정 시 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 5, 10, 50, 100배 증가된다.
라파마이신 및 라파마이신 유사체 (때때로 라파로그로 지칭됨), 예를 들어 RAD001은 본원에 기재된 FKBP/FRB-기반 이량체화 스위치에서 이량체화 분자로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 이량체화 분자는 라파마이신 (시롤리무스), RAD001 (에베롤리무스), 조타롤리무스, 템시롤리무스, AP-23573 (리다포롤리무스), 비올리무스 및 AP21967로부터 선택될 수 있다. FKBP/FRB-기반 이량체화 스위치와 함께 사용하기에 적합한 추가의 라파마이신 유사체는 섹션 표제 "조합 요법", 또는 서브섹션 표제 "낮은 용량의 mTOR 억제제와의 조합"에 추가로 기재되어 있다.
CAR과 케모카인 수용체의 공동-발현
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 케모카인 수용체 분자를 추가로 포함한다. T 세포에서 케모카인 수용체 CCR2b 또는 CXCR2의 트랜스제닉 발현은 흑색종 및 신경모세포종을 비롯한 CCL2- 또는 CXCL1-분비 고형 종양으로의 트래픽킹을 증진시킨다 (Craddock et al., J Immunother. 2010 Oct; 33(8):780-8 및 Kershaw et al.,Hum Gene Ther. 2002 Nov 1; 13(16):1971-80). 따라서, 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 종양, 예를 들어 고형 종양에 의해 분비되는 케모카인을 인식하는 CAR-발현 세포에서 발현된 케모카인 수용체는 CAR-발현 세포가 종양으로 귀소하는 것을 개선시킬 수 있고, CAR-발현 세포가 종양에 침윤하는 것을 용이하게 할 수 있고, CAR-발현 세포의 항종양 효능을 증진시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 케모카인 수용체 분자는 자연 발생 또는 재조합 케모카인 수용체 또는 그의 케모카인-결합 단편을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 CAR-발현 세포에서의 발현에 적합한 케모카인 수용체 분자는 CXC 케모카인 수용체 (예를 들어, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, 또는 CXCR7), CC 케모카인 수용체 (예를 들어, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, 또는 CCR11), CX3C 케모카인 수용체 (예를 들어, CX3CR1), XC 케모카인 수용체 (예를 들어, XCR1), 또는 그의 케모카인-결합 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR과 함께 발현될 케모카인 수용체 분자는 종양에 의해 분비되는 케모카인(들)에 기초하여 선택된다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 CCR2b 수용체 또는 CXCR2 수용체를 추가로 포함, 예를 들어 발현한다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 및 케모카인 수용체 분자는 동일한 벡터 상에 존재하거나, 또는 2개의 상이한 벡터 상에 존재한다. 본원에 기재된 CAR 및 케모카인 수용체 분자가 동일한 벡터 상에 존재하는 실시양태에서, CAR 및 케모카인 수용체 분자는 각각 2개의 상이한 프로모터의 제어 하에 있거나, 또는 동일한 프로모터의 제어 하에 있다.
RNA 형질감염
시험관내 전사된 RNA CAR을 생산하는 방법이 본원에 개시된다. 본 발명은 또한 세포 내로 직접 형질감염될 수 있는 CAR 코딩 RNA 구축물을 포함한다. 형질감염에 사용하기 위한 mRNA를 생성하는 방법은 특수하게 설계된 프라이머를 사용한 주형의 시험관내 전사 (IVT)에 이은 폴리A 첨가를 수반할 수 있으며, 이는 3' 및 5' 비번역 서열 ("UTR"), 5' 캡 및/또는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 발현시킬 핵산, 및 폴리A 테일을 함유하는, 전형적으로 50-2000개 염기 길이의 구축물 (서열식별번호: 35)을 생산한다. 이와 같이 생산된 RNA는 상이한 유형의 세포를 효율적으로 형질감염시킬 수 있다. 한 측면에서, 주형은 CAR에 대한 서열을 포함한다.
한 측면에서, CD123 CAR은 메신저 RNA (mRNA)에 의해 코딩된다. 한 측면에서, CD123 CAR을 코딩하는 mRNA는 CART 세포의 생산을 위해 T 세포 내로 도입된다.
한 실시양태에서, 시험관내 전사된 RNA CAR은 일시적 형질감염의 형태로서 세포에 도입될 수 있다. RNA는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)-생성 주형을 사용하여 시험관내 전사에 의해 생산된다. 임의의 공급원으로부터의 관심 DNA는 적절한 프라이머 및 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 mRNA 합성을 위한 주형으로 PCR에 의해 직접 전환될 수 있다. DNA의 공급원은 예를 들어 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, cDNA, 합성 DNA 서열 또는 임의의 다른 적절한 DNA 공급원일 수 있다. 시험관내 전사를 위한 목적하는 주형은 본 발명의 CAR이다. 예를 들어, RNA CAR을 위한 주형은 항종양 항체의 단일 쇄 가변 도메인을 포함하는 세포외 영역; 힌지 영역, 막횡단 도메인 (예를 들어, CD8a의 막횡단 도메인); 및 예를 들어 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, PCR을 위해 사용되는 DNA는 오픈 리딩 프레임을 함유한다. DNA는 유기체의 게놈으로부터 자연 발생 DNA 서열로부터 유래될 수 있다. 한 실시양태에서, 핵산은 일부 또는 모두의 5' 및/또는 3' 비번역 영역 (UTR)을 포함할 수 있다. 핵산은 엑손 및 인트론을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, PCR을 위해 사용되는 DNA는 인간 핵산 서열이다. 또 다른 실시양태에서, PCR을 위해 사용되는 DNA는 5' 및 3' UTR을 포함하는 인간 핵산 서열이다. DNA는 대안적으로 자연 발생 유기체에서 정상적으로는 발현되지 않는 인공 DNA 서열일 수 있다. 예시적인 인공 DNA 서열은 함께 라이게이션되어 융합 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 형성하는 유전자의 부분을 함유하는 것이다. 함께 라이게이션되는 DNA의 부분은 단일 유기체로부터 또는 1종 초과의 유기체로부터 유래될 수 있다.
PCR은 형질감염을 위해 사용되는 mRNA의 시험관내 전사를 위한 주형을 생성하기 위해 사용된다. PCR을 수행하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. PCR에 사용하기 위한 프라이머는 PCR을 위한 주형으로서 사용되는 DNA의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 갖도록 설계된다. 본원에 사용된 "실질적으로 상보적인"은 프라이머 서열 내의 대부분의 또는 모든 염기가 상보적이거나 또는 1개 이상의 염기가 비-상보적이거나 미스매치된 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 실질적으로 상보적인 서열은 PCR을 위해 사용되는 어닐링 조건 하에서 의도된 DNA 표적과 어닐링하거나 혼성화할 수 있다. 프라이머는 DNA 주형의 임의의 부분에 실질적으로 상보적이도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 5' 및 3' UTR을 포함하는, 세포에서 정상적으로 전사되는 핵산의 부분 (오픈 리딩 프레임)을 증폭하도록 설계될 수 있다. 프라이머는 또한 특정한 관심 도메인을 코딩하는 핵산의 부분을 증폭하도록 설계될 수 있다. 한 실시양태에서, 프라이머는 5' 및 3' UTR의 모두 또는 일부를 포함하는 인간 cDNA의 코딩 영역을 증폭하도록 설계될 수 있다. PCR을 위해 유용한 프라이머는 관련 기술분야에 널리 공지된 합성 방법에 의해 생성될 수 있다. "정방향 프라이머"는 증폭될 DNA 서열의 상류에 존재하는 DNA 주형 상의 뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드의 영역을 함유하는 프라이머이다. "상류"는 코딩 가닥과 관련하여 증폭시킬 DNA 서열에 대해 5' 위치를 지칭하기 위해 본원에 사용된다. "역방향 프라이머"는 증폭시킬 DNA 서열의 하류에 존재하는 이중-가닥 DNA 주형에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드의 영역을 함유하는 프라이머이다. "하류"는 코딩 가닥과 관련하여 증폭시킬 DNA 서열의 3' 위치를 지칭하기 위해 본원에 사용된다.
PCR에 유용한 임의의 DNA 폴리머라제가 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 시약 및 폴리머라제는 수많은 공급원으로부터 상업적으로 입수가능하다.
안정성 및/또는 번역 효율을 촉진하는 능력을 갖는 화학 구조도 사용될 수 있다. RNA는 바람직하게는 5' 및 3' UTR을 갖는다. 한 실시양태에서, 5' UTR은 1 내지 3000개 뉴클레오티드 길이이다. 코딩 영역에 부가되는 5' 및 3' UTR 서열의 길이는 UTR의 상이한 영역에 어닐링하는 PCR용 프라이머의 설계를 포함하나 이에 제한되지는 않는 상이한 방법에 의해 변경될 수 있다. 이러한 접근법을 사용하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 전사된 RNA의 형질감염 후에 최적 번역 효율을 달성하기 위해 필요한 5' 및 3' UTR 길이를 변형시킬 수 있다.
5' 및 3' UTR은 관심 핵산에 대한 자연 발생, 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 대안적으로, 관심 핵산에 내인성이 아닌 UTR 서열은 UTR 서열을 정방향 및 역방향 프라이머 내로 혼입시킴으로써 또는 주형의 임의의 다른 변형에 의해 부가될 수 있다. 관심 핵산에 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용은 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율의 변형을 위해 유용할 수 있다. 예를 들어, 3' UTR 서열 내의 AU-풍부 요소가 mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있다고 공지되어 있다. 따라서, 3' UTR은 관련 기술분야에 널리 공지된 UTR의 특성을 기초로 하여 전사되는 RNA의 안정성을 증가시키도록 선택되거나 설계될 수 있다.
한 실시양태에서, 5' UTR은 내인성 핵산의 코작(Kozak) 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 관심 핵산에 내인성이 아닌 5' UTR이 상기 기재된 바와 같이 PCR에 의해 부가되는 경우에, 컨센서스 코작 서열은 5' UTR 서열의 부가에 의해 재설계될 수 있다. 코작 서열은 일부 RNA 전사체의 번역 효율을 증가시킬 수 있지만, 효율적인 번역을 가능하게 하기 위해 모든 RNA에 필요한 것으로 보이지는 않는다. 많은 mRNA에 대한 코작 서열의 필요성은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 다른 실시양태에서, 5' UTR은 그의 RNA 게놈이 세포에서 안정한 RNA 바이러스의 5' UTR일 수 있다. 다른 실시양태에서, 다양한 뉴클레오티드 유사체가 mRNA의 엑소뉴클레아제 분해를 저해하기 위해 3' 또는 5' UTR에 사용될 수 있다.
유전자 클로닝을 필요로 하지 않으면서 RNA를 DNA 주형으로부터 합성할 수 있기 위해, 전사 프로모터는 전사시킬 서열의 상류의 DNA 주형에 부착되어야 한다. RNA 폴리머라제에 대한 프로모터로서 기능하는 서열이 정방향 프라이머의 5' 말단부에 부가되는 경우에, RNA 폴리머라제 프로모터는 전사되는 오픈 리딩 프레임의 상류의 PCR 생성물 내로 혼입된다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 프로모터는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 T7 폴리머라제 프로모터이다. 다른 유용한 프로모터는 T3 및 SP6 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. T7, T3 및 SP6 프로모터에 대한 컨센서스 뉴클레오티드 서열이 관련 기술분야에 공지되어 있다.
바람직한 실시양태에서, mRNA는 세포에서 리보솜 결합, 번역의 개시 및 mRNA의 안정성을 결정하는 5' 말단 및 3' 폴리(A) 테일 상에 둘 다의 캡을 갖는다. 원형 DNA 주형, 예를 들어 플라스미드 DNA에서, RNA 폴리머라제는 진핵 세포에서의 발현에 적합하지 않은 긴 콘카테머 생성물을 생산한다. 3' UTR의 말단에서 선형화된 플라스미드 DNA의 전사는 전사 후에 폴리아데닐화된 경우에도 진핵 형질감염에 유효하지 않은 정상 크기의 mRNA를 생성한다.
선형 DNA 주형 상에서, 파지 T7 RNA 폴리머라제는 주형의 마지막 염기를 넘어 전사체의 3' 말단을 연장시킬 수 있다 (Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)).
폴리A/T 스트레치의 DNA 주형 내로의 통상적인 통합 방법은 분자 클로닝이다. 그러나, 플라스미드 DNA 내로 통합된 폴리A/T 서열은 플라스미드 불안정성을 유발할 수 있고, 이것은 박테리아 세포로부터 수득된 플라스미드 DNA 주형이 종종 결실 및 다른 이상에 의해 고도로 오염되는 이유이다. 이는 클로닝 절차를 어렵고 시간 소모적으로 만들 뿐만 아니라 종종 신뢰할 수 없게 만든다. 이러한 이유 때문에, 클로닝 없이 폴리A/T 3' 스트레치를 갖는 DNA 주형의 구축을 가능하게 하는 방법이 매우 바람직하다.
전사 DNA 주형의 폴리A/T 절편은 폴리T 테일, 예컨대 100T 테일 (서열식별번호: 31) (크기는 50-5000 T일 수 있음 (서열식별번호: 32))을 함유하는 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 동안, 또는 DNA 라이게이션 또는 시험관내 재조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 다른 방법에 의해 PCR 후에 생산될 수 있다. 폴리(A) 테일은 또한 안정성을 RNA에 제공하고, 그의 분해를 감소시킨다. 일반적으로, 폴리(A) 테일의 길이는 전사된 RNA의 안정성과 양의 상관관계가 있다. 한 실시양태에서, 폴리(A) 테일은 100 내지 5000개 아데노신 (서열식별번호: 33)이다.
RNA의 폴리(A) 테일은 폴리(A) 폴리머라제, 예컨대 이. 콜라이 폴리A 폴리머라제 (E-PAP)를 사용하여 시험관내 전사 후에 추가로 연장될 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리(A) 테일의 길이를 100개의 뉴클레오티드로부터 300 내지 400개의 뉴클레오티드 (서열식별번호: 34)로 증가시키는 것은, RNA의 번역 효율의 약 2-배 증가를 발생시킨다. 추가로, 상이한 화학기의 3' 말단에 대한 부착은 mRNA 안정성을 증가시킬 수 있다. 이러한 부착은 변형된/인공 뉴클레오티드, 압타머 및 다른 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, ATP 유사체는 폴리(A) 폴리머라제를 사용하여 폴리(A) 테일 내로 혼입될 수 있다. ATP 유사체는 RNA의 안정성을 추가로 증가시킬 수 있다.
5' 캡이 또한 RNA 분자에게 안정성을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 RNA는 5' 캡을 포함한다. 5' 캡은 관련 기술분야에 공지되고 본원에 기재된 기술을 사용하여 제공된다 (Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).
본원에 개시된 방법에 의해 생산된 RNA는 또한 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 서열을 함유할 수 있다. IRES 서열은 mRNA에 대한 캡-비의존성 리보솜 결합을 개시하고 번역의 개시를 용이하게 하는 임의의 바이러스, 염색체 또는 인공적으로 설계된 서열일 수 있다. 세포 투과성 및 생존을 용이하게 하는 인자, 예컨대 당, 펩티드, 지질, 단백질, 항산화제, 및 계면활성제를 함유할 수 있는, 세포 전기천공에 적합한 임의의 용질이 포함될 수 있다.
RNA는 임의의 수많은 상이한 방법, 예를 들어 전기천공 (아막사 뉴클레오펙터(Amaxa Nucleofector)-II (아막사 바이오시스템즈(Amaxa Biosystems), 독일 쾰른), (ECM 830 (BTX) (하버드 인스트루먼츠(Harvard Instruments), 매사추세츠주 보스턴) 또는 진 펄서(Gene Pulser) II (바이오라드(BioRad), 콜로라도주 덴버), 멀티포레이터(Multiporator) (에펜도르프(Eppendort), 독일 함부르크), 리포펙션을 사용한 양이온성 리포솜 매개 형질감염, 중합체 캡슐화, 펩티드 매개 형질감염, 또는 바이오리스틱 입자 전달 시스템, 예컨대 "유전자 총" (예를 들어, 문헌 [Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)] 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 상업적으로 입수가능한 방법을 사용하여 표적 세포 내로 도입될 수 있다.
비-바이러스 전달 방법
일부 측면에서, 본원에 기재된 CAR을 코딩하는 핵산을 세포 또는 조직 또는 대상체 내로 전달하는데 비-바이러스 방법이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 비-바이러스 방법은 트랜스포손 (전위가능 요소로도 불림)의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스포손은 게놈 내 위치에서 그 자체를 삽입할 수 있는 DNA 조각, 예를 들어 자기-복제 및 그의 카피의 게놈 내로의 삽입이 가능한 DNA 조각, 또는 보다 긴 핵산으로부터의 스플라이싱 및 게놈 내 또 다른 위치 내로의 삽입이 가능한 DNA 조각이다. 예를 들어, 트랜스포손은 전위를 위한 역전된 반복부 플랭킹 유전자로 구성된 DNA 서열을 포함한다.
트랜스포손을 사용한 핵산 전달의 예시적인 방법은 슬리핑 뷰티 트랜스포손 시스템(Sleeping Beauty transposon system) (SBTS) 및 피기백(piggyBac) (PB) 트랜스포손 시스템을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65; 및 Ding et al. Cell. 122.3(2005):473-83]을 참조하고, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다.
SBTS는 2개의 성분: 1) 트랜스진을 함유하는 트랜스포손 및 2) 트랜스포사제 효소의 공급원을 포함한다. 트랜스포사제는 트랜스포손을 캐리어 플라스미드 (또는 다른 공여자 DNA)로부터 표적 DNA, 예컨대 숙주 세포 염색체/게놈으로 전위시킬 수 있다. 예를 들어, 트랜스포사제는 캐리어 플라스미드/공여자 DNA에 결합하고, 플라스미드로부터 트랜스포손 (트랜스진(들) 포함)을 잘라내고, 이를 숙주 세포의 게놈 내로 삽입한다. 예를 들어, 상기 문헌 [Aronovich et al.]을 참조한다.
예시적인 트랜스포손은 pT2-기반 트랜스포손을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Grabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47; 및 Singh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971]을 참조하고, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다. 예시적인 트랜스포사제는 Tc1/마리너-유형 트랜스포사제, 예를 들어 SB10 트랜스포사제 또는 SB11 트랜스포사제 (예를 들어 시토메갈로바이러스 프로모터로부터 발현될 수 있는 과다활성 트랜스포사제)를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Aronovich et al.; Kebriaei et al.; 및 Grabundzija et al.]을 참조하고, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다
SBTS의 사용은 트랜스진, 예를 들어 본원에 기재된 CAR을 코딩하는 핵산의 효율적인 통합 및 발현을 허용한다. 예를 들어 트랜스포손 시스템, 예컨대 SBTS를 사용하여 본원에 기재된 CAR을 안정적으로 발현하는 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포를 생성하는 방법이 본원에 제공된다.
본원에 기재된 방법에 따라, 일부 실시양태에서, 1종 이상의 핵산, 예를 들어 SBTS 성분을 함유하는 플라스미드가 세포 (예를 들어, T 또는 NK 세포)에게 전달된다. 예를 들어, 핵산(들)은 핵산 (예를 들어, 플라스미드 DNA) 전달의 표준 방법, 예를 들어 본원에 기재된 방법, 예를 들어 전기천공, 형질감염 또는 리포펙션에 의해 전달된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 트랜스진, 예를 들어 본원에 기재된 CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스포손을 함유한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 트랜스진 (예를 들어, 본원에 기재된 CAR을 코딩하는 핵산) 뿐만 아니라 트랜스포사제 효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스포손을 함유한다. 다른 실시양태에서, 2개의 핵산을 갖는 시스템, 예를 들어 이중-플라스미드 시스템이 제공되며, 예를 들어 여기서 제1 플라스미드는 트랜스진을 포함하는 트랜스포손을 함유하고, 제2 플라스미드는 트랜스포사제 효소를 코딩하는 핵산 서열을 함유한다. 예를 들어, 제1 및 제2 핵산은 숙주 세포 내로 공동-전달된다.
일부 실시양태에서, SBTS를 사용한 유전자 삽입 및 뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), CRISPR/Cas 시스템, 또는 조작된 메가뉴클레아제 재조작된 귀소 엔도뉴클레아제)를 사용한 유전자 편집의 조합을 사용하는 것에 의해, 본원에 기재된 CAR을 발현하는 세포, 예를 들어 T 또는 NK 세포가 생성된다.
일부 실시양태에서, 비-바이러스 전달 방법의 사용은 세포, 예를 들어 T 또는 NK 세포의 재프로그래밍 및 세포의 대상체 내로의 직접 주입을 허용한다. 비-바이러스 벡터의 이점은 환자 집단을 충족시키는데 필요한 충분한 양을 생산하는 것의 용이성 및 상대적으로 낮은 비용, 저장 동안의 안정성, 및 면역원성의 결여를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
CAR을 코딩하는 핵산 구축물
본 발명은 또한 본원에 기재된 1개 이상의 CAR 구축물을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 한 측면에서, 핵산 분자는 메신저 RNA 전사체로서 제공된다. 한 측면에서, 핵산 분자는 DNA 구축물로서 제공된다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이며, 여기서 CAR은 CD123 결합 도메인 (예를 들어, 인간화 또는 인간 CD123 결합 도메인), 막횡단 도메인, 및 자극 도메인, 예를 들어 공동자극 신호전달 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 제타 쇄를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 본원에 기재된 CD123 결합 도메인, 예를 들어 서열식별번호: 157-160, 184-215, 478, 480, 483, 485, 및 556-587로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CD123 결합 도메인이다. 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 157-160, 478, 480, 483, 및 485로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 인간 CD123 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 184-215, 및 556-587로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 인간화 CD123 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인이다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 6의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 힌지 영역, 예를 들어 본원에 기재된 힌지에 의해 막횡단 도메인에 연결된다. 한 실시양태에서, 힌지 영역은 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 5, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 공동자극 도메인을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 예를 들어 MHC 부류 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된, 본원에 기재된 단백질의 기능적 신호전달 도메인이다.
한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 서열식별번호: 7의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인 및 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 8의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열, 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 1의 리더 서열, 서열식별번호: 157-160, 184-215, 478, 480, 483, 485, 및 556-587로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 (또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열)을 갖는 scFv 도메인, 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 5 (또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열)의 힌지 영역, 서열식별번호: 6의 서열 (또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열)을 갖는 막횡단 도메인, 서열식별번호: 7의 서열을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인 또는 서열식별번호: 8의 서열 (또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열)을 갖는 CD27 공동자극 도메인 또는 서열식별번호: 43의 서열 (또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열)을 갖는 CD28 공동자극 도메인 또는 서열식별번호: 45의 서열 (또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열)을 갖는 ICOS 공동자극 도메인, 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열 (또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열)을 갖는 CD3 제타 자극 도메인을 포함하는 CAR 구축물을 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 핵산 분자에 의해 코딩된 단리된 폴리펩티드 분자에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드 분자는 서열식별번호: 98-101 및 125-156으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CD123 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 분자를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이며, 여기서 상기 CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 157-160, 184-215, 478, 480, 483, 485, 및 556-587로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 157-160, 478, 480, 483, 및 485로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 인간 CD123 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 서열식별번호: 184-215, 및 556-587로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 인간화 CD123 결합 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 코딩된 CAR 분자는 공동자극 도메인을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 MHC 부류 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 기능적 신호전달 도메인이다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 서열식별번호: 7의 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, MHC 부류 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4, (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인이다.
한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 6의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인 및 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 7의 서열 및 서열식별번호: 9의 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다. 한 실시양태에서, CD123 결합 도메인은 힌지 영역에 의해 막횡단 도메인에 연결된다. 한 실시양태에서, 힌지 영역은 서열식별번호: 2를 포함한다. 한 실시양태에서, 힌지 영역은 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 5를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 1의 리더 서열, 서열식별번호: 157-160,184-215, 478, 480, 483, 485, 556-587로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 scFv 도메인, 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 5의 힌지 영역, 서열식별번호: 6의 서열을 갖는 막횡단 도메인, 서열식별번호: 7의 서열을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인, 또는 서열식별번호: 8의 서열을 갖는 CD27 공동자극 도메인, 또는 서열식별번호: 43의 서열을 갖는 CD28 공동자극 도메인, 또는 서열식별번호: 45의 서열을 갖는 ICOS 공동자극 도메인, 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열을 갖는 CD3 제타 자극 도메인을 포함하는 코딩된 CAR 분자에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 코딩된 CAR 분자는 서열식별번호: 98-101 및 125-156으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
목적하는 분자를 코딩하는 핵산 서열은 관련 기술분야에 공지된 재조합 방법을 사용하여, 예컨대 예를 들어 유전자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝함으로써, 이를 포함하는 것으로 공지된 벡터로부터 유전자를 유도함으로써, 또는 표준 기술을 사용하여 이를 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접 단리함으로써 수득할 수 있다. 대안적으로, 관심 유전자는 클로닝하기 보다는 합성적으로 생산할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA가 삽입된 벡터를 제공한다. 레트로바이러스, 예컨대 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 딸세포에서 트랜스진의 장기간의 안정한 통합 및 그의 증식을 가능하게 하기 때문에 장기간의 유전자 전달을 달성하기 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 비-증식 세포, 예컨대 간세포를 형질도입할 수 있다는 점에서 종양-레트로바이러스, 예컨대 뮤린 백혈병 바이러스로부터 유래된 벡터에 비해 추가의 이점을 갖는다. 이는 또한 낮은 면역원성의 추가의 이점을 갖는다. 레트로바이러스 벡터는 또한, 예를 들어 감마레트로바이러스 벡터일 수 있다. 감마레트로바이러스 벡터는, 예를 들어 프로모터, 패키징 신호 (Ψ), 프라이머 결합 부위 (PBS), 1개 이상 (예를 들어, 2개)의 긴 말단 반복부 (LTR), 및 관심 트랜스진, 예를 들어 CAR을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 감마레트로바이러스 벡터는 바이러스 구조 유전자, 예컨대 gag, pol, 및 env가 결여되어 있을 수 있다. 예시적인 감마레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV), 비장-초점 형성 바이러스 (SFFV), 및 골수증식성 육종 바이러스 (MPSV), 및 그로부터 유래된 벡터를 포함한다. 다른 감마레트로바이러스 벡터가, 예를 들어 문헌 [Tobias Maetzig et al., "Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application" Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713]에 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 목적하는 CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 아데노바이러스 벡터 (A5/35)이다. 또 다른 실시양태에서, CAR을 코딩하는 핵산의 발현은 트랜스포손, 예컨대 슬리핑 뷰티, 크리스퍼, CAS9, 및 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하여 달성할 수 있다. 하기 문헌 [June et al. 2009Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716]을 참조하고, 이는 본원에 참조로 포함된다.
간단히 요약하면, CAR을 코딩하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은 전형적으로 CAR 폴리펩티드 또는 그의 부분을 코딩하는 핵산을 프로모터에 작동가능하게 연결하고, 구축물을 발현 벡터 내로 혼입시킴으로써 달성된다. 벡터는 진핵세포에서의 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열, 및 목적하는 핵산 서열의 발현의 조절을 위해 유용한 프로모터를 함유한다.
본 발명의 발현 구축물은 또한 표준 유전자 전달 프로토콜을 사용한 핵산 면역화 및 유전자 요법을 위해 사용될 수 있다. 유전자 전달을 위한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함하는 미국 특허 번호 5,399,346, 5,580,859, 5,589,466을 참조한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 유전자 요법 벡터를 제공한다.
핵산은 수많은 유형의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스, 및 코스미드를 포함하나 이에 제한되지는 않는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 특정한 관심 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 및 서열분석 벡터를 포함한다.
또한, 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY], 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 포진 바이러스, 및 렌티바이러스를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로 적합한 벡터는 적어도 1종의 유기체에서 기능적인 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 1개 이상의 선택 마커를 함유한다 (예를 들어, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 번호 6,326,193).
수많은 바이러스 기반 시스템이 포유동물 세포 내로의 유전자 전달을 위해 개발된 바 있다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 벡터 내로 삽입되고 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 레트로바이러스 입자 내에 패키징될 수 있다. 이어서, 재조합 바이러스는 단리되고, 생체내에서 또는 생체외에서 대상체의 세포로 전달될 수 있다. 수많은 레트로바이러스 시스템이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 수많은 아데노바이러스 벡터가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다.
추가의 프로모터 요소, 예를 들어 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 개시 부위의 30-110 bp 상류의 영역에 위치하지만, 수많은 프로모터는 기능적 요소를 또한 개시 부위의 하류에 함유하는 것으로 밝혀진 바 있다. 프로모터 요소 사이의 간격은 빈번하게 탄력적이어서, 프로모터 기능은 요소가 역전되거나 서로에 대해 이동할 때 보존된다. 티미딘 키나제 (tk) 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 간격은 활성이 감소하기 시작하기 전 50 bp까지 증가할 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소는 전사를 활성화하기 위해 협동적 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 보인다.
포유동물 T 세포에서 CAR 트랜스진을 발현할 수 있는 프로모터의 예는 EF1a 프로모터이다. 천연 EF1a 프로모터는 아미노아실 tRNA의 리보솜으로의 효소적 전달을 담당하는 신장 인자-1 복합체의 알파 서브유닛의 발현을 구동한다. EF1a 프로모터는 포유동물 발현 플라스미드에서 광범하게 사용된 바 있고, 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝된 트랜스진으로부터 CAR 발현을 구동하는데 유효한 것으로 밝혀진 바 있다. 예를 들어, 문헌 [Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참조한다. 한 측면에서, EF1a 프로모터는 서열식별번호: 11로서 제공된 서열을 포함한다.
프로모터의 또 다른 예는 극초기 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 그에 작동가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 구동할 수 있는 강력한 구성적 프로모터 서열이다. 그러나, 원숭이 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 극초기 프로모터, 라우스(Rous) 육종 바이러스 프로모터, 뿐만 아니라 예컨대 비제한적으로 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 신장 인자-1α 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터인 인간 유전자 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 구성적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 구성적 프로모터의 사용으로 제한되지 않아야 한다. 유도성 프로모터가 또한 본 발명의 일부로서 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 발현을 목적으로 하는 경우에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 턴 온할 수 있거나, 또는 발현을 목적으로 하지 않는 경우에 발현을 턴 오프할 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라시클린 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
프로모터의 또 다른 예는 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터이다. 실시양태에서, 말단절단된 PGK 프로모터 (예를 들어, 야생형 PGK 프로모터 서열과 비교하여 1개 이상, 예를 들어 1, 2, 5, 10, 100, 200, 300 또는 400개의 뉴클레오티드 결실을 갖는 PGK 프로모터)가 바람직할 수 있다. 예시적인 PGK 프로모터의 뉴클레오티드 서열이 하기 제공된다.
WT PGK 프로모터
Figure pct00092
예시적인 말단절단된 PGK 프로모터:
PGK100:
Figure pct00093
PGK200:
Figure pct00094
PGK300:
Figure pct00095
PGK400:
Figure pct00096
벡터는 또한, 예를 들어 분비를 용이하게 하는 신호 서열, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결인자 (예를 들어, 소 성장 호르몬 (BGH) 유전자로부터), 에피솜 복제 및 원핵생물에서의 복제를 가능하게 하는 요소 (예를 들어 SV40 기원 및 ColE1 또는 관련 기술분야에 공지되어 있는 다른 것) 및/또는 선택을 가능하게 하는 요소 (예를 들어, 암피실린 저항성 유전자 및/또는 제오신 마커)를 포함할 수 있다.
CAR 폴리펩티드 또는 그의 부분의 발현을 평가하기 위해, 세포 내로 도입되는 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터를 통해 형질감염되거나 감염될 것이 모색되는 세포의 집단으로부터 발현 세포의 확인 및 선택을 용이하게 하기 위한 선택 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 다를 함유할 수 있다. 다른 측면에서, 선택 마커는 DNA의 개별 조각 상에 보유되고, 공동-형질감염 절차에 사용될 수 있다. 선택 마커 및 리포터 유전자 둘 다는 숙주 세포에서 발현이 가능하도록 하는 적절한 조절 서열과 플랭킹될 수 있다. 유용한 선택 마커는 예를 들어 항생제-저항성 유전자, 예컨대 neo 등을 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하고 조절 서열의 기능성을 평가하기 위해 사용된다. 일반적으로 리포터 유전자는, 수용자 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 그에 의해 발현되지 않고, 그의 발현이 일부 용이하게 검출가능한 특성, 예를 들어 효소적 활성에 의해 표시되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포 내로 도입된 후 적합한 시간에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시페라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제를 코딩하는 유전자, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82]). 적합한 발현 시스템은 널리 공지되어 있고, 공지된 기술을 사용하여 제조하거나 상업적으로 입수할 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 최고 수준의 발현을 보이는, 최소 5' 플랭킹 영역을 갖는 구축물은 프로모터로서 확인된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결되고, 프로모터-구동 전사를 조정하는 능력에 대해 작용제를 평가하는데 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 벡터는 제2 CAR을 코딩하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 제2 CAR은 급성 골수성 백혈병 세포 상에서 발현되는 표적, 예컨대 예를 들어, CD33, CD34, CLL-1, FLT3 또는 폴레이트 수용체 베타에 대한 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 제1 항원을 표적화하고 공동자극 신호전달 도메인을 갖지만 1차 신호전달 도메인은 갖지 않는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR을 코딩하는 핵산 서열, 및 제2의, 상이한 항원을 표적화하고 1차 신호전달 도메인을 갖지만 공동자극 신호전달 도메인은 갖지 않는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 코딩하는 핵산을 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 CD123 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 공동자극 도메인을 포함하는 제1 CD123 CAR을 코딩하는 핵산 및 CD123 이외의 항원 (예를 들어, AML 세포 상에서 발현된 항원, 예를 들어 CD33, CD34, CLL-1, FLT3, 또는 폴레이트 수용체 베타)을 표적화하고 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 코딩하는 핵산을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 벡터는 CD123 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CD123 CAR을 코딩하는 핵산 및 CD123 이외의 항원 (예를 들어, AML 세포 상에서 발현된 항원, 예를 들어, CD33, CLL-1, CD34, FLT3, 또는 폴레이트 수용체 베타)을 표적화하고 항원에 대한 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 공동자극 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 코딩하는 핵산을 포함한다.
한 실시양태에서, 벡터는 본원에 기재된 CD123 CAR을 코딩하는 핵산 및 억제 CAR을 코딩하는 핵산을 포함한다. 한 실시양태에서, 억제 CAR은, 암 세포에서는 발견되지 않지만 정상 세포, 예를 들어 CD123을 또한 발현하는 정상 세포에서 발견되는 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 억제 CAR은 억제 분자의 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다. 예를 들어, 억제 CAR의 세포내 도메인은 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR 베타의 세포내 도메인일 수 있다.
실시양태에서, 벡터는 CAR, 예를 들어 본원에 기재된 CD123 CAR 및 제2 CAR, 예를 들어 억제 CAR 또는 CD123 이외의 항원 (예를 들어, AML 세포 상에서 발현된 항원, 예를 들어, CLL-1, CD33, CD34, FLT3, 또는 폴레이트 수용체 베타)에 특이적으로 결합하는 CAR을 코딩하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, CAR을 코딩하는 2개 이상의 핵산 서열은 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 단일 핵산 분자에 의해 코딩된다. 이러한 측면에서, 2개 이상의 CAR은, 예를 들어 1개 이상의 펩티드 절단 부위 (예를 들어, 세포내 프로테아제에 대한 자가-절단 부위 또는 기질)에 의해 분리될 수 있다. 펩티드 절단 부위의 예는 하기를 포함하며, 여기서 GSG 잔기는 임의적이다:
Figure pct00097
유전자를 세포 내로 도입하고 발현시키는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 발현 벡터와 관련하여, 벡터는 관련 기술분야의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유동물, 박테리아, 효모, 또는 곤충 세포 내로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 옮겨질 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주사, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY]을 참조한다. 숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드의 도입을 위한 바람직한 방법은 인산칼슘 형질감염이다.
숙주 세포 내로 관심 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유동물, 예를 들어 인간 세포 내로 삽입하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,350,674 및 5,585,362를 참조한다.
숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드성 분산액 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로구체, 비드, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합된 미셀, 및 리포솜을 비롯한 지질-기반 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체내에서 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드성 시스템은 리포솜 (예를 들어, 인공 막 소포)이다. 핵산의 최신 기술의 표적화된 전달, 예컨대 표적화된 나노입자 또는 다른 적합한 마이크로미터-미만 크기의 전달 시스템을 사용한 폴리뉴클레오티드의 전달을 위한 다른 방법이 이용가능하다.
비-바이러스 전달 시스템이 이용되는 경우에, 예시적인 전달 비히클은 리포솜이다. 지질 제제의 사용은 숙주 세포 내로의 핵산의 도입 (시험관내, 생체외 또는 생체내)을 위해 고려된다. 또 다른 측면에서, 핵산은 지질과 회합될 수 있다. 지질과 회합된 핵산은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포솜의 지질 이중층 내에 점재되거나, 리포솜 및 올리고뉴클레오티드 둘 다와 회합된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되거나, 리포솜 내에 포획되거나, 리포솜과 복합체화되거나, 지질 함유 용액 중에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질 내에 현탁액으로서 함유되거나, 미셀과 함께 함유 또는 복합체화되거나, 또는 지질과 달리 회합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 회합 조성물은 용액 중의 임의의 특정한 구조로 제한되지 않는다. 예를 들어, 이들은 이중층 구조로, 미셀로서, 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 이들은 또한 단순히 용액 중에 점재되고, 가능하게는 크기 또는 형상이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 자연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 세포질에서 자연 발생하는 지방 액적, 뿐만 아니라 장쇄 지방족 탄화수소 및 그의 유도체, 예컨대 지방산, 알콜, 아민, 아미노 알콜, 및 알데히드를 함유하는 화합물의 부류를 포함한다.
사용하기 적합한 지질은 상업적 공급원으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린 ("DMPC")은 미주리주 세인트 루이스의 시그마(Sigma)로부터 수득할 수 있고; 디세틸 포스페이트 ("DCP")는 케이 & 케이 래보러토리즈(K & K Laboratories) (뉴욕주 플레인뷰)로부터 수득할 수 있고; 콜레스테롤 ("Chol")은 칼바이오켐-베링(Calbiochem-Behring)으로부터 수득할 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤 ("DMPG") 및 다른 지질은 아반티 폴라 리피즈, 인크.(Avanti Polar Lipids, Inc.) (앨라배마주 버밍엄)로부터 수득할 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 내의 지질의 원액은 약 -20℃에서 저장될 수 있다. 클로로포름이 메탄올보다 더 용이하게 증발되기 때문에, 클로로포름이 유일한 용매로서 사용된다. "리포솜"은 둘러싸는 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다층막 지질 비히클을 포괄하는 일반적 용어이다. 리포솜은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 갖는 소포 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 다층 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층을 갖는다. 이들은 인지질이 과량의 수용액 중에 현탁될 경우에 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 폐쇄된 구조의 형성 전에 자기-재배열을 거치고, 물 및 지질 이중층들 사이의 용해된 용질을 포획한다 (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). 그러나, 정상 소포 구조가 아니라 용액 중에서 상이한 구조를 갖는 조성물도 포괄된다. 예를 들어, 지질은 미셀 구조를 가정할 수 있거나 또는 단지 지질 분자의 불균일 응집체로서 존재할 수 있다. 또한, 리포펙타민-핵산 복합체가 고려된다.
외인성 핵산을 숙주 세포 내로 도입하거나 또는 달리 세포를 본 발명의 억제제에 노출시키기 위해 사용된 방법과 상관없이, 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위해 다양한 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들어 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 "분자 생물학적" 검정, 예컨대 서던 및 노던 블롯팅, RT-PCR 및 PCR; 예를 들어 면역학적 수단 (ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의해 또는 본 발명의 범주 내에 포함되는 작용제를 확인하기 위해 본원에 기재된 검정에 의해, 예컨대 특정한 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 "생화학적" 검정을 포함한다.
본 발명은 CAR 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 추가로 제공한다. 한 측면에서, CAR 벡터는 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포 내로 직접 형질도입될 수 있다. 한 측면에서, 벡터는 클로닝 또는 발현 벡터, 예를 들어 1종 이상의 플라스미드 (예를 들어, 발현 플라스미드, 클로닝 벡터, 미니서클, 미니벡터, 이중 미세 염색체), 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터 구축물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 벡터이다. 한 측면에서, 벡터는 포유동물 면역 이펙터 세포, 예를 들어 포유동물 T 세포 또는 포유동물 NK 세포에서 CAR 구축물을 발현할 수 있다. 한 측면에서, 포유동물 T 세포는 인간 T 세포이다.
세포의 공급원
확장 및 유전적 변형 전에, 세포 (예를 들어 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)의 공급원을 대상체로부터 수득한다. 용어 "대상체"는 면역 반응이 도출될 수 있는 살아있는 유기체 (예를 들어, 포유동물)를 포함하는 것으로 의도된다. 대상체의 예는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트, 및 그의 트랜스제닉 종을 포함한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직, 및 종양을 비롯한 수많은 공급원으로부터 수득될 수 있다.
본 발명의 특정 측면에서, 관련 기술분야에서 입수가능한 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)주의 임의의 수가 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, T 세포는 통상의 기술자에게 공지된 임의의 많은 기술, 예컨대 피콜(Ficoll)™ 분리를 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. 하나의 바람직한 측면에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 분리반출술에 의해 수득된다. 분리반출술 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포를 비롯한 림프구, 다른 유핵 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 함유한다. 한 측면에서, 분리반출술에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하고 세포를 후속 프로세싱 단계를 위해 적절한 완충제 또는 배지에 두기 위해 세척될 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 세포를 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 세척한다. 대안적 측면에서, 세척 용액은 칼슘이 결여되어 있고, 마그네슘이 결여될 수 있거나 또는 모두는 아니지만 많은 2가 양이온이 결여될 수 있다.
칼슘의 부재 하에 초기 활성화 단계는 확대된 활성화로 이어질 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백한 바와 같이, 세척 단계는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해, 예컨대 반-자동화 "관통형" 원심분리기 (예를 들어, 코브(Cobe) 2991 셀 프로세서, 박스터 시토메이트(Baxter CytoMate), 또는 해모네틱스 셀 세이버 5(Haemonetics Cell Saver 5))를 제조업체의 지침에 따라 사용하는 것에 의해 달성할 수 있다. 세척 후에, 세포를 다양한 생체적합성 완충제, 예컨대 Ca-무함유, Mg-무함유 PBS, 플라스마라이트 A(PlasmaLyte A), 또는 완충제 존재 또는 부재 하의 다른 염수 용액 중에 재현탁시킬 수 있다. 대안적으로, 분리반출술 샘플의 바람직하지 않은 성분을 제거하고, 세포를 배양 배지 내에 직접 재현탁시킬 수 있다.
본 출원의 방법은 5% 이하, 예를 들어 2%의 인간 AB 혈청을 포함하는 배양 배지 조건을 이용할 수 있고, 공지된 배양 배지 조건 및 조성, 예를 들어 문헌 [Smith et al., "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement" Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31]에 기재된 것을 사용할 수 있는 것으로 인식된다.
한 측면에서, T 세포는 적혈구를 용해시키고, 예를 들어 퍼콜(PERCOLL)™ 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 역류 원심 분리에 의해 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다.
T 세포의 특정 하위집단, 예컨대 CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+ T 세포는 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, 한 측면에서, T 세포는 항-CD3/항-CD28 (예를 들어, 3x28)-접합된 비드, 예컨대 디나비즈(DYNABEADS)® M-450 CD3/CD28 T와 함께 목적하는 T 세포의 양성 선택을 위한 충분한 시간 동안 인큐베이션함으로써 단리된다. 한 측면에서, 시간은 약 30분이다. 추가 측면에서, 시간은 30분 내지 36시간 또는 그 초과 및 그 사이의 모든 정수 값의 범위이다. 추가 측면에서, 시간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6시간이다. 또 다른 바람직한 측면에서, 시간은 10 내지 24시간이다. 한 측면에서, 인큐베이션 시간은 24시간이다. 다른 세포 유형과 비교하여 T 세포가 거의 없는 임의의 상황에서, 예컨대 종양 조직으로부터 또는 면역손상 개체로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 단리하는데 있어서, T 세포를 단리하기 위해 보다 긴 인큐베이션 시간이 사용될 수 있다. 또한, 보다 긴 인큐베이션 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 단순히 시간을 단축하거나 연장함으로써 T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합하도록 하고/거나, 비드 대 T 세포의 비를 증가시키거나 감소시킴으로써 (본원에 추가로 기재된 바와 같음), 배양 개시 시 또는 과정 동안의 다른 시점에 T 세포의 하위집단을 우선적으로 선택할 수 있다. 추가로, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비를 증가시키거나 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단은 배양 개시 시 또는 다른 목적하는 시점에 우선적으로 선택될 수 있다. 통상의 기술자는 다중 선택 라운드가 또한 본 발명과 관련하여 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 특정 측면에서, 활성화 및 확장 과정에서 선택 절차를 수행하고 "비선택된" 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "비선택된" 세포는 또한 추가 라운드의 선택에 적용될 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단의 풍부화는 음성 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 대해 지시된 항체의 조합을 사용하여 달성될 수 있다. 1가지 방법은 음성 선택된 세포 상에 제시된 세포 표면 마커에 대해 지시된 모노클로날 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역부착 또는 유동 세포측정법을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부화하기 위해, 모노클로날 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 특정 측면에서, 전형적으로 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+, 및 FoxP3+를 발현하는 조절 T 세포를 풍부화하거나 또는 양성 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 특정 측면에서, T 조절 세포는 항-C25 접합된 비드 또는 다른 유사한 선택 방법에 의해 고갈된다.
본원에 기재된 방법은, 예를 들어 본원에 기재된 예를 들어 음성 선택 기술을 사용하여, 예를 들어 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 특정 하위집단, T 조절 세포-고갈 집단, CD25+ 고갈 세포의 선택을 포함할 수 있다. 바람직하게는, T 조절 고갈 세포의 집단은 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만의 CD25+ 세포를 함유한다.
한 실시양태에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ T 세포는 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 또는 CD25-결합 리간드, IL-2를 사용하여 집단으로부터 제거된다. 한 실시양태에서, 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 또는 CD25-결합 리간드는 기질, 예를 들어 비드에 접합되거나, 또는 달리 기질, 예를 들어 비드 상에 코팅된다. 한 실시양태에서, 항-CD25 항체 또는 그의 단편은 본원에 기재된 바와 같은 기질에 접합된다.
한 실시양태에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ T 세포는 밀테니(Miltenyi)™로부터의 CD25 고갈 시약을 사용하여 집단으로부터 제거된다. 한 실시양태에서, 세포 대 CD25 고갈 시약의 비는 1e7개 세포 대 20 uL, 또는 1e7개 세포 대 15 uL, 또는 1e7개 세포 대 10 uL, 또는 1e7개 세포 대 5 uL, 또는 1e7개 세포 대 2.5 uL, 또는 1e7개 세포 대 1.25 uL이다. 한 실시양태에서, 예를 들어 T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 고갈을 위해, 5억개 초과의 세포/ml가 사용된다. 추가 측면에서, 6억, 7억, 8억, 또는 9억개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다.
한 실시양태에서, 고갈될 면역 이펙터 세포의 집단은 약 6 x 109개의 CD25+ T 세포를 포함한다. 다른 측면에서, 고갈될 면역 이펙터 세포의 집단은 약 1 x 109개 내지 1x 1010개의 CD25+ T 세포, 및 그 사이의 임의의 정수 값을 포함한다. 한 실시양태에서, T 조절 고갈 세포의 생성된 집단은 2 x 109개의 T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 세포, 또는 그 미만 (예를 들어, 1 x 109개, 5 x 108개, 1 x 108개, 5 x 107개, 1 x 107개, 또는 그 미만의 CD25+ 세포)을 갖는다.
한 실시양태에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 세포는 고갈 튜빙 세트, 예컨대 예를 들어 튜빙 162-01이 구비된 클리니맥(CliniMAC) 시스템을 사용하여 집단으로부터 제거된다. 한 실시양태에서, 클리니맥 시스템은 고갈 설정, 예컨대 예를 들어, DEPLETION2.1로 가동된다.
특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 분리반출술 전 또는 CAR-발현 세포 생성물의 제조 동안 대상체에서 면역 세포의 음성 조절자의 수준을 감소시키는 것 (예를 들어, 원치않는 면역 세포, 예를 들어 TREG 세포의 수를 감소시키는 것)은 대상체의 재발 위험을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, TREG 세포를 고갈시키는 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. TREG 세포를 감소시키는 방법은 시클로포스파미드, 항-GITR 항체 (본원에 기재된 항-GITR 항체), CD25-고갈 및 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 제조 방법은 CAR-발현 세포의 제조 전에 TREG 세포의 수를 감소시키는 것 (예를 들어, 고갈시키는 것)을 포함한다. 예를 들어, 제조 방법은, 예를 들어 CAR-발현 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포) 생성물의 제조 전에 TREG 세포를 고갈시키기 위해 샘플, 예를 들어 분리반출술 샘플을 항-GITR 항체 및/또는 항-CD25 항체 (또는 그의 단편 또는 CD25-결합 리간드)와 접촉시키는 것을 포함한다
한 실시양태에서, 대상체는 CAR-발현 세포 생성물 제조를 위한 세포의 수집 전에 TREG 세포를 감소시키는 1종 이상의 요법으로 사전-처리되고, 그에 의해 CAR-발현 세포 처리에 대한 대상체의 재발 위험이 감소된다. 한 실시양태에서, TREG 세포를 감소시키는 방법은 대상체에게 시클로포스파미드, 항-GITR 항체 중 1종 이상의 투여, CD25-고갈, 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 시클로포스파미드, 항-GITR 항체 중 1종 이상의 투여, CD25-고갈, 또는 그의 조합은 CAR-발현 세포 생성물의 주입 전, 그 동안 또는 그 후에 일어날 수 있다.
한 실시양태에서, 대상체는 CAR-발현 세포 생성물 제조를 위한 세포의 수집 전에 시클로포스파미드로 사전-처리되고, 그에 의해 CAR-발현 세포 처리에 대한 대상체의 재발 위험이 감소된다. 한 실시양태에서, 대상체는 CAR-발현 세포 생성물 제조를 위한 세포의 수집 전에 항-GITR 항체로 사전-처리되고, 그에 의해 CAR-발현 세포 처리에 대한 대상체의 재발 위험이 감소된다.
한 실시양태에서, 제거될 세포의 집단은 조절 T 세포도 또는 종양 세포도 아니지만, CART 세포의 확장 및/또는 기능에 달리 음의 영향을 미치는 세포, 예를 들어 CD14, CD11b, CD33, CD15, 또는 잠재적으로 면역 억제 세포에 의해 발현되는 다른 마커를 발현하는 세포이다. 한 실시양태에서, 이러한 세포는 조절 T 세포 및/또는 종양 세포와 공동으로, 또는 상기 고갈 후에, 또는 또 다른 순서로 제거되는 것이 고려된다.
본원에 기재된 방법은 1개 초과의 선택 단계, 예를 들어 1개 초과의 고갈 단계를 포함할 수 있다. 음성 선택에 의한 T 세포 집단의 풍부화는, 예를 들어 음성 선택된 세포에 고유한 표면 마커로 지시되는 항체의 조합에 의해 달성될 수 있다. 1가지 방법은 음성 선택된 세포의 표면 상에 존재하는 세포 표면 마커로 지시되는 모노클로날 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역부착 또는 유동 세포측정법을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부화하기 위해, 모노클로날 항체 칵테일은 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법은 종양 항원, 예를 들어 CD25를 포함하지 않는 종양 항원, 예를 들어 CD19, CD30, CD38, CD123, CD20, CD14 또는 CD11b를 발현하는 집단으로부터 세포를 제거하여 CAR, 예를 들어 본원에 기재된 CAR의 발현에 적합한 T 조절 고갈, 예를 들어 CD25+ 고갈 및 종양 항원 고갈 세포의 집단을 제공하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 종양 항원 발현 세포는 T 조절, 예를 들어 CD25+ 세포와 동시에 제거된다. 예를 들어, 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 및 항종양 항원 항체 또는 그의 단편은 세포를 제거하는데 사용될 수 있는 동일한 기질, 예를 들어 비드에 부착될 수 있거나, 또는 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 또는 항종양 항원 항체 또는 그의 단편은 세포를 제거하는데 사용될 수 있는 혼합물인 개별 비드에 부착될 수 있다. 다른 실시양태에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 세포의 제거 및 종양 항원 발현 세포의 제거는 순차적이고, 예를 들어 어느 하나의 순서로 일어날 수 있다.
또한, 체크 포인트 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 체크 포인트 억제제를 발현하는 집단으로부터 세포, 예를 들어 PD1+ 세포, LAG3+ 세포, 및 TIM3+ 세포 중 1종 이상을 제거하여, T 조절 고갈, 예를 들어 CD25+ 고갈 세포 및 체크 포인트 억제제 고갈 세포, 예를 들어 PD1+, LAG3+ 및/또는 TIM3+ 고갈 세포의 집단을 제공하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 예시적인 체크 포인트 억제제는 B7-H1, B7-1, CD160, P1H, 2B4, PD1, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, TIGIT, CTLA-4, BTLA 및 LAIR1을 포함한다. 한 실시양태에서, 체크 포인트 억제제 발현 세포는 T 조절, 예를 들어 CD25+ 세포와 동시에 제거된다. 예를 들어, 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 및 항-체크 포인트 억제제 항체 또는 그의 단편은 세포를 제거하는데 사용될 수 있는 동일한 비드에 부착될 수 있거나, 또는 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 또는 항-체크 포인트 억제제 항체 또는 그의 단편은 세포를 제거하는데 사용될 수 있는 혼합물인 개별 비드에 부착될 수 있다. 다른 실시양태에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 세포의 제거 및 체크 포인트 억제제 발현 세포의 제거는 순차적이고, 예를 들어 어느 하나의 순서로 일어날 수 있다.
한 실시양태에서, IFN-γ, TNFα, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, 그랜자임 B 및 퍼포린, 또는 다른 적절한 분자, 예를 들어 다른 시토카인 중 1종 이상을 발현하는 T 세포 집단이 선택될 수 있다. 세포 발현에 대해 스크리닝하는 방법은 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 2013/126712에 기재된 방법에 의해 결정될 수 있다.
양성 또는 음성 선택에 의한 세포의 목적하는 집단의 단리를 위해, 세포의 농도 및 표면 (예를 들어, 입자, 예컨대 비드)은 변할 수 있다. 특정 측면에서, 세포 및 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해 비드 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 유의하게 감소시키는 (예를 들어, 세포의 농도를 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 한 측면에서, 20억개/ml의 농도가 사용된다. 한 측면에서, 10억개 세포/ml의 농도가 사용된다. 추가 측면에서, 1억개 초과/ml가 사용된다. 추가 측면에서, 1천만, 1천5백만, 2천만, 2천5백만, 3천만, 3천5백만, 4천만, 4천5백만, 또는 5천만개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 한 측면에서, 7천5백만, 8천만, 8천5백만, 9천만, 9천5백만, 또는 1억개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가 측면에서, 1억2천5백만 또는 1억5천만개 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다.
높은 농도의 사용은 증가된 세포 수율, 세포 활성화, 및 세포 확장을 발생시킬 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포, 예컨대 CD28-음성 T 세포의, 또는 많은 종양 세포가 존재하는 샘플 (예를 들어, 백혈병성 혈액, 종양 조직 등)로부터의 보다 효율적인 포획을 가능하게 한다. 이러한 세포의 집단은 치료 가치를 가질 수 있고, 수득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어 높은 농도의 세포를 사용하는 것은, 정상적으로는 보다 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 보다 효율적인 선택을 가능하게 한다.
관련 측면에서, 보다 낮은 농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포 및 표면 (예를 들어, 입자, 예컨대 비드)의 혼합물을 유의하게 희석시킴으로써, 입자와 세포 사이에 상호작용이 최소화된다. 이것은 입자에 결합되는 다량의 목적하는 항원을 발현하는 세포를 선택한다. 예를 들어, CD4+ T 세포는 보다 높은 수준의 CD28을 발현하고, 희석 농도에서 CD8+ T 세포보다 더 효율적으로 포획된다. 한 측면에서, 사용된 세포의 농도는 5 X 10e6개/ml이다. 다른 측면에서, 사용된 농도는 약 1 X 105개/ml 내지 1 X 106개/ml, 및 그 사이의 임의의 정수 값일 수 있다.
다른 측면에서, 세포를 2-10℃ 또는 실온에서 상이한 속도로 상이한 시간 길이 동안 회전장치 상에서 인큐베이션할 수 있다.
자극을 위한 T 세포는 또한 세척 단계 후에 동결될 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도의 단핵구를 제거함으로써 보다 균일한 생성물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후에, 세포는 동결 용액 중에 현탁될 수 있다. 많은 동결 용액 및 파라미터가 관련 기술분야에 공지되어 있고 이러한 맥락에서 유용할 것이지만, 한 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% 플라스마라이트-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민, 및 7.5% DMSO, 또는 예를 들어, 헤스판(Hespan) 및 플라스마라이트 A를 함유하는 다른 적합한 세포 동결 매질을 함유하는 배양 배지를 사용하는 것을 수반하고, 세포는 이어서 1분에 1℃의 속도로 -80℃로 동결되고, 액체 질소 저장 탱크의 증기 상에 저장된다. 다른 제어 동결 방법 뿐만 아니라 -20℃에서의 또는 액체 질소 내의 즉각적인 비제어 동결이 사용될 수 있다.
특정 측면에서, 동결보존된 세포는 본원에 기재된 바와 같이 해동 및 세척되고, 1시간 동안 실온에서 휴지되도록 한 후, 본 발명의 방법을 사용하여 활성화된다.
또한, 본 발명과 관련하여 본원에 기재된 바와 같은 확장된 세포가 필요할 수 있을 때 그 전의 일정 기간에 대상체로부터 혈액 샘플 또는 분리반출술 생성물을 수집하는 것이 고려된다. 따라서, 확장시킬 세포의 공급원은 필요한 임의의 시점에 수집될 수 있고, 목적하는 세포, 예컨대 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포가 단리되고, 세포 요법, 예를 들어 T 세포 요법으로부터 이익을 얻을 임의의 수많은 질환 또는 상태, 예컨대 본원에 기재된 것에 대한 T 세포 요법에 추후 사용하기 위해 동결될 수 있다. 한 측면에서, 혈액 샘플 또는 분리반출술은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취된다. 특정 측면에서, 혈액 샘플 또는 분리반출술은 질환이 발생할 위험이 있지만 아직 질환이 발생하지 않은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취되고, 관심 세포가 단리되고, 추후 사용을 위해 동결된다. 특정 측면에서, 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포는 확장, 동결되고, 나중에 사용될 수 있다. 특정 측면에서, 샘플은 본원에 기재된 바와 같은 특정한 질환의 진단 직후에, 그러나 임의의 치료 전에 환자로부터 수집된다. 추가 측면에서, 세포는 나탈리주맙, 에팔리주맙, 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 시클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역절제제, 예컨대 캄파트, 항-CD3 항체, 시톡산, 플루다라빈, 시클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀산, 스테로이드, FR901228과 같은 작용제, 및 방사선조사를 사용하는 치료를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 수많은 관련 치료 양식 전에 대상체로부터의 혈액 샘플 또는 분리반출술로부터 단리된다.
본 발명의 추가 측면에서, T 세포는 기능적 T 세포를 사용한 대상체의 치료 후에 환자로부터 직접 수득된다. 이와 관련하여, 특정 암 치료, 특히 면역계를 손상시키는 약물을 사용한 치료 후, 환자가 치료로부터 정상적으로 회복되는 기간 동안의 치료 직후에, 수득된 T 세포의 품질은 생체외에서 확장되는 그의 능력이 최적화되거나 개선될 수 있는 것으로 관찰되었다. 마찬가지로, 본원에 기재된 방법을 사용한 생체외 조작 후에, 이들 세포는 증진된 생착 및 생체내 확장을 위한 바람직한 상태로 존재할 수 있다. 따라서, 이러한 회복기 동안 T 세포, 수지상 세포, 또는 조혈 계열의 다른 세포를 포함하는 혈액 세포를 수집하는 것이 본 발명의 문맥 내에서 고려된다. 추가로, 특정 측면에서, 특히 요법 후의 규정된 시간 윈도우 동안 특정한 세포 유형의 재증식, 재순환, 재생, 및/또는 확장이 유리한 조건을 대상체에서 생성하기 위해 가동화 (예를 들어, GM-CSF를 사용한 가동화) 및 조건화 요법이 사용될 수 있다. 예시적인 세포 유형은 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 및 면역계의 다른 세포를 포함한다.
한 실시양태에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 면역 이펙터 세포는 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제를 제공받은 대상체로부터 수득된다. 한 실시양태에서, CAR을 발현하도록 조작될 면역 이펙터 세포의 집단, 예를 들어 T 세포는 대상체 내의 또는 대상체로부터 수거된 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 수준, 또는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포/ PD1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 비가 적어도 일시적으로 증가되도록 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제의 충분한 시간 후에 또는 충분한 투여 후에 수거된다.
다른 실시양태에서, CAR을 발현하도록 조작되었거나 또는 조작될 면역 이펙터 세포의 집단, 예를 들어 T 세포는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 수를 증가시키거나 또는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포/ PD1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 비를 증가시키는 mTOR 억제제의 양과의 접촉에 의해 생체외에서 처리될 수 있다.
한 실시양태에서, T 세포 집단은 디아글리세롤 키나제 (DGK)-결핍이다. DGK-결핍 세포는 DGK RNA 또는 단백질을 발현하지 않거나 또는 감소 또는 억제된 DGK 활성을 갖는 세포를 포함한다. DGK-결핍 세포는 유전적 접근법에 의해, 예를 들어 RNA-간섭제, 예를 들어 siRNA, shRNA, miRNA를 투여하여 DGK 발현을 감소 또는 방지하는 것에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, DGK-결핍 세포는 본원에 기재된 DGK 억제제를 사용한 처리에 의해 생성될 수 있다.
한 실시양태에서, T 세포 집단은 이카로스(Ikaros)-결핍이다. 이카로스-결핍 세포는 이카로스 RNA 또는 단백질을 발현하지 않거나 또는 감소 또는 억제된 이카로스 활성을 갖는 세포를 포함하고, 이카로스-결핍 세포는 유전적 접근법에 의해, 예를 들어 RNA-간섭제, 예를 들어 siRNA, shRNA, miRNA를 투여하여 이카로스 발현을 감소 또는 방지하는 것에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 이카로스-결핍 세포는 이카로스 억제제, 예를 들어 레날리도미드를 사용한 처리에 의해 생성될 수 있다.
실시양태에서, T 세포 집단은 DGK-결핍 및 이카로스-결핍이고, 예를 들어 DGK 및 이카로스를 발현하지 않거나 또는 감소 또는 억제된 DGK 및 이카로스 활성을 갖는다. 이러한 DGK 및 이카로스-결핍 세포는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다.
한 실시양태에서, NK 세포는 대상체로부터 수득된다. 또 다른 실시양태에서, NK 세포는 NK 세포주, 예를 들어 NK-92 세포주 (콘퀘스트(Conkwest))이다.
동종 CAR 면역 이펙터 세포
본원에 기재된 실시양태에서, 면역 이펙터 세포는 동종 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 동종 T 세포, 예를 들어 기능적 T 세포 수용체 (TCR) 및/또는 인간 백혈구 항원 (HLA), 예를 들어, HLA 부류 I 및/또는 HLA 부류 II의 발현이 결여된 동종 T 세포일 수 있다.
기능적 TCR이 결여된 T 세포는 예를 들어 그의 표면 상에 임의의 기능적 TCR을 발현하지 않도록 조작되거나, 기능적 TCR을 포함하는 1개 이상의 서브유닛을 발현하지 않도록 조작되거나 (예를 들어, TCR 알파, TCR 베타, TCR 감마, TCR 델타, TCR 엡실론, 및/또는 TCR 제타를 발현하지 않도록 (또는 감소된 발현을 나타내도록) 조작되거나), 또는 그의 표면 상에 매우 적은 기능적 TCR을 생산하도록 조작될 수 있다. 대안적으로, T 세포는 예를 들어 TCR의 서브유닛 중 1개 이상의 돌연변이된 또는 말단절단된 형태의 발현에 의해 실질적으로 손상된 TCR을 발현할 수 있다. 용어 "실질적으로 손상된 TCR"은 이러한 TCR이 숙주에서 유해한 면역 반응을 도출하지 않을 것임을 의미한다.
본원에 기재된 T 세포는 예를 들어 그의 표면 상에 기능적 HLA를 발현하지 않도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 T 세포는 세포 표면 발현 HLA, 예를 들어, HLA 부류 I 및/또는 HLA 부류 II가 하향조절되도록 조작될 수 있다. 일부 측면에서, HLA의 하향조절은 베타-2 마이크로글로불린 (B2M)의 발현을 감소시키거나 제거하는 것에 의해 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, T 세포는 기능적 TCR 및 기능적 HLA, 예를 들어 HLA 부류 I 및/또는 HLA 부류 II가 결여될 수 있다.
기능적 TCR 및/또는 HLA의 발현이 결여된 변형된 T 세포는 TCR 또는 HLA의 1개 이상의 서브유닛의 녹아웃 또는 녹다운을 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 siRNA, shRNA, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) 전사-활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 또는 아연 핑거 엔도뉴클레아제 (ZFN)를 사용한 TCR 및/또는 HLA의 녹다운을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 동종 세포는, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 억제 분자를 발현하지 않거나 낮은 수준으로 발현하는 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 예를 들어 면역 이펙터 반응을 일으키는 CAR-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있는 억제 분자를 발현하지 않거나 낮은 수준으로 발현하는 세포일 수 있다. 억제 분자의 예는 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR 베타를 포함한다. 예를 들어, DNA, RNA 또는 단백질 수준에서의 억제에 의한 억제 분자의 억제는 CAR-발현 세포 성능을 최적화할 수 있다. 실시양태에서, 억제 핵산, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 예를 들어 억제 핵산, 예를 들어 dsRNA, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR), 전사-활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 또는 아연 핑거 엔도뉴클레아제 (ZFN)가 사용될 수 있다.
TCR 또는 HLA를 억제하는 siRNA 및 shRNA
일부 실시양태에서, TCR 발현 및/또는 HLA 발현은 세포에서 TCR 및/또는 HLA, 및/또는 본원에 기재된 억제 분자 (예를 들어, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR 베타)를 코딩하는 핵산을 표적화하는 siRNA 또는 shRNA를 사용하여 억제될 수 있다.
T 세포에서 siRNA 및 shRNA의 발현은 임의의 통상적인 발현 시스템, 예를 들어 렌티바이러스 발현 시스템을 사용하여 달성될 수 있다.
TCR의 1종 이상의 성분의 발현을 하항조절하는 예시적인 shRNA는 예를 들어 미국 공개 번호 2012/0321667에 기재되어 있다. HLA 부류 I 및/또는 HLA 부류 II 유전자의 발현을 하항조절하는 예시적인 siRNA 및 shRNA는 예를 들어 미국 공개 번호 US 2007/0036773에 기재되어 있다.
TCR 또는 HLA를 억제하는 CRISPR
본원에 사용된 "CRISPR" 또는 "TCR 및/또는 HLA에 대한 CRISPR" 또는 "TCR 및/또는 HLA를 억제하는 CRISPR"은 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부의 세트, 또는 이러한 반복부의 세트를 포함하는 시스템을 지칭한다. 본원에 사용된 "Cas"는 CRISPR-연관 단백질을 지칭한다. "CRISPR/Cas" 시스템은 TCR 및/또는 HLA 유전자, 및/또는 본원에 기재된 억제 분자 (예를 들어, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR 베타)를 침묵 또는 돌연변이시키기 위해 사용될 수 있는, CRISPR 및 Cas로부터 유래된 시스템을 지칭한다.
자연-발생 CRISPR/Cas 시스템은 서열분석된 유박테리움 게놈의 대략 40% 및 서열분석된 고세균의 90%에서 발견된다. 문헌 [Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8: 172]. 이러한 시스템은 외래 유전 요소, 예컨대 플라스미드 및 파지에 저항성을 부여하는 원핵 면역계의 유형이고, 후천성 면역 형태를 제공한다. 문헌 [Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-1712; Marragini et al. ( 2008) Science 322: 1843-1845].
CRISPR/Cas 시스템은 진핵생물, 예컨대 마우스 또는 영장류에서의 유전자 편집 (특정 유전자를 침묵, 증진 또는 변화시키는 것)에 사용하기 위해 변형된 바 있다. 문헌 [Wiedenheft et al. (2012) Nature 482: 331-8]. 이는 특이적으로 설계된 CRISPR 및 1개 이상의 적절한 Cas를 함유하는 플라스미드를 진핵 세포 내로 도입함으로써 달성된다.
때때로 CRISPR 유전자좌로 불리는 CRISPR 서열은 교대 반복부 및 스페이서를 포함한다. 자연-발생 CRISPR에서, 스페이서는 통상적으로 박테리아에 외래인 서열, 예컨대 플라스미드 또는 파지 서열을 포함하고; TCR 및/또는 HLA CRISPR/Cas 시스템에서 스페이서는 TCR 또는 HLA 유전자 서열로부터 유래된다.
CRISPR 유전자좌로부터의 RNA는 구성적으로 발현되고, Cas 단백질에 의해 작은 RNA로 프로세싱된다. 이들은 반복부 서열과 플랭킹된 스페이서를 포함한다. RNA는 RNA 또는 DNA 수준에서 외인성 유전 요소를 침묵시키기 위해 다른 Cas 단백질을 안내한다. 문헌 [Horvath et al. (2010) Science 327: 167-170; Makarova et al. (2006) Biology Direct 1: 7]. 스페이서는 따라서 siRNA와 유사하게 RNA 분자에 대한 주형으로서 역할을 한다. 문헌 [Pennisi (2013) Science 341: 833-836].
이들은 많은 상이한 유형의 박테리아에서 자연 발생하기 때문에, CRISPR의 정확한 배열 및 Cas 유전자의 구조, 기능, 및 수, 및 그의 산물은 종별로 다소 상이하다. 문헌 [Haft et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1: e60; Kunin et al. (2007) Genome Biol. 8: R61; Mojica et al. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-182; Bolotin et al. (2005) Microbiol. 151: 2551-2561; Pourcel et al. (2005) Microbiol. 151: 653-663; 및 Stern et al. (2010) Trends. Genet. 28: 335-340]. 예를 들어, Cse (Cas 하위유형, 이. 콜라이) 단백질 (예를 들어, CasA)은 CRISPR RNA 전사체를 기능적 복합체인 캐스케이드를 보유하는 스페이서-반복부 단위로 프로세싱하는 캐스케이드를 형성한다. 문헌 [Brouns et al. (2008) Science 321: 960-964]. 다른 원핵생물에서, Cas6은 CRISPR 전사체를 프로세싱한다. 이. 콜라이에서의 CRISPR-기반 파지 불활성화는 캐스케이드 및 Cas3을 필요로 하지만, Cas1 또는 Cas2는 필요로 하지 않는다. 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 및 다른 원핵생물에서 Cmr (Cas RAMP 모듈) 단백질은 상보성 표적 RNA를 인식하고 절단하는 작은 CRISPR RNA와 기능적 복합체를 형성한다. 보다 단순한 CRISPR 시스템은 이중 나선의 각각의 나선에 대해 1개씩, 2개의 활성 절단 부위를 갖는 뉴클레아제인 단백질 Cas9에 의존한다. Cas9 및 변형된 CRISPR 유전자좌 RNA의 조합이 유전자 편집을 위해 시스템에서 사용될 수 있다. 문헌 [Pennisi (2013) Science 341: 833-836].
CRISPR/Cas 시스템은 따라서 TCR 및/또는 HLA 유전자의 편집 (염기쌍의 부가 또는 결실), 또는 TCR 및/또는 HLA의 발현을 감소시키는 조기 정지의 도입을 위해 사용될 수 있다. CRISPR/Cas 시스템은 대안적으로 RNA 간섭처럼 사용되고, TCR 및/또는 HLA 유전자를 가역적인 방식으로 턴 오프할 수 있다. 포유동물 세포에서, 예를 들어 RNA는 Cas 단백질을 TCR 및/또는 HLA 프로모터로 안내하여, RNA 폴리머라제를 입체적으로 차단할 수 있다.
관련 기술분야에 공지된, 예를 들어 미국 공개 번호 20140068797, 및 문헌 [Cong (2013) Science 339: 819-823]에 기재된 기술을 사용하여 TCR 및/또는 HLA를 억제하는 인공 CRISPR/Cas 시스템이 생성될 수 있다. 또한 TCR 및/또는 HLA를 억제하는 관련 기술분야에 공지된, 예를 들어 문헌 [Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576], 미국 특허 번호 8,871,445; 8,865,406; 8,795,965; 8,771,945; 및 8,697,359에 기재된 다른 인공 CRISPR/Cas 시스템이 또한 생성될 수 있다.
TCR 및/또는 HLA를 억제하는 TALEN
"TALEN" 또는 "HLA 및/또는 TCR에 대한 TALEN" 또는 "HLA 및/또는 TCR을 억제하는 TALEN"은 HLA 및/또는 TCR 유전자, 및/또는 본원에 기재된 억제 분자 (예를 들어, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR 베타)를 편집하기 위해 사용될 수 있는 인공 뉴클레아제인 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제를 지칭한다.
TALEN은 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합시킴으로써 인공적으로 생산된다. 전사 활성화제-유사 이펙터 (TALE)는 HLA 또는 TCR 유전자의 부분을 포함하는 임의의 목적하는 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 TALE를 DNA 절단 도메인과 조합함으로써, HLA 또는 TCR 서열을 포함하는 임의의 목적하는 DNA 서열에 특이적인 제한 효소가 생산될 수 있다. 이어서, 이들은 세포 내로 도입될 수 있고, 여기서 이들은 게놈 편집을 위해 사용될 수 있다. 문헌 [Boch (2011) Nature Biotech. 29: 135-6; 및 Boch et al. (2009) Science 326: 1509-12; Moscou et al. (2009) Science 326: 3501].
TALE는 크산토모나스(Xanthomonas) 박테리아에 의해 분비되는 단백질이다. DNA 결합 도메인은 제12 및 제13 아미노산을 제외하고, 반복된, 고도로 보존된 33-34개 아미노산 서열을 함유한다. 이들 2개의 위치는 매우 가변적이고, 이것은 특정 뉴클레오티드 인식과의 강한 상관관계를 보여준다. 따라서, 이들은 목적하는 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다.
TALEN을 생산하기 위해, TALE 단백질은 야생형 또는 돌연변이된 FokI 엔도뉴클레아제인 뉴클레아제 (N)에 융합된다. TALEN에서의 사용을 위해 FokI에 대한 여러 돌연변이가 이루어진 바 있고; 이들은 예를 들어 절단 특이성 또는 활성을 개선시킨다. 문헌 [Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734; Wood et al. (2011) Science 333: 307; Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793; 및 Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96].
FokI 도메인은 이량체로서 기능하고, 적절한 배향 및 간격으로 표적 게놈 내의 부위에 대해 특유한 DNA 결합 도메인을 갖는 2개의 구축물을 필요로 한다. TALE DNA 결합 도메인과 FokI 절단 도메인 사이의 아미노산 잔기의 수 및 2개의 개별 TALEN 결합 부위 사이의 염기의 수 둘 다는 높은 활성 수준의 달성을 위해 중요한 파라미터인 것으로 보인다. 문헌 [Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8].
HLA 또는 TCR TALEN은 이중-가닥 파괴 (DSB)를 생성하기 위해 세포 내에서 사용될 수 있다. 돌연변이는 복구 메카니즘이 비-상동 말단 연결을 통해 파괴를 부적절하게 복구하는 경우에 파괴 부위에 도입될 수 있다. 예를 들어, 부적절한 복구는 프레임 시프트 돌연변이를 도입할 수 있다. 대안적으로, 외래 DNA가 TALEN과 함께 세포 내로 도입될 수 있고; 외래 DNA의 서열 및 염색체 서열에 따라, 이러한 과정은 HLA 또는 TCR 유전자 내의 결함을 교정하거나 또는 이러한 결함을 wt HLA 또는 TCR 유전자 내에 도입하여 HLA 또는 TCR의 발현을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
HLA 또는 TCR 내의 서열에 특이적인 TALEN은 모듈 성분을 사용하는 다양한 방식을 비롯하여 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 구축될 수 있다. 문헌 [Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29: 149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: e19509].
HLA 및/또는 TCR을 억제하는 아연 핑거 뉴클레아제
"ZFN" 또는 "아연 핑거 뉴클레아제" 또는 "HLA 및/또는 TCR에 대한 ZFN" 또는 "HLA 및/또는 TCR을 억제하는 ZFN"은 HLA 및/또는 TCR 유전자, 및/또는 본원에 기재된 억제 분자 (예를 들어, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR 베타)를 편집하기 위해 사용될 수 있는 인공 뉴클레아제인 아연 핑거 뉴클레아제를 지칭한다.
TALEN처럼, ZFN은 DNA-결합 도메인에 융합된 FokI 뉴클레아제 도메인 (또는 그의 유도체)을 포함한다. ZFN의 경우에, DNA-결합 도메인은 1개 이상의 아연 핑거를 포함한다. 문헌 [Carroll et al. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782; 및 Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160].
아연 핑거는 1개 이상의 아연 이온에 의해 안정화된 작은 단백질 구조 모티프이다. 아연 핑거는 예를 들어 Cys2His2를 포함할 수 있고, 대략 3-bp 서열을 인식할 수 있다. 공지된 특이성의 다양한 아연 핑거를 조합하여 약 6, 9, 12, 15 또는 18-bp 서열을 인식하는 다중-핑거 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 파지 디스플레이, 효모 1-하이브리드 시스템, 박테리아 1-하이브리드 및 2-하이브리드 시스템, 및 포유동물 세포를 비롯하여, 특정 서열을 인식하는 아연 핑거 (및 그의 조합)를 생성하기 위한 다양한 선택 및 모듈 어셈블리 기술이 이용가능하다.
TALEN처럼, ZFN은 DNA를 절단하기 위해 이량체화되어야 한다. 따라서, 한 쌍의 ZFN이 비-회문식 DNA 부위를 표적화하기 위해 필요하다. 2개의 개별 ZFN은 DNA의 대향하는 가닥에 결합해야 하고, 그의 뉴클레아제는 적절하게 이격된다. 문헌 [Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-5].
또한, TALEN처럼, ZFN은 DNA에 이중-가닥 파괴를 생성할 수 있고, 이것은 부적절하게 복구되는 경우에 프레임-시프트 돌연변이를 생성할 수 있고, 이는 세포 내 HLA 및/또는 TCR의 발현 및 양의 감소로 이어질 수 있다. ZFN은 또한 HLA 또는 TCR 유전자를 돌연변이시키기 위해 상동 재조합과 함께 사용될 수 있다.
HLA 및/또는 TCR 내의 서열에 특이적인 ZFN은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 구축될 수 있다. 문헌 [Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16: 1200-7; Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400: 96]; 미국 특허 공개 2011/0158957; 및 미국 특허 공개 2012/0060230을 참조한다.
텔로머라제 발현
어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 일부 실시양태에서, 치료 T 세포는 T 세포의 단축된 텔로미어로 인해 환자에서 단기 지속성을 갖고; 따라서, 텔로머라제 유전자에 의한 형질감염은 T 세포의 텔로미어를 늘이고 환자에서의 T 세포의 지속성을 개선시킬 수 있다. 문헌 [Carl June, "Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic", Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007)]을 참조한다. 따라서, 한 실시양태에서, 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포는 텔로머라제 서브유닛, 예를 들어 텔로머라제의 촉매 서브유닛, 예를 들어 TERT, 예를 들어 hTERT를 이소적으로 발현한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 세포를 텔로머라제 서브유닛, 예를 들어 텔로머라제의 촉매 서브유닛, 예를 들어 TERT, 예를 들어 hTERT를 코딩하는 핵산과 접촉시키는 것을 포함하는, CAR-발현 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 세포는 CAR을 코딩하는 구축물과의 접촉 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 핵산과 접촉될 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)의 집단을 제조하는 방법을 특색으로 한다. 한 실시양태에서, 방법은 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포)의 집단을 제공하는 단계, 면역 이펙터 세포의 집단을 CAR을 코딩하는 핵산과 접촉시키는 단계; 및 CAR 및 텔로머라제 발현을 가능하게 하는 조건 하에, 면역 이펙터 세포의 집단을 텔로머라제 서브유닛, 예를 들어 hTERT를 코딩하는 핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 텔로머라제 서브유닛을 코딩하는 핵산은 DNA이다. 한 실시양태에서, 텔로머라제 서브유닛을 코딩하는 핵산은 텔로머라제 서브유닛의 발현을 구동시킬 수 있는 프로모터를 포함한다.
한 실시양태에서, hTERT는 하기와 같은, 진뱅크 단백질 ID AAC51724.1의 아미노산 서열을 갖는다 (Meyerson et al., "hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization" Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795):
Figure pct00098
한 실시양태에서, hTERT는 서열식별번호: 606의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 갖는다. 한 실시양태에서, hTERT는 서열식별번호: 606의 서열을 갖는다. 한 실시양태에서, hTERT는 N-말단, C-말단, 또는 둘 다에서 결실 (예를 들어, 5, 10, 15, 20, 또는 30개 이하의 아미노산)을 포함한다. 한 실시양태에서, hTERT는 N-말단, C-말단, 또는 둘 다에서 트랜스제닉 아미노산 서열 (예를 들어, 5, 10, 15, 20, 또는 30개 이하의 아미노산)을 포함한다.
한 실시양태에서, hTERT는 진뱅크 수탁 번호 AF018167의 핵산 서열에 의해 코딩된다 (Meyerson et al., "hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization" Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795):
Figure pct00099
Figure pct00100
Figure pct00101
한 실시양태에서, hTERT는 서열식별번호: 607의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 갖는 핵산에 의해 코딩된다. 한 실시양태에서, hTERT는 서열식별번호: 607의 핵산에 의해 코딩된다.
세포의 활성화 및 확장
세포는 일반적으로 예를 들어 미국 특허 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 및 미국 특허 출원 공개 번호 20060121005에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 활성화 및 확장될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 T 세포는 CD3/TCR 복합체 연관 신호를 자극하는 작용제 및 T 세포의 표면 상의 공동자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 확장될 수 있다. 특히, T 세포 집단은 본원에 기재된 바와 같이, 예컨대 표면에 고정된 항-CD3 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이오노포어와 함께 단백질 키나제 C 활성화제 (예를 들어, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상의 보조 분자의 공동-자극을 위해, 보조 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포의 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건 하에 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체가 사용될 수 있다. 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3, XR-CD28 (디아클론(Diaclone), 프랑스 브장송)을 포함하고, 관련 기술분야에 통상적으로 공지된 다른 방법이 사용될 수 있다 (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
특정 측면에서, T 세포에 대한 1차 자극 신호 및 공동자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 각각의 신호를 제공하는 작용제는 용액 중에 존재하거나 표면에 커플링될 수 있다. 표면에 커플링되는 경우에, 작용제는 동일한 표면 (즉, "시스" 형태) 또는 개별 표면 (즉, "트랜스" 형태)에 커플링될 수 있다. 대안적으로, 한 작용제는 표면에 커플링되고 다른 작용제는 용액 중에 존재할 수 있다. 한 측면에서, 공동자극 신호를 제공하는 작용제는 세포 표면에 결합되고, 1차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 용액 중에 존재하거나 표면에 커플링된다. 특정 측면에서, 둘 다의 작용제는 용액 중에 존재할 수 있다. 한 측면에서, 작용제는 가용성 형태로 존재한 후, 표면, 예컨대 Fc 수용체 또는 항체 또는 다른 결합제를 발현하는 세포에 가교될 수 있고, 이것이 작용제에 결합할 것이다. 이와 관련하여, 본 발명에서 T 세포를 활성화 및 확장하는데 사용하기 위해 고려되는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)에 대한, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 20040101519 및 20060034810을 참조한다.
한 측면에서, 2종의 작용제는 동일한 비드, 즉 "시스" 또는 개별 비드, 즉 "트랜스"의 비드 상에 고정된다. 예로서, 1차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 항-CD3 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고, 공동자극 신호를 제공하는 작용제는 항-CD28 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며; 둘 다의 작용제는 동일한 비드에 동등한 분자량으로 공동-고정된다. 한 측면에서, CD4+ T 세포 확장 및 T 세포 성장을 위해 1:1 비의 비드에 결합된 각각의 항체가 사용된다. 본 발명의 특정 측면에서, 비드에 결합된 항 CD3:CD28 항체의 비는 1:1의 비를 사용하여 관찰된 확장과 비교하여 T 세포 확장의 증가가 관찰되도록 사용된다. 하나의 특정한 측면에서, 1:1의 비를 사용하여 관찰된 확장과 비교하여 약 1 내지 약 3배의 증가가 관찰된다. 한 측면에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 비는 100:1 내지 1:100 및 그 사이의 모든 정수 값의 범위이다. 본 발명의 한 측면에서, 항-CD3 항체보다 많은 항-CD28 항체가 입자에 결합되고, 즉 CD3:CD28의 비는 1 미만이다. 본 발명의 특정 측면에서, 비드에 결합된 항 CD28 항체 대 항 CD3 항체의 비는 2:1보다 크다. 하나의 특정한 측면에서, 비드에 결합된 항체의 1:100 CD3:CD28 비가 사용된다. 한 측면에서, 비드에 결합된 항체의 1:75 CD3:CD28 비가 사용된다. 추가 측면에서, 비드에 결합된 항체의 1:50 CD3:CD28 비가 사용된다. 한 측면에서, 비드에 결합된 항체의 1:30 CD3:CD28 비가 사용된다. 한 바람직한 측면에서, 비드에 결합된 항체의 1:10 CD3:CD28 비가 사용된다. 한 측면에서, 비드에 결합된 항체의 1:3 CD3:CD28 비가 사용된다. 한 측면에서, 비드에 결합된 항체의 3:1 CD3:CD28 비가 사용된다.
1:500 내지 500:1 및 그 사이의 임의의 정수 값의 입자 대 세포의 비가 T 세포 또는 다른 표적 세포를 자극하기 위해 사용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 인식할 수 있는 바와 같이, 입자 대 세포의 비는 표적 세포에 대한 입자 크기에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 작은 크기의 비드는 소수의 세포에만 결합할 수 있지만, 보다 큰 비드는 많은 세포에 결합할 수 있다. 특정 측면에서, 세포 대 입자의 비는 1:100 내지 100:1 및 그 사이의 임의의 정수 값의 범위이고, 추가의 측면에서 비는 1:9 내지 9:1 및 그 사이의 임의의 정수 값을 포함하고, 이는 또한 T 세포를 자극하기 위해 사용될 수 있다. T 세포 자극을 발생시키는 항-CD3- 및 항-CD28-커플링된 입자 대 T 세포의 비는 상기 언급된 바와 같이 달라질 수 있지만, 특정의 바람직한 값은 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 및 15:1을 포함하고, 하나의 바람직한 비는 T 세포 당 적어도 1:1 입자이다. 한 측면에서, 1:1 이하의 입자 대 세포의 비가 사용된다. 하나의 특정한 측면에서, 바람직한 입자: 세포 비는 1:5이다. 추가의 측면에서, 입자 대 세포의 비는 자극 일에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 한 측면에서, 입자 대 세포의 비는 제1일에 1:1 내지 10:1이고, 추가의 입자는 이후에 10일까지 매일 또는 격일로, 1:1 내지 1:10의 최종 비 (첨가 일의 세포 수 기준)로 세포에 첨가된다. 하나의 특정한 측면에서, 입자 대 세포의 비는 자극 제1일에 1:1이고, 자극 제3일 및 제5일에 1:5로 조정된다. 한 측면에서, 입자는 매일 또는 격일 기준으로 자극의 제1일에 1:1, 제3일 및 제5일에 1:5의 최종 비로 첨가된다. 한 측면에서, 입자 대 세포의 비는 자극 제1일에 2:1이고, 자극 제3일 및 제5일에 1:10으로 조정된다. 한 측면에서, 입자는 매일 또는 격일 기준으로 자극의 제1일에 1:1, 제3일 및 제5일에 1:10의 최종 비로 첨가된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다양한 다른 비가 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있음을 이해할 것이다. 특히, 비는 입자 크기 및 세포 크기 및 종류에 따라 달라질 것이다. 한 측면에서, 사용하기에 가장 일반적인 비는 제1일에 대략 1:1, 2:1 및 3:1이다.
본 발명의 추가 측면에서, 세포, 예컨대 T 세포는 작용제-코팅된 비드와 조합되고, 비드 및 세포를 후속적으로 분리한 후, 세포를 배양한다. 다른 측면에서, 배양 전에, 작용제-코팅된 비드 및 세포를 분리하지 않고, 함께 배양한다. 추가의 측면에서, 비드 및 세포는 먼저 힘, 예컨대 자력을 인가하여 농축함으로써, 세포 표면 마커의 라이게이션을 증가시켜 세포 자극을 유도한다.
예를 들어, 세포 표면 단백질은 항-CD3 및 항-CD28이 부착되는 상자성 비드 (3x28 비드)가 T 세포에 결합하도록 함으로써 라이게이션될 수 있다. 한 측면에서, 세포 (예를 들어, 104 내지 109개 T 세포) 및 비드 (예를 들어, 1:1 비의 디나비즈® M-450 CD3/CD28 T 상자성 비드)를 완충제, 예를 들어 PBS (2가 양이온, 예컨대, 칼슘 및 마그네슘 미함유) 내에 조합한다. 다시, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 임의의 세포 농도가 사용될 수 있음을 쉽게 이해할 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 샘플에 매우 드물 수 있고, 단지 샘플의 0.01%만을 이루거나 또는 전체 샘플 (즉, 100%)이 관심 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포 수가 본 발명의 측면에 포함된다. 특정 측면에서, 세포 및 입자의 최대 접촉을 보장하기 위해 입자 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 유의하게 감소시키는 (즉, 세포의 농도를 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 한 측면에서, 약 100억개 세포/ml, 90억개/ml, 80억개/ml, 70억개/ml, 60억개/ml, 50억개/ml, 또는 20억개 세포/ml의 농도가 사용된다. 한 측면에서, 1억개 세포/ml 초과의 농도가 사용된다. 추가의 측면에서, 1천만, 1천5백만, 2천만, 2천5백만, 3천만, 3천5백만, 4천만, 4천5백만, 또는 5천만개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가의 한 측면에서 7천5백만, 8천만, 8천5백만, 9천만, 9천5백만, 또는 1억개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가의 측면에서, 1억2천5백만 또는 1억5천만개 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다. 높은 농도의 사용은 증가된 세포 수율, 세포 활성화, 및 세포 확장을 발생시킬 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포, 예컨대 CD28-음성 T 세포의 보다 효율적인 포획을 가능하게 한다. 이러한 세포의 집단은 치료 가치를 가질 수 있고, 특정 측면에서 수득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 높은 농도의 세포를 사용하면, 정상적으로는 보다 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포를 보다 효율적으로 선택하는 것이 가능하다.
한 실시양태에서, CAR, 예를 들어, 본원에 기재된 CAR을 코딩하는 핵산으로 형질도입된 세포는, 예를 들어 본원에 기재된 방법에 의해 확장된다. 한 실시양태에서, 세포는 배양 중 수시간 (예를 들어, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18, 21시간) 내지 약 14일 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일)의 기간 동안 확장된다. 한 실시양태에서, 세포는 4 내지 9일의 기간 동안 확장된다. 한 실시양태에서, 세포는 8일 이하, 예를 들어 7, 6 또는 5일의 기간 동안 확장된다. 한 실시양태에서, 세포, 예를 들어 본원에 기재된 CD123 CAR 세포는 배양 중 5일 동안 확장되고, 생성된 세포는 동일한 배양 조건 하에 배양 중 9일 동안 확장된 동일한 세포보다 더 강력하다. 효력은, 예를 들어 다양한 T 세포 기능, 예를 들어 증식, 표적 세포 사멸, 시토카인 생산, 활성화, 이동, 또는 그의 조합에 의해 규정될 수 있다. 한 실시양태에서, 5일 동안 확장된 세포, 예를 들어 본원에 기재된 CD123 CAR 세포는 동일한 배양 조건 하에 배양 중 9일 동안 확장된 동일한 세포와 비교하여 항원 자극 시 세포 배가에서 적어도 1, 2, 3 또는 4배 증가를 보인다. 한 실시양태에서, 세포, 예를 들어 본원에 기재된 CD123 CAR을 발현하는 세포는 배양 중 5일 동안 확장되고, 생성된 세포는 동일한 배양 조건 하에 배양 중 9일 동안 확장된 동일한 세포와 비교하여 보다 높은 염증유발 시토카인 생산, 예를 들어 IFN-γ 및/또는 GM-CSF 수준을 나타낸다. 한 실시양태에서, 5일 동안 확장된 세포, 예를 들어 본원에 기재된 CD123 CAR 세포는 동일한 배양 조건 하에 배양 중 9일 동안 확장된 동일한 세포와 비교하여 pg/ml 단위의 염증유발 시토카인 생산, 예를 들어 IFN-γ 및/또는 GM-CSF 수준에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10배 또는 그 초과의 증가를 보인다.
본 발명의 한 측면에서, 혼합물은 수시간 (약 3시간) 내지 약 14일 또는 그 사이의 임의의 시간상 정수 값 동안 배양될 수 있다. 한 측면에서, 혼합물은 21일 동안 배양될 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 비드 및 T 세포는 함께 약 8일 동안 배양된다. 한 측면에서, 비드 및 T 세포는 함께 2-3일 동안 배양된다. 또한, T 세포의 배양 시간이 60일 이상이 될 수 있도록 여러 사이클의 자극이 바람직할 수 있다. T 세포 배양을 위해 적절한 조건은 혈청 (예를 들어, 소 태아 또는 인간 혈청), 인터류킨-2 (IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ, 및 TNF-α 또는 통상의 기술자에게 공지된 세포의 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함하는 증식 및 생존에 필요한 인자를 포함할 수 있는 적절한 배지 (예를 들어, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는, 엑스-비보(X-vivo) 15 (론자(Lonza)))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가제는 계면활성제, 플라스마네이트, 및 환원제, 예컨대 N-아세틸-시스테인 및 2-메르캅토에탄올을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 배지는 혈청-비함유 또는 적절한 양의 혈청 (또는 혈장) 또는 규정된 세트의 호르몬으로 보충된 아미노산, 피루브산나트륨, 및 비타민, 및/또는 T 세포의 성장 및 확장을 위해 충분한 양의 시토카인(들)과 함께 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, 엑스-비보 15, 및 엑스-비보 20, 최적화제를 포함할 수 있다. 항생제, 예를 들어 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험적 배양에만 포함되고, 대상체 내에 주입되어야 하는 세포의 배양물에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 지지하기 위해 필요한 조건, 예를 들어 적절한 온도 (예를 들어, 37℃) 및 분위기 (예를 들어, 공기 플러스 5% CO2) 하에 유지된다.
한 실시양태에서, 세포는, 예를 들어 본원에 기재된 방법, 예컨대 유동 세포측정법에 의해 측정 시 14일 확장 기간에 걸쳐 세포의 적어도 200-배 (예를 들어, 200-배, 250-배, 300-배, 350-배) 증가를 발생시키는, 1종 이상의 인터류킨을 포함하는 적절한 배지 (예를 들어, 본원에 기재된 배지 중에서 확장된다. 한 실시양태에서, 세포는 IL-15 및/또는 IL-7 (예를 들어, IL-15 및 IL-7)의 존재 하에 확장된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 방법, 예를 들어 CAR-발현 세포 제조 방법은, 예를 들어 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 또는 CD25-결합 리간드, IL-2를 사용하여 세포 집단으로부터 T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ T 세포를 제거하는 것을 포함한다. 세포 집단으로부터 T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ T 세포를 제거하는 방법은 본원에 기재되어 있다. 실시양태에서, 방법, 예를 들어 제조 방법은 세포 집단 (예를 들어, T 조절 세포, 예컨대 CD25+ T 세포가 고갈된 세포 집단; 또는 항-CD25 항체, 그의 단편, 또는 CD25-결합 리간드와 이전에 접촉시킨 세포 집단)을 IL-15 및/또는 IL-7과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 세포 집단 (예를 들어, 항-CD25 항체, 그의 단편, 또는 CD25-결합 리간드와 이전에 접촉시킨 것)은 IL-15 및/또는 IL-7의 존재 하에 확장된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 CAR-발현 세포의 제조 동안 인터류킨-15 (IL-15) 폴리펩티드, 인터류킨-15 수용체 알파 (IL-15Ra) 폴리펩티드, 또는 IL-15 폴리펩티드 및 IL-15Ra 폴리펩티드, 예를 들어 hetIL-15 둘 다의 조합을 포함하는 조성물과, 예를 들어 생체외에서 접촉된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 CAR-발현 세포의 제조 동안 IL-15 폴리펩티드를 포함하는 조성물과, 예를 들어 생체외에서 접촉된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 CAR-발현 세포의 제조 동안 IL-15 폴리펩티드 및 IL-15 Ra 폴리펩티드 둘 다의 조합을 포함하는 조성물과, 예를 들어 생체외에서 접촉된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 CAR-발현 세포의 제조 동안 hetIL-15를 포함하는 조성물과, 예를 들어 생체외에서 접촉된다.
한 실시양태에서 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 생체외 확장 동안 hetIL-15를 포함하는 조성물과 접촉된다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 생체외 확장 동안 IL-15 폴리펩티드를 포함하는 조성물과 접촉된다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 생체외 확장 동안 IL-15 폴리펩티드 및 IL-15Ra 폴리펩티드 둘 다를 포함하는 조성물과 접촉된다. 한 실시양태에서, 접촉은 림프구 하위집단, 예를 들어 CD8+ T 세포의 생존 및 증식을 발생시킨다.
상이한 자극 횟수에 노출된 T 세포는 상이한 특징을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 전형적인 혈액 또는 분리반출술을 거친 말초 혈액 단핵 세포 생성물은 세포독성 또는 억제자 T 세포 집단 (TC, CD8+)보다 큰 헬퍼 T 세포 집단 (TH, CD4+)을 갖는다. CD3 및 CD28 수용체를 자극하는 것에 의한 T 세포의 생체외 확장은 T 세포의 집단을 생산하고, 이는 약 8-9일 전에는 주로 TH 세포로 이루어지는 반면에, 약 8-9일 후 T 세포의 집단은 점점 더 큰 TC 세포의 집단을 포함한다. 따라서, 치료의 목적에 따라, 대상체에게 주로 TH 세포를 포함하는 T 세포 집단을 주입하는 것이 유리할 수 있다. 유사하게, TC 세포의 항원-특이적 하위세트가 단리되면, 이 하위세트를 더 큰 정도로 확장시키는 것이 유익할 수 있다.
추가로, CD4 및 CD8 마커에 더하여, 다른 표현형 마커는 세포 확장 과정 동안 유의하게, 그러나 대부분 재현가능하게 상이하다. 따라서, 그러한 재현가능성 때문에, 특정 목적을 위해 활성화된 T 세포 생성물을 적합하게 조정할 수 있다.
CD123 CAR이 구축되면, 다양한 검정을 사용하여 분자의 활성, 예컨대 비제한적으로 항원 자극 후에 T 세포를 확장시키는 능력, 재자극의 부재 하에 T 세포 확장을 지속시키는 능력, 및 적절한 시험관내 및 동물 모델에서의 항암 활성을 평가할 수 있다. CD123 CAR의 효과를 평가하기 위한 검정이 하기에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
1차 T 세포에서 CAR 발현의 웨스턴 블롯 분석은 단량체 및 이량체의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참조한다. 아주 간략하게, CAR을 발현하는 T 세포 (CD4+ 및 CD8+ T 세포의 1:1 혼합물)를 10일 초과 동안 시험관내에서 확장시킨 후, 용해 및 환원 조건 하의 SDS-PAGE를 수행한다. 전장 TCR-ζ 세포질 도메인 및 내인성 TCR-ζ 쇄를 포함하는 CAR은 TCR-ζ 쇄에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출된다. 동일한 T 세포 하위세트는 공유 이량체 형성의 평가를 허용하는 비-환원 조건 하의 SDS-PAGE 분석을 위해 사용된다.
항원 자극 후에 CAR+ T 세포의 시험관내 확장은 유동 세포측정법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물을 αCD3/αCD28 aAPC로 자극한 후, 분석할 프로모터의 제어 하에 GFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입한다. 예시적인 프로모터는 CMV IE 유전자, EF-1α, 유비퀴틴 C, 또는 포스포글리세로키나제 (PGK) 프로모터를 포함한다. GFP 형광은 유동 세포측정법에 의해 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 하위세트에서 배양 제6일에 평가된다. 예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참조한다. 대안적으로, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물을 제0일에 αCD3/αCD28 코팅된 자기 비드로 자극하고, 2A 리보솜 스키핑 서열을 사용하여 eGFP와 함께 CAR을 발현하는 비시스트론 렌티바이러스 벡터를 사용하여 제1일에 CAR로 형질도입한다. 배양물을 세척 후에 항-CD3 및 항-CD28 항체 (K562-BBL-3/28)의 존재 하에 CD19+ K562 세포 (K562-CD19), 야생형 K562 세포 (K562 야생형) 또는 hCD32 및 4-1BBL을 발현하는 K562 세포로 재자극한다. 외인성 IL-2를 배양물에 격일로 100 IU/ml로 첨가한다. GFP+ T 세포를 비드-기반 카운팅을 사용하여 유동 세포측정법에 의해 카운팅한다. 예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참조한다. 항-CD123 T 세포를 사용하거나 (예를 들어, 문헌 [Gill et al. Blood 2014;123:2343] 참조) 또는 항-CD123 CAR T 세포에 의해 유사한 검정을 수행할 수 있다.
재자극의 부재 하에 지속되는 CAR+ T 세포 확장을 또한 측정할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참조한다. 간략하게, 평균 T 세포 부피 (fl)는 제0일에 αCD3/αCD28 코팅된 자기 비드를 사용한 자극, 및 제1일에 나타낸 CAR을 사용한 형질도입 후에 쿨터 멀티사이저 III(Coulter Multisizer III) 입자 계수기, 넥셀롬 셀로미터 비전(Nexcelom Cellometer Vision) 또는 밀리포어 셉터(Millipore Scepter)를 사용하여 배양 제8일에 측정한다.
CART 활성을 측정하기 위해 동물 모델을 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 면역결핍 마우스에서 원발성 인간 프리-B ALL을 치료하기 위해 인간 CD19-특이적 CAR+ T 세포를 사용하는 이종이식편 모델을 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참조한다. 매우 간략하게, ALL의 확립 후에, 마우스를 처리군으로 무작위화하였다. 상이한 수의 αCD19-ζ 및 αCD19-BB-ζ 조작된 T 세포를 1:1 비로 B-ALL를 보유하는 NOD-SCID-γ-/- 마우스 내에 공동주사한다. 마우스로부터의 비장 DNA 내의 αCD19-ζ 및 αCD19-BB-ζ 벡터의 카피수를 T 세포 주사 후에 다양한 시간에 평가한다. 동물을 백혈병에 대해 매주 간격으로 평가한다. 말초 혈액 CD19+ B-ALL 모세포 카운트를 αCD19-ζ CAR+ T 세포 또는 모의-형질도입된 T 세포를 주사한 마우스에서 측정한다. 군에 대한 생존 곡선을 로그 순위 검정을 사용하여 비교한다. 또한, NOD-SCID-γ-/- 마우스에서 T 세포 주사 4주 후에 절대 말초 혈액 CD4+ 및 CD8+ T 세포 카운트를 또한 분석할 수 있다. 마우스에게 백혈병성 세포를 주사하고, 3주 후에 eGFP에 연결된 CAR을 코딩하는 비시스트론 렌티바이러스 벡터에 의해 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포를 주사한다. T 세포를 주사 전에 모의-형질도입된 세포와 혼합함으로써 45-50% 투입 GFP+ T 세포로 정규화하고, 유동 세포측정법에 의해 확인한다. 1-주 간격으로 백혈병에 대해 동물을 평가한다. CAR+ T 세포군에 대한 생존 곡선을 로그 순위 검정을 사용하여 비교한다. CD123 CART를 사용하여 유사한 실험을 행할 수 있다.
용량 의존성 CAR 치료 반응을 평가할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참조한다. 예를 들어, 제21일에 CAR T 세포, 동등한 수의 모의-형질도입된 T 세포를 주입하거나 또는 T 세포를 주입하지 않은 마우스에서 백혈병 확립 35-70일 후에 말초 혈액을 수득한다. 각각의 군으로부터의 마우스를 말초 혈액 CD19+ ALL 모세포 카운트의 결정을 위해 무작위로 채혈한 후, 제35일 및 제49일에 치사시킨다. 남아있는 동물을 제57일 및 제70일에 평가한다. CD123 CART를 사용하여 유사한 실험을 행할 수 있다.
세포 증식 및 시토카인 생산의 평가는 예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]에 이전에 기재된 바 있다. 간략하게, CAR-매개 증식의 평가는 세척된 T 세포를 CD19 (K19) 또는 CD32 및 CD137 (KT32-BBL)을 발현하는 K562 세포와 2:1의 최종 T-세포:K562 비로 혼합함으로써 마이크로타이터 플레이트에서 수행된다. K562 세포는 사용 전 감마-방사선으로 방사선조사된다. 항-CD3 (클론 OKT3) 및 항-CD28 (클론 9.3) 모노클로날 항체를 배양물에 첨가하고, KT32-BBL 세포는 T-세포 증식을 자극하기 위한 양성 대조군으로 기능하고, 이것은 이들 신호가 생체외에서 장기간 CD8+ T 세포 확장을 지지하기 때문이다. T 세포는 제조업체에 의해 기재된 바와 같이 카운트브라이트(CountBright)™ 형광 비드 (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스바드) 및 유동 세포측정법을 사용하여 배양물에서 열거된다. CAR+ T 세포는 eGFP-2A 연결된 CAR-발현 렌티바이러스 벡터로 조작된 T 세포를 사용한 GFP 발현에 의해 확인된다. GFP를 발현하지 않는 CAR+ T 세포에 대해, CAR+ T 세포는 비오티닐화 재조합 CD123 단백질 및 2차 아비딘-PE 접합체로 검출된다. T 세포 상의 CD4+ 및 CD8+ 발현은 또한 특이적 모노클로날 항체 (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))로 동시에 검출된다. 시토카인 측정은 제조업체의 지침에 따라 인간 TH1/TH2 시토카인 세포측정 비드 어레이 키트 (비디 바이오사이언시스, 캘리포니아주 샌 디에고)를 사용하여 또는 루미넥스 30-플렉스 키트 (인비트로젠)을 사용하여 재자극 24시간 후에 수집된 상청액에 대해 수행된다. 형광을 비디 포르테사(BD Fortessa) 유동 세포측정기를 사용하여 평가하고, 데이터를 제조업체의 지침에 따라 분석한다. CD123 CART를 사용하여 유사한 실험을 행할 수 있다.
세포독성은 표준 51Cr-방출 검정에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참조한다. 간략하게, 표적 세포 (K562 세포주 및 원발성 프로-B-ALL 세포)를 37℃에서 2시간 동안 빈번하게 교반하면서 51Cr (NaCrO4로서, 뉴 잉글랜드 뉴클리어(New England Nuclear), 매사추세츠주 보스턴)을 로딩하고, 완전 RPMI 내에 2회 세척하고, 마이크로타이터 플레이트 내로 플레이팅한다. 이펙터 T 세포를 웰 내에서 완전 RPMI 내에서 표적 세포와, 이펙터 세포:표적 세포 (E:T)의 다양한 비로 혼합한다. 배지만 함유하는 (자발적 방출, SR) 또는 트리톤-X 100 세제의 1% 용액 (총 방출, TR)을 함유하는 추가의 웰을 또한 제조한다. 37℃에서 4시간 인큐베이션한 후, 각각의 웰로부터 상청액을 수거한다. 이어서, 방출된 51Cr을 감마 입자 계수기 (팩커드 인스트루먼트 코포레이션(Packard Instrument Co.), 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 측정한다. 각각의 조건은 적어도 삼중으로 수행되고, 용해 백분율은 하기 식을 사용하여 계산된다: % 용해 = (ER - SR)/(TR - SR) (여기서, ER은 각각의 실험 조건의 경우에 방출된 평균 51Cr을 나타낸다).
영상화 기술이 종양-보유 동물 모델에서 CAR의 특이적 트래픽킹 및 증식을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 검정은 예를 들어 문헌 [Barrett et al., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011)]에 기재되어 있다. 간략하게, NOD/SCID/γc-/- (NSG) 마우스에게 Nalm-6 세포를 IV 주사하고, 7일 후에 CAR 구축물을 사용한 전기천공 4시간 후에 T 세포를 주사한다. T 세포를 반딧불이 루시페라제를 발현하도록 렌티바이러스 구축물로 안정하게 형질감염시키고, 마우스를 생체발광에 대해 영상화한다. 대안적으로, Nalm-6 이종이식편 모델에서 CAR+ T 세포의 단일 주사의 치료 효능 및 특이성은 다음과 같이 측정할 수 있다: NSG 마우스에게 반딧불이 루시페라제를 안정하게 발현하도록 형질도입된 Nalm-6을 주사한 후, 7일 후에 CD123 CAR로 전기천공된 T 세포를 단일 꼬리-정맥 주사한다. 동물을 주사 후 다양한 시점에서 영상화한다. 예를 들어, 제5일 (치료 2일 전) 및 제8일 (CAR+ PBL 24시간 후)에 대표적인 마우스에서 반딧불이 루시페라제 양성 백혈병의 광자-밀도 열 지도를 생성할 수 있다. 본원의 실시예 섹션에서 기재된 것들 및 관련 기술분야에 공지된 것을 포함하는 다른 검정이 또한 본 발명의 CD123 CAR 구축물을 평가하는데 사용될 수 있다.
대안적으로, 또는 본원에 개시된 방법과 조합하여, CAR-발현 세포의 검출 및/또는 정량화 (예를 들어, 시험관내 또는 생체내 (예를 들어, 임상 모니터링)); 면역 세포 확장 및/또는 활성화; 및/또는 CAR 리간드의 사용을 수반하는 CAR-특이적 선택 중 하나 이상을 위한 방법 및 조성물이 개시된다. 하나의 예시적 실시양태에서, CAR 리간드는 CAR 분자에 결합하는, 예를 들어 CAR의 세포외 항원 결합 도메인에 결합하는 항체 (예를 들어, 항원 결합 도메인에 결합하는 항체, 예를 들어 항-이디오타입 항체; 또는 세포외 결합 도메인의 불변 영역에 결합하는 항체)이다. 다른 실시양태에서, CAR 리간드는 CAR 항원 분자 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 CAR 항원 분자)이다.
한 측면에서, CAR-발현 세포를 검출 및/또는 정량화하는 방법이 개시된다. 예를 들어, CAR 리간드는 시험관내 또는 생체내에서 CAR-발현 세포를 검출 및/또는 정량화하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 환자에서 CAR-발현 세포의 임상 모니터링, 또는 환자에의 투여). 방법은 하기를 포함한다:
CAR 리간드 (임의로, 표지화 CAR 리간드, 예를 들어 태그, 비드, 방사성 또는 형광 표지를 포함하는 CAR 리간드)를 제공하는 단계;
CAR-발현 세포를 획득하는 단계 (예를 들어, CAR-발현 세포를 함유하는 샘플, 예컨대 제조 샘플 또는 임상 샘플을 획득하는 단계);
CAR-발현 세포를 CAR 리간드와 결합이 일어나는 조건 하에 접촉시켜, 존재하는 CAR-발현 세포의 수준 (예를 들어, 양)을 검출하는 단계. CAR-발현 세포와 CAR 리간드의 결합은 FACS, ELISA 등과 같은 표준 기술을 사용하여 검출될 수 있다.
또 다른 측면에서, 세포 (예를 들어, 면역 이펙터 세포)를 확장 및/또는 활성화하는 방법이 개시된다. 방법은 하기를 포함한다:
CAR-발현 세포 (예를 들어, 제1 CAR-발현 세포 또는 일시적 발현 CAR 세포)를 제공하는 단계;
상기 CAR-발현 세포를 CAR 리간드, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 CAR 리간드와 면역 세포 확장 및/또는 증식이 일어나는 조건 하에 접촉시켜, 활성화 및/또는 확장된 세포 집단을 생산하는 단계.
특정 실시양태에서, CAR 리간드가 존재한다 (예를 들어, 기질, 예를 들어 비-자연 발생 기질에 고정되거나 부착됨). 일부 실시양태에서, 기질은 비-세포 기질이다. 비-세포 기질은 플레이트 (예를 들어, 마이크로타이터 플레이트), 막 (예를 들어, 니트로셀룰로스 막), 매트릭스, 칩 또는 비드로부터 선택된 고체 지지체일 수 있다. 실시양태에서, CAR 리간드는 기질에 (예를 들어, 기질 표면 상에) 존재한다. CAR 리간드는 기질에 공유 또는 비-공유 고정되거나, 부착되거나, 회합된다 (예를 들어 가교된다). 한 실시양태에서, CAR 리간드는 비드에 부착된다 (예를 들어, 공유 부착된다). 상기 실시양태에서, 면역 세포 집단은 시험관내 또는 생체외 확장될 수 있다. 방법은 CAR 분자의 리간드의 존재 하에, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 방법을 사용하여 면역 세포의 집단을 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 세포를 확장 및/또는 활성화하는 방법은 추가로 제2 자극 분자, 예를 들어 CD28의 첨가를 포함한다. 예를 들어, CAR 리간드 및 제2 자극 분자는 기질, 예를 들어 1개 이상의 비드에 고정되어, 증가된 세포 확장 및/또는 활성화를 제공할 수 있다.
또 다른 측면에서, CAR 발현 세포를 선택 또는 풍부화하는 방법이 제공된다. 방법은 CAR 발현 세포를 본원에 기재된 바와 같은 CAR 리간드와 접촉시키는 단계; 및 CAR 리간드의 결합에 기초하여 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, CAR 발현 세포를 고갈, 감소 및/또는 사멸시키는 방법이 제공된다. 방법은 CAR 발현 세포를 본원에 기재된 바와 같은 CAR 리간드와 접촉시키는 단계; 및 CAR 리간드의 결합에 기초하여 세포를 표적화하여, CAR-발현 세포의 수를 감소시키고/거나 그를 사멸시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, CAR 리간드는 독성제 (예를 들어, 독소 또는 세포 제거 약물)에 커플링된다. 또 다른 실시양태에서, 항-이디오타입 항체는 이펙터 세포 활성, 예를 들어 ADCC 또는 ADC 활성을 유발할 수 있다.
본원에 개시된 방법에 사용될 수 있는 예시적인 항-CAR 항체가 예를 들어 WO 2014/190273 및 문헌 [Jena et al., "Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials", PLOS March 2013 8:3 e57838]에 기재되어 있고, 그의 내용은 본원에 참조로 포함된다. 한 실시양태에서, 항-이디오타입 항체 분자는 항-CD19 항체 분자, 예를 들어 항-CD19 scFv를 인식한다. 예를 들어, 항-이디오타입 항체 분자는 문헌 [Jena et al., PLOS March 2013 8:3 e57838]에 기재된 CD19-특이적 CAR mAb 클론 번호 136.20.1과 결합에 대해 경쟁할 수 있거나; CD19-특이적 CAR mAb 클론 번호 136.20.1과 동일한 CDR (예를 들어, 카바트 정의, 코티아 정의, 또는 카바트와 코티아 정의의 조합을 사용하여 VH CDR1, VH CDR2, CH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3 중 1개 이상, 예를 들어 모두)을 가질 수 있거나; CD19-특이적 CAR mAb 클론 번호 136.20.1로서 1개 이상 (예를 들어, 2개)의 가변 영역을 가질 수 있거나, 또는 CD19-특이적 CAR mAb 클론 번호 136.20.1을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-이디오타입 항체는 문헌 [Jena et al.]에 기재된 방법에 따라 제조되었다. 또 다른 실시양태에서, 항-이디오타입 항체 분자는 WO 2014/190273에 기재된 항-이디오타입 항체 분자이다. 일부 실시양태에서, 항-이디오타입 항체 분자는 WO 2014/190273의 항체 분자, 예컨대 136.20.1과 동일한 CDR (예를 들어 VH CDR1, VH CDR2, CH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3 중 1개 이상, 예를 들어 모두)을 갖거나; WO 2014/190273의 항체 분자의 1개 이상 (예를 들어, 2개)의 가변 영역을 가질 수 있거나, 또는 WO 2014/190273의 항체 분자, 예컨대 136.20.1을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 항-CAR 항체는 예를 들어 WO 2014/190273에 기재된 바와 같은 CAR 분자의 세포외 결합 도메인의 불변 영역에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-CAR 항체는 CAR 분자의 세포외 결합 도메인의 불변 영역, 예를 들어 중쇄 불변 영역 (예를 들어, CH2-CH3 힌지 영역) 또는 경쇄 불변 영역에 결합한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 항-CAR 항체는 WO 2014/190273에 기재된 2D3 모노클로날 항체와 결합에 대해 경쟁하거나, 2D3과 동일한 CDR (예를 들어 VH CDR1, VH CDR2, CH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3 중 1개 이상, 예를 들어 모두)을 갖거나, 또는 2D3의 1개 이상 (예를 들어, 2개)의 가변 영역을 갖거나, 또는 WO 2014/190273에 기재된 바와 같은 2D3을 포함한다.
일부 측면 및 실시양태에서, 본원의 조성물 및 방법은, 예를 들어 2014년 7월 31일에 출원된 미국 일련 번호 62/031,699에 기재된 바와 같이 T 세포의 특정 하위세트에 대해 최적화되고, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, T 세포의 최적화된 하위세트는 대조군 T 세포, 예를 들어 동일한 구축물을 발현하는 상이한 유형 (예를 들어, CD8+ 또는 CD4+)의 T 세포와 비교하여 증진된 지속성을 나타낸다.
일부 실시양태에서, CD4+ T 세포는 본원에 기재된 CAR을 포함하며, 상기 CAR은 CD4+ T 세포에 적합한 (예를 들어 그에 최적화된, 예를 들어 증진된 지속성으로 이어지는) 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 ICOS 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8+ T 세포는 본원에 기재된 CAR을 포함하며, 상기 CAR은 CD8+ T 세포에 적합한 (예를 들어 그에 최적화된, 예를 들어 증진된 지속성으로 이어지는) 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 4-1BB 도메인, CD28 도메인, 또는 ICOS 도메인 이외의 또 다른 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR은 본원에 기재된 항원 결합 도메인을 포함한다 (예를 들어, CD123에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR, 예를 들어 표 2 또는 표 6의 CAR).
한 측면에서, 대상체, 예를 들어 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재된다. 방법은 상기 대상체에게 유효량의
1) 항원 결합 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 항원 결합 도메인, 예를 들어 CD123에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인, 예를 들어 표 2, 표 6, 또는 표 9의 항원-결합 도메인;
막횡단 도메인; 및
세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 제1 공동자극 도메인, 예를 들어 ICOS 도메인
을 포함하는 CAR을 포함하는 CD4+ T 세포 (CARCD4 +); 및
2) 항원 결합 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 항원 결합 도메인, 예를 들어 CD123에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인, 예를 들어 표 2, 표 6, 또는 표 9의 항원-결합 도메인;
막횡단 도메인; 및
세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 제2 공동자극 도메인, 예를 들어 4-1BB 도메인, CD28 도메인, 또는 ICOS 도메인 이외의 또 다른 공동자극 도메인
을 포함하는 CAR을 포함하는 CD8+ T 세포 (CARCD8 +)
를 투여하는 것을 포함하며;
여기서 CARCD4 + 및 CARCD8 +는 서로 상이하다.
임의로, 방법은
3) 항원 결합 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 항원 결합 도메인, 예를 들어 CD123에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인, 예를 들어 표 2, 표 6, 또는 표 9의 항원-결합 도메인;
막횡단 도메인; 및
세포내 신호전달 도메인
을 포함하는 CAR을 포함하는 제2 CD8+ T 세포 (제2 CARCD8 +)
를 투여하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 제2 CARCD8 +은 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 CARCD8 + 상에 존재하지 않는 공동자극 신호전달 도메인을 포함하고, 임의로 ICOS 신호전달 도메인은 포함하지 않는다.
치료 용도
CD123 연관 질환 및/또는 장애
본 발명은, 특히, 예를 들어 증식성 질환, 예컨대 암 또는 악성종양 또는 전암성 상태, 예컨대 골수이형성증, 골수이형성 증후군 또는 전백혈병을 비롯한 CD123을 발현하는 세포와 연관된 CD123의 발현과 연관된 질환 또는 상태; 또는 CD123을 발현하는 세포와 연관된 비-암 관련 적응증을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 한 측면에서, CD123의 발현과 연관된 암은 혈액암이다. 한 측면에서, 혈액암은 AML, 골수이형성 증후군, ALL, 만성 골수성 백혈병, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 골수증식성 신생물, 호지킨 림프종 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. CD123의 발현과 연관된 추가의 질환은, 예를 들어 CD123의 발현과 연관된 비정형 및/또는 비-전형적 암, 악성종양, 전암성 상태 또는 증식성 질환을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. CD123의 발현과 연관된 비-암 관련 적응증이 또한 포함될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 CD123 발현과 연관된 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 종양의 일부는 CD123에 대해 음성이고 종양의 일부는 CD123에 대해 양성인 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 CAR은 상승된 CD123의 발현과 연관된 질환의 치료를 거친 대상체를 치료하는데 유용하고, 여기서 상승된 수준의 CD123에 대한 치료를 거친 대상체는 상승된 수준의 CD123과 연관된 질환을 나타낸다. 실싱양태에서, 본 발명의 CAR은 CD123의 발현과 연관된 질환의 치료를 거친 대상체를 치료하는데 유용하고, 여기서 CD123의 발현과 관련된 치료를 거친 대상체는 CD123의 발현과 연관된 질환을 나타낸다.
한 측면에서, 본 발명은 포유동물 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포에서의 발현을 위해 프로모터에 작동가능하게 연결된 CD123 CAR을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 발명은 CD123-발현 종양을 치료하는데 사용하기 위한 CD123 CAR을 발현하는 재조합 T 세포를 제공하고, 여기서 CD123 CAR을 발현하는 재조합 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포는 CD123 CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123 CART 또는 CD123 CAR-발현 NK 세포)로 불린다. 한 측면에서, 본 발명의 CD123 CART는 CD123 CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123 CART 또는 CD123 CAR-발현 NK 세포)가 종양 세포를 표적화하고 종양의 성장이 억제되도록 종양 세포를 그의 표면 상에 발현된 적어도 1개의 본 발명의 CD123 CAR과 접촉시킬 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 CD123 CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123 CART 또는 CD123 CAR-발현 NK 세포)가 항원에 반응하여 활성화되고 암 세포를 표적화하도록 종양 세포를 본 발명의 CD123 CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123 CART 또는 CD123 CAR-발현 NK 세포)와 접촉시키는 것을 포함하는 CD123-발현 종양 세포의 성장을 억제하는 방법에 관한 것이며, 여기서 종양의 성장은 억제된다.
한 측면에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 암이 대상체에서 치료되도록 대상체에게 본 발명의 CD123 CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123 CART 또는 CD123 CAR-발현 NK 세포)를 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 CD123 CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123 CART 또는 CD123 CAR-발현 NK 세포)에 의해 치료될 수 있는 암의 예는 CD123의 발현과 연관된 암이다. 본 발명의 CD123 CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123 CART 또는 CD123 CAR-발현 NK 세포)에 의해 치료될 수 있는 암의 예는 AML, 호지킨 림프종, 골수이형성 증후군, 만성 골수성 백혈병 및 다른 골수증식성 신생물, 또는 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포를 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형시키고, CD123 CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123 CART 또는 CD123 CAR-발현 NK 세포)를 그를 필요로 하는 수용자에게 주입하는 세포 요법의 유형을 포함한다. 주입된 세포는 수용자 내에서 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 항체 요법과는 달리, CAR-변형된 면역 이펙터 세포, 예를 들어 CAR-변형된 T 세포 또는 CAR-변형된 NK 세포는 생체내에서 복제할 수 있어서 장기간 존속하고, 이는 지속된 종양 제어로 이어질 수 있다. 다양한 측면에서, 환자에 투여된 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포, 또는 그의 자손은 환자에게 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포를 투여한 후 환자 내에서 적어도 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년, 또는 5년 동안 지속된다.
본 발명은 또한 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포를 키메라 항원 수용체 (CAR)를 일시적으로 발현하도록 예를 들어 시험관내 전사된 RNA에 의해 변형시키고, CAR-발현 세포, 예를 들어 CAR T 세포 또는 CAR NK 세포를 그를 필요로 하는 수용자에게 주입하는 세포 요법의 유형을 포함한다. 주입된 세포는 수용자 내에서 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 따라서, 다양한 측면에서, 환자에 투여된 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포는 환자에게 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포를 투여한 후 1개월 미만, 예를 들어 3주, 2주, 1주 동안 존재한다.
임의의 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, CAR-변형된 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포에 의해 도출된 항종양 면역 반응은 능동 또는 수동 면역 반응일 수 있거나, 또는 대안적으로 직접 대 간접 면역 반응으로 인한 것일 수 있다. 한 측면에서, CAR 형질도입된 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포는 CD123을 발현하는 인간 암 세포에 반응하여 특이적 염증유발 시토카인 분비 및 강력한 세포용해 활성을 나타내고, 가용성 CD123 억제에 저항하고, 방관자 사멸을 매개하고, 확립된 인간 종양의 퇴행을 매개한다. 예를 들어, CD123-발현 종양의 불균질 영역 내의 항원이-없는 종양 세포는 인접한 항원-양성 암 세포에 대해 이전에 반응한 CD123-재지시된 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포에 의한 간접적인 파괴에 감수성일 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 완전-인간 CAR-변형된 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)는 포유동물에서 생체외 면역화 및/또는 생체내 요법을 위한 백신의 유형일 수 있다. 한 측면에서, 포유동물은 인간이다.
생체외 면역화와 관련하여, 하기 중 적어도 하나가 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포를 포유동물 내로 투여하기 전 시험관내에서 일어난다: i) 세포의 확장, ii) CAR을 코딩하는 핵산의 세포로의 도입 또는 iii) 세포의 동결보존.
생체외 절차는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 하기에 보다 상세하게 논의된다. 간략하게, 세포는 포유동물 (예를 들어, 인간)으로부터 단리되고, 본원에 개시된 CAR을 발현하는 벡터에 의해 유전자 변형된다 (즉, 시험관내에서 형질도입 또는 형질감염된다). CAR-변형된 세포는 포유동물 수용자에게 투여되어 치료 이익을 제공할 수 있다. 포유동물 수용자는 인간일 수 있고, CAR-변형된 세포는 수용자에 관하여 자가일 수 있다. 대안적으로, 세포는 수용자에 관하여 동종, 동계 또는 이종일 수 있다.
조혈 줄기 및 전구 세포의 생체외 확장 절차는 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,199,942에 기재되어 있고, 이는 본 발명의 세포에 적용될 수 있다. 다른 적합한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 따라서 본 발명은 세포의 생체외 확장의 임의의 특정한 방법으로 제한되지 않는다. 간략하게, T 세포의 생체외 배양 및 확장은: (1) 포유동물로부터 말초 혈액 수거 또는 골수 이식편으로부터 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포를 수집하는 것; 및 (2) 이러한 세포를 생체외 확장시키는 것을 포함한다. 미국 특허 번호 5,199,942에 기재된 세포 성장 인자에 더하여, 다른 인자, 예컨대 flt3-L, IL-1, IL-3 및 c-kit 리간드가 세포의 배양 및 확장을 위해 사용될 수 있다.
생체외 면역화와 관련하여 세포-기반 백신을 사용하는 것에 더하여, 본 발명은 또한 환자에서 항원에 대해 지시된 면역 반응을 도출하는 생체내 면역화를 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
일반적으로, 본원에 기재된 바와 같이 활성화되고 확장된 세포는 면역손상된 개체에서 발생하는 질환의 치료 및 예방에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 CAR-변형된 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)는 CD123의 발현과 연관된 질환, 장애 및 상태의 치료에 사용된다. 특정 측면에서, 본 발명의 세포는 CD123의 발현과 연관된 질환, 장애 및 상태의 발생 위험이 있는 환자의 치료에 사용된다. 따라서, 본 발명은 CD123의 발현과 연관된 질환, 장애 및 상태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 CAR-변형된 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)를 투여하는 것을 포함하는, CD123의 발현과 연관된 질환, 장애 및 상태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
한 측면에서 본 발명의 CAR-발현 세포 (CART 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)는 증식성 질환, 예컨대 암 또는 악성종양, 또는 전암성 상태, 예컨대 골수이형성증, 골수이형성 증후군 또는 전백혈병을 치료하는데 사용될 수 있다. 한 측면에서, CD123의 발현과 연관된 암은 세포의 비정상적 성장을 특징으로 하는 혈액암, 전백혈병, 과다증식성 장애, 증식증 또는 이형성증이다.
한 측면에서, 본 발명의 CAR-발현 세포 (CART 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)는 암을 치료하는데 사용되며, 여기서 암은 혈액암이다. 혈액암 상태는 혈액, 골수 및 림프계에 영향을 미치는 암의 유형, 예컨대 백혈병 및 악성 림프증식성 상태이다.
한 측면에서, 본 발명의 조성물 및 CAR-발현 세포 (CART 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)는 특히 골수성 백혈병, AML 및 그의 하위유형, 만성 골수성 백혈병 (CML), 골수이형성 증후군 (MDS), 골수증식성 신생물 (MPN), 조직구성 장애, 및 비만 세포 장애를 치료하는데 유용하다.
백혈병은 급성 백혈병 및 만성 백혈병으로서 분류될 수 있다. 급성 백혈병은 급성 골수 백혈병 (AML) 및 급성 림프성 백혈병 (ALL)으로서 추가로 분류될 수 있다. 만성 백혈병은 만성 골수 백혈병 (CML) 및 만성 림프성 백혈병 (CLL)을 포함한다. 다른 관련 상태는 골수 혈액 세포의 비유효 생산 (또는 이형성증) 및 AML로의 변환 위험과 연관된 혈액 상태의 다양한 집단인 골수이형성 증후군 (MDS, 이전에 "전백혈병"으로 공지됨)을 포함한다.
림프종은 림프구에서 발생한 혈액 세포 종양의 군이다. 예시적인 림프종은 비-호지킨 림프종 및 호지킨 림프종을 포함한다.
AML에서, 비정상적으로 분화된, 장기-생존 골수 전구세포의 악성 형질전환 및 비제어 증식은 미성숙 혈액 형성의 높은 순환 횟수 및 악성 세포에 의한 정상 골수의 대체를 야기한다. 증상은 피로, 창백, 용이한 타박상 및 출혈, 열 및 감염을 포함하고; 백혈병성 침윤의 증상은 단지 환자의 약 5%에서 존재한다 (종종 피부 징후로서). 말초 혈액 도말표본 및 골수의 검사는 진단적이다. 기존 치료는 완화를 달성하기 위한 유도 화학요법 및 재발을 피하기 위한 완화후 화학요법 (줄기 세포 이식의 존재 또는 부재 하)을 포함한다.
AML은 형태학, 면역표현형 및 세포화학에 의해 서로 구별되는 수많은 하위유형을 갖는다. 우세한 세포 유형에 기초하여, 골수성, 골수성-단핵구성, 단핵구성, 적혈구성 및 거핵구성을 비롯한 5개의 부류가 기재되어 있다.
완화 유도율은 50 내지 85%의 범위이다. 장기 무질환 생존기간은, 보고된 바로는 환자의 20 내지 40%에서 발생하고, 줄기 세포 이식으로 치료받은 더 어린 환자에서 40 내지 50%로 증가한다.
예후 인자는 치료 프로토콜 및 강도를 결정하는 것을 돕고; 잠재적 이익은 증가된 치료 독성을 정당화하는 것으로 생각되기 때문에, 강력한 음성 예후 특색을 갖는 환자는 통상적으로 보다 강한 형태의 요법이 주어진다. 가장 중요한 예후 인자는 백혈병 세포 핵형이고; 바람직한 핵형은 t(15;17), t(8;21), 및 inv16 (p13;q22)을 포함한다. 음성 인자는 증가하는 나이, 이전 골수이형성 상, 속발성 백혈병, 높은 WBC 카운트, 및 아우어 로드의 부재를 포함한다.
초기 요법은 완화를 유도하고자 시도하고, AML은 보다 적은 약물에 반응한다는 점에서 ALL과 가장 상이하다. 기본 유도 요법은 5 내지 7일 동안의 연속 IV 주입 또는 고용량에 의한 시타라빈을 포함하고; 다우노루비신 또는 이다루비신은 이 시간 동안 3일 동안 IV로 주어진다. 일부 요법은 6-티오구아닌, 에토포시드, 빈크리스틴 및 프레드니손을 포함하지만, 그의 기여는 불분명하다. 치료는 통상적으로 감염 및 출혈과 더불어 유의한 골수억제를 발생시키고; 골수 회복 전 유의한 잠복기가 존재한다. 이 시간 동안, 세심한 예방적 및 지지적 관리가 중요하다.
만성 골수 (또는 골수성) 백혈병 (CML)은 또한 만성 과립구성 백혈병으로 공지되어 있고, 백혈구의 암으로서 특징화된다. CML을 위한 통상의 치료 요법은 Bcr-Abl 티로신 키나제 억제제, 이마티닙 (글리벡(Gleevec)®), 다사티닙 및 닐로티닙을 포함한다. Bcr-Abl 티로신 키나제 억제제는 필라델피아 염색체 전위를 갖는 CML 환자에 특히 유용하다.
골수이형성 증후군 (MDS)은 무질서하고 비유효한 조혈 또는 혈액 생산을 특징으로 하는 혈액 의학적 상태이다. 따라서, 혈액-형성 세포의 수 및 품질은 비가역적으로 저하된다. MDS를 갖는 일부 환자는 중증 빈혈이 발생할 수 있고, 다른 환자는 무증상이다. MDS에 대한 분류 개요는, 특정한 혈액 세포 유형, 예를 들어 골수모세포, 단핵구 및 적혈구 전구체의 비 또는 빈도를 지정하는 기준과 함께 관련 기술분야에 공지되어 있다. MDS는 불응성 빈혈, 고리 철적모구 동반 불응성 빈혈, 과다 모세포 동반 불응성 빈혈, 변환 중 과다 모세포 동반 불응성 빈혈, 만성 골수단핵구성 백혈병 (CML)을 포함한다.
MDS을 위한 치료는 증상의 중증도에 따라 달라진다. 중증 증상을 겪고 있는 환자를 위한 공격적 치료 형태는 골수 이식, 및 혈액 제품 지원 (예를 들어, 수혈) 및 조혈 성장 인자 (예를 들어, 에리트로포이에틴)에 의한 지지적 관리를 포함한다. MDS를 치료하기 위해 다른 작용제: 5-아자시티딘, 데시타빈 및 레날리도미드가 빈번하게 사용된다. 일부 경우에, 철 킬레이트화제 데페록사민 (데스페랄(Desferal)®) 및 데페라시록스 (엑스자이드(Exjade)®)가 또한 투여될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CAR-발현 세포 (예를 들어, CART 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)는 암 또는 백혈병 줄기 세포를 갖는 백혈병을 치료하는데 사용된다. 예를 들어, 백혈병 줄기 세포는 CD34+/CD38- 백혈병 세포이다.
본 발명은 특히, 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 한 측면에서, 암은 백혈병 (예컨대 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병 및 골수이형성 증후군)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 혈액암 및 림프종 (예컨대 다발성 골수종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종 및 소세포- 및 대세포-여포성 림프종)을 포함하는 악성 림프증식성 상태이다.
한 측면에서, 본 발명의 CAR-발현 세포 (예를 들어, CART 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)는 다른 암 및 악성종양, 예컨대 비제한적으로 예를 들어, B-세포 급성 림프성 백혈병 ("B-ALL"), T-세포 급성 림프성 백혈병 ("T-ALL"), 급성 림프성 백혈병 (ALL)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 급성 백혈병; 예를 들어, 만성 골수 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 만성 백혈병; 예를 들어, B 세포 전림프구성 백혈병, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 모발상 세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 상태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성증 및 골수이형성 증후군, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 형질모구성 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 골수 혈액 세포의 비유효 생산 (또는 이형성증)과 연관된 혈액 상태의 다양한 집단인 "전백혈병"을 포함하나 이에 제한되지는 않는 추가의 혈액암 또는 혈액 상태 등을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 CAR-변형된 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포는 단독으로, 또는 희석제 및/또는 다른 성분, 예컨대 IL-2 또는 다른 시토카인 또는 세포 집단과 조합되어 제약 조성물로서 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 CD123-발현 세포를 포함하는 세포의 집단을 CD123-발현 세포에 결합하는 본 발명의 CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123 CART 세포 또는 CD123 CAR-발현 NK 세포)와 접촉시키는 것을 포함하는, CD123-발현 세포 집단의 증식을 억제 또는 그를 감소시키는 방법을 제공한다. 구체적 측면에서, 본 발명은 CD123-발현 암 세포 집단을 CD123-발현 세포에 결합하는 본 발명의 CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123 CART 세포 또는 CD123 CAR-발현 NK 세포)와 접촉시키는 것을 포함하는, CD123을 발현하는 암 세포의 증식을 억제 또는 그의 집단을 감소시키는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 CD123-발현 암 세포 집단을 CD123-발현 세포에 결합하는 본 발명의 CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123 CART 세포 또는 CD123 CAR-발현 NK 세포)와 접촉시키는 것을 포함하는, CD123을 발현하는 암 세포의 증식을 억제 또는 그의 집단을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 본 발명의 CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123 CART 세포 또는 CD123 CAR-발현 NK 세포)는 골수성 백혈병 또는 CD123-발현 세포와 연관된 또 다른 암을 갖는 대상체 또는 그에 대한 동물 모델에서 세포 및/또는 암 세포의 수량, 수, 양 또는 백분율을 음성 대조군에 비해 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 65%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 감소시킨다. 한 측면에서, 대상체는 인간이다.
본 발명은 또한 CD123-발현 세포와 연관된 질환 (예를 들어, CD123을 발현하는 혈액암 또는 비정형 암)의 예방, 치료 및/또는 관리를 필요로 하는 대상체에게 CD123-발현 세포에 결합하는 본 발명의 CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123 CART 세포 또는 CD123 CAR-발현 NK 세포)를 투여하는 것을 포함하는, CD123-발현 세포와 연관된 질환 (예를 들어, CD123을 발현하는 혈액암 또는 비정형 암)을 예방, 치료 및/또는 관리하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 대상체는 인간이다. CD123-발현 세포와 연관된 장애의 비제한적 예는 자가면역 장애 (예컨대 루푸스), 염증성 장애 (예컨대 알레르기 및 천식) 및 암 (예컨대 CD123을 발현하는 혈액암 또는 비정형 암)을 포함한다.
본 발명은 또한 CD123-발현 세포와 연관된 질환의 예방, 치료 및/또는 관리를 필요로 하는 대상체에게 CD123-발현 세포에 결합하는 본 발명의 CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123 CART 세포 또는 CD123 CAR-발현 NK 세포)를 투여하는 것을 포함하는, CD123-발현 세포와 연관된 질환을 예방, 치료 및/또는 관리하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 대상체는 인간이다.
본 발명은 CD123-발현 세포와 연관된 암의 재발의 예방을 필요로 하는 대상체에게 CD123-발현 세포에 결합하는 본 발명의 CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123 CART 세포 또는 CD123 CAR-발현 NK 세포)를 투여하는 것을 포함하는, CD123-발현 세포와 연관된 암의 재발을 예방하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 방법은 CD123-발현 세포에 결합하는 본원에 기재된 CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123 CART 세포 또는 CD123 CAR-발현 NK 세포)의 유효량을 또 다른 요법의 유효량과 조합하여 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
골수 절제
한 측면에서, 본 발명은 골수 절제를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 한 측면에서, 본 발명은 대상체에서 존재하는 골수의 적어도 일부를 근절시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특정 경우에, 본 발명의 CD123 CAR을 포함하는 CART123 세포는 CD123 양성 골수 골수성 전구 세포를 근절시키는 것으로 본원에 기재되어 있다.
한 측면에서, 본 발명은 골수 절제를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123 CART 세포 또는 CD123 CAR-발현 NK 세포)를 투여하는 것을 포함하는, 골수 절제 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 골수 이식 또는 골수 재조건화가 유익한 치료 전략인 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 존재하는 골수의 일부 또는 전부를 근절시키는데 사용될 수 있다. 한 측면에서, 본원의 다른 곳에 기재된 CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123 CART 세포 또는 CD123 CAR-발현 NK 세포)를 투여하는 것을 포함하는 본 발명의 골수 절제 방법은 대상체에서 골수 이식 전에 수행된다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명의 방법은 골수 또는 줄기 세포 이식 전 세포 조건화 요법을 제공한다. 한 측면에서, 골수 이식은 줄기 세포의 이식을 포함한다. 골수 이식은 자가 또는 동종 세포의 이식을 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123 CART 세포 또는 CD123 CAR-발현 NK 세포)를 투여하여 존재하는 골수의 적어도 일부를 근절시키는 것을 포함하는, 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 골수 이식이 유익한 임의의 질환 또는 장애를 치료하기 위한 치료 요법의 적어도 일부로서 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 방법은 골수 이식을 필요로 하는 임의의 대상체에서 사용될 수 있다. 한 측면에서, CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123 CART 세포 또는 CD123 CAR-발현 NK 세포)를 투여하는 것을 포함하는 골수 절제는 AML의 치료에 유용하다. 특정 측면에서, 본 발명의 방법에 의한 골수 절제는 혈액암, 고형 종양, 혈액 질환, 대사 장애, HIV, HTLV, 리소솜 축적 장애 및 면역결핍을 치료하는데 유용하다.
본원에 개시된 조성물 및 방법은 존재하는 골수의 적어도 일부를 근절시켜 백혈병, 림프종, 골수종, ALL, AML, CLL, CML, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 및 다발성 골수종을 포함하나 이에 제한되지는 않는 혈액암을 치료하는데 사용될 수 있다.
본원에 개시된 조성물 및 방법은 특히 골수이형성증, 빈혈, 발작성 야간 혈색소뇨, 재생불량성 빈혈, 후천성 순수 적혈구 빈혈, 다이아몬드-블랙판 빈혈, 판코니 빈혈, 혈구감소증, 무거핵구성 혈소판감소증, 골수증식성 장애, 진성 다혈구혈증, 본태성 혈소판증가증, 골수섬유증, 혈색소병증, 겸상 적혈구 질환, 중증성 β 지중해빈혈을 포함하나 이에 제한되지는 않는 혈액 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
본원에 개시된 조성물 및 방법은 지질증, 스핑고지질증, 백질이영양증, 뮤코폴리사카라이드증, 당단백증, 영아 신경 세로이드 리포푸신증, 얀스키-빌쇼스키병, 니만-픽병, 고셔병, 부신백질이영양증, 이염성 백질이영양증, 크라베병, 후를러 증후군, 샤이에 증후군, 후를러-샤이에 증후군, 헌터 증후군, 산필리포 증후군, 모르키오 증후군, 마로토-라미 증후군, 슬라이 증후군, 점액지질증, 푸코지질증, 아스파르틸글루코사민뇨, 알파-만노시드축적증 및 월만병을 포함하나 이에 제한되지는 않는 리소솜 축적 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
본원에 개시된 조성물 및 방법은 T-세포 결핍, 복합 T-세포 및 B-세포 결핍, 식세포 장애, 면역 조절이상 질환, 선천성 면역 결핍, 모세혈관확장성 운동실조, 디조지 증후군, 중증 복합 면역결핍 (SCID), 비스코트-알드리치 증후군, 코스트만 증후군, 슈와크만-다이아몬드 증후군, 그리셀리 증후군 및 NF-카파-B 필수 조정자 (NEMO) 결핍을 포함하나 이에 제한되지는 않는 면역결핍을 치료하는데 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 대상체의 골수의 적어도 일부를 본 발명의 CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123 CART 세포 또는 CD123 CAR-발현 NK 세포)에 의해 근절시키는 골수 조건화를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 특정 경우에, 대상체의 골수는 CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123 CART 세포 또는 CD123 CAR-발현 NK 세포)의 활성에 의해 표적화 및 제거될 수 있는 악성 전구체 세포를 포함한다. 한 측면에서, 골수 조건화 요법은 천연 골수의 근절 후에 대상체에게 골수 또는 줄기 세포 이식물을 투여하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 골수 재조건화 요법은 항종양 CAR 요법, 화학요법, 방사선 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 다른 항암 요법과 조합된다.
한 측면에서, 투여된 CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123 CART 세포 또는 CD123 CAR-발현 NK 세포)의 근절이 골수 또는 줄기 세포 이식물의 주입 전에 요구될 수 있다. CAR-발현 세포 (예를 들어, CD123 CART 세포 또는 CD123 CAR-발현 NK 세포)의 근절은 자살 유전자의 사용, RNA 코딩된 CAR을 사용한 제한된 CAR 지속성, 또는 항체 또는 화학요법을 포함하는 항-T 세포 양식을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 적합한 전략 또는 처리를 사용하여 달성될 수 있다.
조합 요법
본원에 기재된 CAR-발현 세포는 다른 공지된 작용제 및 요법과 조합되어 사용될 수 있다. 본원에 사용된 "조합되어" 투여된은, 2종 (또는 그 초과)의 상이한 치료가 대상체가 장애를 앓는 동안 대상체에게 전달됨을 의미하고, 예를 들어 대상체가 장애로 진단된 후 및 장애가 치유 또는 제거되기 전 또는 치료가 다른 이유로 중지되기 전에 2종 이상의 치료가 전달된다. 일부 실시양태에서, 1종의 치료의 전달은 제2 전달이 개시될 때 여전히 발생하여, 투여 관점에서 중첩된다. 이것은 때때로 본원에서 "동시" 또는 "공동 전달"로 지칭된다. 다른 실시양태에서, 1종의 치료의 전달은 다른 치료의 전달이 개시되기 전에 종료된다. 어느 하나의 경우의 일부 실시양태에서, 조합 투여로 인해 치료가 보다 효과적이다. 예를 들어, 제2 치료가 보다 효과적이고, 예를 들어 더 적은 제2 치료에 의해 동등한 효과가 관찰되거나, 또는 제1 치료의 부재 하에 제2 치료가 투여된 경우에 관찰될 것보다 더 큰 정도로 제2 치료가 증상을 감소시키거나, 또는 제1 치료에 의해 유사한 상황이 관찰된다. 일부 실시양태에서, 증상 또는 장애와 관련된 다른 파라미터의 감소가 다른 것의 부재 하에 전달된 1종의 치료에 의해 관찰될 것보다 더 크도록 전달된다. 2종의 치료의 효과는 부분적으로 부가적이거나, 전체적으로 부가적이거나, 또는 부가적인 것보다 클 수 있다. 전달된 제1 치료의 효과가 제2 치료가 전달될 때 여전히 검출가능하도록 전달이 이루어질 수 있다.
본원에 기재된 CAR-발현 세포 및 적어도 1종의 추가의 치료제는 동시에, 동일한 조성물 내에 또는 개별 조성물 내에, 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적인 투여를 위해, 본원에 기재된 CAR-발현 세포가 먼저 투여될 수 있고 추가의 작용제는 두 번째로 투여될 수 있거나, 투여 순서가 역전될 수 있다.
CAR 요법 및/또는 다른 치료제, 절차 또는 양식은 장애의 활성 기간 동안, 또는 질환의 완화 또는 보다 낮은 활성 기간 동안 투여될 수 있다. CAR 요법은 장애의 다른 치료 전, 치료와 공동으로, 치료-후, 또는 완화 동안 투여될 수 있다.
조합되어 사용되는 경우에, CAR 요법 및 추가의 작용제 (예를 들어, 제2 또는 제3 작용제), 또는 모두는 개별적으로, 예를 들어 단독요법으로서 사용되는 각각의 작용제의 양 또는 투여량보다 높거나, 낮거나, 또는 동일한 양 또는 용량으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, CAR 요법, 추가의 작용제 (예를 들어, 제2 또는 제3 작용제), 또는 모두의 투여되는 양 또는 투여량은 개별적으로, 예를 들어 단독요법으로서 사용되는 각각의 작용제의 양 또는 투여량보다 낮다 (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%). 다른 실시양태에서, 목적하는 효과 (예를 들어, 암의 치료)를 발생시키는 CAR 요법, 추가의 작용제 (예를 들어, 제2 또는 제3 작용제), 또는 모두의 양 또는 투여량은 동일한 치료 효과를 달성하기 위해 요구되는 개별적으로 예를 들어 단독요법으로서 사용되는 각각의 작용제의 양 또는 투여량보다 낮다 (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 낮다).
추가 측면에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 치료 요법에서 수술, 시토카인, 방사선, 또는 화학요법, 예컨대 시톡산, 플루다라빈, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 탈메틸화제, 또는 펩티드 백신, 예컨대 문헌 [Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971]에 기재된 것과 조합되어 사용될 수 있다.
특정 경우에, 본 발명의 화합물은 다른 치료제, 예컨대 다른 항암제, 항알레르기제, 항오심제 (또는 항구토제), 통증 완화제, 세포보호제 및 그의 조합과 조합된다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 화학요법제와 조합되어 사용될 수 있다. 예시적인 화학요법제는 안트라시클린 (예를 들어, 독소루비신 (예를 들어, 리포솜 독소루비신)), 빈카 알칼로이드 (예를 들어, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈), 알킬화제 (예를 들어, 시클로포스파미드, 데카르바진, 멜팔란, 이포스파미드, 테모졸로미드), 면역 세포 항체 (예를 들어, 알렘투주맙, 겜투주맙, 리툭시맙, 오파투무맙, 토시투모맙, 브렌툭시맙), 항대사물 (예를 들어, 폴산 길항제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 아데노신 데아미나제 억제제 (예를 들어, 플루다라빈) 포함), mTOR 억제제, TNFR 글루코코르티코이드 유도된 TNFR 관련 단백질 (GITR) 효능제, 프로테아솜 억제제 (예를 들어, 아클라시노마이신 A, 글리오톡신 또는 보르테조밉); 면역조정제, 예컨대 탈리도미드 또는 탈리도미드 유도체 (예를 들어, 레날리도미드)를 포함한다.
조합 요법에 사용하기 위해 고려되는 일반적 화학요법제는 아나스트로졸 (아리미덱스(Arimidex)®), 비칼루타미드 (카소덱스(Casodex)®), 블레오마이신 술페이트 (블레녹산(Blenoxane)®), 부술판 (밀레란®), 부술판 주사 (부술펙스®), 카페시타빈 (젤로다(Xeloda)®), N4-펜톡시카르보닐-5-데옥시-5-플루오로시티딘, 카르보플라틴 (파라플라틴(Paraplatin)®), 카르무스틴 (BiCNU®), 클로람부실 (류케란(Leukeran)®), 시스플라틴 (플라티놀(Platinol)®), 클라드리빈 (류스타틴(Leustatin)®), 시클로포스파미드 (시톡산® 또는 네오사르®), 시타라빈, 시토신 아라비노시드 (시토사르-U®), 시타라빈 리포솜 주사 (데포사이트®), 다카르바진 (DTIC-돔)®), 닥티노마이신 (악티노마이신 D(Actinomycin D), 코스메간(Cosmegan)), 다우노루비신 히드로클로라이드 (세루비딘(Cerubidine)®), 다우노루비신 시트레이트 리포솜 주사 (다우녹솜®), 덱사메타손, 도세탁셀 (탁소테레(Taxotere)®), 독소루비신 히드로클로라이드 (아드리아마이신(Adriamycin)®, 루벡스(Rubex)®), 에토포시드 (베페시드(Vepesid)®), 플루다라빈 포스페이트 (플루다라(Fludara)®), 5-플루오로우라실 (아드루실(Adrucil)®, 에푸덱스(Efudex)®), 플루타미드 (유렉신(Eulexin)®), 테자시티빈, 겜시타빈 (디플루오로데옥시시티딘), 히드록시우레아 (히드레아(Hydrea)®), 이다루비신 (이다마이신(Idamycin)®), 이포스파미드 (이펙스(IFEX)®), 이리노테칸 (캄프토사르(Camptosar)®), L-아스파라기나제 (엘스파르(ELSPAR)®), 류코보린 칼슘, 멜팔란 (알케란(Alkeran)®), 6-메르캅토퓨린 (퓨린톨(Purinethol)®), 메토트렉세이트 (폴렉스(Folex)®), 미톡산트론 (노반트론(Novantrone)®), 밀로타르그, 파클리탁셀 (탁솔(Taxol)®), 포에닉스(phoenix) (이트륨90/MX-DTPA), 펜토스타틴, 카르무스틴 이식물을 갖는 폴리페프로산 20 (글리아델(Gliadel)®), 타목시펜 시트레이트 (놀바덱스(Nolvadex)®), 테니포시드 (부몬(Vumon)®), 6-티오구아닌, 티오테파, 티라파자민 (티라존(Tirazone)®), 주사용 토포테칸 히드로클로라이드 (하이캄틴(Hycamptin)®), 빈블라스틴 (벨반(Velban)®), 빈크리스틴 (온코빈(Oncovin)®), 및 비노렐빈 (나벨빈(Navelbine)®)을 포함한다.
본 발명의 화합물과의 조합을 위한 특정한 관심 항암제는 안트라시클린; 알킬화제; 항대사물; 칼슘 의존성 포스파타제 칼시뉴린 또는 p70S6 키나제 FK506를 억제하거나, p70S6 키나제를 억제하는 약물; mTOR 억제제; 면역조정제; 안트라시클린; 빈카 알칼로이드; 프로테오솜 억제제; GITR 효능제; 단백질 티로신 포스파타제 억제제; CDK4 키나제 억제제; BTK 억제제; MKN 키나제 억제제; DGK 키나제 억제제; 또는 종양용해 바이러스를 포함한다.
예시적인 항대사물은, 비제한적으로, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 아데노신 데아미나제 억제제, 메토트렉세이트 (류마트렉스(Rheumatrex)®, 트렉살(Trexall)®), 5-플루오로우라실 (아드루실(Adrucil)®, 에푸덱스(Efudex)®, 플루오로플렉스(Fluoroplex)®), 플록수리딘 (FUDF®), 시타라빈 (시토사르-U®, 타라빈 PFS), 6-메르캅토퓨린 (퓨리-네톨(Puri-Nethol)®)), 6-티오구아닌 (티오구아닌 타블로이드(Thioguanine Tabloid)®), 플루다라빈 포스페이트 (플루다라(Fludara)®), 펜토스타틴 (니펜트(Nipent)®), 페메트렉세드 (알림타(Alimta)®), 랄티트렉세드 (토무덱스(Tomudex)®), 클라드리빈 (류스타틴(Leustatin)®), 클로파라빈 (클로파렉스(Clofarex)®, 클로라르(Clolar)®), 아자시티딘 (비다자(Vidaza)®), 데시타빈 및 겜시타빈 (겜자르(Gemzar)®)을 포함한다. 바람직한 항대사물은 시타라빈, 클로파라빈 및 플루다라빈을 포함한다.
예시적인 알킬화제는 비제한적으로 질소 머스타드, 에틸렌이민 유도체, 알킬 술포네이트, 니트로소우레아 및 트리아젠): 우라실 머스타드 (아미노우라실 머스타드(Aminouracil Mustard)®, 클로레타미나실(Chlorethaminacil)®, 데메틸도판(Demethyldopan)®, 데스메틸도판(Desmethyldopan)®, 해만타민(Haemanthamine)®, 노르도판(Nordopan)®, 우라실 질소 머스타드(Uracil nitrogen mustard)®, 우라실로스트(Uracillost)®, 우라실모스타자(Uracilmostaza)®, 우라무스틴(Uramustin)®, 우라무스틴(Uramustine)®), 클로르메틴 (머스타르겐(Mustargen)®), 시클로포스파미드 (시톡산®, 네오사르(Neosar)®, 클라펜(Clafen)®, 엔독산(Endoxan)®, 프로시톡스(Procytox)®, 레비뮨(Revimmune)™), 이포스파미드 (미톡사나(Mitoxana)®), 멜팔란 (알케란®), 클로람부실 (류케란®), 피포브로만 (아메델(Amedel)®, 베르사이트(Vercyte)®), 트리에틸렌멜라민 (헤멜(Hemel)®, 헥살렌(Hexalen)®, 헥사스타트(Hexastat)®), 트리에틸렌티오포스포르아민, 테모졸로미드 (테모다르(Temodar)®), 티오테파 (티오플렉스(Thioplex)®), 부술판 (부실벡스(Busilvex)®, 밀레란®), 카르무스틴 (BiCNU®), 로무스틴 (세뉴(CeeNU)®), 스트렙토조신 (자노사르(Zanosar)®), 및 다카르바진 (DTIC-돔®)을 포함한다. 추가의 예시적인 알킬화제는 비제한적으로 옥살리플라틴 (엘록사틴(Eloxatin)®); 테모졸로미드 (테모다르® 및 테모달®); 닥티노마이신 (악티노마이신-D, 코스메겐(Cosmegen)®으로도 공지됨); 멜팔란 (L-PAM, L-사르코리신, 및 페닐알라닌 머스타드, 알케란®으로도 공지됨); 알트레타민 (헥사메틸멜라민 (HMM), 헥살렌®으로도 공지됨); 카르무스틴 (BiCNU®); 벤다무스틴 (트레안다(Treanda)®); 부술판 (부술펙스® 및 밀레란®); 카르보플라틴 (파라플라틴®); 로무스틴 (CCNU, 세뉴®로도 공지됨); 시스플라틴 (CDDP, 플라티놀® 및 플라티놀®-AQ로도 공지됨); 클로람부실 (류케란®); 시클로포스파미드 (시톡산® 및 네오사르®); 다카르바진 (DTIC, DIC 및 이미다졸 카르복스아미드, DTIC-돔®으로도 공지됨); 알트레타민 (헥사메틸멜라민 (HMM), 헥살렌®으로도 공지됨); 이포스파미드 (이펙스®); 프레드누무스틴; 프로카르바진 (마툴란(Matulane)®); 메클로레타민 (질소 머스타드, 무스틴 및 메클로로에타민 히드로클로라이드, 머스타르겐®으로도 공지됨); 스트렙토조신 (자노사르®); 티오테파 (티오포스포아미드, TESPA 및 TSPA, 티오플렉스®로도 공지됨); 시클로포스파미드 (엔독산®, 시톡산®, 네오사르®, 프로시톡스®, 레비뮨®); 및 벤다무스틴 HCl (트레안다®)을 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 플루다라빈, 시클로포스파미드 및/또는 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 플루다라빈, 시클로포스파미드, 및 리툭시맙 (FCR)과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 대상체는 CLL을 갖는다. 예를 들어, 대상체는 짧은 아암의 염색체 17에서 결실 (del(17p), 예를 들어 백혈병성 세포에서)을 갖는다. 다른 예에서, 대상체는 del(17p)을 갖지 않는다. 실시양태에서, 대상체는 이뮤노글로불린 중쇄 가변-영역 (IgVH) 유전자에서 돌연변이를 포함하는 백혈병성 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, 대상체는 이뮤노글로불린 중쇄 가변-영역 (IgVH) 유전자에서 돌연변이를 포함하는 백혈병성 세포를 포함하지 않는다. 실시양태에서, 플루다라빈은 약 10-50 mg/m2 (예를 들어, 약 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 또는 45-50 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다. 실시양태에서, 시클로포스파미드는 약 200-300 mg/m2 (예를 들어, 약 200-225, 225-250, 250-275, 또는 275-300 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다. 실시양태에서, 리툭시맙은 약 400-600 mg/m2 (예를 들어, 400-450, 450-500, 500-550, 또는 550-600 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 벤다무스틴 및 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 대상체는 CLL을 갖는다. 예를 들어, 대상체는 짧은 아암의 염색체 17에서 결실 (del(17p), 예를 들어 백혈병성 세포에서)을 갖는다. 다른 예에서, 대상체는 del(17p)을 갖지 않는다. 실시양태에서, 대상체는 이뮤노글로불린 중쇄 가변-영역 (IgVH) 유전자에서 돌연변이를 포함하는 백혈병성 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, 대상체는 이뮤노글로불린 중쇄 가변-영역 (IgVH) 유전자에서 돌연변이를 포함하는 백혈병성 세포를 포함하지 않는다. 실시양태에서, 벤다무스틴은 약 70-110 mg/m2 (예를 들어, 70-80, 80-90, 90-100, 또는 100-110 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다. 실시양태에서, 리툭시맙은 약 400-600 mg/m2 (예를 들어, 400-450, 450-500, 500-550, 또는 550-600 mg/m2) 의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 리툭시맙, 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및/또는 코르티코스테로이드 (예를 들어, 프레드니손)와 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 리툭시맙, 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손 (R-CHOP)과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 대상체는 미만성 대 B-세포 림프종 (DLBCL)을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 비벌키 제한-병기 DLBCL을 갖는다 (예를 들어, 7 cm 미만의 크기/직경을 갖는 종양을 포함함). 실시양태에서, 대상체는 방사선으로 R-CHOP과 조합되어 치료된다. 예를 들어, 대상체에게 R-CHOP (예를 들어 1-6사이클, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6사이클의 R-CHOP)이 투여된 다음, 방사선이 투여된다. 일부 경우에, 대상체에게 방사선 후에 R-CHOP (예를 들어 1-6사이클, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6사이클의 R-CHOP)이 투여된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 에토포시드, 프레드니손, 빈크리스틴, 시클로포스파미드, 독소루비신 및/또는 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 에토포시드, 프레드니손, 빈크리스틴, 시클로포스파미드, 독소루비신 및 리툭시맙 (EPOCH-R)과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 용량-조정된 EPOCH-R (DA-EPOCH-R)과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 대상체는 B 세포 림프종, 예를 들어 Myc-재배열 공격성 B 세포 림프종을 갖는다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 리툭시맙 및/또는 레날리도미드와 조합되어 대상체에게 투여된다. 레날리도미드 ((RS)-3-(4-아미노-1-옥소 1,3-디히드로-2H-이소인돌-2-일)피페리딘-2,6-디온)는 면역조정제이다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 리툭시맙 및 레날리도미드와 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 대상체는 여포성 림프종 (FL) 또는 외투 세포 림프종 (MCL)을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 FL을 갖고, 이전에 암 요법으로 치료받은 바 없다. 실시양태에서, 레날리도미드는 약 10-20 mg (예를 들어, 10-15 또는 15-20 mg)의 투여량으로, 예를 들어 매일 투여된다. 실시양태에서, 리툭시맙은 약 350-550 mg/m2 (예를 들어, 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475, 또는 475-500 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다.
예시적인 mTOR 억제제는, 예를 들어 템시롤리무스; 리다포롤리무스 (공식적으로 데포롤리무스로서 공지됨, (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2 [(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-디히드록시-19,30-디메톡시-15,17,21,23,29,35-헥사메틸-2,3,10,14,20-펜타옥소-11,36-디옥사-4-아자트리시클로[30.3.1.04,9]헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-12-일]프로필]-2-메톡시시클로헥실 디메틸포스피네이트, 또한 AP23573 및 MK8669로도 공지되고 PCT 공개 번호 WO 03/064383에 기재됨); 에베롤리무스 (아피니토르(Afinitor)® 또는 RAD001); 라파마이신 (AY22989, 시롤리무스(Sirolimus)®); 시마피모드 (CAS 164301-51-3); 엠시롤리무스, (5-{2,4-비스[(3S)-3-메틸모르폴린-4-일]피리도[2,3-d]피리미딘-7-일}-2-메톡시페닐)메탄올 (AZD8055); 2-아미노-8-[트랜스-4-(2-히드록시에톡시)시클로헥실]-6-(6-메톡시-3-피리디닐)-4-메틸-피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온 (PF04691502, CAS 1013101-36-4); 및 N2-[1,4-디옥소-4-[[4-(4-옥소-8-페닐-4H-1-벤조피란-2-일)모르폴리늄-4-일]메톡시]부틸]-L-아르기닐글리실-L-α-아스파르틸L-세린- (서열식별번호: 706), 내부 염 (SF1126, CAS 936487-67-1) 및 XL765를 포함한다.
예시적인 면역조정제는 예를 들어 아푸투주맙 (로슈(Roche)®로부터 이용가능함); 페그필그라스팀 (뉴라스타(Neulasta)®); 레날리도미드 (CC-5013, 레블리미드(Revlimid)®); 탈리도미드 (탈로미드(Thalomid)®), 악티미드 (CC4047); 및 IRX-2 (인터류킨 1, 인터류킨 2, 및 인터페론 γ를 비롯한 인간 시토카인의 혼합물, CAS 951209-71-5, IRX 테라퓨틱스(IRX Therapeutics)로부터 이용가능함)을 포함한다.
예시적인 안트라시클린은 예를 들어 독소루비신 (아드리아마이신® 및 루벡스®); 블레오마이신 (블레녹산®); 다우노루비신 (다우노루비신 히드로클로라이드, 다우노마이신, 및 루비도마이신 히드로클로라이드, 세루비딘®); 다우노루비신 리포솜 (다우노루비신 시트레이트 리포솜, 다우녹솜®); 미톡산트론 (DHAD, 노반트론®); 에피루비신 (엘렌스(Ellence)™); 이다루비신 (이다마이신®, 이다마이신 PFS®); 미토마이신 C (뮤타마이신(Mutamycin)®); 겔다나마이신; 헤르비마이신; 라비도마이신; 및 데스아세틸라비도마이신을 포함한다.
예시적인 빈카 알칼로이드는 예를 들어 비노렐빈 타르트레이트 (나벨빈®), 빈크리스틴 (온코빈®), 및 빈데신 (엘디신(Eldisine)®)); 빈블라스틴 (빈블라스틴 술페이트, 빈카류코블라스틴 및 VLB, 알카반(Alkaban)-AQ® 및 벨반®으로도 공지됨); 및 비노렐빈 (나벨빈®)을 포함한다.
예시적인 프로테오솜 억제제는 보르테조밉 (벨케이드(Velcade)®); 카르필조밉 (PX-171-007, (S)-4-메틸-N-((S)-1-(((S)-4-메틸-1-((R)-2-메틸옥시란-2-일)-1-옥소펜탄-2-일)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)-2-((S)-2-(2-모르폴리노아세트아미도)-4-페닐부탄아미도)-펜탄아미드); 마리조밉 (NPI-0052); 익사조밉 시트레이트 (MLN-9708); 델란조밉 (CEP-18770); 및 O-메틸-N-[(2-메틸-5-티아졸릴)카르보닐]-L-세릴-O-메틸-N-[(1S)-2-[(2R)-2-메틸-2-옥시라닐]-2-옥소-1-(페닐메틸)에틸]-L-세린아미드 (ONX-0912)를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 브렌툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 브렌툭시맙은 항-CD30 항체 및 모노메틸 아우리스타틴 E의 항체-약물 접합체이다. 실시양태에서, 대상체는 호지킨 림프종 (HL), 예를 들어 재발성 또는 불응성 HL을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 CD30+ HL을 포함한다. 실시양태에서, 대상체는 자가 줄기 세포 이식 (ASCT)을 겪은 바 있다. 실시양태에서, 대상체는 ASCT를 겪은 바 없다. 실시양태에서, 브렌툭시맙은 약 1-3 mg/kg (예를 들어, 약 1-1.5, 1.5-2, 2-2.5, 또는 2.5-3 mg/kg)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로, 예를 들어 3주마다 투여된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 브렌툭시맙 및 다카르바진과 조합되어 또는 브렌툭시맙 및 벤다무스틴과 조합되어 대상체에게 투여된다. 다카르바진은 5-(3,3-디메틸-1-트리아제닐)이미다졸-4-카르복스아미드의 화학 명칭을 갖는 알킬화제이다. 벤다무스틴은 4-[5-[비스(2-클로로에틸)아미노]-1-메틸벤즈이미다졸-2-일]부탄산의 화학 명칭을 갖는 알킬화제이다. 실시양태에서, 대상체는 호지킨 림프종 (HL)을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 이전에 암 요법으로 치료받은 바 없다. 실시양태에서, 대상체는 적어도 60세, 예를 들어 60, 65, 70, 75, 80, 85세 또는 그 초과이다. 실시양태에서, 다카르바진은 약 300-450 mg/m2 (예를 들어, 약 300-325, 325-350, 350-375, 375-400, 400-425, 또는 425-450 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다. 실시양태에서, 벤다무스틴은 약 75-125 mg/m2 (예를 들어 75-100 또는 100-125 mg/m2, 예를 들어 약 90 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다. 실시양태에서, 브렌툭시맙은 약 1-3 mg/kg (예를 들어, 약 1-1.5, 1.5-2, 2-2.5, 또는 2.5-3 mg/kg)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로, 예를 들어 3주마다 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 CD20 억제제, 예를 들어 항-CD20 항체 (예를 들어, 항-CD20 단일- 또는 이중특이적 항체) 또는 그의 단편과 조합되어 대상체에게 투여된다. 예시적인 항-CD20 항체는 리툭시맙, 오파투무맙, 오크렐리주맙, 벨투주맙, 오비누투주맙, TRU-015 (트루비온 파마슈티칼스(Trubion Pharmaceuticals)), 오카라투주맙, 및 프로131921 (제넨테크(Genentech))을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [Lim et al. Haematologica. 95.1(2010):135-43]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 항-CD20 항체는 리툭시맙을 포함한다. 리툭시맙은 예를 들어 www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdf에 기재된 바와 같은, CD20에 결합하고 CD20 과다발현 세포의 세포용해를 유발하는 키메라 마우스/인간 모노클로날 항체 IgG1 카파이다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 대상체는 CLL 또는 SLL을 갖는다.
일부 실시양태에서, 리툭시맙은 정맥내로, 예를 들어 정맥내 주입으로서 투여된다. 예를 들어, 각각의 주입은 약 500-2000 mg (예를 들어, 약 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400-1500, 1500-1600, 1600-1700, 1700-1800, 1800-1900, 또는 1900-2000 mg)의 리툭시맙을 제공한다. 일부 실시양태에서, 리툭시맙은 150 mg/m2 내지 750 mg/m2, 예를 들어 약 150-175 mg/m2, 175-200 mg/m2, 200-225 mg/m2, 225-250 mg/m2, 250-300 mg/m2, 300-325 mg/m2, 325-350 mg/m2, 350-375 mg/m2, 375-400 mg/m2, 400-425 mg/m2, 425-450 mg/m2, 450-475 mg/m2, 475-500 mg/m2, 500-525 mg/m2, 525-550 mg/m2, 550-575 mg/m2, 575-600 mg/m2, 600-625 mg/m2, 625-650 mg/m2, 650-675 mg/m2, 또는 675-700 mg/m2의 용량으로 투여되며, 여기서 m2는 대상체의 체표면적을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 리툭시맙은 적어도 4일, 예를 들어 4, 7, 14, 21, 28, 35일, 또는 그 초과의 투여 간격으로 투여된다. 예를 들어, 리툭시맙은 적어도 0.5주, 예를 들어 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주 또는 그 초과의 투여 간격으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 리툭시맙은, 예를 들어 적어도 2주, 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20주 또는 그 초과의 일정 기간 동안 본원에 기재된 용량 및 투여 간격으로 투여된다. 예를 들어, 리툭시맙은 치료 사이클당 총 적어도 4용량 (예를 들어, 치료 사이클당 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 그 초과의 용량) 동안 본원에 기재된 용량 및 투여 간격으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 항-CD20 항체는 오파투무맙을 포함한다. 오파투무맙은 대략 149 kDa의 분자량을 갖는 항-CD20 IgG1κ 인간 모노클로날 항체이다. 예를 들어, 오파투무맙은 트랜스제닉 마우스 및 하이브리도마 기술을 사용하여 생성되고, 재조합 뮤린 세포주 (NS0)로부터 발현 및 정제된다. 예를 들어, www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf; 및 임상 시험 식별자 번호 NCT01363128, NCT01515176, NCT01626352, 및 NCT01397591을 참조한다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 오파투무맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 대상체는 CLL 또는 SLL을 갖는다.
일부 실시양태에서, 오파투무맙은 정맥내 주입으로 투여된다. 예를 들어, 각각의 주입은 약 150-3000 mg (예를 들어, 약 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1200, 1200-1400, 1400-1600, 1600-1800, 1800-2000, 2000-2200, 2200-2400, 2400-2600, 2600-2800, 또는 2800-3000 mg)의 오파투무맙을 제공한다. 실시양태에서, 오파투무맙은, 예를 들어 약 11 용량 동안, 예를 들어 24주 동안 약 300 mg의 출발 투여량에 이어서 2000 mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 오파투무맙은 적어도 4일, 예를 들어 4, 7, 14, 21, 28, 35일 또는 그 초과의 투여 간격으로 투여된다. 예를 들어, 오파투무맙은 적어도 1주, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 26, 28, 20, 22, 24, 26, 28, 30주 또는 그 초과의 투여 간격으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 오파투무맙은 일정 기간, 예를 들어 적어도 1주, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60주 또는 그 초과, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월 또는 그 초과, 또는 1, 2, 3, 4, 5년 또는 그 초과 동안 본원에 기재된 용량 및 투여 간격으로 투여된다. 예를 들어, 오파투무맙은 치료 사이클당 총 적어도 2 용량 (예를 들어, 치료 사이클당 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20 또는 그 초과의 용량) 동안 본원에 기재된 용량 및 투여 간격으로 투여된다.
일부 경우에, 항-CD20 항체는 오크렐리주맙을 포함한다. 오크렐리주맙은, 예를 들어 임상 시험 식별자 번호 NCT00077870, NCT01412333, NCT00779220, NCT00673920, NCT01194570, 및 문헌 [Kappos et al. Lancet. 19.378(2011):1779-87]에 기재된 바와 같은 인간화 항-CD20 모노클로날 항체이다.
일부 경우에, 항-CD20 항체는 벨투주맙을 포함한다. 벨투주맙은 CD20에 대한 인간화 모노클로날 항체이다. 예를 들어, 임상 시험 식별자 번호 NCT00547066, NCT00546793, NCT01101581, 및 문헌 [Goldenberg et al. Leuk Lymphoma. 51(5)(2010):747-55]을 참조한다.
일부 경우에, 항-CD20 항체는 GA101을 포함한다. GA101 (오비누투주맙 또는 RO5072759로도 불림)은 인간화 및 글리코-조작된 항-CD20 모노클로날 항체이다. 예를 들어, 문헌 [Robak. Curr. Opin. Investig. Drugs. 10.6(2009):588-96]; 임상 시험 식별자 번호: NCT01995669, NCT01889797, NCT02229422, 및 NCT01414205; 및 www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf를 참조한다.
일부 경우에, 항-CD20 항체는 AME-133v를 포함한다. AME-133v (LY2469298 또는 오카라투주맙으로도 불림)는 리툭시맙과 비교하여 FcγRIIIa 수용체에 대해 증가된 친화도 및 증진된 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 활성을 갖는 CD20에 대한 인간화 IgG1 모노클로날 항체이다. 예를 들어, 문헌 [Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25; 및 Forero-Torres et al. Clin Cancer Res. 18.5(2012):1395-403]을 참조한다.
일부 경우에, 항-CD20 항체는 PRO131921을 포함한다. PRO131921은 리툭시맙과 비교하여 FcγRIIIa에 대한 보다 나은 결합 및 증진된 ADCC를 갖도록 조작된 인간화 항-CD20 모노클로날 항체이다. 예를 들어, 문헌 [Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25; 및 Casulo et al. Clin Immunol. 154.1(2014):37-46]; 및 임상 시험 식별자 번호 NCT00452127을 참조한다.
일부 경우에, 항-CD20 항체는 TRU-015를 포함한다. TRU-015는 CD20에 대한 항체의 도메인으로부터 유래된 항-CD20 융합 단백질이다. TRU-015는 모노클로날 항체보다 작지만, Fc-매개 이펙터 기능을 보유한다. 예를 들어, 문헌 [Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25]을 참조한다. TRU-015는 인간 IgG1 힌지, CH2, 및 CH3 도메인에 연결된 항-CD20 단일-쇄 가변 단편 (scFv)을 함유하지만, CH1 및 CL 도메인은 결여되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CD20 항체는 치료제, 예를 들어 본원에 기재된 화학요법제 (예를 들어, 시톡산, 플루다라빈, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 탈메틸화제, 펩티드 백신, 항종양 항생제, 티로신 키나제 억제제, 알킬화제, 항미세관제 또는 항유사분열제), 항알레르기제, 항오심제 (또는 항구토제), 통증 완화제 또는 세포보호제에 접합되거나 달리 결합된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 B-세포 림프종 2 (BCL-2) 억제제 (예를 들어, 베네토클락스, ABT-199 또는 GDC-0199로도 불림) 및/또는 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 베네토클락스 및 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 베네토클락스는 항아폽토시스 단백질, BCL-2를 억제하는 소분자이다. 베네토클락스 (4-(4-{[2-(4-클로로페닐)-4,4-디메틸시클로헥스-1-엔-1-일]메틸}피페라진-1-일)-N-({3-니트로-4-[(테트라히드로-2H-피란-4-일메틸)아미노]페닐}술포닐)-2-(1H-피롤로[2,3-b]피리딘-5-일옥시)벤즈아미드)의 구조가 하기 제시된다.
Figure pct00102
실시양태에서, 대상체는 CLL을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 재발성 CLL을 갖고, 예를 들어 대상체는 이전에 암 요법을 투여받은 바 있다. 실시양태에서, 베네토클락스는 약 15-600 mg (예를 들어, 15-20, 20-50, 50-75, 75-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 또는 500-600 mg)의 투여량으로, 예를 들어 매일 투여된다. 실시양태에서, 리툭시맙은 약 350-550 mg/m2 (예를 들어, 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475, 또는 475-500 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로, 예를 들어 매월 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 종양용해 바이러스와 조합되어 투여된다. 실시양태에서, 종양용해 바이러스는 암 세포 내에서 선택적으로 복제될 수 있고, 그의 사멸을 촉발하거나 성장을 늦출 수 있다. 일부 경우에, 종양용해 바이러스는 비-암 세포에 대해서는 전혀 효과를 갖지 않거나 최소 효과를 갖는다. 종양용해 바이러스는 종양용해 아데노바이러스, 종양용해 단순 포진 바이러스, 종양용해 레트로바이러스, 종양용해 파르보바이러스, 종양용해 백시니아 바이러스, 종양용해 신드비스 바이러스, 종양용해 인플루엔자 바이러스 또는 종양용해 RNA 바이러스 (예를 들어, 종양용해 레오바이러스, 종양용해 뉴캐슬병 바이러스 (NDV), 종양용해 홍역 바이러스 또는 종양용해 수포성 구내염 바이러스 (VSV))를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 종양용해 바이러스는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 US2010/0178684 A1에 기재된 바이러스, 예를 들어 재조합 종양용해 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해 바이러스는, 예를 들어 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 US2010/0178684 A1에 기재된 바와 같은, 면역 또는 염증 반응의 억제제를 코딩하는 핵산 서열 (예를 들어, 이종 핵산 서열)을 포함한다. 실시양태에서, 재조합 종양용해 바이러스, 예를 들어 종양용해 NDV는 아폽토시스촉진 단백질 (예를 들어, 아폽틴), 시토카인 (예를 들어, GM-CSF, 인터페론-감마, 인터류킨-2 (IL-2), 종양 괴사 인자-알파), 이뮤노글로불린 (예를 들어, ED-B 피브로넥틴에 대한 항체), 종양 연관 항원, 이중특이적 어댑터 단백질 (예를 들어, NDV HN 단백질 및 T 세포 공동-자극 수용체, 예컨대 CD3 또는 CD28에 대해 지시된 이중특이적 항체 또는 항체 단편; 또는 NDV HN 단백질에 대해 지시된 인간 IL-2와 단일 쇄 항체 사이의 융합 단백질)을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Zamarin et al. Future Microbiol. 7.3(2012):347-67]을 참조하고, 그의 전문은 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 종양용해 바이러스는 US 8591881 B2, US 2012/0122185 A1, 또는 US 2014/0271677 A1에 기재된 키메라 종양용해 NDV이고, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 종양용해 바이러스는 암 세포에서만 독점적으로 복제하도록 설계된 조건부 복제 아데노바이러스 (CRAd)를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Alemany et al. Nature Biotechnol. 18(2000):723-27]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 종양용해 아데노바이러스는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Alemany et al.]의 페이지 725의 표 1에 기재된 것을 포함한다.
예시적인 종양용해 바이러스는 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다:
군 B 종양용해 아데노바이러스 (ColoAd1) (사이옥수스 테라퓨틱스 리미티드(PsiOxus Therapeutics Ltd.)) (예를 들어, 임상 시험 식별자: NCT02053220 참조);
ONCOS-102 (이전에 CGTG-102로 불림), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)를 포함하는 아데노바이러스임 (온코스 테라퓨틱스(Oncos Therapeutics)) (예를 들어, 임상 시험 식별자: NCT01598129 참조);
VCN-01, 인간 PH20 히알루로니다제를 코딩하는 유전자 변형된 종양용해 인간 아데노바이러스 (브이씨엔 바이오사이언시스, 에스.엘.(VCN Biosciences, S.L.)) (예를 들어, 임상 시험 식별자: NCT02045602 및 NCT02045589 참조);
조건부 복제 아데노바이러스 ICOVIR-5, 탈조절된 망막모세포종/E2F 경로를 갖는 암 세포에서 선택적으로 복제하도록 변형된 야생형 인간 아데노바이러스 혈청형 5 (Had5)로부터 유래된 바이러스임 (인스티튜트 카탈라 드옹콜로지아(Institut Catala d'Oncologia)) (예를 들어, 임상 시험 식별자: NCT01864759 참조);
셀리비르(Celyvir), ICOVIR5, 종양용해 아데노바이러스로 감염된 골수-유래 자가 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 포함함 (호스피탈 인판틸 유니베르시타리오 니노 예수스(Hospital Infantil Universitario Nino Jesus), 스페인 마드리드/ 라몬 알레마니(Ramon Alemany) (예를 들어, 임상 시험 식별자: NCT01844661 참조);
CG0070, 인간 E2F-1 프로모터가 본질적 E1a 바이러스 유전자의 발현을 구동하여 바이러스 복제 및 세포독성을 Rb 경로-결손 종양 세포로 제한한 조건부 복제 종양용해 혈청형 5 아데노바이러스 (Ad5)임 (콜드 제네시스, 인크.(Cold Genesys, Inc.)) (예를 들어, 임상 시험 식별자: NCT02143804 참조); 또는
DNX-2401 (이전에 델타-24-RGD로 명명됨), 망막모세포종 (Rb)-경로 결손 세포에서 선택적으로 복제되고 특정 RGD-결합 인테그린을 보다 효율적으로 발현하는 세포를 감염시키도록 조작된 아데노바이러스임 (클리니카 유니베르시다드 드 나바라(Clinica Universidad de Navarra), 나바라 대학교/ 디엔에이트릭스, 인크.(DNAtrix, Inc.)) (예를 들어, 임상 시험 식별자: NCT01956734 참조).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 종양용해 바이러스는 주사, 예를 들어 피하, 동맥내, 정맥내, 근육내, 척수강내, 또는 복강내 주사에 의해 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 종양용해 바이러스는 종양내로, 경피로, 경점막으로, 경구로, 비강내로, 또는 폐 투여를 통해 투여된다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR을 발현하는 세포는 Treg 세포 집단을 감소시키는 분자와 조합되어 대상체에게 투여된다. Treg 세포의 수를 감소시키는 (예를 들어, 고갈시키는) 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 CD25 고갈, 시클로포스파미드 투여, GITR 기능 조정을 포함한다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 분리반출술 전 또는 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 투여 전에 대상체에서 Treg 세포의 수를 감소시키는 것은 종양 미세환경에서 원치않는 면역 세포 (예를 들어, Treg)의 수를 감소시키고 대상체의 재발 위험을 감소시키는 것으로 여겨진다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 발현 세포는 GITR 표적화하고/거나 GITR 기능을 조정하는 분자, 예컨대 조절 T 세포 (Treg)를 고갈시키는 GITR 효능제 및/또는 GITR 항체와 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR을 발현하는 세포는 시클로포스파미드와 조합되어 대상체에게 투여된다. 한 실시양태에서, GITR 결합 분자 및/또는 GITR 기능을 조절하는 분자 (예를 들어, GITR 효능제 및/또는 Treg 고갈 GITR 항체)는 CAR-발현 세포의 투여 전에 투여된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, GITR 효능제는 세포의 분리반출술 전에 투여될 수 있다. 실시양태에서, 시클로포스파미드는 CAR-발현 세포의 투여 (예를 들어, 주입 또는 재-주입) 전 또는 세포의 분리반출술 전에 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 시클로포스파미드 및 항-GITR 항체는 CAR-발현 세포의 투여 (예를 들어, 주입 또는 재-주입) 전 또는 세포의 분리반출술 전에 대상체에게 투여된다. 한 실시양태에서, 대상체는 암 (예를 들어, 고형 암 또는 혈액암, 예컨대 ALL 또는 CLL)을 갖는다. 한 실시양태에서, 대상체는 CLL을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 ALL을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 고형 암, 예를 들어 본원에 기재된 고형 암을 갖는다. 예시적인 GITR 효능제는, 예를 들어 GITR 융합 단백질 및 항-GITR 항체 (예를 들어, 2가 항-GITR 항체), 예컨대 예를 들어, 미국 특허 번호 6,111,090, 유럽 특허 번호 090505B1, 미국 특허 번호 8,586,023, PCT 공개 번호 WO 2010/003118 및 2011/090754에 기재된 GITR 융합 단백질, 또는 예를 들어 미국 특허 번호 7,025,962, 유럽 특허 번호 1947183B1, 미국 특허 번호 7,812,135, 미국 특허 번호 8,388,967, 미국 특허 번호 8,591,886, 유럽 특허 번호 EP 1866339, PCT 공개 번호 WO 2011/028683, PCT 공개 번호 WO 2013/039954, PCT 공개 번호 WO2005/007190, PCT 공개 번호 WO 2007/133822, PCT 공개 번호 WO2005/055808, PCT 공개 번호 WO 99/40196, PCT 공개 번호 WO 2001/03720, PCT 공개 번호 WO99/20758, PCT 공개 번호 WO2006/083289, PCT 공개 번호 WO 2005/115451, 미국 특허 번호 7,618,632, 및 PCT 공개 번호 WO 2011/051726에 기재된 항-GITR 항체를 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 발현 세포는 GITR 효능제, 예를 들어 본원에 기재된 GITR 효능제와 조합되어 대상체에 투여된다. 한 실시양태에서, GITR 효능제는 CAR-발현 세포 전에 투여된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, GITR 효능제는 세포의 분리반출술 전에 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 발현 세포는 mTOR 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 mTOR 억제제, 예를 들어 라파로그, 예컨대 에베롤리무스와 조합되어 대상체에게 투여된다. 한 실시양태에서, mTOR 억제제는 CAR-발현 세포 전에 투여된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, mTOR 억제제는 세포의 분리반출술 전에 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 발현 세포는 단백질 티로신 포스파타제 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 단백질 티로신 포스파타제 억제제와 조합되어 대상체에게 투여된다. 한 실시양태에서, 단백질 티로신 포스파타제 억제제는 SHP-1 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 SHP-1 억제제, 예컨대 예를 들어 소듐 스티보글루코네이트이다. 한 실시양태에서, 단백질 티로신 포스파타제 억제제는 SHP-2 억제제이다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 키나제 억제제와 조합되어 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 키나제 억제제는 CDK4 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 CDK4 억제제, 예를 들어 CD4/6 억제제, 예컨대 예를 들어, 6-아세틸-8-시클로펜틸-5-메틸-2-(5-피페라진-1-일-피리딘-2-일아미노)-8H-피리도[2,3-d]피리미딘-7-온, 히드로클로라이드 (팔보시클립 또는 PD0332991로도 지칭됨)이다. 한 실시양태에서, 키나제 억제제는 BTK 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 BTK 억제제, 예컨대 예를 들어, 이브루티닙이다. 한 실시양태에서, 키나제 억제제는 mTOR 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 mTOR 억제제, 예컨대 예를 들어, 라파마이신, 라파마이신 유사체, OSI-027이다. mTOR 억제제는, 예를 들어 mTORC1 억제제 및/또는 mTORC2 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 mTORC1 억제제 및/또는 mTORC2 억제제일 수 있다. 한 실시양태에서, 키나제 억제제는 MNK 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 MNK 억제제, 예컨대 예를 들어, 4-아미노-5-(4-플루오로아닐리노)-피라졸로[3,4-d] 피리미딘이다. MNK 억제제는, 예를 들어 MNK1a, MNK1b, MNK2a 및/또는 MNK2b 억제제일 수 있다. 한 실시양태에서, 키나제 억제제는 DGK 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 DGK 억제제, 예컨대 예를 들어, DGKinh1 (D5919) 또는 DGKinh2 (D5794)이다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 알로이신 A; 플라보피리돌 또는 HMR-1275, 2-(2-클로로페닐)-5,7-디히드록시-8-[(3S,4R)-3-히드록시-1-메틸-4-피페리디닐]-4-크로메논; 크리조티닙 (PF-02341066); 2-(2-클로로페닐)-5,7-디히드록시-8-[(2R,3S)-2-(히드록시메틸)-1-메틸-3-피롤리디닐]-4H-1-벤조피란-4-온, 히드로클로라이드 (P276-00); 1-메틸-5-[[2-[5-(트리플루오로메틸)-1H-이미다졸-2-일]-4-피리디닐]옥시]-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-1H-벤즈이미다졸-2-아민 (RAF265); 인디술람 (E7070); 로스코비틴 (CYC202); 팔보시클립 (PD0332991); 디나시클립 (SCH727965); N-[5-[[(5-tert-부틸옥사졸-2-일)메틸]티오]티아졸-2-일]피페리딘-4-카르복스아미드 (BMS 387032); 4-[[9-클로로-7-(2,6-디플루오로페닐)-5H-피리미도[5,4-d][2]벤즈아제핀-2-일]아미노]-벤조산 (MLN8054); 5-[3-(4,6-디플루오로-1H-벤즈이미다졸-2-일)-1H-인다졸-5-일]-N-에틸-4-메틸-3-피리딘메탄아민 (AG-024322); 4-(2,6-디클로로벤조일아미노)-1H-피라졸-3-카르복실산 N-(피페리딘-4-일)아미드 (AT7519); 4-[2-메틸-1-(1-메틸에틸)-1H-이미다졸-5-일]-N-[4-(메틸술포닐)페닐]-2-피리미딘아민 (AZD5438); 및 XL281 (BMS908662)로부터 선택된 CDK4 억제제이다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 CDK4 억제제, 예를 들어 팔보시클립 (PD0332991)이고, 팔보시클립은 일정 기간 동안 매일, 예를 들어 28일 사이클의 14-21일 동안 매일 또는 21일 사이클의 7-12일 동안 매일 약 50 mg, 60 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 105 mg, 110 mg, 115 mg, 120 mg, 125 mg, 130 mg, 135 mg (예를 들어, 75 mg, 100 mg 또는 125 mg)의 용량으로 투여된다. 한 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12회 또는 그 초과의 사이클의 팔보시클립이 투여된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 시클린-의존성 키나제 (CDK) 4 또는 6 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 CDK4 억제제 또는 CDK6 억제제와 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 CDK4/6 억제제 (예를 들어, CDK4 및 CDK6 둘 다를 표적화하는 억제제), 예를 들어 본원에 기재된 CDK4/6 억제제와 조합되어 대상체에게 투여된다. 한 실시양태에서, 대상체는 MCL을 갖는다. MCL은 현행 이용가능한 요법에 대해 불량한 반응성의, 즉 본질적으로 치유불가능한 공격성 암이다. MCL의 많은 경우에, 시클린 D1 (CDK4/6의 조절제)이 MCL 세포에서 발현된다 (예를 들어, 이뮤노글로불린 및 시클린 D1 유전자를 수반하는 염색체 전위로 인함). 따라서, 이론에 얽매이지는 않지만, MCL 세포는 CDK4/6 억제에 대해 높은 특이성으로 고도로 감수성인 것으로 생각된다 (즉, 정상 면역 세포에 대해서는 최소 효과). CDK4/6 억제제 단독은 MCL을 치료하는데 있어서 일부 효능을 갖지만, 높은 재발률을 갖는 부분적 완화만이 달성된다. 예시적인 CDK4/6 억제제는 LEE011 (리보시클립으로도 불림)로, 그의 구조가 하기 제시된다.
Figure pct00103
이론에 얽매이지는 않지만, CDK4/6 억제제 (예를 들어, LEE011 또는 본원에 기재된 다른 CDK4/6 억제제)와 함께 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 투여는, 예를 들어 CDK4/6 억제제 단독과 비교하여, 예를 들어 더 높은 완화율 및/또는 더 낮은 재발률을 갖는 더 높은 반응성을 달성할 수 있는 것으로 여겨진다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 이브루티닙 (PCI-32765); GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; 및 LFM-A13으로부터 선택된 BTK 억제제이다. 바람직한 실시양태에서, BTK 억제제는 인터류킨-2-유도성 키나제 (ITK)의 키나제 활성을 감소시키거나 억제하지 않고, GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; 및 LFM-A13으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 BTK 억제제, 예를 들어 이브루티닙 (PCI-32765)이다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 BTK 억제제 (예를 들어, 이브루티닙)과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 이브루티닙 (PCI-32765로도 불림)과 조합되어 대상체에게 투여된다. 이브루티닙 (1-[(3R)-3-[4-아미노-3-(4-페녹시페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일]피페리딘-1-일]프로프-2-엔-1-온)의 구조가 하기 제시된다.
Figure pct00104
실시양태에서, 대상체는 CLL, 외투 세포 림프종 (MCL), 또는 소림프구성 림프종 (SLL)을 갖는다. 예를 들어, 대상체는 짧은 아암의 염색체 17에서 결실 (del(17p), 예를 들어 백혈병성 세포에서)을 갖는다. 다른 예에서, 대상체는 del(17p)을 갖지 않는다. 실시양태에서, 대상체는 재발성 CLL 또는 SLL을 갖고, 예를 들어 대상체는 이전에 암 요법을 투여받은 바 있다 (예를 들어, 이전에 1, 2, 3, 또는 4종의 선행 암 요법을 투여받은 바 있음). 실시양태에서, 대상체는 불응성 CLL 또는 SLL을 갖는다. 다른 실시양태에서, 대상체는 여포성 림프종, 예를 들어 재발 또는 불응성 여포성 림프종을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이브루티닙은 약 300-600 mg/일 (예를 들어, 약 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 또는 550-600 mg/일, 예를 들어, 약 420 mg/일 또는 약 560 mg/일)의 투여량으로, 예를 들어 경구로 투여된다. 실시양태에서, 이브루티닙은 약 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 420 mg, 440 mg, 460 mg, 480 mg, 500 mg, 520 mg, 540 mg, 560 mg, 580 mg, 600 mg (예를 들어, 250 mg, 420 mg 또는 560 mg)의 용량으로 소정의 기간 동안 매일, 예를 들어 21일 사이클 동안 매일, 또는 28일 사이클 동안 매일 투여된다. 한 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12사이클 또는 그 초과의 사이클의 이브루티닙이 투여된다. 일부 실시양태에서, 이브루티닙은 리툭시맙과 조합되어 투여된다. 예를 들어, 문헌 [Burger et al. (2013) Ibrutinib In Combination With Rituximab (iR) Is Well Tolerated and Induces a High Rate Of Durable Remissions In Patients With High-Risk Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL): New, Updated Results Of a Phase II Trial In 40 Patients, Abstract 675 presented at 55th ASH Annual Meeting and Exposition, New Orleans, LA 7-10 Dec]을 참조한다. 이론에 얽매이지는 않지만, 이브루티닙의 첨가는 T 세포 증식 반응을 증진시키고, T 세포를 T-헬퍼-2 (Th2)에서 T-헬퍼-1 (Th1) 표현형으로 이동시킬 수 있는 것으로 생각된다. Th1 및 Th2는 헬퍼 T 세포의 표현형으로, Th1 대 Th2는 상이한 면역 반응 경로를 지시한다. Th1 표현형은 예를 들어 세포, 예컨대 세포내 병원체/바이러스 또는 암성 세포를 사멸시키거나 자가면역 반응을 영속시키는 염증유발 반응과 연관된다. Th2 표현형은 호산구 축적 및 항-염증 반응과 연관된다.
본원의 방법, 용도 및 조성물의 일부 실시양태에서, BTK 억제제는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 출원 WO/2015/079417에 기재된 BTK 억제제이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, BTK 억제제는 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
<화학식 I>
Figure pct00105
여기서,
R1은 수소, 또는 히드록시에 의해 임의로 치환된 C1-C6 알킬이고;
R2는 수소 또는 할로겐이고;
R3은 수소 또는 할로겐이고;
R4는 수소이고;
R5는 수소 또는 할로겐이거나;
또는 R4 및 R5는 서로 부착되고, 결합, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH=CH-, -CH=CH-CH2-; -CH2-CH=CH-; 또는 -CH2-CH2-CH2-를 나타내고;
R6 및 R7은 서로 독립적으로 H, 히드록실에 의해 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 할로겐 또는 히드록시에 의해 임의로 치환된 C3-C6 시클로알킬, 또는 할로겐을 나타내고;
R8, R9, R, R', R10 및 R11은 서로 독립적으로 H, 또는 C1-C6 알콕시에 의해 임의로 치환된 C1-C6 알킬을 나타내거나; 또는 R8, R9, R, R', R10 및 R11 중 임의의 2개는 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 3 - 6원 포화 카르보시클릭 고리를 형성할 수 있고;
R12는 수소, 또는 할로겐 또는 C1-C6 알콕시에 의해 임의로 치환된 C1-C6 알킬이거나;
또는 R12 및 R8, R9, R, R', R10 또는 R11 중 어느 하나는 이들이 결합되어 있는 원자와 함께, 할로겐, 시아노, 히드록실, C1-C6 알킬 또는 C1-C6 알콕시에 의해 임의로 치환될 수 있는 4, 5, 6 또는 7원 아자시클릭 고리를 형성할 수 있고;
n은 0 또는 1이고;
R13은 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시 또는 N,N-디-C1-C6 알킬 아미노에 의해 임의로 치환된 C2-C6 알케닐; C1-C6 알킬 또는 C1-C6 알콕시에 의해 임의로 치환된 C2-C6 알키닐; 또는 C1-C6 알킬에 의해 임의로 치환된 C2-C6 알킬레닐 옥시드이다.
일부 실시양태에서, 화학식 I의 BTK 억제제는 하기로부터 선택된다: N-(3-(5-((1-아크릴로일아제티딘-3-일)옥시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (E)-N-(3-(6-아미노-5-((1-(부트-2-에노일)아제티딘-3-일)옥시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(6-아미노-5-((1-프로피올로일아제티딘-3-일)옥시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(6-아미노-5-((1-(부트-2-이노일)아제티딘-3-일)옥시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(5-((1-아크릴로일피페리딘-4-일)옥시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(6-아미노-5-(2-(N-메틸아크릴아미도)에톡시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (E)-N-(3-(6-아미노-5-(2-(N-메틸부트-2-엔아미도)에톡시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(6-아미노-5-(2-(N-메틸프로피올아미도)에톡시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (E)-N-(3-(6-아미노-5-(2-(4-메톡시-N-메틸부트-2-엔아미도)에톡시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(6-아미노-5-(2-(N-메틸부트-2-인아미도)에톡시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(2-((4-아미노-6-(3-(4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미도)-5-플루오로-2-메틸페닐)피리미딘-5-일)옥시)에틸)-N-메틸옥시란-2-카르복스아미드; N-(2-((4-아미노-6-(3-(6-시클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)페닐)피리미딘-5-일)옥시)에틸)-N-메틸아크릴아미드; N-(3-(5-(2-아크릴아미도에톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(6-아미노-5-(2-(N-에틸아크릴아미도)에톡시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(6-아미노-5-(2-(N-(2-플루오로에틸)아크릴아미도)에톡시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(5-((1-아크릴아미도시클로프로필)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (S)-N-(3-(5-(2-아크릴아미도프로폭시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (S)-N-(3-(6-아미노-5-(2-(부트-2-인아미도)프로폭시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (S)-N-(3-(6-아미노-5-(2-(N-메틸아크릴아미도)프로폭시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (S)-N-(3-(6-아미노-5-(2-(N-메틸부트-2-인아미도)프로폭시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(6-아미노-5-(3-(N-메틸아크릴아미도)프로폭시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (S)-N-(3-(5-((1-아크릴로일피롤리딘-2-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (S)-N-(3-(6-아미노-5-((1-(부트-2-이노일)피롤리딘-2-일)메톡시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (S)-2-(3-(5-((1-아크릴로일피롤리딘-2-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-(히드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-3,4-디히드로이소퀴놀린-1(2H)-온; N-(2-((4-아미노-6-(3-(6-시클로프로필-1-옥소-3,4-디히드로이소퀴놀린-2(1H)-일)-5-플루오로-2-(히드록시메틸)페닐)피리미딘-5-일)옥시)에틸)-N-메틸아크릴아미드; N-(3-(5-(((2S,4R)-1-아크릴로일-4-메톡시피롤리딘-2-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(6-아미노-5-(((2S,4R)-1-(부트-2-이노일)-4-메톡시피롤리딘-2-일)메톡시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; 2-(3-(5-(((2S,4R)-1-아크릴로일-4-메톡시피롤리딘-2-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-(히드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-3,4-디히드로이소퀴놀린-1(2H)-온; N-(3-(5-(((2S,4S)-1-아크릴로일-4-메톡시피롤리딘-2-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(6-아미노-5-(((2S,4S)-1-(부트-2-이노일)-4-메톡시피롤리딘-2-일)메톡시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(5-(((2S,4R)-1-아크릴로일-4-플루오로피롤리딘-2-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(6-아미노-5-(((2S,4R)-1-(부트-2-이노일)-4-플루오로피롤리딘-2-일)메톡시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (S)-N-(3-(5-((1-아크릴로일아제티딘-2-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (S)-N-(3-(6-아미노-5-((1-프로피올로일아제티딘-2-일)메톡시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (S)-2-(3-(5-((1-아크릴로일아제티딘-2-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-(히드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-3,4-디히드로이소퀴놀린-1(2H)-온; (R)-N-(3-(5-((1-아크릴로일아제티딘-2-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (R)-N-(3-(5-((1-아크릴로일피페리딘-3-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(5-(((2R,3S)-1-아크릴로일-3-메톡시피롤리딘-2-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(5-(((2S,4R)-1-아크릴로일-4-시아노피롤리딘-2-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; 또는 N-(3-(5-(((2S,4S)-1-아크릴로일-4-시아노피롤리딘-2-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드.
달리 제공되지 않는 한, 화학식 I의 BTK 억제제를 기재하는데 상기 사용된 화학 용어는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 출원 WO/2015/079417에 제시된 바와 같은 그의 의미에 따라 사용된다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 하기로부터 선택된 mTOR 억제제이다: 템시롤리무스; 리다포롤리무스 (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2 [(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-디히드록시-19,30-디메톡시-15,17,21,23,29,35-헥사메틸-2,3,10,14,20-펜타옥소-11,36-디옥사-4-아자트리시클로[30.3.1.04,9] 헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-12-일]프로필]-2-메톡시시클로헥실 디메틸포스피네이트, AP23573 및 MK8669로도 공지됨; 에베롤리무스 (RAD001); 라파마이신 (AY22989); 세마피모드; (5-{2,4-비스[(3S)-3-메틸모르폴린-4-일]피리도[2,3-d]피리미딘-7-일}-2-메톡시페닐)메탄올 (AZD8055); 2-아미노-8-[트랜스-4-(2-히드록시에톡시)시클로헥실]-6-(6-메톡시-3-피리디닐)-4-메틸-피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온 (PF04691502); 및 N2-[1,4-디옥소-4-[[4-(4-옥소-8-페닐-4H-1-벤조피란-2-일)모르폴리늄-4-일]메톡시]부틸]-L-아르기닐글리실-L-α-아스파르틸L-세린- (서열식별번호: 706), 내부 염 (SF1126); 및 XL765.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 mTOR 억제제, 예를 들어 라파마이신이고, 라파마이신은 약 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg (예를 들어, 6 mg)의 용량으로 소정의 기간 동안 매일, 예를 들어 21일 사이클 동안 매일, 또는 28일 사이클 동안 매일 투여된다. 한 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12사이클 또는 그 초과의 사이클의 라파마이신이 투여된다. 한 실시양태에서, 키나제 억제제는 mTOR 억제제, 예를 들어 에베롤리무스이고, 에베롤리무스는 약 2 mg, 2.5 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg (예를 들어, 10 mg)의 용량으로 소정의 기간 동안 매일, 예를 들어 28일 사이클 동안 매일 투여된다. 한 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12사이클 또는 그 초과의 사이클의 에베롤리무스가 투여된다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 CGP052088; 4-아미노-3-(p-플루오로페닐아미노)-피라졸로[3,4-d] 피리미딘 (CGP57380); 세르코스포라미드; ETC-1780445-2; 및 4-아미노-5-(4-플루오로아닐리노)-피라졸로[3,4-d] 피리미딘으로부터 선택된 MNK 억제제이다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 포스포이노시티드 3-키나제 (PI3K) 억제제 (예를 들어, 본원에 기재된 PI3K 억제제, 예를 들어 이델라리십 또는 두벨리십) 및/또는 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 이델라리십 및 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 두벨리십 및 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 이델라리십 (GS-1101 또는 CAL-101로도 불림; 길리아드(Gilead))은 PI3K의 델타 이소형을 차단하는 소분자이다. 이델라리십 (5-플루오로-3-페닐-2-[(1S)-1-(7H-퓨린-6-일아미노)프로필]-4(3H)-퀴나졸리논)의 구조가 하기 제시된다.
Figure pct00106
두벨리십 (IPI-145로도 불림; 인피니티 파마슈티칼스(Infinity Pharmaceuticals) 및 아브비(Abbvie))은 PI3K-δ,γ를 차단하는 소분자이다. 두벨리십 (8-클로로-2-페닐-3-[(1S)-1-(9H-퓨린-6-일아미노)에틸]-1(2H)-이소퀴놀리논)의 구조가 하기 제시된다.
Figure pct00107
실시양태에서, 대상체는 CLL을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 재발성 CLL을 갖고, 예를 들어 대상체는 이전에 암 요법을 투여받은 바 있다 (예를 들어, 이전에 항-CD20 항체를 투여받은 바 있거나, 또는 이전에 이브루티닙을 투여받은 바 있음). 예를 들어, 대상체는 짧은 아암의 염색체 17에서 결실 (del(17p), 예를 들어 백혈병성 세포에서)을 갖는다. 다른 예에서, 대상체는 del(17p)을 갖지 않는다. 실시양태에서, 대상체는 이뮤노글로불린 중쇄 가변-영역 (IgVH) 유전자에서 돌연변이를 포함하는 백혈병성 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, 대상체는 이뮤노글로불린 중쇄 가변-영역 (IgVH) 유전자에서 돌연변이를 포함하는 백혈병성 세포를 포함하지 않는다. 실시양태에서, 대상체는 긴 아암의 염색체 11에서 결실 (del(11q))을 갖는다. 다른 실시양태에서, 대상체는 del(11q)을 갖지 않는다. 실시양태에서, 이델라리십은 약 100-400 mg (예를 들어, 100-125, 125-150, 150-175, 175-200, 200-225, 225-250, 250-275, 275-300, 325-350, 350-375, 또는 375-400 mg)의 투여량으로, 예를 들어 BID 투여된다. 실시양태에서, 두벨리십은 약 15-100 mg (예를 들어, 약 15-25, 25-50, 50-75, 또는 75-100 mg)의 투여량으로, 예를 들어 1일 2회 투여된다. 실시양태에서, 리툭시맙은 약 350-550 mg/m2 (예를 들어, 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475, 또는 475-500 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 2-아미노-8-[트랜스-4-(2-히드록시에톡시)시클로헥실]-6-(6-메톡시-3-피리디닐)-4-메틸-피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온 (PF-04691502); N-[4-[[4-(디메틸아미노)-1-피페리디닐]카르보닐]페닐]-N'-[4-(4,6-디-4-모르폴리닐-1,3,5-트리아진-2-일)페닐]우레아 (PF-05212384, PKI-587); 2-메틸-2-{4-[3-메틸-2-옥소-8-(퀴놀린-3-일)-2,3-디히드로-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]페닐}프로판니트릴 (BEZ-235); 아피톨리십 (GDC-0980, RG7422); 2,4-디플루오로-N-{2-(메틸옥시)-5-[4-(4-피리다지닐)-6-퀴놀리닐]-3-피리디닐}벤젠술폰아미드 (GSK2126458); 8-(6-메톡시피리딘-3-일)-3-메틸-1-(4-(피페라진-1-일)-3-(트리플루오로메틸)페닐)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2(3H)-온 말레산 (NVP-BGT226); 3-[4-(4-모르폴리닐피리도[3',2':4,5]푸로[3,2-d]피리미딘-2-일]페놀 (PI-103); 5-(9-이소프로필-8-메틸-2-모르폴리노-9H-퓨린-6-일)피리미딘-2-아민 (VS-5584, SB2343); 및 N-[2-[(3,5-디메톡시페닐)아미노]퀴녹살린-3-일]-4-[(4-메틸-3-메톡시페닐)카르보닐]아미노페닐술폰아미드 (XL765)로부터 선택된 이중 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K) 및 mTOR 억제제이다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 역형성 림프종 키나제 (ALK) 억제제와 조합되어 대상체에게 투여된다. 예시적인 ALK 키나제는 크리조티닙 (화이자(Pfizer)), 세리티닙 (노파르티스(Novartis)), 알렉티닙 (츄가이(Chugai)), 브리가티닙 (AP26113으로도 불림; 아리아드(Ariad)), 엔트렉티닙 (이그니타(Ignyta)), PF-06463922 (화이자), TSR-011 (테사로(Tesaro)) (예를 들어, 임상 시험 식별자 번호 NCT02048488 참조), CEP-37440 (테바(Teva)), 및 X-396 (엑스커버리(Xcovery))을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 고형 암, 예를 들어 본원에 기재된 고형 암, 예를 들어 폐암을 갖는다.
크리조티닙의 화학 명칭은 3-[(1R)-1-(2,6-디클로로-3-플루오로페닐)에톡시]-5-(1-피페리딘-4-일피라졸-4-일)피리딘-2-아민이다. 세리티닙의 화학 명칭은 5-클로로-N2-[2-이소프로폭시-5-메틸-4-(4-피페리디닐)페닐]-N4-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-2,4-피리미딘디아민이다. 알렉티닙의 화학 명칭은 9-에틸-6,6-디메틸-8-(4-모르폴리노피페리딘-1-일)-11-옥소-6,11-디히드로-5H-벤조[b]카르바졸-3-카르보니트릴이다. 브리가티닙의 화학 명칭은 5-클로로-N2-{4-[4-(디메틸아미노)-1-피페리디닐]-2-메톡시페닐}-N4-[2-(디메틸포스포릴)페닐]-2,4-피리미딘디아민이다. 엔트렉티닙의 화학 명칭은 N-(5-(3,5-디플루오로벤질)-1H-인다졸-3-일)-4-(4-메틸피페라진-1-일)-2-((테트라히드로-2H-피란-4-일)아미노)벤즈아미드이다. PF-06463922의 화학 명칭은 (10R)-7-아미노-12-플루오로-2,10,16-트리메틸-15-옥소-10,15,16,17-테트라히드로-2H-8,4-(메테노)피라졸로[4,3-h][2,5,11]-벤족사디아자시클로테트라데신-3-카르보니트릴이다. CEP-37440의 화학 구조는 (S)-2-((5-클로로-2-((6-(4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-일)-1-메톡시-6,7,8,9-테트라히드로-5H-벤조[7]아눌렌-2-일)아미노)피리미딘-4-일)아미노)-N-메틸벤즈아미드이다. X-396의 화학 명칭은 (R)-6-아미노-5-(1-(2,6-디클로로-3-플루오로페닐)에톡시)-N-(4-(4-메틸피페라진-1-카르보닐)페닐)피리다진-3-카르복스아미드이다.
칼슘 의존성 포스파타제 칼시뉴린 (시클로스포린 및 FK506)을 억제하거나 또는 성장 인자 유도 신호전달에 중요한 p70S6 키나제를 억제하는 약물 (라파마이신) (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993)이 또한 사용될 수 있다. 추가 측면에서, 본 발명의 세포 조성물은 골수 이식, 플루다라빈과 같은 화학요법제를 사용하는 T 세포 절제 요법, 외부-빔 방사선 요법 (XRT), 시클로포스파미드, 및/또는 항체, 예컨대 OKT3 또는 캄파트와 공동으로 (예를 들어, 그 전에, 동시에 또는 그 후에) 환자에게 투여될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 세포 조성물은 B-세포 절제 요법, 예컨대 CD20과 반응하는 작용제, 예를 들어 리툭산(Rituxan) 후에 투여된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 대상체는 고용량 화학요법에 이어 말초 혈액 줄기 세포 이식을 사용하는 표준 치료를 받을 수 있다. 특정 실시양태에서, 이식 후에, 대상체는 본 발명의 확장된 면역 세포의 주입을 받는다. 추가의 실시양태에서, 확장된 세포는 수술 전 또는 후에 투여된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 인돌아민 2,3-디옥시게나제 (IDO) 억제제와 조합되어 대상체에게 투여된다. IDO는 아미노산, L-트립토판의 키누레닌으로의 분해를 촉매하는 효소이다. 많은 암, 예를 들어 전립선, 결장직장, 췌장, 자궁경부, 위, 난소, 두부 및 폐암이 IDO를 과다발현한다. pDC, 대식세포 및 수지상 세포 (DC)는 IDO를 발현할 수 있다. 이론에 얽매이지는 않지만, L-트립토판의 감소 (예를 들어, IDO에 의해 촉매됨)는 T-세포 무반응 및 아폽토시스를 유도함으로써 면역억제 환경을 발생시키는 것으로 생각된다. 따라서, 이론에 얽매이지는 않지만, IDO 억제제는 예를 들어 CAR-발현 면역 세포의 억제 또는 사멸을 감소시킴으로써 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 효능을 증진시킬 수 있는 것으로 생각된다. 실시양태에서, 대상체는 고형 종양, 예를 들어 본원에 기재된 고형 종양, 예를 들어 전립선, 결장직장, 췌장, 자궁경부, 위, 난소, 두부 또는 폐암을 갖는다. IDO의 예시적인 억제제는 1-메틸-트립토판, 인독시모드 (뉴링크 제네틱스(NewLink Genetics)) (예를 들어, 임상 시험 식별자 번호 NCT01191216; NCT01792050 참조), 및 INCB024360 (인사이트 코포레이션(Incyte Corp.)) (예를 들어, 임상 시험 식별자 번호 NCT01604889; NCT01685255 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 골수-유래 억제자 세포 (MDSC)의 조정제와 조합되어 대상체에게 투여된다. MDSC는 많은 고형 종양의 주변 및 종양 부위에 축적된다. 이들 세포는 T 세포 반응을 억제함으로써 CAR-발현 세포 요법의 효능을 방해한다. 이론에 얽매이지는 않지만, MDSC 조정제의 투여는 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 효능을 증진시키는 것으로 생각된다. 한 실시양태에서, 대상체는 고형 종양, 예를 들어 본원에 기재된 고형 종양, 예를 들어 교모세포종을 갖는다. MDSC의 예시적인 조정제는 MCS110 및 BLZ945를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. MCS110은 대식세포 콜로니-자극 인자 (M-CSF)에 대한 모노클로날 항체 (mAb)이다. 예를 들어, 임상 시험 식별자 번호 NCT00757757을 참조한다. BLZ945는 콜로니 자극 인자 1 수용체 (CSF1R)의 소분자 억제제이다. 예를 들어 문헌 [Pyonteck et al. Nat. Med. 19(2013):1264-72]을 참조한다. BLZ945의 구조가 하기 제시된다.
Figure pct00108
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 면역억제 형질 세포의 활성을 억제 또는 감소시키는 작용제와 조합되어 대상체에게 투여된다. 면역억제 형질 세포는 T 세포-의존성 면역원성 화학요법, 예컨대 옥살라플라틴을 저해하는 것으로 제시된 바 있다 (Shalapour et al., Nature 2015, 521:94- 101). 한 실시양태에서, 면역억제 형질 세포는 IgA, 인터류킨 (IL)-10, 및 PD-L1 중 1종 이상을 발현할 수 있다. 한 실시양태에서, 작용제는 CD19 CAR-발현 세포 또는 BCMA CAR-발현 세포이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 인터류킨-15 (IL-15) 폴리펩티드, 인터류킨-15 수용체 알파 (IL-15Ra) 폴리펩티드, 또는 IL-15 폴리펩티드 및 IL-15Ra 폴리펩티드 둘 다의 조합, 예를 들어 hetIL-15 (애드뮨 테라퓨틱스, 엘엘씨(Admune Therapeutics, LLC))와 조합되어 대상체에게 투여된다. hetIL-15는 IL-15 및 IL-15Ra의 이종이량체 비-공유 복합체이다. hetIL-15는, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 U.S. 8,124,084, U.S. 2012/0177598, U.S. 2009/0082299, U.S. 2012/0141413, 및 U.S. 2011/0081311에 기재되어 있다. 실시양태에서, het-IL-15는 피하로 투여된다. 실시양태에서, 대상체는 암, 예를 들어 고형 암, 예를 들어 흑색종 또는 결장암을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 전이성 암을 갖는다.
실시양태에서, 본원에 기재된 질환, 예를 들어 혈액 장애, 예를 들어 AML 또는 MDS를 갖는 대상체에게 본원에 기재된 CAR-발현 세포가 작용제, 예를 들어 세포독성 또는 화학요법제, 생물학적 요법 (예를 들어, 항체, 예를 들어 모노클로날 항체 또는 세포 요법), 또는 억제제 (예를 들어, 키나제 억제제)와 조합되어 투여된다. 실시양태에서, 대상체에게 본원에 기재된 CAR-발현 세포가 세포독성제, 예를 들어 CPX-351 (세라토르 파마슈티칼스(Celator Pharmaceuticals)), 시타라빈, 다우노루비신, 보사록신 (수네시스 파마슈티칼스(Sunesis Pharmaceuticals)), 사파시타빈 (시클라셀 파마슈티칼스(Cyclacel Pharmaceuticals)), 이다루비신 또는 미톡산트론과 조합되어 투여된다. CPX-351은 시타라빈 및 다우노루비신을 5:1 몰비로 포함하는 리포솜 제제이다. 실시양태에서, 대상체에게 본원에 기재된 CAR-발현 세포가 저메틸화제, 예를 들어 DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제, 예를 들어 아자시티딘 또는 데시타빈과 조합되어 투여된다. 실시양태에서, 대상체에게 본원에 기재된 CAR-발현 세포가 생물학적 요법, 예를 들어 항체 또는 세포 요법, 예를 들어 225Ac-린투주맙 (악티맙-A; 악티늄 파마슈티칼스(Actinium Pharmaceuticals)), IPH2102 (이네이트 파마(Innate Pharma)/브리스톨 마이어스 스큅(Bristol Myers Squibb)), SGN-CD33A (시애틀 제네틱스(Seattle Genetics)), 또는 겜투주맙 오조가미신 (밀로타르그(Mylotarg); 화이자)과 조합되어 투여된다. SGN-CD33A는 항-CD33 항체에 부착된 피롤로벤조디아제핀 이량체를 포함하는 항체-약물 접합체 (ADC)이다. 악티맙-A는 악티늄으로 표지된 항-CD33 항체 (린투주맙)이다. IPH2102는 킬러 이뮤노글로불린-유사 수용체 (KIR)를 표적화하는 모노클로날 항체이다. 실시양태에서, 대상체에게 본원에 기재된 CAR-발현 세포가 FLT3 억제제, 예를 들어, 소라페닙 (바이엘(Bayer)), 미도스타우린 (노파르티스), 퀴자르티닙 (다이이치 산쿄(Daiichi Sankyo)), 크레놀라닙 (아로그 파마슈티칼스(Arog Pharmaceuticals)), PLX3397 (다이이치 산쿄), AKN-028 (아키니온 파마슈티칼스(Akinion Pharmaceuticals)), 또는 ASP2215 (아스텔라스(Astellas))와 조합되어 투여된다. 실시양태에서, 대상체에게 본원에 기재된 CAR-발현 세포가 이소시트레이트 데히드로게나제 (IDH) 억제제, 예를 들어, AG-221 (셀진(Celgene)/아기오스(Agios)) 또는 AG-120 (아기오스/셀진)과 조합되어 투여된다. 실시양태에서, 대상체에게 본원에 기재된 CAR-발현 세포가 세포 주기 조절제, 예를 들어 폴로-유사 키나제 1 (Plk1)의 억제제, 예를 들어 볼라세르팁 (베링거 잉겔하임(Boehringer Ingelheim)); 또는 시클린-의존성 키나제 9 (Cdk9)의 억제제, 예를 들어 알보시딥 (톨레로 파마슈티칼스(Tolero Pharmaceuticals)/사노피 아벤티스(Sanofi Aventis))과 조합되어 투여된다. 실시양태에서, 대상체에게 본원에 기재된 CAR-발현 세포가 B 세포 수용체 신호전달 네트워크 억제제, 예를 들어 B-세포 림프종 2 (Bcl-2)의 억제제, 예를 들어 베네토클락스 (아브비/로슈(Roche)); 또는 브루톤 티로신 키나제 (Btk)의 억제제, 예를 들어 이브루티닙 (파마시클릭스(Pharmacyclics)/존슨 & 존슨 얀센 파마슈티칼(Johnson & Johnson Janssen Pharmaceutical))과 조합되어 투여된다. 실시양태에서, 대상체에게 본원에 기재된 CAR-발현 세포가 M1 아미노펩티다제의 억제제, 예를 들어 토세도스타트 (씨티아이 바이오파마(CTI BioPharma)/베르날리스(Vernalis)); 히스톤 데아세틸라제 (HDAC)의 억제제, 예를 들어 프라시노스타트 (엠이아이 파마(MEI Pharma)); 다중-키나제 억제제, 예를 들어 리고세르팁 (온코노바 테라퓨틱스(Onconova Therapeutics)/백스터(Baxter)/심바이오(SymBio)); 또는 펩티드성 CXCR4 역 효능제, 예를 들어 BL-8040 (바이오라인알엑스(BioLineRx))과 조합되어 투여된다. 실시양태에서, 대상체에게 CD123-표적화 CAR-발현 세포가 CD123 이외의 항원, 예를 들어 CLL-1, BCMA, CD33, CD19, FLT-3, 또는 폴레이트 수용체 베타를 표적화하는 CAR-발현 세포와 조합되어 투여된다.
또 다른 실시양태에서, 대상체는 이식, 예를 들어 세포의 동종 줄기 세포 이식 전에 본 발명의 CD123 CAR-발현 세포 조성물의 주입을 받는다. 바람직한 실시양태에서, CD123-CAR 발현 세포는, 예를 들어 mRNA CD123 CAR의 전기천공에 의해 CD123 CAR을 일시적으로 발현하고, 이에 의한 CD123의 발현은 생착 실패를 피하기 위해 공여자 줄기 세포의 주입 전에 종결된다.
일부 환자는 투여 동안 또는 그 후 본 발명의 화합물 및/또는 다른 항암제(들)에 대해 알레르기 반응을 경험할 수 있고; 따라서, 알레르기 반응의 위험을 최소화하기 위해 항알레르기제가 종종 투여된다. 적합한 항알레르기제는 코르티코스테로이드, 예컨대 덱사메타손 (예를 들어, 데카드론(Decadron)®), 베클로메타손 (예를 들어, 베클로벤트(Beclovent)®), 히드로코르티손 (코르티손, 히드로코르티손 소듐 숙시네이트, 히드로코르티손 인산나트륨으로도 공지됨, 상표명 알라-코르트(Ala-Cort)®, 히드로코르티손 포스페이트, 솔루-코르테프(Solu-Cortef)®, 히드로코르트 아세테이트(Hydrocort Acetate)® 및 라나코르트(Lanacort)® 하에 판매됨), 프레드니솔론 (상표명 델타-코르텔(Delta-Cortel)®, 오라프레드(Orapred)®, 페디아프레드(Pediapred)® 및 프렐론(Prelone)® 하에 판매됨), 프레드니손 (상표명 델타손(Deltasone)®, 리퀴드 레드(Liquid Red)®, 메티코르텐(Meticorten)® 및 오라손(Orasone)® 하에 판매됨), 메틸프레드니솔론 (6-메틸프레드니솔론, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 메틸프레드니솔론 소듐 숙시네이트로도 공지됨, 상표명 듀랄론(Duralone)®, 메드랄론(Medralone)®, 메드롤(Medrol)®, M-프레드니솔(M-Prednisol)® 및 솔루-메드롤(Solu-Medrol)® 하에 판매됨); 항히스타민제, 예컨대 디펜히드라민 (예를 들어, 베나드릴(Benadryl)®), 히드록시진 및 시프로헵타딘; 및 기관지확장제, 예컨대 베타-아드레날린성 수용체 효능제, 알부테롤 (예를 들어, 프로벤틸(Proventil)®) 및 테르부탈린 (브레틴(Brethine)®)을 포함한다.
일부 환자는 본 발명의 화합물 및/또는 다른 항암제(들)의 투여 동안 및 그 후 오심을 경험할 수 있고; 따라서, 항오심제가 오심 (상부 위) 및 구토를 방지하는데 사용된다. 적합한 항구토제는 아프레피탄트 (에멘드(Emend)®), 온단세트론 (조프란(Zofran)®), 그라니세트론 HCl (키트릴(Kytril)®), 로라제팜 (아티반(Ativan)®), 덱사메타손 (데카드론(Decadron)®), 프로클로르페라진 (콤파진(Compazine)®), 카소피탄트 (레조닉(Rezonic)® 및 준리사(Zunrisa)®) 및 그의 조합을 포함한다.
치료 기간 동안 경험한 통증을 완화하기 위한 의약은 환자를 보다 더 편안하게 하기 위해 종종 처방된다. 통상적인 일반 진통제, 예컨대 타이레놀(Tylenol)®이 종종 사용된다. 그러나, 오피오이드 진통제 약물, 예컨대 히드로코돈/파라세타몰 또는 히드로코돈/아세트아미노펜 (예를 들어, 비코딘(Vicodin)®), 모르핀 (예를 들어, 아스트라모르프(Astramorph)® 또는 아빈자(Avinza)®), 옥시코돈 (예를 들어, 옥시콘틴(OxyContin)® 또는 페르코셋(Percocet)®), 옥시모르폰 히드로클로라이드 (오파나(Opana)®) 및 펜타닐 (예를 들어, 두라게식(Duragesic)®이 또한 중등도 또는 중증 통증에 유용하다.
정상 세포를 치료 독성으로부터 보호하고, 기관 독성을 제한하기 위한 노력에서, 세포보호제 (예컨대 신경보호제, 유리-라디칼 스캐빈저, 심장보호제, 안트라시클린 혈관외유출 중화제, 영양제 등)는 보조 요법으로서 사용될 수 있다. 적합한 세포보호제는 아미포스틴 (에티올(Ethyol)®), 글루타민, 디메스나 (타보셉트(Tavocept)®), 메스나 (메스넥스(Mesnex)®), 덱스라족산 (지네카드(Zinecard)® 또는 토텍트(Totect)®), 크살리프로덴 (크사프릴라(Xaprila)®) 및 류코보린 (칼슘 류코보린, 시트로보룸 인자 및 폴린산으로도 공지됨)을 포함한다.
코드 번호, 일반명 또는 상표명에 의해 확인되는 활성 화합물의 구조는 표준 일람의 현행판 "The Merck Index"으로부터 또는 데이터베이스, 예를 들어 페이턴츠 인터내셔널 (예를 들어 IMS 월드 퍼블리케이션즈(IMS World Publications))로부터 입수할 수 있다.
본 발명의 화합물과 조합되어 사용될 수 있는 상기 언급된 화합물은 상기 인용된 문헌에서와 같이 관련 기술분야에 기재되어 있는 대로 제조되고 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 적어도 1종의 화합물 (예를 들어, 본 발명의 화합물) 또는 그의 제약상 허용되는 염을 인간 또는 동물 대상체에게 투여하는데 적합한 제약상 허용되는 담체와 함께 단독으로 또는 다른 항암제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 세포 증식성 질환, 예컨대 암을 앓고 있는 인간 또는 동물 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 이러한 치료를 필요로 하는 인간 또는 동물 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 화합물 (예를 들어, 본 발명의 화합물) 또는 그의 제약상 허용되는 염을 단독으로 또는 다른 항암제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
특히, 조성물은 조합 치료제로서 함께 제제화되거나 또는 개별적으로 투여될 것이다.
조합 요법에서, 본 발명의 화합물 및 다른 항암제(들)는 동시에, 공동으로 또는 어떠한 구체적 시간 제한 없이 순차적으로 투여될 수 있으며, 여기서 이러한 투여는 환자의 신체 내에서 2종의 화합물의 치료 유효 수준을 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 화합물 및 다른 항암제(들)는 일반적으로 주입에 의해 또는 경구로 임의의 순서로 순차적으로 투여된다. 투여 요법은 질환의 병기, 환자의 신체적 적합도, 개별 약물의 안전성 프로파일 및 개별 약물의 내성, 뿐만 아니라 조합물을 투여하는 담당 의사 및 의료 진료의(들)에게 널리 공지된 다른 기준에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 화합물 및 다른 항암제(들)는 치료에 사용되는 특정한 사이클에 따라 서로 수분, 수시간, 수일, 또는 심지어 수주 내로 이격되어 투여될 수 있다. 또한, 사이클은 치료 사이클 동안 하나의 약물을 다른 것보다 더 종종 투여하는 것 및 약물의 투여당 상이한 용량으로의 투여를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 1종 이상의 화합물 및 본원에 개시된 바와 같은 조합 파트너를 포함하는 키트가 제공된다. 대표적인 키트는 (a) 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, (b) 예를 들어 상기 나타낸 바와 같은 적어도 1종의 조합 파트너를 포함하며, 이에 의해 이러한 키트는 패키지 삽입물 및 투여 지침서를 비롯한 다른 라벨을 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 공지된 치료 과정, 예를 들어 호르몬의 투여 또는 특히 방사선과 조합되어 유리하게 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 특히 방사선증감제로서, 특히 방사선요법에 대해 불량한 감수성을 나타내는 종양의 치료를 위해 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 대상체에게 CAR-발현 세포의 투여와 연관된 부작용을 감소 또는 호전시키는 작용제를 투여할 수 있다. CAR-발현 세포의 투여와 연관된 부작용은 CRS, 및 대식세포 활성화 증후군 (MAS)으로도 불리는 혈구포식성 림프조직구증식증 (HLH)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. CRS의 증상은 고열, 오심, 일시적 저혈압, 저산소증 등을 포함한다. CRS는 임상적 체질 징후 및 증상, 예컨대 열, 피로, 식욕부진, 근육통, 관절통, 오심, 구토 및 두통을 포함할 수 있다. CRS는 임상적 피부 징후 및 증상, 예컨대 발진을 포함할 수 있다. CRS는 임상적 위장 징후 및 증상, 예컨대 오심, 구토 및 설사를 포함할 수 있다. CRS는 임상적 호흡 징후 및 증상, 예컨대 빈호흡 및 저산소혈증을 포함할 수 있다. CRS는 임상적 심혈관 징후 및 증상, 예컨대 빈맥, 확대된 맥압, 저혈압, 증가된 심장 박출량 (초기) 및 잠재적으로 감소된 심장 박출량 (후기)을 포함할 수 있다. CRS는 임상적 응고 징후 및 증상, 예컨대 상승된 d-이량체, 저섬유소원혈증 (출혈의 존재 또는 부재 하)을 포함할 수 있다. CRS는 임상적 신장 징후 및 증상, 예컨대 질소혈증을 포함할 수 있다. CRS는 임상적 간 징후 및 증상, 예컨대 트랜스아미니티스 및 고빌리루빈혈증을 포함할 수 있다. CRS는 임상 신경계 징후 및 증상, 예컨대 두통, 정신상태 변화, 혼동, 섬망, 단어 찾기 곤란 또는 명백한 실어증, 환각, 진전, 겨냥이상, 변경된 보행, 및 발작을 포함할 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 CAR-발현 세포를 대상체에게 투여하고, CAR-발현 세포를 사용한 치료로부터 생성되는 상승된 수준의 가용성 인자를 관리하기 위해 1종 이상의 작용제를 추가로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 대상체에서 상승되는 가용성 인자는 IFN-γ, TNFα, IL-2 및 IL-6 중 1종 이상이다. 한 실시양태에서, 대상체에서 상승되는 인자는 IL-1, GM-CSF, IL-10, IL-8, IL-5 및 프랙탈카인 중 1종 이상이다. 따라서, 이러한 부작용을 치료하기 위해 투여되는 작용제는 이들 가용성 인자 중 1종 이상을 중화시키는 작용제일 수 있다. 한 실시양태에서, 이들 가용성 형태 중 1종 이상을 중화시키는 작용제는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 이러한 작용제의 예는 스테로이드 (예를 들어, 코르티코스테로이드), TNFα의 억제제, 및 IL-6의 억제제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. TNFα 억제제의 예는 항-TNFα 항체 분자, 예컨대 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골 및 골리무맙이다. TNFα 억제제의 또 다른 예는 융합 단백질, 예컨대 에타네르셉트이다. TNFα의 소분자 억제제는 크산틴 유도체 (예를 들어 펜톡시필린) 및 부프로피온을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. IL-6 억제제의 예는 항-IL-6 항체 분자, 예컨대 토실리주맙 (toc), 사릴루맙, 엘실리모맙, CNTO 328, ALD518/BMS-945429, CNTO 136, CPSI-2364, CDP6038, VX30, ARGX-109, FE301, 및 FM101이다. 한 실시양태에서, 항-IL-6 항체 분자는 토실리주맙이다. IL-1R 기반 억제제의 예는 아나킨라이다.
일부 실시양태에서, 대상체에게 코르티코스테로이드, 예컨대 예를 들어, 특히 메틸프레드니솔론, 히드로코티손이 투여된다.
일부 실시양태에서, 대상체에게 혈관수축제, 예컨대 예를 들어, 노르에피네프린, 도파민, 페닐에프린, 에피네프린, 바소프레신, 또는 그의 조합이 투여된다.
한 실시양태에서, 대상체에게 해열제가 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 대상체에게 진통제가 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, 대상체에게 CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제가 투여될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 작용제는 억제 분자를 억제하는 작용제일 수 있고, 예를 들어 작용제는 체크포인트 억제제이다. 억제 분자, 예를 들어 프로그램화된 사멸 1 (PD1)은 일부 실시양태에서 면역 이펙터 반응을 일으키는 CAR-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 억제 분자의 예는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다. 예를 들어, DNA, RNA 또는 단백질 수준에서 억제에 의한 억제 분자의 억제는 CAR-발현 세포 성능을 최적화할 수 있다. 실시양태에서, 억제 핵산, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 예를 들어 dsRNA, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR), 전사-활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 또는 아연 핑거 엔도뉴클레아제 (ZFN)와 같은 억제 핵산이 CAR-발현 세포에서 억제 분자의 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 억제제는 shRNA이다. 한 실시양태에서, 억제 분자는 CAR-발현 세포 내에서 억제된다. 이들 실시양태에서, 억제 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자는 CAR의 성분, 예를 들어 모든 성분을 코딩하는 핵산에 연결된다.
한 실시양태에서, T-세포 기능을 조정 또는 조절, 예를 들어 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자는 T-세포 기능을 조정 또는 조절, 예를 들어 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자가 발현되도록, 예를 들어 CAR-발현 세포 내에서 발현되도록 프로모터, 예를 들어 H1- 또는 U6-유래 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 문헌 [Tiscornia G., "Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA," Chapter 3, in Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA (eds. Friedmann and Rossi). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2007; Brummelkamp TR, et al. (2002) Science 296: 550-553; Miyagishi M, et al. (2002) Nat. Biotechnol. 19: 497-500]을 참조한다. 한 실시양태에서, T-세포 기능을 조정 또는 조절, 예를 들어 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자는 CAR의 성분, 예를 들어 모든 성분을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 동일한 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터 상에 존재한다. 이러한 실시양태에서, T-세포 기능을 조정 또는 조절, 예를 들어 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자는 CAR의 성분, 예를 들어 모든 성분을 코딩하는 핵산에 5'- 또는 3'-로 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터 상에 위치한다. T-세포 기능을 조정 또는 조절, 예를 들어 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자는 CAR의 성분, 예를 들어 모든 성분을 코딩하는 핵산과 동일하거나 상이한 방향으로 전사될 수 있다. 한 실시양태에서, T-세포 기능을 조정 또는 조절, 예를 들어 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자는 CAR의 성분, 예를 들어 모든 성분을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터 이외의 벡터 상에 존재한다. 한 실시양태에서, T-세포 기능을 조정 또는 조절, 예를 들어 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자는 CAR-발현 세포 내에서 일시적으로 발현된다. 한 실시양태에서, T-세포 기능을 조정 또는 조절, 예를 들어 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자는 CAR-발현 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합된다. 도 51a-51e는 T-세포 기능을 조정 또는 조절, 예를 들어 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 갖는, CAR의 성분, 예를 들어 모든 성분을 발현시키기 위한 벡터의 예를 도시한다.
T-세포 기능을 조정 또는 조절, 예를 들어 억제하는 분자의 발현을 억제하는데 유용한 dsRNA 분자의 예가 하기 제공되고, 여기서 T-세포 기능을 조정 또는 조절, 예를 들어 억제하는 분자는 PD-1이다.
PDCD1 (PD1) RNAi 작용제의 명칭 (마우스 PDCD1 유전자 서열 NM_008798.2 내 그의 위치로부터 유래됨)이, DNA 서열을 나타내는 서열식별번호: 216-263과 함께 하기 표 16에 제공된다. 센스 (S) 및 안티센스 (AS) 서열 둘 다는 이러한 표에서 19mer 및 21mer 서열로서 표시된다. 또한, 위치 (PoS, 예를 들어, 176)는 마우스 PDCD1 유전자 서열 NM_008798.2 내 위치 번호로부터 유래된 것임을 주목한다. "sense 19" 서열식별번호: 608-619; "sense 21" 서열식별번호: 620-631; "asense 21" 서열식별번호: 632-643; "asense 19" 서열식별번호: 644-655에 상응하는 12개의 군에 서열식별번호가 표시된다.
<표 16> 마우스 PDCD1 (PD1) shRNA 서열
Figure pct00109
PDCD1 (PD1) RNAi 작용제의 명칭 (인간 PDCD1 유전자 서열 내 그의 위치로부터 유래됨)이, DNA 서열을 나타내는 서열식별번호: 264-311과 함께 하기 표 17에 제공된다. 센스 (S) 및 안티센스 (AS) 서열 둘 다는 19mer 및 21mer 서열로서 표시된다. "sense 19" 서열식별번호: 656-667; "sense 21" 서열식별번호: 668-679; "asense 21" 서열식별번호: 680-691; "asense 19" 서열식별번호: 692-703에 상응하는 12개의 군에 서열식별번호가 표시된다.
<표 17> 인간 PDCD1 (PD1) shRNA 서열
Figure pct00110
한 실시양태에서, 억제 신호의 억제제는, 예를 들어 억제 분자에 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 예를 들어, 작용제는 PD1, PD-L1, PD-L2 또는 CTLA4 (예를 들어, 이필리무맙 (MDX-010 및 MDX-101로도 지칭되고, 예르보이(Yervoy)®로서 시판됨; 브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb)); 트레멜리무맙 (화이자(Pfizer)로부터 이용가능한 IgG2 모노클로날 항체, 이전에 티실리무맙, CP-675,206으로서 공지됨))에 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 한 실시양태에서, 작용제는 TIM3에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 작용제는 LAG3에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다. 실시양태에서, CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제, 예를 들어 억제 분자의 억제제는 동종 CAR, 예를 들어 본원에 기재된 동종 CAR (예를 들어, 본원의 동종 CAR 섹션에 기재된)과 조합되어 투여된다.
PD-1은 CD28, CTLA-4, ICOS, 및 BTLA를 또한 포함하는 CD28 패밀리의 수용체의 억제 구성원이다. PD-1은 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수 세포 상에서 발현된다 (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). PD-1에 대한 2개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2는 PD-1에 결합 시 T 세포 활성화를 하향조절하는 것으로 제시된 바 있다 (Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1은 인간 암에서 풍부하다 (Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). 면역 억제는 PD-1과 PD-L1의 국부 상호작용을 억제함으로써 역전될 수 있다.
PD-1, PD-L1 및 PD-L2의 항체, 항체 단편 및 다른 억제제는 관련 기술분야에서 입수가능하고, 본원에 기재된 본 발명의 CAR과 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 니볼루맙 (BMS-936558 또는 MDX1106으로도 지칭됨; 브리스톨-마이어스 스큅)은 PD-1을 특이적으로 차단하는 완전 인간 IgG4 모노클로날 항체이다. 니볼루맙 (클론 5C4) 및 PD-1에 특이적으로 결합하는 다른 인간 모노클로날 항체는 US 8,008,449 및 WO2006/121168에 기재되어 있다. 피딜리주맙 (CT-011; 큐어 테크(Cure Tech))은 PD-1에 결합하는 인간화 IgG1k 모노클로날 항체이다. 피딜리주맙 및 다른 인간화 항-PD-1 모노클로날 항체는 WO2009/101611에 기재되어 있다. 펨브롤리주맙 (이전에 람브롤리주맙으로 공지되고, MK03475로도 지칭됨; 머크(Merck))은 PD-1에 결합하는 인간화 IgG4 모노클로날 항체이다. 펨브롤리주맙 및 다른 인간화 항-PD-1 항체는 US 8,354,509 및 WO2009/114335에 개시되어 있다. MEDI4736 (메드이뮨(Medimmune))은 PDL1에 결합하는 인간 모노클로날 항체이고, 리간드가 PD1과 상호작용하는 것을 억제한다. MDPL3280A (제넨테크/로슈)는 PD-L1에 결합하는 인간 Fc 최적화된 IgG1 모노클로날 항체이다. MDPL3280A 및 PD-L1에 대한 다른 인간 모노클로날 항체는 미국 특허 7,943,743 및 미국 특허 출원 공개 20120039906에 개시되어 있다. 다른 항-PD-L1 결합제는 YW243.55.S70 (중쇄 및 경쇄 가변 영역이 WO2010/077634의 서열식별번호: 20 및 21에 제시되어 있음) 및 MDX-1 105 (BMS-936559로도 지칭됨, 예를 들어 WO2007/005874에 개시된 항-PD-L1 결합제)를 포함한다. AMP-224 (B7-DCIg; 암플리뮨 (Amplimmune); 예를 들어 WO2010/027827 및 WO2011/066342에 개시됨)는 PD-1 및 B7-H1 사이의 상호작용을 차단하는 PD-L2 Fc 융합 가용성 수용체이다. 다른 항-PD-1 항체는 AMP 514 (암플리뮨), 특히 예를 들어 US 8,609,089, US 2010028330 및/또는 US 20120114649에 개시된 항-PD-1 항체를 포함한다.
한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 또는 그의 단편은 그 전문이 참조로 포함되는 US 2015/0210769, 표제 "Antibody Molecules to PD-1 and Uses Thereof"에 기재된 바와 같은 항-PD-1 항체 분자이다. 한 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 BAP049-hum01, BAP049-hum02, BAP049-hum03, BAP049-hum04, BAP049-hum05, BAP049-hum06, BAP049-hum07, BAP049-hum08, BAP049-hum09, BAP049-hum10, BAP049-hum11, BAP049-hum12, BAP049-hum13, BAP049-hum14, BAP049-hum15, BAP049-hum16, BAP049-Clone-A, BAP049-Clone-B, BAP049-Clone-C, BAP049-Clone-D, 또는 BAP049-Clone-E 중 임의의 것으로부터 선택된; 또는 US 2015/0210769의 표 1에 기재된 바와 같은, 또는 표 1의 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 서열 중 임의의 것과 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과로 동일한) 서열에 의해 코딩된 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로부터의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR (또는 집합적으로 모든 CDR); 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예를 들어 동일하거나 또는 적어도 1개의 아미노산 변경을 갖지만 2, 3 또는 4개 이하의 변경 (예를 들어, 치환, 결실, 또는 삽입, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-PD-1 항체 분자는 본원에 기재된 항체, 예를 들어 BAP049-hum01, BAP049-hum02, BAP049-hum03, BAP049-hum04, BAP049-hum05, BAP049-hum06, BAP049-hum07, BAP049-hum08, BAP049-hum09, BAP049-hum10, BAP049-hum11, BAP049-hum12, BAP049-hum13, BAP049-hum14, BAP049-hum15, BAP049-hum16, BAP049-Clone-A, BAP049-Clone-B, BAP049-Clone-C, BAP049-Clone-D, 또는 BAP049-Clone-E 중 임의의 것으로부터 선택된; 또는 US 2015/0210769의 표 1에 기재된 바와 같은, 또는 표 1의 뉴클레오티드 서열; 또는 상기 서열 중 임의의 것과 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과로 동일한) 서열에 의해 코딩된 항체로부터의 적어도 1, 2, 3 또는 4개의 가변 영역을 포함한다.
TIM3 (T 세포 이뮤노글로불린-3)은 또한, 특히 IFN-g-분비 CD4+ T 헬퍼 1 및 CD8+ T 세포독성 1 세포에서 T 세포 기능을 음성적으로 조절하고, T 세포 소진에서 중요한 역할을 한다. TIM3 및 그의 리간드, 예를 들어 갈렉틴-9 (Gal9), 포스포티딜세린 (PS), 및 HMGB1 사이의 상호작용의 억제는 면역 반응을 증가시킬 수 있다. TIM3 및 그의 리간드의 항체, 항체 단편, 및 다른 억제제는 관련 기술분야에서 이용가능하고, 본원에 기재된 CD19 CAR과 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, TIM3을 표적화하는 항체, 항체 단편, 소분자, 또는 펩티드 억제제는 TIM3의 IgV 도메인에 결합하여, 그의 리간드와의 상호작용을 억제한다. TIM3을 억제하는 항체 및 펩티드는 WO2013/006490 및 US20100247521에 개시되어 있다. 다른 항-TIM3 항체는 인간화 버전의 RMT3-23 (문헌 [Ngiow et al., 2011, Cancer Res, 71:3540-3551]에 개시됨), 및 클론 8B.2C12 (문헌 [Monney et al., 2002, Nature, 415:536-541]에 개시됨)를 포함한다. TIM3 및 PD-1을 억제하는 이중-특이적 항체는 US20130156774에 개시되어 있다.
한 실시양태에서, 항-TIM3 항체 또는 그의 단편은 그 전문이 참조로 포함되는 US 2015/0218274, 표제 "Antibody Molecules to TIM3 and Uses Thereof"에 기재된 바와 같은 항-TIM3 항체 분자이다. 한 실시양태에서, 항-TIM3 항체 분자는 ABTIM3, ABTIM3-hum01, ABTIM3-hum02, ABTIM3-hum03, ABTIM3-hum04, ABTIM3-hum05, ABTIM3-hum06, ABTIM3-hum07, ABTIM3-hum08, ABTIM3-hum09, ABTIM3-hum10, ABTIM3-hum11, ABTIM3-hum12, ABTIM3-hum13, ABTIM3-hum14, ABTIM3-hum15, ABTIM3-hum16, ABTIM3-hum17, ABTIM3-hum18, ABTIM3-hum19, ABTIM3-hum20, ABTIM3-hum21, ABTIM3-hum22, ABTIM3-hum23 중 임의의 것으로부터 선택된; 또는 US 2015/0218274의 표 1-4에 기재된 바와 같은; 또는 표 1-4의 뉴클레오티드 서열; 또는 상기 서열 중 임의의 것과 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과로 동일한) 서열에 의해 코딩된 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로부터의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR (또는 집합적으로 모든 CDR), 또는 밀접하게 관련된 CDR, 예를 들어 동일하거나 또는 적어도 1개의 아미노산 변경을 갖지만 2, 3 또는 4개 이하의 변경 (예를 들어, 치환, 결실, 또는 삽입, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 CDR을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항-TIM3 항체 분자는 본원에 기재된 항체, 예를 들어 ABTIM3, ABTIM3-hum01, ABTIM3-hum02, ABTIM3-hum03, ABTIM3-hum04, ABTIM3-hum05, ABTIM3-hum06, ABTIM3-hum07, ABTIM3-hum08, ABTIM3-hum09, ABTIM3-hum10, ABTIM3-hum11, ABTIM3-hum12, ABTIM3-hum13, ABTIM3-hum14, ABTIM3-hum15, ABTIM3-hum16, ABTIM3-hum17, ABTIM3-hum18, ABTIM3-hum19, ABTIM3-hum20, ABTIM3-hum21, ABTIM3-hum22, ABTIM3-hum23 중 임의의 것으로부터 선택된; 또는 US 2015/0218274의 표 1-4에 기재된 바와 같은, 또는 표 1-4의 뉴클레오티드 서열; 또는 상기 서열 중 임의의 것과 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과로 동일한) 서열에 의해 코딩된 항체로부터의 적어도 1, 2, 3 또는 4개의 가변 영역을 포함한다.
다른 실시양태에서, CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제는 CEACAM 억제제 (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3, 및/또는 CEACAM-5 억제제)이다. 한 실시양태에서, CEACAM의 억제제는 항-CEACAM 항체 분자이다. 예시적인 항-CEACAM-1 항체, 예를 들어 모노클로날 항체 34B1, 26H7, 및 5F4가 WO 2010/125571, WO 2013/082366 WO 2014/059251 및 WO 2014/022332에 기재되어 있거나; 또는 그의 제조합 형태는 예를 들어 US 2004/0047858, US 7,132,255 및 WO 99/052552에 기재된 바와 같다. 다른 실시양태에서, 항-CEACAM 항체는 예를 들어 문헌 [Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146)]에 기재된 바와 같이 CEACAM-5에 결합하거나, 또는 예를 들어 WO 2013/054331 및 US 2014/0271618에 기재된 바와 같이 CEACAM-1 및 CEACAM-5와 교차반응한다.
이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 암배아성 항원 세포 부착 분자 (CEACAM), 예컨대 CEACAM-1 및 CEACAM-5는, 적어도 부분적으로, 항종양 면역 반응의 억제를 매개하는 것으로 여겨진다 (예를 들어, 문헌 [Markel et al. J Immunol. 2002 Mar 15;168(6):2803-10; Markel et al. J Immunol. 2006 Nov 1;177(9):6062-71; Markel et al. Immunology. 2009 Feb;126(2):186-200; Markel et al. Cancer Immunol Immunother. 2010 Feb;59(2):215-30; Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. 2012 Jun;11(6):1300-10; Stern et al. J Immunol. 2005 Jun 1;174(11):6692-701; Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529] 참조). 예를 들어, CEACAM-1은 TIM-3에 대한 이종친화성 리간드로서 및 TIM-3-매개 T 세포 관용 및 소진에서 역할을 하는 것으로서 기재되어 있다 (예를 들어, WO 2014/022332; 문헌 [Huang, et al. (2014) Nature doi:10.1038/nature13848] 참조). 실시양태에서, CEACAM-1 및 TIM-3의 공동-차단은 이종이식편 결장직장암 모델에서 항종양 면역 반응을 증진시키는 것으로 밝혀진 바 있다 (예를 들어, WO 2014/022332; 상기 문헌 [Huang, et al. (2014)] 참조). 다른 실시양태에서, CEACAM-1 및 PD-1의 공동-차단은 예를 들어 WO 2014/059251에 기재된 바와 같이 T 세포 관용을 감소시킨다. 따라서, CEACAM 억제제는 본원에 기재된 다른 면역조정제 (예를 들어, 항-PD-1 및/또는 항-TIM-3 억제제)와 함께 사용되어 암, 예를 들어 흑색종, 폐암 (예를 들어, NSCLC), 방광암, 결장암, 난소암 및 본원에 기재된 바와 같은 다른 암에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있다.
LAG3 (림프구 활성화 유전자-3 또는 CD223)은 CD8+ T 세포 소진에서 소정의 역할을 하는 것으로 밝혀진 바 있는, 활성화된 T 세포 및 B 세포 상에서 발현되는 세포 표면 분자이다. LAG3 및 그의 리간드의 항체, 항체 단편, 및 다른 억제제는 관련 기술분야에서 이용가능하고, 본원에 기재된 CD19 CAR과 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, BMS-986016 (브리스톨-마이어스 스큅)은 LAG3을 표적화하는 모노클로날 항체이다. IMP701 (이뮤텝(Immutep))은 길항제 LAG3 항체이고, IMP731 (이뮤텝 및 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline))은 고갈 LAG3 항체이다. 다른 LAG3 억제제는, MHC 부류 II 분자에 결합하고 항원 제시 세포 (APC)를 활성화시키는 LAG3의 가용성 부분 및 Ig의 재조합 융합 단백질인 IMP321 (이뮤텝)을 포함한다. 다른 항체는 예를 들어 WO2010/019570에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제는 예를 들어, 제1 도메인 및 제2 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있고, 여기서 제1 도메인은 억제 분자 또는 그의 단편이고, 제2 도메인은 양성 신호와 연관된 폴리펩티드, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 양성 신호와 연관된 폴리펩티드는 CD28, CD27, ICOS의 공동자극 도메인, 예를 들어 CD28, CD27 및/또는 ICOS의 세포내 신호전달 도메인, 및/또는 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 CD3 제타의 1차 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 융합 단백질은 CAR을 발현하는 동일한 세포에 의해 발현된다. 또 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 CD123 CAR을 발현하지 않는 세포, 예를 들어 T 세포에 의해 발현된다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제는 miR-17-92이다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR의 활성을 증진시키는 작용제는 시토카인이다. 시토카인은 T 세포 확장, 분화, 생존, 및 항상성과 관련하여 중요한 기능을 갖는다. 본원에 기재된 CAR-발현 세포를 제공받은 대상체에게 투여될 수 있는 시토카인은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-18, 및 IL-21, 또는 그의 조합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 투여되는 시토카인은 IL-7, IL-15, 또는 IL-21, 또는 그의 조합이다. 시토카인은 1일에 1회, 또는 1일에 1회 초과, 예를 들어 1일에 2회, 1일에 3회, 또는 1일에 4회 투여될 수 있다. 시토카인은 1일 초과 동안 투여될 수 있고, 예를 들어 시토카인은 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주 또는 4주 동안 투여된다. 예를 들어, 시토카인은 7일 동안 1일에 1회 투여된다.
실시양태에서, 시토카인은 CAR-발현 T 세포와 조합되어 투여된다. 시토카인은 CAR-발현 T 세포와 동시에 또는 공동으로 투여, 예를 들어 동일한 날에 투여될 수 있다. 시토카인은 CAR-발현 T 세포와 동일한 제약 조성물 내에 제조될 수 있거나, 또는 개별 제약 조성물로 제조될 수 있다. 대안적으로, 시토카인은 CAR-발현 T 세포의 투여 직후, 예를 들어 CAR-발현 T 세포의 투여 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 후에 투여될 수 있다. 시토카인이 1일 초과에 걸쳐 이루어지는 투여 요법으로 투여되는 실시양태에서, 시토카인 투여 요법의 제1일은 CAR-발현 T 세포에 의한 투여와 동일한 날일 수 있거나, 또는 시토카인 투여 요법의 제1일은 CAR-발현 T 세포의 투여 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 후일 수 있다. 한 실시양태에서, 제1일에 CAR-발현 T 세포가 대상체에게 투여되고, 제2일에 시토카인이 다음 7일 동안 1일에 1회 투여된다. 바람직한 실시양태에서, CAR-발현 T 세포와 조합되어 투여되는 시토카인은 IL-7, IL-15, 또는 IL-21이다.
다른 실시양태에서, 시토카인은 CAR-발현 세포의 투여의 소정의 기간 후, 예를 들어 CAR-발현 세포의 투여의 적어도 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 10주, 12주, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 또는 1년 또는 그 초과 후에 투여된다. 한 실시양태에서, 시토카인은 CAR-발현 세포에 대한 대상체의 반응의 평가 후에 투여된다. 예를 들어, 본원에 기재된 투여량 및 요법에 따라 대상체에게 CAR-발현 세포가 투여된다. CAR-발현 세포 요법에 대한 대상체의 반응은 종양 성장의 억제, 순환 종양 세포의 감소, 또는 종양 퇴행을 비롯한 본원에 기재된 임의의 방법을 사용하여, CAR-발현 세포의 투여의 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 10주, 12주, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 또는 1년 또는 그 초과 후에 평가된다. CAR-발현 세포 요법에 대해 충분한 반응을 나타내지 않는 대상체에게 시토카인이 투여될 수 있다. CAR-발현 세포 요법에 대해 준-최적 반응을 갖는 대상체에게의 시토카인의 투여는 CAR-발현 세포 효능 또는 항암 활성을 개선시킨다. 바람직한 실시양태에서, CAR-발현 세포의 투여 후에 투여되는 시토카인은 IL-7이다.
CD19 억제제와의 조합
본원에 개시된 방법 및 조성물은 CD19 억제제와 조합되어 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, CD123CAR-함유 세포 및 CD19 억제제 (예를 들어, CD19에 결합하는 CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CD19에 결합하는 CAR 분자를 발현하는 1종 이상의 세포)는 동시에 또는 공동으로 또는 순차적으로 투여된다.
일부 실시양태에서, CD123CAR-함유 세포 및 CD19 억제제는 대상체 내로 동시에 또는 공동으로 주입되고, 예를 들어 동일한 주입 부피로 혼합된다. 예를 들어, CD123CAR-함유 세포 및 CD19CAR-함유 세포의 집단은 함께 혼합된다. 대안적으로, CD123CAR 및 CD19CAR을 공동-발현하는 세포의 집단이 투여된다. 다른 실시양태에서, 동시 투여는 CD123CAR-함유 세포 및 CD19 억제제의, 예를 들어 미리 결정된 시간 간격 내 (예를 들어, 서로 15, 30, 또는 45분 내)에서의 개별 투여를 포함한다.
일부 실시양태에서, CD123CAR-함유 세포의 시작 및 CD19 억제제의 시작은 서로 1, 2, 3, 4, 6, 12, 18, 또는 24시간 내, 또는 서로 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 60, 80, 또는 100일 내이다. 일부 실시양태에서, CD123CAR-함유 세포 전달의 종료 및 CD19 억제제 전달의 종료는 서로 1, 2, 3, 4, 6, 12, 18, 또는 24시간 내, 또는 서로 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 60, 80, 또는 100일 내이다. 일부 실시양태에서, 투여와 관련하여 CD123CAR-함유 세포 전달 (예를 들어, 주입)과 CD19 억제제 전달 (예를 들어, 주입)의 종료 사이의 중첩은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30분이다. 한 실시양태에서, CD19 억제제는 CD123CAR-함유 세포 전에 투여된다. 다른 실시양태에서, CD123CAR-함유 세포는 CD19 억제제 전에 투여된다.
일부 실시양태에서, CD123CAR-함유 세포는 CD19 억제제 (예를 들어, CD19CAR 분자를 발현하는 하나 이상의 세포)가 대상체 내에 존재하는 (예를 들어, 세포가 확장을 거치고 있는) 동안 투여된다. 다른 실시양태에서, CD19 억제제 (예를 들어, CD19CAR 분자를 발현하는 하나 이상의 세포)는 CD123CAR-함유 세포가 대상체 내에 존재하는 (예를 들어, 세포가 확장을 거치로 있는) 동안 투여된다.
CD19 억제제는 CD19 CAR-발현 세포, 예를 들어 CD19 CART 세포 또는 항-CD19 항체 (예를 들어, 항-CD19 단일- 또는 이중특이적 항체) 또는 그의 단편 또는 접합체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 CD19 CAR-세포 (예를 들어, CART 세포) (예를 들어 본원에 참조로 포함되는 WO2012/079000에 기재된 바와 같은 예를 들어 CTL019)와 조합되어 대상체에게 투여된다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 본원에 참조로 포함되는 WO2014/153270 (예를 들어, WO2014/153270의 표 3)에 기재된 바와 같은 인간화 항원 결합 도메인을 포함하는 CD19 CAR-세포 (예를 들어, CART 세포)와 조합되어 대상체에게 투여된다.
CD19 억제제 (예를 들어, 제1 CD19 CAR-발현 세포) 및 제2 CD123 CAR-발현 세포는 동일한 세포 유형 또는 상이한 유형에 의해 발현될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, CD19 CAR을 발현하는 세포는 CD4+ T 세포이고 CD123 CAR을 발현하는 세포는 CD8+ T 세포이거나, 또는 CD19 CAR을 발현하는 세포는 CD8+ T 세포이고 CD123 CAR을 발현하는 세포는 CD4+ T 세포이다. 다른 실시양태에서, CD19 CAR을 발현하는 세포는 T 세포이고 CD123 CAR을 발현하는 세포는 NK 세포이거나, 또는 CD19 CAR을 발현하는 세포는 NK 세포이고 CD123 CAR을 발현하는 세포는 T 세포이다. 다른 실시양태에서, CD19 CAR을 발현하는 세포 및 CD123 CAR을 발현하는 세포는 둘 다 NK 세포이거나 또는 둘 다 T 세포이고, 예를 들어 둘 다 CD4+ T 세포이거나 또는 둘 다 CD8+ T 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 단일 세포가 CD19 CAR 및 CD123 CAR을 발현하고, 이 세포는 예를 들어 NK 세포 또는 T 세포, 예컨대 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포이다.
제1 CAR 및 제2 CAR은 동일하거나 상이한 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 CD19 CAR은 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하고 CD123 CAR은 공동자극 도메인, 예를 들어 41BB, CD27 또는 CD28 공동자극 도메인을 포함하는 한편, 일부 실시양태에서 CD19 CAR은 공동자극 도메인, 예를 들어 41BB, CD27 또는 CD28 공동자극 도메인을 포함하고 CD123 CAR은 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, 각각의 CD19 CAR 및 CD123 CAR은 동일한 유형의 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하지만, CD19 CAR 및 CD123 CAR은 상이한 공동자극 도메인을 포함하고, 예를 들어 (1) CD19 CAR은 41BB 공동자극 도메인을 포함하고 CD123 CAR은 상이한 공동자극 도메인, 예를 들어 CD27 공동자극 도메인을 포함하거나, (2) CD19 CAR은 CD27 공동자극 도메인을 포함하고 CD123 CAR은 상이한 공동자극 도메인, 예를 들어 41BB 공동자극 도메인을 포함하거나, (3) CD19 CAR은 41BB 공동자극 도메인을 포함하고 CD123 CAR은 CD28 공동자극 도메인을 포함하거나, (4) CD19 CAR은 CD28 공동자극 도메인을 포함하고 CD123 CAR은 상이한 공동자극 도메인, 예를 들어 41BB 공동자극 도메인을 포함하거나, (5) CD19 CAR은 CD27 공동자극 도메인을 포함하고 CD123 CAR은 CD28 공동자극 도메인을 포함하거나, 또는 (6) CD19 CAR은 CD28 공동자극 도메인을 포함하고 CD123 CAR은 CD27 공동자극 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 CD19 항원-결합 도메인 및 CD123 항원-결합 도메인 둘 다, 예를 들어 이중특이적 항체를 포함하는 CAR을 포함한다.
실시양태에서, 대상체는 급성 골수성 백혈병 (AML), 예를 들어 CD19 양성 AML 또는 CD19 음성 AML을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 CD19+ 림프종, 예를 들어 CD19+ 비-호지킨 림프종 (NHL), CD19+ FL, 또는 CD19+ DLBCL을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 재발성 또는 불응성 CD19+ 림프종을 갖는다. 실시양태에서, 림프구고갈 화학요법은 CD19 CART 세포의 투여 (예를 들어, 주입) 전, 그와 공동으로, 또는 그 후에 대상체에게 투여된다. 한 예에서, 림프구고갈 화학요법은 CD19 CART 세포의 투여 전 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 림프구고갈 화학요법은 CD19 CART 세포 주입의 1-4일 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4일) 전에 종료된다. 실시양태에서, CD19 CART 세포의 다중 용량은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 투여된다. 예를 들어, 단일 용량은 약 5 x 108개의 CD19 CART 세포를 포함한다. 실시양태에서, 림프구고갈 화학요법은 본원에 기재된 CAR-발현 세포, 예를 들어 비-CD19 CAR-발현 세포의 투여 (예를 들어, 주입) 전, 그와 공동으로, 또는 그 후에 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, CD19 CART는 비-CD19 CAR-발현 세포, 예를 들어 본원에 기재된 비-CD19 CAR-발현 세포의 투여 (예를 들어, 주입) 전, 그와 공동으로, 또는 그 후에 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 CD123의 발현과 연관된 질환, 예를 들어 본원에 기재된 암의 치료를 위해 CD19 CAR-발현 세포, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 WO2012/079000에 기재된 바와 같은 예를 들어 CTL019와 조합되어 대상체에게 투여된다. 이론에 얽매이지는 않지만, CD19 CAR-발현 세포를 CAR-발현 세포와 조합하여 투여하는 것은 초기 계열 암 세포, 예를 들어 암 줄기 세포를 표적화하고/거나, 면역 반응을 조정하고/거나, 조절 B 세포를 고갈시키고/거나, 종양 미세환경을 개선시킴으로써 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 효능을 개선시키는 것으로 여겨진다. 예를 들어, CD19 CAR-발현 세포는 초기 계열 마커를 발현하는 암 세포, 예를 들어 암 줄기 세포 및 CD19-발현 세포를 표적화하는 한편, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 후기 계열 마커, 예를 들어 CD123을 발현하는 암 세포를 표적화한다. 이러한 사전컨디셔닝 접근법은 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 효능을 개선시킬 수 있다. 이러한 실시양태에서, CD19 CAR-발현 세포는 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 투여 (예를 들어, 주입) 전, 그와 공동으로, 또는 그 후에 투여된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 또한 CD19를 표적화하는 CAR, 예를 들어 CD19 CAR을 발현한다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 및 CD19 CAR을 발현하는 세포는 본원에 기재된 암, 예를 들어 AML의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 한 실시양태에서, CAR 분자 중 하나 또는 둘 다의 구성은 1차 세포내 신호전달 도메인 및 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CAR 분자 중 하나 또는 둘 다의 구성은 1차 세포내 신호전달 도메인 및 2개 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 또는 5개 또는 그 초과의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. 이러한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 분자 및 CD19 CAR은 동일하거나 상이한 1차 세포내 신호전달 도메인, 동일하거나 상이한 공동자극 신호전달 도메인, 또는 동일한 수 또는 상이한 수의 공동자극 신호전달 도메인을 가질 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 CAR 및 CD19 CAR은 스플릿 CAR로서 구성되고, 여기서 CAR 분자 중 하나는 항원 결합 도메인 및 공동자극 도메인 (예를 들어, 4-1BB)을 포함하는 한편, 다른 CAR 분자는 항원 결합 도메인 및 1차 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, CD3 제타)을 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 및 제2 CAR, 예를 들어 CD19 CAR은 동일한 벡터 상에 있거나, 2개의 상이한 벡터 상에 있다. 본원에 기재된 CAR 및 제2 CAR, 예를 들어 CD19 CAR이 동일한 벡터 상에 있는 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 및 제2 CAR, 예를 들어 CD19 CAR을 코딩하는 핵산 서열은 동일한 프레임 내에 존재하고, 1개 이상의 펩티드 절단 부위, 예를 들어 P2A에 의해 분리된다.
다른 실시양태에서, 본원에 개시된 CAR-발현 세포는 항-CD19 항체 억제제와 조합되어 투여된다. 한 실시양태에서, 항-CD19 항체는 본원에 참조로 포함되는 WO2014/153270 (예를 들어, WO2014/153270의 표 3)에 기재된 바와 같은 인간화 항원 결합 도메인 또는 그의 접합체이다. 다른 예시적인 항-CD19 항체 또는 그의 단편 또는 접합체는 블리나투모맙, SAR3419 (사노피(Sanofi)), MEDI-551 (메드이뮨 엘엘씨(MedImmune LLC)), 콤보톡스, DT2219ARL (매소닉 암 센터), MOR-208 (XmAb-5574로도 불림; 모르포시스(MorphoSys)), XmAb-5871 (젠코르(Xencor)), MDX-1342 (브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb)), SGN-CD19A (시애틀 제네틱스(Seattle Genetics)), 및 AFM11 (아피메드 테라퓨틱스(Affimed Therapeutics))을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [Hammer. MAbs. 4.5(2012): 571-77]을 참조한다. 블리나투모맙은 2개의 scFv - CD19에 결합하는 것과 CD3에 결합하는 것으로 구성된 이중특이적 항체이다. 블리나투모맙은 T 세포가 암 세포를 공격할 것을 지시한다. 예를 들어, 문헌 [Hammer et al.; 임상 시험 식별자 번호 NCT00274742 및 NCT01209286]을 참조한다. MEDI-551은 증진된 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 갖도록 조작된 Fc를 갖는 인간화 항-CD19 항체이다. 예를 들어, 문헌 [Hammer et al.; 및 임상 시험 식별자 번호 NCT01957579]를 참조한다. 콤보톡스는 CD19 및 CD22에 결합하는 면역독소의 혼합물이다. 면역독소는 탈글리코실화 리신 A 쇄에 융합된 scFv 항체 단편으로 구성된다. 예를 들어, 문헌 [Hammer et al.; 및 Herrera et al. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 31.12(2009):936-41; Schindler et al. Br. J. Haematol. 154.4(2011):471-6]을 참조한다. DT2219ARL은 2개의 scFv 및 말단절단된 디프테리아 독소를 포함하는, CD19 및 CD22를 표적화하는 이중특이적 면역독소이다. 예를 들어, 문헌 [Hammer et al.; 및 임상 시험 식별자 번호 NCT00889408]을 참조한다. SGN-CD19A는 합성 세포독성 세포-사멸제, 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)에 연결된 항-CD19 인간화 모노클로날 항체로 구성된 항체-약물 접합체 (ADC)이다. 예를 들어, 문헌 [Hammer et al.; 및 임상 시험 식별자 번호 NCT01786096 및 NCT01786135]를 참조한다. SAR3419는 절단가능한 링커를 통해 메이탄신 유도체에 접합된 항-CD19 인간화 모노클로날 항체를 포함하는 항-CD19 항체-약물 접합체 (ADC)이다. 예를 들어, 문헌 [Younes et al. J. Clin. Oncol. 30.2(2012): 2776-82; Hammer et al.; 임상 시험 식별자 번호 NCT00549185; 및 Blanc et al. Clin Cancer Res. 2011;17:6448-58]을 참조한다. XmAb-5871은 Fc-조작된, 인간화 항-CD19 항체이다. 예를 들어, 문헌 [Hammer et al.]을 참조한다. MDX-1342는 증진된 ADCC를 갖는 인간 Fc-조작된 항-CD19 항체이다. 예를 들어, 문헌 [Hammer et al.]을 참조한다. 실시양태에서, 항체 분자는 이중특이적 항-CD19 및 항-CD3 분자이다. 예를 들어, AFM11은 CD19 및 CD3을 표적화하는 이중특이적 항체이다. 예를 들어, 문헌 [Hammer et al.; 및 임상 시험 식별자 번호 NCT02106091]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CD19 항체는 치료제, 예를 들어 화학요법제, 펩티드 백신 (예컨대 문헌 [Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971]에 기재된 것), 면역억제제 또는 면역절제제, 예를 들어 시클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, FK506, 캄파트, 항-CD3 항체, 시톡신, 플루다라빈, 라파마이신, 미코페놀산, 스테로이드, FR901228 또는 시토카인에 접합되거나 또는 달리 결합된다.
낮은 용량의 mTOR 억제제와의 조합
본원에 기재된 방법은 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제, 예를 들어 라파로그, 예컨대 RAD001을 비롯한 알로스테릭 mTOR 억제제를 사용한다. 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제 (예를 들어, 면역계를 완전히 억제하기에 불충분하지만 면역 기능을 개선시키기에는 충분한 용량)의 투여는 대상체에서 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 CAR-발현 세포의 성능을 최적화할 수 있다. mTOR 억제를 측정하는 방법, 투여량, 치료 요법, 및 적합한 제약 조성물은 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 번호 2015/01240036에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제의 투여는 하기:
i) PD-1 양성 면역 이펙터 세포의 수에서의 감소;
ii) PD-1 음성 면역 이펙터 세포의 수에서의 증가;
iii) PD-1 음성 면역 이펙터 세포 / PD-1 양성 면역 이펙터 세포의 비에서의 증가;
iv) 나이브 T 세포의 수에서의 증가;
v) 예를 들어 기억 T 세포, 예를 들어 기억 T 세포 전구체 상에서의 하기 마커 중 1종 이상의 발현에서의 증가: CD62L고, CD127고, CD27+, 및 BCL2;
vi) 예를 들어 기억 T 세포, 예를 들어 기억 T 세포 전구체 상에서의 KLRG1의 발현에서의 감소; 또는
vii) 기억 T 세포 전구체, 예를 들어 하기 특징 중 어느 하나 또는 그의 조합을 갖는 세포의 수에서의 증가: 증가된 CD62L고, 증가된 CD127고, 증가된 CD27+, 감소된 KLRG1, 및 증가된 BCL2
중 1종 이상을 발생시킬 수 있고; 여기서 상기 중 임의의 것, 예를 들어 i), ii), iii), iv), v), vi), 또는 vii)은 예를 들어 비-처리 대상체와 비교하여 예를 들어 적어도 일시적으로 발생한다.
또 다른 실시양태에서, 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제의 투여는, 예를 들어 배양물 또는 대상체에서, 예를 들어 비-처리 CAR-발현 세포 또는 비-처리 대상체와 비교하여 CAR-발현 세포의 증가 또는 연장된 증식을 발생시킨다. 실시양태에서, 증가된 증식은 CAR-발현 세포의 수에서의 증가와 연관된다. 증가 또는 연장된 증식을 측정하는 방법은 실시예 9 및 10에 기재되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제의 투여는, 예를 들어 배양물 또는 대상체에서, 예를 들어 비-처리 CAR-발현 세포 또는 비-처리 대상체와 비교하여 CAR-발현 세포에 의한 암 세포의 증가된 사멸을 발생시킨다. 실시양태에서, 암 세포의 증가된 사멸은 종양 부피에서의 감소와 연관된다. 암 세포의 증가된 사멸을 측정하는 방법은 실시예 2에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포는 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제제, 예를 들어 RAD001, 또는 촉매 mTOR 억제제와 조합되어 투여된다. 예를 들어, 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제의 투여는 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 투여 전에 개시되거나; 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 투여 전에 완결되거나; 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 투여와 동시에 개시되거나; 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 투여와 중첩되거나; 또는 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 투여 후에 계속될 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제의 투여는 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하도록 조작하기 위해 면역 이펙터 세포를 최적화할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 억제제, 예를 들어 RAD001, 또는 촉매 억제제의 투여는 대상체로부터 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하도록 조작하기 위해 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 수거 전에 개시 또는 완결된다.
또 다른 실시양태에서, 예를 들어 대상체로부터의 수거 후의 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하도록 조작하기 위한 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포, 또는 예를 들어 대상체에의 투여 전의 CAR-발현 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포는 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제의 존재 하에 배양될 수 있다.
한 실시양태에서, 대상체에게 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제를 투여하는 것은, 예를 들어 1주에 1회, 예를 들어 즉시 방출 투여 형태로, 0.1 내지 20, 0.5 내지 10, 2.5 내지 7.5, 3 내지 6, 또는 약 5 mg의 RAD001 또는 그의 생물학적 등가 양을 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 대상체에게 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제를 투여하는 것은, 예를 들어 1주에 1회, 예를 들어 지속 방출 투여 형태로, 0.3 내지 60, 1.5 내지 30, 7.5 내지 22.5, 9 내지 18, 또는 약 15 mg의 RAD001, 또는 그의 생물학적 등가 양을 투여하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, mTOR 억제제의 용량은 적어도 5 내지 90% 이하, 적어도 10 내지 90% 이하, 적어도 15 내지 90% 이하, 적어도 20 내지 90% 이하, 적어도 30 내지 90% 이하, 적어도 40 내지 90% 이하, 적어도 50 내지 90% 이하, 적어도 60 내지 90% 이하, 적어도 70 내지 90% 이하, 적어도 5 내지 80% 이하, 적어도 10 내지 80% 이하, 적어도 15 내지 80% 이하, 적어도 20 내지 80% 이하, 적어도 30 내지 80% 이하, 적어도 40 내지 80% 이하, 적어도 50 내지 80% 이하, 적어도 60 내지 80% 이하, 적어도 5 내지 70% 이하, 적어도 10 내지 70% 이하, 적어도 15 내지 70% 이하, 적어도 20 내지 70% 이하, 적어도 30 내지 70% 이하, 적어도 40 내지 70% 이하, 적어도 50 내지 70% 이하, 적어도 5 내지 60% 이하, 적어도 10 내지 60% 이하, 적어도 15 내지 60% 이하, 적어도 20 내지 60% 이하, 적어도 30 내지 60% 이하, 적어도 40 내지 60% 이하, 적어도 5 내지 50% 이하, 적어도 10 내지 50% 이하, 적어도 15 내지 50% 이하, 적어도 20 내지 50% 이하, 적어도 30 내지 50% 이하, 적어도 40 내지 50% 이하, 적어도 5 내지 40% 이하, 적어도 10 내지 40% 이하, 적어도 15 내지 40% 이하, 적어도 20 내지 40% 이하, 적어도 30 내지 40% 이하, 적어도 35 내지 40% 이하, 적어도 5 내지 30% 이하, 적어도 10 내지 30% 이하, 적어도 15 내지 30% 이하, 적어도 20 내지 30% 이하, 또는 적어도 25 내지 30% 이하의 mTOR 억제와 연관되거나 또는 mTOR 억제를 제공한다.
mTOR 억제의 정도는 P70 S6 키나제 억제의 정도로서 나타내어질 수 있거나 그에 상응하고, 예를 들어 mTOR 억제의 정도는 P70 S6 키나제 활성에서의 감소 수준에 의해, 예를 들어 P70 S6 키나제 기질의 인산화에서의 감소에 의해 결정될 수 있다. mTOR 억제의 수준은 다양한 방법, 예컨대 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 번호 2015/01240036에 기재된 바와 같은, 또는 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 7,727,950에 기재된 바와 같은 불레이 검정에 의해 P70 S6 키나제 활성을 측정하는 것; 웨스턴 블롯에 의해 인산화 S6의 수준을 측정하는 것; 또는 PD1 음성 면역 이펙터 세포 대 PD1 양성 면역 이펙터 세포의 비에서의 변화를 평가하는 것에 의해 평가될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "mTOR 억제제"는 세포에서 mTOR 키나제를 억제하는 화합물 또는 리간드, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 지칭한다. 한 실시양태에서, mTOR 억제제는 알로스테릭 억제제이다. 알로스테릭 mTOR 억제제는 중성 트리시클릭 화합물 라파마이신 (시롤리무스), 예를 들어 라파마이신 유도체, 라파마이신 유사체 (라파로그로도 지칭됨) 및 mTOR 활성을 억제하는 다른 마크롤리드 화합물을 비롯한 라파마이신과 구조적 및 기능적 유사성을 갖는 화합물인 라파마이신-관련 화합물을 포함한다. 한 실시양태에서, mTOR 억제제는 촉매 억제제이다.
라파마이신은 하기 화학식 A에 제시된 구조를 갖는 스트렙토미세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)에 의해 생산된 공지된 마크롤리드 항생제이다.
<화학식 A>
Figure pct00111
예를 들어, 문헌 [McAlpine, J.B., et al., J. Antibiotics (1991) 44: 688; Schreiber, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433]; 미국 특허 번호 3,929,992를 참조한다. 라파마이신에 대해 제안되는 다양한 넘버링 스킴이 존재한다. 혼동을 피하기 위해, 특정 라파마이신 유사체가 본원에서 명명되는 경우에, 명칭은 화학식 A의 넘버링 스킴을 사용하는 라파마이신과 관련하여 주어진다.
본 발명에서 유용한 라파마이신 유사체는, 예를 들어 라파마이신의 시클로헥실 고리 상의 히드록실 기가 OR1 (여기서 R1은 히드록시알킬, 히드록시알콕시알킬, 아실아미노알킬 또는 아미노알킬임)에 의해 대체된 O-치환된 유사체; 예를 들어 그 내용이 참조로 포함되는 US 5,665,772 및 WO94/09010에 기재된 바와 같은 에베롤리무스로도 공지된 RAD001이다.
다른 적합한 라파마이신 유사체는 26- 또는 28-위치에서 치환된 것을 포함한다. 라파마이신 유사체는 상기 언급된 유사체의 에피머, 특히 위치 40, 28 또는 26에서 치환된 유사체의 에피머일 수 있고, 예를 들어 그 내용이 참조로 포함되는 US 6,015,815, WO95/14023 및 WO99/15530에 기재된 바와 같이 임의로 추가로 수소화될 수 있다 (예를 들어 그 내용이 참조로 포함되는 US 7,091,213, WO98/02441 및 WO01/14387에 기재된 조타롤리무스로도 공지된 ABT578 또는 라파마이신 유사체, 예를 들어 리다포롤리무스로도 공지된 AP23573).
US 5,665,772로부터의 본 발명에서 사용하기에 적합한 라파마이신 유사체의 예는 40-O-벤질-라파마이신, 40-O-(4'-히드록시메틸)벤질-라파마이신, 40-O-[4'-(1,2-디히드록시에틸)]벤질-라파마이신, 40-O-알릴-라파마이신, 40-O-[3'-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4(S)-일)-프로프-2'-엔-1'-일]-라파마이신, (2'E,4'S)-40-O-(4',5'-디히드록시펜트-2'-엔-1'-일)-라파마이신, 40-O-(2-히드록시)에톡시카르보닐메틸-라파마이신, 40-O-(2-히드록시)에틸-라파마이신, 40-O-(3-히드록시)프로필-라파마이신, 40-O-(6-히드록시)헥실-라파마이신, 40-O-[2-(2-히드록시)에톡시]에틸-라파마이신, 40-O-[(3S)-2,2-디메틸디옥솔란-3-일]메틸-라파마이신, 40-O-[(2S)-2,3-디히드록시프로프-1-일]-라파마이신, 40-O-(2-아세톡시)에틸-라파마이신, 40-O-(2-니코티노일옥시)에틸-라파마이신, 40-O-[2-(N-모르폴리노)아세톡시]에틸-라파마이신, 40-O-(2-N-이미다졸릴아세톡시)에틸-라파마이신, 40-O-[2-(N-메틸-N'-피페라지닐)아세톡시]에틸-라파마이신, 39-O-데스메틸-39,40-O,O-에틸렌-라파마이신, (26R)-26-디히드로-40-O-(2-히드록시)에틸-라파마이신, 40-O-(2-아미노에틸)-라파마이신, 40-O-(2-아세트아미노에틸)-라파마이신, 40-O-(2-니코틴아미도에틸)-라파마이신, 40-O-(2-(N-메틸-이미다조-2'-일카르브에톡사미도)에틸)-라파마이신, 40-O-(2-에톡시카르보닐아미노에틸)-라파마이신, 40-O-(2-톨릴술폰아미도에틸)-라파마이신 및 40-O-[2-(4',5'-디카르보에톡시-1',2',3'-트리아졸-1'-일)-에틸]-라파마이신을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 유용한 다른 라파마이신 유사체는 라파마이신의 시클로헥실 고리 상의 히드록실 기 및/또는 28 위치의 히드록실 기가 히드록시에스테르 기로 대체된 유사체이고, 예를 들어 US RE44,768에서 확인되는 라파마이신 유사체, 예를 들어 템시롤리무스가 공지되어 있다.
본 발명에 유용한 다른 라파마이신 유사체는 16 위치의 메톡시 기가 또 다른 치환기, 바람직하게는 (임의로 히드록시-치환된) 알키닐옥시, 벤질, 오르토메톡시벤질 또는 클로로벤질에 의해 대체되고/거나 39 위치의 메톡시 기가 39 탄소와 함께 결실되어 라파마이신의 시클로헥실 고리가 39 위치 메톡시 기가 결여된 시클로펜틸 고리로 된 것; 예를 들어 그 내용이 본원에 참조로 포함되는 WO95/16691 및 WO96/41807에 기재된 바와 같은 것을 포함한다. 유사체는 라파마이신의 40-위치의 히드록시가 알킬화되고/거나 32-카르보닐이 환원되도록 추가로 변형될 수 있다.
WO95/16691로부터의 라파마이신 유사체는 16-데메톡시-16-(펜트-2-이닐)옥시-라파마이신, 16-데메톡시-16-(부트-2-이닐)옥시-라파마이신, 16-데메톡시-16-(프로파르길)옥시-라파마이신, 16-데메톡시-16-(4-히드록시-부트-2-이닐)옥시-라파마이신, 16-데메톡시-16-벤질옥시-40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신, 16-데메톡시-16-벤질옥시-라파마이신, 16-데메톡시-16-오르토-메톡시벤질-라파마이신, 16-데메톡시-40-O-(2-메톡시에틸)-16-펜트-2-이닐)옥시-라파마이신, 39-데메톡시-40-데스옥시-39-포르밀-42-노르-라파마이신, 39-데메톡시-40-데스옥시-39-히드록시메틸-42-노르-라파마이신, 39-데메톡시-40-데스옥시-39-카르복시-42-노르-라파마이신, 39-데메톡시-40-데스옥시-39-(4-메틸-피페라진-1-일)카르보닐-42-노르-라파마이신, 39-데메톡시-40-데스옥시-39-(모르폴린-4-일)카르보닐-42-노르-라파마이신, 39-데메톡시-40-데스옥시-39-[N-메틸, N-(2-피리딘-2-일-에틸)]카르바모일-42-노르-라파마이신 및 39-데메톡시-40-데스옥시-39-(p-톨루엔술포닐히드라조노메틸)-42-노르-라파마이신을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
WO96/41807로부터의 라파마이신 유사체는 32-데옥소-라파마이신, 16-O-펜트-2-이닐-32-데옥소-라파마이신, 16-O-펜트-2-이닐-32-데옥소-40-O-(2-히드록시-에틸)-라파마이신, 16-O-펜트-2-이닐-32-(S)-디히드로-40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신, 32(S)-디히드로-40-O-(2-메톡시)에틸-라파마이신 및 32(S)-디히드로-40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 적합한 라파마이신 유사체는 그 내용이 참조로 포함되는 US2005/0101624에 기재된 바와 같은 우미롤리무스이다.
달리 에베롤리무스 (아피니토르(Afinitor)®)로도 공지된 RAD001은 화학 명칭 (1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-디히드록시-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-히드록시에톡시)-3-메톡시시클로헥실]-1-메틸에틸}-19,30-디메톡시-15,17,21,23,29,35-헥사메틸-11,36-디옥사-4-아자-트리시클로[30.3.1.04,9]헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-2,3,10,14,20-펜타온을 갖는다.
알로스테릭 mTOR 억제제의 추가의 예는 시롤리무스 (라파마이신, AY-22989), 40-[3-히드록시-2-(히드록시메틸)-2-메틸프로파노에이트]-라파마이신 (템시롤리무스 또는 CCI-779로도 불림) 및 리다포롤리무스 (AP-23573/MK-8669)를 포함한다. 알로스테릭 mTOR 억제제의 다른 예는 조타롤리무스 (ABT578) 및 우미롤리무스를 포함한다.
대안적으로 또는 추가로, 촉매 ATP-경쟁적 mTOR 억제제는 mTOR 키나제 도메인을 직접적으로 표적화하고, mTORC1 및 mTORC2 둘 다를 표적화하는 것으로 발견되었다. 이들은 라파마이신-저항성 mTORC1 결과물, 예컨대 4EBP1-T37/46 인산화 및 캡-의존성 번역을 조정하기 때문에, 또한 라파마이신으로서 이러한 알로스테릭 mTOR 억제제보다 mTORC1의 보다 유효한 억제제이다.
촉매 억제제는 BEZ235 또는 2-메틸-2-[4-(3-메틸-2-옥소-8-퀴놀린-3-일-2,3-디히드로-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)-페닐]-프로피오니트릴 또는 모노토실레이트 염 형태 (BEZ235의 합성은 WO2006/122806에 기재되어 있음); 화학 명칭 {5-[2,4-비스-((S)-3-메틸-모르폴린-4-일)-피리도[2,3d]피리미딘-7-일]-2-메톡시-페닐}-메탄올을 갖는 CCG168 (달리 AZD-8055로 공지됨, 문헌 [Chresta, C.M., et al., Cancer Res, 2010, 70(1), 288-298]); 3-[2,4-비스[(3S)-3-메틸모르폴린-4-일]피리도[2,3-d]피리미딘-7-일]-N-메틸벤즈아미드 (WO09104019); 3-(2-아미노벤조[d]옥사졸-5-일)-1-이소프로필-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-아민 (WO10051043 및 WO2013023184); N-(3-(N-(3-((3,5-디메톡시페닐)아미노)퀴녹살린-2-일)술파모일)페닐)-3-메톡시-4-메틸벤즈아미드 (WO07044729 및 WO12006552); 화학 명칭 1-[4-[4-(디메틸아미노)피페리딘-1-카르보닐]페닐]-3-[4-(4,6-디모르폴리노-1,3,5-트리아진-2-일)페닐]우레아를 갖는 PKI-587 (Venkatesan, A.M., J. Med.Chem., 2010, 53, 2636-2645); 화학 명칭 2,4-디플루오로-N-{2-메톡시-5-[4-(4-피리다지닐)-6-퀴놀리닐]-3-피리디닐}벤젠술폰아미드를 갖는 GSK-2126458 (ACS Med. Chem. Lett., 2010, 1, 39-43); 5-(9-이소프로필-8-메틸-2-모르폴리노-9H-퓨린-6-일)피리미딘-2-아민 (WO10114484); (E)-N-(8-(6-아미노-5-(트리플루오로메틸)피리딘-3-일)-1-(6-(2-시아노프로판-2-일)피리딘-3-일)-3-메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2(3H)-일리덴)시안아미드 (WO12007926)를 포함한다.
촉매 mTOR 억제제의 추가의 예는 8-(6-메톡시-피리딘-3-일)-3-메틸-1-(4-피페라진-1-일-3-트리플루오로메틸-페닐)-1,3-디히드로-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2-온 (WO2006/122806) 및 Ku-0063794 (Garcia-Martinez JM, et al.,Biochem J., 2009, 421(1), 29-42]를 포함한다. Ku-0063794는 라파마이신 (mTOR)의 포유동물 표적의 특이적 억제제이다. WYE-354는 촉매 mTOR 억제제의 또 다른 예이다 (Yu K, et al. (2009). Biochemical, Cellular, and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin. Cancer Res. 69(15): 6232-6240).
본 발명에 따라 유용한 mTOR 억제제는 상기 중 임의의 것의 전구약물, 유도체, 제약상 허용되는 염, 또는 그의 유사체를 또한 포함한다.
mTOR 억제제, 예컨대 RAD001은 본원에 기재된 특정한 투여량을 기초로 하여 관련 기술분야에 널리-확립되어 있는 방법을 기초로 전달을 위해 제제화될 수 있다. 특히, 미국 특허 6,004,973 (본원에 참조로 포함됨)은 본원에 기재된 mTOR 억제제와 함께 사용가능한 제제의 예를 제공한다.
CAR-유효성 또는 샘플 적합성을 평가하기 위한 방법 및 바이오마커
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체 (예를 들어 암, 예를 들어 혈액암을 갖는 대상체)에서 CAR-발현 세포 요법 (예를 들어, CD123 CAR 요법)의 유효성, 또는 CAR 요법 (예를 들어, CD123 CAR 요법)을 위한 샘플 (예를 들어, 분리반출술 샘플)의 적합성을 평가 또는 모니터링하는 방법을 특색으로 한다. 방법은 CAR 요법에 대한 유효성 또는 샘플 적합성의 값을 획득하는 것을 포함하며, 여기서 상기 값은 CAR-발현 세포 요법의 유효성 또는 적합성을 나타낸다.
실시양태에서, CAR 요법에 대한 유효성 또는 샘플 적합성의 값은 하기 중 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과 (모두)의 측정치를 포함한다:
(i) 샘플 (예를 들어, 분리반출술 샘플 또는 제조된 CAR-발현 세포 생성물 샘플) 내 휴지기 TEFF 세포, 휴지기 TREG 세포, 더 어린 T 세포 (예를 들어, 더 어린 CD4 또는 CD8 세포, 또는 감마/델타 T 세포), 또는 초기 기억 T 세포 또는 그의 조합 중 1, 2, 3종 또는 그 초과 (예를 들어, 모두)의 수준 또는 활성;
(ii) 샘플 (예를 들어, 분리반출술 샘플 또는 제조된 CAR-발현 세포 생성물 샘플) 내 활성화 TEFF 세포, 활성화 TREG 세포, 더 노화된 T 세포 (예를 들어, 더 노화된 CD4 또는 CD8 세포), 또는 후기 기억 T 세포 또는 그의 조합 중 1, 2, 3종 또는 그 초과 (예를 들어, 모두)의 수준 또는 활성;
(iii) 샘플 (예를 들어, 분리반출술 샘플 또는 제조된 CAR-발현 세포 생성물 샘플) 내 면역 세포 소진 마커, 예를 들어 1, 2종 또는 그 초과의 면역 체크포인트 억제제 (예를 들어, PD-1, PD-L1, TIM-3 및/또는 LAG-3)의 수준 또는 활성. 한 실시양태에서, 면역 세포는 소진 표현형을 갖고, 예를 들어 적어도 2종의 소진 마커를 공동-발현하며, 예를 들어 PD-1 및 TIM-3을 공동-발현한다. 다른 실시양태에서, 면역 세포는 소진 표현형을 갖고, 예를 들어 적어도 2종의 소진 마커를 공동-발현하며, 예를 들어 PD-1 및 LAG-3을 공동-발현한다;
(iv) 샘플 (예를 들어, 분리반출술 샘플 또는 제조된 CAR-발현 세포 생성물 샘플) 내 예를 들어 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 집단에서의 CD27 및/또는 CD45RO- (예를 들어, CD27+ CD45RO-) 면역 이펙터 세포의 수준 또는 활성;
(v) CCL20, IL-17a 및/또는 IL-6, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1로부터 선택된 바이오마커 중 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20종 또는 그 초과의 수준 또는 활성;
(vi) CAR-발현 세포 생성물 샘플, 예를 들어 CD123-발현 세포 생성물 샘플 내 시토카인 수준 또는 활성 (예를 들어, 시토카인 레퍼토리의 품질); 또는
(vii) 제조된 CAR-발현 세포 생성물 샘플 내 CAR-발현 세포의 형질도입 효율.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, CAR-발현 세포 요법은 복수 (예를 들어, 집단)의 CAR-발현 면역 이펙터 세포, 예를 들어 복수 (예를 들어, 집단)의 T 세포 또는 NK 세포, 또는 그의 조합을 포함한다. 한 실시양태에서, CAR-발현 세포 요법은 CD123 CAR 요법이다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, (i)-(vii) 중 1개 이상의 측정치는 대상체로부터 획득된 분리반출술 샘플로부터 수득된다. 분리반출술 샘플은 주입 또는 재-주입 전에 평가될 수 있다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, (i)-(vii) 중 1개 이상의 측정치는 제조된 CAR-발현 세포 생성물 샘플, 예를 들어 CD123 CAR-발현 세포 생성물 샘플로부터 수득된다. 제조된 CAR-발현 세포 생성물은 주입 또는 재-주입 전에 평가될 수 있다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 대상체는 CAR-발현 세포 요법을 제공받기 전, 그 동안, 또는 제공받은 후에 평가된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, (i)-(vii) 중 1개 이상의 측정치는 유전자 발현, 유동 세포측정법 또는 단백질 발현 중 1종 이상에 대한 프로파일을 평가한다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 (i)-(vii) 중 1개 이상의 측정치에 기초하여 대상체를 반응자, 비-반응자, 재발자 또는 비-재발자로서 확인하는 것을 추가로 포함한다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 반응자 (예를 들어, 완전 반응자)는 비-반응자와 비교하여 GZMK, PPF1BP2, 또는 나이브 T 세포 중 1, 2종 또는 그 초과 (모두)의 보다 큰 수준 또는 활성을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 비-반응자는 반응자와 비교하여 IL22, IL-2RA, IL-21, IRF8, IL8, CCL17, CCL22, 이펙터 T 세포, 또는 조절 T 세포 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7종 또는 그 초과 (예를 들어, 모두)의 보다 큰 수준 또는 활성을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
한 실시양태에서, 재발자는 비-재발자와 비교하여 하기 유전자: MIR199A1, MIR1203, uc021ovp, ITM2C, 및 HLA-DQB1 중 1종 이상 (예를 들어, 2, 3, 4종 또는 모두)의 증가된 발현 수준 및/또는 비-재발자와 비교하여 하기 유전자: PPIAL4D, TTTY10, TXLNG2P, MIR4650-1, KDM5D, USP9Y, PRKY, RPS4Y2, RPS4Y1, NCRNA00185, SULT1E1, 및 EIF1AY 중 1종 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11종 또는 모두)의 감소된 발현 수준을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된 환자이다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 완전 반응자는 참고 값, 예를 들어 CD8+ T 세포의 비-반응자 백분율과 비교하여 CD8+ T 세포의 보다 큰, 예를 들어 통계적으로 유의하게 보다 큰 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 완전 반응자는, 예를 들어 CD8+ 집단에서 참고 값, 예를 들어 CD27+ CD45RO- 면역 이펙터 세포의 비-반응자 수와 비교하여 CD27+ CD45RO- 면역 이펙터 세포의 보다 큰 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 완전 반응자 또는 부분 반응자는 참고 값, 예를 들어 CD4+ T 세포의 비-반응자 백분율과 비교하여 CD4+ T 세포의 보다 큰, 예를 들어 통계적으로 유의하게 보다 큰 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 완전 반응자는 참고 값, 예를 들어 휴지기 TEFF 세포, 휴지기 TREG 세포, 더 어린 T 세포 (예를 들어, 더 어린 CD4 또는 CD8 세포), 또는 초기 기억 T 세포의 비-반응자 수와 비교하여 휴지기 TEFF 세포, 휴지기 TREG 세포, 더 어린 T 세포 (예를 들어, 더 어린 CD4 또는 CD8 세포, 또는 감마/델타 T 세포), 또는 초기 기억 T 세포 또는 그의 조합 중 1, 2, 3종 또는 그 초과 (예를 들어, 모두)의 보다 큰 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 비-반응자는 참고 값, 예를 들어 활성화 TEFF 세포, 활성화 TREG 세포, 더 노화된 T 세포 (예를 들어, 더 노화된 CD4 또는 CD8 세포), 또는 후기 기억 T 세포의 반응자 수와 비교하여 활성화 TEFF 세포, 활성화 TREG 세포, 더 노화된 T 세포 (예를 들어, 더 노화된 CD4 또는 CD8 세포), 또는 후기 기억 T 세포 또는 그의 조합 중 1, 2, 3종 또는 그 초과 (예를 들어, 모두)의 보다 큰 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 비-반응자는 면역 세포 소진 마커, 예를 들어 1, 2종 또는 그 초과의 면역 체크포인트 억제제 (예를 들어, PD-1, PD-L1, TIM-3 및/또는 LAG-3)의 보다 큰 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다. 한 실시양태에서, 비-반응자는 반응자로부터의 PD-1 또는 LAG-3 발현 면역 이펙터 세포의 백분율과 비교하여 PD-1, PD-L1, 또는 LAG-3 발현 면역 이펙터 세포 (예를 들어, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포) (예를 들어, CAR-발현 CD4+ 세포 및/또는 CD8+ T 세포)의 보다 큰 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
한 실시양태에서, 비-반응자는 소진 표현형을 갖는 면역 세포, 예를 들어 적어도 2종의 소진 마커를 공동-발현하는, 예를 들어 PD-1, PD-L1 및/또는 TIM-3을 공동-발현하는 면역 세포의 보다 큰 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다. 다른 실시양태에서, 비-반응자는 소진 표현형을 갖는 면역 세포, 예를 들어 적어도 2종의 소진 마커를 공동-발현하는, 예를 들어 PD-1 및 LAG-3을 공동-발현하는 면역 세포의 보다 큰 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 비-반응자는 CAR-발현 세포 요법에 대해 반응자 (예를 들어, 완전 반응자)와 비교하여 CAR-발현 세포 집단 (예를 들어, CD123 CAR+ 세포 집단)에서 PD-1/ PD-L1+/LAG-3+ 세포의 보다 큰 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 부분 반응자는 CAR-발현 세포 집단 (예를 들어, CD123 CAR+ 세포 집단)에서 반응자보다 PD-1/ PD-L1+/LAG-3+ 세포의 보다 높은 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 비-반응자는 CAR-발현 세포 집단 (예를 들어, CD123 CAR + 세포 집단)에서 PD1/ PD-L1+ CAR+의 소진 표현형 및 LAG3의 공동-발현을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 비-반응자는 반응자 (예를 들어, 완전 반응자)와 비교하여 CAR-발현 세포 집단 (예를 들어, CD123 CAR + 세포 집단)에서 PD-1/ PD-L1+/TIM-3+ 세포의 보다 큰 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 부분 반응자는 CAR-발현 세포 집단 (예를 들어, CD123 CAR + 세포 집단)에서 반응자보다 PD-1/ PD-L1+/TIM-3+ 세포의 보다 높은 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 분리반출술 샘플에서 CD8+ CD27+ CD45RO- T 세포의 존재는 CAR-발현 세포 요법 (예를 들어, CD123 CAR 요법)에 대한 대상체 반응의 양성 예측인자이다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 분리반출술 샘플에서 높은 백분율의 PD1+ CAR+ 및 LAG3+ 또는 TIM3+ T 세포는 CAR-발현 세포 요법 (예를 들어, CD123 CAR 요법)에 대한 대상체 반응의 불량한 예후 예측인자이다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 반응자 (예를 들어, 완전 또는 부분 반응자)는 하기 프로파일 중 1, 2, 3종 또는 그 초과 (또는 모두)를 갖는다:
(i) 참고 값, 예를 들어 CD27+ 면역 이펙터 세포의 비-반응자 수와 비교하여 보다 큰 수의 CD27+ 면역 이펙터 세포를 가짐;
(ii) 참고 값, 예를 들어 CD8+ T 세포의 비-반응자 수와 비교하여 보다 큰 수의 CD8+ T 세포를 가짐;
(iii) 참고 값, 예를 들어 1종 이상의 체크포인트 억제제를 발현하는 세포의 비-반응자 수와 비교하여 1종 이상의 체크포인트 억제제, 예를 들어 PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, 또는 KLRG-1, 또는 조합으로부터 선택된 체크포인트 억제제를 발현하는 보다 적은 수의 면역 세포를 가짐; 또는
(iv) 참고 값, 예를 들어 휴지기 TEFF 세포, 휴지기 TREG 세포, 나이브 CD4 세포, 비자극 기억 세포 또는 초기 기억 T 세포의 비-반응자 수와 비교하여 휴지기 TEFF 세포, 휴지기 TREG 세포, 나이브 CD4 세포, 비자극 기억 세포 또는 초기 기억 T 세포 또는 그의 조합 중 1, 2, 3, 4종 또는 그 초과 (모두)의 보다 큰 수를 가짐.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, (vi)의 시토카인 수준 또는 활성은 시토카인 CCL20/MIP3a, IL17A, IL6, GM-CSF, IFNγ, IL10, IL13, IL2, IL21, IL4, IL5, IL9 또는 TNFα, 또는 그의 조합 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8종 또는 그 초과 (또는 모두)로부터 선택된다. 시토카인은 IL-17a, CCL20, IL2, IL6, 또는 TNFa 중 1, 2, 3, 4종 또는 그 초과 (모두)로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 시토카인의 증가된 수준 또는 활성은 IL-17a 및 CCL20 중 1종 또는 둘 다로부터 선택되고, 이는 증가된 반응성 또는 감소된 재발을 나타낸다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, (vii)에서 15% 이상의 형질도입 효율은 증가된 반응성 또는 감소된 재발을 나타낸다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, (vii)에서 15% 미만의 형질도입 효율은 감소된 반응성 또는 증가된 재발을 나타낸다.
실시양태에서, 본원의 방법에 의해 확인된 반응자, 비-반응자, 재발자 또는 비-재발자는 임상 기준에 따라 추가로 평가될 수 있다. 예를 들어, 완전 반응자는 치료에 대해 완전 반응, 예를 들어 완전 완화를 나타낸 질환, 예를 들어 암을 갖거나, 또는 그를 갖는 대상체로 확인된다. 완전 반응은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 NCCN 가이드라인®, 또는 문헌 [Cheson et al., J Clin Oncol 17:1244 (1999) 및 Cheson et al., "Revised Response Criteria for Malignant Lymphoma", J Clin Oncol 25:579-586 (2007)] (이들 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 사용하여 확인될 수 있다. 부분 반응자는 치료에 대해 부분 반응, 예를 들어 부분 완화를 나타낸 질환, 예를 들어 암을 갖거나, 또는 그를 갖는 대상체로 확인된다. 부분 반응은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 NCCN 가이드라인® 또는 체손(Cheson) 기준을 사용하여 확인될 수 있다. 비-반응자는 치료에 대해 반응을 나타내지 않는 질환, 예를 들어 암을 갖거나, 또는 그를 갖는 대상체로 확인되며, 예를 들어 환자는 안정 질환 또는 진행성 질환을 갖는다. 비-반응자는, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 NCCN 가이드라인® 또는 체손 기준을 사용하여 확인될 수 있다.
대안적으로 또는 본원에 개시된 방법과 조합하여, 상기 값에 대해 반응성인 것에 하기 중 1, 2, 3, 4종 또는 그 초과를 수행한다:
예를 들어 반응자 또는 비-재발자에게 CAR-발현 세포 요법의 투여;
CAR-발현 세포 요법의 변경된 용량의 투여;
CAR-발현 세포 요법의 스케줄 또는 시간 경과의 변경;
예를 들어 비-반응자 또는 부분 반응자에게 CAR-발현 세포 요법과 조합하여 추가의 작용제, 예를 들어 체크포인트 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 체크포인트 억제제의 투여;
비-반응자 또는 부분 반응자에게 CAR-발현 세포 요법을 사용한 처리 전 대상체에서 더 어린 T 세포의 수를 증가시키는 요법의 투여;
예를 들어 비-반응자 또는 부분 반응자로서 확인된 대상체에 대해 CAR-발현 세포 요법의 제조 방법의 변형, 예를 들어 CAR을 코딩하는 핵산을 도입하기 전 더 어린 T 세포의 풍부화, 또는 형질도입 효율의 증가;
예를 들어 비-반응자 또는 부분 반응자 또는 재발자에 대해 대체 요법의 투여; 또는
대상체가 비-반응자 또는 재발자이거나 또는 그러한 것으로 확인된 경우에, 예를 들어 CD25 고갈, 시클로포스파미드, 항-GITR 항체 또는 그의 조합의 투여 중 1종 이상에 의해 TREG 세포 집단 및/또는 TREG 유전자 서명의 감소.
특정 실시양태에서, 대상체는 항-GITR 항체에 의해 사전-처리된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 주입 또는 재-주입 전 항-GITR 항체에 의해 처리된다.
생체중합체 전달 방법
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 1종 이상의 CAR-발현 세포는 생체중합체 스캐폴드, 예를 들어 생체중합체 이식물을 통해 대상체에게 투여 또는 전달될 수 있다. 생체중합체 스캐폴드는 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 전달, 확장, 및/또는 분산을 지지 또는 증진시킬 수 있다. 생체중합체 스캐폴드는 자연 발생적 또는 합성적일 수 있는 생체적합성 (예를 들어, 염증 또는 면역 반응을 실질적으로 유도하지 않음) 및/또는 생분해성 중합체를 포함한다.
적합한 생체중합체의 예는 단독의, 또는 임의의 다른 중합체 조성물과 임의의 농도 및 임의의 비로 조합된 한천, 아가로스, 알기네이트, 알기네이트/칼슘 포스페이트 시멘트 (CPC), 베타-갈락토시다제 (β-GAL), (1,2,3,4,6-펜타아세틸 a-D-갈락토스), 셀룰로스, 키틴, 키토산, 콜라겐, 엘라스틴, 젤라틴, 히알루론산 콜라겐, 히드록시아파타이트, 폴리(3-히드록시부티레이트-코-3-히드록시-헥사노에이트) (PHBHHx), 폴리(락티드), 폴리(카프로락톤) (PCL), 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLG), 폴리에틸렌 옥시드 (PEO), 폴리(락트산-코-글리콜산) (PLGA), 폴리프로필렌 옥시드 (PPO), 폴리비닐 알콜 (PVA), 실크, 대두 단백질, 및 대두 단백질 단리물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 생체중합체는 부착- 또는 이동-촉진 분자, 예를 들어 림프구의 콜라겐 수용체에 결합하는 콜라겐-모방체 펩티드, 및/또는 자극 분자에 의해 증대 또는 변형되어, 전달되는 세포의 전달, 확장, 또는 기능, 예를 들어 항암 활성을 증진시킬 수 있다. 생체중합체 스캐폴드는 주사가능한, 예를 들어 겔 또는 반-고체, 또는 고체 조성물일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 대상체에게의 전달 전에 생체중합체 스캐폴드 상에 시딩될 수 있다. 실시양태에서, 생체중합체 스캐폴드는, 예를 들어 스캐폴드의 생체중합체에 혼입되거나 접합된, CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 본원에 기재된 1종 이상의 추가의 치료제 (예를 들어, 또 다른 CAR-발현 세포, 항체, 또는 소분자) 또는 작용제를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 생체중합체 스캐폴드는 예를 들어 종양내로 주사되거나, 또는 종양에 또는 항종양 효과를 매개하기에 충분히 종양에 근접하여 외과적으로 이식된다. 생체중합체 조성물 및 그의 전달 방법의 추가의 예가 문헌 [Stephan et al., Nature Biotechnology, 2015, 33:97-101]; 및 WO2014/110591에 기재되어 있다.
제약 조성물 및 치료
본 발명의 제약 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 CAR-발현 세포, 예를 들어 복수의 CAR-발현 세포를 1종 이상의 제약상 또는 생리학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함할 수 있다. 상기 조성물은 완충제, 예컨대 중성 완충 염수, 포스페이트 완충 염수 등; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 아주반트 (예를 들어, 수산화알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 한 측면에서 정맥내 투여를 위해 제제화된다.
본 발명의 제약 조성물은 치료할 (또는 예방할) 질환에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여의 양 및 빈도는 환자의 상태, 환자의 질환의 종류 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이지만, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 것이다.
한 실시양태에서, 제약 조성물은 예를 들어 내독소, 미코플라스마, 복제 적격 렌티바이러스 (RCL), p24, VSV-G 핵산, HIV gag, 잔류 항-CD3/항-CD28 코팅된 비드, 마우스 항체, 풀링된 인간 혈청, 소 혈청 알부민, 소 혈청, 배양 배지 성분, 벡터 패키징 세포 또는 플라스미드 성분, 박테리아 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택된 오염물이 실질적으로 없고, 예를 들어 검출가능한 수준의 오염물이 없다. 한 실시양태에서, 박테리아는 알칼리게네스 파에칼리스(Alcaligenes faecalis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 네이세리아 메닌기티데스(Neisseria meningitides), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 및 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 군 A로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종이다.
"면역학적 유효량", "항종양 유효량", "종양-억제 유효량", 또는 "치료량"이 제시되는 경우에, 투여할 본 발명의 조성물의 정확한 양은 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도, 및 환자 (대상체)의 상태에서의 개별 차이를 고려하여 의사가 결정할 수 있다. 본원에 기재된 T 세포를 포함하는 제약 조성물은 104 내지 109개 세포/kg 체중, 일부 경우에 105 내지 106개 세포/kg 체중 (상기 범위 내의 모든 정수 값 포함)의 투여량으로 투여될 수 있는 것으로 일반적으로 언급될 수 있다. T 세포 조성물은 또한 이들 투여량으로 다중 횟수로 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, CAR 세포 (예를 들어, CD123 CAR 세포)의 용량은 약 1 x 106, 1.1 x 106, 2 x 106, 3.6 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 1.8 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 또는 5 x 108개 세포/kg을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 세포 (예를 들어, CD123 CAR 세포)의 용량은 적어도 약 1 x 106, 1.1 x 106, 2 x 106, 3.6 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 1.8 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 또는 5 x 108개 세포/kg을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 세포 (예를 들어, CD123 CAR 세포)의 용량은 최대 약 1 x 106, 1.1 x 106, 2 x 106, 3.6 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 1.8 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 또는 5 x 108개 세포/kg을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 세포 (예를 들어, CD123 CAR 세포)의 용량은 약 1.1 x 106 - 1.8 x 107개 세포/kg을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 세포 (예를 들어, CD123 CAR 세포)의 용량은 약 1 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 또는 5 x 109개 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 세포 (예를 들어, CD123 CAR 세포)의 용량은 적어도 약 1 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 또는 5 x 109개 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 세포 (예를 들어, CD123 CAR 세포)의 용량은 최대 약 1 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 또는 5 x 109개 세포를 포함한다.
세포는 면역요법에서 통상적으로 공지되어 있는 주입 기술을 사용하여 투여될 수 있다 (예를 들어 [Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988] 참조).
특정 측면에서, 활성화된 T 세포를 대상체에게 투여한 후, 후속적으로 혈액을 재채취하고 (또는 분리반출술을 수행하고), 본 발명에 따라 그로부터 T 세포를 활성화하고, 환자에게 이들 활성화되고 확장된 T 세포를 재주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 과정은 수주마다 다중 횟수로 수행될 수 있다. 특정 측면에서, T 세포는 10cc 내지 400cc의 혈액 채취물로부터 활성화될 수 있다. 특정 측면에서, T 세포는 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc 또는 100cc의 혈액 채취물로부터 활성화된다.
대상 조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 이식(implantation) 또는 이식(transplantation)에 의한 것을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 경동맥으로, 피하로, 피내로, 종양내로, 결절내로, 수질내로, 근육내로, 정맥내 (i.v.) 주사에 의해, 또는 복강내로 환자에게 투여될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 CAR-발현 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포) 조성물은 피부내 또는 피하 주사에 의해 환자에게 투여된다. 한 측면에서, 본 발명의 CAR-발현 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포) 조성물은 i.v. 주사에 의해 투여된다. CAR-발현 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)의 조성물은 종양, 림프절, 또는 감염 부위 내로 직접 주사될 수 있다.
특정한 예시적인 측면에서, 대상체는 백혈구분리반출술을 거칠 수 있고, 여기서 백혈구는 수집, 풍부화, 또는 생체외 고갈되어 관심 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)를 선택하고/거나 단리한다. 이들 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포) 단리물은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 확장되고, 본 발명의 1종 이상의 CAR 구축물이 도입되어, 본 발명의 CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR T 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)를 생성할 수 있도록 처리될 수 있다. 그를 필요로 하는 대상체는 후속적으로 고용량 화학요법에 이어 말초 혈액 줄기 세포 이식에 의하는 표준 치료를 거칠 수 있다. 특정 측면에서, 이식 이후에 또는 이식과 공동으로, 대상체는 본 발명의 확장된 CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR T 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)의 주입을 받는다. 추가의 측면에서, 확장된 세포는 수술 전에 또는 수술 이후에 투여된다.
환자에게 투여할 상기 치료의 투여량은 치료되는 상태의 정확한 속성 및 치료의 수용자에 따라 달라질 것이다. 인간 투여를 위한 투여량의 스케일링은 관련 기술분야에서 허용되는 실시에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 일반적으로 캄파트에 대한 용량은 통상적으로 1 내지 30일의 기간 동안 매일 투여되는, 성인 환자의 경우에 1 내지 약 100 mg 범위 내일 것이다. 바람직한 1일 용량은 1일에 1 내지 10 mg이지만, 일부 경우에 1일에 40 mg까지의 보다 많은 용량이 사용될 수 있다 (미국 특허 번호 6,120,766에 기재됨).
한 실시양태에서, CAR은 예를 들어 시험관내 전사를 사용하여 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포) 내로 도입되고, 대상체 (예를 들어, 인간)는 본 발명의 CAR-발현 세포 (예를 들어 CAR T 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)의 초기 투여 및 본 발명의 CAR-발현 세포 (예를 들어 CAR T 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)의 1회 이상의 후속 투여를 제공받고, 여기서 1회 이상의 후속 투여는 이전 투여 후 15일 미만에, 예를 들어 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2일에 투여된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 CAR-발현 세포 (예를 들어 CAR T 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)의 1회 초과의 투여는 1주에 대상체 (예를 들어, 인간)에게 투여되고, 예를 들어 본 발명의 CAR-발현 세포 (예를 들어 CAR T 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)의 2, 3 또는 4회 투여가 1주에 투여된다. 한 실시양태에서, 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)는 1주에 1회 초과의 CAR-발현 세포 (예를 들어 CAR T 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)의 투여 (예를 들어, 1주에 2, 3 또는 4회 투여) (본원에서 사이클로도 지칭됨)를 제공받고, 이어서 어떠한 CAR-발현 세포 (예를 들어 CAR T 세포 또는 CAR-발현 NK 세포) 투여도 없는 1주에 이어서, CAR-발현 세포 (예를 들어 CAR T 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)의 1회 이상의 추가 투여 (예를 들어, 1주에 CAR-발현 세포 (예를 들어 CAR T 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)의 1회 초과의 투여)가 대상체에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)는 CAR-발현 세포 (예를 들어 CAR T 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)의 1회 초과의 사이클을 제공받고, 각각의 사이클 사이의 시간은 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 또는 3일 미만이다. 한 실시양태에서, CAR-발현 세포 (예를 들어 CAR T 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)는 1주에 3회 투여 동안 격일로 투여된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 CAR-발현 세포 (예를 들어 CAR T 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주 또는 그 초과 동안 투여된다.
한 측면에서, CD123 CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR T 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)는 렌티바이러스 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스를 사용하여 생성된다. 그러한 방식으로 생성된 CAR-발현 세포 (예를 들어 CAR T 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)는 안정한 CAR 발현을 가질 것이다.
한 측면에서, CAR-발현 세포, 예를 들어 CART 또는 CAR-발현 NK 세포는 바이러스 벡터, 예컨대 감마레트로바이러스 벡터, 예를 들어 본원에 기재된 감마레트로바이러스 벡터를 사용하여 생성된다. 이들 벡터를 사용하여 생성된 CAR-발현 세포, 예를 들어 CART 또는 CAR-발현 NK 세포는 안정한 CAR 발현을 갖는다.
한 측면에서, CAR-발현 세포 (예를 들어 CAR T 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)는 형질도입 후 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15일 동안 CAR 벡터를 일시적으로 발현한다. CAR의 일시적 발현은 RNA CAR 벡터 전달에 의해 실행될 수 있다. 한 측면에서, CAR RNA는 전기천공에 의해 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포) 내로 형질도입된다.
일시적으로 발현하는 CAR 세포 (예를 들어, CAR T 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)를 사용하여 (특히, 뮤린 scFv 보유 CAR에 의해) 치료받는 환자에서 일어날 수 있는 잠재적인 이슈는 다중 치료 후 아나필락시스이다.
이러한 이론에 얽매이지는 않지만, 이러한 아나필락시스 반응은 체액성 항-CAR 반응, 즉, 항-IgE 이소형을 갖는 항-CAR 항체를 발생시키는 환자에 의해 유발될 수 있는 것으로 여겨진다. 환자의 항체 생산 세포는 항원에의 노출에서 10 내지 14일 중단이 있을 때 IgG 이소형 (아나필락시스를 유발하지 않음)으로부터 IgE 이소형으로 부류 전환을 거치는 것으로 생각된다.
환자가 일시적 CAR 요법 (예컨대, RNA 형질도입에 의해 생성된 것)의 과정 동안 항-CAR 항체 반응을 생성할 위험이 크면, CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR T 세포 또는 CAR-발현 NK 세포) 주입 중단은 10 내지 14일 초과로 지속되어서는 안된다.
실시예
본 발명은 하기 실험 실시예를 참조하여 추가로 상세히 기재된다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되고, 달리 명시되지 않는 한 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 본 발명은 어떠한 방식으로도 하기 실시예에 제한되는 것으로 해석되어서는 안되고, 대신에 본원에 제공된 교시의 결과로서 분명해지는 임의의 및 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
추가의 설명 없이, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 선행하는 상세한 설명 및 하기 예시적인 실시예를 사용하여, 본 발명의 화합물을 제조 및 이용하고 청구된 방법을 실시할 수 있는 것으로 여겨진다. 하기 작업 실시예는 본 발명의 다양한 측면을 구체적으로 나타내고, 나머지 개시내용을 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: 인간 CAR 구축물
완전 인간 항-CD123 단일 쇄 가변 단편을 단리하였다. 항-CD123 ScFv를 CD3제타 쇄 및 4-1BB 공동자극 분자를 갖는 렌티바이러스 CAR 발현 벡터 내로 클로닝하였다. CAR-함유 플라스미드 (상세한 설명에 제공된 표 1)를 STBL3 세포에서의 박테리아 형질전환에 이어, 내독소-무함유 퀴아젠(Qiagen) 플라스미드 마키 키트를 사용한 맥시프렙에 의해 증폭시켰다. 렌티바이러스 상청액을 표준 기술을 사용하여 293T 세포에서 생산하였다.
VL 및 VH 도메인이 scFv에서 출현하는 순서는 다양하였고 (즉, VL-VH, 또는 VH-VL 배향), 여기서 "G4S" (서열식별번호: 25) 서브유닛의 3 또는 4개의 카피 (여기서 각각의 서브유닛은 서열 GGGGS (서열식별번호: 25)를 포함함) (예를 들어, (G4S)3 (서열식별번호: 28) 또는 (G4S)4(서열식별번호: 27))는 가변 도메인과 연결되어 표 2 (상세한 설명에 제공됨)에 제시된 바와 같은 전체 scFv 도메인을 생성하였다.
CAR 구축물의 서열 및 그의 도메인 서열은 상세한 설명에 열거되어 있다. 인간 CAR 구축물의 분석을 예를 들어 실시예 2, 3, 및 6에 기재된 바와 같이 수행하였다.
실시예 2: 인간 scFv 보유 CART의 분석 및 시험관내 활성
인간 항-CD123 CAR 구축물을, NFAT 프로모터에 의해 구동되는 루시페라제 리포터를 함유하는 Jurkat 세포주 (JNL 세포로 불림)를 사용하여 활성에 대해 평가하였다. CD123 CAR 활성을 본원에 기재된 4종의 인간 CAR 구축물 (CD123 CAR1-4) 및 뮤린 CD123 CAR 구축물 1172 및 1176에 대해 측정하였다. 1172 및 1176 구축물에 대한 아미노산 서열이 하기 제공되고, PCT/US2014/017328에 추가로 기재되고 특징화되어 있다.
1172 구축물: CD123 4-1BBCD3z-CAR (아미노산 서열) (서열식별번호: 707)
Figure pct00112
1176 구축물: CD123 4-1BBCD3z-CAR (26292) (아미노산 서열) (서열식별번호: 708)
Figure pct00113
CAR 활성은 이러한 NFAT-구동 리포터의 활성화로서 측정하였다. 형질도입을 위해 CART 구축물을 함유하는 렌티바이러스 상청액을 JNL 세포에 첨가하였다. 형질도입 4-6일 후, JNL 세포를 하기 기재된 바와 같이 FACS에 의해 CAR 발현에 대해 평가하거나, 또는 표적-양성 (CD123을 발현하도록 조작된 MOLM3, K562 세포 (CD123-K562)) 또는 표적-음성 (K562) 세포주와 3:1의 이펙터 (JNL) 대 표적 세포주 (E:T) 비로 혼합하여 활성화를 촉발시켰다 (도 1). 공동-인큐베이션 20시간 후, 도 2에 제시된 바와 같이 엔비전 기기 상에서 브라이트-글로™ 루시페라제 검정을 사용하여 루시페라제 신호를 측정하였다.
CD123 발현 ("CD123+") 표적에 대한 반응으로 CD123 CAR 형질도입된 T 세포 ("CART-CD123" 또는 "CART-CD123 T 세포")의 이펙터 T 세포 반응의 양 및 품질에 기초하여 최적 항-CD123 CAR 구축물을 선택하였다. 이펙터 T 세포 반응은 세포 확장, 증식, 배가, 시토카인 생산 및 표적 세포 사멸 또는 세포용해 활성 (탈과립화)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
CART-CD123의 생성
인간 scFv 코딩 렌티바이러스 전달 벡터를 사용하여, VSVg 유사형화 렌티바이러스 입자 내에 패키징된 게놈 물질을 생산하였다. 렌티바이러스 전달 벡터 DNA를 3종의 패키징 성분 VSVg, gag/pol 및 rev와, 리포펙타민 시약과 조합하여 혼합하여, 이들을 함께 렌티-X 293T 세포(클론테크(Clontech)) 내로 형질감염시켰다.
30시간 후, 배지를 수집하고, 여과하고, -80℃에서 저장하였다. 치료적 CART-CD123은 정상 분리반출술을 거친 공여자로부터의 혈액을 사용하여 출발함으로써 생성하였고, 그의 나이브 T 세포는 T 세포, CD4+ 및 CD8+ 림프구에 대한 음성 선택에 의해 수득하였다. 이들 세포를 37℃, 5% CO2에서 RPMI 1640, 10% 열-불활성화 소 태아 혈청 (FCS), 2 mM L-글루타민, 1x 페니실린/스트렙토마이신, 100 μM 비-필수 아미노산, 1 mM Na피루베이트, 10 mM Hepes, 및 55 μM 2-메르캅토에탄올 중 CD3x28 비드 (디나비즈® 인간 T-증량제 CD3/CD28, 인비트로젠)에 의해 1:3의 비로 활성화시켰다. T 세포를 24-웰 플레이트의 웰당 0.5 mL 배지 중 1x106개 T 세포로 배양하였다. 24시간 후, T 세포는 파열하였고, 0.5 mL의 바이러스 상청액을 첨가하였다. 이어서 T 세포는 대수 성장 패턴으로 분열하기 시작하였고, 이를 mL당 세포 카운트를 측정함으로써 모니터링하고, T 세포를 2일 마다 신선한 배지 중에 희석하였다. T 세포가 대략 10일 후에 휴지기를 시작함에 따라, 대수 성장은 약해졌다. 느려지는 성장 속도 및 ~300 fl에 근접하는 T 세포 크기의 조합은 추후 분석을 위해 동결보존시킬 T 세포에 대한 상태를 결정하였다.
동결보존하기 전, 형질도입된 세포의 백분율 (세포 표면 상에서 항-CD123 CAR을 발현함) 및 그의 발현의 상대 형광 강도를 BD LSR포르테사 또는 BD-FACS칸토 상에서 검출 시약으로서 단백질 L을 사용하여 유동 세포측정 분석에 의해 결정하였다. 비염색된 세포를 초과하는 신호에 대한 FACS로부터의 상대 형광 강도의 히스토그램 플롯을 게이팅하는 것은 형질도입된 T 세포의 백분율을 입증하였다. 형질도입은 도 2에 제시된 바와 같이 12-42%의 CART 양성 세포 범위를 발생시켰다.
CART-CD123 재지시된 T 세포의 세포용해 활성의 평가
CART-CD123 T 세포가 표적 발현 세포를 사멸시키는 기능적 능력을 평가하기 위해, 세포를 해동하고, 밤새 회복되게 하였다.
T 세포 사멸은 루시페라제를 안정적으로 발현하는 CD123-발현 MOLM13 급성 골수 백혈병 세포주에 대해 지시되었다. 비형질도입된 T 세포를 사용하여 비-특이적 배경 사멸 수준을 결정하였다. CART-CD123의 세포용해 활성은 이펙터가 항-CD123 키메라 수용체를 발현하는 T 세포로서 정의되는 경우에 4:1의 이펙터:표적 세포 비 및 T 세포의 2-배 하향 희석의 적정으로서 측정하였다. 적절한 수의 T 세포를 불변 수의 표적 세포와 혼합함으로써 검정을 개시하였다. 20시간 후 엔비전 기기 상에서 브라이트-글로™ 루시페라제 검정을 사용하여 루시페라제 신호를 측정하였다. CD123-CART-발현 세포 대 비형질도입된 T 세포의 비율이 증가함에 따라, CD123 세포의 사멸이 유사하게 증가하였다. 여기서 제시된 데이터는 CD123을 발현하는 그러한 세포가 CD123-CART-발현 세포에 의해서만 파괴되고, 비형질도입된 T 세포에 의해서는 그렇지 않다는 것을 시사한다. 도 3.
시토카인 생산
CD123 CART 세포의 시토카인 생산을 측정하기 위해, CD123-2, CD123-3, 또는 CD123-4를 발현하는 세포를 해동하고, 밤새 회복되게 하였다. 이소형 대조군을 발현하는 T 세포 ("이소형"으로 지칭됨)를 배경 T 세포 효과에 대한 비-특이적 대조군으로서 사용하였다. T 세포를 MOLM13, PL21, 또는 U87 세포 (표적 세포로 지칭됨)에 대해 지시하였다. 이펙터가 CD123 CAR을 발현하는 T 세포로서 정의된 경우에 표시된 바와 같이 1.25:1 또는 20:1의 이펙터:표적 비에서 검정을 시험하였다. 검정은, 인간 시토카인 검출을 위한 CBA-플렉스 키트를 사용한 시토카인 IL-2 (도 24a), IFN-감마 (도 24b), 및 TNF-알파 (도 24c)의 분석을 위해 배지를 제거한 경우에 세포를 혼합하고 24시간 후에 실행하였다. CD123 CAR-발현 T 세포를 CD123을 발현하는 암 세포와 함께 배양한 경우에, 모든 CD123-CART은 표적-발현 세포에 반응하여 시토카인을 생산하였다.
실시예 3: AML에서의 CART123
T 세포 형질도입
인간 항-인간 CD123 클론 NVS 2 (CAR123-2를 발현함), NVS 3 (CAR123-3을 발현함), NVS 4 (CAR123-4를 발현함)를 추가의 연구를 위해 선택하였다. 이들 클론은 시노몰구스 CD123에 대해 모두 교차-반응성이었다. 그의 활성을 CD8 힌지 도메인, CD8 막횡단 도메인, 및 41BB-공동자극 도메인과 함께 경쇄에서 중쇄 배향으로 VH 및 VL 도메인을 포함하는 마우스 클론 1172 및 1176과 비교하였다. 1176도 또한 시노몰구스 CD123에 대해 교차-반응성이었다. 1172는 그렇지 않았다.
플라스미드로 적격 세포를 형질전환시키고, 500cc 브로쓰 중에서 성장시키고, 맥시프렙에 의해 단리하고, 표준 방법을 사용하여 293T 세포 내로 형질도입하였다. 렌티바이러스 상청액을 24 및 48시간 째에 수집하고, 초원심분리를 사용하여 농축시키고, 동결시켰다.
렌티바이러스를 SupT1 세포에 대해 적정하고, MOI 3으로의 1차 T 세포의 형질도입을 위해 적절한 양의 바이러스를 결정하였다. 1차 정상 공여자 CD4+CD8 세포를 항-CD3/CD28 비드 (디날, 인비트로젠) 및 인터류킨-2 100U/ml를 사용하여 6일 동안 자극한 다음, 탈비드하고, 일단 동결시켰다. T 세포 세포 부피가 <300fL (대략 10-12일 후)로 감소하였다.
T 세포 형질도입 효율은 모든 클론에 대해 실질적으로 100%였다 (도 5a 및 5b). CD4:CD8 비는 NVS 클론에서 대략 1:1이었고, 1172 및 1176 클론에서 3:2였다 (도 6).
탈과립화
탈과립화를 평가하기 위해, CART 세포 (NVS 2-4, 1172 및 1176 클론)를 해동하고, T 세포 배지 중 2e6개 세포/ml의 농도로 밤새 안정시켰다. 이어서 세포를 카운팅하고, 다음 날 1e6개 세포/ml로 재현탁시켰다. 종양 표적 세포 (TCM, PMA/iono, MOLM14 또는 JURKAT)는 5e6개 세포/ml로 재현탁시켰다. 세포를 48 웰 플레이트에서 1e5개 T 세포 : 5e5개 종양 세포의 비로 플레이팅하고, 항-CD107a PECy7, 항-CD49d 정제, 및 항-CD28 정제 항체의 존재 하에 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 수거하고, 항-CD3 APC로 염색하고, BD LSR 포르테사를 사용하여 획득하였다 (도 7).
T 세포 탈과립화를 도 7의 각각의 플롯의 상부 우측 4분면에 나타낸다. 여기서 제시된 결과는, 2-시간 시험관내 검정 동안의 유사한 탈과립화에 의해 나타내어지는, CD123+ 표적의 유사한 T 세포 인식을 입증하였다. C1176은 다른 클론에서의 대략 80%와 비교하여 65%의 열등한 탈과립화를 가졌다.
세포독성
세포독성을 평가하기 위해, CART 세포 (NVS 2-4, 1172 및 1176 클론)를 해동하고, T 세포 배지 중 2e6개 세포/ml로 밤새 안정시켰다. 세포를 카운팅하고, 다음 날 1e6개 세포/ml로 재현탁시켰다. 종양 표적 세포 (MOLM14)를 1e6개 세포/ml로 재현탁시켰다. 세포를 표시된 바와 같이 (도 8) 감소되는 E:T 비로 흑색, 편평-바닥 96 웰 플레이트에 이중으로 플레이팅하였다. 인큐베이션 20시간 후, 루시페린을 첨가하고, 플레이트를 영상화하여 잔여 살아있는 세포의 척도로서 광자 유동을 결정하였다. MOLM14 세포의 사멸은 20시간에 대부분의 이펙터:표적 비에서 모든 클론 사이에 동등하였다.
생체내 마우스 모델
NSG 마우스에 1e6개 루시페라제 발현 MOLM14 세포를 D0에 iv 주사하였다. D6에 마우스를 종양 부담에 대해 영상화하고 (IVIS 스펙트럼), 처리군으로 무작위화하였다. 최소 종양 부담을 갖는 마우스를 대조군 (비형질도입된 T 세포, UTD)으로 할당하였다. CART 세포 (NVS 2-4, 1172 및 1176 클론) 또는 대조군 T 세포 (1e6)를 D7에 i.v. 주사하였다. D13에 수행된 영상화로부터의 데이터를 도 9에 제시한다. 주사 6일 후, 모든 항-CD123 구축물은 시험관내 데이터와 일치하는 동등한 항종양 효과를 제공하였다.
실시예 4: 인간화 CAR 구축물
시노몰구스 CD123에 대해 교차-반응성인 뮤린 1176에 기초하여 인간화 항-CD123 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 생성하고, 세포내 CD3제타 쇄 및 4-1BB의 세포내 공동-자극 도메인을 갖는 렌티바이러스 발현 벡터 내로 클로닝하고, 표 5 (상세한 설명에 제공됨)에 표시된 명칭을 제공하였다.
VL 및 VH 도메인이 scFv에서 출현하는 순서는 다양하고 (즉, VL-VH, 또는 VH-VL 배향), 여기서 "G4S" (서열식별번호: 25) 서브유닛의 3 또는 4개의 카피 (여기서 각각의 서브유닛은 서열 GGGGS (서열식별번호: 25)를 포함함) (예를 들어, (G4S)3 (서열식별번호: 28) 또는 (G4S)4(서열식별번호: 27))는 가변 도메인과 연결되어 표 6 (상세한 설명에 제공됨)에 제시된 바와 같은 전체 scFv 도메인을 생성한다.
인간화 scFv 단편 (서열식별번호: 184-215) CAR의 서열이 본원의 표 6에 제공된다. 이들 클론은 모두 CD3제타 쇄로부터 유래된 공동-자극 도메인의 신호 도메인 내에 Q/K 잔기 변화를 함유하였다. 이어서 CAR scFv 단편을 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝하여 단일 코딩 프레임 내에서, 발현을 위한 EF1 알파 프로모터 (서열식별번호: 11)를 사용하여 전장 CAR 구축물을 생성하였다.
실시예 5: 호지킨 림프종에서의 CART123
CD123은 유동 세포측정법에 의해 전형적 호지킨 림프종 (HL)의 약 50%에서 발현되는 것으로 공지되어 있다. IL3의 호지킨 림프종 세포주 배양물에의 외인성 투여는 성장을 촉진하고, 혈청 고갈에 의해 세포를 아폽토시스로부터 부분적으로 구출할 수 있는 것으로 공지되어 있다. SL-401에 의한 CD123 (IL-3Ra)의 억제는 CD123++ HL 세포주 (HDLM-2, L428)의 생존율을 감소시키는 것으로 공지되어 있다.
HL을 갖는 8명의 환자를 면역조직화학에 의해 CD123 발현에 대해 분석하였다. 표 15에 제시된 바와 같이, 4/8개의 샘플이 미세환경의 리드-스턴버그 세포 및/또는 면역 세포에서 양성을 제시하였다.
<표 15> 8개의 HL 시편에서의 IHC에 의한 표적 발현
Figure pct00114
유동 세포측정법은 널리-공지된 호지킨 림프종 세포주 HDLM-2에서의 CD30 및 CD123의 발현을 제시하였다 (도 10). B-세포 마커 CD19 및 CD20은 부재하였다.
하기 실험은 마우스 항-인간 CD123 scFv의 경쇄에서 중쇄 또는 중쇄에서 경쇄 배향을 갖는 pELNS 항-CD123-41BB-CD3ζ (CAR123) 플라스미드 DNA를 사용하였다. T 세포를 정상 공여자 (ND052, 휴먼 이뮤놀로지 코어(Human Immunology Core))로부터 수득하고, CD3/CD28 자기 비드 (인비트로젠)를 사용하여 확장시키고, 제2일에 CAR123 렌티바이러스로 형질도입하였다. 제6일에 T2A 공동발현에 의한 CD123의 대용물 마커인 dsRed를 검출하는 것을 통해 CD123을 검출하였다. dsRed는 유동 세포측정법을 통해 검출하였다 (도 11a-b).
이어서 4종의 호지킨 림프종 세포주 (HDLM2, KMH2, L428, SUPHD1), CD123+ MOLM14 (양성 대조군) 및 A375 (음성 대조군)에서 CD123 발현에 대해 Q-PCR을 수행하였다. CD123은 모든 호지킨 림프종 세포주에서 발현하였다 (도 12). GUSB를 하우스키핑 유전자로서 사용하였다. Ct 역치는 40이었다.
HL 세포 성장을 촉진하는데 있어서의 IL-3의 역할
CD123이 IL3 수용체 α 쇄이고, IL-3이 조혈 성장 및 분화에서 중요한 역할을 갖기 때문에, IL3 신호전달이 호지킨 림프종 세포주의 성장에서 중요한지 여부를 조사하였다. IL-3을 비롯한 인간 시토카인을 과다발현하는 NOD-SCID-γ-쇄 KO 마우스 (NSG-S 마우스)에 루시페라제-발현 HDLM-2 세포주를 생착시켰다. i.v. 주사 후, 신생물성 세포가 파종성 연부 조직 덩이를 점차적으로 형성하였다. 중화 항-IL3 항체의 연속 주사는 종양의 성장을 늦추었다. 여기서 제시된 결과는 CD123이 호지킨 림프종에서 특히 관련된 표적일 수 있다는 것을 시사한다. 종양 부담을 BLI에 의해 제시하였다 (도 13).
CD107a 탈과립화 검정
비형질도입된 T 세포 (UTD) 또는 CART123을 항-CD28, 항-CD49d 항체 및 모넨신의 존재 하에 HDLM-2 (CD123+ HL 세포주)와 5 표적 세포 대 1 T 세포의 비로 4시간 동안 인큐베이션하였다. 항-CD30 CAR T 세포를 추가의 대조군으로서 사용하였다.
유동 세포측정법에 의해 검출된 바와 같이, CART123은 CD107a 탈과립화를 증가시키는 것으로 제시되었지만 UTD는 그렇지 않았다 (도 14 및 15). 또한 CART123은 세포질내 시토카인 생산 (IL-2, TNF)에서의 유의한 증가를 제시하였다 (도 16).
CART123은 HDLM-2 세포를 사멸시킨다
루시페라제 기반 24시간 사멸 검정을 수행하였다. T 세포를 루시페라제+ HDML-2 세포와 상이한 비 (0.3:1 - 10:1)로 공동-인큐베이션하였다. CART123은 생물발광 방출에서의 감소에 의해 제시되는 바와 같이 용량 의존성 사멸을 제시하였지만, UTD는 그렇지 않았다. 흥미롭게도, CD30-특이적 CAR T 세포는 최소 활성을 제시하였다 (도 17).
CART123은 HL 세포주의 존재 하에 증식한다
T 세포를 5-일 T 세포 증식 검정에서 HL 세포주 (CD123+) 또는 대조군 (Jurkat CD123- , MOLM-14 CD123+) 또는 PMA/이오노마이신 (양성 대조군) 또는 세포 배지 (음성 대조군)와 인큐베이션하였다. CART123 및 CART30 세포는 HL 세포주와 공동-배양한 경우에 강건한 증식을 제시하였지만, UTD는 그렇지 않았다 (도 18).
증식 검정으로부터의 상청액을 72시간 후에 수집하고, 30종의 시토카인의 존재를 루미넥스 검정에 의해 분석하였다. CART123은 다중 시토카인의 강건한 생산을 제시하였다 (IFNg, IL-2, TNFa 및 MIP1b 루미넥스 MFI가 각각 도 19a-19d에 제시됨).
호지킨 림프종 세포주 (HDLM-2)에 대한 CART123의 생체내 효능
여기서 제시된 시험관내 데이터를 확증하기 위해, 생체내 동물을 개발하였다. 1백만개의 루시페라제+ HDLM-2 세포를 제0일에 i.v. 주사하였다. 이어서 입증된 연속 생물발광 영상화 (BLI)를 수행하여 종양 수준을 관찰하였다 (도 20). 낮은 수준의 종양이 제7일에 관찰되었고, 이어서 대략 6주에 걸쳐 인간 질환의 무통성 속성을 재현하는 종양 부담에서 점진적 증가가 관찰되었다. 종양 부담이 기준선보다 20-배 더 높아진 때인 제43일에, 마우스를 1백5십만개의 CART123 세포 또는 대조군 T 세포로 처리하였다.
CART123은 14일 내에 파종성 종양의 완전 및 지속적 근절을 유도하였고, 이는 6개월에 100% 재발-부재 및 100% 전체 생존으로 이어졌다 (도 21 및 22).
종양 제거는 연속 말초 혈액 채혈 중 유동 세포측정법에 의해 검출된 바와 같은 광범위한 CAR T 세포 확장과 연관되었다 (도 23). 확장된 T 세포는 대략 50% CD8 및 50% CD4 세포였다. T 세포 수는 종양 부담이 감소함에 따라 시간의 경과에 따라 축소되었다.
실시예 6: CD123-2 CAR의 추가의 특징화
추가의 시험관내 검정을 수행하여 CAR123-2 구축물을 발현하도록 렌티바이러스 형질도입된 1차 T 세포 (본원에서 LV CAR123-2로도 지칭됨)를 평가하였다. CAR-발현 T 세포 (LV CAR123-2)를 음성 대조군으로서 작용하는 시토메갈로바이러스 (hCMV) 당단백질 H (gH)에 대한 scFv를 발현하는 T 세포 (본원에서 항-GH로 칭함)와 비교하였다. 주요 시험관내 검정은 시토카인 생산, 증식, 및 세포 사멸 검정을 포함하였다. 증식 검정은 T 세포 (LV CAR123-2 또는 항-GH)를 CD123-발현 (항원 +) 세포주, 예를 들어 인간 CD123을 발현하는 MOLM13 또는 K562, 또는 CD123-음성 (항원 -) 대조군 세포주, 예를 들어 K562와 인큐베이션함으로써 수행하였다. T 세포를 4일 동안 성장시켰다. 도 25에 제시된 바와 같이, CAR-발현 세포는 CD123-발현 세포의 존재 하에 배양한 경우에 음성 대조군과 비교하여 강건한 증식을 나타내었다.
CAR123-2-발현 T 세포가 표적 세포를 사멸시키는 능력은 1:20에서 1:0.3125까지의 2-배 희석 범위의 표적:이펙터 세포 비의 적정으로서 측정하였다. 시험된 표적 세포는 루시페라제를 안정적으로 발현하는 CD123-발현 MOLM13 세포주, 루시페라제를 안정적으로 발현하는 PL21 세포, 및 루시페라제를 안정적으로 발현하는 U87 세포였다. 도 26a 및 26b에 제시된 바와 같이, CD123-CAR 발현 세포는 CD123-발현 암 세포 (MOLM13 및 PL21)의 사멸을 표적화하는 것을 입증한 한편, 음성 대조군 (항-GH를 발현하는 세포) 및 비형질도입된 세포 (UTD)는 표적화된 사멸을 입증하지 않았다. 도 26c에 제시된 바와 같이, UTD, 음성 대조군 (항-GH) 및 CD123 CAR-발현 세포는 U87 세포 (CD123을 발현하지 않음)의 특이적 사멸을 입증하지 않았다.
시토카인 생산 검정은 T 세포 (CAR123-2 또는 항-GH를 발현함)를 항원 양성 (MOLM13) 또는 항원 음성 (U87) 세포와 함께 포함하는 공동-배양물로부터의 상청액을 분석함으로써 수행하였다. CD123-CAR T 세포는 IFN-감마 (도 27a) 및 IL-2 (도 27b)의 강건한 시토카인 생산을 제시하였다.
실시예 7: 항원-상실 재발의 치료 및 예방을 위한 항-CD123 및 항-CD19 CAR T 세포의 조합
화학요법-불응성 또는 재발성 (r/r) B-세포 급성 림프모구성 백혈병 (B-ALL)은 불량한 예후와 연관되지만, 최근에 입증된 바와 같이, 이는 면역계에 대해 정교하게 감수성인 것으로 남아있다. 특히, 항-CD19 키메라 항원 수용체 T 세포 (CART19, CTL019) 및 이중-특이적 항-CD19/CD3 항체 (블리나투모맙)는 이러한 환자 집단에서 45-90%의 전례없는 완전 반응률을 생성한다. 둘 다의 접근법은 자가 T 세포가 CD19-발현 세포를 인식하도록 재-지시한다. 블리나투모맙은 CART19 T 세포가 내장된 공동-자극 도메인과 함께 신호전달하는 T 세포 수용체에 융합된 항-CD19 scFv를 발현하도록 유전자 변형된 경우에; 항-CD19 단일 쇄 가변 단편 (scFv)이 항-CD3 scFv와 조합된 이중특이적 구축물의 연속 장기간 주입을 사용한다. 최근 연구는 CTL019로 처리된 r/r B-ALL을 갖는 환자의 90%가 완전 완화 (CR)에 도달하고, 6개월의 전체 생존 (OS)은 78%임을 제시하였다. CART19에 의한 고무적인 결과는 또한 다른 B-세포 신생물, 예컨대 만성 림프구성 백혈병 및 비-호지킨 림프종을 갖는 환자에서도 수득되었다.
그러나, CART19 또는 블리나투모맙으로 처리된 환자의 하위세트는 재발이 발생하였고, 이들 재발의 유의한 부분은 CD19의 상실을 특징으로 하였다. B-ALL에서, CD19-음성 재발은 CART19 또는 블리나투모맙 요법 후 환자의 10-20%에서 보고된 바 있고, 다른 처리의 설정에서는 기재된 바 없으며; 전체적으로 블리나투모맙 후에 약 30% 및 CART19 후 최대 50% 재발이 CD19-음성이었다. CD19는 가장 초기 단계의 B 세포 발생으로부터 성숙 B-세포까지 발현되는 원형 B-세포 마커이다. CD19-결핍 B 세포는 선택적 성장 단점을 나타내기 때문에, CD19는 B 세포 생물학에서 중요한 역할을 한다. 따라서, CD19의 부재는 B-ALL에서 매우 비통상적인 발견이고, 강력한 CD19-지시된 면역요법의 시기 전 단지 드문 환자에서만 보고된 바 있다. 항원 상실의 가능한 메카니즘은 현재 조사 중이고, 이들 강력한 항-CD19 작용제에 의한 백혈병 하위-클론에 대한 선택 압력에 의해 유발되었을 가능성이 가장 크다. FDA에 의한 블리나투모맙의 최근 승인 및 CTL019에 따른 획기적인 상태로 인해, r/r B-ALL를 갖는 증가하는 수의 환자는 이들 작용제로 처리될 가능성이 있다. 따라서, CART19 또는 블리나투모맙 후에 CD19-음성 모세포에 의해 재발될 이들 환자를 치료할 수 있기 위해서는 신규의 효과적인 전략이 필요하다. 이상적으로는, 새로운 접근법은 활성 항원-상실 재발을 갖는 환자를 치료할 뿐만 아니라, 선행하는 것을 사용한 경우에 그의 발생을 잠재적으로 예방할 수 있을 것이다.
인터류킨-3 수용체 알파 (또는 CD123)는 조혈에 관여하고, 급성 골수성 백혈병 (AML), 급성 림프성 백혈병 (ALL), 형질세포양 수지상 세포 신생물, 모발상 세포 백혈병, 및 호지킨 림프종을 비롯한 여러 혈액 신생물에서 발현되는 것으로 제시된 바 있다. 계열-연관 표면 항원, 예컨대 CD33 (골수성) 또는 CD19 (B-림프성)와 달리, CD123은 조혈 전구 세포 상에서 계층적으로 발현되고, AML에서 CD123은 화학요법에 대한 저항성 및 초기 처리 후 재발에 관여하는 백혈병성 줄기 세포 상에서 발현된다. 이들 특징으로 인해, CD123은 표적화 요법에 대한 큰 관심을 생성하여 왔고, IL3-디프레티라 독소 융합 단백질 (SL-401, DT388IL3), 네이키드 항-CD123 모노클로날 항체 (CSL-360, CSL-362), 항체-약물 접합체, 이중-특이적 항체 또는 CD3Fv-IL3 융합 구축물, 및 보다 최근에는 항-CD123 키메라 항원 수용체 T 세포와 같은 다중 작용제가 개발되고 있다. 이들 접근법 중 일부는 현재 임상 시험에서 검증 중이고, 더 많은 것들이 향후 수년 내에 임상에서 시험될 것이다. 키메라 항원 수용체 T 세포 (CART123)로 CD123을 표적화하는 것은 인간 원발성 AML 이종이식편에서 심층적이고 장기간의 반응으로 이어질 수 있고, 항백혈병 T 세포 기억을 확립할 수 있다. 여기서, CD123은 CD19-지시된 요법 후에 발생한 CD19-음성 B-ALL 재발에서 발현되고, CART19 (CTL019)와 조합된 CAR-123 T 세포는 B-ALL 이종이식편에서 항원-상실 재발의 치료 및 예방을 위한 유효 요법이다.
물질 및 방법
세포주 및 원발성 샘플. 세포주를 원래 ATCC (버지니아주 마나사스) (K-562) 또는 DSMZ (독일 브라운슈바이크) (MOLM-14 및 NALM-6)로부터 수득하였다. 모든 세포주를 미코플라스마 오염의 존재에 대해 시험하였다 (미코얼러트(MycoAlert)™ 미코플라스마 검출 키트, LT07-318, 스위스 바젤 론자). 일부 실험의 경우에, 세포주를 반딧불이 루시페라제/eGFP로 형질도입한 다음 분류하여 >99% 양성 집단을 수득하였다. 루시페라제 양성 K-562 세포주를 또한 말단절단된 CD19 또는 말단절단된 CD123로 형질도입하여, 어떤 것도 발현하지 않거나, 단지 CD19 또는 단지 CD123만을 발현하는 세포주를 수득하였다. MOLM-14 및 K562를 관련 도에 표시된 바와 같이 대조군으로서 사용하였다. 세포주를 10% 태아 소 혈청 (FBS, 제미니(Gemini), 100-106, 캘리포니아주 웨스트 새크라멘토)으로 보충된 RPMI 배지 1640 (깁코(Gibco), 11875-085, 라이프테크놀로지스(LifeTechnologies), 뉴욕 그랜드 아일랜드), 및 50 UI/ml 페니실린/스트렙토마이신 (깁코, 라이프테크놀로지스, 15070-063)을 함유하는 배양물 중에 유지시켰다. 탈식별 원발성 인간 ALL 골수 (BM) 및 말초 혈액 (PB) 시편을 임상시험 심사 위원회 (IRB)-프로토콜 하의 펜실베니아 대학교/필라델피아 어린이 병원의 임상 실시로부터 수득하거나, 펜실베니아 대학교의 줄기 세포 및 이종이식편 코어로부터 또는 현행 CTL019 임상 시험의 연구 샘플 (펜실베니아 대학교에서의 해석 및 상관관계 연구 실험실)로부터 구입하였다. 모든 기능적 연구를 위해, 1차 세포를 적어도 실험 12시간 전에 해동하고, 37℃에서 휴지시켰다.
원발성 B-ALL 모세포의 생체내 확장. 방법은 문헌 [D. M. Barrett, A. E. Seif, C. Carpenito, D. T. Teachey, J. D. Fish, C. H. June, S. A. Grupp, G. S. Reid, Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling. Blood 118, e112-117 (2011)]에 개시되어 있다.
형광 계내 혼성화 (FISH) 및 면역조직화학. FISH 분석 및 면역조직화학을 표준 방법에 따라 및 기재된 바와 같이 수행하였다. (M. A. Belaud-Rotureau, M. Parrens, P. Dubus, J. C. Garroste, A. de Mascarel, J. P. Merlio, A comparative analysis of FISH, RT-PCR, PCR, and immunohistochemistry for the diagnosis of mantle cell lymphomas. Modern pathology : an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc 15, 517-525 (2002)). FISH 분석을 표준 방법에 따라 수행하였다. 간략하게, 수거한 ALL 세포를 고정제 (아세트산 및 메탄올) 중에 현탁시키고, 슬라이드 상에 침착시키고, 건조되게 두었다. 이중 색상 유전자 융합 프로브 BCR/ABL (애보트 몰레큘라(Abbott Molecular))을 혼성화 완충제 용액 중에 적용하였다. 슬라이드를 커버-슬립하고, 밀봉하고, HY브라이트(HYBrite) 챔버 내부에 37℃에서 6시간 동안 두었다. 실란트 및 커버슬립을 제거한 후, 슬라이드를 2회 세척하고, 블롯팅하고, 건조시키고, DAPI로 대조염색하였다. 슬라이드를 형광 현미경 하에 검사하였고, 최소 200개의 핵이 각각의 시편에서 평가되었다.
CAR 구축물 및 CAR T 세포의 생성. 뮤린 항-CD19 키메라-항원 수용체 (CD8 힌지, 4-1BB 공동-자극 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인)를 이전에 기재된 바와 같이 생성하였다. (Milone, et al., Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 17, 1453-1464 (2009) 및 Imai, et al., Leukemia 18, 676-684 (2004)). 이는 펜실베니아 대학교에서의 CTL019 임상 시험에 현재 사용되는 동일한 구축물이다. CAR123을 위해, scFv 항-CD123 (1172 구축물 (서열식별번호: 707, 및 PCT/US2014/017328에 기재된 바와 같음) 및 CAR19의 동일한 백본 구축물을 사용하였다. CAR-발현 T 세포의 생산은 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. (Gill, et al., Blood 123, 2343-2354 (2014)). 정상 공여자 CD4 및 CD8 T 세포 또는 PB 단핵 세포 (PBMC)를 펜실베니아 대학교의 인간 면역학 코어로부터 수득하였다. T 세포를 1:1의 CD4:CD8 비로 1x106개/ml로 플레이팅하고, 인간 AB 혈청 5% (제미니(Gemini), 100-512), 페니실린/스트렙토마이신 (깁코, 15070063) 및 글루타맥스 (깁코, 35050061)로 보충된 엑스-비보(X-vivo) 15 배지 (론자, 04-418Q) 중에서, 배양 제1일에 첨가되고 제6일에 제거되는 항-CD3/CD28 디나비즈 (라이프 테크놀로지스, 11161D)를 사용하여 확장시켰다. T 세포를 제2일에 렌티바이러스로 형질도입하였다. T 세포를 8-15일 동안 배양물 중에서 확장시키고, 중앙 세포 부피가 300 fl 미만일 때 수거하였다. 이어서 T 세포를 추후 실험을 위해 10% DMSO를 함유하는 FBS 중에서 동결보존시켰다. 모든 실험 전에, T 세포를 해동하고, 37℃에서 밤새 휴지시켰다.
다중파라미터 유동 세포측정법. 유동 세포측정법을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Kenderian, et al., Leukemia, (2015)). 항-인간 항체를 바이오레전드, 이바이오사이언스(eBioscience) 또는 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)으로부터 구입하였다. 시험관내 배양물 또는 동물로부터 세포를 단리하고, 2% 소 태아 혈청으로 보충된 PBS 중에서 1회 세척하고, 실온에서 15분 동안 염색하였다. 세포 수 정량화를 위해, 카운트브라이트(Countbright) (인비트로젠) 비드를 제조업체의 지침에 따라 사용하였다. 모든 분석에서, 관심 집단을 전방 vs. 측방 산란 특징에 기초하여 게이팅한 다음 단일선 게이팅하고, 살아있는 세포는 라이브 데드 픽서블 아쿠아(Live Dead Fixable Aqua) (인비트로젠)를 사용하여 게이팅하였다. 품질 관리를 위해 시간 게이팅을 포함시켰다. CAR19의 표면 발현은 항-이디오타입 항체를 사용하여 이전에 기재된 바와 같이 검출하였다. CAR123의 검출은 염소-항-마우스 항체 (잭슨 래보러토리즈(Jackson Laboratories)) 또는 CD123-Fc/His (시노 바이올로지칼스(Sino Biologicals)) 및 항-His-APC (R&D) 또는 PE (압캠(AbCam))를 사용하여 수행하였다. 유동 세포측정법을 4-레이저 포르테사-LSR II 세포측정기 (벡톤-디킨슨) 상에서 수행하고, 플루우조 X 10.0.7r2 (트리 스타(Tree Star))에 의해 분석하였다.
시험관내 T-세포 이펙터 기능 검정. 탈과립화, CFSE 증식, 세포독성 검정 및 시토카인 측정을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. (Gill, et al., Blood 123, 2343-2354 (2014) 및 Kalos, et al., Science translational medicine 3, 95ra73 (2011)).
탈과립화 검정. 간략하게, T 세포를 T 세포 배지 중에서 표적 세포와 1:5 비로 인큐베이션하였다. 항-CD107a-PECY7 (바이오레전드), 항-CD28 (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences)), 항-CD49d (비디 바이오사이언시스) 항체 및 모넨신 (비디 바이오사이언시스)을 공동-배양물에 첨가하였다. 4시간 후, 세포를 수거하고, CAR 발현, CD3, CD8 및 라이브 데드 아쿠아 염색 (인비트로젠)에 대해 염색하였다. 세포를 고정하고 투과화한 다음 (인비트로젠 Fix/Perm 완충제), 세포내 염색을 수행하여 다중 시토카인 (IFN, TNFα, IL-2, GM-CSF, MIP1β)을 검출하였다.
증식 검정. T 세포를 세척하고, 100 ul의 PBS 중 1x107개/ml로 재현탁시키고, 100 ul의 CFSE 2.5 uM (인비트로젠)으로 37℃에서 5분 동안 염색하였다. 이어서 반응을 차가운 배지로 켄칭하고, 세포를 3회 세척하였다. 표적을 100 Gy의 용량으로 방사선조사하였다. T 세포를 방사선조사된 표적 세포와 1:1 비로 120시간 동안 인큐베이션하고, 24시간에 배지를 첨가하였다. 이어서 세포를 수거하고, CD3, CAR 및 라이브 데드 아쿠아 (인비트로젠)에 대해 염색하고, 절대 정량화를 위해 유동 세포측정 분석 전에 카운트브라이트 비드 (인비트로젠)를 첨가하였다.
세포독성 검정. 루시페라제/eGFP+ 세포주를 이전에 기재된 바와 같이 세포독성 검정에 사용하였다. 간략하게, 표적을 이펙터 T 세포와 표시된 비로 24시간 동안 인큐베이션하였다. 사멸은 제노겐 IVIS-200 스펙트럼 카메라 상에서의 생물발광 영상화에 의해 계산하였다.
시토카인 측정. 이펙터 및 표적 세포를 1:1 비로 T 세포 배지 중에서 24시간 동안 공동-인큐베이션하였다. 상청액을 수거하고, 30-플렉스 루미넥스 어레이 (루미넥스 코포레이션(Luminex Corp), 플렉스맵(FLEXMAP) 3D)에 의해 제조업체의 프로토콜 (인비트로젠)에 따라 분석하였다.
동물 실험. 생체내 실험을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. (Kenderian, et al., Leukemia, (2015)). 이용된 이종이식편 모델의 개요가 관련 도면, 결과에서 상세하게 논의되어 있다. 원래 잭슨 래보러토리즈로부터 입수한 NOD-SCID-γ 쇄-/- (NSG)를 펜실베니아 대학교의 줄기 세포 및 이종이식편 코어에서 구입하였다. 모든 실험은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 지침에 부착된 동물 실험 윤리 위원회 (IACUC)에 의한 승인을 받은 프로토콜 (#803230)에 따라 수행하였다. PBS 200 ul 중 표시된 농도의 세포 (백혈병 세포주 또는 T 세포)를 마우스의 꼬리 정맥 내로 주사하였다. 제노겐 IVIS-200 스펙트럼 카메라를 사용하여 생물발광 영상화를 수행하고, 리빙이미지 소프트웨어 v. 4.3.1 (캘리퍼 라이프사이언시스(Caliper LifeSciencies))에 의해 분석하였다. 실험 종료 시 또는 IACUC 프로토콜에 따라 사전-명시된 종점을 충족시킨 경우에 동물을 안락사시켰다.
다광자 현미경검사. 마우스를 마취하고, 37℃의 코어 온도로 유지시켰다. 두피를 제거하고 두개골을 고정한 후 골수를 영상화하였다. 영상화는 피코초 레이저 (코헤런트(Coherent))가 구비된 레이카 SP5 2-광자 현미경 시스템 (레이카 마이크로시스템즈(Leica Microsystems))을 사용하여 수행하였다. 각각의 영상화 획득은 20분 지속되었고, 이어서 마우스 진정을 평가하였다. 850 nm의 레이저 광을 사용하여 셀트레이스 바이올렛, GFP, 및 셀트레이스 오렌지 (또는 TRITC)를 여기시켰다. 20x 물-침지 렌즈를 사용하여 영상을 수득하였다. 생성된 영상을 볼로시티(Volocity) 소프트웨어 (퍼킨엘머(PerkinElmer))를 사용하여 분석하였다.
통계적 분석. 모든 통계는 윈도우, 버전 6.04용 그래프패드 프리즘 6 (캘리포니아주 라 욜라)을 사용하여 표시된 바와 같이 수행하였다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 2개의 군을 비교하였고; 다중 군을 비교하는 분석에서는, 다중 비교를 위한 홀름-시다 보정과 함께 일원 분산 분석 (ANOVA)을 수행하였다. 다중 군을 다중 시점/비에서 비교하는 경우에, 각각의 시점/비에 대해 스튜던트 t-검정 또는 ANOVA를 사용하였다. 생존 곡선은 로그-순위 검정을 사용하여 비교하였다. 도에서 별표는 p-값 (*=<0.05, **=<0.01, ***=<0.001, ****=<0.0001)을 나타내기 위해 사용하였고, "ns"는 "유의하지 않음" (p>0.05)을 의미한다. 각각의 실험에 대한 통계의 추가의 세부사항은 도면 범례에서 열거된다.
결과
CD123은 B-ALL, 백혈병 줄기 세포 및 CD19-음성 재발에서 발현된다.
B-세포 급성 림프모구성 백혈병에서 CD123의 발현을 평가하기 위해, 본 발명자들의 현행 CTL019 임상 연구에 등록된 14명의 대상체를 비롯한 성인 및 소아 ALL 환자로부터의 42개의 샘플을 분석하였다. 도 31a, 31b 및 38a에 제시된 바와 같이, CD123은 대부분의 ALL 모세포의 표면 상에서 고도로 균질하게 발현되었고, 이는 표적화 요법을 위한 이상적인 후보라는 것을 나타낸다. 또한, CD123은 CD34+ CD38-로서 확인된 추정 백혈병 줄기 세포 (LSC)에서도 발현되는 것으로 발견되었다 (도 31c). CD19-음성 모세포의 작은 하위세트는 일부 B-ALL 환자에서 확인할 수 있고, 이들 세포는 이들이 악성 표현형을 갖는 세포를 함유하는 경우에 항원-상실 재발에 기여할 수 있었다. CD19-음성 하위세트에서 질환의 존재를 평가하기 위해, 필라델피아 염색체 양성 B-ALL 벌크 집단으로부터의 CD19- CD123+ 세포를 분류하였다 (CD45dim, 도 38b에 제시된 게이팅 전략). 이들 세포는 CD19+ 모세포보다 낮은 빈도이기는 하지만 BCR-ABL 전위에 대해 클론성인 것으로 발견되었다 (도 31d). 이러한 발견은 CD19를 단독으로 표적화하는 것이, 일부 경우에, CD19-CD123+ 세포로부터 유래된 서브클론 재발로 이어질 수 있다는 것을 보여준다. 또한, 이러한 발견은 CD123을 표적화하는 것이 LSC 및 가능하게는 CD19-neg 백혈병 클론의 제거를 통해 보다 심층적인 반응으로 이어질 수 있다는 것을 시사한다.
마지막으로 CTL019 후에 재발한, CD19가 상실된 B-ALL 환자의 샘플에서 CD123의 발현을 또한 평가하였다. 중요한 것은, CD19의 완전 상실과 대조적으로, 대부분의 환자가 재발 시 CD123 발현을 유지하였다 (도 31e, 31f 및 38c). 이들 발견은 CD123이 CART19 또는 블리나투모맙 후에 발생한 CD19-neg ALL 모세포를 표적화하기 위한 이상적인 마커를 나타낸다는 것을 보여준다.
항-CD123 키메라 항원 수용체 T 세포는 시험관내 및 생체내에서 인간 B-ALL에 대해 활성이다.
렌티바이러스 형질도입되고 항-CD3/CD28 자기 비드에 의해 확장된 항-CD123 키메라 항원 수용체 T 세포 (CART123)를 생성하였다 (37). B-급성 림프모구성 백혈병에 대한 CART123의 시험관내 및 생체내 활성을 본원에 기재된 바와 같이 평가하였다.
CD19++ 및 CD123+인 B-ALL 세포주 NALM-6 (도 32a 및 39a) 및 원발성 B-ALL 샘플을 사용하였다. CART123 및 CART19 사이의 헤드-투-헤드 시험관내 비교는 T 세포를 NALM-6 또는 원발성 ALL과 공동-배양한 경우에 유사한 CD107a 탈과립화율을 밝혀내었다 (도 32b). CART123은 또한 CART19와 유사한 효능으로 용량-의존성 방식으로 NALM-6 세포를 사멸시킬 수 있었다 (도 32c). 보다 장기간의 실험에서, NALM-6 또는 원발성 ALL과 3-5일 동안 공동-배양한 경우에 CART123은 증식하고 (도 32d 및 32e) 다중 시토카인을 생산하였다 (도 32f). 이들 결과는 CART123이 다중 B-ALL 표적에 대해 CART-19와 동등한 효력을 나타낸다는 것을 보여준다.
이들 데이터를 생체내 모델에서 확인하기 위해, 원발성 ALL 모델을 이용하였다. 이 모델에서, B-ALL 환자로부터 수득한 원발성 모세포를 NOD-SCID-γ 쇄 녹-아웃 (NSG) 마우스에서 계대배양하고, eGFP 및 방아벌레 루시페라제 (GFP/Luc)를 함유하는 리포터 구축물로 형질도입하였다. NSG 마우스에 GFP/Luc+ 원발성 ALL 모세포를 i.v. 주사하고 (JH331, CD19+, CD123+, 표현형 첨가), 생착 후, 마우스를 무작위화하여 CART19, CART123 또는 대조군 비형질도입된 T 세포 (UTD)를 제공하였다. 대조군 T 세포로 처리된 마우스는 신속하게 질환으로 사망한 한편, CART19 또는 CART123으로 처리된 마우스는 종양 근절 및 장기간 생존을 제시하였다 (도 33a 및 33b). CAR123 T 세포는 마우스의 말초 혈액 (PB)에서 대조군 T 세포와 비교하여 유의하게 확장되었고, 높은 수준의 CAR123을 발현하였다 (도 33c). 본 발명자들이 마우스에 CD123- CD19+ 백혈병 (AV576)을 생착시킨 경우에, CART19만이 항백혈병 활성을 제시한 반면 CART123은 대조군 UTD와 비교하여 어떠한 효과도 갖지 않았기 때문에 (도 39b 및 39c), CART123의 항백혈병 활성은 특이적이고, 모세포의 표면에서의 CD123의 인식을 기초로 하였다.
CART123 용량과 항종양 활성의 가능한 상관관계를 검출하기 위해, 높은 백혈병 부담을 보유하는 마우스의 생체내 모델 (NALM-6 세포주를 사용함)을 개발하였다. 이러한 모델에서, 표준 용량의 CART123 (2백만개의 CAR+ 세포)은 종양을 제거할 수 없었다. 이들 마우스에게 상이한 용량의 CART123 (1.25, 2 및 5백만개 CAR+ 세포)을 주사하고, 용량-관련 항백혈병 활성을 관찰하였다 (도 39d).
CART123은 항원-상실 재발의 신규 전임상 모델에서 고도로 활성이지만 CART19는 그렇지 않다
표적 CD19-음성 재발에 대한 새로운 전략을 시험하기 위해, 항원-상실 재발의 신규 생체내 모델을 개발하였다. 본 발명자들의 CTL019 임상 시험 중 하나에 등록된 환자 CHP101)로부터 수득한 B 세포 모세포를, 질환이 CD19++ 및 CD123+인 경우에 기준선에서 (CTL019 요법 전), 환자에서 CD19-음성 질환이 발생한 경우에 (CD123은 여전히 발현됨, 도 40a) CTL019 후 재발 시에 수집하였다. 이어서 모세포를 NSG 마우스에서 확장시키고, 기준선 질환 (CD19+)의 경우에 방아벌레 녹색 루시페라제 (CBG)로 또는 재발 (CD19-)의 경우에 방아벌레 적색 루시페라제 (CBR)로 형질도입하였다 (방법 섹션 참조). 중요한 것은, 생체내 확장 동안, 모세포는 CD19 이외의 B 세포 아이덴티티의 마커를 보유하였다 (데이터는 제시하지 않음). 제1 실험에서, NSG 마우스에 기준선 질환 CD19+ (CBG, 녹색) 또는 CD19-neg (CBR, 적색) 백혈병을 생착시켰다. 둘 다의 군을 무작위화하여 CART19 또는 대조군 T 세포 (UTD)를 제공하였다 (도 34a). 도 34b에 제시된 바와 같이, 둘 다의 군에서 UTD로 처리된 마우스는 CD19의 발현과 독립적으로 기준선 및 재발 질환 둘 다의 신속한 진행을 제시하였다. 반대로, CART19로 처리된 마우스의 군에서, 기준선 질환이 생착된 마우스 (CD19-양성)만이 CART19 처리에 반응하였고, 재발성 질환이 생착된 마우스 (CD19-음성)는 예상된 바와 같이 불응을 제시하였다. 이는 또한 시험관내 CD107a 탈과립화 검정에서 재현되었다 (도 40b). CD19를 발현하거나 또는 그것이 결여된 상이한 클론의 생체내 존재를 시뮬레이션하기 위해, NSG 마우스에 기준선 및 재발 질환의 1:1 혼합물을 생착시키고; 제8일에 마우스를 무작위화하여 CART19 또는 대조군 T 세포를 제공하였다. 종양 부담을 생체내 CD19+ (CBG, 녹색)/CD19- (CBR, 적색) 백혈병 상대 성장 사이를 구별할 수 있는 생물발광 영상화에 의해 모니터링하였다. 도 43c에 제시된 바와 같이, UTD를 제공받은 마우스에서 제6일에 존재한 CD19+ (녹색) 및 CD19- (적색) 백혈병 둘 다는 제11일에 유사하게 증가하였고, CART19로 처리된 마우스에서 기준선 질환 (녹색)은 완전히 제거된 반면 재발성 질환 (적색)은 진행을 제시하였다.
원발성 CD19-음성 B-ALL 및 CART19 실패의 이러한 고유한 이종이식편 모델을 사용하여 항원-상실 재발의 치료에서의 CART123의 역할을 평가하였다. 원발성 CD19-음성 모세포 (CBR 양성)를 NSG 마우스 내로 주사하고 (도 34d), 마우스를 무작위화하여 CART19, CART123 또는 대조군 T 세포를 제공하였다. CART19 및 대조군 T 세포는 항종양 활성의 완전한 결여를 제시한 반면에, CART123은 이들 마우스에서 질환의 완전한 근절 및 장기간 생존을 발생시켰다 (도 34e 및 34f). 실제로 CART19에 불응성인 원발성 B-ALL의 전임상 모델에서, 신규 CART123은 질환을 근절시키고 장기간 생존을 부여할 수 있었다.
단세포 수준에서의 이러한 생체내 모델에서 CART19 및 CART123의 차별 거동을 이해하기 위해, 차별 표지된 CART19 (셀트레이스 바이올렛, 청색) 및 CART123 (셀트랙커 오렌지 또는 TRITC, 적색)의 혼합물을 CD19-양성 원발성 모세포 (GFP) 또는 CD19-음성 재발성 모세포 (GFP)를 보유하는 마우스에 주입하여 일련의 실험을 수행하였고, 주사 대략 24시간 후에 두개 골수의 생체내 2-광자 현미경검사를 사용하여 그의 거동을 추적하였다 (실험 개요, 도 35a). 이들 연구는 CART19 및 CART123이 백혈병을 함유하는 골수 공간으로 트래픽킹되었고, 동족 항원의 CART 세포 인식이 운동성 정지와 상관된다는 것을 제시하였다. 구체적으로, 기준선 CD19+CD123+ 백혈병이 생착된 마우스에서 62.9% +/- 3.8의 CART19 및 81.1%+/-1.2의 CART123이 모세포에 인접한 원형 형태로 멈춘 것으로 발견된 반면에, 재발성 CD19-CD123+ 백혈병이 생착된 마우스에서는 단지 CART123 세포만이 거의 종양 세포에서 정지하였다 (CART123 80.9%+/-5.1 vs CART19 12.4%+/- 2.2) (도 35b 및 35c). 이들 발견은 CD19-음성 재발성 ALL에서 CART123만이 백혈병 세포 (GFP)와 생산적 시냅스를 확립할 수 있고, 이에 따라 그의 운동성은 감소되는 반면에, CART19 세포는 백혈병 모세포의 인식 없이 환경에서 샘플링 및 이동을 계속한다는 것을 나타낸다.
CART123 및 CART19의 조합물은 CD19-음성 재발을 예방할 수 있다
CART123은 CART19 저항성 전임상 모델에서 CD19-지시된 요법 후에 발생한 CD19-음성 재발의 치료에 효과적인 것으로 입증되었다. 그러나, 조합 접근법은 활성 CD19-양성 질환을 치료하는 한편 항원-상실 재발을 동시에 예방할 수 있다. 이러한 가설을 시험하기 위해, 원발성 CD19- 및 CD19+ 질환을 함께 NSG 마우스 내로 주사함으로써 CD19-음성 회피에 대한 잠재력을 갖는 B-ALL의 대두되는 임상 문제를 모델링하였다. 이어서 마우스를 무작위화하여 대조군 T 세포 (UTD), CART19, 또는 CART19 및 CART123의 조합물을 T 세포의 동일한 총 용량으로 제공하였다 (도 36a). 도 36b에 제시된 바와 같이, 대조군 T 세포로 처리된 마우스는 백혈병 클론 둘 다의 진행을 가졌고, CART19는 대부분의 CD19-neg 질환의 신속한 진행을 제시하였다 (적색). 대조적으로 CART123 및 CART19의 조합물로 처리된 마우스는 질환의 제거를 제시하였고, 도 36c에 제시된 바와 같이 전체 생존을 개선시켰다. 실험의 말미에 희생시킨 마우스의 분석은 풀링된 CAR T 세포 군에서 잔류 백혈병의 증거를 전혀 제시하지 않았다. 대조적으로, CART19 단독요법 후에 진행성 질환을 갖는 마우스는 예상되는 CD19 음성 표현형을 유지하였다 (도 36d).
마지막으로, CD19 및/또는 CD123 둘 다에 의해 활성화될 수 있는 CART를 발생시키기 위해, 하나는 CAR19를 보유하고 다른 것은 CAR123을 보유하는 2종의 렌티바이러스로 T 세포를 형질도입하였다. 도 37a에 제시된 바와 같이, 4종의 상이하게 형질도입된 T 세포 하위세트가 검출되었다: CAR19 및 CAR123 이중 음성, CAR19 단일 양성, CAR123 단일 양성 및 이중 양성 CAR19/CAR123 T 세포. 이들 4종의 하위세트를 분류하고, K562-WT, K562 CD19+ 또는 K562 CD123+에 대해 그의 기능성 및 특이성을 시험하였다. 도 37b는 CD107a 탈과립화 검정의 결과를 보여주며, 여기서 단일 양성 하위세트는 그의 특이적 표적에 반응한 반면에, 오직 이중 양성 집단만이 CD19 및 CD123 둘 다를 발현하는 K562의 존재 하에 탈과립화할 수 있었다. 또한, 이중-자극된 CART 세포는 동등한 수의 단일-자극된 CART 세포와 비교하여 이중-양성 표적에 대해 더 강력한 세포독성을 나타내었고, 이는 2종의 상이한 항원에 의해 촉발된 CAR을 사용하는 것에 의한 효능에 있어서의 잠재적 증분을 시사한다 (도 37c)
논의
CD19 지시된 면역요법은 재발성 및 불응성 급성 림프모구성 백혈병 치료의 패러다임을 변화시키고 있다. 이전에 좋지 않은 결과를 가졌던 환자는 현재 완전 반응 및 장기간 질환 완화를 달성할 현실적인 잠재력을 갖는다. 그러나, 다른 형태의 강력한 표적화 요법으로 치료된 백혈병의 경우에 일부 상황 하에 제시된 바와 같이, 백혈병 세포는 항원-상실 돌연변이를 발생시킬 수 있고, 이는 저항성 및 재발로 이어진다. CART19의 경우에, 재발의 2종의 주요 패턴이 관찰된 바 있다. 지속성의 실패를 통한 CART19의 조기 상실을 갖는 환자는 원래의 클론이 재발할 위험이 있고; 실제로, 최소 잔류 질환 분석은 악성종양을 완전히 근절시키기 위해서는 1-6개월의 지속적인 CART 활성이 요구될 수 있다는 것을 보여주었다. 대조적으로, 재발의 약 50%는 CART19 지속성에도 불구하고 발생하였고, 이는 CD19-음성 백혈병의 발생을 특징으로 하였다. 후자의 관찰은 CART19에 의한 강력한 선택 압력과 관련된다. 명백하게, CD19-음성 재발은 또한 블리나투모맙 요법 후에 발생한 바 있고, 이들은 이러한 거의 틀림없이 덜 강력한 요법 후의 소수의 재발 발생을 나타낸다. (5) CD19-음성 질환의 발생에 대한 다중 잠재적 메카니즘이 존재한다. 이들 중 하나는 기준선에서 매우 낮은 빈도로 존재하는 CD19-음성 클론의 선택 및 상대적 생존 이점이고, 이는 처음에 CD19-음성 재발을 야기하는 가장 가능성 있는 인자로 간주되었다. 보다 최근의 다른 메카니즘, 예컨대 CD19의 스플라이싱의 조절이상이 또한 중요한 것으로 간주된 바 있다. 본원에서는, B-ALL에서 드문 CD19-ve 모세포가 보다 흔한 CD19-양성 백혈병 모세포에서 발견되는 특징 세포유전 이상을 함유할 수 있다는 것을 최초로 제시하며, 이것을 CD19-음성 재발의 잠재적 메카니즘으로서 확인시켜준다. 본 발명자들은 CD123+CD19-ve 모세포가 면역결핍 마우스 내에 생착될 수 있다는 것을 입증함으로써 이들 발견을 확인하였고, 이는 CD123이 AML에서와 같이 B-ALL에서 백혈병성 줄기 세포의 마커일 수 있다는 것을 보여준다.
본 연구의 목적은 CD19-지시된 요법 후 항원 상실에 의한 재발 환자를 치료하기 위한 신규 전략을 규정하기 위한 것이다. CD123은 대부분의 B-ALL에서 고도로 발현되고, 특히 CD123은 CD19-음성 질환을 갖는 재발 환자에서 발현된 채로 남아있다. CD19- CD123+ 집단에서 클론 백혈병성 세포의 존재는 CART19와 조합하여 CD123을 표적화하는 것이 CART19 압력 시 선택 이점으로 인해 증식할 수 있는 서브-클론을 근절시킬 가능성을 증가시킬 수 있다는 것을 입증하였다. CD123은 이전에 AML에서 백혈병성 줄기 세포의 마커로서 확인된 바 있다. 본원은 CD123이 ALL에서 면역표현형상-규정된 백혈병성 줄기 세포 (LSC)에서 발현된다는 것은 LSC 상의 CD123을 표적화하는 것이 ALL 근절을 촉진시킬 수 있는 가능성을 상승시킨다고 제시하였다.
항원-상실 재발에서 CART 123의 역할을 연구하기 위해, 펜실베니아 대학교/필라델피아 어린이 병원의 CTL019 시험 중 하나에 등록된 B-ALL 환자 (CHP101)로부터 유래된 1차 모세포로부터 CD19-음성 재발의 신규 이종이식편 모델을 개발하였다. 이 환자는 기준선에서 전형적 CD19+CD123+ 표현형을 가졌지만, 이후 CART19 처리 후에 CD19-CD123+ 질환으로 재발하였다. 이 모델을 사용하여, CART123은 재발된 질환을 근절시킬 수 있고, CART19와의 조합은 항원-상실 재발을 예방할 수 있다는 것을 입증하였다. 이는 임상적으로 관련된 환자-유래 모델에서의 이중 CART 조합의 최초 입증이다. 또한, 생체내 영상화의 사용을 통해, CART 세포가 정맥내 주사 후 24시간 미만 내에 골수로 진입하고, 그의 표적을 탐색하고, 감속하여 동족 항원-보유 세포와 상호작용한다는 것이 제시되었다. 또한, 이전에 공개된 결과와 일치하여, 이중 신호전달 CART123/19가 CART 단독 또는 CAR 둘 다의 풀보다 더 효과적인 것이 제시되었다.
이전에, 급성 골수성 백혈병의 치료에 대한 항-CD123 키메라 항원 수용체의 전-임상 효능이 제시되었다. CART123은 CD123의 조혈 줄기 및 전구 세포의 인식으로 인해 조혈 독성을 유발하고, 강력한 줄기 세포 독성으로서의 임상 해석에 대한 잠재적인 주요 도전과제는 영구적 골수절제로 이어질 수 있다. 조혈 독성을 최소화하기 위해, CD19 및 CD123의 공동-연관 시에만 T 세포를 활성화하는 신규 구축물이 이러한 조혈 독성을 동시에 제거할 수 있는 것으로 가설화하였다. 본원은 CD19 인식으로부터의 활성화 신호 및 CD123 인식으로부터의 자극 신호를 제공받은 CART 세포가 B-ALL 세포를 사멸시킬 수 있을 뿐만 아니라 본 발명자들이 이전에 기재한 강력한 조혈 독성을 피할 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 개념은 CD19/PSMA 인식의 인공 시스템을 사용하여 이전에 공개되었지만, 이러한 임상적으로 관련된 구축물은 본 분야에서 임상 해석으로의 비교적 명확한 경로와 함께 주요 진전을 나타낸다. 주목할 것은, 이러한 이중 CAR 설계가 감소된 독성과 연관될 것이지만, CAR 인식을 덜 제한하기 보다는 더 발생시킴으로써 항원 상실 재발의 이슈를 미해결인 채로 남기게 될 수 있다. 그러나, CD123을 표적화하는 것이 ALL 줄기 세포를 성공적으로 근절시킨다면, 이러한 접근법은 안전하면서 동시에 효과적일 수 이다.
요약하면, 본원은 CD123을 표적화하는 것에 의한, B-ALL을 치료하기 위한 신규하고 효과적인 전략을 입증한다. 이러한 접근법은 CD123이 B-ALL을 갖는 일부 환자에서 드문 CD19-음성 악성 세포에서 발현되고, CD19-지시된 면역요법 후에 발생한 항원-상실 재발에서 유지되기 때문에 특히 매력적이다. 또한, the CART19와 CART123의 조합은 CD19-음성 재발의 발생을 예방할 수 있다.
실시예 8: 체크포인트 억제제와 조합된 CART 기능 및 치료 지수의 증진
키메라 항원 수용체 T 세포 (CART) 요법은 지난 수년에 걸쳐 혈액 악성종양에서 강력하고 잠재적으로 치유적인 요법으로서 개발되어 왔다. CD19 지시된 CART 세포는 대부분의 환자에서 지속되는 급성 림프모구성 백혈병에서 ~90%의 인상적인 완전 반응률을 발생시켜 왔다. 그러나, 만성 림프구성 백혈병과 같은 다른 악성종양에서의 전체 반응률은 약 50%이다. 이는 부분적으로, 백혈병 세포에 의해 유도되는 CART 소진 및 기능장애와 관련될 수 있다. 이러한 예에서, 혈액 악성종양에서 CART 세포 기능장애 및 소진을 유도하는데 있어서의 억제 수용체/경로의 역할을 평가하였다.
종양 모델로서, 급성 골수성 백혈병 (AML) 세포주 (MOLM14) 및 원발성 AML 샘플을 CD33 또는 CD123 지시된 CART 세포 (41BB 및 CD3z 자극 도메인 및 렌티바이러스 벡터, 1172 구축물 (서열식별번호: 707) 포함)로 처리하였다.
원발성 AML 샘플 또는 MOLM14 세포주와 CD33 또는 CD123 지시된 CART의 인큐베이션은 인큐베이션 24시간 후에 종양 세포 상에서의 PDL1의 유의한 상향-조절 (제0일 0% vs 제1일 80%, P <0.001), 및 공동-배양 3-7일 후에 T 세포 상에서의 PD1 및 TIM3의 상향-조절 (제0일 8%의 T 세포가 PD1을 발현함 vs 제3일 43%, P=0.03 및 제0일 13%의 T 세포가 TIM3을 발현함 vs 제3일 71%, p=0.001, 도 41a, 41b, 및 41c)을 발생시켰다. 추가의 유동 세포측정 분석은 CD8+ T 세포 (도 42a, 42b, 42c, 및 42d) 및 CD4+ T 세포에서 체크포인트 억제제 PD1, TIM3, 및 추가의 체크포인트 억제제 LAG3 및 CTLA4의 상향조절을 입증하였다. 중요한 것은, 표적 세포 (원발성 AML 또는 MOLM14 세포)에의 노출 3-7일 후에 최대 발현이 관찰되었다.
생체내 실험을 위해, NSG (NOD-SCID-g-/-) 마우스에 MOLM14 세포주를 생착시켰다. 준최적 용량의 CD33 또는 CD123 CART에 의한 이들 AML 이종이식편의 처리는, 초기 항종양 반응에 이어 40-60%의 마우스에서 질환 재발을 발생시켰다 (도 44).
이들 마우스의 골수로부터 T 세포를 단리하고, 억제 수용체의 차등 발현에 대해 분석하였다. CART 세포 요법 후 완화 상태의 마우스로부터 단리된 T 세포와 비교하여 재발된 질환을 갖는 마우스로부터 단리된 T 세포 상에서 PD1 및 TIM-3 수용체의 유의하게 증가된 상향-조절이 존재하였다 (도 43 및 45).
다음으로, 생체외 CART 세포 요법 후 T 세포 기능을 개선시키기 위해 체크포인트 억제제를 첨가하는 것의 역할을 조사하였다. CART 세포 요법 후에 재발된 마우스의 골수로부터 단리된 T 세포를 종양의 존재 하에 PD-1 억제제 (바이오엑스셀(BioXcell), 카탈로그 번호는 BE0193이고, 클론#은 J110임), TIM3 억제제 (바이오레전드(Biolegend), 클론 F38-2E2, 카탈로그 번호 345010), CEACAM 억제제 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 카탈로그 번호 SAB1403604-100UG), 또는 PD1 및 TIM3 억제제의 조합, 또는 PD1 및 CEACAM1 억제제의 조합과 공동-배양하였다. 체크포인트 억제제를 10 ug/ml의 농도로 투여하였다. 체크포인트 억제제의 존재 하에 시토카인 생산 (예를 들어, IFN-감마) 및 Ki-67 증식 마커에 의해 측정된 바와 같은 CART 세포 이펙터 기능의 개선이 존재하였다. CART 세포 이펙터 기능의 개선은 PD1 및 TIM3 억제제 둘 다를 조합한 경우에 더욱 현저하였다 (도 46a 및 46b).
마지막으로, 체크포인트 억제제를 CART와 조합하는 것이 항종양 활성을 개선시킬 것인지, 예를 들어 치료 지수를 증대시키고 AML 이종이식편에서 재발을 예방할 것인지 여부를 시험하였다. 이러한 접근법에서, MOLM14 이종이식편을 체크포인트 억제제의 상이한 조합의 존재 또는 부재 하에 준최적 용량의 CD33 또는 CD123 지시된 CART 또는 대조군 비형질도입된 T 세포 (UTD)로 처리하였다. NSG 마우스에 MOLM14 AML 세포주를 생착시켰다. 생착은 생물발광 영상화에 의해 확인하였다. 이어서 AML 이종이식편을 준최적 용량 (0.25-0.5 x106개 총 T 세포 I.V)의 CD33 또는 CD123 지시된 CART 또는 대조군 비형질도입된 T 세포 (UTD)로 처리하였다. 또한 마우스에게 T 세포의 3일, 6일, 9일 및 12일 후에 PD-1 차단, TIM3 차단 또는 둘 다의 조합을 제공하였다. 이어서 마우스를 연속 영상화하여 질환 부담을 평가하였다. 실험 개요를 도 47 및 49에 요약하였다.
비형질도입된 T 세포에의 체크포인트 억제제의 첨가는 항백혈병성 효과로 이어지지 않았다 (도 48). 그러나, PD1 또는 TIM3 차단의 첨가는 도 50a, 50b, 50c 및 50d에 제시된 바와 같이 상승작용적 항종양 활성을 야기하였다. 지속적인 완전 반응률은 CART123 단독에 의한 처리의 경우에 45% (도 50a, 50b, 및 50c), CART123+PD1 억제에 의한 처리의 경우에 80% (도 50a), CART123+TIM3 억제에 의한 처리의 경우에 100% (도 50b), 및 CART123+ 둘 다의 PD1 및 TIM3 억제에 의한 처리의 경우에 80% (도 50c)였다.
따라서, 체크포인트 억제제와 조합된 CART123에 의한 처리는, CART123을 투여한 경우에 관찰된 항종양 효과를 임의의 체크포인트 억제제 단독을 투여한 경우에 관찰된 항종양 효과와 합한 것보다, 더 큰 항종양 활성을 발생시켰다. 이들 결과는 PD1 및 TIM3 경로가 AML에서의 CART 소진 및 기능장애에 관여한다는 것을 나타낸다. 체크포인트 억제제와 CART 세포의 조합은 AML 및 다른 혈액 악성종양에서 증진된 기능으로 이어질 수 있다.
실시예 9: 낮은 용량의 RAD001은 세포 배양 모델에서 CART 증식을 자극한다
CART-발현 세포를 표적 세포와 상이한 농도의 RAD001의 존재 하에 공동-배양함으로써 시험관내 CAR T 세포 증식에 대한 낮은 용량의 RAD001의 효과를 평가하였다.
물질 및 방법
CAR-형질도입된 T 세포의 생성
인간화, 항-인간 CD19 CAR (huCART19) 렌티바이러스 전달 벡터를 사용하여 VSVg 유사형화 렌티바이러스 입자 내에 패키징된 게놈 물질을 생산하였다. 인간화 항-인간 CD19 CAR (huCART19)의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 2014년 3월 15일에 출원된 PCT 공개 WO2014/153270에 기재된 CAR 1, ID 104875이고, 거기서 서열식별번호: 85 및 31로 지정되어 있다.
렌티바이러스 전달 벡터 DNA를 3종의 패키징 성분 VSVg env, gag/pol 및 rev와, 리포펙타민 시약과 조합하여 혼합하여 렌티-X 293T 세포를 형질감염시켰다. 이후 배지를 24h 및 30h 후에 바꾸고, 바이러스-함유 배지를 수집하고, 여과하고, -80℃에서 저정하였다. 건강한 공여자 혈액 또는 류코팩(leukopak)의 음성 자기 선택에 의해 수득된 신선한 또는 동결된 나이브 T 세포의 형질도입에 의해 CART를 생성하였다. 항-CD3/항-CD28 비드와 24h 동안 인큐베이션하여 T 세포를 활성화시키고, 그 후 바이러스 상청액 또는 농축된 바이러스 (각각 MOI=2 또는 10)를 배양물에 첨가하였다. 변형된 T 세포가 약 10일 동안 확장되게 하였다. 형질도입된 세포 (세포 표면 상에서 CAR을 발현함)의 백분율 및 CAR 발현의 수준 (상대 형광 강도, 기하 평균)을 제7일 내지 제9일에 유동 세포측정 분석에 의해 결정하였다. 성장 속도의 감속 및 ~350 fL에 근접한 T 세포 크기의 조합은 추후 분석을 위해 동결보존될 T 세포에 대한 상태를 결정한다.
CART의 증식의 평가
CART의 기능성을 평가하기 위해, T 세포를 해동하고, 카운팅하고, 셀로미터에 의해 생존율을 평가하였다. 각각의 배양물 중 CAR-양성 세포의 수를 비-형질도입된 T 세포 (UTD)를 사용하여 정규화하였다. CART에 대한 RAD001의 영향을 50nM에서 출발하는 RAD001을 사용한 적정에서 시험하였다. 모든 공동-배양 실험에 사용된 표적 세포주는 CD19를 발현하고 루시페라제를 발현하도록 형질도입된 인간 전-B 세포 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) 세포주인 Nalm-6이다.
CART의 증식을 측정하기 위해, T 세포를 표적 세포와 1:1의 비로 배양하였다. 세포가 CD3, CD4, CD8 및 CAR 발현에 대해 염색된 경우에 검정을 4일 동안 실행하였다. T 세포의 수는 참조로서 비드를 카운팅하는 것을 사용하여 유동 세포측정법에 의해 평가하였다.
결과
CART 세포의 증식 능력을 4일 공동-배양 검정에서 시험하였다. CAR-양성 CD3-양성 T 세포 (어두운 막대) 및 총 CD3-양성 T 세포 (연한 막대)의 수는 CAR-형질도입된 및 비-형질도입된 T 세포를 Nalm-6과 배양한 후에 평가하였다 (도 53). huCART19 세포는 0.016 nM 미만의 RAD001의 존재 하에 배양한 경우에 확장되었고, 보다 높은 화합물의 농도에서 더 낮은 정도로 확장되었다. 중요한 것은, 0.0032 및 0.016 nM RAD001 둘 다에서의 증식이 RAD001의 첨가의 부재 하에 관찰된 것보다 더 높았다. 비-형질도입된 T 세포 (UTD)는 검출가능한 확장을 제시하지 않았다.
실시예 10: 낮은 용량의 RAD001은 생체내 CART 확장을 자극한다
본 실시예는 huCAR19 세포가 상이한 농도의 RAD001에 의해 생체내 증식하는 능력을 평가한다.
물질 및 방법:
NALM6-luc 세포: NALM6 인간 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) 세포주는 재발성 ALL을 갖는 환자의 말초 혈액으로부터 발생하였다. 이어서 세포를 반딧불이 루시페라제로 태그부착하였다. 이들 현탁 세포를 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청으로 보충된 RPMI에서 성장시켰다.
마우스: 더 잭슨 래보러토리로부터 6주령 NSG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) 마우스를 제공받았다 (스톡 번호 005557).
종양 이식: NALM6-luc 세포를 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청으로 보충된 RPMI에서 시험관내 성장 및 확장시켰다. 이어서 세포를 15 ml 원추형 튜브로 옮기고, 차가운 멸균 PBS로 2회 세척하였다. 이어서 NALM6-luc 세포를 카운팅하고, PBS의 밀리리터당 10x106개 세포의 농도로 재현탁시켰다. 세포를 빙상에 두고, 즉시 (1시간 내) 마우스에 이식하였다. 마우스당 총 1x106개 세포를 위해 NALM6-luc 세포를 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 100 μl 부피로 주사하였다.
CAR T 세포 투여: 마우스에게 종양 이식 7일 후 5x106개 CAR T 세포를 투여하였다. 세포를 37℃ 수조 내에서 부분적으로 해동한 다음, 세포를 함유하는 튜브에 1 ml의 차가운 멸균 PBS를 첨가하여 완전히 해동하였다. 해동된 세포를 15 ml 팔콘 튜브로 옮기고, PBS를 사용하여 10 ml의 최종 부피로 조정하였다. 세포를 1000rpm에서 각각 10분 동안 2회 세척한 다음, 혈구계 상에서 카운팅하였다. 이어서, T 세포를 차가운 PBS ml당 50x106개 CAR T 세포의 농도로 재현탁시키고, 마우스에게 투여할 때까지 빙상에 유지시켰다. 마우스당 5x106개 CAR T 세포의 용량을 위해 마우스에게 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 100 μl의 CAR T 세포를 주사하였다. 군당 8마리의 마우스를 100 μl의 PBS 단독 (PBS) 또는 인간화 CD19 CAR T 세포로 처리하였다.
RAD001 투여: 1mg RAD001과 동등한 50mg의 농축된 마이크로-에멀전을 제제화한 다음, 투여 시점에 D5W (물 중 덱스트로스 5%) 중에 재현탁시켰다. 마우스에게 200 μl의 목적하는 용량의 RAD001을 경구로 매일 (경구 위관영양을 통해) 투여하였다.
PK 분석: 마우스에게 RAD001을 종양 이식 7일 후에 시작하여 매일 투여하였다. 투여 군은 하기와 같다: 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 및 10 mg/kg. RAD001의 최초 및 최종 용량 후 제0일 및 제14일에 마우스에서 채혈하고, 하기 시점에 PK 분석하였다: 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 및 24시간.
결과:
확장 및 RAD001의 약동학을 NALM6-luc 종양을 갖는 NSG 마우스에서 시험하였다. RAD001 단독을 매일 경구 투여하는 것은 NALM6-luc 종양의 성장에 대해 영향을 갖지 않았다 (도 54). RAD001의 약동학적 분석은 그것이 종양 보유 마우스의 혈액 중에서 상당히 안정하다는 것을 제시하였다 (도 55a 및 55b). 제0일 및 제14일 둘 다의 PK 분석은 혈액 중 RAD001 농도가 시험된 최저 용량 (0.3 mg/kg)에서 투여 24시간 후에도 10nm을 초과한다는 것을 제시하였다.
이들 용량에 기초하여, huCAR19 CAR T 세포를 RAD001의 존재 및 부재 하에 투여하여 이들 세포의 증식 능력을 결정하였다. 투여 24시간 후 혈액 중 RAD001의 수준에 기초하여 사용된 최고 용량은 3 mg/kg이었다. RAD001의 농도가 RAD001의 최종 용량 24시간 후에 10nM을 초과하였기 때문에, CAR T 세포를 사용한 생체내 연구에 여러 더 낮은 용량의 RAD001을 사용하였다. CAR T 세포를 매일 경구 RAD001 투여를 시작하기 1일 전에 IV 투여하였다. FACS를 통해 T 세포 확장에 대해 마우스를 모니터링하였다.
RAD001의 최저 용량은 CAR T 세포의 증진된 증식을 제시하였다 (도 56). 이러한 증진된 증식은 CD8+ CAR T 세포보다 CD4+ CAR T 세포를 사용한 경우에 보다 명백했고, 연장되었다. 그러나, CD8+ CAR T 세포에 의하면, CAR T 세포 투여 후 초기 시점에 증진된 증식을 관찰할 수 있었다. 실시양태에서, RNA CART 세포는 또한 체크포인트 억제제와 조합되어 사용될 수 있다.
실시예 11: CART123 종결 전략의 시험관내 특징화
종결 전략은 CART123 요법의 독성을 최소화하기 위한 특정한 관심대상이다. CART123 활성을 감소시키기 위한 하나의 전략은 CAR123과 CD20을 공동-발현시키고, 파괴시키기 위한 CART123 세포를 표적화하는 항-CD20 항체 리툭시맙을 사용하는 것에 의한 CD123 CAR-발현 T 세포의 절제를 수반한다. 이러한 예에서, CD20을 공동-발현하는 CART123 세포를 생성하고, 다양한 시험관내 검정, 예컨대 탈과립화 및 시토카인 생산 능력에 의해 특징화하였다.
CD123 CAR 및 CD20을 발현하는 발현 벡터를 구축하였다. 벡터의 지도는 도 57에 제시되어 있다. NVS2 CAR123 (본원에서 CAR123-2로도 지칭됨)은 CD123에 대해 지시된 인간화 단일 쇄 가변 단편, CD8 힌지, CD8 막횡단 도메인, 41BB 및 CD3 자극 도메인으로 구성된다. NVS2 CAR123은 EF1알파 프로모터 하에 있고, P2A 단백질을 갖는 완전 CD20 분자와 작동가능하게 연결된다. CAR123 만을 발현하는 세포를 본원에서 CART123 세포라 칭하고, CAR123 및 CD20을 공동-발현하는 세포는 본원에서 CART123P2ACD20 세포라 칭한다.
CD107 탈과립화 검정을 위해, CART123 및 CART123P2A CD20 세포를 단독으로, CD123 양성 세포주 MOLM14, CD123 음성 대조군 세포주 Jurkat, 및 양성 대조군으로서 PMA/이오노마이신과 함께 CD28, CD49d 공동자극 분자 및 모넨신의 존재 하에 배양하였다. CD107a를 인큐베이션 4시간 후에 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. CART123 P2A CD20 세포는 CD123 양성 표적에 반응하여, CART123 세포와 유사하게, 강건하고 특이적인 CD107a 탈과립화를 거쳤고 (도 58), 이에 의해 CD20 분자의 도입이 CART123 세포의 탈과립화에 유해한 영향을 미치지 않는다는 것이 입증되었다.
CART123P2A CD20 세포의 시토카인 생산을 또한 평가하였다. CART123 및 CART123P2A CD20 세포를 단독으로, CD123 양성 세포주 MOLM14, CD123 음성 대조군 세포주 Jurkat, 및 양성 대조군으로서 PMA/이오노마이신과 함께, CD28, CD49d 공동자극 분자 및 모넨신의 존재 하에 배양하였다. 4시간 후에 세포를 수거하고, 고정 및 투과화하고, 시토카인 GM-CSF, TNFα, IFNγ, 또는 IL-2에 대해 염색하고, 유동 세포측정 분석을 수행하였다. 이들 검정으로부터의 결과는 대부분의 CART123 P2A CD20 세포가 CD123 양성 표적에 반응하여, CART123 세포와 유사하게, GM-CSF (도 59a), TNFα(도 59b), IFNγ(도 59c), 및 IL-2 (도 59d)를 생산한다는 것을 입증하였다.
세포독성 검정에서, CART123 및 CART123P2A CD20 세포를 MOLM14-luc와 24시간 동안 제시된 바와 같은 상이한 E:T 비로 인큐베이션한 다음, 잔여 살아있는 세포의 척도로서 생물발광 영상화를 수행하였다. 결과는 CART123 P2A CD20 세포가 CART123 세포와 대등한 CD123 양성 표적 MOLM14의 특이적 사멸을 발생시킨다는 것을 제시하였다 (도 60).
다음으로 리툭시맙-매개 세포독성을 CART123 P2A CD20 세포에 대해 평가하였다. CART123 및 CART123 P2A CD20을 리툭시맙과 다양한 농도, 0 μg/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml 및 100 μg/ml로 인큐베이션하였다. 0, 4, 12, 및 48시간 째에 세포를 수거하고, CD3에 대해 염색하였다. T 세포 고갈의 백분율을 산출하였다. 리툭시맙은 100 ug/ml의 농도에서 및 CART123P2A CD20 세포에서의 인큐베이션 48시간 후에 직접 세포독성을 발생시켰지만 (도 61b) CART123 세포에서는 그렇지 않았다 (도 61a).
CART123P2ACD20 세포 고갈이 매개되는 메카니즘을 조사하였다. CART123 P2A CD20 세포를 리툭시맙과 상이한 농도, 0 μg/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml 및 100 μg/ml로, 15% 토끼 보체의 존재 하에 인큐베이션하였다. 도 62에 제시된 바와 같이, 리툭시맙 1ug/ml 또는 10ug/ml는 인큐베이션 12시간 후에 대부분의 CART123 P2A CD20 세포의 고갈을 발생시켰다. 리툭시맙 100 ug/ml은 인큐베이션 4시간 후에 대부분의 CART123 P2A CD20 세포의 고갈을 발생시켰다. CART123 P2A CD20 세포 고갈은 보체 의존성 세포독성에 의해 매개되었다.
실시예 12: CD123 CART의 효율적 종결 전략
급성 골수성 백혈병 (AML)을 갖는 많은 어린이 및 성인은 현행 치료 양식에 의해 재발하거나 치유불가능하며, 이는 대체 요법에 대한 필요를 강조한다. CD123을 표적화하는 키메라 항원 수용체 T 세포 (CART123)는 인간 AML의 뮤린 이종이식편 모델에서 강력한 항백혈병 활성을 입증한 바 있다. 그러나, 정상 인간 조혈 세포가 생착된 마우스의 CART123 처리는 과도한 골수절제를 야기하였고, 이러한 요법으로 치료될 수 있는 AML을 갖는 환자에서 중증 혈액학적 독성의 우려를 상승시켰다. 여기서, AML의 CART123-유도된 근절 후 T 세포 결실이 백혈병 제어를 손상시키지 않으면서 이러한 방관자 독성을 최소화하여 항-AML CAR T 세포 면역요법의 치료 범위를 증가시킬 수 있는지 여부를 평가하였다.
방법
인간 AML 이종이식편 모델에서 3가지 종결 전략을 검사하였다: (1) 항-CD123-41BB-CD3제타 CART123으로 렌티바이러스-형질도입된 1x105-1x106개의 T 세포로 처리한 후 항-CD52 항체 알렘투주맙에 의한 T 세포 절제, (2) CD20을 공동-발현하도록 조작된 1x105-1x106개의 CART123 (CART123/CD20)으로 처리한 후 항-CD20 항체 리툭시맙에 의한 T 세포 절제, 및 (3) "생분해성" 항-CD123 mRNA-전기천공된 CAR T 세포 (RNA-CART123)에 의한 처리. 루시페라제-발현 인간 AML 세포주 (MOLM14, MOLM13, U937) 또는 원발성 AML 시편이 생착된 마우스 (n=3)를 CD123-재지시된 CAR T 세포로 상기와 같이 처리하였다. 본 실험에 이용된 CD123 CAR 구축물은 1172 구축물 (서열식별번호: 707)이며, 이를 마우스에게 제1주에 투여하였다. T 세포 고갈 연구를 위해, 알렘투주맙 1 또는 5 mg/kg을 제2주, 제3주, 또는 제4주 (예를 들어, CART123 후 1, 2, 또는 3주)에 복강내로 (IP) 주사하여 최적 용량 및 T 세포 절제의 시점을 결정하였다. 후속 연구에서, 리툭시맙 10 mg/kg을 CART123/CD20 4주 후에 IP로 주사하거나, 또는 1x107개의 RNA-CART123을 AML 생착 5, 9, 및 16일 후에 정맥내로 주사하였다. 이어서 마우스를 매주 생물발광 영상화하고/거나 혈액, 비장, 및/또는 골수의 정량적 유동 세포측정 분석하였다.
결과
CD123+ AML 이종이식편의 CART123 처리는 생체내에서 현저한 T 세포 확장 및 백혈병 근절을 유도하여, 장기간 생존을 발생시켰다 (p<0.0001 vs 비형질도입된 T 세포-처리된 대조군). 최소한의 이종 이식편-대-숙주 효과가 관찰되었다.
알렘투주맙 투여에 의한 이종이식편 모델에서의 CART123의 연속 절제로부터의 결과를 도 72a에 제시한다. 또한 CART123 세포의 정량화를 상응하는 시점에 수행하였고 (도 72b), 단일 용량의 알렘투주맙이 CART123 세포를 신속하게 제거한다는 것을 제시하였다. 하나의 용량의 알렘투주맙은 모든 시험된 모델에서 T 세포를 신속하게 제거하였고, 최고의 효능은 제4주 (예를 들어, CART123 후 3주)에서의 5 mg/kg 용량이었다. 전체 생존의 분석을 도 72c에 제시하며, 이는 제3주 또는 제4주에 알렘투주맙을 제공받은 마우스가 제2주에 알렘투주맙을 제공받은 마우스와 비교하여 개선된 생존을 제시한다는 것을 입증하였다.
CART123/CD20은 CART123의 그것과 유사한 동역학으로 AML을 근절시켰고, CART123/CD20 주입 후 4주에 1 용량의 리툭시맙은 백혈병 완화를 보존하는 한편 T 세포를 신속하게 제거하였다. 알렘투주맙 또는 리툭시맙 투여 시점에 CART123- 또는 CART123/CD20-유도된 AML 완화를 갖는 마우스는 ≥12주 동안 백혈병-부재를 유지하였고 (도 72a), 동물 생존은 T 세포 고갈을 거치지 않은 CD123- 재지시된 CAR T 세포-처리된 마우스의 그것과 상이하지 않았다 (p=1.00). 반대로, 보다 초기의 알렘투주맙 투여 시점에 잔여 AML을 갖는 CART123-처리된 마우스는 유효한 선행 T 세포 제거와 일치하는 신속한 AML 진행을 경험하였다 (도 72a).
또한, 이전에 알렘투주맙- 또는 리툭시맙-절제된 T 세포를 갖는 동물의 AML 재챌린지 ("재발")는 T 세포 재-출현없이 신속한 AML 증식을 발생시켰고, 이는 T 세포 고갈의 완전성을 확인시켜준다. 비-절제된 마우스는 CD123+ 재챌린지의 거부와 함께 CAR T 세포 재-확장을 입증하였다 (p<0.0001) (도 72a).
또한 알렘투주맙 처리를 소아 환자-유래 이종이식편 모델인 제2 생체내 모델에서 검사하였다. 이 모델에서, 마우스에게 AML290 세포를 주사하였다. AML 생착 6주 후, 마우스에게 염수, 비형질도입된 T 세포, 또는 CART123 세포를 투여하였다 (제0주로 나타내어짐). 알렘투주맙 5 mg/kg을 CART123 세포가 제공된 마우스의 하위세트에 제4주에 투여하였다. 알렘투주맙 처리는 말초 혈액에서 CART123 T 세포를 완전히 제거한다는 것을 제시하였다 (도 73b). 종양 진행의 분석은 CART123을 제공받은 마우스가 CART123 처리 후 8주 이하에 완화를 입증한다는 것을 제시하였다. 제4주에 알렘투주맙 처리 및 CART123 세포의 절제를 제공받은 마우스는 완화를 유지하였다 (도 73a). CART123 투여 후 이종이식편의 다른 기관에 존재하는 AML의 분석을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. CART123 세포에 의한 처리는 비장 (도 74a) 및 골수 (도 74b) 둘 다에서 AML 세포의 절제를 발생시켰다. CART123 투여 4주 후 알렘투주맙에 의한 처리는 비장 (도 74a) 및 골수 (도 74b)에서 AML 세포의 지속적인 절제에 의해 입증되는 바와 같이 완화를 보존하였다.
RNA-CART123은 예상대로 CART123 또는 CART123/CD20보다 생체내에서 더 짧은 지속성을 가졌지만, RNA-CART123은 AML을 가장 신속하게 제거하였고, 장기간 동물 생존을 촉진하였다. 알렘투주맙 또는 리툭시맙 단독은 비-CART123-처리된 이종이식편 모델 vs AML-단독 대조군에서 AML 증식을 억제하지 않았다 (p=1.00).
본 실시예에 기재된 3가지 종결 접근법의 비교를 도 75에 제시한다.
결론:
알렘투주맙 및 리툭시맙은 인간 AML 이종이식편 모델에서 CD123-재지시된 CAR T 세포를 완전히 제거하였다. 지속적인 백혈병 완화는, 각각 CART123 후 또는 CART123/CD20 후 알렘투주맙 5 mg/kg 또는 리툭시맙 10 mg/kg을 통한 T 세포 종결 전, 4주 동안의 CART123 또는 CART123/CD20 지속을 필요로 하였다. 진행 중인 연구는 추가의 원발성 AML 이종이식편 모델에서의, 및 다른 항-AML CAR T 세포 면역요법에 대한 T 세포 제거의 효능을 조사하고 있다. 이들 T 세포 종결 전략은 AML을 갖는 환자에서, 특히 잠재적인 조혈 줄기 세포 이식 전 CAR T 세포 요법의 효능을 증대시킬 수 있다.
실시예 13: CAR19 및 CAR123 조합
대부분의 B-급성 림프모구성 백혈병 (B-ALL) 모세포는 CD19 및 CD123을 공동-발현한다. 둘 다의 항원을 동시에 표적화하는 것은 증가된 항종양 활성으로 이어지고, 재발률을 감소시킬 수 있다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, CAR19 및 CAR123의 조합은 증가된 치료 효능을 갖는다. 본 실시예에서, CAR19 및 CAR123의 조합을 투여하기 위한 상이한 구축물을 조사하였다.
CAR19 및 CAR123의 조합을 투여하기 위한 하나의 전략은 이중 CART를 통하는 것으로, 여기서 T 세포는 CAR19 및 CAR123 구축물 둘 다를 발현한다. CAR19 및 CAR123 둘 다의 서열을 보유하는 단일 렌티바이러스 벡터를 (2개의 개별 벡터 대신) 구축하여 임상 용도를 위한 이중-CART 생산을 촉진하였다 (도 63a). 이러한 렌티바이러스 구축물은 EF1 프로모터 하에 P2A 도메인을 통해 연결된 CAR19 및 CAR123을 둘 다 포함한다. T 세포를 렌티바이러스 구축물로 형질도입하고, 6일 동안 배양한 다음, 유동 세포측정 분석을 위해 CD19 scFv-특이적 항체 및 CD123-His 펩티드 및 항-His-PE 항체로 염색하였다. 결과는 CAR19 및 CAR123 둘 다를 발현하는 T 세포가 검출되었음을 제시하였다 (도 63b).
또 다른 전략에서, 스플릿 CAR 전략을 이용하여 CAR19 및 CAR123을 발현시켰다. 이 전략에서, 공동자극 도메인 4-1BB를 포함하는 CAR123을 P2A 도메인을 통해 1차 신호전달 도메인 CD3제타를 포함하는 CAR19에 연결시킨 벡터를 구축하였다 (도 64a). 구체적으로, CAR123은 CD123 scFv, CD8 힌지 및 CD8 막횡단 도메인, 및 4-1BB 도메인을 포함하였다. CAR19는 CD19 scFv, CD8 힌지 및 CD8 막횡단 도메인, 및 CD3 제타 도메인을 포함하였다. 이 전략에서, CAR의 각각의 scFv 부분에 의한 CD19 및 CD123 둘 다의 단독 인식은 스플릿 CART 세포의 활성화를 발생시킬 것이다. T 세포를 렌티바이러스 구축물로 형질도입하고, 6일 동안 배양한 다음, 유동 세포측정 분석을 위해 CD19 scFv-특이적 항체 및 CD123-His 펩티드 및 항-His-PE 항체로 염색하였다. 결과는 CAR19 및 CAR123 둘 다를 발현하는 T 세포가 검출되었음을 제시하였다 (도 64b).
실시예 14: 조직구성 장애에서의 CD123 CART 요법
CD123 CART 요법은 조직구성 장애, 예컨대 BPDCN 또는 비만 세포 장애에서 유용할 수 있다. 본 실시예에서, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물 (BPDCN) 및 비만 세포 장애 (예컨대 전신 비만세포증 및 비만 세포 백혈병)와 관련하여 CART123 기능을 평가하기 위해 실험을 수행하였다.
BPDCN은 조직구/수지상 세포 신생물로서 분류된, pDC의 전구체로부터 발생한 드물고 공격적인 혈액 신생물이다. 모든 BPDCN은 CD123을 발현한다. BPDCN 모세포는 성공적인 생체외 증식을 위해 IL-3을 필요로 하기 때문에 CD123은 BPDCN 생존을 위해 중요한 것으로 보인다. 화학요법에 대한 초기의 높은 반응률에 불구하고, 장기간 생존은 통상적으로 매우 불량하고, 중앙 생존기간은 초기 표현과 관계없이 9-13개월이다.
CD123 발현을 조혈 줄기 세포 (HSC), 급성 골수성 백혈병 세포주 (AML), 또는 2종의 상이한 BPDCN 상에서 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 중앙 형광 강도를 제시한다. AML, 정상 골수 CD34+ 세포, 및 2종의 경우의 BPDCN 상에서의 CD123의 발현을 도 65에 제시한다. 이들 데이터는 CD123이 정상 골수와 비교하여 BPDCN 상에서 10-20-배 더 높은 수준으로 발현된다는 것을 보여준다.
대안적 항-CD123 클론 (32716 (본원에서 1172 구축물로도 지칭됨) 및 26292 (본원에서 1176 구축물로도 지칭됨), 둘 다의 구축물은 PCT/US2014/017328에 기재 및 특징화되어 있음)을 사용하여 추가의 CART123 구축물을 생성하였다. 실시예 2 또는 3에 기재된 것과 유사하게 세포 사멸 검정을 수행하였다. 클론 26292는 양성 대조군 AML 또는 BPDCN과 비교하여 정상 CD34 세포의 감소된 사멸을 발생시켰고, 이는 증진된 치료 범위를 생성할 수 있는 감쇠된 활성을 갖는 CART-123을 생산하는 것이 실현가능하다는 것을 보여준다 (도 66b). 대조적으로, 클론 32716은 CD34 세포 및 BPDCN의 유사한 사멸을 제시하였다 (도 66a).
T 세포 기능, 예컨대 탈과립화 및 시토카인 생산의 감수성 분석을 실시예 2 또는 3에 기재된 것과 유사하게 수행하였다. 클론 26292 CART123을 CD34+ HSC (도 67, 상부 열) 또는 BPDCN (도 67, 하부 열)과 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. CD107 탈과립화를 평가하였다. 탈과립화 검정으로부터의 결과는 클론 26292의 이펙터 기능이 CD34+ HSC에 의해 여전히 촉발될 수 있다는 것을 제시하였다 (도 67, 상부 열).
전신 비만세포증 및 비만 세포 백혈병을 비롯한 비만 세포 장애는 불량한 예후와 연관된 드문 조직구성 악성종양이다. 비만 세포는 CD123을 높은 수준으로 발현하고, 따라서 비만 세포 장애는 CART123에 의해 치료될 수 있다.
비만 세포 장애에 대해 CD123 발현의 분석을 수행하였다. 비만 세포 백혈병 / 전신 비만세포증을 갖는 환자의 혈액으로부터의 단핵 세포를 라이브/데드 아쿠아 (LDAQ, 도 68a 및 68b에서 x 축) 및 이소형 (도 68a) 또는 CD123 PE (도 68b)로 염색하였다. 대부분의 SM 세포는 CD123을 발현하였다.
CD107 탈과립화 검정을 수행하여 비만 세포 백혈병 세포의 존재 하에서의 CART123 활성을 평가하였다. CART123 세포를 단독으로, PMA 및 이오노마이신 (도 69a) 또는 비만 세포 백혈병 / 전신 비만세포증을 갖는 환자의 혈액으로부터의 단핵 세포 (도 69b)와 함께 항-CD107a 항체의 존재 하에 2시간 동안 배양하였다. 항-CD3을 사용하여 T 세포를 게이팅하였다. CD107a 양성을 CART123 단독 튜브를 사용하여 게이팅하였다. SM 세포에 대한 CART123의 반응은 양성 대조군 PMA+이오노마이신에 의해 생성된 것과 동등하였다.
실시예 15: 종양 미세환경에 대한 CART123의 효과
본 실시예에서, 종양 미세환경에 대한 CD123 CAR-발현 세포의 효과를 실험하기 위해 검정을 수행하였다. 이들 검정을 사용하여 호지킨 림프종에서 종양 미세환경에 대한 CART123의 효과를 평가할 수 있다.
제1 검정은 악성 세포, 예를 들어 호지킨 림프종 세포 (HL 세포)가 종양 미세환경 내 세포, 예를 들어 단핵구에서 면역억제 표현형을 발생시키는지 여부를 결정하기 위해 수행하였다. 단핵구 세포 및 HL 세포를 상부 및 하부 챔버를 포함하는 트랜스웰 플레이트에서 성장시켰다. 단핵구 및 악성 세포를 하기 구성으로 배양하였다: (1) 단핵구 세포를 하나의 챔버, 예를 들어 하부 챔버에서 성장시키고, HL 세포를 다른 챔버, 예를 들어 상부 챔버에서 성장시키거나, (2) 단핵구 세포 및 HL 세포를 함께 트랜스웰 플레이트의 동일한 면에서 성장시키거나, 또는 (3) 단핵구 세포를 단독으로 성장시켰다 (대조군). 세포를 목적하는 시간 동안 배양한 다음, 유동 세포측정 분석 또는 실시간 정량적 PCR을 위해 세포를 수거하여, 마커, 예컨대 CD14 및 HLADR의 수준을 평가함으로써 단핵구 표현형, 예를 들어 면역억제 표현형을 검출하였다.
제2 검정은 면역억제 종양 미세환경 세포, 예를 들어 단핵구가 CART 세포에 의해 매개되는 항종양 T 세포 면역을 억제할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 수행하였다. 본 검정은, 항종양 T 세포 면역의 억제가 가용성 인자를 통해 이루어지는 것으로 추측되는 경우에는 트랜스웰 플레이트를 사용하여, 또는 항종양 T 세포 면역의 억제가 접촉-매개인 것으로 추측되는 경우에는 표준 세포 배양 용기를 사용하여, 2가지 상이한 방식으로 수행할 수 있다. 항종양 T 세포 면역의 억제가 가용성 인자를 통해 이루어질 수 있는 검정의 경우에, 세포를 상부 및 하부 챔버를 포함하는 트랜스웰 플레이트에서 성장시켰다. 세포를 하기 구성으로 배양하였다: (1) 하나의 챔버, 예를 들어 상부 챔버에서 HL 세포, 및 다른 챔버, 예를 들어 하부 챔버에서 CART19 세포 및 CD19-발현 종양 세포, 예를 들어 B 세포 종양; (2) 하나의 챔버, 예를 들어 상부 챔버에서 단핵구, 및 다른 챔버에서 CART19 세포 및 CD19-발현 종양 세포, 예를 들어 B 세포 종양; 및 (3) 하나의 챔버, 예를 들어 상부 챔버에서 HL 세포 및 단핵구, 및 다른 챔버에서 CART19 세포 및 CD19-발현 종양 세포, 예를 들어 B 세포 종양. 항종양 T 세포 면역의 억제가 접촉-매개될 수 있는 검정의 경우에, 세포를 하기 구성으로 배양하였다: (1) HL 세포, CART19 세포, 및 CD19-발현 종양 세포; (2) 단핵구, CART19 세포, 및 CD19-발현 종양 세포; 및 (3) HL 세포, 단핵구, CART19 세포, 및 CD19-발현 종양 세포. 세포를 목적하는 시간 동안 배양한 다음, CART19 기능을 평가하였다. CART19 기능을 평가하기 위한 검정은, 예를 들어 실시예 2 및 3에 기재된 바와 같은 증식 및 사멸 검정을 포함한다.
제3 검정은 CART123이 종양 미세환경에서 면역억제 세포를 표적화하는지 결정하기 위해 수행하였다. 본 검정은, 항종양 T 세포 면역의 억제가 가용성 인자를 통해 이루어지는 것으로 추측되는 경우에는 트랜스웰 플레이트를 사용하여, 또는 항종양 T 세포 면역의 억제가 접촉-매개인 것으로 추측되는 경우에는 표준 세포 배양 용기를 사용하여, 2가지 상이한 방식으로 수행할 수 있다. 항종양 T 세포 면역의 억제가 가용성 인자를 통해 이루어질 수 있는 검정의 경우에, 세포를 상부 및 하부 챔버를 포함하는 트랜스웰 플레이트에서 성장시켰다. 세포를 상기 기재된 제2 검정의 경우에서의 3가지 트랜스웰 플레이트 구성으로 배양하고, 추가로 CART123 세포를 포함하는 하기 구성으로 배양하였다: (4) 하나의 챔버, 예를 들어 상부 챔버에서 HL 세포 및 CART123 세포, 및 다른 챔버, 예를 들어 하부 챔버에서 CART19 세포 및 CD19+CD123- 종양 세포, 예를 들어 B 세포 종양; (5) 하나의 챔버, 예를 들어 상부 챔버에서 단핵구 및 CART123 세포, 및 다른 챔버에서 CART19 세포 및 CD19+CD123- 종양 세포, 예를 들어 B 세포 종양; 및 (6) 하나의 챔버, 예를 들어 상부 챔버에서 HL 세포, 단핵구, 및 CART123 세포, 및 다른 챔버에서 CART19 세포 및 CD19+CD123- 종양 세포, 예를 들어 B 세포 종양. 항종양 T 세포 면역의 억제가 접촉-매개될 수 있는 검정의 경우에, 세포를 상기 기재된 제2 검정의 경우에서의 3가지 표준 세포 배양 용기에서 배양하고, 추가로 CART123 세포를 포함하는 하기 구성으로 배양하였다: (4) HL 세포, CART19 세포, CART123 세포, 및 CD19+CD123- 종양 세포; (5) 단핵구, CART19 세포, CART123 세포, 및 CD19+CD123- 종양 세포; 및 (6) HL 세포, 단핵구, CART19 세포, CART123 세포, 및 CD19+CD123- 종양 세포. 세포를 목적하는 시간 동안 배양한 다음, CART19 기능을 평가하였다. CART19 기능을 평가하기 위한 검정은, 예를 들어 실시예 2 및 3에 기재된 바와 같은 증식 및 사멸 검정을 포함한다.
실시예 16: 불응성 또는 재발성 AML에서의 RNA CART123의 임상 연구
본 연구는 급성 골수성 백혈병 (AML) 대상체에서의 탠덤 TCRζ 및 4-1BB (TCRζ /4-1BB) 공동자극 도메인을 발현하는 항-CD123 키메라 항원 수용체를 발현하는 정맥내로 투여된, RNA 전기천공된 자가 T 세포 ("RNA CART123"으로 지칭됨)의 실현가능성, 안전성 및 효능을 다룬다. 본 연구는 15명의 대상체를 평가하였다. 평가가능한 대상체는 적어도 하나의 용량의 RNA CART123 세포를 제공받은 자이다. 능동적 프로토콜 개입의 지속기간은 스크리닝 방문으로부터 대략 2개월이었다. 대상체를 그의 제1 주입 후 6개월 동안 추적하였다.
본 연구의 1차 목적은 CRS (시토카인 방출 증후군) 및 MAS (대식세포 활성화 증후군)의 빈도를 추정하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 유해 사건의 빈도 및 중증도를 기록함으로써 AML 대상체에서의 RNA CART123의 안전성을 평가하기 위한 것이다. 본 연구의 2차 목적은 하기를 포함한다: (1) RNA CART123 세포의 지속성 및 트래픽킹 결정; (2) 말초 혈액 및 골수 내 모세포 카운트의 감소를 측정하는 것에 의한 AML 대상체에서의 RNA CART123 세포의 적어도 1회의 용량의 효능의 추정; (3) (i) 표준 형태학적 완전 반응 기준 (카운트 회복의 존재 하의 악성 모세포 <5%), (ii) 카운트 회복의 부재 하의 악성 모세포 <5%, 및 (iii) 최소 잔류 질환 평가를 사용하여 28 +/- 5일에 전체 반응률 (ORR)을 측정하는 것에 의한 AML 대상체에서의 RNA CART123 세포의 적어도 1회의 용량의 효능의 추정; (4) RNA CART123 세포 주입 후 6개월까지 모든 대상체에 대한 전체 생존 (OS) 및 무진행 생존 (PFS) 및 사망 원인(들) 결정; (5) RNA CART123 세포 주입 후 6개월까지 반응 대상체에 대한 반응 지속기간 (DOR) 결정; 및 (6) 동종 HCT (또는 제2 동종 HCT)로 진행한 대상체의 백분율의 결정.
적격 대상체는 현행 이용가능한 요법을 사용하여 어떠한 이용가능한 치유적 치료 옵션이 없는, AML 또는 골수이형성 증후군을 갖는 18세 초과의 남성 또는 여성이다. 제2 또는 후속 재발, 구제 불응성인 임의의 재발, 또는 적어도 2차의 요법 후에 지속성 질환을 갖는 대상체. 대상체는 스크리닝 전 2주 내에 골수 흡인물 또는 생검에서 >5% 모세포의 평가가능한 질환, 또는 골수외 질환 (CNS 관여는 금지됨)을 가져야 한다.
2주에 걸친 총 최대 6회 용량 동안 대상체를 RNA 항-CD123 CAR T 세포의 IV 투여로 처리하였다. 투여는 대상체 체중에 따라 대상체내 용량 증량에 의하였다. 대상체를 2개의 코호트로 나누었다. 코호트 1은 RNA CART123 세포를 제공받는 제1의 3명의 대상체를 포함하였고, 주입 전 림프구고갈 화학요법 없이 3회의 증가하는 용량의 RNA CART123 세포를 제공받았다 (도 70). 코호트 2는 연구의 나머지 12명의 대상체를 포함하였고, 최대 6회의 IV 용량의 RNA CART123 세포를 증가하는 용량으로 제공받았다 (도 71). 코호트 2는 제1 CART123 세포 주입 4일 (+/- 1일) 전에 림프구고갈 화학요법이 주어질 수 있다 (ALC> 500/uL인 경우). 림프구고갈 화학요법은 제4 용량의 RNA CART123 세포 전에 반복될 수 있다 (ALC> 500/uL인 경우). 림프구고갈 화학요법은 단일 용량의 시클로포스파미드 (1mg/m2)를 포함한다. RNA CART123 처리 요법 내의 림프구고갈 화학요법 용량은 항상성 공간을 증진시킴으로써 후속 T 세포 용량의 생착을 증진시키도록 설계된다.
체중을 기준으로 한 CART 세포의 용량을 하기 표에 제공한다:
Figure pct00115
투여를 위해 사용되는 체중은 분리반출술 절차 전에 수득한 체중일 수 있다. 세포 수는 유동 세포측정법에 의해 결정된 CAR 발현을 갖는 CAR+ 세포를 기초로 하였다. 투여는 대상체 체중의 변화에 대해 변하지 않을 것이다. 제시된 용량은 제조 가변성을 고려하여 +/- 20%이다.
샘플 RNA CART123 투여 스케줄이 하기 제공된다:
Figure pct00116
기준선 및 후속 종양 평가는 AML에 대한 표준 관리 임상 실시에 따라 수행될 것이다. 기준선 AML 골수 평가는 대상체의 최종 골수가 최초 시클로포스파미드 용량 전 2주를 초과하여 수행된 경우에 수행될 수 있다. 대상체는 제16+/-2일 (또는 최종 RNA CART123 주입을 제공받은지 7일 내), 제28+/-5일, 및 3 및 6개월 둘 다 (동종HCT로 진행되지 않은 환자의 경우)에 백혈병 반응에 대해 골수 평가를 받을 것이다. CART 세포 수준 및 시토카인은 TCSL 연구 실험실에서 적절한 시험에 의해 결정될 것이다. 질환 반응 정의는 AML에 대한 표준일 수 있다.
D28+/-5 (또는 최종 T 세포 주입 14일 후, 어느 것이든 더 초기에 발생한 것)에 골수 무형성증을 갖는 모든 대상체는 구출 전략으로서 동종 조혈 세포 이식 (동종HCT)을 받을 것이다. 따라서 모든 대상체는 이전에 확인된 줄기 세포 공여자를 가져야 한다. 골수 무형성증은 ANC < 0.5k/ul 또는 혈소판 < 50k/ul와 함께, 연령별 정상으로부터 세포충실성에서의 >75% 감소로서 정의된다
치료 제한 독성 (TLT)은 섹션 5.5에 정의된 바와 같은 비-혈액 등급 3 또는 그 초과의 유해 사건 및 임의의 등급 3 또는 그 초과의 과민 반응 및 자가면역 반응을 비롯한, T 세포 주입과 어쩌면, 아마도, 또는 분명히 관련된 임의의 예상외의 사건으로서 정의된다. 하기 사건은 TLT를 구성하지 않는다: 열 및 감염, 임의의 등급의 혈구감소증, 종양 용해 증후군, 시토카인 방출 증후군 또는 7일 이내에 등급 2 이하로 해소된 임의의 대사 또는 실험실 이상.
유해 사건 보고는 RNA CART123 세포의 최초 용량의 출발 시 시작되고, 제4개월에 걸쳐, 또는 HCT 또는 또 다른 대체 요법을 위한 조건화가 개시될 때까지, 어느 것이든 더 초기에 발생하는 것까지 계속될 것이다. 대상체는 급성 및 누적 독성의 증거에 대해 계속적으로 재평가될 수 있다.
등가물
본원에 인용된 각각의 및 모든 특허, 특허 출원 및 공개의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본 발명은 구체적 측면과 관련하여 개시되지만, 관련 기술분야의 다른 통상의 기술자가 본 발명의 진정한 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 본 발명의 다른 측면 및 변형을 고안할 수 있을 것임이 분명하다. 첨부된 청구범위는 모든 이러한 측면 및 동등한 변형을 포함하는 것으로 해석되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> NOVARTIS AG THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA <120> TREATMENT OF CANCER USING A CD123 CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR <130> N2067-7064WO5 <140> <141> <150> PCT/CN2014/090508 <151> 2014-11-06 <150> PCT/CN2014/084696 <151> 2014-08-19 <160> 709 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 2 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 3 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 3 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys Met 225 230 <210> 4 <211> 282 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 4 Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala 1 5 10 15 Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala 20 25 30 Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys 35 40 45 Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro 50 55 60 Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln 65 70 75 80 Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly 85 90 95 Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val 100 105 110 Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly 115 120 125 Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn 130 135 140 Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro 145 150 155 160 Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys 165 170 175 Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser 180 185 190 Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu 195 200 205 Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro 210 215 220 Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser 225 230 235 240 Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr 245 250 255 Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg 260 265 270 Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His 275 280 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 5 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 6 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 20 <210> 7 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 8 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 8 Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro 1 5 10 15 Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr 20 25 30 Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro 35 40 45 <210> 9 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 11 <211> 1184 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 11 cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60 tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120 aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180 gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240 gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300 gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg 360 ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg 420 cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg 480 ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt 540 tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg 600 gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc 660 tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg 720 tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg 780 caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat 840 ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct 900 ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc 960 tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg 1020 cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga 1080 tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc 1140 agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtga 1184 <210> 12 <211> 63 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60 ccc 63 <210> 13 <211> 135 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60 tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120 gacttcgcct gtgat 135 <210> 14 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 14 gagagcaagt acggccctcc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcct gggcggaccc 60 agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgag 120 gtgacctgtg tggtggtgga cgtgtcccag gaggaccccg aggtccagtt caactggtac 180 gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagcccc gggaggagca gttcaatagc 240 acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggaa 300 tacaagtgta aggtgtccaa caagggcctg cccagcagca tcgagaaaac catcagcaag 360 gccaagggcc agcctcggga gccccaggtg tacaccctgc cccctagcca agaggagatg 420 accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 480 gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 540 gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag 600 gagggcaacg tctttagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660 aagagcctga gcctgtccct gggcaagatg 690 <210> 15 <211> 847 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 15 aggtggcccg aaagtcccaa ggcccaggca tctagtgttc ctactgcaca gccccaggca 60 gaaggcagcc tagccaaagc tactactgca cctgccacta cgcgcaatac tggccgtggc 120 ggggaggaga agaaaaagga gaaagagaaa gaagaacagg aagagaggga gaccaagacc 180 cctgaatgtc catcccatac ccagccgctg ggcgtctatc tcttgactcc cgcagtacag 240 gacttgtggc ttagagataa ggccaccttt acatgtttcg tcgtgggctc tgacctgaag 300 gatgcccatt tgacttggga ggttgccgga aaggtaccca cagggggggt tgaggaaggg 360 ttgctggagc gccattccaa tggctctcag agccagcact caagactcac ccttccgaga 420 tccctgtgga acgccgggac ctctgtcaca tgtactctaa atcatcctag cctgccccca 480 cagcgtctga tggcccttag agagccagcc gcccaggcac cagttaagct tagcctgaat 540 ctgctcgcca gtagtgatcc cccagaggcc gccagctggc tcttatgcga agtgtccggc 600 tttagcccgc ccaacatctt gctcatgtgg ctggaggacc agcgagaagt gaacaccagc 660 ggcttcgctc cagcccggcc cccaccccag ccgggttcta ccacattctg ggcctggagt 720 gtcttaaggg tcccagcacc acctagcccc cagccagcca catacacctg tgttgtgtcc 780 catgaagata gcaggaccct gctaaatgct tctaggagtc tggaggtttc ctacgtgact 840 gaccatt 847 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 16 ggtggcggag gttctggagg tggaggttcc 30 <210> 17 <211> 72 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60 accctttact gc 72 <210> 18 <211> 126 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120 gaactg 126 <210> 19 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 19 aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60 gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120 tcc 123 <210> 20 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336 <210> 21 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336 <210> 22 <211> 373 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 22 Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr 1 5 10 15 Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe 20 25 30 Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr 35 40 45 Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu 50 55 60 Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu 65 70 75 80 Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn 85 90 95 Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala 100 105 110 Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg 115 120 125 Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly 130 135 140 Gln Phe Gln Thr Leu Val Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr 145 150 155 160 Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala 165 170 175 Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe 180 185 190 Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val 195 200 205 Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys 210 215 220 Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr 225 230 235 240 Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu 245 250 255 Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro 260 265 270 Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly 275 280 285 Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro 290 295 300 Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr 305 310 315 320 Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly 325 330 335 Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln 340 345 350 Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln 355 360 365 Ala Leu Pro Pro Arg 370 <210> 23 <211> 1182 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 23 atggccctcc ctgtcactgc cctgcttctc cccctcgcac tcctgctcca cgccgctaga 60 ccacccggat ggtttctgga ctctccggat cgcccgtgga atcccccaac cttctcaccg 120 gcactcttgg ttgtgactga gggcgataat gcgaccttca cgtgctcgtt ctccaacacc 180 tccgaatcat tcgtgctgaa ctggtaccgc atgagcccgt caaaccagac cgacaagctc 240 gccgcgtttc cggaagatcg gtcgcaaccg ggacaggatt gtcggttccg cgtgactcaa 300 ctgccgaatg gcagagactt ccacatgagc gtggtccgcg ctaggcgaaa cgactccggg 360 acctacctgt gcggagccat ctcgctggcg cctaaggccc aaatcaaaga gagcttgagg 420 gccgaactga gagtgaccga gcgcagagct gaggtgccaa ctgcacatcc atccccatcg 480 cctcggcctg cggggcagtt tcagaccctg gtcacgacca ctccggcgcc gcgcccaccg 540 actccggccc caactatcgc gagccagccc ctgtcgctga ggccggaagc atgccgccct 600 gccgccggag gtgctgtgca tacccgggga ttggacttcg catgcgacat ctacatttgg 660 gctcctctcg ccggaacttg tggcgtgctc cttctgtccc tggtcatcac cctgtactgc 720 aagcggggtc ggaaaaagct tctgtacatt ttcaagcagc ccttcatgag gcccgtgcaa 780 accacccagg aggaggacgg ttgctcctgc cggttccccg aagaggaaga aggaggttgc 840 gagctgcgcg tgaagttctc ccggagcgcc gacgcccccg cctataagca gggccagaac 900 cagctgtaca acgaactgaa cctgggacgg cgggaagagt acgatgtgct ggacaagcgg 960 cgcggccggg accccgaaat gggcgggaag cctagaagaa agaaccctca ggaaggcctg 1020 tataacgagc tgcagaagga caagatggcc gaggcctact ccgaaattgg gatgaaggga 1080 gagcggcgga ggggaaaggg gcacgacggc ctgtaccaag gactgtccac cgccaccaag 1140 gacacatacg atgccctgca catgcaggcc cttccccctc gc 1182 <210> 24 <211> 394 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 24 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro 20 25 30 Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly 35 40 45 Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe 50 55 60 Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu 65 70 75 80 Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe 85 90 95 Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val 100 105 110 Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser 115 120 125 Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg 130 135 140 Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser 145 150 155 160 Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Thr Thr Thr Pro Ala 165 170 175 Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser 180 185 190 Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr 195 200 205 Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala 210 215 220 Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 225 230 235 240 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 245 250 255 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 260 265 270 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg 275 280 285 Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 290 295 300 Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 305 310 315 320 Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 325 330 335 Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 340 345 350 Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 355 360 365 Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 370 375 380 Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 385 390 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 25 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 26 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30) <223> /note="This sequence may encompass 1-6 "Gly Gly Gly Gly Ser" repeating units" <400> 26 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 27 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 27 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 28 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 29 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 29 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 30 <211> 5000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5000) <223> /note="This sequence may encompass 50-5000 nucleotides" <400> 30 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2100 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2280 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2340 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2400 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2460 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2520 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2580 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2700 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2760 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2820 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3000 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3060 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5000 <210> 31 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 31 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 100 <210> 32 <211> 5000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5000) <223> /note="This sequence may encompass 50-5000 nucleotides" <400> 32 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 180 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 240 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 300 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 360 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 420 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 480 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 540 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 600 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 660 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 720 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 780 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 840 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 900 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 960 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1020 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1080 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1140 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1200 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1260 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1320 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1380 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1440 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1500 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1560 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1620 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1680 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1740 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1800 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1860 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1920 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1980 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2040 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2100 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2160 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2220 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2280 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2340 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2400 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2460 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2520 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2580 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2640 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2700 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2760 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2820 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2880 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2940 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3000 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3060 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3120 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3180 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3240 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3300 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3360 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3420 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3480 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3540 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3600 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3660 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3720 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3780 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3840 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3900 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3960 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4020 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4080 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4140 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4200 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4260 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4320 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4380 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4440 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4500 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4560 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4620 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4680 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4740 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4800 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4860 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4920 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4980 tttttttttt tttttttttt 5000 <210> 33 <211> 5000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5000) <223> /note="This sequence may encompass 100-5000 nucleotides" <400> 33 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2100 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2280 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2340 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2400 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2460 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2520 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2580 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2700 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2760 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2820 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3000 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3060 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5000 <210> 34 <211> 400 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(400) <223> /note="This sequence may encompass 100-400 nucleotides" <400> 34 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 400 <210> 35 <211> 2000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2000) <223> /note="This sequence may encompass 50-2000 nucleotides" <400> 35 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2000 <210> 36 <211> 230 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys Met 225 230 <210> 37 <211> 690 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 gagagcaagt acggccctcc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcct gggcggaccc 60 agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgag 120 gtgacctgtg tggtggtgga cgtgtcccag gaggaccccg aggtccagtt caactggtac 180 gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagcccc gggaggagca gttcaatagc 240 acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggaa 300 tacaagtgta aggtgtccaa caagggcctg cccagcagca tcgagaaaac catcagcaag 360 gccaagggcc agcctcggga gccccaggtg tacaccctgc cccctagcca agaggagatg 420 accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 480 gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 540 gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag 600 gagggcaacg tctttagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660 aagagcctga gcctgtccct gggcaagatg 690 <210> 38 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(4) <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 38 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 39 <211> 1461 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 ccccaagtcc aactcgtcca gtcaggagcg gaagtcaaga agcccggagc gtcagtcaaa 120 gtgtcatgca aagcctcggg ctacactttc actgggtact acatgcactg ggtgcgccag 180 gctccaggac agggactgga atggatggga tggatcaacc cgaactccgg tggcaccaat 240 tacgcccaga agttccaggg gagggtgacc atgactcgcg acacgtcgat cagcaccgca 300 tacatggagc tgtcaagact ccggtccgac gatactgccg tgtactactg cgcacgggac 360 atgaacattc tggccaccgt gccttttgac atctggggtc agggaactat ggttaccgtg 420 tcctctggtg gaggcggctc cggcgggggg ggaagcggag gcggtggaag cgacattcag 480 atgacccagt cgccttcatc cctttcggcg agcgtgggag atcgcgtcac tatcacttgt 540 cgggcctcgc agtccatctc cacctacctc aattggtacc agcagaagcc aggaaaagca 600 ccgaatctgc tgatctacgc cgcgttttcc ttgcaatcgg gagtgccaag cagattcagc 660 ggatcgggat caggcactga tttcaccctc accatcaact cgctgcaacc ggaggatttc 720 gctacgtact attgccaaca aggagacagc gtgccgctca ccttcggcgg agggactaag 780 ctggaaatca agaccactac cccagcaccg aggccaccca ccccggctcc taccatcgcc 840 tcccagcctc tgtccctgcg tccggaggca tgtagacccg cagctggtgg ggccgtgcat 900 acccggggtc ttgacttcgc ctgcgatatc tacatttggg cccctctggc tggtacttgc 960 ggggtcctgc tgctttcact cgtgatcact ctttactgta agcgcggtcg gaagaagctg 1020 ctgtacatct ttaagcaacc cttcatgagg cctgtgcaga ctactcaaga ggaggacggc 1080 tgttcatgcc ggttcccaga ggaggaggaa ggcggctgcg aactgcgcgt gaaattcagc 1140 cgcagcgcag atgctccagc ctacaagcag gggcagaacc agctctacaa cgaactcaat 1200 cttggtcgga gagaggagta cgacgtgctg gacaagcgga gaggacggga cccagaaatg 1260 ggcgggaagc cgcgcagaaa gaatccccaa gagggcctgt acaacgagct ccaaaaggat 1320 aagatggcag aagcctatag cgagattggt atgaaagggg aacgcagaag aggcaaaggc 1380 cacgacggac tgtaccaggg actcagcacc gccaccaagg acacctatga cgctcttcac 1440 atgcaggccc tgccgcctcg g 1461 <210> 40 <211> 1461 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 ccccaagtgc aactcgtcca aagcggagcg gaagtcaaga aacccggagc gagcgtgaaa 120 gtgtcctgca aagcctccgg ctacaccttt acgggctact acatgcactg ggtgcgccag 180 gcaccaggac agggtcttga atggatggga tggatcaacc ctaattcggg cggaactaac 240 tacgcacaga agttccaggg gagagtgact ctgactcggg atacctccat ctcaactgtc 300 tacatggaac tctcccgctt gcggtcagat gatacggcag tgtactactg cgcccgcgac 360 atgaatatcc tggctaccgt gccgttcgac atctggggac aggggactat ggttactgtc 420 tcatcgggcg gtggaggttc aggaggaggc ggctcgggag gcggaggttc ggacattcag 480 atgacccagt ccccatcctc tctgtcggcc agcgtcggag atagggtgac cattacctgt 540 cgggcctcgc aaagcatctc ctcgtacctc aactggtatc agcaaaagcc gggaaaggcg 600 cctaagctgc tgatctacgc cgcttcgagc ttgcaaagcg gggtgccatc cagattctcg 660 ggatcaggct caggaaccga cttcaccctg accgtgaaca gcctccagcc ggaggacttt 720 gccacttact actgccagca gggagactcc gtgccgctta ctttcggggg gggtacccgc 780 ctggagatca agaccactac cccagcaccg aggccaccca ccccggctcc taccatcgcc 840 tcccagcctc tgtccctgcg tccggaggca tgtagacccg cagctggtgg ggccgtgcat 900 acccggggtc ttgacttcgc ctgcgatatc tacatttggg cccctctggc tggtacttgc 960 ggggtcctgc tgctttcact cgtgatcact ctttactgta agcgcggtcg gaagaagctg 1020 ctgtacatct ttaagcaacc cttcatgagg cctgtgcaga ctactcaaga ggaggacggc 1080 tgttcatgcc ggttcccaga ggaggaggaa ggcggctgcg aactgcgcgt gaaattcagc 1140 cgcagcgcag atgctccagc ctacaagcag gggcagaacc agctctacaa cgaactcaat 1200 cttggtcgga gagaggagta cgacgtgctg gacaagcgga gaggacggga cccagaaatg 1260 ggcgggaagc cgcgcagaaa gaatccccaa gagggcctgt acaacgagct ccaaaaggat 1320 aagatggcag aagcctatag cgagattggt atgaaagggg aacgcagaag aggcaaaggc 1380 cacgacggac tgtaccaggg actcagcacc gccaccaagg acacctatga cgctcttcac 1440 atgcaggccc tgccgcctcg g 1461 <210> 41 <211> 1461 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 ccccaagtcc aactcgttca atccggcgca gaagtcaaga agccaggagc atcagtgaaa 120 gtgtcctgca aagcctcagg ctacatcttc acgggatact acatccactg ggtgcgccag 180 gctccgggcc agggccttga gtggatgggc tggatcaacc ctaactctgg gggaaccaac 240 tacgctcaga agttccaggg gagggtcact atgactcgcg atacctccat ctccactgcg 300 tacatggaac tctcgggact gagatccgac gatcctgccg tgtactactg cgcccgggac 360 atgaacatct tggcgaccgt gccgtttgac atttggggac agggcaccct cgtcactgtg 420 tcgagcggtg gaggaggctc ggggggtggc ggatcaggag ggggaggaag cgacatccag 480 ctgactcaga gcccatcgtc gttgtccgcg tcggtggggg atagagtgac cattacttgc 540 cgcgccagcc agagcatctc atcatatctg aattggtacc agcagaagcc cggaaaggcc 600 ccaaaactgc tgatctacgc tgcaagcagc ctccaatcgg gagtgccgtc acggttctcc 660 gggtccggtt cgggaactga ctttaccctg accgtgaatt cgctgcaacc ggaggatttc 720 gccacgtact actgtcagca aggagactcc gtgccgctga ccttcggtgg aggcaccaag 780 gtcgaaatca agaccactac cccagcaccg aggccaccca ccccggctcc taccatcgcc 840 tcccagcctc tgtccctgcg tccggaggca tgtagacccg cagctggtgg ggccgtgcat 900 acccggggtc ttgacttcgc ctgcgatatc tacatttggg cccctctggc tggtacttgc 960 ggggtcctgc tgctttcact cgtgatcact ctttactgta agcgcggtcg gaagaagctg 1020 ctgtacatct ttaagcaacc cttcatgagg cctgtgcaga ctactcaaga ggaggacggc 1080 tgttcatgcc ggttcccaga ggaggaggaa ggcggctgcg aactgcgcgt gaaattcagc 1140 cgcagcgcag atgctccagc ctacaagcag gggcagaacc agctctacaa cgaactcaat 1200 cttggtcgga gagaggagta cgacgtgctg gacaagcgga gaggacggga cccagaaatg 1260 ggcgggaagc cgcgcagaaa gaatccccaa gagggcctgt acaacgagct ccaaaaggat 1320 aagatggcag aagcctatag cgagattggt atgaaagggg aacgcagaag aggcaaaggc 1380 cacgacggac tgtaccaggg actcagcacc gccaccaagg acacctatga cgctcttcac 1440 atgcaggccc tgccgcctcg g 1461 <210> 42 <211> 1467 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 ccccaagtcc aactccaaca gtcaggcgca gaagtgaaaa agagcggtgc atcggtgaaa 120 gtgtcatgca aagcctcggg ctacaccttc actgactact atatgcactg gctgcggcag 180 gcaccgggac agggacttga gtggatggga tggatcaacc cgaattcagg ggacactaac 240 tacgcgcaga agttccaggg gagagtgacc ctgacgaggg acacctcaat ttcgaccgtc 300 tacatggaat tgtcgcgcct gagatcggac gatactgctg tgtactactg tgcccgcgac 360 atgaacatcc tcgcgactgt gccttttgat atctggggac aggggactat ggtcaccgtt 420 tcctccgctt ccggtggcgg aggctcggga ggccgggcct ccggtggagg aggcagcgac 480 atccagatga ctcagagccc ttcctcgctg agcgcctcag tgggagatcg cgtgaccatc 540 acttgccggg ccagccagtc catttcgtcc tacctcaatt ggtaccagca gaagccggga 600 aaggcgccca agctcttgat ctacgctgcg agctccctgc aaagcggggt gccgagccga 660 ttctcgggtt ccggctcggg aaccgacttc actctgacca tctcatccct gcaaccagag 720 gactttgcca cctactactg ccaacaagga gattctgtcc cactgacgtt cggcggagga 780 accaaggtcg aaatcaagac cactacccca gcaccgaggc cacccacccc ggctcctacc 840 atcgcctccc agcctctgtc cctgcgtccg gaggcatgta gacccgcagc tggtggggcc 900 gtgcataccc ggggtcttga cttcgcctgc gatatctaca tttgggcccc tctggctggt 960 acttgcgggg tcctgctgct ttcactcgtg atcactcttt actgtaagcg cggtcggaag 1020 aagctgctgt acatctttaa gcaacccttc atgaggcctg tgcagactac tcaagaggag 1080 gacggctgtt catgccggtt cccagaggag gaggaaggcg gctgcgaact gcgcgtgaaa 1140 ttcagccgca gcgcagatgc tccagcctac aagcaggggc agaaccagct ctacaacgaa 1200 ctcaatcttg gtcggagaga ggagtacgac gtgctggaca agcggagagg acgggaccca 1260 gaaatgggcg ggaagccgcg cagaaagaat ccccaagagg gcctgtacaa cgagctccaa 1320 aaggataaga tggcagaagc ctatagcgag attggtatga aaggggaacg cagaagaggc 1380 aaaggccacg acggactgta ccagggactc agcaccgcca ccaaggacac ctatgacgct 1440 cttcacatgc aggccctgcc gcctcgg 1467 <210> 43 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 43 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 44 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 44 aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60 gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120 tcc 123 <210> 45 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 45 Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr 1 5 10 15 Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg Leu Thr Asp 20 25 30 Val Thr Leu 35 <210> 46 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 46 acaaaaaaga agtattcatc cagtgtgcac gaccctaacg gtgaatacat gttcatgaga 60 gcagtgaaca cagccaaaaa atccagactc acagatgtga cccta 105 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 47 Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 48 <211> 134 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 48 accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60 tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120 gacttcgcct gtga 134 <210> 49 <400> 49 000 <210> 50 <400> 50 000 <210> 51 <400> 51 000 <210> 52 <400> 52 000 <210> 53 <400> 53 000 <210> 54 <400> 54 000 <210> 55 <400> 55 000 <210> 56 <400> 56 000 <210> 57 <400> 57 000 <210> 58 <400> 58 000 <210> 59 <400> 59 000 <210> 60 <400> 60 000 <210> 61 <400> 61 000 <210> 62 <400> 62 000 <210> 63 <400> 63 000 <210> 64 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30) <223> /note="This sequence may encompass 1-6 "Gly Gly Gly Gly Ser" repeating units" <400> 64 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 65 <400> 65 000 <210> 66 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 66 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 ccccaagtgc agctggtcca gtcgggagcc gaagtcaaga agcccggcgc tagcgtgaaa 120 gtgtcctgca aagcctccgg gtacacattc acctcctact ggatgaattg ggtcagacag 180 gcgcccggcc agggactcga gtggatggga aggattgatc cttacgactc cgaaacccat 240 tacaaccaga agttcaagga ccgcgtgacc atgactgtgg ataagtccac ttccaccgct 300 tacatggagc tgtccagcct gcgctccgag gataccgcag tgtactactg cgcccgggga 360 aactgggacg actattgggg acagggaact accgtgaccg tgtcaagcgg gggtggcggt 420 agcggaggag ggggctccgg cggcggcggc tcagggggcg gaggaagcga cgtgcagctc 480 acccagtcgc cctcatttct gtcggcctca gtgggagaca gagtgaccat tacttgtcgg 540 gcctccaaga gcatctccaa ggacctggcc tggtatcagc agaagccagg aaaggcgcct 600 aagttgctca tctactcggg gtcgaccctg caatctggcg tgccgtcccg gttctccggt 660 tcgggaagcg gtaccgaatt cacccttact atctcctccc tgcaaccgga ggacttcgcc 720 acctactact gccaacagca caacaagtac ccgtacactt tcgggggtgg cacgaaggtc 780 gaaatcaaga ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 67 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 67 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 ccccaagtgc agctggtcca gtcgggagcc gaagtcaaga agcccggcgc tagcgtgaaa 120 gtgtcctgca aagcctccgg gtacacattc acctcctact ggatgaattg ggtcagacag 180 gcgcccggcc agggactcga gtggatggga aggattgatc cttacgactc cgaaacccat 240 tacaaccaga agttcaagga ccgcgtgacc atgactgtgg ataagtccac ttccaccgct 300 tacatggagc tgtccagcct gcgctccgag gataccgcag tgtactactg cgcccgggga 360 aactgggacg actattgggg acagggaact accgtgaccg tgtcaagcgg gggtggcggt 420 agcggaggag ggggctccgg cggcggcggc tcagggggcg gaggaagcga agtggtgctg 480 acccagtcgc ccgcaaccct ctctctgtcg ccgggagaac gcgccactct ttcctgtcgg 540 gcgtccaaga gcatctcaaa ggacctcgcc tggtaccagc agaagcctgg tcaagccccg 600 cggctgctga tctactccgg ctccacgctg caatcaggaa tcccagccag attttccggt 660 tcggggtcgg ggactgactt caccttgacc attagctcgc tggaacctga ggacttcgcc 720 gtgtattact gccagcagca caacaagtac ccgtacacct tcggaggcgg tactaaggtc 780 gagatcaaga ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 68 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 68 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 ccccaagtgc agctggtcca gtcgggagcc gaagtcaaga agcccggcgc tagcgtgaaa 120 gtgtcctgca aagcctccgg gtacacattc acctcctact ggatgaattg ggtcagacag 180 gcgcccggcc agggactcga gtggatggga aggattgatc cttacgactc cgaaacccat 240 tacaaccaga agttcaagga ccgcgtgacc atgactgtgg ataagtccac ttccaccgct 300 tacatggagc tgtccagcct gcgctccgag gataccgcag tgtactactg cgcccgggga 360 aactgggacg actattgggg acagggaact accgtgaccg tgtcaagcgg gggtggcggt 420 agcggaggag ggggctccgg cggcggcggc tcagggggcg gaggaagcga cgtcgtgatg 480 acccagtcac cggcattcct gtccgtgact cccggagaaa aggtcacgat tacttgccgg 540 gcgtccaaga gcatctccaa ggacctcgcc tggtaccaac agaagccgga ccaggcccct 600 aagctgttga tctactcggg gtccaccctt caatcgggag tgccatcgcg gtttagcggt 660 tcgggttctg ggaccgactt cactttcacc atctcctcac tggaagccga ggatgccgcc 720 acttactact gtcagcagca caacaagtat ccgtacacct tcggaggcgg taccaaagtg 780 gagatcaaga ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 69 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 69 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 ccccaagtgc agctggtcca gtcgggagcc gaagtcaaga agcccggcgc tagcgtgaaa 120 gtgtcctgca aagcctccgg gtacacattc acctcctact ggatgaattg ggtcagacag 180 gcgcccggcc agggactcga gtggatggga aggattgatc cttacgactc cgaaacccat 240 tacaaccaga agttcaagga ccgcgtgacc atgactgtgg ataagtccac ttccaccgct 300 tacatggagc tgtccagcct gcgctccgag gataccgcag tgtactactg cgcccgggga 360 aactgggacg actattgggg acagggaact accgtgaccg tgtcaagcgg gggtggcggt 420 agcggaggag ggggctccgg cggcggcggc tcagggggcg gaggaagcga cgtggtcatg 480 actcagtccc cggactcact cgcggtgtcg cttggagaga gagcgaccat caactgtcgg 540 gcctcaaaga gcatcagcaa ggacctggcc tggtaccagc agaagccggg acagccgcca 600 aagctgctga tctactccgg gtccaccttg caatctggtg tccctgaccg gttctccggt 660 tccgggtcgg gtaccgactt cacgctcact atttcgtcgc tgcaagccga agatgtggcc 720 gtgtactatt gccaacagca caacaagtac ccctacactt ttggcggagg caccaaggtg 780 gaaatcaaga ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 70 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 70 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgacgtgc agctcaccca gtcgccctca tttctgtcgg cctcagtggg agacagagtg 120 accattactt gtcgggcctc caagagcatc tccaaggacc tggcctggta tcagcagaag 180 ccaggaaagg cgcctaagtt gctcatctac tcggggtcga ccctgcaatc tggcgtgccg 240 tcccggttct ccggttcggg aagcggtacc gaattcaccc ttactatctc ctccctgcaa 300 ccggaggact tcgccaccta ctactgccaa cagcacaaca agtacccgta cactttcggg 360 ggtggcacga aggtcgaaat caaggggggt ggcggtagcg gaggaggggg ctccggcggc 420 ggcggctcag ggggcggagg aagccaagtg cagctggtcc agtcgggagc cgaagtcaag 480 aagcccggcg ctagcgtgaa agtgtcctgc aaagcctccg ggtacacatt cacctcctac 540 tggatgaatt gggtcagaca ggcgcccggc cagggactcg agtggatggg aaggattgat 600 ccttacgact ccgaaaccca ttacaaccag aagttcaagg accgcgtgac catgactgtg 660 gataagtcca cttccaccgc ttacatggag ctgtccagcc tgcgctccga ggataccgca 720 gtgtactact gcgcccgggg aaactgggac gactattggg gacagggaac taccgtgacc 780 gtgtcaagca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 71 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 71 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgaagtgg tgctgaccca gtcgcccgca accctctctc tgtcgccggg agaacgcgcc 120 actctttcct gtcgggcgtc caagagcatc tcaaaggacc tcgcctggta ccagcagaag 180 cctggtcaag ccccgcggct gctgatctac tccggctcca cgctgcaatc aggaatccca 240 gccagatttt ccggttcggg gtcggggact gacttcacct tgaccattag ctcgctggaa 300 cctgaggact tcgccgtgta ttactgccag cagcacaaca agtacccgta caccttcgga 360 ggcggtacta aggtcgagat caaggggggt ggcggtagcg gaggaggggg ctccggcggc 420 ggcggctcag ggggcggagg aagccaagtg cagctggtcc agtcgggagc cgaagtcaag 480 aagcccggcg ctagcgtgaa agtgtcctgc aaagcctccg ggtacacatt cacctcctac 540 tggatgaatt gggtcagaca ggcgcccggc cagggactcg agtggatggg aaggattgat 600 ccttacgact ccgaaaccca ttacaaccag aagttcaagg accgcgtgac catgactgtg 660 gataagtcca cttccaccgc ttacatggag ctgtccagcc tgcgctccga ggataccgca 720 gtgtactact gcgcccgggg aaactgggac gactattggg gacagggaac taccgtgacc 780 gtgtcaagca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 72 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 72 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgacgtcg tgatgaccca gtcaccggca ttcctgtccg tgactcccgg agaaaaggtc 120 acgattactt gccgggcgtc caagagcatc tccaaggacc tcgcctggta ccaacagaag 180 ccggaccagg cccctaagct gttgatctac tcggggtcca cccttcaatc gggagtgcca 240 tcgcggttta gcggttcggg ttctgggacc gacttcactt tcaccatctc ctcactggaa 300 gccgaggatg ccgccactta ctactgtcag cagcacaaca agtatccgta caccttcgga 360 ggcggtacca aagtggagat caaggggggt ggcggtagcg gaggaggggg ctccggcggc 420 ggcggctcag ggggcggagg aagccaagtg cagctggtcc agtcgggagc cgaagtcaag 480 aagcccggcg ctagcgtgaa agtgtcctgc aaagcctccg ggtacacatt cacctcctac 540 tggatgaatt gggtcagaca ggcgcccggc cagggactcg agtggatggg aaggattgat 600 ccttacgact ccgaaaccca ttacaaccag aagttcaagg accgcgtgac catgactgtg 660 gataagtcca cttccaccgc ttacatggag ctgtccagcc tgcgctccga ggataccgca 720 gtgtactact gcgcccgggg aaactgggac gactattggg gacagggaac taccgtgacc 780 gtgtcaagca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 73 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 73 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgacgtgg tcatgactca gtccccggac tcactcgcgg tgtcgcttgg agagagagcg 120 accatcaact gtcgggcctc aaagagcatc agcaaggacc tggcctggta ccagcagaag 180 ccgggacagc cgccaaagct gctgatctac tccgggtcca ccttgcaatc tggtgtccct 240 gaccggttct ccggttccgg gtcgggtacc gacttcacgc tcactatttc gtcgctgcaa 300 gccgaagatg tggccgtgta ctattgccaa cagcacaaca agtaccccta cacttttggc 360 ggaggcacca aggtggaaat caaggggggt ggcggtagcg gaggaggggg ctccggcggc 420 ggcggctcag ggggcggagg aagccaagtg cagctggtcc agtcgggagc cgaagtcaag 480 aagcccggcg ctagcgtgaa agtgtcctgc aaagcctccg ggtacacatt cacctcctac 540 tggatgaatt gggtcagaca ggcgcccggc cagggactcg agtggatggg aaggattgat 600 ccttacgact ccgaaaccca ttacaaccag aagttcaagg accgcgtgac catgactgtg 660 gataagtcca cttccaccgc ttacatggag ctgtccagcc tgcgctccga ggataccgca 720 gtgtactact gcgcccgggg aaactgggac gactattggg gacagggaac taccgtgacc 780 gtgtcaagca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 74 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 74 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 ccccaagtgc agctggtgca gtcaggcagc gaactgaaga agcccggagc ctccgtcaaa 120 gtgtcctgca aagcctcggg atacaccttc acctcctact ggatgaactg ggtccgccag 180 gcacctggac aggggctgga gtggatggga aggatcgatc cctacgattc cgaaacccat 240 tacaatcaga agttcaagga ccggtttgtg ttctccgtgg acaagtccgt gtccaccgcc 300 tacctccaaa ttagcagcct gaaggcggag gatacagctg tctactactg cgctcgcgga 360 aactgggatg actattgggg ccagggaact accgtgactg tgtcctccgg gggtggcggt 420 agcggaggag ggggctccgg cggcggcggc tcagggggcg gaggaagcga cgtgcagctc 480 acccagtcgc cctcatttct gtcggcctca gtgggagaca gagtgaccat tacttgtcgg 540 gcctccaaga gcatctccaa ggacctggcc tggtatcagc agaagccagg aaaggcgcct 600 aagttgctca tctactcggg gtcgaccctg caatctggcg tgccgtcccg gttctccggt 660 tcgggaagcg gtaccgaatt cacccttact atctcctccc tgcaaccgga ggacttcgcc 720 acctactact gccaacagca caacaagtac ccgtacactt tcgggggtgg cacgaaggtc 780 gaaatcaaga ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 75 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 75 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 ccccaagtgc agctggtgca gtcaggcagc gaactgaaga agcccggagc ctccgtcaaa 120 gtgtcctgca aagcctcggg atacaccttc acctcctact ggatgaactg ggtccgccag 180 gcacctggac aggggctgga gtggatggga aggatcgatc cctacgattc cgaaacccat 240 tacaatcaga agttcaagga ccggtttgtg ttctccgtgg acaagtccgt gtccaccgcc 300 tacctccaaa ttagcagcct gaaggcggag gatacagctg tctactactg cgctcgcgga 360 aactgggatg actattgggg ccagggaact accgtgactg tgtcctccgg gggtggcggt 420 agcggaggag ggggctccgg cggcggcggc tcagggggcg gaggaagcga agtggtgctg 480 acccagtcgc ccgcaaccct ctctctgtcg ccgggagaac gcgccactct ttcctgtcgg 540 gcgtccaaga gcatctcaaa ggacctcgcc tggtaccagc agaagcctgg tcaagccccg 600 cggctgctga tctactccgg ctccacgctg caatcaggaa tcccagccag attttccggt 660 tcggggtcgg ggactgactt caccttgacc attagctcgc tggaacctga ggacttcgcc 720 gtgtattact gccagcagca caacaagtac ccgtacacct tcggaggcgg tactaaggtc 780 gagatcaaga ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 76 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 76 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 ccccaagtgc agctggtgca gtcaggcagc gaactgaaga agcccggagc ctccgtcaaa 120 gtgtcctgca aagcctcggg atacaccttc acctcctact ggatgaactg ggtccgccag 180 gcacctggac aggggctgga gtggatggga aggatcgatc cctacgattc cgaaacccat 240 tacaatcaga agttcaagga ccggtttgtg ttctccgtgg acaagtccgt gtccaccgcc 300 tacctccaaa ttagcagcct gaaggcggag gatacagctg tctactactg cgctcgcgga 360 aactgggatg actattgggg ccagggaact accgtgactg tgtcctccgg gggtggcggt 420 agcggaggag ggggctccgg cggcggcggc tcagggggcg gaggaagcga cgtcgtgatg 480 acccagtcac cggcattcct gtccgtgact cccggagaaa aggtcacgat tacttgccgg 540 gcgtccaaga gcatctccaa ggacctcgcc tggtaccaac agaagccgga ccaggcccct 600 aagctgttga tctactcggg gtccaccctt caatcgggag tgccatcgcg gtttagcggt 660 tcgggttctg ggaccgactt cactttcacc atctcctcac tggaagccga ggatgccgcc 720 acttactact gtcagcagca caacaagtat ccgtacacct tcggaggcgg taccaaagtg 780 gagatcaaga ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 77 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 77 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 ccccaagtgc agctggtgca gtcaggcagc gaactgaaga agcccggagc ctccgtcaaa 120 gtgtcctgca aagcctcggg atacaccttc acctcctact ggatgaactg ggtccgccag 180 gcacctggac aggggctgga gtggatggga aggatcgatc cctacgattc cgaaacccat 240 tacaatcaga agttcaagga ccggtttgtg ttctccgtgg acaagtccgt gtccaccgcc 300 tacctccaaa ttagcagcct gaaggcggag gatacagctg tctactactg cgctcgcgga 360 aactgggatg actattgggg ccagggaact accgtgactg tgtcctccgg gggtggcggt 420 agcggaggag ggggctccgg cggcggcggc tcagggggcg gaggaagcga cgtggtcatg 480 actcagtccc cggactcact cgcggtgtcg cttggagaga gagcgaccat caactgtcgg 540 gcctcaaaga gcatcagcaa ggacctggcc tggtaccagc agaagccggg acagccgcca 600 aagctgctga tctactccgg gtccaccttg caatctggtg tccctgaccg gttctccggt 660 tccgggtcgg gtaccgactt cacgctcact atttcgtcgc tgcaagccga agatgtggcc 720 gtgtactatt gccaacagca caacaagtac ccctacactt ttggcggagg caccaaggtg 780 gaaatcaaga ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 78 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 78 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgacgtgc agctcaccca gtcgccctca tttctgtcgg cctcagtggg agacagagtg 120 accattactt gtcgggcctc caagagcatc tccaaggacc tggcctggta tcagcagaag 180 ccaggaaagg cgcctaagtt gctcatctac tcggggtcga ccctgcaatc tggcgtgccg 240 tcccggttct ccggttcggg aagcggtacc gaattcaccc ttactatctc ctccctgcaa 300 ccggaggact tcgccaccta ctactgccaa cagcacaaca agtacccgta cactttcggg 360 ggtggcacga aggtcgaaat caaggggggt ggcggtagcg gaggaggggg ctccggcggc 420 ggcggctcag ggggcggagg aagccaagtg cagctggtgc agtcaggcag cgaactgaag 480 aagcccggag cctccgtcaa agtgtcctgc aaagcctcgg gatacacctt cacctcctac 540 tggatgaact gggtccgcca ggcacctgga caggggctgg agtggatggg aaggatcgat 600 ccctacgatt ccgaaaccca ttacaatcag aagttcaagg accggtttgt gttctccgtg 660 gacaagtccg tgtccaccgc ctacctccaa attagcagcc tgaaggcgga ggatacagct 720 gtctactact gcgctcgcgg aaactgggat gactattggg gccagggaac taccgtgact 780 gtgtcctcca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 79 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 79 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgaagtgg tgctgaccca gtcgcccgca accctctctc tgtcgccggg agaacgcgcc 120 actctttcct gtcgggcgtc caagagcatc tcaaaggacc tcgcctggta ccagcagaag 180 cctggtcaag ccccgcggct gctgatctac tccggctcca cgctgcaatc aggaatccca 240 gccagatttt ccggttcggg gtcggggact gacttcacct tgaccattag ctcgctggaa 300 cctgaggact tcgccgtgta ttactgccag cagcacaaca agtacccgta caccttcgga 360 ggcggtacta aggtcgagat caaggggggt ggcggtagcg gaggaggggg ctccggcggc 420 ggcggctcag ggggcggagg aagccaagtg cagctggtgc agtcaggcag cgaactgaag 480 aagcccggag cctccgtcaa agtgtcctgc aaagcctcgg gatacacctt cacctcctac 540 tggatgaact gggtccgcca ggcacctgga caggggctgg agtggatggg aaggatcgat 600 ccctacgatt ccgaaaccca ttacaatcag aagttcaagg accggtttgt gttctccgtg 660 gacaagtccg tgtccaccgc ctacctccaa attagcagcc tgaaggcgga ggatacagct 720 gtctactact gcgctcgcgg aaactgggat gactattggg gccagggaac taccgtgact 780 gtgtcctcca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 80 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 80 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgacgtcg tgatgaccca gtcaccggca ttcctgtccg tgactcccgg agaaaaggtc 120 acgattactt gccgggcgtc caagagcatc tccaaggacc tcgcctggta ccaacagaag 180 ccggaccagg cccctaagct gttgatctac tcggggtcca cccttcaatc gggagtgcca 240 tcgcggttta gcggttcggg ttctgggacc gacttcactt tcaccatctc ctcactggaa 300 gccgaggatg ccgccactta ctactgtcag cagcacaaca agtatccgta caccttcgga 360 ggcggtacca aagtggagat caaggggggt ggcggtagcg gaggaggggg ctccggcggc 420 ggcggctcag ggggcggagg aagccaagtg cagctggtgc agtcaggcag cgaactgaag 480 aagcccggag cctccgtcaa agtgtcctgc aaagcctcgg gatacacctt cacctcctac 540 tggatgaact gggtccgcca ggcacctgga caggggctgg agtggatggg aaggatcgat 600 ccctacgatt ccgaaaccca ttacaatcag aagttcaagg accggtttgt gttctccgtg 660 gacaagtccg tgtccaccgc ctacctccaa attagcagcc tgaaggcgga ggatacagct 720 gtctactact gcgctcgcgg aaactgggat gactattggg gccagggaac taccgtgact 780 gtgtcctcca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 81 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 81 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgacgtgg tcatgactca gtccccggac tcactcgcgg tgtcgcttgg agagagagcg 120 accatcaact gtcgggcctc aaagagcatc agcaaggacc tggcctggta ccagcagaag 180 ccgggacagc cgccaaagct gctgatctac tccgggtcca ccttgcaatc tggtgtccct 240 gaccggttct ccggttccgg gtcgggtacc gacttcacgc tcactatttc gtcgctgcaa 300 gccgaagatg tggccgtgta ctattgccaa cagcacaaca agtaccccta cacttttggc 360 ggaggcacca aggtggaaat caaggggggt ggcggtagcg gaggaggggg ctccggcggc 420 ggcggctcag ggggcggagg aagccaagtg cagctggtgc agtcaggcag cgaactgaag 480 aagcccggag cctccgtcaa agtgtcctgc aaagcctcgg gatacacctt cacctcctac 540 tggatgaact gggtccgcca ggcacctgga caggggctgg agtggatggg aaggatcgat 600 ccctacgatt ccgaaaccca ttacaatcag aagttcaagg accggtttgt gttctccgtg 660 gacaagtccg tgtccaccgc ctacctccaa attagcagcc tgaaggcgga ggatacagct 720 gtctactact gcgctcgcgg aaactgggat gactattggg gccagggaac taccgtgact 780 gtgtcctcca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 82 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 82 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgaggtgc agctggtgca gagcggagcc gaggtcaaga agcctggaga atccctgagg 120 atcagctgca aaggcagcgg gtataccttc acctcctact ggatgaattg ggtccgccag 180 atgcccggaa aaggcctgga gtggatggga cggattgacc cctacgactc ggaaacccat 240 tacaaccaga agttcaagga tcacgtgacc atctccgtgg acaagtccat ttccactgcg 300 tacctccagt ggtcaagcct gaaggcctcc gacactgcta tgtactactg cgcacgcgga 360 aactgggatg attactgggg acagggaaca accgtgactg tgtcctccgg gggtggcggt 420 agcggaggag ggggctccgg cggcggcggc tcagggggcg gaggaagcga cgtgcagctc 480 acccagtcgc cctcatttct gtcggcctca gtgggagaca gagtgaccat tacttgtcgg 540 gcctccaaga gcatctccaa ggacctggcc tggtatcagc agaagccagg aaaggcgcct 600 aagttgctca tctactcggg gtcgaccctg caatctggcg tgccgtcccg gttctccggt 660 tcgggaagcg gtaccgaatt cacccttact atctcctccc tgcaaccgga ggacttcgcc 720 acctactact gccaacagca caacaagtac ccgtacactt tcgggggtgg cacgaaggtc 780 gaaatcaaga ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 83 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 83 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgaggtgc agctggtgca gagcggagcc gaggtcaaga agcctggaga atccctgagg 120 atcagctgca aaggcagcgg gtataccttc acctcctact ggatgaattg ggtccgccag 180 atgcccggaa aaggcctgga gtggatggga cggattgacc cctacgactc ggaaacccat 240 tacaaccaga agttcaagga tcacgtgacc atctccgtgg acaagtccat ttccactgcg 300 tacctccagt ggtcaagcct gaaggcctcc gacactgcta tgtactactg cgcacgcgga 360 aactgggatg attactgggg acagggaaca accgtgactg tgtcctccgg gggtggcggt 420 agcggaggag ggggctccgg cggcggcggc tcagggggcg gaggaagcga agtggtgctg 480 acccagtcgc ccgcaaccct ctctctgtcg ccgggagaac gcgccactct ttcctgtcgg 540 gcgtccaaga gcatctcaaa ggacctcgcc tggtaccagc agaagcctgg tcaagccccg 600 cggctgctga tctactccgg ctccacgctg caatcaggaa tcccagccag attttccggt 660 tcggggtcgg ggactgactt caccttgacc attagctcgc tggaacctga ggacttcgcc 720 gtgtattact gccagcagca caacaagtac ccgtacacct tcggaggcgg tactaaggtc 780 gagatcaaga ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 84 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 84 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgaggtgc agctggtgca gagcggagcc gaggtcaaga agcctggaga atccctgagg 120 atcagctgca aaggcagcgg gtataccttc acctcctact ggatgaattg ggtccgccag 180 atgcccggaa aaggcctgga gtggatggga cggattgacc cctacgactc ggaaacccat 240 tacaaccaga agttcaagga tcacgtgacc atctccgtgg acaagtccat ttccactgcg 300 tacctccagt ggtcaagcct gaaggcctcc gacactgcta tgtactactg cgcacgcgga 360 aactgggatg attactgggg acagggaaca accgtgactg tgtcctccgg gggtggcggt 420 agcggaggag ggggctccgg cggcggcggc tcagggggcg gaggaagcga cgtcgtgatg 480 acccagtcac cggcattcct gtccgtgact cccggagaaa aggtcacgat tacttgccgg 540 gcgtccaaga gcatctccaa ggacctcgcc tggtaccaac agaagccgga ccaggcccct 600 aagctgttga tctactcggg gtccaccctt caatcgggag tgccatcgcg gtttagcggt 660 tcgggttctg ggaccgactt cactttcacc atctcctcac tggaagccga ggatgccgcc 720 acttactact gtcagcagca caacaagtat ccgtacacct tcggaggcgg taccaaagtg 780 gagatcaaga ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 85 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 85 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgaggtgc agctggtgca gagcggagcc gaggtcaaga agcctggaga atccctgagg 120 atcagctgca aaggcagcgg gtataccttc acctcctact ggatgaattg ggtccgccag 180 atgcccggaa aaggcctgga gtggatggga cggattgacc cctacgactc ggaaacccat 240 tacaaccaga agttcaagga tcacgtgacc atctccgtgg acaagtccat ttccactgcg 300 tacctccagt ggtcaagcct gaaggcctcc gacactgcta tgtactactg cgcacgcgga 360 aactgggatg attactgggg acagggaaca accgtgactg tgtcctccgg gggtggcggt 420 agcggaggag ggggctccgg cggcggcggc tcagggggcg gaggaagcga cgtggtcatg 480 actcagtccc cggactcact cgcggtgtcg cttggagaga gagcgaccat caactgtcgg 540 gcctcaaaga gcatcagcaa ggacctggcc tggtaccagc agaagccggg acagccgcca 600 aagctgctga tctactccgg gtccaccttg caatctggtg tccctgaccg gttctccggt 660 tccgggtcgg gtaccgactt cacgctcact atttcgtcgc tgcaagccga agatgtggcc 720 gtgtactatt gccaacagca caacaagtac ccctacactt ttggcggagg caccaaggtg 780 gaaatcaaga ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 86 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 86 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgacgtgc agctcaccca gtcgccctca tttctgtcgg cctcagtggg agacagagtg 120 accattactt gtcgggcctc caagagcatc tccaaggacc tggcctggta tcagcagaag 180 ccaggaaagg cgcctaagtt gctcatctac tcggggtcga ccctgcaatc tggcgtgccg 240 tcccggttct ccggttcggg aagcggtacc gaattcaccc ttactatctc ctccctgcaa 300 ccggaggact tcgccaccta ctactgccaa cagcacaaca agtacccgta cactttcggg 360 ggtggcacga aggtcgaaat caaggggggt ggcggtagcg gaggaggggg ctccggcggc 420 ggcggctcag ggggcggagg aagcgaggtg cagctggtgc agagcggagc cgaggtcaag 480 aagcctggag aatccctgag gatcagctgc aaaggcagcg ggtatacctt cacctcctac 540 tggatgaatt gggtccgcca gatgcccgga aaaggcctgg agtggatggg acggattgac 600 ccctacgact cggaaaccca ttacaaccag aagttcaagg atcacgtgac catctccgtg 660 gacaagtcca tttccactgc gtacctccag tggtcaagcc tgaaggcctc cgacactgct 720 atgtactact gcgcacgcgg aaactgggat gattactggg gacagggaac aaccgtgact 780 gtgtcctcca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 87 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 87 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgaagtgg tgctgaccca gtcgcccgca accctctctc tgtcgccggg agaacgcgcc 120 actctttcct gtcgggcgtc caagagcatc tcaaaggacc tcgcctggta ccagcagaag 180 cctggtcaag ccccgcggct gctgatctac tccggctcca cgctgcaatc aggaatccca 240 gccagatttt ccggttcggg gtcggggact gacttcacct tgaccattag ctcgctggaa 300 cctgaggact tcgccgtgta ttactgccag cagcacaaca agtacccgta caccttcgga 360 ggcggtacta aggtcgagat caaggggggt ggcggtagcg gaggaggggg ctccggcggc 420 ggcggctcag ggggcggagg aagcgaggtg cagctggtgc agagcggagc cgaggtcaag 480 aagcctggag aatccctgag gatcagctgc aaaggcagcg ggtatacctt cacctcctac 540 tggatgaatt gggtccgcca gatgcccgga aaaggcctgg agtggatggg acggattgac 600 ccctacgact cggaaaccca ttacaaccag aagttcaagg atcacgtgac catctccgtg 660 gacaagtcca tttccactgc gtacctccag tggtcaagcc tgaaggcctc cgacactgct 720 atgtactact gcgcacgcgg aaactgggat gattactggg gacagggaac aaccgtgact 780 gtgtcctcca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 88 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 88 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgacgtcg tgatgaccca gtcaccggca ttcctgtccg tgactcccgg agaaaaggtc 120 acgattactt gccgggcgtc caagagcatc tccaaggacc tcgcctggta ccaacagaag 180 ccggaccagg cccctaagct gttgatctac tcggggtcca cccttcaatc gggagtgcca 240 tcgcggttta gcggttcggg ttctgggacc gacttcactt tcaccatctc ctcactggaa 300 gccgaggatg ccgccactta ctactgtcag cagcacaaca agtatccgta caccttcgga 360 ggcggtacca aagtggagat caaggggggt ggcggtagcg gaggaggggg ctccggcggc 420 ggcggctcag ggggcggagg aagcgaggtg cagctggtgc agagcggagc cgaggtcaag 480 aagcctggag aatccctgag gatcagctgc aaaggcagcg ggtatacctt cacctcctac 540 tggatgaatt gggtccgcca gatgcccgga aaaggcctgg agtggatggg acggattgac 600 ccctacgact cggaaaccca ttacaaccag aagttcaagg atcacgtgac catctccgtg 660 gacaagtcca tttccactgc gtacctccag tggtcaagcc tgaaggcctc cgacactgct 720 atgtactact gcgcacgcgg aaactgggat gattactggg gacagggaac aaccgtgact 780 gtgtcctcca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 89 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 89 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgacgtgg tcatgactca gtccccggac tcactcgcgg tgtcgcttgg agagagagcg 120 accatcaact gtcgggcctc aaagagcatc agcaaggacc tggcctggta ccagcagaag 180 ccgggacagc cgccaaagct gctgatctac tccgggtcca ccttgcaatc tggtgtccct 240 gaccggttct ccggttccgg gtcgggtacc gacttcacgc tcactatttc gtcgctgcaa 300 gccgaagatg tggccgtgta ctattgccaa cagcacaaca agtaccccta cacttttggc 360 ggaggcacca aggtggaaat caaggggggt ggcggtagcg gaggaggggg ctccggcggc 420 ggcggctcag ggggcggagg aagcgaggtg cagctggtgc agagcggagc cgaggtcaag 480 aagcctggag aatccctgag gatcagctgc aaaggcagcg ggtatacctt cacctcctac 540 tggatgaatt gggtccgcca gatgcccgga aaaggcctgg agtggatggg acggattgac 600 ccctacgact cggaaaccca ttacaaccag aagttcaagg atcacgtgac catctccgtg 660 gacaagtcca tttccactgc gtacctccag tggtcaagcc tgaaggcctc cgacactgct 720 atgtactact gcgcacgcgg aaactgggat gattactggg gacagggaac aaccgtgact 780 gtgtcctcca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 90 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 90 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgaagtgc agctcgtcga gagcggaggg ggactggtgc agcccggagg aagcctgagg 120 ctgtcctgcg ctgcctccgg ctacaccttc acctcctact ggatgaactg ggtcagacag 180 gcacctggaa agggactggt ctgggtgtcg cgcattgacc cctacgactc cgaaacccat 240 tacaatcaga aattcaagga ccgcttcacc atctccgtgg acaaagccaa gagcaccgcg 300 tacctccaaa tgaactccct gcgcgctgag gatacagcag tgtactattg cgcccgggga 360 aactgggatg attactgggg ccagggaact actgtgactg tgtcatccgg gggtggcggt 420 agcggaggag ggggctccgg cggcggcggc tcagggggcg gaggaagcga cgtgcagctc 480 acccagtcgc cctcatttct gtcggcctca gtgggagaca gagtgaccat tacttgtcgg 540 gcctccaaga gcatctccaa ggacctggcc tggtatcagc agaagccagg aaaggcgcct 600 aagttgctca tctactcggg gtcgaccctg caatctggcg tgccgtcccg gttctccggt 660 tcgggaagcg gtaccgaatt cacccttact atctcctccc tgcaaccgga ggacttcgcc 720 acctactact gccaacagca caacaagtac ccgtacactt tcgggggtgg cacgaaggtc 780 gaaatcaaga ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 91 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 91 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgaagtgc agctcgtcga gagcggaggg ggactggtgc agcccggagg aagcctgagg 120 ctgtcctgcg ctgcctccgg ctacaccttc acctcctact ggatgaactg ggtcagacag 180 gcacctggaa agggactggt ctgggtgtcg cgcattgacc cctacgactc cgaaacccat 240 tacaatcaga aattcaagga ccgcttcacc atctccgtgg acaaagccaa gagcaccgcg 300 tacctccaaa tgaactccct gcgcgctgag gatacagcag tgtactattg cgcccgggga 360 aactgggatg attactgggg ccagggaact actgtgactg tgtcatccgg gggtggcggt 420 agcggaggag ggggctccgg cggcggcggc tcagggggcg gaggaagcga agtggtgctg 480 acccagtcgc ccgcaaccct ctctctgtcg ccgggagaac gcgccactct ttcctgtcgg 540 gcgtccaaga gcatctcaaa ggacctcgcc tggtaccagc agaagcctgg tcaagccccg 600 cggctgctga tctactccgg ctccacgctg caatcaggaa tcccagccag attttccggt 660 tcggggtcgg ggactgactt caccttgacc attagctcgc tggaacctga ggacttcgcc 720 gtgtattact gccagcagca caacaagtac ccgtacacct tcggaggcgg tactaaggtc 780 gagatcaaga ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 92 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 92 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgaagtgc agctcgtcga gagcggaggg ggactggtgc agcccggagg aagcctgagg 120 ctgtcctgcg ctgcctccgg ctacaccttc acctcctact ggatgaactg ggtcagacag 180 gcacctggaa agggactggt ctgggtgtcg cgcattgacc cctacgactc cgaaacccat 240 tacaatcaga aattcaagga ccgcttcacc atctccgtgg acaaagccaa gagcaccgcg 300 tacctccaaa tgaactccct gcgcgctgag gatacagcag tgtactattg cgcccgggga 360 aactgggatg attactgggg ccagggaact actgtgactg tgtcatccgg gggtggcggt 420 agcggaggag ggggctccgg cggcggcggc tcagggggcg gaggaagcga cgtcgtgatg 480 acccagtcac cggcattcct gtccgtgact cccggagaaa aggtcacgat tacttgccgg 540 gcgtccaaga gcatctccaa ggacctcgcc tggtaccaac agaagccgga ccaggcccct 600 aagctgttga tctactcggg gtccaccctt caatcgggag tgccatcgcg gtttagcggt 660 tcgggttctg ggaccgactt cactttcacc atctcctcac tggaagccga ggatgccgcc 720 acttactact gtcagcagca caacaagtat ccgtacacct tcggaggcgg taccaaagtg 780 gagatcaaga ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 93 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 93 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgaagtgc agctcgtcga gagcggaggg ggactggtgc agcccggagg aagcctgagg 120 ctgtcctgcg ctgcctccgg ctacaccttc acctcctact ggatgaactg ggtcagacag 180 gcacctggaa agggactggt ctgggtgtcg cgcattgacc cctacgactc cgaaacccat 240 tacaatcaga aattcaagga ccgcttcacc atctccgtgg acaaagccaa gagcaccgcg 300 tacctccaaa tgaactccct gcgcgctgag gatacagcag tgtactattg cgcccgggga 360 aactgggatg attactgggg ccagggaact actgtgactg tgtcatccgg gggtggcggt 420 agcggaggag ggggctccgg cggcggcggc tcagggggcg gaggaagcga cgtggtcatg 480 actcagtccc cggactcact cgcggtgtcg cttggagaga gagcgaccat caactgtcgg 540 gcctcaaaga gcatcagcaa ggacctggcc tggtaccagc agaagccggg acagccgcca 600 aagctgctga tctactccgg gtccaccttg caatctggtg tccctgaccg gttctccggt 660 tccgggtcgg gtaccgactt cacgctcact atttcgtcgc tgcaagccga agatgtggcc 720 gtgtactatt gccaacagca caacaagtac ccctacactt ttggcggagg caccaaggtg 780 gaaatcaaga ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 94 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 94 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgacgtgc agctcaccca gtcgccctca tttctgtcgg cctcagtggg agacagagtg 120 accattactt gtcgggcctc caagagcatc tccaaggacc tggcctggta tcagcagaag 180 ccaggaaagg cgcctaagtt gctcatctac tcggggtcga ccctgcaatc tggcgtgccg 240 tcccggttct ccggttcggg aagcggtacc gaattcaccc ttactatctc ctccctgcaa 300 ccggaggact tcgccaccta ctactgccaa cagcacaaca agtacccgta cactttcggg 360 ggtggcacga aggtcgaaat caaggggggt ggcggtagcg gaggaggggg ctccggcggc 420 ggcggctcag ggggcggagg aagcgaagtg cagctcgtcg agagcggagg gggactggtg 480 cagcccggag gaagcctgag gctgtcctgc gctgcctccg gctacacctt cacctcctac 540 tggatgaact gggtcagaca ggcacctgga aagggactgg tctgggtgtc gcgcattgac 600 ccctacgact ccgaaaccca ttacaatcag aaattcaagg accgcttcac catctccgtg 660 gacaaagcca agagcaccgc gtacctccaa atgaactccc tgcgcgctga ggatacagca 720 gtgtactatt gcgcccgggg aaactgggat gattactggg gccagggaac tactgtgact 780 gtgtcatcca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 95 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 95 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgaagtgg tgctgaccca gtcgcccgca accctctctc tgtcgccggg agaacgcgcc 120 actctttcct gtcgggcgtc caagagcatc tcaaaggacc tcgcctggta ccagcagaag 180 cctggtcaag ccccgcggct gctgatctac tccggctcca cgctgcaatc aggaatccca 240 gccagatttt ccggttcggg gtcggggact gacttcacct tgaccattag ctcgctggaa 300 cctgaggact tcgccgtgta ttactgccag cagcacaaca agtacccgta caccttcgga 360 ggcggtacta aggtcgagat caaggggggt ggcggtagcg gaggaggggg ctccggcggc 420 ggcggctcag ggggcggagg aagcgaagtg cagctcgtcg agagcggagg gggactggtg 480 cagcccggag gaagcctgag gctgtcctgc gctgcctccg gctacacctt cacctcctac 540 tggatgaact gggtcagaca ggcacctgga aagggactgg tctgggtgtc gcgcattgac 600 ccctacgact ccgaaaccca ttacaatcag aaattcaagg accgcttcac catctccgtg 660 gacaaagcca agagcaccgc gtacctccaa atgaactccc tgcgcgctga ggatacagca 720 gtgtactatt gcgcccgggg aaactgggat gattactggg gccagggaac tactgtgact 780 gtgtcatcca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 96 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 96 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgacgtcg tgatgaccca gtcaccggca ttcctgtccg tgactcccgg agaaaaggtc 120 acgattactt gccgggcgtc caagagcatc tccaaggacc tcgcctggta ccaacagaag 180 ccggaccagg cccctaagct gttgatctac tcggggtcca cccttcaatc gggagtgcca 240 tcgcggttta gcggttcggg ttctgggacc gacttcactt tcaccatctc ctcactggaa 300 gccgaggatg ccgccactta ctactgtcag cagcacaaca agtatccgta caccttcgga 360 ggcggtacca aagtggagat caaggggggt ggcggtagcg gaggaggggg ctccggcggc 420 ggcggctcag ggggcggagg aagcgaagtg cagctcgtcg agagcggagg gggactggtg 480 cagcccggag gaagcctgag gctgtcctgc gctgcctccg gctacacctt cacctcctac 540 tggatgaact gggtcagaca ggcacctgga aagggactgg tctgggtgtc gcgcattgac 600 ccctacgact ccgaaaccca ttacaatcag aaattcaagg accgcttcac catctccgtg 660 gacaaagcca agagcaccgc gtacctccaa atgaactccc tgcgcgctga ggatacagca 720 gtgtactatt gcgcccgggg aaactgggat gattactggg gccagggaac tactgtgact 780 gtgtcatcca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 97 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 97 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgacgtgg tcatgactca gtccccggac tcactcgcgg tgtcgcttgg agagagagcg 120 accatcaact gtcgggcctc aaagagcatc agcaaggacc tggcctggta ccagcagaag 180 ccgggacagc cgccaaagct gctgatctac tccgggtcca ccttgcaatc tggtgtccct 240 gaccggttct ccggttccgg gtcgggtacc gacttcacgc tcactatttc gtcgctgcaa 300 gccgaagatg tggccgtgta ctattgccaa cagcacaaca agtaccccta cacttttggc 360 ggaggcacca aggtggaaat caaggggggt ggcggtagcg gaggaggggg ctccggcggc 420 ggcggctcag ggggcggagg aagcgaagtg cagctcgtcg agagcggagg gggactggtg 480 cagcccggag gaagcctgag gctgtcctgc gctgcctccg gctacacctt cacctcctac 540 tggatgaact gggtcagaca ggcacctgga aagggactgg tctgggtgtc gcgcattgac 600 ccctacgact ccgaaaccca ttacaatcag aaattcaagg accgcttcac catctccgtg 660 gacaaagcca agagcaccgc gtacctccaa atgaactccc tgcgcgctga ggatacagca 720 gtgtactatt gcgcccgggg aaactgggat gattactggg gccagggaac tactgtgact 780 gtgtcatcca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840 cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900 cggggtcttg acttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggctgg tacttgcggg 960 gtcctgctgc tttcactcgt gatcactctt tactgtaagc gcggtcggaa gaagctgctg 1020 tacatcttta agcaaccctt catgaggcct gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt 1080 tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc 1140 agcgcagatg ctccagccta caagcagggg cagaaccagc tctacaacga actcaatctt 1200 ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc 1260 gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag 1320 atggcagaag cctatagcga gattggtatg aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac 1380 gacggactgt accagggact cagcaccgcc accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg 1440 caggccctgc cgcctcgg 1458 <210> 98 <211> 487 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn 65 70 75 80 Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser 85 90 95 Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro 115 120 125 Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln 145 150 155 160 Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 165 170 175 Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr Leu Asn Trp 180 185 190 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala 195 200 205 Phe Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 210 215 220 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe 225 230 235 240 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Ser Val Pro Leu Thr Phe Gly 245 250 255 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro 260 265 270 Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro 275 280 285 Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu 290 295 300 Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 305 310 315 320 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly 325 330 335 Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val 340 345 350 Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu 355 360 365 Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp 370 375 380 Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn 385 390 395 400 Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg 405 410 415 Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 420 425 430 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 435 440 445 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 450 455 460 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 465 470 475 480 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 99 <211> 487 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn 65 70 75 80 Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser 85 90 95 Ile Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro 115 120 125 Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln 145 150 155 160 Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 165 170 175 Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp 180 185 190 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala 195 200 205 Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 210 215 220 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe 225 230 235 240 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Ser Val Pro Leu Thr Phe Gly 245 250 255 Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro 260 265 270 Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro 275 280 285 Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu 290 295 300 Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 305 310 315 320 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly 325 330 335 Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val 340 345 350 Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu 355 360 365 Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp 370 375 380 Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn 385 390 395 400 Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg 405 410 415 Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 420 425 430 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 435 440 445 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 450 455 460 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 465 470 475 480 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 100 <211> 487 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Ile Phe Thr Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn 65 70 75 80 Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser 85 90 95 Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Ser Asp Asp Pro 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro 115 120 125 Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln 145 150 155 160 Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 165 170 175 Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp 180 185 190 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala 195 200 205 Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 210 215 220 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe 225 230 235 240 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Ser Val Pro Leu Thr Phe Gly 245 250 255 Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro 260 265 270 Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro 275 280 285 Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu 290 295 300 Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 305 310 315 320 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly 325 330 335 Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val 340 345 350 Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu 355 360 365 Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp 370 375 380 Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn 385 390 395 400 Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg 405 410 415 Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 420 425 430 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 435 440 445 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 450 455 460 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 465 470 475 480 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 101 <211> 336 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Ser Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Asn 65 70 75 80 Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser 85 90 95 Ile Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro 115 120 125 Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Arg Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp 145 150 155 160 Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp 165 170 175 Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu 180 185 190 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 195 200 205 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 210 215 220 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 225 230 235 240 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Ser Val Pro Leu Thr 245 250 255 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro 260 265 270 Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu 275 280 285 Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg 290 295 300 Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly 305 310 315 320 Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys 325 330 335 <210> 102 <400> 102 000 <210> 103 <400> 103 000 <210> 104 <400> 104 000 <210> 105 <400> 105 000 <210> 106 <400> 106 000 <210> 107 <400> 107 000 <210> 108 <400> 108 000 <210> 109 <400> 109 000 <210> 110 <400> 110 000 <210> 111 <400> 111 000 <210> 112 <400> 112 000 <210> 113 <400> 113 000 <210> 114 <400> 114 000 <210> 115 <400> 115 000 <210> 116 <400> 116 000 <210> 117 <400> 117 000 <210> 118 <400> 118 000 <210> 119 <400> 119 000 <210> 120 <400> 120 000 <210> 121 <400> 121 000 <210> 122 <400> 122 000 <210> 123 <400> 123 000 <210> 124 <400> 124 000 <210> 125 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 125 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser 85 90 95 Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 165 170 175 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 225 230 235 240 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 126 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 126 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser 85 90 95 Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Val Leu 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr 165 170 175 Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 127 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 127 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser 85 90 95 Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr 165 170 175 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala 225 230 235 240 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 128 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 128 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser 85 90 95 Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr 165 170 175 Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 129 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 129 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys 145 150 155 160 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 130 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 130 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 20 25 30 Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys 145 150 155 160 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 131 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 131 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu 20 25 30 Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys 145 150 155 160 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 132 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 132 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu 20 25 30 Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys 145 150 155 160 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 133 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 133 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser 85 90 95 Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 165 170 175 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 225 230 235 240 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 134 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 134 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser 85 90 95 Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Val Leu 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr 165 170 175 Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 135 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 135 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser 85 90 95 Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr 165 170 175 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala 225 230 235 240 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 136 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 136 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser 85 90 95 Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr 165 170 175 Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 137 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 137 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys 145 150 155 160 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser Val 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 138 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 138 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 20 25 30 Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys 145 150 155 160 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser Val 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 139 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 139 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu 20 25 30 Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys 145 150 155 160 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser Val 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 140 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 140 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu 20 25 30 Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys 145 150 155 160 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser Val 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 141 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 141 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser 85 90 95 Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr 100 105 110 Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 165 170 175 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 225 230 235 240 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 142 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 142 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser 85 90 95 Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr 100 105 110 Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Val Leu 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr 165 170 175 Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 143 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 143 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser 85 90 95 Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr 100 105 110 Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr 165 170 175 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala 225 230 235 240 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 144 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 144 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser 85 90 95 Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr 100 105 110 Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr 165 170 175 Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 145 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 145 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys 145 150 155 160 Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala 225 230 235 240 Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 146 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 146 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 20 25 30 Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys 145 150 155 160 Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala 225 230 235 240 Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 147 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 147 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu 20 25 30 Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys 145 150 155 160 Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala 225 230 235 240 Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 148 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 148 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu 20 25 30 Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys 145 150 155 160 Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala 225 230 235 240 Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 149 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 149 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Val Trp Val Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala 85 90 95 Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 165 170 175 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 225 230 235 240 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 150 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 150 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Val Trp Val Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala 85 90 95 Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Val Leu 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr 165 170 175 Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 151 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 151 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Val Trp Val Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala 85 90 95 Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr 165 170 175 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala 225 230 235 240 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 152 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 152 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Val Trp Val Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala 85 90 95 Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr 165 170 175 Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 153 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 153 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 145 150 155 160 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 180 185 190 Leu Val Trp Val Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 154 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 154 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 20 25 30 Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 145 150 155 160 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 180 185 190 Leu Val Trp Val Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 155 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 155 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu 20 25 30 Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 145 150 155 160 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 180 185 190 Leu Val Trp Val Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 156 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 156 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu 20 25 30 Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 145 150 155 160 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 180 185 190 Leu Val Trp Val Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 157 <211> 264 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 157 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn 65 70 75 80 Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser 85 90 95 Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro 115 120 125 Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln 145 150 155 160 Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 165 170 175 Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr Leu Asn Trp 180 185 190 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala 195 200 205 Phe Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 210 215 220 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe 225 230 235 240 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Ser Val Pro Leu Thr Phe Gly 245 250 255 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 260 <210> 158 <211> 264 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 158 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn 65 70 75 80 Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser 85 90 95 Ile Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro 115 120 125 Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln 145 150 155 160 Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 165 170 175 Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp 180 185 190 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala 195 200 205 Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 210 215 220 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe 225 230 235 240 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Ser Val Pro Leu Thr Phe Gly 245 250 255 Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 260 <210> 159 <211> 264 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 159 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Ile Phe Thr Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn 65 70 75 80 Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser 85 90 95 Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Ser Asp Asp Pro 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro 115 120 125 Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln 145 150 155 160 Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 165 170 175 Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp 180 185 190 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala 195 200 205 Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 210 215 220 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe 225 230 235 240 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Ser Val Pro Leu Thr Phe Gly 245 250 255 Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 260 <210> 160 <211> 266 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 160 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Ser Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Asn 65 70 75 80 Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser 85 90 95 Ile Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro 115 120 125 Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Arg Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp 145 150 155 160 Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp 165 170 175 Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu 180 185 190 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 195 200 205 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 210 215 220 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 225 230 235 240 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Ser Val Pro Leu Thr 245 250 255 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 260 265 <210> 161 <400> 161 000 <210> 162 <400> 162 000 <210> 163 <400> 163 000 <210> 164 <400> 164 000 <210> 165 <400> 165 000 <210> 166 <400> 166 000 <210> 167 <400> 167 000 <210> 168 <400> 168 000 <210> 169 <400> 169 000 <210> 170 <400> 170 000 <210> 171 <400> 171 000 <210> 172 <400> 172 000 <210> 173 <400> 173 000 <210> 174 <400> 174 000 <210> 175 <400> 175 000 <210> 176 <400> 176 000 <210> 177 <400> 177 000 <210> 178 <400> 178 000 <210> 179 <400> 179 000 <210> 180 <400> 180 000 <210> 181 <400> 181 000 <210> 182 <400> 182 000 <210> 183 <400> 183 000 <210> 184 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 184 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser 85 90 95 Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 165 170 175 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 225 230 235 240 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 260 <210> 185 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 185 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser 85 90 95 Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Val Leu 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr 165 170 175 Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 260 <210> 186 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 186 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser 85 90 95 Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr 165 170 175 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala 225 230 235 240 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 260 <210> 187 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 187 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser 85 90 95 Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr 165 170 175 Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 260 <210> 188 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 188 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys 145 150 155 160 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 260 <210> 189 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 189 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 20 25 30 Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys 145 150 155 160 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 260 <210> 190 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 190 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu 20 25 30 Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys 145 150 155 160 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 260 <210> 191 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 191 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu 20 25 30 Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys 145 150 155 160 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 260 <210> 192 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 192 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser 85 90 95 Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 165 170 175 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 225 230 235 240 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 260 <210> 193 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 193 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser 85 90 95 Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Val Leu 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr 165 170 175 Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 260 <210> 194 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 194 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser 85 90 95 Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr 165 170 175 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala 225 230 235 240 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 260 <210> 195 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 195 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser 85 90 95 Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr 165 170 175 Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 260 <210> 196 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 196 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys 145 150 155 160 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser Val 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 260 <210> 197 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 197 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 20 25 30 Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys 145 150 155 160 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser Val 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 260 <210> 198 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 198 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu 20 25 30 Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys 145 150 155 160 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser Val 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 260 <210> 199 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 199 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu 20 25 30 Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys 145 150 155 160 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser Val 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 260 <210> 200 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 200 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser 85 90 95 Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr 100 105 110 Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 165 170 175 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 225 230 235 240 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 260 <210> 201 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 201 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser 85 90 95 Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr 100 105 110 Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Val Leu 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr 165 170 175 Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 260 <210> 202 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 202 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser 85 90 95 Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr 100 105 110 Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr 165 170 175 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala 225 230 235 240 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 260 <210> 203 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 203 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser 85 90 95 Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr 100 105 110 Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr 165 170 175 Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 260 <210> 204 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 204 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys 145 150 155 160 Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala 225 230 235 240 Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 260 <210> 205 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 205 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 20 25 30 Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys 145 150 155 160 Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala 225 230 235 240 Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 260 <210> 206 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 206 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu 20 25 30 Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys 145 150 155 160 Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala 225 230 235 240 Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 260 <210> 207 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 207 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu 20 25 30 Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys 145 150 155 160 Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala 225 230 235 240 Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 260 <210> 208 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 208 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Val Trp Val Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala 85 90 95 Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 165 170 175 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 225 230 235 240 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 260 <210> 209 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 209 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Val Trp Val Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala 85 90 95 Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Val Leu 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr 165 170 175 Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 260 <210> 210 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 210 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Val Trp Val Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala 85 90 95 Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr 165 170 175 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala 225 230 235 240 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 260 <210> 211 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 211 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Val Trp Val Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala 85 90 95 Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr 165 170 175 Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser 195 200 205 Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 245 250 255 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 260 <210> 212 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 212 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 145 150 155 160 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 180 185 190 Leu Val Trp Val Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 260 <210> 213 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 213 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 20 25 30 Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 145 150 155 160 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 180 185 190 Leu Val Trp Val Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 260 <210> 214 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 214 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu 20 25 30 Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 145 150 155 160 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 180 185 190 Leu Val Trp Val Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 260 <210> 215 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 215 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu 20 25 30 Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His 100 105 110 Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 145 150 155 160 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 180 185 190 Leu Val Trp Val Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr 195 200 205 Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 260 <210> 216 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 216 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 217 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 217 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 218 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 218 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Ser Asp Asp Pro Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 219 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 219 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 220 <400> 220 000 <210> 221 <400> 221 000 <210> 222 <400> 222 000 <210> 223 <400> 223 000 <210> 224 <400> 224 000 <210> 225 <400> 225 000 <210> 226 <400> 226 000 <210> 227 <400> 227 000 <210> 228 <400> 228 000 <210> 229 <400> 229 000 <210> 230 <400> 230 000 <210> 231 <400> 231 000 <210> 232 <400> 232 000 <210> 233 <400> 233 000 <210> 234 <400> 234 000 <210> 235 <400> 235 000 <210> 236 <400> 236 000 <210> 237 <400> 237 000 <210> 238 <400> 238 000 <210> 239 <400> 239 000 <210> 240 <400> 240 000 <210> 241 <400> 241 000 <210> 242 <400> 242 000 <210> 243 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 243 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 244 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 244 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 245 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 245 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 246 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 246 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 247 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 247 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 248 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 248 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 249 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 249 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 250 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 250 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 251 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 251 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 252 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 252 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 253 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 253 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 254 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 254 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 255 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 255 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 256 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 256 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 257 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 257 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 258 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 258 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 259 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 259 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 260 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 260 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 261 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 261 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 262 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 262 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 263 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 263 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 264 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 264 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 265 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 265 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 266 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 266 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 267 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 267 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 268 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 268 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 269 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 269 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 270 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 270 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 271 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 271 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 272 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 272 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 273 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 273 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 274 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 274 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 275 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 275 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Phe Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Ser Val Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 276 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 276 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Ser Val Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 277 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 277 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Ser Val Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 278 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 278 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Ser Val Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 279 <400> 279 000 <210> 280 <400> 280 000 <210> 281 <400> 281 000 <210> 282 <400> 282 000 <210> 283 <400> 283 000 <210> 284 <400> 284 000 <210> 285 <400> 285 000 <210> 286 <400> 286 000 <210> 287 <400> 287 000 <210> 288 <400> 288 000 <210> 289 <400> 289 000 <210> 290 <400> 290 000 <210> 291 <400> 291 000 <210> 292 <400> 292 000 <210> 293 <400> 293 000 <210> 294 <400> 294 000 <210> 295 <400> 295 000 <210> 296 <400> 296 000 <210> 297 <400> 297 000 <210> 298 <400> 298 000 <210> 299 <400> 299 000 <210> 300 <400> 300 000 <210> 301 <400> 301 000 <210> 302 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 302 Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 303 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 303 Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 304 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 304 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 305 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 305 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 306 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 306 Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 307 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 307 Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 308 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 308 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 309 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 309 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 310 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 310 Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 311 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 311 Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 312 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 312 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 313 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 313 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 314 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 314 Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 315 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 315 Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 316 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 316 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 317 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 317 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 318 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 318 Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 319 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 319 Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 320 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 320 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 321 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 321 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 322 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 322 Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 323 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 323 Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 324 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 324 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 325 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 325 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 326 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 326 Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 327 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 327 Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 328 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 328 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 329 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 329 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 330 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 330 Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 331 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 331 Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 332 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 332 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 333 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 333 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 334 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 334 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met His 1 5 10 <210> 335 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 335 Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His 1 5 10 <210> 336 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 336 Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His 1 5 10 <210> 337 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 337 Gly Tyr Ile Phe Thr Gly Tyr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 338 <400> 338 000 <210> 339 <400> 339 000 <210> 340 <400> 340 000 <210> 341 <400> 341 000 <210> 342 <400> 342 000 <210> 343 <400> 343 000 <210> 344 <400> 344 000 <210> 345 <400> 345 000 <210> 346 <400> 346 000 <210> 347 <400> 347 000 <210> 348 <400> 348 000 <210> 349 <400> 349 000 <210> 350 <400> 350 000 <210> 351 <400> 351 000 <210> 352 <400> 352 000 <210> 353 <400> 353 000 <210> 354 <400> 354 000 <210> 355 <400> 355 000 <210> 356 <400> 356 000 <210> 357 <400> 357 000 <210> 358 <400> 358 000 <210> 359 <400> 359 000 <210> 360 <400> 360 000 <210> 361 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 361 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn 1 5 10 <210> 362 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 362 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 363 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 363 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 364 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 364 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 365 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 365 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 366 <400> 366 000 <210> 367 <400> 367 000 <210> 368 <400> 368 000 <210> 369 <400> 369 000 <210> 370 <400> 370 000 <210> 371 <400> 371 000 <210> 372 <400> 372 000 <210> 373 <400> 373 000 <210> 374 <400> 374 000 <210> 375 <400> 375 000 <210> 376 <400> 376 000 <210> 377 <400> 377 000 <210> 378 <400> 378 000 <210> 379 <400> 379 000 <210> 380 <400> 380 000 <210> 381 <400> 381 000 <210> 382 <400> 382 000 <210> 383 <400> 383 000 <210> 384 <400> 384 000 <210> 385 <400> 385 000 <210> 386 <400> 386 000 <210> 387 <400> 387 000 <210> 388 <400> 388 000 <210> 389 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 389 Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 390 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 390 Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 391 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 391 Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 392 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 392 Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 393 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 393 Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 394 <400> 394 000 <210> 395 <400> 395 000 <210> 396 <400> 396 000 <210> 397 <400> 397 000 <210> 398 <400> 398 000 <210> 399 <400> 399 000 <210> 400 <400> 400 000 <210> 401 <400> 401 000 <210> 402 <400> 402 000 <210> 403 <400> 403 000 <210> 404 <400> 404 000 <210> 405 <400> 405 000 <210> 406 <400> 406 000 <210> 407 <400> 407 000 <210> 408 <400> 408 000 <210> 409 <400> 409 000 <210> 410 <400> 410 000 <210> 411 <400> 411 000 <210> 412 <400> 412 000 <210> 413 <400> 413 000 <210> 414 <400> 414 000 <210> 415 <400> 415 000 <210> 416 <400> 416 000 <210> 417 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 417 Gly Asn Trp Asp Asp Tyr 1 5 <210> 418 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 418 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 419 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 419 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 420 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 420 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 421 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 421 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 422 <400> 422 000 <210> 423 <400> 423 000 <210> 424 <400> 424 000 <210> 425 <400> 425 000 <210> 426 <400> 426 000 <210> 427 <400> 427 000 <210> 428 <400> 428 000 <210> 429 <400> 429 000 <210> 430 <400> 430 000 <210> 431 <400> 431 000 <210> 432 <400> 432 000 <210> 433 <400> 433 000 <210> 434 <400> 434 000 <210> 435 <400> 435 000 <210> 436 <400> 436 000 <210> 437 <400> 437 000 <210> 438 <400> 438 000 <210> 439 <400> 439 000 <210> 440 <400> 440 000 <210> 441 <400> 441 000 <210> 442 <400> 442 000 <210> 443 <400> 443 000 <210> 444 <400> 444 000 <210> 445 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 445 Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala 1 5 10 <210> 446 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 446 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 447 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 447 Ala Ala Phe Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 448 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 448 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 449 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 449 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 450 <400> 450 000 <210> 451 <400> 451 000 <210> 452 <400> 452 000 <210> 453 <400> 453 000 <210> 454 <400> 454 000 <210> 455 <400> 455 000 <210> 456 <400> 456 000 <210> 457 <400> 457 000 <210> 458 <400> 458 000 <210> 459 <400> 459 000 <210> 460 <400> 460 000 <210> 461 <400> 461 000 <210> 462 <400> 462 000 <210> 463 <400> 463 000 <210> 464 <400> 464 000 <210> 465 <400> 465 000 <210> 466 <400> 466 000 <210> 467 <400> 467 000 <210> 468 <400> 468 000 <210> 469 <400> 469 000 <210> 470 <400> 470 000 <210> 471 <400> 471 000 <210> 472 <400> 472 000 <210> 473 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 473 Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser 1 5 <210> 474 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 474 Gln Gln Gly Asp Ser Val Pro Leu Thr 1 5 <210> 475 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 475 Gln Gln Gly Asp Ser Val Pro Leu Thr 1 5 <210> 476 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 476 Gln Gln Gly Asp Ser Val Pro Leu Thr 1 5 <210> 477 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 477 Gln Gln Gly Asp Ser Val Pro Leu Thr 1 5 <210> 478 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 478 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 130 135 140 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg 145 150 155 160 Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Phe Ser Leu Gln Ser 180 185 190 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 195 200 205 Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220 Gln Gln Gly Asp Ser Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Glu Ile Lys <210> 479 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 479 caagtgcaac tcgtccaaag cggagcggaa gtcaagaaac ccggagcgag cgtgaaagtg 60 tcctgcaaag cctccggcta cacctttacg ggctactaca tgcactgggt gcgccaggca 120 ccaggacagg gtcttgaatg gatgggatgg atcaacccta attcgggcgg aactaactac 180 gcacagaagt tccaggggag agtgactctg actcgggata cctccatctc aactgtctac 240 atggaactct cccgcttgcg gtcagatgat acggcagtgt actactgcgc ccgcgacatg 300 aatatcctgg ctaccgtgcc gttcgacatc tggggacagg ggactatggt tactgtctca 360 tcgggcggtg gaggttcagg aggaggcggc tcgggaggcg gaggttcgga cattcagatg 420 acccagtccc catcctctct gtcggccagc gtcggagata gggtgaccat tacctgtcgg 480 gcctcgcaaa gcatctcctc gtacctcaac tggtatcagc aaaagccggg aaaggcgcct 540 aagctgctga tctacgccgc ttcgagcttg caaagcgggg tgccatccag attctcggga 600 tcaggctcag gaaccgactt caccctgacc gtgaacagcc tccagccgga ggactttgcc 660 acttactact gccagcaggg agactccgtg ccgcttactt tcgggggggg tacccgcctg 720 gagatcaag 729 <210> 480 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 480 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 130 135 140 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg 145 150 155 160 Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 180 185 190 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 195 200 205 Leu Thr Val Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220 Gln Gln Gly Asp Ser Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu 225 230 235 240 Glu Ile Lys <210> 481 <211> 1760 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 481 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 ccccaagtgc aactcgtcca aagcggagcg gaagtcaaga aacccggagc gagcgtgaaa 120 gtgtcctgca aagcctccgg ctacaccttt acgggctact acatgcactg ggtgcgccag 180 gcaccaggac agggtcttga atggatggga tggatcaacc ctaattcggg cggaactaac 240 tacgcacaga agttccaggg gagagtgact ctgactcggg atacctccat ctcaactgtc 300 tacatggaac tctcccgctt gcggtcagat gatacggcag tgtactactg cgcccgcgac 360 atgaatatcc tggctaccgt gccgttcgac atctggggac aggggactat ggttactgtc 420 tcatcgggcg gtggaggttc aggaggaggc ggctcgggag gcggaggttc ggacattcag 480 atgacccagt ccccatcctc tctgtcggcc agcgtcggag atagggtgac cattacctgt 540 cgggcctcgc aaagcatctc ctcgtacctc aactggtatc agcaaaagcc gggaaaggcg 600 cctaagctgc tgatctacgc cgcttcgagc ttgcaaagcg gggtgccatc cagattctcg 660 ggatcaggct caggaaccga cttcaccctg accgtgaaca gcctccagcc ggaggacttt 720 gccacttact actgccagca gggagactcc gtgccgctta ctttcggggg gggtacccgc 780 ctggagatca agaccactac cccagcaccg aggccaccca ccccggctcc taccatcgcc 840 tcccagcctc tgtccctgcg tccggaggca tgtagacccg cagctggtgg ggccgtgcat 900 acccggggtc ttgacttcgc ctgcgatatc tacatttggg cccctctggc tggtacttgc 960 ggggtcctgc tgctttcact cgtgatcact ctttactgta agcgcggtcg gaagaagctg 1020 ctgtacatct ttaagcaacc cttcatgagg cctgtgcaga ctactcaaga ggaggacggc 1080 tgttcttgcc ggttcccaga ggaggaggaa ggcggctgcg aactgcgcgt gaaattcagc 1140 cgcagcgcag acgctccagc ctacaagcag gggcagaacc agctctacaa cgaactcaat 1200 cttggtcgga gagaggagta cgacgtgctg gacaagcgga gaggacggga cccagaaatg 1260 ggcgggaagc cgcgcagaaa gaatccccaa gagggcctgt acaacgagct ccaaaaggat 1320 aagatggcag aagcctatag cgagattggt atgaaagggg aacgcagaag aggcaaaggc 1380 cacgacggac tgtaccaggg actcagcacc gccaccaagg acacctatga cgctcttcac 1440 atgcaggccc tgccgcctcg gtaagtcgac agctcgcttt cttgctgtcc aatttctatt 1500 aaaggttcct ttgttcccta agtccaacta ctaaactggg ggatattatg aagggccttg 1560 agcatctgga ttctgcctaa taaaaaacat ttattttcat tgctgcgtcg agagctcgct 1620 ttcttgctgt ccaatttcta ttaaaggttc ctttgttccc taagtccaac tactaaactg 1680 ggggatatta tgaagggcct tgagcatctg gattctgcct aataaaaaac atttattttc 1740 attgctgcct cgacgaattc 1760 <210> 482 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 482 caagtccaac tcgttcaatc cggcgcagaa gtcaagaagc caggagcatc agtgaaagtg 60 tcctgcaaag cctcaggcta catcttcacg ggatactaca tccactgggt gcgccaggct 120 ccgggccagg gccttgagtg gatgggctgg atcaacccta actctggggg aaccaactac 180 gctcagaagt tccaggggag ggtcactatg actcgcgata cctccatctc cactgcgtac 240 atggaactct cgggactgag atccgacgat cctgccgtgt actactgcgc ccgggacatg 300 aacatcttgg cgaccgtgcc gtttgacatt tggggacagg gcaccctcgt cactgtgtcg 360 agcggtggag gaggctcggg gggtggcgga tcaggagggg gaggaagcga catccagctg 420 actcagagcc catcgtcgtt gtccgcgtcg gtgggggata gagtgaccat tacttgccgc 480 gccagccaga gcatctcatc atatctgaat tggtaccagc agaagcccgg aaaggcccca 540 aaactgctga tctacgctgc aagcagcctc caatcgggag tgccgtcacg gttctccggg 600 tccggttcgg gaactgactt taccctgacc gtgaattcgc tgcaaccgga ggatttcgcc 660 acgtactact gtcagcaagg agactccgtg ccgctgacct tcggtggagg caccaaggtc 720 gaaatcaag 729 <210> 483 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 483 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Ser Asp Asp Pro Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro 130 135 140 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg 145 150 155 160 Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 180 185 190 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 195 200 205 Leu Thr Val Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220 Gln Gln Gly Asp Ser Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 225 230 235 240 Glu Ile Lys <210> 484 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 484 caagtccaac tccaacagtc aggcgcagaa gtgaaaaaga gcggtgcatc ggtgaaagtg 60 tcatgcaaag cctcgggcta caccttcact gactactata tgcactggct gcggcaggca 120 ccgggacagg gacttgagtg gatgggatgg atcaacccga attcagggga cactaactac 180 gcgcagaagt tccaggggag agtgaccctg acgagggaca cctcaatttc gaccgtctac 240 atggaattgt cgcgcctgag atcggacgat actgctgtgt actactgtgc ccgcgacatg 300 aacatcctcg cgactgtgcc ttttgatatc tggggacagg ggactatggt caccgtttcc 360 tccgcttccg gtggcggagg ctcgggaggc cgggcctccg gtggaggagg cagcgacatc 420 cagatgactc agagcccttc ctcgctgagc gcctcagtgg gagatcgcgt gaccatcact 480 tgccgggcca gccagtccat ttcgtcctac ctcaattggt accagcagaa gccgggaaag 540 gcgcccaagc tcttgatcta cgctgcgagc tccctgcaaa gcggggtgcc gagccgattc 600 tcgggttccg gctcgggaac cgacttcact ctgaccatct catccctgca accagaggac 660 tttgccacct actactgcca acaaggagat tctgtcccac tgacgttcgg cggaggaacc 720 aaggtcgaaa tcaag 735 <210> 485 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 485 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Arg Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln 130 135 140 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 145 150 155 160 Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln 165 170 175 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu 180 185 190 Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 195 200 205 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 210 215 220 Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Ser Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr 225 230 235 240 Lys Val Glu Ile Lys 245 <210> 486 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 486 Gly Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 487 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 487 Gly Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 488 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 488 Gly Tyr Tyr Ile His 1 5 <210> 489 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 489 Asp Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 490 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 490 Ser Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 491 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 491 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 492 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 492 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 493 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 493 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 494 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 494 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 495 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 495 Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 496 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 496 Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 497 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 497 Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 498 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 498 Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 499 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 499 Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 500 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 500 Gly Asn Trp Asp Asp Tyr 1 5 <210> 501 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 501 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 502 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 502 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 503 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 503 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 504 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 504 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 505 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 505 Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala 1 5 10 <210> 506 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 506 Ala Ala Phe Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 507 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 507 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 508 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 508 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 509 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 509 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 510 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 510 Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser 1 5 <210> 511 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 511 Gln Gln Gly Asp Ser Val Pro Leu Thr 1 5 <210> 512 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 512 Gln Gln Gly Asp Ser Val Pro Leu Thr 1 5 <210> 513 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 513 Gln Gln Gly Asp Ser Val Pro Leu Thr 1 5 <210> 514 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 514 Gln Gln Gly Asp Ser Val Pro Leu Thr 1 5 <210> 515 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 515 Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 516 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 516 Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 1 5 <210> 517 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 517 Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 1 5 <210> 518 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 518 Gly Tyr Ile Phe Thr Gly Tyr 1 5 <210> 519 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 519 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 1 5 <210> 520 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 520 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 1 5 <210> 521 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 521 Asn Pro Asn Ser Gly Gly 1 5 <210> 522 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 522 Asn Pro Asn Ser Gly Gly 1 5 <210> 523 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 523 Asn Pro Asn Ser Gly Gly 1 5 <210> 524 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 524 Asn Pro Asn Ser Gly Asp 1 5 <210> 525 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 525 Asp Pro Tyr Asp Ser Glu 1 5 <210> 526 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 526 Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 527 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 527 Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 528 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 528 Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 529 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 529 Asp Met Asn Ile Leu Ala Thr Val Pro Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 530 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 530 Gly Asn Trp Asp Asp Tyr 1 5 <210> 531 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 531 Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr 1 5 <210> 532 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 532 Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 533 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 533 Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 534 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 534 Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 535 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 535 Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 1 5 <210> 536 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 536 Ala Ala Phe 1 <210> 537 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 537 Ala Ala Ser 1 <210> 538 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 538 Ala Ala Ser 1 <210> 539 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 539 Ala Ala Ser 1 <210> 540 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 540 Ser Gly Ser 1 <210> 541 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 541 Gly Asp Ser Val Pro Leu 1 5 <210> 542 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 542 Gly Asp Ser Val Pro Leu 1 5 <210> 543 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 543 Gly Asp Ser Val Pro Leu 1 5 <210> 544 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 544 Gly Asp Ser Val Pro Leu 1 5 <210> 545 <400> 545 000 <210> 546 <400> 546 000 <210> 547 <400> 547 000 <210> 548 <400> 548 000 <210> 549 <400> 549 000 <210> 550 <400> 550 000 <210> 551 <400> 551 000 <210> 552 <400> 552 000 <210> 553 <400> 553 000 <210> 554 <400> 554 000 <210> 555 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 555 His Asn Lys Tyr Pro Tyr 1 5 <210> 556 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 556 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser 130 135 140 Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 145 150 155 160 Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly 180 185 190 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu 195 200 205 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220 Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 225 230 235 240 Ile Lys <210> 557 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 557 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala 130 135 140 Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala 145 150 155 160 Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly 180 185 190 Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 195 200 205 Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220 Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 225 230 235 240 Ile Lys <210> 558 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 558 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala 130 135 140 Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 145 150 155 160 Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp 165 170 175 Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly 180 185 190 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe 195 200 205 Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220 Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 225 230 235 240 Ile Lys <210> 559 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 559 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp 130 135 140 Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala 145 150 155 160 Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly 180 185 190 Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 195 200 205 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220 Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 225 230 235 240 Ile Lys <210> 560 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 560 Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 115 120 125 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser 130 135 140 Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 165 170 175 Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 180 185 190 Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 195 200 205 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser <210> 561 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 561 Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 115 120 125 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser 130 135 140 Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 165 170 175 Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 180 185 190 Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 195 200 205 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser <210> 562 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 562 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 115 120 125 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser 130 135 140 Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 165 170 175 Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 180 185 190 Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 195 200 205 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser <210> 563 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 563 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 115 120 125 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser 130 135 140 Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 165 170 175 Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 180 185 190 Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 195 200 205 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser <210> 564 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 564 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser 130 135 140 Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 145 150 155 160 Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly 180 185 190 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu 195 200 205 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220 Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 225 230 235 240 Ile Lys <210> 565 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 565 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala 130 135 140 Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala 145 150 155 160 Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly 180 185 190 Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 195 200 205 Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220 Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 225 230 235 240 Ile Lys <210> 566 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 566 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala 130 135 140 Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 145 150 155 160 Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp 165 170 175 Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly 180 185 190 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe 195 200 205 Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220 Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 225 230 235 240 Ile Lys <210> 567 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 567 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp 130 135 140 Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala 145 150 155 160 Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly 180 185 190 Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 195 200 205 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220 Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 225 230 235 240 Ile Lys <210> 568 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 568 Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 115 120 125 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser 130 135 140 Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 165 170 175 Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 180 185 190 Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu 195 200 205 Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser <210> 569 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 569 Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 115 120 125 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser 130 135 140 Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 165 170 175 Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 180 185 190 Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu 195 200 205 Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser <210> 570 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 570 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 115 120 125 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser 130 135 140 Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 165 170 175 Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 180 185 190 Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu 195 200 205 Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser <210> 571 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 571 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 115 120 125 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser 130 135 140 Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 165 170 175 Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 180 185 190 Asp Arg Phe Val Phe Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu 195 200 205 Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser <210> 572 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 572 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser 130 135 140 Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 145 150 155 160 Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly 180 185 190 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu 195 200 205 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220 Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 225 230 235 240 Ile Lys <210> 573 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 573 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala 130 135 140 Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala 145 150 155 160 Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly 180 185 190 Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 195 200 205 Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220 Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 225 230 235 240 Ile Lys <210> 574 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 574 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala 130 135 140 Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 145 150 155 160 Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp 165 170 175 Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly 180 185 190 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe 195 200 205 Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220 Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 225 230 235 240 Ile Lys <210> 575 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 575 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp 130 135 140 Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala 145 150 155 160 Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly 180 185 190 Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 195 200 205 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220 Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 225 230 235 240 Ile Lys <210> 576 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 576 Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 115 120 125 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser 130 135 140 Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 165 170 175 Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 180 185 190 Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu 195 200 205 Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser <210> 577 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 577 Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 115 120 125 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser 130 135 140 Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 165 170 175 Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 180 185 190 Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu 195 200 205 Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser <210> 578 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 578 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 115 120 125 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser 130 135 140 Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 165 170 175 Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 180 185 190 Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu 195 200 205 Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser <210> 579 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 579 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 115 120 125 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser 130 135 140 Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 165 170 175 Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 180 185 190 Asp His Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu 195 200 205 Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser <210> 580 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 580 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser 130 135 140 Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 145 150 155 160 Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly 180 185 190 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu 195 200 205 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220 Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 225 230 235 240 Ile Lys <210> 581 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 581 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala 130 135 140 Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala 145 150 155 160 Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly 180 185 190 Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 195 200 205 Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220 Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 225 230 235 240 Ile Lys <210> 582 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 582 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala 130 135 140 Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 145 150 155 160 Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp 165 170 175 Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly 180 185 190 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe 195 200 205 Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220 Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 225 230 235 240 Ile Lys <210> 583 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 583 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp 130 135 140 Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala 145 150 155 160 Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly 180 185 190 Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 195 200 205 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220 Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 225 230 235 240 Ile Lys <210> 584 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 584 Asp Val Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 115 120 125 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 130 135 140 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val Ser 165 170 175 Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 180 185 190 Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Ser Thr Ala Tyr Leu 195 200 205 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser <210> 585 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 585 Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 115 120 125 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 130 135 140 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val Ser 165 170 175 Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 180 185 190 Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Ser Thr Ala Tyr Leu 195 200 205 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser <210> 586 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 586 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 115 120 125 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 130 135 140 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val Ser 165 170 175 Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 180 185 190 Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Ser Thr Ala Tyr Leu 195 200 205 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser <210> 587 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 587 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 115 120 125 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 130 135 140 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val Ser 165 170 175 Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 180 185 190 Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Ser Thr Ala Tyr Leu 195 200 205 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser <210> 588 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 588 Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Gly Gly Pro Ser Ser Pro Lys Lys 1 5 10 15 Lys Arg Lys Val Ser Arg Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly 20 25 30 Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr 35 40 45 Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg 50 55 60 Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly 65 70 75 80 Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu 85 90 95 Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile 100 105 110 Ile Pro Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu 115 120 125 Glu Thr Ser Tyr 130 <210> 589 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 589 Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys 1 5 10 15 Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly 20 25 30 Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met 35 40 45 Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln 50 55 60 Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala 65 70 75 80 Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr Leu 85 90 95 Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Thr Ser 100 105 <210> 590 <211> 93 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 590 Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg 1 5 10 15 Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu 20 25 30 Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr 35 40 45 Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp 50 55 60 Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala 65 70 75 80 Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys 85 90 <210> 591 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 591 Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Ile Glu Ala Ser Arg 1 5 10 15 Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu 20 25 30 Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr 35 40 45 Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp 50 55 60 Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala 65 70 75 80 Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser 85 90 95 <210> 592 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 592 Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Leu Glu Ala Ser Arg 1 5 10 15 Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu 20 25 30 Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr 35 40 45 Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp 50 55 60 Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala 65 70 75 80 Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser 85 90 95 <210> 593 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 593 Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg 1 5 10 15 Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu 20 25 30 Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr 35 40 45 Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp 50 55 60 Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala 65 70 75 80 Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser 85 90 95 <210> 594 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(78) <223> Any amino acid <400> 594 Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Xaa Glu Ala Ser Arg 1 5 10 15 Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu 20 25 30 Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr 35 40 45 Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp 50 55 60 Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Xaa Gln Ala 65 70 75 80 Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser 85 90 95 <210> 595 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 595 Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Ile Glu Ala Ser Arg 1 5 10 15 Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu 20 25 30 Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr 35 40 45 Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp 50 55 60 Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala 65 70 75 80 Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser 85 90 95 <210> 596 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 596 Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Leu Glu Ala Ser Arg 1 5 10 15 Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu 20 25 30 Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr 35 40 45 Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp 50 55 60 Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala 65 70 75 80 Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser 85 90 95 <210> 597 <211> 521 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 597 acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct 60 ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtgtg 120 gggcggaggg cgtggcgggg aagggccggc gacgagagcc gcgcgggacg actcgtcggc 180 gataaccggt gtcgggtagc gccagccgcg cgacggtaac gagggaccgc gacaggcaga 240 cgctcccatg atcactctgc acgccgaagg caaatagtgc aggccgtgcg gcgcttggcg 300 ttccttggaa gggctgaatc cccgcctcgt ccttcgcagc ggccccccgg gtgttcccat 360 cgccgcttct aggcccactg cgacgcttgc ctgcacttct tacacgctct gggtcccagc 420 cgcggcgacg caaagggcct tggtgcgggt ctcgtcggcg cagggacgcg tttgggtccc 480 gacggaacct tttccgcgtt ggggttgggg caccataagc t 521 <210> 598 <211> 118 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 598 acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct 60 ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtg 118 <210> 599 <211> 221 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 599 acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct 60 ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtgtg 120 gggcggaggg cgtggcgggg aagggccggc gacgagagcc gcgcgggacg actcgtcggc 180 gataaccggt gtcgggtagc gccagccgcg cgacggtaac g 221 <210> 600 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 600 acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct 60 ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtgtg 120 gggcggaggg cgtggcgggg aagggccggc gacgagagcc gcgcgggacg actcgtcggc 180 gataaccggt gtcgggtagc gccagccgcg cgacggtaac gagggaccgc gacaggcaga 240 cgctcccatg atcactctgc acgccgaagg caaatagtgc aggccgtgcg gcgcttggcg 300 ttccttggaa gggctgaatc cccg 324 <210> 601 <211> 422 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 601 acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct 60 ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtgtg 120 gggcggaggg cgtggcgggg aagggccggc gacgagagcc gcgcgggacg actcgtcggc 180 gataaccggt gtcgggtagc gccagccgcg cgacggtaac gagggaccgc gacaggcaga 240 cgctcccatg atcactctgc acgccgaagg caaatagtgc aggccgtgcg gcgcttggcg 300 ttccttggaa gggctgaatc cccgcctcgt ccttcgcagc ggccccccgg gtgttcccat 360 cgccgcttct aggcccactg cgacgcttgc ctgcacttct tacacgctct gggtcccagc 420 cg 422 <210> 602 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(3) <223> /replace=" " <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(21) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 602 Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 1 5 10 15 Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 603 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(3) <223> /replace=" " <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(22) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 603 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 604 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(3) <223> /replace=" " <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(23) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 604 Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp 1 5 10 15 Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 605 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(3) <223> /replace=" " <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(25) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 605 Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala 1 5 10 15 Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 25 <210> 606 <211> 1132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 606 Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser 1 5 10 15 His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly 20 25 30 Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg 35 40 45 Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro 50 55 60 Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu 65 70 75 80 Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val 85 90 95 Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro 100 105 110 Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr 115 120 125 Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val 130 135 140 Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val 145 150 155 160 Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr 165 170 175 Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly 180 185 190 Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg 195 200 205 Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg 210 215 220 Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg 225 230 235 240 Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp 245 250 255 Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val 260 265 270 Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala 275 280 285 Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His 290 295 300 Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro 305 310 315 320 Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly 325 330 335 Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro 340 345 350 Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser 355 360 365 Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln 370 375 380 Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His 385 390 395 400 Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg 405 410 415 Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln 420 425 430 Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu 435 440 445 Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe 450 455 460 Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser 465 470 475 480 Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser 485 490 495 Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met 500 505 510 Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys 515 520 525 Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe 530 535 540 Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe 545 550 555 560 Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr 565 570 575 Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His 580 585 590 Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln 595 600 605 His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile 610 615 620 Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val 625 630 635 640 Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser 645 650 655 Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg 660 665 670 Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg 675 680 685 Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro 690 695 700 Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile 705 710 715 720 Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln 725 730 735 Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His 740 745 750 Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp 755 760 765 Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser 770 775 780 Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu 785 790 795 800 Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His 805 810 815 Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro 820 825 830 Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp 835 840 845 Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu 850 855 860 Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala 865 870 875 880 Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys 885 890 895 Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu 900 905 910 Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe 915 920 925 Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser 930 935 940 Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe 945 950 955 960 Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly 965 970 975 Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn 980 985 990 Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln 995 1000 1005 Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln 1010 1015 1020 Gln Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp 1025 1030 1035 Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly 1040 1045 1050 Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu 1055 1060 1065 Ala Val Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr 1070 1075 1080 Arg His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr 1085 1090 1095 Ala Gln Thr Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr 1100 1105 1110 Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys 1115 1120 1125 Thr Ile Leu Asp 1130 <210> 607 <211> 4027 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 607 caggcagcgt ggtcctgctg cgcacgtggg aagccctggc cccggccacc cccgcgatgc 60 cgcgcgctcc ccgctgccga gccgtgcgct ccctgctgcg cagccactac cgcgaggtgc 120 tgccgctggc cacgttcgtg cggcgcctgg ggccccaggg ctggcggctg gtgcagcgcg 180 gggacccggc ggctttccgc gcgctggtgg cccagtgcct ggtgtgcgtg ccctgggacg 240 cacggccgcc ccccgccgcc ccctccttcc gccaggtgtc ctgcctgaag gagctggtgg 300 cccgagtgct gcagaggctg tgcgagcgcg gcgcgaagaa cgtgctggcc ttcggcttcg 360 cgctgctgga cggggcccgc gggggccccc ccgaggcctt caccaccagc gtgcgcagct 420 acctgcccaa cacggtgacc gacgcactgc gggggagcgg ggcgtggggg ctgctgttgc 480 gccgcgtggg cgacgacgtg ctggttcacc tgctggcacg ctgcgcgctc tttgtgctgg 540 tggctcccag ctgcgcctac caggtgtgcg ggccgccgct gtaccagctc ggcgctgcca 600 ctcaggcccg gcccccgcca cacgctagtg gaccccgaag gcgtctggga tgcgaacggg 660 cctggaacca tagcgtcagg gaggccgggg tccccctggg cctgccagcc ccgggtgcga 720 ggaggcgcgg gggcagtgcc agccgaagtc tgccgttgcc caagaggccc aggcgtggcg 780 ctgcccctga gccggagcgg acgcccgttg ggcaggggtc ctgggcccac ccgggcagga 840 cgcgtggacc gagtgaccgt ggtttctgtg tggtgtcacc tgccagaccc gccgaagaag 900 ccacctcttt ggagggtgcg ctctctggca cgcgccactc ccacccatcc gtgggccgcc 960 agcaccacgc gggcccccca tccacatcgc ggccaccacg tccctgggac acgccttgtc 1020 ccccggtgta cgccgagacc aagcacttcc tctactcctc aggcgacaag gagcagctgc 1080 ggccctcctt cctactcagc tctctgaggc ccagcctgac tggcgctcgg aggctcgtgg 1140 agaccatctt tctgggttcc aggccctgga tgccagggac tccccgcagg ttgccccgcc 1200 tgccccagcg ctactggcaa atgcggcccc tgtttctgga gctgcttggg aaccacgcgc 1260 agtgccccta cggggtgctc ctcaagacgc actgcccgct gcgagctgcg gtcaccccag 1320 cagccggtgt ctgtgcccgg gagaagcccc agggctctgt ggcggccccc gaggaggagg 1380 acacagaccc ccgtcgcctg gtgcagctgc tccgccagca cagcagcccc tggcaggtgt 1440 acggcttcgt gcgggcctgc ctgcgccggc tggtgccccc aggcctctgg ggctccaggc 1500 acaacgaacg ccgcttcctc aggaacacca agaagttcat ctccctgggg aagcatgcca 1560 agctctcgct gcaggagctg acgtggaaga tgagcgtgcg gggctgcgct tggctgcgca 1620 ggagcccagg ggttggctgt gttccggccg cagagcaccg tctgcgtgag gagatcctgg 1680 ccaagttcct gcactggctg atgagtgtgt acgtcgtcga gctgctcagg tctttctttt 1740 atgtcacgga gaccacgttt caaaagaaca ggctcttttt ctaccggaag agtgtctgga 1800 gcaagttgca aagcattgga atcagacagc acttgaagag ggtgcagctg cgggagctgt 1860 cggaagcaga ggtcaggcag catcgggaag ccaggcccgc cctgctgacg tccagactcc 1920 gcttcatccc caagcctgac gggctgcggc cgattgtgaa catggactac gtcgtgggag 1980 ccagaacgtt ccgcagagaa aagagggccg agcgtctcac ctcgagggtg aaggcactgt 2040 tcagcgtgct caactacgag cgggcgcggc gccccggcct cctgggcgcc tctgtgctgg 2100 gcctggacga tatccacagg gcctggcgca ccttcgtgct gcgtgtgcgg gcccaggacc 2160 cgccgcctga gctgtacttt gtcaaggtgg atgtgacggg cgcgtacgac accatccccc 2220 aggacaggct cacggaggtc atcgccagca tcatcaaacc ccagaacacg tactgcgtgc 2280 gtcggtatgc cgtggtccag aaggccgccc atgggcacgt ccgcaaggcc ttcaagagcc 2340 acgtctctac cttgacagac ctccagccgt acatgcgaca gttcgtggct cacctgcagg 2400 agaccagccc gctgagggat gccgtcgtca tcgagcagag ctcctccctg aatgaggcca 2460 gcagtggcct cttcgacgtc ttcctacgct tcatgtgcca ccacgccgtg cgcatcaggg 2520 gcaagtccta cgtccagtgc caggggatcc cgcagggctc catcctctcc acgctgctct 2580 gcagcctgtg ctacggcgac atggagaaca agctgtttgc ggggattcgg cgggacgggc 2640 tgctcctgcg tttggtggat gatttcttgt tggtgacacc tcacctcacc cacgcgaaaa 2700 ccttcctcag gaccctggtc cgaggtgtcc ctgagtatgg ctgcgtggtg aacttgcgga 2760 agacagtggt gaacttccct gtagaagacg aggccctggg tggcacggct tttgttcaga 2820 tgccggccca cggcctattc ccctggtgcg gcctgctgct ggatacccgg accctggagg 2880 tgcagagcga ctactccagc tatgcccgga cctccatcag agccagtctc accttcaacc 2940 gcggcttcaa ggctgggagg aacatgcgtc gcaaactctt tggggtcttg cggctgaagt 3000 gtcacagcct gtttctggat ttgcaggtga acagcctcca gacggtgtgc accaacatct 3060 acaagatcct cctgctgcag gcgtacaggt ttcacgcatg tgtgctgcag ctcccatttc 3120 atcagcaagt ttggaagaac cccacatttt tcctgcgcgt catctctgac acggcctccc 3180 tctgctactc catcctgaaa gccaagaacg cagggatgtc gctgggggcc aagggcgccg 3240 ccggccctct gccctccgag gccgtgcagt ggctgtgcca ccaagcattc ctgctcaagc 3300 tgactcgaca ccgtgtcacc tacgtgccac tcctggggtc actcaggaca gcccagacgc 3360 agctgagtcg gaagctcccg gggacgacgc tgactgccct ggaggccgca gccaacccgg 3420 cactgccctc agacttcaag accatcctgg actgatggcc acccgcccac agccaggccg 3480 agagcagaca ccagcagccc tgtcacgccg ggctctacgt cccagggagg gaggggcggc 3540 ccacacccag gcccgcaccg ctgggagtct gaggcctgag tgagtgtttg gccgaggcct 3600 gcatgtccgg ctgaaggctg agtgtccggc tgaggcctga gcgagtgtcc agccaagggc 3660 tgagtgtcca gcacacctgc cgtcttcact tccccacagg ctggcgctcg gctccacccc 3720 agggccagct tttcctcacc aggagcccgg cttccactcc ccacatagga atagtccatc 3780 cccagattcg ccattgttca cccctcgccc tgccctcctt tgccttccac ccccaccatc 3840 caggtggaga ccctgagaag gaccctggga gctctgggaa tttggagtga ccaaaggtgt 3900 gccctgtaca caggcgagga ccctgcacct ggatgggggt ccctgtgggt caaattgggg 3960 ggaggtgctg tgggagtaaa atactgaata tatgagtttt tcagttttga aaaaaaaaaa 4020 aaaaaaa 4027 <210> 608 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 608 ggaggtccct caccttcta 19 <210> 609 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 609 cggaggatct tatgctgaa 19 <210> 610 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 610 cccgcttcca gatcataca 19 <210> 611 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 611 ggagacctca acaagatat 19 <210> 612 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 612 aaggcatggt cattggtat 19 <210> 613 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 613 gcatggtcat tggtatcat 19 <210> 614 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 614 ggtcattggt atcatgagt 19 <210> 615 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 615 cctagtgggt atccctgta 19 <210> 616 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 616 gaggatggac attgttctt 19 <210> 617 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 617 gcatgcaggc tacagttca 19 <210> 618 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 618 ccagcacatg cactgttga 19 <210> 619 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 619 cacatgcact gttgagtga 19 <210> 620 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 620 ctggaggtcc ctcaccttct a 21 <210> 621 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 621 gtcggaggat cttatgctga a 21 <210> 622 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 622 tgcccgcttc cagatcatac a 21 <210> 623 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 623 ctggagacct caacaagata t 21 <210> 624 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 624 tcaaggcatg gtcattggta t 21 <210> 625 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 625 aggcatggtc attggtatca t 21 <210> 626 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 626 atggtcattg gtatcatgag t 21 <210> 627 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 627 gccctagtgg gtatccctgt a 21 <210> 628 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 628 atgaggatgg acattgttct t 21 <210> 629 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 629 gagcatgcag gctacagttc a 21 <210> 630 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 630 ttccagcaca tgcactgttg a 21 <210> 631 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 631 agcacatgca ctgttgagtg a 21 <210> 632 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 632 tagaaggtga gggacctcca g 21 <210> 633 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 633 ttcagcataa gatcctccga c 21 <210> 634 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 634 tgtatgatct ggaagcgggc a 21 <210> 635 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 635 atatcttgtt gaggtctcca g 21 <210> 636 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 636 ataccaatga ccatgccttg a 21 <210> 637 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 637 atgataccaa tgaccatgcc t 21 <210> 638 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 638 atggtcattg gtatcatgag t 21 <210> 639 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 639 gccctagtgg gtatccctgt a 21 <210> 640 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 640 atgaggatgg acattgttct t 21 <210> 641 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 641 gagcatgcag gctacagttc a 21 <210> 642 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 642 ttccagcaca tgcactgttg a 21 <210> 643 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 643 agcacatgca ctgttgagtg a 21 <210> 644 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 644 tagaaggtga gggacctcc 19 <210> 645 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 645 ttcagcataa gatcctccg 19 <210> 646 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 646 tgtatgatct ggaagcggg 19 <210> 647 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 647 atatcttgtt gaggtctcc 19 <210> 648 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 648 ataccaatga ccatgcctt 19 <210> 649 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 649 atgataccaa tgaccatgc 19 <210> 650 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 650 atggtcattg gtatcatga 19 <210> 651 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 651 gccctagtgg gtatccctg 19 <210> 652 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 652 atgaggatgg acattgttc 19 <210> 653 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 653 gagcatgcag gctacagtt 19 <210> 654 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 654 ttccagcaca tgcactgtt 19 <210> 655 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 655 agcacatgca ctgttgagt 19 <210> 656 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 656 ggccaggatg gttcttaga 19 <210> 657 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 657 gcttcgtgct aaactggta 19 <210> 658 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 658 gggcgtgact tccacatga 19 <210> 659 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 659 caggcctaga gaagtttca 19 <210> 660 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 660 cttggaaccc attcctgaa 19 <210> 661 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 661 ggaacccatt cctgaaatt 19 <210> 662 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 662 gaacccattc ctgaaatta 19 <210> 663 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 663 aacccattcc tgaaattat 19 <210> 664 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 664 acccattcct gaaattatt 19 <210> 665 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 665 cccattcctg aaattattt 19 <210> 666 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 666 ctgtggttct attatatta 19 <210> 667 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 667 aaatatgaga gcatgctaa 19 <210> 668 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 668 tctaagaacc atcctggcc 19 <210> 669 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 669 taccagttta gcacgaagc 19 <210> 670 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 670 tcatgtggaa gtcacgccc 19 <210> 671 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 671 tgaaacttct ctaggcctg 19 <210> 672 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 672 ttcaggaatg ggttccaag 19 <210> 673 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 673 aatttcagga atgggttcc 19 <210> 674 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 674 taatttcagg aatgggttc 19 <210> 675 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 675 ataatttcag gaatgggtt 19 <210> 676 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 676 aataatttca ggaatgggt 19 <210> 677 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 677 aaataatttc aggaatggg 19 <210> 678 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 678 taatataata gaaccacag 19 <210> 679 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 679 ttagcatgct ctcatattt 19 <210> 680 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 680 gcggccagga tggttcttag a 21 <210> 681 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 681 gagcttcgtg ctaaactggt a 21 <210> 682 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 682 acgggcgtga cttccacatg a 21 <210> 683 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 683 tgcaggccta gagaagtttc a 21 <210> 684 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 684 tccttggaac ccattcctga a 21 <210> 685 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 685 ttggaaccca ttcctgaaat t 21 <210> 686 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 686 tggaacccat tcctgaaatt a 21 <210> 687 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 687 ggaacccatt cctgaaatta t 21 <210> 688 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 688 gaacccattc ctgaaattat t 21 <210> 689 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 689 aacccattcc tgaaattatt t 21 <210> 690 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 690 ccctgtggtt ctattatatt a 21 <210> 691 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 691 ttaaatatga gagcatgcta a 21 <210> 692 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 692 tctaagaacc atcctggccg c 21 <210> 693 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 693 taccagttta gcacgaagct c 21 <210> 694 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 694 tcatgtggaa gtcacgcccg t 21 <210> 695 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 695 tgaaacttct ctaggcctgc a 21 <210> 696 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 696 ttcaggaatg ggttccaagg a 21 <210> 697 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 697 aatttcagga atgggttcca a 21 <210> 698 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 698 taatttcagg aatgggttcc a 21 <210> 699 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 699 ataatttcag gaatgggttc c 21 <210> 700 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 700 aataatttca ggaatgggtt c 21 <210> 701 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 701 aaataatttc aggaatgggt t 21 <210> 702 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 702 taatataata gaaccacagg g 21 <210> 703 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 703 ttagcatgct ctcatattta a 21 <210> 704 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 704 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 705 <211> 150 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 705 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 150 <210> 706 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 706 Arg Gly Asp Ser 1 <210> 707 <211> 494 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 707 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala 20 25 30 Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala 35 40 45 Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Asn Thr Phe Met His Trp Tyr Gln 50 55 60 Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn 65 70 75 80 Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr 85 90 95 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr 100 105 110 Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly 115 120 125 Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu 145 150 155 160 Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 165 170 175 Ile Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys 180 185 190 Ser Phe Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr 195 200 205 Tyr Ser Ala Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser 210 215 220 Ala Ser Thr Ala Tyr Leu His Ile Asn Asp Leu Lys Asn Glu Asp Thr 225 230 235 240 Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Gly Gly Tyr Asp Pro Met Asp Tyr 245 250 255 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ser Gly Thr 260 265 270 Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser 275 280 285 Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly 290 295 300 Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp 305 310 315 320 Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile 325 330 335 Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys 340 345 350 Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys 355 360 365 Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val 370 375 380 Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn 385 390 395 400 Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val 405 410 415 Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg 420 425 430 Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys 435 440 445 Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg 450 455 460 Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys 465 470 475 480 Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 490 <210> 708 <211> 487 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 708 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala 35 40 45 Ser Lys Ser Ile Ser Lys Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly 50 55 60 Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly 65 70 75 80 Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 85 90 95 Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln 100 105 110 Gln His Asn Lys Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 115 120 125 Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly 145 150 155 160 Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser 165 170 175 Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Asp Gln Gly Leu Glu Trp 180 185 190 Ile Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys 195 200 205 Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 210 215 220 Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 225 230 235 240 Cys Ala Arg Gly Asn Trp Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 245 250 255 Thr Val Ser Ser Ala Ser Ser Gly Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro 260 265 270 Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro 275 280 285 Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu 290 295 300 Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 305 310 315 320 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly 325 330 335 Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val 340 345 350 Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu 355 360 365 Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp 370 375 380 Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn 385 390 395 400 Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg 405 410 415 Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 420 425 430 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 435 440 445 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 450 455 460 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 465 470 475 480 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 709 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(40) <223> /note="This sequence may encompass 1-10 "Gly Gly Gly Ser" repeating units" <400> 709 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 35 40

Claims (102)

  1. 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 단리된 핵산 분자이며, 여기서 CAR은 CD123 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서 상기 CD123 결합 도메인은 표 9, 표 2, 또는 표 6에 열거된 임의의 CD123 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CD123 결합 도메인이 표 9, 표 2, 또는 표 6에 열거된 임의의 CD123 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3)을 추가로 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3이 표 11, 13, 4, 또는 8에 열거된 LC CDR 서열인 단리된 핵산 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3이 표 10, 12, 3, 또는 7에 열거된 HC CDR 서열인 단리된 핵산 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 표 9 또는 2에 열거된 임의의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열;
    (ii) 표 9 또는 2에 제공된 경쇄 가변 영역 중 임의의 것의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (iii) 표 9 또는 2에 제공된 경쇄 가변 영역 중 임의의 것의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열
    을 포함하는 CAR을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 표 9 또는 2에 열거된 임의의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열;
    (ii) 표 9 또는 2에 제공된 중쇄 가변 영역 중 임의의 것의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (iii) 표 9 또는 2에 제공된 중쇄 가변 영역 중 임의의 것의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열
    을 포함하는 CAR을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 표 9 또는 2에 열거된 임의의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 표 9 또는 2에 열거된 임의의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 CD123 결합 도메인이
    (i) 서열식별번호: 480, 483, 485, 478, 158, 159, 160, 157, 217, 218, 219, 216, 276, 277, 278, 또는 275로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열;
    (ii) 서열식별번호: 480, 483, 485, 478, 158, 159, 160, 157, 217, 218, 219, 216, 276, 277, 278, 또는 275 중 임의의 것에 대해 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (iii) 서열식별번호: 480, 483, 485, 478, 158, 159, 160, 157, 217, 218, 219, 216, 276, 277, 278, 또는 275 중 임의의 것에 대해 95-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열
    을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, CD123 결합 도메인이 서열식별번호: 479, 481, 482, 484로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 CAR이 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인을 포함하는 막횡단 도메인을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 코딩된 막횡단 도메인이 서열식별번호: 6의 아미노산 서열, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 포함하지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 포함하는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (ii) 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열이 서열식별번호: 17의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인
    단리된 핵산 분자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 CD123 결합 도메인이 힌지 영역에 의해 막횡단 도메인에 연결된 것인 단리된 핵산 분자.
  13. 제12항에 있어서,
    (i) 코딩된 힌지 영역이 서열식별번호: 2의 아미노산 서열, 또는 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 포함하지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 포함하는 아미노산 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (ii) 힌지 영역을 코딩하는 핵산 서열이 서열식별번호: 13의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인
    핵산 분자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 공동자극 도메인이 MHC 부류 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 수득된 기능적 신호전달 도메인인 단리된 핵산 분자.
  15. 제14항에 있어서, 코딩된 공동자극 도메인이 서열식별번호: 7의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  16. 제14항에 있어서, 공동자극 도메인을 코딩하는 핵산 서열이 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인이 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인이 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열; 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열; 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인이 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열이 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현되는 것인 단리된 핵산 분자.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열이 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 및/또는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 21의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 코딩하는 리더 서열을 추가로 포함하는 단리된 핵산 분자.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열식별번호: 99, 100, 101, 또는 98 중 임의의 것의 아미노산 서열;
    (ii) 서열식별번호: 99, 100, 101, 또는 98 중 임의의 것에 대해 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (iii) 서열식별번호: 99, 100, 101, 또는 98 중 임의의 것에 대해 95-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열
    을 포함하는 CAR을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 39, 40, 41, 또는 38 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 39, 40, 41, 또는 38 중 임의의 것에 대해 95-99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 핵산 분자에 의해 코딩된 단리된 폴리펩티드 분자.
  25. 단리된 키메라 항원 수용체 (CAR) 폴리펩티드이며, 여기서 CAR은 CD123 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편, 막횡단 도메인, 및 공동자극 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서 상기 CD123 결합 도메인은 표 9, 2, 또는 6에 열거된 임의의 CD123 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하는 것인 단리된 키메라 항원 수용체 (CAR) 폴리펩티드.
  26. 제25항에 있어서, 상기 CD123 결합 도메인이 표 9, 2, 또는 6에 열거된 임의의 CD123 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2) 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3)을 추가로 포함하는 것인 단리된 CAR 폴리펩티드.
  27. 제26항에 있어서, 상기 LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3이 표 11, 13, 4, 또는 8에 열거된 LC CDR 서열인 단리된 CAR 폴리펩티드.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3이 표 10, 12, 3, 또는 7에 열거된 HC CDR 서열인 단리된 CAR 폴리펩티드.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 표 9 또는 2에 열거된 임의의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열;
    (ii) 표 9 또는 2에 제공된 경쇄 가변 영역 중 임의의 것의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (iii) 표 9 또는 2에 제공된 경쇄 가변 영역 중 임의의 것의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열
    을 포함하는 단리된 CAR 폴리펩티드.
  30. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 표 2 또는 9에 열거된 임의의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열;
    (ii) 표 2 또는 9에 제공된 중쇄 가변 영역 중 임의의 것의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (iii) 표 2 또는 9에 제공된 중쇄 가변 영역 중 임의의 것의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열
    을 포함하는 단리된 CAR 폴리펩티드.
  31. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 표 2 또는 9에 열거된 임의의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 표 2 또는 9에 열거된 임의의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 CAR 폴리펩티드.
  32. 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열식별번호: 480, 483, 485, 478, 158, 159, 160, 157, 217, 218, 219, 216, 276, 277, 278, 또는 275로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열;
    (ii) 서열식별번호: 480, 483, 485, 478, 158, 159, 160, 157, 217, 218, 219, 216, 276, 277, 278, 또는 275 중 임의의 것에 대해 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (iii) 서열식별번호: 480, 483, 485, 478, 158, 159, 160, 157, 217, 218, 219, 216, 276, 277, 278, 또는 275 중 임의의 것에 대해 95-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열
    을 포함하는 단리된 CAR 폴리펩티드.
  33. 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 막횡단 도메인이 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터의 막횡단 도메인을 포함하는 것인 단리된 CAR 폴리펩티드.
  34. 제25항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 막횡단 도메인이 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (ii) 아미노산 서열이 서열식별번호: 6의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 포함하지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 포함하거나; 또는
    (iii) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열인
    단리된 CAR 폴리펩티드.
  35. 제25항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, CD123 결합 도메인이 힌지 영역에 의해 막횡단 도메인에 연결된 것인 단리된 CAR 폴리펩티드.
  36. 제35항에 있어서, 힌지 영역이 서열식별번호: 2, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 CAR 폴리펩티드.
  37. 제25항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 공동자극 도메인이 MHC 부류 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 수득된 기능적 신호전달 도메인인 단리된 CAR 폴리펩티드.
  38. 제25항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 공동자극 도메인이 서열식별번호: 7의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 CAR 폴리펩티드.
  39. 제25항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 것인 단리된 CAR 폴리펩티드.
  40. 제25항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열; 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열; 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 CAR 폴리펩티드.
  41. 제25항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 아미노산 서열이 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현되는 것인 단리된 CAR 폴리펩티드.
  42. 제25항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 리더 서열을 추가로 포함하는 단리된 CAR 폴리펩티드.
  43. 제25항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열식별번호: 99, 100, 101, 또는 98 중 임의의 것의 아미노산 서열;
    (ii) 서열식별번호: 99, 100, 101, 또는 98 중 임의의 것에 대해 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (iii) 서열식별번호: 99, 100, 101, 또는 98 중 임의의 것에 대해 95-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열
    을 포함하는 단리된 CAR 폴리펩티드.
  44. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 분자, RNA 분자 또는 그의 조합인 핵산 분자.
  45. 제44항에 있어서, 제24항 내지 제43항 중 어느 한 항의 CAR 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA인 핵산 분자.
  46. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 또는 제24항 내지 제43항 중 어느 한 항의 CAR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터이며, DNA 벡터 또는 RNA 벡터인 벡터.
  47. 제46항에 있어서, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 벡터.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 서열식별번호: 11의 서열을 포함하는 EF-1 프로모터를 추가로 포함하는 벡터.
  49. 제1항 내지 제23항, 제44항 및 제45항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 제24항 내지 제43항 중 어느 한 항의 CAR 폴리펩티드, 또는 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포.
  50. 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포 내로 제1항 내지 제23항, 제44항 및 제45항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 또는 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항의 벡터를 도입, 예를 들어 형질도입하는 것을 포함하는, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포를 제조하는 방법.
  51. RNA를 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 세포의 집단을 생성하는 방법이며, 여기서 RNA는 제1항 내지 제23항, 제44항 및 제45항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 또는 제24항 내지 제43항 중 어느 한 항의 CAR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 것인 방법.
  52. 포유동물에게 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 제24항 내지 제43항 중 어느 한 항의 CAR 폴리펩티드를 포함하는 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물 내에 항종양 면역을 제공하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 세포가 자가 T 세포 또는 동종 T 세포인 방법.
  54. CD123의 발현과 연관된 질환을 갖는 포유동물에게 제1항 내지 제23항, 제44항 및 제45항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 제24항 내지 제43항 중 어느 한 항의 CAR 폴리펩티드를 포함하는 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물을 치료하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, CD123 발현과 연관된 질환이
    (i) 암 또는 악성종양,
    (ii) 전암성 상태, 또는
    (ii) CD123의 발현과 연관된 비-암 관련 적응증
    인 방법.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, 질환이 혈액암 또는 전-백혈병인 방법.
  57. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 급성 골수성 백혈병 (AML), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 급성 림프모구성 B-세포 백혈병 (B-세포 급성 림프성 백혈병, BALL), 급성 림프모구성 T-세포 백혈병 (T-세포 급성 림프성 백혈병, TALL), B-세포 전림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 (CML), 모발상 세포 백혈병, 호지킨 림프종, 조직구성 장애, 비만 세포 장애, 골수이형성증, 골수이형성 증후군, 골수증식성 신생물, 형질 세포 골수종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 또는 그의 조합 중 1종 이상으로부터 선택된 것인 방법.
  58. 제52항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단이
    (i) CAR 핵산 또는 CAR 폴리펩티드를 포함하는 세포의 효능을 증가시키는 작용제;
    (ii) CAR 핵산 또는 CAR 폴리펩티드를 포함하는 세포의 투여와 연관된 1종 이상의 부작용을 호전시키는 작용제; 또는
    (iii) CD123의 발현과 연관된 질환을 치료하는 작용제
    중 1종 이상과 조합되어 투여되는 것인 방법.
  59. 제52항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단이 제24항 내지 제43항 중 어느 한 항의 CAR 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA를 포함하는 것인 방법.
  60. 제52항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단이 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 제24항 내지 제43항 중 어느 한 항의 CAR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포함하는 것인 방법.
  61. 제52항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단이 화학요법, 표적화 항암 요법, 종양용해 약물, 세포독성제, 시토카인, 외과적 절차, 방사선 절차, 공동자극 분자의 효능제, 면역 체크포인트 분자의 억제제, 백신 또는 제2 CAR-기반 면역요법 중 1종 이상으로부터 선택된 제2 치료제 또는 절차와 조합되어 투여되는 것인 방법.
  62. 제52항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단이 OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3 또는 CD83 리간드 중 1종 이상으로부터 선택된 공동자극 분자의 효능제와 조합되어 투여되는 것인 방법.
  63. 제52항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단이 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 또는 TGFR, 예를 들어 TGFR베타 중 1종 이상으로부터 선택된 면역 체크포인트 분자의 억제제와 조합되어 투여되는 것인 방법.
  64. 제61항에 있어서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단이 PD-1 억제제, TIM-3 억제제, CEACAM-1 억제제 또는 그의 조합과 조합되어 투여되는 것인 방법.
  65. 제64항에 있어서, PD-1 억제제 및 TIM-3 억제제가 조합되어 투여되는 것인 방법.
  66. 제64항에 있어서, TIM-3 억제제 및 CEACAM-1 억제제가 조합되어 투여되는 것인 방법.
  67. 제61항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 효능제 또는 억제제가 항체 분자, 예를 들어 단일특이적 항체 분자 또는 이중특이적 항체 분자인 방법.
  68. 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 억제제가 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단의 투여에 후속하여 투여되는 것인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 억제제가 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단의 투여의 약 3-7일 후에 투여되는 것인 방법.
  70. 제52항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단이 CD19 억제제와 조합되어 투여되는 것인 방법.
  71. 제70항에 있어서, CD19 억제제가 CD19 CAR-발현 세포 또는 항-CD19 항체 분자인 방법.
  72. 제54항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 CD19-음성 암, 예를 들어 CD19-음성 재발성 암인 방법.
  73. 포유동물에게 제1항 내지 제23항, 제44항 및 제45항 중 어느 한 항의 핵산 또는 제24항 내지 제43항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 CD19-음성 재발을 예방하는 방법.
  74. 제73항에 있어서, CD19 억제제, 예를 들어 CD19 CAR-발현 세포를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  75. 제54항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 백혈병, 예를 들어 급성 림프모구성 백혈병 (예를 들어, 재발성 및 불응성 ALL) 또는 AML인 방법.
  76. 제70항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단이 CD19 억제제의 투여 후에 투여되는 것인 방법.
  77. 제70항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단이 CD19 억제제와 공동으로 투여되는 것인 방법.
  78. 제52항 내지 제75항 및 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단이 CD19 CAR 및 CD123 CAR을 발현하는 것인 방법.
  79. 제77항 또는 제78항에 있어서, CD19 CAR 및 CD123 CAR이 CD19 또는 CD123 중 하나를 발현하는 표적 세포 (예를 들어, 조혈 줄기 세포)에 결합한 경우의 활성화와 비교하여 CD19 CAR 및 CD123 CAR 둘 다가 표적 세포, 예를 들어 표적 CD19+CD123+ 세포 (예를 들어, B-ALL 모세포)에 결합한 경우에 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단의 완전 활성화가 일어나도록, CD19 CAR 또는 CD123 CAR이 스플릿 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
  80. 제79항에 있어서, CD123CAR이 공동자극 도메인, 예를 들어 4-1BB 신호전달 도메인을 포함하고, CD19 CAR이 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
  81. 제52항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단으로 처리한 후 T 세포 고갈제를 투여하여 세포 (예를 들어, CD123CAR-발현 세포)를 감소 (예를 들어, 고갈)시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  82. 포유동물을 제1항 내지 제23항, 제44항 및 제45항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 또는 제24항 내지 제43항 중 어느 한 항의 CAR 폴리펩티드를 포함하는 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단으로 처리한 후 포유동물에게 T 세포 고갈제를 투여하여 세포 (예를 들어, CD123CAR-발현 세포)를 감소 (예를 들어, 고갈)시키는 것을 포함하는, CAR 요법 후 CD123CAR-발현 세포를 감소 (예를 들어, 고갈)시키는 방법.
  83. 제81항 또는 제82항에 있어서, T 세포 고갈제가 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단의 투여의 1, 2, 3, 4 또는 5주 후에 투여되는 것인 방법.
  84. 제81항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 백혈병, 예를 들어 ALL 또는 AML을 갖는 것인 방법.
  85. 제81항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 고갈제가 CD52 억제제인 방법.
  86. 제85항에 있어서, CD52 억제제가 항-CD52 항체 분자, 예를 들어 알렘투주맙인 방법.
  87. 제81항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단이 CD123CAR 폴리펩티드 및 T 세포 고갈제에 의해 인식되는 표적 단백질을 발현하는 것인 방법.
  88. 제87항에 있어서, 표적 단백질이 CD20인 방법.
  89. 제88항에 있어서, T 세포 고갈제가 항-CD20 항체, 예를 들어 리툭시맙인 방법.
  90. 제87항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단이 CD123CAR 핵산 및 표적 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 (예를 들어, 벡터)을 포함하는 것인 방법.
  91. 제52항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 세포, 예를 들어 조혈 줄기 세포 또는 골수를 포유동물 내로 이식하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  92. 의약으로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 분자, 폴리펩티드, 벡터, 또는 세포.
  93. CD123의 발현과 연관된 질환의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 분자, 폴리펩티드, 벡터, 또는 세포.
  94. 암의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 분자, 폴리펩티드, 벡터, 또는 세포.
  95. 제93항에 있어서, 질환이 AML, ALL, B-ALL, T-ALL, B-세포 전림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, CML, 모발상 세포 백혈병, 호지킨 림프종, 비만 세포 장애, 골수이형성 증후군, 골수증식성 신생물, 형질 세포 골수종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 또는 그의 조합으로부터 선택된 것인 용도.
  96. 제49항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인으로부터의 양성 신호를 포함하는 제2 폴리펩티드와 회합된, 억제 분자의 적어도 일부를 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 추가로 발현하는 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단.
  97. 제96항에 있어서, 키메라 분자가 PD1의 적어도 일부를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 공동자극 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 것인 세포.
  98. 제58항에 있어서, 작용제가 mTOR 억제제이고, 대상체에게 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제, 예를 들어 RAD001 또는 라파마이신을 투여하는 것인 방법.
  99. 제98항에 있어서, mTOR 억제제가 대상체의 말초 혈액 또는 대상체로부터 단리된 T 세포의 표본에서 PD-1 양성 T 세포의 비율을 감소시키거나, PD-1 음성 T 세포의 비율을 증가시키거나, PD-1 음성 T 세포/ PD-1 양성 T 세포의 비를 증가시키는데 충분한 양의 시간 동안 투여되는 것인 방법.
  100. 대상체에게 제1항 내지 제23항, 제44항 및 제45항 중 어느 한 항의 CAR 핵산 분자 또는 제24항 내지 제43항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 세포 이식 전에 대상체를 조건화하는 방법.
  101. 제100항에 있어서, 세포 이식이 줄기 세포 이식, 예를 들어 조혈 줄기 세포 이식 또는 골수 이식인 방법.
  102. 제100항 또는 제101항에 있어서, 세포 이식 전에 대상체를 조건화하는 것이 대상체 내 CD123-발현 세포, 예를 들어 CD123-발현 정상 세포 또는 CD123-발현 암 세포의 수를 감소시키는 것을 포함하는 것인 방법.
KR1020177007130A 2014-08-19 2015-08-19 암 치료에 사용하기 위한 항-cd123 키메라 항원 수용체 (car) Active KR102616429B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNPCT/CN2014/084696 2014-08-19
CN2014084696 2014-08-19
CNPCT/CN2014/090508 2014-11-06
CN2014090508 2014-11-06
PCT/US2015/045898 WO2016028896A1 (en) 2014-08-19 2015-08-19 Anti-cd123 chimeric antigen receptor (car) for use in cancer treatment

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170039307A true KR20170039307A (ko) 2017-04-10
KR102616429B1 KR102616429B1 (ko) 2023-12-26

Family

ID=54011902

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177007130A Active KR102616429B1 (ko) 2014-08-19 2015-08-19 암 치료에 사용하기 위한 항-cd123 키메라 항원 수용체 (car)

Country Status (21)

Country Link
US (4) US9815901B2 (ko)
EP (2) EP3183268B1 (ko)
JP (2) JP7084138B2 (ko)
KR (1) KR102616429B1 (ko)
CN (2) CN107108744B (ko)
AU (2) AU2015305531B2 (ko)
CA (1) CA2958553A1 (ko)
CO (1) CO2017001573A2 (ko)
DK (1) DK3183268T3 (ko)
ES (1) ES2791248T3 (ko)
HU (1) HUE049218T2 (ko)
IL (2) IL250362B (ko)
LT (1) LT3183268T (ko)
MX (1) MX2017002205A (ko)
MY (1) MY189028A (ko)
PL (1) PL3183268T3 (ko)
PT (1) PT3183268T (ko)
RU (2) RU2020117196A (ko)
SG (1) SG11201700770PA (ko)
TW (2) TW202140557A (ko)
WO (1) WO2016028896A1 (ko)

Families Citing this family (214)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10058621B2 (en) 2015-06-25 2018-08-28 Immunomedics, Inc. Combination therapy with anti-HLA-DR antibodies and kinase inhibitors in hematopoietic cancers
EA201491573A1 (ru) 2012-02-22 2015-03-31 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Применение передающего сигнал домена cd2 в химерных антигенспецифических рецепторах второго поколения
WO2014100615A1 (en) 2012-12-20 2014-06-26 Purdue Research Foundation Chimeric antigen receptor-expressing t cells as anti-cancer therapeutics
DK2943511T3 (da) 2013-01-14 2019-10-21 Xencor Inc Nye heterodimeriske proteiner
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
ES2760023T3 (es) 2013-02-20 2020-05-12 Univ Pennsylvania Tratamiento del cáncer utilizando receptor de antígeno quimérico anti-EGFRvIII humanizado
ES2814962T3 (es) 2013-02-20 2021-03-29 Novartis Ag Fijación eficaz como objetivo de la leucemia humana primaria utilizando células T modificadas con receptor de antígeno quimérico anti-CD123
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
EP3623380A1 (en) * 2013-03-15 2020-03-18 Michael C. Milone Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
UY35468A (es) 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
US10570204B2 (en) 2013-09-26 2020-02-25 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Methods for treating hematologic cancers
US20150140036A1 (en) 2013-11-13 2015-05-21 Novartis Institutes For Biomedical Research, Inc. Low, immune enhancing, dose mtor inhibitors and uses thereof
CA3225456A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Novartis Ag Human mesothelin chimeric antigen receptors and uses thereof
JP6793902B2 (ja) 2013-12-20 2020-12-02 ノバルティス アーゲー 調節可能キメラ抗原受容体
ES2963718T3 (es) 2014-01-21 2024-04-01 Novartis Ag Capacidad presentadora de antígenos de células CAR-T potenciada mediante introducción conjunta de moléculas co-estimuladoras
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) * 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
CA2936962C (en) 2014-03-14 2024-03-05 Novartis Ag Antibody molecules to lag-3 and uses thereof
DK3122781T3 (da) 2014-03-28 2020-03-16 Xencor Inc Bispecifikke antistoffer, der binder til cd38 og cd3
KR20240042250A (ko) 2014-04-07 2024-04-01 노파르티스 아게 항-cd19 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료
SG10201913782UA (en) 2014-07-21 2020-03-30 Novartis Ag Treatment of cancer using a cll-1 chimeric antigen receptor
WO2016014553A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
WO2016014565A2 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
CA2955154C (en) 2014-07-21 2023-10-31 Novartis Ag Treatment of cancer using a cd33 chimeric antigen receptor
DK3183268T3 (da) 2014-08-19 2020-05-11 Univ Pennsylvania Behandling af cancer ved anvendelse af en cd123-kimær antigenreceptor
ES2688035T3 (es) 2014-08-29 2018-10-30 Gemoab Monoclonals Gmbh Receptor de antígeno universal que expresa células inmunes para direccionamiento de antígenos múltiples diversos, procedimiento para fabricación del mismo y utilización del mismo para tratamiento de cáncer, infecciones y enfermedades autoinmunes
WO2016040880A1 (en) 2014-09-13 2016-03-17 Novartis Ag Combination therapies of alk inhibitors
EP3194443B1 (en) 2014-09-17 2021-07-14 Novartis AG Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
AU2015330898B2 (en) 2014-10-08 2022-03-10 Novartis Ag Biomarkers predictive of therapeutic responsiveness to chimeric antigen receptor therapy and uses thereof
US10889653B2 (en) 2014-11-26 2021-01-12 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
MX2017006918A (es) 2014-11-26 2018-01-25 Xencor Inc Anticuerpos heterodimericos que se unen a cd3 y cd38.
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
EP3766895B1 (en) 2014-12-03 2024-07-10 Juno Therapeutics, Inc. Methods and compositions for adoptive cell therapy
US10428155B2 (en) 2014-12-22 2019-10-01 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
RU2021118125A (ru) 2014-12-29 2022-04-06 Новартис Аг Способы получения экспрессирующих химерный антигенный рецептор клеток
US11459390B2 (en) 2015-01-16 2022-10-04 Novartis Ag Phosphoglycerate kinase 1 (PGK) promoters and methods of use for expressing chimeric antigen receptor
US11161907B2 (en) 2015-02-02 2021-11-02 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
US20170151281A1 (en) 2015-02-19 2017-06-01 Batu Biologics, Inc. Chimeric antigen receptor dendritic cell (car-dc) for treatment of cancer
US10227411B2 (en) 2015-03-05 2019-03-12 Xencor, Inc. Modulation of T cells with bispecific antibodies and FC fusions
EP3270936A4 (en) 2015-03-17 2018-08-08 Chimera Bioengineering Inc. Smart car devices, de car polypeptides, side cars and uses thereof
HRP20220893T1 (hr) 2015-04-08 2022-10-14 Novartis Ag Cd20 terapije, cd22 terapije, i kombinirane terapije sa stanicom koja eksprimira cd19 kimerni antigenski receptor
EP3283619B1 (en) 2015-04-17 2023-04-05 Novartis AG Methods for improving the efficacy and expansion of chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3286211A1 (en) 2015-04-23 2018-02-28 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
MX2017014776A (es) 2015-05-20 2018-02-15 Novartis Ag Combinacion farmaceutica de everolimus con dactolisib.
JP6961497B2 (ja) * 2015-06-25 2021-11-05 アイセル・ジーン・セラピューティクス・エルエルシー キメラ抗体受容体（ＣＡＲｓ）の構成およびその使用方法
WO2017222593A1 (en) * 2016-06-24 2017-12-28 Icell Gene Therapeutics Llc Chimeric antigen receptors (cars), compositions and methods thereof
SG10201912978PA (en) 2015-07-21 2020-02-27 Novartis Ag Methods for improving the efficacy and expansion of immune cells
EP3331913A1 (en) 2015-08-07 2018-06-13 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins
CN108780084B (zh) 2015-09-03 2022-07-22 诺华股份有限公司 预测细胞因子释放综合征的生物标志物
JP2019500055A (ja) * 2015-11-09 2019-01-10 アペリシス， インコーポレイテッド 改変された免疫細胞およびその使用
ES2940607T3 (es) 2015-12-03 2023-05-09 Juno Therapeutics Inc Receptores quiméricos modificados y composiciones y métodos relacionados
IL259576B (en) 2015-12-04 2022-09-01 Novartis Ag Grna molecule comprising tracr and crrna, pharmaceutical composition comprising same and method of preparing cells for immunotherapy
CN108699136B (zh) 2015-12-07 2022-03-18 Xencor股份有限公司 结合cd3和psma的异二聚抗体
US11052111B2 (en) 2015-12-08 2021-07-06 Chimera Bioengineering, Inc. Smart CAR devices and DE CAR polypeptides for treating disease and methods for enhancing immune responses
CN109069597A (zh) 2015-12-22 2018-12-21 诺华股份有限公司 间皮素嵌合抗原受体(car)和抗pd-l1抗体抑制剂联用于抗癌治疗
SG11201805449PA (en) 2015-12-28 2018-07-30 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor -expressing cells
EP4219689A3 (en) 2015-12-30 2023-12-20 Novartis AG Immune effector cell therapies with enhanced efficacy
AU2017225733A1 (en) 2016-03-04 2018-09-27 Novartis Ag Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (CAR) molecules and uses therefore
US11549099B2 (en) 2016-03-23 2023-01-10 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
US12144850B2 (en) 2016-04-08 2024-11-19 Purdue Research Foundation Methods and compositions for car T cell therapy
US11446398B2 (en) 2016-04-11 2022-09-20 Obsidian Therapeutics, Inc. Regulated biocircuit systems
WO2017180565A1 (en) * 2016-04-14 2017-10-19 Immunomedics, Inc. Combination therapy with anti-hla-dr antibodies and kinase inhibitors in hematopoietic cancers
JP7497955B6 (ja) 2016-04-15 2024-07-01 ノバルティス アーゲー 選択的タンパク質発現のための組成物および方法
WO2017201019A1 (en) 2016-05-17 2017-11-23 Chimera Bioengineering, Inc. Methods for making novel antigen binding domains
EP3469001A4 (en) 2016-06-09 2020-05-06 Seattle Genetics, Inc. COMBINATIONS OF PBD-BASED ANTIBODY CONJUGATES WITH FLT3 INHIBITORS
JP7010854B2 (ja) 2016-06-14 2022-01-26 ゼンコア インコーポレイテッド 二重特異性チェックポイント阻害剤抗体
CA3029328A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
AU2017295886C1 (en) * 2016-07-15 2024-05-16 Novartis Ag Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor
EP3487525A4 (en) * 2016-07-22 2020-03-18 Seattle Genetics, Inc. COMBINATION THERAPY WITH CD19-ADC AND RCHP
SG11201900634VA (en) * 2016-07-26 2019-02-27 Tessa Therapeutics Pte Ltd Chimeric antigen receptor
TW201806619A (zh) * 2016-07-28 2018-03-01 瑞士商諾華公司 嵌合抗原受體及pd-1抑制劑之組合療法
US20190161542A1 (en) 2016-08-01 2019-05-30 Novartis Ag Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
CN107793481A (zh) * 2016-08-31 2018-03-13 南京传奇生物科技有限公司 一种靶向人cd123的嵌合受体配体及其应用
EP4342978A3 (en) 2016-09-01 2024-07-03 Chimera Bioengineering Inc. Gold optimized car t-cells
EP3515472A4 (en) * 2016-09-23 2020-04-29 OncoSec Medical Incorporated MODULATION OF RESPONSES TO THERAPY BY CHECKPOINT INHIBITOR
WO2018064387A1 (en) 2016-09-28 2018-04-05 Novartis Ag Porous membrane-based macromolecule delivery system
TWI797091B (zh) 2016-10-07 2023-04-01 瑞士商諾華公司 利用嵌合抗原受體之癌症治療
CA3039930A1 (en) 2016-10-14 2018-04-19 Xencor, Inc. Bispecific heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ralpha fc-fusion proteins and pd-1 antibody fragments
CN110177809B (zh) * 2016-11-16 2023-11-03 埃博灵克斯股份有限公司 能够结合CD123和TCRα/β的T细胞募集多肽
JP2020500930A (ja) 2016-11-23 2020-01-16 ノバルティス アーゲー エベロリムス、ダクトリシブまたは両方で免疫応答を増強する方法
MX2019006286A (es) 2016-12-03 2020-02-07 Juno Therapeutics Inc Metodos para determinar la dosificacion en la terapia celular.
CN110249046A (zh) 2016-12-05 2019-09-17 朱诺治疗学股份有限公司 用于过继细胞疗法的工程化细胞的产生
CN107058390A (zh) * 2017-01-17 2017-08-18 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种慢病毒载体、重组慢病毒质粒、病毒及病毒的应用
WO2018136606A1 (en) * 2017-01-18 2018-07-26 Thalia Papayannopoulou Compositions and methods for transplant recipient conditioning
EP3574005B1 (en) 2017-01-26 2021-12-15 Novartis AG Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
CA3051481A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Phospholipid ether (ple) car t cell tumor targeting (ctct) agents
ES2988795T3 (es) 2017-02-27 2024-11-21 Juno Therapeutics Inc Composiciones, artículos de fabricación y métodos relacionados con la dosificación en terapia celular
US11850262B2 (en) 2017-02-28 2023-12-26 Purdue Research Foundation Compositions and methods for CAR T cell therapy
EP3601561A2 (en) 2017-03-22 2020-02-05 Novartis AG Compositions and methods for immunooncology
US11104737B2 (en) 2017-03-28 2021-08-31 Rigel Pharmaceuticals, Inc. ACVR2A-specific antibody and method of treatment of muscle atrophy
JP7249287B2 (ja) 2017-03-31 2023-03-30 ザ・ボード・オブ・トラスティーズ・オブ・ザ・リーランド・スタンフォード・ジュニア・ユニバーシティ Ｔ細胞受容体シグナル伝達を阻害または調節することによって、ｔ細胞枯渇を処置する方法
JP2020517259A (ja) 2017-04-19 2020-06-18 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 操作された抗原受容体を発現する免疫細胞
CN110650975B (zh) 2017-05-15 2024-04-05 美国卫生和人力服务部 双顺反子嵌合抗原受体及其用途
KR20200041834A (ko) * 2017-06-01 2020-04-22 젠코어 인코포레이티드 Cd123 및 cd3에 결합하는 이중특이성 항체
US11434290B2 (en) 2017-06-08 2022-09-06 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Chimeric antigen receptors with enhanced NFκB signaling
MA49517A (fr) 2017-06-30 2020-05-06 Xencor Inc Protéines de fusion fc hétérodimères ciblées contenant il-15/il-15ra et domaines de liaison à l'antigène
US11976121B2 (en) 2017-07-20 2024-05-07 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. CD123-binding chimeric antigen receptors
CN109423495A (zh) * 2017-08-24 2019-03-05 上海恒润达生生物科技有限公司 一种双靶向嵌合抗原受体及其用途
CA3070861A1 (en) * 2017-09-22 2019-03-28 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Chimeric antigen receptors with enhanced nfkb signaling
EP3688143A4 (en) * 2017-09-26 2021-09-22 Longwood University CHEMICAL ANTIGEN RECEPTOR SPECIFIC TO PD-1 AS AN IMMUNOTHERAPY
WO2019072824A1 (en) * 2017-10-09 2019-04-18 Cellectis IMPROVED ANTI-CD123 CAR IN UNIVERSAL MODIFIED IMMUNE T LYMPHOCYTES
BR112020007576A2 (pt) 2017-10-18 2020-09-24 Novartis Ag composições e métodos para degradação de proteína seletiva
CN109694854B (zh) * 2017-10-20 2023-11-21 亘喜生物科技（上海）有限公司 通用型嵌合抗原受体t细胞制备技术
BR112020007710A2 (pt) 2017-10-25 2020-10-20 Novartis Ag métodos para produzir células que expressam receptor de antígeno quimérico
CN111542596B (zh) 2017-11-01 2025-01-14 朱诺治疗学股份有限公司 产生工程化细胞的治疗性组合物的方法
WO2019089858A2 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Methods of assessing or monitoring a response to a cell therapy
CN112272563A (zh) 2017-11-08 2021-01-26 Xencor股份有限公司 使用新颖抗pd-1序列的双特异性和单特异性抗体
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
CA3083949A1 (en) * 2017-11-30 2020-06-06 Novartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, and uses thereof
JP2021508317A (ja) 2017-12-01 2021-03-04 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 遺伝子操作された細胞の投与および調節のための方法
AU2018379094A1 (en) 2017-12-08 2020-06-25 Juno Therapeutics, Inc. Phenotypic markers for cell therapy and related methods
EP3728302A1 (en) 2017-12-19 2020-10-28 Xencor, Inc. Engineered il-2 fc fusion proteins
JP7394058B2 (ja) 2017-12-21 2023-12-07 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 新規抗原結合部分の特異性試験のためのユニバーサルレポーター細胞アッセイ
CN111492243B (zh) * 2017-12-21 2024-11-01 豪夫迈·罗氏有限公司 用于新颖抗原结合模块的特异性测试的car-t细胞测定法
US11701387B2 (en) * 2018-01-04 2023-07-18 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Chimeric antigen receptor specific for BDCA2 antigen
AU2019209432A1 (en) 2018-01-22 2020-08-06 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Methods of use for CAR T cells
CN111989108B (zh) 2018-02-13 2024-07-16 嵌合体生物工程公司 利用rna去稳定元件协调基因表达
TW202000229A (zh) 2018-02-23 2020-01-01 美商安德賽特公司 Car t細胞療法之順序方法
WO2019166453A1 (en) * 2018-03-01 2019-09-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Specificity assay for novel target antigen binding moieties
US20190284288A1 (en) * 2018-03-19 2019-09-19 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for t-cell and cytokine activation
WO2019195623A2 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
WO2019195586A1 (en) 2018-04-06 2019-10-10 The Regents Of The University Of California Methods of treating egfrviii expressing glioblastomas
CA3097741A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Tim-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and tim-3 antigen binding domains
CN112867734A (zh) 2018-04-18 2021-05-28 Xencor股份有限公司 包含IL-15/IL-15Ra Fc融合蛋白和PD-1抗原结合结构域的靶向PD-1的异源二聚体融合蛋白及其用途
WO2019210153A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
US20210396739A1 (en) 2018-05-01 2021-12-23 Novartis Ag Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
WO2019227003A1 (en) 2018-05-25 2019-11-28 Novartis Ag Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
US20210123075A1 (en) 2018-06-08 2021-04-29 Novartis Ag Compositions and methods for immunooncology
WO2019241315A1 (en) 2018-06-12 2019-12-19 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
AU2019284911A1 (en) 2018-06-13 2020-12-17 Novartis Ag BCMA chimeric antigen receptors and uses thereof
EP3817767A1 (en) * 2018-07-02 2021-05-12 Cellectis Chimeric antigen receptors (car)-expressing cells and combination treatment for immunotherapy of patients with relapse refractory adverse genetic risk aml
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
US20210275589A1 (en) * 2018-07-13 2021-09-09 Nanjing Legend Biotech Co. Ltd. Co-receptor systems for treating infectious diseases
WO2020027094A1 (ja) 2018-07-31 2020-02-06 サイアス株式会社 ｉＰＳ細胞を介して再生Ｔ細胞集団を製造する方法
KR20240046632A (ko) * 2018-08-01 2024-04-09 난트퀘스트, 인크. 면역 요법의 안정한 유전적 변형을 위한 귀소 수용체 또는 사이토카인, 및 키메라 항원 수용체를 포함하는 4 시스트론 시스템
WO2020027832A1 (en) * 2018-08-01 2020-02-06 Nantkwest, Inc. Chemokine responsive activated natural killer cells with secondary homing activation for verified targets
WO2020047449A2 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
WO2020047452A2 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
US20210363245A1 (en) * 2018-09-17 2021-11-25 The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Services Bicistronic chimeric antigen receptors targeting cd19 and cd20 and their uses
CN113260630B (zh) 2018-09-20 2024-05-24 莱蒂恩技术公司 用于用抗cd123免疫治疗来治疗癌症的组合物和方法
CN113416251B (zh) * 2018-09-26 2022-05-17 重庆精准生物技术有限公司 抗cd123人源化单链抗体及其应用
WO2020072821A2 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Xencor, Inc. Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
US20210386788A1 (en) 2018-10-24 2021-12-16 Obsidian Therapeutics, Inc. Er tunable protein regulation
WO2020092736A1 (en) * 2018-10-31 2020-05-07 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for treating cancer
EP3873500A4 (en) 2018-10-31 2023-01-11 Mayo Foundation for Medical Education and Research CANCER TREATMENT METHODS AND MATERIALS
WO2020125806A1 (en) 2018-12-17 2020-06-25 Shanghai United Imaging Intelligence Co., Ltd. Systems and methods for image segmentation
CN109754394B (zh) * 2018-12-28 2021-02-23 上海联影智能医疗科技有限公司 三维医学图像处理装置及方法
CN113271945A (zh) 2018-12-20 2021-08-17 诺华股份有限公司 包含3-(1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物的给药方案和药物组合
CN113490528B (zh) 2019-02-15 2024-12-03 诺华股份有限公司 3-(1-氧代-5-(哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物及其用途
ES2982474T3 (es) 2019-02-15 2024-10-16 Novartis Ag Derivados de 3-(1-oxoisoindolin-2-il)piperidin-1,6-diona sustituidos y usos de estos
CN109777783B (zh) * 2019-02-20 2023-07-04 上海尚泰生物技术有限公司 表达cxcr2的car-nk92细胞、制备方法及其应用
WO2020172553A1 (en) 2019-02-22 2020-08-27 Novartis Ag Combination therapies of egfrviii chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors
EP3930763A1 (en) 2019-02-25 2022-01-05 Novartis AG Mesoporous silica particles compositions for viral delivery
US11472890B2 (en) 2019-03-01 2022-10-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind ENPP3 and CD3
WO2020198678A1 (en) * 2019-03-27 2020-10-01 University Of Virginia Patent Foundation Priming with targeted activated t cells can enhance chemo responsiveness of cancer cells
EP3952886A1 (en) 2019-04-10 2022-02-16 Elevatebio Technologies, Inc Flt3-specific chimeric antigen receptors and methods of using the same
WO2020210665A1 (en) * 2019-04-12 2020-10-15 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Chimeric antigen receptors with cd20 safety switch
EP3953455A1 (en) 2019-04-12 2022-02-16 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
WO2020219742A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
TWI865517B (zh) * 2019-04-26 2024-12-11 美商艾洛基因醫療公司 抗利妥昔單抗嵌合抗原受體及其用途
CN114040926A (zh) 2019-05-04 2022-02-11 印希比股份有限公司 结合cd123的多肽及其用途
KR20220010544A (ko) 2019-05-21 2022-01-25 노파르티스 아게 Cd19 결합 분자 및 이의 용도
EP3984549A4 (en) 2019-06-14 2023-08-02 Thyas Co. Ltd. Medicinal composition
WO2021034653A1 (en) 2019-08-18 2021-02-25 Chimera Bioengineering, Inc. Combination therapy with gold controlled transgenes
MX2022002363A (es) * 2019-08-27 2022-06-14 Janssen Biotech Inc Sistema receptor de antígeno quimérico y usos de este.
WO2021046451A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Obsidian Therapeutics, Inc. Compositions and methods for dhfr tunable protein regulation
WO2021092560A1 (en) * 2019-11-08 2021-05-14 Humanigen, Inc. Epha3 directed car-t cells for treatment of tumors
EP4065158A2 (en) 2019-11-26 2022-10-05 Novartis AG Chimeric antigen receptors binding bcma and cd19 and uses thereof
WO2021108613A1 (en) 2019-11-26 2021-06-03 Novartis Ag Cd19 and cd22 chimeric antigen receptors and uses thereof
US10980836B1 (en) 2019-12-11 2021-04-20 Myeloid Therapeutics, Inc. Therapeutic cell compositions and methods of manufacturing and use thereof
KR20220116522A (ko) 2019-12-20 2022-08-23 노파르티스 아게 증식성 질환의 치료를 위한 항-tgf-베타 항체 및 체크포인트 억제제의 용도
WO2021146590A2 (en) * 2020-01-17 2021-07-22 Aetio Biotherapy, Inc. Pro-antibody that reduces off-target toxicity
IL295878A (en) 2020-02-27 2022-10-01 Novartis Ag Methods for producing cells expressing a chimeric antigen receptor
IL295604A (en) 2020-02-27 2022-10-01 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
US20210277149A1 (en) * 2020-03-06 2021-09-09 Mustang Bio, Inc. Anti-idiotype antibodies and methods of using the same
CN113493521B (zh) * 2020-04-03 2023-05-05 重庆精准生物技术有限公司 靶向cd19和cd123的双靶点嵌合抗原受体及其应用
CN113493522B (zh) * 2020-04-03 2023-04-28 重庆精准生物技术有限公司 双特异性嵌合抗原受体及其应用
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
CA3186600A1 (en) 2020-06-08 2021-12-16 Janssen Biotech, Inc. Cell-based assay for determining the in vitro tumor killing activity of chimeric antigen expressing immune cells
EP4165169A1 (en) 2020-06-11 2023-04-19 Novartis AG Zbtb32 inhibitors and uses thereof
CA3187944A1 (en) 2020-06-22 2021-12-30 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Lair-1-binding agents and methods of use thereof
JP2023531676A (ja) 2020-06-23 2023-07-25 ノバルティス アーゲー ３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピぺリジン－２，６－ジオン誘導体を含む投与レジメン
KR20230152783A (ko) 2020-07-07 2023-11-03 칸큐어 엘엘씨 Mic 항체 및 결합제 및 이의 사용 방법
JP2023536164A (ja) 2020-08-03 2023-08-23 ノバルティス アーゲー ヘテロアリール置換３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用
CN111995688B (zh) * 2020-08-13 2024-01-16 金鑫 靶向cd123和nkg2d配体的双特异嵌合抗原受体及应用
IL300666A (en) 2020-08-19 2023-04-01 Xencor Inc ANTI–CD28 COMPOSITIONS
MX2023002107A (es) 2020-08-21 2023-03-15 Novartis Ag Composiciones y metodos para la generacion in vivo de celulas que expresan car.
WO2022098905A2 (en) 2020-11-04 2022-05-12 Myeloid Therapeutics, Inc. Engineered chimeric fusion protein compositions and methods of use thereof
JP2023549504A (ja) 2020-11-13 2023-11-27 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体（ｃａｒ）発現細胞との組合せ療法
JP2024500847A (ja) 2020-12-18 2024-01-10 センチュリー セラピューティクス，インコーポレイテッド 適合可能な受容体特異性を有するキメラ抗原受容体システム
CN117062611A (zh) 2021-01-26 2023-11-14 惠和生物技术(上海)有限公司 嵌合抗原受体（car）构建体和表达car构建体的nk细胞
EP4305067A1 (en) 2021-03-09 2024-01-17 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
WO2022192586A1 (en) 2021-03-10 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and gpc3
EP4308133A4 (en) 2021-03-17 2025-01-22 Myeloid Therapeutics Inc MODIFIED CHIMERIC FUSION PROTEIN COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
WO2022229853A1 (en) 2021-04-27 2022-11-03 Novartis Ag Viral vector production system
WO2022250431A1 (ko) 2021-05-25 2022-12-01 주식회사 박셀바이오 모노바디 기반 키메라 항원 수용체 및 이를 포함하는 면역 세포
US20240366667A1 (en) * 2021-06-21 2024-11-07 Westlake University Disruptions of pdcd1, adora2a, and ctla4 genes and uses thereof
JP2024528086A (ja) * 2021-07-29 2024-07-26 ブイオーアール バイオファーマ インコーポレーテッド がん治療用キメラ抗原受容体
CN114933654B (zh) * 2021-08-16 2024-09-06 上海优替济生生物医药有限公司 靶向cd123的抗体、嵌合抗原受体及其用途
EP4388000A1 (en) 2021-08-20 2024-06-26 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor?expressing cells
US20230338424A1 (en) * 2022-03-02 2023-10-26 Lentigen Technology, Inc. Compositions and Methods for Treating Cancer with Anti-CD123 Immunotherapy
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors
WO2024089639A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Novartis Ag Lentiviral formulations
WO2024094004A1 (zh) * 2022-11-03 2024-05-10 重庆精准生物技术有限公司 靶向cd123的全人源抗体及其应用
US20240262899A1 (en) * 2023-01-12 2024-08-08 University Of Virginia Patent Foundation Anti-cith3 antibodies and uses thereof
CN116836282B (zh) * 2023-02-13 2024-03-29 北京艺妙神州医药科技有限公司 抗体、嵌合抗原受体及其用途
TW202500126A (zh) 2023-05-24 2025-01-01 美商金橘生物科技公司 雜環化合物及其用途
CN116990504B (zh) * 2023-09-27 2023-12-01 苏州旭光科星抗体生物科技有限公司 检测人可溶性cd4的双抗体夹心酶联免疫试剂盒

Family Cites Families (410)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA737247B (en) 1972-09-29 1975-04-30 Ayerst Mckenna & Harrison Rapamycin and process of preparation
US4433059A (en) 1981-09-08 1984-02-21 Ortho Diagnostic Systems Inc. Double antibody conjugate
US4444878A (en) 1981-12-21 1984-04-24 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Bispecific antibody determinants
GB2116183B (en) 1982-03-03 1985-06-05 Genentech Inc Human antithrombin iii dna sequences therefore expression vehicles and cloning vectors containing such sequences and cell cultures transformed thereby a process for expressing human antithrombin iii and pharmaceutical compositions comprising it
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5869620A (en) 1986-09-02 1999-02-09 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US5906936A (en) 1988-05-04 1999-05-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Endowing lymphocytes with antibody specificity
JPH021556A (ja) 1988-06-09 1990-01-05 Snow Brand Milk Prod Co Ltd ハイブリッド抗体及びその作製方法
ATE151110T1 (de) 1988-09-02 1997-04-15 Protein Eng Corp Herstellung und auswahl von rekombinantproteinen mit verschiedenen bindestellen
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US6303121B1 (en) 1992-07-30 2001-10-16 Advanced Research And Technology Method of using human receptor protein 4-1BB
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
AU6290090A (en) 1989-08-29 1991-04-08 University Of Southampton Bi-or trispecific (fab)3 or (fab)4 conjugates
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5273743A (en) 1990-03-09 1993-12-28 Hybritech Incorporated Trifunctional antibody-like compounds as a combined diagnostic and therapeutic agent
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9012995D0 (en) 1990-06-11 1990-08-01 Celltech Ltd Multivalent antigen-binding proteins
WO1992020791A1 (en) 1990-07-10 1992-11-26 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
DK0564531T3 (da) 1990-12-03 1998-09-28 Genentech Inc Berigelsesfremgangsmåde for variantproteiner med ændrede bindingsegenskaber
US5582996A (en) 1990-12-04 1996-12-10 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Bifunctional antibodies and method of preparing same
US6319494B1 (en) 1990-12-14 2001-11-20 Cell Genesys, Inc. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
CA2074825C (en) 1990-12-14 2005-04-12 Daniel J. Capon Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
CA2105300C (en) 1991-03-01 2008-12-23 Robert C. Ladner Process for the development of binding mini-proteins
US7049136B2 (en) 1991-03-07 2006-05-23 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
IE920716A1 (en) 1991-03-07 1992-09-09 Gen Hospital Corp Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
US6004811A (en) 1991-03-07 1999-12-21 The Massachussetts General Hospital Redirection of cellular immunity by protein tyrosine kinase chimeras
EP0580737B1 (en) 1991-04-10 2004-06-16 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
AU1784992A (en) 1991-04-19 1992-11-17 Schering Corporation Subunit of the human interleukin-3 receptor
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
US5199942A (en) 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
US6511663B1 (en) 1991-06-11 2003-01-28 Celltech R&D Limited Tri- and tetra-valent monospecific antigen-binding proteins
WO1992022653A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
EP1291360A1 (en) 1991-12-13 2003-03-12 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
ATE151113T1 (de) 1992-01-23 1997-04-15 Merck Patent Gmbh Fusionsproteine von monomeren und dimeren von antikörperfragmenten
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
US8211422B2 (en) 1992-03-18 2012-07-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric receptor genes and cells transformed therewith
IL104570A0 (en) 1992-03-18 1993-05-13 Yeda Res & Dev Chimeric genes and cells transformed therewith
WO1993023537A1 (en) 1992-05-08 1993-11-25 Creative Biomolecules Chimeric multivalent protein analogues and methods of use thereof
DE69334305D1 (de) 1992-08-21 2010-01-28 Univ Bruxelles Immunoglobuline ohne leichte Ketten
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
US5350674A (en) 1992-09-04 1994-09-27 Becton, Dickinson And Company Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
CA2145278C (en) 1992-09-25 2009-03-10 Peter J. Hudson Target binding polypeptide
GB9221220D0 (en) 1992-10-09 1992-11-25 Sandoz Ag Organic componds
GB9221657D0 (en) 1992-10-15 1992-11-25 Scotgen Ltd Recombinant bispecific antibodies
WO1994009817A1 (en) 1992-11-04 1994-05-11 City Of Hope Novel antibody construct
GB9323648D0 (en) 1992-11-23 1994-01-05 Zeneca Ltd Proteins
ATE199392T1 (de) 1992-12-04 2001-03-15 Medical Res Council Multivalente und multispezifische bindungsproteine, deren herstellung und verwendung
US7211259B1 (en) 1993-05-07 2007-05-01 Immunex Corporation 4-1BB polypeptides and DNA encoding 4-1BB polypeptides
US6476198B1 (en) 1993-07-13 2002-11-05 The Scripps Research Institute Multispecific and multivalent antigen-binding polypeptide molecules
US5635602A (en) 1993-08-13 1997-06-03 The Regents Of The University Of California Design and synthesis of bispecific DNA-antibody conjugates
WO1995009917A1 (en) 1993-10-07 1995-04-13 The Regents Of The University Of California Genetically engineered bispecific tetravalent antibodies
EP0729471A1 (en) 1993-11-19 1996-09-04 Abbott Laboratories Semisynthetic analogs of rapamycin (macrolides) being immunomodulators
PL314238A1 (en) 1993-12-17 1996-09-02 Sandoz Ltd Rapamycin derivatives
US5362718A (en) 1994-04-18 1994-11-08 American Home Products Corporation Rapamycin hydroxyesters
NZ285395A (en) 1994-05-02 1998-10-28 Novartis Ag Chimeric antibody, cancer treatment
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5786464C1 (en) 1994-09-19 2012-04-24 Gen Hospital Corp Overexpression of mammalian and viral proteins
EP0787185A2 (en) 1994-10-20 1997-08-06 MorphoSys AG Targeted hetero-association of recombinant proteins to multi-functional complexes
US5712149A (en) 1995-02-03 1998-01-27 Cell Genesys, Inc. Chimeric receptor molecules for delivery of co-stimulatory signals
US6103521A (en) 1995-02-06 2000-08-15 Cell Genesys, Inc. Multispecific chimeric receptors
RU2167676C2 (ru) 1995-02-24 2001-05-27 Дзе Дженерал Хоспитал Корпорейшн Перенаправление клеточного иммунитета посредством химерных рецепторов
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
DE69633175T2 (de) 1995-05-23 2005-08-11 Morphosys Ag Multimere proteine
SK284529B6 (sk) 1995-06-09 2005-05-05 Novartis Ag Deriváty rapamycínu, spôsob ich prípravy, farmaceutická kompozícia s ich obsahom a súprava alebo balenie na použitie pri imunosupresii, zápale alebo infekciách
BE1009856A5 (fr) 1995-07-14 1997-10-07 Sandoz Sa Composition pharmaceutique sous la forme d'une dispersion solide comprenant un macrolide et un vehicule.
EP0799244A1 (en) 1995-10-16 1997-10-08 Unilever N.V. A bifunctional or bivalent antibody fragment analogue
GB9526131D0 (en) 1995-12-21 1996-02-21 Celltech Therapeutics Ltd Recombinant chimeric receptors
WO1997024373A1 (en) 1995-12-29 1997-07-10 Medvet Science Pty. Limited Monoclonal antibody antagonists to haemopoietic growth factors
US5874240A (en) 1996-03-15 1999-02-23 Human Genome Sciences, Inc. Human 4-1BB receptor splicing variant
AU2507397A (en) 1996-04-04 1997-10-29 Unilever Plc Multivalent and multispecific antigen-binding protein
AU735648B2 (en) 1996-07-12 2001-07-12 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Materials and method for treating or preventing pathogenic fungal infection
DE69738749D1 (de) 1996-08-16 2008-07-17 Schering Corp Zelloberflächen-antigen aus säugetieren und verwandte reagenzien
US6111090A (en) 1996-08-16 2000-08-29 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
US6114148C1 (en) 1996-09-20 2012-05-01 Gen Hospital Corp High level expression of proteins
JP2002512502A (ja) 1996-10-25 2002-04-23 セル・ジェネシス・インコーポレイテッド 癌細胞の標的細胞溶解
DE69835143T2 (de) 1997-01-21 2007-06-06 The General Hospital Corp., Boston Selektion von proteinen mittels rns-protein fusionen
JP2002505574A (ja) 1997-04-30 2002-02-19 エンゾン，インコーポレイテッド ポリアルキレンオキシド修飾された単鎖ポリペプチド
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US20030207346A1 (en) 1997-05-02 2003-11-06 William R. Arathoon Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
EP1012280B1 (en) 1997-06-11 2004-11-10 Borean Pharma A/S Trimerising module
DE69839147T2 (de) 1997-06-12 2009-02-19 Novartis International Pharmaceutical Ltd. Künstliche antikörperpolypeptide
US20030060444A1 (en) 1997-06-25 2003-03-27 Celltech Therapeutics, Ltd. Cell activation process and reagents therefor
GB9713473D0 (en) 1997-06-25 1997-09-03 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US6015815A (en) 1997-09-26 2000-01-18 Abbott Laboratories Tetrazole-containing rapamycin analogs with shortened half-lives
TW557297B (en) 1997-09-26 2003-10-11 Abbott Lab Rapamycin analogs having immunomodulatory activity, and pharmaceutical compositions containing same
WO1999020758A1 (en) 1997-10-21 1999-04-29 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor-like proteins tr11, tr11sv1, and tr11sv2
DE69841562D1 (de) 1997-10-27 2010-04-29 Bac Ip Bv Multivalente antigenbindende proteine
EP1049787B1 (en) 1998-01-23 2004-11-24 Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie Multipurpose antibody derivatives
JP2002502607A (ja) 1998-02-09 2002-01-29 ジェネンテク・インコーポレイテッド 新規な腫瘍壊死因子レセプター相同体及びそれをコードする核酸
CZ121599A3 (cs) 1998-04-09 1999-10-13 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů, způsob její přípravy a léčivo obsahující tuto molekulu
ES2246567T3 (es) 1998-04-15 2006-02-16 Brigham & Womens Hospital Composiciones para receptores inhibidores de celulas t y usos de las mismas.
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
GB9809658D0 (en) 1998-05-06 1998-07-01 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
GB9812545D0 (en) 1998-06-10 1998-08-05 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
ES2207278T3 (es) 1998-07-28 2004-05-16 Micromet Ag Heterominicuerpos.
EP1109921A4 (en) 1998-09-04 2002-08-28 Sloan Kettering Inst Cancer FUSION RECEPTORS SPECIFIC TO MEMBRANE SPECIFIC PROSTATIC ANTIGEN AND USES THEREOF
AU2472400A (en) 1998-10-20 2000-05-08 City Of Hope CD20-specific redirected T cells and their use in cellular immunotherapy of CD20+ malignancies
US6333396B1 (en) 1998-10-20 2001-12-25 Enzon, Inc. Method for targeted delivery of nucleic acids
JP2002541845A (ja) 1999-04-16 2002-12-10 セルテック セラピューティックス リミテッド 合成膜貫通成分
US7534866B2 (en) 2005-10-19 2009-05-19 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating bioactive assemblies of increased complexity and uses
US7527787B2 (en) 2005-10-19 2009-05-05 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
CA2378179A1 (en) 1999-07-12 2001-01-18 Genentech, Inc. Promotion or inhibition of angiogenesis and cardiovascularization by tumor necrosis factor ligand/receptor homologs
CN1293081C (zh) 1999-08-24 2007-01-03 阿里亚德基因治疗公司 28－表雷帕霉素类似物,其制备方法，药物组合物和用途
AU1086501A (en) 1999-10-15 2001-04-30 Carnegie Institution Of Washington Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
GB9925848D0 (en) 1999-11-01 1999-12-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
CA2406864A1 (en) 2000-02-24 2001-08-30 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
ATE510855T1 (de) 2000-03-06 2011-06-15 Univ Kentucky Res Found Verwendung eines antikörpers oder eines immunotoxins, der bzw. das selektiv an cd123 bindet zur beeinträchtigung hämatologischer krebs-vorläuferzellen
PT2857516T (pt) 2000-04-11 2017-08-28 Genentech Inc Anticorpos multivalentes e utilizações dos mesmos
US20020103345A1 (en) 2000-05-24 2002-08-01 Zhenping Zhu Bispecific immunoglobulin-like antigen binding proteins and method of production
IL136511A0 (en) 2000-06-01 2001-06-14 Gavish Galilee Bio Appl Ltd Genetically engineered mhc molecules
AU2001275474A1 (en) 2000-06-12 2001-12-24 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
WO2002002781A1 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Heterodimeric fusion proteins
US20020076406A1 (en) 2000-07-25 2002-06-20 Leung Shui-On Multivalent target binding protein
GB0025307D0 (en) 2000-10-16 2000-11-29 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
CN1308447C (zh) 2000-10-20 2007-04-04 中外制药株式会社 低分子化的激动剂抗体
CA2427858A1 (en) * 2000-11-03 2002-05-10 University Of Vermont And State Agricultural College Compositions for inhibiting grb7
ATE338124T1 (de) 2000-11-07 2006-09-15 Hope City Cd19-spezifische umgezielte immunzellen
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
AU2002247826A1 (en) 2001-03-13 2002-09-24 University College London Specific binding members
US7070995B2 (en) 2001-04-11 2006-07-04 City Of Hope CE7-specific redirected immune cells
CN1294148C (zh) 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
US7514537B2 (en) 2001-04-30 2009-04-07 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human gliomas
US20090257994A1 (en) 2001-04-30 2009-10-15 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
US20030171546A1 (en) 2001-04-30 2003-09-11 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
DK1399484T3 (da) 2001-06-28 2010-11-08 Domantis Ltd Dobbelt-specifik ligand og anvendelse af denne
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
CA2763913C (en) 2001-08-10 2014-10-28 Aberdeen University Antigen binding domains
EP1293514B1 (en) 2001-09-14 2006-11-29 Affimed Therapeutics AG Multimeric single chain tandem Fv-antibodies
DK1438400T3 (da) 2001-10-01 2009-10-05 Dyax Corp Flerkædede eukaryote display-vektorer og anvendelser deraf
US20030148982A1 (en) 2001-11-13 2003-08-07 Brenner Malcolm K. Bi-spcific chimeric T cells
AU2002357072A1 (en) 2001-12-07 2003-06-23 Centocor, Inc. Pseudo-antibody constructs
US7745140B2 (en) 2002-01-03 2010-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool
US7638325B2 (en) 2002-01-03 2009-12-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform
US7638326B2 (en) 2002-01-03 2009-12-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform
IL162734A0 (en) 2002-02-01 2005-11-20 Ariad Gene Therapeutics Inc Phosphorus-containing compounds & uses thereof
CA2478011C (en) 2002-03-01 2013-05-21 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
GB0208104D0 (en) 2002-04-09 2002-05-22 Univ Dundee Method
EP1500665B1 (en) 2002-04-15 2011-06-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha METHODS FOR CONSTRUCTING scDb LIBRARIES
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
US20040047858A1 (en) 2002-09-11 2004-03-11 Blumberg Richard S. Therapeutic anti-BGP(C-CAM1) antibodies and uses thereof
US7488802B2 (en) 2002-12-23 2009-02-10 Wyeth Antibodies against PD-1
GB0230203D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Fc fusion
US20050129671A1 (en) 2003-03-11 2005-06-16 City Of Hope Mammalian antigen-presenting T cells and bi-specific T cells
GB0305702D0 (en) 2003-03-12 2003-04-16 Univ Birmingham Bispecific antibodies
US20050003403A1 (en) 2003-04-22 2005-01-06 Rossi Edmund A. Polyvalent protein complex
WO2004107618A2 (en) 2003-05-23 2004-12-09 Wyeth Gitr ligand and gitr ligand-related molecules and antibodies and uses thereof
US20050163782A1 (en) 2003-06-27 2005-07-28 Biogen Idec Ma Inc. Modified binding molecules comprising connecting peptides
EP1638510B1 (en) 2003-07-01 2015-09-02 Immunomedics, Inc. Multivalent carriers of bi-specific antibodies
EP1660126A1 (en) 2003-07-11 2006-05-31 Schering Corporation Agonists or antagonists of the clucocorticoid-induced tumour necrosis factor receptor (gitr) or its ligand for the treatment of immune disorders, infections and cancer
US7696322B2 (en) 2003-07-28 2010-04-13 Catalent Pharma Solutions, Inc. Fusion antibodies
AU2004286198C1 (en) 2003-08-18 2011-02-24 Medimmune, Llc Humanization of antibodies
WO2005019429A2 (en) 2003-08-22 2005-03-03 Potentia Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhancing phagocytosis or phagocyte activity
WO2005035575A2 (en) 2003-08-22 2005-04-21 Medimmune, Inc. Humanization of antibodies
WO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 融合蛋白質組成物
US20050113564A1 (en) 2003-11-05 2005-05-26 St. Jude Children's Research Hospital Chimeric receptors with 4-1BB stimulatory signaling domain
US7435596B2 (en) 2004-11-04 2008-10-14 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Modified cell line and method for expansion of NK cell
US7220755B2 (en) 2003-11-12 2007-05-22 Biosensors International Group, Ltd. 42-O-alkoxyalkyl rapamycin derivatives and compositions comprising same
JP2007518399A (ja) 2003-12-02 2007-07-12 ジェンザイム コーポレイション 肺癌を診断および治療する組成物並びに方法
US20050136051A1 (en) 2003-12-22 2005-06-23 Bernard Scallon Methods for generating multimeric molecules
GB0329825D0 (en) 2003-12-23 2004-01-28 Celltech R&D Ltd Biological products
US20050266425A1 (en) 2003-12-31 2005-12-01 Vaccinex, Inc. Methods for producing and identifying multispecific antibodies
US8383575B2 (en) 2004-01-30 2013-02-26 Paul Scherrer Institut (DI)barnase-barstar complexes
GB0409799D0 (en) 2004-04-30 2004-06-09 Isis Innovation Method of generating improved immune response
WO2005118788A2 (en) 2004-05-27 2005-12-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
WO2006083289A2 (en) 2004-06-04 2006-08-10 Duke University Methods and compositions for enhancement of immunity by in vivo depletion of immunosuppressive cell activity
EP1786918A4 (en) 2004-07-17 2009-02-11 Imclone Systems Inc NEW BISPECIFIC ANTIBODY TETRAVALENT
JP2008511337A (ja) 2004-09-02 2008-04-17 ジェネンテック・インコーポレーテッド ヘテロ多量体分子
US7994298B2 (en) 2004-09-24 2011-08-09 Trustees Of Dartmouth College Chimeric NK receptor and methods for treating cancer
EP1827604B1 (en) 2004-12-10 2019-11-20 Peter MacCallum Cancer Institute Methods and compositions for adoptive immunotherapy
AU2006230099B2 (en) 2005-03-25 2012-04-19 Gitr, Inc. GITR binding molecules and uses therefor
TWI544076B (zh) 2005-03-31 2016-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd A method of manufacturing a polypeptide that controls assembly
EP1874824A4 (en) 2005-04-06 2009-12-30 Ibc Pharmaceuticals Inc METHODS OF GENERATING STABLE COMPOUND RELATED COMPLEXES OF HOMODIMERS, HOMOTRATEERS OR DIMER SIZES AND USES THEREOF
CA2605024C (en) 2005-04-15 2018-05-22 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
CN109485727A (zh) 2005-05-09 2019-03-19 小野药品工业株式会社 程序性死亡-1(pd-1)的人单克隆抗体及使用抗pd-1抗体来治疗癌症的方法
PT1899364T (pt) 2005-05-17 2020-05-20 Univ Connecticut Composições e métodos para imunomodulação num organismo
GB0510390D0 (en) 2005-05-20 2005-06-29 Novartis Ag Organic compounds
US20060263367A1 (en) 2005-05-23 2006-11-23 Fey Georg H Bispecific antibody devoid of Fc region and method of treatment using same
CN105330741B (zh) 2005-07-01 2023-01-31 E.R.施贵宝&圣斯有限责任公司 抗程序性死亡配体1(pd-l1)的人单克隆抗体
US20070036773A1 (en) 2005-08-09 2007-02-15 City Of Hope Generation and application of universal T cells for B-ALL
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
WO2007024715A2 (en) 2005-08-19 2007-03-01 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
ATE452913T1 (de) 2005-08-26 2010-01-15 Pls Design Gmbh Bivalente igy antikörperkonstrukte für diagnostische und therapeutische anwendungen
EP2364974A1 (en) 2005-10-07 2011-09-14 Exelixis, Inc. N-(3-Phenylamino-quinoxalin-2-yl)-benzenesulfonamide derivatives as phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors
WO2007044887A2 (en) 2005-10-11 2007-04-19 Transtarget, Inc. Method for producing a population of homogenous tetravalent bispecific antibodies
WO2007062466A1 (en) 2005-11-29 2007-06-07 The University Of Sydney Demibodies: dimerisation-activated therapeutic agents
MX2008007056A (es) 2005-12-02 2008-11-12 Sinai School Medicine Virus quimericos que presentan proteinas de superficie no nativas y usos de los mismos.
JP5709356B2 (ja) 2006-01-13 2015-04-30 アメリカ合衆国 哺乳動物細胞における発現のためのコドン最適化ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒ−α遺伝子
WO2007133822A1 (en) 2006-01-19 2007-11-22 Genzyme Corporation Gitr antibodies for the treatment of cancer
JP2009526857A (ja) 2006-02-15 2009-07-23 イムクローン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 機能性抗体
NZ591252A (en) 2006-03-17 2012-06-29 Biogen Idec Inc Methods of designing antibody or antigen binding fragments thereof with substituted non-covarying amino acids
WO2007112362A2 (en) 2006-03-24 2007-10-04 The Regents Of The University Of California Construction of a multivalent scfv through alkyne-azide 1,3-dipolar cycloaddition
EP1999154B1 (en) 2006-03-24 2012-10-24 Merck Patent GmbH Engineered heterodimeric protein domains
EP4218801A3 (en) 2006-03-31 2023-08-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
EP2799449A1 (en) 2006-05-25 2014-11-05 Bayer Intellectual Property GmbH Dimeric molecular complexes
US20070274985A1 (en) 2006-05-26 2007-11-29 Stefan Dubel Antibody
CA2654317A1 (en) 2006-06-12 2007-12-21 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Single-chain multivalent binding proteins with effector function
JP5959795B2 (ja) 2006-08-18 2016-08-02 アーメイゲン・テクノロジーズ・インコーポレイテッドＡｒｍａｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． 血液脳関門送達のための物質
ES2399075T3 (es) 2006-08-30 2013-03-25 Genentech, Inc. Anticuerpos multiespecíficos
US20100105136A1 (en) 2006-10-09 2010-04-29 The General Hospital Corporation Chimeric t-cell receptors and t-cells targeting egfrviii on tumors
KR20090105913A (ko) 2006-11-02 2009-10-07 다니엘 제이 카폰 이동 부분을 갖는 하이브리드 면역글로불린
US20080131415A1 (en) 2006-11-30 2008-06-05 Riddell Stanley R Adoptive transfer of cd8 + t cell clones derived from central memory cells
WO2008140621A2 (en) 2006-12-21 2008-11-20 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Transgenic oncolytic viruses and uses thereof
ES2667863T3 (es) 2007-03-29 2018-05-14 Genmab A/S Anticuerpos biespecíficos y métodos de producción de los mismos
ES2398760T3 (es) 2007-03-30 2013-03-21 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Expresión constitutiva de ligandos coestimuladores en linfocitos T transferidos de forma adoptiva
WO2008127735A1 (en) 2007-04-13 2008-10-23 Stemline Therapeutics, Inc. Il3ralpha antibody conjugates and uses thereof
WO2008131242A1 (en) 2007-04-18 2008-10-30 Zymogenetics, Inc. Single chain fc, methods of making and methods of treatment
CN104945508B (zh) 2007-06-18 2019-02-22 默沙东有限责任公司 针对人程序性死亡受体pd-1的抗体
NZ703668A (en) 2007-06-27 2016-07-29 Us Sec Dep Of Health And Human Services Complexes of il-15 and il-15ralpha and uses thereof
AU2008275589B2 (en) 2007-07-12 2013-11-21 Gitr, Inc. Combination therapies employing GITR binding molecules
US20090155275A1 (en) 2007-07-31 2009-06-18 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
ES2628395T3 (es) 2007-08-15 2017-08-02 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Anticuerpo regulado por proteasa
EP2212350B1 (en) 2007-10-26 2013-08-28 Governing Council of the University of Toronto Treating chronic viral infection by targetting TIM-3
US20110189203A1 (en) 2007-11-27 2011-08-04 Ablynx N.V. Immunoglobulin constructs
BRPI0819693A2 (pt) 2007-11-30 2020-08-18 Glaxo Group Limited Construção de ligação de antígeno, método para tratar um paciente que sofre de câncer ou uma doença inflamatória, sequência de polinucleotídeo, polinucleotídeo, célula hospedeira transformada ou transfectada recombinante, método para produziruma construção de ligação de antígeno, e, composição farmacêutica
US20110052574A1 (en) 2007-12-06 2011-03-03 Csl Limited Method of inhibition of leukemic stem cells
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
AU2009204501B2 (en) 2008-01-07 2015-02-12 Amgen Inc. Method for making antibody Fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
US10059923B2 (en) 2008-01-30 2018-08-28 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods for off-the-shelf tumor immunotherapy using allogeneic T-cell precursors
CN104548091A (zh) 2008-02-11 2015-04-29 治疗科技公司 用于肿瘤治疗的单克隆抗体
MX2010009156A (es) 2008-02-21 2010-09-09 Astrazeneca Ab Terapia de combinacion 238.
US8379824B2 (en) 2008-03-06 2013-02-19 At&T Intellectual Property I, Lp Methods and apparatus to provide a network-based caller identification service in a voice over internet protocol network
US8168757B2 (en) 2008-03-12 2012-05-01 Merck Sharp & Dohme Corp. PD-1 binding proteins
NZ590667A (en) 2008-07-02 2013-01-25 Emergent Product Dev Seattle Tgf-b antagonist multi-target binding proteins
AR072999A1 (es) 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
PT2350129E (pt) 2008-08-25 2015-10-02 Amplimmune Inc Composições de antagonistas de pd-1 e métodos de utilização
WO2010098788A2 (en) 2008-08-25 2010-09-02 Amplimmune, Inc. Pd-i antagonists and methods for treating infectious disease
ES2961498T3 (es) 2008-08-26 2024-03-12 Hope City Método y composiciones para el funcionamiento mejorado del efecto antitumoral de las células T
JPWO2010030002A1 (ja) 2008-09-12 2012-02-02 国立大学法人三重大学 外来性ｇｉｔｒリガンド発現細胞
US8476282B2 (en) 2008-11-03 2013-07-02 Intellikine Llc Benzoxazole kinase inhibitors and methods of use
EP3929216A1 (en) 2008-12-09 2021-12-29 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-pd-l1 antibodies and their use to enhance t-cell function
WO2010085660A2 (en) 2009-01-23 2010-07-29 Roger Williams Hospital Viral vectors encoding multiple highly homologous non-viral polypeptides and the use of same
EP2987856B1 (en) 2009-02-05 2018-07-25 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Chimeric newcastle disease viruses and uses thereof
EP3192811A1 (en) 2009-02-09 2017-07-19 Université d'Aix-Marseille Pd-1 antibodies and pd-l1 antibodies and uses thereof
US20120070450A1 (en) 2009-03-24 2012-03-22 Riken Leukemia stem cell markers
DK2414362T3 (da) 2009-04-03 2014-09-22 Verastem Inc Pyrimidinsubstituerede purinforbindelser som kinaseinhibitorer
JP5694923B2 (ja) 2009-04-27 2015-04-01 協和発酵キリン株式会社 血液腫瘍治療を目的とした抗ＩＬ−３Ｒα抗体
US9067986B2 (en) 2009-04-27 2015-06-30 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
CN102482354B (zh) 2009-04-30 2015-02-25 特尔汗什莫尔医学基础设施研究和服务公司 抗ceacam1抗体以及使用该抗体的方法
ES2598005T3 (es) 2009-08-14 2017-01-24 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Uso de IL-15 para aumentar la salida del timo y para tratar la linfopenia
KR101790802B1 (ko) 2009-09-03 2017-10-27 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 항-ｇｉｔｒ 항체
CN102665756A (zh) 2009-10-01 2012-09-12 Csl有限公司 费城染色体阳性白血病的治疗方法
EP2483301A1 (en) 2009-10-01 2012-08-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department of Health and Human Services Anti-vascular endothelial growth factor receptor-2 chimeric antigen receptors and use of same for the treatment of cancer
WO2011059836A2 (en) 2009-10-29 2011-05-19 Trustees Of Dartmouth College T cell receptor-deficient t cell compositions
GB0919054D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Isis Innovation Treatment of obesity
SI2496698T1 (sl) 2009-11-03 2019-07-31 City Of Hope Skrajšan epiderimalni receptor faktorja rasti (EGFRt) za selekcijo transduciranih T celic
US8956828B2 (en) 2009-11-10 2015-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
EP2504028A4 (en) 2009-11-24 2014-04-09 Amplimmune Inc SIMULTANEOUS INHIBITION OF PD-L1 / PD-L2
EP2332994A1 (en) 2009-12-09 2011-06-15 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Trispecific therapeutics against acute myeloid leukaemia
EA201492253A1 (ru) 2009-12-29 2015-06-30 Эмерджент Продакт Дивелопмент Сиэтл, Ллс Конструкторы, связывающиеся с ron, и способы их использования
EP2531216B1 (en) 2010-02-04 2019-03-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Icos critically regulates the expansion and function of inflammatory human th17 cells
BR112012026766B1 (pt) 2010-04-20 2021-11-03 Genmab A/S Métodos in vitro para gerar um anticorpo igg heterodimérico, para a seleção de um anticorpo biespecífico, vetor de expressão, anticorpo igg heterodimérico, composição farmacêutica, e, uso de um anticorpo igg heterodimérico
AU2011267837B2 (en) 2010-06-15 2016-06-23 Csl Limited Immunotherapeutic method involving CD123 (IL-3Ralpha) antibodies and immunostimulating complex
US9163087B2 (en) 2010-06-18 2015-10-20 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Bi-specific antibodies against TIM-3 and PD-1 for immunotherapy in chronic immune conditions
CA2803900A1 (en) 2010-07-09 2012-01-12 Exelixis, Inc. Combinations of kinase inhibitors for the treatment of cancer
KR20130043198A (ko) 2010-07-16 2013-04-29 피라말 엔터프라이지즈 리미티드 키나제 억제제로서 치환된 이미다조퀴놀린 유도체
AU2011281062B2 (en) 2010-07-21 2015-01-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for modification of a HLA locus
EP3467101A3 (en) 2010-09-08 2019-06-19 Baylor College of Medicine Immunotherapy of brain tumor using geneticially engineered gd2-specific t cells
CN108424462A (zh) 2010-10-27 2018-08-21 贝勒医学院 使t细胞重定向针对cd70阳性恶性肿瘤的嵌合cd27受体
PH12013501201A1 (en) 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
AU2011343887B2 (en) 2010-12-14 2016-06-16 University Of Maryland, Baltimore Universal anti-tag chimeric antigen receptor-expressing T cells and methods of treating cancer
MX2013008376A (es) 2011-01-18 2013-08-12 Univ Pennsylvania Composiciones y metodos para el tratamiento de cancer.
AU2012230780B2 (en) 2011-03-23 2016-10-27 Fred Hutchinson Cancer Center Method and compositions for cellular immunotherapy
WO2012127464A2 (en) 2011-03-23 2012-09-27 Gavish-Galilee Bio Applications Ltd Constitutively activated t cells for use in adoptive cell therapy
AP2013007142A0 (en) 2011-04-01 2013-09-30 Sloan Kettering Inst Cancer T cell receptor-like antibodies specific for a WT1peptide presented by HLA-A2
NZ723731A (en) 2011-04-08 2020-05-29 Baylor College Medicine Reversing the effects of the tumor microenvironment using chimeric cytokine receptors
US20130071414A1 (en) 2011-04-27 2013-03-21 Gianpietro Dotti Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
CN102796198A (zh) 2011-05-26 2012-11-28 中国医学科学院血液病医院 抗CD3抗体Fv片段与白介素3的融合蛋白、制备方法及其用途
US8841418B2 (en) 2011-07-01 2014-09-23 Cellerant Therapeutics, Inc. Antibodies that specifically bind to TIM3
CA2842798C (en) 2011-07-25 2021-02-23 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant virus products and methods for inhibition of expression of dux4
CN104114233B (zh) 2011-07-29 2021-11-12 宾夕法尼亚大学董事会 转换共刺激受体
MX2014001662A (es) 2011-08-11 2014-08-26 Intellikine Llc Polimeros inhibidores de cinasas.
US9833476B2 (en) 2011-08-31 2017-12-05 The Trustees Of Dartmouth College NKP30 receptor targeted therapeutics
US20130108641A1 (en) 2011-09-14 2013-05-02 Sanofi Anti-gitr antibodies
EA201490636A1 (ru) 2011-09-16 2014-08-29 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Сконструированные с помощью рнк t-клетки для лечения злокачественных новообразований
EP2755487B1 (en) 2011-09-16 2018-12-19 Baylor College Of Medicine Targeting the tumor microenvironment using manipulated nkt cells
WO2013054320A1 (en) 2011-10-11 2013-04-18 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Antibodies to carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule (ceacam)
CN109485730A (zh) 2011-10-20 2019-03-19 美国卫生和人力服务部 抗cd22嵌合抗原受体
WO2013060867A2 (en) 2011-10-27 2013-05-02 Genmab A/S Production of heterodimeric proteins
ES2753614T3 (es) 2011-12-01 2020-04-13 Brigham & Womens Hospital Inc Anticuerpos recombinantes anti-CEACAM1 para terapia contra el cáncer
CN104203981A (zh) 2011-12-19 2014-12-10 合成免疫股份有限公司 双特异性抗体分子
WO2013126726A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Double transgenic t cells comprising a car and a tcr and their methods of use
EA201491573A1 (ru) 2012-02-22 2015-03-31 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Применение передающего сигнал домена cd2 в химерных антигенспецифических рецепторах второго поколения
IN2014DN07414A (ko) 2012-02-22 2015-04-24 Univ Pennsylvania
US10040846B2 (en) 2012-02-22 2018-08-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for generating a persisting population of T cells useful for the treatment of cancer
ES2924722T3 (es) 2012-05-18 2022-10-10 Aptevo Res & Development Llc Unión de inmunofusión de scFv biespecífico (BIf) a CD123 y CD3
NZ714353A (en) 2012-05-25 2017-05-26 Univ California Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription
WO2014011996A1 (en) 2012-07-13 2014-01-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of assessing the suitability of transduced t cells for administration
EP3338794B1 (en) 2012-07-13 2020-02-26 The Trustees of the University of Pennsylvania Toxicity management for anti-tumor activity of cars
IN2015DN00139A (ko) 2012-07-13 2015-06-12 Univ Pennsylvania
EP3730512A1 (en) 2012-07-13 2020-10-28 The Trustees of the University of Pennsylvania Enhancing activity of car t cells by co-introducing a bispecific antibody
US20160235787A1 (en) 2012-07-13 2016-08-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Epitope Spreading Associated with CAR T-Cells
IN2014DN10889A (ko) 2012-07-13 2015-09-11 Univ Pennsylvania
US10513540B2 (en) 2012-07-31 2019-12-24 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Modulation of the immune response
BR122020002988A8 (pt) 2012-08-20 2023-04-25 Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst Método e composições para imunoterapia celular
WO2014039513A2 (en) 2012-09-04 2014-03-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Inhibition of diacylglycerol kinase to augment adoptive t cell transfer
EP2904106A4 (en) 2012-10-01 2016-05-11 Univ Pennsylvania COMPOSITIONS AND METHOD FOR TARGETING CURRIC ACIDS FOR THE TREATMENT OF CANCER
WO2014055657A1 (en) 2012-10-05 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a trans-signaling approach in chimeric antigen receptors
AU2013329186B2 (en) * 2012-10-10 2019-02-14 Sangamo Therapeutics, Inc. T cell modifying compounds and uses thereof
BR112015008118A2 (pt) 2012-10-12 2017-12-05 Brigham & Womens Hospital Inc reforço da resposta imune
CA2894684A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of improved crispr-cas systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation in eukaryotes
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
US20140189896A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Feng Zhang Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
EP2943565B1 (en) 2013-01-14 2018-03-28 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for delivery of immune cells to treat un-resectable or non-resected tumor cells and tumor relapse
ES2814962T3 (es) 2013-02-20 2021-03-29 Novartis Ag Fijación eficaz como objetivo de la leucemia humana primaria utilizando células T modificadas con receptor de antígeno quimérico anti-CD123
ES2760023T3 (es) 2013-02-20 2020-05-12 Univ Pennsylvania Tratamiento del cáncer utilizando receptor de antígeno quimérico anti-EGFRvIII humanizado
US20160031996A1 (en) 2013-03-14 2016-02-04 Csl Limited Anti il-3r alpha agents and uses thereof
NZ711946A (en) 2013-03-14 2020-05-29 Icahn School Med Mount Sinai Newcastle disease viruses and uses thereof
WO2014138819A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Csl Limited Agents that neutralize il-3 signaling and uses thereof
EP3623380A1 (en) 2013-03-15 2020-03-18 Michael C. Milone Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
US9657105B2 (en) 2013-03-15 2017-05-23 City Of Hope CD123-specific chimeric antigen receptor redirected T cells and methods of their use
UY35468A (es) 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
US9701758B2 (en) 2013-05-24 2017-07-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-CD19 scFv (FMC63) polypeptide
PL3049439T3 (pl) 2013-09-26 2020-07-13 Ablynx N.V. Bispecyficzne nanociała
US9512084B2 (en) 2013-11-29 2016-12-06 Novartis Ag Amino pyrimidine derivatives
CA3225456A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Novartis Ag Human mesothelin chimeric antigen receptors and uses thereof
JP6793902B2 (ja) 2013-12-20 2020-12-02 ノバルティス アーゲー 調節可能キメラ抗原受容体
CA2936501A1 (en) * 2014-01-13 2015-07-16 Stephen J. Forman Chimeric antigen receptors (cars) having mutations in the fc spacer region and methods for their use
ES2963718T3 (es) 2014-01-21 2024-04-01 Novartis Ag Capacidad presentadora de antígenos de células CAR-T potenciada mediante introducción conjunta de moléculas co-estimuladoras
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
AU2015220762B2 (en) 2014-02-21 2019-05-02 Cellectis Method for in situ inhibition of regulatory T cells
US20170081411A1 (en) 2014-03-15 2017-03-23 Novartis Ag Regulatable chimeric antigen receptor
JP2017513818A (ja) 2014-03-15 2017-06-01 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体を使用する癌の処置
US9944709B2 (en) 2014-03-19 2018-04-17 Cellectis CD123 specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy
KR20240042250A (ko) 2014-04-07 2024-04-01 노파르티스 아게 항-cd19 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료
US20170274014A1 (en) 2014-07-21 2017-09-28 Jennifer Brogdon Combinations of low, immune enhancing, doses of mtor inhibitors and cars
CA2955154C (en) 2014-07-21 2023-10-31 Novartis Ag Treatment of cancer using a cd33 chimeric antigen receptor
EP3194585A1 (en) 2014-07-21 2017-07-26 Novartis AG Sortase molecules and uses thereof
SG10201913782UA (en) 2014-07-21 2020-03-30 Novartis Ag Treatment of cancer using a cll-1 chimeric antigen receptor
WO2016014565A2 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
WO2016014553A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
EP3193915A1 (en) 2014-07-21 2017-07-26 Novartis AG Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars
EP3660042B1 (en) 2014-07-31 2023-01-11 Novartis AG Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing t-cells
CA2958200A1 (en) 2014-08-14 2016-02-18 Novartis Ag Treatment of cancer using a gfr alpha-4 chimeric antigen receptor
DK3183268T3 (da) 2014-08-19 2020-05-11 Univ Pennsylvania Behandling af cancer ved anvendelse af en cd123-kimær antigenreceptor
EP3194443B1 (en) 2014-09-17 2021-07-14 Novartis AG Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
AU2015330898B2 (en) 2014-10-08 2022-03-10 Novartis Ag Biomarkers predictive of therapeutic responsiveness to chimeric antigen receptor therapy and uses thereof
WO2016061368A1 (en) 2014-10-15 2016-04-21 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for treating b-lymphoid malignancies
RU2021118125A (ru) 2014-12-29 2022-04-06 Новартис Аг Способы получения экспрессирующих химерный антигенный рецептор клеток
US11459390B2 (en) 2015-01-16 2022-10-04 Novartis Ag Phosphoglycerate kinase 1 (PGK) promoters and methods of use for expressing chimeric antigen receptor
US11161907B2 (en) 2015-02-02 2021-11-02 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
US20180140602A1 (en) 2015-04-07 2018-05-24 Novartis Ag Combination of chimeric antigen receptor therapy and amino pyrimidine derivatives
HRP20220893T1 (hr) 2015-04-08 2022-10-14 Novartis Ag Cd20 terapije, cd22 terapije, i kombinirane terapije sa stanicom koja eksprimira cd19 kimerni antigenski receptor
EP3283619B1 (en) 2015-04-17 2023-04-05 Novartis AG Methods for improving the efficacy and expansion of chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3286211A1 (en) 2015-04-23 2018-02-28 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
SG10201912978PA (en) 2015-07-21 2020-02-27 Novartis Ag Methods for improving the efficacy and expansion of immune cells
EP3331913A1 (en) 2015-08-07 2018-06-13 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins
CN108780084B (zh) 2015-09-03 2022-07-22 诺华股份有限公司 预测细胞因子释放综合征的生物标志物
MX2018003353A (es) 2015-09-17 2018-09-17 Novartis Ag Terapias con celulas cart con una eficacia mejorada.
CN109069597A (zh) 2015-12-22 2018-12-21 诺华股份有限公司 间皮素嵌合抗原受体(car)和抗pd-l1抗体抑制剂联用于抗癌治疗
EP4219689A3 (en) 2015-12-30 2023-12-20 Novartis AG Immune effector cell therapies with enhanced efficacy
AU2017225733A1 (en) 2016-03-04 2018-09-27 Novartis Ag Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (CAR) molecules and uses therefore
US11549099B2 (en) 2016-03-23 2023-01-10 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
WO2017210617A2 (en) 2016-06-02 2017-12-07 Porter, David, L. Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells
AU2017295886C1 (en) 2016-07-15 2024-05-16 Novartis Ag Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor
TW201806619A (zh) 2016-07-28 2018-03-01 瑞士商諾華公司 嵌合抗原受體及pd-1抑制劑之組合療法
US20190161542A1 (en) 2016-08-01 2019-05-30 Novartis Ag Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule
WO2018059549A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Novartis Ag Immune effector cell therapies with enhanced efficacy
TWI797091B (zh) 2016-10-07 2023-04-01 瑞士商諾華公司 利用嵌合抗原受體之癌症治療
EP3577134A1 (en) 2017-01-31 2019-12-11 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric t cell receptor proteins having multiple specificities
WO2018160731A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Novartis Ag Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
CN110831619A (zh) 2017-03-22 2020-02-21 诺华股份有限公司 具有增强功效的生物标志和car t细胞疗法
US20200179511A1 (en) 2017-04-28 2020-06-11 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US20200055948A1 (en) 2017-04-28 2020-02-20 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
BR112020007576A2 (pt) 2017-10-18 2020-09-24 Novartis Ag composições e métodos para degradação de proteína seletiva
BR112020007710A2 (pt) 2017-10-25 2020-10-20 Novartis Ag métodos para produzir células que expressam receptor de antígeno quimérico
AU2018369883A1 (en) 2017-11-15 2020-05-28 Novartis Ag BCMA-targeting chimeric antigen receptor, CD19-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapies
CA3083949A1 (en) 2017-11-30 2020-06-06 Novartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, and uses thereof
WO2019160956A1 (en) 2018-02-13 2019-08-22 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
US20200061113A1 (en) 2018-04-12 2020-02-27 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy characterization assays and uses thereof
WO2019210153A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
US20210396739A1 (en) 2018-05-01 2021-12-23 Novartis Ag Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
US20200085869A1 (en) 2018-05-16 2020-03-19 Novartis Ag Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor therapies
WO2019227003A1 (en) 2018-05-25 2019-11-28 Novartis Ag Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
AU2019284911A1 (en) 2018-06-13 2020-12-17 Novartis Ag BCMA chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2020047449A2 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
WO2020069405A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Novartis Ag Cd22 chimeric antigen receptor (car) therapies
WO2020069409A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Novartis Ag Cd19 chimeric antigen receptor (car) and cd22 car combination therapies
EP3930763A1 (en) 2019-02-25 2022-01-05 Novartis AG Mesoporous silica particles compositions for viral delivery
EP3953455A1 (en) 2019-04-12 2022-02-16 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP4065158A2 (en) 2019-11-26 2022-10-05 Novartis AG Chimeric antigen receptors binding bcma and cd19 and uses thereof
WO2021108613A1 (en) 2019-11-26 2021-06-03 Novartis Ag Cd19 and cd22 chimeric antigen receptors and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cytotherapy 16(4):S8(2014.04.) *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2016028896A1 (en) 2016-02-25
JP2017530694A (ja) 2017-10-19
SG11201700770PA (en) 2017-03-30
JP2021184715A (ja) 2021-12-09
IL280204A (en) 2021-03-01
US20230220090A1 (en) 2023-07-13
BR112017003104A2 (pt) 2017-12-05
CA2958553A1 (en) 2016-02-25
MX2017002205A (es) 2017-08-21
RU2017108903A3 (ko) 2019-03-14
AU2015305531B2 (en) 2021-05-20
CN107108744A (zh) 2017-08-29
CN107108744B (zh) 2020-09-25
US11591404B2 (en) 2023-02-28
LT3183268T (lt) 2020-06-10
JP7084138B2 (ja) 2022-06-14
RU2020117196A (ru) 2020-10-15
CN112410363A (zh) 2021-02-26
IL250362A0 (en) 2017-03-30
ES2791248T3 (es) 2020-11-03
US20160068601A1 (en) 2016-03-10
US9815901B2 (en) 2017-11-14
TW202140557A (zh) 2021-11-01
HUE049218T2 (hu) 2020-10-28
EP3712171A1 (en) 2020-09-23
TW201617367A (zh) 2016-05-16
EP3183268B1 (en) 2020-02-12
US20180312595A1 (en) 2018-11-01
RU2017108903A (ru) 2018-09-21
RU2724999C2 (ru) 2020-06-29
EP3183268A1 (en) 2017-06-28
PL3183268T3 (pl) 2020-09-07
US10703819B2 (en) 2020-07-07
US20210002377A1 (en) 2021-01-07
AU2021218185A1 (en) 2021-09-09
MY189028A (en) 2022-01-20
PT3183268T (pt) 2020-05-15
AU2015305531A1 (en) 2017-02-23
KR102616429B1 (ko) 2023-12-26
TWI719946B (zh) 2021-03-01
CO2017001573A2 (es) 2017-07-19
DK3183268T3 (da) 2020-05-11
IL250362B (en) 2021-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11591404B2 (en) Treatment of cancer using a CD123 chimeric antigen receptor
US10851166B2 (en) Treatment of cancer using a CD33 chimeric antigen receptor
TWI746437B (zh) Ｃｄ２０療法、ｃｄ２２療法及與表現ｃｄ１９嵌合抗原受體（ｃａｒ）之細胞的組合療法
US20200215171A1 (en) Treatment of cancer using a cll-1 chimeric antigen receptor
KR20160135233A (ko) 항-cd19 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료
BR112017003104B1 (pt) Molécula de ácido nucleico isolada que codifica um receptor de antígeno quimérico (car), polipeptídeo do car isolado, domínio de ligação a cd123, vetor, método in vitro ou ex vivo para preparação de uma célula ou para geração de uma população de células, usos de uma célula, e composição farmacêutica

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20170315

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
A201 Request for examination
AMND Amendment
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20200818

Comment text: Request for Examination of Application

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20220929

Patent event code: PE09021S01D

AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

Patent event date: 20230426

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PE06012S01D

Patent event date: 20220929

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I

AMND Amendment
PX0701 Decision of registration after re-examination

Patent event date: 20231010

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event code: PX07013S01D

Patent event date: 20230922

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

Patent event date: 20230426

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PX07011S01I

Patent event date: 20221229

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

Patent event date: 20200818

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20231218

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20231219

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration