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KR20150130480A - 장내 병원균에 대한 면역 반응을 증진시키는 조성물 및 방법 - Google Patents

장내 병원균에 대한 면역 반응을 증진시키는 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20150130480A
KR20150130480A KR1020157028645A KR20157028645A KR20150130480A KR 20150130480 A KR20150130480 A KR 20150130480A KR 1020157028645 A KR1020157028645 A KR 1020157028645A KR 20157028645 A KR20157028645 A KR 20157028645A KR 20150130480 A KR20150130480 A KR 20150130480A
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Abstract

장내 세균에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 백신 벡터 및 이를 사용하는 방법이 제공된다. 백신 벡터는 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. PAL 폴리펩티드는 백신 벡터의 표면 상에서 발현될 수 있다. 백신 벡터는 면역자극 폴리펩티드,예컨대 CD154 폴리펩티드 또는 HMGB1 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

Description

장내 병원균에 대한 면역 반응을 증진시키는 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS OF ENHANCING IMMUNE RESPONSES TO ENTERIC PATHOGENS}
<관련 출원에 대한 상호 참조>
본 특허 출원은 2013년 3월 15일 출원된 미국 가특허 출원 번호 제61/790,301호의 우선권을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 참조문헌으로서 포함된다.
<서열 목록>
본 출원은 전자 출원된 것이며, .txt 포맷의, 전자 제출된 서열 목록을 포함한다. .txt 파일은 2014년 3월 14일 작성된, 파일명 "2014-03-14_5658-00203_ST25.txt"의 서열 목록을 포함하며, 그 크기는 31,093 바이트이다. 이 .txt 파일에 포함된 서열 목록은 명세서의 일부이며, 그 전체가 본원에 참조문헌으로서 포함된다.
세균 감염은 여전히 사람 및 농경 및 가축 동물에 상당한 건강 위험을 제기한다. 항생제 내성의 증가는 농업에서 항생제의 사용으로부터 떠날 필요 및 인간 식량 공급의 세균 감염 및 세균 오염을 조절하는 대체 방법을 개발할 필요를 증가시켰다. 살모넬라 및 대장균은 흔히 인간 식인성 감염의 세균 원인으로 전세계적으로 보고되었고, 유행병학적 증거는 가금류 및 가금류 제품을 포함하는 육류 제품이 인간 감염의 실질적인 출처임을 나타낸다. 미국에서, 추정된 140만 사례의 인간 살모넬라증이 매년 보고된다. 이 사례에는, 비록 여러 다른 혈청형이 또한 인간의 장염을 일으키는 것으로 나타났지만, S. 엔테리카 (S. enterica ) 혈청형 엔테리디티스(S. enterica serovars Enteritidis)(SE) 및 티피무륨(Typhimurium)(ST)이 가장 흔히 단리된다. 상당한 감염율에 책임이 있는 다른 그람음성 세균은 쉬겔라 균(Shigella spp), 비브리오 균(Vibrio spp), 에르비니아 균(Erwinia spp), 케브시엘라 균(Kebsiella spp), 시트로박터 균(Citrobacter spp), 예르시니아 균(Yersinia spp), 프로비덴시아 균(Providencia spp) 및 비슷한 세균을 포함한다. 이들 세균 감염을 통제하는 새로운 수단이 필요하다.
PAL 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 백신 벡터가 개시된다. PAL 폴리펩티드는 백신 벡터에서 이종, 비-음성적으로 발현된, 재조합 폴리펩티드이다. PAL 폴리펩티드는 서열 1, 서열 1과 90 % 동일성이 있는 서열, 예컨대 서열 6, 또는 적어도 6 아미노산 길이인 그것의 면역원성 단편으로부터 선택된다. 폴리펩티드는 백신 벡터의 표면 상에서 발현될 수 있다. 서열 1의 면역원성 단편은 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 36 또는 서열 37을 포함할 수 있다. 백신 벡터는 또한 면역자극 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 면역자극 폴리펩티드는 또한 백신 벡터의 표면 상에서 발현될 수 있다. 면역자극 폴리펩티드는 CD40 또는 HMGB1 폴리펩티드에 결합할 수 있는 CD154 폴리펩티드일 수 있다. CD154 폴리펩티드는 50개 미만의 아미노산을 포함하고, 아미노산 140-149 또는 그의 상동체를 포함한다.
본 발명에 따른 백신은 바이러스, 효모, 세균 또는 리포솜과 같은 벡터 내에 포함될 수 있다. 한 측면에서, 백신은 서열 42, 44 또는 46 또는 이들 서열 중 하나와 90 % 동일성을 갖는 서열의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 제약학적 조성물은 본원에 기재된 백신 벡터 및 제약학적으로 허용가능한 담체로 구성될 수 있다.
또 다른 측면에서, 대상체에 본원에 기재된 백신 벡터를 투여함으로써 대상체 내 그람-음성 세균에 대응한 면역 반응을 증진시키는 방법이 제공된다. 증진된 면역 반응은 증진된 항체 반응, 증진된 T 세포 반응 또는 그들의 조합일 수 있다.
또 추가적인 측면에서, 대상체에 본원에 기재된 바와 같은 백신 벡터를 투여함으로써 대상체 내 그람-음성 세균 감염에 관련된 이환률 또는 사망률을 감소시키는 방법이 제공된다. 백신 벡터는 대조군과 비교하여, 백신 벡터를 투여받은 대상체에서 그람-음성 세균에 의한 후속 감염과 관련된 이환률 또는 사망률을 감소시킬 수 있다.
도 1은 108 cfu/닭으로 식염수, 또는 바실루스 주쇄(BS BB) 또는 PAL-벡터 BS 백신(BS PAL) 후보물질을 이용한 경구 섭식에 의한 백신접종 후 17일차에 코팅 항원으로서 합성 PAL-BSA를 이용한 ELISA에 의해 측정된 PAL 서열-특이적 혈청 IgG 항체 수준을 나타내는 그래프이다. 결과는 평균 S/P 비 ± SEM(n=10)으로 표시된다. 다른 대문자 글자의 군은 ANOVA를 사용하여 실질적으로 다르다(P <0.05).
도 2는 108 cfu/닭으로 식염수, 또는 바실루스 주쇄(BS BB) 또는 PAL-벡터 BS 백신 후보물질(BSNNP)을 이용한 경구 섭식에 의한 백신접종 후 17-일차에 코팅 항원으로서 합성 PAL-BSA를 이용한 ELISA에 의해 측정된 PAL 서열-특이적 회장 sIgA 항체 수준을 나타내는 그래프이다. 결과는 평균 S/P 비 ± SEM(n=10)으로 표시된다. 다른 대문자 글자의 군은 ANOVA를 사용하여 실질적으로 다르다(P <0.05).
도 3은 부화 후 17 및 21일차에 기존 미생물 평판 측정(plate counting)을 사용하여 108 cfu/닭으로 식염수, BSBB 또는 PAL-BS 구축물 벡터 백신(BSNNP)을 수용하는 닭에서 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium)의 수를 확인한 그래프이다. 모든 군은 부화-후 11일차에 1x108 cfu/ml의 ST 도전 투여량을 수용한다. 결과는 평균 log10 cfu/그램의 맹장 내용물 ± SEM(n=10)으로 표시된다. 다른 대문자 글자의 군은 ANOVA를 사용하여 실질적으로 다르다(P <0.05).
도 4는 PAL의 나타난 헥사펩티드에 대해 대조군(PBST)과 비교해 두 단일클론 항체(2B5 및 1B2)의 친화력을 나타내는 그래프이다.
도 5는 나타난 백신 균주(strain) 또는 대조군으로의 백신접종 후 21-일차 브로일러의 맹장으로부터 단리된 그램 당 살모넬라 하이델부르크(Heidelberg) 균층 형성 단위(cfu)를 나타내는 그래프이다. 다른 대문자 글자의 군은 ANOVA를 사용하여 실질적으로 다르다(P <0.05).
도 6은 나타난 백신 균주 또는 대조군으로의 백신접종 후 21-일차 및 33-일차 브로일러의 맹장으로부터 단리된 그램 당 살모넬라 하이델부르크 균층 형성 단위(cfu)를 나타내는 그래프이다. 별표가 있는 군은 ANOVA에 의해 실질적으로 다르다(P <0.05).
도 7은 나타난 백신 균주 또는 대조군으로의 백신접종 후 28일차 브로일러의 맹장으로부터의 살모넬라 하이델부르크 양의 백분율 회수를 나타내는 그래프이다. 다른 대문자 글자의 군은 ANOVA를 사용하여 실질적으로 다르다(P <0.05).
도 8은 뮤린 대식세포에 의해 나타난 백신 균주의 식균작용 백분율을 나타내는 그래프이다. 다른 대문자 글자의 군은 ANOVA를 사용하여 실질적으로 다르다(P <0.05).
그람-음성 세균에 대한 종래 백신은 일반적으로 종종 주입을 통해 제한된 개수로 전달되는 생/약독화된 세균에 기반한다. 그람-음성 세균은 꽤 다양하고 다른 종의 세균 중에서의 및 심지어 같은 종 내 다른 균주 중에서의 항원형 다양성이 하나 초과의 균주 또는 혈청형에 대한 백신접종이 어렵게 만든다. 재조합 백신은 개발되었지만 항원형 다양성 때문에 세균의 단일 종 또는 심지어 단일 균주에 대한 면역 반응을 증진시키는 것으로 일반적으로 제한된다. 다중 혈청형에 대해 및 정말로 하나를 초과하는 종의 그람-음성 세균에 대해 보호할 수 있는 백신이 최적일 것이다. 더욱이, 경구로 투여될 수 있는 백신은 투여를 더 저렴하고 좀더 순응성이도록 만들 것이다. 그람-음성 생물체에서 광범위하게 발견되는 PAL, 펩티도글리칸-관련 지질단백질의 고도로 보존된 영역을 포함하는 백신이 제공된다.
재조합 DNA 기술은 다수의 효모, 세균 및 바이러스 종을 상대적으로 쉽게 조작할 수 있다. 일부 미생물은 경미한 병원성 또는 비-병원성이지만, 강한 면역 반응을 발생시킬 수 있다. 이들 미생물은 벡터에서 재조합적으로 발현된 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 관심의 대상이 되는 백신 벡터를 제조한다. 미생물에 의해 벡터화된 백신은 자연 감염을 모방할 수 있고, 강력하고 장기간 지속되는 점막 면역 생성에 도움을 줄 수 있고, 제조 및 투여가 상대적으로 저렴할 수 있다. 이들 백신 벡터의 다수는 비용 및 투여를 위한 전문가에 대한 요구를 감소시키고 투여에 대한 저항성을 낮추는 경구 투여가 될 수 있다. 추가로, 이러한 벡터는 종종 하나를 초과하는 항원을 보유할 수 있고, 다중의 감염원에 대하여 방어를 제공하는 잠재능을 가질 수 있다.
백신은 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 임의의 조성물을 포함한다. 백신 벡터는 항원 및 임의로 다른 면역자극 폴리펩티드를 보유하도록 조작될 수 있고, 또한 보조제를 포함할 수 있거나, 추가로 기생충에 대한 면역 반응을 증가시키고, 후속 감염과 관련된 이환율 및 사망률로부터 더욱 잘 보호하기 위해 보조제와 함께 투여될 수 있는 조성물이다. 백신접종 및 장내 병원균에 대한 면역 반응의 발생을 위한 세균, 바이러스 또는 효모 벡터와 같은 벡터의 용도가 본원에 개시된다. 장내 병원균은 대장균, 살모넬라 및 실시예의 표 1에서 개시된 다른 장내 미생물을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 백신 벡터의 투여 후 면역 반응은 완전하게 방어성일 필요는 없지만, 장내 병원균으로의 후속 감염과 관련된 이환율 또는 사망률 백분율(즉, 사망 가능성)을 감소시킬 수 있다.
한 측면에서, 서열 1-6, 32, 36 또는 37 또는 적어도 6 아미노산 길이인 이들 서열 중 어느 하나의 면역원성 단편 중 적어도 하나를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 백신 벡터가 제공된다. 또한 면역자극 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함할 수도 있는 백신 벡터가 제공된다. 적합하게 PAL 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편 및 면역자극 폴리펩티드가 백신 벡터의 표면 상에서 발현된다. 서열 1의 폴리펩티드의 면역원성 단편은 서열 2-5 또는 36-40 또는 적어도 6 아미노산 길이인 임의의 다른 단편 중 어느 하나 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항원성 폴리펩티드는 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 32, 서열 36, 서열 37 또는 면역원성 단편 또는 이들 서열 중 임의의 조합을 포함할 수 있거나, 본질적으로 그로 이루어질 수 있거나, 또는 그로 이루어질 수 있다.
항원성 폴리펩티드의 면역원성 단편은 적어도 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20 아미노산 길이이고, 본원에서 제공하는 서열과 적어도 85 %, 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 %의 동일성 백분율을 갖는 서열일 수 있다. 백신은 백신이 투여된 대상체에서 폴리펩티드에 대해 면역 반응을 유도할 수 있는 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 임의의 조성물을 포함한다. 백신접종 및 살모넬라 균, 에스케리치아 균(Escherichia spp), 쉬겔라 균, 비브리오 균, 에르비니아 균, 케브시엘라 균, 시트로박터 균, 예르시니아 균, 프로비덴시아 균 또는 표 1에서 나열된 것들과 같은 비슷한 세균을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는 장내 세균에 대한 면역 반응의 발생을 위한 세균 벡터와 같은 벡터의 용도가 개시된다.
본원에 제공된 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 다수의 병원성 생물체로부터의 다른 항원이 벡터 내로 삽입될 수 있고 벡터에서 발현될 수 있다. 대상체 면역화 이후에 벡터에 의한 이들 폴리뉴클레오티드의 발현은 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응의 발생을 가능하게 할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 벡터의 염색체 내로 삽입할 수 있거나, 또는 플라스미드 또는 다른 염색체외 DNA 상에서 코딩될 수 있다. 통상의 기술자는 벡터, 예컨대 살모넬라 또는 바실루스에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 얻기 위한 다양한 방법론이 존재한다는 것을 이해할 것이다. 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 폴리뉴클레오티드를 프로모터(예컨대, 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 등)에 작동가능하게 연결시킬 수 있다. 적합하게, 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 벡터, 예컨대 세균 벡터 내로 삽입되고, 이로써 폴리뉴클레오티드는 발현된다.
PAL 또는 다른 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 프레임 내에서 막횡단 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 삽입될 수 있다. 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 벡터 폴리뉴클레오티드 서열 내로 삽입되어 벡터의 표면 상에서 항원성 폴리펩티드의 발현을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 벡터 폴리뉴클레오티드 서열이 프레임 내에 유지되도록, 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 프레임 내에서 막횡단 단백질의 외부 루프 영역을 코딩하는 영역 중의 벡터 폴리뉴클레오티드 내로 삽입될 수 있다. 한 실시양태에서, 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드가 실시예에서 기재된 바와 같은 살모넬라의 lamB 유전자의 루프 9 내로 삽입될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 바실루스의 cotB 유전자와 같은 폴리뉴클레오티드 내로 삽입될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드가 막횡단 단백질이 아닌, 세포 벽에 부착되는 단백질의 표면 노출된 단부 내로 또는 그 단부에 삽입된다. 단백질은 단백질 또는 액체 앵커(anchor)를 통해 세포 벽에 고정 또는 부착되는 분비 단백질일 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)의 피브로넥틴 결합 단백질(FbpB)의 3' 단부에 삽입될 수 있다. 대안적으로, 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드는 분비 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 내로 삽입될 수 있다.
항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 매우 다양한 벡터 폴리뉴클레오티드에 삽입되어 백신으로 처리된 대상체의 면역 세포에 항원성 폴리펩티드의 발현 및 제시를 제공할 수 있다는 것을 통상의 기술자는 이해할 것이다. 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 단일 카피 또는 하나를 초과하는 카피로 포함될 수 있다. 다중 카피가 백신 벡터 염색체 내부 또는 염색체외에서 단일 위치에 또는 하나 초과의 위치에 삽입될 수 있다.
적합하게 제1 폴리뉴클레오티드는 서열 1, 서열 6 또는 적어도 6 이상의 아미노산인 그의 면역원성 단편 예컨대 서열 2-5 또는 36-40을 코딩한다. 벡터는 제1 폴리뉴클레오티드의 하나를 초과하는 카피를 포함할 수 있고 동일한 또는 상이한 병원체를 표적으로 한 다중 항원성 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 실시예에서, 서열 1-6, 32, 36 및 37이 면역원성인 것으로 나타났다. 서열 1(EGHADERGTPEYNISLGER) 및 8(TVEGHADERGTPEYNISLG)이 실시예에서 바실루스 또는 살모넬라 벡터 내로 포함된다. 단일 병원체 또는 표적으로부터 유래된 하나를 초과하는 폴리펩티드로부터의 에피토프의 조합 또는 다른 병원체들 또는 표적들로부터 유래된 에피토프의 조합이 구체적으로 고려된다. 폴리뉴클레오티드는 벡터 내로 별도로 삽입될 수 있고, 이는 하나를 초과하는 에피토프를 함유하는 융합 단백질로서 삽입될 수 있다. 실시예에서, 서열 1(PAL) 및 31(CJ0113)이 바실루스 벡터 내로 도입되었다(서열 42, 44 및 46 및 실시예 참조). 적합하게, 벡터 내로 삽입된 항원성 폴리펩티드의 일부는 면역원성이다. 면역원성 단편은 세포성 또는 체액성 면역 반응을 유도할 수 있거나, 또는 표적 병원체 또는 관련된 병원체에 의한 후속 감염과 관련된 이환율 또는 사망률을 감소시킬 수 있는 펩티드 또는 폴리펩티드이다.
항원성 폴리펩티드는 면역원성인 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 항원성 폴리펩티드는 병원체-관련된, 알레르겐-관련된, 종양-관련된 또는 질환-관련된 항원을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 병원체는 바이러스, 기생충, 진균 및 세균 병원체 뿐만 아니라 단백질 병원체 예컨대 프리온을 포함한다. 항원성 폴리펩티드는 전장의 단백질 또는 그의 일부일 수 있다. 많은 단백질의 면역계 인식은, 흔히 에피토프로 지칭되는 상대적으로 적은 수의 아미노산에 기초한다는 것이 잘 확립되었다. 에피토프는 단지 4-8 아미노산일 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 항원성 폴리펩티드는 전장의 서열, 4 아미노산 길이 에피토프 또는 이들 극단 사이의 임의의 일부일 수 있다. 사실상, 항원성 폴리펩티드는 단일 병원체 또는 단백질로부터의 하나를 초과하는 에피토프를 포함할 수 있다. 항원성 폴리펩티드는 본원에서 제공된 서열과 적어도 85 %, 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 백분율 동일성을 가질 수 있다. 적합하게, 폴리펩티드의 항원성 단편은 서열 1-6, 32, 36 또는 37의 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 12개, 15개, 17개 이상의 연속 아미노산일 수 있다.
다중 카피의 동일한 에피토프, 또는 상이한 단백질로부터의 다중 에피토프가 백신 벡터에 포함될 수 있다. 백신 벡터 내 에피토프는, 단일 백신 벡터를 사용하여 다중 관련된 병원체를 표적화할 수 있도록 허용하기 위해, 관련되어 있고, 상동성일 수 있다. 동일하거나 상이한 병원체 또는 질환으로부터의 수개의 에피토프 또는 항원은 다중 항원에 대한 증진된 면역 반응을 발생하기 위해 조합하여 단일 백신 벡터로 투여될 수 있다는 것이 구상된다. 재조합 백신 벡터는 다중 병원성 미생물, 바이러스로부터의 항원 또는 종양 관련 항원을 코딩할 수 있다. 다중 항원을 발현할 수 있는 백신 벡터의 투여는 동시에 2 가지 이상의 질환에 대하여 면역을 유도함으로써, 단일 병원체의 다중 균주에 대하여 더욱 광범위한 방어를 제공할 수 있거나, 단일 병원체에 대해 더욱 강력한 면역 반응을 제공할 수 있다는 이점을 가진다. 실시예에서, 백신 벡터는 서열 1의 PAL 항원성 폴리펩티드 및 국제 특허 공보 제WO2011/156619에서 캄필로박터(Campylobacter)에 대한 면역 반응을 증진시키는데 효과적임이 이미 입증된 서열 31의 캄필로박터 항원성 폴리펩티드를 포함한다.
단일 백신에 의해 하나를 초과하는 병원체에 대한 면역 반응을 증진시키기 위하여 다른 병원체로부터의 항원성 폴리펩티드가 백신 벡터에 사용될 수 있다는 것을 통상의 기술자는 이해할 것이다. 다중 병원체에 대한 단일 백신을 투여하는 것이 이로울 것이다. 인플루엔자, 살모넬라, 캄필로박터 또는 다른 병원체와 함께 대장균과 같은 장내 병원균에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 백신이 구상된다. 예를 들어, 제2 항원성 폴리펩티드는 인플루엔자 폴리펩티드일 수 있고, 적합하게는 이는 인플루엔자 H5N1 폴리펩티드 또는 인플루엔자 바이러스의 다중 균주와 관련된 폴리펩티드, 예컨대, 인플루엔자 M2 단백질의 폴리펩티드이다. M2e로 알려져 있는 인플루엔자 A 바이러스 M2 단백질의 엑토도메인은 바이러스의 표면으로부터 돌출되어 있다. M2 단백질의 M2e 부분은 약 24개의 아미노산을 함유한다. M2e 폴리펩티드는 인플루엔자 내에서는 한 단리물에서 그 다음 단리물 간에 거의 차이가 없다. 사실상, 1918년 유행성 독감 이래로 M2e 중 오직 몇몇의 천연적으로 발생한 돌연변이만이 감염된 인간으로부터 단리되었다. 추가로, 조류 및 돼지(swine) 숙주로부터 단리된 인플루엔자 바이러스는 상이하지만, 여전히 보존되는 M2e 서열을 가지고 있다. 인간, 조류 및 돼지 숙주로부터 단리된 M2e 폴리펩티드 서열에 관한 리뷰를 위해, 문헌[리우(Liu) 외, Microbes and Infection 7:171-177 (2005)] 및 [레이드(Reid) 외, J. Virol. 76:10717-10723 (2002)](이들 문헌은 각각 그 전체가 본원에 참조문헌으로서 포함됨)을 참조할 수 있다. 적합하게 전체 M2e 폴리펩티드는 백신 벡터 내로 삽입될 수 있거나, 또는 오직 부분만이 사용될 수 있다. 8개의 아미노산 폴리펩티드(아미노산 서열: EVETPIRN을 갖는 LM2, 서열 9 또는 아미노산 서열 EVETPTRN을 갖는 그의 변이체 M2eA, 서열 10)를 백신 벡터 내로 도입하였고, 닭으로의 투여 후 항체 반응을 일으키는 것으로 입증되었다. U.S. 공개 제2011/0027309(이는 그 전체가 본원에 참조문헌으로서 포함됨)를 참조할 수 있다.
인플루엔자 A에 대한 면역 반응을 증진시키도록 백신 벡터 내에 포함시키는데 다른 적합한 에피토프는 인플루엔자 A의 헤마글루티닌(HA) 또는 핵 단백질(NP)의 폴리펩티드를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 서열 11, 서열 12, 서열 13 또는 서열 14의 펩티드는 백신 벡터에 포함될 수 있다. 이들 서열 중 임의의 것이 다른 병원체 또는 항원으로부터 유래된 에피토프를 포함하는 임의의 다른 에피토프와 함께 사용될 수 있다는 것을 통상의 기술자는 이해할 것이다.
예를 들어, 본원에 제공된 PAL 항원성 폴리펩티드는 U.S. 특허 공개 제US2011/0159026 또는 국제 공개 제WO 2011/156619(이들 모두는 그 전체가 본원에 참조문헌으로서 포함됨)에서 제공된 것들과 같은 그람 음성 세균으로부터의 다른 항원성 폴리펩티드와 조합될 수 있다. 하나는 다중 그람 음성 세균에 광범위한 면역을 제공하고 다른 것은 특정 그람 음성 세균에 더 특이적인 다중 항원성 폴리펩티드의 조합은 후속 감염으로부터 우수한 방어를 제공할 수 있다.
백신 벡터의 일부로서 포함된 면역자극 분자는 잠재적으로 장기간-지속되는 방어에 중요한 면역계의 일부를 활성화시킬 수 있다. 면역자극 폴리펩티드는 순수한(naive) 또는 적응 면역 반응을 자극시킬 수 있는 폴리펩티드일 수 있다. 면역자극 폴리펩티드는 천연적으로 백신 벡터와는 관련이 없고, 척추동물 면역계, 예컨대, 백신을 투여받게 될 대상체의 면역계와는 천연적으로 관련이 있는 폴리펩티드이다. 두 면역자극 폴리펩티드, 즉 CD154 및 고이동성 그룹 박스 1(HMGB1) 폴리펩티드가 본원에 기재되지만, 다른 면역자극 폴리펩티드가 사용될 수 있거나, 또는 대안적으로, 본원에 기재된 것들과 조합하여 사용될 수 있다는 것을 통상의 기술자는 이해할 것이다.
면역계를 유발하는데 관여하는 폴리펩티드를 코딩하는 추가의 폴리뉴클레오티드 또한 백신 벡터에 포함될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 그의 자극성 효과에 대해 공지된 면역계 분자, 예컨대 인터루킨, 종양 괴사 인자, 인터페론, 또는 면역-조절에 관여하는 또다른 폴리뉴클레오티드를 코딩할 수 있다. 백신은 또한 본원에 기재된 CD154 또는 HMGB1 폴리펩티드와 같은, 면역 반응을 자극하는 것으로 알려진 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
HMGB1은 활성화된 대식세포 및 손상된 세포에 의해 분비되고, 선천성 면역 반응에 영향을 미치면서, 염증의 시토카인 매개인자로서의 역할을 한다. HMGB1 서열의 일부가 실시예에 기재된 백신 벡터에 포함되었다. HMGB1(고이동성 그룹 박스-1) 단백질은 최초로는 DNA 구조 및 안정성에 중요한 DNA-결합 단백질로서 확인되었다. 이는 서열 특이성 없이 DNA에 결합하는 편재하여 발현되는 핵 단백질이다. 단백질은 고도로 보존되고, 식물 내지 포유류에서 발견된다. 제브라피시, 닭 및 인간 HMGB1 아미노산 서열은 각각 서열 23, 서열 15 및 서열 22에 제공되어 있다. 포유류 전체의 서열은 98 %의 아미노산 동일성을 가지고 고도로 보존되며 아미노산 변이는 보존적이다. 따라서, 한 종으로부터의 HMGB1 단백질은 기능상 또다른 종으로부터의 것 대신으로 치환될 수 있다. 전장의 HMGB1 단백질 또는 그의 일부가 본원에 기재된 백신 벡터에서 HMGB1 폴리펩티드로서 사용될 수 있다. HMGB1은 서열 16 및 17에 나타난 바와 같은 A 박스, 및 서열 18 및 19에 나타난 바와 같은 B 박스로 명명되는 2개의 DNA 결합 영역을 갖는다. 문헌[앤더슨(Andersson) 및 트레이시(Tracey), Annu. Rev. Immunol. 2011, 29:139-162](이는 그 전체가 참조문헌으로서 본원에 포함됨)을 참조할 수 있다.
HMGB1은 염증 매개인자이고, 예컨대, 괴사 세포로부터의 핵 손상 신호로서의 역할을 한다. HMGB1은 또한 단백질의 아세틸화, 핵 통과 전위, 및 분비를 필요로 하는 프로세스에서 단핵구/대식세포 계통의 세포에 의해 활발하게 분비될 수 있다. 세포외 HMGB1은 최종 당화 생성물에 대한 수용체(Receptor for Advanced Glycated End-products)(RAGE), 및 톨-유사 수용체 패밀리(TLR)의 구성원, 특히 TLR4를 통한 신호 전달에 의해 염증의 강력한 매개인자로서의 역할을 한다. RAGE 결합 활성이 확인되었고, 이는 서열 20의 폴리펩티드를 필요로 한다. TLR4 결합은 서열 15의 106번 위치의 시스테인을 필요로 하고, 이는 HMGB1의 B 박스 영역에서 발견된다.
HMGB1의 염증성 활성은 전장의 단백질 및 기능성 단편이 확인되는 것을 필요로 하지 않는다. B 박스는 HMGB1의 염증-유발성 효과를 매개하는데 충분한 것으로 밝혀져 있으며, 따라서, 서열 18 및 19는 본 발명의 맥락 내에서 HMGB1 폴리펩티드 또는 그의 기능성 단편이다. 추가로, RAGE 결합 부위 및 염증-유발성 시토카인 활성은 각각 서열 20 및 서열 21로 지도화되었다. 따라서, 이들 폴리펩티드는 본 발명의 맥락 내에서 HMGB1 폴리펩티드의 기능성 단편이다.
통상의 기술자는 예컨대, 국제 공개 제WO02 092004(그 전체가 본원에 참조문헌으로서 포함됨)의 방법과 같은 방법을 사용하여 염증-유발성 시토카인 활성을 자극할 수 있는 HMGB1 폴리펩티드 및 그의 단편을 확인할 수 있다. 적합하게, HMGB1 폴리펩티드는 서열 15의 아미노산 150-183의 RAGE 결합 도메인(서열 20 또는 그의 상동체) 및 서열 15의 아미노산 89-109의 염증-유발성 시토카인 활성 도메인(서열 21 또는 그의 상동체)을 포함한다. 특히, HMGB1 폴리펩티드 및 그의 기능성 단편 또는 상동체는 서열 15 또는 16-23의 HMGB1 폴리펩티드와 동일하거나, 또는 적어도 99 % 동일, 적어도 98 % 동일, 적어도 95 % 동일, 적어도 90 % 동일, 적어도 85 % 동일, 또는 적어도 80 % 동일한 폴리펩티드를 포함한다.
하기에 더욱 상세하기 기재되는 바와 같이, 백신 벡터는 대상체에서 CD40에 결합할 수 있고 대상체가 벡터 및 그의 관련된 항원에 반응하도록 자극할 수 있는 CD154 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 수지상 세포(DC)의 관여는 순수한 T 세포를 활성화시켜 T 세포 확장 및 효과기 세포로의 분화를 유발하는 독특한 능력을 가지기 때문에, 강력한 면역 반응을 개시하는데 필수적이다. 사실상 모든 신체 조직에서 발견되는 항원 제시 세포(APC)인 DC의 역할은 항원을 포획하고, 이들을 관련 림프양 조직으로 수송한 다음, 이들을 순수한 T 세포에 제시하는 것이다. DC에 의한 활성화 시, T 세포는 확장되고, 효과기 세포로 분화하고, 제2 면역 기관을 떠나 말초 조직으로 진입한다. 활성화된 세포독성 T 세포(CTL)는 바이러스-감염된 세포, 종양 세포 또는 심지어는 세포내 기생충(예컨대, 살모넬라)으로 감염된 APC를 파괴시킬 수 있고, 바이러스 감염에 대해 방어하는데 중요한 것으로 나타났다. CD40은 TNF-수용체 패밀리 분자의 구성원이고, 전문적인 항원-제시 세포(APC), 예컨대, DC 및 B 세포를 포함하는 다양한 세포 유형에서 발현된다. CD40과 그의 리간드 CD154의 상호작용은 체액성 및 세포성 면역 모두에서 매우 중요하고, 이를 위해 자극성을 띤다. DC 표면 상에서 발현된 CD40을 통한 DC의 자극은 항-CD40 항체에 의해 모의될 수 있다. 그러나, 이는 신체 내에서는 활성화된 T-세포의 표면 상에서 발현된 CD40에 대한 천연 리간드(즉 CD154)와의 상호작용에 의해 발생한다. 흥미롭게도, CD154의 CD40-결합 영역이 확인되었다. CD154의 CD40-결합 영역은 벡터, 예컨대, 살모넬라 또는 바실루스 벡터의 표면 상에서 발현될 수 있고, 본원에서 제공되는 실시예 및 U.S. 특허 공보 제2011/0027309(그 전체가 본원에 참조문헌으로서 포함됨)에서 나타난 바와 같이, 공동-제시된 펩티드 서열에 대하여 증진된 면역 반응을 이끈다. CD154 폴리펩티드는 CD154 전장의 단백질의 일부 또는 전체 CD154 단백질일 수 있다. 적합하게, CD154 폴리펩티드는 CD40에 결합할 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 항원에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있는 CD154 폴리펩티드를 코딩하는 CD154 폴리뉴클레오티드는 백신에 포함될 수 있다. 적합하게, CD154 폴리펩티드는 50개 미만의 아미노산 길이, 더욱 적합하게 40개 미만, 30개 미만 또는 20개 미만의 아미노산 길이이다. 폴리펩티드는 10 내지 15개의 아미노산 길이, 10 내지 20개의 아미노산 길이 또는 10 내지 25개의 아미노산 길이일 수 있다. CD154 서열 및 CD40 결합 영역은 다양한 종들 사이에 고도로 보존되지 않는다. 닭 및 인간의 CD154 서열은 각각 서열 24 및 서열 25에 제공된다.
인간, 닭, 오리, 마우스 및 소를 포함하는 다수의 종에 대한 CD154의 CD40 결합 영역이 결정되었고, 이는 각각 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29 및 서열 30에 나타난다. 비록 종 사이에는 CD40 결합 영역의 서열에서 가변성이 있지만, 인간 CD154 폴리펩티드는 닭에서 면역 반응을 증진시킬 수 있었다. 그러므로, 본 발명자들은 종 특이적 CD154 폴리펩티드 또는 이종성 CD154 폴리펩티드를 사용하여 본 발명을 실시할 수 있다. 따라서, 서열 24-30의 CD154 폴리펩티드가 백신 벡터에 포함될 수 있거나, 또는 서열 24-30의 서열과 적어도 99, 98, 97, 96, 95, 93, 90 또는 85 % 동일한 폴리펩티드가 백신 벡터에 포함될 수 있다.
CD154로부터의 폴리펩티드는 적어도 부분적으로는 그의 수용체인 CD40에 결합함으로써 면역 반응을 자극시킨다. 폴리펩티드는 대상체의 면역 세포 상에서 발현되고, 대식세포 및 다른 항원 제시 세포 상의 CD40 수용체에 결합할 수 있는 CD154 폴리펩티드에 상동성이다. 이 리간드-수용체 복합체의 결합이 대식세포(및 대식세포 계통 세포, 예컨대 수지상 세포)를 자극하여, 다른 국소 면역 세포(예컨대, B-림프구)를 활성화시키는 것으로 공지된 시토카인 분비를 증가시킴과 동시에, 식균작용 및 항원 제시를 증진시킨다. 이로써, 면역 반응 및 확장된 항체 생산을 위해 CD154 펩티드와 관련된 분자가 우선적으로 표적화된다.
항원성 폴리펩티드 및 면역자극 폴리펩티드는 백신 벡터를 통해 전달된다. 백신 벡터는 세균, 효모, 바이러스 또는 리포솜-기반 벡터일 수 있다. 잠재적인 백신 벡터는 바실루스(바실루스 섭틸리스), 살모넬라(살모넬라 엔테리디티스), 쉬겔라, 에스케리치아(대장균), 예르시니아, 보르데텔라(Bordetella), 락토코쿠 스(Lactococcus), 락토바실루스, 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 비브리오(비브리오 콜레라), 리스테리아(Listeria), 효모 예컨대 사카로미세스속(Saccharomyces), 또는 피치아(Pichia), 아데노바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스바이러스, 알파바이러스 및 아데노-관련 바이러스를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 생 세균, 효모 또는 바이러스 백신 벡터는 면역약화된 개체에게는 여전히 위험을 초래할 수 있고, 추가의 정밀 조사가 요구될 수 있다. 따라서, 사멸되거나 불활성화되거나 또는 미국 식품의약국(Food and Drug Administration)(FDA)에 의해 일반적으로 안전하다고 인정되는(Generally Recognized As Safe)(GRAS) 생물체로서의 자격을 얻은 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 문제는 이러한 벡터를 사용하여 강력한 면역 반응을 발생시키는 것이다. 세균, 효모 또는 바이러스 백신 벡터를 불활성화시키거나 사멸시키는 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 방법, 예컨대, 포르말린 불활성화, 항생제-기반 불활성화, 열 처리 및 에탄올 처리를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 본 발명자들은 백신 벡터의 표면 상에 면역자극 폴리펩티드, 예컨대, HMGB1(고이동성 그룹 박스 1) 폴리펩티드를 포함함으로써, 바실루스 균 벡터 또는 다른 GRAS 벡터를 사용하여 항원성 폴리펩티드에 대한 강력한 면역 반응을 발생시킬 수 있다. 실제로, 이러한 벡터는 투여 후 복제가 불가능하고, 여전히 강력한 면역 반응을 유도할 수 있도록 불활성화될 수 있다. 백신 벡터는 병원성이 아닌 야생-형 세균, 효모 또는 바이러스일 수 있다. 대안적으로는 벡터는 벡터가 숙주에서 복제할 수 있는 제한된 능력을 가지거나, 또는 몇 세대 이상 동안 보충된 배지 없이는 성장할 수 없도록 약독화될 수 있다. 통상의 기술자는 벡터를 약독화하는 방법 및 그를 수행하는 수단이 다양하다는 것을 이해할 것이다.
항원성 폴리펩티드의 적어도 일부 및 면역자극 폴리펩티드의 적어도 일부가 백신 벡터 표면 상에 존재하거나 발현된다. 백신 벡터의 표면 상에 존재하는 것은 막횡단 단백질의 외부 루프 내에 포함되고, 막횡단 단백질, 막 지질 또는 막 고정된 탄수화물 또는 폴리펩티드와 상호작용하는, 예컨대, 그와 공유적으로 또는 화학적으로 가교-결합된 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드는 N-말단, C-말단 또는 막횡단 단백질 내 어느 위치에든 펩티드 결합을 통해 연결된(즉, 막횡단 단백질의 두 아미노산 사이에, 또는 막횡단 단백질의 하나 이상의 아미노산을 대신하여 삽입된(즉 결실-삽입)) 폴리펩티드를 포함하는 아미노산을 가짐으로써 막횡단 단백질 내에 포함될 수 있다. 적합하게, 폴리펩티드는 막횡단 단백질의 외부 루프 내로 삽입될 수 있다. 적합한 막횡단 단백질은 srtA, cotB 및 lamB이지만, 통상의 기술자는 다수의 적합한 막횡단 단백질이 이용가능하다는 것을 이해할 것이다. 폴리펩티드는 항원성 폴리펩티드 및 면역자극 폴리펩티드가 백신 벡터의 표면 상에서 발현될 수 있도록 막 또는 세포 벽 고정된 단백질 또는 지질에 연결될 수 있다.
상기 기술된 바와 같이, 항원성 또는 면역자극 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 벡터의 염색체 내로 삽입될 수 있거나, 또는 염색체외에서(예컨대, 플라스미드, BAC 또는 YAC 상에서) 유지될 수 있다. 통상의 기술자는 이들 폴리뉴클레오티드가 다양한 폴리뉴클레오티드 중의 프레임 내에 삽입될 수 있고, 벡터의 상이한 부분에서 발현될 수 있거나, 또는 분비될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있는 면역자극 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 항원성 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 면역자극 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결될 수 있고, 이로써 벡터 중 두 폴리펩티드는 동일한 폴리펩티드의 일부이다. 실시예에서, 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 면역자극 폴리펩티드를 코딩한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드를 코딩하는 두 폴리뉴클레오티드 모두는 살모넬라 엔테리디티스 또는 또다른 백신 벡터의 lamB 유전자의 루프 9 중의 프레임내로 삽입된다. 통상의 기술자는 다른 막횡단 단백질을 코딩하는 세균 폴리뉴클레오티드 및 lamB 유전자의 다른 루프 또한 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
대안적으로, 항원성 폴리펩티드 및/또는 면역자극 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 백신 벡터의 표면 상의 단백질, 지질 또는 탄수화물과의 회합을 통해 백신 벡터의 표면 상에 표출되거나 제시되는 분비된 폴리펩티드 내로 삽입될 수 있다. 통상의 기술자는 항원성 폴리펩티드 및/또는 면역자극 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 매우 다양한 백신 벡터 폴리뉴클레오티드에 삽입되어 백신 벡터로 처리된 대상체의 면역 세포에 항원성 폴리펩티드 및/또는 면역자극 폴리펩티드의 발현 및 제시를 제공하도록 될 수 있다는 것을 이해할 것이다. PAL 항원성 폴리펩티드 및 면역자극 폴리펩티드의 코딩 영역은 리스테리아(Listeria)로부터의 소르타제에 대한 분류 모티프를 함유하는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 피브로넥틴 결합 단백질의 C-말단에 융합될 수 있다. 이는 분비 단백질이 그람 양성 세균 예컨대 바실루스의 세포 벽에 고정될 수 있도록 한다. 문헌[응우옌(Nguyen) 및 슈만(Schumann), J Biotechnol (2006) 122: 473-482](이는 그 전체가 본원에 참조문헌으로서 포함됨)을 참조할 수 있다. 다른 유사 방법 또한 사용될 수 있다.
대안적으로, 바이러스 벡터가 통상의 기술자에게 이용가능한 방법을 통해 사용된다면, 폴리펩티드는 막, 세포 벽 또는 캡시드에의 단백질, 지질 또는 탄수화물에 공유적으로 또는 화학적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 항원성 및 면역자극 폴리펩티드를 백신 벡터의 표면 상에 제시하는데 이-황화 결합 또는 비오틴－아비딘 가교-결합이 사용될 수 있다. 적합하게, 항원성 폴리펩티드 및 면역자극 폴리펩티드는 융합 단백질의 일부이다. 두 폴리펩티드는 펩티드 결합을 통해 직접 연결될 수 있거나, 또는 링커, 스페이서 또는 이들이 삽입되는 제3 단백질의 섹션에 의해 이격화될 수 있다. 실시예에서, 아미노산 스페이서가 폴리펩티드 사이에 사용되었다. 스페이서는 2 내지 20개의 아미노산, 적합하게는 3 내지 10개의 아미노산, 적합하게는 6 내지 8개의 아미노산일 수 있다. 적합하게, 스페이서 중의 아미노산은 소형 측쇄를 가지고, 비-하전된 것, 예컨대, 글리신, 알라닌 또는 세린이다. 스페이서는 아미노산 잔기의 조합을 가질 수 있다.
실시예에서, 백신 벡터는 동일한 폴리뉴클레오티드 상에서 코딩되고, 서로 프레임 내에 있는 항원성 폴리펩티드(서열 1 및 서열 31(캄피(Campy) Cj0113)) 및 면역자극 폴리펩티드(HMGB1)를 갖는다. 서열 42, 44 및 46을 참조할 수 있다. 특히, 각 폴리펩티드 단편 사이의 3개의 아미노산 스페이서를 사용하는 실시예에서, HMGB1 폴리펩티드가 백신 벡터 삽입의 N- 또는 C-말단 중 하나에 위치하는 백신 벡터가 후속 감염에 대한 최적의 방어의 결과를 이끈다. 최적 수행 백신 벡터는 CJ0113 이어서 PAL 이어서 HMGB1를 갖는다(N- 내지 C-말단 또는 서열 42). 따라서, 백신 벡터의 표면 상 항원 및 면역자극 폴리펩티드의 순서 또는 표출이 면역 반응에 영향을 미칠 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 면역자극 폴리펩티드 및 항원성 폴리펩티드는 다른 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. 통상의 기술자는 다양한 방법이 백신 벡터의 표면 상에서 항원성 폴리펩티드 및 HMGB1 폴리펩티드의 발현을 얻는데 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 방법은 통상의 기술자에게 공지되었다.
백신 벡터 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 제약학적으로 허용가능한 담체는 생체내 투여에 적합한 임의의 담체이다. 적합하게, 제약학적으로 허용가능한 담체는 경구, 비강 또는 점막 전달에 허용가능하다. 제약학적으로 허용가능한 담체는 물, 완충된 용액, 글루코스 용액 또는 세균 배양액을 포함할 수 있다. 조성물의 추가적인 성분은 적합하게 부형제, 예컨대 안정제, 보존제, 희석제, 유화제 및 윤활제를 포함할 수 있다. 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제의 예는 안정제, 예컨대 탄수화물(예컨대, 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로스, 글루코스, 덱스트란), 단백질, 예컨대, 알부민 또는 카제인, 단백질-함유 작용제, 예컨대 소 혈청 또는 탈지유 및 완충제(예컨대, 포스페이트 완충제)를 포함한다. 특히 이러한 안정제가 조성물에 첨가될 때, 조성물은 냉동-건조 또는 분사-건조에 적합하다. 조성물 중 백신 벡터는 복제할 수 없고, 적합하게, 백신 벡터는 조성물에 첨가되기 전 불활성화되거나 사멸화된다.
백신 벡터를 투여함으로써 대상체에서 면역 반응을 증진시키는 방법이 또한 제공된다. 백신 벡터는 서열 1-6, 32, 36, 37 또는 그의 면역원성 단편의 항원성 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 백신 벡터는 또한 면역자극 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 면역자극 폴리펩티드는 적합하게 천연적으로 척추동물 면역계와 관련이 있고, 면역 반응을 자극하는데 관여하는 폴리펩티드이다. 면역자극 폴리펩티드는 대상체의 천연 또는 적응 면역 반응을 자극시킬 수 있다. 적합하게 상기에 더욱 상세하게 기술되어 있는 HMGB1 폴리펩티드 또는 CD154 폴리펩티드가 면역자극 폴리펩티드로서 사용될 수 있다. 본원에서 제공되는 방법에서, 항원성 PAL 폴리펩티드 및 임의로 면역자극 폴리펩티드를 포함하는 백신 벡터를, 백신 벡터에 대한, 및 특히 항원성 폴리펩티드에 대한, 및 적합하게는 그람-음성 세균, 예컨대 살모넬라 및 대장균에 대한 대상체의 면역 반응을 증진시키는 유효량으로 대상체에 투여된다.
증진된 면역 반응은 항체 또는 T 세포 반응을 포함할 수 있다. 적합하게, 면역 반응은 방어 면역 반응이지만, 면역 반응은 완전하게 방어적이지 않을 수 있지만, 감염과 관련된 이환율 또는 사망률을 감소시킬 수 있다. 면역자극 폴리펩티드는 항원성 PAL 폴리펩티드 이외에도 백신 벡터에 존재하는 임의의 외부 항원 또는 항원성 폴리펩티드에 대한 대상체의 면역 반응을 증진시키는데 사용될 수 있다. 통상의 기술자는 면역자극 폴리펩티드가 백신 벡터에 존재하는 하나를 초과하는 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증진시키는데 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 면역 반응을 증진시키는 것은 대상체의 면역계에 의해 매개되는 치료학적 또는 예방학적 효과를 유도하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 구체적으로, 면역 반응을 증진시키는 것은 증진된 항체의 제조, 증진된 항체 중쇄의 종류 변환(class switching), 항원 제시 세포의 성숙, 헬퍼 T 세포의 자극, 세포용해성 T 세포의 자극 또는 T 및 B 세포 기억의 유도를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
적합하게, 백신 벡터는 HMGB1 폴리펩티드(서열 15)의 아미노산 150-183 및 89-109를 포함하는 폴리펩티드, 또는 그의 상동체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 실시예에서, HMGB1의 190 아미노산 폴리펩티드가 사용되었다. 적합하게, 폴리뉴클레오티드는 대상체와 동일한 종으로부터의 HMGB1 폴리펩티드를 코딩한다. HMGB1이 많은 종 사이에 고도로 보존되기 때문에, HMGB1 폴리펩티드 및 대상체의 이종성 조합(예컨대, 닭 백신에서 사용하기 위한 인간 HMGB1 폴리펩티드)이 본 발명의 방법에서 유용할 수 있다. HMGB1 폴리펩티드는 사용되어 임의의 외부 항원, 항원성 폴리펩티드 또는 백신 벡터 내에 또는 상에 존재하는 하나를 초과하는 폴리펩티드에 대해 대상체에서 면역 반응을 증진시킬 수 있다. 통상의 기술자는 HMGB1 폴리펩티드가 사용되어 백신 벡터 내에 존재하는 하나를 초과하는 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다. HMGB1로부터의 폴리펩티드는 적어도 부분적으로는 수지상 세포 및 대식세포를 활성화시키고, 이로써 시토카인, 예컨대 IL-1, IL-6, IFN-γ 및 TNF-α의 생산을 자극시킴으로써 면역 반응을 자극시킨다. 실시예에서, HMGB1의 폴리펩티드가 백신 벡터의 표면 상에서 발현되었다.
백신 벡터는 적합하게 CD40에 결합할 수 있고 CD40을 활성화시킬 수 있는 CD154 폴리펩티드를 함유할 수 있다. CD40에 결합할 수 있는 CD154 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신은 백신에 대한 대상체의 면역 반응을 증진시키거나, 또는 이를 일으키는데 효과적인 양으로 대상체에 투여된다. 적합하게, 백신은 인간 CD154 폴리펩티드(서열 25)의 아미노산 140-149를 포함하는 폴리펩티드, 또는 그의 상동체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 상기 언급한 바와 같이, 하나의 종으로부터 유래된 아미노산 140-149의 상동체는 다른 종에서의 면역 반응을 자극시키는데 사용될 수 있다. 적합하게, 폴리뉴클레오티드는 대상체와 동일한 종으로부터의 CD154 폴리펩티드를 코딩한다. 적합하게, 서열 26의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 인간 대상체에서 사용되고, 서열 27의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 닭에서 사용되고, 서열 28의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 오리에서 사용되고, 서열 29의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 마우스에서 사용되고, 서열 30의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 소에서 사용된다. 인간 CD154 폴리펩티드(서열 26)는 닭 백신에서 사용되었고, 외부 항원에 대한 면역 반응을 증진시키는 것으로 입증되었다. 따라서, CD154 폴리펩티드 및 대상체의 다른 이종성 조합은 본 발명의 방법에서 유용할 수 있다.
추가로, 살모넬라 균, 에스케리치아 균, 쉬겔라 균, 비브리오 균, 에르비니 아 균, 케브시엘라 균, 시트로박터 균, 예르시니아 균, 프로비덴시아 균 및 비슷한 세균으로부터 선택된 그람 음성 세균에 대한 면역 반응을 증진시키는 방법 및 그람-음성 세균으로의 후속 감염과 관련된 이환율을 감소시키는 방법이 개시된다. 간략하면, 방법은 대상체에 유효량으로, 항원성 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열 및 임의로, 면역자극 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신 벡터를 투여하는 것을 포함한다. 항원성 PAL 폴리펩티드는 서열 1-6을 포함할 수 있다. 항원성 PAL 폴리펩티드의 삽입은 문헌[BMC Biotechnol. 2007 Sept, 17: 7(1): 59, Scarless and Site-directed Mutagenesis in Salmonella Enteritidis chromosome](이는 그 전체가 본원에 참조문헌으로서 포함됨)에 기재된 무자국(scarless) 부위-지정 돌연변이 시스템, 및 문헌[응우옌 및 슈만, J Biotechnol 2006 122: 473-482](이는 그 전체가 본원에 참조문헌으로서 포함됨)에 기재된 바와 같은, 본원에서 사용된 방법을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아닌, 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 벡터는 또한 바이러스, 예컨대 인플루엔자 M2e 또는 세균, 예컨대 살모넬라, 캄필로박터 또는 대장균을 포함하는 다른 병원체로부터의 다른 항원성 폴리펩티드와 함께 항원성 PAL 폴리펩티드를 발현하도록 조작될 수 있다. 특히, CD40 또는 HMGB1에 결합할 수 있는 CD154의 폴리펩티드는 항원성 PAL 폴리펩티드에 대한 대상체의 면역 반응을 증진시키기 위해 벡터에 의해 발현될 수 있다.
항원성 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 또한 그람-음성 세균에 의한 후속 감염과 관련된 이환율을 감소시키는데 사용될 수 있다. 조성물은 세균이 질환을 유발하는 것을 방지할 수 있거나, 또는 본원에 기재된 조성물 또는 백신 벡터를 투여받은 대상체에서 임의의 관련된 이환율을 제한하거나, 감소시킬 수 있다. 본원에 기재된 조성물 및 백신 벡터는 질환의 기간, 체중 감소, 질환 증상의 중증도를 감소시키거나, 질환과 관련된 이환율 또는 사망률을 감소시키거나, 또는 질환에 걸릴 가능성을 감소시킴으로써 후속 질환의 중증도를 감소시킬 수 있다. 조성물은 또한 전파를 억제시킴으로써 병원체의 확산을 감소시킬 수 있다. 본원에 기재된 백신 벡터의 투여 이후, 질환과 관련된 이환율 또는 사망률은 백신 벡터가 제공되지 않은 유사 대상체와 비교하였을 때 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 또는 심지어는 100 %만큼 감소될 수 있다.
동물 또는 인간에의 투여를 위해, 조성물은 비강내로, 점막으로, 분사에 의해, 진피내로, 비경구적으로, 피하로, 복강내로, 정맥내로, 두개내로, 경구로, 에어로졸에 의해 또는 근육내로를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 다양한 수단에 의해 투여될 수 있다. 점안 투여, 경구 위관 영양법 또는 식수 또는 식품에의 첨가가 추가적으로 적합하다. 가금류의 경우, 조성물은 난내로 투여될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태는 대상체에서 면역 반응을 증진시키는 방법을 제공한다. 적합한 대상체는 척추동물, 적합하게 포유동물, 적합하게 인간, 및 조류, 적합하게 인간, 및 조류, 적합하게, 가금류, 예컨대 닭 또는 칠면조를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 다른 동물, 예컨대 소, 고양이, 개 또는 돼지 또한 사용될 수 있다. 적합하게, 대상체는 비-인간이고, 농업용 동물일 수 있다.
투여하고자 하는 백신의 유용한 투여량은 대상체의 연령, 체중 및 종, 투여의 모드 및 경로, 및 면역 반응 유발의 대상이 되는 병원체의 유형에 따라 달라질 것이다. 조성물은 면역 반응을 유발하는데 충분한 임의의 투여량으로 투여될 수 있다. 103 내지 1010의 벡터 카피(즉, 균층 형성 단위 또는 플라크 형성 단위), 104 내지 109의 벡터 카피, 또는 105 내지 107의 벡터 카피 범위의 투여량이 적합하다는 것이 구성된다.
면역 반응을 증진시키기 위해 조성물은 단 1회 투여될 수 있거나, 또는 2 회 이상에 걸쳐 투여될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 1년 이상의 간격을 두고 2회 이상에 걸쳐 투여될 수 있다. 백신 벡터는 투여 이전에 생존가능한 미생물을 포함할 수 있지만, 일부 실시양태에서, 벡터는 투여 이전에 사멸될 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 대상체에서 복제될 수 있는 반면, 다른 실시양태에서, 벡터는 대상체에서 복제될 수 없는, 예컨대, 사멸된 백신 벡터 또는 리포솜일 수도 있다. 벡터로서 사용된 미생물을 불활성화시키는 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 세균 백신 벡터는 포르말린, 에탄올, 열 노출 또는 항생제를 사용하여 불활성화될 수 있다. 통상의 기술자는 또한 다른 방법도 사용할 수 있다.
다중의 항원에 대하여 증진된 면역 반응을 발생시키기 위해 동일 또는 상이한 병원체로부터의 수개의 에피토프 또는 항원이 조합하여 단일 백신으로 투여될 수 있다는 것이 구상된다. 재조합 백신은 다중 병원성 미생물, 바이러스 또는 종양 관련 항원으로부터의 항원을 코딩할 수 있다. 다중 항원을 발현할 수 있는 백신의 투여는 동시에 2 가지 이상의 질환에 대한 면역을 유도한다는 이점을 갖는다. 예를 들어, 생 약독화된 세균은 단일 병원체로부터의 다중 항원, 예컨대, 살모넬라로부터의 FliC 및 PAL에 대한, 또는 상이한 병원체, 예컨대, 인플루엔자 및 살모넬라로부터의 다중 항원에 대한 면역 반응을 유도하는데 적합한 벡터를 제공한다.
백신 벡터는 관련 기술분야에 주지된 방법을 사용하여 임의의 비-필수 부위에서 백신 벡터 내로 삽입될 수 있거나, 또는 대안적으로, 플라스미드 또는 다른 염색체외 비히클(예컨대, BAC 또는 YAC) 상에서 운반될 수 있는, 항원을 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 사용함으로써 구축될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위한 적합한 한 부위는 막횡단 단백질의 외부 부분 내에 존재하거나, 또는 분비 경로를 위해 외인성 폴리뉴클레오티드를 표적하고/거나, 세포 벽에 부착될 수 있도록 허용하는 서열에 커플링된다. 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위한 적합한 막횡단 단백질의 한 예로는 lamB 유전자가 있다. 세포 벽 부착의 적합한 한 방법은 실시예에 제공된다.
외인성 폴리뉴클레오티드는 병원성 미생물 또는 바이러스로부터 선택되는 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하지만, 이에 제한되지 않고, 효과적인 면역 반응이 발생되도록 하는 방식으로 발현되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 병원성 바이러스, 예컨대 인플루엔자(예컨대, M2e, 헤마글루티닌 또는 뉴라미니다제), 헤르페스바이러스(예컨대, 헤르페스바이러스의 구조 단백질을 코딩하는 유전자), 레트로바이러스(예컨대, gp160 외피 단백질), 아데노바이러스, 파라믹소바이러스, 코로나바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 또한 예컨대 세균 단백질, 예컨대 독소, 외막 단백질 또는 다른 고도로 보존되는 단백질을 코딩하는 유전자와 같이, 병원성 세균으로부터 수득될 수 있다. 추가로, 기생충, 예컨대 아피콤플렉산(Apicomplexan) 기생충으로부터의 외인성 폴리뉴클레오티드는 벡터 백신에서 사용하기 위한 것으로 관심의 대상이 되는 후보물질이 된다.
본 개시는 본원에 제시된 구축, 성분의 배열, 또는 방법 단계의 구체적인 상세한 설명으로 제한되지 않는다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 하기 개시에 비추어 통상의 기술자에게 자명한 다양한 방식으로 제조, 실시, 사용, 수행 및/또는 형성될 수 있다. 본원에서 사용된 어구 및 용어는 단지 기재하기 위한 것이며, 청구범위의 범주를 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 설명 및 청구범위에서 다양한 구조 또는 방법 단계를 지칭하기 위해 사용된 바, 예컨대 제1, 제2, 및 제3과 같은 서수의 표시는 임의의 구체적인 구조 또는 단계, 또는 이러한 구조 또는 단계에 대한 임의의 특정 순서 또는 배열을 나타내는 것으로 해석되지 않도록 한다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에서 달리 명시되지 않는 한, 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공되는 임의의 및 모든 예, 또는 예시 용어(예컨대, "예컨대")의 사용은 단순히 본 개시를 용이하게 하기 위한 것이고, 달리 청구되지 않는 한, 본 개시의 범주를 제한하는 것을 암시하는 것은 아니다. 본 명세서에서 어떤 용어도, 및 도면에 제시된 어떤 구조도, 청구되지-않은 임의의 요소가 개시된 주제의 실시에 필수적이라는 것을 나타내는 것으로 해석되지 않아야 한다. 용어 "비롯한," "포함하는," 또는 "가지는" 및 그의 파생어의 본원에서의 사용은 이하 열거되는 요소 및 그의 등가물 뿐만 아니라, 추가의 요소를 포함하는 것으로 한다. 특정 요소를 "비롯한," "포함하는," 또는 "가지는" 것으로 언급되는 실시양태는 또한 이들 특정 요소"로 본질적으로 이루어진," 및 이"로 이루어진" 것으로 간주된다. 용어 "한," "하나" 및 "그"는 달리 구체적으로 설명되지 않는 한, 하나 또는 하나를 초과하는 것을 의미할 수 있다.
본원에서 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 값을 범위로 언급하는 것은 단지 그 범위 내에 포함되어 있는 각각의 개별 값을 개별적으로 지칭하는 단축 방법으로서의 역할을 하는 것으로 하며, 각각의 개별 값은 마치 그 값이 본원에서 개별적으로 언급된 것과 같이 본 명세서에 포함된다. 예를 들어, 농도 범위가 1 % 내지 50 %로 언급되었다면, 값, 예컨대 2 % 내지 40 %, 10 % 내지 30 %, 또는 1 % 내지 3 % 등이 본 명세서에서 명백하게 열거된 것으로 한다. 이는 단지 구체적으로 의도되는 한 예일 뿐이고, 열거된 최저값 및 최고값을 포함하여, 그 값 사이의 수치 값의 모든 가능한 조합이 본 개시에서 명백하게 언급된 것으로 간주되어야 한다. 특정의 언급된 양 또는 양의 범위를 기재하기 위해 단어 "약"을 사용하는 것은, 예컨대 제작 공차, 치수 측정시 계기 및 인간 오차 등으로 인해 해명될 수 있거나, 또는 자연적으로 그렇게 되는 값과 같은, 언급된 양에 매우 가까운 값이 상기 양에 포함된다는 것을 나타내는 것으로 한다. 양을 지칭하는 모든 백분율은 달리 언급되지 않는 한 중량%이다.
하기 실시예는 단지 예시적인 것이고, 본 발명의, 또는 첨부된 청구범위의 범주를 제한하는 것으로 되지 않는다. 본원에서 인용된 특허, 특허 공개 및 비-특허 문헌을 포함하는 모든 참고문헌은 그 전체가 본원에 참조문헌으로서 포함된다. 참고문헌에서의 언급내용과 본원에서의 언급된 것 사이에 임의의 상충이 존재할 경우, 이는 본원에 포함된 언급내용을 지지하는 방식으로 해결되어야 한다.
실시예
그람-음성 병원성 세균 및 면역원성 중 모두에서 고도로 보존된 폴리펩티드를 포함할 수 있는 고도로 보존된 폴리펩티드로서 대장균으로부터 Pal 폴리펩티드를 선택하였다. 대장균 서열을 Pal(P0A912)의 아미노산 106-124으로부터 선택하면서 시작하였다. 선택된 서열의 항원성 잠재능은 EMBL 및 NCBI 데이터베이스(Combet, C., C. Blanchet, C. Geourjon, and G. Deleage. 2000. NPS@: network protein sequence analysis. Trends Biochem Sci 25:147-50)에서 밝혀진 공고된 서열에 대한 네트워크 단백질 서열 분석(Network Protein Sequence Analysis) 프로그램을 사용하여 확인하였다. 서열을 그 다음 사용하여, EXPASY 서버 상의 생물정보학 스위스 기관(Swiss Institute of Bioinformatics)의 Blast 검색 엔진을 사용하여 서열 상동성에 대한 검색을 하도록 하였다. Blast 검색은 우리가 처음에 선택한 Pal 서열(TVEGHADERGTPEYNISLG (서열 8))과 동일한 서열을 가진 여러 단백질(Pal)을 찾았다. 동일한 서열을 가진 Pal 단백질의 목록은 대장균, 살모넬라 티 피 및 파라티피 균, 쉬겔라 균, 엔테로박터 균(Enterobacter spp), 시트로박터 균(Citrobacter spp), 크로노박터 균(Cronobacter spp)을 포함한다. 또한 94 %보다 높은 상동성을 갖는 Pal 단백질(제2 아미노산의 비슷한 치환을 갖거나 또는 갖지 않는 오직 하나의 아미노산이 다른)은 100 % 범위로 비브리오 균, 소달리스 균(Sodalis spp), 에르비니아 균, 클렙시엘라 균(Klebsiella spp), 디케야 균(Dickeya spp), 세라티아 균(Serratia spp), 프로테우스 균(Proteus spp), 제노라브두스 균(Xenorhabdus spp), 펙토박테리움 균(Pectobacterium spp) 및 판토에아 균(Pantoea spp)이다.
다른 병원체 종에 대한 항원을 최적화하기 위해, 제17 아미노산이 세린으로부터 알라닌으로 변경될 것이다. 새로운 서열은 TVEGHADERGTPEYNIALG(서열 32)이 된다. 이 서열은 100 % 범위로 비브리오 균, 소달리스 균, 에르비니아 균, 클렙시엘라 균, 디케야 균, 세라티아 균, 프로테우스 균, 제노라브두스 균, 펙토박테리움 균 및 판토에아 균 및 동일 또는 유사한 아미노산 서열에 대해 최적의 면역 자극을 제공할 것으로 예상된다. 이들 종의 단백질은 백신접종 후 면역 시스템에 의해 표적화되고, 이들 생물체에 대한 방어를 제공할 것으로 기대된다.
Pal 에피토프(TVEGHADERGTPEYNISLG (서열 8))는 바실루스 섭틸리스(BS) 벡터에 삽입되고 발현되었다. Pal 바실루스 구축물은 그 다음 바실루스 주쇄(BS BB) 또는 식염수로 비슷하게 처리된 닭과 비교해 부화일에 108 cfu/닭으로 경구 위관 영양법을 통해 닭을 백신접종시킴으로써 살모넬라에 대한 백신 벡터로서 시험되었다. 새는 부화-후 11일차에 동일한 처리로 부스팅되었다. 샘플은 17일차에 특이적 면역 반응에 대해 수확되었다. 백신에 대한 면역 반응이 혈청 IgG(도 1) 및 분비 회장 IgA(도 2)를 측정함으로써 평가되었다. 바실루스 상에 발현된 Pal의 선택된 서열로 백신접종 후, 대조군에 비하여 특히 Pal 서열에 대한 실질적인 혈청 및 분비 면역 반응이 있었다(도 1 및 2).
백신접종-후 11일차에 살모넬라 티피무륨(ST) 도전에 대한 바실루스 벡터 백신 후보물질의 평가가 부화-후 17일 및 21일(또는 도전 후 6일 및 10일)차에 백신접종된 닭의 맹장에서 살모넬라 균층의 수를 확인함으로써 착수되었다. 맹장 내 ST의 수준은 종래 미생물 기법을 사용하여 측정되었다. 바실루스 벡터 상에서 발현된 Pal의 선택된 서열로 백신접종된 닭은 맹장 내 살모넬라의 수준을 상당히 감소시켰다. 도 3에서 나타나는 바와 같이, 맹장 내 살모넬라의 수준은 식염수 또는 BS BB로 백신접종한 닭과 비교해 BS-PAL(BSNNP)로 백신접종한 닭에서 4½ 로그만큼 감소되었다. 이는 미국 식품의약국(FDA)에 의해 일반적으로 안전하다고 인정되는(GRAS) 미생물, 예컨대 바실루스 섭틸리스에 의해 벡터화된 살모넬라에 대한 제1 효과적인 백신이다.
상기 PAL(TVEGHADERGTPEYNISLG (서열 8))로 지칭되는 면역원 서열의 최적화를 목표로 한 조사에서, 에피토프 맵핑 실험이 이 19-mer 올리고펩티드 PAL의 부분의 상대적인 항원성에 접근하도록 설계되었다. 이 서열은 각 3 아미노산으로 오버랩되는 7 헥사펩티드로 분할되었다. 예를 들어, 각 TVEGHA(서열 39), GHADER(서열 2) 및 DERGTP(서열 3)은, 서열의 부분이 즉시 좌측(아미노 말단을 향해) 및 우측(카복시 말단을 향해)인 각각 3 아미노산을 공유한다. 이 목적을 위하여, 7개의 헥사펩티드 걸침 아미노산 잔기 1-3, 4-6, 7-9 등이 합성되고 소 혈청 알부민(BSA)에 연결된다. 살모넬라(및 관련된 종)의 세포 벽에 표출되는 것과 같은 PAL 19-mer 펩티드 및 천연 에피토프 모두와 강하게 반응하는 두 단일클론 항체(mAbs, 2B5 및 1B2로 지명)가 선택되고 그들의 PAL의 각 세그먼트에 대한 상대적인 친화도가 시험된다(도 4).
결과는, 시험된 7개의 펩티드 중에서, PAL1(3 잔기 pre-PAL, "YKV", 및 PAL 아미노 말단 잔기 "TVE"; 서열 38)이 두 mAb에 대해 가장 적은 항원성을 띄었음을 나타냈다. 이는 트레오닌이 하전되지 않은 아미노산이고 발린이 지방족 잔기이고, 이 둘은 상대적으로 소수성이고 따라서 원 면역원 PAL에 접근가능할 가능성이 더 낮다는 것을 관찰함으로서 설명될 수 있다. 접근가능성이 낮은 잔기는 잠재적인 면역 반응을 유도할 가능성이 낮다. 추가로, 대부분의 항체 에피토프는 자연적으로 친수성이다. 그와 반대로, 두 최적의 반응성의 mAb는 PAL6(서열 4) 및 PAL7(서열 6)에 대해 훨씬 더 높은 친화도를 갖는다(PAL1에 비해 ELISA 흡수 수준이 PAL6의 경우 2 배로 높고 PAL7의 경우 50 %보다 높음). 이들 결과는 PAL의 C-말단 절반이 살모넬라 및 관련 세균 종에 의해 표출되는 것과 같이 천연 단백질과 강하게 교차-반응되는 항체 수의 발생에 관한 면역원의 가장 결정적인 부분 및 면역원의 더 노출되고 접근가능한 부분이라는 것을 명확하게 나타낸다. 흥미롭게도, PAL7 헥사펩티드를 발생시키기 위하여, 원 19-mer PAL의 부분이 아니지만, 천연 세균 단백질: E(글루타메이트) 및 R(아르기닌) 내 플랭크 PAL인 2개 잔기가 첨가되었다. 이들 모두는 하전된 잔기이고 따라서 세균 표적 종에 노출될 높은 가능성을 갖는다.
상기 근거에 기초하여, PALbis(서열 1)로 지정된 새로운 19-mer가 발생되었다. PALbis는 (1) 이는 두 N-말단 아미노산 T(트레오닌) 및 V(발린)을 더이상 함유하지 않고 (2) 이는 두 추가의 잔기, 즉 E(글루타메이트) 및 R(아르기닌)로 C-말단이 연장되었다는 점에서, 원 PAL 19-mer와 상이하다. 따라서, 개선된 아미노산 서열, PALbis는 EGHADERGTPEYNISLGER(서열 1)이다. PALbis는 세균의 복수 속과 비교하여 교차-종 반응성이 유지됨(BLAST 결과는 표 1에 나타남)을 확인하였다. 대 장균, 살모넬라 티피 및 파라티피, 쉬겔라, 엔테로박터, 시트로박터, 및 크로노박터 균 중에서의 서열 상동성은 여전히 100 % 상동성을 갖는다. 비브리오, 소달리 스, 에르비니아, 클렙시엘라, 디케야, 세라티아, 프로테우스, 제노라브두스, 펙토 박테리움 및 판토에아 균 중에서의 서열 상동성은 단일 아미노산 치환 S15A(서열 6)가 있는 95 % 상동성을 갖는다. 관련된 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)가 서열 7과 같이 나타나고 서열 1의 서열과 65 % 동일성을 갖는다. 따라서, 단일 백신 벡터로 교차-균주 면역 반응을 얻기 위해, 서열 1을 발현하는 백신 벡터로 계속하도록 선택하였다.
<표 1>
세균 중 PALbis(서열 1)의 서열 비교
PALbis 서열:
EGHADERGTPEYNI S LGER 대장균(서열 1)
EGHADERGTPEYNI A LGER 비브리오(서열 6)
EG NC DE W GTDEYN QA LG__ 캄필로박터(서열 7)
Figure pct00001
Figure pct00002
PALbis(서열 1)가 교차-균주 도전 실험에서 작동하는 능력을 시험하기 위해, 여러 백신 후보물질을 만들었다. 본원에서 사용된 백신 벡터는 실질적으로 국제 공보 제WO2008/036675 및 국제 공보 제WO2011/091255에서 기재된 바와 같이 만들어졌다. 3개의 별개의 구축물이 만들어지고 2개의 별개 백신 벡터, 살모넬라 엔테리 디티스 또는 살모넬라 티피무륨에 포함되었다. 사용된 삽입물은 본원에서 서열 31로 기재된 및 원래 국제 공보 제WO2011/156619에 기재된 CJ0113 에피토프를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 원래 국제 공보 제WO2011/091255에 기재된 서열 24의 HMGB1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 본원에서 확인되고 기재된 서열 1의 PALbis 서열을 포함하였다. 3가지 폴리뉴클레오티드는 세린 스페이서(입체 장애 문제를 피하기 위해 삽입된 3개의 세린 잔기)에 의해 분리되고 프레임 내에서 살모넬라 막횡단 단백질 lamB의 외부 루프 9 내로 다양한 순서로 삽입된다. 그 결과의 삽입물의 핵산 및 아미노산 서열은 서열 41-46에서 나타난다. 서열 41 및 42는 각각 CJ0113-PAL-HMGB1 삽입물의 핵산 및 아미노산 서열이다. 서열 43 및 44는 각각 CJ0113-HMGB1-PAL 삽입물의 핵산 및 아미노산 서열이다. 서열 45 및 46은 각각 HMGB1-CJ0113-PAL 삽입물의 핵산 및 아미노산 서열이다. 다양한 순서의 동일한 삽입물로 3가지 백신 벡터를 만드는 목적은, HMGB1 결합 도메인이 숙주 세포 상의 수용체에 접근할 수 없도록 만들 수 있거나, 또는 표면-제시된 항원이 숙주 면역 세포에 접근할 수 없도록 만들 수 있는 벡터 작용제 상에 맵핑되지 않은 표면 잔기와 상호작용하는 폴리펩티드의 임의의 위치 또는 입체 장애 효과를 조절하기 위해서이다.
살모넬라 엔테리디티스 벡터 백신은 도전 후 살모넬라 하이델부르크 회수를 감소시켰다. 닭은 살모넬라 하이델부르크 도전 균주에 비하면 이종 살모넬라 혈청군에 속한 살모넬라 엔테리디티스 벡터 백신으로 백신접종하여, PAL 항원이 교차 살모넬라 혈청군 면역 반응을 발생시킬지 측정하였다. 생 살모넬라 엔테리디티스-CJ0113-PAL-HMGB1, 생 살모넬라 엔테리디티스-CJ0113-HMGB1-PAL(이는 나중에 HMGB1에 두 점 돌연변이 및 PAL에 프레임-시프트 돌연변이를 함유하여 서열 35의 PAL 에피토프가 되는 것으로 측정됨), 및 생 살모넬라 엔테리디티스-HMGB1-CJ0113-PAL(HMGB1에서 나중에 측정된 점 돌연변이가 있음) 백신이 4x108 cfu/닭으로 1-일차에 경구 위관 영양되었다. 닭은 경구 위관 영양법에 의해 7x106 cfu/닭으로 7일차에 살모넬라 하이델부르크로 도전되었다. 21-일차 브로일러 닭의 맹장으로부터 단리된 그램 당 살모넬라 하이델부르크 균층 형성 단위(cfu)가 결정되었다. 생 살모넬라 엔테리디티스-CJ0113-PAL-HMGB1 백신접종된 닭의 도전 14일 후 맹장으로부터 회수된 살모넬라 하이델부르크 cfu/g는 HMGB1 내 두 점 돌연변이 및 PAL 백신접종된 닭 내 프레임-시프트 돌연변이가 있는 생 살모넬라 엔테리디티스-CJ0113-HMGB1-PAL, HMGB1 백신접종된 닭 및 비-백신접종된 대조군 닭(도 5; P=0.003) 내 점 돌연변이가 있는 생 살모넬라 엔테리디티스-HMGB1-CJ0113-PAL보다 상당히 낮다.
닭은 또한 살모넬라 하이델부르크 도전에 비하면 이종 살모넬라 혈청군에 속한 글루타르알데히드-불활성화된 살모넬라 엔테리디티스 벡터 백신으로 백신접종하여, PAL 항원이 교차 살모넬라 혈청군 면역 반응을 발생시킬지 측정하였다. 글루타르알데히드-불활성화된 살모넬라 엔테리디티스-CJ0113-PAL-HMGB1, 살모넬라 엔테 리디티스-CJ0113-mHMGB1-mPAL(HMGB1 내 점 돌연변이 및 PAL 내 프레임시프트 돌연변이 있음), 살모넬라 엔테리디티스-mHMGB1-CJ0113-PAL(HMGB1 내 점 돌연변이 있음) 백신이 만노실화된 키토산(국제 출원 제PCT/US13/67212호에서 기재된 바와 같음)으로 아쥬반트되었다. 제조된 백신은 1x109 cfu/닭으로 1-일차 닭에 경구 위관 영양되도록 사용되었다. 닭은 경구 위관 영양법에 의해 8.5x106 cfu/닭으로 살모넬라 하이델부르크로 17일차에 도전되었다. 브로일러에 대한 글루타르알데히드-불활성화된 살모넬라 엔테리디티스-CJ0113-PAL-HMGB1 백신접종 및 살모넬라-엔테리디티스-mHMGB1-CJ0113-PAL 백신접종은 도전 후 5일차에 맹장으로부터 살모넬라 하이델부르크 회수를 상당히 감소시켰고(도 6; P<0.05), 살모넬라 하이델부르크 회수는 도전 후 17일차에 살모넬라 엔테리디티스-mHMGB1-CJ0113-PAL 및 살모넬라 엔테리디티스-CJ0113-PAL-HMGB1 백신접종된 닭에서 낮게 유지되었다(P=0.033). 이들 데이터는, 백신 주쇄가 살모넬라 혈청군 D 균주로부터 유래되고 살모넬라 혈청군 B 도전에 대해 방어함을 고려할 때, 이들 백신 내 PAL 및 PAL 에피토프가 교차-혈청군 살모넬라 도전에 대한 방어를 제공하는 것을 나타낸다.
특히, 삽입물 내에 돌연변이가 발견되었기 때문에, 이들 실험은 백신 내 3가지 폴리펩티드의 상대적인 배향 또는 위치의 임의의 효과가 있는지를 결정하는데 유용하지는 않았다. 돌연변이는 PAL 폴리펩티드의 방어적 또는 면역원성 부분에 관하여 유용한 정보를 준다. 단일 뉴클레오티드 결실은 살모넬라 엔테리디티스-CJ0113-mHMGB1-mPAL 백신의 PAL 폴리뉴클레오티드에서 발견되었다. 야생-형 PAL 뉴클레오티드 서열은 5'-GAAGGTCACGCGGACGAACGTGGTACCCCGGAATACAACATCTCTCTGGGTGAACGT-3'(서열 33; 돌연변이 서열 내 결실된 구아닌에 밑줄)이고 살모넬라 엔테리디티스-CJ0113-mHMGB1-mPAL 내 발견된 돌연변이 PAL 서열은 5'-GAAGGTCACGCGGACGAACGTGGTACCCCGAATACAACATCTCTCTGGGTGAACGT-3'(서열 34)이다. PAL 뉴클레오티드 서열 내 구아닌 결실(야생-형 서열에 밑줄) 31 염기쌍은 PAL 펩티드 서열의 마지막 8개 아미노산을 변경하는 프레임-시프트 돌연변이를 일으킨다. 서열 1의 야생-형 PAL은 서열 35(EGHADERGTPNTTSLWVN; 마지막 8개 아미노산은 서열 1에서 확인된 것들과 다르고 이에 밑줄)이 된다. 이 돌연변이 PAL에 의한 효과적인 면역 반응의 개발의 부족은, 상기 도 4에서 항체 반응의 개발에 중요한 것으로 나타난 PAL의 마지막 9개 아미노산의 손실로 인한 것으로 보여진다. 따라서 최소한의 PAL 에피토프는 서열 36(EYNISLGER) 또는 그것의 비브리오 대응 서열 37(EYNIALGER)일 수 있다.
백신은 상기 언급된 돌연변이를 고치기 위해 다시 만들어졌다. 일단 돌연변이가 고쳐지면, 브로일러에의 생 살모넬라 엔테리디티스-CJ0113-PAL-HMGB1, 생 살 모넬라 엔테리디티스-HMGB1-CJ0113-PAL 및 생 살모넬라 티피무륨-HMGB1-CJ0113-PAL 백신접종이 도전 후 10일차에 수집된 브로일러의 맹장으로부터 24 시간 동안 테트라티오네이트 농축 후 살모넬라 하이델부르크 회수를 상당히 감소시켰다(도 7; P<0.05). 부화일에 닭은 경구 위관 영양법에 의해 107 cfu의 생-살모넬라 엔테리디티스-CJ0113-PAL-HMGB1, 살모넬라 엔테리디티스-CJ0113-HMGB1-PAL, 살모넬라 엔테 리디티스-HMGB1-CJ0113-PAL, 살모넬라 티피무륨-CJ0113-PAL-HMGB1, 살모넬라 티피무륨-CJ0113-HMGB1-PAL 또는 살모넬라 티피무륨-HMGB1-CJ0113-PAL로 백신접종 되었다. 부화일 닭의 추가적 그룹은 경구 위관 영양법에 의해 106 cfu 살모넬라 엔테리디티스-CJ0113-PAL-HMGB1로 백신접종 되었다. 살모넬라 엔테리디티스-CJ0113-PAL-HMGB1, 살모넬라 엔테리디티스-CJ0113-HMGB1-PAL, 살모넬라 엔테리디티스-HMGB1-CJ0113-PAL, 살모넬라 티피무륨-CJ0113-PAL-HMGB1, 살모넬라 티피무륨-CJ0113-HMGB1-PAL 또는 살모넬라 티피무륨-HMGB1-CJ0113-PAL 백신접종된 닭은 107 cfu의 각 백신으로 14일차에 부스팅되었다. 부화일에 106 cfu를 접종받은 살모넬라 엔테리디티스-CJ0113-PAL-HMGB1 백신접종된 닭은 108 cfu의 살모넬라 엔테리디티스-CJ0113-PAL-HMGB1로 부스팅되었다. 닭은 경구 위관 영양법에 의해 6x106 cfu/닭으로 17일차에 도전되었고 그 결과는 도 7에 도전 세균 회수 백분율로 나타난다. 그 결과는 백신 벡터 내 각 삽입물의 위치가 백신에 의해 제공된 방어의 수준에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
살모넬라 엔테리디티스 세균 세포 표면 상에 PAL 발현은 항체 생성을 자극하기 위해 직접 B 림프구와 상호작용할 것이다. 살모넬라 엔테리디티스 세균 세포 표면상에 HMGB1 발현은 쥐류 대식세포 내로 식세포의 섭취 백분율에 영향을 미친다(도 8). Raw 264 세포계로부터의 쥐류 대식세포는 생 살모넬라 엔테리디티스 백신 벡터, 살모넬라 엔테리디티스-CJ0113-PAL-HMGB1, 살모넬라 엔테리디티스-CJ0113-HMGB1-PAL 또는 살모넬라 엔테리디티스-HMGB1-CJ0113-PAL로 한 시간 동안 공동-배양되었다. 대장균 pHrodo 붉은 생입자가 각 배지에 첨가되고 두 시간 동안 인큐베이팅되었다. 생입자 및 세균이 대식세포에 의해 삼켜진 후 파고솜이 생성된다. 파고솜은 파고리소좀의 내부를 산화시키는 리소좀과 융합한다. 생입자의 형광 강도는 pH가 더 산성이 됨에 따라 증가한다; 따라서, 파고리소좀 내에 있는 생입자는 더 높은 형광 강도를 가질 것이다. 살모넬라 엔테리디티스-CJ0113-PAL-HMGB1 백분율 식세포 섭취는 살모넬라 엔테리디티스-CJ0113-HMGB1-PAL보다 더 높은 살모넬라 엔테리디티스-HMGB1-CJ0113-PAL보다 더 높고, 이는 삽입물의 말단에서 HMGB1가 세포 표면과 유리하게 상호작용하고 식세포 섭취를 증진시킴을 시사한다.
이들 데이터를 바탕으로, 키메라 DNA의 선형 디스플레이는 하전된 아미노산의 위치에 의존하는 단백질 접힘을 변화시킨다. 항원 및 면역 자극 분자의 상이한 선형 조합은 세균 세포 표면 상에서 각 항원 및 면역 자극의 공간 배열에 영향을 미칠 것이다. 이들 선형 조합의 단백질 발현은 세균 세포 표면 상의 채널 단백질이 주위 채널 단백질과 입체 장애를 만들기 때문에 각 세균 종에 대해 다를 수 있다. 감소된 백신 효과는 입체 장애로 인해 불리한 PAL 또는 HMGB1 단백질 발현의 결과가 될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> PUMFORD, Neil LAYTON, Sherryll HARGIS, Billy BIELKE, Lisa FAULKNER, Olivia ABI-GHANEM, Daad BERGHMAN, Luc <120> COMPOSITIONS AND METHODS OF ENHANCING IMMUNE RESPONSES TO ENTERIC PATHOGENS <130> 5658-00203 <150> US 61/790,301 <151> 2013-03-15 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> E. coli <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> PAL bis from E. coli <400> 1 Glu Gly His Ala Asp Glu Arg Gly Thr Pro Glu Tyr Asn Ile Ser Leu 1 5 10 15 Gly Glu Arg <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 2 Gly His Ala Asp Glu Arg 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 3 Asp Glu Arg Gly Thr Pro 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 4 Glu Tyr Asn Ile Ser Leu 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 5 Ile Ser Leu Gly Glu Arg 1 5 <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> Vibrio spp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> PAL bis from vibrio spp. <400> 6 Glu Gly His Ala Asp Glu Arg Gly Thr Pro Glu Tyr Asn Ile Ala Leu 1 5 10 15 Gly Glu Arg <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Campylobacter spp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> corresponding peptide from Campylobacter spp. <400> 7 Glu Gly Asn Cys Asp Glu Trp Gly Thr Asp Glu Tyr Asn Gln Ala Leu 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 19 <212> PRT <213> E. coli <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> PAL from E. coli <400> 8 Thr Val Glu Gly His Ala Asp Glu Arg Gly Thr Pro Glu Tyr Asn Ile 1 5 10 15 Ser Leu Gly <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Avian Influenza virus m2e <400> 9 Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn 1 5 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Avian Influenza virus m2e <400> 10 Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn 1 5 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Avian Influenza virus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> Avian Influenza virus (HA5 UA) <400> 11 Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln 1 5 10 <210> 12 <211> 19 <212> PRT <213> Avian Influenza virus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> Avian Influenza virus (HA5 LB) <400> 12 Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn Asp Tyr 1 5 10 15 Glu Glu Leu <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Avian Influenza virus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Avian Influenza virus (NP 54-69) <400> 13 Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser 1 5 10 15 <210> 14 <211> 14 <212> PRT <213> Avian Influenza virus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Avian Influenza virus (NP 147-160) <400> 14 Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp 1 5 10 <210> 15 <211> 190 <212> PRT <213> Gallus gallus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(190) <223> Chicken HMGB1 amino acid <400> 15 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ser Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Leu Arg Tyr Glu Lys Glu Met Lys Asn Tyr Val Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Phe Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Val Asp Ala Gly Lys Lys Val Val Ala 165 170 175 Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp 180 185 190 <210> 16 <211> 85 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HMGB1 box a1 <400> 16 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ser Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Leu Arg Tyr Glu Lys Glu Met Lys Asn Tyr Val Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr 85 <210> 17 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HMGB1 box a2 <400> 17 Pro Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu 1 5 10 15 Arg Trp Lys Thr Met Ser Ser Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met 20 25 30 Ala Lys Ala Asp Lys Leu Arg Tyr Glu Lys Glu Met Lys Asn Tyr Val 35 40 45 Pro Pro Lys Gly Glu Thr 50 <210> 18 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HMGB1 box b1 <400> 18 Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe 1 5 10 15 Cys Ser Glu Phe Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser 20 25 30 Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala 35 40 45 Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu 50 55 60 Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr 65 70 <210> 19 <211> 69 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HMGB1 box b2 <400> 19 Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu 1 5 10 15 Phe Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp 20 25 30 Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp 35 40 45 Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu 50 55 60 Lys Asp Ile Ala Ala 65 <210> 20 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HMGB1 RAGE Binding domain <400> 20 Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe 1 5 10 15 Cys Ser Glu Phe Arg 20 <210> 21 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HMGB1 proinflammatory cytokine activity <400> 21 Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg Ala Lys Gly 1 5 10 15 Lys Val Asp Ala Gly Lys Lys Val Val Ala Lys Ala Glu Lys Ser Lys 20 25 30 Lys <210> 22 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(215) <223> HMGB1 <400> 22 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val 165 170 175 Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu 180 185 190 Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Asp Glu 195 200 205 Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu 210 215 <210> 23 <211> 205 <212> PRT <213> Danio rerio <220> <221> misc_feature <222> (1)..(205) <223> Zebra fish HMGB1 <400> 23 Met Gly Lys Asp Pro Thr Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr Ala 1 5 10 15 Tyr Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro Glu 20 25 30 Ala Thr Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg Trp 35 40 45 Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala Lys 50 55 60 Leu Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Asn Tyr Ile Pro Pro 65 70 75 80 Lys Gly Glu Lys Lys Lys Arg Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg 85 90 95 Pro Pro Ser Ala Phe Phe Ile Phe Cys Ser Glu Phe Arg Pro Lys Val 100 105 110 Lys Glu Glu Thr Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Arg Leu 115 120 125 Gly Glu Met Trp Asn Lys Ile Ser Ser Glu Glu Lys Gln Pro Tyr Glu 130 135 140 Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala 145 150 155 160 Tyr Arg Ser Lys Gly Lys Val Gly Gly Gly Ala Ala Lys Ala Pro Ser 165 170 175 Lys Pro Asp Lys Ala Asn Asp Glu Asp Glu Asp Asp Asp Glu Glu Glu 180 185 190 Asp Glu Asp Asp Asp Asp Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu 195 200 205 <210> 24 <211> 272 <212> PRT <213> Gallus gallus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(272) <223> CD154 chicken <400> 24 Met Asn Glu Ala Tyr Ser Pro Ala Ala Pro Arg Pro Met Gly Ser Thr 1 5 10 15 Ser Pro Ser Thr Met Lys Met Phe Met Cys Phe Leu Ser Val Phe Met 20 25 30 Val Val Gln Thr Ile Gly Thr Val Leu Phe Cys Leu Tyr Leu His Met 35 40 45 Lys Met Asp Lys Met Glu Glu Val Leu Ser Leu Asn Glu Asp Tyr Ile 50 55 60 Phe Leu Arg Lys Val Gln Lys Cys Gln Thr Gly Glu Asp Gln Lys Ser 65 70 75 80 Thr Leu Leu Asp Cys Glu Lys Val Leu Lys Gly Phe Gln Asp Leu Gln 85 90 95 Cys Lys Asp Arg Thr Ala Ser Glu Glu Leu Pro Lys Phe Glu Met His 100 105 110 Arg Gly His Glu His Pro His Leu Lys Ser Arg Asn Glu Thr Ser Val 115 120 125 Ala Glu Glu Lys Arg Gln Pro Ile Ala Thr His Leu Ala Gly Val Lys 130 135 140 Ser Asn Thr Thr Val Arg Val Leu Lys Trp Met Thr Thr Ser Tyr Ala 145 150 155 160 Pro Thr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr His Glu Gly Lys Leu Lys Val Glu 165 170 175 Lys Ala Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Val Ser Phe Cys Thr Lys 180 185 190 Ala Ala Ala Ser Ala Pro Phe Thr Leu Tyr Ile Tyr Leu Tyr Leu Pro 195 200 205 Met Glu Glu Asp Arg Leu Leu Met Lys Gly Leu Asp Thr His Ser Thr 210 215 220 Ser Thr Ala Leu Cys Glu Leu Gln Ser Ile Arg Glu Gly Gly Val Phe 225 230 235 240 Glu Leu Arg Gln Gly Asp Met Val Phe Val Asn Val Thr Asp Ser Thr 245 250 255 Ala Val Asn Val Asn Pro Gly Asn Thr Tyr Phe Gly Met Phe Lys Leu 260 265 270 <210> 25 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(261) <223> Human CD154 <400> 25 Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu 20 25 30 Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg 35 40 45 Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val 50 55 60 Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser 65 70 75 80 Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys 85 90 95 Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu 100 105 110 Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser 115 120 125 Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly 130 135 140 Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln 145 150 155 160 Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr 165 170 175 Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser 180 185 190 Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala 195 200 205 Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His 210 215 220 Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn 225 230 235 240 Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe 245 250 255 Gly Leu Leu Lys Leu 260 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(11) <223> Human CD154 peptide <400> 26 Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn 1 5 10 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Galus gallus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(11) <223> Chicken CD154 peptide <400> 27 Trp Met Thr Thr Ser Tyr Ala Pro Thr Ser Ser 1 5 10 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Anas sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Duck CD154 peptide <400> 28 Trp Asn Lys Thr Ser Tyr Ala Pro Met Asn 1 5 10 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Mouse CD154 peptide <400> 29 Trp Ala Lys Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Lys 1 5 10 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Bos taurus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Cow CD154 peptide <400> 30 Trp Ala Pro Lys Gly Tyr Tyr Thr Leu Ser 1 5 10 <210> 31 <211> 21 <212> PRT <213> Campylobacter jejuni Cj0113 <400> 31 Gly Val Ser Ile Thr Val Glu Gly Asn Cys Asp Glu Trp Gly Thr Asp 1 5 10 15 Glu Tyr Asn Gln Ala 20 <210> 32 <211> 19 <212> PRT <213> Vibrio spp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> Vibrio spp. alternative PAL epitope <400> 32 Thr Val Glu Gly His Ala Asp Glu Arg Gly Thr Pro Glu Tyr Asn Ile 1 5 10 15 Ala Leu Gly <210> 33 <211> 57 <212> DNA <213> E. coli <220> <221> misc_feature <222> (1)..(57) <223> E. coli nucleotide sequence for PAL epitope <400> 33 gaaggtcacg cggacgaacg tggtaccccg gaatacaaca tctctctggg tgaacgt 57 <210> 34 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence encoding in vector (CJ0113-HMGB1-PAL) <400> 34 gaaggtcacg cggacgaacg tggtaccccg aatacaacat ctctctgggt gaacgt 56 <210> 35 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence encoded by SEQ ID NO: 34 mutant PAL <400> 35 Glu Gly His Ala Asp Glu Arg Gly Thr Pro Asn Thr Thr Ser Leu Trp 1 5 10 15 Val Asn <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> E. coli <220> <221> misc_feature <222> (1)..(9) <223> Epitope of PAL from E. coli <400> 36 Glu Tyr Asn Ile Ser Leu Gly Glu Arg 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Vibrio spp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(9) <223> Epitope of PAL from Vibrio spp. <400> 37 Glu Tyr Asn Ile Ala Leu Gly Glu Arg 1 5 <210> 38 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 38 Tyr Lys Val Thr Val Glu 1 5 <210> 39 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 39 Thr Val Glu Gly His Ala 1 5 <210> 40 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 40 Gly Thr Pro Glu Tyr Asn 1 5 <210> 41 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic insert in CJ0113-PAL-HMGB1 nucleotide <400> 41 tcctcctccg gtgtttctat caccgttgaa ggtaactgcg acgaatgggg taccgacgaa 60 tacaaccagg cgtcctcctc cgaaggtcac gcggacgaac gtggtacccc ggaatacaac 120 atctctctgg gtgaacgttc ctcctccatg ggtaaaggcg acccgaaaaa accgcgtggt 180 aaaatgtctt cttacgcgtt cttcgttcag acctgccgtg aagaacacaa aaaaaaacac 240 ccggacgctt ctgttaactt ctctgaattc tctaaaaaat gctctgaaag atggaaaacc 300 atgtcttcta aagaaaaagg taaattcgaa gacatggcga aagcggacaa actgagatac 360 gaaaaagaaa tgaaaaacta cgttccgccg aaaggtgaaa ccaaaaaaaa attcaaagac 420 ccgaacgcgc cgaaacgtcc gccgtctgcg ttcttcctgt tctgcagcga attcagaccg 480 aaaatcaaag gtgaacaccc gggtctgtct atcggtgacg ttgcgaaaaa actgggtgaa 540 atgtggaaca acaccgcggc ggacgacaaa cagccgtacg aaaaaaaagc ggcgaaactg 600 aaagaaaaat acgaaaaaga catcgcggcg tacagagcga aaggtaaagt tgacgcgggt 660 aaaaaagttg ttgcgaaagc ggaaaaatct aaaaaaaaaa aagaagaaga agaagactcc 720 tcctcc 726 <210> 42 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic insert in CJ0113-PAL-HMGB1 amino acid <400> 42 Ser Ser Ser Gly Val Ser Ile Thr Val Glu Gly Asn Cys Asp Glu Trp 1 5 10 15 Gly Thr Asp Glu Tyr Asn Gln Ala Ser Ser Ser Glu Gly His Ala Asp 20 25 30 Glu Arg Gly Thr Pro Glu Tyr Asn Ile Ser Leu Gly Glu Arg Ser Ser 35 40 45 Ser Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser 50 55 60 Tyr Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His 65 70 75 80 Pro Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu 85 90 95 Arg Trp Lys Thr Met Ser Ser Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met 100 105 110 Ala Lys Ala Asp Lys Leu Arg Tyr Glu Lys Glu Met Lys Asn Tyr Val 115 120 125 Pro Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro 130 135 140 Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Phe Arg Pro 145 150 155 160 Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys 165 170 175 Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro 180 185 190 Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile 195 200 205 Ala Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Val Asp Ala Gly Lys Lys Val Val 210 215 220 Ala Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Ser 225 230 235 240 Ser Ser <210> 43 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic insert in CJ0113-HMGB1-PAL nucleotide CJ0113-HMGB1-PAL <400> 43 tcctcctccg gtgtttctat caccgttgaa ggtaactgcg acgaatgggg taccgacgaa 60 tacaaccagg cgtcctcctc catgggtaaa ggcgacccga aaaaaccgcg tggtaaaatg 120 tcttcttacg cgttcttcgt tcagacctgc cgtgaagaac acaaaaaaaa acacccggac 180 gcttctgtta acttctctga attctctaaa aaatgctctg aaagatggaa aaccatgtct 240 tctaaagaaa aaggtaaatt cgaagacatg gcgaaagcgg acaaactgag atacgaaaaa 300 gaaatgaaaa actacgttcc gccgaaaggt gaaaccaaaa aaaaattcaa agacccgaac 360 gcgccgaaac gtccgccgtc tgcgttcttc ctgttctgca gcgaattcag accgaaaatc 420 aaaggtgaac acccgggtct gtctatcggt gacgttgcga aaaaactggg tgaaatgtgg 480 aacaacaccg cggcggacga caaacagccg tacgaaaaaa aagcggcgaa actgaaagaa 540 aaatacgaaa aagacatcgc ggcgtacaga gcgaaaggta aagttgacgc gggtaaaaaa 600 gttgttgcga aagcggaaaa atctaaaaaa aaaaaagaag aagaagaaga ctcctcctcc 660 gaaggtcacg cggacgaacg tggtaccccg gaatacaaca tctctctggg tgaacgttcc 720 tcctcc 726 <210> 44 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic insert in CJ0113-HMGB1-PAL amino acid <400> 44 Ser Ser Ser Gly Val Ser Ile Thr Val Glu Gly Asn Cys Asp Glu Trp 1 5 10 15 Gly Thr Asp Glu Tyr Asn Gln Ala Ser Ser Ser Met Gly Lys Gly Asp 20 25 30 Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr Ala Phe Phe Val Gln 35 40 45 Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro Asp Ala Ser Val Asn 50 55 60 Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg Trp Lys Thr Met Ser 65 70 75 80 Ser Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala Lys Ala Asp Lys Leu 85 90 95 Arg Tyr Glu Lys Glu Met Lys Asn Tyr Val Pro Pro Lys Gly Glu Thr 100 105 110 Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala 115 120 125 Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Phe Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His 130 135 140 Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp 145 150 155 160 Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala 165 170 175 Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg Ala Lys 180 185 190 Gly Lys Val Asp Ala Gly Lys Lys Val Val Ala Lys Ala Glu Lys Ser 195 200 205 Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Ser Ser Ser Glu Gly His Ala 210 215 220 Asp Glu Arg Gly Thr Pro Glu Tyr Asn Ile Ser Leu Gly Glu Arg Ser 225 230 235 240 Ser Ser <210> 45 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic insert in HMGB1-CJ0113-PAL nucleotide <400> 45 tcctcctcca tgggtaaagg cgacccgaaa aaaccgcgtg gtaaaatgtc ttcttacgcg 60 ttcttcgttc agacctgccg tgaagaacac aaaaaaaaac acccggacgc ttctgttaac 120 ttctctgaat tctctaaaaa atgctctgaa agatggaaaa ccatgtcttc taaagaaaaa 180 ggtaaattcg aagacatggc gaaagcggac aaactgagat acgaaaaaga aatgaaaaac 240 tacgttccgc cgaaaggtga aaccaaaaaa aaattcaaag acccgaacgc gccgaaacgt 300 ccgccgtctg cgttcttcct gttctgcagc gaattcagac cgaaaatcaa aggtgaacac 360 ccgggtctgt ctatcggtga cgttgcgaaa aaactgggtg aaatgtggaa caacaccgcg 420 gcggacgaca aacagccgta cgaaaaaaaa gcggcgaaac tgaaagaaaa atacgaaaaa 480 gacatcgcgg cgtacagagc gaaaggtaaa gttgacgcgg gtaaaaaagt tgttgcgaaa 540 gcggaaaaat ctaaaaaaaa aaaagaagaa gaagaagact cctcctccgg tgtttctatc 600 accgttgaag gtaactgcga cgaatggggt accgacgaat acaaccaggc gtcctcctcc 660 gaaggtcacg cggacgaacg tggtaccccg gaatacaaca tctctctggg tgaacgttcc 720 tcctcc 726 <210> 46 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic insert in HMGB1-CJ0113-PAL amino acid <400> 46 Ser Ser Ser Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met 1 5 10 15 Ser Ser Tyr Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys 20 25 30 Lys His Pro Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys 35 40 45 Ser Glu Arg Trp Lys Thr Met Ser Ser Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu 50 55 60 Asp Met Ala Lys Ala Asp Lys Leu Arg Tyr Glu Lys Glu Met Lys Asn 65 70 75 80 Tyr Val Pro Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn 85 90 95 Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Phe 100 105 110 Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys 115 120 125 Glu Glu Glu Glu Asp Ser Ser Ser Gly Val Ser Ile Thr Val Glu Gly 130 135 140 Asn Cys Asp Glu Trp Gly Thr Asp Glu Tyr Asn Gln Ala Ser Ser Ser 145 150 155 160 Glu Gly His Ala Asp Glu Arg Gly Thr Pro Glu Tyr Asn Ile Ser Leu 165 170 175 Gly Glu Arg Ser Ser Ser 180

Claims (28)

  1. 서열 1, 서열 1과 90 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열 또는 6개 이상의 아미노산 길이의 이들의 면역원성 단편의, 백신 벡터의 표면 상에서 발현되는 PAL 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 백신 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 백신 벡터의 표면 상에서 발현되는 면역자극 폴리펩티드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하는, 백신 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 면역자극 폴리펩티드가 CD40에 결합할 수 있는 HMGB1 폴리펩티드 또는 CD154 폴리펩티드인, 백신 벡터.
  4. 제3항에 있어서, HMGB1 폴리펩티드가 서열 15-23 중 하나 이상 또는 서열 15-23 중 하나 이상의 단편으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는, 백신 벡터.
  5. 제3항에 있어서, CD154 폴리펩티드가 50개 미만의 아미노산을 가지고, 서열 24, 서열 25 또는 그의 상동체의 아미노산 140-149를 포함하는, 백신 벡터.
  6. 제5항에 있어서, CD154 폴리펩티드가 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29 또는 서열 30을 포함하는, 백신 벡터.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, PAL 폴리펩티드가 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 32, 서열 36, 서열 37 또는 그의 조합인, 백신 벡터.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 하나 초과 카피의 제1 폴리뉴클레오티드 및/또는 하나 초과 카피의 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 백신 벡터.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열이 프레임 내에서 제2 폴리뉴클레오티드 서열에 연결되는, 백신 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드가 스페이서 뉴클레오티드를 통해 연결되는, 백신 벡터.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 바이러스, 세균, 효모 및 리포솜으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 백신 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 백신 벡터가 바실루스 균(Bacillus spp.), 살모넬라 균(Salmonella spp.), 락토바실루스 균(Lactobacillus spp.) 또는 에스케리치아 균(Escherichia spp.)인, 백신 벡터.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는, 백신 벡터.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원성 폴리펩티드가 서열 7 또는 서열 31로부터 선택되는 폴리펩티드인, 백신 벡터.
  15. 서열 42, 44 또는 46 중 하나 이상의 폴리펩티드 또는 서열 42, 44 또는 46과 90 % 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 백신 벡터.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 백신 벡터 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제약학적 조성물.
  17. 그람-음성 세균에 대한 대상체의 면역 반응을 증진시키는데 효과적인 양으로 대상체에 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 백신 벡터 또는 제16항의 제약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 그람-음성 세균에 대한 면역 반응을 증진시키는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 증진된 면역 반응이 증진된 항체 반응, 증진된 T 세포 반응 또는 둘 다를 포함하는, 방법.
  19. 백신 벡터를 투여받지 않은 대조군 대상체와 비교하여 그람-음성 세균에 의한 대상체의 후속 감염과 관련된 이환율을 감소시키는데 효과적인 양으로 대상체에 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 백신 벡터 또는 제16항의 제약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 그람-음성 세균에 의한 감염과 관련된 이환율을 감소시키는 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 백신 벡터가 경구, 점막, 비경구, 피하, 근육내, 안내 및 난내로 이루어진 군으로부터 선택되는 경로에 의해 투여되는, 방법.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 가금류 종의 구성원인, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 가금류 종이 닭 또는 칠면조인, 방법.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 포유류인, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 대상체가 인간인, 방법.
  25. 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 약 104 내지 약 109 벡터 카피의 백신을 대상체에 투여하는, 방법.
  26. 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 약 105 내지 약 107 벡터 카피의 백신을 대상체에 투여하는, 방법.
  27. 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 백신 벡터가 대상체에 투여되기 이전에 사멸화되거나, 또는 대상체에서 복제될 수 없는 것인, 방법.
  28. 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 그람-음성 세균이 살모넬라 균, 에스케리치아 균, 쉬겔라 균(Shigella spp), 비브리오 균(Vibrio spp), 에르비니아 균(Erwinia spp), 케브시엘라 균(Kebsiella spp), 시트로박터 균(Citrobacter spp), 예르시니아 균(Yersinia spp) 및 프로비덴시아 균(Providencia spp)으로부터 선택되는 것인, 방법.
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