ITMI20011986A1 - Metodo e composizione per l'attivazione di cellule presentanti l'antigene - Google Patents

Description

Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:

“METODO E COMPOSIZIONE PER L’ATTIVAZIONE DI CELLULE PRESENTANTI L’ANTIGENE”

La presente invenzione riguarda un metodo per indurre l’attivazione (maturazione) di cellule presentanti l' antigene, le composizioni usate a tale scopo e il loro uso nell’attivazione della risposta immunitaria.

Le cellule presentanti l' antigene (APC) costituiscono un complesso di cellule in grado di internalizzare un antigene, processarlo ed esprimerne epitopi in associazione a molecole MHC di classe I e IL In generale si può dire che la caratteristica che accomuna le cellule del gruppo delle APC professionali è l’espressione sulla superficie cellulare di molecole MHC di classe II oltre che di classe I. Il gruppo comprende principalmente cellule dendritiche, macrofagi attivati, cellule microgliali del sistema nervoso centrale e linfociti B. Tra queste, le cellule dendritiche (DC) sono particolarmente specializzate nella presentazione degli antigeni e costituiscono una popolazione con caratteristiche distintive e un’ampia diffusione tissutale. Le DC sono coinvolte nell’attivazione della risposta immunitaria, che avviene mediante stimolazione dei linfociti T nel corso di varie patologie quali infezioni, malattie autoimmuni e rigetto di trapianti. L’attivazione o maturazione delle DC è un processo necessario per l’“innesco” delle cellule T e l’inizio della risposta immunitaria.

Nelle malattie autoimmuni e nel rigetto di trapianto, cioè in assenza di agenti patogeni, l’induzione della maturazione delle cellule dendritiche avviene attraverso molecole endogene, che possiedono attività immunogena in vivo. E noto che le cellule morenti contengono e rilasciano molecole in grado di amplificare la risposta immunitaria (3-8). Tali molecole, normalmente segregate all'intemo delle cellule vitali, rimangono tali nel processo apoptotico mentre vengono rilasciate durante la necrosi cellulare.

E inoltre noto che costituenti cellulari rilasciati nel terreno di coltura dopo necrosi cellulare sono in grado di provocare la maturazione delle DC (3,4). Diversamente, DC stimolate con cellule in stato apoptotico iniziale, o con il loro terreno di coltura, non vengono attivate (3-5, 9). Ugualmente, le DC non vengono attivate da leucociti polimorfonucleati necrotici (PMN).

Recentemente è stato riportato che la proteina non-istonica nucleare HMGB1 è rilasciata da cellule necrotiche (10). Nelle cellule vitali HMGB1 non si associa stabilmente alla cromatina; viene invece sequestrata dalla cromatina nucleare deacetilata durante l’apoptosi. HMGB1 extracellulare determina la produzione di TNF-α e di altre citochine ed è coinvolta nella patogenesi dello shock settico (12,13, WO00/47104). Inoltre, la concentrazione di HMGB1 aumenta durante lo shock emorragico in assenza di componenti batterici (14).

Si è ora sorprendentemente trovato che HMGB1 possiede un marcato effetto di induzione della maturazione di cellule dendritiche.

A conferma di ciò si è visto che HMGB1 si accumula nel terreno di coltura di cellule necrotiche che inducono maturazione delle DC, quali B-LCL o HeLa. Al contrario, il terreno di coltura di polimorfonucleati necrotici, privo di HMGB1, non induce attivazione delle stesse cellule dendritiche.

Dapprima si è valutato se HMGB1 rilasciata da cellule necrotiche fosse necessaria per la maturazione delle DC. A questo scopo, sono state stimolate cellule dendritiche con il terreno di coltura di fibroblasti embrionali di topo e con corrispondenti terreni di cellule Hmgbl-t-. Solo i terreni di fibroblasti necrotici contenenti HMGB1 inducevano la maturazione di DC. L’effetto specifico di HMGB1 è stato dimostrato impiegando HMGB1 ricombinante, che era in grado di indurre maturazione in misura pari alle cellule necrotiche. Si è visto inoltre che sia la proteina ricombinante, sia i terreni di coltura di cellule necrotiche non inducevano attivazione di DC in presenza di anticorpi neutralizzanti HMGB 1.

Si è quindi valutata la capacità di HMGB1 di indurre maturazione in vivo di DC presentanti l' antigene. Come prevedibile, essendo le cellule apoptotiche di linfoma di per sé scarsamente immunogene (perché riconosciute come “self’ dai topi ad esse singenici), tutti i topi inoculati con cellule RMA apoptotiche sviluppavano il tumore. Al contrario, l’ 80% degli animali immunizzati con cellule di linfoma in presenza di HMGB1 rigettavano il tumore, mentre nel rimanente 20% la crescita neoplastica era sostanzialmente ritardata.

Nell’insieme questi risultati indicano che HMGB1 attiva le cellule presentanti Γ antigene in vitro e in vivo. Si ritiene che HMGB1, una volta rilasciata dalle cellule necrotiche, fornisca alle DC il segnale necessario alla maturazione, e alla conseguente migrazione verso i linfonodi e inizio della risposta immunitaria.

Pertanto, secondo un primo aspetto l’invenzione è diretta all’uso di HMGB1, o di suoi frammenti dotati di attività biologica simile o aumentata rispetto alla proteina intera, preferibilmente i frammenti corrispondenti agli HMG box, per indurre l attivazione di cellule presentanti l antigene in vitro. Con il termine “cellule presentanti l antigene” s’intende il gruppo di cellule aventi le caratteristiche descritte all’inizio.

Gli indicatori d’attivazione possono variare in funzione del tipo cellulare considerato. Per quanto riguarda macrofagi, microglia e linfociti B, per esempio, si tratta di un’attivazione funzionale con aumento dell’espressione di membrana di molecole MHC e di molecole co-stimolatorie a seguito del contatto con altri adiuvanti, come descritto in (27, 28).

Nel caso delle cellule dendritiche, si considerano attivate o mature quelle cellule che mostrano un’ aumentata espressione di marcatori caratteristici del “fenotipo di maturazione”, quali le molecole di superficie CD83 e CD86, o una ridotta espressione di marcatori caratteristici del fenotipo immaturo, quali CD 115, CD 14, CD68 e CD32.

Le cellule dendritiche immature possono essere ottenute da precursori ematopoietici o da cellule staminali, per esempio da cellule PBMC, mediante opportuno trattamento con citochine quali GM-CSF, IL-4 e flt3-L.

L’attivazione o maturazione delle cellule presentanti l antigene può essere condotta a partire da una coltura di cellule immature o inattive, mediante aggiunta nel terreno di coltura della proteina HMGB1 ed eventualmente di altri fattori coadiuvanti quali citochine.

Una volta portate a maturazione o attivate, le cellule presentanti l’antigene, in particolare le DC, possono essere utilizzate per l’attivazione di linfociti T in risposta a determinati antigeni; i linfociti così attivati possono poi essere somministrati ad un soggetto per stimolarne la risposta immunitaria verso gli stessi antigeni.

Secondo una realizzazione preferita l invenzione è pertanto diretta ad un metodo ex vivo per l’attivazione di linfociti T che comprende i seguenti passaggi:

a) porre in contatto una preparazione di APC inattive con HMGB1, 0 con suoi frammenti biologicamente attivi, in modo da indurne l’attivazione;

b) porre in contatto le APC attivate con un determinato antigene; c) esporre i linfociti T alle APC attivate ed esposte all’antigene. Secondo una realizzazione preferita, in qualità di APC sono utilizzate le cellule dendritiche.

1 passaggi a) - c) sopra indicati possono essere eseguiti in diversa successione. Per esempio, l antigene può essere aggiunto ad una coltura di APC immature o inattive prima della proteina HMGB1 o dei suoi frammenti. Inoltre, le APC o DC possono essere trasfettate con un vettore per l’espressione di un determinato antigene o di un polipeptide da esso derivato, o ancora un vettore per l’espressione di una specifica molecola MHC. Antigeni associati a microrganismi, virus, tumori o malattie autoimmuni, sono utili per l’attivazione dei linfociti secondo il metodo descritto. Come antigeni tumorali, oltre alle proteine o loro frammenti isolati da tessuti o cellule tumorali, si possono usare cellule intere, uccise attraverso apoptosi o necrosi. Si possono inoltre utilizzare antigeni associati a virus o retrovirus, in particolare HIV, o a patogeni intracellulari, quali mycobacteria o plasmodia.

Secondo un altro aspetto, l’invenzione si riferisce all’uso di HMGB1, o di suoi frammenti biologicamente attivi, per la preparazione di composizioni farmaceutiche idonee a stimolare la risposta immunitaria verso un determinato antigene. Secondo una realizzazione preferita, tali composizioni verranno utilizzate nella vaccinazione, in particolare nella vaccinazione contro tumori e contro agenti infettivi. La proteina HMGB1 o i suoi frammenti, opportunamente formulati, potranno essere somministrati insieme all’antigene o separatamente da questo, con funzione di adiuvanti.

Secondo un ulteriore aspetto, l’invenzione comprende l’uso di anticorpi diretti contro HMGB1, o contro un suo frammento, o di altri inibitori funzionali, quali inibitori e antagonisti recettoriali, per il trattamento di patologie autoimmuni o infiammatorie. Il blocco dell’attività di HMGB1, infatti, impedisce la maturazione di cellule dendritiche in risposta a stimoli pro-infiammatori, e può essere utile nel trattamento di malattie infiammatorie e autoimmuni croniche in cui siano coinvolte cellule T auto-reattive o in cui sono coinvolti anticorpi ad alta affinità (p.e. malattie autoimmuni sistemiche o organo-specifiche, vasculiti).

Per gli scopi della presente invenzione, può essere utilizzata qualunque variante di specie della proteina HMGB1 dotata di attività biologica su cellule umane, preferibilmente la variante di mammifero (la proteina è sostanzialmente identica in tutti i mammiferi), ancora più preferibilmente quella umana, la cui sequenza amminoacidica è riportata in Bianchi et al., 1989, Specifìc recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1, Science 243: 1056-1059 (n. di accesso della sequenza su banca dati Y00463). HMGB1 può essere prodotta da cellule batteriche (Bianchi 1991, Gene 104: 271-275; Lee et al. 1998, Gene 225: 97-105), da lieviti (Mistry et al. 1997, Biotechniques 22: 718-729), oppure mediante purificazione da colture cellulari oppure da tessuti di mammiferi.

Metodi e risultati

Cellule

Cellule DC e neutrofili sono stati ottenuti da sangue di donatori sani, come descritto (26). Fibroblasti embrionali sono stati ottenuti da animali wild type e Hmgbl-/-. Tutte le linee sono state testate per contaminazione da mycoplasma mediante PCR.

Apoptosi e necrosi

Le cellule sono state uccise per necrosi a seguito di tre cicli di congelamento/scongelamento, come descritto (4). L’effettiva morte è stata confermata mediante analisi FACS dopo colorazione .con FITC-annexina V e propidio ioduro (9,26). L’apoptosi è stata indotta da radiazione UV (9).

Maturazione di DC

Cellule DC immature sono state stimolate con cellule apoptotiche o necrotiche (rapporto DC: cellule morte = 2:1) o con il loro terreno di coltura. Dove indicato, gli esperimenti sono stati condotti in presenza o in assenza di anticorpi policlonali anti-HMGBl (Pharmingen). In esperimenti paralleli, le DC sono state incubate con HMGB1 purificate (0,1-100 ng/ml) o con la proteina HOXD9. La maturazione è stata valutata dopo 48 ore sulla base di evidenze morfologiche e citometria di flusso (9). La vitalità cellulare è stata valutata a diversi tempi di trattamento. Per escludere una possibile contaminazione da endotossina, sono stati condotti esperimenti in terreno contenente polimixina (Sigma; 70 u/ml), come descritto (12). In queste condizioni, l’aggiunta di LPS purificata (E. coli 026:B6 da Sigma, 100 ng/ml) non portava ad una significativa maturazione, mentre TNFα ricombinante causava un’efficace maturazione delle DC.

Produzione e detezione di HMGB1

Per l’espressione di HMGB1 di lunghezza completa in E. coli ceppo BL21(-), si è utilizzato il plasmide pT7-7-rHMGBlcm. La proteina è stata poi purificata (10). Gli estratti di cellule morenti ottenuti con detergente, o i sumatanti, trasferiti su membrane di nitrocellulosa, sono stati sondati con anticorpi policlonali specifici anti-HMGBle anticorpi anti-coniglio coniugati con FITC (Boehringer) (10). I nuclei sono stati contro-colorati con DAPI (10).

Immunizzazione

Topi C57BL/6 sono stati iniettati sottocute per due volte ogni settimana con PBS o lxlO<6 >cellule RMA apoptotiche, in presenza o in assenza di HMGB1 ricombinante (0,5 pg/topo). La contaminazione da endotossina, valutata con il test cinetico “QLC Limulus amebocyte celi lysate” (BioWhittaker, Walkersville, MD), era inferiore a 0,03 U/animale. Dopo 14 giorni i topi sono stati stimolati sottocute nel fianco opposto con 50xl0<3 >cellule RMA di linfoma vitali. L’aspetto e la grandezza del tumore sono stati valutati come descritto (18).

I risultati delle prove sperimentali sono riportati nelle figure allegate, di cui segue una descrizione:

Figura 1: I sumatanti di cellule necrotiche che causano maturazione di DC contengono HMGB1.

a. L’espressione delle molecole di superficie CD83 e CD86 è stata valutata mediante citometria di flusso su DC immature non trattate o su DC stimolate con Hela, B-LCL e PMN congelati/scongelati (F/T), o con i loro sumatanti (sup).

b. HMGB1 è stata valutata attraverso western blotting nel pellet (P) o nel sumatante (S) di HeLa, B-LCL o PMN F/T necrotiche. Come controllo, si è utilizzata HMGB1 ricombinante purificata (rHMGBl; 10, 50 o 100 ng/corsia).

c. La distribuzione intracellulare di HMGB1 è stata valutata mediante immunoistochimica in cellule PMN e HeLa (pannelli di destra). I nuclei sono evidenziati con colorazione DAPI (pannelli di sinistra).

Figura 2: HMGB1 è sufficiente a indurre la maturazione delle DC. a. L’espressione delle molecole di superficie HLA-DR, CD40, CD83, CD80 e CD86 è stata valutata attraverso citometria di flusso su DC immature non trattate o su DC trattate con rHMGBl (25 o 100 ng/ml).

b. L’incremento relativo nell’espressione di superficie è espresso come intensità di fluorescenza media (MFI) di cellule trattate con rHMGBl rispetto all’MFI di cellule DC immature non trattate.

Gli esperimenti sono stati ripetuti almeno tre volte con DC da diversi donatori. Le differenze sono statisticamente significative, in base agli algoritmi Kolmogorov-Smimov (*=D/s(n) valori>25). ;Figura 3: HMGB1 è necessaria alla maturazione delle DC indotta da cellule necrotiche. ;a. L’espressione delle molecole di superficie HLA-DR, CD40, CD83, CD80 e CD86 è stata valutata con citometria di flusso su DC immature non trattate o su DC trattate con i surnatanti di fibroblasti necrotici wild type (F/T /+) o dei corrispondenti fibroblasti Hmgbl-/-. ;b. L’incremento relativo nell’espressione di superficie è espresso come intensità di fluorescenza media (MFI) di DC trattate con i sumatanti di fibroblasti necrotici Hmgbl+/+ o di DC trattate con i surnatanti di fibroblasti necrotici Hmgbl-/- rispetto all’MFI di DC immature non tratattate. Gli esperimenti sono stati ripetuti almeno tre volte con DC da diversi donatori. Solo le DC trattate con i surnatanti di fibroblasti necrotici Hmgbl+/+ erano significativamente più alte, in base all’ algoritmo Kolmogorov/Smimov (*= D/s (n) valori > 25).

c. Anticorpi specifici per HMGB1 inibiscono la maturazione di DC indotta da rHMGBl (25 ng/ml). I risultati sono espressi come percentuale di inibizione, calcolata come segue: inibizione % = 100 x (1 - MFI di DC trattate con rHMGBl in presenza di anticorpi anti-HMGBl / MFI di DC trattate con rHMGBl senza anticorpi anti-HMGBl).

d. Anticorpi specifici per HMGB1 inibiscono la maturazione di DC indotta dai surnatanti di B-LCL necrotiche F/T. I risultati sono espressi come percentuale di inibizione, calcolata come segue: inibizione % - 100 x (1 -MFI di DC trattate con surnatanti di B-LCL necrotiche F/T in presenza di anticorpi anti-HMGBl / MFI di DC trattate con surnatanti di B-LCL necrotiche F/T senza anticorpi anti-HMGBl)

Figura 4: HMGB1 aumenta l’immunogenicità di cellule apoptotiche di linfoma.

La crescita sottocutanea di cellule di linfoma RMA è stata valutata in gruppi di cinque topi C57BL/6 vaccinati con PBS (cerchi vuoti), lxl 0<6 >cellule RMA apoptotiche (cerchi pieni chiari) o lxl 0<6 >cellule RMA apoptotiche in presenza di rHMGBl (0,5 pg/topo - cerchi pieni scuri).

a. I risultati mostrati (asse y) indicano la frazione di topi senza tumore a tempi diversi dopo somministrazione di cellule di linfoma vitali (asse x).

b. I risultati mostrati (asse y) indicano il diametro medio del tumore a tempi diversi dopo somministrazione di cellule di linfoma vitali (asse x).

Claims (12)

1. RIVENDICAZIONI 1. Uso della proteina HMGB1, o di suoi frammenti biologicamente attivi, per indurre l’attivazione di cellule presentanti l antigene in vitro.
2. 2. Uso secondo la rivendicazione 1, dove dette cellule presentanti Γ antigene sono cellule dendritiche.
3. 3. Uso della proteina HMGB1 o di suoi frammenti biologicamente attivi, per la preparazione di una composizione farmaceutica utile per stimolare la risposta immunitaria.
4. 4. Uso secondo la rivendicazione 3, in cui detta composizione è un vaccino.
5. 5. Uso secondo la rivendicazione 3, in cui detta composizione è un adiuvante vaccinico.
6. 6. Uso di anticorpi contro la proteina HMGB1 o di suoi inibitori funzionali per la preparazione di una composizione farmaceutica per il trattamento di patologie infiammatorie o autoimmuni.
7. 7. Metodo ex vivo per l’attivazione di linfociti T che comprende i seguenti passaggi: a) porre in contatto una preparazione di APC immature o inattive con HMGB1, o con suoi frammenti biologicamente attivi, in modo da indurne l’attivazione; b) porre in contatto le APC con un determinato antigene; c) esporre i linfociti T alle APC attivate e cimentate con l antigene, dove i passaggi a) e b) sono eseguiti indipendentemente uno dall’altro.
8. 8. Metodo secondo la rivendicazione 2, in cui gli antigeni sono associati a microrganismi, virus, tumori, malattie autoimmuni.
9. 9. Metodo secondo le rivendicazioni 7-8, in cui le APC vengono trasfettate con un vettore per l’espressione di un antigene o di una molecola MHC.
10. 10. Metodo secondo le rivendicazioni 7-9, in cui le APC sono cellule dendritiche.
11. 11. Composizione farmaceutica contenente la proteina HMGB1 o suoi frammenti biologicamente attivi.
12. 12. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 11, in forma di vaccino.