KR20150068998A - 숙주 세포 변형 방법 - Google Patents
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Abstract
숙주 세포로 핵산 서열을 삽입하는 신규한 방법이 본원에 기재된다. 삽입된 핵산 서열을 포함하는 유전학적으로 안정적인 숙주 세포 및 단백질의 생성에서 상기 숙주 세포를 이용하는 방법이 또한 본원에 기재된다.
Description
1
서론
숙주 세포에 핵산 서열을 삽입시키는 새로운 방법이 본원에 기재된다. 삽입된 핵산 서열을 포함하는 유전학적으로 안정적인 숙주 세포 및 단백질의 생성에서 상기 숙주 세포를 이용하는 방법이 또한 본원에 기재된다.
2
배경
단일 유전자 또는 작은 DNA 단편의 재조합 발현은 플라스미드에 재조합 유전자를 제공함으로써 가장 흔히 수행된다. 플라스미드는 분자생물학 기술에 의해 효과적으로 생성되고 조작될 수 있다[1]. 이들은 숙주 세포에 신속히 삽입되고, 원형 플라스미드 분자에서 또한 인코딩되는 내성 카세트에 의해 플라스미드를 포함하는 숙주 세포에 부여되는 항생제 선택에 의해 유지된다. 통상적으로, 재조합 단백질은 단백질을 인코딩하는 유전자를 함유하는 플라스미드를 이용하여 발현된다.
큰 DNA 단편의 재조합 발현은 다양한 제한을 갖는다. 예를 들어, 표준 발현 플라스미드는 큰 DNA 단편의 삽입 후에 종종 유전학적으로 불안정하다. 종종, 플라스미드 불안정을 극복하기 위한 시도로 여러 메커니즘에 의해 삽입된 DNA를 안정화시키는 요소를 함유하는 코스미드 및/또는 포스미드가 사용된다. 추가로, 플라스미드의 카피수는 복제 기점에 따라 다양한 자릿수(orders of magnitude)의 범위이며, 이들은 추가로 성장 상태[2], 배지 조성, 및 개별적 세포간 차이[3]에 의해 영향을 받을 수 있다. 또한, 오직 제한된 수의 코스미드 및 포스미드가 이용가능하다. 따라서, 다수의 큰 DNA 단편을 하나의 세포에서 조합시키는 것은 일반적으로 어렵다.
일반적으로 크거나 작을 수 있는 플라스미드의 추가 결점은 세포에서 에피솜 요소를 유지시키기 위해 선택압이 필요하다는 것이다. 선택압은 항생제의 사용을 필요로 하며, 이는 항생제에 대한 알레르기 반응의 위험 및 제조를 위한 추가 비용으로 인해 의약 제품의 생성에 바람직하지 않다. 또한, 선택압은 종종 완전하지 않아, 일부 클론이 플라스미드를 상실하고, 이에 따라 더 이상 재조합 생성물을 생성하지 않는 균일하지 않은 박테리아 배양을 발생시킨다[4].
추가로, 숙주 세포로의 큰 DNA 단편의 염색체 삽입은 어려운 일이다. E. 콜리(E. coli) 유전체로 큰 DNA 단편을 삽입하기 위한 전략이 사용되어 왔으나[5], 현존하는 방법은 숙주 세포 유전체의 요망되는 부위에 8 kb보다 큰 DNA 단편의 삽입을 허용하지 않는다.
3
개요
한 양태에서, 숙주 세포 유전체에 큰 연속적 DNA 서열을 삽입하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 상기 큰 DNA 서열은 다수의 구성요소, 예를 들어, 유전자, 프로모터, 종료자 등을 포함할 수 있고, 숙주 세포 유전체 내의 요망되는 위치에 선택적으로 삽입될 수 있다. 특정 구체예에서, 큰 DNA 서열은, 단편에 존재하는 하나 이상의 구성요소(예를 들어, 유전자)가 숙주 세포에 의해 발현되고, 예를 들어, 숙주 세포가 이러한 숙주 세포에 의해 일반적으로 발현되지 않는 하나 이상의 구성요소(예를 들어, 유전자)를 발현하고/하거나 숙주 세포가 이러한 숙주 세포에 의해 자연적으로 발현되는 구성요소(예를 들어, 유전자)를 발현하나, 상기 구성요소를 더 많이 발현하도록, 숙주 세포 유전체의 영역에 선택적으로 삽입될 수 있다.
특정 구체예에서, 숙주 세포 유전체로 큰 DNA 서열을 삽입하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 큰 DNA 서열은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 초과의 유전자를 포함한다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 숙주 세포로 삽입된 DNA 서열에 존재하는 유전자는 DNA 서열에 또한 존재하는 1개 또는 다수의 조절 서열 또는 프로모터의 조절하에 있다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 숙주 세포로 삽입된 DNA 서열은 큰 DNA 서열에 존재하는 유전자의 발현에 필수적이거나 이로운 추가 요소, 예를 들어, 인핸서, 종료자를 포함할 수 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 숙주 세포 유전체로 큰 DNA 서열을 삽입하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 큰 DNA 서열은 하나 이상의 오페론, 예를 들어, 일반적인 조절 신호 또는 프로모터의 조절 하의 유전자의 클러스터를 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 숙주 세포 유전체로 큰 DNA 서열을 삽입하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 숙주 세포 유전체는 추가로 숙주 세포 유전체와 일반적으로 관련된 DNA의 결실을 가지며, 즉, 상기 방법은 숙주 세포 유전체로의 이종성 DNA의 삽입 및 숙주 세포 유전체로부터의 일반적으로 존재하는 DNA의 제거 둘 모두를 발생시킨다. 특정 구체예에서, 큰 DNA 서열의 삽입은 동등한 크기의 숙주 세포 유전체로부터의 DNA의 서열의 제거 부위에서 이루어지며, 즉, 숙주 세포 유전체의 DNA가 삽입되는 DNA 서열에 의해 대체된다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 숙주 세포로의 헬퍼 플라스미드 및 공여체 플라스미드의 도입을 포함한다. 본원에서 사용되는 헬퍼 플라스미드는 숙주 세포의 유전체로의 큰 DNA 서열의 삽입에 필요한 요소를 포함하는(예를 들어, 유전자를 인코딩하는) 플라스미드를 포함하는 것을 의미한다. 본원에 기재된 방법에 따르면, 헬퍼 플라스미드는 숙주 세포 유전체 자체로 임의의 DNA를 통합시키는 것이 아니라, 본원에 기재된 공여체 플라스미드에 존재하는 삽입 DNA의 통합을 촉진한다. 헬퍼 플라스미드는 하기 섹션 5.1.1에 더 상세히 기재된다. 본원에서 사용되는 공여체 플라스미드는 숙주 세포 유전체로 삽입되는 큰 DNA 서열을 포함하는 플라스미드를 포함하는 것을 의미하며, 즉, 공여체 플라스미드는 숙주 세포 유전체에 그 자체의 일부를 "공여"한다(즉, 숙주 세포 유전체로 삽입되는 큰 DNA 서열이 공여된다). 특정 구체예에서, 본원에 제공된 공여체 플라스미드는 숙주 세포 유전체로의 큰 DNA 서열의 삽입에 필요하거나 유용한 다른 요소를 포함한다. 공여체 플라스미드는 하기 섹션 5.1.2에 더 상세히 기재된다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 큰 DNA 서열이 삽입된 유전체를 포함하는 숙주 세포(예를 들어, 원핵생물 숙주 세포, 예를 들어, E. 콜리)가 본원에 제공된다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본원에 기재된 방법은 관심 단백질, 예를 들어, 백신으로서 사용하기 위한 단백질, 당화된 단백질, 화장품에서 사용하기 위한 단백질 등을 생성시킬 수 있는 유전학적으로 안정적인 숙주 세포를 생성시키기 위해 이용될 수 있다. 본원에 제공된 방법의 결과로서, 상기 숙주 세포는 관심 유전자를 포함하는 DNA가 숙주 세포의 유전체로 직접 삽입된다는 사실로 인해, 특정 마커, 예를 들어, 항생제 선택 마커의 존재하에서 유지되고/되거나 증식될 필요는 없다.
특정 구체예에서, 공여체 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드를 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공되며, (a) 헬퍼 플라스미드는, (i) 제 1 프로모터의 조절하에 있는, 람다 red 재조합효소를 인코딩하는 열린해독틀; 및 (ii) 제 2 프로모터의 조절하에 있는, 숙주 세포 유전체에 존재하지 않는 인지 서열을 갖는 제한 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 열린해독틀을 포함하고; (b) 공여체 플라스미드는, (i) 5'에서 3' 방향으로, (1) 제한 엔도뉴클레아제의 인지 서열; (2) 적어도 0.5 킬레베이스(kb)의 제 1 상동성 영역, (3) 적어도 8 kb의 이종성 삽입 DNA, 및 (4) 적어도 0.5 kb의 제 2 상동성 영역; 및 (ii) 역선택(counterselection) 마커를 포함한다. 특정 구체예에서, 인지 서열은 적어도 18개의 염기쌍을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 제한 엔도뉴클레아제는 SceI이다.
본원에 기재된 방법에 따라 숙주 세포 유전체로 삽입된 이종성 삽입 DNA는 선택 마커를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 이종성 삽입 DNA가 선택 마커를 포함하는 경우, 선택 마커는 플립파제 인지 표적(flippase recognition target)(FRT) 부위에 플랭킹된다. 특정 구체예에서, 제 1 및 제 2 상동성 영역은 숙주 세포 유전체의 인접 영역에 대해 상동성이다.
본원에 기재된 공여체 플라스미드의 제 1 및 제 2 상동성 영역은 이종성 삽입 DNA의 삽입에 필요하거나 요망되는 임의의 크기일 수 있다. 예를 들어, 상동성 영역은 약 또는 적어도 0.5 kb, 0.6 kb, 0.7 kb. 0.8 kb, 0.9 kb, 1 kb, 1.1 kb, 1.2 kb, 1.3 kb, 1.4 kb, 1.5 kb, 1.6 kb, 1.7 kb, 1.8 kb, 1.9 kb, 2.0 kb, 또는 2.0 kb 초과일 수 있다. 특정 구체예에서, 제 1 및 제 2 상동성 영역은 동일 크기일 수 있다. 특정 구체예에서, 제 1 및 제 2 상동성 영역은 상이한 크기일 수 있다.
본원에 제공된 방법을 이용하여 본원에 기재된 숙주 세포로 삽입되는 이종성 삽입 DNA는 크기가 크며, 예를 들어, 이종성 삽입 DNA는 당 분야에 공지된 표준 방법을 이용하여 숙주 세포 유전체로 삽입될 수 없는 크기이다. 예를 들어, 본원에 제공된 방법을 이용하여 본원에 기재된 숙주 세포로 삽입되는 이종성 삽입 DNA는 약 또는 적어도 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 16 kb, 17 kb, 18 kb, 19 kb, 20 kb, 21 kb, 22 kb, 23 kb, 24 kb, 또는 25 kb일 수 있다.
3.1
약어 및 용어
본원에서 사용되는 HR로 약어화된 상동성 영역은 본원에 기재된 공여체 플라스미드에 존재하는 DNA의 영역을 나타낸다. HR은 DNA가 삽입되는 것을 의미하는 숙주 세포의 유전체에 존재하는 DNA의 영역과 상동성인 DNA의 영역이다. 특정 구체예에서, HR은 DNA가 삽입되는 것을 의미하는 숙주 세포의 유전체에 존재하는 DNA의 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 07%, 98%, 99%, 또는 99.5% 상동성이다. 특정 구체예에서, HR은 DNA가 삽입되는 것을 의미하는 숙주 세포의 유전체에 존재하는 DNA의 영역에 100% 상동성이다. 특정한 바람직한 구체예에서, HR은 DNA가 삽입되는 것을 의미하는 숙주 세포의 유전체에 존재하는 DNA의 영역과 적어도 99.5% 상동성이다.
본원에서 사용되는 표적 부위는 본원에 기재된 공여체 플라스미드의 상동성 영역에 상보적인 숙주 세포 유전체에 존재하는 부위를 나타낸다.
본원에서 사용되는 이종성 삽입 DNA는 본원에 기재된 방법을 이용하여 표적 숙주 세포 유전체로 삽입되는 본원에 기재된 공여체 플라스미드에 존재하는 DNA의 서열을 나타낸다.
DNA의 상황에서 본원에서 사용되는 삽입은 DNA의 또 다른 부분(예를 들어, 숙주 세포 유전체)으로 이종성 삽입 DNA를 도입시켜 이종성 삽입 DNA를 포함하는 DNA 분자(예를 들어, 변형된 숙주 세포 유전체)를 생성시키는 과정을 나타낸다.
본원에서 사용되는 수용체 세포는 본원에 제공된 방법에 따라 변형되는 숙주 세포를 나타내며, 예를 들어, 수용체 세포는 이종성 삽입 DNA를 포함하도록 변형된 유전체를 포함한다.
본원에서 사용되는 카세트는 유전자, 및 유전자 기능, 예를 들어, 항생제 내성의 표현형 발현에 필요한 상기 유전자의 조절 서열을 함유하는 DNA 서열을 나타낸다. 카세트는 또한 수용체 세포의 유전체 또는 또 다른 DNA 서열(예를 들어, 플라스미드)로부터의 카세트의 제거를 촉진하는 플랭킹 서열을 함유할 수 있다. 카세트와 관련될 수 있는 예시적 플랭킹 서열은 플립파제 인지 표적(FRT) 부위를 포함한다. 본원에 기재된 방법에 따르면, 항생제 선택(예를 들어, 특정 항생제 내성 마커를 발현하는 숙주 세포의 선택)은 선택 카세트 및 성장 배지 중 항생제를 이용하여 수행될 수 있다. 카세트는 내성에 대해 대문자 R이 후속되는 항생제 약어에 의해 약어화될 수 있으며, 예를 들어, ampR은 앰피실린(amp)에 내성을 부여하는 카세트를 나타낸다. 따라서, 이러한 명명법은 유전형이 아니라 표현형을 기재한다. 본원에 기재된 방법에 따라 사용되는 항생제에 대한 약어는 하기 표 6에 제공되어 있다.
본원에서 사용되는 O 항원 클러스터 및 rfb 클러스터는 O 항원의 생합성을 담당하는 유전자 클러스터를 나타낸다[6].
본원에서 사용되는 운데카프레놀 포스페이트는 Und-P로 약어화되고, 운데카프레놀 피로포스페이트는 Und-PP로 약어화된다.
본원에서 사용되는 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 무독화된 외독소 A는 EPA로 약어화된다. 본원에 기재된 EPA는 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 무독화될 수 있다[7].
다양한 수집물로부터의 E. 콜리 균주가 본원에서 언급된다. 상기 언급에서, upecGVXN"숫자", CCUG"숫자", 및 StGVXN"숫자"는 예테보리, 스웨덴, 및 GlycoVaxyn strain collection의 배양 수집물인 요로감염병원균 E. 콜리를 수집하는 역학 연구로부터의 균주를 나타내며, 여기서 "숫자"는 균주에 대해 지정된 특정 번호를 나타낸다.
4
도면의 간단한 설명
도 1. 공여체 플라스미드 pDOC-C 및 관련 요소의 개략적 맵. ampR: 베타 락탐 내성을 부여하는 유전자를 인코딩하는 DNA 카세트; sacB: 수크로스에 대한 민감성을 부여하는 발현 카세트; oriT: 복제 기점; MCS: 다중 클로닝 부위; SceI: 공여체 플라스미드로부터 DNA를 이동시키기 위한 호밍 엔도뉴클레아제(homing endonuclease) 제한 부위; DNA 삽입물: HR1과 HR2 사이의 수용체 세포 DNA를 대체하는 DNA 스트레치(stretch); HR1, HR2: 상동성 영역 1 및 2, 이들은 교차되거나 상동성 재조합이 발생하는 숙주 세포에 존재하는 DNA 영역이다; 선택 카세트: 통합된 클론을 스크리닝하기 위한 선택가능한 마커 유전자, 이러한 카세트는 카세트의 제거를 가능케 하는 부위 특이적 상동성 재조합 부위에 의해 플랭킹될 수 있다; 관심 DNA: 선택 카세트 제거 후 표적 균주 DNA 대신에 표적 균주에 남아있는 외래 DNA.
도 2. 통합 절차의 개략도. 다양한 단계의 절차가 괄호 내의 숫자에 의해 표지된다. 헬퍼 플라스미드, 공여체 플라스미드(원으로 표지된 pTKRED 및 pDOC) 및 염색체(스크리블(scribble))를 함유하는 표적 세포(직사각형)가 성장되고(1), IPTG 및 아라비노스로 유도되어(2), 상동성 재조합효소 람다 red 및 호밍 엔도뉴클레아제 SceI(가위(scissors))의 발현이 유도된다. 후자는 pDOC 공여체 플라스미드를 절단함으로써 삽입 DNA를 이동시켜, 세포 내부에 선형화된 삽입 DNA를 발생시킨다(3). 선형화된 삽입 DNA는 상동성 재조합 부위 HR1 및 2(굵은 흑색 막대)에서 교차 및 상동성 재조합을 촉진하는 람다 red 재조합효소에 대한 최적 기질이다. 효소 재조합은 교차된 얇은 흑색 선에 의해 표시된다(4). 생성된 균주는 HR1과 2 사이에 이전에 존재했던 DNA 대신에 삽입 DNA를 함유한다. 이후, 헬퍼 및 공여체 플라스미드는 본문에 기재된 바와 같은 다양한 절차에 의해 표적 세포로부터 상실('제거')된다.
도 3. (A) 상부 패널은 공여체 플라스미드의 E. 콜리 O1 rfb 클러스터를 나타내고, 플랭킹 HR은 균주 W3110의 수용체 유전체 내의 표적 부위(삽입 DNA 내의 HR 영역과 상동성인 부위)와 연결된 얇은 선으로 표시되며; 이탤릭체는 유전자명을 나타내고, 빈 화살표는 공여체 플라스미드로부터의 유전자를 나타내고, 속이 채워진 화살표는 통합 후에 제거되는 W3110로부터의 수용체 rfb 클러스터를 나타낸다. 흑색의 좁은 속이 채워진 박스는 FLP 매개 부위 특이적 재조합에 의한 clmR 제거를 위한 부위 특이적 재조합 부위를 나타낸다. 속이 채워진 큰 직사각형은 균주 W3110 O 항원이 음성이 되도록 하는 붕괴 삽입 요소를 포함하는 W3110의 wbbL 유전자를 나타낸다. 얇은 화살표 및 숫자는 PCR 시험 및 공여체 플라스미드 클로닝에 사용된 올리고뉴클레오티드의 어닐링 영역 및 수를 나타낸다. (B)는 세포 내의 O1 rfb 클러스터의 존재를 입증하는 콜로니 PCR의 결과를 도시한다. 하부 패널은 전기영동에 의해 아가로스 젤 상에서 분리되고, Gel Red DNA 염색으로 염색되고, UV광으로 조명되어 DNA를 시각화시킨 PCR 시험 반응물이다. PCR 반응물은 올리고뉴클레오티드 2241 및 2242(A 참조), 및 rfb 클러스터 삽입, waaL 결실, 및 선택 카세트 제거 후에 대조군 균주 및 균주 1, W3110 ΔO16::O1- clmR; 2, W3110 ΔO16::rfbO1; 3, W3110 ΔO16::rfbO1 ΔwaaL::clmR; 4, W3110 ΔO16::rfbO1 ΔwaaL 5, W3110 ΔwaaL; 6, W3110의 재현탁된 콜로니를 함유하였다.
도 4. 다양한 단계의 균주 작제물에서의 O1-당 발현의 시험. rfb 클러스터의 통합(W3110 ΔrfbO16::rfbO1- clmR, 패널 A), clmR 카세트의 제거(W3110 ΔrfbO16::rfbO1, 패널 B), waaL 붕괴(W3110 ΔrfbO16::rfbO1 Δw a aL::clmR, 패널 C), 및 waaL 결실로부터의 clmR 카세트 제거(W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL, 패널 D) 후의 E. 콜리 세포로부터의 단백분해효소 K 처리된 전체 세포 추출물. 배양물은 LB 배지에서 성장되었고, 37℃에서 밤새 인큐베이션되었고, 세포 용해질은 SDS Lammli 샘플 완충액에서 용해시키고, 1시간 동안 65℃에서 단백분해효소 K와 함께 인큐베이션시켜 처리되었다. 추출물은 SDS PAGE에 의해 분리되었고, 은 염색(LPS를 시각화시킴, A, C, D 상부 패널)을 이용하여 직접 발달되거나, 전기이동에 의해 니트로셀룰로스 막으로 이동된 후, 항-O1 항혈청으로 면역검출되었다(αO1; A, B, C, D 하부 패널). 대조군이 동시에 분석되었다(패널 A, B: upecGVXN140, 이는 이후의 통합을 위해 O1 rfb 클러스터를 증폭시키는데 사용된 임상 분리물임). 레인 번호가 표시되며, 흑색 박스 내에 균주 명칭이 제공된다. M: 마커 레인, 분자량은 kDa로 표시된다. "클론"으로 표지된 열은 실험으로부터 상이하게 분석된 클론을 나타낸다.
도 5. 2 AB 표지 및 MS/MS에 의한 균주 W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL로부터의 E. 콜리 O1 O 항원 분석. A. E. 콜리 O1 재조합 O 항원의 HPLC 분석. 세포 추출물은 기재된 바와 같이 처리되었고, 세포로부터의 건조된 유기 추출물은 가수분해되고 정제되었다. 생성된 Und-PP 결합된 다당류는 지질로부터 방출되었고, 추가로 정제되었고, 2 AB를 이용한 환원 말단에서의 환원성 아민화에 의해 표지되었다. 형광 방출은 GlycoSepN 컬럼 상에서의 정상 상 HPLC에 의해 표지된 다당류의 분리시에 측정되었다. 크로마토그램(채워진 크로마토그램)은 용리 시간에 따른 형광 트레이스이다(균주 W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL). 점선 트레이스는 O 항원을 발현하지 않는 대조군 샘플이다(W3110 ΔwaaL). 1개, 2개, 3개, 4개의 별표는 1개, 2개, 3개, 4개의 O 항원 반복 단위에 해당하는 피크를 나타내고, 5개의 별표는 6개의 반복 단위 분자의 단편이다. B. 패널 A로부터의 2개의 별표 HPLC 용리 분획의 MALDI-TOF/TOF 분석. 2개의 O1 반복 단위 Na+ 이온 부가물의 예상 질량에 해당하는 [m/z] = 1849가 MS/MS에 대해 선택되었고, 예상된 단당류 서열을 입증하는 Y 단편 이온 시리즈가 표시되어 있다.
도 6. EPA 4 부위의 O1 당화에 대한 삽입된 균주에 의한 EPA-O1 당단백질의 소규모 발현 시험. E. 콜리 세포(W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL)가 하기 실시예에 기재되는 바와 같이 EPA 발현 플라스미드(p659) 및 5개의 상이한 pglB 발현 플라스미드로 형질전환되었다. 세포는 성장되고, 아라비노스 및 IPTG로 유도되었고, 37℃에서 밤새 인큐베이션 후, 세포는 수거되었고, 원형질막주위 단백질 추출물이 제조되었다. 이후, 추출물은 SDS PAGE에 의해 분리되었고, 전기블로팅에 의해 니트로셀룰로스 막으로 옮겨지고, 면역검출되었다. 좌측 패널: 항-EPA 항혈청을 이용한 웨스턴 블롯, 우측 패널: 항-O1 항혈청을 이용한 웨스턴 블롯. PglB 플라스미드는 레인 위에 표시되며(A, p114: 비-코돈 최적화된 HA 태그 함유 pglB의 발현; B, p939: 코돈 최적화됨, HA 태그 함유; C, p970: 코돈 최적화됨, HA 태그 제거; D, 코돈 최적화됨, HA 태그 함유, 자연 당화 부위 N534Q 제거; 및 E, 코돈 최적화됨, HA 태그 제거, 자연 당화 부위 N534Q 제거); 분자량 마커 레인 크기가 표시된다.
도 7. 다양한 단계의 작제물에서의 E. 콜리 O2 O 항원 컨쥬게이트 생성 균주의 균주 작제물로부터의 콜로니의 PCR 스크리닝. 본문에 기재된 바와 같은 삽입 실험으로부터의 E. 콜리 세포가 특정 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR에 의해 지노타이핑(genotyping) 특징에 대해 시험되었다. A. 상부 패널은 공여체 플라스미드 내의 rfb 클러스터를 나타내고, 플랭킹 HR은 균주 W3110의 수용체 유전체 내의 표적 부위와 연결된 얇은 선으로 표시되었고; 이탤릭체는 유전자명을 나타내고, 빈 화살표는 공여체 플라스미드로부터의 유전자를 나타내고, 속이 채워진 화살표는 수용체 rfb 클러스터를 나타낸다. 흑색의 좁은 속이 채워진 박스는 FLP 매개 부위 특이적 재조합에 의한 clmR 제거를 위한 부위 특이적 재조합 부위를 나타낸다. 속이 채워진 큰 직사각형은 삽입 요소를 포함하는 W3110의 붕괴된 wbbL 유전자를 나타낸다. 얇은 화살표 및 숫자는 PCR 시험 및 공여체 플라스미드 클로닝에 사용된 올리고뉴클레오티드의 어닐링 영역을 나타낸다. B. 하부 패널은 waaL의 결실을 시험하기 위해 PCR 시험 반응의 생성물을 시각화시키기 위해 UV 광으로 조명된 Gel Red 염색된 전기영동된 아가로스 젤이다. PCR 반응물은 올리고뉴클레오티드 1114 및 1326, 및 통합, waaL 붕괴, 및 선택 카세트 제거 후의 대조군 균주 및 균주 1, St4043 = W3110 ΔO16::O2- kanR; 2, St4044 = W3110 ΔO16::O2- kanR ΔwaaL::clmR; 3, W3110 ΔrfbO16::rfbO2 ΔwaaL; 4 W3110 ΔwaaL; 5, W3110; 6,. W3110 ΔwaaL::clmR의 재현탁된 콜로니를 함유하였다. 예상된 앰플리콘 크기는 변형되지 않은 서열에 대해 1.7 kb, clmR 삽입에 대해 1.5 kb, clmR 카세트 제거 후에 0.5 kb이다.
도 8. 다양한 단계의 균주 작제물에서의 O2 O 항원 발현의 시험. rfb 클러스터의 통합(W3110 ΔrfbO16::rfbO2-kanR, 패널 A), 및 waaL 붕괴 후, clmR 및 kanR 카세트 제거(W3110 ΔrfbO16::rfbO2 ΔwaaL, 패널 B) 후의 E. 콜리 세포로부터의 단백분해효소 K 처리된 전체 세포 추출물이 LB 배지에서 성장된 배양물로부터 제조되었고, 37℃에서 밤새 인큐베이션되었다. 세포 용해질은 SDS Lammli 샘플 완충액에서 용해시키고, 1시간 동안 65℃에서 단백분해효소 K와 함께 인큐베이션시켜 처리되었다. 이후, 추출물은 SDS PAGE에 의해 분리되었고, 은 염색(LPS를 시각화시킴, 패널 B, 좌측)을 이용하여 직접 발달되거나, 전기이동에 의해 니트로셀룰로스 막으로 이동되었고, 항 O2 항혈청(αO2)으로 면역검출되어 Und-PP 결합된 O6 다당류가 검출되었다(Und-PP 결합된 O 항원, 패널 A, B 우측). 대부분의 경우에서 모 조상(parental ancestor) 균주인 대조군 샘플이 동시에 분석되었다. 레인 번호가 표시되며, 흑색 박스 내에 균주 명칭이 제공된다. 패널 A: 레인 2는 PCR에 의해 관심 DNA를 생성시키기 위해 사용된 임상 분리물로부터의 추출물을 함유한다(upecGVXN116). 패널 B: 레인 2는 waaL 결실 전의 삽입된 균주를 함유한다.
도 9. 2 AB 표지에 의한 균주 W3110 ΔrfbO16::rfbO2 ΔwaaL로부터의 E. 콜리 O2 O 항원 발현. 세포는 기재된 바와 같이 처리되었고, 세포로부터의 건조된 유기 추출물은 가수분해되고 정제되었다. 다당류는 2 AB를 이용한 환원 말단에서의 환원성 아민화에 의해 표지되었고, GlycoSepN 컬럼 상에서의 정상 상 HPLC에 의해 분석되었다. A. 균주 W3110 ΔrfbO16::rfbO2 ΔwaaL로부터의 E. 콜리 O2 재조합 O 항원의 HPLC 분석. 크로마토그램(채워진 선)은 용리 시간에 따른 형광 트레이스이다. 점선 트레이스는 O 항원을 발현하지 않는 대조군 샘플이다. 1개, 2개, 3개의 별표는 1개, 2개, 및 3개의 O 항원 반복 단위와 일치하는 용리 시간을 갖는 피크에 해당하는 피크를 나타낸다. B. 패널 A의 2개의 별표에 의해 표지된 피크 분획의 MALDI-TOF/TOF 분석. Na+ 이온이 부착된 2개의 O2 O 항원 반복 단위의 예상 질량에 해당하는 [m/z] = 1817이 MS/MS에 대해 선택되었고, 정확한 단당류 서열을 입증하는 Y 단편 이온 시리즈가 표시되어 있다.
도 10. EPA 4 부위의 O2 당화에 대한 통합된 균주의 소규모 시험. E. 콜리 세포(W3110 ΔrfbO16::rfbO2 ΔwaaL)는 본문에 기재된 바와 같은 p659 및 2개의 상이한 pglB 발현 플라스미드로 형질전환되었다. 세포는 성장되고, 아라비노스 및 IPTG로 유도되었고, 37℃에서 밤새 인큐베이션 후, 세포는 수거되었고, 원형질막주위 단백질 추출물이 제조되었다. 이후, 추출물은 SDS PAGE에 의해 분리되었고, 전기블로팅에 의해 니트로셀룰로스 막으로 옮겨지고, 면역검출되었다. 좌측 패널: 항 EPA 항혈청(αEPA)을 이용한 웨스턴 블롯, 우측 패널: 항 O2 항혈청(αO2)을 이용한 웨스턴 블롯. 플라스미드는 대문자에 의해 레인 위에 표시되며(B, 코돈 최적화된, HA 태그 함유 pglB 발현 플라스미드(p939), D, 코돈 최적화됨, HA 태그 없음(p970)), 분자량 마커 레인 크기가 표시된다. 대조군으로서, p659 및 p939를 함유하는 임상 E. 콜리 분리물 upecGVXN124(StGVXN3947)로부터의 추출물이 분석되었다(레인 x).
도 11. 다양한 단계의 작제물에서의 E. 콜리 O6 O 항원 컨쥬게이트 생성 균주의 균주 작제물로부터의 콜로니의 PCR 스크리닝. 실시예에 기재된 바와 같은 통합 실험으로부터의 E. 콜리 세포가 특정 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR에 의해 지노타이핑 특징에 대해 시험되었다. 패널 A는 공여체 플라스미드 내의 rfb 클러스터를 나타내고, 플랭킹 HR은 W3110 유전체 내의 수용체 부위 내의 HR 영역과 연결된 얇은 선으로 표시되었고; 이탤릭체는 유전자명을 나타내고, 빈 화살표는 공여체 플라스미드로부터의 유전자를 나타내고, 속이 채워진 화살표는 W3110에서의 수용체 rfb 클러스터를 나타낸다. 흑색의 좁은 속이 채워진 박스는 FLP 재조합에 의한 kanR 제거를 위한 부위 특이적 재조합 부위를 나타낸다. 속이 채워진 큰 박스는 W3110의 붕괴된 wbbL 유전자를 나타낸다. 얇은 화살표 및 숫자는 PCR 시험 및 공여체 플라스미드 클로닝에 사용된 올리고뉴클레오티드의 어닐링 영역 및 수를 나타낸다. 하부 패널 (B-D)은 PCR 시험 반응의 생성물을 시각화시키기 위해 UV 광으로 조명된 Gel Red 염색된 아가로스 젤이다. PCR 반응물은 패널 위에 나타낸 올리고뉴클레오티드, 및 통합, waaL 붕괴, 및 선택 카세트 제거 후의 대조군 균주 및 균주 1, W3110; 2, W3110 ΔwaaL; 3, W3110 ΔrfbO16::rfbO6-kanR ΔwaaL; 4 및 5, W3110 ΔrfbO16::rfbO6 ΔwaaL의 2개의 상이한 클론의 재현탁된 콜로니를 함유하였다. 시험된 올리고뉴클레오티드 쌍이 표시된다. 5' HR 영역 전이를 시험하기 위한 PCR(패널 B)은 1.697 kb의 PCR 생성물을 생성시키고, 3' HR 전이에 대해서는 kanR 카세트의 존재 또는 부재하에서 3.6 kb 또는 2.3 kb를 생성시키고(패널 C), O6 wzy(c2564) PCR(패널 D)에 대해서는 0.783 kb를 생성시킨다.
도 12. 다양한 단계의 균주 작제물에서의 O6 O 항원 발현의 시험. rfb 클러스터의 통합(W3110 ΔrfbO16::rfbO6-kanR, 패널 A), waaL 붕괴(W3110 Δr fbO16::rfbO6-kanR ΔwaaL::clmR, 패널 B), 및 clmR 카세트 제거(W3110 ΔrfbO16::rfbO6-kanR ΔwaaL, 패널 C) 후의 E. 콜리 세포로부터의 단백분해효소 K 처리된 전체 세포 추출물이 LB 배지에서 성장된 배양물로부터 제조되었고, 37℃에서 밤새 인큐베이션되었다. 세포 용해질은 SDS Lammli 샘플 완충액에서 세포 펠렛을 용해시키고, 1시간 동안 65℃에서 단백분해효소 K와 함께 인큐베이션시켜 제조되었다. 이후, 추출물은 SDS PAGE에 의해 분리되었고, 은 염색(LPS를 시각화시킴, 패널 B 및 C, 좌측)을 이용하여 직접 발달되거나, 전기이동에 의해 니트로셀룰로스 막으로 이동되었고, 항 O6 항혈청(αO6)으로 면역검출되어 지질 결합된 O6 다당류가 검출되었다(O 항원, 패널 A, B 우측, C 좌측). 대부분의 경우에서 표시된 바와 같이 직계 모 조상(direct parental ancestor) 균주인 대조군 샘플이 동시에 분석되었다. 레인 번호가 표시되며, 흑색 박스 내에 균주 명칭이 제공된다. 패널 A: 레인 3은 야생형 E. 콜리 O6 균주로부터의 추출물을 함유한다(CCUG27).
도 13. EPA 인코딩 4 부위의 O6 당화에 대한 통합된 균주의 소규모 시험. E. 콜리 세포(W3110 ΔrfbO16::rfbO6- kanR ΔwaaL)는 본문에 기재된 바와 같은 EPA(p659) 및 pglB 발현 플라스미드(코돈 최적화된, HA 태그 함유 pglB 발현 플라스미드, p939)로 형질전환되었다. 세포는 성장되었고, 아라비노스 및 IPTG로 유도되었고, 37℃에서 밤새 인큐베이션 후, 세포는 수거되었고, 원형질막주위 단백질 추출물이 제조되었다. 이후, 추출물은 SDS PAGE에 의해 분리되었고, 전기블로팅에 의해 니트로셀룰로스 막으로 옮겨지고, 면역검출되었다. 좌측 패널: 항 EPA 항혈청(αEPA)을 이용한 웨스턴 블롯, 우측 패널: 항 O6 항혈청(αO6)을 이용한 웨스턴 블롯.
도 14. 다양한 글리코컨쥬게이트 생성 시스템의 비교 분석. O1(패널 A), O2(패널 B), 및 O6(패널 C) O 항원을 생성시키는 다양한 E. 콜리 ΔwaaL 세포는 p659 및 p939(C 말단 HA 태그를 갖는 코돈 최적화된 pglB)로 형질전환되었고, 글리코컨쥬게이트의 발현에 대해 시험되었다. 발현 배양물은 37℃에서 10 mM MgCl2가 보충된 TB 배지에서 성장되었다. 배양물은 0.2% 아라비노스 및 1 mM IPTG 첨가에 의해 0.4-1.2의 OD600에서 유도되었다. 세포는 밤새의 유도(20시간) 후에 수거되었고, 원형질막주위 추출물이 리소자임 방법에 의해 제조되었다. 이후, 추출물이 SDS PAGE에 의해 분리되었고, 전기블로팅에 의해 니트로셀룰로스 막으로 옮겨지고, 항 EPA 항혈청(A, B 및 C, 좌측 패널), 및 O1, O2, 또는 O6 O 항원 특이적 항혈청(A, B, C, 우측 패널)을 이용하여 면역검출되었다. 숙주 세포는 임상 E. 콜리 분리물(레인 1), 본 특허 출원에 기재된 바와 같은 삽입된 W3110 세포(레인 2: A, W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL, B, W3110 ΔrfbO16::rfbO2 Δw a aL, C, W3110 ΔrfbO16::rfbO6- kanR ΔwaaL), 또는 코스미드(pLAFR)에 각각의 rfb 클러스터를 함유하는 W3110 ΔwaaL 세포(레인 3)였다. 각각의 웨스턴 블롯에 대해 분자 크기 마커 질량이 표시될 뿐만 아니라 탐지 혈청이 사용된다.
도 15. W3110 균주 내의 P. 시겔로이데스(P. shigelloides) O17 rfb 클러스터의 통합으로부터의 콜로니의 PCR 스크리닝. 본문에 기재된 바와 같은 통합 실험으로부터의 E. 콜리 세포가 특정 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR에 의해 지노타이핑 특징에 대해 시험되었다. 2개의 상이한 수용체 균주 W3110 및 W3110 ΔwecA -wzzE ΔwaaL이 시험되었다. 상부 패널 (A)는 공여체 플라스미드(wzz를 갖지 않거나 가짐) 내의 P. 시겔로이데스 rfb 클러스터 및 흑색 박스 내의 플랭킹 HR, 및 W3110 유전체 내의 표적 부위를 나타내고, 이탤릭체는 유전자명을 나타내고, 빈 화살표는 공여체 플라스미드로부터의 유전자를 나타내고, 빈 것은 수용체 부위로부터의 것이다. 흑색의 좁은 속이 채워진 박스는 FLP 유도된 부위 특이적 재조합에 의한 clmR 제거를 위한 부위 특이적 재조합 부위를 나타낸다. 속이 채워진 큰 박스는 삽입 요소에 의해 자연 붕괴된 W3110의 wbbL 유전자 영역을 나타낸다. 화살표 및 숫자는 PCR 시험에 사용된 올리고뉴클레오티드의 어닐링 위치 및 명칭을 나타낸다. 하기 쌍이 시험되었다: a) wzy가 결실되는 경우 PCR 생성물의 부재를 발생시키고, wzy가 존재하는 경우 0.9 kb 생성물을 발생시키는, E. 콜리 O16 wzy의 결실을 입증하기 위한 1226 및 1227; b) 1.522 kb 생성물을 생성시키는 P. 시겔로이데스 wzy & wbgV의 존재에 대한 1549 및 1550; c) wzz를 갖는 2.545 kb의 생성물 및 wzz가 없는 클론에 의한 1.403 kb를 발생시키는 HR1 전이 영역에 대한 1284 및 1513. B: 통합 콜로니 용해질(백색 번호) 및 표시된 올리고뉴클레오티드 쌍을 함유하는 PCR 반응 혼합물의 아가로스 젤 전기영동. O16의 wzy의 부재, wzy-wbgV 및 HR1(5') 전이 영역의 존재가 성공적인 통합을 나타낸다. DNA 마커 밴드 크기가 표시된다. 하기 균주가 확인되었다: wzz가 없는 W3110 ΔwecA-wzzE ΔwaaL ΔrfbO16::rfbPsO17-clmR: 클론 3, wzz를 갖는 W3110 ΔwecA - wzzE ΔwaaL ΔrfbO16::PsO17-clmR 클론 51, wzz가 없는 W3110 ΔrfbO16::rfbPsO17- clmR 클론 7, 및 wzz를 갖는 W3110 ΔrfbO16::rfbPsO17- clmR 클론 46.
도 16. 다양한 단계의 균주 작제물에서의 P. 시겔로이데스 O 항원 발현의 시험. 삽입 실험으로부터 유래되고 PCR 스크리닝에 의해 선택된 E. 콜리 세포가 은 염색(좌측 패널) 및 항 S. 손네이(S. sonnei) 항혈청을 이용한 웨스턴 블로팅(우측 패널)에 의해 당지질 생성에 대해 시험되었다. wzz가 없는 W3110 ΔwecA - wzzE ΔwaaL ΔrfbO16::rfbPsO17- clmR: 클론 3(레인 3), wzz를 갖는 W3110 ΔwecA - wzzE ΔwaaL ΔrfbO16::rfbPsO17- clmR 클론 51(레인 4), wzz가 없는 W3110 ΔrfbO16::rfbPsO17-clmR 클론 7(레인 1), 및 wzz를 갖는 W3110 ΔrfbO16::rfbPsO17-clmR 클론 46(레인 2).
도 17. W3110의 rfb 클러스터를 대체하는 rfp 및 rfb 유전자 클러스터의 통합 후의 S. 디센테리에(S. dysenteriae) 타입 1 O 항원 발현의 시험. 삽입을 위한 표적 균주로서, W3110 뿐만 아니라 W3110 ΔwaaL 세포가 사용되었다. 삽입 실험으로부터의 E. 콜리 클론이 콜로니 PCR에 의해 스크리닝되었다. 당지질 생성이 은 염색(좌측 패널) 및 항 S. 디센테리에 타입 1 항혈청에 대한 웨스턴 블로팅(우측 패널)에 의해 분석되었다. 레인 3, 4: 통합 후의 W3110 뿐마 아니라 W3110 ΔwaaL 균주; 레인 1, 2: 통합 및 clmR 카세트의 제거 후의 W3110 뿐만 아니라 W3110 ΔwaaL.
도 18. 2 AB 표지 및 HPLC에 의한 S. 디센테리에 타입 1 O 항원 발현 분석. W3110 ΔrfbO16::rfbSd1 ΔwaaL이 실시예에 기재된 바와 같이 처리되었다. 크로마토그램(패널 A)은 용리 시간에 따른 형광 트레이스이다. 별표는 MALDI-TOF/TOF MS에 의해 분석된 바와 같은 2(**), 3,(***) 및 4 (****) O 항원 반복 단위와 일치하는 용리 시간을 갖는 피크에 해당하는 피크를 나타낸다(패널 B)[8,9].
도 19. S. 디센테리에 타입 1 O 항원 글리코컨쥬게이트는 p293 및 p114를 이용하여 W3110 ΔrfbO16::rfbSd1 ΔwaaL에서 생성되었다. A. SEC HPLC 분석. B. 단당류 조성물 분석을 위한 PMP 표지. 글루코스, 람노스 및 2-N-아세틸글루코사민의 용리 시간에 대해 교정하기 위해 단당류 혼합물이 사용되었다. C. 글리코컨쥬게이트의 SDS PAGE 분리 및 쿠마시 블루 염색에 의한 검출 및 니트로셀룰로스 막으로의 전기이동 후의 항 S. 디센테리에 1 항혈청 검출. D. 히드라진분해 분석. 당단백질 제조물 내의 다당류가 히드라진분해에 의해 단백질로부터 분리되었고, 2 AB에 의해 표지되었고, HPLC에 의해 분석되었다. 표시된 피크가 수거되었고, MS/MS 분석은 2 또는 3 반복 단위 O 항원 구조와 일치하였다.
도 20. gtrII 또는 gtrX에 의한 분지 글루코실트랜스페라제 gtrS의 교환 후의 S. 플렉스네리(S. flexneri) 당지질 발현의 시험. A. 관련 O 항원의 반복 단위 구조. 도면은 S. 플렉스네리(S. flexneri) 2a 및 3a가 분지 글루코스 잔기의 부착 부위가 상이함을 나타낸다. 항 그룹 II 및 항 그룹 7, 8 항혈청은 상기 부착 부위 사이를 구별할 수 있다. B. W3110 유전체로의 gtrII 통합의 콜로니 PCR 분석. gtrS 유전자는 clmR 카세트에 융합된 gtrII로 구성된 앰플리콘에 의해 대체되었다. 도면은 성공적인 상동성 재조합 후의 gtr 클러스터 주위의 염색체 스트레치를 도시하며, 여기서 clmR 카세트는 여전히 존재한다. 화살표는 콜로니 PCR에 사용된 올리고뉴클레오티드에 대한 어닐링 위치를 나타낸다. 레인 1(W3110 ΔwbbIJK ΔgtrS::gtrII-clmR)은 재조합 클론을 이용한 콜로니 PCR의 결과이고, 레인 2(W3110 Δw bbI JK)는 대조군이다. clmR 카세트는 E. 콜리로부터의 Xer 재조합효소에 의한 부위 특이적 재조합에 의해 카세트의 절제를 유도하는 dif 부위에 플랭킹된다. 이는 콜로니 PCR에서 clmR 카세트를 함유하는 스트레치 및 clmR 카세트가 결핍된 스트레치에 해당하는 밴드가 관찰되는 것을 의미한다(예상 크기는 2.8 및 1.8 kb이다). 대조군은 모 균주에 대해 예상된 바와 같은 1.6 kb의 밴드를 나타낸다. C. 플라스미드 상의 S. 플렉스네리 2457T rfb 클러스터를 함유하는 W3110 E. 콜리 세포는 은 염색(좌측 패널), 항 그룹 II 항혈청 및 항 그룹 7,8 항혈청 웨스턴 블로팅(중간 및 우측 패널)에 의해 분석되었다. 레인 1: W3110; 레인 2: W3110 ΔgtrS::gtrII; 레인 3: W3110 ΔgtrS :: gtrX.
도 21. S. 플렉스네리 타입 2a O 항원 글리코컨쥬게이트가 p293 및 p114를 이용하여 W3110 ΔrfbO16::rfbpSf2a ΔwaaL에서 생성되었다. A. 글리코컨쥬게이트의 SDS PAGE 분리 및 쿠마시 블루 염색에 의한 검출 및 니트로셀룰로스 막으로의 전기이동 후의 항 타입 II 항혈청 검출. B. 정제된 EPA 당단백질의 SEC HPLC 분석. C. 단당류 조성물 분석을 위한 PMP 표지. 글루코스, 람노스 및 글루코사민의 용리 시간에 대해 교정하기 위해 단당류가 사용되었다. 용리 시간은 화살표에 의해 표시된다. D. 히드라진분해 분석. 당단백질 제조물 내의 다당류가 히드라진분해에 의해 단백질로부터 분리되었고, 2 AB에 의해 표지되었고, HPLC에 의해 분석되었다. 표시된 피크가 수거되었고, MS/MS 분석은 2 또는 3 반복 단위 O 항원 구조 및 이의 단편과 일치하였다. 중요하게는, 글루코스 분지가 MSMS에 의해 명백히 검출되었다(제시되지 않음).
도 22. 주사된 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 래트로부터의 혈청이 S. 플렉스네리 2a LPS에 대한 IgG 역가에 대해 분석되었다. Log 역가가 각각의 개별적 래트 혈청으로부터 제시된다. 혈청이 세번째 주사 2주 후에 수거되었다. 항 2a IgG의 상응하는 수준이 세번째 주사(3번째 후) 2주 후에 도달되었고, 그룹 사이의 통계적 차이(만-휘트니 검정(Mann-Whitney test)에 따름)가 제시된다. 동물 혈청의 특정 IgG 역가가 효소결합면역흡착법(ELISA)를 이용하여 검출되었다. S. 플렉스네리 2a 균주 ATCC700930으로부터 추출된 2a LPS가 마이크로플레이트의 웰에 흡착된다. 이후, 2a 항체 역가가 분석되는 혈청의 연속 희석액의 첨가에 의해 결정된다. 항-래트 또는 항-마우스 IgG 이차 항체에 커플링된 호스라디쉬-퍼옥시다제가 역가를 결정하기 위해 효소적 비색 반응에 사용된다. 종점 역가는 면역전 푸울(pool) 평균 상의 가장 높은 희석 + 면역전 혈청의 3회의 표준 편차로 정의되고, Log10으로 표현된다.
도 23. PA103 O 항원 클러스터의 통합 후의 P. 아에루기노사 O11 O 항원 발현의 시험. 통합 실험으로부터 유래되고 PCR 스크리닝 및 표현형 시험에 의해 선택된 E. 콜리 세포가 항 P. 아에루기노사 그룹 E 항혈청에 대한 웨스턴 블로팅에 의한 당지질 생성에 대해 분석되었다. 통합된 표적 균주(레인 1-4) 및 공여체 플라스미드 p1012(레인 5) 및 p1013(레인 6)을 함유하는 DH5α 세포로부터 유래된 대조군 추출물이 분석되었다.
도 24. O11 wzy 및 wbjA로 대체된 카세트(clmR 카세트에 융합된 cap5HIJK 유전자로 구성됨)를 함유하는 P. 아에루기노사 O11 rfb 클러스터로 구성된 16 kb 키메라 클러스터의 통합은 재조합 글리코컨쥬게이트를 제조할 수 있는 세포를 발생시킨다. 전체 세포 추출물이 밤새 성장된 세포로부터 제조되었고, SDS Lammli 완충액에서 용해되었고, 1시간 동안 단백분해효소 K로 처리되었다. 상기 샘플로부터 당지질을 분리시키기 위해 SDS PAGE가 이용되었고, CP5 다당류를 확인하기 위해 항 CP5 항혈청에 대해 은 염색 또는 웨스턴 블로팅이 이용되었다. 레인 1-3: p471, p477, 또는 p498과 함께 작제된 통합된 클론. p471은 wecA의 DNA 업스트림 및 W3110으로부터의 wzzE ORF 서열의 다운스트림에 해당하는 HR 1 및 2를 함유한다. W3110 숙주 세포로의 삽입이 수행되었다. 레인 5, 6, 및 7에서 분석된 DH5α 세포에서 대조군 추출물(p498, p477, 또는 p471)을 제조하기 위해 공여체 플라스미드가 이용되었고, 레인 4는 음성 대조군(p473)을 함유한다. 레인 8은 CP5 다당류를 생성하는 플라스미드 p393을 함유하는 W3110 ΔwecA 세포의 추출물로부터 제조된 양성 대조군이다[10].
도 25는 O1 항원을 발현하는 플라스미드 및 EPA를 발현하는 플라스미드를 갖는 MG1655 waaL::pglB-galK E. 콜리 숙주 균주에 의한 pglB 및 O1-EPA의 생성의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 좌측 패널은 항-HIS 항체를 이용한 EPA에 대한 탐지의 결과를 나타내고, 우측 패널은 항-HA 항체를 이용한 pglB에 대한 탐지의 결과를 나타낸다.
도 26은 담체 단백질-당 항원 바이오컨쥬게이트의 정제를 위한 전략을 도시한다.
도 27은 숙주 세포 유전체에 삽입된 pglB를 포함하고, 당 항원(시겔라 O1) 및 담체 단백질(EPA)을 생성시키는 플라스미드를 갖는 숙주 세포의 삼투압 충격 후에 수득된 미정제 추출물의 크로마토그램을 도시한다. 크로마토그램은 첫번째 음이온 교환 컬럼(Source Q) 상에서의 삼투압 충격 분획 흐름의 결과를 도시한다. 미정제 추출물의 풀링된 분획 A6-A9에서 확인된 O1-EPA가 쿠마시-염색된 젤(삽입물)에서 도시된다.
도 28은 O1 항원을 발현하는 플라스미드 및 EPA를 발현하는 플라스미드를 갖는 배양된 MG1655 waaL::pglB-galK E. 콜리 숙주 균주의 원형질막공간으로부터 분리된 단백질의 첫번째 Source Q 컬럼 상에서의 흐름으로부터 수득된 분획에 존재하는 단백질의 쿠마시 염색의 결과를 도시한다.
도 29는 O1 항원을 발현하는 플라스미드 및 EPA를 발현하는 플라스미드를 갖는 배양된 MG1655 waaL::pglB-galK E. 콜리 숙주 균주의 원형질막공간으로부터 분리된 단백질의 두번째 Source Q 컬럼 상에서의 흐름으로부터 수득된 분획에 존재하는 단백질의 쿠마시 염색의 결과를 도시한다.
도 30은 숙주 세포 유전체로 삽입된 pglB를 포함하고, 당 항원(시겔라 O1) 및 담체 단백질(EPA)을 생성시키는 플라스미드를 갖는 숙주 세포가 삼투압 충격에 적용되고, 첫번째 음이온 교환 컬럼(Source Q) 상에서 흐르고, 두번째 음이온 교환 컬럼(Source Q) 상에서 흐른 후에 수득된 생성물의 크로마토그램을 도시한다.
도 31은 O1 항원을 발현하는 플라스미드 및 EPA를 발현하는 플라스미드를 갖는 배양된 MG1655 waaL::pglB-galK E. 콜리 숙주 균주의 원형질막공간으로부터 분리된 단백질의 Superdex 200 컬럼 상에서의 흐름으로부터 수득된 분획에 존재하는 단백질의 쿠마시 염색의 결과를 도시한다.
도 32는 숙주 세포 유전체로 통합된 pglB를 포함하고, 당 항원(시겔라 O1) 및 담체 단백질(EPA)을 생성하는 플라스미드를 갖는 숙주 세포가 삼투압 충격에 적용되고, 첫번째 음이온 교환 컬럼(Source Q) 상에서 흐르고, 두번째 음이온 교환 컬럼(Source Q) 상에서 흐르고, Superdex 200 컬럼 상에서 흐른 후에 수득된 생성물의 크로마토그램을 도시한다.
5
상세한 설명
한 양태에서, 숙주 세포 유전체로 큰 연속적 DNA 서열을 삽입하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 상기 큰 DNA 서열은 다수의 구성요소, 예를 들어, 유전자, 프로모터, 종료자 등을 포함할 수 있고, 숙주 세포 유전체 내의 요망되는 위치에 선택적으로 삽입될 수 있다. 특정 구체예에서, 큰 DNA 서열은, 단편에 존재하는 하나 이상의 구성요소(예를 들어, 유전자)가 숙주 세포에 의해 발현되고, 예를 들어, 숙주 세포가 이러한 숙주 세포에 의해 일반적으로 발현되지 않는 하나 이상의 구성요소(예를 들어, 유전자)를 발현하고/하거나 숙주 세포가 이러한 숙주 세포에 의해 자연적으로 발현되는 구성요소(예를 들어, 유전자)를 발현하나, 상기 구성요소를 더 많이 발현하도록, 숙주 세포 유전체의 영역에 선택적으로 삽입될 수 있다.
특정 구체예에서, 숙주 세포 유전체로 큰 DNA 서열을 삽입하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 큰 DNA 서열은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 초과의 유전자를 포함한다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 숙주 세포로 삽입된 DNA 서열에 존재하는 유전자는 DNA 서열에 또한 존재하는 1개 또는 다수의 조절 서열 또는 프로모터의 조절하에 있다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 숙주 세포로 삽입된 DNA 서열은 큰 DNA 서열에 존재하는 유전자의 발현에 필수적이거나 이로운 추가 요소, 예를 들어, 인핸서, 종료자를 포함할 수 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 숙주 세포 유전체로 큰 DNA 서열을 삽입하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 큰 DNA 서열은 하나 이상의 오페론, 예를 들어, 일반적인 조절 신호 또는 프로모터의 조절 하의 유전자의 클러스터를 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 숙주 세포 유전체로 큰 DNA 서열을 삽입하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 숙주 세포 유전체는 추가로 숙주 세포 유전체와 일반적으로 관련된 DNA의 결실을 가지며, 즉, 상기 방법은 숙주 세포 유전체로의 이종성 DNA의 삽입 및 숙주 세포 유전체로부터의 일반적으로 존재하는 DNA의 제거 둘 모두를 발생시킨다. 특정 구체예에서, 큰 DNA 서열의 삽입은 동등한 크기의 숙주 세포 유전체로부터의 DNA의 서열의 제거 부위에서 이루어지며, 즉, 숙주 세포 유전체의 DNA가 삽입되는 DNA 서열에 의해 대체된다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 숙주 세포로의 헬퍼 플라스미드 및 공여체 플라스미드의 도입을 포함한다. 본원에서 사용되는 헬퍼 플라스미드는 숙주 세포의 유전체로의 큰 DNA 서열의 삽입에 필요한 요소를 포함하는(예를 들어, 유전자를 인코딩하는) 플라스미드를 포함하는 것을 의미한다. 본원에 기재된 방법에 따르면, 헬퍼 플라스미드는 숙주 세포 유전체 자체로 임의의 DNA를 통합시키는 것이 아니라, 본원에 기재된 공여체 플라스미드에 존재하는 삽입 DNA의 통합을 촉진한다. 헬퍼 플라스미드는 하기 섹션 5.1.1에 더 상세히 기재된다. 본원에서 사용되는 공여체 플라스미드는 숙주 세포 유전체로 삽입되는 큰 DNA 서열을 포함하는 플라스미드를 포함하는 것을 의미하며, 즉, 공여체 플라스미드는 숙주 세포 유전체에 그 자체의 일부를 "공여"한다(즉, 숙주 세포 유전체로 삽입되는 큰 DNA 서열이 공여된다). 특정 구체예에서, 본원에 제공된 공여체 플라스미드는 숙주 세포 유전체로의 큰 DNA 서열의 삽입에 필요하거나 유용한 다른 요소를 포함한다. 공여체 플라스미드는 하기 섹션 5.1.2에 더 상세히 기재된다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 큰 DNA 서열이 삽입된 유전체를 포함하는 숙주 세포(예를 들어, 원핵생물 숙주 세포, 예를 들어, E. 콜리)가 본원에 제공된다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본원에 기재된 방법은 관심 단백질, 예를 들어, 백신으로서 사용하기 위한 단백질, 당화된 단백질, 화장품에서 사용하기 위한 단백질 등을 생성시킬 수 있는 유전학적으로 안정적인 숙주 세포를 생성시키기 위해 이용될 수 있다. 본원에 제공된 방법의 결과로서, 상기 숙주 세포는 관심 유전자를 포함하는 DNA가 숙주 세포의 유전체로 직접 삽입된다는 사실로 인해, 특정 마커, 예를 들어, 항생제 선택 마커의 존재하에서 유지되고/되거나 증식될 필요는 없다.
특정 구체예에서, 공여체 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드를 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공되며, (a) 헬퍼 플라스미드는, (i) 제 1 프로모터의 조절하에 있는, 람다 red 재조합효소를 인코딩하는 열린해독틀; 및 (ii) 제 2 프로모터의 조절하에 있는, 숙주 세포 유전체에 존재하지 않는 인지 서열을 갖는 제한 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 열린해독틀을 포함하고; (b) 공여체 플라스미드는, (i) 5'에서 3' 방향으로, (1) 제한 엔도뉴클레아제의 인지 서열; (2) 적어도 0.5 킬레베이스(kb)의 제 1 상동성 영역, (3) 적어도 8 kb의 이종성 삽입 DNA, 및 (4) 적어도 0.5 kb의 제 2 상동성 영역; 및 (ii) 역선택(counterselection) 마커를 포함한다. 특정 구체예에서, 인지 서열은 적어도 18개의 염기쌍을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 제한 엔도뉴클레아제는 SceI이다.
5.1
DNA
삽입 방법
숙주 세포의 유전체로 큰 DNA 서열(즉, 이종성 삽입 DNA)을 삽입하는 방법이 본원에 제공된다. 당업자는 본원에 기재된 새로운 방법이 여러 장점을 갖고, 백신을 포함하는 상업적 물품의 생물학적 생성에 이용될 수 있는 숙주 세포(예를 들어, 원핵생물 숙주 세포)의 생성을 가능케 하는 것을 인지할 것이다. 본원에 기재된 방법에 따라 생성된 유전학적으로 안정적인 숙주 세포가 갖는 예시적 장점은 (i) 염색체 삽입되는 DNA에 대해 선택압이 불필요하고, (ii) 이종성 삽입 DNA 내의 유전자의 카피수가 세포 주기에 따라 1 또는 2로 엄격히 조절되고, (iii) 숙주 세포 유전체 내의 이종성 삽입 DNA가 숙주 세포 증식의 다수의 세대에 걸쳐 안정적인 채로 유지된다는 점을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 안정적 숙주 세포는, 예를 들어, 산업적 발효에 유용하다.
당업자는 본 발명의 새로운 방법이 이러한 방법에서 이용되는 다양한 성분을 변형시킴으로써 실시될 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 예를 들어, 본원에 기재된 공여체 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드는 본원에 기재된 방법에서 기능을 유지하는 한 다수의 다양한 요소를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 공여체 플라스미드, 본원에 기재된 헬퍼 플라스미드, 및 본원에 기재된 숙주 세포에 대한 예시적 변형은 이하 섹션 5.1.1에 제시된다.
예시적 구체예에서, 숙주 세포의 유전체로 큰 DNA 서열(즉, 이종성 삽입 DNA)을 삽입하는 방법은 (i) (a) 숙주 세포 유전체 내의 재조합 부위에 특이적인 상동성 영역(HR), 예를 들어, 긴 상동성 영역(예를 들어, 임의의 적절한 크기, 예를 들어, 0.4-2.0 kb의 HR)에 플랭킹된 이종성 삽입 DNA(상기 HR의 사용은 삽입 효율을 증가시킴), 및 (b) 숙주 세포로의 공여체 플라스미드의 도입 후에 공여체 플라스미드, 즉, 통합되지 않은 공여체 플라스미드를 포함하는 숙주 세포의 성장을 억제하는 역 선택 마커(역 선택 마커의 사용은 거짓 양성 컬럼을 배제시킴[11])를 포함하는, 공여체 플라스미드; 및 (ii) 람다 red 재조합효소를 인코딩하는 열린해독틀 및 숙주 세포 유전체에 존재하지 않는 인지 서열을 갖는 제한 엔도뉴클레아제(예를 들어, SceI 제한 엔도뉴클레아제)를 인코딩하는 열린해독틀을 포함하는 헬퍼 플라스미드의 사용을 포함한다. 헬퍼 플라스미드에서, 람다 red 재조합효소를 인코딩하는 열린해독틀 및 숙주 세포 유전체에 존재하지 않는 인지 서열을 갖는 제한 엔도뉴클레아제(예를 들어, SceI 제한 엔도뉴클레아제)를 인코딩하는 열린해독틀은 열린해독틀에 의해 생성되는 단백질의 협력된 발현을 위해 다양한 프로모터(예를 들어, 제 1 프로모터 및 제 2 프로모터)의 조절하에 있을 수 있다[12]. 공여체 플라스미드는 또한 헬퍼 플라스미드에 존재하는 제한 엔도뉴클레아제의 인지 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법은 순서대로 다수의 라운드의 삽입을 가능케 하며, 즉, 먼저 큰 DNA 삽입물이 하나의 위치에 삽입될 수 있고, 이후 더 많은 삽입이 동일 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 이들 연속적 삽입은 숙주 세포 유전체의 임의의 부분으로 표적화될 수 있고, 즉, 이전에 삽입된 DNA 또는 숙주 세포에 존재하는 최초의 염색체 서열로 또한 표적화될 수 있다. 또한, 상기 방법은 문헌[Datsenko and Wanner (Datsenko KA, Wanner BL: One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A 2000, 97(12):6640-6645)]에 따른 상동성 재조합과 같은 다른 삽입 방법과 상용된다. 본원에 기재된 방법의 삽입 단계, 즉, 이종성 삽입 DNA가 숙주 세포의 유전체로 삽입되는 단계는 생체 내에서의 상동성 DNA 스트레치의 상동성 재조합 또는 교차를 기초로 한다. 상동성 재조합 동안, DNA의 하나의 동족체는 표적 부위에 존재해야 하고, 하나는 공여체 작제물(즉, 공여체 플라스미드)에 존재해야 한다. 본원에 기재된 방법에 따르면, 삽입에 필요한 요소가 숙주 세포로 도입될 수 있고, 예를 들어, 숙주 세포로 도입되는 하나 이상의 플라스미드에 도입될 수 있다. 당업자는 플라스미드가 숙주 세포로 도입될 수 있는 방법을 용이하게 인지할 것이며, 이를 수행하기 위한 예시적 방법은 하기 섹션 5.1.3에 제공된다.
이종성 삽입 DNA가 숙주 세포의 유전체로 삽입될 수 있는 방법은 다수의 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 공여체 플라스미드 및/또는 헬퍼 플라스미드는 상기 방법이 수행되기 전에 조작될 필요가 있을 수 있다. 추가로, 숙주 세포에 대한 변형은 삽입 방법 전 또는 삽입 방법 동안 수행될 수 있다. 당업자는 제공된 숙주 세포로 삽입되는 것이 요망되는 이종성 삽입 DNA를 기초로 하여 어떠한 단계가 수행될 필요가 있는지 용이하게 이해할 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 숙주 세포로 이종성 삽입 DNA를 삽입하는 방법은 하기 단계 중 일부 또는 전부를 포함할 수 있다:
(1) 공여체 플라스미드가 제조된다. 요망되는 이종성 삽입 DNA 서열(즉, 하나 이상의 관심 유전자를포함하는 이종성 삽입 DNA 서열)이 공여 플라스미드로 사용하기에 적합한 플라스미드의 클로닝 부위(예를 들어, MCS로 약어화된 다중 클로닝 부위)로 클로닝된다(섹션 5.1.2 참조). 상동성 영역으로 사용하기에 적합한 DNA 서열(즉, 숙주 세포 유전체 상의 삽입 위치에 상동성인 DNA 서열)이 또한 공여체 플라스미드로 클로닝되어, 상동성 영역이 이종성 삽입 DNA에 플랭킹된다. 공여체 플라스미드의 클로닝 및 어셈블리의 상기 방법은 DNA를 변형시키고 합성하기 위한 임의의 확립되고 널리 공지된 기술, 비제한적인 예로, 제한 효소 및 리가제를 이용한 분자 클로닝, 유전자전위효소, 화학적 합성 등에 따라 수행될 수 있으며, 상기 기술은 당업자에게 공지되어 있다[1].
또한, 특정 구체예에서, 항생제 내성을 부여하는 단백질을 인코딩하는 열린해독틀을 포함하는 선택 카세트는 상동성 아암(arm) 사이에 위치된다. 유전체에 삽입된 이종성 삽입 DNA를 포함하는 숙주 세포는 이들을 선택 카세트의 항생제 내성 유전자가 내성을 제공하는 항생제를 포함하는 배지에서 배양함으로써 확인될 수 있다. 특정 구체예에서, 선택 카세트는 FRT 부위에 플랭킹될 수 있고[13], 이는 부위 특이적 재조합에 의한 카세트의 이후의 제거를 가능케 한다. 상기 방식으로 공여체 플라스미드에 FRT 부위를 통합시키는 것은 따라서 선택 카세트가 숙주 세포 유전체 냉에 통합된 채로 유지되지 않는 것을 보장한다. 또 다른 구체예에서, 선택 카세트는 dif 부위 매개 부위 특이적 상동성 재조합[14], 또는 다른 부위 특이적 염색체 돌연변이유발 기술을 통한 통합 후에 제거될 수 있다.
본원에 기재된 공여체 플라스미드는 또한 역선택(counterselection) 단백질을 인코딩하는 열린해독틀을 포함하도록 조작된다. 역선택 접근법에서 사용하기에 적합한 당업자에게 공지된 단백질을 인코딩하는 임의의 유전자가 본원에 기재된 공여체 플라스미드로 통합될 수 있다. 특정 구체예에서, 역선택을 위해 sacB 유전자가 사용된다.
본원에 기재된 공여체 플라스미드는 또한 복제 기점을 포함하도록 조작된다. 당업자는 공여체 플라스미드로 통합된 복제 기점이 유전체 변형을 겪는 숙주 세포에서 사용하기에 적합해야 하는 것을 용이하게 인지할 것이다. 예를 들어, 클로닝이 E. 콜리에서 수행되는 경우 E. 콜리 복제 기점이 제공되어야 한다. 특정 구체예에서, 복제 기점은 oriT이다. 당업자는 셔틀 플라스미드(즉, 다수의 숙주 세포, 예를 들어, 다수의 박테리아 종에서 복제가 가능한 플라스미드)가 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 생성될 수 있으며, 상기 플라스미드가 다수의 유형의 숙주 세포, 예를 들어, 원핵생물 세포, 고세균 세포, 유박테리아 세포, 또는 진핵생물 세포로의 삽입에 이용될 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 상기 셔틀 플라스미드는 유기체 특이적 발현 조절 요소 및 복제 기점을 포함할 수 있다.
(2) 헬퍼 플라스미드가 제조된다. 헬퍼 플라스미드는 본원에 기재된 바와 같은 숙주 세포로의 DNA 삽입을 매개하고, 재조합을 겪는 숙주 세포 내의 헬퍼 플라스미드의 유지를 위한 모든 필요한 활성을 인코딩하도록 조작된다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 헬퍼 플라스미드는 (i) 숙주 세포 내의 플라스미드 유지를 위한 선택 카세트, (ii) 재조합효소, 즉, 상동성 DNA 스트레치 사이의 교차 효능을 지지하고 향상시키는 효소 또는 효소들의 발현을 위한 레귤론(regulon), (iii) DNA 삽입물을 선형화시켜 상동성 재조합을 겪을 수 있는 말단 상동성 서열을 발생시키는 기능의 발현을 위한 레귤론, (iv) 자신의 recA 카피를 갖지 않는 숙주 세포에 대한 RecA 동족체를 발현하는 레귤론, 및 (v) 조건 복제 기점을 포함한다. 이들 요소는 하기에 더욱 상세히 기재된다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용된 헬퍼 플라스미드는 헬퍼 플라스미드 pTKRED(Gene bank GU327533.1;[12])와 유사한 구성요소를 포함한다. 특정 구체예에서, 헬퍼 플라스미드 pTKRED(Gene bank GU327533.1;[12])가 본원에 기재된 방법에서 사용된다.
(3) 공여체 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드가 동일 숙주 세포로 도입된다. 공여체 및 헬퍼 플라스미드의 삽입은 전기천공, 화학적 적격 세포의 사용, 열 충격, 및 파지 형질도입을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 당업자에게 공지된 많은 다양한 기술에 의해 수행될 수 있다. 이후, 숙주 세포는 도입된 플라스미드를 갖는 세포를 농축시키기 위해 선택 조건하에서 배양될 수 있다.
(4) 삽입 절차가 개시된다. 예시적 삽입 절차는 하기 단계를 포함한다: 양성 클론(즉, 헬퍼 및 공여체 플라스미드 둘 모두를 포함하는 숙주 세포)의 밤새 배양물은, 예를 들어, 선택을 위한 적절한 항생제(이러한 항생제는 공여체/헬퍼 플라스미드에 존재하는 선택 카세트를 기초로 하여 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있음)를 포함하는 배지에서 30℃에서 성장될 수 있다. 이후, 배양물은 희석될 수 있고, 예를 들어, 적절한 항생제의 존재하에서 지수증식기까지 30℃에서 성장될 수 있다. 상기 조건하에서, 헬퍼 및 공여체 플라스미드가 유지되나, 침묵(silent)된다. 다음으로, 배지는 선택을 위한 항생제 뿐만 아니라 플라스미드에 존재하는 조건 요소의 임의의 유도인자(예를 들어, 유도성 프로모터 또는 조건 복제 기점)를 함유하는 배지로 대체된 후, 세포가 추가로 인큐베이션된다. 상기 시간 동안, 헬퍼 플라스미드 내의 제한 엔도뉴클레아제(예를 들어, SceI) 및 헬퍼 플라스미드 내의 재조합효소(예를 들어, 람다 red 재조합효소)가 발현되어, 상동성 아암에서의 공여체 플라스미드의 분해, 및 숙주 세포의 유전체 내의 상동성 부위에서의 상동성 DNA의 상동성 재조합이 발생된다(도 2 참조). 다음으로, 세포는 공여체 플라스미드의 역선택 마커에 상응하는 성분(예를 들어, 역선택 마커가 sacB인 경우 수크로스)을 함유하는 배지에 플레이팅된다. 이러한 단계는 공여체 플라스미드를 포함하는 세포, 즉, 공여체 플라스미드가 삽입되지 않은 상태로 존재하는 세포의 역선택을 발생시킨다. 상기 배지는 또한 공여체 플라스미드의 삽입 카세트에 존재하는 내성 마커(즉, 이종성 삽입 DNA를 함유하는 세포를 선택하기 위한 공여체 플라스미드의 HR 사이에 존재하는 항생제 내성 카세트)를 포함한다. 밤새 인큐베이션 후, 세포는 이후 (i) 헬퍼 및 공여체 플라스미드의 상실 및 (ii) 이종성 DNA 삽입물의 존재와 일치하는 항생제 내성 표현형을 나타내는 조합된 클론이 스크리닝된다.
당업자는 상기 조건이 표준 실험 접근법을 이용하여 변형될 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 특정 조건은 사용되는 특정 숙주 세포, 사용되는 선택 및 역선택 마커 등을 기초로 하여 변경될 수 있다. 예시적 삽입 균주는 표 1 및 2에 제공된다.
특정 구체예에서, 숙주 세포로 DNA를 삽입하는 방법은 다음을 포함한다: 양성 클론(즉, 헬퍼 및 공여체 플라스미드를 함유하는 클론)의 밤새 배양물은 선택을 위한 항생제(spec 및 공여체 플라스미드의 선택가능한 마커 중 하나 또는 둘 모두)를 함유하는 액체 LB 배지 중에서 30℃에서 성장되고, 0.05의 OD600로 희석되고, 스펙티노마이신 및 DNA 삽입 선택 마커(kanR 또는 clmR)의 존재하에서 지수증식기까지 30℃에서 성장된다. 상기 조건하에서, 헬퍼 및 공여체가 유지되나, 침묵된다. 이후, 배지는 선택을 위한 항생제, 0.2% 아라비노스, 및 1 mM IPTG를 함유하는 LB 배지로 대체되고, 세포는 몇시간(2, 4, 6, 8 h) 동안 30℃에서 추가로 인큐베이션된다. 상기 시간 동안, SceI 및 Red 재조합효소 단백질이 발현되어, 상동성 아암에서의 공여체 플라스미드의 분해, 및 유전체 내의 상동성 부위에서의 상동성 DNA의 상동성 재조합이 발생된다(도 2). 이후, 세포는 10% 수크로스(공여체 플라스미드를 함유하는 세포를 역선택하기 위함), 및 DNA 삽입물을 여전히 함유하는 세포를 선택하기 위한 삽입 카세트에 존재하는 내성 마커(kanR 또는 clmR)를 함유하는 LB 배지에 플레이팅된다. 다른 선택 및 역선택 마커는 조건의 조정을 필요로 할 수 있다. 37-42℃에서의 밤새 인큐베이션 후, 세포는 i) 헬퍼의 상실 및 ii) 공여체 플라스미드 및 iii) DNA 삽입물의 존재와 일치하는 항생제 내성 표현형을 나타내는 재조합된 클론에 대해 스크리닝된다. 클론은 민감한 콜로니를 스크리닝하기 위해 amp, spec, 및 kan 또는 clm이 보충된 LM 상에서 복제 플레이팅된다. DNA 삽입물을 함유할 가능성이 있는 후보 박테리아 콜로니를 나타내는 조합된 표현형은 앰피실린에 대한 민감성(공여체 플라스미드의 상실을 나타냄); 스펙티노마이신 민감성(헬퍼 플라스미드의 상실을 나타냄); Clm 또는 kan 내성(DNA 삽입물의 존재를 나타냄)이다.
하기 실시예에서 입증되는 바와 같이, 상기 방법은 과정 중에 E. 콜리 유전체로부터 자연적으로 미리 존재하는 O 항원 및 캡슐 클러스터를 동시에 제거하면서 E. 콜리 유전체의 특정 위치로 O 항원 및 캡슐 다당류 클러스터를 포함하는 이종성 DNA 서열을 삽입하기 위해 사용되었다. 생성된 숙주 세포는 특정 부위에 공유적으로 결합된 O 항원 다당류를 함유하는 상기 숙주 세포의 원형질막 주위공간에서 발현된 담체 단백질로 구성되는 당단백질을 생성시키기 위해 사용되었다. 당업자는 상기 방법이 숙주 세포로 임의의 요망되는 이종성 DNA 서열을 삽입하기 위해 적용될 수 있음을 용이하게 인지할 것이다.
5.1.1
헬퍼 플라스미드
본원에 기재되고 본원에 기재된 방법에 따라 사용되는 헬퍼 플라스미드는 DNA 삽입 매개 및 필요한 기간 동안 재조합을 겪는 숙주 세포, 즉, 이종성 DNA가 본원에 기재된 방법에 의해 삽입되는 숙주 세포 내의 헬퍼 플라스미드의 유지를 위한 모든 필요한 구성요소를 인코딩한다. 하기는 본원에 기재된 헬퍼 플라스미드로 도입될 수 잇는 특정 구성요소이다.
5.1.1.1
선택가능한 마커
선택가능한 마커는 본원에 기재된 바와 같이 변형된 숙주 세포로의 헬퍼 플라스미드의 적절한 도입을 보장하기 위해 본원에 기재된 헬퍼 플라스미드로 도입된다. 특히, 선택가능한 마커는 형질전환 후에 플라스미드를 수용한 숙주 세포를 선택하고, 재조합 절차 동안 플라스미드를 유지시키기 위해 사용될 수 있다. 선택을 위한 다수의 시스템이 당 분야에 공지되어 있고, 당업자가 이용가능하다. 예는 (i) 항생제에 대한 내성(예를 들어, amp, kan, spec, clm, gen, tmp, tet)[15]; (ii) 선택 배지에서의 성장, 예를 들어, 영양요구 마커 시스템(Regis Sodoyer, Virginie Courtois, Isabelle Peubez and Charlotte Mignon (2012). Antibiotic-Free Selection for Bio-Production: Moving Towards a New "Gold Standard", Antibiotic Resistant Bacteria - A Continuous Challenge in the New Millennium, Marina Pana (Ed.), ISBN: 978-953-51-0472-8, InTech, http://www.intechopen.com/books/antibiotic-resistant-bacteria-a-continuous-challenge-in-the-new-millennium/antibiotic-free-selection-for-bio-production-moving-towards-a-new-gold-standard로부터 이용가능함), (iii) 독소-항독소 시스템, 및 (iv) 예를 들어, 트리클로산(triclosan)과 같은 살생제에 대한 내성[16]을 부여하는 유전자 카세트를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 하기 표 6은 또한 선택을 위해 사용될 수 있는 항생제의 목록을 제공한다.
특정 구체예에서, 스펙티노마이신 내성 카세트는 표적 세포에서 헬퍼 플라스미드를 유지시키기 위해 헬퍼 플라스미드 선택에 사용된다.
5.1.1.2
재조합효소 효소
본원에 기재된 헬퍼 플라스미드는 DNA의 상동성 부분의 교차(상동성 재조합) 및 리라이게이션(re-ligation)을 뒷받침하기 위한 재조합효소를 포함한다. 본원에 기재된 방법에 따라 사용될 수 있는 예시적 재조합효소는 람다 red 재조합효소, Rac 프로파지로부터의 RecE/RecT[17], 및 박테리오파지 람다로부터의 RedαβΔ[18-20]를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 헬퍼 플라스미드에서 사용되는 재조합효소는 람다 red 재조합효소이다. 또 다른 특정 구체예에서, 람다 red 재조합효소는 lac 프로모터의 조절하에 있다. 람다 red 재조합효소는 상동성 재조합 반응(교차)을 촉매하며, 플라스미드 상의 3개의 열린해독틀에서 인코딩되는 3개의 기능성 서브유닛으로 구성된다. 첫번째 유전자는 다수의 숙주-뉴클레아제 억제제 단백질 Gam 패밀리인 gam이다. Gam 단백질은 RecBCD 뉴클레아제를 억제하고, 박테리아 및 박테리오파지 둘 모두에서 발견된다. 두번째 유전자는 베타이며, RecT 패밀리의 단백질을 인코딩한다. RecT 단백질은 DNA 단일-가닥 어닐링 단백질(SSAPs), 예를 들어, RecT, Red-베타, ERF 및 Rad52이며, RecA-의존성 및 RecA-독립적 DNA 재조합 경로에서 작용한다. 세번째 유전자는 YqaJ-유사 바이러스 재조합효소 도메인 단백질을 인코딩하는 exo 유전자이다. 이러한 단백질 패밀리는 많은 다양한 박테리아 종에서 발견되나, 바이러스 기원이다. 상기 단백질은 올리고머를 형성하며, Mg(2+)-의존성 반응에서 선형 이중-가닥 DNA를 분해하는 연작용 알칼리성 엑소뉴클레아제로 작용한다. 이는 5'-인산화 DNA 말단에 대한 선호를 갖는다. 3개의 단백질은 E. 콜리 및 다른 유기체에서 상동성 재조합 사건을 촉진한다.
특정 구체예에서, 헬퍼 플라스미드에 존재하는 재조합효소는 lac 프로모터가 아닌 프로모터의 조절하에 있다. 상기 다른 프로모터는 araBAD 프로모터[21], 람노스 프로모터[22], 열 유도성 프로모터[23], 살리실레이트 프로모터[24], 테트라사이클린 프로모터[25] 등을 포함할 수 있으나, 에에 제한되지는 않는다.
5.1.1.3
엔도뉴클레아제
헬퍼 플라스미드 상의 엔도뉴클레아제는 공여체 플라스미드를 선형화시키고, 이에 의해 DNA의 삽입 단편을 이동시킨다. 따라서, 본원에 기재된 제공된 방법에서 사용되는 공여체 플라스미드는 헬퍼 플라스미드에 존재하는 제한 엔도뉴클레아제의 인지 서열을 갖는다. 재조합효소 효소에 의한 상동성 재조합은 표적 부위와 쌍을 형성하기 위한 기질로서 단일 가닥 DNA 삽입물 말단에 좌우된다. 따라서, 선형화(즉, 이중 가닥 말단 생성)은 DNA 삽입물의 활성화를 위한 중요한 단계이다. 열린 이중 가닥 DNA 말단은 단일 가닥으로 효소적으로 분해되고, 이는 이후 쌍형성 및 재조합을 위한 실제 기질이다.
본원에서 사용된 엔도뉴클레아제는 숙주 세포의 세포질에서 작용할 수 있고, 이에 따라 이들은 공여체 플라스미드를 절단할 수 있으나, 숙주 세포 유전체 안정성에 영향을 미치지 않아야 한다. 일반적으로, 임의의 제한 효소 또는 DNA 이중 가닥 커터가 숙주 세포 유전체 DNA를 절단하지 않는 한 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 세포질에서 작용하고, 길고 희귀한 인지 부위를 표적으로 하는 엔도뉴클레아제가 사용될 수 있는데, 이러한 엔도뉴클레아제는 희귀한 인지 서열을 가짐에 의해 매우 부위 특이적이기 때문이다. 예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 28, 29, 또는 30개 초과의 염기쌍 인지 부위의 인지 서열을 갖는 엔도뉴클레아제가 본원에 기재된 방법에서 사용하기 위해 선택될 수 있다.
특정 구체예에서, 호밍 엔도뉴클레아제가 본원에 기재된 방법에서 사용된다. 호밍 엔도뉴클레아제는 인트론 또는 인테인에 의해 인코딩된 특별한 유형의 제한 효소이다. 이들은 다양한 구조적 기, 예를 들어, LAGLIDADG ( SEQ ID NO : 1), GIY-YIG (SEQ ID NO: 2), H-N-H, 및 His-Cys 박스 패밀리를 포함한다. 호밍 엔도뉴클레아제의 예시적 목록은 하기 표 4에 제공된다. 본원에서 사용되는 엔도뉴클레아제는 이들이 헬퍼 플라스미드에 또한 존재하는 유도성 프로모터의 조절하에 있도록 헬퍼 플라스미드에 존재할 수 있다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 헬퍼 플라스미드에 의해 인코딩된 엔도뉴클레아제는 SceI이다. SceI은 LAGLIDADG(SEQ ID NO: 1) DNA 엔도뉴클레아제 패밀리의 일원이다. 이는 DNA 이동 요소에 의해 인코딩된 부위-특이적 DNA 엔도뉴클레아제의 패밀리이다. 기능적으로, SceI은 E. 콜리 유전체에서 발생하지 않는 18개 염기쌍의 인지 서열 TAGGGATAACAGGGTAAT(SEQ ID NO: 3)을 절단하는 호밍 제한 엔도뉴클레아제이다. 특이적인 희귀한 긴 인지 서열은 본 발명에서의 이의 적용에 중요하다. 특정 구체예에서, SceI은 유도성 프로모터, 예를 들어, 아라비노스 프로모터의 조절하에 있다.
5.1.1.4
RecA
RecA는 상동성 재조합, DNA 복구, 및 SOS 반응의 유도에서 역할을 하는 박테리아 효소이다. RecA는 DNA 가닥 교환에 ATP 가수분해를 커플링시키고, 즉, 이는 실제 재조합 반응을 촉매한다. 본원에 기재된 바와 같은 재조합의 목적상, recA 활성이 숙주 세포포에 존재해야 한다. 그러나, 대부분의 경우에서, 야생형 숙주 세포 유전체에 존재하는 카피는 재조합이 발생하기에 충분하다. 따라서, recA는 recA를 내인성으로 발현하는 숙주 세포로 도입될 필요는 없다.
recA를 발현하지 않는 숙주 세포에서, recA는 헬퍼 플라스미드 상에서 숙주 세포로 도입될 수 있다. RecA 동족체는 거의 모든 유기체에 존재한다. 따라서, 당업자는 임의의 recA 기능적 유전자가 본원에 기재된 방법에 따라 사용될 수 있으며, 즉, 숙주 세포에서의 이의 자연적 존재를 기초로 하여 사용되거나, 숙주 세포, 예를 들어, recA를 자연적으로 포함하지 않는 숙주 세포로 recA 기능을 도입시킴으로써 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
5.1.1.5
조건 복제 기점
헬퍼 플라스미드의 DNA 복제 및 세포 분열 동안 딸세포로의 플라스미드 카피의 분포에 복제 기점이 필요하다. 세포에서 플라스미드 카피수를 향상시키거나 감소시키기 위해 조건 복제 기점이 사용될 수 있다. 예를 들어, 온도 민감성 복제 기점이 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있다. 상기 복제 기점은 37℃ 초과의 온도에서 비-기능적이어서 플라스미드 상실을 발생시킨다. 다른 조건 복제 기점이 당 분야에 공지되어 있으며, 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있다[26]. 조건 복제 기점의 예시적 목록이 표 5에 제공된다.
특정 구체예에서, 본원에서 사용된 복제 기점은 온도 민감성 pSC101 복제 기점[27]이며, 이는 높은 온도에서의 성장시 플라스미드의 상실을 발생시킨다. 사용될 수 있는 다른 복제 기점은 pMB1, ColE1, R100, IncW, 및 다른 것으로부터의 것을 포함한다(예를 들어, [28] 참조).
5.1.1.6
유도성 프로모터 및 유도인자
헬퍼 플라스미드 기능을 조절하는 능력은 세포 성장 동안 재조합 활성을 제한된 시간으로 감소시키는데 중요한데, 이는 연속적 재조합이 촉진되는 경우 원치않는 부작용이 발생할 수 있기 때문이다. 따라서, 유도성 프로모터 및 유도인자가 헬퍼 플라스미드의 특정 구성요소가 요망되는 경우에만 발현되는 것을 보장하기 위해 이용될 수 있다. 예시적 유도성 프로모터는 araBAD 프로모터 시스템(아라비노스의 존재에 의해 유도됨) 및 tac 프로모터(IPTG의 존재에 의해 유도됨)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 표 7은 본원에 기재된 방법에 따라 사용될 수 있는 유도성 성분의 추가 목록을 제공한다.
5.1.2
공여체 플라스미드
본원에 기재된 공여체 플라스미드는 숙주 세포에 요망되는 이종성 삽입 DNA 서열을 "공여"하여, 이종성 삽입 DNA가 안정적으로 통합된 숙주 세포를 발생시킨다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 방법에서 사용된 공여체 플라스미드는 플라스미드 pDOC-C를 기초로 한다(Gene bank GQ889494.1;[11]). pDOC-C는 pEXT100T의 유도체이다[29]. 플라스미드는 선택을 위한 앰피실린 내성 유전자(ampR), 복제 기점(oriT), 및 sacB 유전자를 함유한다. SacB는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)로부터 유래된 레반슈크라제(levansucrase) 오페론의 분비된 단백질이다. 수크로스의 존재하에서, sacB는 치사율을 제공한다. 따라서, 단순히 배지에 수크로스를 첨가함으로써, 플라스미드를 갖는 세포에 대해 역선택하기 위한 시스템으로서 sacB가 사용될 수 있다[30]. 또한, pDOC-C는 생체내 선형화를 위해 SceI 부위에 플랭킹된 다중 클로닝 부위를 인코딩한다.
하기는 본원에 기재된 헬퍼 플라스미드로 도입될 수 있는 특정 구성요소이다.
5.1.2.1
선택가능한 마커
본원에 기재된 공여체 플라스미드 상에 존재하는 선택가능한 마커는 상기 섹션 5.1.1.1에 제공된 바와 동일한 목록 뿐만 아니라 하기 표 6에 나열되는 것으로부터 선택될 수 있다. 다른 선택 시스템이 또한 사용될 수 있고, 예를 들어, 영양요구 마커를 기초로 한 선택 시스템이 삽입 사건 선택에 유용할 것이다. 수용체 균주가 균주를 영양요구로 만드는 유전자 내에 결실을 함유하는 경우(즉, 이의 성장은 특정 배지 구성요소에 좌우됨), 이러한 유전자는 DNA 삽입물에 포함될 수 있다.
특정 구체예에서, 공여체 플라스미드는 clmR 및/또는 kanR 카세트를 포함한다.
5.1.2.2
이종성 삽입 DNA
당업자는 임의의 유전자, 또는 유전자의 조합물이 이종성 삽입 DNA에 포함될 수 있고, 이후 본원에 기재된 방법을 이용하여 숙주 세포 유전체로 삽입될 수 있음을 용이하게 인지할 것이다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 숙주 세포로 삽입된 이종성 삽입 DNA는 유전자 클러스터를 포함한다. 특정 구체예에서, 유전자 클러스터는 캡슐 다당류를 인코딩하는 것이다. 또 다른 특정 구체예에서, 유전자 클러스터는 O 항원을 인코딩하는 것이다. 상기 삽입된 유전자 클러스터를 포함하는 숙주 세포는, 예를 들어, 백신으로 사용될 수 있는 재조합 당단백질 생성물을 합성하기 위해 사용될 수 있다.
당업자는 본 발명이 숙주 세포의 유전체로의 큰 DNA 서열의 안정적 삽입을 가능케 하는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, DNA 서열은 1 kb 내지 40 kb까지 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 이종성 삽입 DNA는 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 16 kb, 17 kb, 18 kb, 19 kb, 또는 20 kb 초과이다. 특정 구체예에서, 이종성 삽입 DNA는 25 kb 초과이다. 특정 구체예에서, 이종성 삽입 DNA는 30 kb 초과이다. 특정 구체예에서, 이종성 삽입 DNA는 35 kb 초과이다. 특정 구체예에서, 이종성 삽입 DNA는 40 kb 초과이다.
한 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 E. 콜리 균주의 rfb 클러스터를 포함하는 DNA 서열을 숙주 세포로 삽입시키기 위해 사용된다. 삽입된 rfb 클러스터는 당 분야에 공지된 임의의 O 혈청군/O 항원, 예를 들어, O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19, O20, O21, O22, O23, O24, O25, O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45, O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73, O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, O111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144,O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186, 또는 O187, 및 이들의 하위혈청형에 속할 수 있다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 원핵생물 숙주 세포이다. 또 다른 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜리이다.
또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 슈도모나스(Pseudomonas) 균주의 rfb 클러스터를 포함하는 DNA 서열을 숙주 세포로 삽입하기 위해 사용된다. 특정 구체예에서, 슈도모나스 균주는 P. 아에루기노사(P. aeruginosa) 균주이다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 원핵생물 숙주 세포이다. 또 다른 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜리이다.
또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 살모넬라(Salmonella) 균주의 rfb 클러스터를 포함하는 DNA 서열을 숙주 세포에 삽입하기 위해 사용된다. 특정 구체예에서, 살모넬라 균주는 S. 엔테리카(S. enterica) 균주이다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 원핵생물 숙주 세포이다. 또 다른 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜리이다.
또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 숙주 세포로 예르시니아(Yersinia) 균주의 rfb 클러스터를 포함하는 DNA 서열을 삽입하기 위해 사용된다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 원핵생물 숙주 세포이다. 또 다른 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜리이다.
또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 클렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae) 균주의 rfb 클러스터를 포함하는 DNA 서열을 숙주 세포로 삽입하기 위해 사용된다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 원핵생물 숙주 세포이다. 또 다른 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜리이다.
또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis) 균주의 rfb 클러스터를 포함하는 DNA 서열을 숙주 세포에 삽입하기 위해 사용된다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 원핵생물 숙주 세포이다. 또 다른 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜리이다.
또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 아시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii) 균주의 rfb 클러스터를 포함하는 DNA 서열을 숙주 세포로 삽입하기 위해 사용된다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 원핵생물 숙주 세포이다. 또 다른 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜리이다.
또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 부르크홀데리아(Burkholderia ) 균주의 rfb 클러스터를 포함하는 DNA 서열을 숙주 세포로 삽입하기 위해 사용된다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 원핵생물 숙주 세포이다. 또 다른 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜리이다.
또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 시겔라(Shigella) 균주의 rfb 클러스터를 포함하는 DNA 서열을 숙주 세포에 삽입하기 위해 사용된다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 원핵생물 숙주 세포이다. 또 다른 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜리이다.
또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 유기체의 캡슐 다당류 유전자 클러스터를 포함하는 DNA 서열을 숙주 세포에 삽입하기 위해 사용된다. 특정 구체예에서, 유기체는 E. 콜리 균주이다. 또 다른 특정 구체예에서, 유기체는 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 균주(예를 들어, S. 뉴모니에(S. pneumoniae), S. 피로게네스(S. pyrogenes), S. 아갈락티카에(S. agalacticae)), 스태필로코쿠스(Staphylococcus) 균주(예를 들어, S. 아우레우스(S. aureus)), 부르크홀데리아(Burkholderia) 균주(예를 들어, B. 말레이(B mallei), B. 슈도말레이(B. pseudomallei), B. 타일란덴시스(B. thailandensis))이다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 원핵생물 숙주 세포이다. 또 다른 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜리이다.
또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 운데카프레닐피로포스페이트 상에서 올리고당류 또는 다당류를 합성하는 하나 이상의 효소를 포함하는 DNA 서열을 삽입하기 위해 사용된다.
특정 구체예에서, 숙주 세포는 rfb 클러스터 외부에서 인코딩되는 상기 숙주 세포 유전 요소로 도입시킴으로써 최적화된다. 예를 들어, rfb 클러스터 및 캡슐 다당류 클러스터의 외부에서 발견되고, 재조합 다당류를 변형시키는 글리코실트랜스페라제 및 아세틸트랜스페라제를 인코딩하는 유전자가 숙주 세포로 도입될 수 있다. 또 다른 예로서, E. 콜리 및 시겔라 O 항원에서, 프로파지 유전자 클러스터에서 인코딩된 글루코실트랜스페라제가 존재한다[31,32]. 이들 유전자 클러스터는 gtr로 언급되고, 운데카프레놀-포스페이트(GtrA)에 단일 글루코스 잔기를 첨가하는 글루코실트랜스페라제, 글루코스-포스페이트 결합된 운데카프레놀을 막의 원형질막의 바깥쪽으로 플립(flip)시키는 GtrB, 및 이후에 운데카프레닐-포스페이트 결합된 글루코스를 성장하는 O 항원 사슬로 운반하는 특정 Gtr 트랜스페라제로 이루어진 오페론으로 구성된다. 상기 유전자를 포함하는 DNA는 본원에 기재된 숙주 세포로 도입될 수 있다.
유사한 변형은 아세틸화이다. O 항원의 아세틸화는 시겔라에서 흔하고, E. 콜리에서는 정도가 덜하다. 변형은 rfb 클러스터 내에서 종종 인코딩(E. coli O16)되나, 또한 rfb 클러스트의 외부에서 인코딩(S. 플렉스네리 3a)되는 단일 아세틸 트랜스페라제에 의해 촉매된다[33]. 상기 아세틸 트랜스페라제를 인코딩하는 DNA는 본원에 기재된 숙주 세포로 도입될 수 있다.
O 항원의 분지 및 변형은 종종 다당류에 대한 효과적이고 특이적인 면역 반응에 중요하다. 따라서, 이들 변형 경로는 자연에서 발견된 모든 가능한 에피토프를 함유하는 컨쥬게이트를 생성시키기 위해 삽입되는 생성 균주에 포함될 수 있다.
본 발명의 추가 구체예는 유도성 프로모터 시스템에 의해 조절되는 재조합 단백질 생성을 위한 발현 카세트의 삽입이다. 이는 발현 카세트를 함유할 뿐만 아니라 조절 단백질을 위한 발현 작제물을 함유하는 큰 DNA 스트레치가 제시된 기술에 대한 적당한 표적인 것을 의미한다.
본원에 기재된 방법에 따라 숙주 세포로 삽입될 수 있는 다른 DNA 서열은 공지된 공급원으로부터 유래된 올리고사카릴트랜스페라제 및 글리코실트랜스페라제, 예를 들어, 원핵생물 올리고사카릴트랜스페라제 및 글리코실트랜스페라제 및/또는 진핵생물 올리고사카릴트랜스페라제 및 글리코실트랜스페라제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
(a)
상동성 영역의 선택
본원에 기재된 방법에 따라 사용하기 위한 상동성 영역(HR)의 길이는 실험적으로 결정될 수 있다. 일반적으로, HR은 약 0.1 kb 및 3.0 kb, 또는 그 초과의 범위의 길이를 가질 수 있다. 특정 구체예에서, HR은 0.1 kb 내지 0.5 kb, 0.5 kb 내지 1 kb, 1 kb 내지 3 kb, 3 kb 내지 5 kb, 5 kb 내지 10 kb, 10 kb 내지 15 kb, 15 kb 내지 20 kb, 또는 20 kb 초과이다. 특정 구체예에서, HR은 동일 길이이거나, 길이가 동등하다. 특정 구체예에서, HR은 동일 길이가 아니거나, 길이가 동등하지 않다.
HR 사이의 거리는 또한 실험에 의해 결정될 수 있다. HR 사이의 거리는 .1 kb 내지 12 kb, 또는 그 초과의 범위일 수 있고, 이종성 삽입 DNA 및/또는 결실되는 숙주 세포 유전체 내의 DNA의 스트레치의 길이에 의해 결정될 수 있다(예를 들어, 숙주 세포 유전체의 긴 스트레치는 이들이 숙주 세포의 생존에 필수적인 유전자를 포함하지 않는 한 결실될 수 있다). 이종성 DNA 삽입의 위치는 HR의 서열에 의해 규정된다. 따라서, 삽입은 숙주 세포의 유전체 내의 사실상 임의의 위치(예를 들어, 숙주 세포의 임의의 염색체 상의 임의의 위치)에서 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 공여체 플라스미드의 HR이, 예를 들어, 표적 염색체 내가 아니라 숙주 세포에 존재하는 표적 플라스미드 상에 존재하는 한, 본원에 기재된 방법은 표적 세포에 존재하는 플라스미드로 큰 DNA 단편을 클로닝하기 위해 이용될 수 있다.
본원에 기재된 방법의 중요한 양태는 DNA 삽입물이 상동성 재조합 영역을 선택함으로써 이에 따라 선택된 유전체 위치 내에 삽입되는 것이다(HR1 및 HR2, 도 1 참조). HR1 및 HR2는 공여체 플라스미드 상의 DNA 삽입물에 플랭킹되어 있고, 이들은 또한 삽입 후에 DNA 삽입물에 의해 대체되는 DNA에 플랭킹된다. 하기에 제공되는 실시예에서, 표적 염색체에서 서로 3(wecA-wzzE의 대체) 또는 12 kb(rfb 클러스터의 대체) 떨어져 위치된 HR이 선택되었고, 성공적인 삽입이 관찰되었다.
삽입 위치는 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다수의 방식으로 선택될 수 있다: I) 삽입 영역이 선택될 수 있는데, 이는 경쟁 또는 방해 경로를 요망되는 것으로 대체함으로써 경쟁 또는 방해 경로를 가능하게는 제거하는 것이 요망되기 때문이며(하기 실시예 참조); II) 삽입은 표적 세포가 자연적으로 유사한 클러스터를 함유하는 위치에서 선택될 수 있다. 발현 수준 및 위치는 이후 최적 발현을 위해 균형이 이루어질 수 있고; III) 삽입 위치는 삽입되는 DNA와 관련되지 않을 수 있고, 발현 수준에 대해 완전히 경험적으로 선택될 수 있고, 재조합 DNA 삽입물은 특정 위치에서 나타나고, 즉, 다수의 상이한 무작위 삽입이 이루어질 수 있고, 최적 생성 균주가 선택될 수 있으며; IV) 삽입은 요망되지 않는 기능을 결실시킬 수 있거나, 재조합 단백질의 선택을 위해 사용될 수 있는 기능을 결실시킬 수 있다.
(b)
삽입 부위의 DNA의 결실
특정 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 숙주 세포 DNA의 결실, 예를 들어, 삽입된 DNA의 요망되는 결과를 방해할 수 있는 하나 이상의 유전자를 인코딩하는 유전체 DNA의 결실을 발생시킨다. 특정 구체예에서, 제거되는 숙주 세포 유전체 DNA는 이종성 삽입 DNA로 직접적으로 대체된다. 경쟁 또는 방해 경로를 요망되는 것으로 가능하게 대체함으로써 경쟁 또는 방해 경로를 제거하는 상기 개념은 DNA 삽입 부위를 선택하는 적당한 방식이다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 방법을 이용하여 생성된 변형된 숙주 세포를 이용하여 단백질 글리코컨쥬게이트를 조작하는 것이 요망되는 경우에서, waaL, 장내세균 공통 항원(ECA) 유전자 클러스터(wec 클러스터로도 언급됨)에서 인코딩되는 유전자, gtr 프로파지 유전자 클러스터 유전자, 뉴클레오티드 당 생합성과 관련된 유전자, 원형질막주위 프로테아제를 인코딩하는 유전자, 및 Und-P 생합성 및 재순환 유전자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 당단백질 수율을 감소시키는 단백질을 인코딩하는 유전자를 결실시키는 것이 유용하다. 일부 경우에서, 숙주 세포 글리코실트랜스페라제는 DNA 삽입물에 의해 인코딩된 재조합 다당류 생성을 방해할 수 있다. 따라서, 본 발명의 추가 구체예는 재조합 다당류를 변형시켜 요망되지 않는 특징을 갖는 하이브리드 구조를 발생시키는 숙주 세포 글리코실트랜스페라제의 결실이다.
(c)
삽입된 DNA의 제거
재조합 박테리아 균주가 GIMP 하에서의 임상 물질 생성에 사용되는 경우 원치않고 불필요한 서열이 우려사항이다. 따라서, 특정 구체예에서, 보조 DNA 서열은 이들이 더 이상 필요하지 않을 시에 본원에 기재된 방법에 따라 생성된 숙주 세포로부터 제거된다. 예를 들어, 관심 DNA와 함께 삽입되는 선택 카세트는 이들이 더 이상 생성된 숙주 세포와 관련되지 않도록 하기 위해 이후에 제거될 수 있다. DNA의 삽입 후에 상기 요소를 제거하기 위해, 다양한 방법이 사용될 수 있다[34]. 예를 들어, FRT/FLP 유래된 부위 특이적 재조합이 이용될 수 있다[35](실시예 참조). 상기 경우에서, 제거되는 서열에 플랭킹되는 FLP 서열에 특이적인 재조합효소(예를 들어, 28 bp 서열을 인지하는 FLP 재조합효소)는 he 서열을 조합시킴으로써 상기 특이적 서열 사이의 DNA를 절제시킬 수 있다. 대안적 절제 시스템은 loxP/Cre, 및 difXer 시스템이다[14,36].
5.1.2.3
다른 변형
특정 구체예에서, 본원에 기재된 글리코컨쥬게이트는 최적화된 성장 배지에서 생성된다. 특정 구체예에서, 성장 배지는 (i) 배지 내의 효모 추출물의 양(예를 들어, 5 내지 35 g/l), (ii) 배지의 Mg2 + 농도(예를 들어, 0 내지 25 mM), (iii) 배지의 펩톤 추출물 농도(예를 들어, 5-25 g/l), (iv) 배지의 트립톤 추출물 농도(예를 들어, 5-25 g/l), 및/또는 (v) 배지로의 분자 샤페론의 첨가, 예를 들어, 트레할로스(예를 들어, 25 mM-50mM), 에틸렌글리콜(예를 들어, 0.5%), 글루탐산(예를 들어, 0.1 M), 푸트레신(예를 들어, 25 mM), 트리메틸-N-옥시드(예를 들어, 5 mM), 및/또는 L-프롤린(예를 들어, 5 mM)의 첨가 중 하나 이상을 다양화시킴으로써 최적화된다.
특정 구체예에서, 성장 배지는 배지의 pH를 다양화시킴으로써 최적화된다. 예를 들어, pH 6.5로부터 8.5로의 변화는 글리코컨쥬게이트 수율에 대한 효과에 대해 평가될 수 있다. 특정 유전자는 특정 pH에서 최적으로 수행한다. 따라서, 성장 배지는 특정 유전자의 최적화를 위해 선택된 pH 값에서 사용될 수 있다. 예를 들어, PglB 활성은 ~pH 8에서 최적이다. 따라서, 특정 구체예에서, 본원에 기재된 방법에서의 숙주 세포의 성장은 pH 8에서 수행된다. 또 다른 특정 구체예에서, 본원에 기재된 방법에서의 숙주 세포의 성장은 4-6, 5-7, 6-8, 또는 7-9 범위의 pH에서 수행된다.
5.1.3
플라스미드 도입의 방법
당업자에게 공지된 임의의 방법이 플라스미드, 예를 들어, 공여체 및 헬퍼 플라스미드, 및 DNA를 숙주 세포로 도입시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 전기천공, 열 충격에 의한 화학적 형질전환, 자연 형질전환, 파지 형질도입, 및 컨쥬게이션을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
5.1.4
숙주 세포
본원에 기재된 방법에 의해 조작된 숙주 세포가 본원에 포함되며, 상기 숙주 세포는 관심 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함한다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 숙주 세포에 의해 생성된 단백질은 백신에서 사용될 수 있는 항원, 예를 들어, 바이러스 또는 박테리아 항원이다. 또 다른 특정 구체예에서, 본원에 기재된 숙주 세포에 의해 생성된 단백질은 담체 단백질이며, 상기 담체 단백질은 하나 이상의 이로운 특징을 갖도록 본원에 기재된 숙주 세포에 의해 변형되며, 예를 들어, 담체 단백질은 당화된다.
헬퍼 및 공여체 플라스미드에서 인코딩되는 요소는 본 발명이 특정 숙주 세포에서 사용될 수 있는지 결정한다. 하기 실시예는 그람-음성 E. 콜리 숙주 세포에서의 사용을 기재하나, 고세균, 원핵생물 숙주 세포, 및 진핵생물 숙주 세포를 포함하는 당업자에게 공지된 임의의 숙주 세포가 DNA의 삽입을 위한 수용체 세포로 사용될 수 있다. 예시적 원핵생물 숙주 세포는 에스케리키아(Escherichia) 종, 시겔라(Shigella) 종, 클렙시엘라(Klebsiella) 종, 잔토모나스(Xhantomonas) 종, 살모넬라(Salmonella) 종, 예르시니아(Yersinia) 종, 락토코쿠스(Lactococcus) 종, 락토바실러스(Lactobacillus) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 코리네박테리움(Corynebacterium) 종, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종, 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 종, 스태필로코쿠스(Staphylococcus) 종, 바실러스(Bacillus) 종, 및 클로스트리듐(Clostridium) 종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
5.1.5
분석 방법
본 발명의 기능적 적용을 위해, 플라스미드 유지(헬퍼 플라스미드, 공여체 플라스미드) 및 DNA 삽입물 선택을 위한 다양한 선택 시스템의 조합을 사용하는 것이 필수적이다. 이들 선택 시스템은 서로 상용성이어야 하고, 즉, 이들은 현존하는 시스템(specR, ampR 및 clmR 또는 kanR)과 유사할 수 있거나, 유용한 항생제 카세트 및/또는 대안적 플라스미드 선택 시스템의 임의의 대안적 조합일 수 있다.
후보 삽입 클론의 유전형은 DNA 분석에 사용되는 임의의 방법에 의해 확인될 수 있다. 스크리닝은 염색체 삽입 위치의 상황에서 DNA 삽입물의 존재를 분석하는 것을 기초로 해야 한다. 이는 DNA 삽입물은 표적 부위, 즉, 표적 부위 영역 외부의 서열 다음에서 발견되어야 하는 것을 의미한다. PCR은 예를 들어, O 항원 클러스터가 상이한 것으로 교환되는 경우에 재조합에 의해 절제된 유전자의 부재를 나타내기 위해 수행될 수 있다. 또는, 이는 DNA 삽입물의 존재를 나타내기 위해 사용될 수 있다. 또는, 이는 HR에 플랭킹된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 DNA 스트레치를 증폭시키기 위해 사용될 수 있으며, 이는 염색체 DNA 및 DNA 삽입물의 결합이 발생한 것을 나타낸다. DNA 서열분석은 동일 결과를 나타낼 수 있으며, 즉, DNA 삽입물 서열은 상동성 재조합에 의해 영향을 받지 않는 염색체 DNA 서열에 연속적으로 연결되어야 한다. 또는, DNA 삽입물 및 삽입(HR) 부위 다음의 영향을 받지 않는 염색체 서열을 함유하는 염색체 DNA 단편을 확인하기 위해 서던 블롯이 사용될 수 있다. 또는, DNA 삽입물 단편에 특이적인 PCR 프로브를 이용한 콜로니 하이브리드화가 이용될 수 있다.
DNA 삽입물의 존재를 나타내는 또 다른 방식은 삽입된 유전자의 활성을 평가하는 것에 의한 것이다. 후보 클론의 표현형 분석은 DNA 삽입물의 활성을 확인하는 것을 가능케 하나, 정확한 삽입 위치를 확인하는 것은 가능하지 않다. 하기 제시된 실시예에서, 재조합 다당류 생합성 유전자 클러스터가 삽입되었고, 이에 따라 재조합 세포 내의 삽입 후의 다당류의 존재를 나타내는 간단한 실험은 성공적인 재조합을 입증하기에 충분하다. 이는 SDS PAGE 또는 크로마토그래피 후 웨스턴 블로팅 또는 ELISA에 의한 세포 추출물의 분리와 조합이 가능하나 반드시 그럴 필요는 없는 다당류 특이적 항혈청을 이용한 면역 블롯(웨스턴 블롯, 콜로니 블롯, 도트 블롯 등)에 의해 수행될 수 있으며, 또한, 고해상도 기술, 예를 들어, MS, NMR, HPLC, 또는 생성물에 대한 화학적 또는 물리적 확인 방법이 DNA 삽입물 활성을 입증하는데 유용하다.
5.2
적용
5.2.1
단백질 당화
특정 구체예에서, 본원에 제공된 변형된 숙주 세포가 단백질 당화에 사용될 수 있다. 단백질 당화는 컨쥬게이트 백신, 즉, 백신이 설계되는 병원체의 다당류 및 단백질 항원을 함유하는 백신을 생성시키도록 설계될 수 있다.
5.2.1.1
항원
하기 다당류 항원과 관련된 유전자를 인코딩하는 DNA가 본원에 기재된 방법에 따라 삽입 DNA로서 사용될 수 있다:
E. 콜리의 O 항원(O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19, O20, O21, O22, O23, O24, O25, O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45, O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73, O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, O111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144,O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186, O187), 살모넬라 종(S. 엔테리카 아종 엔테리카(S. enterica subsp. Enterica), S. 엔테리카 아종 살라메(S. enterica subsp. Salamae), S. 엔테리카 아종 아리조네(S. enterica subsp. arizonae), S. 엔테리카 아종 디아리조네(S. enterica subsp. Diarizonae), S. 엔테리카 아종 휴테네(S. enterica subsp. Houtenae), S. 봉고리(S. bongori), 및 S. 엔테리카 아종 인디카(S. enterica subsp. Indica), 및 [37]에 상술된 바와 같은 O 타입 1-67, 슈도모나스 종(P. 아에루기노사 O 혈청형 1-20 [38]), 클렙시엘라 종(특히, K. 뉴모니아(K. pneumonia) 혈청형 O1, O2(및 하위혈청형), O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, [39]), 아시네토박터(Acinetobacter) O 항원(특히, [40]에서 확인되는 A. 바우만니이(A. baumannii) O 항원), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) O 항원(혈청형 A, B, C, D, E, F, G, H, I J, K, L1, L2, L3), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera) O 항원 O1 내지 155, 리스테리아 종(Listeria sp.), 특히 L. 모노사이토게네스(L. monocytogenes) 유형 1, 2, 3, 4 및 이들의 하위혈청형, 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila) 혈청형 1 내지 15 O 항원, 보르데텔라 파라퍼투시스(Bordetella parapertussis) O 항원, 부르크홀데리아 말레이(Burkholderia mallei) 및 슈도말레이(pseudomallei) O 항원, 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 캄필로박터 종(Campylobacter sp.)(C. 제주니(C. jejuni)); 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile)(혈청형 A, G, H, K, S1, S4, D, Cd-5, K Toma et al 1988, 및 C. 퍼프린겐스(C. perfringens) 혈청형 A, B, C, D 및 E), 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 타입 5 및 8, 스트렙토코쿠스 피로게네스(Streptococcus pyrogenes)(그룹 B 스트렙토코쿠스 캡슐 혈청형 다당류), E. 콜리(E. coli), 스트렙토코쿠스 아갈락티카에(Streptococcus agalacticae)(그룹 A 스트렙토코쿠스 캡슐 다당류), 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis)(혈청형 A, B, C, W, Y, X), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis) 캡슐 다당류 타입 I-V의 캡슐 다당류; 및 다른 표면 다당류 구조, 예를 들어, 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi) 당지질([41]), 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis) 필린 O 글리칸[42,43] 및 리포올리고당류(LOS), 헤모필루스 인플루엔자 LOS, 리슈매니아 메이저(Leishmania major) 리포포스포글리칸[44,45]), 종양 관련 탄수화물 항원(말라리아 글리코실 포스파티딜이노시톨, 미코박테리움 튜베르쿨로시스 아라비노만난)[46].
5.2.1.2
담체 단백질
컨쥬게이트 백신의 생성에서 사용하기에 적합한 임의의 담체 단백질이 본원에서 사용될 수 있다. 예시적 담체 단백질은 P. 아에루기노사의 외독소 A(EPA), CRM197, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, S. 아우레우스의 무독화된 용혈소 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, E. 콜리 FimH, E. 콜리 FimHC, E. 콜리 열 민감 장독소, E. 콜리 열 민감 장독소의 무독화 변이체, 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB), 콜레라 독소, 콜레라 독소의 무독화된 변이체, E. 콜리 sat 단백질, E. 콜리 sat 단백질의 패신저 도메인, C. 제주니(C. jejuni) AcrA, 및 C. 제주니 자연 당단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 컨쥬게이트 백신의 생성에서 사용되는 담체 단백질은 변형되고, 예를 들어, 단백질이 덜 독성이고/이거나, 당화 등에 더욱 민감하도록 하는 방식으로 변형된다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 컨쥬게이트 백신의 생성에서 사용되는 담체 단백질은 단백질의 낮은 농도가, 예를 들어, 면역원성 조성물 내에 이의 바이오컨쥬게이트 형태로 투여되는 것을 가능케 하는 방식으로 담체 단백질 내의 당화 부위의 수가 최대화되도록 변형된다. 따라서, 특정 구체예에서, 본원에 기재된 담체 단백질은 담체 단백질과 일반적으로 관련된 것보다(예를 들어, 자연/천연, 예를 들어, "야생형" 상태의 담체 단백질과 관련된 당화 부위의 수에 비해) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 초과의 당화 부위를 더 포함하도록 변형된다. 특정 구체예에서, 당화 부위의 도입은 단백질의 일차 구조 어디에라도 당화 컨센서스 서열의 삽입에 의해 달성된다. 상기 당화 부위의 도입은, 예를 들어, 단백질의 일차 구조에 새로운 아미노산을 첨가(즉, 당화 부위가 전체적 또는 부분적으로 첨가됨)하거나, 당화 부위를 생성시키기 위해 단백질 내의 존재하는 아미노산을 돌연변이(즉, 아미노산이 단백질에 첨가되지 않고, 단백질의 선택된 아미노산이 당화 부위를 형성하도록 돌연변이됨)시킴으로써 달성될 수 있다. 당업자는 단백질의 아미노산 서열은 당 분야에 공지된 접근법, 예를 들어, 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 변형을 포함하는 재조합 접근법을 이용하여 용이하게 변형될 수 있음을 인지할 것이다. 특정 구체예에서, 당화 컨센서스 서열은 담체 단백질의 특정 영역, 예를 들어, 단백질의 표면 구조, 단백질의 N 또는 C 말단, 및/또는 단백질의 염기에서 디설파이드 브릿지에 의해 안정화되는 루프 내로 도입된다. 특정 구체예에서, 고전적인 5개의 아미노산 당화 컨센서스 서열은 더욱 효과적인 당화를 위해 리신 잔기에 의해 연장될 수 있고, 이에 따라 삽입된 컨센서스 서열은 삽입되어야 하거나, 수용체 단백질 아미노산을 대체하는 5, 6, 또는 7개의 아미노산을 인코딩할 수 있다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 컨쥬게이트 백신의 생성에 사용되는 담체 단백질은 "태그", 즉, 담체 단백질의 분리 및/또는 확인을 가능케 하는 아미노산의 서열을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 담체 단백질에 태그를 첨가하는 것은 단백질의 정제, 및 그러므로 태깅된 담체 단백질을 포함하는 컨쥬게이트 백신의 정제에 유용할 수 있다. 본원에서 사용될 수 잇는 예시적 태그는 히스티딘(HIS) 태그(예를 들어, 헥사 히스티딘-태그, 또는 6XHis-Tag), FLAG-TAG, 및 HA 태그를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 구체예에서, 본원에서 사용되는 태그는 이들이 더 이상 필요하지 않은 후, 예를 들어, 단백질이 정제된 후 제거가능하고, 예를 들어, 화학적 작용제 또는 효소적 수단에 의해 제거된다.
5.2.1.3
숙주 세포 변형
특정 구체예에서, 본원에 기재된 컨쥬게이트 백신을 생성시키기 위해 사용된 숙주 세포는 이종성 핵산, 예를 들어, 하나 이상의 담체 단백질을 인코딩하는 이종성 핵산 및/또는 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 이종성 핵산, 예를 들어, 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하도록 조작된다. 특정 구체예에서, 당화 경로(예를 들어, 원핵생물 및/또는 진핵생물 당화 경로)와 관련된 단백질을 인코딩하는 이종성 핵산이 본원에 기재된 숙주 세포로 도입될 수 있다. 상기 핵산은 올리고사카릴 트랜스페라제 및/또는 글리코실트랜스페라제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 단백질을 인코딩할 수 있다. 이종성 핵산(예를 들어, 담체 단백질을 인코딩하는 핵산 및/또는 다른 단백질, 예를 들어, 당화와 관련된 단백질을 인코딩하는 핵산)은 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 전기천공, 열 충격에 의한 화학적 형질전환, 자연 형질전환, 파지 형질도입, 및 컨쥬게이션을 이용하여 본원에 기재된 숙주 세포로 도입될 수 있다. 특정 구체예에서, 이종성 핵산은 플라스미드를 이용하여 본원에 기재된 숙주 세포로 도입되고, 예를 들어, 이종성 핵산은 플라스미드(예를 들어, 발현 벡터)에 의해 숙주 세포에서 발현된다. 또 다른 특정 구체예에서, 이종성 핵산은 본원에 제공된 삽입 방법을 이용하여 본원에 기재된 숙주 세포로 도입된다.
특정 구체예에서, 추가 변형이 본원에 기재된 숙주 세포로 도입(예를 들어, 재조합 기술을 이용함)될 수 있다. 예를 들어, 당화 경로와 경쟁하거나 방해(예를 들어, 숙주 세포로 재조합적으로 도입되는 당화와 관련된 하나 이상의 이종성 유전자와 경쟁하거나 방해)할 수 있는 부분을 형성하는 단백질을 인코딩하는 숙주 세포 핵산(예를 들어, 유전자)은 이들을 비활성/기능이상이 되도록 만드는 방식으로 숙주 세포 배경(유전체)에서 결실되거나 변형될 수 있다(즉, 결실/변형되는 숙주 세포 핵산은 기능성 단백질을 인코딩하지 않거나 어떻게든 단백질을 인코딩하지 않는다). 특정 구체예에서, 핵산이 본원에 제공된 숙주 세포의 유전체로부터 결실되는 경우, 이들은 요망되는 서열, 예를 들어, 당단백질 생성에 유용한 서열에 의해 대체된다. 상기 대체는 본원에 기재된 삽입 방법 중 하나 이상의 방식에 의해 이루어질 수 있으며, 숙주 세포로 삽입되는 이종성 삽입 DNA는 숙주 세포로부터 결실된 유전자(들)의 기능을 대체할 수 있다.
숙주 세포에서 결실(및 일부 경우에, 다른 요망되는 핵산 서열로 대체)될 수 있는 예시적 유전자는 당지질 생합성과 관련된 숙주 세포의 유전자, 예를 들어, waaL(예를 들어, 문헌[Feldman et al., 2005, PNAS USA 102:3016-3021] 참조), 지질 A 코어 생합성 클러스터, 갈락토스 클러스터, 아라비노스 클러스터, 콜론산(colonic acid) 클러스터, 캡슐 다당류 클러스터, 운데카프레놀-p 생합성 유전자, und-P 재순환 유전자, 뉴클레오티드 활성화 당 생합성과 관련된 대사 효소, 장내세균 공통 항원 클러스터, 및 프로파지 O 항원 변형 클러스터, 예를 들어, grabs 클러스터를 포함한다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 숙주 세포는 이들이 본원에 기재된 방법에 의한 숙주 세포의 유전체로의 이종성 삽입 DNA의 삽입의 결과로서 생성되는 O 항원이 아닌 임의의 O 항원을 생성하지 않도록 변형된다. 또 다른 특정 구체예에서, 본원에 기재된 숙주 세포는 이들이 본원에 기재된 방법에 의한 숙주 세포의 유전체로의 이종성 삽입 DNA의 삽입의 결과로서 생성되는 캡슐 다당류가 아닌 임의의 캡슐 다당류를 생성하지 않도록 변형된다.
5.2.1.4
글리코컨쥬게이트
본원에 기재된 방법은 당화된 담체 단백질을 포함하는 글리코컨쥬게이트를 생성시키기 위해 이용될 수 있다(예를 들어, 섹션 5.2.1.2 참조). 특정 구체예에서, 본원에 기재된 항원(예를 들어, 다당류), 예를 들어, 섹션 5.2.1.1에 기재된 항원으로 당화된 담체 단백질(예를 들어, 섹션 5.2.1.2 참조)을 포함하는 글리코컨쥬게이트가 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 담체 단백질은 EPA이다.
특정 구체예에서, EPA 및 하나 이상의 다양한 다당류, 예를 들어, 섹션 5.2.1.1에 기재된 하나 이상의 다당류를 포함하는 글리코컨쥬게이트가 본원에 제공된다.
또 다른 특정 구체예에서, E. 콜리 O1, O2, O4, O6, O7, O8, O11, O15, O16, O17, O18, O20, O22, O25, O73, O75, 및/또는 O83 중 하나 이상에 컨쥬게이션된 담체 단백질을 포함하는 글리코컨쥬게이트가 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 담체 단백질은 EPA이다.
또 다른 특정 구체예에서, 하나 이상의 다양한 P. 아에루기노사 다당류에 컨쥬게이션된 담체 단백질을 포함하는 글리코컨쥬게이트가 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 담체 단백질은 EPA이다.
또 다른 특정 구체예에서, 하나 이상의 다양한 K. 뉴모니에 다당류에 컨쥬게이션된 담체 단백질을 포함하는 글리코컨쥬게이트가 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 담체 단백질은 EPA이다.
5.2.1.5
이점
본원에 기재된 글리코컨쥬게이트를 생성시키는 방법은 특정한 상업적 중요성 및 관련성이 있는 방법인데, 이는 이들이 염색체적으로 삽입된 DNA의 증가된 안정성 및 이에 따른 발효 동안의 관심 DNA의 발현으로 인해 낮은 위험으로 대규모 발효를 가능케 하기 때문이다. 삽입 DNA 발현을 유지하기 위한 공지된 방법은 삽입 DNA를 갖는 에피솜을 기초로 한다. 이들 에피솜은 항생제 선택에 의해 유지될 필요가 있다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 삽입 DNA의 플라스미드 발생 발현에 비해 유리한데, 이는 특히 이종성 DNA가 숙주 세포 유전체로 삽입된 후에 발효 동안 항생제 선택이 필요하지 않기 때문이다. 즉, 삽입 DNA가 염색체에 삽입되는 경우, 이는 선택될 필요가 없는데, 이는 숙주 유전체의 복제와 함께 증식되기 때문이다. 추가로, 매 세대(즉, 숙주 세포 복제 주기)마다 플라스미드를 상실할 위험이 증가하는 것이 플라스미드 발생 시스템에서 공지된 불이익이다. 이러한 플라스미드의 상실은 때때로 세포 분열 동안 세포 분리의 단계에서 딸세포로의 플라스미드의 부적절한 분배로 인한 것이다. 대규모에서, 박테리아 배양물은 더 작은 발효 규모에서보다 더 자주 복제되어 높은 세포 밀도에 도달한다. 따라서, 더 높은 세포 안정성 및 삽입 DNA 발현은 더 높은 생성 수율을 발생시켜, 명백한 장점을 제공한다. 세포 안정성은 또한 규제 당국에 의한 승인에 대한 절차 승인 기준인 한편, 항생제 선택은 일반적으로 다양한 이유로 발효 동안 요망되지 않는데, 예를 들어, 항생제는 최종 의약 제품에 불순물로 존재하고, 알레르기 반응을 야기시키는 위험을 갖고, 항생제는 항생제 내성을 촉진(예를 들어, 유전자 전달 또는 내성 병원체의 선택에 의함)시킬 수 있다.
본원에 기재된 방법의 또 다른 장점은 DNA의 큰 단편이 한번에 숙주 세포의 유전체로 삽입될 수 있다는 점이다(즉시 삽입(at-once-insertion)). 숙주 세포 유전체로 DNA를 도입시키기 위한 현존하는 방법은 상동성 재조합에 의한 작은 DNA 단편의 반복된 삽입을 이용한다[47]. 따라서, 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본원에 기재된 즉시 삽입의 방법은 유리한데, 이는 이들이 다수의 삽입의 회피를 가능케 하기 때문이다.
5.2.1.6
분석 방법
본원에 기재된 글리코컨쥬게이트의 구조적 조성 및 당 사슬 길이를 분석하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다.
한 구체예에서, 글리칸을 분석하기 위해 히드라진분해가 이용될 수 있다. 첫째로, 다당류는 제조업체의 설명서에 따라 히드라진과의 인큐베이션에 의해 이의 단백질 담체로부터 방출된다(Ludger Liberate Hydrazinolysis Glycan Release Kit, Oxfordshire, UK). 친핵체 히드라진은 다당류와 담체 단백질 사이의 글리코시드 결합을 공격하며, 부착된 글리칸의 방출을 가능케 한다. N-아세틸기는 상기 처리 동안 상실되며, 재-N-아세틸화에 의해 재구성되어야 한다. 자유 글리칸은 탄소 컬럼에서 정제된 후, 환원 말단에서 형광단 2-아미노 벤즈아미드로 표지된다[48]. 표지된 다당류는 문헌[Royle et al .]의 HPLC 프로토콜에 따라 GlycoSep-N 컬럼(GL Sciences)에서 분리된다[49]. 생성된 형광 크로마토그램은 다당류 길이 및 반복 단위의 수를 나타낸다. 구조 정보는 개별적 피크를 수거한 후, MS/MS 분석을 수행함으로써 수집될 수 있다. 이에 의해, 반복 단위의 단당류 조성 및 서열이 확인될 수 있고, 추가로 다당류 조성의 균질성이 확인될 수 있다. 히드라진분해 및 2 AB 표지화 후에 수득된 HPLC 크로마토그램이 실시예 중 하나에 제시된다(도 21). 저분자량의 특정 피크는 MALDI-MS/MS에 의해 분석될 수 있고, 결과는 글리칸 서열을 확인하기 위해 이용된다. 각각의 피크는 특정 수의 반복 단위 및 이의 단편으로 구성된 중합체에 해당한다. 따라서, 크로마토그램은 중합체 길이 분포를 측정하는 것을 가능케 한다. 용리 시간은 중합체 길이에 대한 지표이며, 형광 강도는 각각의 중합체에 대한 몰 과다(molar abundance)와 관련된다.
또 다른 구체예에서, SDS-PAGE 또는 모세관 젤 전기영동이 글리칸 및 글리코컨쥬게이트를 평가하기 위해 이용될 수 있다. 본원에서 합성되는 O 항원 글리칸에 대한 중합체 길이는 선형으로 어셈블리되는 반복 단위의 수에 의해 규정된다. 이는 통상적인 사다리 유사 패턴이 글리칸을 구성하는 다양한 반복 단위 수의 결과인 것을 의미한다. 따라서, SDS PAGE 또는 크기에 의해 분리하는 다른 기술에서 서로 다음에 존재하는 2개의 밴드는 단지 하나의 반복 단위가 상이하다. 이들 별개의 차이는 글리칸 크기에 대해 당단백질을 분석하는 경우에 이용되며, 당화되지 않은 담체 단백질 및 다양한 중합체 사슬 길이를 갖는 글리코컨쥬게이트가 이들의 전기영동 이동성에 따라 분리된다. 글리코컨쥬게이트에 존재하는 첫번째 검출가능한 반복 단위 수(n1) 및 평균 반복 단위 수(naverage)가 측정된다. 이들 파라미터는 배치 투 배치(batch to batch) 일관성 또는 다당류 안정성을 입증하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 완전한 글리코컨쥬게이트의 크기를 측정하기 위해 고 질량 MS 및 크기 배제 HPLC가 적용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 안트론-황산 검정이 다당류 수율을 측정하기 위해 사용될 수 있다[50].
(a)
당화 부위 사용에서의 변화
특정 단백질에서의 부위 사용이 삽입된 시스템과는 대조적으로 3 플라스미드 시스템에서 변경되는 것을 나타내기 위해, 당화 부위 사용은 정량되어야 한다. 이렇게 하기 위한 방법은 하기에 기재된다.
당펩티드 LC-MS/MS: 글리코컨쥬게이트는 프로테아제(들)로 분해되고, 펩티드는 적합한 크로마토그래피 방법(C18, 친수성 상호작용 HPLC HILIC, GlycoSepN 컬럼, SE HPLC, AE HPLC)에 의해 분리되고, 다양한 펩티드가 MS/MS를 이용하여 확인된다. 이러한 방법은 화학적(스미스 분해) 또는 효소 방법에 의해 단축되는 이전의 당 사슬과 함께 또는 상기 당 사슬 없이 이용될 수 있다. 215 내지 280 nm에서의 UV 검출을 이용한 당펩티드 피크의 정량은 당화 부위 사용의 상대적 결정을 가능케 한다.
크기 배제 HPLC: 더 높은 당화 부위 사용은 SE HPLC 컬럼으로부터의 더 이른 용리 시간에 의해 반영된다. (a)를 또한 참조하라.
(b)
균질성
글리코컨쥬게이트 균질성(즉, 부착된 당 잔기의 균질성)은 글리칸 길이 및 유체역학적 반경을 측정하는 방법을 이용하여 평가될 수 있다(상기 및 섹션 5.3.5 참조).
5.2.2
다른 잠재적 임상/
실제 적용
본원에 기재된 방법은 숙주 세포 유전체로 큰 DNA 단편을 도입시키기 위해 바람직한 임의의 숙주 세포의 작제에 이용될 수 있으며, 상기 DNA 단편은 삽입 DNA를 갖는 숙주 세포주의 생성(예를 들어, 요망되는 생성물, 예를 들어, 삽입 DNA에 의해 인코딩된 단백질을 생성시키기 위한 숙주 세포주의 대규모 생성) 동안 유지된다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법은 비제한적인 예로, 항생제, 알칼로이드, 카로티노이드, 니코틴아미드 및 동일 세포 내에서의 다수의 효소 반응에 의해 합성되는 다른 이차 대사물 및 보조인자를 인코딩하는 삽입된 DNA를 포함하는 숙주 세포를 생성시키기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 상기 구성요소를 인코딩하는 삽입된 DNA를 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다.
5.2.3
단백질의 더 높은 수율
통합된 균주는 3 플라스미드 시스템과 비교하여 감소된 항생제 선택 부하로 인해 더 높은 수율의 글리코컨쥬게이트를 제조할 수 있다. 또한, 세포에 대한 감소된 대사 부하로 인해 보다 덜한 단백질분해성 분해가 발생한다.
5.2.4
단백질의 더 높은 균질성
통합된 균주는 더 짧은 덜 확산된 다당류 길이 분포를 갖는 글리코컨쥬게이트를 제조한다. 따라서, 글리코컨쥬게이트는 특성규명하기에 더 용이하고, 다 잘 규명된다. 또한, 삽입은 3 플라스미드 시스템과 비교하여 감소된 항생제 선택 부하로 인해 발효 과정 동안 생성물의 덜한 단백질분해를 발생시킬 수 있는 세포로 원형질막주위 스트레스의 정도를 감소시킬 수 있다.
5.2.5
더 높은 생성 균주 안정성
단백질 당화 시스템은 생성 숙주에서 담체 단백질 발현 DNA, 올리고사카릴 트랜스페라제 발현 DNA, 및 다당류 발현 DNA의 3개의 재조합 요소를 필요로 한다. 종래 박테리아 생성 시스템은 플라스미드 상에 상기 3 요소를 함유한다. 따라서, 플라스미드 상실로 인해, 특히 플라스미드의 유지를 위해 사용된 항생제가 GIMP 물질의 발효 동안 존재하지 않아야 하기 때문에 제조 동안 불안정성에 대한 위험이 존재한다. 삽입된 균주는 아직 이동 요소를 덜 함유하므로, 이들은 많은 세대에 걸쳐 더욱 안정적이다. 이는 더 큰 규모의 발효 및 더 긴 인큐베이션 시간(더 높은 세대 수)가 더욱 용이한 것을 의미한다. 또한, 선택을 위한 항생제의 부재는 민감한 대상체에서 알레르기 반응을 야기시킬 수 있는 미량의 항생제의 부재로 인해 생성물을 더 안전하게 만든다[4].
5.2.6
생성 과정의 더 높은 재현성
삽입된 균주는 고정된 염색체 삽입으로 인해 유전적으로 더 안정적이고, 이에 따라 생성 과정 동안, 예를 들어, 삽입된 이종성 DNA를 포함하는 숙주 세포의 배양 동안 요망되는 단백질 생성의 더 높은 재현성을 발생시킨다.
5.2.7
이점을 시험하기 위한 분석 방법
수율 . 수율은 조절된 최적화 조건하에서 생물반응기에서 성장된 1 리터의 박테리아 생성 배양물로부터 유래된 탄수화물 양으로 측정된다. 글리코컨쥬게이트의 정제 후, 탄수화물 수율은 안트론 검정(예를 들어, 섹션 5.2.1.7 참조) 또는 탄수화물 특이적 항혈청을 이용한 ELISA에 의해 직접 측정될 수 있다. 간접적 측정은 단백질 그램 당 이론적 탄수화물 양을 계산하기 위해 단백질 양(널리 공지된 BCA, 로우리, 또는 브래드포드 검정에 의해 측정됨) 및 글리칸 길이 및 구조를 이용함으로써 가능하다. 또한, 수율은 또한 휘발성 완충액으로부터 당단백질 제조물을 건조시키거나 중량을 측정하기 위한 저울을 이용함으로써 측정될 수 있다.
균질성 . 균질성은 글리칸 길이 및 가능하게는 당화 부위의 수의 변동성을 의미한다. 상기 나열된 방법이 본 목적에 이용될 수 있다. SE-HPLC는 유체역학적 반경의 측정을 가능케 한다. 담체 내의 당화 부위의 더 높은 수는 덜한 당화 부위를 갖는 담체에 비해 유체역학적 반경에서 더 높은 변화를 발생시킨다. 그러나, 단일 글리칸 사슬이 분석되는 경우, 이들은 더욱 조절된 길이로 인해 더욱 균질하게 될 수 있다. 글리칸 길이는 히드라진분해, SDS PAGE, 및 CGE에 의해 측정된다(섹션 5.1.2.7. 참조). 또한, 균질성은 또한 특정 당화 부위 사용 패턴이 더 넓은 범위/더 좁은 범위로 변하는 것을 의미할 수 있다. 이들 요인은 당펩티드 LC-MS/MS에 의해 측정될 수 있다(섹션 5.1.2.7 참조).
균주 안정성 및 재현성. 선택압의 부재하에서의 박테리아 발효 동안 균주 안정성은 생성 배양 세포 내의 재조합 DNA의 존재 또는 부재를 입증하는 직접적 및 간접적 방법에 의해 측정된다. 배양 부피 영향은 증가된 생성 시간을 의미하는 연장된 배양 시간에 의해 시뮬레이션될 수 있다. 발효에서 세대가 많을수록, 재조합 요소가 상실될 가능성이 더 크다. 재조합 요소의 상실은 불안정성으로 간주된다. 간접적 방법은 선택 카세트와 재조합 DNA의 회합, 예를 들어, 플라스미드 내의 항생제 내성 카세트에 의존한다. 생성 배양 세포는 선택 배지, 예를 들어, 선택 시스템과 관련된 항생제 또는 다른 화학물질이 보충된 LB 플레이트에 플레이팅되고, 내성 콜로니는 각각의 선택 화합물질과 관련된 재조합 DNA에 대해 양성인 것으로 간주된다. 3 플라스미드 시스템의 경우에서, 3개 모두의 항생제에 대한 내성 콜로니가 계수되고, 3개 모두의 내성을 함유하는 세포의 비율은 안정적인 집단으로 간주된다. 대안적으로, 정량 PCR이 선택의 존재 및 부재하에서 다양한 발효 시점에서 3 재조합 요소의 재조합 DNA의 양을 측정하기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 재조합 DNA의 상대량 및 절대량이 측정되고 비교된다. 생성 과정의 재현성은 본 출원에서 언급된 방법에 의해 일관성 배치의 완전 분석에 의해 측정된다.
5.3
조성물
5.3.1
플라스미드를 포함하는 조성물
한 구체예에서, 본원에 기재된 플라스미드 중 하나 이상, 예를 들어, 하나 이상의 공여체 또는 헬퍼 플라스미드를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
특정 구체예에서, 공여체 플라스미드를 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 상기 공여체 플라스미드는 (i) 5'으로부터 3'으로, (1) 제한 엔도뉴클레아제의 인지 서열; (2) 적어도 0.5 킬로베이스(kb)의 제 1 상동성 영역, (3) 적어도 8 kb의 이종성 삽입 DNA; 및 (4) 적어도 0.5 kb의 제 2 상동성 영역; 및 (ii) 역선택 마커를 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 헬퍼 플라스미드를 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 상기 헬퍼 플라스미드는 (i) 제 1 프로모터의 조절 하에 있는 람다 red 재조합효소를 인코딩하는 열린해독틀; 및 (ii) 제 2 프로모터의 조절 하에 있는 숙주 세포 유전체에 존재하지 않는 인지 서열을 갖는 제한 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 열린해독틀을 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 공여체 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드를 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 상기 공여체 플라스미드는 (i) 5'으로부터 3'으로, (1) 제한 엔도뉴클레아제의 인지 서열; (2) 적어도 0.5 킬로베이스(kb)의 제 1 상동성 영역, (3) 적어도 8 kb의 이종성 삽입 DNA; 및 (4) 적어도 0.5 kb의 제 2 상동성 영역; 및 (ii) 역선택 마커를 포함하고; 상기 헬퍼 플라스미드는 (i) 제 1 프로모터의 조절 하에 있는 람다 red 재조합효소를 인코딩하는 열린해독틀; 및 (ii) 제 2 프로모터의 조절 하에 있는 숙주 세포 유전체에 존재하지 않는 인지 서열을 갖는 제한 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 열린해독틀을 포함한다.
5.3.2
숙주 세포를 포함하는 조성물
한 구체예에서, 본원에 기재된 숙주 세포를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 상기 조성물은 본원에 기재된 컨쥬게이트 백신을 생성시키기 위한 방법에서 사용될 수 있고, 예를 들어, 조성물은 단백질의 생성에 적합한 조건하에서 배양될 수 있다. 이후, 바이오컨쥬게이트는 상기 조성물로부터 분리될 수 있다.
본원에 제공된 숙주 세포를 포함하는 조성물은 본원에 기재된 숙주 세포의 유지 및 생존에 적합한 추가 성분을 포함할 수 있고, 숙주 세포에 의한 단백질의 생성에 필요하거나 유리한 추가 성분, 예를 들어, 유도성 프로모터에 대한 유도인자, 예를 들어, 아라비노스, IPTG를 추가로 포함할 수 있다.
5.3.3
면역원성 조성물
5.3.3.1
당화된 단백질을 포함하는 조성물
한 구체예에서, 본원에 기재된 DNA 삽입 방법에 의해 발생된 숙주 세포에 의해 생성된 하나 이상의 글리코컨쥬게이트를 포함하는 면역원성 조성물이 본원에 제공된다. 상기 글리코컨쥬게이트는 단백질, 예를 들어, 담체 단백질 내에 인코딩된 당화 컨센서스 서열에 부착된 O 항원 글리칸을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 담체 단백질은 하나 이상의 도입된 당화 부위를 포함하는 외독소 A일 수 있거나, 담체 단백질은 FimCH일 수 있고, 하나 이상의 도입된 당화 부위를 포함할 수 있다. 다른 특정 구체예에서, 담체 단백질은 하나 이상의 도입된 당화 부위를 포함하는 E. 콜리 단백질 항원을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, O 항원은 병원성 E. 콜리 분리물로부터의 E. 콜리 O 항원, 예를 들어, O1, O2, O4, O7, O8, O9, O11, O15, O16, O17, O18; O20, O22, O25, O73, O75, 또는 O83이다.
또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 면역원성 조성물은 본원에 기재된 항원, 예를 들어, 섹션 5.2.1.1에 기재된 항원에 컨쥬게이션된 담체 단백질(예를 들어, 섹션 5.2.1.2에 기재된 담체 단백질)을 포함한다. 특정 구체예에서, 담체 단백질은 EPA이다. 또 다른 특정 구체예에서, 항원은 E. 콜리 항원, 예를 들어, E. 콜리 다당류이다.
또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 면역원성 조성물은 O1 혈청형의 E. 콜리 O 항원에 의해 당화된 담체 단백질(예를 들어, 섹션 5.2.1.2에 기재된 담체 단백질, 예를 들어, EPA)(O1-EPA)을 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 면역원성 조성물은 O2 혈청형의 E. 콜리 O 항원에 의해 당화된 담체 단백질(예를 들어, 섹션 5.2.1.2에 기재된 담체 단백질, 예를 들어, EPA)(O2-EPA)을 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 면역원성 조성물은 O6 혈청형의 E. 콜리 O 항원에 의해 당화된 담체 단백질(예를 들어, 섹션 5.2.1.2에 기재된 담체 단백질, 예를 들어, EPA)(O6-EPA)을 포함한다.
다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 면역원성 조성물은 O1, O2, O4, O7, O8, O9, O11, O15, O16, O17, O18; O20, O22, O25, O73, O75, 또는 O83 혈청형의 E. 콜리 O 항원에 의해 당화된 담체 단백질(예를 들어, 섹션 5.2.1.2에 기재된 담체 단백질, 예를 들어, EPA)을 포함한다.
본원에 제공된 면역원성 조성물은 조성물이 투여되는 숙주에서 면역 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 면역원성 조성물은 백신으로 사용될 수 있고, 따라서 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 면역원성 조성물은 E. 콜리에 의해 대상체(예를 들어, 인간 대상체)의 감염의 예방에 사용된다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 면역원성 조성물은 E. 콜리의 감염에 의해 야기된 요로 감염에 대한 백신으로 사용된다.
예를 들어, E. 콜리의 감염에 의해 야기된 요로 감염에 대한 백신으로서 사용하기 위한 본원에 기재된 면역원성 조성물은 E. 콜리 항원(예를 들어, 섹션 5.2.1.1에 기재된 E. 콜리 항원)에 의해 당화된 담체 단백질(예를 들어, 섹션 5.2.1.2에 기재된 담체 단백질, EPA)을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, E. 콜리 항원은 O1, O2, O4, O7, O8, O9, O11, O15, O16, O17, O18; O20, O22, O25, O73, O75, 또는 O83 혈청형의 O 항원이다.
또 다른 특정 구체예에서, 본원에 기재된 면역원성 조성물은 슈도모나스(Pseudomonas)에 의한 대상체(예를 들어, 인간 대상체)의 감염의 예방에서 사용된다. 또 다른 특정 구체예에서, 본원에 기재된 면역원성 조성물은 시겔라(Shigella)에 의한 대상체(예를 들어, 인간 대상체)의 감염의 예방에서 사용된다.
본원에 기재된 바이어컨쥬게이트를 포함하는 조성물은 약학적 투여에서 사용하기에 적합한 임의의 추가 성분을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 면역원성 조성물은 일가 제형이다. 다른 구체예에서, 본원에 기재된 면역원성 조성물은 다가 제형이다. 예를 들어, 다가 제형은 본원에 기재된 1개 초과의 바이어컨쥬게이트를 포함한다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 조성물은 보존제, 예를 들어, 수은 유도체 티메로살을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 약학적 조성물은 0.001% 내지 0.01%의 티메로살을 포함한다. 다른 구체예에서, 본원에 기재된 약학적 조성물은 보존제를 포함하지 않는다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 조성물(예를 들어, 면역원성 조성물)은 애쥬번트를 포함하거나, 애쥬번트와 조합하여 투여된다. 본원에 기재된 조성물과 조합하여 투여하기 위한 애쥬번트는 상기 조성물의 투여 전, 투여와 동시에, 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 용어 "애쥬번트"는 본원에 기재된 조성물과 함께 또는 본원에 기재된 조성물의 일부로서 투여되는 경우 바이오컨쥬게이트에 대한 면역 반응을 증가시키고/시키거나, 향상시키고/시키거나, 부스팅시키나, 화합물이 단독으로 투여되는 경우 바이오컨쥬게이트에 대한 면역 반응을 발생시키지 않는 화합물을 나타낸다. 일부 구체예에서, 애쥬번트는 폴리 바이오컨쥬게이트 펩티드에 대한 면역 반응을 발생시키고, 알레르기 또는 다른 유해 반응을 발생시키지 않는다. 애쥬번트는, 예를 들어, 림프구 동원, B 및/또는 T 세포의 자극, 및 대식세포의 자극을 포함하는 여러 메커니즘에 의한 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 애쥬번트의 특정 예는 알루미늄 염(백반)(예를 들어, 알루미늄 하이드록시드, 알루미늄 포스페이트, 및 알루미늄 설페이트), 3 데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(MPL)(영국 특허 GB2220211 참조), MF59(Novartis), AS03(GlaxoSmithKline), AS04(GlaxoSmithKline), 폴리소르베이트 80(Tween 80; ICL Americas, Inc.), 이미다조피리딘 화합물(국제 공개 번호 WO2007/109812호로 공개된 국제 출원 번호 PCT/US2007/064857 참조), 이미다조퀴녹살린 화합물(국제 공개 번호 WO2007/109813호에 공개된 국제 출원 번호 PCT/US2007/064858호 참조) 및 사포닌, 예를 들어, QS21(문헌[Kensil et al ., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); 미국 특허 번호 5,057,540 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, 애쥬번트는 프로인트 애쥬번트(완전 또는 불완전)이다. 다른 애쥬번트는 임의로 면역 자극제, 예를 들어, 모노포스포릴 지질 A와 조합된 수중유 에멀젼(예를 들어, 스쿠알렌 또는 땅콩유)이다(문헌[Stoute et al ., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)] 참조). 또 다른 애쥬번트는 CpG이다(Bioworld Today, Nov. 15, 1998).
5.4
처리 및 면역화 방법
한 구체예에서, 본원에 기재된 글리컨쥬게이트 또는 이의 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 감염을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 감염을 치료하기 위한 방법은 유효량의 본원에 기재된 글리코컨쥬게이트 또는 이의 조성물을 본원에 기재된 감염을 치료할 필요가 있는 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 글리코컨쥬게이트 또는 이의 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 글리코컨쥬게이트에 대해 면역 반응을 유도하기 위한 방법은 유효량의 본원에 기재된 바이오컨쥬게이트 또는 이의 조성물을 면역 반응을 유도할 필요가 있는 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 바이어컨쥬게이트 또는 이의 조성물을 이용하여 감염을 예방하기 위한 모노클로날 항체를 생성시키기 위한 방법이 본원에 제공된다.
특정 구쳉예에서, 글리코컨쥬게이트 또는 이의 조성물이 투여되는 대상체는 감염, 예를 들어, 박테리아 감염을 갖거나, 감염, 예를 들어, 박테리아 감염에 민감하다. 또 다른 특정 구체예에서, 바이오컨쥬게이트 또는 이의 조성물이 투여되는 대상체는 E. 콜리로 감염되거나, E. 콜리 감염에 민감하다.
6
실시예
6.1
실시예
1: E. 콜리 O1 O 항원 컨쥬게이트 생성을 위한 균주 작제
삽입에 대한 첫번째 단계는 표준 분자 클로닝 기술에 의해 공여체 플라스미드 pDOC로의 O1 rfb 클러스터의 클로닝이다[1]. O1 rfb 클러스터 영역을 활성을 확인하기 위해 플라스미드 pLAFR1으로 클로닝하였고(A, 하기), 동시에 유전체로 O1 클러스터를 삽입하기 위해 공여체 플라스미드 pDOC로 클로닝하였다(B. 하기).
A. O1 rfb 클러스터 및 이의 플랭킹 1.5 kb 영역을 코스미드 벡터 pLAFR1(GenBank: AY532632.1)으로 서브클로닝하였다. O1 클러스터를 올리고뉴클레오티드 2193/2161을 이용하여 upecGVXN032(StGVXN3736)로 명명된 임상 분리물의 염색체 DNA로부터의 PCR에 의해 증폭시켰다(표 3 참조). 올리고뉴클레오티드 2193/2161은 O1 rfb 클러스터에 플랭킹된 유전자, 즉 galF 내 및 gnd 후에서 어닐링된다. PCR 생성물을 p157의 SgsI 부위로 클로닝하였다. p157은 EcoRI 부위로 클로닝되어 p947을 생성시키는 2개의 상보성 올리고뉴클레오티드(300/301)로 구성된 카세트를 함유하는 pLAFR1이다. 주형으로서 p947을 이용하여, PCR을 수행하여 올리고뉴클레오티드 2198/2166을 이용하여 5' 말단의 플랭킹 영역(galF')으로부터 클러스터 내의 마지막 유전자(wekO)의 말단으로 O1 rfb 클러스터 DNA를 증폭시켰다(도 3 참조). 생성물을 p967의 BamHI/SgsI 부위로 클로닝시켜 p985를 생성시켰다. p967을 pDOC-C(GenBank: GQ889494.1)로부터 클로닝시켰고, MCS 및 kanR 카세트를 함유하였다(세부사항에 대해서는 섹션 6.2 참조). p985를 p562로의 추가 삽입을 위한 O1 rfb 클러스터의 PCR을 위한 주형으로 사용하였다(하기 참조).
B. p562를 다음과 같이 제조하였다: 2개의 PCR 생성물 및 올리고뉴클레오티드 1187/1188을 이용한 어셈블리 PCR로부터 삽입물을 생성시켰다(표 3 참조). 한 PCR 생성물을 올리고뉴클레오티드 1188/1189(표 3 참조; clmR 카세트 및 FRT 부위를 인코딩함)를 이용하여 pKD3(GenBank: AY048742.1)으로부터 생성시켰고, 또 다른 PCR 생성물은 올리고뉴클레오티드 1186/1187를 이용하여 W3110 유전체 DNA의 PCR로부터 유래된 3' 상동성 영역이었다(표 3 참조; 즉, 인터진(intergene) 영역 및 gnd 유전자를 인코딩하는 W3110 유전체 내의 O16 rfb 클러스터의 DNA 다운스트림). 어셈블리된 DNA를 BamHI/EcoRI을 이용하여 절단하고, pDOC-C 내의 동일 부위로 클로닝하여, p482를 생성시켰다. 5' 상동성 영역의 PCR 생성물(galF'로 지정된 galF 유전자의 인코딩 부분, 및 galF와 첫번째 O16 유전자 사이의 인터진 영역)을 이후 W3110 염색체 DNA 및 올리고뉴클레오티드 1171/1515를 이용하여 생성시키고, BamHI 및 SpeI으로 절단시키고, p482의 SpeI/BamHI 부위로 클로닝하여 p562를 생성시켰다.
p562는 사이에 MCS 및 역 clmR 내성 카세트를 갖는 5' 및 3' 상동성 영역(5': O16 rfb 클러스터의 rmlB의 1 kb 업스트림; 3': O16 rfb 클러스터 내의 마지막 유전자의 1.6 kb 다운스트림 DNA)을 인코딩한다. 올리고뉴클레오티드 2214/2215를 이용하여 p985로부터 증폭된 O1 rfb 클러스터를 삽입하기 위해 MCS를 이용하였다. 생성된 플라스미드 p1003은 O1 rfb 클러스터의 삽입을 위한 공여체 플라스미드였고, 도 3A 및 표 1에 예시된 바와 같은 요소를 함유하였다.
삽입 및 선택: 헬퍼 플라스미드 p999(GenBank: GU327533.1)를 전기천공에 의해 W3110 세포로 도입시켰다. p999의 온도 민감성 복제 표현형으로 인해, 생성된 세포를 p999의 선택을 위해 스펙티노마이신으로 보충된 LB 중에서 모든 시간동안 30℃에서 성장시켰다. 다음 단계에서, p1003을 전기천공에 의해 p999를 함유하는 W3110 세포로 도입시켰다. 세포를 30℃에서 LB 배지에서 앰피실린 및 스펙티노마이신 내성에 대해 선택하였다. 플라스미드를 동일 세포 내에서 공여체 플라스미드 DNA의 존재하에서 헬퍼 플라스미드 상에서 인코딩된 효소의 발현을 가능케 하기 위해 수용체 세포로 삽입하였다.
다음으로, 삽입 절차를 수행하였다. 새로이 형질전환된 균주를 180 rpm에서 밤새 5 ml 규모로 30℃에서 앰피실린 및 스펙티노마이신의 존재하에서 LB 배지에서 성장시켰다. 10 ㎕의 조밀 배양물을 spec 및 amp가 보충된 1 ml LB를 함유하는 새로운 튜브로 옮겼다. 이후, 새로운 배양물을 30℃에서 2시간 동안 180 rpm에서 성장시키고, 세포를 4℃에서 5분 동안 5000 rpm에서 원심분리시키고, 상층액을 spec, 0.2% 아라비노스(w/v), 및 1 mM IPTG가 보충된 LB 배지에 의해 대체하였다. 배지 조성물은 헬퍼 플라스미드 선택, 및 삽입을 가능케 하기 위해 재조합효소 및 SceI 엔도뉴클레아제 발현을 뒷받침한다. 세포를 재현탁시키고, 180 rpm에서 4-18 시간 동안 30℃에서 추가로 인큐베이션하였다.
배지 변화후 다양한 시점에서, 0.5 ml의 배양물을 clm(DNA 삽입물의 선택을 위함) 및 10%(w/v) 수크로스(공여체 플라스미드에 대해 역선택하기 위함)가 보충된 LB 플레이트에 플레이팅하고, 밤새 37℃에서 인큐베이션(온도 민감성 헬퍼 플라스미드의 상실에 대해 선택하기 위함)하였다.
정확한 삽입 표현형에 대해 생성된 콜로니를 스크리닝하기 위해, 세포를 spec, amp, 또는 clm이 보충된 LB 플레이트에 복제 플레이팅하였다. clm에 대해 내성(삽입물의 존재)이나, amp 및 spec에 대해 민감성(공여체 및 헬퍼 플라스미드의 부재)인 콜로니를 삽입에 대해 추가로 분석하였다.
균주가 W3110로부터 유래되는 대체된 DNA를 상실하고, DNA 삽입물을 함유하는지 확인하기 위해, 콜로니 PCR을 수행하였다. 정확한 표현형(앰피실린 민감성, 클로람페니콜 내성, 스펙티노마이신 민감성, 수크로스 내성)을 갖는 후보 콜로니를 채집하엿고, 콜로니 PCR 시험을 수행하였다. 장외 E. 콜리(ExPEC) 균주에서의 O 혈청형의 확인을 위해 PCR 전략[51]을 이용하였다. 14개의 일반적인 ExPEC O 혈청형의 rfb 클러스터에 존재하는 독특한 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 쌍을 이용하였다. O1 삽입의 경우에서, O1(2241 및 2242) 또는 O16으로부터의 wzx의 부분을 증폭시키는 올리고뉴클레오티드를 이용하였다. 다양한 클론을 확인하였다. 성공적인 삽입을 O16 특이적 올리고뉴클레오티드를 갖는 PCR 생성물의 부재(제시되지 않음), 및 O1 올리고뉴클레오티드를 갖는 특정 신호의 존재(도 3B)에 의해 일부 클론에서 확인하였다. 생성된 균주를 W3110 Δr fbO16::rfbO1-clmR로 명명하였다.
다음 단계에서, clmR 카세트를 보고된 바와 같이 FLP 재조합효소를 발현하는 온도 민감성 pCP20 플라스미드를 이용함으로써 O1 rfb 클러스터와 함께 삽입된 DNA로부터 제거하였다[35]. 생성된 세포를 clm에 대한 민감성에 대해 시험한 후, 추가로 시험하였다. 생성된 균주를 W3110 Δr fbO16::rfbO1로 명명하였다.
또한, 생성 균주로부터의 O 항원 리가제(waaL)를 최적 글리코컨쥬게이트 생성을 위해 결실시켰다. 이를 파지 형질도입에 의해 수행하였다. P1vir 파지(E. 콜리 유전 스톡 센터 #12133)를 이용하여 waaL 유전자가 올리고뉴클레오티드 623 및 624를 이용하여 pKD3으로부터 PCR에 의해 증폭된 clmR 카세트에 의해 대체된 W3110 ΔwaaL::clmR 균주로부터 용해질을 생성시켰다[13, 52]. 파지 형질도입을 W3110 Δr fbO16::rfbO1에서 수행하였고, 생성된 균주를 W3110 Δr fbO16::rfbO1 Δw aaL::clmR로 명명하였다. 이후, 클로람페니콜 내성 카세트를 FLP 유도 재조합에 의해 제거하였다(W3110 Δr fbO16::rfbO1 Δw aaL).
재조합 조작 및 선택의 모든 단계에서, O1 rfb 클러스터의 존재를 확인하기 위해 O1 wzx의 존재에 대한 PCR 시험을 수행하였다(도 3B). 추가 PCR 시험은 삽입의 5' 및 3' 말단에서 재조합된 영역을 특이적으로 증폭시키는 올리고뉴클레오티드, 즉, HR1 및 2 영역 외부를 어닐링시키는 쌍으로 수행될 수 있다('5' 및 3' 전이 영역 PCR'). 예를 들어, W3110 유전체 내에서 어닐링시키기 위해 하나의 PCR 올리고뉴클레오티드가 생성될 수 있고, DNA 삽입물 내에서 어닐링시키기 위해 다른 PCR 올리고뉴클레오티드가 생성될 수 있다. 따라서, 삽입이 성공적인 경우 양성 PCR 신호만이 가능하다. 이후, 생성된 PCR 생성물은 서열분석되어 염색체 수용체 균주 DNA 및 DNA 삽입물의 라이게이션이 확인될 수 있다. 또한, 파지 형질도입 및 clmR 카세트 제거 변형을 확인하기 위해 PCR 및 서열분석이 이용될 수 있다.
삽입된 DNA의 활성을 확인하기 위해, O1 항원 다당류를 함유하는 삽입된 균주의 당지질 생성을 균주 제작의 다양한 단계에서 시험하였다. 최초 삽입 실험으로부터의 후보 클론을 항생제 및 수크로스 민감성 표현형에 의한 예비스크리닝, 및 PCR 시험으로부터의 양성 결과에 따라 선택하였다. 세포를 LB 배지에서 밤새 성장시키고, 전체 세포 추출물을 제조하였다. 제조된 당지질을 분석하기 위해, 추출물을 단백분해효소 K로 처리하여, 단백질에 의한 가능한 방해를 제거하였다. 생성된 샘플을 SDS PAGE에서 런닝시키고, 은 염색에 의해 염색하거나, 니트로셀룰로스 막으로의 전달 후에 항 O1 특이적 항혈청을 이용한 면역염색에 의해 검출하였다. 추정 인테그란드(putative integrand)로부터의 추출물을 은 염색에 의해 분석한 경우, LPS를 나타내는 25 내지 55 kDa의 사다리 유사 패턴이 대조군 균주(레인 3)에서와 같이 관찰되었다(도 4A, 상부 패널, 레인 1, 2). 웨스턴 블로팅이 동일 분자량 범위에서 사다리 유사 신호를 나타내었고, 이는 LPS가 임상 O1 분리물로부터 유래되는 대조군 LPS(레인 3)와 같은 O1 항원(도 4A, 하부, 레인 1, 2)을 함유한 것을 입증한다. 이들 결과는 W3110 Δr fbO16::rfbO1- clmR에서 지질 A에서 제시된 O1 항원 생성을 입증한다.
W3110 Δr fbO16::rfbO1 균주를 웨스턴 블로팅(도 4B, 레인 1, 2)에 의해 다시 시험(clmR 카세트의 제거 후)하여, 변형에도 불구하고 O1 LPS 생성을 확인하였다. 균주 W3110 Δr fbO16::rfbO1 Δw aaL::cat에서의 파지 형질도입에 의한 waaL 결실을 확인하기 위해, LPS 생성을 다시 분석하였다(도 4C, 레인 1). 사다리 유사 신호는 예상된 바와 같이 은 염색 검정(상부)으로부터 소실되었다. 웨스턴 블롯 분석은 사다리 유사 신호를 여전히 검출하였으나(레인 1, 하부), waaL 유전자(레인 2)를 여전히 함유한 대조군 균주(W3110 ΔrfbO16::rfbO1)보다 강도가 낮았고, 은 염색에 의해 시각화된 바와 같이 LPS를 제조할 수 있었다. 더 약한 신호가 Und-PP 결합된 O1 O 항원으로부터 유래되며, 이는 waaL 유전자의 결실로 인해 지질 A로 전달될 수 없다. 이는 파지 형질도입에 의한 waaL 결실이 예상된 바와 같이 발생한 것을 의미하며, 이는 유전형 W3110 Δr fbO16::rfbO1 Δw aaL::cat을 입증한다. 선택된 클론을 FLP 발생 재조합에 의해서와 동일한 방식으로 clmR 카세트 제거에 대해 선택하였다. 생성된 클론(W3110 Δr fbO16::rfbO1 Δw aaL)을 은 염색 및 웨스턴 블로팅(도 4D)에 의해 분석하였고, 도 4D의 레인 1에서 관찰된 것과 동등한 표현형을 나타내었다.
최종 균주 W3110 Δr fbO16::rfbO1 Δw aaL을 추가 방법에 의해 특성규명하였다. 상기 세포에 의한 Und-PP에서의 O 항원의 생성을 확인하기 위해, 형광 2 AB 표지화 후 HPLC 및 MS/MS에 의한 지질 결합된 올리고당류(Und-PP-결합된 O 항원)의 분자 특성규명을 가능케 하는 방법을 이용하였다. W3110 Δr fbO16::rfbO1 Δw aaL 및 대조군 균주(W3110 Δw aaL)를 37℃에서 진탕 플라스크 내에서 밤새 성장시켰다. 400의 OD600과 동등한 세포를 수거하고, 0.9 % NaCl로 1회 세척하였다. 세척된 세포 펠렛을 동결건조시켰다. 지질을 반복된 라운드의 볼텍싱(vortexing) 및 10분 동안 얼음 상에서의 인큐베이션에 의해 95% 메탄올(MeOH)을 이용하여 건조된 세포로부터 추출하였다. 현탁액을 ddH2O의 첨가에 의해 85% MeOH로 전환시키고, 주기적으로 볼텍싱하면서 얼음 상에서 10분 동안 추가로 인큐베이션하였다. 원심분리 후, 상층액을 수거하고, 추출물을 N2 하에서 건조시켰다. 건조된 지질을 1:1(v/v) 메탄올/물(M/W)에 용해시키고, C18 SepPak 카트리지(Waters Corp., Milford, MA)에 적용시켰다. 카트리지를 10 ml MeOH로 컨디셔닝시킨 후, 10 ml의 1:1 M/W 중 10 mM TBAP으로 평형화시켰다. 샘플의 로딩 후, 카트리지를 10 ml의 1:1 M/W 중 10 mM TBAP으로 세척하고, 5 ml MeOH로 용리시킨 후, 5 ml의 10:10:3 클로로포름/메탄올/물(C/M/W)로 용리시켰다. 조합된 용리액을 N2 하에서 건조시켰다.
지질 샘플을 건조된 샘플을 2 ml의 50 % n-프로판올 중 1 M 트리플루오로아세트산(TFA)에 용해시키고, 15분 동안 50℃로 가열시킴으로써 가수분해시켰다. 가수분해된 샘플을 N2 하에서 건조시키고, 4 ml의 3:48:47 C/M/W에 용해시키고, C18 SepPak 카트리지에 적용시켜, 가수분해된 글리칸으로부터 지질을 분리시켰다. 카트리지를 10 ml MeOH로 컨디셔닝시킨 후, 10 ml의 3:48:47 C/M/W로 평형화시켰다. 샘플을 카트리지에 적용시키고, 유통(flow through)을 수거하였다. 카트리지를 4 ml의 3:48:47 C/M/W로 세척하고, 조합된 유통을 SpeedVac을 이용하여 건조시켰다.
건조된 샘플을 문헌[Bigge et al.][48]에 따라 2-아미노벤즈아미드(2 AB)로 표지하였다. 글리칸 청소를 문헌[Merry et al.][53]에 기재된 바와 같은 종이 디스크 방법을 이용하여 수행하였다. 2 AB 표지된 글리칸의 분리를 문헌[Royle et al.][49]에 따르지만, 3 용매 시스템으로 변형된 GlycoSep N 정상 상 컬럼을 이용한 HPLC에 의해 수행하였다. 용매 A: 80% 아세토니트릴 중 10 mM 암모늄 포르메이트 pH 4.4. 용매 B: 40% 아세토니트릴 중 30 mM 암모늄 포르메이트 pH 4.4. 용매 C: 0.5% 포름산. 컬럼 온도는 30℃였고, 2 AB 표지된 글리칸을 형광(λex= 330 nm, λem= 420 nm)에 의해 검출하였다. 구배 조건: 0.4 ml 분-1의 유량에서 160분에 걸쳐 100% A에서 100% B 후, 2분에 걸쳐 100% B로부터 100% C로의 선형 구배 후, 2분에 걸쳐 100% A로 복귀시키고, 1 ml 분-1의 유량에서 100% A에서 15분 동안 런닝시킨 후, 5분 동안 0.4 ml 분-1으로 유량을 복귀시켰다. 샘플을 ddH2O에 주입하였다.
O-항원 특이적 글리칸을 확인하기 위해, 대조군 세포로부터의 2 AB 글리칸 프로파일을 W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL로부터 수득된 프로파일과 비교하였다(도 5A). W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL 특이적 피크를 수거하고, 2 AB 글리칸을 MALDI SYNAPT HDMS Q-TOF 시스템(Waters Corp., Milford, MA)에서 분석하였다(도 5B). 샘플을 5:95의 아세토니트릴/물에 용해시키고, 80:20의 메탄올/물 중 20 mg ml-1 DHB로 1:1 스포팅(spotting)시켰다. PEG(미리 조합된 용액, Waters Corp., Milford, MA)으로 교정을 수행하였고, 60:40:0.1의 아세토니트릴/물/트리플루오로아세트산 중 5 mg ml-1의 α-시아노-4-하이드록시신남산(CHCA, Sigma-Aldrich, Switzerland)을 이용하여 1:3으로 스포팅시켰다. 기계에는 200 Hz 고체 상태 UV 레이저가 장비되었다. 질량 스펙트럼을 양성 이온 모드로 기록하였다. MSMS에 대해, 레이저 에너지를 200Hz의 발화율(firing rate)에서 240으로 고정시켰고, 충돌 가스는 아르곤이었고, m/z에 따른 충돌 에너지를 상승시키기 위해 충돌 에너지 프로파일을 이용하였다. 모든 스펙트럼을 조합시키고, 배경을 공제하고, 평탄화(Savitzsky Golay)시키고, MassLynx v4.0 소프트웨어(Waters Corp., Milford, MA)를 이용하여 집중시켰다. 상기 방법은 또한 US2011/0274720 A1호에 기재되어 있다.
MALDI-TOF/TOF 분석에 의한 여러 W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL 특이적 피크로부터 유래된 조각 이온 시리즈(도 5B)는 E. 콜리의 O1A 하위혈청형에 대해 보고된 단당류 서열과 일치하였다[54]. 이에 의해 글리코컨쥬게이트 형성에 적합한 E. 콜리 균주를 기초로 한 O1A O 항원 생성 W3110의 작제가 입증되었다.
상기 균주에 의한 O1A 글리코컨쥬게이트의 생성을 나타내기 위해, C. 제주니의 PglB 올리고사카릴 트랜스페라제(5개의 상이한 변이체, 하기 참조) 및 P. 아에루기노사의 담체 단백질 외독소 A(4개의 글리코실 컨센서스 서열을 엔코딩함, p659)의 유도성 발현을 인코딩하는 플라스미드를 W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL로 전기천공에 의해 도입시켰다. 생성 세포를 5 mM MgCl2, spec 및 amp가 보충된 LB 배지에 접종시키고, 정지기까지 37℃에서 밤새 성장시켰다. 이후, 세포를 0.05의 OD600으로 희석시키고, spec 및 amp를 함유하는 TB에서 0.8의 OD600까지 성장시켰다. 0.2% 아라비노스 및 1 mM IPTG의 첨가에 의해 EPA 및 PglB 발현을 개시시키고, 배양물을 또 다른 20시간 동안 성장시켰다. 이후, 세포를 원심분리에 의해 수거하고, 원형질막주위 세포 추출물을 리소자임 방법을 이용하여 제조하였다[55]. 원형질막주위 추출물(OD600으로 표준화됨)을 SDS PAGE에 의해 분리시키고, 전기이동 후 면역블로팅에 의해 분석하였다(도 6). 항 EPA 항혈청(좌측 패널) 및 항 O1 항혈청(우측 패널) 둘 모두를 이용한 검출은 모든 샘플에 대해 100 내지 130 kDa의 투명한 사다리 유사 패턴을 나타내며, 이는 EPA 단백질 및 O1 다당류로 구성된 당단백질을 강하게 나타낸다. EPA 항혈청 단독으로 수득된 신호(70 kDa 초과)는 당화되지 않은 EPA에 해당한다. 다양한 PglB 변이체가 다양한 특정 생산성의 당단백질을 발생시키는 것이 명백하며, C 말단 HA 태그를 함유하는 본래의 야생형 C. 제주니 단백질 서열에 해당하는 PglB로 가장 작은 수율이 수득되었다(p114, [9]). 코돈 최적화 단독(p939), 코돈 최적화 및 HA 태그 제거(p970), 코돈 최적화 및 자연 PglB 당화 부위의 N534Q로의 돌연변이(p948), 및 코돈 최적화, HA 태그 제거 및 자연 PglB 당화 부위의 제거(p971)는 수배 더 높은 수율을 나타내는 더 강한 신호를 발생시킨다. 더 높은 수율은 코돈 최적화된 유전자가 사용되는 경우 PglB 번역의 더욱 효과적인 방식, 및 C 말단 HA 태그가 PglB 단백질의 활성 또는 폴딩을 방해한다는 사실에 의해 설명될 수 있다.
당단백질은 3 플라스미드 시스템으로 관찰된 바와 같은 더 짧은 글리칸 길이를 나타내는 매우 순수한 글리코컨쥬게이트의 분취용 정제를 위해 10 l 규모로 생물반응기 중 삽입된 균주에 의해 생성될 수 있다. 글리코컨쥬게이트의 순도 및 크기를 분석하기 위해 모세관 젤 전기영동이 이용될 수 있다. 예를 들어, 글리코컨쥬게이트에 부착된 다당류는 히드라진분해에 의해 단백질로부터 제거될 수 있고, 다당류 구조 및 길이의 분석을 위해 2 AB 표지화 및 HPLC-MS/MS에 의해 분석하였다. 당단백질 담체로의 O1A O 항원의 부착을 확인하기 위해 상기 분석이 이용될 수 있다. 또한, 단당류 조성 결정, 구조 확인을 위한 NMR 분석 및 가스 크로마토그래피를 위해 PMP 분석이 수행될 수 있다. 또한, 글리칸 및 담체 단백질에 대해 항체를 발생시키기 위해 동물의 면역화가 수행될 수 있다. 전임상 검정, 예를 들어, 옵소닌식작용 사멸 검정 및/또는 수동 보호를 이용하여 항-감염 활성이 제시될 수 있다.
6.2
실시예
2: E.
콜리
O2
O 항원
컨쥬게이트
생성을 위한 균주
작제
균주 작제를 실시예 1과 유사하게 수행하였다. O2 rfb 클러스터를 표 1에 상술된 HR 영역 및 카세트로 구성된 pDOC 플라스미드에 클로닝하였다. O2 rfb 클러스터를 올리고 2207/2166을 이용하여 임상 분리물 upecGVXN116(StGVXN3949)으로부터 증폭시키고, p967의 BamHI/SgsI 부위로 클로닝하였다. O2 rfb 앰플리콘은 galF 내로부터 wekR까지모든 서열을 함유하였다. wekR과 gnd 사이의 DNA를 DNA 삽입물로부터 생략시켰다. 2개의 부분적으로 상보성인 올리고뉴클레오티드(2167/2168)로 구성된 올리고카세트의 p946의 XhoI 및 BamHI 부위로의 삽입에 의해 p967을 클로닝하였다. AscI을 이용한 p843 분해, 점착 제한 부위 종단을 채우기 위한 DNA 중합효소의 클레노우(Klenow) 단편을 이용한 선형화된 플라스미드의 처리, 및 플라스미드의 연속적 재라이게이션에 의해 p946을 수득하였다. 올리고뉴클레오티드 2066 및 2068(표 3 참조)을 이용하여 pKD4[13]로부터 유래된 PCR 앰플리콘을 동일 효소를 이용한 p482의 BamHI 및 SgsI 부위로 클로닝하여 p843을 생성시켰다. 생성된 공여체 플라스미드 p1003은 upecGVXN116으로부터의 업스트림 HR1 영역 및 rfb 클러스터, 및 뒤에 제거가능한 kanR 카세트, 및 뒤에 HR2 영역을 함유하였다(도 7).
p999 헬퍼 플라스미드(GenBank: GU327533.1)를 전기천공에 의해 W3110 세포로 도입시켰다[1]. 물 중 5-500 ng DNA를 얼음 상의 표준 전기천공 큐벳 내의 50 ㎕ 전기적격 세포 현탁액과 혼합하고, 2-10분 동안 1.8 kV의 전압에서 BioRad Micro Pulser(BioRad, Hercules, CA)에서 전기천공시켰다. p999의 온도 민감성 복제 표현형으로 인해, 생성된 세포를 플레이팅시키고, 모든 시간에서 30℃에서 성장시켰다. 다음 단계에서, 30℃에서 p999의 선택을 위한 스펙티노마이신이 보충된 LB 중에서 p999를 함유하는 W3110을 성장시킴으로써 적격 세포를 제조하였고, p1003을 전기천공에 의해 세포로 도입시키고, 세포를 30℃에서 LB 플레이트에서 앰피실린 및 스펙티노마이신 내성에 대해 선택하였다. 플라스미드를 동일 세포 내의 공여체 플라스미드 DNA의 존재하에서 헬퍼 플라스미드에서 인코딩된 효소의 발현을 가능케 하는 수용체 세포로 삽입하였다.
새로이 형질전환된 균주를 180 rpm에서 밤새 5 ml 규모로 30℃에서 앰피실린 및 스펙티노마이신의 존재하에서 LB 배지에서 성장시켰다. 10 ㎕의 배양물을 spec 및 amp가 보충된 1 ml 액체 LB를 함유하는 새로운 튜브로 옮겼다. 새로운 배양물을 이후 30℃에서 2시간 동안 180 rpm에서 성장시켰다. 이후, 세포를 4℃에서 5분 동안 5000 rpm에서 원심분리시키고, 상층액을 폐기하고, 스펙티노마이신, 0.2% 아라비노스(w/v), 및 1 mM IPTG가 보충된 LB 배지를 첨가하여 헬퍼 플라스미드 선택(Spec), 및 재조합효소(아라비노스) 및 SceI 엔도뉴클레아제(IPTG) 발현을 뒷받침하였다. 재현탁된 세포를 180 rpm에서 4-18시간 동안 30℃에서 추가로 인큐베이션하였다.
배지 교환 후 4 내지 18시간으로부터 다양한 시점에서, 0.5 ml의 배양물을 kan(DNA 삽입물의 선택을 위함) 및 10%(w/v) 수크로스(공여체 플라스미드에 대해 역선택하기 위함)가 보충된 LB에 플레이팅시키고, 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다(온도 민감성 헬퍼 플라스미드의 상실에 대해 선택하기 위함).
정확한 삽입 표현형에 대해 생성된 콜로니를 스크리닝하기 위해, 세포를 spec, amp, 또는 kan으로 보충된 LB 플레이트에 복제 플레이팅하였다. kan에 대해 내성(삽입물의 존재)이나, amp 및 spec에 대해 민감성(공여체 및 헬퍼 플라스미드의 부재)인 콜로니를 삽입에 대해 추가로 분석하였다.
다음 단계에서, waaL 유전자를 상기 기재된 바와 같은 파지 형질도입에 의해 붕괴시켰다. 파지 형질도입으로부터의 생성된 균주를 clm(waaL 결실) 및 kan(O2 rfb 클러스터 삽입) 내성에 대해 선택하여, 유전형 W3110 ΔrfbO16::rfbO2-kanR ΔwaaL::cat를 생성시켰다.
kan(rfb 클러스터 삽입) 및 clm(waaL 결실)에 대한 항생제 내성 카세트를 [35]에 기재된 바와 같이 pCP20을 이용하여 FLP 재조합효소 유도 재조합에 의해 단일 단계로 제거하였다.
DNA 삽입물의 삽입을 이전에 공개된 올리고뉴클레오티드 2243 및 2244을 이용하여 O16 wzx의 부재 및 O2 wzy의 존재에 대해 PCR에 의해 시험하였다(도 7A)[51]. 추가 분석은 5' 및 3' 전이 영역 PCR 및 서열분석을 포함할 수 있다. waaL 결실을 waaL 유전자에 플랭킹된 DNA 영역 내에서 어닐링되는 올리고뉴클레오티드 1114 및 1326(표 3 참조)을 이용하여 콜로니 PCR 접근법에 의해 시험하였다(도 7B). PCR 생성물은 온전한 waaL 카피가 존재하는 경우 상기 올리고뉴클레오티드를 이용하여 1.5 kb보다 크고(레인 1 및 5), waaL이 clmR 카세트로 대체된 경우 약간 더 작고(1.5 kb 미만, 레인 2 및 6), clmR 카세트의 제거 후, PCR 앰플리콘은 약 0.5 kb 크기이다(도 7B). 따라서, waaL 결실은 성공적이었다. 최종 균주(W3110 ΔrfbO16::rfbO2 ΔwaaL)는 5' 및 3' 전이 영역 PCR에 의해 시험될 수 있다.
균주 작제 동안 O 항원 생성 표현형을 확인하기 위해 LPS 샘플의 O2 형결정 혈청을 이용한 은 염색 및 웨스턴 블롯 분석을 이용하였다(도 8). 항 O2 항혈청으로 탐지되는 경우, 추정 구성요소(integrant)로부터의 추출물(W3110 ΔrfbO16::O2-kanR, A, 레인 1) 뿐만 아니라 양성 대조군 균주인 임상 E. 콜리 O2 분리물(레인 2)에서 사다리가 검출되었다. 이는 인테그란드가 활성 O2 rfb 클러스터를 함유한 것을 암시하였다. 최종 균주(W3110 Δr fbO16::rfbO2 Δw aaL)를 은 염색(도 8B, 좌측 패널), 및 웨스턴 블롯(도 8B, 우측 패널)에 의한 LPS 및 Und-PPO 항원 생성에 대해 시험하였다. waaL 양성 균주는 은 염색에 의해 시각화된 바와 같이 사다리 유사 신호를 갖는 LPS를 생성한 반면(레인 2), waaL 결실 및 항생제 카세트 제거 후에 신호가 부재하였다(레인 1). 웨스턴 블로팅(패널 B)은 둘 모두의 샘플에서 사다리 유사 패턴을 나타내었으나, waaL 결실된 균주에서 강도는 훨씬 낮았다. 이는 실제로 waaL 결실된 균주가 Und-PP 결합된 O2 반응성 다당류를 생성한 것을 나타낸다.
상기 세포에 의한 Und-PP에서의 O 항원의 생성을 확인하기 위해, 상기 기재된 바와 같은 2 AB 표지화 방법(섹션 6.2)을 이용하였다. 형광 추적자를 O 항원을 생성할 수 없는 균주와 비교한 경우 W3110 ΔrfbO16::rfbO2 ΔwaaL에 대해 특이적인 신호를 관찰하였다. 특이적 피크 용리 시간은 MALDI MS/MS에 의해 분석시 이전에 확인된 O2 반복 단위와 일치하였다(도 9A). 여러 수거된 피크로부터의 단편화 이온 시리즈를 상기 기재된 바와 같이 MALDI-TOF/TOF에 의해 분석하였다. 단편화 패턴은 O2 O 항원 반복 단위와 일치한다(도 9B). 이에 의해, E. 콜리 균주 W3110 ΔrfbO16::rfbO2 ΔwaaL를 기초로 한 O2 O 항원 생성 W3110의 작제가 확인되었다.
W3110 Δr fbO16::rfbO2 Δw aaL에 의한 O2 글리코컨쥬게이트의 생성을 나타내기 위해, C. 제주니(2개의 상이한 변이체)의 PglB 올리고사카릴 트랜스페라제 및 담체 단백질 EPA(4개의 당화 컨센서스 서열을 인코딩함, p659)의 유도성 발현을 위한 플라스미드를 전기천공에 의해 W3110 Δr fbO16::rfbO2 Δw aaL로 도입시켰다. 세포를 5 mM MgCl2, spec 및 amp로 보충된 LB 배지로 접종시키고, 정지기까지 37℃에서 밤새 성장시켰다. 이후, 세포를 0.05의 OD600으로 희석시키고, spec 및 amp를 함유하는 TB에서 0.8의 OD600까지 성장시켰다. EPA 및 PglB 발현을 0.2% 아라비노스 및 1 mM IPTG의 첨가에 의해 개시시키고, 배양물을 또 다른 20시간 동안 성장시켰다. 이후, 세포를 원심분리에 의해 수거하고, 원형질막주위 세포 추출물을 리소자임 방법을 이용하여 제조하였다[55]. 원형질막주위 추출물(세포 밀도로 표준화됨)을 SDS PAGE에 의해 분리시키고, 웨스턴 블로팅에 의해 분석하였다(도 10). 항 EPA 항혈청(좌측 패널) 및 항 O2 항혈청(우측 패널) 둘 모두를 이용한 검출은 100 kDa 초과의 통상적인 O 항원 사다리 유사 패턴의 2개의 클러스터를 나타내며, 이는 EPA 단백질 및 O2 다당류로 구성된 당단백질을 강하게 나타낸다. EPA 항혈청 단독으로 수득된 신호(70 kDa 초과)는 당화되지 않은 EPA에 해당한다. 첫번째 클러스터(100과 130 kDa 사이)는 단독으로 당화된 EPA 단백질에 해당하고, 두번째의 더 약한 클러스터(130 kDa 초과)는 이중으로 당화된 EPA 단백질에 해당한다. 항 O2 웨스턴 블롯에서 관찰된 사다리 유사 신호는 필시 다당류 부분을 여전히 함유하는 EPA O2 글리코컨쥬게이트의 분해 생성물이다. 둘 모두의 PglB 변이체가 당단백질의 유사한 특정 생산성을 발생시키는 것이 명백하다. upecGVXN124(StGVXN3947)는 waaL 유전자가 결실되고[13], 플라스미드 p659 및 p939가 전기천공에 의해 이에 도입된 임상 O2 혈청형 분리물이다. 상기 대조군 발현 시스템을 비교측정기로 사용하여(레인 x), 발현 숙주로서 임상 분리물(upecGVXN124)을 이용하여 발현 시스템으로부터보다 W3110 ΔrfbO16::rfbO2 ΔwaaL(레인 B)로부터 유래된 추출물로부터 더 강한 신호가 관찰되었다. 따라서, W3110에서의 삽입은 자연 균주에서의 당화에 비해 더 높은 수율의 글리코컨쥬게이트를 발생시킬 수 있다.
당단백질은 또한 3 플라스미드 시스템으로 관찰된 바와 같은 더 짧은 글리칸 길이를 나타내는 매우 순수한 글리코컨쥬게이트의 분취용 정제를 위해 10 l 규모로 생물반응기에서 삽입된 균주에 의해 생성될 수 있다. 글리코컨쥬게이트의 순도, 양 및 크기를 분석하기 위해 모세관 젤 전기영동이 사용될 수 있다. 글리코컨쥬게이트에 부착된 다당류는 히드라진분해에 의해 단백질로부터 제거될 수 있고, 다당류 구조 및 길이의 분석을 위해 2 AB 표지화 및 HPLC-MS/MS에 의해 분석될 수 있다. 이러한 분석은 당단백질 담체로의 O2 O 항원의 부착을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 단당류 조성 결정을 위해 PMP 분석이 수행될 수 있고, 구조 형태에 대해 NMR 분석 및 가스 크로마토그래피가 수행될 수 있다. 추가로, 동물의 면역화는 글리칸 및 담체 단백질에 대한 항체를 발생시키기 위해 수행될 수 있다. 항-감염 활성은 옵소닌식작용 사멸 검정 및/또는 수동 보호와 같은 검정을 이용함으로써 제시될 수 있다.
6.3
실시예
3: E. 콜리 O6 O 항원 컨쥬게이트 생성을 위한 균주 작제
상기 기재된 바와 같이 균주 작제를 수행하였다. O6 rfb 클러스터를 표 1에 상술된 바와 같이 HR 영역 및 kanR 카세트로 구성된 pDOC 플라스미드에 클로닝하였다. O6 클러스터를 올리고뉴클레오티드 1907/1908을 이용하여 E. 콜리 균주 CCUG11309로부터의 유전체 DNA로부터 증폭시키고(도 11A), p843의 BamHI 및 BcuI 부위로 클로닝하여 p914를 생성시켰다.
p999 헬퍼 플라스미드(GenBank: GU327533.1)를 전기천공에 의해 W3110 세포로 도입시켰다[1]. 물 중 5-500 ng DNA를 얼음 상에서 표준 전기천공 큐벳에서 50 ㎕ 전기적격 세포 현탁액과 혼합하고, 2-10분 동안 1.8 kV의 전압에서 BioRad Micro Pulser(BioRad)에서 전기천공시켰다. p999의 온도 민감성 복제 표현형으로 인해, 생성된 세포를 플레이팅시키고, 모든 시간에서 30℃에서 성장시켰다. 다음 단계에서, p914를 전기천공에 의해 p999를 갖는 W3110으로 도입시키고, 세포를 30℃에서 LB 플레이트 상에서 amp 및 spec 내성에 대해 선택하였다. 동일 세포 내에서 공여체 플라스미드 DNA의 존재하에서 헬퍼 플라스미드 상에서 인코딩된 효소의 발현을 가능케 하기 위해 수용체 세포로 플라스미드를 삽입하였다.
헬퍼 및 공여체 플라스미드를 함유하는 전기천공된 클론을 180 rpm에서 밤새 5 ml 규모로 30℃에서 amp 및 spec의 존재하에서 LB 배지에서 성장시켰다. 10 ㎕의 배양물을 spec 및 amp로 보충된 1 ml 액체 LB를 함유하는 새로운 튜브로 옮겼다. 이후, 새로운 배양물을 30℃에서 2시간 동안 180 rpm에서 성장시켰다. 이후, 배지를 교환하고, 배양물을 4℃에서 5분 동안 5000 rpm에서 원심분리시키고, 상층액을 폐기하고, 세포 펠렛을 spec, 0.2% 아라비노스(w/v), 및 헬퍼 플라스미드 선택을 뒷받침하기 위한 1 mM IPTG(Spec), 및 재조합효소(ara) 및 SceI 엔도뉴클레아제(IPTG) 발현이 보충된 LB 배지에 재현탁시켰다. 재현탁된 세포를 180 rpm에서 4-18시간 동안 30℃에서 추가로 인큐베이션하여 재조합 사건이 발생하도록 하였다.
배지 교환 후 4 내지 18시간으로부터 다양한 시점에서, 0.5 ml의 배양물을 kan(DNA 삽입물의 선택을 위함) 및 10%(w/v) 수크로스(공여체 플라스미드에 대해 역선택하기 위함)가 보충된 LB에 플레이팅시키고, 밤새 37℃에서 인큐베이션(온도 민감성 헬퍼 플라스미드의 상실에 대해 선택하기 위함)하였다.
정확한 삽입 표현형(W3110 ΔrfbO16::rfbO6-kanR)에 대해 발생된 콜로니를 스크리닝하기 위해, 세포를 spec, amp, 또는 kan이 보충된 LB 플레이트에 복제 플레이팅하였다. kan에 대해 내성(DNA 삽입물의 존재)이나, amp 및 spec에 대해 민감성(공여체 및 헬퍼 플라스미드의 부재)인 콜로니를 삽입에 대해 추가로 분석하였다. 또한, 콜로니 블로팅을 수행하였다. kan이 보충된 LB에서 성장된 복제 플레이팅된 콜로니를 '콜로니 리프팅(colony lifting)'에 의해 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 막이 완전히 습윤화될 때까지 둥근 니트로셀룰로스 막을 성장하는 콜로니의 상부의 LB 플레이트에 놓았다. 막의 리프팅시, 막에 접착된 콜로니를 Tween 20(0.02 % w/v)이 보충된 PBS에서 세척하였다. 이후, 막을 O6 항원을 생성한 콜로니의 검출을 위해 항 O6 항혈청을 이용한 웨스턴 블롯으로 처리하였다. 막의 발달 후에 양성 콜로니가 어두운 점으로 나타났다.
kan(rfb 클러스터 삽입으로부터 유래됨) 및 clm(waaL 결실)에 대한 항생제 내성 카세트를 [35]에 기재된 바와 같이 플라스미드 pCP20을 이용한 FLP 재조합효소 유도 재조합에 의해 단일 단계로 제거하였다.
DNA 삽입물의 삽입을 O16 wzx의 부재 및 O6 wzy의 존재에 대해 PCR[51](도 11D), 5'(도 11B) 및 3'(도 11C) 전이 영역 PCR, LPS 샘플의 은 염색, 및 O6 항결정 혈청을 이용한 웨스턴 블롯 분석(도 12)에 의해 시험하였다. 추출물을 항 O6 혈청으로 분석(E. 콜리 O6 대조군 균주와 유사함, 레인 3)한 경우에 클론 A(도 12A, 레인 1)만이 사다리 유사 O 항원 신호를 만든 반면, 클론 B는 음성이었다(레인 2). 모든 추가 시험은 rfb 클러스터의 기능적 활성에 대해 양성이었다.
다음 단계에서, waaL 유전자를 [52]에 기재된 바와 같이 클론 A로부터 파지 형질도입에 의해 붕괴시켰다. 은 염색은 O 항원이 waaL 검출 균주에 존재하지 않는 것을 나타내며(도 12B, 좌측 패널, 레인 1), 웨스턴 분석은 동일 추출물에서 통상적인 약한 사다리 모양 신호로서 Und-PP 결합된 O6 O 항원을 나타낸다(도 12B, 우측 패널, 레인 1). waaL 결실 전, LPS가 명백히 관찰된다(둘 모두의 패널, 레인 2). 상기 결과는 성공적인 waaL 결실을 나타내었다.
clm(waaL 결실), 및 이후 kan(rfb 클러스터 삽입)에 대한 항생제 내성 카세트를 FLP 재조합에 의해 2개의 연속적 단계로 제거하였다[35]. 도 12C는 남아있는 Und-PP 결합된 신호를 이용한 clmR 제거 후의 2개의 클론(레인 1, 2)을 나타낸다(웨스턴 블롯, 우측 패널). 최종 균주(2개의 클론, W3110 Δr fbO16::rfbO6 Δw aaL)를 5' 및 3' 전이 영역 PCR에 의해 시험하였다(도 11A 및 B). LPS의 은 염색, 웨스턴 블롯, 및 형광 2 AB 표지화 후, Und-PP-결합된 다당류의 HPLC 및 MS/MS 분석이 수행되어 확인될 수 있다. 모든 데이터에서 선택된 클론 둘 모두에서 rfb 클러스터의 성공적인 삽입, 및 기능적 활성을 확인할 수 있다.
O6 글리코컨쥬게이트의 생성을 나타내기 위해, C. 제주니의 PglB 올리고사카릴 트랜스페라제(p939) 및 담체 단백질 EPA(4개의 당화 컨센서스 서열을 인코딩함, p659)의 유도성 발현을 제공하는 플라스미드를 전기 천공에 의해 W3110 Δr fbO16::rfbO6-kanR Δw aaL(즉, 최종 균주 W3110 ΔrfbO16::rfbO6 ΔwaaL의 조상)에 도입시켰다. 세포를 성장시키고, 유도인자를 첨가하고, 세포를 밤새 추가로 성장시켰다. 샘플을 수거하고, 원형질막주위 세포 추출물을 리소자임 방법을 이용하여 제조하였다[55]. 원형질막 주위 추출물(세포 밀도로 표준화됨)을 SDS PAGE에 의해 분리시키고, 전기이동 후 면역블로팅에 의해 분석하였다. 항 EPA 항혈청 및 항 O6 항혈청 둘 모두를 이용한 검출은 100 내지 130 사이에 하나 및 130 kDa 초과의 하나의 사다리 유사 신호의 2개의 명백한 클러스터를 나타낸다(도 13). 이들 신호는 EPA 단백질 및 O6 다당류로 구성된 당단백질을 강하게 나타낸다. EPA 항혈청 단독으로 수득된 신호(70 kDa 초과)는 당화되지 않은 EPA에 해당한다. 2개의 사다리 클러스터가 검출된 것이 명백하며, 이는 2 부위에서 당화된 EPA를 나타낸다.
당단백질은 또한 글리코컨쥬게이트의 분취용 정제를 위해 10 l 규모로 생물반응기에서 삽입된 균주에 의해 생성될 수 있다. 글리코컨쥬게이트에 부착된 다당류는 히드라진분해에 의해 단백질로부터 제거될 수 있고, Und-PP 결합된 O 항원과 같이 2 AB 표지화 및 HPLC-MS/MS에 의해 분석될 수 있다. 이러한 분석은 당단백질 담체에 대한 O6 항원의 부착을 확인할 수 있다.
컨쥬게이트 생성물의 품질 및 양과 관련하여 삽입된 균주를 분석하기 위해, O1, O2, 및 O6 EPA 글리코컨쥬게이트 생성에 대한 삽입된 균주의 성능을 "3 플라스미드 시스템", 즉, 종래에 기재된 바와 같은 에피솜에서 인코딩된 rfb 클러스터를 갖는 시스템[9], 또는 "야생형 균주" 시스템인 대안적 생성 시스템과 비교하였다. 3 플라스미드 시스템에서, W3110 Δw aaL 균주가 발현 숙주로 사용된다. 삽입된 시스템 및 야생형 시스템과 비교하여 상기 시스템에서 약간의 기술적 차이가 존재한다. 3 플라스미드 시스템은 숙주 내에서의 3개의 플라스미드의 도입 및 유지를 필요로 한다. 이는 플라스미드 유지를 보장하기 위해 발효 동안 3개의 상이한 항생제가 성장 배지에 첨가되어야 하는 것을 의미한다. 3개의 플라스미드의 공존은 상용성 벡터 백본을 필요로 한다. 특히, 큰 rfb 클러스터 서열은 특정한 유지 시스템 및 강한 선택압을 필요로 한다. 주로 플라스미드 상실이 발생하고, 이에 따라 병에 걸린 세포가 재조합 생성물을 생성하는 것을 중지하거나, 플라스미드 유지가 수율을 하락시키는 상기 세포에 대한 부담을 의미함에 따라 플라스미드 유지는 재조합 미생물 발효 생성을 위한 생성 과정에서 감소된 수율에 대한 영구적 원인이다. 항생제에 대한 인간의 잠재적인 알레르기 유해 사례로 인해, 항생제 비함유 생성 과정에 대해 규제 당국의 요구가 증가하고 있다. 따라서, 에피솜에 이전에 존재한 생합성 클러스터를 염색체로 통합시키는 것은 명백한 장점이다.
두번째 가능한 생성 시스템은 감염된 개체 또는 현장으로부터 유래된 자연의 임상 분리물을 기초로 하고, 이들을 생성 플랫폼으로 이용하는 것이다. 이들은 관심 O 항원을 자연 생성함에 따라, 간단한 waaL 결실은 이들 균주를 적합한 자연 삽입된 생성 균주로 만든다. 그러나, 많은 독소 및 인자가 E. 콜리 임상 분리물에서 인코딩되고 발현되므로, 규제 당국은 상기 시스템으로부터 생성물에 대해 더 높은 품질의 표준을 요구하며, 이는 고비용이고 시간 소모적인 일이다. 따라서, 잘 연구되어 있고 안전한 숙주 W3110으로의 삽입이 적합한 대안이며, 플라스미드 관련 불이익이 감소되고, 경계적 요구조건이 달성된다.
본 발명자는 3개 모두의 E. 콜리 O 항원에 대해 3개 모두의 생성 시스템을 분석하였다(도 14). EPA(p659) 및 PglB(p939)에 대한 발현 플라스미드를 유전체 내(삽입된 균주 또는 임상 분리물) 또는 플라스미드 상(3 플라스미드 시스템)에 rfb 유전자좌를 함유하는 숙주 세포로 도입시켰다. 박테리아 배양물을 먼저 세포 내에 존재하는 플라스미드를 유지시키는데 필요한 모든 항생제를 함유하는 LB 배지에서 밤새 성장시켰다. 이후, 배양물을 TB 배지 중에 0.05의 OD600으로 희석시키고, 0.4-1.2의 OD600까지 성장시키고, 유도인자(아라비노스 0.2%, IPTG 1 mM)를 첨가하였다. 37℃에서 유도 20시간 후, 세포를 수거하고, 원형질막주위 추출물을 리소자임 방법을 이용하여 제조하였다. 이후, 원형질막주위 용해질을 SDS PAGE 및 면역검출(웨스턴 블롯)에 의해 분석하였다.
당화되지 않은 EPA가 항-EPA 블롯에서 70 kDa 초과에서 관찰된다. 100 kDa 초과에서 클러스터링된 사다리 유사 패턴은 통상적인 O 항원 다당류 길이 분포를 갖는 전장 글리코컨쥬게이트이다. 일반적으로, 모든 시스템은 유사한 자릿수로 글리코컨쥬게이트를 생성시킨다. 그러나, 3 플라스미드 시스템은 더욱 크게 확산된 것으로 보이거나(도 14, 패널 A, 레인 3 및 2 비교), 삽입된 균주(야생형 및 삽입형)보다 높은 분자량 수준(모든 패널, 레인 3 및 2 비교)에 도달한 것으로 보이는 항 EPA 및 항 다당류 웨스턴 블롯에서 사다리 유사 신호를 발생시킨다. 이는 삽입 전략이 글리코컨쥬게이트 생성을 위한 강력한 과정 조정 도구임을 나타낸다(도 14).
긴 다당류 글리코컨쥬게이트(3 플라스미드 시스템에 의해 제조됨) 및 삽입된 균주의 전임상 비교가, 후자의 컨쥬게이트가 더욱 면역원성이고 더욱 규정된 것인지의 여부를 결정하기 위해 수행될 수 있다.
생성 배양물 내의 재조합 DNA 요소의 배양 균일성 및 유지의 비교가 삽입된 숙주 균주로부터의 세포가 더 높은 수준의 생성물을 생성시킬 수 있고, 더 나은 재현성 패턴을 나타내고, 이들이 유전학적으로 더욱 안정적인 것을 나타내기 위해 수행될 수 있고, 이에 따라 삽입이 규모확장의 높은 용이성으로 인해 더 우수한 것을 입증한다.
6.4
실시예 4: S. 손네이 O 항원 생성을 위한 균주 작제
P. 시겔로이데스 O17 클러스터는 S. 손네이 rfb 클러스터와 기능적으로 동일하나, 불안정한 병원성 플라스미드에서 엔코딩되지 않고, 이에 따라 P. 시겔로이데스로부터 클로닝되었다. 상기 클러스터를 올리고뉴클레오티드 1508/1509(wzz 없음) 및 1528/1509(wzz를 가짐)를 이용하여 P. 시겔로이데스 O17로부터의 유전체 DNA로부터 증폭시켰다. P. 시겔로이데스 O17의 rfb 클러스터를 pDOC-유래 플라스미드 p562로 클로닝하여, p563(wzz가 포함됨) 및 p568(wzz 유전자가 결핍됨)을 생성시켰다. 헬퍼 플라스미드는 표 1에 상술된 바와 같이 HR 영역 및 선택 카세트로 구성되었다. 균주 작제를 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. DNA 삽입물의 삽입을 O16 wzy의 부재 및 S. 손네이 wzy-wbgV의 존재에 대해 PCR, 5' 및 3' 전이 영역 PCR(도 15), LPS 샘플의 은 염색, 및 S. 손네이 형결정 혈청을 이용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 시험하였다(도 16).
6.5
실시예
5: S. 디센테리에 O 항원 글리코컨쥬게이트 생성을 위한 삽입된 균주
S. 디센테리에의 rfp 및 rfb 클러스터가 E. 콜리에서 O 항원을 생성시키는 기능적 단위를 형성하지만, S. 디센테리에 유전체 내에서, 이들은 다양한 위치에 존재한다([8]). 둘 모두의 클러스터를 표 1에 상술된 바와 같이 HR 영역 및 선택 카세트로 구성된 pDOC 플라스미드에 클로닝하였다. rfb/rfp를 함유하는 플라스미드 pSDM7([8])로부터의 BamHI 단편을 적합한 MCS 카세트를 함유하는 pLAFR1으로 서브클로닝하였다. 여기로부터, 올리고뉴클레오티드 1261 및 1272(표 3 참조)를 사용하여 pDOC-유래 p503으로 하나의 앰플리콘으로 rfp/rfb를 클로닝하여 p504를 생성시켰다. p503을 p482로부터 클로닝하였다(섹션 6.1 참조): galF의 일부(galF') 및 균주 W3110의 galF와 rmlB 사이의 인터진 영역을 함유하는 삽입을 위한 HR1 영역을 인코딩하는 PCR 앰플리콘(올리고뉴클레오티드 1171/1263을 이용함)을 SpeI 및 BamHI으로 분해시키고, 동일 효소를 이용하여 분해된 p482로 라이게이션시켰다(p503을 생성시킴). rfp 및 rfb는 S. 디센테리에 타입 I의 유전체 상에서 2개의 독립된 클러스터로 발견되며, p504로부터 발현된 경우에 galF', rfp, rfb, 및 gnd에 대해 번역 방향이 동일하도록 클로닝되었다. DNA 삽입물의 삽입을 waaL 양성 및 음성 균주에서 수행하였고, O16 wzy의 부재에 대해 PCR, 5' 및 3' 전이 영역 PCR, LPS 샘플의 은 염색, 및 형결정 혈청을 이용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 시험하였다(제시되지 않음). 도 17은 clmR 카세트 제거 전 및 후의 삽입된 W3110 ΔrfbO16::rfbSd1 ΔwaaL 및 W3110 ΔrfbO16::rfbSd1의 당지질 분석을 도시한다. 추출물을 SDS PAGE 후에 은 염색에 의해 분석하는 경우, waaL 양성 균주만이 LPS의 통상적인 O 항원 패턴을 나타내었으나, Δw aaL 균주는 그렇지 않았다. 모든 균주는 항 S. 디센테리에 1 O 항원 특이적 항혈청에 반응하였고, 이는 상기 균주에서의 재조합 O 항원의 생성을 입증한다(도 17).
분자 세부사항에 있어서 재조합 O 항원의 구조를 분석하기 위해, W3110 ΔrfbO16::rfbSd1-clmR ΔwaaL로부터의 Und-PP 결합된 다당류 푸울을 세포의 가수분해된 유기 추출물의 2 AB 표지화 및 정상 상 HPLC에 의해 분석하였다(도 18). 추적은 SDS PAGE에서 종종 관찰된 사다리 유사 패턴을 나타낸다. 특정 피크의 MS/MS 분석이 S. 디센테리에 타입 1 다당류 서열을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
W3110 Δr fbO16::rfbSd1-clmR Δw aaL은 하기 기재되는 바와 같은 EPA S. 디센테리에 1 컨쥬게이트이 생성을 위한 숙주였다. 상기 균주를 이용한 글리코컨쥬게이트 백신 후보의 생성을 확인하기 위해, 발현 플라스미드 p293 및 p114를 균주로 형질전환시키고, 생물반응기에서 10 l 규모로 발효시켰다. EPA 컨쥬게이트를 정제하고, 당화되지 않은 EPA를 고전적 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 생성된 최종 벌크를 SEC HPLC(도 19A), SDS PAGE 후, 쿠마시 염색 또는 면역검출(도 19C) 단당류 조성 분석(도 19B) 및 히드라진분해 후, 2 AB 표지화, HPLC 분석 및 MS/MS(도 19D)에 의해 분석하여 당 구조 및 컨쥬게이트 품질을 확인하였다.
6.6
실시예
6: S. 플렉스네리 2a O 항원 글리코컨쥬게이트 생성을 위한 삽입된 균주
시겔라 O 항원은 면역학적으로 다양하다. 항원으로서 O 항원 다당류를 이용한 시겔라증에 대한 종합적 백신에 대해, 충분한 적용범위를 발생시키기 위해 적어도 5개의 혈청형의 O 항원 구조가 포함되어야 하는 것으로 생각된다. 목적은 가장 우세한 감염성 균주로부터 가능한 한 많은 항원성 요소를 포함시키고, S. 디센테리에 타입 1, S. 손네이, 및 S. 플렉스네리 타입 6, 및 S. 플렉스네리 2a 및 3a O 항원을 함유시키는 것이다[56].
혈청형 2a 및 3a는 혈청형 Y로 언급되는 동일한 O 항원 백본 다당류 구조를 기초로 한다. S. 플렉스네리에서는 큰 O 혈청형 다양성이 존재한다. 이는 글루코스 및 아세틸 기에 의한 Y 혈청형 반복 단위의 변형으로 인한 것이다. 상기 종류의 변형은 2a 또는 3a 혈청형 구조의 구성을 담당한다(도 20A). Y 백본 변형은 다양하며, 다양한 조합의 변형은 많은 혈청학적으로 교차반응성인 다당류 구조를 발생시킨다. 혈청형 2a 및 3a는 시겔라에서 종종 발견되는 2개의 상이한 글루코스 및 하나의 아세틸화 분지 변형을 함유하며, 따라서 다른 교차반응성 항원에 대해 보호하기 위해 백신에 포함된다.
구조 다양성을 발생시키는 데코레이션 효소(decoration enzyme)는 혈청형 Y의 백본에 글루코스 및 아세틸 잔기를 부착시키는 특이적 트랜스페라제이다. 백본은 rfb 클러스터에서 전적으로 인코딩되는 반면, 글루코스 또는 아세틸기의 첨가를 담당하는 효소는 rfb 클러스터의 외부에서 인코딩된다. 일부 E. 콜리 O 항원에 대해 동일한 관찰이 이루어졌다(예를 들어, O16). 많은 경우에서 백본 변형이 면역원성에 중요한 것으로 생각되므로, 이들은 삽입된 생성 균주에 포함되어야 한다.
rfb 클러스터의 외부에 위치되는 글리코실트랜스페라제(또는 아세틸트랜스페라제)를 필요로 하는 O 항원을 생성시키는 삽입된 E. 콜리 균주의 작제를 위해, 먼저 추가 트랜스페라제를 함유한 숙주 균주를 작제하고, 플라스미드로부터 rfb 클러스터를 공동발현시킴으로써 이의 기능성에 대해 시험하였다. 추가 단계에서, W3110 rfb 클러스터 대신에 O 항원 클러스터의 삽입을 수행하였다. 상기 사건의 순서는 순전히 실제적인 것으로, 체계적인 것이 아니며, 즉, 순서는 반대일 수 있다. S. 플렉스네리 2a O 항원을 제조하기 위해 상기 절차를 수행하였고, 상기 균주로 제조된 글리코컨쥬게이트는 전임상 시험에서 기능적으로 활성인 것으로 밝혀졌다.
본 발명자는 2a 및 3a 글리코컨쥬게이트 생성을 위한 숙주 균주로서 E. 콜리 W3110을 선택하였는데, 이는 이것이 효과적인 글리코컨쥬게이트 생성을 위한 증명된 능력을 갖기 때문이다. W3110은 O16 rfb 클러스터에서 붕괴된 글리코실트랜스페라제 유전자로 인해 O 항원 생성이 불충분하다. 그러나, 본 발명의 계획된 검정을 이용하여 rfb 클러스터로부터 나머지 활성에 의한 잠재적 방해를 피하기 위해, rfb 글리코실 및 아세틸트랜스페라제 유전자 wbbIJK를 결실시켰다[13]. E. 콜리 재조합효소에 의해 사용된 dif 부위를 이용한 부위 특이적 재조합 기능화를 이용함으로써 선택 카세트를 자동적으로 제거하였다[14]. 균주 시겔라 플렉스네리 2457T(혈청형 2a)으로부터 클로닝된 S. 플렉스네리 rfb 클러스터가 발현된 경우, 추출물의 당지질 분석은 S. 플렉스네리 혈청형 Y 표현형을 나타내었다. 상기 추출물로부터의 LPS는 측쇄 변형 특이적 항 그룹 II 및 항 그룹 7, 8 항혈청에 반응성이 아니었다(도 20C, 레인 1).
Y 혈청형으로의 글루코스 데코레이션의 첨가를 위해, E. 콜리 W3110ㅇ ㅔ존재하는 현존하는 변형 시스템의 장점을 취하였다. 글루코스 변형은 종종 프로파지 DNA 삽입물로부터 발생하는 효소 기구에 의해 촉매된다[57]. E. 콜리 W3110은 gtr 오페론으로 언급되는 상기 유전 요소를 함유한다. gtr 오페론은 3개의 유전자를 함유한다. 처음 2개의 유전자는 매우 보존되어 있고, 현재까지 확인된 gtr 클러스터 대부분에 공통으로 존재한다(gtrAB). 세번째 유전자는 막의 원형질막주위 측면 상의 성장하는 O 항원 사슬 내의 특정 위치에 글루코스를 첨가하는 글루코실트랜스페라제를 인코딩한다. W3110의 경우에서, 상기 유전자는 gtrS로 명명된다. S. 플렉스네리 2a 및 3a에서, gtr 클러스터가 존재한다. 각각의 gtrAB 유전자는 매우 상동성인 반면, 세번째 유전자(2a에서 gtrII 및 3a에서 gtrX)는 다양하다[32]. W3110 시스템에 대한 이들의 기계적 상동성으로 인해, gtrS의 gtrII 또는 gtrX로의 교환이 또한 글루코스 데코레이션 활성을 전달하는 것으로 추론되었다.
상기 가설을 시험하기 위해, [14]에 기재된 바와 같이 카세트 절제 전략을 이용한 상동성 재조합[13]에 의해 gtrS 유전자를 gtrII 또는 gtrX로 교환하였다. dif 부위에 의해 플랭킹된 clmR 카세트를 플라스미드 p411 내의 화학적으로 합성된 gtrII 또는 gtrX ORF에 대해 다운스트림에 배치하였다. p411로부터 gtrII 및 clmR을 인코딩하는 PCR 단편을 생성시키기 위해 올리고뉴클레오티드 1018 및 1019를 사용하였다. 올리고뉴클레오티드 오버행은 gtrS ORF의 업스트림(gtrB 서열) 및 다운스트림과 동일하였다. 상기 앰플리콘을 이용하여, 상동성 재조합을 수행하였다[13]. 정확한 재조합을 콜로니 PCR(올리고뉴클레오티드 1016/1017을 이용함)에 의해 확인하고, PCR 생성물을 서열분석하였다(도 20B). gtr 효소가 타입 Y 백본 구조를 데코레이션할 수 있는지 확인하기 위해, 양성 균주를 균주 2457T로부터 rfb 클러스터를 발현하는 플라스미드로 형질전환시켰다. 상기 세포로부터의 추출물은 은 염색에 의해 분석된 바에 따라 LPS를 함유하였으나, 이들의 전기영동 이동은 rfb 클러스터 단독을 발현하는 대조군 균주와 약간 차이를 나타냈다(도 20C, 좌측 패널, 레인 1, 2, 3 비교). 동일한 추출물을 글루코스 측쇄 특이적 항혈청으로 전과 같이 탐지하였고, 예상된 바와 같이, 항 그룹 II 항혈청은 균주 W3110 Δr trS::gtrII를 갖는 신호를 발생시켰고, W3110 Δ g trS::gtrX 균주는 항 그룹 7,8 항혈청을 갖는 신호를 발생시켰다. 따라서, gtr 유전자의 교환은 글루코스 데코레이션을 위한 특정 능력을 E. 콜리 W3110에 전달하여, 균주 W3110 Δg trS::gtrII 및 W3110 Δg trS::gtrX를 생성시켰다. 유사하게, 재조합 글리코컨쥬게이트 발현 균주에서 데코레이션 활성을 발생시키기 위해 적합한 숙주 균주로 전체 gtr 클러스터 또는 세번째 유전자 단독(즉, 특이적 글루코실트랜스페라제)을 삽입할 수 있다.
아세틸화 변형을 갖는 S. 플렉스네리 3a 구조의 완료를 위해, 공지된 아세틸트랜스페라제 유전자가 유사한 전략을 이용하여 생성 균주로 삽입될 수 있다. 2a 혈청형에 대해, 다당류 데코레이션 활성에 대해 시험될 수 있는 후보 아세틸트랜스페라제 유전자를 확인하기 위해 유전자 서열분석 및 상동성 분석이 이용될 수 있다.
재조합 2a O 항원을 갖는 단백질 당화를 수용하기 위해, waaL 유전자를 상동성 재조합에 의해 결실시켜[13,14], 균주 W3110 Δg trS::gtrX Δw aaL을 생성시켰다. 또한, E. 콜리 W3110 rfb 클러스터를 실시예 1에 기재된 바와 같이 S. 플렉스네리 2457T로부터의 것으로 교환하여 W3110 Δr fbO16::rfb2457T Δg trS::gtrX ΔwaaL을 생성시켰다. 공여체 플라스미드 p487을 올리고뉴클레오티드 1171 및 1172를 이용하여 제조된 PCR 앰플리콘의 삽입에 의해 p482로부터 작제하였다. 또한, 담체 단백질의 유도에 사용된 아라비노스의 대사 분해를 피하기 위해, araBAD 클러스터를 상기 균주에서 붕괴시켰다. 재조합 단백질이 araBAD 프로모터 시스템에 의해 조절되는 경우에 araBAD 결실이 수율을 증가시키는 것이 널리 공지되어 있다. 따라서, 균주 W3110 ΔrfbO16::rfb2457T ΔgtrS::gtrX ΔwaaL을 균주 W3110 ΔaraBAD::cat로부터 제조된 파지 용해질로 형질도입시켰다. W3110 ΔaraBAD::clmR을 올리고뉴클레오티드 1562 및 1563 및 주형으로서 pKD3을 이용한 PCR에 의해 제조된 DNA 삽입물을 이용한 상동성 재조합에 의해 제조하였다[13].
산업적 규모의 백신 후보 생성을 위해 결과로서 발생한 균주 W3110 ΔaraBAD::clmR ΔrfbO16::rfb2457T ΔgtrS::gtrII ΔwaaL을 사용하기 위해, 2개의 당화 부위를 함유하는 EPA 담체 단백질에 대한 발현 플라스미드(p293) 및 HA 태그를 함유하는 pglB 올리고사카릴 트랜스페라제에 대한 발현 플라스미드(p114)를 전기천공에 의해 W3110 ΔaraBAD::clmR ΔrfbO16::rfb2457T ΔgtrS::gtrII ΔwaaL로 도입시켰다. 생성된 균주를 10 l 규모로 발효시키고, EPA 글리코컨쥬게이트를 생성된 바이오매스로부터 정제하였다. 숙주 세포 불순물 및 당화되지 않은 담체 단백질을 제거하기 위해 정제를 수행하였다. 컨쥬게이트를 SEC HPLC(도 21B), SDS PAGE 후, 쿠마시 염색 및 면역검출(도 21A), 히드라진분해 후, MS/MS(도 21D), 단당류 조성 분석(도 21C), 및 절대 단당류 형태에 대한 GC-MS(제시되지 않음)에 의해 특성규명하였다(5.2.1.7. 및 5.3.5. 참조). 이러한 데이터는 균주의 삽입 및 염색체 변형이 S. 플렉스네리 2a 백신 생성물 후보의 생성을 위한 효과적인 생성 시스템을 발생시키는 것을 입증하였다.
백신 후보가 동물 모델에서 기능적인지 확인하기 위해, p114 및 p293을 함유하는 삽입된 균주 W3110 ΔaraBAD::clmR ΔrfbO16::rfb2457T ΔgtrS::gtrII ΔwaaL에서 생성된 2a-EPA E . coli 글리코컨쥬게이트 백신의 면역원성을 시험하였다. 래트에 PBS 중 2.5 ㎍의 탄수화물을 함유하는 2a-EPA 컨쥬게이트 또는 PBS 단독을 3주 간격으로 3회 피하 투여하였다(도 22). 결과는 대부분의 개체에서 유의한 혈청전환을 나타내고, 평균 log 역가가 대조군 주사(PBS)가 투여된 동물에 비해 면역화된 동물(di-BC 및 Flex-BC 그룹)에서 통계적으로 유의하게 더 높은 것을 나타낸다. 이러한 결과는 또한 면역원성 및 이에 의해 필시 효능에 대해 O 항원의 아세틸화가 필요하지 않는 것을 나타낸다. 아세틸화 2a-EPA 글리코컨쥬게이트(Flex-BC)를 동일 절차를 이용하여 약화된 S. 플렉스네리 2a 균주(균주 2457T)에서 생성시켰으나, 생성 균주 S. 플렉스네리 2a ΔwaaL은 p114 및 p293이 도입되었다. 균주 2457T는 이의 O 항원을 아세틸화시키는 것으로 공지되어 있다[58].
6.7
실시예
7: P.
아에루기노사
O11
O 항원 생성을 위한 삽입된 균주
O11 O 항원 클러스터를 표 1에 상술된 바와 같이 HR 영역 및 선택 카세트로 구성된 pDOC 플라스미드로 클로닝하였다. O 항원 클러스터를 올리고뉴클레오티드 2245/2247을 이용하여 P. 아에루기노사 균주 PA103으로부터 증폭시켰다(표 3 참조). 균주 작제를 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. W3110 ΔwaaL로의 DNA 삽입물(wzz를 가짐)의 삽입을 O16 wzx의 부재 및 O11의 존재에 대한 PCR, 5' 및 3' 전이 영역 PCR, LPS 샘플의 은 염색, 및 P. 아에루기노사 항 그룹 E(O11) 형결정 혈청을 이용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 시험하였다. 제시된 예에서, 정확한 항생제 내성 표현형을 갖는 4개의 클론을 O11 O 항원 생성에 대해 시험하였고(A 내지 D, 레인 1-4), 이들은 항 그룹 E 혈청을 이용하여 분석하는 경우 약 34 kDa 크기에 해당하는 전기영동 이동을 갖는 통상적인 사다리 유사 O 항원 신호를 만들었다(도 23). 대조군으로서, wzz를 갖는 공여체 플라스미드 및 wzz를 갖지 않는 공여체 플라스미드를 함유하는 E. 콜리 DH5a 세포를 이용하였다(레인 5 및 6). 대조군 균주는 활성 waaL 유전자를 함유하고, 이에 따라 O11 Und-PP와 상이한 패턴을 나타내는 O11 LPS를 만든다(레인 1-4). 따라서, 신호는 더욱 강하고, 더 높은 분자량 범위에서 관찰된다. wzz의 부재하에서(레인 6), 신호는 더 작은 분자량으로 집중되고, 이는 E. 콜리 O16 wzz가 상기 기능을 효과적으로 진행시킬 수 있음을 나타낸다. 종합하면, 상기 결과는 E. 콜리에서의 P. 아에루기노사 O11 O 항원 클러스터의 성공적 삽입 및 기능적 발현을 나타내었다. 추가 데이터는 P. 아에루기노사 O11 wzz가 E. 콜리 DH5a에서 사슬 조절에 대해 활성이고, 이의 활성이 wzz 클래스의 E. 콜리 사슬 길이 조절인자 효소에 의해 기능적으로 대체될 수 있음을 나타낸다.
6.8.
실시예
8:
키메라
, 비-자연 클러스터의 삽입
그람 양성 캡슐 다당류 생성 및 E. 콜리에서 상기 다당류를 이용한 담체 단백질의 당화를 달성하였다[10]. CPS 구조를 갖는 재조합 O 항원을 제조하기 위해 O 항원 클러스터 단편 및 CPS 클러스터 단편으로 구성된 융합 작제물로 구성된 도입된 DNA에 의해 다당류를 합성하였다.
상기 작제된 키메라 클러스터를 Und-PP-CP5의 생산성을 시험하기 위해 W3110 유전체로 2개의 상이한 위치에 삽입하였다. 삽입을 유도하기 위해, 상이한 상동성 영역을 공여체 플라스미드로 클로닝하였다.
한 경우에서, 표적 부위는 상기 실시예에서와 유사한 W3110 rfb 클러스터였고, 즉, HR 영역은 O16 rfb 클러스터 내에 함유된 ORF로부터의 업스트림 및 다운스트림 영역이었다. pDOC-C에 HR 부위를 삽입하기 위해, pDOC-C를 HindIII 및 XhoI으로 분해하였고, 동일 효소로 절단된 어셈블리 PCR 생성물을 여기에 라이게이션시켰다. 어셈블리를 i) 올리고뉴클레오티드 1181 및 1182, 또는 ii) 1183 및 1184를 이용하여 생성된 2개의 PCR 생성물에 대해 올리고뉴클레오티드 1182 및 1184를 이용하여 수행하였고, 둘 모두의 경우에서 주형 DNA로서 W3110 ΔwaaL의 유전체 DNA를 이용하였다. 생성된 플라스미드는 p473이었다. Eco81I을 이용함에 의한 p473으로의 클로닝을 위해 플라스미드로부터의 키메라 CP5 생성 유전자 클러스터(p393, US2011/0274720 A1)를 증폭시키기 위해 올리고뉴클레오티드 1142 및 771(또는 1281)를 사용하여 p477(또는 p498)을 생성시켰다. p498을 O11 클러스터의 wzz 및 wzx가 상기 플라스미드에서 결실(wzz 및 wzx가 존재하는 p477과 비교하여)되도록 하는 방식으로 클로닝하였다.
다른 경우에서, 삽입을 ECA 유전자 wecA 및 wzzE에 플랭킹된 표적 부위에서 수행하였다. wecA는 상기 세포에서 이용가능한 Und-P에 대해 재조합 다당류와 경쟁할 수 있으므로, wecA의 결실이 더 높은 CP5 다당류 수율을 발생시키는 것으로 추론되었다. wecA 및 wzzE의 대체를 가능케 하는 공여체 플라스미드를 제조하기 위해, pDOC-C를 먼저 2개의 HR 영역으로 변형시킨 후, CP5 키메라 클러스터를 삽입하였다. 주형으로서 W3110 염색체 DNA를 이용하여 HR 영역 1 및 2를 증폭시키기 위해 올리고뉴클레오티드 1126 및 1129, 뿐만 아니라 1127 및 1128을 이용하였다. PCR 생성물을 올리고뉴클레오티드 1126 및 1127을 이용하여 어셈블리시키고, 어셈블리된 HR을 pDOC-C의 XhoI 및 HindIII 부위로 클로닝하여, p467을 생성시켰다. 플라스미드(p393, US2011/0274720 A1)로부터 키메라 CP5 생성 유전자 클러스터를 증폭시키기 위해 올리고뉴클레오티드 1142 및 771을 이용하였고, 해당 PCR 생성물을 p467의 Eco81I 부위로 클로닝하여 p471을 생성시켰다.
p471, p498, 및 p477을 이용한 둘 모두의 위치로의 삽입을 실시예 1에 기재된 바와 같이 상세하게 수행하였다. 공여체 및 헬퍼 플라스미드를 W3110 세포로 전기천공시키고, 세포를 상기 기재된 바와 같이 처리하였다. 정확한 삽입 위치를 확인하기 위해 콜로니 PCR 방법을 이용하였다. 삽입이 재조합 O 항원을 생성시킬 수 있는 균주를 생성시킨 것을 확인하기 위해, 삽입된 클론 및 대조군 세포로부터의 단백분해효소 K 처리된 세포 용해질을 SDS PAGE에 의해 분리시키고, 은에 의해 염색하거나, 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 항 CP5 특이적 항혈청으로 탐지시켰다. 대조군으로서, 상응하는 공여체 플라스미드를 함유하는 DH5α 세포 또는 CP5 변형된 O 항원을 발현하는 p393 코스미드를 함유하는 W3110 ΔwecA(US2011/0274720 A1)으로부터의 추출물을 분석하였다. 다양한 사다리 유사 신호 강도가 수득되었고(도 24), 공여체 플라스미드 p471(레인 7)이 가장 강하였고, p498(레인 5)이 유사하게 강하였고, p477(레인 6)은 약했다. 레인 4는 키메라 CP5 클러스터를 함유하지 않고, HR1 및 2 영역만 존재하고, CP5 신호는 존재하지 않는 p473을 갖는 음성 대조군 세포를 함유한다. 저분자량의 사다리 유사 신호는 CP5가 아니라 ECA 다당류로 인한 것일 가능성이 가장 높은데, 이는 이들이 항 CP5 특이적 항혈청으로 검출되지 않기 때문이다. p498 및 p477은 p477에 존재하는 P. 아에루기노사 O11 wzz 및 wzx 유전자를 인코딩하는 작은 DNA 스트레치(stretch)에서 상이하다. 따라서, wzz-wzx가 프로모터 효과로 인해 당지질 생성을 제한하는 것으로 결론내려졌다. wzz-wzx를 포함하는 키메라 클러스터를 함유하는 p471은 전사되어 HR1에 존재하는 ECAS 프로모터를 형성할 가능성이 가장 높다. 따라서, p471 내의 위치는 CP5 생합성을 뒷받침한다. 삽입된 클론을 공여체 플라스미드로서 p471(레인 1), p477(레인 2), 및 p498(레인 3)을 이용하여 제조하였다. 신호는 일반적으로 훨씬 약했으나, 중간 사다리 밴드 및 저분자량 밴드의 특정 검출이 검출되었다. 강도는 가장 강한 공여체 플라스미드로부터 유래된 클론에 대해 가장 강했다(도 24). 따라서, 이러한 데이터는 제시된 삽입 방법이 다양한 선택가능한 위치로 적어도 16 kb까지의 길이의 DNA 단편을 삽입할 수 있는 것을 입증한다.
6.9. 실시예 9: 바이어컨쥬게이트를 생성하는 삽입된 올리고사카릴 트랜스페라제를 갖는 박테리아 균주
본 실시예는 바이오컨쥬게이트가 박테리아 숙주 세포 유전체로의 올리고사카릴 트랜스페라제를 인코딩하는 핵산의 삽입에 의해 유전학적으로 변형된 박테리아 숙주 균주에 의해 성공적으로 생성될 수 있음을 입증한다.
HA 태그를 갖는 C. 제주니 pglB 유전자를 Staby™Codon T7 기술(Delphi Genetics, Charleroi, Belgium)을 이용하여 E. 콜리 균주 MG1655(K12)의 유전체로 안정적으로 삽입시켰다. 삽입된 pglB를 갖는 E. 콜리 균주를 생성시키는 방법의 일부로서, pglB를 p114 플라스미드로부터 분리시키고, galK 유전자에 융합시키고, waaL 유전자 대신 숙주 세포 유전체로 삽입하였다. 생성된 E. 콜리 균주 MG1655 waaL::pglB-galK는 정확한 서열의 안정적으로 통합된 pglB를 함유하는 것으로 확인되었다.
바이오컨쥬게이트를 생성시키는 MG1655 waaL::pglB-galK의 능력을 평가하기 위해, 2개의 플라스미드를 균주로 도입시켰다. 첫번째 플라스미드 p64는 시겔라 디센테리에 O1 유전자 클러스터를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 두번째 플라스미드 p271은 히스티딘 태그를 갖는 EPA 담체 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 숙주 세포를 4시간 동안 또는 밤새 배양하고, 분리시키고, 항-HA 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석에 적용시켜 pglB 생성을 확인하고, 항-his 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석에 적용시켜 EPA 생성을 확인하였다. 웨스턴 블롯은 플라스미드 p64 및 p271을 발현하는 MG1655 waaL::pglB-galK 숙주 균주가 EPA 및 pglB 단백질 둘 모두를 성공적으로 생성한 것을 입증하였다. 도 25를 참조하라. 중요하게는, O1-EPA 바이오컨쥬게이트를 확인하였고, 이는 숙주 세포에서 기능성 올리고사카릴 트랜스페라제를 생성시키는 삽입된 pglB 유전자의 능력을 나타내며, 따라서 pglB 유전자가 박테리아 숙주 세포로 삽입될 수 있고, 이의 기능을 유지할 수 있는 것을 나타낸다. 도 25를 참조하라.
바이오컨쥬게이트를 생성시키는 MG1655 waaL::pglB-galK의 능력을 평가하기 위한 또 다른 실험에서, 다양한 플라스미드를 균주로 도입시켰다. 첫번째 플라스미드 p281은 시겔라 디센테리에 O1 유전자 클러스터를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 두번째 플라스미드 p293은 EPA 담체 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 숙주 세포를 바이오리액터에서 16시간 이하 동안 배양하였다. 다양한 시점에서, pglB 및 EPA의 생성을 항-EPA 및 항-HA 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가하였다. 도 26에 제시된 바와 같이, 웨스턴 블롯은 플라스미드 p281 및 p293을 발현하는 MG1655 waaL::pglB-galK 숙주 균주가 EPA 및 pglB 단백질 둘 모두를 성공적으로 생성한 것을 입증하였다. 중요하게는, 플라스미드 p64 및 p271을 발현하는 MG1655 waaL::pglB-galK 숙주 균주로 관찰된 바에 따라, 플라스미드 p281 및 p293을 발현하는 MG1655 waaL::pglB-galK 숙주 균주가 O1-EPA 바이오컨쥬게이트를 생성시켰고, 이는 숙주 세포에서 기능성 올리고사카릴 트랜스페라제를 생성하는 삽입된 pglB 유전자의 능력을 나타내고, 이에 따라 pglB 유전자가 박테리아 숙주 세포로 삽입될 수 있고, 이의 기능을 유지할 수 있는 것을 나타낸다.
다음으로, 플라스미드 p281 및 p293을 발현하는 MG1655 waaL::pglB-galK 숙주 균주에 의해 생성된 O1-EPA 바이오컨쥬게이트를 바이오컨쥬게이트 정제 전략을 이용하여 성공적으로 분리시켰다. 도 26 참조. 간단히, 밤새 성장된 플라스미드 p281 및 p293을 발현하는 MG1655 waaL::pglB-galK 숙주 균주의 원형질막주위 분획으로부터 분리된 단백질을 첫번째 Q-Sepharose 컬럼 상을 흐르게 하였다. 결과를 나타내는 크로마토그램이 도 27에 제시되며, O1-EPA의 강한 생성이 관찰되었다(분획 A6-A9 및 삽입 이미지 참조). 분획을 SDS-PAGE 젤 상을 흐르게 한 후, 쿠마시 염색으로 O1-EPA 함유 분획을 확이하였다. 도 28 참조. O1-EPA에서 풍부한 것으로 확인된 분획 A6-A9를 푸울링시키고, 두번째 Q-Sepharose 컬럼 상을 흐르게 하였고, 두번째 컬럼으로부터 수득된 분획을 SDS-PAGE 젤에서 흐르게 한 후, 쿠마시 염색에 의해 O1-EPA 함유 분획을 확인하였다. 도 29 참조. 결과를 나타내는 크로마토그램이 도 30에 제시되며, O1-EPA의 강한 생성이 분획 B4-B6에서 관찰되었다. 최종적으로, O1-EPA에서 풍부한 것으로 확인된 분획 B4-B6을 푸울링시키고, Superdex 200 컬럼 상을 흐르게 한 후, 쿠마시 염색에 의해 정제된 O1-EPA 바이오컨쥬게이트를 포함하는 분획을 확인하였다. 도 31에서 쿠마시 염색에 의해 제시된 분리된 O1-EPA 바이오컨쥬게이트의 최종 푸울이 매우 정제된 것으로 밝혀졌고(도 32 참조), 3-플라스미드 시스템을 이용하여 제조된 O1-EPA 바이오컨쥬게이트에 대해 동일한 품질인 것으로 입증되었으며, 여기서 pglB 유전자는 숙주 세포 유전체로의 삽입에 의해서가 아니라 플라스미드의 방식에 의해 E. 콜리 숙주 세포로 도입되었다.
결론으로서, 바이오컨쥬게이트가 바이오컨쥬게이트 생성의 필수 성분인 올리고사카릴 트랜스페라제를 유전체의 일부로서 안정적으로 발현하도록 조작된 박테리아 숙주 세포를 이용하여 성공적으로 생성될 수 있는 것으로 입증되었다. 유리하게는, 이종성 당화 기구의 사용에 의해 숙주 세포에서 바이오컨쥬게이트를 생성시키는 현재 공지된 시스템에서보다 상기 새로운 시스템을 이용하여 바이오컨쥬게이트 생성을 위해 더 적은 플라스미드가 필요하였다.
표 1: 삽입 균주.
a도 1 참조.
bHR1, galF와 rmlB 사이의 인터진 영역을 인코딩하는 W3110 rfb 클러스터의 rmlB의 1kb DNA 업스트림, 및 galF 유전자의 C-말단 단편
cHR2, E. 콜리 균주 W3110로부터 클로닝된 O16 rfb 클러스터 내의 마지막 유전자인 wbbL의 1.6 kb 다운스트림 DNA
d클로람페니콜 내성 카세트(clmR) 및 kan 내성 카세트(kanR)를 pKD3 및 pKD4로부터 클로닝되었다[13];
e rfb 클러스터의 서열이 공적인 경우, 인식자가 제공된다. rfb 클러스터가 rfb 클러스터의 공개된 서열 없이 임상 분리물 또는 균주로부터 클로닝된 경우, 가까운 공개된 서열이 표시되고, 별표*로 표지된다.
fS. 디센테리에 타입 I rfb 클러스터는 2개의 오페론으로 구성되고, 하나의 오페론은 rmlB-rfbQ(S. 디센테리에 유전체 내의 galF와 gnd 사이에 위치됨)로부터 유래되며, 두번째 오페론은 바이시스트론 오페론 rfpA 및 rfpB(hisH와 rfe 사이에 존재함(wecA))로 구성된다.
g플레시오모나스 시겔로이데스(Plesiomonas shigelloides) O17로부터 클로닝됨
h[10] 참조; 본 클러스터는 반복 단위 구조 내에서 스태필로코쿠스 아우레우스의 CP5 캡슐 다당류와 동일한 O 항원을 생성시킬 수 있다.
j2개 형태의 키메라 클러스터를 rfb 유전자좌로 삽입하였고, 하나는 P. 아에루기노사 PA103으로부터의 wzz-wzx 유전자를 함유하고, 하나는 P. 아에루기노사 PA103으로부터의 wzz-wzx 유전자가 결핍되어 있다.
표 2. 추가 삽입 균주
표 3. 올리고뉴클레오티드 목록
표 4: 호밍 엔도뉴클레아제의 목록
표 5: 복제 기점의 목록
표 6: 분자생물학에서 사용된 항생제
표 7: 박테리아 발현에서 사용된 유도성 프로모터
표 8: 박테리아 발현 균주
인용된 참고문헌
동등물:
본원에 개시된 방법, 숙주 세포, 및 조성물은 본원에 기재된 특정 구체예에 의한 범위 내로 제한되지 않는다. 또한, 기재된 것에 더한 방법, 숙주 세포, 및 조성물의 다양한 변형이 상기 설명 및 수반하는 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 상기 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
다양한 공개문헌, 특허 및 특허 출원이 본원에 인용되며, 이의 전체 개시내용은 참조로서 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> GlycoVaxyn AG
<120> METHODS OF HOST CELL MODIFICATION
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<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease CpaII
<400> 13
gggccgattg agacacggtc 20
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease CreI
<400> 14
ctgggttcaa aacgtcgtga gacagtttgg 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease CreI
<400> 15
gacccaagtt ttgcagcact ctgtcaaacc 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease DmoI
<400> 16
atgccttgcc gggtaagttc cggcgcgcat 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease DmoI
<400> 17
tacggaacgg cccattcaag gccgcgcgta 30
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease DreI
<400> 18
caaaacgtcg taagttccgg cgcg 24
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease DreI
<400> 19
gttttgcagc attcaaggcc gcgc 24
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease HmuI
<400> 20
agtaatgagc ctaacgctca gcaa 24
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease HmuI
<400> 21
tcattactcg gattgcgagt cgtt 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease HmuII
<400> 22
agtaatgagc ctaacgctca acaa 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease HmuII
<400> 23
tcattactcg gattgcgagt tgtt 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease LlaI
<400> 24
cacatccata accatatcat tttt 24
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease LlaI
<400> 25
gtgtaggtat tggtatagta aaaa 24
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease MsoI
<400> 26
ctgggttcaa aacgtcgtga gacagtttgg 30
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease MsoI
<400> 27
gacccaagtt ttgcagcact ctgtcaaacc 30
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease PI-PfuI
<400> 28
gaagatggga ggagggaccg gactcaactt 30
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease PI-PfuI
<400> 29
cttctaccct cctccctggc ctgagttgaa 30
<210> 30
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease PI-PkoII
<400> 30
cagtactacg gttac 15
<210> 31
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease PI-PkoII
<400> 31
gtcatgatgc caatg 15
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease PorI
<400> 32
gcgagcccgt aagggtgtgt acggg 25
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease PorI
<400> 33
cgctcgggca ttcccacaca tgccc 25
<210> 34
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease PpoI
<400> 34
taactatgac tctcttaagg tagccaaat 29
<210> 35
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease PpoI
<400> 35
attgatactg agagaattcc atcggttta 29
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease PI-PspI
<400> 36
tggcaaacag ctattatggg tattatgggt 30
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease PI-PspI
<400> 37
accgtttgtc gataataccc ataataccca 30
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease ScaI
<400> 38
tgtcacattg aggtgcacta gttattac 28
<210> 39
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease ScaI
<400> 39
acagtgtaac tccacgtgat caataatg 28
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease SceI
<400> 40
agttacgcta gggataacag ggtaatatag 30
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease SceI
<400> 41
tcaatgcgat ccctattgtc ccattatatc 30
<210> 42
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease PI-SceI
<400> 42
atctatgtcg ggtgcggaga aagaggtaat gaaatggca 39
<210> 43
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease PI-SceI
<400> 43
tagatacagc ccacgcctct ttctccatta ctttaccgt 39
<210> 44
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease SceII
<400> 44
ttttgattct ttggtcaccc tgaagtata 29
<210> 45
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease SceII
<400> 45
aaaactaaga aaccagtggg acttcatat 29
<210> 46
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease SceIII
<400> 46
attggaggtt ttggtaacta tttattacc 29
<210> 47
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease SceIII
<400> 47
taacctccaa aaccattgat aaataatgg 29
<210> 48
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease SceIV
<400> 48
tcttttctct tgattagccc taatctacg 29
<210> 49
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease SceIV
<400> 49
agaaaagaga actaatcggg attagatgc 29
<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease SceV
<400> 50
aataattttc ttcttagtaa tgcc 24
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease SceV
<400> 51
ttattaaaag aagaatcatt acgg 24
<210> 52
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease SceVI
<400> 52
gttatttaat gttttagtag ttgg 24
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease SceVI
<400> 53
caataaatta caaaatcatc aacc 24
<210> 54
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease SceVII
<400> 54
tgtcacattg aggtgcacta gttattac 28
<210> 55
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease SceVII
<400> 55
acagtgtaac tccacgtgat caataatg 28
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease Ssp6803I
<400> 56
gtcgggctca taacccgaa 19
<210> 57
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease Ssp6803I
<400> 57
cagcccgagt attgggctt 19
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease TevI
<400> 58
agtggtatca acgctcagta gatg 24
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease TevI
<400> 59
tcaccatagt tgcgagtcat ctac 24
<210> 60
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease TevII
<400> 60
gcttatgagt atgaagtgaa cacgttattc 30
<210> 61
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease TevII
<400> 61
cgaatactca tacttcactt gtgcaataag 30
<210> 62
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease TevIII
<400> 62
tatgtatctt ttgcgtgtac ctttaacttc 30
<210> 63
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease TevIII
<400> 63
atacatagaa aacgcacatg gaaattgaag 30
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease PI-TliI
<220>
<221> misc_feature
<222> 6, 12
<223> n = A,T,C or G
<400> 64
taygcngaya cngacggytt yt 22
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease PI-TliI
<220>
<221> misc_feature
<222> 6, 12
<223> n = A,T,C or G
<400> 65
atrcgnctrt gnctgcctaa ra 22
<210> 66
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease PI-TliII
<400> 66
aaattgcttg caaacagcta ttacggctat 30
<210> 67
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease PI-TliII
<400> 67
tttaacgaac gtttgtcgat aatgccgata 30
<210> 68
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease Tsp061I
<400> 68
cttcagtatg ccccgaaac 19
<210> 69
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease Tsp061I
<400> 69
gaagtcatac ggggctttg 19
<210> 70
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5-prime recognition site of homing endonuclease Vdi141I
<400> 70
cctgactctc ttaaggtagc caaa 24
<210> 71
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3-prime recognition site of homing endonuclease Vdi141I
<400> 71
ggactgagag aattccatcg gttt 24
Claims (67)
- 공여체 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드를 포함하는 숙주 세포로서,
(a) 헬퍼 플라스미드가 (i) 제 1 프로모터의 조절 하에 있는 람다 red 재조합효소를 인코딩하는 열린해독틀; 및 (ii) 제 2 프로모터의 조절 하에 있는 숙주 세포 유전체에 존재하지 않는 인지 서열을 갖는 제한 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 열린해독틀을 포함하고,
(b) 공여체 플라스미드가 (i) 5'으로부터 3'으로, (1) 제한 엔도뉴클레아제의 인지 서열; (2) 적어도 0.5 킬로베이스(kb)의 제 1 상동성 영역, (3) 적어도 8 kb의 이종성 삽입 DNA; 및 (4) 적어도 0.5 kb의 제 2 상동성 영역; 및 (ii) 역선택 마커(counterselection marker)를 포함하는, 숙주 세포. - 제 1항에 있어서, 이종성 삽입 DNA가 선택 마커를 포함하는 숙주 세포.
- 제 2항에 있어서, 선택 마커가 플립파제 인지 표적(flippase recognition target)(FRT) 부위에 플랭킹(flanking)된 숙주 세포.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 및 제 2 상동성 영역이 숙주 세포 유전체의 인접 영역에 상동성인 숙주 세포.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 상동성 영역이 적어도 2 kb인 숙주 세포.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 상동성 영역이 적어도 2 kb인 숙주 세포.
- 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 삽입 DNA가 적어도 20 kb인 숙주 세포.
- 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 인지 서열이 적어도 18개의 염기쌍을 포함하는 숙주 세포.
- 제 1항에 있어서, 제한 엔도뉴클레아제가 SceI인 숙주 세포.
- 제 1항에 있어서, 역선택 마커가 sacB인 숙주 세포.
- 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고사카릴 트랜스페라제를 추가로 포함하는 숙주 세포.
- 제 11항에 있어서, 상기 올리고사카릴 트랜스페라제가 숙주 세포에 이종성인 숙주 세포.
- 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 올리고사카릴 트랜스페라제가 원핵생물 올리고사카릴 트랜스페라제인 숙주 세포.
- 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 글리코실트랜스페라제를 추가로 포함하는 숙주 세포.
- 제 14항에 있어서, 상기 글리코실트랜스페라제가 숙주 세포에 대해 이종성인 숙주 세포.
- 제 15항에 있어서, 상기 이종성 글리코실트랜스페라제가 원핵생물 글리코실트랜스페라제인 숙주 세포.
- 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포에 자연적으로 존재하는 하나 이상의 유전자가 결실되거나 비활성화된 것인 숙주 세포.
- 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 삽입 DNA가 원핵생물 유기체의 rfb 클러스터를 포함하는 숙주 세포.
- 제 18항에 있어서, 상기 rfb 클러스터가 E. 콜리(E. coli) rfb 클러스터, 슈도모나스(Pseudomonas) rfb 클러스터, 살모넬라(Salmonella) rfb 클러스터, 예르시니아(Yersinia) rfb 클러스터, 프란시셀라(Francisella) rfb 클러스터, 클렙시엘라(Klebsiella) rfb 클러스터, 아시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii) 균주로부터의 rfb 클러스터, 시겔라(Shigella) rfb 클러스터, 또는 부르크홀데리아(Burkholderia) rfb 클러스터인 숙주 세포.
- 제 19항에 있어서, 상기 rfb 클러스터가 E. 콜리 rfb 클러스터인 숙주 세포.
- 제 20항에 있어서, 상기 E. 콜리 rfb 클러스터가 혈청형 O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19, O20, O21, O22, O23, O24, O25, O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45, O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73, O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, O111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144,O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186, 또는 O187의 E. 콜리 rfb 클러스터인 숙주 세포.
- 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 삽입 DNA가 원핵생물 유기체의 캡슐 다당류 유전자 클러스터를 포함하는 숙주 세포.
- 제 22항에 있어서, 상기 다당류 유전자 클러스터가 E. 콜리 균주, 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 균주, 스태필로코쿠스(Staphylococcus) 균주, 또는 부르크홀데리아(Burkholderia) 균주로부터의 다당류 유전자 클러스터인 숙주 세포.
- 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 삽입 DNA가 E. 콜리, 살모넬라(Salmonella), 슈도모나스(Pseudomonas), 클렙시엘라(Klebsiella), 아시네토박터(Acinetobacter), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 리스테리아(Listeria), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 보르데텔라 파라퍼투시스(Bordetella parapertussis), 부르크홀데리아 말레이(Burkholderia mallei) 및 슈도말레이(pseudomallei), 프란시셀라 튤라렌시스(Francisella tularensis), 또는 캄필로박터(Campylobacter)의 O 항원을 인코딩하는 숙주 세포.
- 제 24항에 있어서, 상기 E. 콜리의 O 항원이 O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19, O20, O21, O22, O23, O24, O25, O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45, O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73, O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, O111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144,O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186, 또는 O187인 숙주 세포.
- 제 24항에 잇어서, 상기 클렙시엘라의 O 항원이 K. 뉴모니아 혈청형 O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, 또는 O12인 숙주 세포.
- 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종성 삽입 DNA가 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi) 당지질, 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis) 필린 O 글리칸 또는 리포올리고당류(LOS), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) LOS, 리슈매니아 메이저(Leishmania major) 리포포스포글리칸, 또는 종양 관련 탄수화물 항원을 인코딩하는 숙주 세포.
- 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 N-당화를 위한 컨센서스 서열을 포함하는 담체 단백질을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 숙주 세포.
- 제 28항에 있어서, 담체 단백질을 인코딩하는 핵산이 숙주 세포에 대해 이종성인 숙주 세포.
- 제 28항 또는 제 29항에 있어서, 상기 담체 단백질이 P. 아에루기노사(P. aeruginosa)의 무독화된 외독소 A(EPA), CRM197, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, S. 아우레우스(S. aureus)의 무독화된 용혈소 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, E. 콜리 FimH, E. 콜리 FimHC, E. 콜리 열 민감 장독소, E. 콜리 열 민감 장독소의 무독화 변이체, 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB), 콜레라 독소, 콜레라 독소의 무독화된 변이체, E. 콜리 sat 단백질, E. 콜리 sat 단백질의 패신저 도메인, C. 제주니(C. jejuni) AcrA, 및 C. 제주니 자연 당단백질인 숙주 세포.
- 제 30항에 있어서, 상기 담체 단백질이 P. 아에루기노사의 무독화된 외독소 A(EPA)인 숙주 세포.
- 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 에스케리키아(Escherichia) 종, 시겔라(Shigella) 종, 클렙시엘라(Klebsiella) 종, 잔토모나스(Xhantomonas) 종, 살모넬라(Salmonella) 종, 예르시니아(Yersinia) 종, 락토코쿠스(Lactococcus) 종, 락토바실러스(Lactobacillus) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 코리네박테리움(Corynebacterium) 종, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종, 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 종, 스태필로코쿠스(Staphylococcus) 종, 바실러스(Bacillus) 종, 및 클로스트리듐(Clostridium) 종인 숙주 세포.
- 제 32항에 있어서, 상기 숙주 세포가 E. 콜리 종인 숙주 세포.
- 단백질의 생성에 적합한 조건하에서 제 28항 내지 제 33항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 담체 단백질 및 항원을 포함하는 글리코컨쥬게이트를 생성하는 방법.
- 제 34항의 방법에 의해 생성된 글리코컨쥬게이트.
- 제 35항에 있어서, 상기 글리코컨쥬게이트가 담체 단백질 및 항원을 포함하는 글리코컨쥬게이트.
- 제 36항에 있어서, 상기 항원이 (i) E. 콜리, 살모넬라, 슈도모나스, 클렙시엘라, 아시네토박터, 클라미디아 트라코마티스, 비브리오 콜레라, 리스테리아, 레지오넬라 뉴모필라, 보르데텔라 파라퍼투시스, 부르크홀데리아 말레이 및 슈도말레이, 프란시셀라 튤라렌시스, 또는 캄필로박터의 O 항원; (ii) 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스 피로게네스(Streptococcus pyrogenes), E. 콜리, 스트렙토코쿠스 아갈락티카에(Streptococcus agalacticae), 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)의 캡슐 다당류; 또는 (iii) 보렐리아 부르그도르페리 당지질, 나이세리아 메닌기티디스 필린 O 글리칸 또는 리포올리고당류(LOS), 헤모필루스 인플루엔자 LOS, 리슈매니아 메이저 리포포스포글리칸, 또는 종양 관련 탄수화물 항원인 글리코컨쥬게이트.
- 제 37항에 있어서, 상기 E. 콜리의 O 항원이 O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19, O20, O21, O22, O23, O24, O25, O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45, O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73, O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, O111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144,O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186, 또는 O187인 글리코컨쥬게이트.
- 제 37항에 있어서, 상기 클렙시엘라의 O 항원이 K. 뉴모니아 혈청형 O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, 또는 O12인 글리코컨쥬게이트.
- 제 36항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담체 단백질이 무독화된 EPA인 글리코컨쥬게이트.
- 제 35항 내지 제 40항 중 어느 한 항의 글리코컨쥬게이트를 포함하는 면역원성 조성물.
- 제 41항의 면역원성 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 감염을 치료하거나 예방하는 방법.
- 제 42항에 있어서, 상기 감염이 요로감염병원균 E. 콜리에 의한 감염인 방법.
- 제 41항의 면역원성 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법.
- 제 44항에 있어서, 상기 면역 반응이 병원체에 대한 면역 반응인 방법.
- 제 45항에 있어서, 상기 병원체가 E. 콜리, 살모넬라, 슈도모나스, 클렙시엘라, 아시네토박터, 클라미디아 트라코마티스, 비브리오 콜레라, 리스테리아, 레지오넬라 뉴모필라, 보르데텔라 파라퍼투시스, 부르크홀데리아 말레이, 부르크홀데리아 슈도말레이, 프란시셀라 튤라렌시스, 캄필로박터; 클로스트리듐, 스태필로코쿠스, 스트렙토코쿠스, 나이세리아 메닌지티디스, 칸디다 알비칸스, 헤모필루스 인플루엔자, 엔테로코쿠스 파에칼리스; 보렐리아 부르그도르페리 또는 리슈매니아 메이저인 방법.
- 제 42항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
- 공여체 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드를 포함하는 키트로서,
(a) 헬퍼 플라스미드가 (i) 제 1 프로모터의 조절 하에 있는 람다 red 재조합효소를 인코딩하는 열린해독틀; 및 (ii) 제 2 프로모터의 조절 하에 있는 숙주 세포 유전체에 존재하지 않는 인지 서열을 갖는 제한 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 열린해독틀을 포함하고,
(b) 공여체 플라스미드가 (i) 5'으로부터 3'으로, (1) 제한 엔도뉴클레아제의 인지 서열; (2) 적어도 0.5 킬로베이스(kb)의 제 1 상동성 영역, (3) 적어도 8 kb의 이종성 삽입 DNA; 및 (4) 적어도 0.5 kb의 제 2 상동성 영역; 및 (ii) 역선택 마커(counterselection marker)를 포함하는, 키트. - (i) 제 1 프로모터의 조절 하에 있는 람다 red 재조합효소를 인코딩하는 열린해독틀; 및
(ii) 제 2 프로모터의 조절 하에 있는 숙주 세포 유전체에 존재하지 않는 인지 서열을 갖는 제한 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 열린해독틀을 포함하는, 분리된 플라스미드. - (i) 5'으로부터 3'으로, (1) 제한 엔도뉴클레아제의 인지 서열; (2) 적어도 0.5 킬로베이스(kb)의 제 1 상동성 영역, (3) 적어도 8 kb의 이종성 삽입 DNA; 및 (4) 적어도 0.5 kb의 제 2 상동성 영역; 및 (ii) 역선택 마커를 포함하는, 분리된 플라스미드.
- 제 49항 및 제 50항의 플라스미드를 숙주 세포에 도입시키는 것을 포함하는 숙주 세포를 제조하는 방법으로서, 상기 숙주 세포가 공여체 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드를 포함하는, 방법.
- 제 51항에 있어서, 상기 도입이 형질전환을 포함하는 방법.
- 공여체 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드를 포함하는 분리된 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포가 (i) 숙주 세포로 공여체 플라스미드를 도입시키고, (ii) 숙주 세포로 헬퍼 플라스미드를 도입시키는 방법에 따라 도입되는, 분리된 숙주 세포.
- 제 53항에 있어서, 헬퍼 플라스미드가 (i) 제 1 프로모터의 조절 하에 있는 람다 red 재조합효소를 인코딩하는 열린해독틀; 및 (ii) 제 2 프로모터의 조절 하에 있는 숙주 세포 유전체에 존재하지 않는 인지 서열을 갖는 제한 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 열린해독틀을 포함하는 숙주 세포.
- 제 53항 또는 제 54항에 있어서, 공여체 플라스미드가 (i) 5'으로부터 3'으로, (1) 제한 엔도뉴클레아제의 인지 서열; (2) 적어도 0.5 킬로베이스(kb)의 제 1 상동성 영역, (3) 적어도 8 kb의 이종성 삽입 DNA; 및 (4) 적어도 0.5 kb의 제 2 상동성 영역; 및 (ii) 역선택 마커를 포함하는 숙주 세포.
- 제 53항 내지 제 55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도입이 형질전환을 포함하는 숙주 세포.
- 제 53항 내지 제 56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공여체 플라스미드 및 상기 헬퍼 플라스미드가 숙주 세포에 별개로 도입되는 숙주 세포.
- 제 53항 내지 제 56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공여체 플라스미드 및 상기 헬퍼 플라스미드가 동시에 숙주 세포에 도입되는 숙주 세포.
- 올리고사카릴 트랜스페라제를 인코딩하는 이종성 유전자가 숙주 세포의 유전체에 삽입된, 분리된 숙주 세포.
- 제 59항에 있어서, 상기 숙주 세포가 E. 콜리인 분리된 숙주 세포.
- 제 59항 또는 제 60항에 있어서, 상기 유전자가 C. 제주니 pglB 유전자인 분리된 숙주 세포.
- 제 59항 내지 제 61항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포 내의 이종성 유전자의 카피수가 1, 2, 3, 4, 또는 5인 분리된 숙주 세포.
- 제 62항에 있어서, 숙주 세포 내의 이종성 유전자의 카피수가 1인 분리된 숙주 세포.
- 제 59항 내지 제 63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr)을 포함하는 담체 단백질을 포함하고, X가 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있는 분리된 숙주 세포.
- 제 64항에 있어서, 상기 담체 단백질이 상기 숙주 세포에 대해 이종성인 분리된 숙주 세포.
- 제 64항 또는 제 65항에 있어서, 상기 담체 단백질이 슈도모나스 외독소 A, 콜레라 독소 B, AcrA, HlA 또는 ClfA인 분리된 숙주 세포.
- 단백질의 생성에 적합한 조건하에서 제 59항 내지 제 66항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, N-당화된 단백질을 생성시키는 방법.
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