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CN106801029B - 一株重组大肠杆菌及其在制备抗志贺氏菌的糖疫苗中的应用 - Google Patents

一株重组大肠杆菌及其在制备抗志贺氏菌的糖疫苗中的应用 Download PDF

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CN106801029B CN201710046262.5A CN201710046262A CN106801029B CN 106801029 B CN106801029 B CN 106801029B CN 201710046262 A CN201710046262 A CN 201710046262A CN 106801029 B CN106801029 B CN 106801029B
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Abstract

本发明公开了一种能表达痢疾志贺氏菌1型病原菌的脂多糖合成酶基因簇的重组大肠杆菌，该菌含有痢疾志贺氏菌1型病原菌rfb基因簇中的rfbR(rhamnosyltransferase)，rfbQ(rhamnosyltransferase)和orf9(galactosyltransferase)，其基因型是W3110Δwbbl/p‑rfp+p‑O‑Ag。本发明还公开了所述菌在制备抗痢疾志贺氏菌1型病原菌的糖蛋白疫苗中的应用。此重组大肠杆菌可以生产痢疾志贺氏菌1型病原菌的脂多糖结构，以该菌为平台，可以进一步低成本高效的生产抗志贺氏菌1型病原菌的糖蛋白疫苗，具有良好的工业开发和应用前景。

Description

一株重组大肠杆菌及其在制备抗志贺氏菌的糖疫苗中的应用
技术领域
本发明涉及一株重组大肠杆菌及构建方法与应用，尤其涉及一种能表达痢疾志贺氏菌1型病原菌的脂多糖合成酶基因簇的重组大肠杆菌及其在制备抗痢疾志贺氏菌1型病原菌的糖蛋白疫苗中的应用。属于生物技术、基因工程和微生物发酵领域。
背景技术
细菌性痢疾是由志贺菌属(痢疾杆菌)引起的肠道传染病，以严重的结肠发炎为特征，同时伴有全身毒血症症状，严重者可引发感染性休克和(或)中毒性脑病。全世界每年大约有1.65亿细菌性痢疾病例，造成超过110万人死亡，并且70％左右的发作症状表现在低于5岁的儿童身上。细菌性痢疾是我国的常见病、多发病，发病率位于法定的甲、乙类传染病中第四位，至少在10个省、区发生过不同规模流行，应引起足够重视。
按抗原结构和生化反应不同，志贺菌属被分为4个血清型，其中痢疾志贺氏菌1型病原菌(Shigella dysenteriae serotype 1，S.dysenteriae 1)是严重的细菌性痢疾流行病爆发的最主要的病原体，会导致严重的并发症(例如出血性结肠炎、败血症、溶血性尿毒综合症和紫癜)和高死亡率。对痢疾志贺氏菌1型病原菌有效的疫苗是世界卫生组织建议优先发展的疫苗之一。
S.dysenteriae 1脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是一类能够引起宿主免疫反应的表面抗原，可用于制备抗细菌性痢疾的疫苗。S.dysenteriae 1LPS的生物合成基因位于两个无关联的基因位点中，一个基因rfp位点存在于9kb的多拷贝质粒上，另一个基因位点存在于染色体上的rfb基因簇。研究将整个rfb基因簇的8个基因和rfp基因共同导入无毒性的鼠肠道沙门菌肠道亚种伤寒血清型菌株(Salmonella enterica subspeciesenterica serotype Typhi，S.Typhi)中，可以产生典型的S.dysenteriae 1的LPS，并且对宿主有一定的保护免疫。缺点是基因簇过大不容易转化和后期改造。
经检索，依赖于Wzy的合成途径，将含有S.dysenteriae 1rfbR(rhamnosyltransferase)，rfbQ(rhamnosyltransferase)，orf9(galactosyltransferase)基因的部分基因簇和rfp(galactosyltransferase)基因导入E.coli K-12W3110，实现对S.dysenteriae 1LPS进行异源表达的文献或专利还未见报。
发明内容
针对现有方法的不足，本发明要解决的问题是提供一株重组大肠杆菌，其可以表达痢疾志贺氏菌1型(S.dysenteriae 1)病原菌的胞外多糖，以其为平台可以制备抗痢疾志贺氏菌1型病原菌的糖蛋白疫苗。
本发明的技术方案是基于痢疾志贺氏菌1型病原菌和大肠杆菌的脂多糖(LPS)的结构和合成途径相似的特点，采用在大肠杆菌中表达来源于痢疾志贺氏菌1型病原菌基因组上的rfb基因簇中的rfbR(rhamnosyltransferase)，rfbQ(rhamnosyltransferase)和orf9(galactosyltransferase)三个基因，来源于痢疾志贺氏菌1型病原菌的9kb的多拷贝游离质粒上的rfp(galactosyltransferase)基因，利用大肠杆菌的核苷酸寡糖作为供体获得痢疾志贺氏菌1型病原菌的脂多糖结构，为进一步生产抗痢疾志贺氏菌1型病原菌的糖疫苗提供平台。
本发明所述的重组大肠杆菌是一种能表达痢疾志贺氏菌1型病原菌的脂多糖合成酶基因簇的重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌含有痢疾志贺氏菌1型病原菌rfb基因簇中的rfbR(rhamnosyltransferase)，rfbQ(rhamnosyltransferase)和orf9(galactosyltransferase)，其基因型是W3110Δwbbl/p-rfp+p-O-Ag。
本发明所述能表达痢疾志贺氏菌1型病原菌的脂多糖合成酶基因簇的重组大肠杆菌的构建方法，步骤是：
构建含痢疾志贺氏菌1型病原菌rfb基因簇中的rfbR(rhamnosyltransferase)，rfbQ(rhamnosyltransferase)和orf9(galactosyltransferase)三个基因的表达载体p-O-Ag，再构建rfp基因的表达载体p-rfp，然后将所述构建的重组质粒p-O-Ag和p-rfp共转化大肠杆菌K12W3110，即得到能表达痢疾志贺氏菌1型病原菌的脂多糖合成酶基因簇的重组大肠杆菌；
其中，所述包含有rfbR(rhamnosyltransferase)，rfbQ(rhamnosyltransferase)和orf9(galactosyltransferase)三个基因的rfb基因簇O-Ag来源于痢疾志贺氏菌1型病原菌的基因组，其表达rfb基因簇的载体为pACT3；所述rfp基因存在于痢疾志贺氏菌1型病原菌中的9Kb游离质粒，其表达rfp基因的载体为pET15b；所述大肠杆菌K-12W3110，由于插入子IS5的插入从而打断了WbbL的功能，其基因型为W3110Δwbbl。
具体的，上述能表达痢疾志贺氏菌1型病原菌的脂多糖合成酶基因簇的重组大肠杆菌的构建方法是：
1.O-Ag基因簇表达载体的构建
基本方法是以痢疾志贺氏菌1型病原菌基因组为模板，克隆O-Ag基因簇，将所获得的O-Ag部分基因簇插入到线性化pACT3质粒中，从而获得O-Ag基因簇的表达载体p-O-Ag。
2.rfp基因表达载体的构建
基本方法是以志贺氏菌1型病原菌基因组为模板，克隆rfp基因，将所克隆获得的rfp插入质粒pET15b中，从而获得rfp的表达载体p-rfp。
3.重组大肠杆菌菌株的构建
基本方法是将所构建的重组质粒p-O-Ag和p-rfp共转化大肠杆菌K-12W3110，从而获得表达O-Ag基因簇，过量表达rfp的重组大肠杆菌。
本发明所述的能表达痢疾志贺氏菌1型病原菌的脂多糖合成酶基因簇的重组大肠杆菌在制备抗痢疾志贺氏菌1型病原菌的糖蛋白疫苗中的应用。
构建的病原菌LPS的E.coli表达平台，可以用于生产糖疫苗或更有效和安全的糖蛋白疫苗。生物法合成的糖蛋白疫苗是在E.coli表达平台中将细菌多糖如脂多糖或荚膜多糖连接到具有免疫原性的载体蛋白上，通过引发依赖于T细胞的免疫应答从而提供长时间持续的免疫应答。糖蛋白疫苗被认为是最有效和最安全的抗病原菌疫苗之一，具有广阔的应用前景。
本发明公开的重组大肠杆菌是基于E.coli K-12W3110和S.dysenteriae 1LPS的合成都属于依赖于Wzy的合成途径，因此本发明将含有S.dysenteriae 1rfbR(rhamnosyltransferase)，rfbQ(rhamnosyltransferase)，orf9(galactosyltransferase)基因的部分基因簇和rfp(galactosyltransferase)基因导入E.coli K-12W3110，成功对S.dysenteriae 1LPS进行了异源表达。这种方法也适用于异源合成其他病原菌的LPS，具有非常重要的应用价值。
附图说明
图1.S.dysenteriae 1LPS结构改造的示意图。
图2.p-O-Ag表达载体图谱。
图3.p-rfp表达载体图谱。
图4.银染及Western Bloting分析重组大肠杆菌的脂多糖。
其中：M：低分子量蛋白标准
1：S.dysenteriae 1LPS
2：大肠杆菌K12W3110LPS
3：重组大肠杆菌(W3110Δwbbl/p-rfp+p-O-Ag)LPS。
图5.离子色谱分析重组大肠杆菌的O-抗原组成。
其中：1：Rha；2：Gal；3：Glc；4：GlcNAc。
具体实施方式
一般性说明：如下实施例所涉及的限制性内切酶、DNA聚合酶、核酸分子量标准1kbMarker、蛋白分子量标准(12-120kDa)购自Thermo公司；T4ligase购自Takara公司；质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收DNA片段试剂盒购自Omega公司，操作完全按照相应说明书进行。质粒构建中基因测序由华大基因公司完成。质粒pACT3和pET15b均来源于Novagen公司；出发菌大肠杆菌K-12W3110来源于Invitrogen公司；Top10感受态细胞购自鼎国生物技术有限公司；LPS(Lipopolysaccharide)Extraction试剂盒购自iNtRON BIOTECHNOLOGY公司；痢疾志贺氏菌O-抗原诊断血清购自天津生物芯片技术有限责任公司；HRP标记羊抗兔IgG购自KPL公司；痢疾志贺氏菌1型病原菌(S.dysenteriae 1)购自山东省疾病预防控制中心。CaCl2购自Sigma公司，其他试剂和耗材购自国内各试剂公司。实施例中的其他实验方法及试剂如无特殊说明，均为本领域常规方法与市售试剂。
所述LB培养基为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。
所述SOC培养基为：蛋白胨2g/L，酵母粉0.5g/L，NaCl 0.0585g/L，KCl 0.0186g/L，MgCl2 0.203g/L，MgSO4 0.246g/L，葡萄糖20mmol/L。
实施例1、O-Ag基因簇表达载体的构建
根据NCBI公布的痢疾志贺氏菌1型病原菌基因组序列设计引物：
S.d-F-SmalI：5’-TCCCCCGGGATGAATAAATATTGTATCTTAGTA-3’
S.d-R-XbaI：5’-GCTCTAGATCACATTAATGCTACCAAAAAGAGT-3’
以痢疾志贺氏菌1型病原菌基因组为模板，PCR克隆出部分O-Ag基因簇，该基因簇含有rfbR，rfbQ和orf9三个基因。PCR反应体系如下：(引物浓度为20μmol/L)
Figure BDA0001216311830000041
PCR反应条件：95℃预变性3min，95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2.5min，30个循环后72℃延伸10min，16℃保存。
将克隆的O-Ag基因簇片段分别利用核酸内切酶SmalI和XbaI消化处理，同时将质粒载体pACT3也分别利用核酸内切酶SmalI和XbaI消化处理。将消化处理的O-Ag片段和pACT3质粒载体利用琼脂糖凝胶试剂盒回收，然后利用T4连接酶连接。
连接体系为10μl：
O-Ag片段：6μl；
pACT3载体：2μl；
10×Buffer：1μl；
T4连接酶：1μl。
16℃连接12h后，将10μl的连接液转化大肠杆菌Top10感受态细胞。转化过程为：将10μl的连接液加入100μl的Top10感受态细胞中，混匀。冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2min，加入900μl的SOC培养基，37℃，100r/min，孵化1h，涂布氯霉素抗性平板，培养16h，挑取转化子，提取质粒验证。然后进一步测序验证O-Ag基因簇的正确，从而获得重组质粒p-O-Ag。见图2。
实施例2、rfp基因表达载体的构建
根据NCBI公布的痢疾志贺氏菌1型病原菌基因组序列设计引物：
15b-F-NdeI：5’-GGAATTCCATATGATGAAGATCTCAATAATAGGGAA-3’
15b-R-BamHI：5’-CGGGATCCTTAATCAGGAATCCCTAGTA-3’
以痢疾志贺氏菌1型病原菌基因组为模板，PCR克隆出rfp基因。PCR反应体系如下：(引物浓度为20μmol/L)
Figure BDA0001216311830000051
PCR反应条件：95℃预变性3min，95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2.5min，30个循环后72℃延伸10min，16℃保存。
将克隆的rfp基因片段分别利用核酸内切酶NdeI和BamHI消化处理，同时将质粒载体pET15b也分别利用核酸内切酶NdeI和BamHI消化处理。将消化处理的rfp片段和pET15b质粒载体利用琼脂糖凝胶试剂盒回收，然后利用T4连接酶连接。
连接体系为10μl：
rfp基因片段：6μl；
pET15b载体：2μl；
10×Buffer：1μl；
T4连接酶：1μl。
16℃连接12h后，将10μl的连接液转化大肠杆菌Top10感受态细胞。转化过程为：将10μl的连接液加入100μl的Top10感受态细胞中，混匀。冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2min，加入900μl的SOC培养基，37℃，100r/min，孵化1h，涂布氨苄青霉素抗性平板，培养16h，挑取转化子，提取质粒验证。然后进一步测序验证rfb基因的正确，从而获得过重组质粒p-rfp。见图3。
实施例3、重组大肠杆菌菌株的构建
(1)感受态E.coli K-12W3110的制备
(I)菌体E.coli K-12W3110在5mL试管中37℃200r/min过夜培养；
(II)以1％的接种量将上述菌液接种于50mL LB培养基，37℃，200r/min培养2-3h，至OD600＝0.3-0.4(0.36最佳，一般不能超过0.4)；
(III)将菌液转移到50mL离心管中(离心管无菌并4℃遇冷)，冰浴20min，让细胞停止生长，4℃4000r/min离心10min；
(IV)沉淀用适量预冷的CaCl2重悬，4℃4000r/min离心5-10min，弃上清；
(V)沉淀再用适量预冷的CaCl2重悬，冰浴1h,4℃4000r/min离心10min，弃上清；
(VI)用2mL预冷的CaCl2重悬，分装感受态。
(2)重组大肠杆菌菌株的构建
分别将上述所构建的质粒p-O-Ag和p-rfp共转化大肠杆菌K-12W3110感受态细胞，使用氨苄青霉素(终浓度为100μg/mL)和氯霉素(终浓度为50μg/mL)筛选获得重组菌株K-12W3110/p-O-Ag+p-rfp。
实施例4、重组大肠杆菌脂多糖(LPS)的提取与分析
(1)重组大肠杆菌的发酵
挑取所构建的重组菌株(K-12W3110/p-O-Ag+p-rfp)单菌落至装有5mL的LB培养基的25mL的试管中，氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，氯霉素浓度为50μg/mL，37℃，200r/min，培养12h。
将过夜培养的菌液按照1％(v/v)的接种量接入装有50mL LB培养基的100mL的三角瓶中，氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，氯霉素浓度为50μg/mL，37℃，200r/min。
待菌液OD600＝0.6时，加入终浓度为0.2mM IPTG，16℃，200r/min培养20h诱导表达。
大肠杆菌K12W3110出发菌株同时诱导作为阴性对照；病原菌S.dysenteriae 1在37℃，200r/min过夜培养做为阳性对照。
(2)脂多糖(LPS)的提取
将过夜培养的菌液常温13000r/min离心30s，弃掉所有上清液，使用LPS提取试剂盒提取重组大肠杆菌的LPS。
(I)菌体加入1mL的Lysis Buffer并且充分涡旋直至细胞团消失；
(II)加入200μL氯仿，充分涡旋10-20s，在室温孵育5min；
(III)4℃13,000r/min离心10min，转移400μL的上清液到新的EP管，注意不要吸到沉淀；
(IV)加入800μL Purification Buffer，充分混匀，-20℃孵育10min；
(V)4℃13,000r/min离心15min，弃上清；
(VI)用1mL 70％(w/v)乙醇洗涤LPS沉淀物，4℃13,000r/min离心3min，弃上清，室温晾干；
(VII)在LPS沉淀物中加入50μL 10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)溶解LPS，煮沸2min；
(VIII)加入2.5μL蛋白酶K溶液(30mg/mL)，50℃处理30min。
(3)脂多糖(LPS)的分析
提取纯化的脂多糖取样进行SDS-PAGE分析，利用银染和Western Blotting进行鉴定。Western Blotting检测采用痢疾志贺氏菌O抗原诊断血清作为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗，进行检测分析。脂多糖因为由于添加了链长不等的O抗原而显示出梯状条带，只有S.dysenteriae 1和重组大肠杆菌提取的LPS可以特异性的被痢疾志贺氏菌O抗原诊断血清所识别。阴性对照E.coli K-12W3110由于插入子IS5的插入打断了WbbL的功能，形成了O16缺陷型。这样的结果就是E.coli K-12W3110LPS的末端只有一个GlcNAc残基，并不能被痢疾志贺氏菌O抗原诊断血清所识别。结果见图4。
实施例5、重组大肠杆菌O-抗原(O-PS)的提取与分析
(1)重组大肠杆菌O-抗原(O-PS)的提取
(I)20g细胞沉淀(5g/L)用200mL 50％(w/v)苯酚在65℃下萃取15min；
(II)4℃下10,000g离心30min；
(III)收集上清水溶液，用三蒸水透析去除苯酚，然后透析液冻干；
(IV)冻干粉末溶于20mL 0.02M醋酸钠(pH7.0)中，分别用DNase、RNase和蛋白酶K在37℃处理2h；
(V)去除沉淀(4℃下10,000g离心30min)，溶液用110,000g 4℃超高速离12h；
(VI)离心所得胶状物用三蒸水溶解，冻干制备LPS；
(VII)纯化LPS用1％乙酸100℃处理1.5h；
(VIII)12,000g离心30min去除沉淀；
(IX)用Bio-Gel P-2column纯化上清可制备O-PS。
(2)重组大肠杆菌O-抗原(O-PS)的单糖组分分析
提取的O-PS用3M TFA 110℃处理6h，然后使用离子色谱对O-PS的单糖组分进行定性检测。
检测方法：标准品、样品、样品和标准品的混合物在同样的条件下洗脱，根据保留时间，峰值和峰面积的变化判断样品中是否含有这种标品。
检测器：Dionex ED-50，USA；分离柱：Dionex Carbo PacTM PA1BioLCTM(2X250mm)；保护柱：Carbo PacTM PA-100G(2X50mm)。
流动相：10mM NaOH，200mM NaAc；流速：0.3mL/min。结果见图5。
根据以上重组大肠杆菌提取的LPS和O-PS的测定可得出结论，本发明所述的重组大肠杆菌可以生产痢疾志贺氏菌1型病原菌的脂多糖结构，以此为平台可以进一步生产抗志贺氏菌1型病原菌的糖蛋白疫苗。

Claims (3)

1.一种能表达痢疾志贺氏菌1型病原菌的脂多糖合成酶基因簇的重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌含有痢疾志贺氏菌1型病原菌rfb基因簇中的rfbR(rhamnosyltransferase)，rfbQ(rhamnosyltransferase)和orf9(galactosyltransferase)，其基因型是W3110Δwbbl/p-rfp+p-rfbR-rfbQ-orf9。
2.权利要求1所述能表达痢疾志贺氏菌1型病原菌的脂多糖合成酶基因簇的重组大肠杆菌的构建方法，步骤是：
构建含痢疾志贺氏菌1型病原菌rfb基因簇中的rfbR(rhamnosyltransferase)，rfbQ(rhamnosyltransferase)和orf9(galactosyltransferase)三个基因的表达载体p-O-Ag，再构建rfp基因的表达载体p-rfp，然后将所述构建的重组质粒p-O-Ag和p-rfp共转化大肠杆菌K12W3110，即得到能表达痢疾志贺氏菌1型病原菌的脂多糖合成酶基因簇的重组大肠杆菌；
其中，所述包含有rfbR(rhamnosyltransferase)，rfbQ(rhamnosyltransferase)和orf9(galactosyltransferase)三个基因的rfb基因簇O-Ag来源于痢疾志贺氏菌1型病原菌的基因组，其表达rfb基因簇的载体为pACT3；所述rfp基因存在于痢疾志贺氏菌1型病原菌中的9Kb游离质粒，其表达rfp基因的载体为pET15b；所述大肠杆菌K-12W3110，由于插入子IS5的插入从而打断了WbbL的功能，其基因型为W3110Δwbbl。
3.权利要求1所述能表达痢疾志贺氏菌1型病原菌的脂多糖合成酶基因簇的重组大肠杆菌在制备抗痢疾志贺氏菌1型病原菌的糖蛋白疫苗中的应用。
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