CN102851226A - 一株脂多糖合成缺陷的无毒福氏志贺氏菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株脂多糖合成缺陷的无毒福氏志贺氏菌及其构建方法。本发明提供重组菌A，为去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒和所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因得到的重组菌。本发明的实验证明，本发明首先依据质粒不相容原理将野生福氏志贺菌2a 301株的毒力大质粒驱除，构建得到了毒力大质粒无痕缺失突变株301ΔpCP，即一株无毒福氏志贺氏菌，然后利用基于λ噬菌体Red重组酶作用的同源重组技术，靶基因被抗性基因置换下来；随后抗性基因通过转座酶的作用从宿主菌种脱落，从而得到无毒志贺氏菌的waaI缺失株。

Description

一株脂多糖合成缺陷的无毒福氏志贺氏菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株脂多糖合成缺陷的无毒福氏志贺氏菌及其构建方法。

背景技术

志贺氏菌(Shigella spp.)俗称痢疾杆菌，作为一种具有高度传染性革兰氏阴性肠道致病菌，主要通过侵入人结肠上皮细胞最终定位于大肠，而引起典型细菌性痢疾(发热、腹痛、里急后重、大便脓血)，而毒力大质粒则是其致病性的最主要的因素，包含有大概32个与毒力有关的基因，主要包括与III型分泌系统有关的mxi-spa基因，与细菌侵入上皮细胞密切相关的ipaBCD，以及ipgC等毒力基因。

志贺氏菌感染剂量极低(10-100个细菌)，2010年我国卫生部公布的全年法定报告传染病疫情中，细菌性痢疾发病数位居第四，其中福氏2a型占到细菌性痢疾总数的50-70％，次于病毒性肝炎，肺结核和梅毒。目前治疗痢疾的主要方式是抗生素，但不同菌群及血清型之间虽然无交叉免疫，但存在交叉抗药性，加上临床分离多重耐药菌株的不断增加，常规的抗生素治疗遇到了巨大的挑战；由于急性期治疗不及时、对耐药菌株用药不当、治疗不彻底等原因可导致急性菌痢转变成慢性菌痢，故对细菌性痢疾的治疗方式受到越来越严峻的挑战。因此，开发针对细菌的多糖疫苗重新引起了人们的研究兴趣。

在疫苗生产中，通常是使用的减毒(或无毒)病原菌(病毒)，所以需获得无毒菌株，而志贺氏菌的毒力大质粒是其致病性的主要因素。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种重组菌A。

本发明提供的重组菌A，为去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒和所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因得到的重组菌。

上述福氏2a志贺氏菌为福氏2a志贺氏菌301，上述毒力大质粒为pCP301。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述重组菌A的方法，包括如下步骤：去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒和所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因，得到重组菌A。

上述方法中，所述去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒和所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因为依次去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒和所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因。

上述方法中，所述去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒的方法包括如下步骤：

1)将与所述毒力大质粒不相容的质粒导入所述福氏2a志贺氏菌中，得到中间重组菌1(通过抗生素抗性筛选)；

2)去除所述中间重组菌1中的所述与毒力大质粒不相容的质粒，得到去除毒力大质粒的重组菌B；

所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因的方法包括如下步骤：

3)将抗性筛选标记物基因替换掉所述重组菌B基因组中的O-抗原连接酶基因，得到去除O-抗原连接酶基因的中间重组菌2；

4)去除所述中间重组菌2中的所述抗性筛选标记物基因，得到所述重组菌A。

上述方法中，步骤2)包括如下步骤：在40℃-42℃培养所述中间重组菌1，以去除其中的毒力大质粒，得到去除毒力大质粒的重组菌B；所述培养为至少培养3代，所述毒力大质粒为pCP301；

步骤3)包括如下步骤：先将含有编码λ-Red重组系统所需酶的质粒导入所述重组菌B，得到中间重组菌3，再将含有所述抗性筛选标记物基因的DNA片段导入所述中间重组菌3中，得到中间重组菌4(通过抗生素抗性筛选)；再将所述中间重组菌4在40℃-42℃培养，得到中间重组菌2，所述培养为传代至少2次，每次至少13小时；

步骤4)包括如下步骤：先将编码FLP重组酶的质粒导入中间重组菌2中，得到中间重组菌5，再将所述中间重组菌5在40℃-42℃培养，得到所述重组菌A，其中，所述培养为连续培养2代，培养时间为至少12小时。

上述福氏2a志贺氏菌为福氏2a志贺氏菌301，上述毒力大质粒为pCP301。

上述方法中，步骤1)中，所述与毒力大质粒不相容的质粒为pKDinc；

步骤3)中，所述抗性筛选标记物基因为卡那霉素基因；

所述含有编码λ-Red重组系统所需酶的质粒为质粒pKOBEG；

所述含有所述抗性筛选标记物基因的DNA片段的核苷酸序列为序列表中的序列1；

步骤4)中，所述编码FLP重组酶的质粒为质粒pCP20。

上述方法中，步骤3)中，在所述再将含有所述抗性筛选标记物基因的DNA片段导入所述中间重组菌3中的步骤前还包括将所述中间重组菌3经L-阿拉伯糖诱导培养的步骤。

本发明的第三个目的是提供一种制备重组菌B的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒，得到重组菌B。

上述方法中，所述去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒的方法包括如下步骤：

1)将与所述毒力大质粒不相容的质粒导入所述福氏2a志贺氏菌中，得到中间重组菌1(通过抗生素抗性筛选)，

2)去除所述中间重组菌1中的所述与毒力大质粒不相容的质粒，得到去除毒力大质粒的重组菌B；

步骤2)具体包括如下步骤：在40℃-42℃培养所述中间重组菌1，得到去除毒力大质粒的重组菌B；

所述与毒力大质粒不相容的质粒具体为pKDinc。

上述福氏2a志贺氏菌为福氏2a志贺氏菌301，上述毒力大质粒为pCP301。

由上述的方法制备得到的重组菌B也是本发明保护的范围；

或一种DNA分子也是本发明保护的范围，该DNA分子为如下(1)或(2)或(3)：

(1)序列表中序列1所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交的DNA分子；

(3)与(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性的DNA分子。

本发明的实验证明，本发明首先依据质粒不相容原理首先将野生福氏2a志贺菌301株的毒力大质粒驱除，构建得到了毒力大质粒无痕缺失突变株301ΔpCP，即一株无毒福氏志贺氏菌，然后利用基于λ噬菌体Red重组酶作用的同源重组技术，其原理是将一段与靶基因两翼400-600bp同源线性序列导入宿主菌细胞；在λ噬菌体Red重组酶的作用下，线性DNA片段两侧的同源臂与染色体(或载体)的靶序列发生同源重组，靶基因被标记基因置换下来；随后抗性基因通过转座酶的作用从宿主菌种脱落，从而得到无毒志贺氏菌的waaI缺失株。

附图说明

图1为毒力大质粒无痕缺失突变株(301ΔpCP)的PCR验证

图2为突变体检测引物位置示意图

图3为同源重组原理敲除基因示意图

图4为301ΔpCPΔwaaI基因缺失突变株PCR验证

图5为301ΔpCPΔwaaI和野生型301的银染图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、脂多糖合成缺陷的无毒福氏志贺氏菌

一、缺失O-抗原连接酶(waaI)基因的无毒福氏志贺氏菌2a 301的制备

1、福氏志贺氏菌2a 301毒力大质粒缺失株301ΔpCP的构建

A、制备了福氏志贺氏菌2a 301野生株感受态

1)将福氏志贺氏菌301野生株(即为福氏2a志贺氏菌301(Shigella flexneri2a)301，Genome sequence of Shigella flexneri 2a：insights into pathogenicitythrough comparison with genomes of Escherichia coli K12and 0157，Nucl.AcidsRes 2002，30(20)：4432-4441，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得，毒力大质粒为pCP301)接于LB液体培养基中，30℃过夜培养后，按1∶100转接到100mL低盐LB液体培养基中，放于30℃培养至OD₆₀₀达到0.6。

2)离心收集菌体，用高压灭菌过的10％甘油洗涤四次，最后用400uL的10％的灭菌甘油重悬细菌，即可获得电击转化用感受态细胞，分装待用。

B、毒力大质粒的缺失

inc是志贺氏菌毒力大质粒pCP上与其复制相关的一段序列片段，将实验室构建的带有inc片段的pKDinc重组质粒(Global Analysis of a Plasmid-Curred Shigella flexneriStrain：New Instghts into the Interaction between the Chromosome and a VirulencePlasmid，Journal of Proteome Research，2010，9(2)：843-854.温敏型质粒，抗性为氨苄青霉素，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得)电转导入志贺氏菌301野生株(以下简称为301)中，得到中间重组菌。

将中间重组菌在氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中连续传代3次以上，以保证毒力大质粒的丢失，之后将培养的菌液涂布在氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上，待长出单菌落之后通过毒力基因ipaA、ipgB、mxiD、virG的PCR检验毒力大质粒是否丢失，PCR结果中四个毒力基因都没有扩增产物说明毒力大质粒成功丢失，因此该重组菌利用质粒不相容原理将毒力大质粒驱除而只保留有pKDinc质粒，命名为301ΔpCP/pKDinc。

再利用pKDinc质粒的温度敏感特性，将301ΔpCP/pKDinc在无抗的液体LB培养基中42℃连续培养2代，再在无抗LB固体培养基上可以生长，但在含有氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上不长的菌株即为目的菌株301ΔpCP(去除毒力大质粒pCP301的福氏2a志贺氏菌)。

将上述目的菌株301ΔpCP进行PCR检测毒力基因ipaA、ipgB、mxiD、virG和inc，其中，ipaA的引物为：ipaAp1：AAGATTCTGCCTTTGGACC；ipaAp2：GTGGTTGAAGAGTTCTGTATG；

ipgB的引物为：ipgB1U：TGCTTTGACGGTATACAGC；ipgB1L：ACTTCCACAGGTTGAATTCG；

mxiD的引物为：mxiDU：AAGCAGGTTTCTTCTATTGG；mxiDL：GAACACATTACCGATTACAGG；

virG的引物为：VirGp1：CATCAATCCGTTACTCACT；VirGp2：ACTACCAGCAACAATACG；

inc的引物为：incF：TGCGAGAGAGAGGGGATAAC；incR：CGCCTTTTCCATCAGTTTC；

以福氏志贺氏菌301野生株(301)为对照。

结果如图1所示，图1左图为ipaA、ipgB、mxiD、virG的PCR检测结果，右图为inc的PCR检测结果，可以看出，301扩增得到888bp的ipaA(genbank号为AF386526的第107794-108682位核苷酸)、595bp ipgB(genbank号为AF386526的第113531-114126位核苷酸)、986bp mxiD(genbank号为AF386526的第124460-125446位核苷酸)、777bp virG(genbank号为AF386526的第151011-151788位核苷酸)、488bp inc(genbank号为AF386526的第209074-209561位核苷酸)，而301ΔpCP中均无这些片段，ipaA、ipgB、mxiDD、virG这些片段为毒力大质粒上的片段，inc为pKDinc质粒的片段。

以上结果说明构建得到的目的菌株301ΔpCP其毒力PCR结果为阴性，说明该菌株已经丢失了毒力大质粒，同时目的菌株inc的PCR结果也为阴性，证明该菌株也缺失了pKDinc质粒，这就说明301毒力大质粒缺失株301ΔpCP构建成功。

2、线性打靶DNA片段的制备

1)、PCR引物的设计

本研究所用的引物是依据NCBI上福氏2a志贺氏菌301株全基因组序列(NC-004337)中所列waaI基因(genbank号为AE005674的第3769440-3770648位)及其上、下游序列，采用Primer5.0软件完成(详见表1)。在waaI基因的上游(N端)和下游(C端)各设计一对引物，即waaIu5/waaIu3和waaId5/waaId3。为了方便操作，限制性酶切位点BamH I和Sal I将被添加到上游同源臂up的引物末端，限制性酶切位点HIndIII和Xho I被添加到下游同源臂down的引物末端。同时，为了验证突变体是否够构建成功，设计了基因组上waaI基因上下游同源臂以外的一对引物(waaIw5/waaIw3)，内部检测引物(waaIn5/waaIn3)，kan基因引物(KanP5/KanP3)及kan基因内部引物(Kanf5/Kanf3)，进行PCR验证，同时进行测序验证，如图2所示。

表1为引物列表

2)、线性打靶的构建

(1)以福氏2a志贺氏菌301为模板，用waaIu5/waaIu3和waaId5/waaId3分别扩增出waaI的上下游同源臂up和down。PCR条件如下：94℃10min，94℃30s，56℃30s，72℃1min，30个循环，72℃10min，体系为100μL。

结果分别得到长约500bp的waaI的上游同源臂up片段和waaI的下游同源臂down片段。

用0.6％琼脂糖凝胶电泳分离，从凝胶上切下目标条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，操作步骤按说明书进行。

(2)分别将上游同源臂up片段和下游同源臂down回收，连入pMD18-T载体中，并送公司测序，up片段的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第7-634位核苷酸，down片段的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第2143-2822位核苷酸。

(4)将上述up片段BamHI和SalI酶切后与经过同样酶切的质粒pETKan(pETKan构建方法：将卡那霉素抗性基因(序列1自5’末端第641-2136位核苷酸)插入pET-22b质粒(购自Novagen公司，产品目录号69744)的SalI和HindIII位点间)连接，得到中间载体1；再将down片段经过HindIII和XhoI酶切后与经过同样酶切的中间载体1连接，得到中间载体2；

(5)用BamHI和XhoI双酶切中间载体2，用凝胶回收试剂盒回收2828bp目的打靶片段，获得两侧为同源臂中间含kan基因的目的打靶DNA，经过测序，该目的打靶片段具有序列表中序列1所示的核苷酸，为含有所述卡那霉素抗性基因的片段。

其中，序列表中序列1自5’末端第7-634位核苷酸为up片段，自5’末端第641-2136位核苷酸为kan基因，自5’末端第2143-2822位核苷酸为down片段。

(6)以回收的目的打靶DNA片段为模板，以waaIu5和waaId3为引物，再次扩增打靶片段，用凝胶回收试剂盒回收目的片段，即可获得浓度高达300ng/μL的线性打靶DNA片段。

3、缺失O-抗原连接酶(waaI)基因的无毒福氏志贺氏菌2a 301

1)301ΔpCP/pKOBEG感受态的制备

(1)将由上述1得到的毒力大质粒无痕缺失突变株301ΔpCP接于LB液体培养基中，30℃过夜培养后，按1∶100转接到100mL低盐LB液体培养基中，放于30℃培养至OD₆₀₀达到0.6。

(2)离心收集菌体，用高压灭菌过的10％甘油洗涤四次，最后用400uL的10％的灭菌甘油重悬细菌，即可获得电击转化用感受态细胞，分装待用。

(3)由于pKOBEG质粒(A rapid method for efficient gene replacement in thefilamentous fungus Aspergillus nidulans[J].2000，28(22)；e97温敏型质粒，抗性为氯霉素自5’末端第641-2136位核苷酸，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得)含有编码λ-Red重组系统所需各种酶，将pKOBEG质粒电击转化至毒力大质粒无痕缺失突变株301ΔpCP感受态细胞中，涂于氯霉素抗性(pKOBEG质粒的抗性，氯霉素)的LB平板上，30℃培养过夜，得到的阳性克隆即为301ΔpCP/pKOBEG菌株。

2)线性打靶DNA片段的电击转化

(1)将上述得到的301ΔpCP/pKOBEG于30℃培养过夜，以1∶100传代于低盐LB液体培养基(LB培养基(500mL)配方：5g蛋白胨，2.5g酵母粉，2.5g NaCl，pH7.0)，继续培养。

(2)在OD₆₀₀值达到0.6前1h加入L-阿拉伯糖诱导Red重组系统的表达，其终浓度为1mmol/L，待OD₆₀₀值为0.6时，制备301ΔpCP/pKOBEG感受态细胞，步骤同前所述。

(3)取由上述2得到的300ng/μL的线性打靶DNA片段(序列1)5μL，电击转化至分装待用的301ΔpCP/pKOBEG感受态细胞中。

(4)快速加入提前预冷的1mL低盐LB培养基，30℃复苏2.5h左右，然后涂布于卡那霉素抗性的LB平板，放于30℃培养箱培养过夜。

(5)筛选出的阳性克隆即为带有卡那霉素抗性的waaI缺失突变株。

(6)将阳性克隆接种于液体LB培养基(有卡那霉素抗性，浓度为50μg/mL)中，42℃培养传代两次(每次培养12h时间)，即可除去pKOBEG质粒，最终获得含卡那霉素抗性waaI缺失突变株命名为301ΔpCPΔwaaI::kan，即为缺失O-抗原连接酶(waaI)基因的无毒福氏志贺氏菌2a 301。

利用λ-Red重组原理敲除基因原理及流程如图(图3)。

二、脂多糖合成缺陷的无毒福氏志贺氏菌的制备(卡那霉素抗性基因的去除)

1、将上述一得到的突变株301ΔpCPΔwaaI::kan在30℃培养至OD₆₀₀值达到0.6，离心收集菌体，用高压灭菌过的10％甘油洗涤四次，最后用400μL的10％的灭菌甘油重悬细菌，获得电击转化用感受态细胞。

2、将编码FLP重组酶(位点特异性重组酶，识别位点为FRT)的质粒pCP20(One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCRproducts[J].Proc.natl.Acad.Sci.U.S.A，2000，97(12)：6640-6645，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得，抗性为氯霉素)电击转入突变株感受态细胞中，在含氨苄青霉素及不含卡那霉素的LB平板上30℃培养，筛选Ap^rKm^s的阳性克隆。

3、筛选到的阳性克隆，转入液体LB中42℃培养12小时，即可获得不含卡那霉素和质粒pCP20的目的基因缺失突变株301ΔpCPΔwaaI，即为脂多糖合成缺陷的无毒福氏志贺氏菌。

三、脂多糖合成缺陷的无毒福氏志贺氏菌的分子鉴定

以301ΔpCPΔwaaI的基因组作为模板，用一对内部引物(waaIn5/waaIn3)(表1)，一对外部引物(waaIw5/waaIw3)(表1)，一对交叉引物(waaIw5和kanf3)(表1)和kan引物(表1，kan5/kan3)进行PCR验证，以野生株301为模板。PCR条件如下(20μL体系)：反应条件根据各引物退火温度不同而变，延伸时间因扩增产物的大小不同而变。

结果如图4所示，1，5：waaI内部引物；2，6：waaI外部引物；3，7：waaIw5和kanf3；4，8：Kan基因引物；突变株内部引物没有条带，并且成功敲除了靶基因，其外部引物扩增条带比野生株小，因去除了目的基因和kan基因，交叉引物和kan引物也没有扩增条带。而野生株内部引物有扩增条带，同样交叉引物和kan引物没有扩增条带。

上述结果证明得到waaI基因缺失、毒力大质粒缺失、无抗生素基因、福氏2a志贺氏菌突变株301ΔpCPΔwaaI。

四、脂多糖合成缺陷的无毒福氏志贺氏菌的表型鉴定

取1mL由上述得到的突变株301ΔpCPΔwaaI的过夜培养物，离心收集菌体，用PBS洗一次，加入100μL裂解缓冲液(10％SDS 2mL，2-巯基乙醇0.4mL，100％甘油1mL，2M Tris-HCL pH6.85mL，10％溴酚蓝20μL，ddH₂O 1.6mL)充分混匀，沸水煮10分钟，加4μL20mg/mL的蛋白酶K，60℃反应1至2小时，取15μL上样，进行SDS-PAGE，分离胶为15％，浓缩胶为4％，待溴酚蓝出胶后30分钟终止电泳。将上述的聚丙烯酰胺凝胶于固定液中放置过夜，加入增敏液作用30分钟，用去离子水洗3次，每次15分钟，加硝酸银溶液作用20分钟，用去离子水洗2次，每次1分钟，加显影液进行显色，最后终止反应，用去离子水洗。以野生株301为对照。

结果如图5所示，野生株301有ladder形式的条带，而突变株因敲除了O-抗原连接酶waaI，其功能是将O-PS连接到类脂A-核心寡糖上形成LPS，所以没有ladder形式的条带。

Claims (10)

1.一种重组菌A，为去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒和所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因得到的重组菌。

2.一种制备权利要求1所述的重组菌A的方法，包括如下步骤：去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒和所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因，得到重组菌A。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒和所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因为依次去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒和所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：

所述去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒的方法包括如下步骤：

1)将与所述毒力大质粒不相容的质粒导入所述福氏2a志贺氏菌中，得到中间重组菌1；

2)去除所述中间重组菌1中的所述与毒力大质粒不相容的质粒，得到去除毒力大质粒的重组菌B；

所述福氏2a志贺氏菌基因组中的O-抗原连接酶编码基因的方法包括如下步骤：

3)将抗性筛选标记物基因替换掉所述重组菌B基因组中的O-抗原连接酶基因，得到去除O-抗原连接酶基因的中间重组菌2；

4)去除所述中间重组菌2中的所述抗性筛选标记物基因，得到所述重组菌A。

5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：

步骤2)包括如下步骤：在40℃-42℃培养所述中间重组菌1，以去除其中的毒力大质粒，得到去除毒力大质粒的重组菌B；

步骤3)包括如下步骤：先将含有编码λ-Red重组系统所需酶的质粒导入所述重组菌B，得到中间重组菌3，再将含有所述抗性筛选标记物基因的DNA片段导入所述中间重组菌3中，得到中间重组菌4；再将所述中间重组菌4在40℃-42℃培养，得到中间重组菌2；

步骤4)包括如下步骤：先将编码FLP重组酶的质粒导入中间重组菌2中，得到中间重组菌5，再将所述中间重组菌5在40℃-42℃培养，得到所述重组菌A。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

步骤1)中，所述与毒力大质粒不相容的质粒为pKDinc；

步骤3)中，所述抗性筛选标记物基因为卡那霉素基因；

所述含有编码λ-Red重组系统所需酶的质粒为质粒pKOBEG；

所述含有所述抗性筛选标记物基因的DNA片段的核苷酸序列为序列表中的序列1；

步骤4)中，所述编码FLP重组酶的质粒为质粒pCP20。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：

步骤3)中，在所述再将含有所述抗性筛选标记物基因的DNA片段导入所述中间重组菌3中的步骤前还包括将所述中间重组菌3经L-阿拉伯糖诱导培养的步骤。

8.一种制备重组菌B的方法，包括如下步骤：去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒，得到重组菌B。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述去除福氏2a志贺氏菌中的毒力大质粒的方法包括如下步骤：

1)将与所述毒力大质粒不相容的质粒导入所述福氏2a志贺氏菌中，得到中间重组菌1，

2)去除所述中间重组菌1中的所述与毒力大质粒不相容的质粒，得到去除毒力大质粒的重组菌B；

步骤2)具体包括如下步骤：在40℃-42℃培养所述中间重组菌1，得到去除毒力大质粒的重组菌B；

所述与毒力大质粒不相容的质粒具体为pKDinc。

10.由权利要求8或9所述的方法制备得到的重组菌B；

或一种DNA分子，为如下(1)或(2)或(3)：

(1)序列表中序列1所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交的DNA分子；

(3)与(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性的DNA分子。

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