CN102172399B - 沙门菌yncD基因敲除载体及其制备方法及制备的沙门菌减毒疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种沙门菌yncD基因敲除载体，其包含pYG4质粒序列和中间去掉yncD基因序列同时保证阅读框不发生变化的yncD基因上下游序列。本发明还提供上述沙门菌yncD基因敲除载体的制备方法及通过应用上述的沙门菌yncD基因敲除载体敲除沙门菌中的yncD基因制备而成的沙门菌减毒疫苗。本发明提供的沙门菌yncD基因敲除载体能够准确敲除沙门菌种yncD基因，敲除株的毒力发生显著性降低，而且毒力不发生回复。该沙门菌yncD基因敲除载体制备简单、使用安全有效。本发明提供的应用上述的沙门菌yncD基因敲除载体敲除沙门菌中的yncD基因制备而成的沙门菌减毒疫苗，使用方便，安全性高。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因敲除载体及沙门菌减毒疫苗，尤其涉及一种沙门菌yncD基因敲除载体及其制备方法及敲除沙门菌中的yncD基因制备的沙门菌减毒疫苗。
背景技术
沙门菌属细菌包括2500多个血清型，其中部分血清型(伤寒沙门菌、甲型、乙型和丙型副伤寒沙门菌)可以引起人类的传染病，即肠热症(伤寒或副伤寒)；另外部分沙门菌是人畜共患病的病原体，可引起人类食物中毒或者败血症(如鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌等)。沙门菌引起的疾病发病率高，危害严重，例如作为肠道传染病的伤寒和副伤寒，据世界卫生组织估计，全球每年有1600-3300万感染者，死亡病例在50-60万左右。伤寒病例长期位居我国法定传染病的前10位，各地每年仍有大量散发病例，还时有局部的爆发流行，严重威胁着人们的身体健康。而由沙门菌引起的食物中毒则更为常见，是我国细菌性食物中毒的最常见病原之一。因此对于沙门菌感染的控制是一件非常重要的课题。对于沙门菌感染的控制需要采取综合措施，包括改善卫生条件以及有效疫苗的使用。通过疫苗刺激机体产生针对沙门菌的特异性免疫反应是一种有效的低成本预防策略。
接种疫苗的基本目的是诱导机体的免疫反应，进而对病原体的感染起到免疫保护的作用。这一目的可以通过减毒活疫苗株的接种而实现，减毒疫苗株是对病原体进行一定方式的处理，使其毒力减弱到不至于引起宿主感染，但同时又可以有效诱导免疫反应的活疫苗株。传统上的减毒株构建方法是对病原体反复传代，或者采用化学诱变剂处理而获得。但这两种方式获得的减毒株，往往减毒机制不清楚，因为遗传背景不清楚(可能发生单一突变，也可能发生多个突变，而这些突变不都和毒力减弱有关)。因此，对其回复突变可能性的评价也存在困难。由于多重突变可能的存在，也很难拿到一个免疫效果良好的减毒株(因为很可能在诱变过程中，一个编码保护性抗原的基因发生了突变，导致免疫原性下降)。
现代分子生物学技术的发展使得可以通过基因敲除技术构建遗传背景清楚的减毒疫苗株。这种方式往往需要对影响细菌生长的某些重要基因或者与细菌致病性有关的毒力基因进行敲除操作。到目前为止，采取这种方式，已经针对沙门菌构建了很多的减毒株，涉及的基因包括aro，pur，htrA，ompR，ompF，ompC，galE，cya，crp和phoP等的不同组合。
然而，减毒株的构建必须把握一个平衡，即首先要将病原体的毒力减弱，使其接种宿主后不会导致疾病发生；但同时其毒力减弱的程度又不能过大，还需保证其能在机体内短暂生存，以有效诱导机体的免疫反应。为取得这样一个平衡，就需要对不同组合的靶基因进行敲除，然后测试其毒力和安全性，以获得符合临床应用要求的减毒株。
因此对于病原体新型减毒疫苗的研制来说，通过研究不断发现新的可以实现减毒的靶基因，并采用适宜方法将其突变是一个基本前提。
发明内容
本发明的目的是提供一种敲除沙门菌中的yncD基因制备而成的沙门菌减毒疫苗，其可通过应用上述的沙门菌yncD基因敲除载体敲除沙门菌中的yncD基因制备。所述疫苗使用方便，安全性高。
本发明的另一个目的是提供一种沙门菌yncD基因敲除载体，所述载体能够准确敲除沙门菌种yncD基因，敲除株的毒力发生显著性降低，而且毒力不发生回复。该沙门菌yncD基因敲除载体制备简单、使用安全有效。
本发明所述的沙门菌减毒疫苗，是将yncD基因敲除而实现减毒的沙门菌减毒疫苗。
所述疫苗是通过沙门菌yncD基因敲除载体敲除yncD基因。
所述沙门菌yncD基因敲除载体包含pYG4质粒序列和中间去掉yncD基因序列同时保证阅读框不发生变化的yncD基因上下游序列。
所述中间去掉yncD基因序列同时保证阅读框不发生变化的yncD基因上下游序列如SEQ ID NO：2所示。
所述pYG4质粒序列如SEQ ID NO：1所示。
所述沙门菌为伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、丙型副伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、猪霍乱沙门菌和鼠伤寒沙门菌中的至少一种。
沙门菌yncD基因敲除载体，其包含pYG4质粒序列和中间去掉yncD基因序列同时保证阅读框不发生变化的yncD基因上下游序列。
所述pYG4质粒序列如SEQ ID NO：1所示，所述中间去掉yncD基因序列同时保证阅读框不发生变化的yncD基因上下游序列如SEQ ID NO：2所示。
沙门菌减毒疫苗制备方法有以下步骤：
1)通过PCR方式获得拼接在一起的中间去掉yncD基因序列同时保证阅读框不发生变化的yncD基因上下游序列；
2)将步骤1)获得的中间去掉yncD基因序列同时保证阅读框不发生变化的yncD基因上下游序列插入pYG4质粒中，获得所述沙门菌yncD基因敲除载体。
步骤1)包括在所述PCR中应用SEQ ID NO：3-6所示的引物进行PCR扩增。
本发明提供的沙门菌yncD基因敲除而实现减毒的策略，能够实现沙门菌毒力显著降低。
本发明提供的沙门菌yncD基因敲除载体能够准确敲除沙门菌种yncD基因，敲除株的毒力发生显著性降低，而且毒力不发生回复。该沙门菌yncD基因敲除载体制备简单、使用安全有效。本发明提供的应用上述的沙门菌yncD基因敲除载体敲除沙门菌中的yncD基因制备而成的沙门菌减毒疫苗，使用方便，安全性高。
为让本发明之上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
附图说明
图1A至图1C是沙门菌yncD基因敲除的过程示意图，图1A：获得敲除拷贝；图1B：将敲除拷贝通过自杀载体整合到细菌染色体上；图1C：整合菌的染色体内发生双交叉同源重组，通过反向选择获得重组敲除菌株；
图2A为伤寒沙门菌野生株、敲除株和互补株在LB培养基中的生长曲线；图2B为伤寒沙门菌野生株、敲除株和互补株在α-MEM培养基中的生长曲线；
图3为对沙门菌中不同血清型菌株的YncD氨基酸序列的相似性分析；
图4是pYG4质粒示意图。
具体实施方式
试验材料：
一、试验中所用试剂除DNA连接酶和试剂盒外，均为takara公司产品：
LB培养基：
液体：氯化钠1％，胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％；
固体：氯化钠1％，胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，琼脂1.4％121℃高压蒸汽灭菌15分钟；
a-MEM培养基：根据需要，分别加入终浓度10uM的FeSO4和FeCl3；
DNA连接酶 promega公司产品
胶回收试剂盒 omega公司产品
质粒提取试剂盒 omega公司产品
引物制作和DNA片段测序由上海英骏生物技术有限公司完成
卡那霉素培养基：即在普通LB培养基基础上加入终浓度100μg/ml的卡那霉素。
氨苄青霉素培养基：即在普通LB培养基基础上加入终浓度100μg/ml的氨苄青霉素。
二、所用主要仪器：凝胶成像仪：Bio-rad-T2a
电转仪：Bio-rad gene-pluserII
分光光度计：Bio-rad smartspeec 3000
电泳仪：：Bio-rad 72BR5008
PCR仪：：Bio-rad580B5502
水浴：上海生工HH-2A
金属浴：杭州博日CHB-A4-HH
摇床：zhicheng ZHWY-100B恒温摇床
离心机：Thermo LEGEND Micro21
实施例1：沙门菌yncD基因敲除株的构建
具体请参照图1A至图1C及图4，其中图1A至图1C是沙门菌yncD基因敲除的过程示意图，图4是pYG4质粒示意图，pYG4质粒的构建过程请参考“第三军医大学学报”，2009年12月，第31卷第23期第2299-2301页，其全部内容引用于此。
具体请参照图1A。采用交叠PCR方式获得拼接在一起的yncD基因上下游序列SEQ ID NO：2(中间去掉yncD基因序列，同时保证阅读框不发生变化)，连接到pYG4中(其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)构建成敲除载体，命名为pYG4-ΔyncD，转化到大肠埃希菌S17-1/λpir中复制，进行酶切、PCR及测序鉴定。
(1)交叠PCR：根据yncD基因上下序列分别制作两组PCR引物P1和P2、P3和P4，其核苷酸序列如表1所示，其分别如序列表SEQ ID NO：3-6所示(P2和P3有一段互补序列，P1和P4内分别含有限制性内切酶Ndel酶切位点)。然后分别做PCR。
表1
PCR方法具体如下：
引物P1、P2(或者P3、P4) 各1μl
模板为沙门菌ty2野生株菌悬液 1μl
ExTaq酶 1μl
10×缓冲液 5μl
dNTP 1μl
Mg2+ 3μl
ddH2O 37μl
总体积 50μl
反应条件：
94℃5分钟；94℃30秒，55℃40秒，72℃1分钟，共25个循环；72℃5分钟
将两组PCR产物进行凝胶电泳后做胶回收，标记为pcr1和pcr2。由于P2和P3有部分互补序列，所以，再用pcr1和pcr2为模板做交叠PCR，方法如下：
引物P1、P4 各1μl
模板pcr1和pcr2 各1μl
ExTaq酶 1μl
10×缓冲液 5μl
dNTP 1μl
Mg2+ 3μl
ddH2O 36μl
总体积 50μl
反应条件：
94℃5分钟；94℃30秒，55℃40秒，72℃2分钟，共25个循环；72℃5分钟
(2)将所得PCR产物电泳做胶回收，标记为pcr3。用pcr3和PYG4分别做Nde I酶切
体系：PYG4(或者pcr3) 42μl
Nde I 1μl
10×缓冲液 5μl
总体积 50μl
条件：37℃水浴过夜。
将两个酶切产物跑凝胶电泳后胶回收，分别标记为L1和L2。用L1和L2做连接反应构建敲除载体，命名为pYG4-ΔyncD，条件如下：
体系：T4DNA连接酶 1μl
连接酶缓冲液 1μl
L2 5μl
L1 3μl
总体积 10μl
反应条件：16℃金属浴过夜。
(3)将上述连接产物电转入大肠埃希菌S17-1/λpir中复制，卡那霉素平板筛选阳性克隆，增菌后提取质粒，进行酶切、PCR鉴定。
①酶切鉴定体系：待鉴定质粒 17μl
Nde I 1μl
10×缓冲液 2μl
加水至总体积 20μl
反应条件：37℃水浴过夜，琼脂糖凝胶电泳，观察是否出现目的片段。
②PCR体系：
引物P1、P4 各1μl
待鉴定质粒 1μl
rTaq酶 1μl
10×缓冲液 5μl
dNTP 1μl
Mg2+ 3μl
ddH2O 37μl
总体积 50μl
反应条件：94℃5分钟；94℃30秒，55℃40秒，72℃2分钟，共25个循环；72℃5分钟。琼脂糖电泳，观察是否有目的片段。
③送英骏公司测序，对测序获得的序列与网上公布的相应序列比对。
然后参照图1B，将经鉴定的敲除载体通过电转方式转移到沙门菌野生株(选择对卡那霉素敏感的菌株)，该野生株不能在含有卡那霉素的平板上生长，同时敲除载体无法在沙门菌中复制，因此只有当敲除载体整合到野生株的染色体上，该菌株才能在抗性平板上生长，挑选单菌落进行PCR鉴定，鉴定正确后菌株命名为整合株。
(1)将鉴定后的pYG4-ΔyncD质粒电转入沙门菌ty2野生株(购自中国医学微生物保藏中心)，用含卡那霉素的固体培养基筛选。电转条件：0.1cm电转杯，1.8KV，25μf，200欧，所有操作应在冰上进行。取1mlLB培养液加入到电击后的混合液中，于37℃适应45分钟后，涂于卡那霉素平板上进行筛选。
(2)挑选单菌落做PCR鉴定，并同时送测序：
PCR体系：
引物P1、P4 各1μl
待鉴定整合株菌液 1μl
rTaq酶 1μl
10×缓冲液 5μl
dNTP 1μl
Mg2+ 3μl
ddH2O 37μl
总体积 50μl
反应条件：94℃5分钟；94℃30秒，55℃40秒，72℃4分钟，共25个循环；72℃5分钟。琼脂糖电泳，观察是否有目的片段，此时应扩增出两个条带，分别位于1400bp和3500bp左右。
然后参照图1C，为了进一步获得敲除株，将鉴定后的整合菌株置于无抗生素的LB培养基中培养，培养后筛选发生染色体内同源重组的突变株，由于sacB片段的反向选择作用，可用含有5％蔗糖的平板进行筛选，带有sacB片段的整合株无法在该平板上生长，而长出来的菌落都是发生了染色体内重组，从而去掉了载体序列(包括sacB片段)的重组菌株。重组有两种情况，其中50％的可能性产生敲除株，可通过PCR方式筛选鉴定获得敲除株。
PCR鉴定：
引物P1、P4 各1μl
重组株 1μl
rTaq酶 1μl
10×缓冲液 5μl
dNTP 1μl
Mg2+ 3μl
ddH2O 37μl
总体积 50μl
反应条件：94℃5分钟；94℃30秒，55℃40秒，72℃4分钟，共25个循环；72℃5分钟。琼脂糖电泳，观察是否有目的片段，敲除株应扩增出一个条带，位于1400bp左右，而在3500bp左右没有条带。
实施例2：互补质粒和互补株的构建
如果沙门菌毒力的减弱是因为yncD基因的缺失引起的，则当通过质粒转入的方式将带启动子序列的yncD基因再转入敲除株后，细菌毒力便会恢复。根据该原理，根据yncD基因上下游序列设计引物yncD-c1和yncD-c2(分别如SEQ IDNO：7-8所示)，以沙门菌野生株DNA为模板进行PCR扩增得到包含启动子序列的完整yncD基因(SEQ ID NO：9)。对PCR产物进行EcoRI和Hind III双酶切后，与经同样酶切的PBR322质粒连接，电转大肠埃希菌DH5α，以氨苄青霉素平板进行筛选获得阳性克隆并测序鉴定。提取质粒电转入yncd敲除株，氨苄平板筛选得到互补菌株。
yncD-c1：5`-cccgaattctgacgactccttttgataaa-3`(SEQ ID NO：7)
yncD-c2：5`-cccaagcttctttcatgaaactatgacta-3`(SEQ ID NO：8)
PCR条件：
引物yncD-c1和yncD-c2 各1μl
模板沙门菌野生株 1μl
ExTaq酶 1μl
10×缓冲液 5μl
dNTP 1μl
Mg2+ 3μl
ddH2O 37μl
总体积 50μl
反应条件：94℃5分钟；94℃30秒，55℃40秒，72℃2.5分钟，共25个循环；72℃5分钟。
产物胶回收后，命名为pty12，用内切酶EcoR I和HindIII对产物和PBR322分别进行双酶切。
酶切体系：pty12(或PBR322) 42μl
HindIII 1μl
EcoR I 2μl
10×缓冲液 5μl
总体积 50μl
反应条件：37℃水浴过夜
将两个酶切产物胶回收后做连接反应，反应条件和之前连接反应一样。连接反应产物电转入大肠杆菌DH5α中，用氨苄青霉素平板进行筛选，对阳性菌落测序鉴定。鉴定获得的阳性质粒，电转入yncd敲除株，氨苄青霉素平板筛选得到互补菌株。电转条件：0.1cm电转杯，1.8KV，25μf，200欧。所有操作应在冰上进行。
实施例3：yncD敲除株与野生株毒力的比较
收集对数生长期细菌经PBS洗后重悬，悬液中加入终浓度5％的猪胃粘蛋白，设置4个梯度，分别为102，103，104，105CFU，每组3只BALB/c小鼠。将细菌悬液注射至小鼠腹腔，注射后观察72小时内小鼠死亡情况，经统计学处理计算半数致死量LD50。结果见表2，敲除株的毒力发生显著性降低。
表2伤寒沙门菌Ty2及其衍生菌株的LD50的检测
IP：腹腔注射(intraperitoneal injection)
实施例4：yncD敲除株与野生株生物学性状的比较
以LB培养基和α-MEM培养基分别培养yncD敲除株，野生株和互补株，绘制生长曲线，比较二者在不同培养基中的生长性状的差异，请参照图2A和图2B。图2A为伤寒沙门菌野生株、敲除株和互补株在LB培养基中的生长曲线；图2B为伤寒沙门菌野生株、敲除株和互补株在α-MEM培养基中的生长曲线。
图2A中的培养基为LB培养基：分三组，每组三支试管，内装4mlLB培养基，分别接种野生株，yncd敲除株和互补株。每80分钟取样进行OD测试记录数据；
图2B中的培养基为α-MEM培养基，添加了10μM FeSO4：同LB培养基操作一样，由于生长均较LB培养基慢，取样改为8小时一次。
培养条件为：37℃振荡培养。
结论：伤寒沙门菌的敲除株和野生株比较，其在α-MEM培养基中的生长能力减慢。此结果说明yncD敲除株毒力减弱的原因和其生长能力下降有关。yncD基因编码一种外膜转运蛋白，涉及某种物质在外膜上的转运过程，突变后对于靶物质的转运能力下降，而导致其在基本培养基中的生长能力下降，虽然目前尚未确认其转运物质，但以上实验可以证实其功能的重要性及其与致病性的密切关系。
实施例5：沙门菌减毒疫苗的免疫保护效果
通过上述实施例1-4证明，实施例1构建的敲除了yncD基因的沙门菌株能够实现毒力的减弱，可作为沙门菌减毒疫苗应用。进一步采用小鼠免疫保护实验测试yncD基因敲除株作为沙门菌减毒疫苗株的应用价值。
选择体重在20±2克的BALB/c小鼠，取yncD敲除株培养液经PBS洗涤后，经鼻黏膜接种10μl细菌(109CFU)，对照组接种同样体积的无菌PBS。接种后正常喂养四周，进行伤寒沙门菌野生株攻击实验。
收集对数生长期野生株细菌经PBS洗后重悬，悬液中加入终浓度7％的猪胃粘蛋白，设置3个梯度，分别为104，105，106CFU，每组3只BALB/c小鼠，对照组注射剂量为103CFU。将细菌悬液注射至小鼠腹腔，注射后观察72小时内小鼠死亡情况，统计各浓度细菌攻击后的小鼠死亡率。结果见表3。
表3yncD敲除株免疫接种后对毒株攻击的保护率
由结果可以看出，对照组仅注射103CFU的剂量，死亡率就达到100％(这也和之前LD50的测定数据吻合)，说明PBS接种没有保护作用。而实验组经鼻黏膜接种了yncD敲除株，可以对104CFU，105CFU剂量组实现100％的保护，对106CFU剂量组也可实现33.3％的保护率。说明沙门菌yncD敲除株作为减毒疫苗具有良好的免疫保护效果。
实施例6：yncD基因在沙门菌中的相似度分析
为比较沙门菌中不同血清型菌株的yncD基因的保守性，采用GeneDoc软件对沙门菌不同血清型菌株的YncD氨基酸序列进行相似度比对，比对的血清型包括伤寒沙门菌，甲型副伤寒沙门菌，乙型副伤寒沙门菌，丙型副伤寒沙门菌，猪霍乱沙门菌，鼠伤寒沙门菌，Dublin血清型以及肠炎沙门菌，结果见图3，图3为对沙门菌中不同血清型菌株的YncD氨基酸序列的相似性分析。分析表明，yncD基因序列在沙门菌各血清型中具有高度的保守性，相似度大于98％，高度的保守性表明其基因功能在不同沙门菌的血清型中是一致的。
因此，本技术领域的技术人员应能想到的是，本发明所述的上述方法适应于各种不同的具有yncD基因的沙门菌而不限于伤寒沙门菌，例如甲型副伤寒沙门菌，乙型副伤寒沙门菌，丙型副伤寒沙门菌，猪霍乱沙门菌，鼠伤寒沙门菌，Dublin血清型以及肠炎沙门菌，其具体过程和步骤在此不再赘述。同样的，本发明所述的沙门菌减毒的关键原因在于yncD基因的敲除，这是发明人首次发现并阐明的，本技术领域的技术人员应能想到的是，本发明所述的减毒疫苗可以通过其它方式敲除yncD基因而实现，其具体过程和步骤在此不再赘述。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。
Claims (5)
1.一种沙门菌减毒疫苗，其特征在于，所述疫苗是将yncD基因敲除而实现减毒的沙门菌减毒疫苗，所述疫苗是通过沙门菌yncD基因敲除载体敲除yncD基因，该基因敲除载体包含pYG4质粒序列SEQ ID NO:1和中间去掉yncD基因序列同时保证阅读框不发生变化的yncD基因上下游序列SEQ ID NO:2，并且该基因敲除载体采用引物为SEQ ID NO:3-6所示序列的PCR方法制得。
2.根据权利要求1所述的沙门菌减毒疫苗，其特征在于，所述沙门菌为伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、丙型副伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、猪霍乱沙门菌和鼠伤寒沙门菌中的至少一种。
3.一种沙门菌yncD基因敲除载体，其特征在于，包含pYG4质粒序列和中间去掉yncD基因序列同时保证阅读框不发生变化的yncD基因上下游序列，所述pYG4质粒序列如SEQ ID NO:1所示，所述中间去掉yncD基因序列同时保证阅读框不发生变化的yncD基因上下游序列如SEQ ID NO:2所示，该基因敲除载体采用引物为SEQ ID NO:3-6所示序列的PCR方法制得。
4.权利要求3所述的沙门菌yncD基因敲除载体制备方法，其特征在于有以下步骤：
1）通过PCR方式获得拼接在一起的中间去掉yncD基因序列同时保证阅读框不发生变化的yncD基因上下游序列；
2）将步骤1）获得的中间去掉yncD基因序列同时保证阅读框不发生变化的yncD基因上下游序列插入pYG4质粒中，获得所述沙门菌yncD基因敲除载体，该基因敲除载体采用引物为SEQ ID NO:3-6所示序列的PCR方法制得。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1）包括在所述PCR中应用SEQ ID NO:3-6所示的引物进行PCR扩增。
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| CN104474539B (zh) * | 2014-11-17 | 2017-07-11 | 中国人民解放军第三军医大学 | 敲除yncD‑aroC双基因的甲型副伤寒沙门菌减毒疫苗 |
| CN111647057B (zh) * | 2020-05-07 | 2022-09-13 | 西南医科大学附属中医医院 | 一种伤寒沙门菌疫苗重组蛋白及其编码基因和它们的应用 |
-
2011
- 2011-02-25 CN CN2011100465147A patent/CN102172399B/zh active Active
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| ANDREW J. LINK, et al..Methods for Generating Precise Deletions and Insertions in the Genome of Wild-Type Escherichia coli: Application to Open Reading Frame Characterization.《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》.1997,第179卷(第20期),6228-6237. |
| Methods for Generating Precise Deletions and Insertions in the Genome of Wild-Type Escherichia coli: Application to Open Reading Frame Characterization;ANDREW J. LINK, et al.;《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》;19971031;第179卷(第20期);6228-6237 * |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102172399A (zh) | 2011-09-07 |
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