KR20140060548A

KR20140060548A - 당쇄 부가 폴리펩티드 및 당해 폴리펩티드를 포함하는 의약 조성물

Info

Publication number: KR20140060548A
Application number: KR1020147008136A
Authority: KR
Inventors: 히로후미 오치아이; 다이지 시모다; 가즈히로 후카에; 마사토시 마에다; 게이스케 다즈루; 겐타 요시다
Original assignee: 가부시키가이샤 도우사 고가쿠 겐큐쇼
Priority date: 2011-09-04
Filing date: 2012-09-03
Publication date: 2014-05-20
Anticipated expiration: 2032-09-03
Also published as: CA2847336A1; CN106146649B; JP6211418B2; CA2847336C; US9441024B2; CN103946234B; CN106146649A; JPWO2013032012A1; RU2014112044A; EP2752425A1; WO2013032012A1; US9802996B2; RU2627184C2; SG11201400293UA; US20140315800A1; BR112014004936A2; US20160368961A1; TW201315743A; AU2012302637B2; TWI631142B

Abstract

[과제] 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 갖고 또한 소마토스타틴에 비해서 혈중 안정성이 향상된 당쇄 부가 폴리펩티드를 제공한다.
[해결수단] 소마토스타틴 또는 그의 유연체에 있어서 2개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 당쇄 부가 폴리펩티드에 관한 것이다.

Description

당쇄 부가 폴리펩티드 및 당해 폴리펩티드를 포함하는 의약 조성물{Glycosylated polypeptide and drug composition containing said polypeptide}

본 발명은 당쇄 부가 폴리펩티드, 당해 폴리펩티드를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.

소마토스타틴은 중추신경계 및 주변 조직 양쪽에 존재하는 사이클릭 펩티드이다. 소마토스타틴은 처음으로 포유류의 시상하부로부터 단리되어 뇌하수체 전엽으로부터 성장호르몬 분비물의 중요한 저해제로서 동정되었다. 이 펩티드는 시상하부, 췌장, 소화관 등에 널리 분포되어 있고 소마토스타틴 수용체로의 결합을 매개로 작용을 발현한다. 또한 소마토스타틴은 뇌하수체에 있어서의 성장호르몬(GH)의 분비 억제, 갑상선 자극호르몬(TSH) 분비 억제를 비롯하여 소화관에서의 가스트린, 셀렉틴, 콜레시스토키닌(CCK), VIP(Vasoactive Intestinal Polypeptide), 췌장에서의 글루카곤, 인슐린 등의 각종 호르몬 분비를 억제하는 것으로 알려져 있다. 추가로 소화관 운동을 억제하는 작용을 갖는 것도 알려져 있다.

구조식：Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(서열번호 1)를 갖는 천연의 소마토스타틴(소마토트로핀 방출 저해 인자(SRIF)로서도 알려져 있다)이 최초로 Guillemin 및 공동 연구자에 의해 단리되었다. 이 소마토스타틴은 수용체의 패밀리와 상호작용함으로써 그 효과를 발휘한다. 소마토스타틴 수용체(SSTR)에는 1부터 5까지의 서브타입(SSTR1~SSTR5)이 존재하고, 그 중에서도 SSTR2는 GH 분비성 인간 뇌하수체 아데노마, 중추신경계, 뇌하수체 전엽, 망막, 부신수질, 위, 십이지장 점막, 소장, 결장의 각 조직, 및 췌장 랑게르한스섬의 글루카곤 분비성 A세포에 분포하는 것이 알려져 있다. 또한 이들 각 수용체는 각종 종양에 있어서도 발현하는 것이 알려져 있어, 예를 들면 기능성 뇌하수체 선종에 있어서는 SSTR1과 SSTR5가 발현하고 있고, 위장 종양에 있어서는 SSTR2 외에 SSTR1, SSTR3가 발현하고 있으며, 갈색 세포종에서는 SSTR3가 발현하고 있고, 전립선암에 있어서는 SSTR1 및 SSTR5가 발현하고 있으며, 결장직장암에 있어서는 SSTR5가 발현하고 있는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 1). 또한 SSTR4는 길항적으로 조절 작용을 갖는 수용체로서 기능하는 것 및 녹내장 관련 질환의 치료에 있어서 중요한 가능성에 대해서 보고되어 있다(비특허문헌 2). 이와 같이 소마토스타틴 및 그의 유연체는 소마토스타틴 관련 질환이나 여러 가지 종류의 종양에 대해서 잠재적으로 유용한 치료약이다.

한편 천연에 존재하는 소마토스타틴은 혈중 반감기가 2~3분으로 짧기 때문에 생물학적 이용능이 작고 작용의 지속시간이 짧다고 하는 두 가지의 바람직하지 못한 성질을 나타내기 때문에 치료제로서의 사용이나 응용은 한정된다. 이 이유에 의해 효력, 생체 안정성, 작용의 지속시간, 또는 성장호르몬, 인슐린 또는 글루카곤 방출의 억제를 고려한 선택성 중 어느 하나가 우수한 소마토스타틴 유연체를 찾아내기 위해서 여러 가지 소마토스타틴 유연체의 개발이 이루어져 왔다.

임상적으로 이용할 수 있는 최초로 승인된 소마토스타틴 유연체로서는 옥트레오티드(Octreotide)(특허문헌 1 및 특허문헌 2)가 보고되어 있고, 이 옥트레오티드는 소마토스타틴 수용체의 SSTR2, SSTR3 및 SSTR5에 대해서 친화성을 갖는 것이 알려져 있다.

옥트레오티드는 소마토스타틴의 생물학적 활성을 나타내는 데에 중요한 부분인 4개의 아미노산(Phe-Trp-Lys-Thr)의 서열을 갖고, 그 서열의 양 말단에 디설피드(S-S) 결합을 형성하는 Cys를 가지며, 또한 그의 양 말단의 Cys의 외측에 D-Phe와 Thr(ol)을 갖는 8개의 아미노산으로 이루어지는 환상 펩티드로서 개발되어 있다. 이 옥트레오티드는 그의 아미노산 서열에 의해 혈중 반감기를 향상시킴으로써 작용의 지속성을 얻을 수 있고 또한 소마토스타틴에 비해 성장호르몬(GH)에 대한 선택성이 높아 강력한 작용을 갖는 것이 가능하다.

이러한 옥트레오티드를 포함하는 소마토스타틴 유연체는 호르몬 분비성 및 호르몬 의존성 종양을 갖는 환자의 치료에 사용할 수 있다. 현재는 신경 내분비계 종양인 전이성 카르시노이드 종양에 관련된 증상(조홍, 설사, 심장판막질환 및 복통) 및 혈관 작용성 장관 펩티드(VIP) 분비 선종에 관련된 증상(수양성 설사)은 옥트레오티드에 의해 치료된다.

예를 들면 카르시노이드 및 VIP 생산 종양에 있어서 옥트레오티드는 그의 활성인자의 분비 및 작용 양쪽을 저해한다. 따라서 다량 분비성 설사를 특징으로 하는 VIP 생산 종양에서는 소마토스타틴 유연체는 VIP 분비 저해에 의해, 또한 직접 장관 분비에 영향을 미쳐 그 설사를 저감시킬 수 있다.

그러나 한편으로 대부분의 신경 내분비 종양은 옥트레오티드와 같은 소마토스타틴 유연체에 대해서 내성을 가지고 있는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 3). 또한 옥트레오티드는 말단 비대증의 치료에 사용되지만 말단 비대증 환자의 약 3분의 1에는 효과가 없는 것도 보고되어 있다. 또한 대부분의 카르시노이드 종양 환자에 대해서 옥트레오티드는 투여 초기만 효과를 발휘하고 투여 기간이 길어지면 타키필락시스(속성 내성, 속성 관용)가 일어나는 것이 보고되어 있다. 또한 초기의 쿠싱병 환자의 부신피질 자극 호르몬(ACTH) 생산 억제에 대해서 옥트레오티드는 효과를 나타내지 않는 것이 보고되어 있다.

상기와 같은 과제로부터 복수의 소마토스타틴 수용체를 발현하는 종양에 대해서는 천연의 소마토스타틴과 같이 높은 친화성으로 복수의 수용체 서브타입에 결합하는 소마토스타틴 유연체의 개발이 요망되고 있고, 또한 이러한 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 갖는 소마토스타틴 유연체는 지금까지의 소마토스타틴 유연체에 치료 효과가 없는 환자나 내성을 갖는 환자에게도 효과를 가질 가능성이 시사되어 있다(비특허문헌 4).

이와 같이 천연에 존재하는 소마토스타틴과 유사한 구조로, 동일하게 소마토스타틴 수용체에 대해서 친화성을 갖고 또한 소마토스타틴에 비해 혈중 반감기가 연장된 소마토스타틴 아날로그의 개발이 요망되고 있었다.

한편 당쇄가 생체 내에 있어서 여러 가지 역할을 담당하고 있는 것이 명확해져, 혈중에 있어서의 반감기를 연장하기 위해서 옥트레오티드에 당쇄를 부가하는 방법도 제안되어 있다(예를 들면 특허문헌 3).

그러나 그 구조의 복잡함이나 다양성에 의해 연구가 늦어지고 있고 당쇄의 종류나 당쇄를 부가하는 위치가 반드시 최적화되어 있다고는 할 수 없어, 지금까지의 소마토스타틴 유사체의 문제점을 극복한 당쇄 부가 폴리펩티드에 대해서는 보고되어 있지 않다.

미국 특허 제4,310,518호 미국 특허 제4,235,886호 일본국 특허공개 평03-014599호

Currrent Opinion in Pharmacology, 2004, Vol. 4, pp. 608-613 J. Med. Chem. 2003, Vol. 46, pp. 5587-5596 Mol Endocrinol, 2010, Vol. 24(1), pp. 240-249 Molecular and Cellular Endocrinology, Vol. 286, 2008, pp. 69-74

본 발명의 과제는 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 갖고 또한 소마토스타틴에 비해서 혈중 안정성이 향상된 당쇄 부가 폴리펩티드를 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 연구를 거듭한 결과, 소마토스타틴 수용체(somatostatin receptors)에 대한 친화성을 유지하고 또한 혈중 안정성이 향상된 당쇄 부가 폴리펩티드를 발견하였다.

즉 본 발명은

(A) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 SRIF14；(B) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 SRIF14에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드；(C) SRIF14의 유연체(analog);(D) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 SRIF14에 대해서 80% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드；(E) (A)~(D)에 있어서 N개(여기서 N은 1 이상 20 이하의 정수)의 아미노산을 N말단 측에 추가로 포함하는 폴리펩티드；및 (F) (A)~(D)에 있어서 M개(여기서 M은 1 이상 6 이하의 정수)의 아미노산을 C말단 측에 추가로 포함하는 폴리펩티드；로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드에 있어서 2개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있고 또한 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 갖는 것을 특징으로 하는 당쇄 부가 폴리펩티드에 관한 것이다.

여기서 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 당쇄 부가 아미노산으로 치환되는 아미노산의 1개 이상이 SRIF14에 있어서의 19번 위치에 상당하는 아미노산인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 당쇄 부가 폴리펩티드는 상기 (E)의 폴리펩티드에 있어서 2개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있고, 여기서 상기 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 1개 이상의 아미노산이 상기 (E)의 폴리펩티드의 N말단 측의 상기 N개의 아미노산 중 어느 하나에 존재하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 당쇄 부가 폴리펩티드는 상기 (F)의 폴리펩티드에 있어서 2개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있고, 여기서 상기 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 1개 이상의 아미노산이 상기 (F)의 폴리펩티드의 C말단 측의 상기 M개의 아미노산 중 어느 하나에 존재하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 당쇄 부가 폴리펩티드는 상기 (E)의 폴리펩티드에 있어서 2개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있고, 또한 N말단 측에 부가되는 상기 N개의 아미노산의 서열이 X-Y-로 표시되며, 여기서 X는 L개(여기서 L은 1 이상 6 이하의 정수)의 임의의 아미노산의 서열을 의미하고, 또한 Y는 (1) Lys, (2) Arg-Lys, (3) Glu-Arg-Lys, (4) Arg-Glu-Arg-Lys, (5) Pro-Arg-Glu-Arg-Lys, (6) Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys, (7) Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys, (8) Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys, (9) Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys, (10) Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys, (11) Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys, (12) Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys, (13) Ala-Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys, (14) Ser-Ala-Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys 및 (15) 상기 서열 (2)~(14)에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 아미노산의 1개 이상이 상기 (E)의 폴리펩티드의 N말단 측에 부가되는 상기 N개의 아미노산의 서열을 표시하는 X-Y-에 있어서의 X를 의미하는 L개의 아미노산 중 어느 하나에 존재하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 N말단 측에 부가되는 상기 N개의 아미노산은 링커를 매개로 당해 N말단 측에 연결되어 있는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 다른 실시태양에 있어서는 (A) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 SRIF28；(B) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 SRIF28에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드；(C) SRIF28의 유연체;(D) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 SRIF28에 대해서 80% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드；(E) (A)~(D)에 있어서 J개(여기서 J는 1 이상 15 이하의 정수)의 아미노산을 N말단 측에 추가로 포함하는 폴리펩티드；및 (F) (A)~(D)에 있어서 K개(여기서 K는 1 이상 6 이하의 정수)의 아미노산을 C말단 측에 추가로 포함하는 폴리펩티드；

로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드에 있어서 2개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있고 또한 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 갖는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 당쇄 부가 아미노산으로 치환되는 아미노산의 1개 이상이 SRIF28에 있어서의 1번 위치에 상당하는 아미노산, 5번 위치에 상당하는 아미노산, 9번 위치에 상당하는 아미노산, 12번 위치에 상당하는 아미노산, 13번 위치에 상당하는 아미노산, 14번 위치에 상당하는 아미노산 및 19번 위치에 상당하는 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 아미노산인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 당쇄 부가 폴리펩티드는 상기 (E)의 폴리펩티드에 있어서 2개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있고, 여기서 상기 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 1개 이상의 아미노산이 상기 (E)의 폴리펩티드의 N말단 측의 상기 J개의 아미노산에 존재하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 당쇄 부가 폴리펩티드는 상기 (F)의 폴리펩티드에 있어서 2개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있고, 여기서 상기 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 1개 이상의 아미노산이 상기 (F)의 폴리펩티드의 C말단 측의 상기 K개의 아미노산에 존재하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 당쇄 부가 폴리펩티드는 SRIF28과 비교하여 증대된 혈중 안정성을 갖는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 당쇄 부가 폴리펩티드는 SRIF28과 비교하여 10배 이상 증대된 혈중 반감기를 갖는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성이 SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4 및 SSTR5로 이루어진 군으로부터 선택되는 수용체의 적어도 2 이상의 수용체에 대한 친화성을 갖는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 당쇄 부가 폴리펩티드가 SSTR1 및 SSTR4 중 어느 1개 이상에 대해서 친화성을 갖는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 당쇄 부가 폴리펩티드가 SSTR1 및 SSTR4 양쪽에 대해서 친화성을 갖는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 당쇄 부가 폴리펩티드가 SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4 및 SSTR5 모두에 대해서 친화성을 갖는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 각 당쇄 부가 아미노산이 당쇄 부가 Asn 또는 당쇄 부가 Cys인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 각 당쇄 부가 아미노산에 있어서 당쇄와 아미노산이 링커를 매개로 하지 않고 결합되어 있는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 각 당쇄 부가 아미노산에 있어서 당쇄가 4개 이상의 당으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 각 당쇄 부가 아미노산에 있어서 당쇄가 2본쇄 복합형 당쇄(biantennary complex-type sugar chain), 3본쇄 복합형 당쇄 또는 4본쇄 복합형 당쇄인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 각 당쇄 부가 아미노산에 있어서 당쇄가 2본쇄 복합형 당쇄인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 2본쇄 복합형 당쇄가 디시알로 당쇄, 모노시알로 당쇄, 아시알로 당쇄, 디글크낙 당쇄 및 디만노오스 당쇄로 이루어진 군으로부터 선택되는 당쇄인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 각 당쇄 부가 아미노산에 있어서 당쇄가 하기 식：

[식 중, R₁ 및 R₂는 동일 또는 상이하고,

를 나타내며, Ac는 아세틸기를 나타낸다.]

으로 표시되는 당쇄인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 당쇄가 비환원 말단에 1개 이상의 시알산을 가지고 있고, 상기 시알산의 카르복시기가 탄소수 1~30의 알킬아미노기, 벤질기, 아미노기 또는 아미노에틸아미노기에 의해 수식되어 있는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 당쇄 부가 폴리펩티드는 복수의 당쇄 부가 아미노산을 가지고 있고, 상기 각 당쇄 부가 아미노산에 있어서의 당쇄가 모두 동일한 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 당쇄 부가 폴리펩티드는 SRIF28에 있어서의 17번 위치의 Cys와 28번 위치의 Cys에 상당하는 Cys를 가지고 있고, 또한 이들 Cys는 서로 디설피드 결합되어 있는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 당쇄 부가 폴리펩티드의 C말단은 아미드화되어 있는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 당쇄 부가 폴리펩티드의 N말단에 아지드기가 도입되어 있는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 일실시태양에 있어서는 상기 당쇄 부가 폴리펩티드가 표지되어 있는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 다른 태양은 (I) 상기에 기재하는 당쇄 부가 폴리펩티드 및/또는 약학적으로 허용되는 그의 염, 및 (II) 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명의 의약 조성물의 일실시태양에 있어서는 상기 당쇄 부가 폴리펩티드에 있어서 당쇄가 실질적으로 균일한 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 의약 조성물의 일실시태양에 있어서는 소마토스타틴에 관련된 질환의 치료 또는 예방을 위해서 사용되는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 의약 조성물의 일실시태양에 있어서는 상기 소마토스타틴에 관련된 질환이 말단 비대증, 거인증, 알츠하이머병 및 다른 형태의 치매, 암, 호르몬 생산 종양, 내분비 종양, 카르시노이드, 비포마(VIPoma), 인슐리노마, 글루카고노마, 쿠싱병, 호르몬 분비 이상, 당뇨병 및 그의 합병증, 동통, 관절염, 설사, 위궤양, 염증성 장질환, 과민성 장증후군, 소화관 폐색, 장폐색증, 수술 후 재협착, 방사선 장애, 안질환, 안구 건조, 녹내장, 각막실질의 염증, 홍채염, 백내장 및 결막염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 질환인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 다른 태양은 상기에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드의 유효량을 투여하는 것을 특징으로 하는, 소마토스타틴에 관련된 질환의 치료 또는 예방방법에 관한 것이다.

또한 본 발명의 치료 또는 예방방법의 일실시태양에 있어서는 상기 소마토스타틴에 관련된 질환이 말단 비대증, 거인증, 알츠하이머병 및 다른 형태의 치매, 암, 호르몬 생산 종양, 내분비 종양, 카르시노이드, 비포마, 인슐리노마, 글루카고노마, 쿠싱병, 호르몬 분비 이상, 당뇨병 및 그의 합병증, 동통, 관절염, 설사, 위궤양, 염증성 장질환, 과민성 장증후군, 소화관 폐색, 장폐색증, 수술 후 재협착, 방사선 장애, 안질환, 안구 건조, 녹내장, 각막실질의 염증, 홍채염, 백내장 및 결막염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 질환인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 가지고 있고 또한 폴리펩티드 중에 2개 이상의 당쇄를 가짐으로써 소마토스타틴에 비해서 현저히 향상된 혈중 안정성을 갖는다. 또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는 상기 특징을 가짐으로써 소마토스타틴 관련 질환의 치료에 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 소마토스타틴에 부가되는 당쇄는 생체 내에서 용이하게 분해되기 때문에 그의 축적에 의해 생체에 약해를 주는 경우는 없다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 소마토스타틴에 부가되는 당쇄의 일부 또는 전부는 인간을 포함하는 포유류 조류 등의 생체 내에 존재하는 당쇄나 그의 개변체로 체내에 투여해도 부작용이나 항원성을 나타낼 가능성이 낮다. 알레르기 반응이나 항체 생산이 발생하거나 그것에 의해 약효가 얻어지지 않게 되는 등의 걱정이 적다.

또한 본 발명에서 사용되는 당쇄에는 비교적 짧은 것이 많기 때문에 복잡한 제조공정을 거치지 않고 균일한 구조의 것을 얻을 수 있다. 따라서 대규모이고 또한 안정하게 의약품 레벨이 고품질인 소마토스타틴 활성을 갖는 당쇄 부가 폴리펩티드를 얻을 수 있다.

도 1a~도 1d는 본 발명의 일실시형태에 있어서의 당쇄 부가 폴리펩티드에 대한 각 화합물명과 당해 화합물명을 갖는 당쇄 부가 폴리펩티드의 아미노산 서열 정보를 나타낸 도면이다. 또한 도 1e는 SRIF14, SRIF28 및 본 발명의 일실시형태에 있어서의 당쇄 부가 폴리펩티드를 소마토스타틴 수용체 발현 세포에 처치했을 때의 cAMP 생산 억제 작용(아고니스트 활성)에 대한 IC₅₀의 값을 나타내는 그래프이다.
도 2는 SRIF28 및 S1C(disialo)-SRIF28을 랫트에 정맥 내 투여 또는 피하 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 2 중 왼쪽 그래프가 정맥 내 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이고, 오른쪽 그래프가 피하 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 3은 SRIF28, S1C(disialo)-SRIF28, N5C(disialo)-SRIF28, S1C(disialo)·N5C(disialo)-SRIF28을 랫트에 정맥 내 투여 및 피하 투여했을 때의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 3 중 왼쪽 그래프가 정맥 내 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이고, 오른쪽 그래프가 피하 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 4는 SRIF28, S1C(disialo)-SRIF28, S1C(disialo)·R13C(disialo)-SRIF28, S1C(disialo)·N5C(disialo)·A9C(disialo)-SRIF28을 랫트에 정맥 내 투여 및 피하 투여했을 때의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 4 중 왼쪽 그래프가 정맥 내 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이고, 오른쪽 그래프가 피하 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 5는 S1C(disialo)-SRIF28, S1C(disialo)·N5C(disialo)·A9C(disialo)-SRIF28, 3C(disialo)-SRIF28, 5C(disialo)-SRIF28 및 10C(disialo)-SRIF28을 랫트에 정맥 내 투여 및 피하 투여했을 때의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 5 중 왼쪽 그래프가 정맥 내 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이고, 오른쪽 그래프가 피하 투여했을 때의 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 6은 S1C(disialo)-SRIF28, N5C(disialo)-SRIF28, A9C(disialo)-SRIF28, S1C(disialo)·N5C(disialo)-SRIF28, N5C(disialo)·A9C(disialo)-SRIF28, S1C(disialo)·N5C(disialo)·A9C(disialo)-SRIF28을 랫트에 정맥 내 투여 및 피하 투여했을 때의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 6 중 왼쪽 그래프가 정맥 내 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이고, 오른쪽 그래프가 피하 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 7은 S1C(disialo)-SRIF28, S1-2C(disialo)-SRIF28, S1-3C(disialo)-SRIF28을 랫트에 정맥 내 투여 및 피하 투여했을 때의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 7 중 왼쪽 그래프가 정맥 내 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이고, 오른쪽 그래프가 피하 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 8은 S1C(disialo)-SRIF28, S1C(disialo(amide))-SRIF28, S1C(disialo(aminoethylamide))-SRIF28을 랫트에 정맥 내 투여 및 피하 투여했을 때의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 8 중 왼쪽 그래프가 정맥 내 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이고, 오른쪽 그래프가 피하 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 9는 S1C(disialo)-SRIF28, S1C(disialo)-D-Trp22-SRIF28, S1C(disialo(Bn))-SRIF28을 랫트에 정맥 내 투여 및 피하 투여했을 때의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 9 중 왼쪽 그래프가 정맥 내 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이고, 오른쪽 그래프가 피하 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 10은 S1C(disialo)-SRIF28, R13C(disialo)-SRIF28, K14C(disialo)-SRIF28을 랫트에 정맥 내 투여 및 피하 투여했을 때의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 10 중 왼쪽 그래프가 정맥 내 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이고, 오른쪽 그래프가 피하 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 11은 S1C(disialo)-SRIF28, E12C(disialo)-SRIF28, N19C(disialo)-SRIF28, 29C(disialo)-SRIF28, S1C(monosialo)-SRIF28, S1C(asialo)-SRIF28을 랫트에 정맥 내 투여 및 피하 투여했을 때의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 11 중 왼쪽 그래프가 정맥 내 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이고, 오른쪽 그래프가 피하 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 12는 S1C(disialo)-SRIF28, K14C(disialo)-SRIF28, C(disialo)-SRIF14를 랫트에 정맥 내 투여 및 피하 투여했을 때의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 12 중 왼쪽 그래프가 정맥 내 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이고, 오른쪽 그래프가 피하 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 13은 C(disialo)-SRIF14, C(disialo)-C12linker-SRIF14, C(disialo)-PEGlinker-SRIF14를 랫트에 정맥 내 투여 및 피하 투여했을 때의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 13 중 왼쪽 그래프가 정맥 내 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이고, 오른쪽 그래프가 피하 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 14는 SRIF28, S1C(disialo)-SRIF28, S1C(asialo)-SRIF28, S1C(diGlcNAc)-SRIF28, S1C(diMan)-SRIF28, S1C(GlcNAc)-SRIF28을 랫트에 정맥 내 투여 및 피하 투여했을 때의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 14 중 왼쪽 그래프가 정맥 내 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이고, 오른쪽 그래프가 피하 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 15는 S1C(disialo)-SRIF28, S1C(trisialo)-SRIF28, S1C(tetrasialo)-SRIF28, S1-2C(disialo)-SRIF28, S1C(Asn(disialo))-SRIF28을 랫트에 정맥 내 투여 및 피하 투여했을 때의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 15 중 왼쪽 그래프가 정맥 내 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이고, 오른쪽 그래프가 피하 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 16은 SRIF28, S1C(disialo)-SRIF28, S1-2C(disialo)-SRIF28, S1-3C(disialo)-SRIF28, S1-4C(disialo)-SRIF28을 랫트에 정맥 내 투여 및 피하 투여했을 때의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 16 중 왼쪽 그래프가 정맥 내 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이고, 오른쪽 그래프가 피하 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 17은 SRIF14, C(disialo)-SRIF14, C(disialo)-K-SRIF14, C(disialo)-R-K-SRIF14, 2C(disialo)-R-K-SRIF14, 3C(disialo)-R-K-SRIF14를 랫트에 정맥 내 투여 및 피하 투여했을 때의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 17 중 왼쪽 그래프가 정맥 내 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이고, 오른쪽 그래프가 피하 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 18은 S1C(asialo)-SRIF28, S1-2C(asialo)-SRIF28, S1-3C(asialo)-SRIF28을 랫트에 정맥 내 투여 및 피하 투여했을 때의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 18 중 왼쪽 그래프가 정맥 내 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이고, 오른쪽 그래프가 피하 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 19는 S1C(disialo)-SRIF28, S1-2C(disialo)-SRIF28, S1-2C(asialo)-SRIF28, S1-2C(disialo(amide))-SRIF28, S1-2C(disialo(Bn))-SRIF28, C(disialo(aminoethylamide))-S1C(disialo)-SRIF28을 랫트에 정맥 내 투여 또는 피하 투여했을 때의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 19 중 왼쪽 그래프가 정맥 내 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이고, 오른쪽 그래프가 피하 투여했을 때의 각 폴리펩티드의 혈장 중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 20은 본 발명의 일실시형태에 있어서의 당쇄 부가 폴리펩티드에 대해서 랫트 혈장을 사용한 혈장 중 안정성 시험의 결과를 나타내는 그래프이다.

본 명세서에 있어서 「소마토스타틴」이란 14개의 아미노산 서열로 이루어지는 SRIF14 또는 28개의 아미노산 서열로 이루어지는 SRIF28을 가리킨다.

또한 본 명세서에 있어서 SRIF28의 아미노산 서열에 있어서의 N말단의 Ser을 1번 위치로 하고, C말단의 Cys를 28번 위치로 한다. 여기서 SRIF14는 SRIF28의 아미노산 서열에 있어서의 15번 위치로부터 28번 위치의 아미노산 서열과 완전 일치하고 있다. 또한 SRIF28의 아미노산 서열의 15번 위치는 Ala이지만 SRIF14의 아미노산 서열(서열번호 1)에 있어서의 N말단의 Ala를 SRIF28의 15번 위치에 대응시켜서 15번 위치로 한다. 또한 SRIF14 및 SRIF28은 17번 위치의 Cys와 28번 위치의 Cys에 있어서 디설피드 결합을 갖는다.

SRIF14는 하기의 아미노산 서열(서열번호 1)을 갖는다. 또한 하기 아미노산 서열에 있어서 「Ala₁₅」의 15는 15번 위치의 Ala인 것을 의미한다.

Ala₁₅-Gly₁₆-Cys₁₇-Lys₁₈-Asn₁₉-Phe₂₀-Phe₂₁-Trp₂₂-Lys₂₃-Thr₂₄-Phe₂₅-Thr₂₆-Ser₂₇-Cys₂₈

SRIF28은 하기의 아미노산 서열(서열번호 2)을 갖는다.

Ser₁-Ala₂-Asn₃-Ser₄-Asn₅-Pro₆-Ala₇-Met₈-Ala₉-Pro₁₀-Arg₁₁-Glu₁₂-Arg₁₃-Lys₁₄-Ala₁₅-Gly₁₆-Cys₁₇-Lys₁₈-Asn₁₉-Phe₂₀-Phe₂₁-Trp₂₂-Lys₂₃-Thr₂₄-Phe₂₅-Thr₂₆-Ser₂₇-Cys₂₈

본 명세서 중에 있어서 「아미노산」이란 그의 가장 넓은 의미로 사용되어 천연 아미노산뿐 아니라 아미노산 변이체 및 유도체 등과 같은 비천연 아미노산을 포함한다. 당업자라면 이 넓은 정의를 고려하여 본 명세서에 있어서의 아미노산으로서 예를 들면 천연 단백원성(natural proteinogenic) L-아미노산；D-아미노산；아미노산 변이체 및 유도체 등의 화학 수식된 아미노산；노르류신, β-알라닌, 오르니틴 등의 천연 비단백원성 아미노산；및 아미노산의 특징인 당업계에서 공지의 특성을 갖는 화학적으로 합성된 화합물 등을 들 수 있는 것을 이해할 것이다. 비천연 아미노산의 예로서 α-메틸아미노산(α-메틸알라닌 등), D-아미노산, 히스티딘 유사 아미노산(2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘 및 α-메틸-히스티딘 등), 측쇄에 여분의 메틸렌을 갖는 아미노산(「호모」아미노산) 및 측쇄 중의 카르복실산 관능기 아미노산이 설폰산기로 치환되는 아미노산(시스테인산 등)을 들 수 있다. 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 갖는 소마토스타틴 유연체의 몇 가지는 비천연 아미노산을 포함하는 것이 알려져 있다. 바람직한 태양에 있어서 본 발명의 화합물에 포함되는 아미노산은 천연 아미노산으로만 이루어진다.

본 명세서 중에 있어서 아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되었다고 하는 경우, 치환 등 되는 아미노산의 개수는 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 보유하는 한 특별히 한정되지 않지만 1~9개, 바람직하게는 1~5개, 보다 바람직하게는 1~3개 정도이거나 또는 전체 길이의 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내이다. 치환 또는 부가되는 아미노산은 천연 아미노산, 비천연 아미노산 또는 아미노산 아날로그일 수 있고, 바람직하게는 천연 아미노산이다. 아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 소마토스타틴 펩티드의 예로서는, 예를 들면 22번 위치의 Trp를 D체의 Trp(D-Trp)로 치환한 소마토스타틴 펩티드, 19번 위치의 Asn을 결실시킨 것(J. Med. Chem, 2001, 44, 2238-2246), 25번 위치의 Phe를 Tyr로 치환한 것, 8번 위치의 Met를 Leu로 치환한 것(Endocrinology, 1982, 10：1049-1051) 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 「SRIF14 또는 SRIF28의 유연체」란 소마토스타틴과 구조상 유사한 폴리펩티드 및/또는 소마토스타틴과 중복된 구조를 갖는 폴리펩티드, 예를 들면 소마토스타틴의 아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 보존적으로 치환된 폴리펩티드, 소마토스타틴 개변체, 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 갖는 소마토스타틴의 프래그먼트, 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 갖는 신장 소마토스타틴을 들 수 있다.

본 명세서 중에 있어서 「아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 보존적으로 치환된」이란 아미노산 치환에 있어서 원래의 아미노산과 치환되는 아미노산의 친수성 지수 및/또는 소수성 지수가 유사한 치환으로서 그러한 치환의 전후에서 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성의 명확한 저하 또는 소실을 발생시키지 않는 치환을 말한다.

본 명세서 중에 있어서 「소마토스타틴 개변체」란 소마토스타틴의 개변체로서 소마토스타틴의 천연에 존재하는 변이체 또는 소마토스타틴을 인공적으로 개변한 화합물을 포함하고, 그러한 개변으로서는 예를 들면 소마토스타틴의 1 또는 복수의 아미노산 잔기의 알킬화, 아실화(예를 들면 아세틸화), 아미드화, 카르복실화, 에스테르 형성, 디설피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 인산화, 수산화, 표지 성분의 결합 등을 들 수 있다.

본 명세서 중에 있어서 「소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 갖는 소마토스타틴의 프래그먼트」란 소마토스타틴의 N말단 및/또는 C말단으로부터 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실되고 또한 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 유지한 펩티드이다.

본 명세서 중에 있어서 「소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 갖는 신장 소마토스타틴」이란 SRIF28 또는 SRIF14의 N말단 및/또는 C말단에 1개 또는 그 이상의 아미노산이 부가되고 또한 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 유지한 펩티드이다.

본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드；서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드；또는 이들 폴리펩티드의 N말단 또는 C말단에 추가로 아미노산이 부가된 폴리펩티드；로서, 1개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있고 또한 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 갖는 당쇄 부가 폴리펩티드를 포함한다.

서열번호 1 또는 서열번호 2와 상동성을 갖는 폴리펩티드는 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 갖는 한 바람직하게는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다.

본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는 상기와 같이 SRIF14 또는 SRIF28의 N말단 및/또는 C말단에 추가로 아미노산이 부가된 폴리펩티드도 포함한다.

본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드에 있어서 SRIF14의 N말단에 추가로 부가되는 아미노산은 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 유지하는 한 특별히 제한되지 않지만 예를 들면 1 이상 20개 이하의 아미노산을 부가할 수 있다.

여기서 SRIF14의 N말단에 추가로 부가되는 아미노산은 X-Y-로 표시할 수 있다. 또한 Y는 SRIF14의 폴리펩티드에 있어서의 N말단 아미노산에 직접 결합하는 아미노산이고, Y는 아래 (1)~(15) 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진다：

(1) Lys,

(2) Arg-Lys,

(3) Glu-Arg-Lys,

(4) Arg-Glu-Arg-Lys,

(5) Pro-Arg-Glu-Arg-Lys,

(6) Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys,

(7) Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys,

(8) Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys,

(9) Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys,

(10) Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys,

(11) Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys,

(12) Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys,

(13) Ala-Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys,

(14) Ser-Ala-Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys, 및

(15) 상기 서열 (2)~(14)에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 서열

또한 X는 1 이상 6 이하의 임의의 아미노산으로서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 임의의 아미노산을 나타낸다. 바람직하게는 X는 당쇄 부가 아미노산이고, 보다 바람직하게는 당쇄 부가 Asn 또는 당쇄 부가 Cys이다.

본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드에 있어서 SRIF28의 N말단에 추가로 부가되는 아미노산은 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 유지하는 한 특별히 제한되지 않지만 예를 들면 1 이상 15개 이하의 임의의 아미노산을 부가할 수 있고, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 임의의 아미노산을 부가할 수 있다. SRIF28의 N말단에 추가로 부가되는 아미노산은 바람직하게는 당쇄 부가 아미노산이고, 보다 바람직하게는 당쇄 부가 Asn 또는 당쇄 부가 Cys이다. 또한 1 이상 15개 이하의 임의의 아미노산은 그 전체를 당쇄 부가 아미노산으로 하는 것도 가능하다.

본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드에 있어서 SRIF14 또는 SRIF28의 C말단에 추가로 부가되는 아미노산은 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 유지하는 한 특별히 제한되지 않지만 예를 들면 1 이상 6개 이하의 임의의 아미노산을 부가할 수 있고, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 임의의 아미노산을 부가할 수 있다. SRIF14 또는 SRIF28의 C말단에 추가로 부가되는 아미노산은 바람직하게는 당쇄 부가 아미노산이고, 보다 바람직하게는 당쇄 부가 Asn 또는 당쇄 부가 Cys이다. 또한 1 이상 6개 이하의 임의의 아미노산은 그 전체를 당쇄 부가 아미노산으로 하는 것도 가능하다.

본 명세서 중에 있어서 「소마토스타틴의 N말단 측(SRIF28의 1번 위치 또는 SRIF14의 15번 위치)에 추가로 1 또는 수개의 아미노산이 부가된 펩티드」라 하는 경우, SRIF28에 있어서는 N말단인 1번 위치의 Ser에 추가로 임의의 아미노산 또는 당쇄 부가 아미노산이 부가된 것을 말한다. 또한 SRIF14에 있어서는 N말단인 15번 위치의 Ala에 추가로 임의의 아미노산 또는 당쇄 부가 아미노산이 부가된 것을 말한다.

동일하게 「C말단 측(SRIF28 또는 SRIF14의 28번 위치)에 추가로 1 또는 수개의 아미노산이 부가된 펩티드」라 하는 경우, SRIF28 또는 SRIF14의 28번 위치의 Cys에 추가로 임의의 아미노산 또는 당쇄 부가 아미노산이 부가된 것을 말한다.

본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는 그의 N말단 또는 C말단에 링커를 매개로 아미노산을 추가로 부가하는 것도 가능하다. 이러한 링커로서는 예를 들면 아미노산과 펩티드 결합할 수 있도록 양 말단에 아미노기 및 카르복시기를 갖는 알킬 사슬이나 폴리에틸렌글리콜 사슬 등을 들 수 있다. 이러한 링커로서는 예를 들면 -NH-(CH₂)_n-CO-(식 중, n은 정수이고, 목적으로 하는 링커 기능을 저해하지 않는 한 한정되는 것은 아니지만 바람직하게는 1~15의 정수를 나타낸다.)나 -NH-(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂-CO-(식 중, m은 정수이고, 목적으로 하는 링커 기능을 저해하지 않는 한 한정되는 것은 아니지만 바람직하게는 1~7의 정수를 나타낸다.) 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는 -NH-(CH₂)₁₁-CO-(C12linker)나 -NH-(CH₂CH₂O)₃-CH₂CH₂-CO-(PEGlinker) 등을 들 수 있다. 또한 링커를 매개로 당쇄 부가 폴리펩티드에 부가되는 아미노산은 특별히 한정되지 않지만 바람직하게는 당쇄 부가 아미노산이다. 당쇄 부가 아미노산으로서는 예를 들면 당쇄 부가 Asn 또는 당쇄 부가 Cys를 들 수 있다.

또한 본 발명의 일실시태양에 있어서 당쇄 부가 폴리펩티드는 그의 N말단에 아지드기를 도입하는 것도 가능하다. 당쇄 부가 폴리펩티드의 N말단을 아지드화하면 아지드-알킨[3＋2] 환화 부가 반응(cycloaddition reaction)이나 Staudinger 반응 등을 이용하여 여러 가지 분자를 선택적으로 도입할 수 있는 것으로부터 바람직하다. 당쇄 부가 폴리펩티드를 아지드화하는 방법은 특별히 제한되지 않지만 예를 들면 고상합성 중에 있어서 수지 상에 합성된 당펩티드의 N말단에 축합제를 사용하여 아지도 치환 지방산을 축합시킴으로써 얻을 수 있다. 아지도 치환 지방산으로서는 4-아지도부탄산, 5-아지도-펜탄산(5-Azido-pentanoic acid), 6-아지도헥산산을 들 수 있다.

또한 본 발명의 일실시태양에 있어서 당쇄 부가 폴리펩티드는 그의 N말단에 표지 화합물을 부가시키는 것도 가능하다. 본 발명에 사용되는 표지 화합물로서는 아래에 한정되지 않지만 예를 들면 비오틴, 형광색소, 금속 이온 킬레이트제 등을 들 수 있다. 표지 화합물은 당펩티드의 N말단과 직접 결합시키는 것도 가능하고 링커를 매개로 당펩티드의 N말단과 결합시키는 것도 가능하다. 예를 들면 표지 화합물로서 비오틴을 당펩티드의 N말단에 부가시킴으로써 아비딘과의 강한 결합을 이용하여 연구용 시약, 임상 검사약 또는 미사일 요법으로의 응용을 가능하게 할 수 있다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드로의 표지 화합물의 부가는 종래 당업자에게 주지의 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면 고상합성 중에 있어서의 수지 상의 당쇄 부가 폴리펩티드의 N말단에 축합제를 사용하여 표지 화합물을 축합시킬 수 있다.

본 발명의 「당쇄 부가 폴리펩티드」는 2개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 한다.

본 명세서 중에 있어서 「당쇄 부가 폴리펩티드」에는 소마토스타틴의 2개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 폴리펩티드, 상기 소마토스타틴 유연체에 있어서 2개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 폴리펩티드 등이 포함되며, 각각 추가로 당쇄 부가 아미노산 이외의 아미노산의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되어 있어도 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드에 포함된다. 이들 펩티드의 C말단이 아미드화된 펩티드(예를 들면 Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-NH₂(서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 SRIF14NH₂나, Ser-Ala-Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-NH₂(서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 SRIF28NH₂의 2개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 펩티드도 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드에 포함된다. 또한 이들 펩티드의 염도 당쇄 부가 폴리펩티드에 포함된다.

본 명세서 중에 있어서 염은 산 부가염 또는 염기 부가염 중 어느 것이어도 된다. 산 부가염을 형성하기 위해 통상 사용되는 산은 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 인산 등의 무기산 및 p-톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 옥살산, p-브로모페닐설폰산, 카르복실산, 숙신산, 구연산, 안식향산, 초산 등의 유기산이다. 염기 부가염으로서는 수산화암모늄 또는 알칼리 또는 알칼리토류금속 수산화물, 탄산염, 중탄산염 등의 무기 염기로부터 유도된 염을 들 수 있다. 특히 약학적으로 허용되는 염이 바람직하다.

본 명세서 중에 있어서 「당쇄 부가 아미노산」이란 당쇄가 결합한 아미노산으로, 여기서 당쇄와 아미노산은 링커를 매개로 결합되어 있어도 된다. 당쇄와 아미노산의 결합 부위에 특별히 제한은 없지만 당쇄의 환원 말단에 아미노산이 결합되어 있는 것이 바람직하다.

당쇄가 결합하는 아미노산의 종류에 특별히 한정은 없고 천연 아미노산, 비천연 아미노산 중 어느 것을 사용하는 것도 가능하다. 당쇄 부가 아미노산이 생체 내에 당펩티드(당단백질)로서 존재하는 것과 동일 또는 유사한 구조를 갖는다고 하는 관점에서는 당쇄 부가 아미노산은 N-결합형 당쇄와 같은 당쇄 부가 Asn, O-결합형 당쇄와 같은 당쇄 부가 Ser 및 당쇄 부가 Thr이 바람직하고, 특히 당쇄 부가 Asn이 바람직하다.

또한 당쇄와 아미노산이 링커를 매개로 결합되어 있는 경우 링커와의 결합 용이성이라고 하는 관점에서는, 당쇄 부가 아미노산의 아미노산은 아스파라긴산이나 글루타민산 등의 분자 내에 2개 이상의 카르복시기를 갖는 아미노산, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 트립토판 등의 분자 내에 2 이상의 아미노기를 갖는 아미노산, 세린, 트레오닌, 티로신 등의 분자 내에 수산기를 갖는 아미노산, 시스테인 등의 분자 내에 티올기를 갖는 아미노산, 아스파라긴, 글루타민 등의 분자 내에 아미드기를 갖는 아미노산이 바람직하다. 특히 반응성의 관점에서는 아스파라긴산, 글루타민산, 리신, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민이 바람직하다.

또한 본 발명의 임의의 당쇄 부가 폴리펩티드에 대해서 당쇄 구조, 당쇄 이외의 구조, 당쇄의 부가 부위 및 당쇄의 부가 수가 동일한 경우에, 당쇄 부가 아미노산이 당쇄 부가 Asn(링커를 매개로 하지 않는다)의 경우와 당쇄 부가 Cys(링커를 매개로 한다)의 경우에서 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 혈중 반감기에 큰 차이는 없다고 생각된다.

당쇄와 아미노산이 링커를 매개로 결합되어 있는 경우 링커로서는 당해 분야에 있어서 사용되고 있는 것을 널리 사용할 수 있는데, 예를 들면 -NH-(CO)-(CH₂)_a-CH₂-(식 중, a는 정수이고, 목적으로 하는 링커 기능을 저해하지 않는 한 한정되는 것은 아니지만 바람직하게는 0~4의 정수를 나타낸다.), C₁ _-10 폴리메틸렌, -CH₂-R-(여기서 R은 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 탄소환기, 치환된 탄소환기, 복소환기 및 치환된 복소환기로 이루어진 군으로부터 선택되는 기로부터 수소원자가 1개 탈리하여 생기는 기이다), -(CO)-(CH₂)_a-(CO)-(식 중, a는 정수이고, 목적으로 하는 링커 기능을 저해하지 않는 한 한정되는 것은 아니지만 바람직하게는 0~4의 정수를 나타낸다.) 등을 들 수 있다.

당쇄 부가 아미노산에 있어서 당쇄와 소마토스타틴 골격 상의 아미노산이 링커를 매개로 결합되어 있는 경우 링커가 당쇄 측 말단에 아미노산을 포함하는 것도 바람직하다. 아미노산의 종류는 특별히 한정되지 않지만 바람직한 예로서는 Asn을 들 수 있다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는 그 기재(예를 들면 「아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 당쇄 부가 폴리펩티드」라는 기재)에 의해 조금도 제조방법이 한정되는 것은 아니고, 후술의 A법 또는 B법 중 어느 방법으로 제조한 당쇄 부가 폴리펩티드이더라도 「아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 당쇄 부가 폴리펩티드」에 포함된다. 또한 예를 들면 아미노산이 결합되어 있지 않은 당쇄를 펩티드 상의 아미노산에 직접 또는 링커를 매개로 결합한 당쇄 부가 폴리펩티드；당쇄 부가 폴리펩티드에 있어서 부가한 당쇄에 추가로 당 또는 당쇄를 부가함으로써 이미 부가된 당쇄를 신장시킨 당쇄 부가 폴리펩티드；당쇄 부가 아미노산의 아미노기 및/또는 카르복시기에 1 또는 수개의 아미노산을 결합시키고, 추가로 이를 1 또는 복수의 소마토스타틴 프래그먼트와 연결시킨 당쇄 부가 폴리펩티드；아미노산이 결합된 당쇄를 펩티드 상의 아미노산에 링커를 매개로 결합한 당쇄 부가 폴리펩티드 등도 최종적인 구조가 일치하고 있는 한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드에 포함된다.

본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드에 있어서 당쇄 부가 아미노산으로 치환되는 아미노산의 수는 혈중 안정성이나 성장호르몬 등의 분비 억제 등의 생리활성, 최종적인 당쇄 부가 폴리펩티드에 존재하는 아미노산의 개수나 당쇄 부가 전후의 당쇄 부가 폴리펩티드의 분자량 등으로 적절히 조절하면 된다. 예를 들면 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는 그의 아미노산 서열에 있어서의 아미노산을 2~15개 당쇄 부가 아미노산으로 치환할 수 있다. 또한 혈중 안정성의 관점에서는 목적하는 활성이 얻어지는 것이라면 2개 이상 치환하는 것이 바람직하고, 예를 들면 2~10개 치환하는 것이 바람직하며, 2~3개 치환하는 것이 보다 바람직하다. 일반적으로 소마토스타틴의 1개의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 당쇄 부가 폴리펩티드에 있어서 당쇄 부가 아미노산 이외의 아미노산의 1개 이상을 추가로 당쇄 부가 아미노산으로 치환한 경우, 혈중 안정성은 증대된다. 한편으로 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성은 감소되는 경향이 있지만 당쇄 부가 폴리펩티드의 혈중 안정성은 증대되기 때문에 감소한 소마토스타틴 활성을 보상 또는 증대시키는 것이 가능하다.

또한 당쇄 부가 폴리펩티드 중에 복수의 당쇄를 갖는 경우 당쇄끼리는 당쇄 부가 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서 연속된 아미노산에 부가하는 것도 가능하고, 간격을 두고 아미노산에 부가하는 것도 가능하다. 당쇄를 빽빽하게 배치하면 급격한 혈장 중 농도의 상승이 없는 점에 있어서 바람직하다. 당쇄를 빽빽하게 배치할 때에는 예를 들면 SRIF14 또는 SRIF28의 N말단에 2~15개 정도의 연속된 당쇄 부가 아미노산을 부가시킬 수 있다. 또한 생물학적 이용능의 관점에서는 당쇄를 부가하는 위치는 연속된 아미노산에 빽빽하게 부가하는 것보다도 간격을 두고 복수의 당쇄를 부가하는 편이 바람직하다.

본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드에 있어서 아미노산을 당쇄 부가 아미노산으로 치환하는 부위는 1개 이상의 소마토스타틴 수용체로의 친화성을 갖는 관점에서 적절히 조절할 수 있고, 바람직하게는 복수의 소마토스타틴 수용체로의 친화성을 갖는 관점에서 적절히 조절할 수 있다.

본 발명의 일태양에 있어서 아미노산을 당쇄 부가 아미노산으로 치환하는 부위는 당쇄 부가 폴리펩티드의 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성 중 복수의 SSTR1~SSTR5의 수용체에 대해서 친화성을 갖는다고 하는 관점에서는, 예를 들면 SRIF14에 있어서의 19번 위치에 상당하는 아미노산, SRIF14의 N말단 측에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서 N말단 측으로부터 1번째, 2번째, 3번째, 6번째, 10번째 및 14번째에 부가되는 아미노산, 및 SRIF14의 C말단 측에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서 C말단 측으로부터 1번째 및 2번째에 부가되는 아미노산을 들 수 있다. 바람직하게는 SRIF14의 N말단 측에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서 N말단 측으로부터 3번째, 6번째, 10번째 및 14번째에 부가되는 아미노산을 들 수 있다.

또한 동일하게 복수의 SSTR1~SSTR5의 수용체에 대해서 친화성을 갖는다고 하는 관점에서는 SRIF28에 있어서의 1번 위치, 5번 위치, 9번 위치, 12번 위치, 13번 위치, 14번 위치 및 19번 위치에 상당하는 아미노산, 및 SRIF28의 C말단에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서 C말단 측으로부터 1번째 및 2번째에 부가되는 아미노산을 들 수 있다. 바람직하게는 SRIF28의 1번 위치, 5번 위치, 9번 위치 및 12번 위치에 상당하는 아미노산을 들 수 있다.

또한 특히 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 2 이상의 아미노산을 당쇄 부가 아미노산으로 치환하는 경우의 예로서, 당쇄 부가 폴리펩티드가 복수의 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 갖는다고 하는 관점에서는, 예를 들면 SRIF14의 N말단 측에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서 N말단 측으로부터 10번째 및 14번째에 부가되는 아미노산；SRIF14의 N말단에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서 N말단 측으로부터 6번째 및 10번째에 부가되는 아미노산；SRIF14의 N말단 측에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서 N말단 측으로부터 2번째 및 14번째에 부가되는 아미노산；SRIF14의 N말단 측에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서 N말단 측으로부터 14번째 및 15번째에 부가되는 아미노산；SRIF14의 N말단 측에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서 N말단 측으로부터 14번째, 15번째 및 16번째에 부가되는 아미노산；SRIF14의 N말단 측에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서 N말단 측으로부터 6번째, 10번째 및 14번째에 부가되는 아미노산의 치환 등을 들 수 있다. 바람직하게는 SRIF14의 N말단 측에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서 N말단 측으로부터 10번째 및 14번째에 부가되는 아미노산；SRIF14의 N말단에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서 N말단 측으로부터 6번째 및 10번째에 부가되는 아미노산；SRIF14의 N말단 측에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서 N말단 측으로부터 14번째 및 15번째에 부가되는 아미노산；SRIF14의 N말단 측에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서 N말단 측으로부터 14번째, 15번째 및 16번째에 부가되는 아미노산；SRIF14의 N말단 측에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서 N말단 측으로부터 6번째, 10번째 및 14번째에 부가되는 아미노산의 치환 등을 들 수 있다.

또한 동일하게 2 이상의 아미노산을 당쇄 부가 아미노산으로 치환하는 경우의 예로서, 당쇄 부가 폴리펩티드가 복수의 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 갖는다고 하는 관점에서는 SRIF28에 있어서의 1번 위치와 5번 위치에 상당하는 아미노산；5번 위치와 9번 위치에 상당하는 아미노산；1번 위치와 13번 위치에 상당하는 아미노산；1번 위치에 상당하는 아미노산과 1번 위치의 N말단 측에 추가로 부가하는 아미노산에 있어서 N말단 측으로부터 1번째에 부가되는 아미노산；1번 위치에 상당하는 아미노산과 1번 위치의 N말단 측에 추가로 부가하는 아미노산에 있어서 N말단 측으로부터 1번째 및 2번째에 부가되는 아미노산；1번 위치, 5번 위치 및 9번 위치에 상당하는 아미노산의 치환 등을 들 수 있고, 바람직하게는 1번 위치와 5번 위치에 상당하는 아미노산의 치환；5번 위치와 9번 위치에 상당하는 아미노산의 치환；1번 위치에 상당하는 아미노산의 치환과 1번 위치의 N말단 측에 추가로 부가하는 아미노산에 있어서 1번째에 부가되는 아미노산；1번 위치에 상당하는 아미노산과 1번 위치의 N말단 측에 추가로 부가하는 아미노산에 있어서 N말단 측으로부터 1번째 및 2번째에 부가되는 아미노산；1번 위치, 5번 위치 및 9번 위치에 상당하는 아미노산의 치환이다.

본 발명의 일태양에 있어서 아미노산을 당쇄 부가 아미노산으로 치환하는 부위는 당쇄 부가 폴리펩티드의 혈중 안정성이라는 관점에서는, 예를 들면 SRIF14에 있어서의 19번 위치에 상당하는 아미노산, SRIF14의 N말단에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서 N말단 측으로부터 1번째, 2번째, 3번째, 6번째, 10번째, 14번째에 부가되는 아미노산, SRIF14의 C말단 측에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서 C말단 측으로부터 1번째 및 2번째에 부가되는 아미노산을 들 수 있다. 바람직하게는 SRIF14에 있어서의 19번 위치에 상당하는 아미노산, SRIF14의 N말단 측에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서 N말단 측으로부터 1번째 및 2번째에 부가되는 아미노산, SRIF14의 C말단 측에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서 C말단 측으로부터 1번째 및 2번째에 부가되는 아미노산을 들 수 있다. 보다 바람직하게는 SRIF14에 있어서의 19번 위치에 상당하는 아미노산, SRIF14의 N말단 측에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서 N말단 측으로부터 1번째에 부가되는 아미노산 및 SRIF14의 C말단 측에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서 C말단 측으로부터 1번째에 부가되는 아미노산이다.

또한 동일하게 당쇄 부가 폴리펩티드의 혈중 안정성이라는 관점에서는, 예를 들면 SRIF28에 있어서의 1번 위치, 5번 위치, 9번 위치, 12번 위치, 13번 위치, 14번 위치 및 19번 위치에 상당하는 아미노산 및 SRIF28의 C말단에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서 C말단 측으로부터 1번째 및 2번째에 부가되는 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산이고, 바람직하게는 SRIF28에 있어서의 13번 위치, 14번 위치 및 19번 위치에 상당하는 아미노산 및 SRIF28의 C말단에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서 C말단 측으로부터 1번째 및 2번째에 부가되는 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산이며, 특히 바람직하게는 SRIF28에 있어서의 14번 위치 및 19번 위치에 상당하는 아미노산 및 SRIF28의 C말단에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서 C말단 측으로부터 1번째에 부가되는 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산이다. 특히 SRIF28의 N말단으로부터 먼 부위의 아미노산의 치환도 바람직하다.

여기서 「특정 아미노산에 상당하는 아미노산」이란 당쇄 폴리펩티드에 있어서 아미노산의 부가, 결실 등이 없는 한 SRIF14 또는 SRIF28의 아미노산 서열에 대응하는 동일한 위치의 아미노산을 말한다. 또한 당쇄 폴리펩티드의 아미노산 서열 내에 있어서 아미노산의 부가, 결실이 존재하는 경우에는 아미노산의 부가, 결실에 의한 아미노산 서열 상의 이동을 고려한 위치에 있는 아미노산을 말한다. 예를 들면 1번 위치로부터 4번 위치까지 Ser₁-Ala₂-Asn₃-Ser₄-의 서열을 갖는 당쇄 부가 폴리펩티드에 있어서 2번 위치와 3번 위치의 아미노산 사이에 1개의 아미노산(Trp)이 부가된 경우(Ser-Ala-Trp-Asn-Ser-), 3번 위치의 아미노산(Asn)에 상당하는 아미노산은 당쇄 부가 폴리펩티드에 있어서 Trp의 삽입에 의해 C말단 측으로 1개 이동한 아미노산(Asn)을 말한다.

본 발명의 일태양에 있어서 당쇄 부가 아미노산으로 치환하는 아미노산은 SRIF28에 있어서의 17번 위치, 21번 위치, 22번 위치, 23번 위치 및 28번 위치에 상당하는 아미노산 이외의 아미노산으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산인 것이 바람직하고, 특히 SRIF28에 있어서의 17번 위치, 22번 위치, 23번 위치 및 28번 위치에 상당하는 아미노산 이외의 아미노산으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산인 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 일태양에 있어서 2 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있는 경우에 아미노산을 당쇄 부가 아미노산으로 치환하는 부위는 상기 중 어느 조합도 채용할 수 있지만 이것에 한정되지 않는다. 예를 들면 1의 부위가 상기의 바람직한 부위로부터 선택되고, 다른 부위가 SRIF14 또는 SRIF28의 임의의 부위로부터 선택되는 조합；1의 부위가 상기의 바람직한 부위로부터 선택되고, 다른 부위가 소마토스타틴의 N말단(SRIF28에 있어서의 1번 위치, 또는 SRIF14에 있어서의 15번 위치) 또는 C말단에 추가로 부가된 1 또는 수개의 아미노산의 임의의 부위로부터 선택되는 조합 등도 또한 본 발명의 바람직한 일태양에 포함된다. 또한 당쇄 부가 폴리펩티드에 있어서 2개 이상의 아미노산이 상기에서 특정되는 아미노산에 있어서 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있는 것이 보다 바람직하다. 또한 당쇄 부가 폴리펩티드 중에 포함되는 모든 당쇄 부가 아미노산이 상기에서 특정되는 아미노산에 있어서 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 것인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드 중 2개의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있는 당쇄 부가 폴리펩티드에 있어서의 2개의 치환되어 있는 아미노산의 조합은 예를 들면 SRIF14에 있어서 19번 위치에 상당하는 아미노산, SRIF14의 N말단에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서의 N말단 측으로부터 1번째, 2번째, 3번째, 6번째, 10번째, 14번째의 아미노산, SRIF14의 C말단 측에 추가로 부가되는 아미노산에 있어서의 C말단 측으로부터 1번째 및 2번째의 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 아미노산으로 할 수 있다. 또한 동일하게 SRIF28에 있어서 1번 위치, 5번 위치, 9번 위치, 12번 위치, 13번 위치, 14번 위치 및 19번 위치에 상당하는 아미노산, 및 SRIF28의 C말단에 추가로 부가되는 1번째의 아미노산 및 SRIF28의 C말단에 추가로 부가되는 2번째의 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 아미노산을 들 수 있다.

3개의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있는 당쇄 부가 폴리펩티드나, 4개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있는 당쇄 부가 폴리펩티드의 치환 위치도 동일하게 상기에서 특정하는 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 3개 또는 4개 이상의 아미노산의 조합을 들 수 있다. 그러나 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는 상기에서 예로 든 조합에 한정되지 않고 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 갖고 천연에 존재하는 소마토스타틴에 비해 향상된 혈중 안정성을 갖는 한 그것 이외의 조합도 포함한다.

본 발명의 일태양에 있어서 당쇄 부가 아미노산 이외의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가가 발생하는 부위는 예를 들면 SRIF28에 있어서의 17번 위치, 22번 위치, 23번 위치 및 28번 위치에 상당하는 아미노산 이외의 아미노산으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산인 것이 바람직하다.

본 명세서 중에 있어서 「당쇄」란 단위당(단당 및/또는 그의 유도체)이 하나 이상 연결되어 생긴 화합물을 말한다. 단위당이 2개 이상 연결되는 경우 각각의 단위당끼리 사이는 글리코시드 결합에 의한 탈수축합에 의해 결합된다. 이러한 당쇄로서는 예를 들면 생체 중에 함유되는 단당류 및 다당류(글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 푸코오스, 크실로오스, N-아세틸글루코사민(GlcNAc), N-아세틸갈락토사민(GalNAc), 시알산 및 그들의 복합체 및 유도체) 외에 분해된 다당, 당단백질, 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸, 당지질 등의 복합 생체 분자로부터 분해 또는 유도된 당쇄 등 광범위한 것을 들 수 있지만 그들에 한정되지 않는다. 당쇄는 직쇄형이어도 되고 분기쇄형이어도 된다.

또한 본 명세서 중에 있어서 「당쇄」에는 당쇄의 유도체도 포함되고, 당쇄의 유도체로서는 예를 들면 당쇄를 구성하는 당이 카르복시기를 갖는 당(예를 들면 C-1번 위치가 산화되어 카르복실산이 된 알돈산(예를 들면 D-글루코오스가 산화된 D-글루콘산), 말단의 C원자가 카르복실산이 된 우론산(D-글루코오스가 산화된 D-글루크론산)), 아미노기 또는 아미노기의 유도체(예를 들면 아세틸화된 아미노기)를 갖는 당(예를 들면 N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-갈락토사민 등), 아미노기 및 카르복시기를 양쪽 모두 갖는 당(예를 들면 N-아세틸뉴라민산(시알산), N-아세틸무람산 등), 데옥시화된 당(예를 들면 2-데옥시-D-리보오스), 황산기를 포함하는 황산화당, 인산기를 포함하는 인산화당 등인 당쇄를 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서 바람직한 당쇄는 소마토스타틴에 부가된 경우(당쇄 부가 아미노산의 형태로 소마토스타틴의 아미노산과 치환된 경우)에 소마토스타틴의 혈중 안정성을 증대시키고 또한 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 소실시키지 않는 당쇄이다. 본 발명의 어떤 태양에 있어서 바람직한 당쇄는 소마토스타틴에 부가된 경우(당쇄 부가 아미노산의 형태로 소마토스타틴의 아미노산과 치환된 경우)에 소마토스타틴의 복수의 수용체에 대한 친화성을 유지할 수 있는 당쇄이고, 더욱 바람직하게는 소마토스타틴의 모든 수용체에 대한 친화성을 유지할 수 있는 당쇄이다.

본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드에 있어서의 당쇄는 특별히 한정되지 않고, 생체 내에서 복합 당질(당펩티드(또는 당단백질), 프로테오글리칸, 당지질 등)로서 존재하는 당쇄여도 되고 생체 내에서는 복합 당질로서 존재하지 않는 당쇄여도 된다.

생체 내에서 복합 당질로서 존재하는 당쇄는 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드가 생체에 투여된다고 하는 관점에서 바람직하다. 이러한 당쇄로서는 생체 내에서 당펩티드(또는 당단백질)로서 펩티드(또는 단백질)에 결합되어 있는 당쇄인 N-결합형 당쇄, O-결합형 당쇄 등을 들 수 있다. 바람직하게는 N-결합형 당쇄가 사용된다. N결합형 당쇄로서는 예를 들면 고만노오스(하이만노오스)형, 복합(컴플렉스)형, 혼성(하이브리드)형을 들 수 있고, 특히 바람직하게는 복합형이 좋다.

본 발명에서 사용하는 바람직한 복합형 당쇄로서는 예를 들면 하기 일반식

[식 중, R₁ 및 R₂는 동일 또는 상이하고,

를 나타낸다. Ac는 아세틸기를 나타낸다.]

으로 표시되는 당쇄 등을 들 수 있다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드에 있어서는 당쇄가 생체 내에서 복합 당질로서 존재하는 당쇄여도 되고, O-결합형 및 N-결합형 이외의 방법으로 소마토스타틴 펩티드에 결합되어 있어도 된다. 예를 들면 전술한 바와 같이 당쇄가 링커를 매개로 Cys나 Lys에 결합되어 있는 것도 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드에 포함된다.

본 발명의 일태양에 있어서 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드에 있어서의 당쇄는 4개 이상, 예를 들면 5개 이상, 7개 이상, 특히 9개 이상, 11개 이상의 당으로 이루어지는 당쇄인 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 일태양에 있어서 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드에 있어서의 당쇄는 5~11개, 9~11개 또는 11개의 당으로 이루어지는 당쇄이다.

본 발명의 바람직한 일태양에 있어서 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드에 있어서의 당쇄는 2본쇄 복합형 당쇄이다. 복합형 당쇄란 2종류 이상의 단당을 포함하고, 아래에 나타내는 기본 구조와 Galβ1-4GlcNAc로 나타내어지는 락토사민 구조를 갖는 것을 특징으로 한다.

2본쇄 복합형 당쇄란 기본 구조의 말단의 2개의 만노오스에 각각 0~3당으로 이루어지는 단일가닥의 당쇄가 결합되어 있는 것을 말한다. 2본쇄 복합형 당쇄로서는 예를 들면 아래에 나타내는 디시알로 당쇄,

모노시알로 당쇄,

아시알로 당쇄,

디글크낙 당쇄,

디만노오스 당쇄,

등이 바람직하고, 보다 바람직하게는 디시알로 당쇄이다.

또한 본 발명의 복합형 당쇄에는 상기의 2본쇄 복합형 당쇄 외에 3본쇄 복합형 당쇄(3분기형 복합형 당쇄), 4본쇄 복합형 당쇄(4분기형 복합형 당쇄)도 포함한다. 예를 들면 3본쇄, 4본쇄 복합형 당쇄로서는 아래의 구조식으로 표시되는 트리시알로 당쇄

하기 구조식으로 표시되는 테트라시알로 당쇄

를 들 수 있다. 또한 3본쇄 복합형 당쇄 및 4본쇄 복합형 당쇄로서는 이들 트리시알로 당쇄 또는 테트라시알로 당쇄의 비환원 말단으로부터 1 또는 복수의 당을 상실한 당쇄도 들 수 있다.

또한 본 발명의 복합형 당쇄에는 푸코오스가 붙은 것도 포함한다. 푸코오스가 붙은 복합형 당쇄로서는 아래의 구조식으로 표시되는 푸코오스 함유 복합형 당쇄

를 들 수 있다. 또한 이들 푸코오스 함유 복합형 당쇄의 비환원 말단으로부터 1 또는 복수의 당을 상실한 당쇄도 들 수 있다.

또한 본 명세서 중에 있어서 「디시알로 당쇄」, 「2본쇄 복합형 당쇄」, 「모노시알로 당쇄」, 「아시알로 당쇄」, 「디글크낙 당쇄」, 「디만노오스 당쇄」, 「3본쇄 복합형 당쇄」, 「4본쇄 복합형 당쇄」, 「푸코오스 함유 복합형 당쇄」에는 상기 화학식으로 나타낸 것 외에 화학식으로 나타낸 예와 결합양식이 상이한 것도 포함되고, 이러한 당쇄도 본 발명의 당쇄로서 바람직하게 사용된다. 이러한 당쇄로서는 예를 들면 디시알로 당쇄 또는 모노시알로 당쇄에 있어서 시알산과 갈락토오스가 (α2→3) 결합으로 결합되어 있는 것 등을 들 수 있다.

또한 당쇄의 비환원 말단에 시알산을 갖는 당쇄의 경우에는 시알산의 카르복시기가 수식된 당쇄를 사용하는 것도 가능하다. 시알산의 카르복시기의 수식으로서는 카르복시기의 음전하를 소실시키거나 또는 양전하로 변환할 수 있는 기인 것이 바람직하고, 예를 들면 탄소수 1~30의 알킬아미노기, 벤질기, 아미노기, 아미노에틸아미노기 등을 들 수 있다. 이들 수식기의 도입에 의해 시알산의 카르복실기의 음전하를 소실시키거나(벤질기, 아미노기 등) 또는 양전하로 변환(아미노에틸아미노기 등)함으로써 당쇄 부가 폴리펩티드의 혈중 클리어런스나 체내 분포의 제어를 의도할 수 있다.

또한 본 발명에서 사용되는 고만노오스형 당쇄는 전술한 복합형 당쇄의 기본 구조에 추가로 만노오스가 2개 이상 결합되어 있는 당쇄이다. 고만노오스형 당쇄는 부피가 크기 때문에 펩티드에 고만노오스형 당쇄를 결합시킴으로써 혈중 안정성이 보다 높아질 수 있다. 포유류의 고만노오스형 당쇄와 같이 5~9개의 만노오스를 포함하는 당쇄가 바람직하지만, 효모의 고만노오스형 당쇄와 같이 보다 많은 만노오스를 포함하는 당쇄여도 된다. 본 발명에 바람직하게 사용되는 고만노오스형 당쇄로서는 예를 들면

하이만노오스-5(M-5)

하이만노오스-9(M-9)

등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 바람직한 당쇄로서는 예를 들면 인간 체내에 있어서 단백질과 결합한 당단백질로서 존재하는 당쇄(예를 들면 「FEBS LETTERS Vol. 50, No. 3, Feb. 1975」에 기재된 당쇄)와, 동일한 구조를 갖는 당쇄(구성당의 종류 및 그들의 결합양식이 동일한 당쇄) 또는 이것의 비환원 말단으로부터 1 또는 복수의 당을 상실한 당쇄인 하기에 기재된 당쇄를 들 수 있다.

본 발명의 바람직한 일태양에 있어서 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드 중의 당쇄 부가 아미노산에 있어서의 당쇄의 구조는 실질적으로 동일하게 하는 것도 가능하고, 또는 상이한 당쇄 구조를 가지고 있어도 된다. 당쇄 부가 폴리펩티드 중의 당쇄의 구조를 실질적으로 동일하게 할 때는 예를 들면 90% 이상 동일 또는 99% 이상 동일한 것이 바람직하고, 당쇄의 구조가 완전히 동일한 것이 가장 바람직하다. 또한 본 명세서 중에 있어서 당펩티드에 있어서의 당쇄의 구조가 동일하다는 것은 2개 이상의 당쇄가 부가된 당쇄 부가 폴리펩티드에 있어서 당해 당쇄끼리를 비교한 경우에 당쇄를 구성하는 당의 종류, 결합순서 및 결합양식이 당펩티드 내에 있어서 동일한 것을 말한다. 또한 본 발명의 바람직한 일태양에 있어서 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 당쇄는 균일한 것이 바람직하다. 본 명세서에 있어서 당쇄 부가 폴리펩티드에 있어서 당쇄가 균일이란 당쇄 부가 폴리펩티드 간에 있어서 당쇄를 비교한 경우에 펩티드 중의 당쇄 부가 부위, 당쇄를 구성하는 각 당의 종류, 결합순서 및 당 간의 결합양식이 당펩티드 간에 동일한 것을 말하고, 적어도 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상의 당쇄의 구조가 균일한 것을 말한다. 특히 당펩티드 간에 있어서 당쇄가 균일한 당펩티드를 포함하는 조성물 등은 품질이 일정하여 특히 의약품의 제조나 어세이 등의 분야에 있어서 바람직하다. 균일한 당쇄의 비율은 예를 들면 HPLC, 캐필러리 전기영동, NMR, 질량 분석 등을 사용한 방법에 의해 측정하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서 바람직한 당쇄 부가 폴리펩티드는 예를 들면 후술의 실시예 20~25, 28, 29, 32~35, 49~51, 63~64 및 66~68에 있어서 제조한 당쇄 부가 폴리펩티드(서열번호 21~26, 29, 30, 33, 34, 88, 89, 125, 127, 129, 148, 149, 157, 164 및 169)이다. 즉 아래의 SRIF28의 아미노산 서열：

Ser₁-Ala₂-Asn₃-Ser₄-Asn₅-Pro₆-Ala₇-Met₈-Ala₉-Pro₁₀-Arg₁₁-Glu₁₂-Arg₁₃-Lys₁₄-Ala₁₅-Gly₁₆-Cys₁₇-Lys₁₈-Asn₁₉-Phe₂₀-Phe₂₁-Trp₂₂-Lys₂₃-Thr₂₄-Phe₂₅-Thr₂₆-Ser₂₇-Cys₂₈(서열번호 2)에 있어서：

(a1) 1번 위치의 Ser이 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환되고 또한 N말단 측에 추가로 디시알로 당쇄 부가 Cys가 1개 부가된 당쇄 부가 폴리펩티드(실시예 20)(서열번호 21)；

(a2) 1번 위치의 Ser 및 5번 위치의 Asn이 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 폴리펩티드(실시예 21)(서열번호 22)；

(a3) 1번 위치의 Ser 및 13번 위치의 Arg가 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 폴리펩티드(실시예 22)(서열번호 23)；

(a4) 5번 위치의 Asn 및 9번 위치의 Ala가 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 폴리펩티드(실시예 23)(서열번호 24)；

(a5) 1번 위치의 Ser이 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환되고 또한 N말단 측에 추가로 디시알로 당쇄 부가 Cys가 2개 부가된 당쇄 부가 폴리펩티드(실시예 24)(서열번호 25)；

(a6) 1번 위치의 Ser, 5번 위치의 Asn 및 9번 위치의 Ala가 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 폴리펩티드(실시예 25)(서열번호 26)；

(a7) 1번 위치의 Ser이 아시알로 당쇄 부가 Cys로 치환되고 또한 N말단 측에 추가로 아시알로 당쇄 부가 Cys가 1개 부가된 당쇄 부가 폴리펩티드(실시예 28)(서열번호 29)；

(a8) 1번 위치의 Ser이 아시알로 당쇄 부가 Cys로 치환되고 또한 N말단 측에 추가로 아시알로 당쇄 부가 Cys가 2개 부가된 당쇄 부가 폴리펩티드(실시예 29)(서열번호 30)；

(a9) 1번 위치의 Ser이 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환되고 또한 19번 위치의 Asn이 GlcNAc 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 폴리펩티드(실시예 32)(서열번호 33)；

(a10) 1번 위치의 Ser이 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환되고 또한 19번 위치의 Asn이 디만노오스 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 폴리펩티드(실시예 33)(서열번호 34)；

(a11) 1번 위치의 Ser이 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환되고 또한 N말단 측에 추가로 디시알로 당쇄 부가 Cys가 4개 부가된 당쇄 부가 폴리펩티드(실시예 34)(서열번호 88)；

(a12) 1번 위치의 Ser이 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환되고 또한 N말단 측에 추가로 디시알로 당쇄 부가 Cys가 9개 부가된 당쇄 부가 폴리펩티드(실시예 35)(서열번호 89)；

(a13) 1번 위치의 Ser 및 12번 위치의 Glu가 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 폴리펩티드(실시예 49)(서열번호 125)；

(a14) 1번 위치의 Ser이 당쇄 상의 시알산의 카르복시기를 카르복실산아미드로 변환한 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환되고 또한 N말단 측에 추가로 당쇄 상의 시알산의 카르복시기를 카르복실산아미드로 변환한 디시알로 당쇄 부가 Cys가 1개 부가된 당쇄 부가 폴리펩티드(실시예 63)(서열번호 148)；

(a15) 1번 위치의 Ser이 당쇄 상의 시알산의 카르복시기를 벤질기에 의해 보호한 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환되고 또한 N말단 측에 추가로 당쇄 상의 시알산의 카르복시기를 벤질기에 의해 보호한 디시알로 당쇄 부가 Cys가 1개 부가된 당쇄 부가 폴리펩티드(실시예 64)(서열번호 149)；

(a16) 1번 위치의 Ser이 디시알로 당쇄 부가 Asn으로 치환되고 또한 19번 위치의 Asn이 디만노오스 당쇄 부가 Cys로 치환된 당쇄 부가 폴리펩티드(실시예 66)(서열번호 157)；

(a17) 1번 위치의 Ser이 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환되고 또한 N말단 측에 추가로 당쇄 상의 시알산의 카르복시기가 1,2-에틸렌디아민의 한쪽 말단과 아미드 결합한 디시알로 당쇄 부가 Cys가 1개 부가된 당쇄 부가 폴리펩티드(실시예 67)(서열번호 164)；

(a18) 1번 위치의 Ser이 디시알로 당쇄 부가 Cys로 치환되고 또한 N말단 측에 추가로 디시알로 당쇄 부가 Cys가 3개 부가된 당쇄 부가 폴리펩티드(실시예 68)(서열번호 169)；

이다.

또한 SRIF14의 아미노산 서열：

Ala₁₅-Gly₁₆-Cys₁₇-Lys₁₈-Asn₁₉-Phe₂₀-Phe₂₁-Trp₂₂-Lys₂₃-Thr₂₄-Phe₂₅-Thr₂₆-Ser₂₇-Cys₂₈(서열번호 1)에 있어서：

(a19) 15번 위치의 Ala의 N말단 측에 추가로 디시알로 당쇄 부가 Cys-디시알로 당쇄 부가 Cys-Arg-Lys-가 부가된 당쇄 부가 폴리펩티드(실시예 50)(서열번호 127)；

(a20) 15번 위치의 Ala의 N말단 측에 추가로 디시알로 당쇄 부가 Cys-디시알로 당쇄 부가 Cys-디시알로 당쇄 부가 Cys-Arg-Lys-가 부가된 당쇄 부가 폴리펩티드(실시예 51)(서열번호 129)；

이다.

본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는 당업자에게 공지의 펩티드 합성방법에 당쇄 부가 공정을 삽입함으로써 제조할 수 있다. 당쇄 부가시에는 트랜스글루타미나아제로 대표되는 효소를 이용하는 방법도 사용할 수 있지만, 이 경우 부가하는 당쇄가 대량으로 필요해지고 최종 공정 후의 정제가 번잡해지며 당쇄의 부가 위치 및 부가 가능한 당쇄가 제한되는 등의 문제가 있기 때문에, 어세이용 등의 소량의 합성에는 사용하는 것이 가능하더라도 의약품 제조 등의 대규모 제조에는 실용적인 방법이라고는 할 수 없는 경우가 있다.

본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 간편한 제조방법으로서, 또한 당쇄의 구조가 균일한 당쇄 부가 폴리펩티드의 안정한 제조방법의 구체예로서, 이하 당쇄 부가 아미노산으로서 당쇄 부가 Asn을 사용하고 고상합성, 액상합성 등의 공지의 펩티드 합성방법을 적용함으로써 당쇄 부가 폴리펩티드를 제조하는 방법(A법), 및 소마토스타틴의 임의의 아미노산을 Cys로 치환한 펩티드를 공지의 펩티드 합성방법에 따라 제조하고, 그 후 Cys에 화학합성에 의해 당쇄를 부가하여 당쇄 부가 폴리펩티드를 제조하는 방법(B법)을 예시한다. 이들 제조방법을 참고로 당업자라면 여러 가지 당쇄 부가 폴리펩티드를 제조하는 것이 가능하고 얻어지는 당쇄 부가 폴리펩티드 및 그의 제조방법은 특히 의약품 제조의 분야에 있어서 매우 유용하다.

또한 이들 A법 및 B법은 둘 이상을 조합하여 행하는 것도 가능하다. 어세이 등에 사용하는 소량의 합성이라면 추가로 상기의 방법에 전이효소에 의한 당쇄 신장반응을 조합하는 것도 가능하다. 또한 A법은 국제공개 제2004/005330호 팸플릿(US2005222382(A1))에, B법은 국제공개 제2005/010053호 팸플릿(US2007060543(A1))에 각각 기재되어 있고, 그 개시는 전체가 본 명세서에 참조로써 포함된다. 또한 A법 및 B법에 있어서 사용되는 당쇄 구조가 균일한 당쇄의 제조에 관해서는 국제공개 제03/008431호 팸플릿(US2004181054(A1)), 국제공개 제2004/058984호 팸플릿(US2006228784(A1)), 국제공개 제2004/058824호 팸플릿(US2006009421(A1)), 국제공개 제2004/070046호 팸플릿(US2006205039(A1)), 국제공개 제2007/011055호 팸플릿 등에 기재되어 있고, 그 개시는 전체가 본 명세서에 참조로써 포함된다.

당쇄 부가 폴리펩티드를 제조하는 방법(A법)

당쇄 부가 폴리펩티드는 예를 들면 아래에 개략을 나타내는 당쇄 부가 Asn을 사용한 고상합성에 의해 제조할 수 있다.

(1) 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 아미노산의 카르복시기를 수지(레진)에 결합시킨다. 이 경우 아미노산의 아미노기 질소를 지용성 보호기로 보호하고 있기 때문에 아미노산끼리의 자기 축합은 방지되고 레진과 아미노산이 반응하여 결합이 일어난다.

(2) 얻어진 반응물의 지용성 보호기를 탈리하여 유리 아미노기(free amino group)를 형성시킨다.

(3) 이 유리 아미노기와 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 임의의 아미노산의 카르복시기를 아미드화반응시킨다.

(4) 상기 지용성 보호기를 탈리하여 유리 아미노기를 형성시킨다.

(5) 상기 (3) 및 (4)의 공정을 1회 이상 반복함으로써 임의의 수의 임의의 아미노산이 연결된, 말단에 레진을 결합하고 타단에 유리 아미노기를 갖는 펩티드가 얻어진다.

(6) 마지막으로 산으로 레진을 절단함으로써 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 얻을 수 있다.

여기서 (1)에 있어서 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 아미노산 대신에 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 당쇄 부가 Asn을 사용하여 당해 아스파라긴 부분의 카르복시기와 레진의 수산기를 반응시키면 C말단에 당쇄 부가 Asn을 갖는 펩티드를 얻을 수 있다.

또한 (2) 다음에 또는 (3)과 (4)를 1회 이상의 임의의 횟수 반복한 후 (3)에 있어서 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 아미노산 대신에 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 당쇄 부가 Asn을 사용하면 임의의 개소에 당쇄를 부가할 수 있다.

또한 (1) 및 (3) 중 어느 한 공정에서 2회 이상, 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 아미노산 대신에 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 당쇄 부가 Asn을 사용함으로써 임의의 2개소 이상에 당쇄가 부가된 펩티드를 얻을 수 있다.

당쇄 부가 아미노산을 결합시킨 후 지용성 보호기를 탈리하여 유리 아미노기를 형성시키고 그 직후에 공정(6)을 행하면 N말단에 당쇄 부가 Asn을 갖는 펩티드를 얻을 수 있다.

수지(레진)로서는 통상 고상합성에서 사용하는 수지(레진)이면 되고, 예를 들면 염소로 관능화된 2-클로로트리틸클로라이드 수지(머크사 제조)나 아미노기로 관능화된 Amino-PEGA 레진(머크사 제조), 수산기를 갖는 NovaSyn TGT 알코올 수지(머크사 제조), Wang 레진(머크사 제조), HMPA-PEGA 레진(머크사 제조) 등을 사용할 수 있다. 또한 Amino-PEGA 레진과 아미노산 사이에 링커를 존재시켜도 되고, 이러한 링커로서 예를 들면 4-히드록시메틸페녹시초산(HMPA), 4-(4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시)-부틸초산(HMPB) 등을 들 수 있다. C말단의 아미노산이 수지에 사전에 결합한 H-Cys(Trt)-Trityl NovaPEG 수지(머크사 제조) 등도 사용할 수 있다.

또한 C말단을 아미드화하는 경우에는 예를 들면 아미노기로 관능화된 Rink-Amide-PEGA 레진(머크사 제조)을 사용하는 것이 바람직하다. 이 레진과 펩티드를 산으로 절단함으로써 펩티드의 C말단 아미노산을 아미드화할 수 있다.

수지와 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 아미노산의 결합은 예를 들면 수산기를 갖는 수지나 염소로 관능화된 수지를 사용하는 데는 아미노산의 카르복시기를 수지에 에스테르 결합시킨다. 또한 아미노기로 관능화된 수지를 사용하는 경우에는 아미노산의 카르복시기를 수지에 아미드 결합에 의해 결합시킨다.

또한 2-클로로트리틸클로라이드 수지는 고상합성에 있어서 펩티드 사슬을 신장할 때 말단에 있는 Cys의 라세미화를 방지할 수 있는 점에 있어서 바람직하다.

아미노산으로서는 모든 아미노산을 사용할 수 있고 예를 들면 천연 아미노산인 세린(Ser), 아스파라긴(Asn), 발린(Val), 류신(Leu), 이소류신(Ile), 알라닌(Ala), 티로신(Tyr), 글리신(Gly), 리신(Lys), 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 아스파라긴산(Asp), 글루타민산(Glu), 글루타민(Gln), 트레오닌(Thr), 시스테인(Cys), 메티오닌(Met), 페닐알라닌(Phe), 트립토판(Trp), 프롤린(Pro)을 들 수 있다.

또한 상기 천연 아미노산의 D체를 사용하는 것도 가능하다.

지용성 보호기로서는 예를 들면 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)기, t-부틸옥시카르보닐(Boc)기, 벤질기, 알릴기, 알릴옥시카르보닐기, 아세틸기 등의 카보네이트계 또는 아미드계의 보호기 등을 들 수 있다. 아미노산에 지용성 보호기를 도입하는 데는 예를 들면 Fmoc기를 도입하는 경우에는 9-플루오레닐메틸-N-숙시니미딜카보네이트와 탄산수소나트륨을 첨가하여 반응을 행함으로써 도입할 수 있다. 반응은 0~50℃, 바람직하게는 실온에서 약 1~5시간 정도 행하는 것이 좋다.

지용성 보호기로 보호한 아미노산으로서는 시판의 것도 사용할 수 있다. 예를 들면 Fmoc-Ser-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Tyr-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys-OH, Fmoc-Arg-OH, Fmoc-His-OH, Fmoc-Asp-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Thr-OH, Fmoc-Cys-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Pro-OH를 들 수 있다.

또한 지용성 보호기로 보호한 아미노산으로서 측쇄에 보호기를 도입한 것으로서 예를 들면 Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Cys(StBu)-OH, Fmoc-Cys(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH를 들 수 있다.

또한 당쇄 부가 폴리펩티드의 아미노산 서열 중에 링커를 부가시키고자 하는 경우에는, 고상합성의 과정에 있어서 상기의 지용성 보호기로 보호한 아미노산 대신에 지용성 보호기로 보호한 링커를 사용함으로써 바람직한 위치에 링커를 삽입할 수 있다.

2-클로로트리틸클로라이드 수지를 사용하는 경우 디이소프로필에틸아민(DIPEA), 트리에틸아민, 피리딘, 2,4,6-콜리딘 등의 염기를 사용함으로써 에스테르화를 행할 수 있다. 또한 수산기를 갖는 수지를 사용하는 경우 에스테르화 촉매로서 예를 들면 1-메시틸렌설포닐-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT), 디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 디이소프로필카르보디이미드(DIC) 등의 공지의 탈수축합제를 사용할 수 있다. 아미노산과 탈수축합제의 사용 비율은 전자 1 중량부에 대해서 후자가 통상 1~10 중량부, 바람직하게는 2~5 중량부이다.

에스테르화반응은 예를 들면 고상 칼럼에 레진을 넣고 이 레진을 용제로 세정한 후 아미노산의 용액을 첨가함으로써 행하는 것이 바람직하다. 세정용 용제로서는 예를 들면 디메틸포름아미드(DMF), 2-프로판올, 디클로로메탄 등을 들 수 있다. 아미노산을 용해하는 용매로서는 예를 들면 디메틸설폭시드(DMSO), DMF, 디클로로메탄 등을 들 수 있다. 에스테르화반응은 0~50℃, 바람직하게는 실온에서 약 10분~30시간 정도, 바람직하게는 15분~24시간 정도 행하는 것이 좋다.

이때 고상 상의 미반응의 수산기를 무수초산 등을 사용하여 아세틸화하여 캡핑하는 것도 바람직하다.

지용성 보호기의 탈리는 예를 들면 염기로 처리함으로써 행할 수 있다. 염기로서는 예를 들면 피페리딘, 모르폴린 등을 들 수 있다. 그때 용매의 존재하에서 행하는 것이 바람직하다. 용매로서는 예를 들면 DMSO, DMF, 메탄올 등을 들 수 있다.

유리 아미노기와 지용성 보호기로 아미노기 질소가 보호된 임의의 아미노산의 카르복시기의 아미드화반응은 활성화제 및 용매의 존재하에서 행하는 것이 바람직하다.

활성화제로서는 예를 들면 디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드·염산염(WSC/HCl), 디페닐포스포릴아지드(DPPA), 카르보닐디이미다졸(CDI), 디에틸시아노포스포네이트(DEPC), 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스피롤리디노포스포늄(DIPCI), 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트(PyBOP), 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt), 히드록시숙신이미드(HOSu), 디메틸아미노피리딘(DMAP), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt), 히드록시프탈이미드(HOPht), 펜타플루오로페놀(Pfp-OH), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트(HBTU), 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-5-클로로-1H-벤조트리아졸륨 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(HCTU), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스포네이트(HATU), O-벤조트리아졸-1-일-1,1,3,3-테트라메틸우로늄테트라플루오로보레이트(TBTU), 3,4-디히드로-3-히드로디-4-옥사-1,2,3-벤조트리아진(Dhbt) 등을 들 수 있다.

활성화제의 사용량은 지용성의 보호기로 아미노기 질소가 보호된 임의의 아미노산에 대해 1~20 당량, 바람직하게는 1~10 당량, 더욱 바람직하게는 1~5 당량으로 하는 것이 바람직하다.

용매로서는 예를 들면 DMSO, DMF, 디클로로메탄 등을 들 수 있다. 반응은 0~50℃, 바람직하게는 실온에서 약 10~30시간 정도, 바람직하게는 15분~24시간 정도 행하는 것이 좋다. 지용성 보호기의 탈리는 상기와 동일하게 행할 수 있다.

수지(레진)로부터 펩티드 사슬을 절단하는 데는 산으로 처리하는 것이 바람직하다. 산으로서는 예를 들면 트리플루오로초산(TFA), 불화수소(HF) 등을 들 수 있다.

이와 같이 하여 목적하는 위치를 당쇄 부가 Asn으로 치환한 당쇄 부가 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 또한 이와 같이 정제된 당쇄 부가 폴리펩티드는 후술하는 바와 같이 탈보호된 Cys끼리의 디설피드 결합을 형성시킨다.

또한 본 발명의 일실시태양에 있어서 고상합성에 사용하는 당쇄 부가 Asn에 있어서의 당쇄 상의 비환원 말단에 시알산을 포함하는 경우에는 산처리에 의해 시알산이 절단되는 것을 방지하기 위해 당해 시알산의 카르복시기를 보호기에 의해 보호하고 있는 것이 바람직하다. 보호기로서는 예를 들면 벤질기, 알릴기, 디페닐메틸기 등을 들 수 있다. 보호기의 도입 및 보호기의 탈리의 방법은 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 또한 보호기의 탈리는 고상합성에 의해 제조된 당쇄 부가 폴리펩티드를 수지로부터 절단한 후에 행하는 것이 바람직하다. 수지로부터 절단 후 당쇄 부가 폴리펩티드에 있어서 디설피드 결합을 형성시킴으로써 당쇄 부가 폴리펩티드를 환화시키는 경우에는 보호기의 탈리는 디설피드 결합의 형성 공정 전이어도 되고 디설피드 결합의 형성 공정 후여도 된다.

당쇄 부가 폴리펩티드를 제조하는 방법(B법)

당쇄 부가 폴리펩티드는 먼저 펩티드 사슬을 합성하고 나중에 합성한 펩티드 사슬에 당쇄를 부가하는 방법에 의해서도 제조할 수 있다. 구체적으로는 당쇄를 부가하고자 하는 위치에 Cys를 포함하는 펩티드를 고상합성법, 액상합성법, 세포에 의해 합성하는 방법, 천연에 존재하는 것을 분리 추출하는 방법 등에 의해 제조한다. 여기서 디설피드 결합을 형성할 예정의 위치에 있는 Cys 등, 당쇄를 부가하지 않는 Cys에 대해서는 예를 들면 아세트아미도메틸(Acm)기로 보호해 둔다. 또한 당쇄를 부가하지 않고 또한 디설피드 결합의 형성에도 사용하지 않는 Cys를 당쇄 부가 폴리펩티드에 도입하는 경우에는 당쇄 부가 공정 및 디설피드 결합 형성 공정 동안 Cys를 보호기에 의해 보호해 두고 그 후 탈보호하도록 하여 Cys를 도입할 수 있다. 이러한 보호기로서는 예를 들면 tert-부틸(tBu)이나 4-메톡시벤질을 들 수 있다.

또한 당쇄 부가 폴리펩티드 중의 Cys에 상이한 당쇄를 부가하는 경우에는 처음에 당쇄를 도입하는 Cys를 무보호로 하고 다음으로 상이한 당쇄를 도입하는 Cys를 StBu 등에 의해 보호해 둠으로써 상이한 당쇄를 도입할 수 있다. 구체적으로는 고상합성 등에 의해 펩티드를 합성할 때, 제1 당쇄를 도입하고자 하는 Cys를 무보호로 하고 또한 제2 당쇄를 도입하고자 하는 Cys를 Fmoc-Cys(StBu)-OH 등을 사용하여 보호기를 갖는 Cys로 한다. 그 후 StBu 등의 보호기를 보유한 채 무보호의 Cys에 당쇄를 도입한다. 다음으로 StBu기 등을 탈보호함으로써 무보호가 된 Cys에 상이한 당쇄를 도입할 수 있다. 또한 제1 당쇄를 도입하고자 하는 Cys 및 제2 당쇄를 도입하고자 하는 Cys는 1개 또는 복수 개로 할 수 있다.

또한 StBu기의 탈보호는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 염산염(TCEP), 디티오트레이톨(DTT), 트리부틸포스핀 등의 환원제를 사용하여 반응시킴으로써 탈보호할 수 있다. 상기 반응은 통상 0~80℃, 바람직하게는 5~60℃, 더욱 바람직하게는 10~35℃에서 행하는 것이 좋다. 반응시간은 바람직하게는 통상 30분~5시간 정도이다. 반응종료 후에는 적절히 공지의 방법(예를 들면 고속액체칼럼크로마토그래피(HPLC))으로 정제하는 것이 좋다.

상이한 당쇄를 도입할 때에는 Cys의 탈보호 공정에 있어서의 환원 조건이나 HPLC 등의 정제 공정에 있어서의 산성 조건에 대해서 보다 안정한 당쇄로부터 도입하는 것이 바람직하다. 특히 시알산 함유 당쇄를 도입할 때에는 시알산을 갖지 않는 당쇄 또는 시알산 잔기 수가 적은 당쇄부터 먼저 도입하는 것이 바람직하다.

또한 당쇄 부가 폴리펩티드의 아미노산 서열 중에 링커를 부가시키고자 하는 경우에는 예를 들면 고상합성의 과정에 있어서 지용성 보호기로 보호한 아미노산 대신에 지용성 보호기로 보호한 링커를 사용함으로써 합성한 폴리펩티드의 바람직한 위치에 링커를 삽입할 수 있다.

다음으로 할로아세틸화 복합형 당쇄 유도체를 상기에서 얻은 무보호의 Cys를 포함하는 펩티드와 반응시킴으로써 당쇄를 무보호의 Cys의 티올기와 반응시켜 펩티드에 결합시킨다. 상기 반응은 인산 완충액, 트리스-염산 완충액, 구연산 완충액, 또는 이들 혼합용액 중에 있어서 통상 0~80℃, 바람직하게는 10~60℃, 더욱 바람직하게는 15~35℃에서 행하는 것이 좋다. 반응시간은 통상 10분~24시간, 바람직하게는 통상 30분~5시간 정도이다. 반응종료 후에는 적절히 공지의 방법(예를 들면 HPLC)으로 정제하는 것이 좋다.

할로아세틸화 복합형 당쇄 유도체는 예를 들면 복합형 아스파라긴 결합형 당쇄의 1번 위치의 탄소에 결합되어 있는 수산기를 -NH-(CH₂)_a-(CO)-CH₂X(X는 할로겐원자, a는 정수이고, 목적으로 하는 링커 기능을 저해하지 않는 한 한정되는 것은 아니지만 바람직하게는 0~4의 정수를 나타낸다.)로 치환한 화합물이다.

구체적으로는 할로아세틸화 복합형 당쇄 유도체와 Cys 함유 펩티드를 인산 완충액 중, 실온에서 반응시킨다. 반응종료 후 HPLC로 정제함으로써 당쇄 부가 Cys로 치환한 당쇄 부가 폴리펩티드를 얻을 수 있다.

또한 DMSO, DMF, 메탄올, 아세토니트릴과 같은 유기 용매와 상기 완충액의 혼합용액 중에서 반응을 행하는 것도 가능하다. 이때 유기 용매의 비율은 0~99%(v/v)의 범위에서 상기 완충액에 첨가할 수 있다. 완충액으로의 용해성이 낮은 무보호의 Cys를 포함하는 펩티드는 이러한 유기 용매를 첨가함으로써 반응용액으로의 용해성을 향상시킬 수 있어 바람직하다.

또는 DMSO, DMF, 메탄올, 아세토니트릴과 같은 유기 용매나 그들 혼합용액 중에서 반응을 행하는 것도 가능하다. 그때 염기의 존재하에서 행하는 것이 바람직하다. 염기로서는 예를 들면 DIPEA, 트리에틸아민, 피리딘, 2,4,6-콜리딘 등을 들 수 있다. 또한 구아니딘 염산염이나 요소를 완충용액에 첨가한 혼합용액 중에 있어서도 반응을 행할 수 있다. 또한 구아니딘 염산염이나 요소는 최종 농도가 1 M~8 M이 되도록 상기 완충액에 첨가할 수 있다. 구아니딘 염산염이나 요소의 첨가에 의해서도 완충액으로의 용해성이 낮은 펩티드의 용해성을 향상시킬 수 있어 바람직하다.

또한 무보호의 Cys를 포함하는 펩티드가 디설피드 결합을 매개로 한 2량체를 형성하는 것을 방지하기 위해 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 염산염(TCEP)이나 디티오트레이톨(DTT)을 완충액에 첨가하여 반응시키는 것도 가능하다. TCEP나 DTT는 최종 농도가 10 μM~10 mM이 되도록 완충액에 첨가할 수 있다.

또한 당쇄를 목적의 Cys에 결합시킨 후 Acm 등으로 보호된 Cys의 보호기를 탈보호한다. 보호기가 Acm기인 경우는 물, 메탄올, 초산 또는 이들 혼합용액 중에 있어서 요오드, 초산수은(II), 질산은(I) 또는 초산은(I) 등을 사용하여 반응시킴으로써 탈보호할 수 있다.

상기 반응은 통상 0~80℃, 바람직하게는 5~60℃, 더욱 바람직하게는 10~35℃에서 행하는 것이 좋다. 반응시간은 바람직하게는 통상 5분~24시간 정도이다. 반응종료 후에는 DTT나 염산 등에 의해 처리한 후, 적절히 공지의 방법(예를 들면 HPLC)으로 정제하는 것이 좋다.

이와 같이 하여 목적하는 위치를 당쇄 부가 Cys로 치환한 당쇄 부가 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 또한 이와 같이 정제된 당쇄 부가 폴리펩티드는 후술하는 바와 같이 탈보호된 Cys끼리의 디설피드 결합을 형성시킨다.

또한 디시알로 당쇄나 모노시알로 당쇄 등의 시알산 함유 당쇄를 펩티드 서열 중에 복수 개 갖는 당쇄 부가 폴리펩티드를 제조할 때에는 도입하는 당쇄 상의 시알산의 카르복시기가 벤질(Bn)기, 알릴기, 디페닐메틸기, 페나실기 등에 의해 보호된 시알산 함유 당쇄를 사용할 수 있다.

시알산의 카르복시기가 보호된 당쇄를 도입했을 때에는 후술하는 당쇄 부가 폴리펩티드에 있어서의 디설피드 결합의 형성 공정 후, 시알산 보호기의 탈보호 공정을 할 수 있다.

이와 같이 시알산의 카르복시기를 벤질기 등으로 보호함으로써 제조 공정에 있어서의 HPLC 등에 의한 분리·정제 공정이 용이해진다. 또한 시알산의 카르복시기의 보호는 산에 불안정한 시알산의 탈리를 방지하는 것도 가능하다.

당쇄 상의 시알산의 카르복시기의 보호 반응은 당업자에게 주지의 방법에 의해 행할 수 있다. 또한 디설피드 결합을 형성시킨 당쇄 부가 폴리펩티드에 있어서 시알산의 카르복시기의 보호기는 염기성 조건하에서 가수분해함으로써 탈보호할 수 있다. 상기 반응은 통상 0~50℃, 바람직하게는 0~40℃, 더욱 바람직하게는 0~30℃에서 행하는 것이 좋다. 반응시간은 바람직하게는 통상 5분~5시간 정도이다. 반응종료 후에는 인산이나 초산 등의 약산에 의해 중화한 후, 적절히 공지의 방법(예를 들면 HPLC)으로 정제하는 것이 좋다.

또한 상기 A법 및 B법에 의해 제작된 당쇄 부가 폴리펩티드는 공기 및/또는 산소, 요오드, DMSO, 산화 및 환원된 글루타티온의 혼합물, 페리시안산 칼륨, 엘만 시약(5,5'-디티오비스(2-니트로안식향산)), 트리플루오로초산 탈륨(III) 및 알킬트리클로로실란설폭시드 등을 사용한 당업자에게 주지의 방법으로 Cys끼리의 디설피드 결합을 형성할 수 있다.

또한 Cys-Cys 간의 디설피드 결합을 형성시킬 때에 디설피드 결합하는 것이 바람직하지 않은 당쇄 부가 폴리펩티드 중의 Cys에 대해서는 보호기에 의해 보호해 둔다. 이러한 보호기로서는 Acm, tBu, 4-메톡시벤질, 4-메틸벤질 등, 산화조건에서 안정한 보호기를 사용할 수 있다.

또한 B법에 있어서 디설피드 결합의 형성은 당쇄의 도입 전에 행하는 것도 가능하다. 단 디설피드 결합시키고자 하는 Cys에 보호기가 도입되어 있는 경우에는 탈보호의 공정이 디설피드 결합 형성의 공정보다도 우선이 된다.

(활성)

본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 가지고 있다. 본 명세서에 있어서 「소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 갖는」다는 것은 소마토스타틴 수용체인 SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4 및 SSTR5 중 1개 이상에 친화성을 갖는 것을 의미한다.

본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는 바람직하게는 2개 이상의 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 갖고, 보다 바람직하게는 3개 이상의 수용체에 대해서 친화성을 가지며, 더욱 바람직하게는 4개 이상의 수용체에 대해서 친화성을 갖고, 가장 바람직하게는 천연의 소마토스타틴(SRIF28 및 SRIF14)과 동일하게 SSTR1~SSTR5의 5개 모든 수용체에 친화성을 갖는다. 특히 SSTR1 및 SSTR4 중 어느 한쪽 이상의 친화성과, 그 외의 SSTR과의 친화성을 가지고 있는 것이 바람직하다.

이와 같이 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드가 소마토스타틴 수용체에 대해서 친화성을 가짐으로써 소마토스타틴 수용체에 대한 소마토스타틴 활성(아고니스트 활성) 및 안타고니스트 활성을 갖는다.

예를 들면 각 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성은 인 비트로(in vitro)에 있어서의 경합적 결합 실험 등을 사용하여 측정할 수 있다.

경합적 결합 실험에 의한 친화성의 측정은 수용체에 대해서 표지 리간드와 시험 물질을 경합적으로 결합시켜 시험 물질 투여에 의한 표지 리간드의 유리를 구하는 것으로부터 시험 물질의 친화성(예를 들면 50% 저해 농도：IC₅₀ 값이나, 결합 저해 상수：Ki 값)을 측정할 수 있다.

예를 들면 소마토스타틴 활성(아고니스트 활성)은 실시예 69-3 및 69-4에 나타내는 바와 같은 소마토스타틴 수용체 발현세포를 사용한 인 비트로에 있어서의 cAMP 생산 억제시험에 의해 평가할 수 있다.

cAMP 생산 억제시험은 소마토스타틴 수용체 발현세포에 대해서 당쇄 부가 폴리펩티드 또는 대조 화합물이 되는 SRIF14 또는 SRIF28을 처치하고 일정 시간 배양 후에 세포 내에 축적된 cAMP량을 측정하고 대조 화합물과 비교함으로써 평가할 수 있다. cAMP량의 측정은 효소 면역 측정법(EIA) 등 공지의 방법에 의해 측정할 수 있다.

예를 들면 소마토스타틴 활성(아고니스트 활성)은 실시예 89 및 실시예 90에 나타내는 바와 같은 인 비보(in vivo)에 있어서의 GH 생산 억제시험에 의해 평가할 수 있다.

GH 생산 억제시험은 예를 들면 하기와 같이 실시할 수 있다. 비절식하의 랫트에 당쇄 부가 폴리펩티드를 피하 투여한다. 랫트는 전신 마취하에서 GH 유리 촉진제를 투여하고 그 후 5분 정도에서 채혈을 행한다. 채혈한 혈액을 혈장 샘플로 하고 효소 면역 측정법(EIA) 등 공지의 수법에 의해 GH 농도를 측정한다. 또한 대조로서 당쇄 부가 폴리펩티드를 포함하지 않은 생리식염액을 투여한 랫트로부터 혈장 샘플을 얻음으로써 측정되는 GH 농도의 비교에 의해 소마토스타틴 활성을 평가할 수 있다.

본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는 설령 그 구조로의 당쇄의 부가에 의해 각 수용체에 대한 어느 정도의 친화성의 감쇠를 초래했다고 하더라도 혈중 반감기가 연장되기 때문에, 그 결과 당쇄가 부가되어 있지 않은 천연에 존재하는 소마토스타틴(이하, 「비당쇄 부가 소마토스타틴」이라 부르는 경우가 있다.)과 동등한 소마토스타틴 활성을 유지할 수 있고, 바람직하게는 증대된 소마토스타틴 활성을 가질 수 있다. 이 혈중 반감기의 연장을 고려하면 예를 들면 실시예 69-1에 기재된 수법에 의해 측정한 경우, 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 각 수용체에 대한 Ki 값과 당쇄를 갖지 않는 SRIF14의 Ki 값의 비는 1000：1~0.3：1의 범위 내인 것이 바람직하고, 100：1~0.3：1의 범위 내인 것이 보다 바람직하며, 10：1~0.3：1의 범위 내인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 혈중 안정성은 바람직하게는 천연에 존재하는 소마토스타틴(비당쇄 부가 소마토스타틴)과 동등 또는 그 이상이다. 혈중 안정성은 당업자에게 공지의 수법을 사용하여 측정할 수 있고 예를 들면 혈장 중에 있어서의 안정성이나 혈중 반감기, AUC(약물 혈장 중 농도-시간 곡선하 면적) 등을 지표로 판단할 수 있다. 또한 신장 클리어런스나 간장 클리어런스의 감소도 혈중 안정성의 증대에 기여한다.

본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는 당쇄를 갖지 않는 SRIF28과 비교하여 혈중 반감기가 증대되어 있고, 예를 들면 실시예 70에 나타내는 실험 수법에 의해 측정한 경우 그 반감기는 SRIF28과 비교하여 4배 이상, 바람직하게는 10배 이상, 보다 바람직하게는 20배 이상, 더욱 바람직하게는 30배 이상 증대되어 있다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는 예를 들면 실시예 88에 나타내는 실험 수법에 의해 측정한 경우 SRIF28과 비교하여 바람직하게는 4배 이상, 보다 바람직하게는 10배 이상, 더욱 바람직하게는 20배 이상의 혈중 안정성을 갖는다.

(의약 조성물)

다음으로 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물에 대해서 설명한다.

본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물은 소마토스타틴에 관련된 질환의 치료 또는 예방에 유효하다. 전술한 바와 같이 소마토스타틴에는 각종 작용이 알려져 있고, 이들 작용에 관련된 질환도 여러 가지이다. 예를 들면 소마토스타틴에 관련된 질환에는 예를 들면 말단 비대증, 거인증, 알츠하이머병 및 다른 형태의 치매, 암, 호르몬 생산 종양, 내분비 종양(예를 들면 카르시노이드, 비포마, 인슐리노마, 글루카고노마), 쿠싱병, 호르몬 분비 이상, 당뇨병 및 그의 합병증, 동통, 관절염, 설사, 위궤양, 염증성 장질환, 과민성 장증후군, 소화관 폐색, 장폐색증, 수술 후 재협착, 방사선 장애, 안질환(예를 들면 안구 건조, 녹내장, 각막실질의 염증, 홍채염, 백내장, 결막염) 등이 포함된다. 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물은 상기 질환, 특히 말단 비대증, 치매, 암, 호르몬 생산 종양, 내분비 종양, 쿠싱병, 호르몬 분비 이상, 당뇨병 합병증, 설사, 소화관 폐색, 장폐색증, 방사선 장애, 안질환 및 각종 종양 또는 장 관련 질환, 호르몬 생산 과잉에 수반되는 소화기 증상의 치료 또는 예방에 유효하다.

상기 의약 조성물은 통상 사용되는 충전제, 증량제, 결합제, 보습제, 붕괴제, 표면활성제, 활택제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 통상의 의약 조성물의 형태로 제제한 것이다.

이러한 의약 조성물로서는 예를 들면 정제, 환제, 산제, 액제, 현탁제, 유제, 과립제, 캡슐제, 좌제, 흡입제, 점안제, 주사제 등을 들 수 있다.

의약 조성물 중에 함유되는 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 양은 특별히 한정되지 않고 넓은 범위 내에서 적절히 선택할 수 있는데 통상 의약 조성물 중에 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드를 1~70 중량% 함유시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물은 추가로 다른 유효성분을 함유하는 것도 가능하고, 다른 유효성분을 함유하는 의약 조성물과 조합하여 사용하는 것도 가능하다. 또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물은 당쇄 부가 폴리펩티드를 약학적으로 허용 가능한 염으로서 포함하는 것도 가능하고, 추가로 상이한 1 이상의 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드를 유효성분으로서 함유하는 것도 가능하다. 또한 상이한 1 이상의 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물과 조합하여 사용하는 것도 가능하다. 또한 의약 조성물에 함유시킬 수 있는 그 밖의 성분으로서는 당업자에게 주지의 약학적으로 허용되는 담체 등을 들 수 있다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드를 사용하는 치료로서는 예를 들면 방사선 치료를 포함할 수 있고, 또한 신체 전체에 걸쳐서 SSTR1~SSTR5 중 어느 하나를 발현하는 세포 및 조직의 분포를 측정하기 위한 신티그래피에 있어서도 유용하다. 방사성 스캐닝 또는 자기공명에 의한 체외 화상화의 사용은 체내에서의 반정량적 검출을 가능하게 할 수 있다.

방사성 표지된 당쇄 부가 폴리펩티드는 예를 들면 인간의 체내에서 건강한 정상 상태에서는 실질적인 양의 SSTR1~SSTR5를 포함하지 않는 조직에 있어서 SSTR1~SSTR5 중 어느 하나를 발현하는 악성 종양의 치료적 처치를 위해 유용하다. 또한 표지된 당쇄 부가 폴리펩티드를 신티그래피를 위해 또는 종양을 억제하기 위해 유효한 양을 함유하는 조성물로서 투여할 수 있다. 이러한 표지의 예는 요오드(¹²³I, ¹²⁵I, ¹³¹I), 인듐(¹¹¹In), 탄소(¹¹C), 불소(¹⁸F), 테크네튬(⁹⁹mTc), 이트륨(⁹⁰Y) 등의 상이한 동위체 또는 형광 표지이다. 표지는 당업자에게 주지의 방법에 의해 실시할 수 있고, 당쇄 부가 폴리펩티드에 포함되거나 직접적으로 결합되거나 또는 적당한 화합물에 결합되어 그것이 당쇄 부가 폴리펩티드에 결합되는 것이 가능하다. 예를 들면 티로신의 요오드화에는 클로라민-T를 사용한 방법 등에 의해 표지할 수 있다.

본 발명에 따른 의약 조성물의 투여방법으로서는 특별히 제한은 없고 각종 제제 형태, 환자의 연령, 성별, 질환의 상태, 기타 조건에 따른 방법으로 투여된다. 정제, 환제, 액제, 현탁제, 유제, 과립제 및 캡슐제의 경우의 투여방법으로서는 예를 들면 경구 투여를 들 수 있다. 또한 주사제의 경우에는 단독으로 또는 포도당, 아미노산 등의 통상의 보액과 혼합하여 정맥 내, 근육 내, 피내, 피하 또는 복강 내에 투여할 수 있다. 좌제의 경우에는 직장 내에 투여된다. 점안제의 경우는 결막낭 등의 안조직에 적용한다. 흡입제의 경우에는 기관지 또는 폐에 적용한다.

상기 의약 조성물의 투여량은 용법, 환자의 연령, 성별, 질환의 정도, 기타 조건에 따라 적절히 선택하면 되고 예를 들면 체중 1 ㎏에 대해 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드가 0.1~900 nmol, 바람직하게는 1~100 nmol, 보다 바람직하게는 1~10 nmol이 되는 투여량으로 할 수 있다.

상기 의약 조성물의 투여 횟수는 용법, 환자의 연령, 성별, 질환의 정도, 기타 조건에 따라 적절히 선택하면 되고 예를 들면 3회/1일, 2회/1일, 1회/1일, 더 나아가서는 그 혈중 안정성에 따라 보다 빈도가 적은 투여 횟수(예를 들면 1회/주, 1회/월 등)도 선택할 수 있다. 바람직하게는 상기 의약 조성물의 투여 횟수는 1회 이하/1일이다.

본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드에 부가된 당쇄는 체내의 대사계에서 용이하게 분해된다. 또한 본 발명의 일태양에 있어서 그 당쇄는 생체 내에서 당펩티드(또는 당단백질)로서 결합하여 존재하는 구조를 갖는다. 따라서 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드 및 그 펩티드를 유효성분으로서 포함하는 의약 조성물은 생체 내에 투여해도 부작용이나 항원성을 나타내지 않아 알레르기 반응이나 항체 생산에 의해 약효가 얻어지지 않게 될 우려가 적은 등의 이점을 갖는다.

또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는 안정하여 간편하게 대량으로 공급하는 것이 가능하고 품질이 안정한 고품질의 의약품의 제공이라고 하는 관점에서도 매우 유용하다.

본 발명은 또한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 유효량을 투여하는 것을 특징으로 하는 소마토스타틴에 관련된 질환의 치료 또는 예방방법도 제공한다.

또한 본 명세서에 있어서 사용되는 용어는 특정 실시태양을 설명하기 위해 사용되는 것으로 발명을 한정하는 의도는 아니다.

또한 본 명세서에 있어서 사용되는 「포함한다」는 용어는 문맥상 명확히 상이한 이해를 해야 하는 경우를 제외하고 기술된 사항(부재, 스텝, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 의도하는 것으로 그 이외의 사항(부재, 스텝, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 배제하지 않는다.

상이한 정의가 없는 한 여기에 사용되는 모든 용어(기술용어 및 과학용어를 포함한다.)는 본 발명이 속하는 기술의 당업자에 의해 널리 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 여기에 사용되는 용어는 상이한 정의가 명시되어 있지 않는 한 본 명세서 및 관련기술분야에 있어서의 의미와 정합적인 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하고, 이상화되거나 또는 과도하게 형식적인 의미에서 해석되어서는 안 된다.

본 발명의 실시태양은 모식도를 참조하면서 설명되는 경우가 있지만, 모식도인 경우 설명을 명확하게 하기 위해 과장되어 표현되고 있는 경우가 있다.

제1, 제2 등의 용어가 각종 요소를 표현하기 위해 사용되지만 이들 요소는 그들 용어에 의해 한정되어서는 안 되는 것이 이해된다. 이들 용어는 하나의 요소를 다른 요소와 구별하기 위해서만 사용되고 있는 것으로, 예를 들면 제1 요소를 제2 요소로 기재하고 마찬가지로 제2 요소는 제1 요소로 기재하는 것은 본 발명의 범위를 벗어나지 않아 가능하다.

이하에 있어서 본 발명을 실시예를 참조하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 태양에 의해 구현화할 수 있어 여기에 기재되는 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다.

실시예

또한 본 명세서 중에 있어서의 당쇄 부가 폴리펩티드의 표기방법에 대해서 하기에 설명한다.

예를 들면 S1C(disialo)·N5C(disialo)-SRIF28로 나타낸 경우에는 SRIF28의 폴리펩티드의 1번 위치의 Ser(S1)과 5번 위치의 Asn이 양쪽 모두 디시알로 당쇄 부가 Cys(C(disialo))에 의해 치환되어 있는 것을 나타낸다.

또한 S1C(disialo)-D-Trp22-SRIF28로 나타낸 경우에는 SRIF28의 폴리펩티드의 1번 위치의 Ser(S1)이 디시알로 당쇄 부가 Cys(C(disialo))에 의해 치환되어 있고, 또한 22번 위치의 Trp가 D-Trp로 치환되어 있는 것을 나타낸다.

또한 C(disialo)-R-K-SRIF14로 나타낸 경우에는 SRIF14의 N말단 측에 당쇄 부가 Cys-Arg-Lys-가 부가된 것을 나타낸다.

또한 29C(disialo)-SRIF28이나 30C(disialo)-SRIF28로 나타낸 경우에는 SRIF28의 C말단인 28번 위치의 Cys에 추가로 디시알로 당쇄 부가 Cys가 1개 부가된 것(29C(disialo)-SRIF28), 또는 SRIF28의 C말단인 28번 위치의 Cys에 추가로 -W-디시알로 당쇄 부가 Cys(W는 28번 위치의 Cys에 결합하는 임의의 아미노산을 나타낸다)가 부가된 것(30C(disialo)-SRIF28)을 나타낸다.

또한 S1-2C(disialo)-SRIF28로 나타낸 경우에는 SRIF28의 폴리펩티드의 N말단에 존재하는 1번 위치의 Ser이 연속하는 2개의 디시알로 당쇄 부가 Cys에 치환되어 있는 것을 나타낸다.

또한 「disialo」는 디시알로 당쇄를 의미하고, 「monosialo」는 모노시알로 당쇄를 의미하며, 「asialo」는 아시알로 당쇄를 의미하고, 「diGlcNAc」는 디글크낙 당쇄를 의미하며, 「GlcNAc」는 N-아세틸글루코사민을 의미하고, 「diMan」은 디만노오스 당쇄를 의미하며, 「trisialo」는 트리시알로 당쇄를 의미하고, 「tetrasialo」는 테트라시알로 당쇄를 의미한다. 또한 (disialo(aminoethylamide))로 나타낸 경우에는 디시알로 당쇄의 시알산의 카르복시기가 아미노에틸아미노기에 의해 수식되고 있는 것을 의미한다. 「aminoethylamide」 대신에 「Bn」, 「amide」, 「hexadecylamide」로 나타내어져 있는 것은 각각 당쇄 상의 시알산의 카르복시기가 벤질기, 아미노기, 헥사데실 아미노기에 의해 보호되어 있는 것을 의미한다.

실시예 1 S1C(disialo)-SRIF28의 합성

1-1 티올의 당쇄 수식반응

하기 화학식 1로 표시되는 펩티드 1(서열번호 38)(APC사 제조)(60.6 ㎎, 18.3 μmol)과 하기 화학식 a로 표시되는 화합물 a(브로모아세트아미드화된 올리고당：오츠카 화학 주식회사 제조)(85.8 ㎎, 36.6 μmol, 펩티드 1에 대해서 2.0 등량)를 33 mM 인산 완충액(pH 7.4, 5.5 mL)에 용해하고 실온에서 30분간 반응시켰다.

[화학식 a]

반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% 초산(AcOH)수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=90：10→75：25 15분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 2로 표시되는 당펩티드 2(서열번호 39)(60.5 ㎎, 10.9 μmol, 수율 59%)를 얻었다.

1-2 Acm기의 탈보호

상기 1-1에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 2(51.2 ㎎, 9.19 μmol)에 초산은(I)(18.8 ㎎, 113 μmol)의 수용액(3.7 mL)을 첨가하고 실온에서 40분간 반응시켰다. 200 mM 트리스-염산 완충액(pH 7.4, 3.7 mL)에 용해한 DTT(43.6 ㎎, 282 μmol) 및 100 mM 아스코르브산 수용액(0.92 mL)을 첨가하고 신속하게 필터로 여과하였다. 여과액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=90：10→75：25 15분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 3으로 표시되는 당펩티드 3(서열번호 40)(29.2 ㎎, 5.38 μmol, 수율 58%)을 얻었다.

1-3 디설피드 결합의 형성

상기 1-2에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 3(29.2 ㎎, 5.38 μmol)을 100 mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)-DMSO(1/1, v/v, 10.8 mL)에 용해하고 실온에서 2일간 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=77：23→64：36 17분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 4로 표시되는 화합물(S1C(disialo)-SRIF28)(서열번호 5)을 포함하는 분획을 얻었다.

이 분획을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=90：10→75：25 15분 직선농도구배 용출]를 사용해서 추가로 정제하여 S1C(disialo)-SRIF28(17.2 ㎎, 3.17 μmol, 수율 59%)을 얻었다.

실시예 2 N5C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 5로 표시되는 화합물(펩티드 5)(서열번호 41)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물(N5C(disialo)-SRIF28)(서열번호 6)을 합성하였다.

실시예 3 A9C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 7로 표시되는 화합물(펩티드 7)(서열번호 42)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 8로 표시되는 화합물(A9C(disialo)-SRIF28)(서열번호 7)을 합성하였다.

실시예 4 E12C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 9로 표시되는 화합물(펩티드 9)(서열번호 43)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 10으로 표시되는 화합물(E12C(disialo)-SRIF28)(서열번호 8)을 합성하였다.

실시예 5 R13C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 11로 표시되는 화합물(펩티드 11)(서열번호 44)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 12로 표시되는 화합물(R13C(disialo)-SRIF28)(서열번호 9)을 합성하였다.

실시예 6 K14C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 13으로 표시되는 화합물(펩티드 13)(서열번호 45)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 14로 표시되는 화합물(K14C(disialo)-SRIF28)(서열번호 10)을 합성하였다.

실시예 7 A15C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 15로 표시되는 화합물(펩티드 15)(서열번호 46)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 16으로 표시되는 화합물(A15C(disialo)-SRIF28)(서열번호 11)을 합성하였다.

실시예 8 G16C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 17로 표시되는 화합물(펩티드 17)(서열번호 47)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 18로 표시되는 화합물(G16C(disialo)-SRIF28)(서열번호 12)을 합성하였다.

실시예 9 K18C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 19로 표시되는 화합물(펩티드 19)(서열번호 48)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 20으로 표시되는 화합물(K18C(disialo)-SRIF28)(서열번호 13)을 합성하였다.

실시예 10 N19C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 21로 표시되는 화합물(펩티드 21)(서열번호 49)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 22로 표시되는 화합물(N19C(disialo)-SRIF28)(서열번호 14)을 합성하였다.

실시예 11 F21C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 23으로 표시되는 화합물(펩티드 23)(서열번호 50)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 24로 표시되는 화합물(F21C(disialo)-SRIF28)(서열번호 15)을 합성하였다.

실시예 12 T26C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 25로 표시되는 화합물(펩티드 25)(서열번호 51)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 26으로 표시되는 화합물(T26C(disialo)-SRIF28)(서열번호 16)을 합성하였다.

실시예 13 29C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 27로 표시되는 화합물(펩티드 27)(서열번호 52)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 28로 표시되는 화합물(29C(disialo)-SRIF28)(서열번호 17)을 합성하였다.

실시예 14 30C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 29로 표시되는 화합물(펩티드 29)(서열번호 53)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 30으로 표시되는 화합물(30C(disialo)-SRIF28)(서열번호 18)을 합성하였다.

실시예 15 S1C(disialo)-D-Trp22-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 31로 표시되는 화합물(펩티드 31)(서열번호 54)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 32로 표시되는 화합물(S1C(disialo)-D-Trp22-SRIF28)(서열번호 19)을 합성하였다.

실시예 16 A9C(disialo)-D-Trp22-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 33으로 표시되는 화합물(펩티드 33)(서열번호 55)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 34로 표시되는 화합물(A9C(disialo)-D-Trp22-SRIF28)(서열번호 20)을 합성하였다.

실시예 17 C(disialo)-SRIF14의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 35로 표시되는 화합물(펩티드 35)(서열번호 56)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 36으로 표시되는 화합물(C(disialo)-SRIF14)(서열번호 35)을 합성하였다.

실시예 18 C(disialo)-R-K-SRIF14의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 37로 표시되는 화합물(펩티드 37)(서열번호 57)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 38로 표시되는 화합물(C(disialo)-R-K-SRIF14)(서열번호 36)을 합성하였다.

실시예 19 C(disialo)-C12linker-SRIF14의 합성

19-1 펩티드의 합성

고상합성용 칼럼에 2-클로로트리틸클로라이드 수지(100 μmol)를 덜어 DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 Fmoc-Cys(Acm)-OH(49.7 ㎎, 120 μmol)와 DIPEA(104.5 μL, 600 μmol)의 디클로로메탄(3.0 mL) 용액을 첨가하고 1시간 진탕하였다. 디클로로메탄 및 DMF로 세정 후 Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF로 세정 후 Prelude(상표) 펩티드 합성기를 사용하여 Fmoc법에 의한 펩티드 고상합성법으로 하기 화학식 39로 표시되는 수지에 결합한 상태에 있는 보호된 펩티드 39(서열번호 58)를 합성하였다. 축합반응은 축합제로서 HCTU를 사용하여 DMF 중에서 행하였다.

Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 HCTU를 축합제로서 사용하여 Fmoc-12-아미노도데칸산 및 Fmoc-Cys(Trt)-OH를 순서대로 축합하였다. 축합 후 Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 TFA：물：트리이소프로필실란：에탄디티올(=90：2.5：5：2.5)을 첨가하고 3시간 실온에서 진탕하였다. 이것에 의해 아미노산 측쇄의 보호기(Acm기 이외)를 탈리시키는 동시에 펩티드와 수지를 분리하였다. 수지를 여과하여 제거하고 여과액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하여 조펩티드(crude peptide)를 침전으로서 얻었다. 조펩티드의 일부를 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 그라디언트 A：B=60：40→36.2：63.8 20분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 40으로 표시되는 화합물(펩티드 40)(서열번호 59)(11.2 ㎎)을 얻었다.

19-2 티올의 당쇄 수식반응

상기 19-1에 기재된 방법으로 얻어진 펩티드 40(6.8 ㎎, 3.3 μmol)과 상기 화학식 a로 표시되는 화합물 a(19.1 ㎎, 8.15 μmol)를 7 M 구아니딘 염산염과 330 μM TCEP를 포함하는 0.2 M 인산 완충액(pH 7.4, 0.96 mL)에 용해하고 실온에서 2시간 반응시켰다. HPLC로 원료 소실을 확인한 후 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴, 그라디언트 A：B=80：20→50：50 25분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 41로 표시되는 화합물(당펩티드 41)(서열번호 60)(7.1 ㎎, 1.6 μmol, 수율 50%)을 얻었다.

19-3 Acm기의 탈보호

상기 19-2에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 41(10.3 ㎎, 2.37 μmol)에 초산은(I)(9.7 ㎎, 58 μmol)의 수용액(0.95 mL)을 첨가하고 실온에서 30분간 반응시켰다. 100 mM 인산 완충액(pH 7.4, 0.95 mL)에 용해한 DTT(22.3 ㎎, 145 μmol) 및 100 mM 아스코르브산 수용액(0.95 mL)을 첨가하고 신속하게 필터로 여과하였다. 여과액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=80：20→50：50 25분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 42로 표시되는 당펩티드 42(서열번호 61)(5.8 ㎎, 1.4 μmol, 수율 59%)를 얻었다.

19-4 디설피드 결합의 형성

상기 19-3에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 42(5.8 ㎎, 1.4 μmol)를 100 mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)-DMSO(1/1, v/v, 3.5 mL)에 용해하고 실온에서 30시간 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=70：30→50：50 25분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 43으로 표시되는 화합물(C(disialo)-C12linker-SRIF14)(서열번호 37)을 포함하는 분획을 얻었다.

이 분획을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=80：20→50：50 25분 직선농도구배 용출]를 사용해서 추가로 정제하여 C(disialo)-C12linker-SRIF14(3.6 ㎎, 0.86 μmol, 수율 61%)를 얻었다.

실시예 20 S1-2C(disialo)-SRIF28의 합성

20-1 펩티드의 합성

고상합성용 칼럼에 2-클로로트리틸클로라이드 수지(100 μmol)를 덜어 DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 Fmoc-Cys(Acm)-OH(49.7 ㎎, 120 μmol)와 DIPEA(104.5 μL, 600 μmol)의 디클로로메탄(3.0 mL) 용액을 첨가하고 1시간 진탕하였다. 디클로로메탄 및 DMF로 세정 후 Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 Prelude(상표) 펩티드 합성기를 사용하여 Fmoc법에 의한 펩티드 고상합성법으로 보호된 펩티드를 수지 상에 합성하였다. 축합반응은 축합제로서 HCTU를 사용하여 DMF 중에서 행하였다.

Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 TFA：물：트리이소프로필실란：에탄디티올(=90：2.5：5：2.5)을 첨가하고 3시간 실온에서 진탕하였다. 수지를 여과하여 제거하고 여과액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하여 조펩티드를 침전으로서 얻었다. 조펩티드의 일부를 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=72：28→68.5：31.5 20분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 44로 표시되는 펩티드 44(서열번호 62)(30.7 ㎎)를 얻었다.

20-2 티올의 당쇄 수식반응

상기 20-1에 기재된 방법으로 얻어진 펩티드 44(45.8 ㎎, 13.4 μmol)와 상기 화학식 a로 표시되는 화합물 a(125.8 ㎎, 53.7 μmol, 펩티드 44에 대해서 4.0 등량)를 33 mM 인산 완충액(pH 7.4, 4.0 mL)에 용해하고 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=83：17→72：28 15분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 45로 표시되는 당펩티드 45(서열번호 63)(44.5 ㎎, 5.61 μmol, 수율 42%)를 얻었다.

20-3 Acm기의 탈보호

상기 20-2에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 45(44.5 ㎎, 5.61 μmol)에 초산은(I)(14.8 ㎎, 88.7 μmol)의 수용액(2.2 mL)을 첨가하고 실온에서 30분간 반응시켰다. 200 mM 인산 완충액(pH 7.4, 2.2 mL)에 용해한 DTT(33.2 ㎎, 215 μmol) 및 100 mM 아스코르브산 수용액(561 μL)을 첨가하고 신속하게 필터로 여과하였다. 여과액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=83：17→72：28 15분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 46으로 표시되는 당펩티드 46(서열번호 64)(34.4 ㎎, 4.41 μmol, 수율 79%)을 얻었다.

20-4 디설피드 결합의 형성

상기 20-3에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 46(34.4 ㎎, 4.41 μmol)을 100 mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)-DMSO(1/1, v/v, 8.8 mL)에 용해하고 실온에서 2일간 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=77：23→65：35 16분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 47로 표시되는 화합물(S1-2C(disialo)-SRIF28)(서열번호 21)을 포함하는 분획을 얻었다.

이 분획을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=83：17→72：28 15분 직선농도구배 용출]를 사용해서 추가로 정제하여 S1-2C(disialo)-SRIF28(20.1 ㎎, 2.58 μmol, 수율 58%)을 얻었다.

실시예 21 S1C(disialo)·N5C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 44 대신에 하기 화학식 48로 표시되는 화합물(펩티드 48)(서열번호 65)을 사용한 것 이외는 실시예 20과 동일하게 하여 하기 화학식 49로 표시되는 화합물(S1C(disialo)·N5C(disialo)-SRIF28)(서열번호 22)을 합성하였다.

실시예 22 S1C(disialo)·R13C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 44 대신에 하기 화학식 50으로 표시되는 화합물(펩티드 50)(서열번호 66)을 사용한 것 이외는 실시예 20과 동일하게 하여 하기 화학식 51로 표시되는 화합물(S1C(disialo)·R13C(disialo)-SRIF28)(서열번호 23)을 합성하였다.

실시예 23 N5C(disialo)·A9C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 44 대신에 하기 화학식 52로 표시되는 화합물(펩티드 52)(서열번호 67)을 사용한 것 이외는 실시예 20과 동일하게 하여 하기 화학식 53으로 표시되는 화합물(N5C(disialo)·A9C(disialo)-SRIF28)(서열번호 24)을 합성하였다.

실시예 24 S1-3C(disialo)-SRIF28의 합성

24-1 펩티드의 합성

고상합성용 칼럼에 2-클로로트리틸클로라이드 수지(100 μmol)를 덜어 DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 Fmoc-Cys(Acm)-OH(49.7 ㎎, 120 μmol)와 DIPEA(104.5 μL, 600 μmol)의 디클로로메탄(3.0 mL) 용액을 첨가하고 1시간 진탕하였다. 디클로로메탄 및 DMF로 세정 후 Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF로 세정 후 Prelude(상표) 펩티드 합성기를 사용하여 Fmoc법에 의한 펩티드 고상합성법으로 보호된 펩티드를 수지 상에 합성하였다. 축합반응은 축합제로서 HCTU를 사용하여 DMF 중에서 행하였다.

Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 TFA：물：트리이소프로필실란：에탄디티올(=90：2.5：5：2.5)을 첨가하고 실온에서 3시간 진탕하였다. 수지를 여과하여 제거하고 여과액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하여 조펩티드를 침전으로서 얻었다. 조펩티드의 일부를 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø50×250 ㎜, 유속：43.7 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=73：27→65：35 14분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 54로 표시되는 펩티드 54(서열번호 68)(41.7 ㎎)를 얻었다.

24-2 티올의 당쇄 수식반응

상기 24-1에 기재된 방법으로 얻어진 펩티드 54(10.7 ㎎, 3.04 μmol)와 상기 화학식 a로 표시되는 화합물 a(36.6 ㎎, 15.6 μmol, 펩티드 54에 대해서 5.2 등량)를 10 μM TCEP를 포함하는 33 mM 인산 완충액(pH 7.4, 0.91 mL)에 용해하고 실온에서 100분간 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=80：20→70：30 5분, 이어서 A：B=70：30→65：35 12분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 55로 표시되는 당펩티드 55(서열번호 69)(11.7 ㎎, 1.14 μmol, 수율 38%)를 얻었다.

24-3 Acm기의 탈보호

상기 24-2에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 55(11.7 ㎎, 1.14 μmol)에 초산은(I)(4.7 ㎎, 28 μmol)의 수용액(0.46 mL)을 첨가하고 실온에서 2시간 반응시켰다. 200 mM 트리스-염산 완충액(pH 7.4, 0.46 mL)에 용해한 DTT(11.3 ㎎, 73 μmol) 및 100 mM 아스코르브산 수용액(0.11 mL)을 첨가하고 신속하게 필터로 여과하였다. 여과액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=80：20→70：30 5분, 이어서 70：30→55：45 15분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 56으로 표시되는 당펩티드 56(서열번호 70)(7.4 ㎎, 0.73 μmol, 수율 64%)을 얻었다.

24-4 디설피드 결합의 형성

상기 24-3에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 56(7.4 ㎎, 0.73 μmol)을 100 mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)-DMSO(1/1, v/v, 1.8 mL)에 용해하고 실온에서 25시간 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=80：20→70：30 5분, 이어서 70：30→69.3：30.7 5분 직선농도구배 용출]를 사용하여 정제함으로써 하기 화학식 57로 표시되는 화합물(S1-3C(disialo)-SRIF28)(서열번호 25)을 포함하는 분획을 얻었다.

이 분획을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=80：20→40：60 20분 직선농도구배 용출]를 사용해서 추가로 정제하여 S1-3C(disialo)-SRIF28(4.7 ㎎, 0.46 μmol, 수율 63%)을 얻었다.

실시예 25 S1C(disialo)·N5C(disialo)·A9C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 54 대신에 하기 화학식 58로 표시되는 펩티드 58(서열번호 71)을 사용한 것 이외는 실시예 24와 동일하게 하여 하기 화학식 59로 표시되는 화합물(S1C(disialo)·N5C(disialo)·A9C(disialo)-SRIF28)(서열번호 26)을 합성하였다.

실시예 26 S1C(monosialo)-SRIF28의 합성

화합물 a 대신에 하기 화학식 b로 표시되는 화합물 b(브로모아세트아미드화된 올리고당：오츠카 화학 주식회사 제조)를 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 60으로 표시되는 화합물(S1C(monosialo)-SRIF28)(서열번호 27)을 합성하였다.

[화학식 b]

최종 생성물에 있어서 하기 화학식 b1의 당쇄를 갖는 당쇄 폴리펩티드와 하기 화학식 b2의 당쇄를 갖는 당쇄 부가 폴리펩티드의 비는 45：55였다. 또한 구조가 동일한 모노시알로 당쇄 유도체를 사용함으로써 실질적으로 균일한 당쇄 구조를 갖는 당쇄 부가 폴리펩티드가 제조 가능하다.

[화학식 b1, b2]

실시예 27 S1C(asialo)-SRIF28의 합성

화합물 a 대신에 하기 화학식 c로 표시되는 화합물 c(브로모아세트아미드화된 올리고당：오츠카 화학 주식회사 제조)를 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 61로 표시되는 화합물(S1C(asialo)-SRIF28)(서열번호 28)을 합성하였다.

[화학식 c]

실시예 28 S1-2C(asialo)-SRIF28의 합성

28-1 티올의 당쇄 수식반응

펩티드 44(21.2 ㎎, 6.21 μmol)와 화합물 c(44.5 ㎎, 25.3 μmol, 펩티드 44에 대해서 4.1 등량)를 33 mM 인산 완충액(pH 7.4, 1.9 mL)에 용해하고 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=77：23→62：38 15분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 62로 표시되는 당펩티드 62(서열번호 72)(24.0 ㎎, 3.54 μmol, 수율 57%)를 얻었다.

28-2 Acm기의 탈보호

상기 28-1에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 62(24.0 ㎎, 3.54 μmol)에 초산은(I)(6.0 ㎎, 36 μmol)의 수용액(1.4 mL)을 첨가하고 실온에서 3시간 반응시켰다. 500 mM 인산 완충액(pH 7.4, 0.57 mL)에 용해한 DTT(14.0 ㎎, 90.8 μmol) 및 100 mM 아스코르브산 수용액(0.35 mL)을 첨가하고 신속하게 필터로 여과하였다. 여과액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=75：25→65：35 15분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 63으로 표시되는 당펩티드 63(서열번호 73)(20.1 ㎎, 3.03 μmol, 수율 86%)을 얻었다.

28-3 디설피드 결합의 형성

상기 28-2에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 63(20.1 ㎎, 3.03 μmol)을 100 mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)-DMSO(1/1, v/v, 6.1 mL)에 용해하고 실온에서 2일간 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=77：23→65：35 16분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 64로 표시되는 화합물(S1-2C(asialo)-SRIF28)(서열번호 29)을 포함하는 분획을 얻었다.

이 분획을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=92：8→80：20 16분 직선농도구배 용출]를 사용해서 추가로 정제하여 S1-2C(asialo)-SRIF28(11.0 ㎎, 1.66 μmol, 수율 55%)을 얻었다.

실시예 29 S1-3C(asialo)-SRIF28의 합성

29-1 티올의 당쇄 수식반응

펩티드 54(21.3 ㎎, 6.06 μmol)와 화합물 c(53.4 ㎎, 30.3 μmol, 펩티드 54에 대해서 5.0 등량)를 33 mM 인산 완충액(pH 7.4, 1.8 mL)에 용해하고 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=75：25→70：30 20분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 65로 표시되는 당펩티드 65(서열번호 74)(39.3 ㎎, 4.59 μmol, 수율 76%)를 얻었다.

29-2 Acm기의 탈보호

상기 29-1에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 65(39.3 ㎎, 4.59 μmol)에 초산은(I)(18.7 ㎎, 112 μmol)의 수용액(1.8 mL)을 첨가하고 실온에서 90분간 반응시켰다. 200 mM 인산 완충액(pH 7.4, 1.8 mL)에 용해한 DTT(43.4 ㎎, 28.1 μmol) 및 100 mM 아스코르브산 수용액(0.46 mL)을 첨가하고 신속하게 필터로 여과하였다. 여과액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=75：25→68：32 18분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 66으로 표시되는 당펩티드 66(서열번호 75)(27.6 ㎎, 3.28 μmol, 수율 71%)을 얻었다.

29-3 디설피드 결합의 형성

상기 29-2에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 66(27.6 ㎎, 3.28 μmol)을 100 mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)-DMSO(1/1, v/v, 8.2 mL)에 용해하고 실온에서 2일간 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=72：28→70.5：29.5 15분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 67로 표시되는 화합물(S1-3C(asialo)-SRIF28)(서열번호 30)을 포함하는 분획을 얻었다.

이 분획을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=96：4→82：18 20분 직선농도구배 용출]를 사용해서 추가로 정제하여 S1-3C(asialo)-SRIF28(14.5 ㎎, 1.72 μmol, 수율 52%)을 얻었다.

실시예 30 N5N(disialo)-SRIF28의 합성

30-1 당펩티드의 고상합성

고상합성용 칼럼에 2-클로로트리틸클로라이드 수지(100 μmol)를 덜어 DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 Fmoc-Cys(Trt)-OH(72.5 ㎎, 120 μmol)와 DIPEA(104.6 μL, 600 μmol)의 디클로로메탄(3.0 mL) 용액을 첨가하고 1시간 진탕하였다. 디클로로메탄 및 DMF로 세정 후 Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF로 세정 후 Prelude(상표) 펩티드 합성기를 사용하여 Fmoc법에 의한 펩티드 고상합성법으로 하기 화학식 68로 표시되는 수지에 결합한 상태에 있는 보호된 펩티드 68(서열번호 76)을 합성하였다. 축합반응은 축합제로서 HCTU를 사용하여 DMF 중에서 행하였다.

다음으로 Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF로 세정 후 하기 화학식 d로 표시되는 화합물 d(오츠카 화학 주식회사 제조)(411.9 ㎎, 150.4 μmol), DMSO-DMF(1/1, v/v, 871 μL) 용액, TBTU(64.2 ㎎, 200 μmol) 및 DIPEA(52.3μL, 300 μmol)를 순차 수지에 첨가하고 실온에서 3시간 진탕시켜 축합시켰다.

[화학식 d]

DMF로 세정 후 이 축합 조작을 1회 반복하였다. 수지를 DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 DMF 중의 20%의 피페리딘에서 20분간 진탕하여 Fmoc기를 탈보호하고 DMF로 수지를 세정함으로써 보호된 하기 화학식 69로 표시되는 화합물(펩티드 69)(서열번호 77)을 수지 상에서 합성하였다.

이 수지에 HOBt/DIC를 축합제로서 사용하여 Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ala, Fmoc-Ser(tBu)-OH를 순서대로 축합하였다. 축합 후 Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 TFA：물：트리이소프로필실란：에탄디티올(=90：2.5：5：2.5)을 첨가하고 실온에서 3시간 진탕하였다. 여과액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하여 조펩티드를 침전으로서 얻었다. 이 조펩티드를 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 A：B=70：30]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 70으로 표시되는 당펩티드 70(서열번호 78)(29.1 ㎎, 5.26 μmol)을 얻었다.

30-2 디설피드 결합의 형성

상기 30-1에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 70(12.2 ㎎, 2.20 μmol)을 100 mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)-DMSO(1/1, v/v, 5.5 mL)에 용해하고 실온에서 2일간 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/min, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=80：20→66：35 30분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 71로 표시되는 당펩티드 71(서열번호 79)(8.3 ㎎, 1.5 μmol, 수율 68%)을 얻었다.

30-3 벤질기의 탈보호

상기 30-2에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 71(7.5 ㎎, 1.4 μmol)을 50 mM 수산화나트륨 수용액(20.6 mL)에 용해시키고 0℃에서 80분간 반응시켰다. 200 mM 초산 수용액(5.1 mL)을 첨가하고 혼합용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=73：27→66.3：33.7 20분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 72로 표시되는 화합물(N5N(disialo)-SRIF28)(서열번호 31)을 포함하는 분획을 얻었다.

이 분획을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=80：20→60：40 30분 직선농도구배 용출]를 사용해서 추가로 정제하여 N5N(disialo)-SRIF28(1.4 ㎎, 수율 19%)을 얻었다.

실시예 31 S1N(disialo)-SRIF28의 합성

31-1 당펩티드의 고상합성

고상합성용 칼럼에 2-클로로트리틸클로라이드 수지(100 μmol)를 덜어 DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 Fmoc-Cys(Trt)-OH(72.5 ㎎, 120 μmol)와 DIPEA(104.6 μL, 600 μmol)의 디클로로메탄(3.0 mL) 용액을 첨가하고 1시간 진탕하였다. 디클로로메탄 및 DMF로 세정 후 Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF로 세정 후 Prelude(상표) 펩티드 합성기를 사용하여 Fmoc법에 의한 펩티드 고상합성법으로 하기 화학식 73으로 표시되는 수지에 결합한 상태에 있는 보호된 펩티드 73(서열번호 80)을 합성하였다. 축합반응은 축합제로서 HCTU를 사용하여 DMF 중에서 행하였다.

다음으로 Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF로 세정 후 화합물 d(420.2 ㎎, 153.3 μmol), DMSO-DMF(1/1, v/v, 871 μL) 용액, TBTU(64.2 ㎎, 200 μmol) 및 DIPEA(52.3 μL, 300 μmol)를 순차 수지에 첨가하고 실온에서 2시간 진탕시켜 축합시켰다. DMF로 세정 후 이 축합 조작을 1회 반복하였다. 수지를 DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 DMF 중의 20%의 피페리딘에서 20분간 진탕하여 Fmoc기를 탈보호하고 DMF로 수지를 세정함으로써 보호된 하기 화학식 74로 표시되는 펩티드 74(서열번호 81)를 수지 상에서 합성하였다.

DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 TFA：물：트리이소프로필실란：에탄디티올(=90：2.5：5：2.5)을 첨가하고 실온에서 3시간 진탕하였다. 여과액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하여 조펩티드를 침전으로서 얻었다. 이 조펩티드를 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 A：B=71：29]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 75로 표시되는 당펩티드 75(서열번호 82)(65.7 ㎎, 11.8 μmol)를 얻었다.

31-2 디설피드 결합의 형성

상기 31-1에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 75(20.3 ㎎, 3.65 μmol)를 100 mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)-DMSO(1/1, v/v, 9.0 mL)에 용해하고 실온에서 2일간 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=72：28→67：33 30분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 76으로 표시되는 당펩티드 76(서열번호 83)(17.0 ㎎, 3.06 μmol, 수율 84%)을 얻었다.

31-3 벤질기의 탈보호

상기 31-2에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 76(7.0 ㎎, 1.3 μmol)을 50 mM 수산화나트륨 수용액(19.1 mL)에 용해시키고 0℃에서 1시간 반응시켰다. 200 mM 초산 수용액(9.6 mL)을 첨가하고 혼합용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=85：15→77.5：22.5 20분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 77로 표시되는 화합물(S1N(disialo)-SRIF28)(서열번호 32)(2.7 ㎎, 0.50 μmol, 수율 40%)을 얻었다.

실시예 32 S1C(disialo)·N19C(GlcNAc)-SRIF28의 합성

32-1 펩티드의 합성

Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 TFA：물：트리이소프로필실란：에탄디티올(=90：2.5：5：2.5)을 첨가하고 실온에서 3시간 진탕하였다. 수지를 여과하여 제거하고 여과액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하여 조펩티드를 침전으로서 얻었다. 조펩티드의 일부를 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=72：28→64：36 20분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 78로 표시되는 펩티드 78(서열번호 84)(28.9 ㎎)을 얻었다.

32-2 티올의 당쇄 수식과 StBu기의 탈보호

상기 32-1에 기재된 방법으로 얻어진 펩티드 78(10.0 ㎎, 2.95 μmol)과 하기 화학식 e로 표시되는 화합물 e(브로모아세트아미드화된 단당：오츠카 화학 주식회사 제조)(2.0 ㎎, 5.90 μmol, 펩티드 78에 대해서 2.0 등량)를 20 μM TCEP를 포함하는 33 mM 인산 완충액(pH 7.4, 0.89 mL)에 용해하고 실온에서 2시간 반응시켰다.

[화학식 e]

반응 후 0.1 M 인산 완충액(pH 7.4, 3.0 mL)에 용해한 DTT(45.5 ㎎, 295 μmol)를 첨가하고 실온에서 3시간 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=75：25→65：35 20분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 79로 표시되는 당펩티드 79(서열번호 85)(6.8 ㎎, 1.9 μmol, 수율 64%)를 얻었다.

32-3 티올의 당쇄 수식반응

상기 32-2에 기재된 방법으로 얻어진 펩티드 79(6.8 ㎎, 1.9 μmol)와 상기 화학식 a로 표시되는 화합물 a(22.4 ㎎, 9.56 μmol, 펩티드 79에 대해서 5.0 등량)를 7.6 mM DTT를 포함하는 0.1 M 인산 완충액(pH 7.4, 2.0 mL)에 용해하고 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=85：15→65：35 20분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 80으로 표시되는 당펩티드 80(서열번호 86)(3.4 ㎎, 0.58 μmol, 수율 31%)을 얻었다.

32-4 Acm기의 탈보호

상기 32-3에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 80(3.8 ㎎, 0.65 μmol)에 초산은(I)(2.7 ㎎, 16 μmol)의 수용액(262 μL)을 첨가하고 실온에서 1시간 반응시켰다. 100 mM 인산 완충액(pH 7.4, 426 μL)에 용해한 DTT(10.0 ㎎, 64.8 μmol) 및 100 mM 아스코르브산 수용액(66 μL)을 첨가하고 신속하게 필터로 여과하였다. 여과액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=90：10→60：40 30분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 81로 표시되는 당펩티드 81(서열번호 87)(2.5 ㎎, 0.44 μmol, 수율 67%)을 얻었다.

32-4 디설피드 결합의 형성

상기 32-3에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 81(2.5 ㎎, 0.44 μmol)을 100 mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)-DMSO(1/1, v/v, 1.1 mL)에 용해하고 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=90：10→70：30 30분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 82로 표시되는 화합물(S1C(disialo)·N19C(GlcNAc)-SRIF28)(서열번호 33)(1.5 ㎎, 0.26 μmol, 수율 59%)을 얻었다.

실시예 33 S1C(disialo)·N19C(diMan)-SRIF28의 합성

화합물 e 대신에 하기 화학식 f로 표시되는 화합물 f(브로모아세트아미드화된 올리고당：오츠카 화학 주식회사 제조)를 사용한 것 이외는 실시예 32와 동일하게 하여 하기 화학식 83으로 표시되는 화합물(S1C(disialo)·N19C(diMan)-SRIF28)(서열번호 34)을 합성하였다.

[화학식 f]

실시예 34 S1-5C(disialo)-SRIF28의 합성

34-1 펩티드의 합성

Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 TFA：물：트리이소프로필실란：에탄디티올(=90：2.5：5：2.5)을 첨가하고 실온에서 3시간 진탕하였다. 수지를 여과하여 제거하고 여과액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하여 조펩티드를 침전으로서 얻었다. 조펩티드를 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø50×250 ㎜, 유속：43.7 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=73：27→65：35 35분 직선농도구배 용출]로 정제하여 하기 화학식 84로 표시되는 펩티드 84(서열번호 90)를 얻었다.

34-2 티올의 당쇄 수식반응

상기 34-1에 기재된 방법으로 얻어진 펩티드 84(33.7 ㎎, 9.06 μmol)와 상기 화학식 a로 표시되는 화합물 a(브로모아세트아미드화된 올리고당：오츠카 화학 주식회사 제조)(160.9 ㎎, 68.6 μmol, 펩티드 84에 대해서 7.5 등량)를 10 μM TCEP를 포함하는 33 mM 인산 완충액(pH 7.4, 2.7 mL)에 용해하고 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO Proteonavi(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=80：20→78.4：21.6 20분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 85로 표시되는 당펩티드 85(서열번호 91)(35.1 ㎎, 2.33 μmol, 수율 26%)를 얻었다.

34-3 Acm기의 탈보호

상기 34-2에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 85(20.6 ㎎, 1.37 μmol)에 초산은(I)(5.6 ㎎, 34 μmol)의 수용액(0.55 mL)을 첨가하고 실온에서 50분간 반응시켰다. 그 후 200 mM 인산 완충액(pH 7.4, 0.55 mL)에 용해한 DTT(13.8 ㎎, 89 μmol) 및 100 mM 아스코르브산 수용액(137 μL)을 첨가하고 신속하게 필터로 여과하였다. 여과액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO Proteonavi(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=80：20→73.6：26.4 16분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 86으로 표시되는 당펩티드 86(서열번호 92)(13.6 ㎎, 0.913 μmol, 수율 67%)을 얻었다.

34-4 디설피드 결합의 형성

상기 34-3에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 86(13.6 ㎎, 0.913 μmol)을 100 mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)-DMSO(1/1, v/v, 2.2 mL)에 용해하고 실온에서 2일간 반응시켰다. 그 후 반응용액을 HPLC[칼럼：Proteonavi(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：10 mM 초산암모늄 수용액 B：10 mM 초산암모늄-아세토니트릴(1/9, v/v) 그라디언트 A：B=78：22→70.8：29.2 15분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 87로 표시되는 S1-5C(disialo)-SRIF28(서열번호 88)(10.4 ㎎, 0.698 μmol, 수율 76%)을 얻었다.

실시예 35 S1-10C(disialo)-SRIF28의 합성

35-1 펩티드의 합성

Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 TFA：물：트리이소프로필실란：에탄디티올(=90：2.5：5：2.5)을 첨가하고 실온에서 3시간 진탕하였다. 수지를 여과하여 제거하고 여과액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하여 조펩티드를 침전으로서 얻었다. 조펩티드를 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=69：31→66.6：33.4 15분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 88로 표시되는 펩티드 88(서열번호 93)(16.8 ㎎)을 얻었다.

35-2 브로모아세트아미드화된 벤질 보호기를 갖는 디시알로 당쇄의 합성

화합물 a(28.9 ㎎, 12.3 μmol)에 DMF(0.58 mL), 브롬화리튬(21.5 ㎎, 248 μmol), 브롬화벤질(14.6 μL, 122 μmol)을 순차 첨가하고 30℃에서 20시간 반응시켰다. 브롬화벤질(14.6 μL, 122 μmol)을 추가로 첨가하고 20시간 반응시켰다. 반응액 톨루엔(30 mL)을 첨가하고 원심분리(10,000×g, 10분간) 후 침전물을 물(100 μL)에 용해하여 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：8.0 mL/분, 전개용매 물：아세토니트릴=95：5→70：30 20분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 g로 표시되는 화합물 g(브로모아세트아미드화된 디시알로 당쇄：7.6 ㎎, 3.0 μmol, 수율 24%)를 얻었다.

[화학식 g]

35-3 티올의 당쇄 수식반응

상기 35-1에 기재된 방법으로 얻어진 펩티드 88(8.1 ㎎, 1.9 μmol)과 상기 35-2에 기재된 방법으로 얻어진 화합물 g(58.0 ㎎)를 2.3 M 구아니딘 염산염을 포함하는 66 mM 인산 완충액(pH 6.8, 0.57 mL)에 용해하고 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=80：20→74.7：25.3 30분 직선농도구배 용출]로 정제하여 하기 화학식 89로 표시되는 당펩티드 89(서열번호 94)(12.3 ㎎, 0.429 μmol, 수율 23%)를 얻었다.

35-4 Acm기의 탈보호

상기 35-3에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 89(49.8 ㎎, 1.74 μmol)에 초산은(I)(10.2 ㎎)의 수용액(0.70 mL)을 첨가하고 실온에서 1시간 반응시켰다. DTT(16.6 ㎎)의 200 mM 인산 완충액(pH 7.4, 0.70 mL) 용액 및 100 mM 아스코르브산 수용액(0.17 mL)을 첨가하고 신속하게 필터로 여과하였다. 여과액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=78：22→73：27 20분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 90으로 표시되는 당펩티드 90(서열번호 95)(33.0 ㎎, 1.16 μmol, 수율 67%)을 얻었다.

35-5 디설피드 결합의 형성

상기 35-4에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 90(2.1 ㎎, 0.074 μmol)을 100 mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)-DMSO(1/1, v/v, 185 μL)에 용해하고 실온에서 2일간 반응시켰다. 그 후 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø4.6×250 ㎜, 유속：0.7 mL/분, 전개용매 A：10 mM 초산암모늄 수용액 B：10 mM 초산암모늄-아세토니트릴(1/9, v/v) 그라디언트 A：B=69：31→65：35 20분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 91로 표시되는 당펩티드 91(서열번호 96)(1.0 ㎎, 0.035 μmol, 수율 47%)을 얻었다.

35-6 벤질기의 탈보호

상기 35-5에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 91(17.1 ㎎, 0.599 μmol)을 50 mM 수산화나트륨 수용액(12 mL)에 용해하고 0℃에서 90분간 반응시켰다. 100 mM 초산 수용액 12 mL를 첨가하고 혼합용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO Proteonavi, ø4.6×250 ㎜, 유속：0.7 mL/분, 전개용매 A：10 mM 초산암모늄 수용액 B：10 mM 초산암모늄-아세토니트릴(1/9, v/v) 그라디언트 A：B=72：18→80：20 20분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 92로 표시되는 당펩티드 92(서열번호 89)(5.8 ㎎, 0.22 μmol, 수율 37%)를 얻었다.

실시예 36 C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 93으로 표시되는 화합물(펩티드 93)(서열번호 97)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 94로 표시되는 화합물(C(disialo)-SRIF28)(서열번호 98)을 합성하였다.

실시예 37 R11C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 95로 표시되는 화합물(펩티드 95)(서열번호 99)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 96으로 표시되는 화합물(R11C(disialo)-SRIF28)(서열번호 100)을 합성하였다.

실시예 38 F20C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 97로 표시되는 화합물(펩티드 97)(서열번호 101)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 98로 표시되는 화합물(F20C(disialo)-SRIF28)(서열번호 102)을 합성하였다.

실시예 39 T24C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 99로 표시되는 화합물(펩티드 99)(서열번호 103)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 100으로 표시되는 화합물(T24C(disialo)-SRIF28)(서열번호 104)을 합성하였다.

실시예 40 F25C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 101로 표시되는 화합물(펩티드 101)(서열번호 105)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 102로 표시되는 화합물(F25C(disialo)-SRIF28)(서열번호 106)을 합성하였다.

실시예 41 S27C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 103으로 표시되는 화합물(펩티드 103)(서열번호 107)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 104로 표시되는 화합물(S27C(disialo)-SRIF28)(서열번호 108)을 합성하였다.

실시예 42 C(disialo)-K-SRIF14의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 105로 표시되는 화합물(펩티드 105)(서열번호 109)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 106으로 표시되는 화합물(C(disialo)-K-SRIF14)(서열번호 110)을 합성하였다.

실시예 43 S1C(disialo)-F25Y-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 107로 표시되는 화합물(펩티드 107)(서열번호 111)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 108로 표시되는 화합물(S1C(disialo)-F25Y-SRIF28)(서열번호 112)을 합성하였다.

실시예 44 S1C(disialo)-SRIF28-아미드의 합성

펩티드 1 대신에 하기 화학식 109로 표시되는 화합물(펩티드 109)(서열번호 113)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 110으로 표시되는 화합물(S1C(disialo)-SRIF28-아미드)(서열번호 114)을 합성하였다.

실시예 45 C(disialo)-PEGlinker-SRIF14의 합성

45-1 펩티드의 합성

상기 19-1에 기재된 방법으로 얻어진 수지에 결합되어 있는 보호된 펩티드 39(서열번호 58)(50 μmol)의 Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF로 세정 후 HCTU를 축합제로서 사용하여 Fmoc-NH-(PEG)₂-COOH(머크사 제조) 및 Fmoc-Cys(Trt)-OH를 순서대로 축합하였다. Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 TFA：물：트리이소프로필실란：에탄디티올(=90：2.5：5：2.5)을 첨가하고 3시간 실온에서 진탕하였다. 수지를 여과하여 제거하고 여과액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하여 조펩티드를 침전으로서 얻었다. 조펩티드의 일부를 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 그라디언트 A：B=74：26→69：31 1분, 이어서 69：31→62：38 30분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 111로 표시되는 화합물(펩티드 111)(서열번호 115)(43.1 ㎎)을 얻었다.

45-2 C(disialo)-PEGlinker-SRIF14의 합성

펩티드 1 대신에 상기 45-1에 기재된 방법으로 얻어진 펩티드 111을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 112로 표시되는 화합물(C(disialo)-PEGlinker-SRIF14)(서열번호 116)을 합성하였다.

실시예 46 Biotin-S1C(disialo)-SRIF28의 합성

46-1 펩티드의 합성

고상합성용 칼럼에 2-클로로트리틸클로라이드 수지(100 μmol)를 덜어 DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 Fmoc-Cys(Acm)-OH(49.7 ㎎, 120 μmol)와 DIPEA(104.5 μL, 600 μmol)를 포함하는 디클로로메탄(3.0 mL) 용액을 첨가하고 1시간 진탕하였다. 디클로로메탄 및 DMF로 세정 후 Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF로 세정 후 Prelude(상표) 펩티드 합성기를 사용하여 Fmoc법에 의한 펩티드 고상합성법으로 하기 화학식 113으로 표시되는 수지에 결합한 상태에 있는 보호된 펩티드 113(서열번호 117)을 합성하였다. 축합반응은 축합제로서 HCTU를 사용하여 DMF 중에서 행하였다.

Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF로 세정 후 HCTU를 축합제로서 사용하여 비오틴을 축합시켰다. DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 TFA：물：트리이소프로필실란：에탄디티올(=90：2.5：5：2.5)을 첨가하고 실온에서 3시간 진탕하였다. 이것에 의해 아미노산 측쇄의 보호기(Acm기 이외)를 탈리시키는 동시에 펩티드와 수지를 분리하였다. 수지를 여과하여 제거하고 여과액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하여 조펩티드를 침전으로서 얻었다. 조펩티드를 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=75：25→61：39 18분 직선농도구배 용출]로 정제하여 하기 화학식 114로 표시되는 펩티드 114(서열번호 118)를 얻었다.

46-2 Biotin-S1C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 상기 46-1에 기재된 방법으로 얻어진 펩티드 114를 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 115로 표시되는 화합물(Biotin-S1C(disialo)-SRIF28)(서열번호 119)을 합성하였다.

실시예 47 Biotin-PEGlinker-S1C(disialo)-SRIF28의 합성

47-1 펩티드의 합성

상기 46-1에서 얻어진 수지에 결합되어 있는 보호된 펩티드 113(서열번호 117)의 Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF로 세정 후 HCTU를 축합제로서 사용하여 Fmoc-NH-(PEG)₂-COOH(머크사 제조) 및 비오틴을 순서대로 축합하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 TFA：물：트리이소프로필실란：에탄디티올(=90：2.5：5：2.5)을 첨가하고 실온에서 3시간 진탕하였다. 수지를 여과하여 제거하고 여과액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하여 조펩티드를 침전으로서 얻었다. 조펩티드를 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=75：25→61：39 22분 직선농도구배 용출]로 정제하여 하기 화학식 116으로 표시되는 펩티드 116(서열번호 120)을 얻었다.

47-2 Biotin-PEGlinker-S1C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 상기 47-1에 기재된 방법으로 얻어진 펩티드 116을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 117로 표시되는 화합물(Biotin-PEGlinker-S1C(disialo)-SRIF28)(서열번호 121)을 합성하였다.

실시예 48 Azido-S1C(disialo)-SRIF28의 합성

48-1 펩티드의 합성

상기 46-1에서 얻어진 수지에 결합되어 있는 보호된 펩티드 113(서열번호 117)의 Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF로 세정 후 HCTU를 축합제로서 사용하여 5-Azido-pentanoic acid를 축합하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 TFA：물：트리이소프로필실란：에탄디티올(=90：2.5：5：2.5)을 첨가하고 실온에서 3시간 진탕하였다. 수지를 여과하여 제거하고 여과액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하여 조펩티드를 침전으로서 얻었다. 조펩티드를 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=70：30→60：40 20분 직선농도구배 용출]로 정제하여 하기 화학식 118로 표시되는 펩티드 118(서열번호 122)을 얻었다.

48-2 Azido-S1C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 상기 48-1에 기재된 방법으로 얻어진 펩티드 118을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 119로 표시되는 화합물(Azido-S1C(disialo)-SRIF28)(서열번호 123)을 합성하였다.

실시예 49 S1C(disialo)·E12C(disialo)-SRIF28의 합성

펩티드 44 대신에 하기 화학식 120으로 표시되는 화합물(펩티드 120)(서열번호 124)을 합성하여 사용한 것 이외는 실시예 20과 동일하게 하여 하기 화학식 121로 표시되는 화합물(S1C(disialo)·E12C(disialo)-SRIF28)(서열번호 125)을 합성하였다.

실시예 50 2C(disialo)-R-K-SRIF14의 합성

펩티드 44 대신에 하기 화학식 122로 표시되는 화합물(펩티드 122)(서열번호 126)을 합성하여 사용한 것 이외는 실시예 20과 동일하게 하여 하기 화학식 123으로 표시되는 화합물(2C(disialo)-R-K-SRIF14)(서열번호 127)을 합성하였다.

실시예 51 3C(disialo)-R-K-SRIF14의 합성

펩티드 54 대신에 하기 화학식 124로 표시되는 화합물(펩티드 124)(서열번호 128)을 합성하여 사용한 것 이외는 실시예 24와 동일하게 하여 하기 화학식 125로 표시되는 화합물(3C(disialo)-R-K-SRIF14)(서열번호 129)을 합성하였다.

실시예 52 S1C(diGlcNAc)-SRIF28의 합성

52-1 티올의 당쇄 수식반응

펩티드 1(서열번호 38)(APC사 제조)(25.0 ㎎, 7.56 μmol)과 하기 화학식 h로 표시되는 화합물 h(브로모아세트아미드화된 올리고당：오츠카 화학 주식회사 제조)(15.6 ㎎, 15.1 μmol, 펩티드 1에 대해서 2.0 등량)를 33 mM 인산 완충액(pH 7.4, 2.3 mL)에 용해하고 실온에서 30분간 반응시켰다.

[화학식 h]

반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 A：B=75：25→62：38 13분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 126으로 표시되는 당펩티드 126(서열번호 130)(25.6 ㎎, 6.01 μmol, 수율 79%)을 얻었다.

52-2 Acm기의 탈보호

상기 52-1에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 126(28.3 ㎎, 6.07 μmol)에 초산은(I)(12.5 ㎎, 74.5 μmol)의 수용액(2.4 mL)을 첨가하고 실온에서 30분간 반응시켰다. 200 mM 트리스-염산 완충액(pH 7.4, 2.4 mL)에 용해한 DTT(28.8 ㎎, 187 μmol) 및 100 mM 아스코르브산 수용액(0.6 mL)을 첨가하고 신속하게 필터로 여과하였다. 여과액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=73：27→60：40 13분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 127로 표시되는 당펩티드 127(서열번호 131)(19.8 ㎎, 4.38 μmol, 수율 72%)을 얻었다.

52-3 디설피드 결합의 형성

상기 52-2에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 127(19.8 ㎎, 4.38 μmol)을 100 mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)-DMSO(1/1, v/v, 8.8 mL)에 용해하고 실온에서 2일간 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=73：27→60：40 13분 직선농도구배 용출]를 사용해서 조정제하여, 하기 화학식 128로 표시되는 화합물(S1C(diGlcNAc)-SRIF28)(서열번호 132)을 포함하는 분획을 얻었다.

이 분획을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=90：10→78：22 12분 직선농도구배 용출]를 사용해서 추가로 정제하여 S1C(diGlcNAc)-SRIF28(11.9 ㎎, 2.63 μmol, 수율 60%)을 얻었다.

실시예 53 S1C(diMan)-SRIF28의 합성

화합물 h 대신에 화합물 f를 사용한 것 이외는 실시예 52와 동일하게 하여 하기 화학식 129로 표시되는 화합물(S1C(diMan)-SRIF28)(서열번호 133)을 합성하였다.

실시예 54 N19C(diMan)-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 펩티드 21을 사용하고, 화합물 h 대신에 화합물 f를 사용한 것 이외는 실시예 52와 동일하게 하여 하기 화학식 130으로 표시되는 화합물(N19C(diMan)-SRIF28)(서열번호 134)을 합성하였다.

실시예 55 S1C(GlcNAc)-SRIF28의 합성

화합물 h 대신에 화합물 e를 사용한 것 이외는 실시예 52와 동일하게 하여 하기 화학식 131로 표시되는 화합물(S1C(GlcNAc)-SRIF28)(서열번호 135)을 합성하였다.

실시예 56 N19C(GlcNAc)-SRIF28의 합성

펩티드 1 대신에 펩티드 21을 사용하고, 화합물 h 대신에 화합물 e를 사용한 것 이외는 실시예 52와 동일하게 하여 하기 화학식 132로 표시되는 화합물(N19C(GlcNAc)-SRIF28)(서열번호 136)을 합성하였다.

실시예 57 S1C(trisialo)-SRIF28의 합성

화합물 a 대신에 하기 화학식 i로 표시되는 화합물 i(브로모아세트아미드화된 올리고당：오츠카 화학 주식회사 제조)를 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 133으로 표시되는 화합물(S1C(trisialo)-SRIF28)(서열번호 137)을 합성하였다.

[화학식 i]

실시예 58 S1C(tetrasialo)-SRIF28의 합성

화합물 a 대신에 하기 화학식 j로 표시되는 화합물 j(브로모아세트아미드화된 올리고당：오츠카 화학 주식회사 제조)를 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 134로 표시되는 화합물(S1C(tetrasialo)-SRIF28)(서열번호 138)을 합성하였다.

[화학식 j]

실시예 59 S1C(disialo(aminoethylamide))-SRIF28의 합성

59-1 브로모아세트아미드화된 디시알로 당쇄 유도체의 합성

하기 화학식 k로 표시되는 화합물 k(오츠카 화학 주식회사 제조)(204.1 ㎎, 92.1 μmol)에 물(2 mL), tert-Butyl N-(2-Aminoethyl)carbamate(0.29 mL, 0.18 mmol)를 첨가하고 실온에서 1시간 교반시켰다. 동결건조 후 얻어진 동결건조물에 DMF(5 mL), HATU(349 ㎎, 921 μmol), DIPEA(161 μL, 921 μmol)를 첨가하고 37℃에서 18시간 반응시켰다. 용액에 톨루엔(50 mL)을 첨가하여 석출된 침전물을 여과로 회수하였다. 침전물을 DMF(5 mL)에 용해하고 겔여과 정제[칼럼：Sephadex G-25, ø20×200 ㎜, 유속：30 mL/h]를 사용해서 정제하여 목적 분획을 회수하고 동결건조함으로써 하기 화학식 l로 표시되는 화합물 l(152.4 ㎎, 60.8 μmol, 수율 66%)을 얻었다.

[화학식 k]

[화학식 l]

화합물 l(100 ㎎, 39.8 μmol)과 탄산수소암모늄(31.4 ㎎, 398 μmol)을 물(1 mL)에 용해하고 실온에서 7일간 반응시켰다. 동결건조 후 얻어진 동결건조물에 대해서 물(1 mL), DCC(41.0 ㎎, 199 μmol), DMF(1 mL)에 용해한 브로모초산(27.7 ㎎, 199 μmol)을 순차 첨가하였다. 빙랭하에서 1시간 반응 후 용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：8.0 mL/분, 전개용매 물：아세토니트릴=84：16]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 m으로 표시되는 화합물 m(브로모아세트아미드화된 디시알로 당쇄 유도체：100 ㎎, 38.2 μmol, 수율 96%)을 얻었다.

[화학식 m]

59-2 티올의 당쇄 수식반응

상기 59-1에 기재된 방법으로 얻어진 화합물 m(14.2 ㎎, 5.40 μmol)과 펩티드 1(15.0 ㎎, 4.53 μmol)을 33 mM 인산 완충액(pH 7.4, 1.3 mL)에 용해하고 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% 초산(AcOH)수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=86：14→82：18 20분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 135로 표시되는 당펩티드 135(서열번호 139)(13.4 ㎎, 2.29 μmol, 수율 51%)를 얻었다.

59-3 Boc기의 탈보호

상기 59-2에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 135(13.4 ㎎, 2.29 μmol)를 95% TFA 수용액(458 μL)에 용해시키고 실온에서 5분간 진탕하였다. 50 mM 초산암모늄 수용액(pH 6.8, 33 mL)을 첨가한 후 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=73：27→65：35 10분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 136으로 표시되는 당펩티드 136(서열번호 140)(12.7 ㎎, 98 μmol, 수율 98%)을 얻었다.

59-4 Acm기의 탈보호

상기 59-3에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 136(12.7 ㎎, 2.25 μmol)에 초산은(I)(9.2 ㎎, 55 μmol)의 수용액(0.9 mL)을 첨가하고 실온에서 30분간 반응시켰다. 그 후 200 mM 인산 완충액(pH 7.4, 0.9 mL)에 용해한 DTT(21.2 ㎎, 137 μmol) 및 100 mM 아스코르브산 수용액(225 μL)을 첨가하고 신속하게 필터로 여과하였다. 여과액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=73：27→60：40 13분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 136으로 표시되는 당펩티드 137(서열번호 141)(5.2 ㎎, 0.94 μmol, 수율 42%)을 얻었다.

59-5 디설피드 결합의 형성

상기 59-4에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 137(5.2 ㎎, 0.94 μmol)을 100 mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)-DMSO(1/1, v/v, 1.9 mL)에 용해하고 실온에서 2일간 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=70：30→65：35 13분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 138로 표시되는 화합물(S1C(disialo(aminoethylamide))-SRIF28)(서열번호 142)을 포함하는 분획을 얻었다.

이 분획을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=92：8→85：15 14분 직선농도구배 용출]를 사용해서 추가로 정제하여 S1C(disialo(aminoethylamide))-SRIF28(3.8 ㎎, 0.69 μmol, 수율 73%)을 얻었다.

실시예 60 S1C(disialo(amide))-SRIF28의 합성

60-1 브로모아세트아미드화된 디시알로 당쇄 유도체의 합성

화합물 k(오츠카 화학 주식회사 제조)(152 ㎎, 68.6 μmol)에 DMF(1.9 mL), 브롬화리튬(357 ㎎, 4.12 mmol), 염화페나실(273 ㎎, 1.37 mmol)을 순차 첨가하고 37℃에서 반응시켰다. 10시간 후 물(19 mL)을 첨가하여 석출물을 여과로 제거하였다. 여과액에 25% 암모늄수(5 mL)를 첨가하여 실온에서 18시간 반응시킨 후 100 mM 인산 완충액(pH 7.4, 80 mL)을 첨가하여 중화하였다. 용액을 HPLC[칼럼：YMC Hydrosphere C18(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：8.0 mL/분, 전개용매 0.1% TFA수：아세토니트릴=98：2→92：8 30분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여 동결건조함으로써 하기 화학식 n으로 표시되는 화합물 n(60.9 ㎎, 27.4 μmol, 수율 40%)을 얻었다.

[화학식 n]

얻어진 중간체 n(37.3 ㎎, 16.8 μmol)과 탄산수소암모늄(13.3 ㎎, 168 μmol)을 물(0.37 mL)에 용해하고 실온에서 7일간 반응시켰다. 동결건조 후 얻어진 동결건조물에 대해서 물(0.37 mL), DCC(17.3 ㎎, 84 μmol), DMF(0.37 mL)에 용해한 브로모초산(11.7 ㎎, 84 μmol)을 순차 첨가하였다. 빙랭하에서 1시간 반응 후의 용액을 HPLC[칼럼：YMC Hydrosphere C18(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：8.0 mL/분, 전개용매 0.1% TFA수：아세토니트릴=98：2→92：8, 30분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 o로 표시되는 화합물 o(브로모아세트아미드화된 디시알로 당쇄 유도체：29.0 ㎎, 12.4 μmol, 수율 74%)를 얻었다.

[화학식 o]

60-2 S1C(disialo(amide))-SRIF28의 합성

화합물 a 대신에 상기 60-1에 기재된 방법으로 얻어진 화합물 o를 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 139로 표시되는 화합물(S1C(disialo(amide))-SRIF28)(서열번호 143)을 합성하였다.

실시예 61 S1C(disialo(Bn))-SRIF28의 합성

화합물 a 대신에 화합물 g를 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 140으로 표시되는 화합물(S1C(disialo(Bn))-SRIF28)(서열번호 144)을 합성하였다.

실시예 62 S1C(disialo(hexadecylamide))-SRIF28의 합성

62-1 브로모아세트아미드화된 디시알로 당쇄 유도체의 합성

화합물 k(오츠카 화학 주식회사 제조)(140 ㎎, 63.0 μmol)에 물(1.5 mL), 메탄올(1.5 mL), 헥사데실아민(300 ㎎, 126 μmol)을 첨가하고 실온에서 1시간 교반시켰다. 동결건조 후 얻어진 동결건조물에 DMF(5 mL), HATU(239 ㎎, 630 μmol), DIPEA(110 μL, 630 μmol)를 첨가하고 37℃에서 반응시켰다. 18시간 후 용액에 디에틸에테르(100 mL)를 첨가하고 석출된 침전물을 여과로 회수하였다. 이 침전물을 DMF(5 mL)에 용해하고 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：8.0 mL/분, 전개용매 물：아세토니트릴=40：60→10：90, 30분 직선농도구배 용출]를 사용하여 정제함으로써 하기 화학식 p로 표시되는 화합물 p(71.1 ㎎, 26.6 μmol, 수율 42%)를 얻었다.

[화학식 p]

얻어진 화합물 p(71.7 ㎎, 26.6 μmol)와 탄산수소암모늄(21.8 ㎎, 266 μmol)을 물(0.7 mL), 메탄올(0.7 mL)에 용해하고 실온에서 반응시켰다. 7일 후 동결건조하여 얻어진 동결건조물에 대해서 물(0.7 mL), 메탄올(0.7 mL), DCC(27.4 ㎎, 133 μmol), DMF(0.7 mL)에 용해한 브로모초산(18.5 ㎎, 133 μmol)을 순차 첨가하였다. 빙랭하에서 1시간 반응 후 용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：8.0 mL/분, 전개용매 물：아세토니트릴=40：60→10：90, 30분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 q로 표시되는 화합물 q(브로모아세트아미드화된 디시알로 당쇄：24.9 ㎎, 8.9 μmol, 수율 33%)를 얻었다.

[화학식 q]

62-2 티올의 당쇄 수식반응

펩티드 1(10.4 ㎎, 3.14 μmol)을 30 μM TCEP를 포함하는 0.5 M 인산 완충액(pH 7.4, 62 μL)에 용해시켰다. 이 용액에 상기 62-1에 기재된 방법으로 얻어진 화합물 q(79.4 ㎎, 28.5 μmol)의 DMSO(3.7 mL)용액을 첨가하고 실온에서 20분간 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO Proteonavi(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=50：50→22：78 14분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 141로 표시되는 당펩티드 141(서열번호 145)(6.4 ㎎, 1.1 μmol, 수율 35%)를 얻었다.

62-3 Acm기의 탈보호

상기 62-2에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 141(6.4 ㎎, 1.1 μmol)에 초산은(I)(3.8 ㎎, 23 μmol)의 수용액(0.8 mL)을 첨가하고 실온에서 40분간 반응시켰다. 그 후 200 mM 인산 완충액(pH 7.4, 377 μL)에 용해한 DTT(8.8 ㎎, 57 μmol) 및 100 mM 아스코르브산 수용액(106 μL)을 첨가하고 신속하게 필터로 여과하였다. 여과액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO Proteonavi(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=48：52→38：62 3분, 이어서 38：62→30：70 8분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 142로 표시되는 당펩티드 142(서열번호 146)(3.2 ㎎, 0.54 μmol, 수율 49%)를 얻었다.

62-3 디설피드 결합의 형성

상기 62-2에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 142(3.2 ㎎, 0.54 μmol)를 100 mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)-DMSO(1/1, v/v, 1.1 mL)에 용해하고 실온에서 2일간 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO Proteonavi(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=48：52→38：62 3분, 이어서 38：62→30：70 8분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 143으로 표시되는 화합물(S1C(disialo(hexadecylamide))-SRIF28)(서열번호 147)(2.8 ㎎, 0.48 μmol, 수율 89%)을 얻었다.

실시예 63 S1-2C(disialo(amide))-SRIF28의 합성

화합물 c 대신에 화합물 o를 사용한 것 이외는 실시예 28과 동일하게 하여 하기 화학식 144로 표시되는 화합물(S1-2C(disialo(amide))-SRIF28)(서열번호 148)을 합성하였다.

실시예 64 S1-2C(disialo(Bn))-SRIF28의 합성

화합물 c 대신에 화합물 g를 사용한 것 이외는 실시예 28과 동일하게 하여 하기 화학식 145로 표시되는 화합물(S1-2C(disialo(Bn))-SRIF28)(서열번호 149)을 합성하였다.

실시예 65 S1C(Asn(disialo))-SRIF28의 합성

화합물 a 대신에 하기 화학식 r로 표시되는 화합물 r(브로모아세틸화된 당쇄 부가 Asn：오츠카 화학 주식회사 제조)을 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 하기 화학식 146으로 표시되는 화합물(S1C(Asn(disialo))-SRIF28)(서열번호 150)을 합성하였다.

[화학식 r]

실시예 66 S1N(disialo)·N19C(diMan)-SRIF28의 합성

66-1 당펩티드의 고상합성

고상합성용 칼럼에 2-클로로트리틸클로라이드 수지(100 μmol)를 덜어 DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 Fmoc-Cys(Trt)-OH(72.5 ㎎, 120 μmol)와 DIPEA(104.6 μL, 600 μmol)의 디클로로메탄(3.0 mL) 용액을 첨가하고 1시간 진탕하였다. 디클로로메탄 및 DMF로 세정 후 Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF로 세정 후 Prelude(상표) 펩티드 합성기를 사용하여 Fmoc법에 의한 펩티드 고상합성법으로 수지에 결합한 상태에 있는 보호된 하기 화학식 147로 표시되는 펩티드 147(서열번호 151)을 합성하였다. 축합반응은 축합제로서 HCTU를 사용하여 DMF 중에서 행하였다.

다음으로 Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF로 세정 후 화합물 d(141.0 ㎎, 51.5 μmol), DMSO-DMF(1/1, v/v, 1.1 mL) 용액, TBTU(21.2 ㎎, 66.0 μmol) 및 DIPEA(17.2 μL, 98.7 μmol)를 순차 수지에 첨가하고 실온에서 4시간 진탕시켜 축합시켰다. DMF로 세정 후 이 축합 조작을 1회 반복하였다. 수지를 DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 DMF 중의 20%의 피페리딘에서 20분간 진탕하여 Fmoc기를 탈보호하고 DMF로 수지를 세정함으로써 하기 화학식 148로 표시되는 수지에 결합한 상태에 있는 보호된 펩티드 148(서열번호 152)을 합성하였다.

DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 TFA：물：트리이소프로필실란：에탄디티올(=90：2.5：5：2.5)을 첨가하고 실온에서 3시간 진탕하였다. 수지를 여과하여 제거하고 여과액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하여 조펩티드를 침전으로서 얻었다. 이 조펩티드를 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 A：B=70：30]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 149로 표시되는 당펩티드 149(서열번호 153)(5.8 ㎎, 1.1 μmol)를 얻었다.

66-2 티올의 당쇄 수식반응

상기 66-1에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 149(10.8 ㎎, 1.90 μmol)와 화합물 f(5.3 ㎎, 5.1 μmol)를 141 μM TCEP를 포함하는 100 mM 인산 완충액(pH 7.4, 0.8 mL)에 용해하고 실온에서 24시간 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 A：B=75：25→60：40 30분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 150으로 표시되는 당펩티드 150(서열번호 154)(4.9 ㎎, 0.74 μmol, 수율 39%)을 얻었다.

66-3 Acm기의 탈보호

상기 66-2에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 150(4.9 ㎎, 0.74 μmol)에 초산은(I)(1.5 ㎎, 9.0 μmol)의 수용액(148 μL)을 첨가하고 실온에서 1.5시간 반응시켰다. 200 mM 인산 완충액(pH 7.4, 145 μL)에 용해한 DTT(3.5 ㎎, 23 μmol) 및 100 mM 아스코르브산 수용액(37 μL)을 첨가하고 신속하게 필터로 여과하였다. 여과액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=74：26→64：36 30분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 151로 표시되는 당펩티드 151(서열번호 155)(3.7 ㎎, 0.57 μmol, 수율 77%)을 얻었다.

66-4 디설피드 결합의 형성

상기 66-3에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 151(3.7 ㎎, 0.54 μmol)을 100 mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)-DMSO(1/1, v/v, 1.4 mL)에 용해하고 실온에서 31시간 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=75：25→60：40 30분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 152로 표시되는 당펩티드 152(서열번호 156)(2.9 ㎎, 0.45 μmol, 수율 78%)를 얻었다.

66-5 벤질기의 탈보호

상기 66-4에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 152(2.9 ㎎, 0.45 μmol)를 50 mM 수산화나트륨 수용액(13.6 mL)에 용해시켜 0℃에서 1시간 반응시켰다. 200 mM 초산 수용액(3.4 mL)을 첨가하고 혼합용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=75：25→60：40 20분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 153으로 표시되는 화합물(S1N(disialo)·N19C(diMan)-SRIF28)(서열번호 157)을 포함하는 분획을 얻었다.

이 분획을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø4.6×250 ㎜, 유속：0.7 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=95：5→85：15 2분, 이어서 85：15→65：35 20분 직선농도구배 용출]를 사용해서 추가로 정제하여 S1N(disialo)·N19C(diMan)-SRIF28(1.6 ㎎, 0.25 μmol, 수율 57%)을 얻었다.

실시예 67 C(disialo(aminoethylamide))·S1C(disialo)-SRIF28의 합성

67-1 펩티드의 합성

고상합성용 칼럼에 2-클로로트리틸클로라이드 수지(100 μmol)를 덜어 DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 Fmoc-Cys(Acm)-OH(49.7 ㎎, 120 μmol)와 DIPEA(104.5 μL, 600 μmol)의 디클로로메탄(3.0 mL) 용액을 첨가하고 1시간 진탕하였다. 디클로로메탄 및 DMF로 세정 후 Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF로 세정 후 Prelude(상표) 펩티드 합성기를 사용하여 Fmoc법에 의한 펩티드 고상합성법으로 수지에 결합한 상태에 있는 보호된 하기 화학식 154로 표시되는 펩티드 154(서열번호 158)를 합성하였다. 축합반응은 축합제로서 HCTU를 사용하여 DMF 중에서 행하였다.

수지의 일부(50 μmol)를 덜어 Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 TFA：물：트리이소프로필실란：에탄디티올(=90：2.5：5：2.5)을 첨가하고 실온에서 3시간 진탕하였다. 수지를 여과하여 제거하고 여과액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하여 조펩티드를 침전으로서 얻었다. 조펩티드를 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=73：27→63：37 30분 직선농도구배 용출]로 정제하여 하기 화학식 155로 표시되는 펩티드 155(서열번호 159)(30.4 ㎎)를 얻었다.

67-2 당쇄 유도체에 있어서의 Boc기의 탈보호

화합물 m(50.0 ㎎, 19.0 μmol)을 TFA-H₂O(95/5, v/v, 2.5 mL) 용액에 용해시켜 실온에서 진탕하였다. 10분 후 디에틸에테르(15 mL)를 첨가하고 석출된 침전을 원심분리(10,000×g 10분간)하였다. 침전물을 물에 용해하여 동결건조함으로써 하기 화학식 s로 표시되는 화합물 s(브로모아세트아미드화된 디시알로 당쇄：46.0 ㎎, 18.9 μmol, 수율 99%)를 얻었다.

[화학식 s]

67-3 티올의 당쇄 수식

상기 67-1에 기재된 방법으로 얻어진 펩티드 155(20.6 ㎎, 5.89 μmol)와 상기 67-2에 기재된 방법으로 얻어진 화합물 s(28.6 ㎎, 11.8 μmol)를 33 mM 인산 완충액(pH 7.4, 1.8 mL)에 용해하고 실온에서 30분 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=74：26→64：36 20분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 156으로 표시되는 당펩티드 156(서열번호 160)(17.1 ㎎, 2.93 μmol, 수율 50%)을 얻었다.

67-4 StBu기의 탈보호

상기 67-3에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 156(17.1 ㎎, 2.93 μmol)에 0.1 M 인산 완충액(pH 7.4, 3.4 mL)에 용해한 DTT(52.9 ㎎, 343 μmol)를 첨가하고 실온에서 3시간 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=95：5→75：25 20분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 157로 표시되는 당펩티드 157(서열번호 161)(8.6 ㎎, 1.5 μmol, 수율 51%)을 얻었다.

67-5 티올의 당쇄 수식반응

상기 67-4에 기재된 방법으로 얻어진 펩티드 157(6.2 ㎎, 1.1 μmol)과 화합물 a(3.8 ㎎, 1.6 μmol)를 1.6 mM DTT를 포함하는 0.36 M 인산 완충액(pH 7.4, 339 mL)에 용해하고 실온에서 2.5시간 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=90：10→75：25 30분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 158로 표시되는 당펩티드 158(서열번호 162)(6.4 ㎎, 0.80 μmol, 수율 73%)을 얻었다.

67-6 Acm기의 탈보호

상기 67-5에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 158(8.2 ㎎, 1.0 μmol)에 초산은(I)(2.1 ㎎, 13 μmol)의 수용액(225 μL)을 첨가하고 실온에서 1시간 반응시켰다. 100 mM 인산 완충액(pH 7.4, 204 μL)에 용해한 DTT(4.8 ㎎, 31 μmol) 및 100 mM 아스코르브산 수용액(51 μL)을 첨가하고 신속하게 필터로 여과하였다. 여과액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=90：10→75：25 30분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 159로 표시되는 당펩티드 159(서열번호 163)(5.5 ㎎, 0.70 μmol, 수율 70%)를 얻었다.

67-7 디설피드 결합의 형성

상기 67-6에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 159(5.4 ㎎, 0.69 μmol)를 100 mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)-DMSO(1/1, v/v, 1.7 mL)에 용해하고 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=75：25→65：35 30분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 160으로 표시되는 화합물(C(disialo(aminoethylamide))·S1C(disialo)-SRIF28)(서열번호 164)을 포함하는 분획을 얻었다.

이 분획을 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=90：10→75：25 20분 직선농도구배 용출]를 사용해서 추가로 정제하여 C(disialo(aminoethylamide))·S1C(disialo)-SRIF28(3.1 ㎎, 0.40 μmol, 수율 58%)을 얻었다.

실시예 68 S1-4C(disialo)-SRIF28의 합성

68-1 펩티드의 합성

고상합성용 칼럼에 2-클로로트리틸클로라이드 수지(100 μmol)를 덜어 DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 Fmoc-Cys(Acm)-OH(49.7 ㎎, 120 μmol)와 DIPEA(104.5 μL, 600 μmol)의 디클로로메탄(3.0 mL) 용액을 첨가하고 1시간 진탕하였다. 디클로로메탄 및 DMF로 세정 후 Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF로 세정 후 Prelude(상표) 펩티드 합성기를 사용하여 Fmoc법에 의한 펩티드 고상합성법으로 하기 화학식 161로 표시되는 수지에 결합한 상태에 있는 보호된 펩티드 161(서열번호 165)을 합성하였다. 축합반응은 축합제로서 HCTU를 사용하여 DMF 중에서 행하였다.

Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리딘으로 처리함으로써 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후 TFA：물：트리이소프로필실란：에탄디티올(=90：2.5：5：2.5)을 첨가하고 실온에서 3시간 진탕하였다. 수지를 여과하여 제거하고 여과액에 냉각한 디에틸에테르를 첨가하여 조펩티드를 침전으로서 얻었다. 조펩티드를 HPLC[칼럼：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 ㎛), ø50×250 ㎜, 유속：43.7 mL/분, 전개용매 A：0.1% TFA수 B：0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=75：25→65：35 20분 직선농도구배 용출]로 정제하여 하기 화학식 162로 표시되는 펩티드 162(서열번호 166)(127.2 ㎎)를 얻었다.

68-2 티올의 당쇄 수식반응

상기 68-1에 기재된 방법으로 얻어진 펩티드 162(30.4 ㎎, 8.40 μmol)와 화합물 a(128 ㎎, 54.7 μmol)를 33 mM 인산 완충액(pH 7.4, 2.5 mL)에 용해하고 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO Proteonavi(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=82：18→71：29 20분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 163으로 표시되는 당펩티드 163(서열번호 167)(30.9 ㎎, 2.44 μmol, 수율 29%)을 얻었다.

68-3 Acm기의 탈보호

상기 68-2에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 163(30.9 ㎎, 2.44 μmol)에 초산은(I)(5.0 ㎎, 30 μmol)의 수용액(0.98 mL)을 첨가하고 실온에서 20분간 반응시켰다. 그 후 200 mM 트리스-염산 완충액(pH 7.4, 0.98 mL)에 용해한 DTT(11.8 ㎎, 76.5 μmol) 및 100 mM 아스코르브산 수용액(244 μL)을 첨가하고 신속하게 필터로 여과하였다. 여과액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO Proteonavi(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：0.1% AcOH수 B：0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴 그라디언트 A：B=82：18→70：30 20분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 164로 표시되는 당펩티드 164(서열번호 168)(20.6 ㎎, 1.64 μmol, 수율 67%)를 얻었다.

68-4 디설피드 결합의 형성

상기 68-3에 기재된 방법으로 얻어진 당펩티드 164(20.6 ㎎, 1.64 μmol)를 100 mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)-DMSO(1/1, v/v, 2.1 mL)에 용해하고 실온에서 2일간 반응시켰다. 그 후 반응용액을 HPLC[칼럼：SHISEIDO Proteonavi(5 ㎛), ø20×250 ㎜, 유속：7.0 mL/분, 전개용매 A：10 mM 초산암모늄 수용액 B：10 mM 초산암모늄-아세토니트릴(1/9, v/v) 그라디언트 A：B=75：25→72：28 15분 직선농도구배 용출]를 사용해서 정제하여, 하기 화학식 165로 표시되는 S1-4C(disialo)-SRIF28(서열번호 169)(11.6 ㎎, 0.93 μmol, 수율 57%)을 얻었다.

표 1-1~표 1-7에 실시예 1~68에 기재된 방법으로 얻어진 당쇄 부가 SRIF 펩티드의 MS 스펙트럼 데이터(ESI-MS)를 나타낸다. 분자 질량은 MassLynx 버전 4.1(Waters사 제조)을 사용하여 다가 단백질 질량 분석의 디콘볼루션(deconvolution)을 행함으로써 얻었다.

[표 1-1]

[표 1-2]

[표 1-3]

[표 1-4]

[표 1-5]

[표 1-6]

[표 1-7]

실시예 69-1 수용체 결합 친화성의 산출

하기의 방법으로 경합적 결합 실험을 행하여 수용체 결합 친화성을 산출하였다.

경합적 결합 실험에 사용한 시약과 그의 정식 화학명은 아래와 같다. HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), BSA(소혈청 알부민).

경합적 결합 실험은 리세르카 바이오사이언스사에 위탁하여 실험 및 데이터 해석을 행하였다. 사용한 수용체 서브타입 및 수용체막 표품을 표 2에 나타낸다. 각 결합 실험에 공통적으로 표지 리간드로서 [¹²⁵I]Tyr¹¹-Somatostatin14(Tyr11-SRIF14)를, 비표지 리간드로서 Somatostatin-14(SRIF14)를, 버퍼로서 5 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 0.1% BSA를 포함한 25 mM HEPES, pH 7.4를 사용하였다. 시험 물질은 0.01 nM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM 또는 1000 nM의 농도로 사용하고 막 표품과 혼합하여 반응액으로 하였다. 또한 반응액에 첨가한 표지 리간드 및 비표지 리간드의 농도를 표 2에 나타낸다. 반응액의 인큐베이션 조건은 SSTR2에서는 25℃에서 4시간, SSTR1, SSTR3, SSTR4, SSTR5에서는 25℃에서 2시간으로 하였다. 실험 회마다 양성 대조로서 SRIF14를 사용하였다. 데이터 해석은 MathIQ^TM(ID Business Solutions사, UK)를 사용하여 비선형성 최소 제곱법으로 결합 저해율의 수치 데이터를 기초로 50% 저해 농도(IC₅₀ 값)를 구하였다. 결합 저해 상수(Ki 값)는 Cheng, Y 등의 방법(Biochem Pharmacol, 22, 3099-3108, 1973)에 의해 산출하였다.

결합 실험을 실시한 화합물 및 결합 실험의 결과를 표 3A에 나타낸다. 또한 대조 화합물로서 옥트레오티드, SRIF14 및 SRIF28을 동일하게 평가하였다. 또한 옥트레오티드에 대해서는 최고 농도를 100 nM로 했기 때문에 SSTR1 및 SSTR4에 있어서 IC₅₀ 값을 산출할 수 없어 >100 nM으로 표기하였다.

또한 도 1a 및 도 1b는 표 3A 중의 화합물명에 대응하는 당쇄 부가 펩티드(당쇄 부가체)의 구조의 일례를 나타낸다.

[표 3A]

대조로 한 옥트레오티드는 SSTR2, SSTR3, SSTR5의 각 수용체에, 또한 SRIF14 및 SRIF28은 모든 SSTR에 결합하였다. 표 3A에 나타내는 바와 같이 본 발명에 따른 화합물은 모든 SSTR에 강력하게 결합하였다. 양성 대조의 SRIF14의 SSTR1에 대한 결합 친화성이 Ki 값으로 0.362 nM이고, 당쇄를 1개 갖는 화합물이 0.704~26.7 nM였던 것에 대해서, 본 발명의 당쇄를 2개 갖는 화합물(실시예 20~23 및 28의 화합물)은 0.712~147 nM로 동일하게 우수한 결합 친화성을 나타내었다. 또한 본 발명의 당쇄를 3개 갖는 화합물(실시예 24, 25 및 29의 화합물)도 3.49 nM, 16.9 nM 및 57.3 nM를 나타내어 우수한 결합 친화성을 가지고 있었다. 또한 그 혈중 반감기의 연장에 의한 생물학적 이용능(bioavailability：BA)도 대폭 증대되기 때문에 결합 친화성의 Ki 값이 다소 높은 경우라도 생체 내에 있어서 수용체에 대해서 유효하게 작용할 수 있다. 동일하게 SRIF14의 SSTR2, SSTR3 및 SSTR4에 대한 결합 친화성이 Ki 값으로 각각 0.00755 nM, 0.0450 nM, 0.273 nM였던 것에 대해서, 본 발명의 당쇄를 2개 이상 갖는 화합물은 각각 0.0336~3.33 nM, 0.0604~3.77 nM, 0.702~40.5 nM로 모두 우수한 결합 친화성을 나타내었다. 또한 SRIF14의 SSTR5에 대한 결합 친화성이 0.326 nM였던 것에 대해서 본 발명의 당쇄를 2개 이상 갖는 화합물은 8.33 nM까지의 높은 결합 친화성을 나타내었다.

이와 같이 실시예 20~23 및 28은 SSTR1~SSTR5의 모든 수용체에 대한 친화성을 갖는 당쇄 2개 수식체이고, 실시예 24, 25 및 29는 SSTR1~SSTR5의 모든 수용체에 대한 친화성을 갖는 당쇄 3개 수식체인 것을 알 수 있었다.

실시예 69-2 수용체 결합 친화성의 산출-2

표 3B에 나타내는 각 화합물에 대해서 실시예 69-1에 기재된 방법으로 경합적 결합 실험을 행하여 수용체 결합 친화성을 산출하였다. 또한 대조 화합물로서 SRIF14 및 SRIF28을 동일하게 평가하였다. 결합 실험의 결과를 표 3B에 나타낸다.

또한 도 1c 및 도 1d는 표 3B 중의 화합물명에 대응하는 당쇄 부가 펩티드의 구조의 일례를 나타낸다.

[표 3B]

표 3B에 나타내는 바와 같이 대조가 되는 SRIF14 및 SRIF28은 SSTR1~SSTR5의 모든 수용체에 결합하였다. 여기서 실시예 69-1과 시험 실시 횟수 등은 상이하기 때문에 SRIF14의 각 수용체에 대한 Ki 값은 상이하고 2.5~13.2배의 높은 수치가 되어 있다. 실시예 1, 7, 8, 9, 26, 27, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 및 68의 화합물은 SSTR1에 대한 Ki 값은 1.46~100 nM, 동일하게 SSTR2에서 0.0536~6.58 nM, SSTR3에서 0.160~13.8 nM, SSTR4에서 1.39~172 nM, SSTR5에서 0.310~95.0 nM로 모든 수용체에 대해서 높은 결합 친화성을 나타내었다. 실시예 12의 화합물은 SSTR2 및 SSTR5에 대한 Ki 값이 SRIF14의 280~1600배였지만, SSTR1, SSTR3 및 SSTR4에 대해서는 17.9, 7.44, 24.1 nM의 Ki 값으로 결합 친화성을 보유하고 있는 것으로 생각되었다. 실시예 40의 화합물은 SSTR1, SSTR2, SSTR3에 대한 Ki 값이 SRIF14의 310~5300배로 현저하게 친화성이 저하되어 있었지만, SSTR4 및 SSTR5에 대해서는 110, 33.0 nM의 Ki 값으로 결합 친화성을 보유하고 있는 것으로 생각되었다. 실시예 51의 화합물은 SSTR2 및 SSTR4에 대한 Ki 값이 SRIF14의 170배 및 46배 이상이었지만, SSTR1, SSTR3, SSTR5에 대해서는 각각 270 nM, 14.0 nM, 23.0 nM의 Ki 값으로 결합 친화성을 보유하고 있는 것으로 생각되었다.

실시예 69-3 수용체 발현세포를 사용한 아고니스트 활성 평가-1

소마토스타틴 수용체는 G단백질 공액 수용체(GPCR)이다. SSTR1~SSTR5는 모두 G단백질의 서브패밀리인 Gi/Go를 매개로 아데닐시클라아제 활성을 억제하여 세포 내 cAMP 농도를 저하시킨다. 본 실험계에서는 각 소마토스타틴 수용체 발현세포를 사용하여 시험 물질의 cAMP 생산 억제 작용의 IC₅₀ 값을 산출하고 아고니스트 활성을 평가하였다. 또한 대조 화합물로서 SRIF14, SRIF28을 동일하게 평가하였다.

본 실험에 사용한 시약과 그의 정식 화학명은 아래와 같다. DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine), HBSS(Hank's Buffered Salt Solution).

SSTR2~SSTR5에 대한 평가는 아래의 조건에서 실험을 행하였다. 버퍼로서 0.3% BSA, 0.5 mM IBMX를 포함한 DMEM을 사용하여 표 3C에 나타내는 수용체 발현세포를 10⁴ cells/well로 파종하였다. 시험 물질은 0.00001 nM, 0.0001 nM, 0.001 nM, 0.01 nM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM 또는 1000 nM의 농도로 10 μM forskolin과 혼합하여 처치하고 실온에서 30분 반응시켰다. 반응 후 0.2 N HCl로 세포를 용해하고 세포 내에 축적된 cAMP량을 케이먼사 cyclic AMP EIA kit(Cayman, 582002)를 사용하여 측정하였다.

SSTR1에 대한 평가는 세레프사에 위탁하여 실험을 행하였다. 버퍼로서 20 mM HEPES(pH 7.4), 500 μM IBMX를 포함한 HBSS를 사용하여 SSTR1 수용체 발현세포를 10⁴ cells/well로 파종하였다. 시험 물질은 0.001 nM, 0.01 nM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM 또는 100 nM의 농도로 1 μM NKH477과 혼합하여 처치하고 37℃에서 20분 반응시켰다. 반응 후 세포 내에 축적된 cAMP량을 시스바이오사 cAMP dynamic2 kit(cisbio, 62AM4PE)를 사용하여 측정하였다.

[표 3C]

당쇄 부가체로서 실시예 1, 18, 27, 28, 59 및 60의 화합물을 사용했을 때의 아고니스트 활성 평가시험의 실험결과(IC₅₀(nM))를 표 3D 및 도 1e에 나타낸다. 대조 화합물의 SRIF14 및 SRIF28의 IC₅₀은 SSTR1에 대해서 0.83~0.89 nM, 또한 SSTR2, SSTR3, SSTR4, SSTR5에 대해서 각각 0.0076~0.073 nM, 0.029~0.21 nM, 0.015~0.074 nM, 0.066~0.12 nM였다. 당쇄 부가체인 화합물의 SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4, SSTR5에 대한 아고니스트 활성의 IC₅₀은 1.0~2.4 nM, 0.041~0.10 nM, 0.12~0.30 nM, 0.039~0.085 nM, 0.043~0.081 nM으로 SSTR1~SSTR5의 모든 수용체에 대해서 우수한 아고니스트 활성을 나타내었다. 실시예 69-1 및 실시예 69-2에 나타낸 결과로부터 이들 화합물은 수용체 결합능을 가지고 있는 것이 명확하고, 이들 화합물은 수용체에 결합함으로써 아고니스트 활성을 발휘하는 것이 명확해졌다.

[표 3D]

실시예 69-4 수용체 발현세포를 사용한 아고니스트 활성 평가-2

당쇄 부가체로서 표 3E에 기재된 각 화합물을 사용해서 실시예 69-3과 동일하게 하여 아고니스트 활성 평가시험을 실시하였다. 실험결과를 표 3E에 나타낸다. 또한 표 3E 중 「-(하이픈)」이 기재되어 있는 칸은 미실시인 것을 나타낸다.

[표 3E]

표 3E에 있어서 당쇄 부가체인 화합물의 SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4, SSTR5에 대한 아고니스트 활성의 IC₅₀은 각각 1.2~22 nM, 0.019~1.4 nM, 0.039~3.8 nM, 0.033~1.6 nM, 0.031~1.1 nM로 SSTR1~SSTR5의 수용체에 대해서 아고니스트 활성을 나타내었다. 실시예 69-1 및 실시예 69-2에 나타낸 결과로부터 이들 화합물은 수용체 결합 친화성을 가지고 있어 이들 화합물은 수용체에 결합함으로써 아고니스트 활성을 발휘하는 것이 명확해졌다.

실시예 70 랫트를 사용한 약물동태시험 1

본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드(당쇄 부가체)가 비당쇄 부가의 SRIF28과 비교하여 약물 혈장 중 농도-시간 곡선하 면적(AUC), 혈중 반감기(t₁ _/2), 평균 체류시간(MRT) 및 생물학적 이용능 등 약물동태 프로파일이 개선되어 있는 것을 확인하기 위해서 랫트를 사용하여 정맥 내 투여 및 피하 투여에 의한 약물동태 해석을 행하였다.

70-1 투여액 및 시약의 조제

당쇄 부가체(S1C(disialo)-SRIF28)를 일본 약국방 생리식염액(오츠카 제약 공장사 제조)에 용해하여 40 μM 용액을 조제하고 투여액으로 하였다. PBS 용액은 Phosphate buffered saline(시그마사 제조 P4417) 1정을 초순수 200 mL에 용해하여 조제하였다. EDTA-PBS는 EDTA-2Na(와코 순약 공업사 제조)를 2 ㎎/mL가 되도록 PBS로 용해하여 조제하였다. 아프로티닌 함유 EDTA-PBS액은 아프로티닌(와코 순약 공업사 제조 010-11834)을 0.142 ㎎/mL가 되도록 EDTA-PBS로 용해하여 조제하고 채취 혈액에 대한 항응고제로서 사용하였다.

70-2 혈장 샘플의 조제

수컷인 SD계 랫트(Crl:CD(SD), 일본 찰스리버 주식회사, 6주령, n=3, 체중 161.3~239.3 g)의 꼬리 정맥 또는 배부(背部) 피하에 상기 70-1에서 조제한 투여액을 비절식하 1 mL/㎏의 용량으로 주사통 및 26G 주사침(모두 테루모사 제조)을 사용하여 투여하였다(S1C(disialo)-SRIF28로서 40 nmol/㎏). 투여 전, 투여 후 2분, 5분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간 후에 랫트 경부 정맥(rat cervical vein)으로부터 채혈을 행하였다. 채취한 혈액 0.2 mL를 상기 70-1에서 조제한 아프로티닌 함유 EDTA-PBS액 0.2 mL와 신속하게 혼합하고 빙상에서 30분 이상 방치하였다. 원심분리(1,870×g, 4℃, 10분) 후 상청을 250 μL 채취하여 혈장 샘플로 하였다. 블랭크 혈장으로서 무처치의 랫트 경부 정맥으로부터 채취한 혈액을 동일하게 처리하여 얻은 혈장을 사용하였다. 혈장 샘플은 측정에 사용하기까지 냉동보존하였다. 또한 팁 및 튜브는 비엠 기기사의 저흡착성의 것을 사용하였다.

70-3 혈장 중 농도 측정

상기 70-2에서 얻어진 혈장 샘플에 있어서의 S1C(disialo)-SRIF28의 혈장 중 농도 측정을 피닉스 파마슈티컬즈사 소마토스타틴 EIA 키트(Phoenix Pharmaceuticals Inc, EK-060-03)를 사용하여 행하였다. 혈장 샘플을 EIA 키트 부속 어세이 버퍼를 사용해서 5배, 20배, 100배, 400배, 1600배로 희석하여 측정 샘플로 하였다. 검량선을 작성하기 위한 표준액은 아래와 같이 조제하였다. 먼저 상기 70-2에서 얻어진 블랭크 혈장을 EIA 키트 부속 어세이 버퍼를 사용하여 혈장 샘플과 동일하게 희석하고 표준액 조제용 어세이 버퍼로 하였다(예를 들면 혈장 샘플을 100배 희석하는 경우는 EIA 키트 부속 어세이 버퍼에 1/100 양의 블랭크 혈장을 첨가하여 표준액 조제용 어세이 버퍼로 하였다). S1C(disialo)-SRIF28을 PBS 용액으로 희석하여 100 μM 용액을 조제하고 100 μM 용액으로부터 2μM 용액을 조제하였다. 얻어진 2μM S1C(disialo)-SRIF28 용액을 표준액 조제용 어세이 버퍼를 사용하여 단계 희석하고 20 nM, 10 nM, 2 nM, 0.4 nM, 0.08 nM, 0.04 nM의 표준액을 조제하였다. 얻어진 결과에 희석률을 곱하고 추가로 항응고제 처리로서의 아프로티닌 함유 EDTA-PBS액에서의 희석률 2를 곱함으로써 혈장 중 농도를 산출하였다. 대조로서 당쇄 부가체 대신에 비당쇄 부가 SRIF28을 사용하여 동일한 조작을 행하였다. 얻어진 혈장 중의 S1C(disialo)-SRIF28 농도 추이를 도 2에 나타낸다.

70-4 약물 속도론적 파라미터의 산출

얻어진 S1C(disialo)-SRIF28 농도 추이로부터 모멘트 해석 수법을 사용하여 AUC를 사다리꼴 법칙에 의해 산출하였다. 또한 외삽법에 의해 정맥 내 투여시의 예측 초기 농도(C₀), 또한 t₁ _/2, MRT 및 피하 투여시의 실측값으로부터 최고 혈장 중 농도(C_max)를 구하였다. 얻어진 약물 속도론적 파라미터를 표 4에 나타낸다.

도 2 및 표 4에 나타낸 결과로부터 판명되는 바와 같이 S1C(disialo)-SRIF28은 비당쇄 부가 SRIF28과 비교하여 t₁ _/2 및 MRT가 현저하게 연장되고 또한 AUC 및 C_max의 증가가 확인되었다. 이들 사실은 당쇄 부가체로 함으로써 혈액 중의 분해활성에 대해서 저항성이 증가했기 때문으로 생각된다. 당쇄 부가체는 비당쇄 부가체에 비해 생체 중에서의 안정성이 향상되는 것이 명확하다. 또한 AUC 및 C_max가 증가한 것의 요인은 본 발명에 따른 생물학적 이용능의 향상 외에 이들 생체 중에서의 안정성 향상도 한 요인으로 생각된다.

실시예 71 랫트를 사용한 약물동태시험 2

당쇄 부가체로서 S1C(disialo)-SRIF28, N5C(disialo)-SRIF28 및 S1C(disialo)·N5C(disialo)-SRIF28을 사용한 것 이외는 실시예 70과 동일하게 하여 약물동태시험을 실시하였다. 대조로서 당쇄 부가체 대신에 비당쇄 부가 SRIF28을 사용하였다. 얻어진 혈장 중의 화합물 농도 추이를 도 3에 나타낸다.

실시예 72 랫트를 사용한 약물동태시험 3

당쇄 부가체로서 S1C(disialo)-SRIF28, S1C(disialo)·R13C(disialo)-SRIF28 및 S1C(disialo)·N5C(disialo)·A9C(disialo)-SRIF28을 사용한 것 이외는 실시예 70과 동일하게 하여 약물동태시험을 실시하였다. 대조로서 당쇄 부가체 대신에 비당쇄 부가 SRIF28을 사용하였다. 얻어진 혈장 중의 화합물 농도 추이를 도 4에 나타낸다.

실시예 73 랫트를 사용한 약물동태시험 4

당쇄 부가체로서 S1C(disialo)-SRIF28, S1C(disialo)·N5C(disialo)·A9C(disialo)-SRIF28, S1-3C(disialo)-SRIF28, S1-5C(disialo)-SRIF28 및 S1-10C(disialo)-SRIF28을 사용한 것 이외는 실시예 70과 동일하게 하여 약물동태시험을 실시하였다. 얻어진 혈장 중의 화합물 농도 추이를 도 5에 나타낸다.

실시예 74 랫트를 사용한 약물동태시험 5

당쇄 부가체로서 S1C(disialo)-SRIF28, N5C(disialo)-SRIF28, A9C(disialo)-SRIF28, S1C(disialo)·N5C(disialo)-SRIF28, N5C(disialo)·A9C(disialo)-SRIF28 및 S1C(disialo)·N5C(disialo)·A9C(disialo)-SRIF28을 사용한 것 이외는 실시예 70과 동일하게 하여 약물동태시험을 실시하였다. 얻어진 혈장 중의 화합물 농도 추이를 도 6에 나타낸다.

실시예 75 랫트를 사용한 약물동태시험 6

당쇄 부가체로서 S1C(disialo)-SRIF28, S1-2C(disialo)-SRIF28 및 S1-3C(disialo)-SRIF28을 사용한 것 이외는 실시예 70과 동일하게 하여 약물동태시험을 실시하였다. 얻어진 혈장 중의 화합물 농도 추이를 도 7에 나타낸다.

실시예 71~75의 약물동태시험에 있어서 얻어진 혈장 중의 화합물 농도 추이로부터 실시예 70과 동일하게 각 화합물의 약물 속도론적 파라미터를 산출하였다. 또한 얻어진 파라미터를 사용하여 생물학적 이용능을 아래의 수학식에 의해 산출하였다. 결과를 표 5A에 나타낸다.

AUC₍ _sc ₎：피하 투여시의 AUC(min·nM)

Dose₍ _sc ₎：피하 투여에 있어서의 투여량(nmol/㎏)

AUC₍ _iv ₎：정맥 내 투여시의 AUC(min·nM)

Dose₍ _iv ₎：정맥 내 투여에 있어서의 투여량(nmol/㎏)

[표 5A]

표 5A에 나타낸 결과로부터 판명되는 바와 같이 본 발명의 당쇄 부가체는 수식 당쇄의 개수가 증가함에 따라서 그 생물학적 이용능이 증가하였다. 즉 비당쇄 부가체에서 5%였던 것이 당쇄를 1개 부가한 당쇄 부가 폴리펩티드에서는 37~60%, 평균 50% 증가하고 있었다. 이에 대해서 2개의 당쇄를 간격 있음으로 부가한 것에서는 77~85%, 평균 81%로, 3개의 당쇄를 간격 있음으로 부가한 것에서는 91%로 증가하고 있는 것이 판명되었다. 또한 당쇄를 부가한 간격이 빽빽한 것을 비교하면 1개 부가한 것에서는 37%의 증가인 것에 대해서, 2개 부가한 것에서는 55%, 3개 부가한 것에서는 69%, 5개 부가한 것에서는 92%로 증가하고 있는 것이 판명되었다(실시예 1, 20, 24 및 34의 화합물). 또한 10개 당쇄를 부가한 것에 대해서는 도 5에 나타내는 바와 같이 측정시간 내에 있어서 혈장 중 농도의 상승을 유지하고 있었기 때문에 AUC를 측정할 수 없고 그 결과 생물학적 이용능을 산출할 수 없었다. 이들 결과에 의해 본 발명에 따른 당쇄 수식에 의해 생물학적 이용능이 당쇄가 부가되어 있지 않은 소마토스타틴에 대해 현저하게 향상되는 것이 증명되고, 또한 당쇄가 1개 부가된 것보다도 2개 이상 부가함으로써 더욱 향상된 생물학적 이용능을 얻을 수 있었다.

피하 투여시의 생물학적 이용능이 증가하는 요인에는 여러 가지 약물동태학적인 변동인자가 존재한다. 그 중 한 요인으로서 화합물의 혈중 안정성 또는 혈중으로의(투여 부위로부터의) 이행성이 생각된다. 표 5A에 나타낸 바와 같이 피하 투여시의 혈중 이행성을 추찰하기 위한 지표가 되는 피하 투여시의 AUC는 수식 당쇄 개수의 증가에 수반하여 증대되는(1개：2209 min·nM, 2개(간격 있음)：3400 min·nM, 3개(간격 있음)：4015 min·nM) 것이 확인되어 혈중 이행성의 향상이 생물학적 이용능의 증가에 기여하고 있는 것이 추찰되었다.

또한 수식 당쇄의 개수가 증가함에 따라 정맥 내 및 피하 투여시의 t₁ _/2 및 MRT의 연장 작용(예를 들면 정맥 내 투여시의 t₁ _/2, 1개：19.0 min, 2개(간격 있음)：27.2 min, 3개(간격 있음)：39.8 min)이 확인되어 혈액 중에서의 안정성이 향상되고 있는 것이 추찰되었다. 한편 정맥 내 투여시의 AUC는 수식 당쇄 개수에 비례한 증대로는 되어 있지 않아(1개：4453 min·nM, 2개(간격 있음)：4198 min·nM, 3개(간격 있음)：4402 min·nM), 화합물의 수식 당쇄 개수 증가에 의한 혈중 안정성 증가만이 생물학적 이용능의 증가에 공헌하고 있는 것은 아니라고 생각된다.

피하 투여시의 C_max는 비당쇄 부가체에 비해 수식 당쇄 개수가 2개까지는 증가하였지만(0개：4.47 nM, 1개：30.5 nM, 2개(간격 있음)：35.6 nM), 3개(간격 있음)(24.8 nM)에서는 반대로 감소하는 결과가 되었다. 투여 부위(본 실시예에서는 피하 투여)로부터의 혈중 이행을 생각한 경우 AUC가 증가하는 요인으로서 신속한 혈액 중으로의 이행 또는 완만하지만 지속적인 혈액 중으로의 이행의 두 가지의 양식이 추측된다. 전자는 투여 부위에서의 분해를 피하는 메리트가 있지만 안정성에 문제가 없다면 후자의 양식이 혈중 이행성이 보다 높다고 추찰된다. 생물학적 이용능이 높은 당쇄를 3개 수식한 것에 있어서 C_max가 감소하고 있었던 것은 급격하지 않고 완만하며 또한 지속적인 혈중 이행성을 나타낸 결과라고 생각된다. 이들 사실로부터 본 발명에 관한 수식 당쇄 개수의 증가는 급격한 혈장 중 농도의 상승이 없고 지속적인 혈중 이행성(일반적으로는 흡수 지연 효과라고 말해도 된다)을 나타낸다고 생각된다.

표 5A에 나타낸 결과로부터 판명되는 바와 같이 수식 위치로서 간격을 둔 경우와 빽빽하게 한 경우에서는 t₁ _/2 및 MRT에 저명한 차는 없었다(예를 들면 정맥 내 투여시의 t₁ _/2, 2개(빽빽함)：28.8 min, 2개(간격 있음)：27.2 min, 3개(빽빽함)：38.5 min, 3개(간격 있음)：39.8 min).

또한 AUC에 관해서는 정맥 내 투여시에는 당쇄 수식이 빽빽한 편이 AUC가 증대되었다. 즉 2개 당쇄의 경우 간격을 둔 화합물 21, 화합물 22, 화합물 23의 4029~4465 min·nM에 비해서 빽빽하게 한 화합물 20은 7306 min·nM이고, 3개 당쇄의 경우 간격을 둔 화합물 25의 4402 min·nM에 비해서 빽빽하게 한 화합물 24는 5660 min·nM이다.

한편 생물학적 이용능은 당쇄 수식 위치에 간격을 둔 편이 빽빽한 편에 비해 향상되었다. 즉 2개 당쇄의 경우 빽빽하게 한 화합물 20의 55%에 비해 간격을 둔 화합물 21, 화합물 22, 화합물 23은 77~85%(평균값 81%)이고, 3개 당쇄의 경우 빽빽하게 한 화합물 24의 69%에 비해 간격을 둔 화합물 25는 91%이다. 이들 사실로부터 본 발명에 관한 당쇄 수식하는 위치로서는 빽빽하게 복수 수식하는 것보다도 간격을 두고 복수 수식하는 편이 생물학적 이용능의 향상에 기여하는 것으로 생각된다.

실시예 76 랫트를 사용한 약물동태시험 7

당쇄 부가체로서 S1C(disialo)-SRIF28, S1C(disialo(amide))-SRIF28, S1C(disialo(aminoethylamide))-SRIF28을 사용한 것 이외는 실시예 70과 동일하게 하여 약물동태시험을 실시하였다. 얻어진 혈장 중의 화합물 농도 추이를 도 8에 나타낸다.

실시예 77 랫트를 사용한 약물동태시험 8

당쇄 부가체로서 S1C(disialo)-SRIF28, S1C(disialo(Bn))-SRIF28, S1C(disialo)-D-Trp22-SRIF28을 사용한 것 이외는 실시예 70과 동일하게 하여 약물동태시험을 실시하였다. 얻어진 혈장 중의 화합물 농도 추이를 도 9에 나타낸다.

실시예 78 랫트를 사용한 약물동태시험 9

당쇄 부가체로서 S1C(disialo)-SRIF28, R13C(disialo)-SRIF28, K14C(disialo)-SRIF28을 사용한 것 이외는 실시예 70과 동일하게 하여 약물동태시험을 실시하였다. 얻어진 혈장 중의 화합물 농도 추이를 도 10에 나타낸다.

실시예 79 랫트를 사용한 약물동태시험 10

당쇄 부가체로서 S1C(disialo)-SRIF28, E12C(disialo)-SRIF28, N19C(disialo)-SRIF28, 29C(disialo)-SRIF28, S1C(monosialo)-SRIF28, S1C(asialo)-SRIF28을 사용한 것 이외는 실시예 70과 동일하게 하여 약물동태시험을 실시하였다. 얻어진 혈장 중의 화합물 농도 추이를 도 11에 나타낸다.

실시예 80 랫트를 사용한 약물동태시험 11

당쇄 부가체로서 S1C(disialo)-SRIF28, K14C(disialo)-SRIF28, C(disialo)-SRIF14를 사용한 것 이외는 실시예 70과 동일하게 하여 약물동태시험을 실시하였다. 얻어진 혈장 중의 화합물 농도 추이를 도 12에 나타낸다.

실시예 81 랫트를 사용한 약물동태시험 12

당쇄 부가체로서 C(disialo)-SRIF14, C(disialo)-C12linker-SRIF14, C(disialo)-PEGlinker-SRIF14를 사용한 것 이외는 실시예 70과 동일하게 하여 약물동태시험을 실시하였다. 얻어진 혈장 중의 화합물 농도 추이를 도 13에 나타낸다.

실시예 82 랫트를 사용한 약물동태시험 13

당쇄 부가체로서 SRIF28, S1C(disialo)-SRIF28, S1C(asialo)-SRIF28, S1C(diGlcNAc)-SRIF28, S1C(diMan)-SRIF28, S1C(GlcNAc)-SRIF28을 사용한 것 이외는 실시예 70과 동일하게 하여 약물동태시험을 실시하였다. 얻어진 혈장 중의 화합물 농도 추이를 도 14에 나타낸다.

실시예 83 랫트를 사용한 약물동태시험 14

당쇄 부가체로서 S1C(disialo)-SRIF28, S1C(tetrasialo)-SRIF28, S1C(trisialo)-SRIF28, S1C(Asn(disialo))-SRIF28, S1-2C(disialo)-SRIF28을 사용한 것 이외는 실시예 70과 동일하게 하여 약물동태시험을 실시하였다. 얻어진 혈장 중의 화합물 농도 추이를 도 15에 나타낸다.

실시예 84 랫트를 사용한 약물동태시험 15

당쇄 부가체로서 SRIF28, S1C(disialo)-SRIF28, S1-2C(disialo)-SRIF28, S1-3C(disialo)-SRIF28, S1-4C(disialo)-SRIF28을 사용한 것 이외는 실시예 70과 동일하게 하여 약물동태시험을 실시하였다. 얻어진 혈장 중의 화합물 농도 추이를 도 16에 나타낸다.

실시예 85 랫트를 사용한 약물동태시험 16

당쇄 부가체로서 SRIF14, C(disialo)-SRIF14, C(disialo)-K-SRIF14, C(disialo)-R-K-SRIF14, 2C(disialo)-R-K-SRIF14, 3C(disialo)-R-K-SRIF14를 사용한 것 이외는 실시예 70과 동일하게 하여 약물동태시험을 실시하였다. 얻어진 혈장 중의 화합물 농도 추이를 도 17에 나타낸다.

실시예 86 랫트를 사용한 약물동태시험 17

당쇄 부가체로서 S1C(asialo)-SRIF28, S1-2C(asialo)-SRIF28, S1-3C(asialo)-SRIF28을 사용한 것 이외는 실시예 70과 동일하게 하여 약물동태시험을 실시하였다. 얻어진 혈장 중의 화합물 농도 추이를 도 18에 나타낸다.

실시예 87 랫트를 사용한 약물동태시험 18

당쇄 부가체로서 S1C(disialo)-SRIF28, S1-2C(disialo)-SRIF28, S1-2C(asialo)-SRIF28, C(disialo(aminoethylamide)·S1C(disialo)-SRIF28, S1-2C(disialo(Bn))-SRIF28, S1-2C(disialo(amide))-SRIF28을 사용한 것 이외는 실시예 70과 동일하게 하여 약물동태시험을 실시하였다. 얻어진 혈장 중의 화합물 농도 추이를 도 19에 나타낸다.

실시예 76~87의 약물동태시험 7~18에 있어서 얻어진 혈장 중의 화합물 농도 추이로부터 실시예 70과 동일하게 하여 각 화합물의 약물 속도론적 파라미터를 산출하였다. 얻어진 약물 속도론적 파라미터를 표 5B~표 5F에 나타낸다.

[표 5B]

표 5B에 나타낸 결과로부터 판명되는 바와 같이 S1C(disialo)-SRIF28, E12C(disialo)-SRIF28, R13C(disialo)-SRIF28, K14C(disialo)-SRIF28, N19C(disialo)-SRIF28, 29C(disialo)-SRIF28, S1C(disialo)-D-Trp22-SRIF28은 정맥 내 투여에 있어서 비당쇄 부가체의 SRIF28과 비교하여 t₁ _/2이 13~18배 연장되고 AUC는 8~23배 증가하였다. 또한 비당쇄 부가체의 SRIF14와 비교하여 C(disialo)-SRIF14, C(disialo)-K-SRIF14, C(disialo)-R-K-SRIF14는 정맥 내 투여에 있어서 t₁ _/2이 33~38배 연장되고 AUC는 44~55배 증가하였다. 또한 C(disialo)-C12linker-SRIF14, C(disialo)-PEGlinker-SRIF14는 비당쇄 부가체의 SRIF14와 비교하여 t₁ _/2이 22~33배 연장되고 AUC는 14~30배 증가하였다. 즉 실시예 70의 경우와 동일하게 당쇄 수식을 행함으로써 혈액 중에서의 안정성이 향상된 결과로 생각되었다.

[표 5C]

표 5C에 나타낸 결과로부터 판명되는 바와 같이 수식하는 당쇄의 크기를 GlcNAc(단당), diMan(5당), diGlcNAc(7당), asialo(9당), monosialo(10당), disialo(11당), trisialo(14당), tetrasialo(17당)로 변경해 간 경우 수식하는 당쇄의 크기 의존적으로 피하 투여시의 t₁ _/2, AUC, 생물학적 이용능이 각각 2~17배, 3~120배, 2~11배 증가하였다. 이것으로부터 수식하는 당쇄의 크기를 변경함으로써 혈중 안정성을 향상시킬 뿐 아니라 그 증가율에 변화를 부여할 수 있는 것이 명확해졌다. 또한 이들 당쇄 중 디만노오스 당쇄나 아시알로 당쇄 등은 특정 단백질과 상호작용하는 것이 알려져 있기 때문에 특정 단백질 또는 특정 단백질을 갖는 장기나 세포로의 타기팅(targeting)에도 이용 가능하다고 생각된다. 또한 비환원 말단의 시알산의 수식으로서 예를 들면 카르복시기로의 aminoethylamide, amide, Bn 등의 도입에 의해 전하를 변경시킨 당쇄를 부가한 S1C(disialo(aminoethylamide))-SRIF28, S1C(disialo(amide))-SRIF28, S1C(disialo(Bn))-SRIF28은 정맥 내 투여에 있어서 비당쇄 부가체와 비교하여 t₁ _/2이 11~14배 연장되고 AUC는 7~12배 증가하여 혈중 안정성이 향상되었다. 이들 사실은 시알산의 카르복시기가 혈중 체류성에 큰 영향을 미쳐 카르복시기의 음전하의 소실(disialo(Bn), disialo(amide)) 또는 양전하로의 변환(disialo(aminoethylamide))에 의해 혈중 클리어런스나 체내 분포를 제어할 수 있는 가능성(이용법)을 나타내고 있다.

[표 5D]

표 5D에 나타낸 결과로부터 판명되는 바와 같이 SRIF14에 disialo 당쇄를 1개 수식한 C(disialo)-R-K-SRIF14, 2개 수식한 2C(disialo)-R-K-SRIF14, 3개 수식한 3C(disialo)-R-K-SRIF14는 정맥 내 투여에 있어서 비당쇄 부가체와 비교하여 t₁ _/2이 각각 38, 63, 71배 연장되고 또한 AUC는 각각 55, 42, 36배 증가하였다. 동일하게 SRIF28에 disialo 당쇄를 1개 수식한 S1C(disialo)-SRIF28, 2개 수식한 S1-2C(disialo)-SRIF28, 3개 수식한 S1-3C(disialo)-SRIF28, 4개 수식한 S1-4C(disialo)-SRIF28은 정맥 내 투여에 있어서 비당쇄 부가체와 비교하여 t₁ _/2이 각각 13, 21, 30, 48배 연장되고 또한 AUC는 각각 11, 12, 12, 15배 증가하였다. SRIF14 및 SRIF28 어느 경우에 있어서도 수식하는 disialo 당쇄의 개수에 따라 혈중 안정성이 향상되는 것이 명확해졌다.

[표 5E]

표 5E에 나타낸 결과로부터 판명되는 바와 같이 SRIF28에 asialo 당쇄를 1개 수식한 S1C(asialo)-SRIF28, 2개 수식한 S1-2C(asialo)-SRIF28, 3개 수식한 S1-3C(asialo)-SRIF28은 정맥 내 투여에 있어서 비당쇄 부가체와 비교하여 t₁ _/2이 각각 10, 6, 5배 연장되고 또한 AUC는 각각 10, 6, 6배 증가하였다. 수식하는 당쇄가 asialo 당쇄인 경우에 있어서도 혈중 안정성이 향상되는 것이 명확해졌다.

[표 5F]

표 5F에 나타낸 결과로부터 판명되는 바와 같이 S1-2C(disialo)-SRIF28, S1-2C(asialo)-SRIF28, C(disialo(aminoethylamide))·S1C(disialo)-SRIF28, S1-2C(disialo(Bn))-SRIF28, S1-2C(disialo(amide))-SRIF28은 정맥 내 투여에 있어서 비당쇄 부가체와 비교하여 t₁ _/2이 각각 6~21배 연장되고 AUC는 각각 6~12배 증가하였다. 즉 SRIF28에 당쇄를 수식함으로써 혈중 안정성이 향상되었다. 또한 시알산 당쇄 개수의 증가에 따라 정맥 내 투여 및 피하 투여 모두 t₁ _/2, AUC, C_max, BA가 증가하였다. 한편 시알산의 카르복시기의 음전하를 소실한 경우(2C(disialo(Bn)), 2C(disialo(amide))) 또는 양전하를 인접하게 추가한 경우(C(disialo(aminoethylamide))·S1C(disialo))에는 피하 투여시의 t₁ _/2이 연장되었음에도 불구하고 AUC나 C_max는 증가하지 않았다. 시알산의 카르복시기가 혈중 체류성 또는 혈중 이행에 큰 영향을 미치는 것으로부터 당쇄 말단의 전하로의 변환에 의해 혈중 클리어런스나 체내 분포를 제어할 수 있는 가능성(이용법)을 나타내고 있다.

실시예 88 랫트 혈장을 사용한 혈장 중 안정성시험

88-1 처치액, 시약 및 랫트 혈장의 조제

당쇄 부가체 및 비당쇄 부가 SRIF28을 PBS 용액에 용해하여 2 μM 용액을 조제하고 처치액으로 하였다. 10% TFA는 트리플루오로초산(와코 순약 공업사 제조 208-02746)을 10 v/v%가 되도록 물로 용해하여 조제하였다. 랫트 혈장은 Wistar계 랫트(Crlj:Wistar, 수컷, 일본 찰스리버 주식회사, 7주령)로부터 헤파린 첨가 혈장(헤파린：일본 약국방 헤파린나트륨 주사액(모치다 제약))으로서 조제하였다.

88-2 혈장 첨가 샘플의 조제

랫트 혈장 0.27 mL(n=3)에 대해서 상기 88-1에서 조제한 당쇄 부가체 처치액 0.03 mL를 신속하게 혼합하여 혈장 첨가 샘플로 하고 37℃ 항온조에서 보온하였다. 혼합 후 0분과 1~24시간까지 시간 경과에 따라 혈장 첨가 샘플 0.04 mL를 채취하고 10% TFA 0.01 mL와 신속하게 혼합하였다. 원심분리(20,000×g, 4℃, 10분) 후 상청을 0.04 mL 채취하여 혈장 중 안정성 측정 샘플로 하였다. 샘플링 시간은 0시간, 1시간, 2시간, 4시간, 또는 0시간, 4시간, 8시간, 24시간으로 하였다. 블랭크 혈장으로서 처치액으로서 PBS 용액을 사용한 것 이외는 동일하게 처리하여 얻은 혈장을 사용하였다. 혈장 샘플은 측정에 사용하기까지 냉동보존하였다. 실험 회마다 양성 대조로서 비당쇄 부가 SRIF28을 사용하였다.

88-3 샘플 중 농도 측정 및 혈장 중 안정성 인덱스의 산출

실시예 70-3의 혈장 중 농도 측정과 동일한 방법으로 상기 88-2에서 얻어진 혈장 중 안정성 측정 샘플 중에 잔존하는 당쇄 부가체의 농도를 측정하였다. 혼합 후 0분의 당쇄 부가체 농도를 100%로 하고, 시간 경과 후의 잔존율을 백분율(%)로 표시하며, 아래의 지수식(1)의 소실속도 상수로부터 산출식(2)를 사용하여 반감기를 산출하였다. 그 후 실험 회마다의 비당쇄 부가 SRIF28의 반감기를 1로 하여 당쇄 부가체의 혈장 중 안정성 인덱스(PS index)를 산출하였다. 결과를 표 6 및 도 20에 나타낸다. 또한 혈장 중 안정성 인덱스가 20 이상인 것에 대해서는 >20으로서 표기하였다. 또한 도 20에서는 혈장 중 안정성 인덱스가 20을 초과하는 것이더라도 20을 상한으로서 표기하고 있다.

도 20에 나타낸 결과로부터 판명되는 바와 같이 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는 SRIF28에 비해 혈장 중 안정성이 증가하였다. 즉 1번 위치, 5번 위치, 9번 위치, 12번 위치에 1개 당쇄를 부가한 것(실시예 1, 2, 3, 4의 화합물)에서는 SRIF28의 4.5배~6.7배이고, 13번 위치에 당쇄를 부가한 것에서 15.9배(실시예 5의 화합물), 14번 위치에 당쇄를 부가한 것에서 19.1배(실시예 6의 화합물), 30번 위치에 당쇄를 부가한 것에서 16.8배(실시예 14의 화합물)였다. 또한 19번 위치, C말단 측에 추가로 당쇄 부가 아미노산을 1개 부가한 것에서는 20배 이상(실시예 10, 13의 화합물)이었다. 당쇄를 부가하는 위치는 1번 위치로부터 C말단 측으로 향함에 따라 혈장 중 안정성이 증가하는 것이 나타내어졌다.

실시예 89 랫트를 사용한 GH 생산 억제시험

본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는 실시예 69에서 나타내는 바와 같이 SSTR의 각 수용체에 대한 친화성을 가지고 있었다. 한편 각 SSTR에 대한 친화성이 감쇠한 것도 보였지만 이러한 경우에 있어서도 실시예 70~88에서 나타낸 혈중 반감기의 연장이나 생물학적 이용능의 증대 등에 의해 생체 내에서 수용체에 대해서 약리학적으로 유효하게 작용을 나타내는 것을 증명하기 위해서 랫트를 사용한 인 비보 시험으로서 성장호르몬(GH) 생산에 대한 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드의 투여 효과를 평가하는 시험을 실시하였다. 혈액 중으로의 GH 생산량의 증가는 GH의 파라크린적 작용(paracrine effect)을 매개로 각종 장기에 대해서 세포의 증식이나 분화계, 생합성계의 활성화 또는 억제를 일으켜 생체반응에 영향을 미치는 것으로 생각된다. 시상하부로부터 방출되는 소마토스타틴은 뇌하수체 전엽으로부터의 혈중으로의 GH 분비를 억제한다. 본 실험계는 혈중 GH 생산량을 지표로 당쇄 부가체의 SSTR에 대한 약리 작용 및 당쇄 부가체의 투여 후의 혈중 잔존을 평가할 수 있는 시험계로서 실시하였다.

89-1 투여액 및 시약의 조제

당쇄 부가체로서 S1C(disialo)-SRIF28, N19C(disialo)-SRIF28, 29C(disialo)-SRIF28, S1C(disialo)·N5C(disialo)-SRIF28 및 S1C(disialo)·N5C(disialo)·A9C(disialo)-SRIF28을 사용하여 일본 약국방 생리식염액(오츠카 제약 공장사 제조)에 용해하여 1~100 μM 용액을 조제하고 투여액으로 하였다. 또한 GH 유리 촉진제로서 GRF(GH 방출 호르몬, Growth hormone releasing factor)를 사용하였다. GRF는 GRF 주사액(주사용 GRF 스미토모 50, Lot. 2006C, 다이닛폰 스미토모 제약사 제조)을 주사용수(Lot. 09H18C, 후소 약품 공업사 제조) 1 mL로 용해 후 2 ㎍/mL가 되도록 생리식염액으로 25배 희석하여 조제하였다. 채혈시에 항응고제로서 사용하는 헤파린은 일본 약국방 헤파린나트륨 주사액(Lot. B084, 모치다 제약사 제조)을 원액 그대로 사용하였다.

89-2 혈장 샘플의 조제

수컷인 SD계 랫트(Crl:CD(SD), 일본 찰스리버 주식회사, 6주령, n=3, 체중 145.2~163.9 g)의 배부 피하에 상기 89-1에서 조제한 투여액을 비절식하 1 mL/㎏의 용량으로 주사통 및 26G 주사침(모두 테루모사 제조)을 사용하여 투여하였다. 대조군으로서 당쇄 부가 폴리펩티드를 포함하지 않는 생리식염액을 동일하게 투여하였다(비히클군). 그 후 즉 당쇄 부가체 투여 후 5~6분 사이에 전신 마취제로서 펜토바르비탈 나트륨(솜노펜틸, Lot.0608101, 교리츠 제약사 제조)을 50 ㎎/㎏이 되도록 주사통 및 주사침을 사용하여 복강 내에 투여하였다. 당쇄 부가체 투여 후 1시간에 즉 마취하에서 50분 이상 경과한 상태에서 GH 유리 촉진제로서 GRF를 꼬리 정맥에 1 mL/㎏의 용량으로 주사통 및 주사침을 사용하여 투여하였다. GRF 투여 후 5분에 랫트 경부 정맥으로부터 헤파린을 넣은 주사통 및 주사침을 사용하여 채혈을 행하였다. 채취한 혈액 0.4 mL를 빙상에서 20분 이상 방치한 후 원심분리(1,870×g, 4℃, 10분)하고 상청을 100 μL 채취하여 혈장 샘플로 하였다. 블랭크 혈장으로서 무처치의 랫트 경부 정맥으로부터 채취한 혈액을 동일하게 처리하여 얻은 혈장을 사용하였다. 혈장 샘플은 측정에 사용하기까지 냉동보존하였다.

89-3 혈장 중 GH 농도의 측정

상기 89-2에서 얻어진 혈장 샘플에 있어서의 GH 농도 측정을 SPI-Bio사 랫트 GrowthHormone EIA 키트(SPI-Bio, A05104)를 사용하여 행하였다. 혈장 샘플을 EIA 키트 부속 어세이 버퍼를 사용하여 20배, 100배, 500배로 희석하고 측정 샘플로 하였다. 검량선을 작성하기 위한 표준액은 첨부의 설명서에 따라 증류수로 40 ng/mL 용액을 조제한 후 어세이 버퍼를 사용하여 단계 희석하고 20 ng/mL, 10 ng/mL, 5 ng/mL, 2.5 ng/mL, 1.25 ng/mL, 0.63 ng/mL, 0.31 ng/mL를 조제하였다. 얻어진 결과에 희석률을 곱함으로써 GH 농도를 산출하였다. 얻어진 혈장 샘플 중 GH 농도를 표 7에 나타낸다.

표 7에 나타낸 결과로부터 판명되는 바와 같이 본 발명의 당쇄 부가체는 랫트에 있어서의 GH 생산을 억제하였다. 실시예 21 및 실시예 25의 당쇄 부가체는 실시예 69-1의 수법에 의해 측정한 경우 각 수용체에 대한 Ki 값과 당쇄를 갖지 않는 SRIF14의 Ki 값의 비가 각각 15.7：1~1.2：1(실시예 21의 화합물) 및 158：1~7.1：1(실시예 25의 화합물)의 범위 내로 나타내어져 있다. 또한 실시예 21 및 실시예 25의 당쇄 부가체는 실시예 70의 수법에 의해 측정한 경우 각각 혈중 반감기가 25배 이상(실시예 21의 화합물) 또는 30배 이상(실시예 25의 화합물) 증대되어 있는 것이 나타내어져 있다. 한편 당쇄를 2개 갖는 본 실시예로부터는 당쇄 부가체가 생체 내에서도 약리학적인 작용을 유효하게 발휘하는 것이 나타내어졌다.

또한 본 발명의 당쇄 부가체는 GRF 투여의 1시간 전에 투여한 경우라도 GH 생산 억제작용을 가지고 있었다.

또한 실시예 1 및 실시예 21과 실시예 25의 당쇄 부가체에서는 랫트 GH 생산능에 대한 유효한 투여량이 10배 정도 상이한 것이 나타내어졌다. 이것은 실시예 69-1의 수법에 의해 측정한 경우 그들 수용체 친화성이 Ki 값으로 10배 정도의 차인 것과 유사하다. 당쇄 부가체의 친화성이 다소 감쇠한 경우에 있어서도 약리학적인 활성을 갖는 것이 나타내어졌다.

실시예 90 랫트를 사용한 GH 생산 억제시험 2

실시예 89-1~89-3과 동일하게 하여 다음에 나타내는 당쇄 부가체인 화합물의 랫트 GH 생산 억제시험을 실시하였다. 당쇄 부가체로서 S1C(disialo)-SRIF28, N5C(disialo)-SRIF28, A9C(disialo)-SRIF28, E12C(disialo)-SRIF28, R13C(disialo)-SRIF28, K14C(disialo)-SRIF28, S1C(disialo)-D-Trp22-SRIF28, S1C(disialo(Bn))-SRIF28, S1C(disialo(amide))-SRIF28, S1C(disialo(aminoethylamide))-SRIF28, S1C(monosialo)-SRIF28, S1C(asialo)-SRIF28, C(disialo)-R-K-SRIF14, S1-2C(asialo)-SRIF28, S1C(disialo)·N5C(disialo)-SRIF28, S1C(disialo)·N5C(disialo)·A9C(disialo)-SRIF28 및 S1-5C(disialo)-SRIF28을 사용하였다. 얻어진 혈장 샘플 중 GH 농도를 표 8에 나타낸다.

표 8에 나타낸 결과로부터 판명되는 바와 같이 본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는 랫트에 있어서의 GH 생산을 억제하였다. S1C(disialo)-SRIF28은 본 시험계에 있어서 1 nmol/㎏부터 GH 생산을 억제하고 3~10 nmol/㎏에서 82~99%의 GH 생산 억제 효과를 나타내었다. 이것은 실시예 69-1 및 69-2 및 실시예 70~87에서 나타낸 바와 같이 SSTR1~SSTR5에 대해서 친화성을 가져 혈중 체류성이 향상되었기 때문이라고 생각된다.

실시예 69-1 및 69-2에 있어서 S1C(disialo)-SRIF28과 동등한 친화성을 나타내는 N5C(disialo)-SRIF28, A9C(disialo)-SRIF28, E12C(disialo)-SRIF28, S1C(disialo)-D-Trp-SRIF28, S1C(disialo(Bn))-SRIF28 및 C(disialo)-R-K-SRIF14는 10 nmol/㎏에서 95~99%의 GH 생산 억제 효과를 나타내, S1C(disialo)-SRIF28과 동등한 효과를 나타내었다.

실시예 70~87의 수법에 나타내는 결과로부터 S1C(monosialo)-SRIF28, S1C(asialo)-SRIF28, S1-2C(asialo)-SRIF28 및 S1C(disialo(amide))-SRIF28은 피하 투여시의 AUC가 S1C(disialo)-SRIF28의 3분의 1 내지 2분의 1이고, 또한 S1C(disialo(aminoethylamide))-SRIF28은 7분의 1이었다. 한편 실시예 69-1 및 69-2에 나타내는 수법에 의해 이들은 모두 S1C(disialo)-SRIF28보다도 높은 친화성을 나타내었다. 그 때문에 본 실험계에 있어서 S1C(monosialo)-SRIF28, S1C(asialo)-SRIF28, S1-2C(asialo)-SRIF28, S1C(disialo(aminoethylamide))-SRIF28 및 S1C(disialo(amide))-SRIF28은 10 nmol/㎏에서 70~99%의 GH 생산을 억제하여 S1C(disialo)-SRIF28과 동등한 효과를 나타내었다고 생각된다.

실시예 69-1 및 69-2에 나타내는 수법에 의해 R13C(disialo)-SRIF28, K14C(disialo)-SRIF28, S1C(disialo)·N5C(disialo)-SRIF28, S1C(disialo)·N5C(disialo)·A9C(disialo)-SRIF28 및 S1-5C(disialo)-SRIF28은 S1C(disialo)-SRIF28보다도 낮은 친화성을 나타내었다. 한편 실시예 70~87의 수법에 나타내는 결과로부터 피하 투여시의 AUC가 S1C(disialo)-SRIF28의 1.8배~3.1배로 향상된 화합물이다. 실험계에 있어서 R13C(disialo)-SRIF28, K14C(disialo)-SRIF28, S1C(disialo)·N5C(disialo)-SRIF28, S1C(disialo)·N5C(disialo)·A9C(disialo)-SRIF28 및 S1-5C(disialo)-SRIF28은 10 또는 100 nmol/㎏ 투여에 의해 GH 생산 억제 활성을 나타내었다. 이들 결과는 수용체 친화성이 저하된 경우에 있어서도 혈중 안정성이 증대됨으로써 소마토스타틴의 활성을 보상 또는 증대시킬 수 있었던 것을 나타낸다.

실시예 91 소화관 폐색 모델에서의 약효시험

본 발명의 당쇄 부가 폴리펩티드는 실시예 89 및 실시예 90에서 나타내는 바와 같이 랫트 생체 내에 있어서도 아고니스트로서 유효하게 작용하는 것을 증명하였다. 다음으로 질환 모델에 있어서도 유효성을 나타내는 것을 증명하기 위해서 랫트 소화관 폐색 모델에서의 평가를 실시하였다. 장폐색증 등의 소화관 폐색에서는 소화관의 조직 장애, 또한 물이나 전해질 등의 흡수능 저하에 의해 복부 팽만감·구토·복통 등과 같은 소화기 증상을 나타낸다. 그 병태는 소화관 내용물의 통과 장애나 소화액이나 생리활성 물질의 소화관 내로의 방출에 의해 일어나는 것이 알려져 있다. 소마토스타틴은 소화기계에 발현하는 SSTR을 매개로 각종 소화액의 분비 억제 또는 물·전해질의 흡수 촉진에 의해 소화관 내용물을 감소시키는 것과 같은 작용을 나타내어 증상 개선에 유효하다고 여겨진다. 본 실험계는 장관 폐색 후의 공장(jejunum)에 있어서의 장액 중량의 변화를 지표로 하여 장액의 흡수 촉진 또는 분비 억제 작용을 평가하는 시험계로서 실시하였다. 또한 조직 장애시의 지표로서 일탈 효소인 아밀라아제(췌장), 젖산탈수소효소(LDH, 간장) 및 크레아틴포스포키나아제(CPK, 골격근, 심근 등)의 혈액 파라미터를 측정하였다.

실시예 91-1 소화관 폐색 모델의 제작

본 시험은 미츠비시 화학 메디언스사에 위탁하여 실시하였다. 수컷인 SD계 랫트(Crl:CD(SD) 일본 찰스리버 주식회사, 8주령, n=5 이상, 체중 251.1~278.1 g)를 12시간 이상 절식시켰다. 2% 이소플루란 및 아산화질소：산소=7：3 흡입으로 마취 도입하고 수술 중에는 이것을 유지하였다. 복부를 정중절개(median incision)하고 십이지장제근으로부터 약 10 ㎝인 곳의 공장을 봉합실로 결찰하였다. 그 후 절개부를 신속하게 봉합하고 화합물 투여까지 절식으로 하였다. 거짓 처치군(sham treatment group)은 공장의 결찰을 행하지 않고 복부를 정중절개한 후에 절개부를 봉합하는 처치를 행하였다.

실시예 91-2 화합물의 조제 및 투여

당쇄 부가체로서 S1C(disialo)-SRIF28, C(disialo)-R-K-SRIF14, S1-2C(asialo)-SRIF28을 사용하여 일본 약국방 생리식염액(오츠카 제약 공장사 제조)에 용해하여 40 μM 용액을 조제하고 투여액으로 하였다. 소화관 폐색수술로부터 18시간 후 1 mL/㎏의 용량으로 주사통 및 25G 주사침(모두 테루모사 제조)을 사용하여 경배부에 피하 투여하였다. Vehicle군으로서 당쇄 부가 폴리펩티드를 포함하지 않는 생리식염액을 동일하게 투여하였다. 또한 대조로서 옥트레오티드를 투여하였다.

실시예 91-3 장액 중량의 측정

화합물 투여 1시간 후에 흡입 마취하에서 복부를 정중절개하고 복부 대정맥으로부터 혈액을 1.5 mL 채취하였다. 그리고 십이지장제근 측의 결찰 공장을 적출하였다. 공장 표면의 액체 및 혈액을 종이 타월로 제거하고, 공장에 붙은 신경·혈관·지방을 절제한 후에 길이 6 ㎝가 되도록 잘라내어, 습중량을 측정하였다. 그 후 36도에서 24시간 건조시켜 건중량을 측정하였다. 장액 중량(mg)은 습중량-건중량으로 산출하였다. 얻어진 공장의 장액 중량을 표 9에 나타낸다.

표 9로부터 명확한 바와 같이 vehicle은 거짓 처치와 비교하여 장액 중량이 유의하게 증가하고 결찰에 의한 소화관 폐색에 수반하여 장액의 분비 항진이 발생하고 있는 것이 확인되었다. 소마토스타틴이나 옥트레오티드는 이러한 소화관 폐색 모델에 있어서 장액의 장관 내로의 분비 억제와 장 조직 측으로의 장액 흡수 촉진작용을 갖는 것이 나타내어져 있고(Scand J Gastroenterol. 1995 May;30(5):464-9.), 본 실험계에 있어서도 옥트레오티드는 그 작용이 확인되었다. S1C(disialo)-SRIF28, C(disialo)-R-K-SRIF14, S1-2C(asialo)-SRIF28에서는 모두 vehicle과 비교하여 장액 중량의 증가가 확인되어, 본 발명에 있어서의 당쇄 부가체에 있어서도 장액의 분비 억제, 물·전해질의 흡수 촉진과 같은 유효성을 나타내는 것이 명확해졌다. 또한 S1-2C(asialo)-SRIF28은 S1C(disialo)-SRIF28과 비교하여 실시예 86 및 87에 있어서 피하 투여시의 AUC가 2분의 1이 되어 있었지만, 실시예 69-1에 있어서 S1C(disialo)-SRIF28보다도 SSTR1~SSTR5에 대한 친화성이 1.7~2.9배 정도 높은 것이 명확해져 있다. 이것은 혈장 중 농도가 낮은 경우라도 수용체 친화성의 향상에 의해 본 모델에 있어서의 약효가 유사하다는 것의 이유로 생각된다. 또한 동일하게 C(disialo)-R-K-SRIF14는 S1C(disialo)-SRIF28의 피하 투여시의 AUC를 비교하면 조금 낮지만 수용체 친화성이 0.7~2.4배 정도 높기 때문에 약효가 유사하다는 것의 이유로 생각된다.

실시예 91-4 혈액 파라미터의 측정

실시예 91-3에서 채취한 혈액을 사용하여 아밀라아제 농도(IU/L), LDH 농도(IU/L) 및 CPK 농도(IU/L)를 자동 분석장치 7170(히타치 제작소)을 사용하여 측정하였다. 측정방법은 각각 BG5B법, UV-rate법 및 JSCC법을 사용하였다. 얻어진 결과를 표 10에 나타낸다.

표 10으로부터 명확한 바와 같이 vehicle은 거짓 처치와 비교하여 아밀라아제 활성, LDH 활성이 증가하고 있어 소화관 폐색에 수반하여 소화기계의 조직 장애가 발생하고 있는 것이 추찰되었다. S1C(disialo)-SRIF28 및 C(disialo)-R-K-SRIF14에서는 vehicle과 비교하여 아밀라아제 활성은 낮은 값이었다. 한편 옥트레오티드에서는 아밀라아제 활성은 vehicle과 동등하였다. 실시예 69-1 및 69-2로부터 명확한 바와 같이 S1C(disialo)-SRIF28, C(disialo)-R-K-SRIF14 및 S1-2C(sialo)-SRIF28은 SSTR1~SSTR5의 모든 수용체에 결합 친화성을 갖는 것에 대해서 옥트레오티드는 SSTR2, SSTR3, SSTR5에 대해서 특이적으로 친화성을 갖는 화합물이다. 랫트 췌장에 있어서는 SSTR1~SSTR5의 모든 수용체가 발현되고 있다는 보고가 있는 것으로부터(J Histochem Cytochem. 2004 Mar;52(3):391-400.), 당쇄 부가체는 옥트레오티드와는 상이한 수용체에 작용함으로써 조직 장애를 경감시켰을 가능성이 생각되었다. 또한 옥트레오티드, C(disialo)-R-K-SRIF14에서는 vehicle과 비교하여 LDH 활성은 낮은 값이었다. 그 밖에 각 파라미터에 대해서 당쇄 부가체의 투여에 의해 악화되는 것은 없었다.

SEQUENCE LISTING <110> GLYTECH, INC. <120> SUGAR CHAIN ADDED POLYPEPTIDE AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE SAME <130> OCKP1103F <150> JP2011-192203 <151> 2011-09-04 <160> 169 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DISULFID <222> (3)..(14) <223> <400> 1 Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 1 5 10 <210> 2 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DISULFID <222> (17)..(28) <223> <400> 2 Ser Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <221> DISULFID <222> (3)..(14) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> AMIDATION <400> 3 Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 1 5 10 <210> 4 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <221> DISULFID <222> (17)..(28) <223> <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> AMIDATION <400> 4 Ser Ala Asn Ser Asn 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CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> disialo sugar chain added <220> <221> NON_CONS <222> (1)..(2) <223> Cys and Ala are bonded through PEGlinker <400> 116 Cys Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 1 5 10 15 <210> 117 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Fmoc <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (3)..(3) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (4)..(4) <223> tBu <220> <221> BINDING <222> (5)..(5) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (11)..(11) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (12)..(12) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (13)..(13) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (14)..(14) <223> Boc <220> <221> BINDING <222> (17)..(17) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (18)..(18) <223> Boc <220> <221> BINDING <222> (19)..(19) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (22)..(22) <223> Boc <220> <221> BINDING <222> (23)..(23) <223> Boc <220> <221> BINDING <222> (24)..(24) <223> tBu <220> <221> BINDING <222> (26)..(26) <223> tBu <220> <221> BINDING <222> (27)..(27) <223> tBu <220> <221> BINDING <222> (28)..(28) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (28)..(28) <223> Resin <400> 117 Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 118 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (17)..(17) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (28)..(28) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Biotin <400> 118 Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 119 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> DISULFID <222> (17)..(28) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> disialo sugar chain added <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Biotin <400> 119 Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 120?? <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (17)..(17) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (28)..(28) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Biotin is bonded to Cys through PEGlinker <400> 120 Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 121?? <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> DISULFID <222> (17)..(28) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> disialo sugar chain added <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Biotin is bonded to Cys through PEGlinker <400> 121 Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 122 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (17)..(17) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (28)..(28) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Azido pentanoyl is bonded to Cys <400> 122 Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 123? <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> DISULFID <222> (17)..(28) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> disialo sugar chain added <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Azido pentanoyl is bonded to Cys <400> 123 Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 124 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (17)..(17) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (28)..(28) <223> Acm <400> 124 Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Cys Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 125 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> DISULFID <222> (17)..(28) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> disialo sugar chain added <220> <221> CARBOHYD <222> (12)..(12) <223> disialo sugar chain added <400> 125 Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Cys Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 126 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (7)..(7) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (18)..(18) <223> Acm <400> 126 Cys Cys Arg Lys Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr 1 5 10 15 Ser Cys <210> 127 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> DISULFID <222> (7)..(18) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> disialo sugar chain added <220> <221> CARBOHYD <222> (2)..(2) <223> disialo sugar chain added <400> 127 Cys Cys Arg Lys Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr 1 5 10 15 Ser Cys <210> 128 <211> 19 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (8)..(8) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (19)..(19) <223> Acm <400> 128 Cys Cys Cys Arg Lys Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe 1 5 10 15 Thr Ser Cys <210> 129 <211> 19 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> DISULFID <222> (8)..(19) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> disialo sugar chain added <220> <221> CARBOHYD <222> (2)..(2) <223> disialo sugar chain added <220> <221> CARBOHYD <222> (3)..(3) <223> disialo sugar chain added <400> 129 Cys Cys Cys Arg Lys Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe 1 5 10 15 Thr Ser Cys <210> 130 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (17)..(17) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (28)..(28) <223> Acm <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> diGlcNAc sugar chain added ? <400> 130 Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 131 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> diGlcNAc sugar chain added ? <400> 131 Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 132 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> DISULFID <222> (17)..(28) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> diGlcNAc sugar chain added ? <400> 132 Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 133 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> DISULFID <222> (17)..(28) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> diMan sugar chain added ? <400> 133 Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 134 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> DISULFID <222> (17)..(28) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (19)..(19) <223> diMan sugar chain added ? <400> 134 Ser Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Cys Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 135 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> DISULFID <222> (17)..(28) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> GlcNAc added ? <400> 135 Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 136 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> DISULFID <222> (17)..(28) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (19)..(19) <223> GlcNAc added ? <400> 136 Ser Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Cys Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 137 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> DISULFID <222> (17)..(28) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Trisialo sugar chain added <400> 137 Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 138 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> DISULFID <222> (17)..(28) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Tetrasialo sugar chain added <400> 138 Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 139 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> 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Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 142 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> DISULFID <222> (17)..(28) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Disialo(aminoethylamide) sugar chain added <400> 142 Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 143 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> DISULFID <222> (17)..(28) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Disialo(amide) sugar chain added <400> 143 Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 144 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> DISULFID <222> (17)..(28) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Disialo sugar chain protected with benzyl group added <400> 144 Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 145 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (17)..(17) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (28)..(28) <223> Acm <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Disialo(hexadecylamide) sugar chain added <400> 145 Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 146 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Disialo(hexadecylamide) sugar chain added <400> 146 Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 147 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> DISULFID <222> (17)..(28) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Disialo(hexadecylamide) sugar chain added <400> 147 Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 148 <211> 29 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> DISULFID <222> (18)..(29) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Disialo(amide) sugar chain added <220> <221> CARBOHYD <222> (2)..(2) <223> Disialo(amide) sugar chain added <400> 148 Cys Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala 1 5 10 15 Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 149 <211> 29 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> DISULFID <222> (18)..(29) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Disialo sugar chain protected with benzyl group added <220> <221> CARBOHYD <222> (2)..(2) <223> Disialo sugar chain protected with benzyl group added <400> 149 Cys Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala 1 5 10 15 Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 150 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> DISULFID <222> (17)..(28) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Asn(disialo) added <400> 150 Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 151 <211> 27 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Fmoc <220> <221> BINDING <222> (2)..(2) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (3)..(3) <223> tBu <220> <221> BINDING <222> (4)..(4) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (10)..(10) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (11)..(11) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (12)..(12) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (13)..(13) <223> Boc <220> <221> BINDING <222> (16)..(16) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (17)..(17) <223> Boc <220> <221> BINDING <222> (18)..(18) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (21)..(21) <223> Boc <220> <221> BINDING <222> (22)..(22) <223> Boc <220> <221> BINDING <222> (23)..(23) <223> tBu <220> <221> BINDING <222> (25)..(25) <223> tBu <220> <221> BINDING <222> (26)..(26) <223> tBu <220> <221> BINDING <222> (27)..(27) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (27)..(27) <223> Resin <400> 151 Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly Cys 1 5 10 15 Lys Cys Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 152 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Disialo sugar chain protected with benzyl group added <220> <221> BINDING <222> (3)..(3) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (4)..(4) <223> tBu <220> <221> BINDING <222> (5)..(5) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (11)..(11) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (12)..(12) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (13)..(13) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (14)..(14) <223> Boc <220> <221> BINDING <222> (17)..(17) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (18)..(18) <223> Boc <220> <221> BINDING <222> (19)..(19) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (22)..(22) <223> Boc <220> <221> BINDING <222> (23)..(23) <223> Boc <220> <221> BINDING <222> (24)..(24) <223> tBu <220> <221> BINDING <222> (26)..(26) <223> tBu <220> <221> BINDING <222> (27)..(27) <223> tBu <220> <221> BINDING <222> (28)..(28) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (28)..(28) <223> Resin <400> 152 Asn Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Cys Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 153 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (17)..(17) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (28)..(28) <223> Acm <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Disialo sugar chain protected with benzyl group added <400> 153 Asn Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Cys Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 154 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (17)..(17) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (28)..(28) <223> Acm <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Disialo sugar chain protected with benzyl group added <220> <221> CARBOHYD <222> (19)..(19) <223> diMan sugar chain added <400> 154 Asn Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Cys Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 155 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Disialo sugar chain protected with benzyl group added <220> <221> CARBOHYD <222> (19)..(19) <223> diMan sugar chain added <400> 155 Asn Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Cys Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 156 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> DISULFID <222> (17)..(28) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Disialo sugar chain protected with benzyl group added <220> <221> CARBOHYD <222> (19)..(19) <223> diMan sugar chain added <400> 156 Asn Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Cys Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 157 <211> 28 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> DISULFID <222> (17)..(28) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Disialo sugar chain added <220> <221> CARBOHYD <222> (19)..(19) <223> diMan sugar chain added <400> 157 Asn Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 1 5 10 15 Cys Lys Cys Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 158 <211> 29 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Fmoc <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (2)..(2) <223> StBu <220> <221> BINDING <222> (4)..(4) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (5)..(5) <223> tBu <220> <221> BINDING <222> (6)..(6) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (12)..(12) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (13)..(13) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (14)..(14) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (15)..(15) <223> Boc <220> <221> BINDING <222> (18)..(18) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (19)..(19) <223> Boc <220> <221> BINDING <222> (20)..(20) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (23)..(23) <223> Boc <220> <221> BINDING <222> (24)..(24) <223> Boc <220> <221> BINDING <222> (25)..(25) <223> tBu <220> <221> BINDING <222> (27)..(27) <223> tBu <220> <221> BINDING <222> (28)..(28) <223> tBu <220> <221> BINDING <222> (29)..(29) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (29)..(29) <223> Resin <400> 158 Cys Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala 1 5 10 15 Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 159 <211> 29 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (2)..(2) <223> StBu <220> <221> BINDING <222> (18)..(18) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (29)..(29) <223> Acm <400> 159 Cys Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala 1 5 10 15 Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 160 <211> 29 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (2)..(2) <223> StBu <220> <221> BINDING <222> (18)..(18) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (29)..(29) <223> Acm <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Disialo(aminoethylamide) sugar chain added <400> 160 Cys Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala 1 5 10 15 Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 161 <211> 29 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (18)..(18) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (29)..(29) <223> Acm <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Disialo(aminoethylamide) sugar chain added <400> 161 Cys Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala 1 5 10 15 Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 162 <211> 29 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (18)..(18) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (29)..(29) <223> Acm <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Disialo(aminoethylamide) sugar chain added <220> <221> CARBOHYD <222> (2)..(2) <223> Disialo sugar chain added <400> 162 Cys Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala 1 5 10 15 Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 163 <211> 29 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Disialo(aminoethylamide) sugar chain added <220> <221> CARBOHYD <222> (2)..(2) <223> Disialo sugar chain added <400> 163 Cys Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala 1 5 10 15 Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 164 <211> 29 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> DISULFID <222> (18)..(29) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Disialo(aminoethylamide) sugar chain added <220> <221> CARBOHYD <222> (2)..(2) <223> Disialo sugar chain added <400> 164 Cys Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala 1 5 10 15 Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 <210> 165 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Fmoc <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (2)..(2) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (3)..(3) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (4)..(4) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (6)..(6) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (7)..(7) <223> tBu <220> <221> BINDING <222> (8)..(8) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (14)..(14) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (15)..(15) <223> OtBu <220> <221> BINDING <222> (16)..(16) <223> Pbf <220> <221> BINDING <222> (17)..(17) <223> Boc <220> <221> BINDING <222> (20)..(20) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (21)..(21) <223> Boc <220> <221> BINDING <222> (22)..(22) <223> Trt <220> <221> BINDING <222> (25)..(25) <223> Boc <220> <221> BINDING <222> (26)..(26) <223> Boc <220> <221> BINDING <222> (27)..(27) <223> tBu <220> <221> BINDING <222> (29)..(29) <223> tBu <220> <221> BINDING <222> (30)..(30) <223> tBu <220> <221> BINDING <222> (31)..(31) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (31)..(31) <223> Resin <400> 165 Cys Cys Cys Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg 1 5 10 15 Lys Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 30 <210> 166 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (20)..(20) <223> Acm <220> <221> BINDING <222> (31)..(31) <223> Acm <400> 166 Cys Cys Cys Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu 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CARBOHYD <222> (4)..(4) <223> disialo sugar chain added <400> 168 Cys Cys Cys Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg 1 5 10 15 Lys Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 30 <210> 169 <211> 31 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <220> <221> DISULFID <222> (20)..(31) <223> <220> <221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> disialo sugar chain added <220> <221> CARBOHYD <222> (2)..(2) <223> disialo sugar chain added <220> <221> CARBOHYD <222> (3)..(3) <223> disialo sugar chain added <220> <221> CARBOHYD <222> (4)..(4) <223> disialo sugar chain added <400> 169 Cys Cys Cys Cys Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg 1 5 10 15 Lys Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 20 25 30

Claims

(A) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 SRIF14；
(B) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 SRIF14에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드；
(C) SRIF14의 유연체(analog);
(D) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 SRIF14에 대해서 80% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드；
(E) (A)~(D)에 있어서 N개(여기서 N은 1 이상 20 이하의 정수)의 아미노산을 N말단 측에 추가로 포함하는 폴리펩티드；및
(F) (A)~(D)에 있어서 M개(여기서 M은 1 이상 6 이하의 정수)의 아미노산을 C말단 측에 추가로 포함하는 폴리펩티드；
로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드에 있어서,
2개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있고 또한
소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 갖는 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제1항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 당쇄 부가 아미노산으로 치환되는 아미노산의 1개 이상이 SRIF14에 있어서의 19번 위치에 상당하는 아미노산인 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제1항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 당쇄 부가 폴리펩티드는 상기 (E)의 폴리펩티드에 있어서 2개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있고,
여기서 상기 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 1개 이상의 아미노산이 상기 (E)의 폴리펩티드의 N말단 측의 상기 N개의 아미노산에 존재하는 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제1항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 당쇄 부가 폴리펩티드는 상기 (F)의 폴리펩티드에 있어서 2개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있고,
여기서 상기 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 1개 이상의 아미노산이 상기 (F)의 폴리펩티드의 C말단 측의 상기 M개의 아미노산에 존재하는 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제1항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 당쇄 부가 폴리펩티드는 상기 (E)의 폴리펩티드에 있어서 2개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있고,
또한 N말단 측에 부가되는 상기 N개의 아미노산의 서열이 X-Y-로 표시되며,
여기서 X는 L개(여기서 L은 1 이상 6 이하의 정수)의 임의의 아미노산의 서열을 의미하고, 또한 Y는
(1) Lys,
(2) Arg-Lys,
(3) Glu-Arg-Lys,
(4) Arg-Glu-Arg-Lys,
(5) Pro-Arg-Glu-Arg-Lys,
(6) Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys,
(7) Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys,
(8) Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys,
(9) Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys,
(10) Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys,
(11) Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys,
(12) Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys,
(13) Ala-Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys,
(14) Ser-Ala-Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys 및
(15) 상기 서열 (2)~(14)에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열인
것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제5항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 아미노산의 1개 이상이 상기 (E)의 폴리펩티드의 N말단 측에 부가되는 상기 N개의 아미노산의 서열을 나타내는 X-Y-에 있어서의 X를 의미하는 L개의 아미노산에 존재하는 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제3항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
N말단 측에 부가되는 상기 N개의 아미노산은 링커를 매개로 당해 N말단 측에 연결되어 있는 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
(A) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 SRIF28；
(B) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 SRIF28에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 폴리펩티드；
(C) SRIF28의 유연체;
(D) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 SRIF28에 대해서 80% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드；
(E) (A)~(D)에 있어서 J개(여기서 J는 1 이상 15 이하의 정수)의 아미노산을 N말단 측에 추가로 포함하는 폴리펩티드；및
(F) (A)~(D)에 있어서 K개(여기서 K는 1 이상 6 이하의 정수)의 아미노산을 C말단 측에 추가로 포함하는 폴리펩티드；
로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드에 있어서,
2개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있고 또한
소마토스타틴 수용체에 대한 친화성을 갖는 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제8항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 당쇄 부가 아미노산으로 치환되는 아미노산의 1개 이상이 SRIF28에 있어서의 1번 위치에 상당하는 아미노산, 5번 위치에 상당하는 아미노산, 9번 위치에 상당하는 아미노산, 12번 위치에 상당하는 아미노산, 13번 위치에 상당하는 아미노산, 14번 위치에 상당하는 아미노산 및 19번 위치에 상당하는 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산인 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제8항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 당쇄 부가 폴리펩티드는 상기 (E)의 폴리펩티드에 있어서 2개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있고,
여기서 상기 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 1개 이상의 아미노산이 상기 (E)의 폴리펩티드의 N말단 측의 상기 J개의 아미노산에 존재하는 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제8항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 당쇄 부가 폴리펩티드는 상기 (F)의 폴리펩티드에 있어서 2개 이상의 아미노산이 당쇄 부가 아미노산으로 치환되어 있고,
여기서 상기 당쇄 부가 아미노산으로 치환된 1개 이상의 아미노산이 상기 (F)의 폴리펩티드의 C말단 측의 상기 K개의 아미노산에 존재하는 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 당쇄 부가 폴리펩티드는 SRIF28과 비교하여 증대된 혈중 안정성을 갖는 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 당쇄 부가 폴리펩티드는 SRIF28과 비교하여 10배 이상 증대된 혈중 반감기를 갖는 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성이 SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4 및 SSTR5로 이루어진 군으로부터 선택되는 수용체의 적어도 2 이상의 수용체에 대한 친화성을 갖는 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제14항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 당쇄 부가 폴리펩티드가 SSTR1 및 SSTR4 중 어느 1개 이상에 대해서 친화성을 갖는 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제14항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 당쇄 부가 폴리펩티드가 SSTR1 및 SSTR4의 양쪽에 대해서 친화성을 갖는 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제14항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 당쇄 부가 폴리펩티드가 SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4 및 SSTR5 모두에 대해서 친화성을 갖는 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 각 당쇄 부가 아미노산이 당쇄 부가 Asn 또는 당쇄 부가 Cys인 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 각 당쇄 부가 아미노산에 있어서 당쇄와 아미노산이 링커를 매개로 하지 않고 결합되어 있는 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 각 당쇄 부가 아미노산에 있어서 당쇄가 4개 이상의 당으로 이루어지는 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 각 당쇄 부가 아미노산에 있어서 당쇄가 2본쇄 복합형 당쇄(biantennary complex-type sugar chain), 3본쇄 복합형 당쇄 또는 4본쇄 복합형 당쇄인 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 각 당쇄 부가 아미노산에 있어서 당쇄가 2본쇄 복합형 당쇄인 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제21항 또는 제22항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 2본쇄 복합형 당쇄가 디시알로 당쇄, 모노시알로 당쇄, 아시알로 당쇄, 디글크낙 당쇄 및 디만노오스 당쇄로 이루어진 군으로부터 선택되는 당쇄인 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 각 당쇄 부가 아미노산에 있어서 당쇄가 하기 식：

[식 중, R₁ 및 R₂는 동일 또는 상이하고,

를 나타내며, Ac는 아세틸기를 나타낸다.]
으로 표시되는 당쇄인 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 당쇄가 비환원 말단에 1개 이상의 시알산을 가지고 있고, 상기 시알산의 카르복시기가 탄소수 1~30의 알킬아미노기, 벤질기, 아미노기 또는 아미노에틸아미노기에 의해 수식되어 있는 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 당쇄 부가 폴리펩티드는 복수의 당쇄 부가 아미노산을 가지고 있고,
상기 각 당쇄 부가 아미노산에 있어서의 당쇄가 모두 동일한 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 당쇄 부가 폴리펩티드는 SRIF28에 있어서의 17번 위치의 Cys와 28번 위치의 Cys에 상당하는 Cys를 가지고 있고,
또한 이들 Cys는 서로 디설피드 결합되어 있는 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 당쇄 부가 폴리펩티드의 C말단은 아미드화되어 있는 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 당쇄 부가 폴리펩티드의 N말단에 아지드기가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드로서,
상기 당쇄 부가 폴리펩티드가 표지되어 있는 것을 특징으로 하는,
당쇄 부가 폴리펩티드.
(I) 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드 및/또는 약학적으로 허용되는 그의 염 및
(II) 약리학적으로 허용되는 담체
를 포함하는 것을 특징으로 하는,
의약 조성물.
제31항에 기재된 의약 조성물로서,
상기 당쇄 부가 폴리펩티드에 있어서 당쇄가 실질적으로 균일한 것을 특징으로 하는,
의약 조성물.
제31항 또는 제32항에 기재된 의약 조성물로서,
소마토스타틴에 관련된 질환의 치료 또는 예방을 위해서 사용되는 것을 특징으로 하는,
의약 조성물.
제33항에 기재된 의약 조성물로서,
상기 소마토스타틴에 관련된 질환이 말단 비대증, 거인증, 알츠하이머병 및 다른 형태의 치매, 암, 호르몬 생산 종양, 내분비 종양, 카르시노이드, 비포마(VIPoma), 인슐리노마, 글루카고노마, 쿠싱병, 호르몬 분비 이상, 당뇨병 및 그의 합병증, 동통, 관절염, 설사, 위궤양, 염증성 장질환, 과민성 장증후군, 소화관 폐색, 장폐색증, 수술 후 재협착, 방사선 장애, 안질환, 안구 건조, 녹내장, 각막실질의 염증, 홍채염, 백내장 및 결막염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 질환인 것을 특징으로 하는,
의약 조성물.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 기재된 당쇄 부가 폴리펩티드의 유효량을 투여하는 것을 특징으로 하는, 소마토스타틴에 관련된 질환의 치료 또는 예방방법.
제35항에 기재된 치료 또는 예방방법으로서,
상기 소마토스타틴에 관련된 질환이 말단 비대증, 거인증, 알츠하이머병 및 다른 형태의 치매, 암, 호르몬 생산 종양, 내분비 종양, 카르시노이드, 비포마, 인슐리노마, 글루카고노마, 쿠싱병, 호르몬 분비 이상, 당뇨병 및 그의 합병증, 동통, 관절염, 설사, 위궤양, 염증성 장질환, 과민성 장증후군, 소화관 폐색, 장폐색증, 수술 후 재협착, 방사선 장애, 안질환, 안구 건조, 녹내장, 각막실질의 염증, 홍채염, 백내장 및 결막염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 질환인 것을 특징으로 하는,
치료 또는 예방방법.