NL194729C - Werkwijze voor de bereiding van peptidealcoholen via vaste fase. - Google Patents

Description

1 194729

Werkwijze voor de bereiding van peptidealcoholen via vaste fase

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een peptidealcohol met formule CHR-XH

5 /

Y-CO-NH-CH

\

CH2OH

waarin 10 Y de rest van een peptidealcohol, die eventueel beschermende groepen bevat, voorstelt, R, waterstof of methyl weergeeft, en X O of S is.

Gevonden is nu een bijzonder geschikte werkwijze voor het bereiden van dergelijke peptidealcoholen doordat een hars met formule 1.2, die de peptidealcohol bevat waarin 15 © de rest van een onoplosbare, synthetische hars is en Z een directe binding of een groep die de hars met geacetaliseerde formylfenylgroep verbindt, voorstelt, waarin de geacetaliseerde CHO-groep meta of para ten op zichte van de Z-groep is geplaatst en een aantal geacetaliseerde formylfenylgroepen met een molecuul van het harspolymeer zijn verbonden, onder zure omstandigheden wordt gehydrolyseerd.

20 De werkwijze is in het bijzonder geschikt voor het bereiden van peptidealcoholen die een koolstof-terminale threoninol-, serinol- of cysteinolgroep bevatten.

Voorbeelden van geschikte peptidealcoholen zijn bijvoorbeeld enkele van de hierna en in EP-B 29579 beschreven somatostatineverbindingen.

Peptidesynthese in de vaste fase is een bijzonder snelle en gunstige werkwijze voor het bereiden van 25 peptiden gebleken en is daardoor een algemeen gebruikelijke werkwijze geworden.

Zoals bekend, wordt eerst een aminozuur via zijn carboxylgroep gebonden, onder vorming van een ester-of amidegroep, aan een hydroxylgroep of aminogroep van een onoplosbare, synthetische hars; daarna worden de verdere aminozuren hieraan in de gewenste volgorde toegevoegd en tenslotte wordt het volledige polypeptide van de dragerhars afgescheiden.

30 Deze synthese verloopt zonder moeilijkheden voor normale polypeptiden met koolstofterminale aminozuren. Polypeptidealcoholen die aan het koolstofuiteinde een aminoaicohol in plaats van een aminozuur bevatten, vormen echter niet gemakkelijk een binding met dragerharsen die OH- of NH2-groepen bevatten en/of worden niet zo gemakkelijk weer afgescheiden indien de synthese is beëindigd.

Het volgende was reeds vroeger voorgesteld als mogelijke vastefasewerkwijzen voor het bereiden van 35 peptidealcoholen: a) de gebruikelijke bereiding van het overeenkomstige polypeptide dat aan het koolstofuiteinde een aminozuur (als de ester van een hars die hydroxylgroepen bevat) bevat en vervolgens afsplitsing door reductie, onder toepassing van boorhydriden, waarbij de carboxylgroep gelijktijdig wordt omgezet in een alcoholfunctie (Amerikaanse octrooischriften 4.254.023/4).

40 b) Toevoeging van de terminale aminoaicohol als ether aan een hydroxymethylhars, onder toepassing van carbonyldiimidazool en tenslotte, na synthese van het peptide, afscheiding onder toepassing van HCI/TFA of HBr/TFA (Kun-Hwa Hsieh en G.R. Marshall, ACS national Meeting, New Orleans, 21-25. 3.1977).

Deze werkwijzen vereisen echter beide drastische splitsingsomstandigheden.

Men heeft nu een methode gevonden waarbij het afscheiden van de peptidealcohol van de hars, onder 45 gelijktijdige vorming van het koolstofterminale peptidealcohol, onder milde omstandigheden kan worden uitgevoerd. Hiertoe wordt volgens de uitvinding de peptidealcohol waarin aan het koolstofterminale uiteinde van de peptideketen twee alcoholgroepen of één alcoholgroep en één thiolgroep aanwezig is, verkregen door zure hydrolyse van een acetaal van de peptidealcohol en een polymeerhars die formylfenylgroepen bevat zoals hiervoor is gedefinieerd. Dit wordt aangeduid als de synthese volgens de uitvinding.

50 Opgemerkt wordt dat in Int. J. Peptide Protein Res. 20 (1982), 451-454 en J. Chem. Soc. Chem.

Commun. (1982), 587-589 wordt voorgesteld om bij vaste-stofsynthese van peptiden verankeringsgroepen toe te passen die met verdund trifluorazijnzuur hydrolyseerbaar zijn.

De peptiden waarop de twee bovengenoemde documenten betrekking hebben zijn peptiden die een aminozuur aan het koolstofuiteinde bevatten. De onderhavige uitvinding betreft echter een werkwijze voor 55 de bereiding van een peptidealcohol met een koolstofterminale aminoaicohol die twee alcoholgroepen of een alcoholgroep en een thiolgroep bevat. Een voorbeeld van een dergelijke peptidealcohol is het octreotide.

194729 2

Voor de bereiding van peptiden volgens de twee documenten wordt gebruikgemaakt van 4-(hydroxymethyl)fenoxyazijnzuur of 3-methoxy-4-(hydroxymethyl)fenoxyazijnzuur voor de koppeling tussen het peptide en de hars, die in zuur milieu verbroken kan worden en specifiek is voor het koppelen van een eindstandig carbonzuur door middel van een estergroep aan een hars in de aanwezigheid van een 5 Fmoc-t-butylbeschermingsgroep. Deze twee koppelingsgroepen kunnen onder milde omstandigheden zoals | bijvoorbeeld met verdund trifluorazijnzuur worden verbroken. i

Volgens de onderhavige werkwijze wordt echter gebruikgemaakt van formylfenyl- of formytfenoxyacetyl- , veankeringsgroepen die worden gekarakteriseerd door een aldehydegroep, waaraan een peptidealcohol zoals hiervoor is gedefinieerd, met de aminoalcohol aan het koolstofterminale uiteinde door een acetaal- 1 10 binding met een formylfenylgroep aan de hars is gebonden en door zure hydrolyse kan worden genomen. i

Terwille van de eenvoud is in formules I en II van het hiervoor genoemde schema slechts één substitutie* groep aan de hars aangegeven; het zal echter duidelijk zijn dat een aantal van dergelijke groepen aan een molecuul van het harspolymeer kunnen zijn gebonden. Het afscheiden van de peptidealcohol van de hars door hydrolyse van de acetaalgroep vindt, zoals hiervoor reeds werd vermeld, onder zure omstandigheden 15 plaats, bijvoorbeeld met verdund trifluorazijnzuur. De hydrolyse kan bij kamertemperatuur worden uitgevoerd.

Indien Z in formule I een directe binding is, zijn de fenylgroepen die acetaalgroepen bevatten rechtstreeks aan het polymeermolecuul gebonden en behoren tot het polymeer. Voorbeelden van dergelijke verbindingen met formule I zijn de acetaten van een geformyleerde polystyreenhars (in formule I, (P) is dan 20 een polyethyleenketen).

Indien Z een groep voorstelt dan bevat deze een groep die het resultaat is van een reactie van een reactieve groep, die rechtstreeks of indirect gebonden is aan het polymeer, met een andere reactieve groep, die rechtstreeks of indirect gebonden is aan de (geacetaliseerde) formylfenylgroep. De Z-groep kan bijvoorbeeld door formule III worden weergegeven, waarin 25 Q1 de rest van een reactieve groep die aan het polymeer is gebonden, voorstelt, Q2 de rest van een reactie groep is die aan de (geacetaliseerde) formylfenylgroep is gebonden, D een groep weergeeft die de Q,-groep met het polymeer verbindt, E een groep weergeeft die de Q2-groep met de (geacetaliseerde) formylfenylgroep verbindt, en p en q, onafhankelijk van elkaar, 0 of 1 zijn.

30 De Qi-Q2-groep is bij voorkeur een ester- of amidegroep, in het bijzonder een carbamoylgroep. Qn is bij voorkeur NH en Q2 geeft bij voorkeur CO aan.

D en E zijn, onafhankelijk van elkaar, bijvoorbeeld alkyleen- of alkyleenoxygroepen met 1-5 koolstof-atomen. Voorbeelden van dergelijke verbindingen met formule I waarin Z een groep met formule III is, zijn verbindingen waarin (P)-D-Q., de rest van een geaminomethyleerde polystyreenhars is en de groep met 35 formule / x-chn

40 VE-^CVcHi'CH'NH"C°‘ï 9roöP

formule IV is, waarin R een waterstof of methyl is, 45 en m 0 of 1 voorstelt, waarbij de acetaalgroep weer m- of p-geplaatst is.

In dit geval is Z dus een groep met formule -CH2-NH-C0-CH-(0)m- en ® is polystyreen .

50 R

De groep met formule IV is bij voorkeur "K X-CH 1 55 -co-CH2-o-(o)-clf Nh-nh-co-y x 0-CH2 3 194729

In plaats van het geaminomethyleerde polystyreen kunnen eveneens andere polymeren worden toegepast, in het bijzonder die met vrije NHz-groepen, bijvoorbeeld polyacrylamiden die aminoethylgroepen bevatten.

Zoals hiervoor reeds werd vermeld is de geacetaliseerde formylfenylgroep bij voorkeur via een amidebin-5 ding met het polymeer gebonden. Dit verzekert dat de binding van de geacetaliseerde formylfenylgroep aan de hars tijdens de synthese van het polypeptide en gedurende de scheiding stabiel blijft en dat, zoals gewenst, splitsing of scheiding bij de acetaalbinding plaatsvindt, zodat enerzijds de peptidealcohol wordt gevormd en anderzijds de formylfenylgroep aan de hars aanwezig blijft

Desgewenst kan de peptidealcohol verder van de hars worden verplaatst door zogenaamde ’’spacers” 10 tussen de reactieve groepen van het polymeer (in het bijzonder aminogroepen) en de reactieve groepen van het geacetaliseerde formylfenylderivaat (in het bijzonder carboxylgroepen) op te nemen. Voor bepaalde reacties aan de polypeptidealcohol, kan dit geschikt geschieden voor de afscheiding (bijv. oxidatie van cysteinegroepen). In dat geval bevat de groep D of E in formule II bovendien de spacer en is Q, of Q2 de reactieve groep van de spacer.

15 De toegepaste spacer kan bijvoorbeeld een ω-aminocarbonzuur, zoals e-aminocapronzuur, zijn.

In een specifiek geval, bij toepassing van geaminomethyleerd polystyreen, een groep met formule IV en e-aminocapronzuur als de spacer, is Z een groep met formule -CH2-NH-CO-(CH2)5-NH-CO-CH-{0)m- .

20 R

De verbindingen met formule I kunnen worden bereid volgens werkwijzen die gebruikelijk zijn in de in vaste fase uitgevoerde technologie, uitgaande van een verbinding met formule V, waarin A een beschermende groep van de aminofunctie is en de acetaalgroep zich op de m- of p-plaats ten opzichte van groep Z bevindt. Voor dit doel wordt allereerst de beschermende groep A afgesplitst en daarna laat men de vrije 25 aminogroep reageren met het volgende N-beschermde aminozuur enz., totdat alle aminozuren aan de hars in een volgorde overeenkomende met de gewenste peptidealcohol zijn gehecht.

De voor de toegepaste aminozuren of voor de aminoalcohol gekozen aminobeschermende groepen moeten groepen zijn die onder niet-zure omstandigheden worden gesplitst, aangezien onder zure omstandigheden hydrolyse van de acetaalgroep plaatsvindt. De CF3CO- of de FMOC-groep 30 (9-fluorenylmethyloxycarbonyl)groep kunnen bijvoorbeeld als dergelijke aminobeschermende groep worden toegepast. Deze beschermende groepen worden op een wijze die gebruikelijk is in de peptidechemie in een basisch milieu afgesplitst.

Alleen beschermende groepen in de zijketens en de aminobeschermende groep van het laatst toegediende aminozuur mag labiel voor een zuur zijn en wordt dan gelijktijdig van de hars afgesplitst, onder 35 vorming van de peptidealcohol.

Bij voorkeur zijn de Boc-groepen als beschermende groep aanwezig.

Als basen worden bij voorkeur kaliumhydroxide, piperidine of NaBH4 toegepast.

De opbouw van de peptideketen kan op een gebruikelijke wijze geschieden uitgaande van een peptide-gedeelte met vrije aminogroepen en een aminozuur met vrije of geactiveerde carboxylgroepen.

40 De reactie kan worden uitgevoerd onder toevoeging van bijvoorbeeld hydroxybenzotriazool en dicyclo-hexylcarbodiimide.

Verbindingen met formule V kunnen bijvoorbeeld worden bereid door a) reactie van een hars met een aldehydegroep met formule II, waarin de CHO-groep zich op de m- of p-plaats ten opzichte van de Z-substituent bevindt, met een N-beschermde aminoalcohol met formule 45 HX-CH^-CHiNHAj-CHjOH, desgewenst in een geactiveerde vorm, of b) reactie van een hars met formule ©-(DV-O, met een verbinding met formule VI, waarin de acetaalgroep zich op de m- of p-plaats ten opzichte van de 50 Qi-(E)q-groep bevindt en waarin Q, en Q2 twee reactieve groepen zijn, die samen onder vorming van een C^-C^-brug reageren.

De acetalisering van werkwijze a) kan geschieden in aanwezigheid van een zuur als katalysator. Onder geschikte zuren vallen p-tolueensulfonzuur en p-trifluormethylsulfonzuur. Desgewenst kan een trimethylsilyl-groep als beschermende groep voor een vrije alcohol worden toegepast.

55 De veresteringswerkwijze b) kan onder zeer milde omstandigheden worden uitgevoerd, bijvoorbeeld door reactie van een carboxylzuurderivaat met een OH- of NH2-groep bevattende polymeer.

De verbindingen met formule VI kunnen worden verkregen door acetylering van een verbinding met 194729 4 formule «2 - ">><, -0- CHO 5 met een verbinding met formule HX-CHFVChKNHAJ-C^OH .

Het acetyleren kan op de wijze als beschreven voor werkwijze a) worden uitgevoerd.

10 Gedurende het opbouwen en het afsplitsen van de peptidealcohol van de hars, kunnen nog meer reacties worden uitgevoerd, bijvoorbeeld verwijdering van beschermende groepen, bijvoorbeeld S-beschermende groepen, of oxidatie van cysteinegroepen.

Dergelijke reacties kunnen na het afsplitsen van de peptidealcohol in de vloeistoffase worden uitgevoerd. Volgens de synthese van de uitvinding kunnen farmacologisch actieve en andere peptiden die aan het 15 koolstofuiteinde twee alcoholgroepen of een alcohol- en een thiolgroep bevatten, op eenvoudige wijze worden bereid.

In de volgende voorbeelden zijn alle temperaturen uitgedrukt in °C en zijn de [af°D waarden niet-gecorrigeerd. De volgende afkortingen worden toegepast: t-Bu = tert.butyl 20 DCCI = dicyclohexylcarbodiimide

Fmoc = 9-fluorenylmethoxycarbonyl

Thr-ol = threoninolgroep = CH3-CH0H-CH(CH20H)-NH- TFA * trifluorazijnzuur HOBT = N-hydroxybenzotriazool 25

Alle peptiden worden verkregen als polyacetaten-polyhydraten met een peptidegehalte van 70-90%.

Uit HPLC analyses blijkt dat de peptiden minder dan 5% andere peptiden bevatten.

De in de volgende voorbeelden vermelde factor "F’ geeft het peptidegehalte in de verkregen producten aan (F=1 komt overeen met een peptidegehalte van 100%). Het verschil tot 100% [(1-F) x 100] wordt 30 gevormd door azijnzuur en water.

Suikers hebben de α-configuratie, tenzij anders vermeld. Deoxy = Desoxy.

Voorbeeld 1 35 Bereiding van octreotide (= SMS) 1) Bereiding van acetaalanker (N-CF3CO-threoninolacetaal en p-formylfenoxy-azijnzuur)

Men voegde 105 g (1,0 mmol) L-threoninol toe aan 200 ml methanol, die met een stikstofstroom werd geroerd. Aldus verkreeg men een heldere oplossing. Men voegde bij 0°C een oplossing van 200 ml van de methylester van trifluorazijnzuur in 250 ml methanol aan het mengsel toe. Daarna hield men het mengsel 40 onder koelen met een ijsbad op een temperatuur van ongeveer 10°C.

Na 1 uur en 30 min kon geen vrij threoninol meer in het mengsel worden aangetoond. Door concentreren bij 40°C verkreeg men een wit, kristallijn residu.

Het residu werd bij 70°C opgelost in 200 ml ethylacetaat en door toevoegen van hexaan neergeslagen, het mengsel werd tot 0°C afgekoeld, gewassen met hexaan en bij kamertemperatuur gedroogd. Aldus 45 verkreeg men N-trifluoracetylthreoninol.

Men loste 50,3 g (0,25 mol) van het verkregen product op in 1,25 I tetrahydrofuran en druppelde hieraan 75 ml trimethylchloorsilaan toe. Onmiddellijk daarna voegde men een mengsel van 70 ml triethylamine en 250 ml tetrahydrofuran toe. Aldus verkreeg men een witte suspensie, die 4 uren werd geroerd. Het mengsel werd gefiltreerd en het filtraat werd bij 40°C ingedampt, waardoor een olie werd verkregen.

50 De olie werd opgelost in 1,5 I methyleenchloride en bij kamertemperatuur behandeld met porties van 90,4 g p-formylfenoxyazijnzuur. Hieraan voegde men porties van 9 ml van de trimethylsilylester van trifluormethaansulfonzuur toe. Het mengsel werd 24 uren bij kamertemperatuur geroerd, daarna gefiltreerd en het residu werd goed uitgewassen met methyleenchloride.

Het filtraat werd geconcentreerd bij 40°C, waarbij een oranjerood, harsachtig product werd verkregen. Dit 55 product werd gechromatografeerd over silicagel. Het elueren geschiedde met ethylacetaat. Bij concentreren van de van belang zijnde fracties werd de in de titel genoemde verbinding met een zuiverheid van 97% (HPLC) verkregen.

5 194729 , 2) Opbouw van het beschermende octapeptide

Men suspendeerde 17,2 g geaminomethyleerd polystyreen (merk Dow 0,7 gew.% van N overeenkomende met 0,5 mmol van methyleenchloride en dimethylformamide (4:1). Daarna voegde men achtereenvolgens 4,17 g van het eindproduct van stap 1, 1,6 g HOBT en 4,0 g DCCI toe. Nadat men het mengsel 2 uur 5 bij kamertemperatuur had geroerd was de proef volgens Kaiser negatief. Het mengsel werd gefiltreerd en gewassen.

De gewassen hars werd gesuspendeerd in 100 ml tetrahydrofuran en methanol (3:1) en behandeld met porties van 10,4 g natriumboorhydride. Het mengsel werd 6 uur geroerd bij kamertemperatuur, gefiltreerd en de hars werd gewassen. De hars werd gesuspendeerd in een mengsel van methyleenchloride en dimethyl-10 formamide (4:1) en men voegde 5,5 g Fmoc-Cys (S-t-Bu)OH, 1,74 g HOBT en 3,6 g DCCI toe. De beschermende Fmoc-groep werd met piperidine (2 x 20 min. contacted) afgesplitst.

Op overeenkomstige wijze werden in achtereenvolgende cycli de volgende N-Fmoc beschermde aminozuren gekoppeld onder toepassing van HOBT/DCCI-ThrOH;Lys (BOC)-OH; D-TrpOH, Phe-OH, Cys(S-tBu)OH en D-Phe-OH, ter verkrijging van de Fmoc beschermde octapeptidehars. De uiteindelijke 15 grootte bedroeg 0,26 mmo/g.

3) Oxidatie en afsplitsing

De verkregen hars werd gesuspendeerd in 100 ml van een mengsel van gelijke delen trifluorethanol en methyleenchloride en behandeld met 50 ml tributylfosfine. Dit mengsel werd 70 uur geroerd bij kamertemperatuur. Het mengsel werd gefiltreerd, gewassen en behandeld met 100 ml van een 1:1 mengsel van 20 tetrahydrofuran en een 1 N-aminoacetaatoplossing. Daarna voegde men 1,1 ml van een 30%-ige waterige waterstofperoxideoplossing toe. Het mengsel werd 24 uur geroerd bij kamertemperatuur. De hars werd gewassen. Het mengsel werd behandeld met 20 ml trifluorazijnzuur, 80 ml methyleenchloride, 10 ml water en 2 ml thioanisool. Het mengsel werd 2 uur geroerd, daarna gefiltreerd en gewassen met trifluorazijnzuur en methyleenchloride. Aan het filtraat voegde men 200 ml diethylether toe. Het verkregen neerslag werd 25 afgefiltreerd. Het residu werd opgelost in een waterige buffer en gedemineraliseerd, bijvoorbeeld onder toepassing van Duolite. De oplossing werd als acetaat gevriesdroogd, waardoor de in de titel genoemde verbinding als acetaat werd verkregen.

Voorbeeld 2 30

Bereiding van hP -[a-glucosyl( 1-4)deoxy-fructosyi] DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol (octreotide)

Men bereidde 393 g van het octapeptide gebonden aan de hars op de wijze als beschreven in het hiervoor gegeven voorbeeld 1. De cysteine beschermende groepen werden reductief verwijderd. De peptidebinding aan de hars werd met waterstofperoxide in een mengsel van tetrahydrofuran en water geoxideerd tot het 35 cyclische octapeptide.

Na wassen in tetrahydrofuran en daarna dimethylformamide werd de peptidehars geschud in 3600 ml van een mengsel van dimethyhlformamide en azijnzuur (8:1). De suspensie werd behandeld met 526 g D(+) maltosemonohydraat. Het mengsel werd verwarmd tot 60°C en 18 uur bij deze temperatuur geroerd.

Het mengsel werd afgekoeld en de peptidehars werd afgefiltreerd en achtereenvolgens gewassen met 40 dimethylformamide en methanol. Daarna werd het gewassen met methyleenchloride. Het peptide werd vervolgens gedurende 1 uur van de hars afgesplitst met een mengsel van 2900 ml methyleenchloride en 716 ml trifluorazijnzuur met een spoor water.

Vervolgens werd het filtraat geroerd en behandeld met porties van 597 g natriumcarbonaat, 30 min. geroerd en gefiltreerd. Het residu werd gewassen met methyleenchloride en methanol.

45 Het filtraat werd drooggedampt.

Het werd gedemineraliseerd onder toepassing van een niet-gefunctionaliseerde polystyreenkolom zoals Duolite (Rohmb Haas AG) of omgekeerde-fase HPLC materiaal, zoals silicagel behandeld met siloxaan en met langketenige vetalcoholgroepen (bijvoorbeeld Labomatic, Zwitserland, merk HB-SIL-18-20-100). De zuivere, in de titel genoemde verbinding, werd verkregen.

Claims (7)

194729 6

1. Werkwijze voor het bereiden van een peptidealcohol met formule CHR,-XH 5 / Y-CO-NH-CH \ ch2oh waarin 10. de rest van een peptidealcohol, die eventueel beschermende groepen bevat, voorstelt, R, waterstof of methyl weergeeft, en X O of S is, met het kenmerk, dat een hars met formule I, die de peptidealcohol bevat, waarin ® de rest van een onoplosbare, synthetische hars is en 15. een directe binding of een groep die de hars met geacetaliseerde formylfenylgroep verbindt, voorstelt, waarin de geacetaliseerde CHO-groep meta of para t.o.v. de Z-groep is geplaatst en een aantal geacetaliseerde formylfenylgroepen met een molecuul van het harspolymeer zijn verbonden, onder zure omstandigheden wordt gehydrolyseerd.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin 20 Z de groep -CH2-NH-C0-CH-(0)m R waarin R waterstof of methyl voorstelt, 25 m 0 of 1 is, en ® een polystyreengroep is.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarin X O is en R1 methyl is.

4. Werkwijze voor het bereiden van octreotide, met het kenmerk, dat men de werkwijze volgens een der conclusies 1-3 toepast.

5. Verbinding met formule I, waarin ® de rest van een onoplosbare, synthetische hars is, Z een directe binding of een groep die de hars met de geacetaliseerde formylfenylgroep verbindt, voorstelt, X O of S is,

35 R1 waterstof of methyl is, en Y de rest van een peptidealcohol is, die beschermende groepen kan bevatten, waarbij de geacetaliseerde CHO-groep meta of para ten opzichte van de Z-groep is geplaatst en een aantal (geacetaliseerde) formylfenylgroepen aan een molecuul van het harspolymeer is gebonden, ten gebruike bij de werkwijze van conclusie 1. Hierbij 1 blad tekening