NL8104079A - Werkwijze voor het veresteren van alfa-l-asparty-l-fenylalanine. - Google Patents
Werkwijze voor het veresteren van alfa-l-asparty-l-fenylalanine. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8104079A NL8104079A NL8104079A NL8104079A NL8104079A NL 8104079 A NL8104079 A NL 8104079A NL 8104079 A NL8104079 A NL 8104079A NL 8104079 A NL8104079 A NL 8104079A NL 8104079 A NL8104079 A NL 8104079A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- phenylalanine
- aspartyl
- alcohol
- serine
- methanol
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 26
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 title claims description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 22
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 22
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 14
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 claims description 11
- 230000032050 esterification Effects 0.000 claims description 11
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 claims description 11
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 claims description 11
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 claims description 8
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 claims description 8
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 claims description 5
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 5
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 4
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 claims description 4
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 claims description 3
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 claims 1
- 229910014033 C-OH Inorganic materials 0.000 claims 1
- 241000511343 Chondrostoma nasus Species 0.000 claims 1
- 229910014570 C—OH Inorganic materials 0.000 claims 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 claims 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims 1
- -1 aspartyl-carboxyl group Chemical group 0.000 description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 16
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 6
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000005690 diesters Chemical class 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N acetylacetone Chemical compound CC(=O)CC(C)=O YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010051873 alkaline protease Proteins 0.000 description 2
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 2
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 2
- 229910000039 hydrogen halide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012433 hydrogen halide Substances 0.000 description 2
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 2
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004453 alkoxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDFRDWFLWVCOGP-UHFFFAOYSA-N carbonothioic O,S-acid Chemical compound OC(S)=O HDFRDWFLWVCOGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- ZZVUWRFHKOJYTH-UHFFFAOYSA-N diphenhydramine Chemical group C=1C=CC=CC=1C(OCCN(C)C)C1=CC=CC=C1 ZZVUWRFHKOJYTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005982 diphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])(*)C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 150000002081 enamines Chemical class 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003187 heptyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229910000042 hydrogen bromide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007327 hydrogenolysis reaction Methods 0.000 description 1
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 125000005740 oxycarbonyl group Chemical group [*:1]OC([*:2])=O 0.000 description 1
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
- C07K5/06113—Asp- or Asn-amino acid
- C07K5/06121—Asp- or Asn-amino acid the second amino acid being aromatic or cycloaliphatic
- C07K5/0613—Aspartame
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Seasonings (AREA)
Description
Λ i % VO 2320
Werkwijze voor het veresteren van o^-L-aspartyl-L-fenylalanine.
De uitvinding betreft een werkwijze voor het selectief ver-esteren van «-L-asparty 1-L-feny lal anine tot de overeenkomstige al-kylesters onder toepassing van een proteolytisch enzym met specifieke esterase-activiteit.
5 De verestering van «-L-aspartyl-L-fenylalanine met chemische middelen is beschreven in Amerikaanseoctrooischriften 3.933.781 en h.173.562.
Een nadeel van chemische methoden is dat de verestering optreedt bij de aspartyl-carboxylgroep en de fenylalaninecarbozylgroep, 10 zodat ongewenste nevenprodukten met de formule 1 (hieronder aange duid als de diëster) en formule 2 (hieronder aangeduid als de as-partylester) worden gevormd.
De diëster en de aspartylester moeten met zuiveringstrappen worden verwijderd om het gewenste produkt te verkrijgen.
15 Vroegere enzymatische veresteringsmethoden zijn gericht ge weest op de verestering van afzonderlijke aminozuren. Men heeft daarbij echter nooit te maken gehad met de selectieve veresterings-problemen die optreden bij dipeptiden, speciaal «-L-aspartyl-L-fe-nylalanine, dat meer dan ëën carbonzuurgroep bezit.
20 B.v. is in Biotechnology and Bioengineering 17. 1627 - 1637 (1975) de verestering van een enkel aminozuur, W-acetyltyrosine, beschreven onder toepassing van geïmmobiliseerde ehymotrypsine of subtilisine Carlsberg in de vrije, ongemodificeerde vorm in een oplosmiddelsysteem van water, ethanol en glycerol.
25 Een nadeel van deze methode was dat belangrijke hoeveelheden van de glycerolester van het aminozuur werden gevormd.
Biotechnology and Bioengineering 19, 1351 - 1361 (1977) beschrijft de verestering van een enkelvoudig aminozuur, ÏT-acetyltryp-tofan onder toepassing van geïmmobiliseerd ehymotrypsine in een 30 tweefasensysteem van water en een niet met water mengbaar oplosmiddel 81 0 4 0 79 ‘ % - 2 - t.w. chloroform.
Een voordeel van de uitvinding is dat de carboxylgroep van het fenylalaninestuk selectief wordt geallieerd door een enzymatische verestering in een een-fasesysteem waarbij de o^-L-aspartyl-5 L-fenylalaainealkylesters worden gevormd zonder dat ongewenste di- esters en aspartylesters worden gevormd.
Dit wordt bereikt door het dipeptide met een alcohol bij aanwezigheid van een serine-alkalische-proteinase in contact te brengen, welke laatste een esterase is met een voorkeur voor aroma-10 tische aminozuren.
De uitvinding betreft dus een werkwijze voor het bereiden van ga^-Ii-aspartyl-L-fenylalaninealkylesters, die bruikbare zoetmid-delen vormen. In het bijzonder wordt het dipeptide-«L-L-asparty 1-L-fenylalanine veresterd door het dipeptide in contact te brengen 15 met een alcohol bij aanwezigheid van een proteolytisch enzym met een specifieke esteraseactiviteit in een water-alcohol-oplosmiddel-systeem, waarin de alcoholconcentratie voldoende is om de hydroly-tische activiteit van het enzym om te keren. Specifieke esteraseactiviteit betreft het vermogen van een proteolytisch enzym omde 20 carbonzuurgroep van het fenylalaninestuk selectief te alkyleren.
cK-L-aspartyl-L-fenylalanine-alkylesters^die aldus zijn geproduceerd, zijn bruikbaar als zoetmiddelen. Deze toepassing is beschreven in Amerikaans octrooischrift 3.^92.131.
Ook kan een H-beschermd-oC-L-aspartyl-L-fenylalanine vol-25 gens deze methode worden veresterd tot overeenkomstige E-beschermde- -L-aspartyl-L-fenylalaninealkylesters. De H-beschermende groep kan volgens elke gebruikelijke techniek worden verwijderd waardoor de c^-L-aspartyl-L-fenylalaninealkylester vrijkomt. Een voorkeurs-E-schermgroep voor toepassing bij de uitvinding, is de carbobenzosy-30 groep.
De uitvinding betreft dus een werkwijze voor het selectief veresteren van oC-L-aspartyl-L-fenylalanine door ©C-L-aspartyl-L-fenylalanine of E-bes chermd- oc-L-aspartyl-L-fenylalanine met een alcohol in contact te brengen bij aanwezigheid van een proteoly-35 tisch enzym met specifieke esterase-activiteit. Het dipeptide wordt 8104079 τ .. »^ri---------. ------* - - ,ι r r π- -- ------------ - ----- I i —____ ____ ..... .....
.¾ - 3 - met het enzym in contact gebracht in een medium van water en alcohol, waarbij de alcoholconcentratie voldoende is om de hydrolyti-sche activiteit om te keren.
De uitvinding verschaft voorts een werkwijze voor het ver-5 ester en van ci-L-aspartyl-L-f enylalanine door 0C-L-asparty 1-L-fenyl- alanine of H-bes chermd- o£-L-aspartyl-L-fenylalanine met een alcohol in contact te brengen bij aanwezigheid van een effectieve ver-esterende hoeveelheid van een serine-basische proteinase in een water-alcoholmedium waarin de alcoholconcentratie voldoende is om 10 de hydrolytische activiteit van de serine-basische-protelnase om te keren. Wanneer H-beschermd-oc-L-aspartyl-L-fenylalanine wordt ver-esterd, wordt de H-schermgroep na de verestering verwijderd, waardoor de vrije o<-L-aspartyl-L-fenylalaninealkylester wordt gevormd.
Voorkeurs alcoholen komen overeen met de formule 15 R-OH
waarin H alkyl is met 1 - 7 koolstof at omen. Voorbeelden van dit soort alkylgroepen zijn methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl en de vertakte isomeren daarvan.
De aminogroep van c<-L-aspartyl-L-f enylalanine kan op een 20 gebruikelijke wijze worden beschermd. Geschikte schermgroepen om vatten maar zijn niet beperkt tot, aryl-alkylgroepen, zoals dife-nylmethyl of trifenylmethyl, al of niet gesubstitueerd door halogeen, nitro, alkyl of alkoxy, b.v. benzhydryl, trityl en di-p-me?-thoxybenzhydryl; acylgroepen, zoals formyl, trifluoracetyl, ftalo-25 yl, benzeensulfenyl en o-nitrofenylsulfenyl; groepen afgeleid van koolzuur of thiokoolzuur, zoals carbobenzoxygroepen al of niet gesubstitueerd in de benzeenring door halogeenatomen, nitrogroepen of alkyl-, alkoxy- of carbalkoxygroepen, b.v. carbobenzoxy, p-broom-carbobenzoxy of p-chloorcarbobenzoxy, p-nitrocarbobenzoxy en p-me-30 thoxycarbobenzoxy; gekleurde benzyloxycarbonylgroepen zoals p-fenyl- azobenzyloxycarbonyl en p- (p-methoxyfenylazo )benzyloxycarbonyl, tolyloxycarbonyl, 2-fenyl-2-propoxycarbonyl, 2-tolyl-2-propo2ycarbonyl en 2-(parabifenylyl)-2-propoxycarbonyl; en alifatische oxy-carbonylgroepen, zoals tert-butoxycarbonyl, alkyloxycarbonyl, cy-35 clopentyloxycarbonyl, tert-amyloxycarbonyl. Een E-schermgroep met 8104079 - k - bijzondere voorkeur bij de uitvinding is de carbobenzoxygroep.
De aminogroepen kunnen ook worden beschermd door een vorming van enaminen,.verkregen door een reactie van de aminogroep met 1,3-diketonen,. b.v. benzqylaceton of acetylaceton.
5 Schermgroepen worden gemakkelijk verwijderd door b.v, hydro- genolyse (b.v. bij aanwezigheid van een palladium-zwart-katalysa-tor), behandeling met een waterstofhalogenide.(zoals waterstofbro-mide, waterstoffluoride of waterstofchloride) .in azijnzuur, of een behandeling met trifluorazijnzuur.
10 De reactie waarbij de esterbinding wordt gevormd, kan worden uitgevoerd in een waterige-buffer-alcoholoplossing met een pH waarbij de enzymactiviteit behouden blijft. Deze is gelegen tussen ca. pH k en T voor serine-basische protelnasen. Karakteristieke buffer-oplossingen omvatten natriumpyrofosfaatbufferoplossing, citroenzuur-15 bufferoplossingen, azijnzuurbufferoplossingen of tris-HCl-buffer- oplossingen.
De bij de uitvinding gebruikte esterase is een serine-basi-sche-proteinase. Deze enzymen vertonen een hoge; esterase-activiteit en hebben een selectieve invloed op aromatische aminozuren. Karaktë-20 ristieke serine-basiscbe-proteinasen omvatten subtilisine en alka lische proteinasen uit diverse stammen van Bacillus, Aspergillus, Streptomvces. Penicillium. en Arthrobacter. Een voorkeurs-serine-ba-sische-protexnase is subtilisine Carlsberg, een handelsprodukt.
Een katalytische hoeveelheid van het enzym wordt bij de reae— 25 tie gebruikt, bij voorkeur 10 - 500 mg per mmol cC-L-aspartyl-L-fe- nylalanine of N-bes chermd-c<-L-asparty1-Ir-fenylalanine. Een calcium-zout mag eveneens worden toegevoegd om de enzymactiviteit te ondersteunen.
Het enzym kan aanwezig zijn in de vrije vorm of zijn geïmmo-30 biliseerd door binding aan een passende drager, zoals poreus glas, een polyacrylamidegel, carboxymethylcellulose of een aminoëthylcel-lulose. "Immobilized Enzymes", deel UI, Methods in Enzymology, ed. Klaus Mosback, beschrijft diverse methoden voor hét immobiliseren van enzymen, 35 De gebruikte reactietemperatuur is gewoonlijk gelegen tussen 8104079 - 5 - 10 en 50°C, wat voldoende is om de enzymactiviteit te handhaven.
Een voorkeurstraject is 20 - ^0°C.
- De reactie wordt uit gevoerd in een medium van water en alcohol» waarbij de alcoholconcentratie voldoende moet zijn om de este-5_ . rase-activiteit van het enzym om te keren. De alcoholconcentratie kan zijn gelegen tussen 10 en 90 vol.#. Een voorkeursalcoholconcen-tratie ligt tussen 30 en T0 vol.#. Een zeer gunstige alcoholconcentratie ligt tussen 50 en 60 vol.#', waarbij 60 vol.# alcohol optimaal is.
10 Volgens een zeer gunstige uitvoeringsvorm van de uitvinding is de serine-basische-proteinase subtilisine Carlsberg, een proteinase met een specifieke esterase-activiteit^terwijl de alcohol bij voorkeur methanol is en aanwezig in een concentratie van 60 vol.#. Het water-alcoholmengsel bevat licht 5 »0 mM calciumchloride en 15 heeft een pH van 5,0_, terwijl de reactie wordt uitgevoerd bij een temperatuur van 25°C.
Onder deze reactievoorwaarden verloopt de reactie bijzonder vlot en glad en wel bij voorkeur in 1 - 260 uren. Een voorkeursreac-tieduur is 1 - 90 uren. Het reactieprodukt wordt hèt gemakkelijkst 20 uit het reactiesysteem geïsoleerd door standaard-chroraatografische technieken of andere in de techniek bekende methoden.
De uitvinding wordt aan de hand van de volgende voorbeelden nader toegelicht. De verhouding tussen gew.dln en vol.dln is die van kg tot liters.
25 Voorbeeld I
Subtilisine Carlsberg (protease type VIII, Sigma Chemical Co.} werd opgelo3t in gedestilleerd water en wel in een concentra-tie van Uo g/dar en gedialyseerd tegen gedestilleerd water van 5 C. 0,1 vol.dl van deze:enzymoplossing werd gemengd met 0,9 vol.dln van 30 een water-methanqloplossing met daarin 0,0056 gew.dln of-L-aspartyl-
Ir-fenylalanine. De water-methanoloplossing werd bereid door 0,6 vol.dln methanol te mengen met 0,075 vol.dln 0,33 M natriumacetaat, 0,225 vol.dln 0,33 M azijnzuur en 0,002 vol.dln 2,5 M calciumchlo-rideoplossing Alvorens het enzym toe te voegen werd de water-35 methanoloplossing gedurende 1 minuut sonisch behandeld om het C<-Ic- 8104079
W
- 6 - aspartyl-L-fenylalanine goed te dispergeren. De totale pH werd met verdund zoutzuur op pH 5,0 gebracht. Het uiteindelijke reactiemeng-
O
sel met daarin 4 g/dar enzym, 5,0 mM calciumchloride, 0,1 M azijn-zuurbuffer, 60% methanol en 0,02 M o(-Ii-aspartyl-L-fenylalanine 5 liet men bij ca. 25°C onder continu roeren gedurende 4 dagen reage ren. Het reactiemengsel werd vervolgens door een Sephadex LH-20 kolom geleid om het .enzym van het dipeptide te scheiden. De dipep-tidefracties werden vervolgens samengevoegd en met een waterstof-halogenide volgens de Amerikaanse octrooischriften 3.798.207 en 10 4.173.562 behandeld om de oC-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester met formule 3 neer te slaan en te zuiveren.
Voorbeeld IX
Voorbeeld I werd herhaald met dit verschil, dat een geïmmobiliseerd enzym als katalysator werd toegepast. Dit enzym was cova-15 lent geïmmobiliseerd op met cyaanbromide geactiveerde DEAE-cellulo- se. De DEAE-cellulose (voor ge zwollen DE52, Whatman) werd geactiveerd door- 0,075 gew.dln te wassen met 0,1 M natriumbicarbonaat en vervolgens te laten reageren met 3 vol.dln cyaanbromideoplossing
O
(25 mg/cnr). De pH werd gebracht op 11,0 en pp deze waarde gehou-20 den met 2 M natriumhydroxide; zachtjes werd gedurende 6 minuten bij 25°C geroerd. Het gel werd af gefiltreerd en gewassen met 100 vol.dln 0,1 M natriumbicarbonaatoplossing. 0,025 gew.dln sübtilisine Carlsberg, opgelost in 0,25 vol.dln 0,1 M natriumbicarbonaatoplos-_ sing en 4 uren gedialyseerd tegen dezelfde buffer bij 5°Cj; hierna ward 25 het gemengd met een door cyaanbromide geactiveerd gel in een gesloten polypropeenbuis (onder argon) en wel gedurende 17 uren bij 5°C.
Het gebonden enzym werd vervolgens gewassen met gedestilleerd water en omgezet met 5 vol.dln 1 M ethanolamine (pH 9,0) onder zachtjes roeren gedurende 2 uren bij 25°C. Het gel werd tweemaal met 30 gedestilleerd water gewassen en hersuspendeerd in 0,3 vol.dln ge destilleerd water.
Deze geïmmobiliseerde enzymsuspensie werd vervolgens gemengd met 0,7 vol.dln water-methanolmengsel en wel zodanig, dat het uiteindelijke mengsel dezelfde concentratie aan stoffen bevatte als 35 bij voorbeeld ï. De reactie werd voorts uitgevoerd als in voor- 8104079 \ - τ * "beeld I "beschreven met dit verschil, dat het geïmmobiliseerde enzym door centrifugeren werd verwijderd, alvorens men het produkt zuiverde.
Voorbeeld III
5 Vervangt men de methanol bij de voorbeelden I en II door equivalente hoeveelheden ethanol en gaat men vervolgens nauwkeurig als in deze voorbeelden beschreven te werk, dan verkrijgt men de oC-L-aspartyl-L-fenylalanine-ethylester met formule U.
Voorbeeld IV
10 Vervangt men de öC-L-aspartyl-Ic-fenylalanine volgens de voorbeelden I en II door 0,0125 gev.dln N-carbobenzoxy-c<-L-aspar-tyl-L-fenylalanine, en gaat men verder analoog te werk, dan verkrijgt men de N-c arb obenz oxy-oC-L- aspartyl-L-f enylalaninemet hyl-ester. Reductie van deze verbinding volgens Bergmann en Zervas 15 Ber. 65% 1192 (1932) verwijdert de N-beschermende carbobenzoxy- groep en doet de vrije oC-L-aspartyl-L-fenylalanine-methylester ontstaan.
8104079
Claims (8)
1. Werkwijze voor het veresteren van c<-L-aspartyl-L-fenylala-nine door o(.-Ir-aspartyl-L-fenylalanine met een alcohol hij aanwezigheid van een effectieve hoeveelheid van een proteolytisch enzym . met een specifieke esterase-activiteit in contact te brengen, en 5 wel in een water-alcoholmedium met een pE U - 7» waarbij de alcohol- concentratie voldoende is om de hydrolytische activiteit van de protease om te keren..
2. Werkwijze, volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het proteolytisch enzym met specifieke esteraseactiviteit een serine-ba- 10 sische-proteïnase is.
3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de serine^ basische-protexnase het subtilisine Carlsberg is. b. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de alcohol methanol is en wel in een concentratie van 10 - 90%. 15 5· .Werkwijze volgens conclusie b, met het kenmerk, dat de seri- ne-basische-protexnase subtilisine Carlsberg is.
6. Werkwijze voor het veresteren van od-L-asparty 1-L-fenylalani-ne door oC -L-aspartyl-L-fenylalanine met methanol bij aanwezigheid van subtilisine Carlsberg als serine-alkalische proteinase in een 20 water-methanolmedium met een pH 5 j0 en een methanolconcentratie van 60% in contact te brengen. 7» Werkwijze voor het veresteren van oi-L-aspartyl-L-fenylalanine met het kenmerk, dat men een E-beschermd-oC-L-aspartyl-L-fenyl-alanine in contact brengt met een alcohol bij aanwezigheid van 25 een effectieve hoeveelheid van een protease met een specifieke esterase-activiteit in een water-alcoholmedium met een pH van b - 7, waarin de alcoholconcentratie voldoende is om de hydrolytische activiteit van de protease om te keren, gevolgd door verwijdering van de E-schermgroep.
8. Werkwijze volgens conclusie 7* met het kenmerk, dat het pro- teolytische enzym met specifieke esterase-activiteit een serine-basische-proteïnase is. 8104079 , 9 - 9* Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat de seri-ne-basische-protease het subtilisine Carlsberg is.
10. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat de alcohol methanol is en deze in een concentratie van 10 - 90% wordt toe- 5 gepast.
11. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat de se-rine-basische proteinase subtilisine Carlsberg is.
12. Werkwijze voor het veresteren van oc-L-asparty 1-L-fenylala-nine door ff-carbobehzozy- o6-L-aspartyl-L-fenylalanine in contact 10 te brengen met methanol bij aanwezigheid van subtilisine Carlsberg als serinè-basische proteinase in een water-methanolmedium bij een pH van 590, waarbij de alcoholconcentratie 60% bedraagt, gevolgd door verwijdering van de carbobenzoxy-schermgroep. 8104079 a~ '*?· O NH2-CH-C-NH-CH-C-0-alkyl 1. O CH~ I2 o o II CH -C-O-alkyl 2. ii I O CH i2 0 o CH-3-C-OH o I II NH -CH-C-NH-CH-C-OCH, 3. 2. ii I O CH. 0 o II CHo-C-OH O NH -CH-C-NH-CH-COCH-CH, fc. 2. ii I O CH- 1 2 O G.D. Searle & Co. · 8104079
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/183,556 US4293648A (en) | 1979-12-12 | 1980-09-02 | Process for esterification of α-L-aspartyl-L-phenylalanine |
| US18355680 | 1980-09-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8104079A true NL8104079A (nl) | 1982-04-01 |
Family
ID=22673315
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8104079A NL8104079A (nl) | 1980-09-02 | 1981-09-02 | Werkwijze voor het veresteren van alfa-l-asparty-l-fenylalanine. |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4293648A (nl) |
| JP (1) | JPS57115196A (nl) |
| AU (1) | AU558330B2 (nl) |
| BE (1) | BE890189A (nl) |
| CA (1) | CA1161381A (nl) |
| CH (1) | CH651067A5 (nl) |
| DE (1) | DE3134807A1 (nl) |
| ES (1) | ES505105A0 (nl) |
| FR (1) | FR2489321A1 (nl) |
| GB (1) | GB2084156B (nl) |
| IE (1) | IE51537B1 (nl) |
| NL (1) | NL8104079A (nl) |
| SE (1) | SE450709B (nl) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4664988A (en) * | 1984-04-06 | 1987-05-12 | Kureha Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Fuel cell electrode substrate incorporating separator as an intercooler and process for preparation thereof |
| IT1176332B (it) * | 1984-06-27 | 1987-08-18 | Erba Farmitalia | Procedimento per al preparazione di peptidi |
| DE3690076T1 (nl) * | 1985-02-15 | 1987-03-12 | ||
| GB8621377D0 (en) * | 1986-09-04 | 1986-10-15 | Celltech Ltd | Enzymatic process |
| US5116741A (en) * | 1988-04-12 | 1992-05-26 | Genex Corporation | Biosynthetic uses of thermostable proteases |
| US5214145A (en) * | 1988-08-31 | 1993-05-25 | Eastman Kodak Company | Trisubstituted piperazin-2,5-diones |
| US5144073A (en) * | 1988-08-31 | 1992-09-01 | Hubbs John C | Process for preparation of dipeptides |
| US4992552A (en) * | 1988-08-31 | 1991-02-12 | Eastman Kodak Company | Process for preparation of amino acids |
| DE3839379A1 (de) * | 1988-11-22 | 1990-05-23 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von tripeptiden |
| US5002872A (en) * | 1989-05-10 | 1991-03-26 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Enzyme mediated coupling reactions |
| JPH0532999U (ja) * | 1991-10-02 | 1993-04-30 | ブラザー工業株式会社 | 金属粉末成形体の脱脂焼結用トレー |
| US6627431B1 (en) | 2000-05-12 | 2003-09-30 | The Nutrasweet Company | Chemoenzymatic synthesis of neotame |
-
1980
- 1980-09-02 US US06/183,556 patent/US4293648A/en not_active Expired - Lifetime
-
1981
- 1981-09-01 CA CA000384993A patent/CA1161381A/en not_active Expired
- 1981-09-01 IE IE2014/81A patent/IE51537B1/en not_active IP Right Cessation
- 1981-09-01 GB GB8126488A patent/GB2084156B/en not_active Expired
- 1981-09-01 FR FR8116652A patent/FR2489321A1/fr active Granted
- 1981-09-01 SE SE8105155A patent/SE450709B/sv not_active IP Right Cessation
- 1981-09-01 ES ES505105A patent/ES505105A0/es active Granted
- 1981-09-02 NL NL8104079A patent/NL8104079A/nl active Search and Examination
- 1981-09-02 BE BE0/205845A patent/BE890189A/fr not_active IP Right Cessation
- 1981-09-02 DE DE19813134807 patent/DE3134807A1/de active Granted
- 1981-09-02 JP JP56137102A patent/JPS57115196A/ja active Granted
- 1981-09-02 CH CH5647/81A patent/CH651067A5/de not_active IP Right Cessation
- 1981-09-04 AU AU74957/81A patent/AU558330B2/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2489321B1 (nl) | 1984-10-19 |
| CH651067A5 (de) | 1985-08-30 |
| AU558330B2 (en) | 1987-01-29 |
| ES8206624A1 (es) | 1982-08-16 |
| IE51537B1 (en) | 1987-01-07 |
| SE8105155L (sv) | 1982-03-03 |
| GB2084156B (en) | 1983-09-21 |
| DE3134807A1 (de) | 1982-05-06 |
| JPH029799B2 (nl) | 1990-03-05 |
| GB2084156A (en) | 1982-04-07 |
| BE890189A (fr) | 1982-03-02 |
| FR2489321A1 (fr) | 1982-03-05 |
| IE812014L (en) | 1982-03-02 |
| AU7495781A (en) | 1982-03-25 |
| SE450709B (sv) | 1987-07-20 |
| US4293648A (en) | 1981-10-06 |
| JPS57115196A (en) | 1982-07-17 |
| DE3134807C2 (nl) | 1990-06-28 |
| CA1161381A (en) | 1984-01-31 |
| ES505105A0 (es) | 1982-08-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4284721A (en) | Method for manufacturing dipeptides | |
| Filippova et al. | L-Pyroglutamyl-L-phenylalanyl-L-leucine-p-nitroanilide—a chromogenic substrate for thiol proteinase assay | |
| NL194729C (nl) | Werkwijze voor de bereiding van peptidealcoholen via vaste fase. | |
| Petra | [31] Bovine procarboxypeptidase and carboxypeptidase A | |
| Frére et al. | [51] Exocellular dd-carboxypeptidases-transpeptidases from Streptomyces | |
| NL8104079A (nl) | Werkwijze voor het veresteren van alfa-l-asparty-l-fenylalanine. | |
| McDonald et al. | Partial purification and characterization of an ovarian tripeptidyl peptidase: a lysosomal exopeptidase that sequentially releases collagen-related (Gly-Pro-X) triplets | |
| EP0149594A2 (en) | Enzymatic coupling of n-formyl amino acids and/or peptide residues | |
| Shechter et al. | Sulfenylation of tryptophan-62 in hen egg-white lysozyme | |
| JPS6050200B2 (ja) | α‐Ｌ‐アスパルチル‐Ｌ‐フエニルアラニンメチルエステルの改良された製法 | |
| Heizer et al. | Hydrolases in the mucosa of rat small intestine for phenylalanine-containing dipeptides | |
| Stepanov et al. | Subtilisin and α-chymotrypsin catalyzed synthesis of peptides containing arginine and lysine p-nitroanilides as c-terminal moieties | |
| DK157889B (da) | Fremgangsmaade til esterificering af alfa-l-aspartyl-l-phenylalanin | |
| EP0092829A2 (en) | Process for semi-synthesis of human insulin and alkaline protease for use therein | |
| Schmer et al. | Purification of Indolyl-3-alkane α-hydroxylase by affinity chromatography on indolyl-agarose columns | |
| Royer | [15] Deblocking in peptide synthesis with immobilized carboxypeptidase Y | |
| JP3118331B2 (ja) | シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素の製造方法 | |
| JPS6258712B2 (nl) | ||
| JPH07116374B2 (ja) | 青色系色素組成物の製造法 | |
| JP3061329B2 (ja) | シクロヘキサンカルボン酸フェニルエステル加水分解酵素 | |
| JPH0751075B2 (ja) | Ｌ−アスパルチル−ｌ−フェニルアラニンアルキルエステルの製造方法 | |
| Yonezawa et al. | Photoaffinity labeling of pepsin. | |
| JPS6228677B2 (nl) | ||
| KEIL-DLOUHÁ et al. | On the Mechanism of the Interaction between Basic Pancreatic Trypsin Inhibitor and Trypsin | |
| JPS6244920B2 (nl) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A85 | Still pending on 85-01-01 | ||
| BA | A request for search or an international-type search has been filed | ||
| BB | A search report has been drawn up | ||
| BC | A request for examination has been filed | ||
| BN | A decision not to publish the application has become irrevocable |