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KR20100091950A - Ｂ7 패밀리 구성원 ｚＢ7Ｈ6 및 관련된 조성물 및 방법 - Google Patents

Ｂ7 패밀리 구성원 ｚＢ7Ｈ6 및 관련된 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20100091950A
KR20100091950A KR1020107009263A KR20107009263A KR20100091950A KR 20100091950 A KR20100091950 A KR 20100091950A KR 1020107009263 A KR1020107009263 A KR 1020107009263A KR 20107009263 A KR20107009263 A KR 20107009263A KR 20100091950 A KR20100091950 A KR 20100091950A
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KR
South Korea
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zb7h6
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polypeptide
cell
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카메론 에스. 브랜트
제이콥 제이. 케네디
원펭 쑤
유진 씨. 이
브라이언 에이. 폭스
제렌 가오
팔라버 브이. 시바쿠마
Original Assignee
지모제넥틱스, 인코포레이티드
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Publication date
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Abstract

본원에는 새롭게 확인된 B7 패밀리 구성원이 개시되는데, 그것은 NK 세포 야기 수용체에 대한 카운터-수용체, NKp30으로서 기능한다. 또한 zB7H6과 NKp30과의 상호작용을 기초로 한 NKp30-중재된 NK 세포 활성을 조절하기 위한 방법 및 조성물뿐 아니라 관련된 선별 방법이 개시된다. 나아가 본원에는 항-zB7H6 항체뿐 아니라 치료제에 포합된 항-ZB7H6 항체를 포함하는 항체-약물 포합체, 그러한 항체 및 항체-약물 포합체를 zB7H6-발현 세포에 대하여 치료 효과를 나타내기 위해 사용하는 방법이 개시된다.

Description

Ｂ7 패밀리 구성원 ｚＢ7Ｈ6 및 관련된 조성물 및 방법{B7 FAMILY MEMBER zB7H6 AND RELATED COMPOSITIONS AND METHODS}
B7 패밀리
포지티브 및 네거티브 공자극 신호는 림프구 활성의 조절에 중요한 역할을 수행하며, 이들 신호를 중재하는 분자들은 면역조절제에 대하여 효과적인 표적이 되는 것으로 확인되었다. 예를 들어 항원-제공 세포 (APC)상에서 B7-1 또는 B7-2와 상호작용할 때, 원형(prototypic) T 세포 공자극 분자인 CD28은 T 세포 수용체 (TcR) 맞물림에 대한 반응으로 T 세포 증식과 분화를 촉진하는 신호를 방출하는 한편, CD28 동족체인 세포독성 T 림프구 항원-4 (CTLA-4)는 T 세포 증식 및 이펙터 기능의 억제를 중재한다 (Chambers et al., Ann . Rev . Immunol ., 19:565-594, 2001; Egen et al., Nature Immunol ., 3:611-618, 2002 참조).
B7 패밀리와 상동성을 가지는 여러 개의 새로운 분자가 발견된 바 있고 (Abbas et al., Nat . Med ., 5:1345-6, 1999; Coyle et al., Nat . Immunol ., 2:203-9, 2001; Carreno et al., Annu . Rev . Immunol ., 20:29-53, 2002; Liang et al., Curr. Opin . Immunol ., 14:384-90, 2002), 림프구 활성화에서의 그것들의 역할은 이제 막 밝혀지기 시작했다. 이들 새로운 공자극성 카운터-수용체로는 B7h2, PD-L1, PD-L2, B7-H3 및 B7-H4가 있다.
공지된 B7 패밀리 구성원의 발현은 항원-제공 세포에 의해 크게 제한된다. 포괄적으로, 이들 연구로 인해 B7 구성원이 세포-중재된 면역반응의 조절에서 중요한 역할을 담당하는 포지티브 또는 네거티브 공자극 신호를 제공하기 위해 림프구상에서 동족 수용체와 상호작용하는 림프양 세포 상의 카운터-수용체라는 것이 밝혀졌다.
따라서 당해 기술분야에는 추가의 B7 패밀리 구성원, 그것들의 카운터-수용체, 및 림프구 공자극 활성을 가지는 그것으로부터 유도된 분자를 확인해야 할 필요가 있다. 이런 필요성은 크게는 그것들의 기초적인 생물학적 중요성 및 그것들의 활성에 영향을 미칠 수 있는 제제들의 치료적 가능성을 토대로 한다. 공자극 신호를 조절할 수 있는 그런 제제는 면역반응의 조절에 중요하게 사용될 것이고, 매우 바람직하다.
NK 세포 및 NKp30
천연 킬러 (NK) 세포는 면역 시스템에서 활성을 나타내는 림프구의 하위세트이고, 사람 말초혈에 있는 단핵 세포의 평균 약 15%를 나타낸다. NK 세포는 처음에는 치사량의 방사선이 조사된 마우스가 동종이계의 또는 부모 스트레인의 골수 세포 (BMC) 동종이식편을 거부할 수 있었다는 관찰에 의해 1971년에 기능적으로 설명되었다 (Cudowicz and Bennett, J. Exp . Med . 134:83-102, 1971; Cudowicz and Bennett, J. Exp . Med . 135:1513-1528, 1971 참조). Cudowicz와 Bennett는 방사선 조사된 F1 하이브리드 H-2-이형접합성 마우스 (A×B)가 부모의 H-2-동종접합성 BMC (A 또는 B)를 거부할 수 있었다는 것을 관찰하였다. 이런 관찰은 이식 항원이 공우성적으로 유전되는 것으로 여겨지고 자손이 부모의 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 결정요인에 대해 불가피하게 내성인 고전적인 이식의 법칙과는 충돌하는 것이었다 (Cudowicz and Bennett, J. Exp . Med . 134:83-102, 1971). 이런 현상의 원인이 되는 세포는 방사선에 대해 내성이고 림프양 세포와 동일한 것으로 밝혀졌으며, 1975년에 시험관 내에서 MHC-비제한 방식으로 종양의 자연스러운 죽음을 중재하는 능력이 있는 것으로 나중에 특징지어졌다 (Herberman and Ortaldo, Science, 214:24-30, 1981; Ortaldo and Herberman, Annu . Rev . Immunol . 2:359-394, 1984; Trinchieri, Adv . Immunol . 47:187- 376, 1989; Murphy et al, J. Natl . Cancer Inst. 85: 1475-1482, 1993). NK 세포가 단독으로 골수 이식 거부반응을 특이하게 중재할 수 있다는 증거는 1987년에, T 및 B 세포를 발달시킬 수 없는 심각한 중증 합병성 면역결핍 (SCID)에 걸린 마우스가 정상적인 NK 세포 기능을 한다는 것을 관찰함으로써 알게 되었다 (Murphy et al., J. Exp . Med . 165:1212-1217, 1987).
NK 세포는 현재 선천성 면역의 한 중요한 가지를 나타내고 종양 및 바이러스로 감염된 세포에 대하여 면역 감시를 하는 데 있어 일차적인 역할을 하는 것으로 인지되고 있다. 그러나 활성화되지 않는 한 NK 세포는 그것들의 정상 기능을 수행하는 데 있어 비효과적이고, 심지어 충분한 수로 존재할 때조차도 그러하다. 실제로 감소된 NK 세포 활성은 암 및 감염성 질병과 관련된다 (Yamazaki et al., Oncology Reports 9:359-363, 2002; Rosenberg et al., Cancer Research 51:5074-5079 (suppl.), 1991; Britteenden et al., Cancer 77:1226-1243, 1996; 미국 특허 제 5,082,833호 및 4,883,662호 참조). 역으로, 상기에서 주지된 것처럼 NK 세포 활성은 BMC 동종이식편의 급성 거부반응을 중재한다. 그러므로 NK 세포 활성의 수준은 면역-관련 장애에서 중요한 역할을 하는 것 같다.
NK 세포 활성은 전형적으로 MHC 부류 I 분자와 억제성 및 활성화 수용체 사이의 상호작용에 의해 조절된다 (Barao and Murphy, BB & MT 9:727-741, 2003). "미싱 셀프(missing self)" 가설은 원래 MHC 부류 I 분자가 결핍된 종양 세포는 NK 세포에 의한 죽음에 민감하다는 관찰을 토대로 한 것이다 (Ljunggren and Karre, Immunol. Today 11:237-244, 1990; Ohlen et al., J. Immunol . 145:52-58, 1990). 조사자들은 추가로 사람 NK 세포가 부류 I-결핍성 엡스타인-바르-바이러스-형질전환된 B-림프아종 셀라인을 용해하는 것을 관찰하였다 (Storkus et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 86:2361-2364, 1989). 또한 부류 I 유전자의 부류 I-결핍성 표적 세포 안으로의 트랜스펙션은 이들 세포가 부분적으로 또는 완전히 NK-세포-중재된 용해에 대해 내성인 것으로 관찰되었다 (Storkus et al, supra; Shimizu and DeMars, Eur . J. Immunol ., 19:447-451, 1989). 그러나 MHC 부류 I은 언제나 NK-세포-중재된 세포독성으로부터 보호될 필요가 있는 것은 아니며, MHC 부류 I에 의한 인지는 NK 세포에 의한 세포용해를 언제나 방해하는 것은 아니다 (Barao and Murphy, 상기동일). 최근 몇 년 동안에 다양한 MHC-부류-I-특이적 억제성 및 활성화 수용체뿐 아니라 비-MHC-부류-I-특이적 활성화 수용체도 확인되었다. 이들 수용체는 예컨대 동종이계의 BMT 및 암 치료법과 같은 치료적 접근법과 관련이 있다.
MHC-부류-I-결핍성 또는 네거티브 표적에 대하여 NK 세포 세포독성을 중재할 수 있는 비-MHC-부류-I-특이적 활성화 수용체는 부분적으로는 천연 세포독성 수용체 (NCR)로서 알려져 있는 NK 세포-특이적 면역글로불린-유사 분자의 이종성 패밀리에 의해 나타난다 (Moretta et al., Annu . Rev . Immunol . 19:197-223, 2001; Diefenbach and Raulet, Immunol . Rev ., 181:170-184, 2001). MHC 부류 I 발현이 없을 때 (예컨대 종양 세포 또는 바이러스-감염 세포 상에서), 이들 활성화 수용체의 NK 세포에 대한 결찰은 표적 세포 죽음을 야기한다. 그런 활성화 수용체의 한 예는 NKp30으로, 그것은 성숙한 천연 킬러 (NK) 세포 및 신호상에서, 무엇보다 CD3ζ와의 결합을 통해 선택적으로 및 구성적으로 발현된다 (Barao and Murphy, 상기동일). NKp30 결합에 대한 표적 세포 리간드는 전에 확인된 바 없다.
이런 NK 세포에 의한 선천성 인지 시스템은 동종이계의 골수 이식 (BMT), 암치료법, 또는 다른 NK-세포-관련 장애의 치료에 임상적으로 적용하기 위한 잠재적으로 강력한 도구인 것으로 나타난다 (Barao and Murphy, 상기동일). 예를 들어 NKp30의 활성화를 자극 또는 억제하는 것은 NK 세포 활성을 조절하고 NK 세포 활성과 관련된 질병 또는 장애를 치료하는 데 유용할 것이다. 특히 NKp30을 야기함으로써 NK 세포 활성을 증강시키는 것은 불충분한 NK 세포 활성을 특징으로 하는 질병 또는 장애, 예컨대 암 및 감염성 질병의 치료에 유용할 것이며, 한편 NKp30을 차단함으로써 NK 세포 활성을 억제하는 것은 NK-세포-중재된 장애, 예컨대 BMC 동종이식편 거부반응의 치료에 유용할 것이다. 본 발명은 본원에서 교시된 것으로부터 당업자에게 명백하게 될 이들 및 다른 용도을 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
발명의 간단한 개요
한 측면으로, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 또는 그것의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는 분리된 zB7H6 폴리펩티드, 이를테면 폴리펩티드 융합물을 제공한다. 예를 들어 어떤 구체예에서, 본 발명의 zB7H6 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열과 최소한 90% 또는 최소한 95% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 절편을 포함하는 분리된 가용성 폴리펩티드이고, 이때 가용성 zB7H6 폴리펩티드는 사람 NKp30에 특이적으로 결합할 수 있다. 구체적인 변형예에서, 그런 가용성 zB7H6 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266 또는 1 내지 266에 표시된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 절편을 포함한다. 그런 가용성 폴리펩티드는 예를 들면 가용성 융합 단백질일 수 있다. 적당한 가용성 융합 단백질은 추가로 면역글로불린 중쇄 불변 영역 (예컨대 Fc 단편), 예컨대 IgG (예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), IgM, IgE, IgA, 또는 IgD 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 적당한 가용성 융합 단백질은 추가로 VASP 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
다른 측면으로, 본 발명은 본원에서 설명된 것과 같은 zB7H6 폴리펩티드를 코드화하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 따라서 특정 구체예에서, 본 발명은 가용성 zB7H6 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 절편을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드, SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열과 최소한 90%의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 절편을 포함하는 zB7H6 폴리펩티드를 제공하며, 이때 zB7H6 폴리펩티드는 사람 NKp30에 특이적으로 결합할 수 있다. 구체적인 변형예에서, 코드화된 가용성 zB7H6 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 절편을 포함한다. 코드화된 가용성 폴리펩티드는 예를 들면 가용성 융합 단백질, 예컨대 면역글로불린 중쇄 불변 영역 또는 VASP 도메인을 포함하는 가용성 융합 단백질일 수 있다. 특정 변형예에서 zB7H6 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 절편은 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 73 내지 798 또는 1 내지 798을 포함한다.
또 다른 측면으로, 본 발명은 상기에서와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한 벡터를 제공한다. 예를 들어 어떤 구체예에서, 본 발명은 다음과 같은 작동가능하게 연결된 요소들을 포함하는 발현 벡터를 제공한다: 전사 개시 영역; 가용성 zB7H6 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 절편, 이때 zB7H6 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열과 최소한 90%의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 절편을 포함하고, zB7H6 폴리펩티드는 사람 NKp30에 특이적으로 결합할 수 있다; 및 전사 종결 영역. 관련된 다른 측면으로 본 발명은 그러한 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 zB7H6 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 가용성 zB7H6 폴리펩티드를 제조하는 방법은 폴리펩티드가 발현되는 조건하에서 상기와 같은 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계와, 그 발현된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 본원에서 설명된 것과 같은 zB7H6 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체를 제공한다. 예를 들어 특정 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 절편에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 그러한 어떤 변형예에서, 항체는 사람 zB7H6의 NKp30과의 상호작용을 억제한다. 특히 적당한 항체는 단클론성 항체, 예컨대 사람 또는 인간화된 단클론성 항체이다. 항-zB7H6 항체는 또한 단일 사슬 항체를 포함한다.
또 다른 측면으로, 본 발명은 사람 천연 킬러 (NK) 세포 활성을 조절하기 위한 방법을 제공한다. 그러한 어떤 방법은 NK 세포 활성을 사람 NK 세포를 재조합 막-결합된 zB7H6 폴리펩티드를 발현하는 세포와 접촉함으로써 증강시키는 방법을 포함하는데, 상기 zB7H6 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열과 최소한 90%의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 절편을 포함하고, zB7H6 폴리펩티드는 사람 NKp30에 특이적으로 결합할 수 있다. 구체적인 변형예에서, zB7H6 폴리펩티드 절편은 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열을 가진다.
NK 세포 활성을 조절하기 위한 다른 방법은 예를 들면 zB7H6-발현 세포에 대한 NK 세포 활성을 감소시키는 것을 포함한다. 그런 방법은 일반적으로 기능성 zB7H6을 발현하는 세포를, 사람 NK 세포의 존재하에 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 절편에 특이하게 결합하는 항체의 유효량과 접촉시키는 것을 포함하며, 이때 상기 항체는 zB7H6과 사람 NKp30과의 상호작용을 억제한다. 그런 NK 세포 활성의 감소 방법은 예를 들면 골수 세포 (BMC) 동종이식편 거부반응의 치료에 유용하다. 따라서 특정 변형예에서, 본 발명의 방법은 NK 세포 활성을 억제하고 그로써 급성 BMC 동종이식편 거부반응을 치료하기에 효과적인 양으로, (a) SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 절편에 특이하게 결합하고 (b) zB7H6과 사람 NKp30과의 상호작용을 억제하는 항체를 투여함으로써 사람 대상에서 골수 세포 (BMC) 동종이식편 거부반응을 치료하는 것을 포함한다. 특히 적당한 항체는 단클론성 항체 (예컨대 사람 또는 인간화된 단클론성 항체)이다. BMC를 치료하기 위한 항체는 또한 단일 사슬 항체일 수 있다.
다른 측면으로, 본 발명은 zB7H6-발현 세포에 대하여 항체 의존성 세포의 세포독성 (ADCC)를 유도하는 방법을 제공한다. 그런 방법은 일반적으로 zB7H6-발현 세포를 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 절편에 특이하게 결합하는 항체의 유효량과 접촉시키는 것을 포함하고, 이때 그 접촉은 NK 세포 또는 ADCC 활성을 가지는 Fc 수용체를 발현하는 CD8+ T 세포의 존재하에 이루어지고, 항체는 Fc 수용체에 결합할 수 있는 Fc 영역을 포함한다. 적당한 항-zB7H6 항체는 단클론성 항체, 이를테면 예컨대 사람 또는 인간화된 단클론성 항체뿐 아니라 단일 사슬 항체이다. 특정 변형예에서, Fc 영역은 단일 사슬 Fc (scFc)이다. zB7H6-발현세포는 예를 들면 zB7H6-발현 암세포이다. 특히 이들 방법을 사용하여 표적화된 죽음을 맞기 쉬운 zB7H6 암세포로는, 예를 들면 결장암세포, 간암세포, 자궁경부암세포, 폐암세포, 췌장암세포, 전립선암세포, 원시혈구 백혈병 세포, B-세포 림프종 세포, 단핵 림프종 세포, 적혈구성 백혈병 세포, 버킷 림프종 세포, 및 만성 골수성 백혈병 세포가 있다.
또 다른 측면으로, 본 발명은 zB7H6-발현 세포에 대하여 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 유도하는 방법을 제공한다. 그런 방법은 일반적으로 zB7H6-발현 세포를 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 절편에 특이하게 결합하는 항체의 유효량과 접촉시키는 것을 포함하며, 이때 접촉은 보체의 존재하에 이루어지고, 항-zB7H6 항체는 CDC 활성을 가지는 Fc 영역을 포함한다. 적당한 항-zB7H6 항체는 단클론성 항체, 이를테면 예를 들어 사람 또는 인간화된 단클론성 항체뿐 아니라 단일 사슬 항체를 포함한다. 특정 변형예에서, Fc 영역은 단일 사슬 Fc (scFc)이다. zB7H6-발현 세포는 예를 들면 zB7H6-발현 암세포일 수 있다. 특히 이들 방법을 사용하여 표적화된 죽음을 맞기 쉬운 zB7H6 암세포로는, 예를 들면 결장암세포, 간암세포, 자궁경부암세포, 폐암세포, 췌장암세포, 전립선암세포, 원시혈구 백혈병 세포, B-세포 림프종 세포, 단핵 림프종 세포, 적혈구성 백혈병 세포, 버킷 림프종 세포, 및 만성 골수성 백혈병 세포가 있다.
관련된 다른 측면으로, 본 발명은 대상에서 zB7H6-발현 암을 치료하는 방법을 제공한다. 그런 방법은 일반적으로 대상에게 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 절편에 특이하게 결합하는 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 이때 항체는 ADCC 및/또는 CDC 활성을 가지는 Fc 영역을 포함한다. 적당한 항-zB7H6 항체는 단클론성 항체, 이를테면 예를 들어 사람 또는 인간화된 단클론성 항체뿐 아니라 단일 사슬 항체를 포함한다. 특정 변형예에서, Fc 영역은 단일 사슬 Fc (scFc)이다. zB7H6-발현 세포는 예를 들면 zB7H6-발현 암세포일 수 있다. 특히 이들 방법을 사용하여 치료되기 쉬운 zB7H6-발현 암으로는, 예를 들면 결장암, 간암, 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 및 전립선암뿐만 아니라, 혈액암, 예컨대 원시혈구 백혈병, B-세포 림프종, 단핵 림프종, 적혈구성 백혈병, 버킷 림프종, 또는 만성 골수성 백혈병이 있다.
다른 측면으로, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 절편에 특이하게 결합하는 항체를 포함하는 항체-약물 포합체를 제공하는데, 이때 항체는 세포독성제에 포합된다. 특정 구체예에서, SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열에 결합하는 항체는 단클론성 항체, 예를 들면 사람 또는 인간화된 단클론성 항체이다. 다른 변형예에서, 항체는 단일 사슬 항체이다. 적당한 세포독성제로는 예를 들면 항-튜불린제, DNA 마이너 그루브 결합제, DNA 마이너 그루브 알킬화제, 듀오카마이신, 및 퓨로마이신이 있다. 특히 적당한 항-튜불린제로는 예를 들면 돌라스타틴, 빈카 알카로이드, 포도필라톡신, 탁산, 박카틴 유도체, 크립토피신, 마이탄시노이드, 및 콤브레타스타틴이 있다.
상기에서 개관된 것과 같은 항체-약물 포합체의 전형적인 구체예에서, 항체는 링커를 경유하여 세포독성제에 포합된다. 특히 적당한 링커는 세포내 조건하에서 절단될 수 있는 링커로, 예를 들면 세포내 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 (예컨대 리소솜성 프로테아제 또는 엔도솜 프로테아제에 의해 절단될 수 있는) 펩티드 링커이다. 세포내 조건하에서 절단될 수 있는 링커는 디펩티드 링커, 예를 들면 val-cit 링커 또는 phe-lys 링커를 포함할 수 있다. 다른 변형예에서, 절단될 수 있는 링커는 5.5 미만의 pH에서 가수분해될 수 있다 (예컨대 히드라존 링커). 여전히 다른 구체예에서, 절단될 수 있는 링커는 이황화물 링커이다.
본 발명은 추가로 상기와 같은 항체-약물 포합체 및 최소한 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 상기 zB7H6-발현 세포를 포함하는 세포 집단 내에서 zB7H6-발현 세포의 성장을 격감시키거나 억제하는 방법을 제공한다. 일반적으로 그 방법은 상기 zB7H6-발현 세포를 효과적인 양의 상기와 같은 항체-약물 포합체와 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 방법은 대상에게 효과적인 양의 항체-약물 포합체를 투여함으로써 대상의 zB7H6-발현 암을 생체 내에서 치료하기 위해 사용된다. 특별한 변형예에서, zB7H6-발현 암은 결장암, 간암, 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 또는 전립선암이다. 또 다른 변형예에서 zB7H6-발현 암은 원시혈구 백혈병, B-세포 림프종, 단핵 림프종, 적혈구성 백혈병, 버킷 림프종, 또는 만성 골수성 백혈병이다.
본 발명은 또한 zB7H6과 NKp30의 상호작용의 길항체 또는 아고니스트를 선별하는 방법을 제공한다. 예를 들어 특정 구체예에서, zB7H6과 NKp30의 상호작용의 길항체를 선별하는 방법은 (a) zB7H6 폴리펩티드와 제제를 NKp30 폴리펩티드의 존재하에 접촉시키는 단계; (b) zB7H6 폴리펩티드와 NKp30 폴리펩티드의 상호작용의 정도를 검출하는 단계; 그리고 (c) 단계 (b)에서 측정된 zB7H6/NKp30 상호작용의 수준이 제제의 부재시에 대조 zB7H6 및 NKp30 폴리펩티드에 대해 측정된 상호작용 수준과 비교하여 상당히 적은 지의 여부를 측정한 후, 그 제제를 zB7H6과 NKp30의 상호작용의 길항체로서 확인하는 단계로 이루어진다. 다른 구체예에서, zB7H6과 NKp30의 상호작용의 아고니스트를 선별하는 방법은 (a) zB7H6 폴리펩티드와 제제를 NKp30 폴리펩티드의 존재하에 접촉시키는 단계; (b) zB7H6 폴리펩티드와 NKp30 폴리펩티드의 상호작용의 정도를 검출하는 단계; 그리고 (c) 단계 (b)에서 측정된 zB7H6/NKp30 상호작용의 수준이 제제의 부재시에 대조 zB7H6 및 NKp30 폴리펩티드에 대해 측정된 상호작용 수준과 비교하여 상당히 더 큰 지의 여부를 측정하여 zB7H6/NKp30 상호작용의 수준이 더 크다면, 그 제제를 zB7H6과 NKp30의 상호작용의 아고니스트로서 확인하는 단계로 이루어진다.
I. 개관
본 발명은 세포 수용체의 B7 패밀리의 신규한 구성원인 zB7H6의 확인 및 특성확인과, NKp30에 결합하는 그것의 능력의 발견에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 수용체는 "zB7H6"으로 표시되고 B7-1, B7-2, B7h2, PD-L1, PD-L2, B7-H3 및 B7-H4와 같은 B7 패밀리의 기존의 공지된 구성원과는 구별된다. 또한 예컨대 zB7H6 및 NKp30의 천연 상호작용을 조절하는 것과 같은 zB7H6-중재된 신호화를 조절하기 위한 방법 및 조성물이 제공되며, 그것은 예컨대 암 및 감염성 질병에 대한 면역치료법을 포함하여 면역치료법에 대한 다수의 치료 용도에 사용된다.
사람 zB7H6을 코드화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2에 도시된다. SEQ ID NO:2의 zB7H6 폴리펩티드는 대략 242 아미노산 잔기 (SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266)의 세포외재성 도메인, 대략 18 아미노산 잔기 (SEQ ID NO:2의 잔기 267 내지 284)의 경막 도메인, 및 대략 158 아미노산 잔기 (SEQ ID NO:2의 잔기 285 내지 454)의 세포내 도메인을 포함한다. zB7H6은 또한 대략 117 아미노산 잔기 (SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 141)의 IgV와 대략 97 아미노산 잔기 (SEQ ID NO:2의 잔기 142 내지 238)의 IgC 도메인을 가진다. 또한 zB7H6의 세포내 도메인 내에는 여러 개의 강력한 신호화 모티프, 이를테면 ITIM 모티프 (SaYtpL, SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 293 내지 298), SH2 결합 모티프 (YqlQ, SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 229 내지 332), 및 SH3 결합 모티프 (PdaPilPvsP, SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 418 내지 427)가 있다.
zB7H6은 B7 패밀리 유전자 프로파일링을 토대로 하여 세포 수용체의 B7 패밀리의 구성원으로서 확인되었다. 유전자 구조 프로필은 신호-2-IgV-2-IgC-2-TMD-0-LgEx이다 (도 7). 이 프로필의 세포외 영역은 B7 유전자 구조 모델과 대등하며, 그것은 첫 번째 엑손이 리더 서열을 코드화하고, 두 번째 엑손이 IgV 도메인을 코드화하며, 세 번째 엑손은 IgC 도메인을 코드화하는 특징적인 엑손 패턴을 포함한다. B7 패밀리 유전자 구조의 다른 특징적인 특징은 엑손의 페이싱이다: 세포외재성 도메인에 상응하는 영역에서, B7 패밀리 구성원들은 엑손 1 내지 4 사이에 있는 2의 보존된 페이싱을 나타낸다 (상기 참조).
zB7H6은 NKp30에 대한 카운터-수용체로서 확인되었는데, 그것은 성숙한 천연 킬러 (NK) 세포 상에 선택적으로 발현된 수용체이고, 활성적 수용체로서 사람 천연 세포독성에 포함된다. NK 세포는 전형적으로 MHC 부류 I 분자와 억제성 수용체 사이의 상호작용에 의해 정상 조직을 공격하는 것을 방해한다. 그러나 MHC 부류 I 발현 (예컨대 종양 세포 또는 바이러스-감염 세포 상에서)의 부재시에, NK 세포 상에서 활성화 수용체의 결찰은 표적-세포 죽음을 야기한다. 그런 NK-세포 수용체의 야기는 NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, 및 DNAMl을 포함한다. 그것에 NKp30이 결합하는 활성화 표적-세포 리간드는 이전에 확인된 바 없고, NKp30에 대한 카운터-수용체로서의 zB7H6의 확인으로, 다양한 치료제가 zB7H6 및 NKp30과의 상호작용을 모방하거나 간섭할 수 있어서 다른 질환들 중에서도 암, 감염성 질병, 또는 NK-세포 중재된 동종이식편 거부반응을 치료하는 목적에 대해 NK 림프구 활성을 조절할 수 있게 된다. 예를 들어 zB7H6-NKp30 상호작용을 모방하는 시약은, 이를테면 세포외재성 도메인을 포함하여 zB7H6의 가용성 형태를 포함하여 NKp30 자극성 신호를 활성화함으로써 종양 또는 바이러스-감염된 세포에 대한 NK 세포 반응을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 역으로, zB7H6-NKp30 상호작용을 차단하는 제제, 예를 들면 NKp30과의 결합에 대해 경합하는 항-zB7H6 항체는 예를 들면 급성 골수 세포 (BMC) 동종이식편 거부반응에서와 같이 NK 세포-중재된 반응을 억제하기 위해 사용될 수 있다.
따라서 한 측면으로, 본 발명은 NK 세포 활성의 조절에서와 암, 감염성 질병, 또는 NK 세포-중재된 동종이식편 거부반응과 같은 장애의 치료에서 유용한 zB7H6 폴리펩티드를 제공한다. 일반적으로 그러한 zB7H6 폴리펩티드는 zB7H6 세포외제성 도메인 (SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266); SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266와 최소한 80% (예컨대 최소한 90% 또는 최소한 95%)의 동일성을 가지고 NKp30에 결합할 수 있는 zB7H6 세포외재성 도메인의 기능성 변이체; 또는 NKp30에 결합할 수 있는, 상기 언급된 zB7H6 세포외재성 도메인 또는 도메인 변이체의 기능성 단편을 포함한다. 어떤 변형예에서, zB7H6 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 454의 아미노산 서열 (예컨대 SEQ ID NO:2의 폴리펩티드), 또는 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 454와 최소한 80% (예컨대 최소한 90% 또는 최소한 95%)의 동일성을 가지는 zB7H6의 기능성 변이체를 가진다. 특정 구체예에서, zB7H6 폴리펩티드는 기능성 경막 도메인이 결여되어 있는 가용성 zB7H6 폴리펩티드이다. 특히 적당한 가용성 zB7H6 폴리펩티드는 zB7H6 세포외재성 도메인, 또는 그것의 기능성 변이체 또는 단편, 및 이종성 폴리펩티드를 포함하는 또는 그것들로 구성되는 융합 단백질을 포함한다. 그런 어떤 변형예에서, 이종성 폴리펩티드는 면역글로불린 부분이고, 특히 적당한 면역글로불린 부분은 면역글로불린 중쇄 불변 영역, 예컨대 사람 Fc 단편이다. 다른 변형예에서, 이종성 폴리펩티드는 혈관확장제-자극된 인단백질 (VASP) 도메인이고, 그것은 특히 가용성 zB7H6의 다량체 (예컨대 사량체) 형태의 제조에 적당하다. 어떤 구체예에서, 가용성 융합 단백질은 추가로 폴리펩티드 링커를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 가용성 zB7H6 폴리펩티드를 코드화하는, 벡터를 포함하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 그런 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 어떤 측면으로, 그런 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 숙주 세포는 가용성 zB7H6 단백질의 제조 방법에 사용된다. 그런 방법은 일반적으로 단백질이 발현되는 조건하에서 가용성 zB7H6 단백질을 코드화하는 발현 벡터로 형질전환된 또는 트랜스펙션된 숙주 세포를 배양하는 단계와, 숙주 세포로부터 가용성 zB7H6 단백질을 회수하는 단계로 이루어진다.
본 발명은 나아가 zB7H6의 세포외재성 도메인에 특이하게 결합하는 항체를 제공한다. 다양한 구체예에서, 그런 항체는 zB7H6의 단량체 및/또는 다량체 형태, 이를테면 예컨대 가용성 zB7H6의 단량체 또는 다량체 형태에 결합한다. 그런 항체로는 아고니스트 항체, 중화 항체, 다클론성 항체, 쥐과의 단클론성 항체, 쥐과의 단클론성 항체로부터 유도된 인간화된 항체, 사람 단클론성 항체, 및 그것들의 항원-결합 단편이 있다. 예시적인 항체 단편은 F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv, 및 최소 인지 유닛을 포함한다. 중화 항체는 zB7H6에 결합함으로써 그것의 NKp30과의 상호작용은 억제되거나 차단된다.
본 발명은 추가로 약제학적으로 허용되는 담체와 본원에서 설명되는 것과 같은 가용성 zB7H6 단백질 또는 항-zB7H6 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 그러한 조성물은 본 발명에 따르는 치료적 방법에 사용될 수 있다.
다른 측면으로, 본 발명은 zB7H6 활성을 모방하거나 차단하는 제제를 사용하여 NK 세포 활성을 조절하는 방법을 제공한다. zB7H6 활성을 모방하는 적당한 제제는 NKp30 활성에 결합하여 그것을 자극할 수 있는 세포외재성 zB7H6 도메인, 또는 그것의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는 zB7H6의 가용성 형태를 포함한다. 또 다른 아고니스트는 기능성 zB7H6 분자를 세포내에서 재조합적으로 제조할 수 있는 유전자 치료 벡터, zB7H6 발현 및/또는 zB7H6-중재된 신호화의 작은 분자 인핸서, 등을 포함한다. 적당한 zB7H6 차단제로는 zB7H6의 세포외재성 도메인의 최소한 일부분에 결합할 수 있고 zB7H6과 NKp30과의 상호작용을 간섭할 수 있는 항-zB7H6 항체; zB7H6과 NKp30의 상호작용의 작은 분자 억제제, 등이 있다. 또 다른 zB7H6 길항체는 추가로 zB7H6 핵산 서열, 억제성 RNA 서열, B7H6 발현 및/또는 세포내 신호화의 작은 분자 억제제 등에 대해 지시된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
예를 들어 어떤 구체예에서, 본 발명은 효과적인 양의 가용성 zB7H6 폴리펩티드를 대상에게 투여함으로써 불충분한 천연 킬러 (NK) 세포 활성 (예컨대 암 또는 감염성 질병)을 특징으로 하는 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 다른 측면으로, 본 발명은 zB7H6-발현 세포에 대한 사람 천연 킬러 (NK) 세포 활성을 감소시키는 방법을 제공하는데, 그 방법은 zB7H6-발현 세포를 사람 NK 세포의 존재하에 zB7H6의 세포외재성 도메인에 특이하게 결합하고 사람 NKp30과 zB7H6의 상호작용을 억제하는 항체의 유효량을 접촉시킴으로써 이루어지며, 그런 방법은 예를 들어 생체 내에서 NK-세포-중재된 동종이식편 거부반응, 특히 급성 BMC 동종이식편 거부반응을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
이들 및 본 발명의 다른 측면은 다음의 상세한 설명을 참조로 하여 명백해질 것이다. 또한 다양한 참조는 아래에 표현되며 그것의 전체 내용이 참조로 삽입된다.
II. 정의
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본원에서 설명되는 방법 및 조성물에 관련된 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 본원에서 사용되는 다음의 용어 및 구절은 다르게 표시되지 않는 한 그것들에 귀속된 의미를 가진다.
본원에서 사용되는 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA), 올리고뉴클레오티드, 중합효소 사슬 반응 (PCR)에 의해 생성된 단편, 및 결찰, 절단, 엔도뉴클레아제 작용, 및 엑소뉴클레아제 작용중 어느 하나에 의해 생성된 단편들을 나타낸다. 핵산 분자는 자연 발생적인 뉴클레오티드 (예컨대 DNA 및 RNA), 또는 자연-발생 뉴클레오티드의 유사체 (예컨대 자연-발생 뉴클레오티드의 α-경상이성질체), 또는 이 두 가지의 조합인 단량체로 구성될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 당 부분에서 및/또는 피리미딘 또는 퓨린 염기 부분에서 변경될 수 있다. 당 변형은 예를 들면 하나 또는 그 이상의 히드록실 기의 할로겐, 알킬기, 아민, 및 아지도 기로의 대체를 포함하거나, 또는 당은 에테르 또는 에스테르로서 기능화될 수 있다. 더욱이, 전체 당 부분은 입체적으로 및 전기적으로 유사한 구조, 예컨대 아자-당 및 탄소고리형 당 유사체로 대체될 수 있다. 당 부분의 변형의 실례로는 알킬화된 퓨린 및 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘, 또는 다른 널리 알려져 있는 헤테로고리형 치환체가 있다. 핵산 단량체는 포스포디에스테르 결합 또는 그런 연쇄 유사체에 의해 연결될 수 있다. 포스포디에스테르 연쇄의 유사체로는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐리데이트, 포스포라미데이트 등이 있다. 용어 "핵산 분자"는 또한 소위 "펩티드 핵산"을 포함하고, 그것은 폴리아미드 골격에 부착된 자연-발생 또는 변형된 핵산 염기를 포함한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
용어 "핵산 분자의 보체"는 상보적인 뉴클레오티드 서열 및 참조 뉴클레오티드 서열과 비교하여 역배향을 가지는 핵산 분자를 나타낸다.
용어 "축퇴성 뉴클레오티드 서열"은 폴리펩티드를 코드화하는 참조 핵산 분자와 비교하여 하나 또는 그 이상의 축퇴성 코돈을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 축퇴성 코돈은 뉴클레오티드의 상이한 트리플릿을 함유하지만, 동일한 아미노산 잔기를 코드화한다 (즉 GAU와 GAC 트리플릿은 각각 Asp를 코드화한다).
용어 "구조적 유전자"는 메신저 RNA (mRNA)로 전사된 핵산 분자를 나타내는데, mRNA는 이어서 특이한 폴리펩티드의 특징적인 아미노산 서열로 번역된다.
"분리된 핵산 분자"는 유기체의 게놈 DNA에 통합되지 않은 핵산 분자이다. 예를 들어 세포의 게놈 DNA로부터 분리된 성장인자를 코드화하는 DNA 분자는 분리된 DNA 분자이다. 분리된 핵산 분자의 다른 실례는 유기체의 게놈에 통합되지 않은 화학적으로 합성된 핵산 분자이다. 특별한 종으로부터 분리된 핵산 분자는 그 종으로부터의 염색체의 완전한 DNA 분자보다 작다.
"핵산 분자 구성물"은 자연에서는 존재하지 않은 배열로 조합되고 병치된 핵산의 절편을 함유하기 위해 사람의 개입을 통해 변형된, 단일- 또는 이중-가닥의 핵산 분자이다.
"선형 DNA"는 유리 5' 및 3' 단부를 가지는 비-원형 DNA 분자를 나타낸다. 선형 DNA는 폐쇄된 원형 DNA 분자, 예컨대 플라스미드로부터, 효소적 소화 또는 물리적 파괴에 의해 제조될 수 있다.
"상보 DNA (cDNA)"는 효소 역전사효소에 의해 mRNA 주형으로부터 형성된 단일-가닥의 DNA 분자이다. 전형적으로 mRNA의 부분들에 상보하는 프라이머가 역전사의 개시를 위해 사용된다. 당업자는 또한 그러한 단일-가닥의 DNA 분자와 그것의 상보하는 DNA 가닥으로 구성되는 이중-가닥 DNA 분자를 나타내기 위해 용어 "cDNA"를 사용한다. 용어 "cDNA"는 또한 RNA 주형으로부터 합성된 cDNA 분자의 클론을 나타낸다.
"프로모터"는 구조적 유전자의 전사를 지시하는 뉴클레오티드 서열이다. 전형적으로 프로모터는 구조적 유전자의 전사 시작 부위 가까이에 있는, 유전자의 5' 비코딩 영역에 위치한다. 전사 개시의 기능을 하는 프로모터 내의 서열 요소들은 때로 일치 뉴클레오티드 서열을 특징으로 한다. 이들 프로모터 요소는 RNA 중합효소 결합 부위, TATA 서열, CAAT 서열, 분화-특이적 요소 (DSEs; McGehee et al., Mol. Endocrinol . 7:551, 1993), 원형 AMP 반응 요소 (CREs), 혈청 반응 요소 (SREs; Treisman, Seminars in Cancer Biol . 1:47, 1990), 클루코코르티코이드 반응 요소 (GREs), 및 다른 전사 인자에 대한 결합 부위, 예컨대 CRE/ATF (O'Reilly et al., J. Biol . Chem . 267:19938, 1992), AP2 (Ye et al., J. Biol . Chem. 269:25728, 1994), SPl, cAMP 반응 요소 결합 단백질 (CREB; Loeken, Gene Expr. 3:253, 1993) 및 옥타머 인자 (일반적으로 Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987), 및 Lemaigre and Rousseau, Biochem . J. 303:1, 1994)를 포함한다. 만약 프로모터가 유도성 프로모터라면, 전사율은 유도제에 대한 반응으로 증가한다. 대조적으로, 전사율은 만약 프로모터가 구성성 프로모터라면 유도제에 의해 조절되지 않는다. 억제가능한 프로모터가 또한 알려져 있다.
"코어 프로모터"는 프로모터 기능을 위한 필수 뉴클레오티드 서열, 이를테면 TATA 박스 및 전사 출발을 함유한다. 이 정의에 의하면, 코어 프로모터는 활성을 증강시키거나 조직 특이성 활성을 부여할 수 있는 특이적 서열의 부재시에 검출가능한 활성을 가지거나 가지지 않을 수도 있다.
"조절 요소"는 코어 프로모터의 활성을 조절하는 뉴클레오티드 서열이다. 예를 들어 조절 요소는 특별한 세포, 조직, 또는 세포기관에서 배타적으로 또는 우선적으로 전사를 가능하게 하는 세포 인자들과 결합하는 뉴크레오티드 서열을 함유할 수 있다. 이들 유형의 조절 요소는 정상적으로 "세포-특이적," "조직-특이적," 또는 "세포기관-특이적" 방식으로 발현되는 유전자들과 결합된다.
"인핸서"는 전사의 출발 부위와 관련된 인핸서의 거리 또는 배향과는 관계없이 전사의 효율을 증가시킬 수 있는 조절 요소의 유형이다.
"이종성 DNA"는 주어진 숙주 세포 내에서 자연적으로 존재하지 않는 DNA 분자, 또는 DNA 분자의 집단을 말한다. 특별한 숙주 세포에 이종성인 DNA 분자는 숙주 DNA가 비-숙주 DNA (즉 외인성 DNA)와 조합되는 한 숙주 세포 종으로부터 유도된 DNA (즉 내인성 DNA)를 함유할 수 있다. 예를 들어 전사 프로모터를 포함하는 숙주 DNA 절편에 작동가능하게 연결된 폴리펩티드를 코드화하는 비-숙주 DNA 절편을 함유하는 DNA 분자는 이종성 DNA 분자인 것으로 여겨진다. 역으로 이종성 DNA 분자는 외인성 프로모터와 작동가능하게 연결된 내인성 유전자를 포함할 수 있다. 또 다른 예시로서, 야생형 세포로부터 유도된 유전자를 포함하는 DNA 분자는 그 DNA 분자가 야생형 유전자가 결핍된 돌연변이 세포에 도입된다면 이종성 DNA인 것으로 여겨진다.
"폴리펩티드"는 그것이 자연적으로 생성된 것이든 또는 합성적으로 생성된 것이든 펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산 잔기의 중합체이다. 약 10 아미노산 잔기보다 적은 폴리펩티드는 통상 "펩티드"로 언급된다.
"단백질"은 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 거대분자이다. 단백질은 또한 비-펩티드 성분, 예컨대 탄수화물 기를 포함할 수 있다. 탄수화물 및 다른 비-펩티드성 구성성분은 그 단백질이 생성되고, 야생형 세포와는 다를 세포에 의해 단백질에 첨가될 수 있다. 단백질은 그것의 아미노산 골격 구조의 관점에서 본원에서 정의되며, 탄수화물 기와 같은 구성성분은 일반적으로 구체화되지 않지만, 그럼에도 제시될 수 있다.
DNA의 숙주 세포 발현의 맥락에서, "이종성" 펩티드 또는 폴리펩티드는 비-숙주 DNA 분자에 의해 코드화된 펩티드 또는 폴리펩티드, 즉 이종성 DNA 분자에 의해 코드화된 펩티드 또는 폴리펩티드이다.
"클로닝 벡터"는 숙주 세포에서 자동적으로 복제할 수 있는 가능성이 있는 핵산 분자, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 또는 박테리오파지이다. 클로닝 벡터는 전형적으로 벡터의 필수적인 생물학적 기능의 손실 없이 하나 또는 소수의 제한 엔도뉴클레아제 인지 부위뿐 아니라 클로닝 벡터로 형질전환된 세포의 확인 및 선택에 사용하기에 적당한 마커 유전자를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 마커 유전자는 전형적으로 테트라사이클린 내성 또는 암피실린 내성을 제공하는 유전자를 포함한다.
"발현 벡터"는 숙주 세포에서 발현되는 유전자를 코드화하는 핵산 분자이다. 전형적으로 발현 벡터는 전사 프로모터, 유전자, 및 전사 터미네이터를 포함한다. 유전자 발현은 통상적으로 프로모터의 조절하에 놓여있고, 그런 유전자는 프로모터"에 작동가능하게 연결되어 있다"고 말할 수 있다. 유사하게 조절 요소 및 코어 프로모터는 만약 조절 요소가 코어 프로모터의 활성을 조절한다면 작동가능하게 연결된다.
"재조합 숙주"는 이종성 핵산 분자, 예컨대 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 함유하는 세포이다. 본 발명의 맥락에서 재조합 숙주의 실례는 발현 벡터로부터 zB7H6을 생성하는 세포이다. 대조적으로 zB7H6은 zB7H6의 "천연 공급원"이고 발현 벡터가 결핍된 세포에 의해 생성될 수 있다.
"통합적 형질전환체"는 재조합 숙주 세포로, 그 안에서 이종성 DNA는 세포의 게놈 DNA로 통합되었다.
"융합 단백질"은 상호 관련하여 상이한 단백질로부터 유도된 최소한 2개의 폴리펩티드 절편을 포함하는 혼성 단백질이다. 본 맥락에서 "상이한 단백질"은 각 단백질이 상이한 유전자좌에 상응하는 것을 의미한다. 단백질은 만약 유전자좌에 상응하는 대립형질에 의해 코드화되거나, 또는 단백질이 그런 대립형질에 의해 코드화된 단백질에 대해 최소한 80%의 서열 동일성을 가진다면 유전자좌에 상응한다. 상이한 단백질로부터 유도된 폴리펩티드 절편은 또한 본원에서 상호 관련하여 "이종성"인 것으로 언급된다. 그로써 예를 들어 zB7H6 폴리펩티드 절편 (예컨대 세포외재성 도메인, 또는 그것의 기능성 변이체 또는 단편) 및 zB7H6과 상이한 단백질로부터의 두 번째 폴리펩티드 절편을 포함하는 융합 단백질의 맥락에서, 두 번째 폴리펩티드 절편은 또한 본원에서 "이종성 폴리펩티드 절편" 또는 "이종성 폴리펩티드"인 것으로 언급된다. 그런 이종성 폴리펩티드는 상기에서 한층 더 설명된 것과 같이, 예를 들면 면역글로불린 불변 영역 및 VASP 도메인을 포함한다.
용어 "수용체"는 "카운터-수용체"로 언급되는 생체활성 분자에 결합하는 세포-결합 단백질을 나타낸다. 이 상호작용은 세포에 미치는 카운터-수용체의 효과를 중재한다. 수용체는 막 결합된 시토졸성 또는 핵의 단량체 (예컨대 갑상선 자극 호르몬 수용체, 베타-아드레날린성 수용체) 또는 다량체 (예컨대 PDGF 수용체, 성장 호르몬 수용체, IL-3 수용체, GM-CSF 수용체, G-CSF 수용체, 에리트로포이에틴 수용체 및 IL-6 수용체)일 수 있다. 막-결합된 수용체는 세포외재성 카운터-수용체-결합 도메인 및 신호 변환에 전형적으로 내포되는 세포내 이펙터 도메인을 포함하는 다중-도메인 구조를 특징으로 한다. 특정 막-결합된 수용체에서, 세포외재성 카운터-수용체-결합 도메인 및 세포내 이펙터 도메인은 완전한 기능성 수용체를 포함하는 별도의 폴리펩티드에 위치한다.
일반적으로 카운터-수용체의 수용체에의 결합은 이펙터 도메인과 세포내 다른 분자(들) 사이의 상호작용을 유발하는 수용체의 형태적 변화를 유발하는데, 그것은 계속해서 세포의 대사의 변경을 유도한다. 수용체-카운터-수용체 상호작용에 자주 결합되는 대사 사건으로는 유전자 전사, 인산화, 탈인산화, 고리형 AMP 생성의 증가, 세포 칼슘의 이동, 막 지질의 이동, 세포 고착, 이노시톨 지질의 가수분해 및 인지질의 가수분해를 포함한다.
"가용성 수용체"는 세포막에 결합되지 않은 수용체 폴리펩티드이다. 가용성 수용체는 경막 및 세포질 도메인이 없는 가장 흔한 카운터-수용체-결합 폴리펩티드이고, 글리코포스포이노시톨 (GPI)를 통해서와 같이 세포 막에 연결된 다른 연쇄이다. 많은 세포-표면 수용체들이 교대로 스플라이스된 mRNA로부터 번역되거나 단백질 가수분해에 의해 생성된 자연 발생적인 가용성 대응물을 가진다. 가용성 수용체는 단량체, 단일이량체, 이종성 이량체, 또는 다량체일 수 있으며, 다량체 수용체는 일반적으로 9개 이하의 하위유닛을 포함하며, 바람직하게는 6개 이하, 가장 바람직하게는 3개 이하의 하위유닛을 포함한다. 수용체 폴리펩티드는 그것이 막 고정 또는 신호 변환을 제공하기 위해 이들 절편의 충분한 부분을 갖고 있지 않을 때 실질적으로 경막 및 세포내 폴리펩티드 절편이 없다고 말할 수 있다. 예를 들어 대표적인 zB7H6에 대한 가용성 수용체는 예컨대 SEQ ID NO:17 또는 19에 표시된 것과 같은 가용성 수용체를 포함한다.
용어 "분비 신호 서열"은 더 큰 폴리펩티드의 성분으로서, 그것이 합성되는 세포의 분비 경로를 통하여 더 큰 폴리펩티드를 지시하는 펩티드 ("분비 펩티드")를 코드화하는 DNA 서열을 나타낸다. 더 큰 폴리펩티드는 통상적으로 분비 경로를 통한 수송 중에 분비 펩티드를 제거하기 위해 절단된다.
"분리된 폴리펩티드"는 본질적으로 세포 성분, 예컨대 탄수화물, 지질, 또는 자연적인 폴리펩티드와 관련된 다른 단백성 불순물로 오염되지 않는 폴리펩티드이다. 전형적으로, 분리된 폴리펩티드의 제제는 고도로 정제된 형태, 즉 최소한 약 80% 순수한, 최소한 약 90% 순수한, 최소한 약 95% 순수한, 95% 이상 순수한, 예컨대 96%, 97%, 또는 98% 또는 그 이상 순수한, 또는 99% 이상 순수한 폴리펩티드를 포함한다. 특별한 단백질 제제가 분리된 폴리펩티드를 함유하는 것을 보여주는 한 가지 방법은 단백질 제제의 도데실 황산 나트륨 (SDS)-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 겔의 쿠마찌 형광 블루 염색 후의 단일 밴드의 출현에 의해서이다. 그러나 용어 "분리된"은 대안적인 물리적 형태, 예컨대 이량체 또는 달리 글리코실화된 또는 유도된 형태의 동일한 폴리펩티드의 존재를 배제하는 것은 아니다.
용어 "아미노-말단" 및 "카르복시-말단"은 본원에서 폴리펩티드 내에 있는 위치를 표시하기 위해 사용된다. 맥락이 허용하는 한 이들 용어는 근접 위치 또는 관련 위치를 표시하기 위하여 폴리펩티드의 특별한 서열 또는 부분을 참조로 사용된다. 예를 들어 폴리펩티드 내의 참조 서열에 대해 카르복시-말단 쪽에 위치한 특정 서열은 참조 서열의 카르복실 말단에 가깝게 위치하지만, 완전한 폴리펩티드의 카르복실 말단에 언제나 존재하는 것은 아니다.
용어 "발현"은 또한 유전자 생성물의 생합성을 의미한다. 예를 들어 구조적 유전자의 경우에 발현은 구조적 유전자의 mRNA로의 전사 및 mRNA의 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드로의 번역을 포함한다.
용어 "스플라이스 변이체"는 본원에서 유전자로부터 전사된 RNA의 대체 형태를 표시하기 위해 사용된다. 스플라이스 변이는 전사된 RNA 분자 내에서 대체 스플라이싱 부위의 사용을 통해 자연적으로 일어나거나, 또는 별도로 전사된 RNA 분자들 사이에서는 더 적은 빈도로 일어나며, 동일한 유전자로부터 전사된 여러 mRNA를 유발할 수 있다. 스플라이스 변이체는 변경된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코드화할 수 있다. 용어 스플라이스 변이체는 또한 본원에서 유전자로부터 전사된 mRNA의 스플라이스 변이체에 의해 코드화된 폴리펩티드를 표시하기 위해 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "면역조절제"는 사이토킨, 세포 성장 인자, 림포톡신 (세포 장애 인자), 공-자극 분자, 조혈인자, 등과, 이들 분자의 합성 유사체를 포함한다.
용어 "보체/항-보체 쌍"은 적절한 조건하에서 비-공유적으로 결합된 안정한 쌍을 형성하는 동일하지 않은 부분을 나타낸다. 예를 들어 비오틴과 아비딘 (또는 스트렙트아비딘)은 보체/항-카운터 쌍의 원형적 구성원이다. 다른 예시적인 보체/항-보체 쌍으로는 수용체/카운터-수용체 쌍, 항체/항원 (또는 합텐 또는 에피토프) 쌍, 센스/안티센스 폴리뉴클레오티드 쌍, 등이 있다. 보체/항-보체 쌍이 계속해서 분해되는 것이 바람직한 경우, 보체/항-보체 쌍은 109M-1의 결합 친화력을 가지는 것이 바람직하다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 면역글로불린 폴리펩티드와 면역글로불린 폴리펩티드의 면역학적으로 활성인 부분, 즉 특이한 항원 (예컨대 zB7H6의 세포외재성 도메인)에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 면역글로불린 패밀리의 폴리펩티드, 또는 그것의 단편을 나타낸다.
"항-이디오타입 항체"는 면역글로불린의 가변 영역 도메인과 결합하는 항체이다. 본 발명의 맥락에서, 항-이디오타입 항체는 항-zB7H6 항체의 가변 영역과 결합하고, 그로써 zB7H6의 에피토프를 모방한다.
"항체 단편"은 F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab 등과 같은 항체의 부분이다. 구조와 관계없이, 항체 단편은 무상 항체에 의해 인지되는 동일한 항원과 결합한다. 예를 들어 항-zB7H6 단클론성 항체 단편은 zB7H6의 에피토프와 결합한다.
용어 "항체"는 또한 유전적으로 공학제조된 무상 항체 또는 단편, 예를 들면 키메릭 항체, 인간화된 항체, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 이루어지는 "Fv" 단편, 경쇄 가변영역으로 이루어지는 폴리펩티드, 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결되는 재조합 단일 사슬 항체 ("scFv 단백질"), 과가변영역을 모방하는 아미노산 잔기로 이루어지는 최소 인지 단위, 등과 합성 항원-결합 펩티드 및 폴리펩티드를 아우른다.
"키메릭 항체"는 설치류 항체로부터 유도된 가변 영역 및 상보하는 결정 영역을 함유하는 한편 항체 분자의 나머지는 사람 항체로부터 유도된 재조합 단백질이다.
"인간화된 항체"는 단클론성 항체의 쥐과 상보성 결정 영역이 쥐과 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변 사슬로부터 사람 가변 도메인으로 전달된 재조합 단백질이다. 쥐과 항체로부터 유도된 사람에서 치료적 용도로 사용되기 위해 인간화된 항체, 예를 들어 사람 단백질에 결합하거나 중화시키는 항체의 구성은 당업자에게 알려져 있다.
본원에서 사용되는 용어 "Fc 단편," "Fc 영역," 또는 "Fc 도메인"은 동의어로서, 세포 상에서 항체 수용체에 결합하는 데 기여하는 항체의 일부 및 보체의 C1q 성분을 말한다. Fc는 "단편 결정"을 나타내는 것으로, 단백질 결정을 쉽게 형성할 항체의 단편이다. 원래 단백질 가수분해성 소화에 의해 설명되는 뚜렷한 단백질 단편은 면역글로불린 단백질의 전체적인 일반 구조를 규정할 수 있다. 문헌에서 원래 정의된 것과 같이, Fc 단편은 이황화-결합된 중쇄 힌지 영역, CH2 및 CH3 도메인으로 구성된다. 그러나 보다 최근에 와서, 그 용어는 CH3, CH2, 및 그러한 두 번째 사슬과 이황화-결합된 이량체를 형성하기에 충분한 힌지의 최소한 일부분으로 구성되는 단일 사슬에도 적용된다. 면역글로불린 구조 및 기능에 대한 개관은 문헌을 참조할 수 있다 (Putnam, The Plasma Proteins, Vol. V (Academic Press, Inc., 1987), pp. 49-140; 및 Padlan, Mol . Immunol . 31:169-217, 1994). 본원에서 사용되는 용어 Fc는 자연 발생 서열의 변이체를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "단일 사슬 Fc," "단일 사슬 Fc 도메인," 및 "scFc"는 동의어이고, 가요성 링커에 의해 결합된 두 개의 Fc 도메인 단량체를 포함하는폴리펩티드를 말하고, 이때 두 개의 Fc 단량체는 Fc 수용체에 결합할 수 있는 기능성 이량체 Fc 도메인을 형성하기 위해 이량체화할 수 있다. 단일 사슬 Fc 폴리펩티드는 2008년 4월 18일에 "단일 사슬 Fc, 그것의 제조 방법 및 치료 방법"이라는 제목으로 출원된 국제 PCT 특허 출원 US08/060852에서 한층 더 설명되며, 그것의 개시내용은 본원에 전체적으로 참조로 삽입된다.
본원에서 사용되는 용어 "ADCC 활성을 가지는 Fc 영역"은 Fc 수용체를 발현하는 세포 용해성 면역 이펙터 세포 (예컨대 NK 세포 또는 CD8+ T 세포) 상에서 세포용해성 Fc 수용체 (예컨대 FcγRIIIα)의 결합을 통해 항체 의존성 세포의 세포독성 (ADCC)을 중재할 수 있는 Fc 도메인을 말한다.
용어 "보체"는 항원-결합 항체와 함께, 세포를 용해하는 능력을 나타내는 정상 혈청 중의 그런 성분들을 포괄적으로 나타낸다. 보체는 혈청 단백질의 그룹으로 구성되고, 이때 혈청 단백질은 그것의 효과를 발휘하기 위해 협조적으로 또는 질서정연한 순서로 작용한다.
본원에서 사용된 용어 "고전적인 보체 경로" 및 "고전적인 보체 시스템"은 동의어이고, 보체를 활성화하기 위한 특별한 경로를 나타낸다. 고전적 경로는 개시를 위해 항원-항체 복합체를 필요로 하고, 질서정연한 방식으로, C1 내지 C9로 표시된 9개의 주요 단백질 성분의 활성화를 포함한다. 활성화 과정의 여러 단계에 있어서, 생성물은 후속되는 단계를 촉매하는 효소이다. 이런 일련의 단계적인 반응은 상대적으로 작은 초기 신호에 의해 보체의 증폭 및 다량의 활성화를 제공한다.
본원에서 사용된 용어 "CDC 활성을 가지는 Fc 영역"은 C1q 보체 단백질의 결합 및 고전적 보체 시스템의 활성화를 통해 보체 의존성 세포독성 (CDC)를 중재할 수 있는 Fc 도메인을 말한다.
본원에서 사용되는 용어 "제제"는 요소, 화합물, 또는 다른 분자 독립체, 이를테면 예컨대 약제학적, 치료적 또는 약리학적 화합물을 의미한다. 제제는 천연 제제 또는 합성 제제 또는 그것의 조합물일 수 있다. "치료제"는 세포 또는 조직에 대해 (예컨대 zB7H6을 발현하는 세포 또는 조직, 예를 들면 zB7H6-발현 암세포에 대해) 단독으로 또는 다른 제제 (예컨대 선구 약물과 조합된 선구 약물 전환 효소)와 조합하여 치료적 (예컨대 유익한) 효과를 발휘하는 제제이다. 본 발명의 특정 측면으로, "치료제"는 치료법에 유용한 포합체를 생성하기 위해 항체에 포합된 제제이다. 치료제의 실례로는, 약물, 독소, 면역조절제, 킬레이터, 붕소 화합물, 광활성제 또는 염료, 및 방사성 동위원소가 있다. 어떤 변형예에서, 항체에 포합하기 위한 치료제는 세포독성 또는 세포증식 억제 효과를 발휘하는 제제이다.
세포에 대한 제제의 효과와 관련하여 "세포독성 효과"는 세포의 죽음을 의미한다. "세포독성 효과"는 세포 증식의 억제를 의미한다. "세포독성제"는 세포에 대해 세포독성 또는 세포증식 억제 효과를 가짐으로써 세포 집단 내에서 세포의 성장을 각각 격감시키거나 억제하는 제제를 의미한다.
"검출가능한 표지"는 진단에 유용한 분자를 생성하기 위하여 항체 부분에 포합될 수 있는 분자 또는 원자이다. 검출가능한 표지의 실례로는 킬레이터, 광활성제, 방사성 동위원소, 형광제, 상자성 제제, 또는 다른 마커 부분을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "친화성 태그"는 두 번째 폴리펩티드의 정제 또는 검출을 제공하기 위해 또는 기질에 두 번째 폴리펩티드의 부착을 위한 부위를 제공하기 위해 두 번째 폴리펩티드에 부착될 수 있는 폴리펩티드 절편을 나타낸다. 원칙적으로 항체 또는 다른 특이적 결합제가 활용될 수 있다면 어떠한 펩티드 또는 단백질이든지 친화성 태그로서 사용될 수 있다. 친화성 태그는 폴리-히스티딘 관, 단백질 A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991), 글루타티온 S 트란스페라제 (Smith and Johnson, Gene 67:31, 1988), Glu-Glu 친화성 태그 (Grussenmeyer et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 82:7952, 1985), 물질 P, FLAG 펩티드 (Hopp et al., Biotechnology 6: 1204, 1988), 스트렙트아비딘 결합 펩티드, 또는 다른 항원성 에피토프 또는 결합 도메인을 포함한다 (Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95, 1991). 친화성 태그를 코드화하는 DNA 분자는 상업적인 공급업체로부터 이용할 수 있다 (예컨대 Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
"네이키드 항체"는 항체 단편과는 반대로, 치료제와 포합되지 않은 전체 항체이다. 네이키드 항체는 다클론성 및 단클론성 항체 둘 다를 포함할 뿐 아니라 키메릭 및 인간화된 항체와 같은 특정 재조합 항체를 포함한다.
용어 "단클론성 항체"는 단일 세포 클론, 이를테면 진핵 또는 원핵 세포 클론, 또는 파지 클론으로부터 유도되고, 그것에 의해 생성된 방법이 아닌 항체를 나타낸다. 그러므로 본원에서 사용된 용어 "단클론성 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생성된 항체에 국한되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "항체 성분"은 전체 항체와 항체 단편을 둘 다 포함한다.
"면역포합체"는 치료제 또는 검출가능한 표지와 항체 성분의 포합체이다.
본원에서 사용되는 용어 "항체 융합 단백질"은 항체 성분과 zB7H6 폴리펩티드 성분을 포함하는 재조합 분자를 나타낸다. 항체 융합 단백질의 실례는 zB7H6 세포외재성 도메인, 및 Fc 도메인 또는 항원-결합 영역 중 어느 하나를 포함하는 단백질을 포함한다.
진핵세포에서, RNA 중합효소 II는 구조적 유전자의 전사를 촉매하여 mRNA를 생성한다. 핵산 분자는 RNA 전사물이 특이적 mRNA의 서열에 상보하는 서열을 가지는 RNA 중합효소 II 주형을 함유하기 위해 디자인될 수 있다. RNA 전사물은 "안티-센스 RNA"로 명명되며, 안티-센스를 코드화하는 핵산 분자는 "안티-센스 유전자"로 명명된다. 안티-센스 RNA 분자는 mRNA에 결합할 수 있고, 그 결과 mRNA 번역이 억제된다.
"억제성 폴리뉴클레오티드"는 두 번째 (표적) 폴리뉴클레오티드의 발현 (전사 또는 번역)을 감소 또는 방해하는 DNA 또는 RNA 분자이다. 억제성 폴리뉴클레오티드는 안티센스 폴리뉴클레오티드, 리보자임, 및 외부 안내 서열을 포함한다. 용어 "억제성 폴리뉴클레오티드"는 추가로 실제 억제성 종을 코드화하는 DNA 및 RNA 분자, 예컨대 리보자임을 코드화하는 DNA 분자를 포함한다.
"zB7H6에 특이적인 안티-센스 올리고뉴클레오티드" 또는 "zB7H6 안티-센스 올리고뉴클레오티드"는 (a) zB7H6의 부분과 안정한 트리플렉스를 형성할 수 있거나, 또는 (b) zB7H6 유전자의 mRNA 전사물의 부분과 안정한 듀플렉스를 형성할 수 있는 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드이다.
"리보자임"은 촉매적 중심을 함유하는 핵산 분자이다. 이 용어는 RNA 효소, 자기-스플라이싱 RNA, 자가-절단 RNA, 및 이들 촉매적 기능을 수행하는 핵산 분자를 포함한다. 리보자임을 코드화하는 핵산 분자는 "리보자임 유전자"로 명명된다.
"외부 안내 서열"은 내인성 리보자임, RNase P를 세포내 mRNA의 특별한 종에 대해 지시하여 RNase P에 의해 mRNA의 절단을 유발하는 핵산 분자이다. 외부 안내 서열을 코드화하는 핵산 분자는 "외부 안내 서열 유전자"로 명명된다.
용어 "변이체 zB7H6 유전자"는 SEQ ID NO:2의 변형인 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 분자를 말한다. 그런 변이체는 zB7H6 유전자의 자연 발생적인 다형태뿐 아니라 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 보존성 아미노산 치환체를 함유하는 합성 유전자를 포함한다. zB7H6 유전자의 추가의 변이체 형태는 본원에서 설명되는 뉴클레오티드 서열의 삽입 또는 결실을 함유하는 핵산 분자이다. 변이체 zB7H6 유전자는 예를 들면 유전자가 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산 분자, 또는 그것의 보체와 엄격한 조건하에서 혼성체를 형성하는 지의 여부를 측정함으로써 확인될 수 있다.
또는 달리 변이체 zB7H6 유전자는 서열 비교에 의해 확인될 수 있다. 만약 두 아미노산 서열의 아미노산 잔기가 최대한 관련되도록 배열될 때 동일하다면 두 아미노산 서열은 "100% 아미노산 서열 동일성"을 가진다. 유사하게, 두 개의 뉴클레오티드 서열은 만약 두 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 잔기가 최대한 관련되도록 배열될 때 "100% 뉴클레오티드 서열 동일성"을 가진다. 서열 비교는 DNASTAR (Madison, Wisconsin)에 의해 제조된 LASERGENE 생물정보학 컴퓨터 사용 세트에 포함되는 것과 같은 표준 소프트웨어 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 두 개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 최적 배열을 측정하는 것에 의해 비교하는 다른 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다 (예를 들어 Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology : Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997); Wu et al. (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins," in Methods in Gene Biotechnology 123-151 (CRC Press, Inc. 1997); Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing (2nd ed., Academic Press, Inc. 1998)). 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 만약 두 서열이 상호 관련하여 최소한 80%, 최소한 90%, 또는 최소한 95%의 서열 동일성을 가진다면 "실질적으로 유사한 서열 동일성" 또는 "실질적인 서열 동일성"을 가지는 것으로 간주된다. 서열 동일성을 가지는 특별한 방법은 아래에서 설명된다.
변이체 zB7H6 유전자 또는 변이체 zB7H6 폴리펩티드를 확인하기 위해 사용된 특별한 방법과 관계없이, 변이체 유전자에 의해 코드화된 변이체 유전자 또는 폴리펩티드는 항-zB7H6 항체에 특이적으로 결합하는 능력에 의해 기능적으로 특징지어질 수 있다. 변이체 zB7H6 유전자 또는 변이체 zB7H6 폴리펩티드는 또한 본원에서 설명되는 것과 같은 생물학적 또는 생화학적 분석법을 사용하여 NKp30에 결합하는 능력에 의해 기능적으로 특징지어질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "대립형질 변이체"는 동일한 염색체 유전자좌를 차지하는 유전자의 둘 또는 그 이상의 대체 형태 중 어느 하나를 나타낸다. 대립형질 변이는 돌연변이를 통해 자연적으로 일어나며, 집단 내에서 표현형으로 다형태를 초래할 수 있다. 유전자 돌연변이는 사일런트이거나 (코드화된 폴리펩티드에 변화가 없음) 또는 변경된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코드화할 수 있다. 용어 대립형질 변이체는 또한 본원에서 유전자의 대립형질 변이체에 의해 코드화된 단백질을 표시하기 위해 사용된다.
용어 "오르토로그 (ortholog)"는 상이한 종으로부터의 폴리펩티드 또는 단백질의 기능성 대응물인 한 종으로부터 얻어지는 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 오르토로그 사이의 서열 차이는 종분화의 결과이다.
"파라로그 (paralog)"는 구별되지만 유기체에 의해 제조되는 구조적으로 관련된 단백질이다. 파라로그는 유전자 복제를 통해 발생하는 것으로 여겨진다. 예를 들어 α-글로빈, β-글로빈, 및 미오글로빈은 상호간에 파라로그이다.
본원에서 사용되는 "NK 세포 활성"은 NK 세포의 세포용해성 활성을 말한다. 그러한 활성을 검출 및/또는 모니터링하기 위한 수많은 방법이 당업자에게 잘 알려져 있는데, 이를테면 본원에 제공되는 실시예에서 설명되는 분석법이 있으며, 그것들에 한정되지는 않는다.
본원에 사용되는 구절 "zB7H6과 NKp30의 상호작용"은 기능성 zB7H6 수용체의 NKp30과의 직접적인 물리적 상호작용 (예컨대 결합) 및/또는 다른 간접적인 상호작용의 결과 zB7H6 수용체 및/또는 NKp30의 자극 및 관련된 세포내 신호화를 유발하는 것을 말한다.
본원에서 사용되는 용어 "차단제"는 예를 들어 세포용해성 활성에 의해 측정되는 것과 같이, zB7H6과 NKp30과의 상호작용을 간섭하는 및/또는 zB7H6이 NK 세포 활성을 야기하는 능력을 간섭하는 그런 제제를 포함한다. 예시적인 제제는 기능-차단 항체뿐 아니라 zB7H6과 NKp30과의 결합을 차단하지만 NK 세포에서 zB7H6-중재된 신호화를 자극하는 데는 실패하는 펩티드 (예컨대 zB7H6-유도된 펩티드, 펩티드 모방체, 작은 분자, 등)를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "모방체"는 zB7H6과 NKp30의 상호작용을 모방하는, 및/또는 zB7H6 및/또는 NKp30의 NK 세포 활성을 야기하는 능력을 증대, 증강 또는 증가시키는 제제를 포함한다. 예시적인 제제로는 zB7H6 가용성 수용체, zB7H6의 NKp30에 결합하는 능력을 증대 또는 증강시키는 또는 NKp30-중재된 신호화를 자극하는데 있어 zB7H6을 대체하는 펩티드 (예컨대 B7H6-유도된 펩티드, 펩티드 모방체, 작은 분자, 등), 및 zB7H6 항-이디오타입 항체를 포함한다.
본 발명은 zB7H6 폴리펩티드의 기능성 단편을 포함한다. 본 발명의 맥락 내에서, zB7H6의 "기능성 단편"은 NKp30에 최소한 특이적으로 결합하는 zB7H6 폴리펩티드의 부분을 말한다. 어떤 구체예에서, zB7H6의 기능성 단편은 NKp30-중재된 NK 세포 활성화를 야기하거나 증강시킬 수 있고, 다른 구체예에서 기능성 단편은 NKp30-중재된 NK 세포 활성화를 차단 또는 감소시킬 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "zB7H6-관련 제제" 또는 "zB7H6-관련 조성물"은 zB7H6 기능적 활성 또는 zB7H6 기능적 활성의 억제를 증명하는 제제, 또는 zB7H6-특이적 결합을 증명하는 제제를 나타낸다. 그런 제제로는 예를 들면 가용성 zB7H6 폴리펩티드, 항-zB7H6 항체, 항-zB7H6 항체-약물 포합체, zB7H6 항-이디오타입 항체 또는 다른 zB7H6 모방제, zB7H6-코드화 폴리뉴클레오티드, 억제 폴리뉴클레오티드 등이 있다.
제제 또는 조성물과 관련하여 "zB7H6 기능적 활성을 증명한다" 또는 "zB7H6 활성을 증명한다"는 구절은 일반적으로 zB7H6 모방제 (이를테면 예컨대 가용성 zB7H6 폴리펩티드 및 zB7H6 항-이디오타입 항체)뿐만 아니라 zB7H6 기능적 활성을 가지는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 말한다.
제제 또는 조성물과 관련하여 "zB7H6 기능적 활성의 억제를 증명한다"는 구절은 일반적으로 zB7H6 차단제 (이를테면 예컨대 기능-차단 항-zB7H6 항체 및 zB7H6의 NKp30과의 결합을 차단하지만 zB7H6-중재된 신호화를 자극하지 못하는 펩티드)뿐만 아니라 zB7H6 유전자의 발현을 감소 또는 방해하는 핵산 (즉 zB7H6 억제 폴리뉴클레오티드)을 말한다.
본원에서 사용되는 용어 "NK 세포-관련된 질병 또는 장애"는 일반적으로 NK-세포-중재된 질병 또는 장애뿐 아니라 불충분한 NK 세포 활성을 특징으로 하는 질병 또는 장애를 말한다.
본원에서 사용되는 구절 "불충분한 NK 세포 활성을 특징으로 하는 질병 또는 장애"는 최소한 부분적으로는 NK 세포 세포용해성 활성에 대한 표적으로서 작용할 수 있지만, 최소한 부분적으로는 NK 세포-중재된 세포독성을 피한 결과로서 질병 또는 장애에서 현저한 병원성 세포를 포함하는 모든 질병 또는 장애를 나타낸다. 그런 병원성 세포는 전형적으로 MHC 부류 I 발현이 결핍된 것들, 예를 들면 특정 종양 세포 또는 바이러스-감염 세포이다. 따라서 불충분한 NK, 세포 활성을 특징으로 하는 전형적인 질병 또는 장애는 암 및 많은 감염성 질병이다. 그런 질병 및 장애는 특히 NK 세포 활성을 증강시키기 위한 특정 치료 방법에 적용될 수 있으며, 이것에 대해서는 본원에서 추가로 설명된다.
본원에서 사용되는 용어 "NK 세포-중재된 질병 또는 장애"는 최소한 부분적으로는 NK 세포 세포용해성 활성에 의해 중재되는 병리학을 가지는 모든 질병 또는 장애를 말한다. 그런 질병 또는 장애의 실례는 골수 세포 (BMC) 동종이식편의 급성 거부반응이다. 그런 질병 또는 장애는 본원에서 추가로 설명되는 것과 같이 NK 세포 활성을 억제하기 위한 특정 치료 방법에 특히 적용된다.
본원에서 설명된 대상에게 가용성 zB7H6 폴리펩티드 또는 항체를 투여함으로써 NK 세포-관련 질병 또는 장애를 치료하는 맥락에서 용어 "효과적인 양"은 NK 세포-관련 질병 또는 장애의 발생을 억제하거나 하나 또는 그 이상의 증상들을 개선하기 위해서 대상에서 NK 세포-중재된 반응을 조절하기에 충분한 그런 분자의 양을 말한다. 제제의 효과적인 양은 본 발명의 방법에 따라 "효과적인 처방"으로 투여된다. 용어 "효과적인 처방"은 질병 또는 장애의 치료 또는 방해를 이루기에 적당한 투여되는 제제의 양과 단위용량 빈도의 조합을 말한다.
표준 분석적 방법의 불명확으로 인해, 중합체의 분자량과 길이는 대략적인 값으로 인지되어야 한다. 그러한 값은 "약" X 또는 "대략" X로 표시되며, X의 진술된 값은 ±10%까지 정확한 것으로 인지될 것이다.
III. zB7H6 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 숙주 세포, 및 관련된 제조 방법
본 발명의 zB7H6 폴리펩티드는 일반적으로 zB7H6 세포외재성 도메인 (SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266), 또는 그것의 기능성 변이체 또는 단편을 포함한다. 그러한 zB7H6 폴리펩티드는 예를 들면 NK 세포 활성의 조절과 암 또는 감염성 질병과 같은 장애의 치료에 유용할 뿐만 아니라 zB7H6과 NKp30과의 기능적 상호작용에 대항하는 활성에 대한 제제를 선별하는 방법에도 유용하다. 일반적으로 본 발명의 zB7H6 폴리펩티드는 다음의 것으로부터 선택된 폴리펩티드 영역을 포함한다:
(i) SEQ ID NO:2의 zB7H6 폴리펩티드의 세포외재성 도메인 (즉 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266);
(ii) SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266과 최소한 80%의 동일성을 가지는 (i)의 zB7H6 세포외재성 도메인의 기능성 변이체; 및
(iii) (i)의 zB7H6 세포외재성 도메인 또는 (ii)의 도메인 변이체의 기능성 단편.
특정 구체예에서, zB7H6 폴리펩티드는 가용성 수용체 폴리펩티드이다. 그러한 zB7H6의 가용성 형태는 기능성 경막 도메인이 결핍되어 있고 전형적으로 또한 실질적으로 세포내 폴리펩티드 절편이 없다. 어떤 대체 구체예에서, zB7H6 폴리펩티드는 zB7H6의 세포막-결합 형태, 예컨대 기능성 경막 도메인 또는 GPI 연쇄를 포함하는 zB7H6 폴리펩티드이다. zB7H6의 세포막 결합된 형태는 예를 들면 전체 길이와 실질적으로 전체 길이 형태의 zB7H6 단백질, 예컨대 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266을 포함하는 또는 그것으로 이루어지는 폴리펩티드, 또는 그것의 변이체를 포함한다.
기능성 세포외재성 도메인 변이체를 포함하는 zB7H6 폴리펩티드의 어떤 구체예에서, 변이체는 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266과 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 가진다. 유사하게 세포외재성 도메인 변이체의 기능성 단편을 포함하는 다른 구체예에서, 단편은 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266과 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 가진다. 앞에서 나타낸 바와 같이 특정 구체예에서, zB7H6 폴리펩티드는 추가로 경막 및 세포내 도메인 성분을 포함할 수 있고, 그러한 어떤 구체예에서, 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266과 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 가진다.
% 서열 동일성은 종래 방법에 의해 측정된다 (Altschul et al., Bull . Math . Bio. 48:603, 1986, 및 Henikoff and Henikoff, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:10915, 1992). 예를 들어 두 개의 아미노산 서열은 아래의 표 1에 나타낸 바와 같이 헤니코프와 헤니코프 (상기 동일)의 10의 갭 오프닝 페널티, 1의 갭 연장 페널티, 및 "BLOSUM62" 측정 행렬을 사용하여 정렬 점수를 최적화하기 위해 배열될 수 있다 (표 1에서 아미노산은 표준 한-문자 암호로 표시된다). 그런 다음 % 동일성은 다음과 같이 계산된다: ([동일한 매치의 총 수]/[더 긴 서열의 길이 + 두 서열을 배열하기 위해 더 긴 서열로 도입된 갭의 수])(100).
Figure pct00001
당업자는 두 아미노산 서열을 배열하기 위해 활용할 수 있는 정립된 알고리즘이 많이 있다는 것을 안다. Pearson과 Lipman의 "FASTA" 유사성 연구 알고리즘은 본원에 개시된 아미노산 서열과 추정되는 zB7H6 변이체의 아미노산 서열에 의해 공유된 동일성의 수준을 조사하기 위한 적당한 단백질 배열 방법이다. FASTA 알고리즘은 문헌에 설명되어 있다 (Pearson and Lipman, Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 85:2444, 1988, and by Pearson, Meth . Enzymol . 183:63, 1990). 간단히 설명하면, FASTA는 먼저 문제의 서열 (예컨대 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266)과 가장 높은 밀도의 동일성 (만약 ktup 변수가 1이라면) 또는 동일성 쌍 (ktup=2라면) 중 어느 하나를 가지는 시험 서열에 의해 공유된 영역을, 보존성 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 고려함이 없이 확인함으로써 서열 유사성을 특징으로 한다. 그런 다음 가장 높은 밀도의 동일성을 가지는 10개의 영역을 아미노산 치환 매트릭스를 사용하여 쌍을 이루는 모든 아미노산의 유사성을 비교함으로써 다시 점수를 매기고, 영역의 단부를 "트리밍"하여 가장 높은 점수에 기여하는 그런 잔기들만을 포함하도록 한다. 만약 "컷오프"보다 큰 점수 (서열의 길이와 ktup 값을 토대로 예정된 식에 의해 계산된)를 가지는 여러 영역이 있다면 손질된 개시 영역은 그 영역들이 갭을 가지는 거의 정확한 배열을 형성하기 위해 결합될 수 있는 지의 여부를 측정하기 위해 조사된다. 마지막으로, 두 아미노산 서열의 가장 높은 점수 영역이 Needleman-Wunsch-Sellers 알고리즘을 변형 사용하여 배열되고 (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol . 48:444, 1970; Sellers, SIAM J. Appl . Math . 26:787, 1974), 그것으로 인해 아미노산 삽입 및 결실이 가능해진다. FASTA 분석에 대한 예시적인 매개변수는 다음과 같다: ktup=1, 갭 오프닝 페널티=10, 갭 연장 페널티=1, 및 치환 매트릭스= BLOSUM62. 이들 매개변수는 Pearson의 부록 2에서 설명된 것과 같이, 측정 행렬 파일 ("SMATRIX")을 변형함으로써 FASTA 프로그램에 도입될 수 있다 (Appendix 2 of Pearson, Meth . Enzymol . 183:63, 1990).
FASTA는 또한 상기에서 설명된 것과 같은 비율을 사용하여 핵산 분자의 서열 동일성을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 뉴클레오티드 서열 비교를 위해 ktup 값은 1 내지 6, 바람직하게는 3 내지 6의 범위, 가장 바람직하게는 3일 수 있고, 다른 매개변수는 위에서 설명된 것과 설정된다.
본 발명은 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266의 아미노산 서열과 비교하여 보존성 아미노산 변화를 나타내는 가용성 zB7H6 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266의 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 함유하는 zB7H6 변이체가 얻어질 수 있는데, 그때 알킬 아미노산은 zB7H6 아미노산 서열에서 알킬 아미노산에 대해 치환되며, 방향족 아미노산은 zB7H6 아미노산 서열에서 방향족 아미노산에 대해 치환되고, 황-함유 아미노산은 zB7H6 아미노산 서열에서 황-함유 아미노산에 대해 치환되며, 히드록시-함유 아미노산은 zB7H6 아미노산 서열에서 히드록시-함유 아미노산에 대해 치환되고, 산성 아미노산은 zB7H6 아미노산 서열에서 산성 아미노산에 대해 치환되며, 염기성 아미노산은 zB7H6 아미노산 서열에서 염기성 아미노산에 대해 치환되고, 또는 이염기성 모노카르복실 아미노산은 zB7H6 아미노산 서열에서 이염기성 모노카르복실 아미노산에 대해 치환된다. 통상적인 아미노산 중에서, "보존성 아미노산 치환"은 예를 들면 각각의 다음 그룹에 있는 아미노산 중의 치환으로 예시된다: (1) 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신, (2) 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판, (3) 세린 및 트레오닌, (4) 아스파테이트 및 글루타메이트, (5) 글루타민 및 아스파라긴, 및 (6) 라이신, 아르기닌 및 히스티딘. 보존성 아미노산 변화의 예시적인 그룹은 추가로 아래의 표 2에 나타낸다.
보존성 아미노산 치환
염기성 산성 극성 소수성 방향족 소형
아르기닌 글루타메이트 글루타민 류신 페닐알라닌 글리신
라이신 아스파테이트 아스파라긴 이소류신 트립토판 알라닌
히스티딘 발린 티로신 세린
메티오닌 트레오닌
메티오닌
BLOSUM62 표는 관련된 단백질의 500 이상의 그룹의 고도로 보존된 영역을 나타내는, 단백질 서열 절편의 약 2,000개의 부분 다중 배열로부터 유도된 아미노산 치환 매트릭스이다 (Henikoff and Henikoff, Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 89: 10915, 1992). 따라서, BLOSUM62 치환 빈도는 본 발명의 아미노산 서열에 도입될 수 있는 보존성 아미노산 치환을 정의하기 위해 사용될 수 있다. 비록 단독으로 화학적 특성을 토대로 아미노산 치환을 디자인하는 것이 가능할지라도 (상기에서 논의된 것과 같이), "보존성 아미노산 치환"이란 표현은 바람직하게는 -1보다 큰 BLOSUM62 값에 의해 표시된 치환을 말한다. 예를 들어 아미노산 치환은 만약 치환이 0, 1, 2 또는 3의 BLOSUM62 값을 특징으로 한다면 보존적이다. 이 시스템에 따라서, 바람직한 보존성 아미노산 치환은 최소한 1의 (예컨대 1, 2 또는 3의) BLOSUM62 값을 특징으로 하는 한편, 보다 바람직한 보존성 아미노산 치환은 최소한 2 (예컨대 2 또는 3)의 BLOSUM62 값을 특징으로 한다. zB7H6의 특별한 변이체는 상응하는 아미노산 서열 (예컨대 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266)에 대해 최소한 80%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 가지는 것을 특징으로 하며, 이때 아미노산 서열의 변이는 하나 또는 그 이상의 보존성 아미노산 치환에 기인한다.
기능성 zB7H6 변이체 또는 단편 폴리펩티드는 NKp30 (예컨대 사람 NKp30)에 특이적으로 결합하는 변이체 또는 단편의 능력을 평가하기 위한 기본적인 분석법, 및/또는 NKp30-중재된 NK 세포 활성화를 야기하는 변이체 또는 단편의 능력을 평가하기 위한 분석법을 사용하여 쉽게 확인될 수 있다. 예를 들어 NKp30을 발현하는 세포는 가용성 zB7H6 폴리펩티드를 사용하는 FACS에 의해 프로브될 수 있고, 가용성 zB7H6 폴리펩티드는 그것의 부분에 특이적인 이차 시약 (예를 들면 비오티닐화된 zB7H6 폴리펩티드를 검출하기 위한 플루오로포어-포합된 스트렙트아비딘, 또는 Fc 단편을 포함하는 zB7H6 융합 단백질을 검출하기 위한 플루오로포어-포합된 항-IgG 항체)을 사용하여 직접적으로 표지되거나 검출될 수 있다. 다른 변형예에서, 기능성 zB7H6 폴리펩티드는 표적 세포에 대항하여 NK 세포 세포용해 활성을 야기하는 그것의 능력에 의해 확인될 수 있다.zB7H6 변이체 및 단편의 zB7H6-관련 기능을 평가하기 위한 예시적인 분석법은 본원에서 추가로 설명된다.
특정 변형예에서, 가용성 zB7H6 폴리펩티드는 zB7H6 세포외재성 도메인, 그것의 기능성 변이체 또는 단편, 및 이종성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이다. 적당한 이종성 폴리펩티드로는 면역글로불린 중쇄 불변 영역이 있다. 예를 들어 어떤 구체예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 Fc 단편 (예컨대 사람 Fc 단편)이고, 그것은 둘 또는 세 개의 불변 영역 도메인 및 힌지 영역을 함유하지만 가변 영역을 함유하지는 않는다 (예컨대 Sledziewski 등의 미국 특허 제 6,018,026호 및 5,750,375호). Fc 단편을 포함하는 그런 융합은 전형적으로 Fc 부분들이 상호간에 이황화 결합되고 두 개의 수용체 폴리펩티드가 상호간에 가깝게 배열되어 있는 다량체, 전형적으로 이량체의 분자로서 분비된다. 예시로서 미국 특허 제 5,723,125호 (Chang et al.)에는 사람 인터페론 및 사람 면역글로불린 Fc 단편을 포함하는 융합 단백질이 설명되어 있다. 인터페론의 C-말단은 Fc 단편의 N-말단에 펩티드 링커 부분에 의해 연결되어 있다. 펩티드 링커의 실례는 주로 면역학적으로 비활성인 T 세포 비활성 서열을 포함하는 펩티드이다. 예시적인 Fc 부분은 사람 γ4 사슬이고, 그것은 용액상태에서 안정하며 보체 활성화 활성을 거의 갖지 않거나 전혀 갖지 않는다. 다른 적당한 Fc 부분은 실질적으로 감소된 이펙터 기능이 결핍되어 있거나 가지는 사람 γ1 사슬의 변이체, 예를 들면 Fc4 (SEQ ID NO:31), Fc5 (SEQ ID NO:32), Fc6 (SEQ ID NO:33), 및 Fc7 (SEQ ID NO:34)이고, 이것들은 도 13a 내지 13c에 도시된다. 따라서 어떤 구체예에서, 본 발명은 zB7H6 세포외재성 도메인, 또는 그것의 기능성 변이체 또는 단편, 및 Fc 단편 (예컨대 사람 Fc 단편 또는 그것의 변이체)를 포함하는 zB7H6 융합 단백질을 제공하며, 이때 zB7H6 세포외재성 도메인, 또는 그것의 기능성 변이체 또는 단편의 C-말단은 펩티드 링커를 통하여 Fc 단편의 N-말단에 부착된다.
가용성 B7H6 융합 단백질의 제조에 특히 적당한 다른 이종성 폴리펩티드는 VASP 도메인을 포함한다. 가용성 수용체 융합 단백질에 VASP 도메인을 사용하는 것은 미국 특허 출원 공개 번호 2007/0254339DP 보다 상세하게 설명되어 있으며, 그것은 본원에 참조로 삽입된다. VASP 도메인은 많은 종에 존재하는 VASP 유전자로부터 유도된다. 서열은 휘감긴 코일 단백질 구조를 형성하는 예상된 그것의 능력에 대해 선택되는데, 왜냐하면 이런 구조는 다량체 단백질 형태를 형성하는 그것의 능력에 중요하기 때문이다. 특히 본 발명에 대해 바람직한 것은 사량체 단백질 구조를 생성하는 휘감긴 코일 단백질의 능력이다. 특히 바람직한 구체예는 SEQ ID NO:4에 표시된 전체 길이의 폴리펩티드 서열인 사람 VASP 서열의 아미노산 342 내지 375를 활용한다. 사람 VASP 단백질을 코드화하는 전체 길이의 DNA 서열은 SEQ ID NO:3에 표시된다.
다량체화 서열의 다른 유형, 예컨대 로이신 지퍼를 사용한 작업 결과, 제한된 수의 보존성 아미노산 치환 (d 잔기에서조차)은 때로 다량체화하는 분자의 능력의 손실 없이 지퍼 서열에 허용될 수 있다 (Landschulz et ah, Science 243: 1681-1688, 1989). 그로써 VASP 도메인에 대한 원래의 서열로부터의 보존성 변화는 본 발명의 범주 내에 포함된다. 예를 들어 상기 표 2는 휘감긴 코일 구조에 의해 허용될 것으로 예상되는 예시적인 보존성 변화를 나타낸다.
만약 하나 이상의 융합 단백질이 헤테로-다량체 단백질, 예컨대 이종사량체를 생성하기 위해 사용된다면, 사용되는 VASP 도메인은 융합 단백질 또는 상이한 VASP 도메인 둘 다에 대해, 이들 도메인이 상호간에 결합되고 다량체 단백질을 형성하는 능력을 갖고 있는 한 동일한 도메인일 수 있다.
특정 구체예에서, VASP 도메인은 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266 (또는 그것의 기능성 변이체 또는 단편)에 도시된 것과 같은 zB7H6 세포외재성 도메인의 C 말단에 연결된다. 추가로, VASP 도메인은 단백질의 중간에 위치할 수 있으며, 그것은 두 개의 비-VASP 폴리펩티드 절편이 양옆에 있는 VASP 도메인과 이중 융합 단백질을 효과적으로 생성하며, 이때 VASP 도메인의 양옆에 있는 폴리펩티드 절편 중 최소한 하나는 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266 (또는 그것의 기능성 변이체 또는 단편)에 도시된 것과 같은 zB7H6 세포외재성 도메인이다. 어떤 변형예에서, VASP 도메인의 옆에 있는 두 번째 폴리펩티드 절편은 zB7H6 결합 활성의 유익에 대해 특이적인 세포 또는 조직에 대한 가용성 수용체를 표적으로 하기 위해 디자인된 폴리펩티드 절편이다.
가용성 zB7H6 융합 구성물에 다량체화 이종성 폴리펩티드 서열을 사용한 한 가지 결과는 다량체 형태의 형성을 통해 리간드 또는 카운터-수용체 (예컨대 NKp30)의 친화성 또는 결합활성을 증가시키는 능력이다. 결합활성이란, 보다 큰 분자에 다량체 분자가 결합하는 강도를 의미하며, 예를 들면 항체에 의한 복합체 항원의 결합이며, 그것에 한정되지는 않는다. 친화성은 단순한 수용체-리간드 시스템의 결합 강도를 의미한다. 그런 특징은 예를 들면 수용체의 다량체화를 통해 zB7H6에 대해 더 강한 결합 특성을 가지는 결합 부위를 형성함으로써 개선될 수 있을 것이다. 결합활성 및 친화성은 당업자에게 잘 알려져 있는 표준 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. 친화성 또는 결합활성의 개선은 다량체 가용성 zB7H6 융합 단백질 및 리간드 또는 카운터-수용체에 대한 친화성 또는 결합활성 값 (예컨대 친화성 상수 또는 Ka)은 단량체 zB7H6 폴리펩티드 및 리간드 또는 카운터-수용체에 대한 값보다 더 높다. 이들 특성을 측정하는 다른 수단은 감소가 다량체화 이종성 폴리펩티드 (예컨대 VASP 사량체화 도메인)를 사용하여 친화성 또는 결합활성이 개선될 때 관찰될 수 있을 경우의 평형 상수 (Kd)이다.
가용성 zB7H6 융합 단백질의 폴리펩티드 절편 (예컨대 zB7H6 세포외재성 도메인, 또는 그것의 기능성 변이체 또는 단편, 및 zB7H6에 이종성인 절편)은 다른 단백질에 직접 연결되어 융합 단백질이 형성될 수 있고, 또는 달리 폴리펩티드 절편은 단백질이 생물학적 활성에 필요한 적절한 이차 및 삼차 구조를 형성하는 것을 보장하기 위해 충분한 거리만큼 분리될 수 있다. 적당한 링커 서열은 가요성 연장 형태를 채택할 것이며 융합 단백질의 기능성 도메인과 상호작용할 수 있는 규칙적인 이차 구조를 발달시키기 위한 경향성을 나타내지 않을 것이며, 융합 도메인의 기능을 또한 간섭할 수 있는 최소한의 소수성 또는 대전 특성 (charged character)을 가질 것이다. 링커 서열은 15 잔기 반복부를 염두에 두고 구성되어야 하는데, 왜냐하면 이종성 서열의 N 또는 C 말단을 단단하게 붙들기 위해 생물학적으로 활성인 단백질을 생성하는 것이 최상의 관심이 아닐 수 있기 때문이다. 이런 고려사항 외에 링커 서열의 길이는 융합 단백질의 생물학적 활성에 중요하게 영향을 미치는 일 없이 달라질 수 있다. 링커 서열은 친화성 태그를 포함하는 융합 단백질 (또는 발현 구성물)의 어떠한 및 모든 성분과 신호 펩티드 사이에 사용될 수 있다. 예시적인 링커는 GSGG 서열이다 (SEQ ID NO:5).
가용성 zB7H6 융합 단백질은 추가로 친화성 태그를 포함할 수 있다. 그런 태그는 융합 단백질의 생물학적 활성을 변경하지 않으며, 고도로 항원성이고, 예컨대 단클론성 항체와 같은 특이적 결합 분자에 의해 가역적으로 결합될 수 있는 에피토프를 제공함으로써 발현 융합 단백질의 신속한 검출 및 정제를 촉진한다. 친화성 태그는 또한 단백질이 대장균과 같은 박테리아에서 생성된다면 세포내 분해에 대한 내성을 전달할 수 있다. 예시적인 친화성 태그는 FLAG 태그 (SEQ ID NO:6) 또는 HIS6 태그 (SEQ ID NO:7)이다. 정제를 위해 이런 친화성 태그를 사용하여 융합 단백질을 제조하는 방법들은 미국 특허 제 5,011,912호에 설명되어 있다.
어떤 변형예에서, 가용성 zB7H6 수용체는 zB7H6 결합 활성의 유익을 위해 특이한 세포 또는 조직에 대한 가용성 수용체를 표적화하기 위해 디자인된 이종성 폴리펩티드 절편인 "표적 도메인"을 포함한다. 예를 들어 어떤 구체예에서, 가용성 융합 단백질은 종양 세포에 대해 융합 단백질을 특이하게 표적화하는 폴리펩티드 절편을 포함한다. 특별한 세포 또는 조직에 대해 융합 단백질을 표적화기에 특히 적당한 이종성 폴리펩티드 절편은 표적 세포 또는 조직과 관련된 세포 표면 마커를 인지하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함한다. 표적화 도메인의 사용은 표적 조직 (예컨대 종양)에 아주 가까운 곳에 가용성 zB7H6 수용체의 높은 국소 농도를 제공할 수 있어서, 가용성 수용체에 비-표적 조직을 노출함으로써 유발될 수 있는 바람직하지 못한 부작용을 최소화하는 것뿐만 아니라 원하는 반응을 이루기 위해 투여되어야 하는 가용성 수용체의 양을 줄일 수 있다. 또한 zB7H6 융합 단백질의 표적화 도메인 부분을 표적 세포의 표면에 결합시키는 것은 NK 세포의 표면에서 zB7H6-결합된 NKp30의 교차결합을 증강시킬 수 있어서, 추가로 표적 세포에 대항한 NK 세포 활성의 NKp30-중재된 자극을 증강시킬 수 있다.
예를 들어 종양 표적 조직의 경우에, 표적화 도메인은 종양-특이적 또는 종양-관련 항원 (즉 정상 세포가 아닌 종양 세포에 의해 발현된 항원, 또는 정상 세포에 관련하여 종양 세포에서 높은 수준으로 발현되는 항원)을 포함할 수 있다. 그런 항원의 실례로는 표피 성장 인자 수용체 패밀리 구성원 (예컨대 EGFR 및 Her2), 암종 배 발생 항원 (CEA), 뮤신 패밀리 구성원 (MUC1), 메소텔린, 폴레이트 수용체, 및 기타가 있다. 조혈성 종양에 특이적인 또는 관련된 항원이 또한 표적화될 수 있는데, 예를 들면 CD30, CD33, CD40, CD72, 및 다른 것들이 있다. 이런 모든 항원에 대한 항체는 다발성 암의 치료를 위해 승인되었거나 또는 임상적으로 시도 중에 있다. 이들 표면 수용체 중 최소한 하나에 대한 항체를 포함하는 zB7H6 융합 단백질은 분자의 국소적인 표적화를 가능하게 할 것이며, 나아가 NK 세포의 표면상에서 zB7H6-결합된 NKp30의 교차결합을 촉진할 수 있어서, 추가로 종양 세포에 대한 NK세포 활성의 NKp30-중재된 자극을 증강시킬 수 있다.
본 발명은 나아가 다양한 다른 폴리펩티드 융합을 제공한다. 예를 들면 어떤 구체예에서, zB7H6 폴리펩티드는 둘 또는 그 이상의 부분 또는 도메인, 예컨대 정제 및 표적화 도메인을 위한 친화성 태그에 융합될 수 있다. 폴리펩티드 융합은 또한 하나 또는 그 이상의 절단 부위, 특히 도메인 간의 절단 부위를 포함할 수 있다 (Tuan et al., Connective Tissue Research 34:1 (1996)).
어떤 변형예에서, zB7H6 폴리펩티드는 추가로 신호 서열 또는 리더 서열을 포함한다. 이들 서열은 일반적으로 발현 중에 숙주 세포로부터 융합 단백질이 분비되는 것을 허용하기 위해 활용되며, 또한 리더 서열, 프레프로 서열 또는 프레 서열로서 알려져 있다. 분비 신호 서열이 zB7H6으로부터 유도되는 한편, 적당한 신호 서열은 또한 다른 분비된 단백질로부터 유도되거나 (예컨대 미국 특허 제 5,641,655호에 설명된 것과 같은, 조직-형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA) 신호 서열) 또는 생체 내에서 합성될 수 있다. 분비성 신호 서열은 zB7H6-코드화 서열에 작동가능하게 연결되어서 두 개의 서열은 정확한 리딩 프레임으로 결합되고 숙주 세포의 분비 경로 안으로 새롭게 합성된 폴리펩티드를 지시하기 위해 위치된다. 분비성 신호 서열은 통상 관심의 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 한편, 특정 분비성 신호 서열은 관심의 뉴클레오티드 서열의 어느곳에든지 위치할 수 있다 (Welch 등의 미국 특허 제 5,037,743호; Holland 등의 미국 특허 제 5,143,830호).
비록 zB7H6 또는 포유류 세포에 의해 생성된 다른 단백질의 분비성 신호 서열 (예컨대 미국 특허 제 5,641,655호에서 설명된 것과 같은 조직-형 플라스미노겐 활성화제 신호 서열)이 재조합 포유류 숙주에서의 zB7H6의 발현에 유용하지만 효모 신호 서열은 효모 세포에서의 발현에 유용하다. 적당한 효모 신호 서열의 실례는 효모 짝짓기 페르몬 α-인자로부터 유도된 것 (MF α1 유전자에 의해 코드화됨), 전화효소로부터 유도된 것 (SUC2 유전자에 의해 코드화됨), 또는 산 포스파타제로부터 유도된 것 (PHO5 유전자에 의해 코드화됨)들이다 (Romanos et al., "Expression of Cloned Genes in Yeast," in DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2nd Edition, Glover and Hames (eds.), pages 123-167 (Oxford University Press 1995).
어떤 변형예에서 zB7H6 폴리펩티드는 연쇄를 통해 중합체로 화학적으로 변형된다. 전형적으로 중합체는 수용성이어서 zB7H6 폴리펩티드 포합체는 수성 환경, 예컨대 생리적 환경에서 침전되지 않는다. 적당한 중합체의 실례는 단일 반응성 기, 예컨대 아실화를 위한 활성 에스테르, 또는 알킬화를 위한 알데하이드를 가지도록 변형된 것이다. 이 방법에서 중합 정도는 조절될 수 있다. 중합체는 분지되거나 분지되지 않는다. zB7H6 폴리펩티드 포합체는 또한 그런 수용성 중합체의 혼합물을 포함할 수 있다. 폴리펩티드 및 수용성 중합체 부분을 포함하는 포합체를 제조하기 위한 일반적인 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다 (Karasiewicz 등의 미국 특허 제 5,382,657호; Greenwald 등의 미국 특허 제 5,738,846호; Nieforth et al., Clin . Pharmacol . Ther . 59:636, 1996; Monkarsh et al., Anal . Biochem . 247:434, 1997). 그런 방법들은 zB7H6을 포함하는 단일이량체, 이종이량체 또는 다량체의 가용성 수용체 포합체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
zB7H6 폴리펩티드 포합체의 한 실례는 zB7H6 폴리펩티드의 N-말단에 부착된 폴리알킬 옥사이드 부분을 포함한다. PEG는 적당한 한 가지 폴리알킬 옥사이드이다. 예시로서, zB7H6은 PEG로 변형될 수 있는데 그 과정은 "페길화 (PEGylation)"로서 알려져 있다. zB7H6의 페길화는 당해 기술분야에 공지되어 있는 페길화 반응들 중 어느 하나에 의해 수행될 수 있다 (EP 0 154 316; Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249, 1992; Duncan and Spreafico, Clin . Pharmacokinet . 27:290, 1994; Francis et al., Int J Hematol 68:1, 1998). 예를 들어 페길화는 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자와의 아실화 반응에 의해 또는 알킬화 반응에 의해 수행될 수 있다. 대체 접근법에서 zB7H6 포합체는 활성화된 PEG를 축합시킴으로써 형성되며, 그때 PEG의 말단 히드록시 또는 아미노기는 활성화된 링커에 의해 대체된다 (예컨대 Karasiewicz 등의 미국 특허 5,382,657호). 페길화 반응을 위해서는 중합체 분자의 전형적인 분자량은 약 2kDa 내지 약 100kDa, 약 5 kDa 내지 약 50kDa, 또는 약 12kDa 내지 약 25kDa이다. 수용성 중합체의 zB7H6의 몰비율은 일반적으로 1:1 내지 100:1의 범위일 것이다. 전형적으로 수용성 중합체의 Zb7h6의 몰비율은 폴리페길화에 대해서는 1:1 내지 20:1이며, 모노페길화에 대해서는 1:1 내지 5:1일 것이다.
zB7H6 폴리펩티드는 예를 들면 용액으로부터 포합체 카운터-수용체를 친화성 정제하기 위해 또는 시험관 내에서의 분석 도구로서 사용될 수 있다. 예를 들어 생물학적 샘플 중의 zB7H6 카운터-수용체의 존재는 zB7H6-면역글로불린 융합 단백질을 사용하여 검출될 수 있는데, 그때 zB7H6 부분은 카운터-수용체에 결합하기 위해 사용되고, 단백질 A 또는 항-Fc 항체와 같은 거대분자는 고체 지지체에 융합 단백질을 결합시키기 위해 사용된다. 그런 시스템은 zB7H6의 그것의 카운터-수용체에의 결합을 간섭하는 아고니스트 및 길항체를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
zB7H6 폴리펩티드는 시험관 내에서 세포상에서 NKp30을 특이적으로 결합시킴으로써 신호를 야기하거나 증강시키기 위해, 그리고 생체 내에서 세포 상에 NKp30을 결합시키고 NK 세포의 NKp30-중재된 활성화를 야기하거나 증강시키기 위해 그것을 비경구적으로 (예컨대 근육내, 피하 또는 정맥내 주사에 의해) 투여함으로써 아고니스트로서 사용될 수 있다. 예를 들어 가용성 zB7H6 융합 단백질은 시험관 내에서 NK 세포 세포용해 활성을 야기하거나 또는 증강시키기 위해, 또는 암 또는 감염성 질병을 치료하기 위해 생체 외에서 또는 생체 내에서 그런 활성을 야기하거나 또는 증강시키기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 논의된 것과 같은 방법을 사용하여 당업자는 SEQ ID NO:2 잔기 25 내지 266의 zB7H6 세포외재성 도메인, 또는 그것에 실질적으로 동일한 zB7H6 세포외재성 도메인을 포함하고 SEQ ID NO:2 잔기 25 내지 266의 NKp30-결합 또는 다른 기능성 특성을 보유하는 폴리펩티드를 포함하여, 본원에서 설명되는 것과 같은 다양한 zB7H6 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 본 발명의 zB7H6 폴리펩티드는 전형적으로 재조합 제조되지만 그런 폴리펩티드는 또한 당해 기술분야에서 일반적으로 활용할 수 있는 다른 방법들 (예컨대 폴리펩티드의 합성 제조, 또는 천연 공급원으로부터의 zB7H6 폴리펩티드의 분리에 의해)에 의해 제조될 수 있다.재조합 zB7H6 수용체 폴리펩티드는 일반적으로 zB7H6 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 절편을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어 재조합 zB7H6 가용성 수용체 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 zB7H6 폴리펩티드의 세포외재성 도메인 (SEQ ID NO:2의 연속적인 아미노산 잔기 25 내지 266)을 코드화하는 절단된 DNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그것의 기능성 변이체 또는 단편을 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 가용성 세포외재성 도메인 폴리펩티드가 실질적으로 경막 및 세포내 폴리펩티드 절편이 없는 형태로 제조되는 것이 바람직하기 때문에 그런 가용성 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 그런 경막 및 세포내 절편을 코드화하는 영역이 결핍될 것이다. 단백질의 재조합 제조 방법은 일반적으로 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
상기에서 논의된 바와 같이, 가용성 zB7H6 폴리펩티드는 또한 본원에서 보편적으로 개시되는 것과 같은 추가의 폴리펩티드 절편을 포함할 수 있다. 가용성 zB7H6 융합 단백질의 경우에 그런 구체예는 또한 당업자에게 보편적으로 공지되어 있는 방법들에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어 융합 단백질은 융합 단백질의 각 성분을 제조하고 그것들을 화학적으로 포합시킴으로써 제조될 수 있다. 융합 단백질의 효소적 및 화학적 절단을 위한 일반적 방법은 예를 들면 Ausubel (1995) pp16-19 내지 16-25에 설명되어 있다. 또는 달리 적절한 리딩 프레임중의 융합 단백질의 두 성분을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 공지된 기법을 사용하여 생성될 수 있고 추가로 본원에서 설명되는 것과 같은 방법들을 사용하여 재조합 발현될 수 있다.
상기에서 가리키는 바와 같이, zB7H6 수용체 폴리펩티드는 일반적으로 zB7H6 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 절편을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 가용성 단백질 형태에 대해서 세포외재성 도메인 폴리펩티드는 실질적으로 경막 및 세포내 폴리펩티드 절편이 없는 형태로 제조되는 것이 바람직하다. 숙주 세포로부터 수용체 도메인의 유출을 지시하기 위해 수용체 DNA는 분비 펩티드, 예컨대 t-PA 분비 펩티드를 코드화하는 이차 DNA 절편에 연결된다. 어떤 구체예에서, 분비된 수용체 도메인의 정제를 촉진하기 위해 폴리-히스티딘 태그, 물질 P, FLAGTM 펩티드 (Hopp et al., Biotechnology 6:1204-1210, 1988; Eastman Kodak Co., New Haven, CT로부터 이용가능함) 또는 그것에 대한 항체 또는 다른 특이적 결합제가 활용가능한 다른 폴리펩티드 또는 단배질과 같은 C-말단 연장물이 수용체 폴리펩티드에 융합될 수 있다.
따라서 다른 측면으로, 본 발명은 본원에서 설명된 것과 같은 zB7H6 폴리펩티드 중 어느 하나를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 일반적으로 가용성 zB7H6 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266의 세포외재성 zB7H6 도메인을 코드화하는 폴리뉴클레오티드 영역, 또는 그것의 기능성 변이체 또는 단편을 포함한다. 다른 특정 변형예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 zB7H6의 세포-막 결합된 형태, 예컨대 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 454 또는 1 내지 454를 포함하는 폴리펩티드, 또는 그것의 기능성 변이체를 코드화한다. 구체적인 구체예에서, 가용성 zB7H6 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 잔기 73 내지 798 또는 1 내지 798을 포함하고, SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 454 또는 1 내지 454를 코드화하는 폴리뉴클레오티드의 실례는 SEQ ID NO:1의 73 내지 1362 또는 1 내지 1362를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 변형예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 추가로 zB7H6 폴리펩티드의 추가의 성분(들)을 코드화하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 영역, 예컨대 zB7H6 융합 단백질의 이종성 폴리펩티드 성분, 신호 분비 서열, 및/또는 친화성 태그를 포함한다.
당업자에 의해 인지될 것과 같이, 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 매우 많은 수의 핵산이 제조될 수 있으며, 그것들은 모두 본 발명의 zB7H6 폴리펩티드를 코드화한다. 그로써 zB7H6 폴리펩티드의 특정 아미노산 서열이 제공된다면 폴리펩티드를 코드화하는 어떠한 수의 상이한 핵산이든지 zB7H6 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경시키지 않는 방식으로 하나 또는 그 이상의 코돈의 서열을 변혈시키기 위한 공지된 기법을 사용하여 제조될 수 있다.
zB7H6-코드화 cDNA는 다양한 방법에 의해, 예컨대 완전한 또는 부분적인 사람 cDNA 또는 개시된 서열을 토대로 한 하나 또는 그 이상의 축퇴성 프로브의 세프를 사용하여 프로브함으로써 분리될 수 있다. cDNA는 또한 본원에 개시된 대표적인 사람 zB7H6 서열로부터 디자인된 프라이머를 사용하는 중합효소 사슬 반응을 사용하여 클론될 수 있다. 또한 zDNA 라이브러리는 숙주 세포를 형질전환 또는 트랜스펙션하기 위해 사용될 수 있으며, 관심의 cDNA의 발현은 zB7H6 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
예를 들어 사람 zB7H6 유전자를 코드화하는 핵산 분자는 SEQ ID NO:1을 토대로 한 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하여 사람 cDNA 또는 게놈 라이브러리에 의해 얻어질 수 있다. 이들 기법은 표준이고 잘 수립되며, 상업적인 공급업체로부터 활용될 수 있는 클로닝 키트를 사용하여 이루어질 수 있다 (Ausubel et al. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology (3rd ed., John Wiley & Sons 1995); Wu et al., Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc. 1997; Aviv and Leder, Proc . Nat'l Acad . Sci USA 69:1408, 1972; Huynh et al., "Constructing and Screening cDNA Libraries in λgtlO and λgt11," in DNA Cloning: A Practical Approach Vol . I, Glover (ed.), page 49 (IRL Press, 1985).
사람 zB7H6 유전자를 코드화하는 핵산 분자는 또한 zB7H6 유전자 또는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 토대로 한 뉴클레오티드 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드 프라이머와의 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 얻어질 수 있다. PCR를 사용하여 라이브러리를 선별하는 일반적인 방법은 예를 들면 문헌들에 제공되어 있다 (Yu et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries," in Methods in Molecular Biology , Vol . 15: PCR Protocols : Current Methods and Applications (White, ed., Humana Press, Inc. 1993)). 더욱이 관련 유전자를 분리하기 위해 PCR을 사용하기 위한 기법도 문헌에 설명되어 있다 (예를 들면 Preston, "Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members," in Methods in Molecular Biology , Vol . 15: PCR Protocols : Current Methods and Applications (White, ed., Humana Press, Inc. 1993). 대체 방법으로서, zB7H6 유전자는 본원에서 설명된 긴 올리고뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 서열을 수동으로 프라이밍하여 핵산 분자를 합성함으로써 얻어질 수 있다 (Ausubel, 상기 동일). 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 수립된 기법들은 최소한 2 킬로염기의 길이를 가지는 DNA 분자를 합성하는 능력을 제공한다 (Adang et al., Plant Molec . Biol . 21:1131, 1993; Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266, 1993; Dillon et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes," in Methods in Molecular Biology , Vol . 15: PCR Protocols : Current Methods and Applications 263-268 (White, ed., Humana Press, Inc. 1993); and Holowachuk et al, PCR Methods Appl . 4:299, 1995). 폴리뉴클레오티드 합성에 대한 개관은 문헌을 참조한다 (Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology , Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994); Itakura et al., Annu . Rev . Biochem . 53:323, 1984; and Climie et al., Proc . Nat'l Acad . Sci USA 87:633, 1990).
앞에서 논의된 것과 같이, 당업자는 유전자 코드의 축퇴성의 견지에서, 상당한 서열 변이가 이들 폴리뉴클레오티드 분자 중에서 가능하다는 것을 쉽게 인지할 것이다. 그로써 본 발명은 SEQ ID NO:1의 축퇴성 뉴클레오티드를 포함하는 zB7H6 폴리펩티드-코드화 핵산 분자, 및 그것들의 RNA 동등물을 포함한다. 주어진 아미노산에 대한 모든 가능한 코돈을 포함하여 축퇴성 코돈은 아래의 표 3에 나타낸다.
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특별한 숙주 세포에서의 발현과 관련하여 상이한 종은 "우선적인 코돈 용법"을 나타낼 수 있다 (Grantham et al., Nucl . Acids Res . 8:1893, 1980; Haas et al. Curr . Biol . 6:315, 1996; Wain-Hobson et al., Gene 13:355, 1981; Grosjean and Fiers, Gene 18:199, 1982; Holm, Nuc . Acids Res . 14:3075, 1986; Ikemura, J. Mol . Biol . 158:573, 1982; Sharp and Matassi, Curr . Opin . Genet . Dev . 4:851, 1994; Kane, Curr . Opin . Biotechnol . 6:494, 1995; and Makrides, Microbiol. Rev . 60:512, 1996). 본원에서 사용되는 용어 "우선적인 코돈 용법" 또는 "우선적인 코돈"은 특정 종의 세포에서 가장 자주 사용되는 단백질 번역 코돈을 말하는 용어이고, 따라서 각 아미노산을 코드화하는 가능한 코돈의 하나 또는 소수의 대표적인 것을 지지한다 (표 2 참조). 예를 들어 아미노산 트레오닌 (Thr)은 ACA, ACC, ACG, 또는 ACT에 의해 코드화될 수 있지만, 포유류 세포에서 ACC는 가장 흔히 사용되는 코돈이고, 다른 종, 예컨대 곤충 세포, 효모, 바이러스 또는 박테리아에서는 상이한 Thr 코돈이 우선적일 수 있다. 특별한 종에 대한 우선적인 코돈은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 안에 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법에 의해 도입될 수 있다. 재조합 DNA 안으로의 우선적인 코돈 서열의 도입은 예를 들면 특별한 세포 유형 또는 종 내에서 보다 효과적인 단백질 번역을 만듦으로써 단백질의 생성을 증강시킬 수 있다. 그러므로 본원에 개시된 축퇴성 코돈 서열은 당해 기술분야에서 통상적으로 사용되고 본원에 개시된 다양한 세포 유형 및 종에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 최적화하기 위한 주형으로서 작용한다. 우선적인 코돈을 함유하는 서열은 다양한 종에서의 발현에 대해 시험되고 최적화될 수 있으며, 본원에 개시된 것과 같이 기능성에 대해 시험된다.
당업자는 SEQ ID NO:1에 개시된 서열은 사람 zB7H6의 단일 대립형질을 나타내고, 대립형질 변이 및 대체 스플라이싱이 발생할 것으로 예상된다는 것을 인지할 것이다. 이 서열의 대립형질 변이체는 표준 과정에 따르는 상이한 개체로부터의 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 프로브함으로써 클론될 수 있다. 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열의 대립형질 변이체는 사일런트 돌연변이를 함유하는 것들과 아미노산 서열 변화를 초래하는 돌연변이를 함유하는 것들을 포함하여, 본원에 개시된 아미노산 서열의 대립형질 변이체인 단백질과 같이 본 발명의 범주 내에 있다. SEQ ID NO:2의 zB7H6 폴리펩티드의 특성을 보유하는 zB7H6 폴리펩티드를 코드화하는, 다르게 스플라이스된 mRNA로부터 생성된 cDNA 분자 (예컨대 NKp30-결합 능력을 보유하는 SEQ ID NO:2 잔기 25 내지 266의 세포외재성 도메인의 변이체)는 그런 cDNA 및 mRNA에 의해 코드화된 폴리펩티드처럼 본 발명의 범주 내에 포함된다. 이들 서열의 대립형질 변이체 및 스플라이스 변이체는 당해 기술분야에 공지된 표준 과정에 따라 상이한 개체 또는 조직으로부터의 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 프로브함으로써 클론될 수 있다.
변이체 zB7H6 핵산 분자는 당해 기술분야에 보편적으로 공지되어 있는 기법을 사용하여 확인될 수 있다. 그런 변이체의 확인에 적당한 기준은 (a) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:2 잔기 25 내지 266의 B7H6 세포외재성 도메인에 상응하는 그것의 영역과 코드화된 폴리펩티드 사이의 서열 동일성 또는 유사성의 측정; 및 (b) 혼성화 분석을 포함한다. 그런 zB7H6 핵산 변이체는 (1) 세척 엄격성이 55 내지 65℃에서 0.1%의 SDS를 포함한 0.5x 내지 2x SSC에 동등한 엄격한 세척 조건하에서 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산 분자 (또는 그것의 보체, 또는 SEQ ID NO:1 잔기 73 내지 798을 포함하는 단편)와 혼성화된 상태를 유지하며; (2) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 대해 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 분자를 포함한다. 또는 달리 zB7H6 변이체는 (1) 세척 엄격성이 50 내지 65℃에서 0.1%의 SDS를 포함한 0.1x 내지 0.2x SSC에 동등한 고도로 엄격한 세척 조건하에서 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산 분자 (또는 그것의 보체, 또는 SEQ ID NO:1 잔기 73 내지 798을 포함하는 단편)와 혼성화된 상태를 유지하며; (2) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 대해 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 분자로서 특징지어질 수 있다.
일반적으로 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 및 pH에서 특이한 서열에 대해 열 용융 온도 (Tm)보다 약 5℃ 낮은 것으로 선택된다. Tm은 표적 서열의 50%가 완벽하게 매치된 프로브에 혼성화하는 온도이다 (규정된 이온 강도 및 pH에서). 혼성화 후에 핵산 분자는 엄격한 조건하에서, 또는 고도로 엄격한 조건하에서 비-혼성화된 핵산 분자를 제거하기 위해 세척될 수 있다 (Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); and Wetmur, Crit . Rev . Biochem . Mol . Biol . 26:227, 1990). OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) 및 프라이머 프레미어(Primer Premier) 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA)와 같은 서열 분석 소프트웨어뿐만 아니라 인터넷 상의 사이트들은 사용자-규정된 범주를 토대로 하여 주어진 서열을 분석하고 Tm을 계산하기 위한 활용가능한 도구이다. 특별한 폴리뉴클레오티드 하이브리드를 사용하기 위한 혼성화 및 세척 조건을 적응하는 것은 당업자의 능력 범주 내에 있다.
% 서열 동일성은 상기에서 설명된 것과 같은 종래 방법에 의해 쉽게 측정될 수 있다.
어떤 구체예에서, zB7H6의 변이체는 상응하는 아미노산 서열 (예컨대 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266)에 대해 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 가지는 것을 특징으로 하고, 이때 아미노산 서열의 변이는 하나 또는 그 이상의 보존성 아미노산 치환에 기인한 것이다. zB7H6-코드화 폴리뉴클레오티드의 보존성 아미노산 변화는 예를 들면 SEQ ID NO:1에 인용된 뉴클레오티드에 대해 뉴클레오티드를 치환함으로써 도입될 수 있다. 그런 "보존성 아미노산" 번이체는 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이생성, 링커-주사 돌연변이생성, 중합효소 연쇄 반응을 사용한 돌연변이생성 등에 의해 얻어질 수 있다 (Ausubel (1995); and McPherson (ed.), Directed Mutagenesis : A Practical Approach (IRL Press 1991)). 상기에서 주지된 것과 같이, 기능성 zB7H6 변이체 폴리펩티드는 NKp30 (예컨대 사람 NKo30)에 특이적으로 결합하는 능력, 및/또는 NKp30-중재된 NK 세포 활성화를 야기하는 변이체 또는 단편의 능력을 평가하기 위한 분석법에 의해 확인될 수 있다.
본 발명의 zB7H6 폴리펩티드는 또한 비-천연 발생적인 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 비-천연 발생적 아미노산으로는 제한 없이, 트랜스-3-메틸프롤린, 2,4-메타노프롤린, 시스-4-히드록시프롤린, 트랜스-4-히드록시프롤린, N-메틸글리신, 알로-트레오닌, 메틸트레오닌, 히드록시에틸시스테인, 히드록시에틸호모시스테린, 니트로글루타민, 호모글루타민, 피페콜산, 티아졸리딘 카르복실산, 데히드로프롤린, 3- 및 4-메틸프롤린, 3,3-디메틸프롤린, tert-로이신, 노르발린, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌, 및 4-플루오로페닐알라닌을 포함한다. 비-천연 발생적인 아미노산 잔기를 단백질에 통합시키는 여러 가지 방법이 당해 기술분야에 알려져 있다. 예를 들면 논센스 돌연변이가 화학적으로 아미노아실화된 억제제 tRNA를 사용하여 억제되는 시험관 내 시스템이 사용될 수 있다. 아미노산을 합성하고 tRNA를 아미노아실화하는 방법들은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 논센스 돌연변이를 함유하는 플라스미드의 전사 및 번역은 전형적으로 대장균 추출물 및 상업적으로 활용되는 효소 및 다른 시약들을 포함하는 세포-유리 시스템에서 수행된다. 단백질은 크로마토그래피에 의해 정제된다 (예컨대 Robertson et al., J. Am . Chem . Soc . 113:2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol . 202:301, 1991; Chung et al., Science 259:806, 1993; and Chun et al., Proc . Nat'l Acad . Sci USA 90: 10145, 1993). 두 번째 방법에서 번역은 돌연변이된 mRNA 및 화학적으로 아미노아실화된 억제제 tRNA의 미소주사에 의해 제노푸스 난모세포에서 수행된다 (Turcatti et al., J. Biol . Chem . 271:19991, 1996). 세 번째 방법에서는 대장균 세포가 대체될 천연 아미노산 (예컨대 페닐알라닌)의 부재하에 및 원하는 비-천연 발생적인 아미노산(들) (예컨대 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌, 또는 4-플루오로페닐알라닌)의 존재하에 배양된다. 비-천연 발생적인 아미노산은 그것의 천연 대응물 대신에 단백질에 통합된다 (Koide et al., Biochem. 33:7470, 1994). 또한 천연 발생 아미노산 잔기는 시험관 내 화학적 변형에 의해 비-천연 발생 종으로 전환될 수 있다. 화학적 변형은 치환 범위를 추가로 확장시키기 위해 부위-특정 돌연변이생성과 조합될 수 있다 (Wynn and Richards, Protein Sci . 2:395, 1993).
제한된 수의 비-보존성 아미노산, 유전자 코드에 의해 코드화되지 않는 아미노산, 및 비천연 아미노산은 zB7H6 아미노산 잔기에 대해 치환될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 중의 필수 아미노산은 당해 기술분야에 공지된 과정, 예컨대 부위-특정 돌연변이생성 또는 알라닌-주사 돌연변이생성에 따라 확인될 수 있다 (Cunningham and Wells, Science 244:1081, 1989; Bass et al., Proc . Natl Acad. Sci USA 88:4498, 1991; Coombs and Corey, "Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering," in Proteins : Analysis and Design 259-311 (Angeletti, ed., Academic Press, Inc. 1998)). 후자의 기법에서 단일 알라닌 돌연변이는 분자 안의 모든 잔기에서 도입되고, 그 결과의 돌연변이 분자는 분자의 활성 (예컨대 NKp30-결합 및/또는 NKp30-중재된 NK 세포 활성화를 야기하는 변이체 또는 단편의 능력)에 중요한 아미노산 잔기를 확인하기 위해 생물학적 활성에 대해 시험된다 (Hilton et al, J. Biol . Chem . 271:4699, 1996).
서열 분석이 추가로 zB7H6 NKp30-결합 영역을 규정하기 위해 사용될 수 있긴 하지만, NKp30에 결합하는 zB7H6에서 역할을 담당하는 아미노산은 또한 구조의 물리적 분석에 의해, 예를 들면 핵자기 공명, 결정학, 전자 회절 또는 광친화성 표지화와 같은 기법을 추정되는 접촉 부위 아미노산의 돌연변이와 함께 사용함으로써 측정될 수 있다 (de Vos et al., Science 255:306, 1992; Smith et al., J. Mol . Biol. 224:899, 1992; and Wlodaver et al., FEBS Lett . 309:59, 1992 ).
다중 아미노산 치환은 공지된 돌연변이생성 및 선별 방법들, 예를 들면 문헌에 개시된 방법들을 사용하여 이루어지고 시험될 수 있다 (Reidhaar-Olson and Sauer, Science 241:53, 1988; Bowie and Sauer, Proc . Nat'l Acad . Sci USA 86:2152, 1989). 간단히 설명하자면, 이들 저자는 폴리펩티드의 둘 또는 그 이상의 위치를 동시에 무작위로 선택하고, 기능성 폴리펩티드에 대해 선택한 후, 각각의 위치에서 허용될 수 있는 치환의 스펙트럼을 측정하기 위해 돌연변이를 일으킨 폴리펩티드를 서열화하는 방법을 개시한다. 사용될 수 있는 다른 방법으로는 파지 디스플레이 (Lowman et al., Biochem . 30:10832, 1991; Lander 등의 미국 특허 제 5,223,409호; 국제 공보 WO 92/06204 (Huse)) 및 영역-특정 돌연변이생성 (Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988)이 있다.
변이체 zB7H6 뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 또한 DNA 셔플링(shuffling)을 통해 생성될 수 있다 (Stemmer, Nature 370:389, 1994; Stemmer, Proc. Nat'l Acad . Sci . USA 91:10747, 1994; 국제 공보 WO 97/20078). 간단히 설명하면, 변이체 DNA 분자는 모 DNA의 무작위 단편화에 의해 시험관 내 동종 재조합에 의해 생성된 후 PCR을 사용하여 재조립되고, 그 결과 점 돌연변이가 무작위 도입된다. 이 기법은 모 DNA 분자의 패밀리, 예컨대 상이한 종으로부터의 대립형질 변이체 또는 DNA 분자를 사용함으로써 변형되어 과정 안에 추가의 가변성이 도입된다. 원하는 활성의 선택 또는 선별과, 이어서 돌연변이 생성과 분석의 추가의 반복은 바람직한 돌연변이에 대한 선택에 의해 서열의 신속한 “진화”를 제공하는 한편, 동시에 해로운 변화에 대한 선택을 제공한다.
본원에 개시된 것과 같은 돌연변이 생성 방법은 숙주 세포에서 클론되고 돌연변이된 폴리펩티드의 활성을 검출하기 위한 많은 처리량의 자동화된 선별 방법과 조합될 수 있다. 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 (예컨대 NKp30에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드)를 코드화하는 돌연변이를 일으킨 DNA 분자는 숙주 세포로부터 회수될 수 있고 현대 장비를 사용하여 신속하게 서열화될 수 있다. 이들 방법으로 관심의 폴리펩티드 중의 개별적인 아미노산의 중요성을 빠르게 측정하는 것이 가능하고, 이것은 미지의 구조를 가지는 폴리펩티드에도 적용될 수 있다.
앞에서 논의된 바와 같이, 본 발명은 또한 zB7H6 세포외재성 도메인의 “기능성 단편”과 그러한 기능성 단편을 코드화하는 핵산 분자를 포함한다. 핵산 분자의 기본적인 검출 분석은 zB7H6 세포외재성 도메인을 코드화하는 핵산 분자의 기능성 단편을 얻기 위해 수행될 수 있다. 일례로서 SEQ ID NO:1의 잔기 73 내지 798의 뉴클레오티드 서열을 가지는 DNA 분자는 Bal31 뉴클레아제로 소화되어 일련의 NESTEDM 결실이 얻어질 수 있다. 그런 다음단편은 발현 벡터 안에 적절한 리딩 프레임에 삽입되고, 발현된 폴리펩티드는 분리되고 NKp30에 결합하는 능력에 대해 시험된다. 엑소뉴클레아제 소화에 대한 한 가지 대안은 원하는 단편의 생성을 구체화하기 위해 결실 또는 중지 코돈을 도입하기 위해 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이생성을 사용하는 것이다. 또는 달리, zB7H6 유전자의 특별한 단편이 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 합성될 수 있다.
이런 일반적인 접근법은 인터페론의 어느 한 쪽 또는 양쪽 모두의 말단에서의 절단에 대한 연구에 의해 예시된다 (Horisberger and Di Marco, Pharmac . Ther . 66:507, 1995). 더욱이 단백질의 기능적 분석에 대한 표준 기법은 예를 들면 문헌에 설명되어 있다 (Treuter et al., Molec . Gen . Genet . 240:113, 1993; Content et al., "Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon," in Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR - TNO Meeting on Interferon Systems 65-72 (Cantell, ed., Nijhoff 1987); Herschman, "The EGF Receptor," in Control of Animal Cell Proliferation , Vol . 1 169-199 (Boynton et al., eds., Academic Press 1985); Coumailleau et al, J. Biol . Chem . 270:29270, 1995; Fukunaga et al., J. Biol . Chem . 270:25291, 1995; Yamaguchi et al., Biochem . Pharmacol . 50:1295, 1995; and Meisel et al., Plant Molec . Biol . 30:1, 1996).
본 발명은 또한 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열과 관련된 아미노산 변화 (예컨대 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 관련된 변화)를 가지는 폴리펩티드를 코드화하는 zB7H6 폴리뉴클레오티드의 기능성 단편을 포함한다. 변이체 zB7H6 유전자는 상기에서 논의된 것과 같이 개시된 뉴클레오티드와 아미노산 서열과의 동일성 수준을 측정함으로써 구조를 토대로 확인될 수 있다. 구조를 토대로 변이체 유전자를 확인하는 대안적인 접근법은 잠재적인 변이체 zB7H6 유전자를 코드화하는 핵산 분자가 SEQ ID NO:1과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 혼성화할 수 있는지를 측정하는 것이다.
본원에 제공된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자는 벡터에 분자를 놓음으로써 번식된다. 바이러스 및 비-바이러스 벡터, 이를테면 플라스미드가 사용된다. 플라스미드의 선택은 번식이 요구되는 세포의 유형 및 번식의 목적에 따라 좌우될 것이다. 특정 벡터는 원하는 DNA 서열의 증폭 및 다량 생산에 유용하다. 배양중인 세포의 발현에는 다른 벡터가 적당하다. 여전히 전체 동물또는 사람에서 세포에서의 전달 및 발현에는 다른 벡터가 적당하다. 적절한 벡터의 선택은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그런 많은 벡터들이 상업적으로 활용가능하다. 부분적인 또는 전체 길이의 폴리뉴클레오티드가 전형적으로 벡터의 절단된 제한 효소 부위에의 DNA 리가제 부착에 의해 벡터 안에 삽입된다. 또는 달리 원하는 뉴클레오티드 서열은 생체 내 동종 재조합에 의해 삽입될 수 있다. 전형적으로 이것은 원하는 뉴클레오티드 서열 양옆에서 벡터에 상동하는 영역을 부착함으로써 이루어진다. 상동성 영역은 올리고뉴클레오티드의 결찰에 의해, 또는 예를 들면 상동성 영역과 원하는 뉴클레오티드 서열의 영역 두 부분을 모두 포함하는 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄 반응에 의해 첨가된다.
발현을 위해서는 발현 카세트 또는 시스템이 사용될 수 있다. zB7H6 유전자를 발현하기 위해서 발현 벡터에서 전사 발현을 조절하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 분자가 숙주 세포 안에 도입된다. 프로모터 및 인핸서와 같은 전사 조절 서열 외에 발현 벡터는 번역 조절 서열 및 발현 벡터을 포함하는 세포의 선택에 적당한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코드화된 유전자 생성물은 어떠한 편리한 발현 시스템, 이를테면 예컨대 박테리아, 효모, 곤충, 양서류 및 포유류 시스템에서 발현된다. 적당한 벡터 및 숙주 세포는 예컨대 미국 특허 제 5,654,173호에서 설명된다. 발현 벡터에서, zB7H6 폴리펩티드-코드화 폴리뉴클레오티드는 원하는 발현 특성을 얻기 위해 필요에 따라 조절 서열에 연결된다. 이것들은 프로모터 (센스 가닥의 5'에서 또는 안티센스 가닥의 3'에서 부착된다), 인핸서, 터미네이터, 오퍼레이터, 억제제, 및 유도제를 포함할 수 있다. 프로모터는 조절되거나 구성성일 수 있다. 어떤 상황에서는 조건부로 활성인 프로모터, 예컨대 조직-특이적 또는 발달 단계-특이적 프로모터를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이것들은 상기에서 벡터에의 연결에 대해 설명된 기법들을 사용하여 원하는 뉴클레오티드 서열에 연결된다. 당해 기술분야에 공지되어 있는 모든 기법들이 사용될 수 있다. 따라서 발현 벡터는 일반적으로 전사 및 번역 개시 영역을 제공할 것이며, 이것들은 유도성이거나 구성성이고, 코딩 영역은 전사 개시 영역, 및 전사 및 번역 종결 영역의 전사 조절하에 작동가능하게 연결된다. 이들 조절 영역은 zB7H6 폴리펩티드를 코드화하는 DNA에 고유하거나 또는 외인성 공급원으로부터 유도될 수 있다.
발현 카세트는 다양한 벡터, 예를 들면 플라스미드, BAC, YAC, 박테리오파지, 예컨대 람다, P1, M13, 등, 식물 또는 동물 바이러스 벡터 (예컨대 레트로바이러스-기초 벡터, 아데노바이러스 벡터) 등에 도입될 수 있고, 이때 벡터는 정상적으로 발현 벡터를 포함하는 세포의 선택을 제공하는 능력을 특징으로 한다. 벡터는 특히 플라스미드 또는 바이러스로서, 또는 숙주 염색체 안으로의 통합을 위해 염색체 외재성 유지를 제공할 수 있다. 염색체 외재성 유지가 바람직한 경우 원래 서열은 플라스미드의 복제를 위해 제공되며, 그것은 낮거나 높은 복사수로 제공될 수 있다. 광범위한 마커는 선택을 위해 활용가능하다. 특히 독소에 대해 보호할 수 있는 것들, 보다 특별하게는 항체에 대해 보호할 수 있는 것들이 사용될 수 있다. 선택되는 특별한 마커는 숙주의 본질에 따라 선택되며, 어떤 경우에는 상보성이 영양요구성 숙주와 함께 사용될 수 있다. DNA 구성물의 도입은 어떠한 편리한 방법, 이를테면 포합, 박테리아 형질전환, 칼슘-침전된 DNA, 일렉트로포레이션, 융합, 트랜스펙션, 바이러스 벡터로의 감염, 유전자 전달 (biolistics) 등을 사용할 수 있다.
zB7H6 폴리펩티드는 종래의 방법에 따라, 발현 목적에 따라 원핵세포 또는 진핵세포에서 발현될 수 있다. 대규모의 단백질 생성을 위해 단세포성 유기체, 에컨대 대장균, 고초균, 맥주효모균, 배큘로바이러스 벡터와 조합된 곤충 세포, 또는 고등 유기체 세포, 예컨대 척추동물, 특히 포유류 세포 (COS 7 세포, HEK 293, CHO, 개구리 난모세포)가 발현 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 따라서 관심의 특이한 발현 시스템은 박테리아, 효모, 곤충 세포 및 포유류 세포 유도된 발현 시스템을 포함한다. 박테리아에서의 대표적인 발현 시스템은 예를 들면 Chang et al., Nature 275:615, 1978; Goeddel et al., Nature (1979) 281:544, 1979; Goeddel et al., Nucleic Acids Res . 8:4057, 1980; EP 0 036,776; 미국 특허 제 4,551,433호; DeBoer et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 80:21-25, 1983; 및 Siebenlist et al., Cell 20:269, 1980에서 설명되는 것들을 포함한다. 효모에서의 대표적인 발현 시스템은 예를 들면 Hinnen et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 75:1929, 1978; Ito et al., J. Bacteriol . 153:163, 1983; Kurtz et al., Mol . Cell . Biol . 6:142, 1986; Kunze et al., J. Basic Microbiol . 25:141, 1985; Gleeson et al., J. Gen . Microbiol . 132:3459, 1986; Roggenkamp et al., Mol . Gen . Genet . 202:302, 1986; Das et al., J. Bacteriol . 158:1165, 1984; De Louvencourt et al., J. Bacteriol . 154:737, 1983; Van den Berg et al., Bio / Technology 8:135, 1990; Kunze et al., J. Basic Microbiol . 25:141, 1985; Cregg et al., Mol . Cell. Biol . 5:3376, 1985; 미국 특허 제 4,837,148호 및 4,929,555호; Beach and Nurse, Nature 300:706, 1981; Davidow et al., Curr . Genet . 10:380, 1985; Gaillardin et al., Curr . Genet . 10:49, 1985; Ballance et al., Biochem . Biophys. Res . Commun . 112:284-289, 1983; Tilburn et al., Gene 26:205-221, 1983; Yelton et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81:1470-1474, 1984; Kelly and Hynes, EMBO J. 4:475479, 1985; EP 0 244,234; 및 WO 91/00357에서 설명된 것들을 포함한다. 곤충 세포에서의 대표적인 발현 시스템은 예를 들면 미국 특허 제 4,745,051호; Friesen et al., "The Regulation of Baculovirus Gene Expression", in: The Molecular Biology Of Baculoviruses (W. Doerfler, ed., 1986); EP 0 127,839; EP 0 155,476; and Vlak et al., J. Gen . Virol . 69:765-776, 1988; Miller et al., Ann . Rev . Microbiol . 42:177, 1988; Carbonell et al., Gene 73:409, 1988; Maeda et al., Nature 315:592-594, 1985; Lebacq-Verheyden et al., Mol . Cell . Biol. 8:3129, 1988; Smith et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82:8844, 1985; Miyajima et al., Gene 58:273, 1987; 및 Martin et al., DNA 7:99, 1988에서 설명된 것들을 포함한다. 수많은 배큘로바이러스 균주 및 변이체 및 숙주로부터의 상응하는 허용적인 곤충 숙주 세포는 Luckow et al., Bio/Technology 6:47-55, 1988; Miller et al., Generic Engineering 8:277-279, 1986; 및 Maeda et al., Nature 15:592-594, 1985에서 설명된다. 대표적인 포유류 세포에서의 발현 시스템은 예를 들면 Dijkema et al., EMBO J. 4:761, 1985, Gorman et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 79:6777, 1982; Boshart et al., Cell 41:521, 1985; 및 미국 특허 제 4,399,216호에서 설명되는 것들을 포함한다. 포유류 발현의 다른 특징은 예를 들면 Ham and Wallace, Meth . Enz . 58:44, 1979; Barnes and Sato, Anal . Biochem . 102:255, 1980; 미국 특허 제 4,767,704호, 4,657,866호, 4,927,762호, 4,560,655호, WO 90/103430, WO 87/00195, 및 미국 특허 RE 30,985에서 설명된 것과 같이 가능해진다.
본 발명의 핵산은 유전적으로 변형된 비-사람 동물 또는 셀라인에서 부위 특이적 유전자 변형을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 용어 "유전자도입"은 zB7H6 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 또는 숙주 세포에 안정하게 전달된 zB7H6 폴리펩티드를 코드화하는 외인성 DNA가 첨가된 유전적으로 변형된 동물을 포함하는 것으로 의도된다. 유전자 도입 동물은 동종 재조합을 통해 만들어질 수 있다. 또는 달리 핵산 구성물은 게놈안에 무작위로 통합된다. 안정한 통합을 위한 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스 및 다른 동물 바이러스, YAC 등을 포함한다. 관심의 것으로는 유전자 도입 포유류, 특히 설치류 (예컨대 쥐, 마우스)이다.
동종 재조합을 위한 DNA 구성물은 가용성 zB7H6 폴리펩티드를 코드화하는 DNA의 최소한 일부를 포함할 것이고, 표적 유전자좌에 대해 상동성인 영역을 포함할 것이다. 편리하게도 포지티브 및 네거티브 선택을 위한 마커가 포함된다. 동종 재조합을 통한 표적화된 유전자 변형을 내포하는 세포의 제조 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 포유류 세포를 트랜스펙션하는 다양한 기법은 예를 들면 Known et al., Methods in Enzymology 185:527-537, 1990을 참조한다.
배단계 줄기 (ES) 세포의 경우, ES 셀라인이 사용될 수 있거나, 또는 ES 세포는 숙주 (예컨대 마우스, 쥐, 기니아 피그)로부터 새롭게 얻어질 수 있다. 그런 세포는 적절한 섬유아세포-공급층 위에서 성장하거나 백혈병 억제 인자 (LIF)의 존재하에 성장한다. ES 세포가 형질전환될 때 세포는 유전자 도입 동물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 형질전환 후에 세포는 적절한 배지에서 공급 층 위에 플레이트된다. 구성물을 함유하는 세포는 선택적인 배지를 사용함으로써 검출될 수 있다. 콜로니가 성장할 수 있는 충분한 시간이 지난 후에 콜로니는 동종 재조합의 발생에 대해 선택되고 분석된다. 그런 다음 동종 재조합을 나타낸 그런 콜로니는 배 조작 및 낭포 주입에 사용될 수 있다. 낭포는 4 내지 6주 된 과잉배란된 암컷으로부터 얻어졌다. ES 세포는 트립신처리되고, 변형된 세포는 낭포의 할강에 주압된다. 주입 후에 낭포는 위임신된 암컷의 각각의 자궁각에 되돌려 놓아진다. 그런 다음 암컷은 원래 조건으로 되돌려지고 그 결과 태어난 새끼들은 구성물을 가지는 돌연변이 세포에 대해 선별된다. 상이한 표현형의 낭포 및 ES 세포를 제공함으로써, 키메릭 자손은 쉽게 검출될 수 있다. 키메릭 동물은 zB7H6 폴리펩티드를 코드화하는 DNA의 존재에 대해 선별되고 변형된 수컷 및 암컷은 동형 접합성 자손을 생성하기 위해 짝지어진다. 유전자 도입 동물은 어떠한 비-사람 포유류, 예컨대 실험실 동물 또는 가축용 동물일 수 있다. 유전자 도입 동물은 생체 내 환경에서 후보 약물의 효과를 측정하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 재조합 벡터 및 본원에서 설명된 것과 같은 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 일반적으로 본 발명의 재조합 벡터 및 숙주 세포는 분리된다. 그러나 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포는 유전적으로 변형된 동물의 일부분일 수 있다.
상기 숙주 세포 중 어느 것, 또는 다른 적절한 숙주 세포 또는 유기체가 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 복제 및/또는 발현하기 위해 사용될 때, 그 결과의 복제된 핵산, RNA, 발현된 단백질 폴리펩티드는 숙주 세포 또는 유기체의 생성물로서 본 발명의 범주 내에 포함된다. 생성물은 당해 기술분야에 공지된 어떠한 적절한 수단에 의해 회수된다. zB7H6 폴리펩티드는 단량체 또는 다량체 (예컨대 단일이량체, 이종이량체, 사량체)로서 제조될 수 있다.
따라서 또 다른 측면으로, 본 발명은 가용성 zB7H6 폴리펩티드, 이를테면 단량체 및 그것의 다량체 (예컨대 단일이량체, 이종이량체, 사량체) 형태를 본원에 설명된 것과 같이 재조합 숙주 세포를 사용하여 제조하는 방법을 제공한다. 그런 방법은 일반적으로 단백질이 발현되는 조건하에서 가용성 zB7H6 단백질을 코드화하는 발현 벡터로 형질전환된 또는 트랜스펙션된 숙주 세포를 배양하고, 숙주 세포로부터 가용성 zB7H6 단백질을 회수하는 단계를 포함한다. 원핵 및 진핵 숙주 세포에 대한 재조합 단백질을 회수하는 기법은 일반적으로 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
예를 들어 포유류 세포 시스템에 의해 생성된 외래 단백질을 발현하고 회수하기 위한 일반적인 방법은 예를 들면 문헌에 제시되어 있다 (Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture," in Protein Engineering: Principles and Practice 163 (Cleland et al., eds., Wiley-Liss, Inc. 1996). 박테리아 시스템에 의해 생성된 단백질을 회수하기 위한 표준 ㄱ기깁기법은 예컨대 문헌에 제시되어 있다 (Grisshammer et al., "Purification of over-produced proteins from E. coli cells," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2 nd Edition 59-92 (Glover et al., eds., Oxford University Press 1995). 배큘로바이러스 시스템으로부터 재조합 단백질을 분리하기 위해 수립된 방법은 예를 들면 문헌에 설명되어 있다 (Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995)).
가용성 zB7H6 폴리펩티드가 대장균과 같은 박테리아에서 발현될 때 폴리펩티드는 세포질에, 전형적으로는 불용성 과립으로서 보유되거나 또는 박테리아 분비 서열에 의해 주변 세포질 공간으로 지시될 수 있다. 전자의 경우에 세포는 용해되고 과립은 회수되며, 예를 들면 구아니딘 이소티오시아네이트 또는 우레아를 사용하여 변성된다. 그런 다음 변성된 폴리펩티드는 변성제를 희석함으로써, 예컨대 우레아 용액과 환원되고 산화된 글루타티온의 조합에 대하여 투석되고, 이어서 완충된 식염수 용액에 대해 투석됨으로써 재접히고 이량체화될 수 있다. 후자의 경우에 폴리펩티드는 주변 세포질 공간의 내용물을 방출하기 위하여 세포를 파괴하고 (예컨대 초음파처리 또는 삼투 충격에 의해) 단백질을 회수함으로써 가용성 및 기능성 형태로 주변 세포질 공간으로부터 회수되고, 그로써 변성 및 재접힘에 대한 필요가 배제된다.
또는 달리 본 발명의 zB7H6 폴리펩티드는 배타적인 고상 합성, 부분 고상 방법, 단편 축합 또는 고전적인 용액 합성에 의해 합성될 수 있다. 이들 합성 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다 (Merrifield, J. Am . Chem . Soc . 85:2149, 1963; Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (2nd ed., Pierce Chemical Co. 1984); Bayer and Rapp, Chem . Pept . Prot . 3:3, 1986; Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis : A Practical Approach (IRL Press 1989); Fields and Colowick, "Solid-Phase Peptide Synthesis," Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997); and Lloyd- Williams et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc. 1997)). 총체적인 화학적 합성 전략의 변형, 예를 들면 "원래의 화학적 결찰" 및 "발현된 단백질 결찰" 또한 표준적이다 (Dawson et al., Science 266:776, 1994; Hackeng et al., Proc . Natl Acad. Sci . USA 94:7845, 1997; Dawson, Methods Enzymol . 287:34, 1997; Muir et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 95:6705, 1998; 및 Severinov and Muir, J. Biol. Chem . 273:16205, 1998).
앞에서 논의된 것과 같이 가용성 zB7H6 폴리펩티드는 단량체로서 또는 다양한 다량체 형태 (예컨대 단일이량체, 이종이량체, 또는 사량체)중 어느 하나로서 제조될 수 있다. 본원에서 설명된 것과 같이 가용성 zB7H6 폴리펩티드인 최소한 하나의 폴리펩티드 사슬과 가용성 비-zB7H6 폴리펩티드인 최소한 하나의 다른 폴리펩티드를 포함하는 재조합으로 제조된 이종이량체의 경우에, 숙주 세포는 상이한 폴리펩티드 사슬을 코드화하는 상이한 발현 벡터로 형질전환되거나 트랜스펙션된다. 어떤 구체예에서, 동일한 숙주 세포는 나중에 배지로부터 분리되는 이종다량체의 상이한 사슬을 코드화하는 상이한 발현 벡터로 트랜스펙션되거나 형질전환되고, 또는 달리 상이한 폴리펩티드 사슬을 코드화하는 각각의 벡터는 상이한 숙주 세포 집단에서 별도로 생성될 수 있으며, 계속해서 재조합 단백질의 분리에 이어 다량체 복합체를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어 상이한 폴리펩티드 사슬 성분들은 원하는 이종다량체 분자를 초래하는 계획적인 비율로 조합될 수 있다. 이종다량체의 상이한 폴리펩티드 사슬은 다양한 태그 서열 (예컨대 His 태그, FLAG 태그, 및 Glu-Glu 태그)로 차등적으로 표지될 수 있어서 그 결과의 분자의 조성의 분석 또는 정제가 가능해진다. 특별한 구체예에서, 이종다량체는 이종이량체 (예컨대 하나의 폴리펩티드 사슬이 예를 들면 면역글로불린 중쇄 영역을 가용성 zB7H6 융합 단백질인 이량체) 또는 이종사량체 (예컨대 최소한 하나의 폴리펩티드 사슬이 예컨대 VASP 도메인을 포함하는 가용성 zB7H6 융합 단백질인 사량체)이다.
본 발명의 폴리펩티드는 오염시키는 거대분자, 특히 다른 단백질 및 핵산과 관련하여 전형적으로 최소한 약 80%의 순도로, 보다 전형적으로는 최소한 약 90%의 순도로, 바람직하게는 최소한 약 95%, 최소한 약 96%, 최소한 약 97%, 최소한 약 98%, 또는 최소한 약 99%의 순도로 정제되며, 감염성 및 발열성 제제가 없다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 약제학적으로 순수한 상태로, 99.9% 순도보다 크게 정제될 수 있다. 특정 제제에서 정제된 폴리펩티드는 실질적으로 다른 폴리펩티드, 특히 동물 기원의 다른 폴리펩티드가 없다.
분획화 및/또는 종래의 정제 방법은 천연 공급원 (예컨대 사람 조직 공급원)으로부터 정제된 zB7H6 폴리펩티드 제제, 합성 zB7H6 폴리펩티드, 및 재조합 숙주 세포로부터 정제된 재조합 zB7H6 폴리펩티드를 얻기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로 황산 암모늄 정제 및 산 또는 케이오트로프 (chaotrope) 추출이 샘플의 분획화를 위해 사용될 수 있다. 예시적인 정제 단계는 히드록시아파타이트, 크기 축출, FPLC 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 적당한 크로마토그래피 배지는 유도화된 덱스트란, 아가로오스, 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 특수 실리카, 등을 포함한다. PEI, DEAE, QAE 및 Q 유도체가 적당하다. 예시적인 크로마토그래피 배지로는 페닐, 부틸, 또는 옥틸 기로 유도화된 배지, 예컨대 페닐-세파로오스 FF (Pharmacia), 토요펄(Toyopearl) 부틸 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), 옥틸-세파로오스 (Pharmacia) 등; 또는 폴리아크릴 수지, 예컨대 Amberchrom CG 71 (Toso Haas)등이 있다. 적당한 고체 지지체로는 유리 비드, 실리카-기초 수지, 셀룰로오스 수지, 아가로오스 비드, 교차결합된 아가로오스 비드, 폴리스티렌 비드, 교차결합된 폴리아크릴아미드 수지 등을 포함하며, 이것들은 그것들이 사용되어야 할 조건하에서 불용성이다. 이들 지지체는 아미노기, 카르복실기, 술프히드릴기, 히드록실기 및/또는 탄수화물 부분에 의해 단백질의 부착을 허용하는 반응성 기로 변형될 수 있다.
결합 화학의 실례는 시아노겐 브로마이드 활성화, N-히드록시숙신이미드 활성화, 에폭시드 활성화, 술프히드릴 활성화, 히드라지드 활성화, 및 카보디이미드 결합 화학을 위한 카르복실 및 아미노 유도체를 포함한다. 이들 및 다른 고체 배지는 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며 광범위하게 사용되고, 상업적인 공급업체로부터 활용가능하다. 폴리펩티드 분리 및 정제에 대한 특별한 방법의 선택은 기본적인 디자인의 문제이고, 선택된 지지체의 특성에 의해 부분적으로 측정된다 (Affinity Chromatography : Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology 1988); and Doonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996)).
zB7H6 폴리펩티드 분리 및 정제에서의 추가의 변형은 당업자에 의해 고안된다. 예를 들어 아래에서 설명되는 것과 같이 얻어지는 항-zB7H6 항체는 면역친화성 정제에 의해 다량의 단백질을 분리하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한 특별한 성질의 개발에 의해 분리된다. 예를 들어 고정된 금속 이온 흡착 (IMAC) 크로마토그래피는 폴리히스티딘 태그를 포함하는 것을 포함하여 히스티딘-풍부 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다. 간단히 설명하면, 겔은 이가의 금속 이온으로 먼저 대전되어 킬레이트가 형성된다 (Sulkowski, Trends in Biochem . 3:1, 1985). 히스티딘-풍부 단백질은 이 매트릭스에 사용된 금속 이온에 따라 차등되는 친화성으로 흡착될 것이고, 경합적인 용출, pH의 강하, 또는 강력한 킬레이트화제의 사용에 의해 용출될 것이다. 다른 정제 방법은 렉틴 친화성 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피에 의해 글리코실화된 단백질의 정제를 포함한다 (M. Deutscher, (ed.), Meth . Enzymol . 182:529, 1990). 발명의 추가의 구체예에서, 관심의 폴리펩티드와 친화성 태그 (예컨대 말토오스-결합 단백질, 면역글로불린 도메인)의 융합은 정제를 용이하게 하기 위해 구성될 수 있다. 더욱이 zB7H6 세포외재성 도메인의 카운터-수용체-결합 특성은 zB7H6 폴리펩티드의 정제를 위해 개발될 수 있고, 예를 들면 NKp30이 칼럼에 결합되고 zB7H6 폴리펩티드가 결합되고 계속해서 표준 크로마토그래피 방법을 사용하여 용출되는 친화성 크로마토그래피를 사용함으로써 개발된다.
zB7H6 폴리펩티드 또는 그것의 단편은 또한 상기에서 설명된 것과 같이 화학적 합성을 통해 제조될 수 있다. zB7H6 폴리펩티드는 단량체 또는 다량체이거나; 글리코실화되거나 글리코실화되지 않거나; 페길화되거나 페길화되지 않거나; 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
일단 생성된 후에는 zB7H6 폴리펩티드의 기능은 기본적인 분석법을 사용하여 쉽게 평가될 수 있다. zB7H6 폴리펩티드의 NKp30에의 결합은 기능적 활성의 한 척도이다. 그런 결합 활성은 예를 들면 NKp30의 결합 도메인에의 결합에 대한 경합에 의해 측정될 수 있다 (즉 경합 결합 분석). 예를 들어 경합 결합 활성의 한 특징은 표지된 가용성 NKp30 수용체 (예컨대 NKp30의 세포외재성 도메인과 비오틴에 포합된 Fc 단편을 포함하는 융합 단백질)와 zB7H6의 고유한 형태 (예컨대 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드)를 발현하는 무상 세포를 사용한다. 그런 분석법은 실시예 7에서 설명된다. 또한 가용성 zB7H6 폴리펩티드의 NKp30-발현 세포에의 결합은 측정될 수 있다. 또는 달리 가용성 zB7H6 또는 zB7H6의 고유한 형태를 발현하는 무상 세포 대신에 고체상에 결합된 정제된 zB7H6을 대체 사용할 수 있다. 경합 결합 분석은 표준 방법론을 사용하여 수행될 수 있다. 경합 자동 방사능 촬영 플레이트 결합 분석, 또는 형광 활성화된 세포 분류, 또는 Scatchard 도표에 의해 얻어질 수 있는 정성적인 또는 반-정량적인 결과는 정량적인 결과를 생성하기 위해 활용될 수 있다.
zB7H6 폴리펩티드의 기능은 또한 예컨대 NKp30 기능과 관련된 생물학적 활성을 측정하는 생체분석, 이를테면 예를 들어 NK 세포 세포용해성 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어 본원에서 제시된 바와 같이, 특정 셀라인, 예컨대 P815는 NKp30을 발현하는 NK-92 세포에 대한 좋은 세포용해성 표적으로서 작용하지 않는다 (예컨대 실시예 7). 그러나 예를 들어 zB7H6 발현 벡터로의 트랜스펙션에 의한 이들 세포에서의 zB7H6 (SEQ ID NO:2)의 발현은 세포가 NK-92 세포에 의한 공격에 취약해지게 한다 (상기 동일 참조). 따라서 세포외재성 도메인에 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실을 가지는 zB7H6 폴리펩티드는 그러한 폴리펩티드의 P815 세포에서의 발현과 잘 알려져 있는 세포용해성 분석에서 NK-92 세포를 사용하여 그런 세포가 NK 세포 공격에 취약한지의 여부를 측정함으로써 기능적 활성에 대해 쉽게 선별될 수 있다. zB7H6 폴리펩티드 기능을 평가하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 NK-92 세포 분석은 아래의 실시예 7에서 설명된다.
zB7H6 폴리펩티드의 기능을 평가하기 위한 다른 분석법으로는 예를 들면 표적 세포 (예컨대 P815)에 대한 NK 세포 기능의 활성화에 대한 시험을 위해 NKp30-발현 NK 세포에 가용성 zB7H6 폴리펩티드의 첨가를 포함한다. NK 세포-표면 수용체에 대한 항체의 평가를 위한 NK 세포 분석은 문헌에 설명되어 있으며 (Pende et al., J. Exp . Med . 190:1505-1516, 1999), 그러한 분석은 본원에서 설명되는 것과 같이 가용성 zB7H6 폴리펩티드의 활성을 평가하기 위해 쉽게 채택될 수 있다.
IV. zB7H6 단백질에 대한 항체
다른 측면으로, 본 발명은 zB7H6에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항-zB7H6 항체는 zB7H6의 세포외재성 도메인에 (예컨대 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 절편에) 특이적으로 결합하는 분리된 항체이다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 항-zB7H6 항체는 사람 NKp30과 zB7H6의 상호작용을 억제할 수 있고, 그런 항체는 예를 들면 zB7H6과 NKp30과의 상호작용과 관련된 세포성 또는 다른 생리적 사건들, 예를 들면 zB7H6- 및/또는 NKp30-중재된 세포내 신호화 및 관련된 이펙터 기능 (예컨대 NKp30-중재된 세포용해 활성)을 억제하는 데 유용하다.
zB7H6에 대한 항체는 예를 들면 zB7H6 발현 벡터 또는 항원으로서 천연 공급원으로부터 분리된 zB7H6의 생성물을 사용하여 얻어질 수 있다. 특히 유용한 항-zB7H6 항체는 zB7H6에 "특이적으로 결합"한다. 항체는 항체가 다음 두 가지 특성 중 최소한 하나를 나타낸다면 특이적으로 결합하는 것으로 간주된다: (1) 항체는 한계점 수준의 결합 활성을 가지는 zB7H6에 결합한다; (2) 항체는 zB7H6에 관련된 폴리펩티드와 유의할만하게 교차반응하지 않는다.
첫 번째 특징과 관련하여, 항체는 만일 그것들이 zB7H6 폴리펩티드, 펩티드, 또는 에피토프에 106M-1 이상의 결합 친화성 (Ka), 바람직하게는 107M-1 이상의 결합 친화성, 보다 바람직하게는 108M-1 이상의 결합 친화성, 가장 바람직하게는 109M-1 이상의 결합 친화성으로 결합하는 경우에 특이적으로 결합한다. 항체의 결합 친화성은 당업자에 의해, 예를 들면 Scatchard 분석 (Scatchard, Ann . NY Acad . Sci . 51:660, 1949)에 의해 쉽게 측정될 수 있다. 두 번째 특징과 관련하여, 항체는 관련된 폴리펩티드 분자와 유의할만하게 교차반응하지 않는다. 예를 들면 항체가 zB7H6을 검출한다 해도 표준 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 공지된 폴리펩티드를 제시하지는 않는다. 공지된 관련 폴리펩티드의 실례는 공지된 B7 패밀리 구성원을 포함한다.
항-zB7H6 항체는 항원성 zB7H6 에피토프-내포 펩티드 및 폴리펩티드를 사용하여 제조될 수 있다. 항원성 에피토프-내포 펩티드 및 폴리펩티드는 전형적으로 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 내에 함유된 최소한 9개의, 또는 15 내지 30 아미노산의 서열을 함유한다. 그러나 본 발명의 zB7H6 폴리펩티드의 30 내지 50 아미노산을 함유하거나, 또는 전체 아미노산 서열까지의 어떠한 길이의 및 전체 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열의 보다 큰 부분을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드는 또한 zB7H6과 결합하는 항체를 유도하는 데 유용하다. 에피토프-내포 펩티드의 아미노산 서열은 수성 용매중에서의 실질적인 용해도를 제공하기 위해 선택된다 (즉 서열은 상대적으로 친수성 잔기를 포함하는 한편, 소수성 잔기는 대체로 회피된다). 또한 프롤린 잔기를 함유하는 아미노산 서열이 또한 항체 생성에 바람직할 수 있다.
zB7H6의 잠재적인 항원성 부위는 LASERGENE (DNASTAR; Madison, WI)의 PROTEAN 프로그램 (버전 3.14)에 의해 시행되는 것과 같이 제임슨-울프 방법 (Jameson & Wolf, CABIOS 4:181, 1988)을 사용하여 확인될 수 있다.
제임슨-울프 방법은 단백질 구조 예측을 위해 6개의 주요 서브루틴을 조합함으로써 잠재적인 항원 결정기를 예측한다. 예를 들어 후프-우즈 방법 (Hoop et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 78:3824, 1981)은 먼저 가장 큰 국소적 친수성 영역 (매개변수: 7개 잔기의 평균)을 나타내는 아미노산 서열을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 두 번째 단계로, 에미니 방법 (Emini et al., J. Virology 55:836, 1985)이 표면 가능성을 계산하기 위해 사용될 수 있다 (매개변수: 표면 결심 경계값 (0.6)=1). 세 번째로, 카플러스-슐츠 방법 (Karplus and Schultz, Naturwissenschaften 72:212, 1985)이 사용되어 골격 사슬 가요성을 예측할 수 있다 (매개변수: 가요성 경계값 (0.2)=1). 분석의 네 번째 및 다섯 번째 단계에서 이차 구조 예측은 Chou-Fasman 방법 (Chou, "Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Composition," in Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation 549-586 (Fasman, ed., Plenum Press 1990) 및 Garnier-Robson 방법 (Gamier et al., J. Mol . Biol . 120:97, 1978) (Chou-Fasman 매개변수: 형태 표=64 단백질; α 영역 경계값=103; β 영역 경계값=105; Garnier-Robson 매개변수: α 및 β 결심 상수=0)을 사용하여 적용될 수 있다. 여섯 번째 서브루틴에서 가요성 매개변수 및 수치요법/용매 접근성 인자는 표면 윤곽 값을 측정하기 위해 조합될 수 있고, "항원성 지수"로서 표시된다. 마지막으로 피크 확대 기능은 항원성 지수에 적용될 수 있으며, 그 항원성 지수는 주요 표면 피크를 내부 영역에 대한 표면 영역의 이동성으로부터 유도된 추가의 자유 에너지를 설명하기 위하여 각각의 피크 값의 예컨대 20, 40, 60, 또는 80%를 첨가함으로써 확대시킨다. 그러나 이 계산은 전형적으로 나선 영역에 잔류하는 어떠한 주요 피크에도 적용되지는 않는데, 왜냐하면 나선 영역이 덜 가요성인 경향이 있기 때문이다.
재조합 zB7H6 단백질에 대한 또는 천연 공급원으로부터 분리된 zB7H6에 대한 다클론성 항체는 당업자에게 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 제조될 수 있다 (Green et al., "Production of Polyclonal Antisera," in Immunochemical Protocols 1-5 (Manson, ed., Humana Press 1992); Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies," in DNA Cloning 2: Expression Systems , 2 nd Edition 15 (Glover et al., eds., Oxford University Press 1995). zB7H6 폴리펩티드의 면역원성은 보조제, 예를 들면 명반 (수산화 알루미늄) 또는 프로인트 완전 또는 불완전 보조제의 사용을 통해 증가될 수 있다. 면역화에 유용한 폴리펩티드는 또한 융합 폴리펩티드, 예컨대 zB7H6의 융합 또는 면역글로불린 폴리펩티드 또는 말토오스 결합 단백질을 가지는 그것의 일부를 포함한다. 폴리펩티드 면역원은 전체 길이의 분자이거나 그것의 일부일 수 있다. 만약 폴리펩티드 부분이 "합텐-유사"한 것이라면 면역화를 위해서 그런 부분은 거대분자 담체, 예컨대 키호울 림펫 헤모시아닌 (KLH), 소혈청 알부민 (BSA), 또는 파상풍 독소에 유익하게 결합 또는 연결될 수 있다.
비록 다클론성 항체가 말, 소, 개, 닭, 쥐, 마우스, 토끼, 기니아 피그, 염소, 또는 양과 같은 동물에서 전형적으로 발생하지만, 본 발명의 항-zB7H6 항체는 또한 인간 이하의 영장류 항체로부터 유도될 수 있다. 비비에서 진단학적으로 및 치료적으로 유용한 항체를 발생시키는 일반적인 기법은 예를 들면 문헌에서 찾아볼 수 있다 (Goldenberg et al., 국제 특허 공보 WO 91/11465, 및 Losman et al., Int. J. Cancer 46:310, 1990).
또는 달리 단클론성 항-zB7H6 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어 특이한 항원에 대한 설치류 단클론성 항체는 당업자에게 공지되어 있는 방법에 의해 얻어질 수 있다 (Kohler et al., Nature 256:495, 1975; Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology , Vol . 1 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) ["Coligan"]; Picksley et al, "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli," in DNA Cloning 2: Expression Systems , 2 nd Edition 93 (Glover et al, eds., Oxford University Press 1995). 특정 변형예에서 단클론성 항체는 zB7H6 유전자 생성물을 포함하는 조성물 (예컨대 SEQ ID NO:2 잔기 25 내지 226을 포함하거나 그것으로 구성되는 폴리펩티드)로 마우스에 주입하는 단계, 혈청 샘플을 제거함으로써 항체 생성의 존재를 증명하는 단계, B-림프구를 얻기 위해 비장을 제거하는 단계, B-림프구를 골수종 세포와 융합시켜서 하이브리도마를 생성하는 단계, 하이브리도마를 클로닝하는 단계, 항원에 대한 항체를 생성하는 포지티브 클론을 선택하는 단계, 항원에 대한 항체를 생성하는 클론을 배양하는 단계, 그리고 하이브리도마 배양물로부터 항체를 분리하는 단계에 의해 얻어진다.
항-zB7H6 항체는 또한 사람 단클론성 항체이거나 그것으로부터 유도된 항체일 수 있다. 사람 단클론성 항체는 항원 도전에 대한 반응으로 특이한 사람 항체를 생성하도록 공학제조된 유전자 도입 마우스로부터 얻어진다. 이 기법에서 사람 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 요소들은 내인성 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 표적화된 파괴를 함유하는 배단계 줄기 셀라인으로부터 유도된 마우스의 균주에 도입된다. 유전자 도입 마우스는 사람 항원에 특이한 사람 항체를 합성할 수 있고, 마우스는 사람 항체-분비 하이브리도마를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 유전자 도입 마우스로부터의 사람 항체를 얻기 위한 방법은 예를 들어 문헌에 설명되어 있다 (Green et al., Nature Genet . 7:13, 1994; Lonberg et al., Nature 368:856, 1994; and Taylor et al., Int . Immun . 6:579, 1994).
단클론성 항체는 잘 정립되어 있는 다양한 기법들에 의해 하이브리도마 배양물로부터 분리되고 정제될 수 있다. 그런 분리 기법은 단백질-A 세파로오스를 사용하는 친화성 크로마토그래피, 크기-축출 크로마토그래피, 및 이온-교환 크로마토그래피를 포함한다 (Coligan at pages 2.7.1-2.7.12 and pages 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in Methods in Molecular Biology ( Vol . 10) 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)).
어떤 구체예에서, 항-zB7H6 항체는 무상 (전체) 항체의 항원-결합 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 항체 단편은 종래 방법에 의해 전체 항체를 펩신 또는 파파인으로 소화시킴으로써 얻어질 수 있다. 예를 들면 항체 단편은 F(ab')2로 표시되는 5S단편을 제공하기 위하여 펩신을 사용하여 항체를 효소적으로 절단함으로써 생성될 수 있다. 이 단편은 추가로 3.5S의 Fab' 일가 단편을 생성하기 위해 티올 환원제로 절단될 수 있다. 임의로, 절단 반응은 이황화 연쇄의 절단으로부터 유발되는 술프히드릴기에 대한 차단기를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들면 펩신을 사용한 효소적 절단으로 2개의 일가 Fab 단편과 Fc 단편이 직접 생성된다. 이들 방법은 Goldenberg의 미국 특허 제 4,331,647호와 다음의 문헌들에 설명된다: Nisonoff et al., Arch Biochem . Biophys . 89:230, 1960; Porter, Biochem . J. 73: 119, 1959; Edelman et al., in Methods in Enzymology ( Vol . 1) 422 (Academic Press 1967); and Coligan at pages 2.8.1-2.8.10 and 2.10.-2.10.4).
항체를 절단하는 다른 방법, 예컨대 일가의 경쇄-중쇄 단편을 형성하기 위한 중쇄의 분리, 추가로 단편의 절단, 또는 다른 효소적, 화학적, 또는 유전적 기법들이 또한 단편이 무상 항체에 의해 인지되는 항원에 결합되는 한 사용될 수 있다.
예를 들어 Fv 단편은 VH와 VL 사슬의 결합을 포함한다. 이 결합은 문헌에 설명된 것과 같이 비공유적일 수 있다 (Inbar et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 69:2659, 1972). 또는 달리 가변성 사슬은 분자내 이황화 결합에 의해 연결될 수 있거나 또는 글루타르알데하이드와 같은 화학에 의해 교차결합될 수 있다 (Sandhu, Crit. Rev . Biotech . 12:437, 1992).
Fv 단편은 펩티드 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 사슬을 포함할 수 있다. 이들 단일-사슬 항원 결합 단백질 (scFv)은 올리고뉴클레오티드에 의해 연결된 VH 및 VL 도메인을 코드화하는 DNA 서열을 포함하는 구조적 유전자를 구성함으로써 제조된다. 구조적 유전자는 계속해서 대장균과 같은 숙주 세포에 도입되는 발현 벡터안에 삽입된다. 재조합 숙주 세포는 두 개의 V 도메인을 연결짓는 링커 펩티드로 단일 폴리펩티드 사슬을 합성한다. scFv를 제조하는 방법은 예를 들면 문헌에 설명되어 있다 (Bird et al., Science 242:423, 1988; Ladner 등의 미국 특허 제 4,946,778호; Pack et al., Bio / Technology 11:1271, 1993, 및 Sandhu, 상기동일 참조). 일례로서 scFv는 시험관 내에서 zB7H6 폴리펩티드에 림프구를 노출시키고, 파지 또는 유사한 벡터에서 라이브러리를 나타내는 항체를 선택함으로써 (예를 들어 고정된 또는 표지된 zB7H6 단백질 또는 펩티드의 사용을 통하여) 얻을 수 있다.
항체 단편의 다른 형태는 단일 상보성-결정 영역 (CDR)을 코드하는 펩티드이다. CDR 펩티드 ("최소 인지 단위")는 관심의 항체의 CDR을 코드화하는 유전자를 구성함으로써 얻을 수 있다. 그런 유전자는 예를 들면 항체-생성 세포의 RNA로부터의 가변 영역을 합성하기 위해 중합효소 연쇄 반응을 사용함으로써 제조될 수 있다 (예컨대 Larrick et al., Methods : A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies : Production , Engineering and Clinical Application 166 (Ritter et al., eds., Cambridge University Press 1995); and Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications 137 (Birch et al., eds., Wiley- Liss, Inc. 1995)).
또는 달리 항-zB7H6 항체는 "인간화된" 단클론성 항체로부터 유도될 수 있다. 인간화된 단클론성 항체는 마우스 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변 사슬로부터 얻어지는 마우스 상보성 결정 영역을 사람 가변 도메인에 전달함으로써 생성된다. 그런 다음 사람 항체의 전형적인 잔기는 쥐과의 대응물의 프레임워크 영역에 치환된다. 인간화된 단클론성 항체로부터 유도된 항체 성분의 사용으로 쥐과의 불변 영역의 면역원성과 관련된 잠재적인 문제점들이 제거된다. 쥐과의 면역글로불린 가변 도메인을 클로닝하기 위한 일반적인 기법은 예를 들면 Orlandi et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 86:3833, 1989에 설명되어 있다. 인간화된 단클론성 항체를 제조하는 기법들은 다음 문헌들에 설명되어 있다: Jones et al., Nature 321:522, 1986; Carter et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 89:4285, 1992; Sandhu, Crit . Rev. Biotech . 12:437, 1992; Singer et al., J. Immun . 150:2844, 1993; Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995); Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies," in Protein Engineering : Principles and Practice 399-434 (Cleland et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. 1996); 및 Queen 등의 미국 특허 제 5,693,762호.
특정 변형예에서 항-zB7H6 항체는 Fc 영역을 포함하는데, 그것은 면역글로불린 (Ig) 중쇄의 CH2 및 CH3 도메인과 전형적으로 Ig 힌지 영역의 일부를 포함한다. Fc는 IgG의 고도로 바람직한 특정 중 두 가지, 즉 이펙터 기능의 보충 및 긴 혈청 반감기의 원인이다. 항체가 부착하게 되는 표적 세포를 죽이는 능력은 Fc가 Fc 수용체 및 보체 단백질인 C1q에 각각 결합하는 것을 통해 면역 이펙터 경로 (ADCC) 및 보체 경로 (CDC)의 활성화로부터 유래된다. 결합은 일차적으로 하부의 힌지 영역과 상부의 CH2 도메인에 위치한 잔기에 의해 중재된다 (예컨대 Wines et al., J. Immunol. 164:5313, 2000; Woof and Burton, Nature Reviews 4:1, 2004). IgG에 의해 증명된 혈청의 긴 반감기는 CH2 및 CH3 도메인의 아미노산과 신생아의 Fc 수용체, FcRn 사이의 pH 의존성 상호작용을 통해 중재된다 (Getie and Ward, Immunology Today 18:592, 1997; Petkova et al., Int . Immunol . 18:1759, 2006).
따라서 Fc 영역을 포함하는 항-zB7H6 항체의 특정 구체예에서, Fc 영역은 ADCC 및/또는 CDC 활성을 가진다. 그런 항체는 특히 zB7H6을 발현하는 표적 세포, 예를 들면 암세포 또는 바이러스로 감염된 세포의 죽음을 중재하는 데 유용한다. 다른 구체예에서, 항-zB7H6 항체는 하나 또는 그 이상의 이펙터 기능이 부족한 (예컨대 ADCC 및/또는 CDC 활성이 결핍된) Fc 영역을 포함한다. 이펙터 기능이 결핍되었거나 실질적으로 감소된 Fc 영역은 예를 들면 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 원래의 Fc 영역 서열에 도입하여 Fc 영역이 세포용해성 Fc 수용체 및/또는 C1q 보체 단백질에 결합하지 않거나 또는 실질적으로 결합이 감소된다. 특히 이펙터 기능이 결핍되었거나 실질적으로 감소된 적당한 Fc 영역은 예를 들면 Fc4 (SEQ ID NO:31), Fc5 (SEQ ID NO:32), Fc6 (SEQ ID NO:33), 및 Fc7 (SEQ ID NO:34)이 있고, 그것들은 도 13a 내지 13c에 도시된다.
Fc 영역을 포함하는 특정 구체예에서, Fc 영역은 단일 사슬 Fc (scFc)이고, 그것은 가요성 링커에 의해 결합된 두 개의 Fc 도메인 단량체를 포함하여서 두 개의 Fc 단량체가 기능성 이량체 Fc 도메인을 형성하기 위해 이량체화될 수 있다. 예를 들어 scFc를 포함하는 항-zB7H6 항체의 어떤 변형예에서, 항체는 scFc 부분에 융합된 단일 사슬 Fv (scFv)를 포함하며, 이때 scFv 부분은 zB7H6에 특이하게 결합된다. scFc와 하나 이상의 항원-결합 도메인 (예컨대 scFv)을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 단일 사슬 Fc 폴리펩티드는 추가로 2008년 4월 18일에 "단일 사슬 Fc, 그것의 제조 방법 및 치료 방법"의 제목으로 출원된 국제 PCT 특허 출원 US08/060852에서 설명된다 (그 내용은 본원에 전체적으로 참조로 삽입된다).
더욱이 본 발명의 항-zB7H6 항체 또는 항체 단편은 당해 기술분야 및 본원에서 설명된 방법들을 사용하여 페길화될 수 있다.
항-이디오타입 항체는 zB7H6 세포외재성 도메인에 특이한 항-zB7H6 항체에 대해 발생할 수 있다 (예컨대 SEQ ID NO:2 잔기 25 내지 266에 대하여). 어떤 변형예에서, 항-이디오타입 항체는 사람 NKp30과 zB7H6의 상호작용을 억제할 수 있는 항-zB7H6 항체에 대한 것이어서, 그런 항-이디오타입 항체는 NKp30에 결합하는 zB7H6의 능력을 모방할 수 있으며, 바람직한 구체예에서 NKp30-중재된 NK 세포 활성화를 야기하거나 증강시킬 수 있다. 다클론성 항-이디오타입 항체는 항-zB7H6 항체 또는 항체 단편으로 표준 기법을 사용하여 동물을 면역처리함으로써 제조될 수 있다 (Green et al., "Production of Polyclonal Antisera," in Methods In Molecular Biology : Immunochemical Protocols 1-12 (Manson, ed., Humana Press 1992). 또한 Coligan, pp 2.4.1-2.4.7). 또는 달리 단클론성 항-이디오타입 항체는 상기에서 설명된 기법들을 사용하고 면역원으로서 항-zB7H6 항체 또는 항체 단편을 사용하여 제조될 수 있다. 다른 대안으로서 인간화된 항-이디오타입 항체 또는 인간이하 영장류 항-이디오타입 항체는 상기에서 설명된 기법들을 사용하여 제조될 수 있다. 항-이디오타입 항체를 제조하는 방법은 예를 들면 Irie의 미국 특허 제 5,208,146호, Greene 등의 미국 특허 제 5,637,677호, 및 Varthakavi and Minocha, J. Gen . Virol . 77:1875, 1996에 설명되어 있다.
항-zB7H6 항체는 zB7H6 면역포합체를 형성하기 위해 검출가능한 표지와 포합될 수 있다. 적당한 검출가능한 표지로는 예를 들면 방사성 동위원소, 형광 표지, 화학발광 표지, 효소 표지, 생체발광 표지 또는 콜로이드상 금이 있다. 그런 검출가능하게 표지된 면역포합체를 제조하고 검출하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 아래에서 보다 상세하게 설명된다.
검출가능한 표지는 자동방사능 사진촬영에 의해 검출되는 방사성 동위원소일 수 있다. 본 발명의 목적에 특히 유용한 동위원소는 3H, 125I, 131I, 35S 및 14C이다.
항-zB7H6 면역포합체는 또한 형광 화합물로 표지될 수 있다. 형광 표지된 항체의 존재는 적절한 파장의 빛에 면역포합체를 노출시키고 그 결과의 형광을 검출함으로써 측정된다. 형광 표지화 화합물로는 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데하이드 및 플루오레스카민이 있다.
또는 달리, 항-zB7H6 면역포합체는 항체 성분을 화학발광 화합물에 결합시킴으로서 검출가능하게 표지될 수 있다. 화학발광-태그 면역포합체의 존재는 화학적 반응이 일어나는 과정 중에 발생하는 발광의 존재를 검출함으로써 측정된다. 화학발광 표지화 화합물의 실례는 루미놀, 이소루미놀, 방향족 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르를 포함한다.
유사하게, 생체발광 화합물이 본 발명의 항-zB7H6 면역포합체를 표지하기 위해 사용될 수 있다. 생체발광은 촉매적 단백질이 화학발광 반응의 효율을 증가시키는 생물학적 시스템에서 발견되는 화학발광의 한 유형이다. 생체발광 단백질의 존재는 발광의 존재를 검출함으로써 측정된다. 표지화에 유용한 생체발광 화합물은 루시페린, 루시페라제 및 에쿠오린을 포함한다.
또는 달리 항-zB7H6 면역포합체는 효소에 항-zB7H6 항체 성분을 연결시킴으로써 검출가능하게 표지될 수 있다. 항-zB7H6-효소 포합체는 적절한 기질의 존재하에 인큐베이션될 때 효소는 기질과 반응하여 예를 들면 분광측량학적, 형광분석학적, 또는 가시적인 수단에 의해 검출될 수 있는 화학적 부분을 생성한다. 다중특이적 면역포합체를 검출가능하게 표지하기 위해 사용될 수 있는 효소의 실례로는 β-갈락토시다제, 글루코오스 옥시다제, 페록시다제 및 알칼리 포스파타제가 있다.
당업자들은 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 적당한 표지들을 알게 될 것이다. 항-zB7H6 항체에 마커 부분을 결합시키는 것은 당해 기술분야에 공지되어 있는 표준 기법들을 사용하여 이루어질 수 있다. 이런 관점에서 전형적인 방법론은 문헌에서 설명된다 (Kennedy et al., Clin . CMm . Acta 70:1, 1976; Schurs et al., Clin. Chim . Acta 81:1, 1977; Shih et al., Int'l J. Cancer 46:1101, 1990; Stein et al., Cancer Res . 50:1330, 1990; 및 Coligan, 상기동일).
더욱이 면역화학 검출의 편리성 및 융통성은 아비딘, 스트렙트아비딘, 및 비오틴과 포합된 항-zB7H6 항체를 사용함으로써 증강될 수 있다 (Wilchek et al. (eds.), "Avidin-Biotin Technology," Methods In Enzymology ( Vol . 184) (Academic Press 1990); Bayer et al., "Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology," in Methods In Molecular Biology ( Vol . 10) 149-162 (Manson, ed., The Humana Press, Inc. 1992)).
면역분석을 수행하기 위한 방법들도 잘 수립되어 있다 (Cook and Self, "Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays," in Monoclonal Antibodies : Production, Engineering , and Clinical Application 180-208 (Ritter and Ladyman, eds., Cambridge University Press 1995); Perry, "The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology," in Monoclonal Antibodies : Principles and Applications 107-120 (Birch and Lennox, eds., Wiley-Liss, Inc. 1995); Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996)).
본 발명은 또한 zB7H6 유전자 발현에 대한 면역학적 진단 분석을 수행하기 위한 키트를 포함한다. 그런 키트는 항-zB7H6 항체를 포함하는 최소한 하나의 용기를 포함한다. 키트는 또한 zB7H6 항체의 존재를 가리킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 시약을 포함하는 두 번째 용기를 포함할 수 있다. 그런 인디케이터 시약의 실례로는 검출가능한 표지, 예컨대 방사성 표지, 형광 표지, 화학발광 표지, 효소 표지, 생체발광 표지, 콜로이드상 금, 등이 있다. 키트는 또한 zB7H6 항체가 zB7H6 단백질을 검출하기 위해 사용되는 것을 사용자에게 전달하기 위한 수단을 포함할 것이다. 예를 들어 글로 쓰여진 지시사항은 동봉된 항체 또는 항체 단편이 zB7H6을 검출하기 위해 사용될 수 있음을 나타낼 것이다. 글로 쓰여진 재료는 용기에 직접 적용되거나, 또는 글로 쓰여진 재로는 포장 내용물의 형태로 제공될 수 있다.
V. 항- zB7H6 항체-약물 포합체
특정 측면으로, 본 발명은 항-zB7H6 항체-약물 포합체를 제공한다. 본원에서 사용된 "항-zB7H6 항체-약물 포합체"는 치료제에 포합된 항-zB7H6 항체 (단원 IV에서 설명된 것과 같은, 상기 참조)를 말한다. 그런 항-zB7H6 항체-약물 포합체는 대상, 예컨대 zB7H6-발현 암에 걸린 대상에게 투여될 때, 전형적으로 단독으로 투여되기도 하지만 다른 치료제와 조합되어 투여될 때 zB7H6-발현 세포에 임상적으로 유익한 효과를 미친다.
전형적인 구체예에서, 항-zB7H6 항체는 세포독성제에 포합되어서, 그 결과 생성된 항체-약물 포합체는 세포에 의해 흡수되거나 내재화될 때 zB7H6-발현 세포 (예컨대 zB7H6-발현 암세포)에 세포독성 또는 세포분열 억제성 효과를 발휘한다. 항체에 포합시키기에 특히 적당한 부분은 화학요법제, 선구 약물 전환 효소, 방사성 동위원소 또는 화합물, 또는 독소이다. 예를 들어 항-zB7H6 항체는 화학요법제 (아래 참조) 또는 독소 (예컨대 세포분열 억제성 또는 세포사멸 제제, 예를 들면 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소)와 같은 세포독성제에 포합될 수 있다. 항-zB7H6 항체에 포합시키는 데 유용한 추가의 제제의 실례는 아래에 제공된다.
다른 구체예에서, 항-zB7H6 항체는 선구 약물 전환 효소에 포합된다. 선구 약물 전환 효소는 항체에 재조합적으로 융합되거나 공지된 방법을 사용하여 거기에 화학적으로 포합될 수 있다. 예시적인 선구 약물 효소는 카르복시펩티다제 G2, β-글루쿠로니다제, 페니실린-V-아미다제, 페니실린-G-아미다제, β-락타마제, β-글루코시다제, 질소환원효소 및 카르복시펩티다제 A이다.
단백질, 및 특히 항체에 치료제를 포합시키기 위한 기법은 잘 알려져 있다: Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Deiker, Inc., 2nd ed. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985); 및 Thorpe et al., 1982, Immunol . Rev . 62:119-58. 또한 PCT 공보 WO 89/12624.
특정 변형예에서, 본원에 설명된 방법에 따르면, 항-zB7H6 항체-약물 포합체는 zB7H6-발현 세포 내에 내재화되고 축적되며, 거기서 항체-약물 포합체는 치료 효과를 나타낸다 (예컨대 세포독성 또는 세포분열 억제 효과). 축적 및 축적 비율을 측정하는 방법은 예를 들면 "약물 포합체 및 암, 자가면역 질병 또는 감염성 질병을 치료하기 위한 그것의 용도"라는 제목으로 출원된 WO 2004/010957에서 찾아볼 수 있다.
전형적인 구체예에서, 치료제 (약물 또는 선구 약물 전환 효소)에 포합된 항-zB7H6 항체를 사용할 때, 제제는 바람직하게는 치료하고자 하는 zB7H6-발현 세포 (예컨대 zB7H6-발현 암 세포)에 의해 내재화될 때 활성이다. 다른 구체예에서, 항-zB7H6 항체-약물 포합체는 내재화되지 않으며, 약물은 세포막에 결합함으로써 치료 효과 (예컨대 zB7H6-발현 세포의 고갈 또는 성장의 억제)를 나타내기에 효과적이다.
zB7H6-발현 세포 (예컨대 zB7H6-발현 암세포) 밖에 있는 치료제의 활성을 최소화하기 위해, 치료제는 전형적으로 그것이 항체를 절단해내지 않는 한 (가수분해에 의해 또는 절단제에 의해) 그것의 활성을 감소시키는 방식으로 포합된다. 그런 구체예에서, 치료제는 zB7H6-발현 세포의 세포내 환경에서 절단에 민감하지만 실질적으로 세포외 환경에는 민감하지 않은 절단가능한 링커와 함께 항체에 부착되어 포합체는 zB7H6-발현 세포에 의해 내재화될 때 (예컨대 엔도솜에서 또는 예를 들면 pH 민감성 또는 프로테아제 민감성에 의해, 리소솜 환경에서 또는 캐비올리에서) 항체로부터 절단된다. (아래의 V(A) 단원 참조).
나아가 특정 구체예에서, 항체-약물 포합체는 원형질막에 관련된 대전되는 치료제를 포함하며, 그로써 추가로 세포에 의해 일단 내재된 후에 원형질 막을 가로지르는 제제의 능력을 최소화한다. 본원에서 사용되는 "대전된 제제"는 (a) 극성화되어서 제제의 한 영역은 원형질막에 관련된 전하를 가지거나, 또는 (b) 원형질막에 관련된 순(net) 전하를 가지는 제제를 의미한다.
전형적으로 항-zB7H6 항체-약물 포합체는 실질적으로 정제된다 (예컨대 실질적으로 그것의 효과를 제한하거나 바람직하지 못한 부작용을 생성하는 물질이 없다). 어떤 구체적인 구체예에서, 항-zB7H6 항체-약물 포합체는 40% 순수하고, 보다 전형적으로는 약 50% 순수하며, 가장 전형적으로는 약 60% 순수하다. 다른 구체적인 구체예에서, 항-CD70 ADC 또는 ADC 유도체는 최소한 대략 60 내지 65%, 65 내지 70%, 70 내지 75%, 75 내지 80%, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 또는 95 내지 98% 순수하다. 다른 구체적인 구체예에서, 항-CD70 ADC 또는 ADC 유도체는 대략 99% 순수하다.
A. 링커
전형적으로 항-zB7H6 항체-약물 포합체는 치료제와 항-zB7H6 항체 사이의 링커 영역을 포함한다. 상기에서 주지된 것과 같이 특정 구체예에서, 링커는 세포내 조건하에서 절단가능하고, 그로써 링커의 절단은 세포내 환경에서 항체로부터 치료제를 방출시킨다.
예를 들어 어떤 구체예에서, 링커는 세포내 환경에 (예컨대 리소솜 또는 엔도솜 또는 캐비올라 내에) 존재하는 절단제에 의해 절단될 수 있다. 링커는 예를 들면 세포내 펩티다제 또는 프로테아제 효소, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 리소솜 또는 엔도솜 프로테아제에 의해 절단되는 펩티딜 링커이다. 전형적으로 펩티딜 링커는 최소한 두 개의 아미노산 길이 또는 최소한 세 개의 아미노산 길이이다. 절단제는 카텝신 B와 D 및 플라스민을 포함할 수 있고, 이것들은 모두 펩티드 약물 유도체를 가수분해하여 활성 약물이 표적 세포 내부에서 방출되는 것을 초래하는 것으로 알려져 있다 (Dubowchik and Walker, Pharm . Therapeutics 83:67-123, 1999). 가장 전형적인 것은 zB7H6-발현 세포에 존재하는 효소에 의해 절단될 수 있는 펩티딜 링커이다. 예를 들어 암성 조직에서 매우 많이 발현되는 티올-의존성 프로테아제 카텝신-B에 의해 절단될 수 있는 펩티딜 링커가 사용될 수 있다 (예컨대 Phe-Leu 또는 Gly-Phe-Leu-Gly 링커). 다른 그런 링커는 예를 들면 미국 특허 제 6,214,345호에 설명되어 있다. 구체적인 구체예에서, 세포내 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩티딜 링커는 Val-Cit (발린-시트룰린) 링커 또는 Phe-Lys (페닐알라닌-라이신) 링커이다 (미국 특허 제 6,214,345호, 이 특허는 val-cit 링커를 사용한 독소루비신의 합성을 설명한다). 치료제의 세포내 단백질 가수분해성 방출을 사용할 때의 한 가지 장점은 전형적으로 제제가 포합될 때 약화되고 포합체의 혈청 안정성은 전형적으로 높다는 것이다.
다른 구체예에서, 절단가능한 링커는 pH-민감성, 즉 특정 pH 값에서 가수분해에 민감하다. 전형적으로 pH-민감성 링커는 산성 조건하에서 가수분해될 수 있다. 예를 들어 리소솜에서 가수분해될 수 있는 산-불안정한 링커 (예컨대 히드라존, 세미카르바존, 티오세미카르바존, 시스-아코니틱 아미드, 오르토에스테르, 아세탈, 케탈 등)가 사용될 수 있다 (미국 특허 제 5,122,368호; 5,824,805호; 5,622,929호; Dubowchik and Walker, Pharm . Therapeutics 83:67-123, 1999; Neville et al., Biol . Chem . 264:14653-14661, 1989). 그런 링커는, 예컨대 혈액중에서와 같은 상대적으로 중성 pH 조건하에서는 안정하지만 pH 5.5 또는 5.0 아래, 대략 리소솜의 pH에서는 불안정하다. 특정 구체예에서, 가수분해될 수 있는 링커는 티오에테르 링커이다 (예컨대 아실히드라존 결합을 통해 치료제에 부착된 티오에테르, 미국 특허 제 5,622,929호 참조).
또 다른 구체예에서, 링커는 환원 조건하에서 절단될 수 있다 (예컨대 이황화 링커). 다양한 이황화 링커가 당해 기술분야에 알려져 있는데, 예를 들면 SATA를 사용하여 형성될 수 있는 것들 (N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트), SPDP를 사용하여 형성될 수 있는 것들 (N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트), SPDB를 사용하여 형성될 수 있는 것들 (N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)부티레이트) 및 SMPT를 사용하여 형성될 수 있는 것들 (N-숙신이미딜-옥시카르보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)톨루엔), SPDB 및 SMPT가 있다 (Thorpe et al., Cancer Res. 47:5924-5931, 1987; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates : Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. 미국 특허 제 4,880,935호 참조).
다른 변형예에서, 링커는 말로네이트 링커 (Johnson et al., Anticancer Res. 15:1387-93, 1995), 말레이미도벤조일 링커 (Lau et al., Bioorg - Med - Chem . 3:1299-1304, 1995), 또는 3'-N-아미드 유사체 (Lau et al., Bioorg - Med - Chem . 3: 1305-12, 1995)이다.
전형적으로 링커는 세포외 환경에 실질적으로 민감하지 않다. 본원에서 사용되는, 링커에 관한 맥락으로 "세포외 환경에 실질적으로 민감하지 않은"은 약 20% 이하, 전형적으로는 약 15% 이하, 보다 전형적으로는 약 10% 이하, 보다 더 전형적으로는 약 5% 이하, 약 3% 이하, 또는 약 1% 이하의 항체-약물 포합체 샘플 중의 링커가 항체-약물 포합체가 세포외 환경 (예컨대 원형질)에 존재할 때 절단되는 것을 의미한다. 링커가 세포외 환경에 실질적으로 민감하지 않은지의 여부는, 예를 들면 (a) 항체-약물 포합체 ("항체-약물 포합체 샘플")과 (b) 등몰량의 포합되지 않은 항체 또는 치료제 ("대조 샘플")를 둘 다 원형질과 함께 예정된 시간 기간 (예컨대 2, 4, 8, 16, 또는 24시간) 동안 독립적으로 인큐베이션한 후, 항체-약물 포합체 샘플 중에 존재하는 포합되지 않은 항체 또는 치료제의 양과 대조 샘플 중에 존재하는 것의 양을, 예를 들면 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정하여 비교함으로써 측정될 수 있다.
어떤 변형예에서 링커는 세포 내재화를 촉진한다. 특정 구체예에서 링커는 치료제와 포합될 때 세포 내재화를 촉진한다 (예컨대 항체-약물 포합체의 링커-치료제 부분의 환경에서). 다른 구체예에서, 링커는 치료제 및 항-zB7H6 항체 둘 다와 포합될 때 (즉 항체-약물 포합체 환경에서) 세포 내재화를 촉진한다.
본 발명의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 다양한 링커는 예를 들면 "약물 포합체 및 암, 자가면역 질병 또는 감염성 질병을 치료하기 위한 그것의 용도"라는 제목의 WO 2004/010957에 설명되어 있다.
B. 치료제
본 발명에 따라 zB7H6-발현 세포에 치료 효과를 나타내는 어떠한 제제든지 항-zB7H6 항체에의 포합을 위한 치료제로서 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 예컨대 zB7H6-발현 암의 치료를 위한 경우와 같이 치료제는 세포독성제이다.
유용한 세포독성제의 부류로는 예를 들면 항튜불린제, 아우리스타틴, DNA 마이너 그루브 결합제, DNA 복제 억제제, 알킬화제 (예컨대 시스-플라틴, 모노(백금), 비스(백금) 및 3-핵 백금 복합체 및 카보플라틴과 같은 백금 복합체), 안트라사이클린, 항생물질, 항폴레이트, 항대사물질, 화학요법 민감화제, 듀오카르마이신, 에토포시드, 플루오르 처리된 피리미딘, 이오노포어 (이온 투과 담체), 렉시트롭신, 질소공급원, 플라티놀, 사전 형성 화합물, 퓨린 항대사물질, 퓨로마이신, 방사선 민감화제, 스테로이드, 탁산, 토포이소메라제 억제제, 빈카 알카로이드 등이 있다.
각각의 세포독성제로는 예를 들면 안드로겐, 안트라마이신 (AMC), 아스파라기나제, 5-아자시티딘, 아지티오프린, 블레오마이신, 부술판, 부티오닌 술폭시이민, 캄프토테신, 카르보플라틴, 마르무스틴 (BSNU), CC-1065, 클로람부실, 시스플라틴, 콜키친, 시클로포스파미드, 시타라빈, 시티딘 아라비노시드, 시토칼라신 B, 다카르바진, 닥티노마이신 (구 악티노마이신), 다우노루비신, 데카르바진, 도세탁셀, 독소루비신, 에스트로겐, 5-플루오르데옥시우리딘, 5-플루오로우라실, 그라미시딘 D, 히드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이리노테칸, 로무스틴 (CCNU), 메클로레타민, 멜팔란, 6-메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미트라마이신, 미토마이신 C, 미토크산트론, 니트로이미다졸, 파클리탁셀, 플리카마이신, 프로카르비진, 스트렙토조토신, 테노포시드, 6-티오구아닌, 티오TEPA, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, VP-16 및 VM-26이 있다.
특히 적당한 세포독성제로는 예를 들면 돌라스타틴 (예컨대 아우리스타틴 E, AFP, MMAF, MMAE), DNA 마이너 그루브 결합제 (예컨대 엔다인 및 렉시트롭신), 듀오카르마이신, 탁산 (예컨대 파클리탁셀 및 도세탁셀), 퓨로마이신, 빈카 알카로이드, CC-1065, SN-38, 토포테칸, 모르폴리노-독소루비신, 리족신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 에키노마이신, 콤브레타스타틴, 네트롭신, 에포틸론 A 및 B, 에스트라무스틴, 크립토피신, 세마도틴, 마이탄시노이드, 디스코데몰리드, 엘레우테로빈, 및 미토크산트론이 있다.
특정 구체예에서, 세포독성제는 예컨대 독소루비신, 파클리탁셀, 멜팔란, 빈카 알카로이드, 메토트렉세이트, 미토마이신 C 또는 에토포시드와 같은 종래의 화학요법제이다. 또한 CC-1065 유사체, 칼리케아미신, 마이탄신, 돌라스타틴 10의 유사체, 리족신, 및 팔리톡신과 같은 강력한 제제가 항-zB7H6-발현 항체에 연결될 수 있다.
구체적인 변형예에서, 세포독성제 및 세포분열 억제제는 아우리스타틴 E (또는 당해 기술분야에 돌라스타틴-10으로 알려져 있다) 또는 그것의 유도체이다. 전형적으로 아우리스타틴 E 유도체는 예컨대 아우리스타틴 E와 케토산 사이에 형성된 에스테르이다. 예를 들어 아우리스타틴 E는 파라아세틸 벤조산 또는 벤조일발레르산과 반응하여 각각 AEB 및 AEVB를 생성할 수 있다. 다른 전형적인 아우리스타틴 유도체로는 AFP (디메틸발린-발린-돌라이소로이신-돌라프로인-페닐알라닌-p-페닐렌디아민), MMAF (도발린-발린-돌라이소로이닌-돌라프로인-페닐알라닌), 및 MAE (모노메틸 아우리스타틴 E)가 있다. 아우리스타틴 E 및 그것의 유도체의 합성 및 구조에 대해서는 미국 특허 출원 공개 번호 20030083263호; 국제 특허 출원 공보 WO 2002/088172 및 WO 2004/010957; 및 미국 특허 제 6,884,869호; 6,323,315호; 6,239,104호; 6,034,065호; 5,780,588호; 5,665,860호; 5,663,149호; 5,635,483호; 5,599,902호; 5,554,725호; 5,530,097호; 5,521,284호; 5,504,191호; 5,410,024호; 5,138,036호; 5,076,973호; 4,986,988호; 4,978,744호; 4,879,278호; 4,816,444호; 및 4,486,414호에 설명되어 있다.
다른 변형예에서, 세포독성제는 DNA 마이너 그루브 결합제이다 (미국 특허 제 6,130,237). 예를 들어 특정 구체예에서, 마이너 그루브 결합제는 CBI 화합물이다. 다른 구체예에서, 마이너 그루브 결합제는 엔다인 (예컨대 칼리케아미신)이다.
특정 구체예에서, 항체-약물 포합체는 항-튜불린제를 포함한다. 항-튜불린제의 실례로는 예를 들면 탁산 (예컨대 탁솔® (파클리탁셀), 탁소테레® (도세탁셀)), T67 (Tularik), 빈카 알킬로이드 (예컨대 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 및 비노렐빈), 및 돌라스타틴 (예컨대 아우리스타틴 E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB)이 있다. 다른 항튜불린제로는 예를 들면 바카틴 유도체, 탁산 유사체 (예컨대 에포틸론 A 및 B), 노코다졸, 콜키친 및 콜키미드, 에스트라무스틴, 크립토피신, 세마도틴, 마이탄시노이드, 콤브레타스타틴, 디스코더몰리드, 및 엘레우테로빈이 있다. 어떤 구체예에서, 항-튜불린제의 다른 그룹인 세포독성제는 마이탄시노이드이다. 예를 들어 구체적인 구체예에서, 마이탄시노이드는 마이탄신 또는 DM-1이다(ImmunoGen, Inc.; Chari et al., Cancer Res . 52:127-131, 1992).
다른 구체예에서, 세포독성제는 항대사물질이다. 항대사물질은 예를 들면 퓨린 길항체 (예컨대 아조티오프린 또는 마이코페놀레이트 모페틸), 디히드로폴레이트 환원효소 억제제 (예컨대 메토트렉세이트), 아시클로비어, 강시클로비어, 지도부딘, 비다라빈, 리바바린, 아지도티미딘, 시티딘 아라비노시드, 아만타딘, 디데옥시우리딘, 요오도데옥시우리딘, 포스카르넷, 또는 트리플루리딘일 수 있다.
C. 항- zB7H6 항체-약물 포합체의 형성
항-zB7H6 항체-약물 포합체의 생성은 당업자에게 알려져 있는 어떠한 기법에 의해서든지 이루어질 수 있다. 간단히 설명하면, 항-zB7H6 항체-약물 포합체는 항-zB7H6 항체, 약물, 및 임의로 약물과 항체를 결합시키는 링커를 포함한다. 많은 상이한 반응들이 항체에 약물의 공유 부착을 위해 활용될 수 있다. 이것은 때로 항체 분자의 아미노산 잔기, 이를테면 라이신의 아민기, 글루탐산과 아스파르트산의 유리 카르복실산기, 시스테인의 술프히드릴기, 및 방향족 아미노산의 다양한 부분의 반응에 의해 이루어진다. 가장 흔하게 사용되는 공유 부착의 비-특이적 방법중 하나는 항체의 아미노 (또는 카르복시)기에 화합물의 카르복시 (또는 아미노)기를 연결시키기 위한 카르보디이미드 반응이다. 또한 이중기능성 제제, 예컨대 디알데하이드 또는 이미도에스테르는 항체 분자의 아미노기에 화합물의 아미노기를 연결시키기 위해 사용될 수 있다. 또한 항체에 약물을 부착시키기 위해 활용될 수 있는 것은 쉬프(Schiff) 염기 반응이다. 이 방법은 글리콜 또는 히드록시기를 함유하는 약물의 페리오데이트 산화와, 그로써 나중에 항체 분자와 반응하는 알데하이드 형성을 포함한다. 부착은 항체 분자의 아미노기와 쉬프 염기의 형성을 통해 일어난다. 이소티오시아네이트는 또한 항체에 약물을 공유 부착하기 위한 결합제로서 사용될 수 있다. 다른 기법들은 당업자에게 공지되어 있으며, 본 발명의 범주 내에 있다. 그러한 기법의 비-제한적 실례는 미국 특허 제 5,665,358호; 5,643,573호 및 5,556,623호에 설명되어 있다.
어떤 구체예에서, 링커의 선구체인 중간체는 적절한 조건하에서 약물과 반응된다. 특정 구체예에서, 반응성기는 약물 및/또는 중간체 상에서 사용된다. 약물과 중간체 사이의 반응 산물, 또는 유도된 약물은 계속해서 적절한 조건 하에서 항-zB7H6 항체와 반응된다.
D. 세포독성 또는 세포분역 억제 활성에 대한 분석
특정 구체예에서, 항-zB7H6 항체-약물 포합체는 세포독성제에 포합된 항-zB7H6 항체를 포함하여서, 항체-약물 포합체는 zB7H6-발현 세포 (예컨대 zB7H6-발현 암세포)에 세포독성 또는 세포분열 억제 효과를 나타낸다. 항-zB7H6 항체-약물 포합체의 세포독성 또는 세포분역 억제 효과에 대해 분석될 수 있는 zB7H6-발현 세포는 예를 들면 아래의 표 5에 열거된 것과 같은 배양 셀라인일 수 있다. 일단 항-zB7H6 항체-약물 포합체는 zB7H6-발현 세포에 세포독성 또는 세포분역 억제 효과를 나타내는 것으로서 확인되며, 치료 효과는 적절한 동물 모델에서 증명될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 세포독성제를 포함하는 항-zB7H6 항체-약물 포합체는 zB7H6-발현 암을 치료하기 위해 사용된다. 본 발명의 항체-약물 포합체의 치료적 효능을 평가하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 다양한 암의 동물 모델은 아래의 단원 VI(B) 및 실시예 21 내지 27에서 설명된다.
세포에 세포분열 억제 또는 세포독성 효과를 나타내는 지의 여부를 측정하는 방법은 일반적으로 당해 기술분야에 알려져 있다. 그런 방법의 예시적인 실례는 아래에서 설명된다. 이들 zB7H6-발현 세포에 미치는 효과 중 어느 것이든지 측정하는 것은, 항-zB7H6 항체-약물 포합체가 최소한 부분적으로는 zB7H6-발현 세포, 예를 들면 zB7H6-발현 암의 비정상적인 성장 또는 활성화에 의해 중재된 병인을 가지는 질병 또는 장애의 치료 또는 방지에 유용하다는 것을 가리킨다.
항-zB7H6 항체-약물 포합체가 zB7H6-발현 세포에 세포분열 억제효과를 나타내는지의 여부를 측정하기 위해서 티미딘 통합 분석이 사용될 수 있다. 예를 들어 zB7H6-발현 세포는 96-웰 플레이트의 웰당 5,000 세포의 밀도로 72-시간 기간 동안 배양될 수 있고, 72-시간 기간의 최종 8시간 동안에는 0.5μCi의 3H-티미딘에 노출되며, 배양 중의 세포에 3H-티미딘의 통합 여부는 항체-약물 포합체의 존재 및 부재시에 측정된다.
세포독성을 측정하기 위해, 괴사 또는 아폽토시스 (프로그램되어 있는 세포 사망)가 측정될 수 있다. 괴사는 전형적으로 원형질막의 증가된 투과성, 세포의 팽창, 및 원형질막의 파괴에 의해 이루어진다. 아폽토시스는 전형적으로 막 수포, 세포질의 응축, 및 내인성 엔도뉴클레아제의 활성화를 특징으로 한다.
세포 생존성은 세포에서의 중성 레드, 트립판 블루 또는 ALAMARTM 블루와 같은 염료의 흡수를 측정함으로써 측정될 수 있다 (Page et al., Intl . J. of Oncology 3:473-476, 1993). 그런 분석법에서, 세포는 염료를 함유하고 있는 배지에서 인큐베이션되고, 세포는 세척되며, 염료의 세포 흡수를 반영하는 잔류하는 염료는 분광학적으로 측정된다. 단백질-결합 염료 술포로다민 B (SRB)는 또한 세포독성을 측정하기 위해 사용될 수 있다 (Skehan et al., J. Nat'l Cancer Inst . 82:1107-12, 1990).
또는 달리 테트라졸륨 염, 예컨대 MTT는 죽은 상태가 아닌 살아있는 세포를 검출하는 것에 의한 포유류 세포 생존 및 증식에 대한 정량적 열량측정 분석에서 사용된다 (Mosmann, J. Immunol . Methods 65:55-63, 1983).
아폽토시스는 예를 들면 DNA 단편화를 측정함으로써 정량될 수 있다. DNA 단편화의 장량적인 시험관 내 측정을 위한 열량측정 광도측정법이 활용될 수 있다. 그런 분석의 실례로는 TUNEL (단편화된 DNA의 표지된 뉴클레오티드의 통합을 검출한다) 및 ELISA-기초 분석이 있으며, 그것들은 Biochemica, 1999, no. 2, pp. 34-37 (Roche Molecular Biochemicals)에서 설명된다.
아폽토시스는 또한 세포에서 형태학적 변화를 측정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어 괴사와 같이 원형질막 통합성의 손실은 특정 염료 (예컨대 형광 염료, 예를 들어 아크리딘 오렌지 또는 에티듐 브로마이드)의 흡수를 측정함으로써 측정될 수 있다. 아폽토시스성 세포수를 측정하는 방법은 Duke와 Cohen에 의해 이미 설명된 바 있다 (Current Protocols In Immunology (Coligan et al. eds., 1992, pp. 3.17.1-3.17.16)). 세포는 또한 DNA 염료 (예컨대 아크리딘 오렌지, 에티듐 브로마이드, 또는 프로피듐 요오다이드)로 표지될 수 있고, 세포는 크로마틴 축합과 내부 핵 막을 따르는 가장자리에 대해 관찰된다. 아폽토시스를 측정하기 위해 측정될 수있는 다른 형태학적 변화로는 예를 들면 세포질 응축, 증가된 막 수포형성, 및 세포 수축이 있다.
아폽토시스를 일으키는 세포의 존재는 배양물의 부착되고 "부유하는" 구획에서 측정될 수 있다. 예를 들어 두 구획은 모두 상층액의 제거, 부착된 세포의 트립신 처리, 원심분리 (예컨대 10분, 2000rpm) 후 세척단계의 제제의 조합, 및 아폽토시스의 검출 (예컨대 DNA 단편화를 측정함으로써)에 의해 수집될 수 있다 (Piazza et al., Cancer Research 55:3110-16, 1995).
VI. 사용 방법
A. 일반
다른 측면으로, 본 발명은 NKp30-발현 세포, 이를테면 예를 들어 천연 킬러 (NK) 세포 및 T 세포 (예컨대 CD8+ T 세포)의 활성 (예컨대 세포용해 활성)을 조절하는 방법을 제공한다. 그런 방법은 예를 들면 NKp30-발현 세포의 증가된 혹은 감소된 활성과 관련된 질병 또는 장애를 치료하기 위한 방법을 포함한다. 어떤 구체예에서, 방법은 NKp30-발현 세포를 zB7H6 폴리펩티드, 또는 zB7H6과 NKp30의 상호작용을 모방할 수 있는 제제 (예컨대 zB7H6 항-이디오타입 항체)와 NKp30-중재된 활성 (예컨대 세포용해성 활성)을 야기하기에 효과적인 양으로 접촉시키는 것을 포함한다. zB7H6 폴리펩티드는 가용성 또는 고정된 (예컨대 세포막-결합된) 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어 구체적인 변형예에서, NKp30-발현 세포의 활성을 증강시키는 방법은 NKp30-발현 세포를 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열과 최소한 90% 또는 최소한 95%의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 절편을 포함하는 분리된 가용성 폴리펩티드와 접촉시키는 것, 또는 NKp30-발현 세포를 재조합 막-결합된 zB7H6 폴리펩티드를 발현하는 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 다른 변형예에서, 방법은 기능성 zB7H6을 발현하는 세포를, NKp30-발현 세포의 존재하에, 항-zB7H6 항체 또는 zB7H6과 NKp30의 상호작용을 간섭할 수 있는 다른 제제와 효과적인 양으로 접촉시키는 것을 포함한다. 그런 방법은 시험관 내에서, 생체 외에서, 또는 생체 내에서 수행될 수 있다.
어떤 바람직한 변형예에서, NK 세포 활성의 조절 방법, 이를테면 예를 들어 증가된 또는 감소된 NK 세포 활성과 관련된 질병 또는 장애의 치료방법을 포함하여 그런 방법들이 제공된다. 어떤 구체예에서, 방법은 NK 세포를 zB7H6 폴리펩티드, 또는 zB7H6과 NKp30의 상호작용을 간섭할 수 있는 다른 제제 (예컨대 zB7H6 항-이디오타입 항체)와, NKp30-중재된 NK 세포 세포용해 활성을 야기하기에 효과적인 양으로 접촉시키는 것을 포함한다. zB7H6 폴리펩티드는 가용성 또는 고정된 (예컨대 세포막-결합된) 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어 구체적인 변형예에서, NK 세포 활성을 증강시키는 방법은 사람 NK 세포를 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열과 최소한 90% 또는 최소한 95%의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 절편을 포함하는 분리된 가용성 폴리펩티드와 접촉시키는 것, 또는 사람 NK 세포를 재조합 막-결합된 zB7H6 폴리펩티드를 발현하는 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 다른 변형예에서, 방법은 기능성 zB7H6을 발현하는 세포를, NKp30-발현 세포의 존재하에, 항-zB7H6 항체 또는 zB7H6과 NKp30의 상호작용을 간섭할 수 있는 다른 제제와 효과적인 양으로 접촉시키는 것을 포함한다. 그런 방법은 시험관 내에서, 생체 외에서, 또는 생체 내에서 수행될 수 있다.
다른 구체예에서, NKp30-발현 T 세포 활성을 조절하는 방법, 이를테면 예를 들어 NKp30-발현 T 세포의 증가되거나 감소된 활성과 관련된 질병 또는 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 특정 T 세포, 이를테면 CD8+ T 세포는 NKp30을 발현하는 것으로 나타났다 (예컨대 Srivastava and Srivastava, Leuk . Res . 30:37-46, 2006). 따라서, 어떤 구체예에서, 방법은 NKp30-발현 세포 (예컨대 CD8+ T 세포)를 zB7H6 폴리펩티드, 또는 zB7H6과 NKp30의 상호작용을 모방할 수 있는 제제 (예컨대 zB7H6 항-이디오타입 항체)와 NKp30-중재된 활성 (예컨대 세포용해성 활성)을 야기하기에 효과적인 양으로 접촉시키는 것을 포함한다. zB7H6 폴리펩티드는 가용성 또는 고정된 (예컨대 세포막-결합된) 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어 구체적인 변형예에서, NKp30-발현 T 세포의 활성을 증강시키는 방법은 NKp30-발현 T 세포를 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열과 최소한 90% 또는 최소한 95%의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 절편을 포함하는 분리된 가용성 폴리펩티드와 접촉시키는 것, 또는 NKp30-발현 T 세포를 재조합 막-결합된 zB7H6 폴리펩티드를 발현하는 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 다른 변형예에서, 방법은 기능성 zB7H6을 발현하는 세포를, NKp30-발현 세포의 존재하에, 항-zB7H6 항체 또는 zB7H6과 NKp30의 상호작용을 간섭할 수 있는 다른 제제와 효과적인 양으로 접촉시키는 것을 포함한다. 그런 방법은 시험관 내에서, 생체 외에서, 또는 생체 내에서 수행될 수 있다.
상기에서 주지된 바와 같이, 특별한 변형예에서 방법은 NK 세포 활성과 관련된 질병 또는 장애를 치료하는 방법이다. 예를 들어 어떤 구체예에서 방법은 효과적인 양의 가용성 zB7H6 폴리펩티드, 또는 zB7H6과 NKp30의 상호작용을 모방할 수 있는 제제 (예컨대 zB7H6 항-이디오타입 항체)를 불충분한 천연 킬러 (NK) 세포 활성을 특징으로 하는 질병 또는 장애 (예컨대 암 또는 감염성 질병)로 고생하는, 또는 그런 장애 또는 질병이 발생될 위험이 높은 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 방법은 효과적인 양의 항-zB7H6 항체 또는 zB7H6과 NKp30의 상호작용을 간섭할 수 있는 다른 제제를 NK-세포-중재된 질병 또는 장애 (예컨대 NK-세포-중재된 동종이식편 거부반응, 예컨대 NK-세포-중재된 골수 세포 (BMC) 동종이식편 거부반응)로 고생하는, 또는 그런 장애 또는 질병이 발생될 위험이 높은 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
어떤 변형예에서, 가용성 zB7H6 폴리펩티드는 암치료법을 위한 면역자극제로서 사용된다. 분비된 다양한 면역조절 단백질은 동물 모델에서 면역 시스템의 자극을 통해 항-종양 반응을 자극하는 것으로 알려져 있다 (일반적으로 Rosenberg (ed.), Principles and practice of the biologic therapy of cancer (Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 3rd ed. 2000)). 예를 들어 IL-2 및 IFN-α의 사용은 전이성 흑색종 및 망막 세포 암종의 치료를 위해 사용된다 (예컨대 Atkins et al., J. Clin . Oncol . 17:2105-16, 1999; Fyfe et al., J. Clin . Oncol . 13:688-96, 1995; Jonasch and Haluska, Oncologist 6:34-55, 2001). 이들 사이토킨의 작용에 대해 제안된 메커니즘은 CD8+ T 세포 및 NK 세포에 의한 직접적인 종양 세포 죽음의 증강을 포함한다. 본원에서 설명된 것과 같은 가용성 zB7H6 수용체는 NKp30-중재된 세포용해 활성의 유도를 통해 NK 세포 또는 CD8+ T 세포에 의한 직접적인 종양 죽음을 증강시키기 위해 유사한 방식으로 사용될 수 있다.
가용성 zB7H6 폴리펩티드는 또한 감염성 질병, 이를테면 예컨대 바이러스 감염의 치료를 위한 면역자극제로서 사용될 수 있다. NK 세포는 침입하는 병원체에 대한 첫 번째 방어선을 구성하고, 통상적으로 바이러스 감염의 초기 단계에서 활성화된다 (Ahmad and Alvarez, J. Leukoc . Biol . 76:743-759, 2004; Shresta et al., Virology 319:262- 273, 2004). CD8+ T 세포는 또한 감염성 병원체에 대한 면역 반응을 중재하는 데 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 (Wong and Palmer, Annu . Rev . Immunol. 21:29-70, 2003). 감염성 질병을 치료하기 위한 현재의 치료는 무엇보다도 NK 및 T 세포 활성을 촉진하는 것으로 알려진 면역 시스템 자극제를 포함한다. 그런 치료는 에컨대 HIV 감염에서 치료제로서 IL-2의 사용 (Smith, AIDS 15 Suppl 2:S28-35, 2001)뿐만 아니라 HCV 감염의 치료에서 IFN-α의 사용 (Ahmad and Alvarez, 상기동일)을 포함한다. NK 세포 활성을 증가시키는 면역조절 단백질을 경유하여 감염성 질병을 치료하기 위한 가능성은, HCV-감염된 개체에서 효과적인 치료법이 NK 세포 활성에서 그것들의 증가와 상관관계가 있다는 관찰에 의해 한층 더 강조된다: 치료법이 NK 세포 반응을 증가시키지 못한 개체에서 바이러스 혈증의 감소는 관찰되지 않았다 (van Thiel et al., Dig . Dis . Sci . 39:970-976, 1994; Wozniakowska-Gesicka et al., Pol . Merkuriusz Lek . 8:376-377, 2000; Bonavita et al., Int . J. Tissue React . 15: 11-16, 1993). 그러므로 NKp30-중재된 NK 또는 CD8+ T 세포 활성을 자극할 수 있는 가용성 zB7H6 폴리펩티드는 감염성 질병을 치료하기 위해 NK-중재된 또는 CD8+ T 세포-중재된 항-병원체 (예컨대 항-바이러스) 방어 메커니즘을 촉진하기 위해 사용될 수 있다.
다른 변형예에서, 항-zB7H6 항체는 NK-세포-중재된 골수 동종이식편 거부반응을 억제하기 위해 사용된다. 골수 이식 (BMT)은 다양한 혈액학적 악성종양의 치료를 위한 치료법 중에서 인정된 방법이 되었다. 그러나 동종 이계의 BMT의 효능은 이식편의 거부반응과 같은 특정 장애물에 의해 제한된다. NK 세포가 골수 동종이식편의 접목의 장벽이고 그것들은 단독으로 마우스에서의 BMC 거부반응의 특이성을 중재할 수 있다는 충분한 증거가 있다 (Murphy et al., J. Exp . Med . 165:1212-1217, 1987; Murphy et al., J. Exp . Med . 166:1499-1509, 1987; Murphy et al., J. Immunol . 144:3305-3311, 1990; Murphy et al., Eur . J. Immunol . 20:1729-1734, 1990; Murphy et al., Immunol . Rev . 181:279-289, 2001). 세포축소성 조건화 없이, T 세포가 고갈된 HLA-미스매치된 BMT를 받은, 임상적으로 SCID에 걸린 환자에게서 관찰된 동종이식편 내성은 공여자로부터의 NK 세포의 높은 활성에 기인한다 (O'Reilly et al., Vox . Sang . 51:81-86, 1986). 따라서 zB7H6과 NKp30의 상호작용을 억제할 수 있는, zB7H6의 세포외재성 도메인에 대한 항체는 본원에서 설명된 것과 같이, 동종이식편에 대한 NK 세포 세포용해 활성을 억제하기 위해 BMT 동안 사용될 수 있고, 그로써 BMC 동종이식편 거부반응을 치료 또는 방지할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 항-zB7H6 항체는 zB7H6-발현 세포, 예컨대 zB7H6-발현 암세포에 대하여 항체 의존성 세포의 세포독성 (ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 유도하기 위해 사용된다. 항체 치료법은 특정 종양이 독특한 항원, 계통-특이적 항원, 또는 정상 세포에 관련하여 과량으로 존재하는 항원을 나타내기 때문에 암치료에 특히 성공적이었다. 실험적 증거는 zB7H6이 정상 조직과 관련하여, 많은 종양-유도된 셀라인, 이를테면 결장암, 간암, 자궁경부암, 폐암, 췌장암 및 전립선암으로부터 유도된 셀라인뿐만 아니라 원시혈구 백혈병, B-세포 림프종, 단핵 림프종, 적혈구성 백혈병, 버킷 림프종, 또는 만성 골수성 백혈병과 같은 혈액의 다양한 암으로부터 유도된 셀라인에 의해 고도로 발현되는 것을 증명한다. 단클론성 항체 치료법의 항-종양 활성과 관련된 메커니즘 중 하나는 항체 의존성 세포의 세포독성 (ADCC)이다. ADCC에서, 표적 세포 (예컨대 암세포)에 결합하는 단클론성 항체 및 단클론성 항체에 대한 수용체를 발현하는 특이적 이펙터 세포 (예컨대 NK 세포, CD8+ T 세포, 단핵세포, 과립구)는 표적 세포 사망을 초래하는 단클론성 항체/표적 세포 복합체를 결성한다.
따라서 어떤 구체예에서, 이펙터 기능을 보유한 Fc 영역을 포함하는 항-zB7H6 항체는 zB7H6-발현 세포에 대하여 항체 의존성 세포의 세포독성 (ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 유도하기 위해 사용된다. ADCC를 유도하는 방법은 일반적으로 zB7H6-발현 세포를, ADCC 활성을 가지는 Fc 영역을 포함하는, 효과적인 양의 항-zB7H6 항체와 접촉하는 것을 포함하고, 이때 접촉 단계는 세포용해 활성을 가지는 Fc 수용체를 발현하는 세포용해성 면역 이펙터 세포의 존재하에 있다. 세포용해성 Fc 수용체 (예컨대 FcγRIIIα 또는 CD16)를 발현하는 면역 이펙터 세포는 예를 들면 NK 세포뿐만 아니라 특정 CD8+ T 세포를 포함한다. CDC를 유도하기 위한 방법은 일반적으로 zB7H6-발현 세포를, CDC 활성을 가지는 Fc 영역을 포함하는, 효과적인 양의 항-zB7H6 항체와 접촉하는 것을 포함하고, 이때 접촉 단계는 보체의 존재하에 있다. 그런 방법을 사용하여 죽음에 대해 표적화될 수 있는 zB7H6-발현 세포는 예를 들면 암세포, 예컨대 결장암세포, 간암세포, 자궁경부암세포, 폐암세포, 췌장암세포, 전립선암세포, 원시혈구 백혈병 세포, B-세포 림프종 세포, 단핵 림프종 세포, 적혈구성 백혈병 세포, 버킷 림프종 세포, 및 만성 골수성 백혈병 세포를 포함한다.
관련된 구체예에서 이펙터 기능을 가지는 Fc 영역을 포함하는 항-zB7H6 항체는 대상에서 zB7H6-발현 암을 치료하기 위해 사용된다. 그런 방법은 일반적으로 대상에게, ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 가지는 Fc 영역을 포함하는, 효과적인 양의 항-zB7H6 항체를 투여하는 것을 포함한다. 그런 방법을 사용하여 특히 치료되기 쉬운 zB7H6-발현 암으로는 예를 들어 결장암, 간암, 자궁경부암, 폐암, 췌장암 또는 전립선암뿐만 아니라 원시혈구 백혈병, B-세포 림프종, 단핵 림프종, 적혈구성 백혈병, 버킷 림프종, 또는 만성 골수성 백혈병과 같은 혈액암이 있다.
또 다른 구체예에서, 항-Zb7h6 항체-약물 포합체 (상기 단원 V 참조)는 zB7H6-발현 세포에 치료제를 전달하기 위해 사용되며, 이때 제제는 치료 효과를 나타낸다. 항-zB7H6 항체-약물 포합체를 활용하는 바람직한 특정 변형예에서, 치료제는 zB7H6-발현 세포, 예컨대 zB7H6-발현 암세포에 세포독성 또는 세포분열 억제 효과는 나타내는 세포독성제이다. 상기에서 나타난 바와 같이, 실험적인 증거는 zB7H6이 정상 조직과 관련하여, 많은 종양-유도된 셀라인, 이를테면 결장암, 간암, 자궁경부암, 폐암, 췌장암 및 전립선암으로부터 유도된 셀라인뿐만 아니라 원시혈구 백혈병, B-세포 림프종, 단핵 림프종, 적혈구성 백혈병, 버킷 림프종, 또는 만성 골수성 백혈병과 같은 혈액의 다양한 암으로부터 유도된 셀라인에 의해 고도로 발현되는 것을 증명한다. 이런 증거는 zB7H6이 암치료에 치료적 효능을 가지는 제제, 특히 종양 세포를 고갈시키거나 성장을 억제할 수 있는 세포독성제를 표적화하는 데 유용한 신규한 종양-특이적 또는 종양-관련된 항원이라는 것을 나타낸다. 따라서 어떤 구체예에서, 세포독성제에 포합된 항-zB7H6 항체를 포함하는 항-zB7H6 항체-약물 포합체는 zB7H6-발현 암을 치료하기 위해 사용된다.
본원에서 설명된 치료 방법의 각각의 구체예에서, 가용성 zB7H6 폴리펩티드, 항체, 또는 다른 zB7H6-관련 항체 (이를테면 예컨대 zB7H6 폴리뉴클레오티드 또는 항-zB7H6 항체-약물 포합체)는 그것에 대한 치료가 모색되는 질병 또는 장애의 관리와 관련된 종래의 방법론들과 일관된 방식으로 전달된다. 본원에 개시된 내용에 따라 효과적인 양의 제제는 질병 또는 장애를 방지하거나 치료하기에 충분한 시간 동안, 그리고 그러한 조건하에서 그럴 필요가 있는 대상에게 투여된다.
본원에서 설명된 것과 같은 가용성 zB7H6 폴리펩티드, 항체, 또는 다른 zB7H6-관련 항체가 투여될 대상은 NK 세포 활성과 관련된 특별한 질병 또는 장애를 전개할 위험이 높은 환자뿐만 아니라 기존의 NK 세포-관련 질병 또는 장애를 보이는 환자를 포함한다. 특정 구체예에서, 대상은 치료가 모색되는 질병 또는 장애를 가지는 것으로 진단되었다. 나아가 대상은 질병 또는 장애에 어떠한 변화에 대한 (예컨대 질병 또는 장애의 임상적 증상의 증가 또는 감소에 대한) 치료과정 중에 모니터될 수 있다. 또한 어떤 변형예에서, 대상은 동족 수용체와의 zB7H6의 상호작용을 모방하거나 차단하는 것을 포함하는 치료를 필요로 하는 다른 질병 또는 장애를 나타내지 않는다.
예방학적 적용에서, 약제학적 조성물 또는 의약은 질병을 제거하거나 질병에 걸릴 위험을 감소시키거나 또는 질병의 전조를 지연시키기에 충분한 양으로 특별한 질병에 민감한, 또는 다르게는 그럴 위험이 있는 환자에게 투여된다. 치료적 용도에서, 조성물 또는 의약은 질병 및 그것의 합병증의 치료에, 또는 최소한 부분적으로 저지하기에 충분한 양으로 그런 질병에 걸린 것으로 의심되는, 또는 이미 걸려있는 환자에게 투여된다. 이것을 이루기에 적당한 양은 치료적으로- 또는 약제학적으로-효과적인 용량 또는 양으로 언급된다. 예방학적 및 치료적 처방 둘 다에서, 제제는 통상 충분한 반응 (예컨대 적절한 NK 세포 활성의 야기 또는 부적절한 NK 세포 활성의 억제)이 이루어질 때까지 여러 단위용량으로 투여된다. 전형적으로 반응은 모니터되고 원하는 반응이 사라지기 시작한다면 반복해서 단위용량이 제공된다.
본 발명의 방법에 따르는 치료에 대한 대상 환자를 확인하기 위해, 특이적 NK세포-관련 장애와 관련된 위험 인자를 측정하기 위해 또는 대상에서 확인된 기존의 장애의 상태를 측정하기 위해 인정된 선별 방법이 사용될 수 있다. 그런 방법은 예를 들면 개체가 특별한 질병으로 진단되었던 것과 관련이 있는지 여부를 측정하는 것을 포함한다. 선별 방법은 또한 예를 들면 유전적인 요소를 가지는 것을 알려져 있는 특별한 질병에 대한 가족력을 측정하기 위한 종래 작업들을 포함한다 (예를 들면 BMT의 경우에 임상 연구 결과 특정 HLA-C 대립형질의 존재가 BM 동종이식편 거부반응에 대한 증가된 위험과 상관관계가 있고 (Scott et al., Blood 92:48644871, 1998) 다양한 암은 또한 특정 유전적 요소를 가지는 것으로 알려져 있다). 암의 비유전적인 요소들은 예를 들면 형질전환하는 다중 유전자의 돌연변이 (예컨대 Ras, Raf, EGFR, cMet 및 기타), 특정 HLA 및 킬러 억제성 수용체 (KIR) 분자의 존재 또는 부재, 또는 그것에 의해 암세포가 NK 세포 및 T 세포와 같은 세포를 직접 또는 간접적으로 면역 억제를 조절할 수 있는 메커니즘이다 (Ljunggren and Malmberg, Nature Rev . Immunol . 7:329-339, 2007; Boyton and Altmann, Clin . Exp. Immunol . 149:1-8, 2007). 이 목적을 위해 뉴클레오티드 프로브는 기본적으로 관심의 특별한 질병과 관련된 유전자 마커를 은닉하는 개체를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 특이한 질병에 대한 마커를 확인하기에 유용한 광범위한 면역학적 방법이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어 특이한 종양과 관련된 항원을 검출하기 위해 단클론성 항체 프로브를 사용하는 다양한 ELISA 면역분석 방법이 활용가능하며, 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 선별은 공지된 환자 증상, 연령 인자, 관련된 위험 인자 등에 의해 나타나는 것과 같이 시행될 수 있다. 이들 방법은 임상의가 치료를 위해 본원에서 설명된 방법을 필요로 하는 환자를 통상적으로 선택하는 것을 가능하게 한다. 이들 방법에 따라서 NK 세포 활성의 조절은 독립적인 치료 프로그램으로서 또는 다른 치료에 대한 추수, 보조, 또는 조정 치료로서 시행될 수 있다.
투여를 위해 zB7H6 폴리펩티드, 항체, 또는 다른 zB7H6-관련 제제는 약제학적 조성물로서 제형된다. 가용성 zB7H6 폴리펩티드, 항-zB7H6 항체, 또는 다른 제제를 포함하는 약제학적 조성물은 약제학적으로 유용한 조성물을 제조하기 위해 공지된 방법을 따라 제형될 수 있고, 그로써 치료 분자는 약제학적으로 허용되는 담체와의 혼합물로 조합된다. 조성물은 만약 그것의 투여가 수용체 환자에 의해 받아들여질 수 있다면 "약제학적으로 허용되는 담체"로 언급된다. 멸균 포스페이트-완충 식염수는 약제학적으로 허용되는 담체의 한 실례이다. 다른 적당한 담체는 당업자들에게 잘 알려져 있다 (Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995). 제형은 추가로 바이러스 표면상에서 단백질이 손실되는 방지하기 위해 하나 또는 그 이상의 부형제, 보존제, 가용화제, 완충제, 알부민을 포함할 수 있다.
zB7H6 폴리펩티드, 항체, 또는 다른 zB7H6-관련 제제를 포함하는 약제학적 조성물은 효과적인 양으로 대상에게 투여된다. 본 발명의 방법에 따라 폴리펩티드, 항체, 또는 다른 제제는 다양한 투여 방식, 이를테면 예를 들어 근육 내, 피하, 정맥 내, 동맥 내, 관절 내, 비경구, 비강 내, 폐 내, 경막, 늑막강 내, 기관지 내, 및 경구 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 방지 및 치료 목적에 대해 제제는 단일 거환 전달로, 연장된 시간 기간 동안 연속적인 전달 (예컨대 연속적인 경막 전달)을 통해, 또는 반복된 투여 프로토콜로 (예컨대 시간마다, 날마다, 또는 주마다) 대상에게 투여될 수 있다.
본 맥락에서 효과적인 단위용량의 측정은 전형적으로 동물 모델 연구와, 이어서 사람 임상 시도를 토대로 하며, 모델 대상에서 대상이 되는 질병 또는 장애의 발생 또는 심각성을 크게 감소시키는 효과적인 단위용량 및 투여 프로토콜을 측정함으로써 유도된다. 본 발명의 조성물의 효과적인 용량은 상이한 많은 인자들, 이를테면 투여수단, 표적 부위, 환자의 생리적 상태, 환자가 사람인지 동물인지의 여부, 투여되는 기타 의약, 치료가 예방을 위한 것인지 또는 치료목적인지의 여부뿐만 아니라 조성물 자체의 특이한 활성 및 개체에서 원하는 반응을 유도하는 능력에 따라 달라진다. 통상적으로 환자는 사람이지만, 어떤 질병에서는 환자는 비사람 포유류이다. 전형적으로, 단위용량 처방은 최적 치료 반응을 제공하기 위해, 즉 안전성과 효능을 최적화하기 위해 조정된다. 따라서 치료적으로 또는 예방학적으로 효과적인 양은 또한 어떠한 바람직하지 못한 부차적인 효과보다 NKp30-중재된 NK 세포 활성을 조절하는 유익한 효과가 우위에 있는 양이다. 가용성 zB7H6 폴리펩티드 또는 항체의 투여를 위해, 단위용량은 전형적으로 약 0.1㎍ 내지 100mg/kg 또는 1㎍/kg 내지 약 50mg/kg의 범위, 보다 통상적으로는 10㎍ 내지 5mg/kg의 대상의 체중의 범위이다. 보다 구체적인 구체예에서, 제제의 효과적인 양은 약 1㎍/kg 내지 약 20mg/kg, 약 10㎍/kg 내지 약 10mg/kg, 또는 약 0.1mg/kg 내지 약 5mg/kg이다. 이 범위 내의 단위용량은 단일 또는 다중 투여에 의해 이루어지며, 예를 들면 하루에 수회 또는 매일, 주마다, 이주 간격으로, 또는 매달 투여를 포함한다. 예를 들어 특정 변형예에서, 처방은 초기 투여 후에 주마다 또는 이주 간격으로 다수의 계속되는 투여로 구성된다. 다른 처방은 초기 투여 후에 달마다 또는 2달 간격으로 다수의 계속되는 투여로 구성된다. 또는 달리 투여는 NK 세포 활성 및/또는 질병 또는 장애의 임상적 증상을 모니터함으로써 나타나는 바와 같이 불규칙적인 기준으로 이루어질 수 있다.
약제학적 조성물의 단위용량은 표적 부위에 원하는 농도를 유지하기 위해 임상의가 주의를 기울임으로써 달라질 수 있다. 예를 들어 만약 정맥내 전달 방식이 선택된다면, 표적 조직에서의 혈류 중의 제제의 국소 농도는 리터당 조성물의 약 1 내지 50 나노몰일 수 있고, 때로 대상의 상태 및 계획된 측정된 반응에 따라 리터당 약 1.0 나노몰 내지 10, 15, 또는 25 나노몰 사이이다. 더 높거나 낮은 농도는 전달 방식을 토대로, 예컨대 경표피 전달 대 점막 표면으로의 전달 방식이 선택될 수 있다. 단위용량은 또한 투여된 제형의 방출 속도를 토대로, 예컨대 비강 분무 대 분말, 지속성 방출 경구 또는 주입된 입자, 경막 제형 등으로 조정되어야 한다. 동일한 혈청 농도 수준을 이루기 위해서는, 예를 들어 방출 속도가 5 나노몰 (표준 조건 하에서)의 방출 속도로 느리게 방출되는 입자는 10 나노몰의 방출 속도를 가지는 입자의 단위용량보다 약 2배로 투여될 것이다.
가용성 zB7H6 폴리펩티드, 항체, 또는 다른 zB7H6-관련 조성물을 포함하는 약제학적 조성물은 액체 형태로, 에어로솔로, 또는 고체 형태로 제공될 수 있다. 액체 형태의 예를 들면 주입가능한 용액, 에어로솔, 방울, 위상학적 용액 및 경구 현탁액이다. 고체 형태의 예를 들면 캡슐, 정제, 및 방출 조절형 형태가 있다. 후자의 형태는 미니 삼투압 펌프 및 이식물을 예로 들 수 있다 (Bremer et al,, Pharm. Biotechnol . 10:239, 1997; Ranade, "Implants in Drug Delivery," in Drug Delivery Systems 95-123 (Ranade and Hollinger, eds., CRC Press 1995); Bremer et al., "Protein Delivery with Infusion Pumps," in Protein Delivery : Physical Systems 239-254 (Sanders and Hendren, eds., Plenum Press 1997); Yewey et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant," in Protein Delivery : Physical Systems 93-117 (Sanders and Hendren, eds., Plenum Press 1997). 다른 고체 형태는 크림, 페이스트, 다른 위상학적 적용 등을 포함한다.
리포솜은 대상에게 치료 폴리펩티드를 예컨대 정맥 내로, 복강 내로, 기관지 내로, 근육 내로, 피하로, 또는 경구 투여, 흡입, 또는 비강 내 투여를 통해 전달하기 위한 수단을 제공한다. 리포솜은 수성 구획을 둘러싸고 있는 하나 또는 그 이상의 지질 이중층으로 구성되는 미세한 소포체이다 (Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin . Microbiol . Infect . Dis . 12 (Suppl.l):S6l, 1993; Kim, Drugs 46:618, 1993; Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers," in Drug Delivery Systems 3-24 (Ranade and Hollinger, eds., CRC Press 1995)). 리포솜은 조성에 있어서 세포막과 유사하며 그 결과로서 리포솜은 안전하게 투여되고, 생체내에서 분해될 수 있다. 제조 방법에 따라 리포솜은 단일층이거나 다중층이며, 리포솜은 0.02㎛ 내지 10㎛ 이상의 범위의 직경으로 크기가 달라질 수 있다. 다양한 제제는 리포솜으로 캡슐화될 수 있다: 소수성 제제는 이중층에 구획되고, 친수성 제제는 내부 수성 공간(들)에 구획된다 (Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987); Ostro et al., American J. Hosp . Pharm . 46:1576, 1989). 더욱이 리포솜 크기, 이중층의 수, 지질 조성과 리포솜의 전하와 표면 특성을 다르게 함으로써 캡슐화된 제제의치료적 활용성을 조절하는 것이 가능하다.
리포솜은 실제로 세포의 어떠한 유형이든지 흡착할 수 있고, 그런 다음 서서히 캡슐화된 제제를 방출할 수 있다. 또는 달리 흡수된 리포솜은 식균작용을 하는 세포에 의해 이물로서 흡수될 수 있다. 세포 이물 흡수에 이어서 리포솜 지질의 리소솜 내 분해 및 캡슐화된 제제의 방출이 이루어진다 (Scherphof et al., Ann . N. Y. Acad . Sci . 446:368, 1985). 정맥내 투여 후에 작은 리포솜 (0.1 내지 1.0㎛)이 통상적으로 간과 비장에 주로 위치한 세망내피계 세포에 의해 흡수되는 한편, 3.0㎛보다 큰 리포솜은 폐에 가라앉는다. 세망내피계 세포에 의한 보다 작은 리포솜의 이런 우선적인 흡수는 화학요법제를 대식세포 및 간의 종양에 전달하기 위해 사용되어 왔다.
세망내피계는 다량의 리포솜 입자로의 포화, 또는 약리학적 수단에 의한 선택적인 대식세포 비활성화를 포함한 여러 방법에 의해 회피될 수 있다 (Claassen et al., Biochim . Biophys . Acta 802:428, 1984). 또한 당지질- 또는 폴리에틸렌 글리콜-유도된 인지질의 리포솜 막 안으로의 통합은 세망내피계에 의한 상당히 감소된 흡수를 초래하는 것으로 밝혀졌다 (Allen et al., Biochim . Biophys . Acta 1068:133, 1991; Allen et al., Biochim . Biophys . Acta 1150:9, 1993).
리포솜은 또한 인지질 조성을 달리 함으로써 또는 리포솜 안에 수용체 또는 카운터-수용체를 삽입시킴으로써 특별한 세포 또는 기관을 표적화하기 위해 제조될 수 있다. 예를 들어 비이온성 계면활성제의 함량이 높게 제조된 리포솜은 간을 표적화하기 위해 사용되어 왔다 (일본 특허 04-244,018, Hayakawa et al.,: Kato et al., Biol . Pharm . Bull . 16:960, 1993). 이들 제형은 소이빈 포스파티딜콜린, α-토코페롤, 및 에톡실화된 수소첨가 캐스터유 (HCO-60)를 메탄올에 혼합하고, 그 혼합물을 진공하에서 농축한 후 그 결과의 혼합물을 물로 재구성함으로써 제조되었다. 소이빈-유도된 스테릴글루코시드 혼합물 (SG)과 콜레스테롤 (Ch)을 포함한 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC)의 리포솜 제형도 또한 간을 표적화하는 것으로 밝혀졌다 (Shimizu et al., Biol . Pharm . Bull . 20:881, 1997).
또는 달리 다양한 표적화 카운터-수용체는 리포솜, 예컨대 항체, 항체 단편, 탄수화물, 비타민, 및 수송 단백질의 표면에 결합될 수 있다. 예를 들어 간을 표적화하기 위해, 리포솜은 분지형 갈락토실지질 유도체로 변형되어 아시알로당단백질 (갈락토오스) 수용체를 표적화할 수 있으며, 그것은 간세포 표면에 배타적으로 발현된다 (Kato and Sugiyama, Crit . Rev . Ther . Drug Carrier Syst . 14:287, 1997; Murahashi et al., Biol . Pharm . Bull . 20:259, 1997). 조직 표적화에 대한 보다 일반적인 접근법에서, 표적 세포는 표적 세포에 의해 발현된 카운터-수용체에 특이적인 비오티닐화된 항체로 표지된다 (Harasym et al., Adv . Drug Deliv . Rev . 32:99, 1998). 유리 항체를 원형질에서 제거한 후에 스트렙트아비딘-포합된 리포솜이 투여된다. 다른 접근법에서 표적화 항체는 리포솜에 직접 부착된다 (Harasym et al., 상기 동일).
폴리펩티드 및 항체는 단백질 미소캡슐화의 표준 기법을 사용하여 리포솜 내에 캡슐화된다 (Anderson et al., Infect . Immun . 31:1099, 1981; Anderson et al., Cancer Res . 50:1853, 1990; Cohen et al., Biochim . Biophys . Acta 1063:95, 1991; Alving et al., "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies," in Liposome Technology ( Vol . III ) 317 (Gregoriadis, ed., CRC Press, 2nd ed. 1993); Wassef et al., Meth . Enzymol . 149:124, 1987). 상기에서 주지된 것과 같이 치료적으로 유용한 리포솜은 다양한 성분을 함유할 수 있다. 예를 들어 리포솜은 폴리(에틸렌 글리콜)의 지질 유도체를 포함할 수 있다 (Allen et al., Biochim. Biophys . Acta 1150:9, 1993.)
분해가능한 중합체 마이크로 스피어는 치료 단백질의 높은 전신 수준을 유지하기 위해 디자인되었다. 마이크로 스피어는 폴리(락타이드-코-글리콜리드)(PLG), 다가무수물, 폴리(오르토 에스테르), 비생체분해성 에틸비닐 아세테이트 중합체와 같은 분해가능한 중합체로부터 제조되고, 이때 단백질은 중합체 안에 포획된다 (Gombotz and Pettit, Bioconjugate Chem . 6:332, 1995; Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery," in Drug Delivery Systems 51-93 (Ranade and Hollinger, eds., CRC Press 1995); Roskos and Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery," in Protein Delivery : Physical Systems 45-92 (Sanders and Hendren, eds., Plenum Press 1997); Bartus et al., Science 281:1161, 1998; Putney and Burke, Nature Biotechnology 16:153, 1998; Putney, Curr . Opin . Chem . Biol . 2:548, 1998). 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-코팅된 나노스피어도 치료 단백질의 정맥내 투여를 위한 담체를 제공할 수 있다 (Grefet al., Pharm . Biotechnol . 10:167, 1997).
다른 단위용량 형태도 문헌에 나타난 바와 같이 당업자에 의해 고안될 수 있다: Ansel and Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lea & Febiger, 5th ed. 1990); Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995), and Ranade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996).
zB7H6 폴리펩티드는 유전자 치료법과 관련하여 사용될 수 있다. 유전자 치료법은 넓은 의미로는 세포 표현형을 일시적으로 또는 영구적으로 변경시키기 위하여 세포 안에 유전자 물질을 전달하는 것으로 규정될 수 있다. 많은 방법들이 사이토킨, 종양 항원, 및 추가의 공-자극성 분자를 유전자 전달법을 통하여 종양 환자의 특이한 위치에 전달하기 위해 개발되었다 (Rosenberg (ed.), Principles and practice of the biologic therapy of cancer (Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 3rd ed. 2000)). 이들 방법론은 zB7H6 DNA 또는 RNA를 사용하기 위해 조정될 수 있다.
따라서 어떤 구체예에서, 대상에서의 NK 세포 반응은 zB7H6 단백질, 이를테면 예를 들어 본원에서 설명된 것과 같은 가용성 zB7H6 폴리펩티드를 코드화하는 핵산의 투여에 의해 조절된다. 그런 zB7H6-코드화 핵산을 사용함으로써 불충분한 NK 세포 활성을 특징으로 하는 질병 또는 장애는 일반적으로 상기에서 논의된 것과 같이 치료될 수 있다. 핵산 치료법의 경우에 zB7H6 폴리펩티드는 가용성 수용체로서 발현될 수 있는데, 그것은 상기에서 설명된 것과 같이 대상에게 직접 투여되는 가용성 zB7H6 폴리펩티드에 유사한 방식으로 NKp30-중재된 효과를 유도하기 위해 세포로부터 분비된다. 또는 달리 zB7H6 폴리펩티드는 단백질 (예컨대 기능성 경막 도메인 또는 GPI 연쇄를 가진다)이 발현되는 세포 표면과 결합상태를 유지하는 형태로 발현될 수 있고, 그런 구체예는 특히 국한된 NKp30-중재된 효과를 유지하기 위하여 특별한 세포 또는 조직을 표적화하는 것을 촉진하는 데 유용하다.
치료 방법에서 사용하기 위한 zB7H6 폴리펩티드-코드화 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. zB7H6 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 절편은 전형적으로 조절 요소, 예컨대 환자의 의도된 표적 세포에서 DNA 절편의 발현을 가능하게 하는 프로모터 및 인핸서에 연결된다. 혈구에서의 발현에 대해, 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 유전자로부터의 프로모터와 인핸서 요소 또는 CMV 주요 중간체 초기 프로모터 및 인핸서는, zB7H6 폴리펩티드의 발현을 통해 NK 세포-중재된 반응의 유도에 대해 바람직한 것과 같이, 발현을 지시하기에 적당하다. 연결된 조절 요소 및 코딩 서열은 때로 벡터 안에 클론된다.
많은 바이러스 벡터 시스템, 이를테면 레트로바이러스 시스템 (Lawrie and Tumin, Cur . Opin . Genet . Develop. 3, 102-109, 1993); 아데노바이러스 벡터 (Bett et al., J. Virol . 67, 5911, 1993); 아데노-관련 바이러스 벡터 (Zhou et al., J. Exp . Med . 179, 1867, 1994), 백시니아 바이러스를 포함한 천연두 패밀리로부터의 바이러스 벡터 및 조류 천연두 바이러스, Sindbis 및 Semliki Forest 바이러스로부터 유도된 것과 같은 알파 바이러스로부터의 바이러스 벡터 (Dubensky et al., J. Virol . 70, 508-519, 1996), 및 유두종 바이러스 (Ohe et al., Human Gene Therapy 6, 325-333, 1995; WO 94/12629 (Woo et al.); Xiao & Brandsma, Nucleic Acids . Res . 24, 2630-2622, 1996)가 활용가능하다.
핵산은 또한 세포에서 기능성 zB7H6 발현의 수준을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어 치료 방법에 사용하기 위한 핵산은 예를 들면 억제 폴리뉴클레오티드 (예컨대 안티센스 폴리뉴클레오티드, 작은 억제 RNA (siRNA), 리보자임, 및 외부 안내 서열)뿐만 아니라 zB7H6 우성 네거티브 변이체를 코드화하는 핵산을 포함할 수 있다. 그런 핵산은 기능성 zB7H6과의 NKp30 상호작용의 수준을 감소시킴으로써 대상에서 zB7H6 활성을 억제하는 데 사용될 수 있다.
zB7H6 폴리펩티드를 코드화하는 DNA, 또는 그것을 함유하는 벡터는 리포솜 안에 포장될 수 있다. 적당한 지질 및 관련된 유사체는 미국 특허 제 5,208,036호, 5,264,618호, 5,279,833호 및 5,283,185호에서 설명된다. 벡터 및 zB7H6 폴리펩티드를 코드화하는 DNA는 또한 과립형 담체에 흡착되거나 그것과 결합되며, 그것의 실례는 폴리메틸 메타크릴레이트 중합체 및 폴리락타이드 및 폴리(락타이드-코-글리콜리드)를 포함한다 (McGee et al., J. Micro Encap ., 1996).
유전자 치료 벡터 또는 네이키드 DNA는 생체 내에서 전신성 투여에 의해 (예컨대 정맥내, 복강내, 비강으로, 위장으로, 피부 내로, 근육내로, 표피 아래로, 또는 두개골 내 주입) 또는 국소 적용에 의해 (예컨대 미국 특허 제 5,399,346호) 각각의 환자에 투여됨으로써 전달될 수 있다. DNA는 또한 유전자 총을 사용하여 투여될 수 있다 (Xiao & Brandsma, 상기 동일). 폴리펩티드를 코드화하는 DNA는 미세한 금속 비드의 표면에 침전된다. 미세입자 투사법은 충격파 또는 팽창 헬륨 가스로 가속화되고, 조직에 여러 세포층의 깊이로 침투한다. 예를 들어 Agacetus, Inc. (Middleton WI)에 의해 제조되는 AccelTM 유전자 전달 장치가 적당하다. 또는 달리 네이키드 DNA는 화학적 또는 기계적 교반으로 피부위에 DNA를 점찍음으로써 피부를 통과하여 혈류로 들어갈 수 있다 (WO 95/05853).
추가의 변형예에서 zB7H6 폴리펩티드를 코드화하는 벡터는 생체 외 세포, 예컨대 개별적인 환자로부터 이식된 세포 (예컨대 림프구, 골수 흡인물, 조직 생검) 또는 보편적인 공여체 조혈 줄기세포에 전달되고, 이어서 그 세포가 환자에게 재이식됨으로써 전달될 수 있고, 보통 그 후에 벡터가 삽입된 세포에 대한 선택이 이어진다.
특정 구체예에서, 방법은 추가로 표적 세포 또는 조직을 특이적으로 인지하는 바이러스 또는 다른 전달 비히클 (예컨대 종양-표적화된 바이러스, 또는 특이적으로 종양 세포를 인지하는 다른 전달 비히클)의 사용을 포함할 수 있다.
본원에서 설명되는 것과 같은 약제학적 조성물은 조합 치료의 맥락에서 또한 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 "조합 치료"는 대상에게 최소한 하나의 치료적으로 효과적인 양의 zB7H6-관련 조성물과 다른 제제가 투여되는 것을 나타낸다. zB7H6-관련 조성물은 예를 들면 가용성 zB7H6 폴리펩티드, 항-zB7H6 항체 (항-zB7H6 항체-약물 포합체를 포함하여), zB7H6 모방제, 예컨대 zB7H6 항-이디오타입 항체, zB7H6-코드화 폴리뉴클레오티드, 억제성 폴리뉴클레오티드, 또는 zB7H6 생물학적 활성, zB7H6 생물학적 활성의 억제, 또는 zb7H6에의 특이한 결합을 증명하는 다른 제제 (예컨대 zB7H6-발현 세포에 치료제를 표적화하는 맥락에서)일 수 있다.
예를 들어 암 면역치료의 관점에서 zB7H6 생물학적 활성을 가지는 조성물은 화학요법, 방사선요법, 및 골수제거와 조합하여 면역자극제로서 사용될 수 있다. zB7H6 폴리펩티드 및 zB7H6 생물학적 활성을 가지는 다른 제제들은 화학요법 또는 방사선 요법의 종래 유형과 동반상승적으로 작용할 수 있다. 예를 들어 림프종 및 망막 세포 암종의 임상 모델에서 IL-2 및 독소루비신과 방사선의 조합 (Ehrke et al., Cancer Immunol . Immunother . 42:221-30, 1996), 또는 IL-2과 방사선의 조합 (Younes et al., Cell Immunol . 165:243-51, 1995) 또는 IFN-α와 방사선이 사용되며 (Nishisaka et al., Cytokines Cell Mol . Ther . 6: 199- 206, 2000) 단일 제제를 사용했을 때보다 월등한 결과가 제공된다. 이런 설정에서 zB7H6 폴리펩티드 및 zB7H6 모방제는 추가로 종양 크기를 감소시킬 수 있고, 화학요법에 의해 더 많은 효율적인 죽음이 가능해진다. 또한, 화학요법 또는 방사선 요법의 치사 용량과, 이어서 골수 이식 또는 줄기 세포 재구성은 종양 크기를 충분히 작은 수준으로까지 (에컨대 최소 잔류 질병) 감소시킬 수 있어서 더 나은 zB7H6-중재된 항종양 효과를 가능하게 한다. 이런 유형의 치료 처방의 실례는 항암 반응을 변형하기 위해 IL2와 IFN-α를 사용하고 이어서 골수제거와 이식을 사용하는 것을 포함한다 (Porrata et al., Bone Marrow Transplant . 28:673-80, 2001; Slavin and Nagler, Cancer J. Sci. Am . Suppl 1:S59-67, 1997; Fefer et al., Cancer J. Sci . Am . Suppl 1:S48-53, 1997). 림프종 및 다른 암의 경우에 zB7H6-관련 조성물이 화학요법제(들)과 관련하여 사용되는 때에 의존하여 zB7H6-관련 조성물은 종양 세포에 화학요법제의 효과와 동반상승효과를 내기 위해 직접 사용되거나, 또는 달리 면역 시스템을 자극하기 위한 화학요법 후에 사용될 수 있다. 당업자들은 두 가지 가능성의 장점을 모두 취하기 위한 프로토콜을 디자인할 수 있을 것이다.
zB7H6 생물학적 활성을 증명하는 본 발명의 조성물은 다양한 사이토킨 및 공-자극성/억제성 분자를 포함하여 다른 면역조절 화합물과 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어 항암 반응을 중재할 때의 zB7H6의 NK 세포 자극 활성은, zB7H6 활성을 가지는 조성물이 다른 부류의 면역조절 분자와 함께 사용될 때 환자에게서 증강될 수 있다. 이것들은 추가의 사이토킨의 사용을 포함하며, 그것에 한정되지는 않는다. 예를 들어 IL-2와 IL-12의 조합된 사용은 T-세포 림프종, 편평상피 세포 암종, 및 폐암에서 유익한 효과를 나타낸다 (Zaki et al., J. Invest . Dermatol . 118:366-71, 2002; Li et al., Arch . Otolaryngol . Head Neck Surg . 127: 1319- 24, 2001; Hiraki et al., Lung Cancer 35:329-33, 2002). 또한 zB7H6 활성을 가지는 조성물은 CD137의 활성화 (Wilcox et al., J. Clin . Invest . 109:651-9, 2002) 또는 CTLA4의 억제 (Chambers et al., Ann . Rev . Immunol . 19:565-94, 2001)와 같이, 면역-기초 이펙터 세포상에서 발견되는 다양한 세포 표면 분자를 공자극하는 시약들과 함께 조합될 수 있다. 또는 달리 zB7H6 활성을 가지는 조성물은 TRAIL-관련 수용체와의 상호작용에 의해 종양 세포 아폽토시스를 유도하는 시약들과 함께 사용될 수 있다 (Takeda et al., J. Exp . Med. 195:161-9, 2002; Srivastava, Neoplasia 3:535-46, 2001). 그런 시약으로는 TRAIL 리간드, TRAIL 리간드-Ig 융합물, 항-TRAIL 항체 등이 있다.
다른 변형예에서 zB7H6 활성을 가지는 조성물은 단클론성 항체 치료법과 조합하여 사용된다. 그런 조합 치료법은 특히 암치료에 유용한데, 그때 단클론성 항체의 사용은 비-호지킨성 림프종 (rituximab 또는 RITUXAN®), 백혈병의 형태들 (gemtuzumab 또는 MYLOTARG®), 유방 세포 암종 (trastuzumab 또는 HERCEPTIN®), 및 결장 암종 (cetuximab 또는 ERBITUX®)을 포함한 많은 종양에 대한 표준 실시가 된다. 항체가 항-암 효과를 중재하는 한 가지 메커니즘은 항체-의존성 세포-중재된 세포독성 (ADCC)으로 언급된 과정을 통하는 것인데, 이 과정에서 NK 세포, 대식세포, 및 호중구를 포함하여 면역-기초 세포는 항체 복합체에 의해 결합된 세포를 죽인다. 따라서 NKp30-중재된 NK 세포 활성을 야기하는 데 있어 그것이 가지는 면역조절성으로 인해, zB7H6은 항체 치료법의 효력을 증강시키기 위하여 사용될 수 있다. 이런 유형의 치료양식의 실례는 호지킨성 및 비-호지킨성 림프종의 치료를 위해 RITUXANTM (rituximab)과 IL-2, IL-12, 또는 IFN-α중 어느 하나의 조합 사용을 포함한다 (Keilholz et al., Leuk . Lymphoma 35:641-2, 1999; Ansell et al., Blood 99:67-74, 2002; Carson et al., Eur . J. Immunol . 31:3016-25, 2001; Sacchi et al., Haematologica 86:951-8., 2001).
약제학적 조성물은 본원에서 설명된 것과 같은 치료 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 용기를 포함하는 키트로서 공급될 수 있다. 치료 분자는 예를 들면 단일 또는 다중 용량을 위한 주사가능한 용액의 형태로, 또는 주사 전에 재구성될 멸균 분말로서 제공될 수 있다. 또는 달리 그런 키트는 건조-분말 분산기 액체 에어로솔 발생기, 또는 치료 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 투여를 위한 분무기를 포함할 수 있다. 그런 키트는 추가로 약제학적 조성물의 지시사항 및 용도에 관한 글로 쓰여진 정보를 포함할 수 있다. 예를 들어 그런 정보는 zB7H6 조성물이 zB7H6에 대한 공지된 민감성을 보이는 환자에게는 금기되는 진술을 포함할 것이다.
B. 암 치료
1. 암 유형
본원에서 설명된 것과 같이 zB7H6은 자극성 NK 세포 수용체, NKp30에 대한 활성화 리간드이다. 특정 변형예에서, NKp30에 대한 아고니스트 zB7H6 활성을 가지는 제제는 그 자체로서, NKp30-중재된 NK 세포 세포용해 활성의 유도를 통해 NK 세포에 의한 직접적인 종양 죽음을 증강시킴으로써 암치료에 대한 면역자극제로서 사용될 수 있다. 또한 본원에서 설명된 연구에 의해 나타나는 바와 같이, zB7H6 항체는 다양한 종양-유도 세포상에서 발현된다. 따라서 다른 변형예에서, zB7H6 항체는 Fc의 Fc 수용체 및 보체 단백질인 C1q에의 결합을 통해 ADCC 또는 CDC 경로를 활성화함으로써 zB7H6-발현 세포의 죽음을 지시하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 변형예에서 항-zB7H6 항체에 포합된 세포독성제를 포함하는 항-zB7H6 항체-약물 포합체는 zB7H6-발현 암세포에 세포독성제를 전달하기 위해 사용될 수 있고, 이때 세포독성제는 암세포의 성장을 격감시키거나 억제함으로써 치료효과를 나타낸다.
아래의 표 4는 표적 조직에 의해 우선적으로 조직화된, 본 발명에 따라 치료될 수 있는 암들을 열거한다.
Figure pct00003
상기에서 열거된 일부 암, 이를테면 종양 반응에 미치는 본 발명에 따르는 zB7H6-관련 제제의 효과를 평가하기 위한 관련된 동물 모델의 일부는 아래에서 보다 더 상세하게 논의된다.
a. 만성 골수성 백혈병
만성 골수성 백혈병 (CML)은 대부분 성인에게서 발생하는 희귀 암 유형이다. 그것은 과립구 (백혈구의 주요 유형 중 하나)의 암이다. CML에서 많은 과립가 생성되고, 그것들은 미성숙하고 적절하게 작용할 수 없을 때 혈액으로 방출된다. 미성숙한 백혈구는 블라스트(blast)로서 알려져 있다. 다른 유형의 혈구의 생성 또한 파괴된다. 정상적으로 백혈구는 규칙적이고 조절된 방식으로 자체적으로 수복되고 재생산되지만, 만성 골수성 백혈병에서는 그 과정이 통제되지 않고 세포는 계속해서 비정상적으로 분열되고 성숙해간다. 질병은 통상 매우 느리게 전개되는데, 그것이 바로 소위 "만성" 골수성 백혈병으로 불리는 이유이다.
CML이 느리게 발달 (진행)하기 때문에 그것의 초기 단계에서 검출하는 것은 어렵다. 때때로 단지 혈액 시험이 다른 이유로 행해질 때만 발견된다. CML의 증상은 자주 불투명하며 비특이적이고, 골수에서의 비정상적인 백혈구 수의 증가 및 정상 혈구 수의 감소에 의해 유발되며, 복부 왼쪽이 꽉 찬 느낌 또는 말랑말랑한 응어리가 느껴진다. 이것은 CML에서는 비장이 확대되기 때문이다. 비장은 복부 왼쪽에 있는 갈비 바로 아래에 놓여있는 기관이다. 그것은 혈액을 여과하며 사용한 적혈구를 제거한다. 비장의 팽창은 또한 위에 압력을 유발할 수 있고, 그것은 소화불량과 빈약한 식욕을 유발할 수 있으며, 어떤 사람들은 혈액 중 혈소판 수가 낮아서 적혈구의 부족 (빈혈)로 인해 피로를 느끼고 창백해 보이고, 어떤 사람들은 그들이 출혈하거나 쉽게 멍이 드는 것을 주지할 수 있다. 정상인보다 멍이 쉽게 드는 것 뿐만 아니라 특수한 유형의 멍도 찾아볼 수 있다. 이것은 다리나 입에서 흔히 볼 수 있는 작은 혈액-유사 반점으로 구성되며 점상출혈로 불린다. 여성들은 그들의 주기가 매우 더 무거워지는 것을 발견하기도 한다. 그러나 이들 증상 및 신호는 드물며, 일부 사람들은 일반화된 가려움을 알아챌 수 있다. 만성 골수성 백혈병은 모든 연령에서 일어날 수 있지만 보다 통상적으로는 중년이나 노년에 더 흔하다. 어린아이에는 드물게 나타난다 (cancerbacup internet website). 종양 반응에 미치는 제제 (예컨대 항-zB7H6 항체-약물 포합체)의 효과는 예를 들면, 면역결핍 마우스에 이식된 사람 CML 세포를 사용하여 사람 종양 이종이식 모델에서 평가될 수 있다 (Ren, Leukemia and Lymphoma 8:1549-1561, 2002; Van Etten, Blood Cells Mol . Dis. 27:201-205, 2001; Wong and Witte, Oncogene 20:5644-5659, 2001).
b. 다발성 골수종
다발성 골수종은 혈장 세포로 불리는 특정 백혈구에서 발생하는 암의 유형이다. 암이 혈장 세포를 포함할 때 신체는 더더욱 많은 이들 세포를 계속해서 생성한다. 불필요한 혈장 세포 (모두 비정상이고 모두 정확하게 유사한)는 골수종 세포로 불린다. 골수종 세포는 골수 및 뼈의 딱딱한 바깥 부분에 모이는 경향이 있다. 때로 골수종 세포는 한 뼈에만 모여서 단일 덩어리, 또는 형질세포종이라 불리는 종양을 형성한다. 그러나 대부분의 경우에 골수종 세포는 많은 뼈에 모이며, 때로 많은 종양을 형성하여 다른 문제를 유발한다. 이런 일이 일어날 때 그 질병은 다발성 골수종이라 불린다.
다발성 골수종에 걸린 사람들은 비정상적으로 많은 수의 동일한 혈장 세포를 가지기 때문에 그들은 또한 한 유형의 항체를 너무 많이 가지고 있다. 이들 골수종 세포 및 항체는 많은 심각한 의료 문제를 유발할 수 있다. (1) 골수종 세포 수가 증가하기 때문에 그들의 뼈는 손상을 입고 약해져서 통증을 유발하고 때로 골절이 발생한다. 뼈의 통증으로 환자는 움직이는 것이 어려울 수 있다. (2) 뼈가 손상될 때, 칼슘은 혈액 안으로 방출된다. 이것은 고칼슘혈증 (혈액에 너무 많은 칼슘이 있다)을 유발할 수 있다. 고칼슘혈증은 식욕의 상실, 메스꺼움, 갈증, 피로, 근육 약화, 안절부절, 및 정신착란까지도 유발할 수 있다. (3) 골수종 세포는 골수가 정상적인 혈장 세포 및 면역시스템에 중요한 다른 백혈구를 형성하는 것을 방해한다. 환자들은 감염 및 질병에 대항할 수 없다. (4) 암세포는 또한 새로운 적혈구의 성장을 방해하여 빈혈을 유발할 수 있다. 빈혈 환자들은 평소와 다른 피로와 무력감을 느낄 수 있다. 그리고 (5) 다발성 골수종 환자들은 신장과 관련된 심각한 문제를 가질 수 있다. 과잉의 항체 단백질 및 칼슘은 신장이 혈액을 적절하게 여과하고 정화하는 것을 방해할 수 있다. 다발성 골수종의 증상들은 질병이 얼마나 진행되었는가에 좌우된다. 질병의 초기 단계에는 증상이 없을 수 있다. 증상이 발생할 때 환자는 통상 뼈의 통증을 느끼는데 등이나 갈비뼈에 자주 통증을 느낀다. 환자는 또한 뼈의 부러짐, 약화, 피로, 체중 손실, 또는 반복된 감염을 경험한다. 질병이 진전될 때 증상들은 메스꺼움, 구토, 변비, 배뇨와 관련된 문제, 및 다리의 약화 또는 마비를 포함한다 (국제 암 연구소의 인터넷 웹사이트). 종양 반응에 미치는 제제 (예컨대 항-zB7H6 항체-약물 포합체)의 효과는 면역결핍 마우스에서 사람 종양 이종이식 모델에서 평가될 수 있다 (Miyakawa et al., Biochem . Biophys . Res . Commun. 313:258-62, 2004).
c. 비-호지킨성 림프종
비-호지킨성 림프종은 림프계의 암 유형이다. 림프종에는 두 가지 주요 유형이 있다. 하나는 호지킨 질병이라 불린다 (처음 이 질병을 발견한 호지킨 박사의 이름을 땄다). 다른 것은 비-호지킨성 림프종이다. 비-호지킨성 림프종에는 약 20개의 상이한 유형이 있다. 대부분의 호지킨 질병의 경우에 리이드-스턴버그 세포로 알려져 있는 특별한 세포는 생체 조직검사에서 발견된다. 이 세포는 다른 림프종에서는 통상적으로 발견되지 않으므로, 그것들은 비-호지킨성 림프종이라 불린다. 이것은 매우 큰 차이처럼 보이지 않지만, 호지킨 림프종과 비-호지킨 질병에 대한 치료가 매우 다를 수 있기 때문에 중요하다.
때로 비-호지킨성 림프종의 첫 번째 신호는 목, 겨드랑이, 서혜부의 림프절의 무통 팽창이다. 다른 증상은 다음 중 어느 하나를 포함할 수 있다: 야간 발한 또는 설명되지 않는 높은 체온 (열); 식욕의 상실, 설명되지 않는 체중 손실 및 과다한 피로; 어린아이는 기침이나 무호흡이 나타날 수 있다. 아이들은 또한 복부의 통증을 불평하거나, 당신 자녀의 복부에서 응어리를 느끼거나 전신의 피부에 지속적인 가려움을 알아채기도 할 것이다 (cancerbacup internet website). 종양 반응에 미치는 제제 (예컨대 항-zB7H6 항체-약물 포합체)의 효과는 문헌에서 설명된 것과 유사한 비-호지킨성 림프종 이종이식 모델에서 평가될 수 있다 (Ansell et al., Leukemia 18:616-23, 2004).
가장 흔하게 사용되는 비-호지킨성 림프종의 분류는 REAL 분류 시스템이다 (Ottensmeier, Chemico - Biological Interactions 135-136:653-664, 2001). 특이한 면역학적 마커는 림프종의 분류에 대해 확인된 바 있다. 예를 들어 여포성 림프종 마커로는 CD20+, CD3-, CD10+, CD5-가 있고; 작은 림프구 림프종 마커로는 CD20+, CD3-, CD10-, CD5+, CD23+가 있으며; 외곽 지대 B 세포 림프종 마커로는 CD20+, CD3-, CD10-, CD23-가 있고; 미만성 거대 B 세포 림프종 마커로는 CD20+, CD3-가 있으며; 맨틀 세포 림프종 마커로는 CD20+, CD3-, CD10-, CD5+, CD23+가 있고; 주변 T 세포 림프종 마커로는 CD20-, CD3+가 있으며; 일차성 종격동 거대 B 세포 림프종 마커로는 CD20+, CD3-가 있고; 림프아세포성 림프종 마커로는 CD20-, CD3+, Tdt+가 있으며, 버킷 림프종 마커로는 CD20+, CD3-, CD 10+, CD5-가 있다 (Decision Resourses, Non-Hodgkins Lymphoma, Waltham, MA., Feb. 2002).
International Working Formulation에 의한 비호지킨성 림프종 (NHL)의 임상적 분류는 다음과 같은 하위유형으로 질병을 나눈다: (1) 만성 림프구 백혈병과 일관된 작은 림프구를 포함하는 저등급 (진행이 느린) 질병 (SC); 대부분 작은 절단된 여포 세포 (FSC); 혼합된 작은 절단된 및 거대 여포 세포 (FM); (2) 대부분 거대 여포 세포를 포함하는 중간 등급의 질병 (FL); 미만성 작은 절단 세포 (DSC); 미만성 혼합 작은 및 거대 세포 (DM); 미만성 큰 절단 또는 비절단 세포 (DL); 및 (3) 면역아세포성 거대 세포를 포함하는 고등급 질병 (IBL); 림프아세포성 회선상 또는 비회선상 세포 (LL); 및 작은 비절단 세포, 버킷 또는 비-버킷 (SNC)(The Non-Hodgkin's Lymphoma Pathologic Classification Project, Cancer 49:2112-35, 1982). Ann Arbor Staging 시스템이 NHL 환자의 등급화를 위해 통상적으로 사용된다. 단계 I은 단일 림프절 영역의 포함이나 단일 림프계 외재성 기관 또는 부위의 국소 포함을 의미한다. 단계 II는 동일한 횡경막 쪽에 둘 또는 그 이상의 림프절 영역을 포함하거나 동일한 횡경막 쪽에 절외 부위 또는 기관 및 하나 또는 그 이상의 림프절 영역을 포함하는 것을 의미한다. 단계 III은 아마도 절외 기관 또는 부위의 국소 포함을 수반하는, 횡경막의 양 쪽에 림프절 영역을 포함하는 것을 의미한다. 단계 IV는 관련된 림프절 포함이 있거나 없는 하나 또는 그 이상의 동떨어진 절외 기관의 미만성 또는 전파성 포함을 의미한다 ("Lymphoid neoplasms," In American Joint Committee on Cancer .: AJCC Cancer Staging Manual 6th ed. New York, NY: Springer, 2002, pp. 393-406). Rituximab은 느린 및 여포성 림프종을 치료하는데 효과적인 것으로 나타났다 (Boye et al., Annals of Oncol . 14:520-535, 2003).
d. 자궁경부암
자궁경부는 질로 들어가는 자궁의 목이다. 자궁경부암은 또한 자궁경부 암종으로도 불리며 자궁경부 표면상에서 비정상 세포를 발달시킨다. 자궁경부암은 여성에게서 발생하는 가장 흔한 암 중 하나이다. 자궁경부암은 통상 자궁경부의 표면상에 있는 세포의 전암성 변화인 형성 이상이 전조로 나타난다. 이들 비정상적인 세포는 침윤성 암으로 진전될 수 있다. 일단 암이 나타나면, 그것은 네 단계를 통해 진전된다. 단계들은 암의 확산 정도에 의해 규정된다. 암이 더 많이 퍼질수록 치료 강도는 더 세지는 것 같다. 자궁경부암에는 2가지의 주요 유형이 있다: (1) 편평상피 형 (표피모양 암): 가장 흔한 유형으로 자궁경부암의 약 80% 내지 85%를 차지한다. 이 암은 성적으로 전염되는 질병에 의해 유발될 수 있다. 그런 성적 질병 중 하나는 사람 유도종바이러스로, 성병 사마귀를 유발한다. 암성 종양은 자궁경부로 성장해간다. 이 암은 일반적으로 자궁경부의 표면에서 시작하고 자궁경부 도말검사 (Pap smear)에 의해 초기 단계에서 진단될 수 있다. (2) 선암종: 이 유형의 자궁경부암은 자궁경부 통로의 자궁경부 선에 있는 조직으로부터 발생한다. 초기 자궁경부암은 통상 아무런 증상도 유발하지 못한다. 암은 보통 자궁경부 도말검사와 골반염에 의해 검출된다. 자궁경부암의 후기 단계는 예상외의 시간에, 예컨대 생리기간 중에, 성행위 후에, 또는 폐경 후에 비정상적인 질출혈 또는 피가 섞인 분비물을 유발한다. 비정상적인 질 분비물은 탁하거나 피가 섞일 수 있고 또는 악취가 나는 점액을 함유할 수도 있다. 암의 진전된 단계는 통증을 유발할 수 있다 (University of Michigan Health System Internet website). 종양 반응에 미치는 제제 (예컨대 항-zB7H6 항체-약물 포합체)의 효과는 문헌에서 설명된 것과 유사한 사람 종양 이종이식 모델에서 평가될 수 있다 (Downs et al., Gynecol . Oncol . 98:203-10, 2005; and Li et al., Int . J. Gynecol . Cancer 15:301-7, 2005).
e. 두경부암
대부분의 두경부암은 암종 (특히 편평 상피세포 암종)으로 불리는 유형의 것이다. 두경부 암종은 입, 코, 목 또는 귀의 라이닝, 또는 혀를 덮는 표면층을 형성하는 세포에서 시작된다. 그러나 두경부암은 세포의 다른 유형으로부터 발달한다. 림프종은 림프계 세포로부터 발달한다. 육종은 근육, 연골 또는 혈관을 구성하는 지지세포로부터 발달한다. 흑색종은 눈과 피부에 색을 주는 멜라닌 형성세포로 불리는 세포로부터 시작한다. 두경부암의 증상은 그것이 존재하는 곳에 따라 달라질 것이다. 예를 들면 설암은 약간의 말흐림을 유발할 수 있다. 가장 흔한 증상은 수주 내에 치료되지 않는 두경부의 궤양 또는 빨갛게 된 부분, 연하 (swallowing)의 어려움, 또는 씹거나 연하의 통증; 호흡 또는 말하기의 문제, 예컨대 지속적인 소리나는 호흡, 말꼬리를 흐리는 말 또는 성난 목소리; 입의 무감각; 지속적인 코막힘, 또는 코의 출혈; 지속적인 귓병, 이명, 또는 청각의 어려움; 입 또는 목의 부어오름 또는 응어리; 얼굴 또는 위턱의 통증이며, 흡연하거나 담배를 씹는 사람들에게서 전암성 변화는 입 가장자리에서, 또는 혀 위에서 일어날 수 있다. 이것들은 반복적인 백색 부분 (백반증) 또는 적색 부분 (홍반증)으로서 나타날 수 있다. 그것들은 통상 무통이지만 때로는 화끈거리거나 출혈이 있을 수 있다 (Cancerbacup Internet website). 종양 반응에 미치는 제제 (예컨대 항-zB7H6 항체-약물 포합체)의 효과는 문헌에서 설명된 것과 유사한 사람 두경부 종양 이종이식 모델에서 평가될 수 있다 (Kuriakose et al., Head Neck 22:57-63, 2000; Cao et al., Clin . Cancer Res . 5:1925-34, 1999; Braakhuis et al., Cancer Res . 51:211-4, 1991; and Baker, Laryngoscope 95:43-56, 1985.
f. 뇌암
뇌조직에서 시작하는 종양은 뇌의 일차 종양으로서 알려져 있다. 일차 뇌 종양은 그것들이 시작하는 뇌 부분 또는 세포 유형에 따라 명명된다. 가장 흔한 일차 뇌 종양은 신경교종이다. 그것들은 신경교세포에서 시작된다. 신경교종에는 많은 유형이 있다. (1) 성상세포종 - 이 종양은 성상세포로 불리는 별모양 신경교세포로부터 발생한다. 성인에게서 성상세포종은 대뇌에서 가장 자주 발생한다. 어린이에게서는 뇌줄기, 대뇌, 및 소뇌에서 발생한다. 제 III 등급 성상세포종은 때로 미분화성상세포종으로 불린다. 제 IV 등급 성상세포종은 보통 다형성 교아세포종으로 불린다. (2) 뇌줄기 신경교종 - 이 종양은 뇌의 하부에서 발생한다. 뇌줄기 신경교종은 유아 및 중년기 성인에게서 가장 흔히 진단된다. (3) 상의세포종 - 이 종양은 척수의 공동 또는 중심 도관을 따라 늘어서있는 세포로부터 발생한다. 이것은 어린이 및 청소년에게서 가장 흔하게 발견된다. (4) 희소돌기아교세포종 - 이 종양은 신경을 덮어서 보호하는 지방 물질을 만드는 세포로부터 발생한다. 이들 종양은 보통 대뇌에서 발생한다. 그것은 느리게 성장하고 보통은 주변의 뇌조직으로 확산되지 않는다. 뇌 종양의 증상은 종양 크기, 유형, 및 위치에 좌우된다. 증상은 종양이 신경을 압박하거나 뇌의 특정 부분을 손상시킬 때 유발될 수 있다. 또한 증상은 뇌가 팽창하거나 두개골 내에서 유체가 많아질 때 유발될 수 있다. 이것들은 뇌 종양의 가장 흔한 증상이다: 두통 (통상적으로 아침에 더 아프다); 메스꺼움 또는 구토; 언어, 시력, 또는 듣기의 변화; 균형잡기 또는 걷기의 문제; 기분, 성격, 또는 집중 능력의 변화; 기억의 문제; 근육 저킹 (jerking) 또는 연축 (발작 또는 경련); 및 팔 또는 다리의 쑤심과 떨림 (National Cancer Institute's Internet website). 종양 반응에 대한 제제 (예컨대 항-zB7H6 항체-약물 포합체)의 효과는 문헌에 설명된 것과 유사한 사람 신경교종 이종이식 모델에서 평가될 수 있다 (Bello et al., Clin . Cancer Res . 8:3539-48, 2002).
g. 갑상선 암
유두 및 여포성 갑상선암은 모든 갑상선 암의 80 내지 90%를 차지한다. 두 가지 유형 모두 갑상선의 여포 세포에서 시작된다. 대부분의 유두 및 여포성 갑상선암은 느리게 성장하는 경향이 있다. 만약 그것이 초기에 검출된다면, 대부분 성공적으로 치료될 수 있다. 수질의 갑상선암은 그것이 다른 신체부위로 확산되기 전에 발견되고 치료된다면 조절하기가 더 쉽다. 역형성 갑상선암은 가장 덜 흔한 유형의 갑상선암이다 (사례의 단지 1 내지 2%). 그것은 여포 세포에서 발생한다. 암세포는 매우 비정상적이며 인지하기 어렵다. 이 유형의 암은 통상 조절하기가 매우 어려운데, 왜냐하면 암세포가 매우 빠르게 성장하고 확산하는 경향이 있기 때문이다. 초기 갑상선암은 자주 증상을 나타내지는 않는다. 그러나 암이 성장함에 따라 증상은 다음과 같은 것들을 포함할 수 있다: 목젖 가까운 목의 앞쪽에 응어리 또는 혹; 쉰 목소리 또는 정상적인 목소리로 말하기 어려움; 부은 림프절, 특히 목의 부은 림프절; 연하 또는 호흡의 어려움; 또는 목구멍 또는 목의 통증 ((National Cancer Institute's Internet website). 종양 반응에 대한 제제 (예컨대 항-zB7H6 항체-약물 포합체)의 효과는 문헌에 설명된 것과 유사한 사람 종양 이종이식 모델에서 평가될 수 있다 (Quidville et al., Endocrinology 145:2561-71, 2004).
h. 간암
원발성 간암에는 두 가지의 상이한 유형이 있다. 가장 흔한 종류는 간종양 또는 간세포 암종 (HCC)으로 불리고, 간의 주요 세포 (간세포)로부터 발생한다. 이 유형은 통상적으로 간에 국한되지만, 때로는 다른 기관에도 확산된다. 그것은 대부분 간경변으로 불리는 간 질병에 걸린 사람에게서 일어난다. 또한 섬유층판 간종양으로 불리는 보다 희귀한 간종양의 하위유형이 있는데, 그것은 보다 어린 사람들에게서 발생할 수 있고, 이전의 간질병과는 관련이 없다. 다른 유형의 원발성 간암은 담관암종 또는 담관암으로 불리는데, 왜냐하면 그것은 담관을 따라 줄서있는 세포에서 시작된다. 간종양을 발달시키는 대부분의 사람은 또한 통상적으로 간경변으로 불리는 질환을 갖고 있다. 이것은 간 전체에 걸쳐 있는 미세한 흉터이며, 그것은 감염 및 긴 시간 기간 동안 심한 알코올 음주를 포함한 다양한 원인으로 인한 것이다. 그러나 단지 간경변에 걸린 사람의 적은 비율만이 원발성 간암으로 발달된다. B형 간염 또는 C형 간염 바이러스로의 감염은 간암을 유도할 수 있고, 또한 간경변의 원인일 수 있으며, 그것은 간종양으로 발달할 위험이 증가된다. 신체에 철의 과다 침착을 유발하는 혈색소증으로 불리는 희귀 질환을 가지는 사람은 간종양을 발달시키는 기회가 더 많다. 본 발명의 zB7H6-관련 제제 (예컨대 가용성 zB7H6 폴리펩티드 또는 항-zB7H6 항체-약쿨 포합체)는 간세포 암종과 관련된 질환 또는 증상 중 최소한 하나를 치료, 방지, 진전의 억제, 개시의 지연, 및/또는 심각성의 감소 또는 억제하기 위해 사용될 수 있다. 간세포 암종은 간염 (예컨대 A형 간염, B형 간염, C형 간염 및 D형 간염) 감염과 관련될 수도 있거나 관련되지 않을 수도 있다. 종양 반응에 대한 제제 (예컨대 항-zB7H6 항체-약물 포합체)의 효과는 문헌에 설명된 것과 유사한 사람 종양 이종이식 모델에서 평가될 수 있다 (Zhou et al., Clin. Cancer Res . 9:6030-7, 2003; and Huynh et al., J. Cell Mol . Med . 2008 (E-Published as a "Postprint," 10.1111/j.1582-4934.2008.00364.x, 2008, at Blackwell Synergy website).
i. 폐암
종양 반응에 대한 제제 (예컨대 항-zB7H6 항체-약물 포합체)의 효과는 사람 작은/비-작은 세포 폐 암종 이종이식 모델에서 평가될 수 있다. 간단히 설명하면, 사람 종양은 면역결핍 마우스에 이식되고, 그 마우스는 제제, 예컨대 항-zB7H6 항체-약물 포합체 단독으로 또는 다른 제제와의 조합으로 치료된다. 치료의 효능은 종양 성장을 평가함으로써 증명될 수 있다 (Nemati et al., Clin Cancer Res . 6:2075-86, 2000; and Hu et al., Clin . Cancer Res . 10:7662-70, 2004).
2. 고체 종양에 대한 종점 및 항-종양 활성
각각의 프로토콜은 종양 반응 평가를 어렵게 규정할 수 있지만, 예시적인 지침은 Clinical Research Associates Manual (Southwest Oncology Group, CRAB, Seattle, WA, October 6, 1998, updated August 1999) ("CRA Manual")에서 찾아볼 수 있다. CRA 매뉴얼 (제 7장 "반응 평가" 참조)에 따르면 종양 반응은 모든 측정가능한 병변 또는 전이의 감소 또는 제거를 의미한다. 질병은 일반적으로 그것이 의학적인 사진 또는 X-선, 컴퓨터 처리된 축 단층촬영 (CT), 자기 공명 영상 (MRI), 또는 촉진에 의해 명확하게 규정된 가장자리를 가지는 이중-차원으로 측정가능한 병변을 포함한다면 측정될 수 있는 것으로 간주된다. 평가가능한 질병은 단일-차원적으로 측정가능한 병변, 명료하게 규정되지 않은 가장자리를 가지는 덩어리, 두 직경이 0.5cm보다 작은 병변, 어느 한 직경이 절단면 사이의 거리보다 작은 스캔상의 병변, 직경이 2cm보다 작은 감지할 수 있는 병변, 또는 뼈 질병을 의미한다. 평가할 수 없는 질병은 흉막 삼출, 복수, 및 간접 증거에 의해 입증된 질병을 포함한다. 이전에 방사선 조사되었지만 진행되지는 않은 병변들이 또한 일반적으로 평가될 수 없는 것으로 간주된다.
객관적 상황에 대한 기준은 고체 종양 반응을 평가하기 위한 프로토콜에 대해 요구된다. 대표적인 기준은 다음의 것들을 포함한다: (1) 모든 측정가능하고 평가가능한 질병의 완전한 소멸로서 규정되고, 새로운 병변이 없으며, 질병 관련된 증상이 없고, 평가할 수 없는 질병의 증거가 없는 완전한 반응 (CR); (2) 모든 측정가능한 병변의 수직 직영의 산물의 합에서 기준값에서 50% 이상 감소하거나 그것과 동일한 것으로 규정되고, 평가할 수 없는 질병이 진전되지 않으며, 새로운 병변이 없고, 최소한 하나의 측정가능한 병변을 가진 환자에게 적용되는 부분 반응 (PR); (3) 기준과 공일한 기법을 사용하여 관찰된 가장 작은 합보다 측정가능한 병변의 산물의 합에서 50% 또는 10cm2 증가한 것으로 규정되거나, 또는 어떠한 평가할 수 있는 질병이 명백하게 나빠지거나, 또는 소멸되었던 어떠한 병변이 다시 나타나거나, 또는 어떠한 새로운 병변이 나타나거나, 또는 죽음이나 질환의 악화 (이 암과 관련되지 않는 한)로 인하여 평가를 위한 복귀에 실패한 것으로 규정된 진행; (4) CR, PR, 또는 진행으로 한정되지 않는 것으로 규정되는 안정한 또는 무반응. (Clinical Research Associates Manual, 상기 동일)
종양학 기술분야 내에 수용된 추가 종점은 전체 생존 (OS), 질병-유리 생존 (DFS), 객관적인 반응 속도 (ORR), 진행되는 시간 (TTP), 및 진행-유리 생존 (PFS)을 포함한디 (Guidance for Industry : Clinical Trial Endpoints for the Approval of Cancer Drugs and Biologies, April 2005, Center for Drug Evaluation and Research, FDA, Rockville, MD).
3. 조합 암치료법
앞에서 논의된 것과 같이, 특정 구체예에서, zB7H6 폴리펩티드, 항체, 또는 다른 zB7H6-관련 제제는 질병 또는 장애의 치료를 위한 두 번째 제제와 조합하여 사용된다. 암 치료를 위해 사용될 때, zB7H6 폴리펩티드, 항체, 또는 본 발명의 다른 제제, 이를테면 예컨대 항-zB7H6 항체-약물 포합체는 예컨대 수술, 방사선 요법, 화학요법, 또는 그것들의 조합과 같은 종래의 암 치료법과 조합하여 사용될 수 있다. 특정 측면으로, 본 발명에 따라 zB7H6-관련 제제와 조합하여 암치료에 유용하게 사용되는 다른 치료제는 항-신생혈관생성제를 포함한다. 어떤 다른 측면으로, 조합 치료에 유용한 다른 치료제는 종양 성장에 포함된 특정 인자의 길항체, 예컨대 EGFR, ErbB2 (Her2), ErbB3, ErbB4, 또는 TNF이다. 어떤 측면으로 본 발명에 따르는 제제는 사이토킨 (예컨대 종양에 대한 면역 반응을 자극하는 사이토킨)과 함께 투여된다. 암치료에 특히 적합한 예시적인 조합 치료는 아래에서 한층 더 상세하게 설명하기로 한다.
a. 종양-관련 항원을 표적화하는 항체
앞에서 주지된 바와 같이, 항체치료법은 특히 암치료에 성공적인데, 왜냐하면 어떤 종양들은 독특한 항원, 계통-특이적 항원, 또는 정상세포와 비교하여 과량으로 존재하는 항원을 나타내기 때문이다. 단클론성 항체 치료법의 항-종양 활성과 관련된 한 가지 메커니즘은 항체 의존성 세포의 세포독성 (ADCC)이다. ADCC에서 표적세포 (예컨대 암세포) 및 단클론성 항체에 대한 수용체를 발현하는 특이한 이펙터 세포 (예컨대 NK 세포, 단핵세포, 과립구)에 결합하는 단클론성 항체는 단클론성 항체/표적 세포 복합체에 결합하여 표적 세포 사망을 초래한다. 따라서 본 발명의 특정 변형예에서 암에 대한 효력을 가지는 zB7H6 폴리펩티드, 항체, 또는 다른 zB7H6-관련 제제는 종양-관련 항원에 대한 단클론성 항체와 함께 투여된다. 항-ZB7H6 항체가 ADCC 또는 CDC를 통해 항-종양 활성을 유도하기 위해, 또는 달리 항-zB7H6 항체-약물 포합체의 맥락에서 활용되는 그런 변형예에서, 조합하여 사용된 단클론성 항체는 두 번째 종양-특이적 또는 종양-관련된 항원에 대한 항체일 것이다. MAb의 용량 및 일정은 함께 투여되는 특이한 항체에 속하는 약리역학 및 독물동력학 특성을 토대로 하며 이들 효과를 최적화하는 한편, zB7H6 폴리펩티드, 항체, 또는 다른 zB7H6-관련 제제의 투여와 관련될 수 있는 어떠한 독성이든지 최소화할 수 있어야 한다.
본원에서 설명된 것과 같은 zB7H6-관련 제제 및 종양-관련 항원에 대한 단클론성 항체와의 조합 치료는 제 1선 치료가 실패하고 제 2선 치료로서 고려될 수 있을 때 필요할 수 있다. 본 발명은 또한 새롭게 진단되고 이전에 항암제로 치료받지 못하였던 환자 집단 ("새로운 환자") 및 이전에 어떠한 단클론성 항체 치료를 받지 않은 환자 ("순진한 환자")에서 제 1선 치료로서 조합을 사용하는 것을 제공한다.
본원에서 설명된 것과 같은 zB7H6-관련 제제는 또한 종양 세포의 어떠한 직접적인 항체-중재된 ADCC 또는 CDC의 부재시에 종양-관련된 항원에 대한 단클론성 항체와의 조합 치료법에 유용하다. 예를 들어 면역시스템에서 억제 신호를 차단하는 항체는 증대된 면역반응을 유도할 수 있다. 항체의 예를 들면 (1) 억제 기능을 가지는 B7R 패밀리 분자, 예컨대 세포독성 T 림프구-관련 항원 4 (CTLA-4), 계획적인 사망-1 (PD-1), B 및 T 림프구 감쇄기 (BTLA)에 대한 항체; (2) IL-10, TGFβ와 같은 억제 사이토킨에 대한 항체; 및 (3) 항-CD25 또는 CTLA-4와 같은 억제 세포의 기능을 격감시키거나 억제하는 항체가 있다. 예를 들어 마우스와 사람 둘 다에서의 항-CTLA-4 MAb는, 면역-억제 조절성 T 세포 (Treg)의 기능을 억제하거나 또는 T 세포상의 CTLA-4의 APC 또는 종양 세포상의 B7-1 또는 B7-2 분자에의 결합을 통해 전달되는 억제 신호를 억제하는 것으로 여겨진다.
아래의 표 6은 본 발명에 따르는 조합 치료법이 가능한 조합치료법에 대해 승인된 또는 시험된 단클론성 항체의 비-배타적인 목록이다.
Figure pct00004
b. 티로신 키나제 억제제
어떤 구체예에서, 본원에서 설명된 것과 같은 zB7H6 폴리펩티드, 항체, 또는 다른 zB7H6-관련 제제는 티로신 키나제 억제제와 조합하여 사용된다. 티로신 키나제는 아데노신 트리포스페이트로부터 표적 단백질에 γ 포스페이트 기의 전달을 촉매하는 효소이다. 티로신 키나제는 수용체 및 비수용체 단백질 티로신 키나제로서 분류될 수 있다. 그것들은 다양한 정상 세포 과정, 이를테면 성장 수용체를 통한 활성화에서 중요한 역할을 하며 다양한 세포 유형의 증식, 생존 및 성장에 영향을 미친다. 추가로, 그것들은 종양 세포 증식을 촉진하고, 항-아폽토시스 효과를 유도하며, 신생혈관형성 및 전이를 촉진하는 것으로 여겨진다. 성장 인자를 통한 활성화 외에 체세포 돌연변이를 통한 단백질 키나제 활성화는 통상적인 종양 형성 메커니즘이다. 확인된 돌연변이의 일부는 B-Raf 키나제, FLt3 키나제, BCR-ABL 키나제, c-KIT 키나제, 표피 성장 인자 (EGFR) 및 PDGFR 경로에 있다. Her2, VEGFR 및 c-Met는 암 진행 및 종양 형성에 연루된 것으로 시사된 다른 중요한 수용체 티로신 키나제 (RTK) 경로이다. 다수의 세포 과정이 티로신 키나제에 의해 개시되기 때문에, 그것들은 억제제에 대한 핵심 표적으로서 확인되었다.
티로신 키나제 억제제 (TKI)는 세포 내부에서 작용하는 작은 분자로, 수용체 및 비-수용체 티로신 키나제 둘 다의 촉매적 티로신 키나제 도메인에 결합하기 위해 아데노신 트리포스페이트 (ATP)와 경합한다. 이런 경합 결합은 성장, 생존, 및 신생혈관 형성과 같은 이들 신호화 사건과 관련된 이펙터 기능을 유도하는 하류 신호화의 개시를 차단한다. 구조 및 컴퓨터를 사용한 접근법을 사용하여, 수많은 의학적 화학 조합 라이브러리로부터 티로신 키나제를 억제하는 많은 화합물이 확인되었다.
대부분의 TKI는 종양세포의 직접적인 억제를 통해 또는 신생혈관 형성의 억제를 통해 종양의 성장을 억제하는 것으로 여겨진다. 더욱이 특정 TKI는 VEGR 패밀리 수용체, 이를테면 소라페니브 (sorafenib) 및 수니티니브 (sunitinib)를 통한 신호화에 영향을 미친다. 어떤 경우에 TKI는 수지상 세포 및 다른 선천적인 면역 세포, 예컨대 NK 세포의 기능을 활성화하는 것으로 밝혀졌다. 이것은 최근에 imatinib에 대한 동물 모델에서 보고되었다. Imatinib는 수지상 세포 및 NK 세포에 의한 킬러 활성을 증강시키는 것으로 밝혀졌다 (Smyth et al., NEJM 354:2282, 2006).
BAY 43-9006 (sorafenib, Nexavar®) 및 SU11248 (sunitinib, Sutent®)은 전이성 신장세포 암종 (RCC)에서 사용하기 위해 최근에 승인된 두 가지의 그런 TKI이다. 다른 많은 TKI는 암의 다양한 유형의 치료를 위해 후기 및 초기 단계 개발상태이다. 다른 TKI로는 그것들에 한정되지는 않지만, 다음의 것들을 포함한다: 글루벡 (Imatinib 메실레이트 (Gleevec®, Novartis); Gefitinib (Iressa®, AstraZeneca); Erlotinib 염산염 (Tarceva®, Genentech); Vandetanib (Zactima®, AstraZeneca), Tipifarnib (Zarnestra®, Janssen-Cilag); Dasatinib (Sprycel®, Bristol Myers Squibb); Lonafarnib (Sarasar®, Schering Plough); Vatalanib 숙시네이트 (Novartis, Schering AG); Lapatinib (Tykerb®, Glaxo SmithKline); Nilotinib (Novartis); Lestaurtinib (Cephalon); Pazopanib 염산염 (Glaxo SmithKline); Axitinib (Pfizer); Canertinib 2염산염 (Pfizer); Pelitinib (National Cancer Institute, Wyeth); Tandutinib (Millennium); Bosutinib (Wyeth); Semaxanib (Sugen, Taiho); AZD-2171 (AstraZeneca); VX-680 (Merck, Vertex); EXEL-0999 (Exelixis); ARRY-142886 (Array BioPharma, AstraZeneca); PD-0325901 (Pfizer); AMG-706 (Amgen); BIBF-1120 (Boehringer Ingelheim); SU-6668 (Taiho); CP-547632 (OSI); (AEE-788 (Novartis); BMS-582664 (Bristol-Myers Squibb); JNK-401 (Celgene); R-788 (Rigel); AZD-1152 HQPA (AstraZeneca); NM-3 (Genzyme Oncology); CP-868596 (Pfizer); BMS-599626 (Bristol-Myers Squibb); PTC-299 (PTC Therapeutics); ABT-869 (Abbott); EXEL-2880 (Exelixis); AG-024322 (Pfizer); XL-820 (Exelixis); OSI-930 (OSI); XL-184 (Exelixis); KRN-951 (Kirin Brewery); CP-724714 (OSI); E-7080 (Eisai); HKI-272 (Wyeth); CHIR-258 (Chiron); ZK-304709 (Schering AG); EXEL-7647 (Exelixis); BAY-57-9352 (Bayer); BIBW-2992 (Boehringer Ingelheim); AV-412 (AVEO); YN-968D1 (Advenchen Laboratories); 미도스타우린 (Novartis); 페리포신 (AEterna Zentaris, Keryx, National Cancer Institute); AG-024322 (Pfizer); AZD-1152 (AstraZeneca); ON-01910Na (Onconova); 및 AZD-0530 (AstraZeneca).
c. 화학요법 조합
특정 구체예에서, zB7H6 폴리펩티드, 항체 또는 다른 zB7H6-관련 제제는 하나 또는 그 이상의 화학요법제와 조합하여 투여된다. 화학요법제는 예를 들면 DNA 또는 RNA에 영향을 미치고 세포 주기 복제를 간섭함으로써 상이한 작용 방식을 가진다. DNA 수준에서 또는 RNA 수준에 대해 작용하는 화학요법제의 실례는 항-대사물, 예컨대 아지티오프린, 시타라빈, 플루다라빈 포스페이트, 플루다라빈, 제미시타빈, 시타라빈, 클라드리빈, 카페시타빈 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 히록시우레아; 알킬화제, 예컨대 멜팔란, 부술판, 시스-플라틴, 카르보플라틴, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 다카라바진, 프로카르바진, 클로람부실, 티오테파, 로무스틴, 테모졸라미드; 항-유사분열 촉진제, 예컨대 비노렐빈, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 도세탁셀, 파클리탁셀; 토포이소메라제 억제제, 예컨대 독소루비신, 암사크린, 이리노테칸, 다우노루비신, 에피루비신, 미토마이신, 미토트렉세이트, 이다루비신, 테니포시드, 에토포시드, 토포테칸; 항생물질, 예컨대 악티노마이신 및 블레오마이신; 아스파라기나제; 안트라사이클린 또는 탁산이다.
d. 방사선 요법 조합
어떤 변형예에서, zB7H6 폴리펩티드, 항체, 또는 다른 zB7H6-관련 제제는 방사선요법과 조합하여 투여된다. 어떤 종양은 방사선 또는 방사성 약제로 치료될 수 있다. 방사선 요법은 일반적으로 절제할 수 없는 또는 수술할 수 없는 종양 및/또는 종양 전이를 치료하기 위해 사용된다. 방사선 요법은 전형적으로 세 가지 방법으로 전달된다. 외부 빔 조사는 신체로부터 거리를 두고 투여되며, 감마선 (60Co) 및 X-선을 포함한다. 근접치료는 공급원, 예를 들면 표적 조직과 또는 표적 조직과 접촉하는 60Co, 137Cs, 192Ir, 또는 125I를 사용한다.
e. 호르몬제 조합
어떤 구체예에서 zB7H6 폴리펩티드, 항체, 또는 다른 zB7H6-관련 제제는 호르몬 또는 항-호르몬과 조합하여 투여된다. 어떤 암은 호르몬 의존성과 관련되고, 예를 들면 난소암, 유방암, 및 전립선암을 포함한다. 호르몬-의존성 암 치료는 항-안드로겐 또는 항-에스트로겐 화합물의 사용을 포함할 수 있다. 암치료에 사용되는 호르몬 및 항-호르몬으로는 에스트라무스틴 포스페이트, 폴리에스트라디올 포스페이트, 에스트라디올, 아나스트로졸, 엑세메스탄, 레트로졸, 타목시펜, 메게스트롤 아세테이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 옥트레오티드, 시프로테론 아세테이트, 비칼투미드, 플루타미드, 트리토렐린, 류프로렐린, 부세렐린 및 고세렐린이 있다.
VII. 선별 방법
다른 측면으로, 본 발명은 zB7H6의 NKp30과의 상호작용의 아고니스트 또는 길항체를 선별하는 방법을 제공한다. 일반적으로 길항체를 선별하기 위한 그런 방법은 다음 단계들을 포함한다: (a) 제제를 NKp30 폴리펩티드의 존재하에 zB7H6 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; (b) zB7H6 폴리펩티드와 NKp30 폴리펩티드의 상호작용의 정도를 검출하는 단계; 그리고 (c) 단계 (b)에서 측정된 zB7H6/NKp30 상호작용의 수준이 제제의 부재시에 zB7H6과 NKp30 폴리펩티드를 조절하기 위해 측정된 상호작용의 수준과 비교하여 상당히 더 적은지를 측정함으로써, zB7H6/NKp30 상호작용의 수준이 만약 더 적다면, 제제는 zB7H6과 NKp30의 상호작용의 길항체로서 확인되는 단계.
아고니스트의 선별 방법은 일반적으로 다음 단계들을 포함한다: (a) 제제를 NKp30 폴리펩티드의 존재하에 zB7H6 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; (b) zB7H6 폴리펩티드와 NKp30 폴리펩티드의 상호작용의 정도를 검출하는 단계; 그리고 (c) 단계 (b)에서 측정된 zB7H6/NKp30 상호작용의 수준이 제제의 부재시에 zB7H6과 NKp30 폴리펩티드를 조절하기 위해 측정된 상호작용의 수준과 비교하여 상당히 더 큰지를 측정함으로써, zB7H6/NKp30 상호작용의 수준이 만약 더 크다면, 제제는 zB7H6과 NKp30의 상호작용의 아고니스트로서 확인되는 단계.
NKp30과의 zB7H6 상호작용의 정도는 예를 들면 NKp30에 대한 zB7H6 결합의 검출뿐만 아니라 zB7H6 폴리펩티드의 NKp30-중재된 세포 활성 (예컨대 세포용해 활성)을 야기하는 능력의 검출, 또는 NKp30 폴리펩티드의 zB7H6-중재된 세포 활성을 야기하는 능력의 검출을 포함할 수 있다. zB7H6/NKp30 상호작용의 아고니스트를 확인하기 위해, 특히 상호작용의 정도가 NKp30- 또는 zB7H6-중재된 세포 활성의 수준인지를 확인하기 위해, 방법은 추가로 제제가 zB7H6 폴리펩티드 또는 NKp30 폴리펩티드의 부재시에 세포 활성을 유도할 수 있는지를 측정하기 위해 추가의 대조표준을 포함할 수 있고, 그로써 만약 제제가 zB7H6 폴리펩티드 또는 NKp30 폴리펩티드의 부재시에 세포 활성을 유도할 수 있다면, 제제는 zB7H6의 NKp30과의 상호작용의 아고니스트가 아니다.
선별 방법에 사용하기 위한 zB7H6 폴리펩티드는 일반적으로 zB7H6 세포외재성 도메인, 또는 그것의 기능성 변이체 또는 단편을 포함할 것이다. 따라서 선별에 사용하기 위한 zB7H6 폴리펩티드는 다음의 것으로부터 선택된 폴리펩티드 영역을 포함할 것이다:
(i) SEQ ID NO:2의 zB7H6 폴리펩티드의 세포외재성 도메인 (즉 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266);
(ii) SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266과 최소한 80%의 동일성을 가지는 (i)의 zB7H6 세포외재성 도메인의 기능성 변이체; 및
(iii) (i)의 zB7H6 세포외재성 도메인 또는 (ii)의 도메인 변이체의 기능성 단편.
전형적인 변형예에서, zB7H6 폴리펩티드는 zB7H6 SEQ ID NO:2 (즉 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266), 또는 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266과 최소한 90% 또는 95%의 서열 동일성을 가지는 기능성 변이체의 세포외재성 도메인을 포함한다. zB7H6 폴리펩티드는 본원에 개시된 것과 같이 가용성 zB7H6 수용체이다. 또 다른 변형예에서 zB7H6 폴리펩티드는 세포상에서 발현된 zB7H6의 막결합 형태이다 (예컨대 재조합 세포상에서 발현된, GPI 연쇄를 가지는 zB7H6 폴리펩티드, 또는 기능성 경막 도메인을 가지는 zB7H6 폴리펩티드, 예컨대 SEQ ID NO:2의 zB7H6 폴리펩티드).
유사하게, 선별 방법에 사용하기 위한 NKp30 폴리펩티드는 NKp30의 세포외재성 도메인, 또는 그것의 기능성 변이체 또는 단편을 포함할 것이다. 전형적으로 NKp30 폴리펩티드는 사람 NKp30 폴리펩티드이거나 또는 사람 NKp30으로부터 유도된 폴리펩티드이다. NKp30 폴리펩티드는 가용성 NKp30 수용체이거나 NKp30의 막결합 형태이다. 특정 변형예에서 NKp30은 세포상에서 발현되는 전체 길이의 NKp30 단백질 (예컨대 전체 길이의 사람 NKp30)이고, 그런 구체예는 특히 무엇보다도 zB7H6의 NKp30과의 상호작용을 검출하기 위한 기능성 판독척도로서 NKp30-중재된 세포용해 활성의 사용을 잘 받아들일 수 있다.
재조합 세포상에서 발현된 zB7H6 또는 NKp30 폴리펩티드를 활용하는 어떤 변형예에서, zB7H6 또는 NKp30 수용체를 코드화하는 cDNA 또는 유전자는 그것의 발현에 필요한 다른 유전자 요소 (예컨대 전사 프로모터)와 조합되고, 그 결과의 발현 벡터는 숙주 세포 안에 삽입된다. DNA를 발현하고 기능성 수용체를 생성하는 세포가 선택되고 다양한 선별 시스템 내에서 사용된다. 단량체, 단일이량체, 이종이량체 및 다량체 수용체 복합체의 각 성분은 동일 세포에서 발현될 수 있다. 더욱이 단량체, 단일이량체, 이종이량체 및 다량체 수용체 복합체의 성분들은 또한 복합체 조립 및 형질전환체의 선별을 가능하게 하기 위해 경막 도메인 또는 다른 막 융합 부분에 융합될 수 있다. 어떤 구체예에서, zB7H6 폴리펩티드와 NKp30 폴리펩티드는 각각 별도의 숙주 세포에서 발현된다. 또는 달리 zB7H6과 NKp30 폴리펩티드 중 하나만이 세포에서 발현된다.
동물 모델 시스템에서, 세포는 후보 제제를 동물에 투여함으로서 후부 제제와 접촉될 수 있다. 후보 제제는 경구로, 정맥내로, 주입 또는 주사에 의해, 또는 다른 방식으로 투여될 수 있다.
선별에 사용하기 위한 제제는 생체분자, 특히 단백질과, 비-공유 상호작용을 통해, 예컨대 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 인력, 또는 소수성 상호작용을 통해 구조적으로 상호작용할 수 있는 가능성을 가지는 모든 제제를 포함할 수 있다. 따라서 많은 유형의 제제가 본 발명의 방법에 의해 선별될 수 있다. 적당한 후보 제제로는 예를 들면 작은 분자, 핵산, 펩티드, 펩티드 모방물, 합성 화합물, 및/또는 천연 화합물이 있다.
선별을 위한 제제는 펩티드 및/또는 핵산의 무작위 및/또는 비-무작위 라이브러리를 포함할 수 있다. 숙주 세포에서 재조합 zB7H6 또는 NKp30의 발현을 포함하는 변형예에서, 핵산 제제는 발현 시스템의 세포를 핵산과 접촉시킴으로써 선별될 수 있다. 구체적인 실례에서 게놈성 또는 cDNA 라이브러리는 zB7H6의 NKp30과의 상호작용을 감소 또는 증강시키는 유전자 제제를 확인하기 위해 zB7H6 또는 NKp30을 발현하는 재조합 세포의 집단으로 도입되고 그곳에서 발현될 수 있다.
다른 구체예에서 선별될 제제는 펩티드 모방물이다. 용어 "펩티드 모방물"은 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드와 실질적으로 동일한 구조적 및 기능적 특성을 가지는 합성 화학적 화합물을 말한다. 펩티드 유사체는 주형 펩티드의 특성과 유사한 특성을 가지는 비-펩티드 약물로서 약제학적 산업에서 통상적으로 사용된다. 이들 유형의 비-펩티드 화합물은 "펩티드 모방물"로 언급된다 (Fauchere, J. Adv . Drug Res . 15:29, 1986; Veber and Freidinger TINS p.392, 1985; and Evans et al., J. Med . Chem . 30:1229, 1987). 치료적으로 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모방물은 동등한 또는 증강된 치료적 또는 예방적 효과를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로 펩티드 모방물은 전형적인 폴리펩티드 (예컨대 원하는 생물학적 또는 약리학적 활성을 가지는 폴리펩티드)에 구조적으로 유사하지만, 예컨대 -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis 및 trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- - 및--CH2SO--로 이루어지는 군으로부터 선택된 연쇄에 의해 임의로 대체되는 하나 또는 그 이상의 펩티드 연쇄를 가진다. 모방물은 전체적으로 아미노산의 합성, 비-천연 유사체로 구성될 수 있거나, 부분적으로 천연 펩티드 아미노산과 부분적으로 아미노산의 비-천연 유사체의 키메릭 분자이다. 모방물은 또한 천연 아미노산 보존성 치환을, 그런 치환이 실질적으로 모방물의 구조 및/또는 활성을 변경시키지 않는 한 통합시킬 수 있다.
선별제는 또한 합성 및/또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 유래될 수 있다. 한 실례는 사람에 의해 사용될 수 있는 FDA-승인될 화합물의 라이브러리이다. 또한 합성 화합물 라이브러리는 많은 회사, 이를테면 Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex (Princeton, N.J.), Brandon Associates (Merrimack, N.H.), 및 Microsource (New Milford, Conn.)로부터 상업적으로 이용할 수 있고, 희귀한 화학적 라이브러리는 Aldrich (Milwaukee, Wis.)로부터 상업적으로 이용할 수 있다.
조합 라이브러리는 이용가능하거나 및/또는 제조될 수 있다. 또는 달리 박테리아, 진균, 식물, 및 동물 추출물 형태의 천연 화합물의 라이브러리가 또한 예를 들면 Pan Laboratories (Bothell, Wash.) 또는 MycoSearch (N.C.)로부터 활용가능하고, 또는 제조될 수 있다. 천연 공급원, 예컨대 동물, 박테리아, 진균, 식물 공급원, 이를테면 잎이나 나무껍질, 및 해얄 샘플로부터 분리된 화합물이 또한 후보 제제로서 선별될 수 있다.
다른 적당한 제제로는 안티센스 분자, 리보자임, 및 항체 (단일 사슬 항체 및 Fv 단편을 포함함)가 있다. 예를 들어 번역 또는 전사 출발 부위, 또는 스플라이스 연결부위에 결합하는 안티센스 분자가 후보 제제일 수 있다. 추가로 천연 및 합성-제조된 라이브러리 및 화합물이 종래의 화학적, 물리적, 및 생화학적 수단을 통해 쉽게 변형된다.
그런 라이브러리, 이를테면 조합 생성된 라이브러리 (예컨대 펩티드 라이브러리)의 선별은 다수의 관련된 및/또는 비관련 화합물을 선별하기 위해 신속하고 효과적인 방법으로 수행될 수 있다. 조합 접근법은 또한 그 자체로서, 활성적이지만 그렇지 못한 경우 바람직하지 못한 화합물에 대해 모델화된 두 번째, 세 번째, 및 네 번째 세대 화합물의 생성에 의해 강력한 치료제의 신속한 진화를 제공한다.
조합 화학 라이브러리의 제조 및 선별은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 그런 조합 화학 라이브러리로는 펩티드 라이브러리가 있고, 그것에 한정되지 않는다 (미국 특허 제 5,010,175호; Furka, Int . J. Pept . Prot . Res . 37:487-93, 1991; Houghton et al., Nature 354:84-88, 1991). 화학적 다양성을 가지는 라이브러리를 생성하기 위한 다른 화학이 또한 사용될 수 있다. 그런 화학으로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만 펩토이드 (PCT 공개 번호 WO 91/19735), 코드화된 펩티드 (PCT 공개 번호 WO 93/20242), 무작위 생체-올리고머 (PCT 공개 번호 WO 92/00091), 벤조디아제핀 (미국 특허 제 5,288,514호; Baum, C&EN, Jan 18, 1993, p.33), 다이버소머 (diversomers), 예컨대 히단토인, 벤조디아제핀 및 디펩티드 (Hobbs et al., Proc. Nat . Acad . Sci . USA 90:6909-13, 1993), 비닐위치 폴리펩티드 (Hagihara et al., J. Amer . Chem . Soc . 114:6568, 1992), 글루코오스 스캐폴딩을 가지는 비펩티드성 펩티드 모방물 (Hirschmann et al., J. Amer . Chem . Soc . 114:9217-18, 1992), 작은 화합물 라이브러리의 유사한 유기 합성물 (Chen et al., J. Amer . Chem. Soc . 116:2661, 1994), 올리고카바메이트 (Cho et al., Science 261:1303, 1993),펩티딜 포스포네이트 (Campbell et al., J. Org . Chem . 59:658, 1994), 핵산 라이브러리 (Ausubel et al., 상기 동일; Sambrook, 상기 동일), 펩티드 핵산 라이브러리 (미국 특허 제 5,539,083호), 항체 라이브러리 (Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14:309-14, 1996 및 PCT/US96/10287), 탄수화물 라이브러리 (Liang et al., Science 274: 1520-22, 1996; 미국 특허 제 5,593,853호), 작은 유기 분자 라이브러리, 예컨대 이소프레노이드 (미국 특허 제5,569,588호), 티아졸리디논 및 메타티아자논 (미국 특허 제 5,549,974호), 피롤리딘 (미국 특허 제 525,735호 및 5,519,134호), 모르폴리노 화합물 (미국 특허 제 5,506,337호) 등.
조합 라이브러리를 제조하기 위한 장치는 상업적으로 활용가능하다 (357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville Ky.; Symphony, Rainin, Woburn, Mass.; 433A Applied Biosystems, Foster City, Calif; 9050 Plus, Millipore, Bedford, Mass.). 또한 수많은 조합 라이브러리 자체가 상업적으로 활용가능하다 (ComGenex, Princeton, NJ.; Tripos, Inc., St. Louis, Mo.; 3D Pharmaceuticals, Exton, Pa.; Martek Biosciences, Columbia, Md.; etc.).
전술한 선별 방법 중 어느 하나에 의해 초기에 확인된 제제는 분명한 활성을 입증하기 위해 추가로 시험 될 수 있다. 예를 들어 후속적인 입증은 적당한 동물 모델 또는 생체 외 사람 세포를 사용하여 수행될 수 있다. 동물 모델 시스템을 사용하는 생체 내 입증을 위해서는 그런 방법의 기본적인 포맷은 NK 세포-관련 질병 또는 장애에 대한 모델로서 작용하는 동물에 대해 초기 선별되는 동안 확인된 제제를 투여한 후, NK 세포 활성이 조절되었는지를 측정하거나 또는 질병 또는 장애의 다른 임상적 증상들이 완화되었는지를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 입증 연구에 활용되는 동물 모델은 일반적으로 모든 종류의 포유류이다. 적당한 동물의 구체적인 실례는 그것들에 한정되는 것은 아니지만 영장류, 마우스, 및 쥐를 포함한다.
본 발명을 다음의 비-제한적인 실례에 의해 추가로 예시한다.
도 1a 및 1b는 가용성 NKp30 융합 단백질을 사용하는 K562 표적에 대한 NK-92 세포용해 활성의 억제를 도시한다. 특히 가용성 NKp30/VASP A1683F는 K562 세포에 대하여 NK-92 세포의 세포용해 활성을 억제하였다 (도 1a). 9:1의 이펙터:표적 비율로 NK-92 이펙터와 K562 표적을 함유하는 웰에 첨가된 상이한 농도의 가용성 NKp30/VASP (0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 및 16.0㎍/ml)를 사용하는 별도의 세포용해 분석 실험에서, 가용성 NKp30은 용량 의존성 방식으로 NK-92 세포에 의한 용해를 억제하였다 (도 1b).
도 2는 K562 세포에 대한 가용성 NKp30 융합 단백질의 결합을 도시한다. K562 세포를 NKp30/mFc2 융합 단백질의 존재하에 인큐베이션한 후 PE 항-mIgG로 이차 표지하고, FACS에 의해 PE 염색에 대해 분석하였다. NKp30/mFc2는 K562 세포에 결합하였다 ("경합 없음"). 이 결합은 이차 가용성 NKp30 융합 단백질, NKp30/VASP와 경합할 수 있지만, 대조 VASP 단백질 ("hzB7R1/Vasp" 및 "B7-DC/Vasp")과는 경합하지 않았다.
도 3은 가용성 NKp30 융합 단백질의 K562 세포에 대한 결합을 도시하지만, BaF3 세포에 대해서는 결합하지 않는 것을 도시한다. K562 세포 및 BaF3 세포는 비오틴에 포합된 NKp30/mFc2로 프로브하였고, 이어서 PE-포합된 스트렙트아비딘으로 이차 표지하였다.
도 4 및 도 5A 및 5B는 K562 세포 및 비오티닐화된 NKp30/mFc2의 교차결합을 도시한다. 4개의 샘플, 즉 관심의 샘플과 3개의 네거티브 대조 샘플을 분석하였다. 관심의 샘플을 비오티닐화된 NKp30/mFc2와 함께 인큐베이션하였다. 3개의 네거티브 대조 샘플은 NKp30 및 BaF3 세포 없이, 그리고 NKp30이 있거나 없는 K562 세포였다. 각 샘플을 화학적 교차결합제와 반응시켜서 어떠한 단백질-단백질 상호작용을 공유 결합시키고, 비오티닐화된 성분들을 분리한 후 스트렙트아비딘 아가로오스 침전에 의해 수집하였다. 샘플을 나누어서 동일한 4 내지 12% Nu-Page 겔 상에서 작동시켰다. 하나의 겔을 스트렙트아비딘-HRP로 프로브된 웨스턴 블롯에 대해 사용하였다 (도 4 및 5B). 이차 겔을 쿠마찌로 염색하였다 (도 5A). 도 5A 및 5B는 쿠마찌-염색 겔 및 상응하는 웨스턴 블롯을 나란히 비교하여 도시한다.
도 6은 단백질 DKFZP686I21167 (이하 zB7H6으로 표시함)의 아미노산 서열을 도시하고, LC-MS/MS로 확인된 펩티드는 진하게 밑줄이 그어져 있다.
도 7은 단백질 DKFZP686I21167 (이하 zB7H6으로 표시함)의 유전자 구조 프로필을 도시한다. 유전자 구조 프로필은 신호-2-IgV-2-IgC-2-TMD-0-LgEx이고, 여기서 정수 "2" 및 "0"은 각각 리더 서열 ("S"), IgV 도메인, IgC 도메인, 경막 도메인 ("TMD"), 및 Gag 폴리단백질에 대한 상동성을 가지고 있는 세포내 도메인을 코드하는 엑손 1 내지 5 사이의 페이싱 (phasing)을 나타낸다. "SxYxxL," "YxxQ," 및 "PxxPxxP"는 zB7H6의 세포내 도메인 내에 있는 강력한 신호화 모티프 (각각 ITIM 모티프, SH2 결합 모티프, 및 SH3 결합 모티프)를 나타낸다.
도 8은 전체 길이의 zB7H6을 발현하는 BaF3 세포에 대한 가용성 NKp30의 결합을 도시한다. 가용성 NKp30/VASP-A647은 사람 zB7H6 발현 벡터로 일렉트로포레이션된 세포에 결합하였고 (도 8a 및 8b-진한 색의 채워지지 않은 선), 빈 벡터 대조표준을 함유한 대조 세포에는 결합하지 않았다 (도 8a 및 8b-채워진 선). NKp30/VASP-A647을 사용한 염색은 100배 과잉량의 미표지된 NKp30/VASP의 존재시에는 관찰되지 않았지만 (도 8a-점선), 100배 과잉량의 미표지된 무관한 VASP 단백질의 존재시에는 관찰되었다 (도 8b-점선).
도 9는 P815 세포의 NK-92 용해를 도시한다. NK-92 세포를 3배 희석으로 27:1 내지 1:1 의 이펙터:표적 비율로 P815 세포와 함께 배양하였다. NK-92 세포는 야생형 P815 세포 또는 2개의 비-야기 대조 단백질 (hIgSF1 및 hB7H1)로 트랜스펙션된 P815 세포를 용해하지 않은 반면, 활성화 항-NKp30 단클론성 항체를 첨가함으로써 재-지시된 용해가 야기되었다. hCD86 또는 zB7H6 중 어느 하나의 트랜스펙션은 P815 세포의 직접적인 죽음을 야기하였다.
도 10은 가용성 NKp30 및 항-zB7H6 항체를 사용하여 zB7H6 발현 세포에 대한 NK-92 세포용해 활성을 억제하는 것을 도시한다. NK-92 세포를 9:1의 이펙터:표적 비율에서 zB7H6을 발현하는 K562 세포 또는 P815 세포와 함께 배양하였다. NKp30의 가용성 형태 (NKp30/VASP), 대조 VASP 단백질 (B7H3/VASP), 항-zB7H6 다클론성 항체, 및 무관한 대조 항체를 일부 웰에 첨가하였다. 가용성 NKp30/VASP 및 항-zB7H6 다클론성 항체가 K562 및 P815 zB7H6 표적에 대한 NK-92 세포의 세포용해 활성을 억제하였고, 반면 VASP와 항체 대조표준은 아무 영향도 미치지 않았다.
도 11a 내지 11c는 가용성 NKp30의 K562, P815 zB7H6 및 293F 세포에 대한 특이적 결합을 도시한다. K562, P815 zB7H6 및 293F 세포를 100배 과잉량의 NKp30/VASP, zB7H6/VASP, 또는 대조 VASP 단백질 (B7H3/VASP)의 부재 또는 존재하에 비오티닐화된 NKp30/mFc2로 FACS에 의해 프로브하였다. 비오티닐화된 NKp30/mFc2와의 인큐베이션 후에 세포를 세척하고 스트렙트아비딘-PE로 염색하였다. 그런 다음 세포를 세척하고 FACSCalibur 상에서 PE 염색에 대해 분석하였다. NKp30/mFc2-비오틴은 K562 (11a), 293F (11b), 및 P815 zB7H6 (11c) 세포에 대해 결합하였다 ("경합 없음"). 이 결합은 NKp30/VASP 및 zB7H6/VASP와 경합할 수 있지만, 대조 VASP 단백질 ("B7H3/VASP")과는 경합하지 않았다.
도 12a 내지 12d는 K562, P815 zB7H6 및 293F 세포에 대한 항-B7H6 항체의 특이한 결합을 도시한다. K562, P815 zB7H6 및 293F 세포를 항-zB7H6 마우스 다클론성 항체 (E10607)의 A647 포합된 형태로 프로브하였다. 세포를 전체 사람 IgG와 함께 인큐베이션하여 Fc 수용체를 차단하였고, A647-포합된 항-zB7H6 ("항-zB7H6-A647") 항체를 100배 과잉량의 VASP 단백질 (zB7H6/VASP 또는 대조 VASP 단백질, B7H3/VASP)의 부재 또는 존재하에 세포에 첨가하였다. 항체와 함께 인큐베이션한 후에 세포를 세척하고 FACSCalibur 상에서 APC 염색에 대해 분석하였다. 항-zB7H6은 K562 (12b), P815 zB7H6 (12c), 및 293F (12d) 세포에 결합하였지만, 트랜스펙션되지 않은 P815 세포에는 결합하지 않았다 (12a)("경합 없음"). 이 결합은 zB7H6/VASP와 경합할 수 있지만 대조 VASP 단백질과는 경합하지 않았다.
도 13a 내지 13c는 특정 면역글로불린 Fc 폴리펩티드의 아미노산 서열을 예시한다. 아미노산 번호는 EU 색인을 토대로 한다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, Bethesda, 1991). 예시된 서열은 야생형 사람 서열 ("wt"; SEQ ID NO:29)과 5개의 변이체 서열, 즉 Fc-488 (SEQ ID NO:30), Fc4 (SEQ ID NO:31), Fc5 (SEQ ID NO:32), Fc6 (SEQ ID NO:33), 및 Fc7 (SEQ ID NO:34)로 표시된 서열을 포함한다. 경쇄 불변 영역 (LC) 및 중쇄 불변 영역 (HC)에 대한 이황화물 결합에 정상적으로 포함된 Cys 잔기가 표시된다. "."는 그 위치에서 야생형에 대한 동일성을 나타낸다. ***는 중지 코돈을 나타내고; C-말단 Lys 잔기는 Fc6로부터 제거되었다. 힌지, CH2, 및 CH3 도메인이 도시된다.
실시예 1: 가용성 NKp30 / VASP 를 사용한 K562 표적에 대한 NK -92 세포용해 활성의 억제
세포용해 분석을 K562 표적에 대한 이펙터로서 NK-92세포를 사용하여 수행하였다.
NK-92 세포 1X의 HBSSF (행크 완충 식염수 (Ca, Mg 유리)+5% FBS)로 세척하고, 1.35×106/ml의 밀도로 (27:1의 비율을 이룸) HBSSF에 재현탁하였다. 150㎕의 세척된 세포를 U-자형 바닥 96-웰 플레이트의 상부 줄에 놓고 HBSSF로 연속적으로 희석하였다 (1:3).
K562 세포를 1X의 HBSSF로 세척하고 10μM의 칼세인 AM 분자 프로브 #C1430 (DMSO 중에서 4mM 스톡의 2.5㎕/ml, 4mM=4mg/ml)중에서 60분 동안 37℃에서 1×106 세포/ml로 표지하였다. 표지된 세포를 2X HBSSF로 세척하고 1×106 세포를 20ml의 HBSSF에 재현탁하였다 (5000 세포/100㎕). 현탁된 표적 세포 100㎕를 희석된 이펙터에 총 부피가 200㎕가 되도록 첨가하였다. 동일한 멸균 희석된 웰 세트에 가용성 형태의 NKp30 (NKp30/VASP A1683F)을 또한 첨가하였다.
이펙터 및 표적 세포를 500rpm에서 2분 동안 회전시키고, 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션한 후 1500rpm에서 5분 동안 회전한 다음, 100㎕의 상층액을 평평한 바닥의 새로운 96-웰에 옮겼다. 전달된 상층액을 함유하는 평평한 바닥의 플레이트를 형광계 상에서 1초 동안 485nm의 여기 파장 및 535nm의 발광 파장에서 판독하였다.
도 1에 도시된 것과 같이 가용성 NKp30/VASP A1683F는 K562에 대하여 NK-92 세포의 세포용해 활성을 억제하였다 (도 1a 참조). 다른 VASP 대조표준은 영향을 미치지 않았는데, 이것은 K562를 용해하는 NK-92의 능력이 NKp30에 의존적임을 시사한다.
별도의 세포용해 분석 실험에서 가용성 NKp20/VASP를 NK-92 이펙터 및 K562 표적 (이펙터:표적 비율은 9:1이다)을 상이한 농도로 (0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 및 16.0㎍/ml) 함유하고 있는 웰에 첨가하였다. 이 실험의 결과는 가용성 NKp30이 NK-92 세포에 의한 용해를 용량 의존성 방식으로 억제하는 것을 증명한다 (도 1b 참조). 이들 결과는 K562 세포 상의 NKp30에 대한 리간드의 존재를 시사하고 추가의 연구조사를 고무하는 것이다.
실시예 2: 가용성 NKp30 은 K562 세포에 특이적으로 결합한다
K562 세포를 가용성 형태의 NKp30 (NKp30/mFc2 (SEQ ID NO:8), NKp30의 세포외재성 도메인과 쥐의 Fc 단편을 함유한다)을 사용하여 FACS에 의해 제조하였다. K562 세포를 PBS/2% FBS에 1.6×106 세포/ml (16,000세포/샘플)의 농도로 재현탁하였다. 100㎕의 샘플을 일정액으로 나누고, 1㎕의 전 사람 IgG (Jackson #009-000-003)를 각각의 분취액에 첨가하였다. NKp30/mFc2 프로브를 2㎍/ml의 농도로 10㎍/ml의 헤파린 및 100배 과잉량의 VASP 단백질 (NKp30/VASP 또는 대조 VASP 단백질, 사람 zB7R1/VASP (SEQ ID NO:12) 또는 B7-DC/VASP (SEQ ID NO:13))과 함께 첨가하였다. 세포를 1시간 동안 얼음 위에서 인큐베이션하고 2ml의 저온 PBS로 세척하였다. 세척된 세포를 100㎕의 PBS/2% FBS에 1㎕의 PE 항-mIgG (Jackson 115-115-071)와 함께 재현탁하고 30분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 2ml의 저온 PBS로 2회 세척하고, 500㎕의 PBS에 재현탁한 후, FACSCalibur 상에서 PE 염색에 대해 분석하였다.
도 2에 도시된 것과 같이, NKp30/mDc2는 K562 세포에 결합하였다 ("경합 없음"). 이 결합은 NKp30/VASP와 경합하였지만, 대조 VASP 단백질 ("hzB7R1/Vasp" 및 "B7-DC/Vasp")과는 경합하지 않았는데, 이것은 K562 세포에 대한 NKp30/mFc2의 결합이 특이적이었음을 증명한다.
별도의 FACS 실험으로, K562 세포와 BaF3 세포를 비오틴에 포합된 NKp30/mFc2 (NKp30/mFc2-비오틴, 4㎍/ml)로 프로브하였다. 이들 연구를 위해 PE-포합된 스트렙트아비딘 (BD Pharmingen 554061)을 이차 시약으로서 사용하였다. 이 실험의 결과는 NKp30/mFc2는 K562 세포에 결합하지만, BaF3 세포에는 결합하지 않음을 나타낸다 (도 3 참조).
실시예 3: K562 세포와 비오티닐화된 NKp30 / mFc2 의 교차결합
K562 세포상의 NKp30 리간드를 확인하기 위한 노력으로 K562 세포를 비오티닐화된 NKp30/mFc2와 교차결합시킨 후 면역침전 및 질량 분광학 분석을 하였다.
4개의 샘플, 즉 관심의 샘플과 3개의 네거티브 대조 샘플을 분석하였다. 관심의 샘플은 비오티닐화된 NKp30/mFc2와 함께 인큐베이션한 K562 세포였다. 3개의 네거티브 대조 샘플은 NKp30이 없는 샘플, 및 NKp30이 있거나 없을 때 BaF3을 포함하는 K562 세포였다. 100×106 세포를 PBS로 1회 세척하고 2ml의 결합 완충액 (RPMI, 3mg/ml의 BSA, 20mM HEPES)으로 재현탁한 후, 2㎍/ml의 NKp30/mFc2-비오틴의 존재 또는 부재시에 2시간 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고 (결합 완충액 중에서 한 번, PBS에서 한 번), 1ml의 교차결합 시약 (3mm의 BS3[Pierce 21580])으로 재현탁한 다음, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. M런 다음 7.5㎕의 2M 트리스 (pH 7.4)를 최종 트리스 농도 15mM로 첨가하고, 세포를 15분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세포를 PBS에서 2회 세척한 후, 1ml의 RIPA/1% TX-100/0.1%의 SDS에서 5분 동안 얼음 위에서 용해하였다 (RIPA 완충액: 20mM 트리스 pH 7.4, 150mM NaCl, 2mM EGTA, 1mM NaVO4, 1mM β-글리세로포스페이트, 1 정제/25ml 완전 미니 프로테아제 억제제 칵테일 정제 (Roche 10946900)). 용해물 상층액을 50㎕의 스트렙트아비딘 아가로오스 (Pierce 20347)와 함께 2시간 동안 4℃에서 흔들어주면서 인큐베이션하였다. 스트렙트아비딘 아가로오스를 PBS로 3회 세척하였다. 결합된 단백질을 7.5㎕의 Nupage 샘플 완충액 (Invitrogen NP0007), 19.5㎕의 H2O, 및 3㎕의 환원제 (Invitrogen NP0004)에 재현탁함으로써 용출한 후 10분 동안 끓였다. 그런 다음 샘플을 반으로 나누어 각각의 반을 두 개의 동일한 4 내지 12%의 Nupage 겔 (약 40×106 세포/레인) 중 하나에 놓았다. 교차결합되지 않은 NKp30/mFc2-비오틴 (100ng, 33ng, 및 3.6ng)을 또한 이들 겔 위에 대조표준으로 놓았다. 두 개의 겔 중 하나를 탠덤 분광계 분석에 사용하였고, 다른 하나는 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다.
웨스턴 블롯 분석을 위해서 단백질을 웨스턴 전달 완충액 (0.025M 트리스/0.186M 글리신/20% (v/v) 메탄올)중의 니트로셀룰로오스 막 (Invitrogen LC2000)에 600mAmp 일정 전류에서 45분 동안 옮겼다. 그런 다음 니트로셀룰로오스 막을 차단 완충액 웨스턴 A (0.097% Tris 염기 (w/w)/0.661% Tris HCl (w/w)/0.186% EDTA (w/w)/0.05% Igepal (v/w)/0.877% NaCl (w/w)/0.25% 젤라틴 1 (w/w))로 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 차단된 막을 스트렙트아비딘-HRP (1:8000, Pierce 21126)로 1시간 동안 실온에서 프로브한 후 PBS로 3회 세척하였다. 세척된 막을 10ml의 ECL A+B 완충액 (Amersham RPN2209)중에서 1분 동안 실온에서 인큐베이션하고, Saran® 랩으로 싼 후 x-선 필름에 노출시켰다. 5초 동안의 노출로 도 4의 결과를 얻었다. 도 4에서 알 수 있는 것과 같이, 고분자량 신호는 단지 NKp30/mFc2-비오틴으로 프로브된 K562 세포에 대해서만 검출된다. 이 고분자량 밴드에 상응하는 단백질을 상응하는 NuPage 겔로부터 탠덤 질량 분광 분석을 위해 절출하였다.
실시예 4: NKp30 상호작용 단백질의 LC - MS / MS 단백체학 분석에 의한 zB7H6 의 확인
도입
K562 세포를 비오티닐화된 NKp30/mFc2와 함께 인큐베이션하고 어떠한 상호작용이든지 그 상호작용의 화학적 교차결합제와의 공유 결합에 의해 보존하였다 (상기 실시예 3 참조). 차등 질량 분광 분석은 펩티드 서열을 사용하여 탠덤 질량 스펙트럼에 매치시키기 위한 자동 검색 알고리즘을 사용함으로써 독특한 단백질을 확인할 수 있다. 이 분석에서 검색 알고리즘 X!Tandem을 사용하여 NKp30/mFc2의 K562 세포와의 상호작용에 독특한 단백질을 확인하였다.
재료 및 방법
4개의 샘플, 즉 관심의 샘플과 3개의 네거티브 대조 샘플을 분석하였다. 관심의 샘플은 비오티닐화된 NKp30/mFc2와 함께 인큐베이션한 K562 세포였다. 3개의 네거티브 대조 샘플은 NKp30이 없는 샘플, 및 NKp30이 있거나 없을 때 BaF3을 포함하는 K562 세포였다. 각 샘플을 어떠한 단백질-단백질 상호작용을 공유 연결시키기 위하여 화학적 교차결합제와 반응시켰고, 비오티닐화된 성분을 분리하고 스트렙트아비딘 아가로오스를 사용하여 침전시킴으로써 수집하였다.
비오티닐화된 성분을 함유하는 스트렙트아비딘 정제된 분획을 SDS-PAGE 전기영동에 의해 분리하였다. 웨스턴 블롯을 준비하고 스트렙트아비딘-HRP로 프로브하였다 (상기 실시 예 3 참조). 두 번째 겔을 쿠마찌로 염색하였다. 도 5A 및 5B는 쿠마찌-염색된 겔 및 병치된 상응하는 웨스턴 블롯을 도시한다.
16개의 겔 밴드를 잘라냈다. 이들 밴드는 도 5A에 설명된 것과 같이 영역 11 내지 14, 21 내지 24, 31 내지 34, 및 41 내지 44에 상응한다. 이들 겔 밴드의 단백질을 TCEP (25㎕, 25mM, 80℃, 15분)로 환원시켰고, 그 결과의 유리 시스테인을 IAM (25㎕, 100mM, 25℃, 2시간)으로 캡핑한 후, 샘플을 트립신 (Promega V5111, lot 18889904, 10㎕, 20㎍/mL, 37℃, 18시간)으로 소화시켰다. 그 결과의 펩티드를 겔 조각으로부터 추출하고, 건조시킨 후 20μL의 0.1% FA에 재구성하였다. 그 결과의 펩티드 혼합물 5㎕를 대략 10cm의 50um 융합 실리카를 채운 Magic C18AQ 3㎛, 200A 수지상에서 분리시켰다. 용출하는 펩티드를 LTQ Ion Trap 질량 분광계상에서 분석하였다. 질량 분광계상에서의 분석은 10회 주사의 주기로 구성하였다. 첫 번째 주사에서 400 내지 2000m/z의 전체 MS주사를 얻었다. 계속되는 주사로 MS/MS에 의해 가장 강력한 이온 9개를 분석하였다. 역동적인 축출은 분석된 이온이 그것의 초기 MS/MS 분석 후에 15초 내지 30초 사이에 MS/MS 분석에 대해 표적화되는 것을 방지하였다.
수정되지 않은 데이터 파일을 Bioworks를 사용하여 시험 파일로 전환하였다. 그 결과의 시험 파일을 자동 검색 알고리즘, X!Tandem을 사용하여 사람 ipi 데이터베이스에 대해 검색하였다.
결과 및 논의
앞에서 주지된 바와 같이 웨스턴 블롯 및 쿠마찌-염색 겔은 도 5A 및 5B에 도시된다. 웨스턴 블롯에서, 독특한 밴드는 비오티닐화된 NKp30/mFc2의 분자량 (~ 50kDa)보다 큰 분자량에서 달리는 관심의 샘플을 함유하는 레인에서 나타난다 (도 5B 참조). 이것은 이들 밴드가 K562 세포의 표면에서 결합 파트너에 교차결합된 비오티닐화된 NKp30이다. 상응하는 쿠마찌-염색 겔 (도 5A 참조)에서, 밴드 11은 K562 세포 표면에서 결합 파트너에 포합된 NKp30으로서 웨스턴 블롯에서 확인된 단백질을 함유한다. 상응하는 네거티브 대조 밴드 (21, 31 및 41)에서 확인되지 않은 겔의 이 부분으로부터 확인된 단백질의 목록은 아래의 표 7에서 찾아볼 수 있다. 게놈 데이터베이스의 분석으로 이들 단백질 중 하나를 가상 단백질 DKFZp686O24166으로서 확인하였다. 가상 단백질 DKFZP686I21167의 아미노산 서열에서 LC-MS/MS에 의해 확인된 세 펩티드의 위치는 도 6에서 찾아볼 수 있다. 모든 스펙트럼은 또한 X!Tandem에 의해 만들어진 펩티드/단백질 표시를 확인하기 위해 수동으로 검사하였다.
겔 밴드 11에서 확인된 독특한 단백질
단백질 이름 LC-MS/MS에 의해 확인된 독특한 펩티드
천연 세포독성 야기하는 수용체 3 3
가상 단백질 DKFZP686I21167 3
플렉틴 6 6
양이온-독립성 만노오스-6-포스페이트 수용체 선구체 13
NKp30/Fc2 8
결론
NKp30/mFc2 및 가상 단백질 DKFZP686I21167은 NKp30/mFc2가 K562 세포와 상호작용하도록 허용된 샘플에서만 확인되었다. 이들 데이터는 가상 단백질 DKFZP686I21167이 NKp30에 대한 결합 파트너라는 것을 지지한다.
실시예 5: zB7H6 서열 및 유전자 구조의 분석 및 B7 패밀리 구성원으로서 zB7H6의 확인
B7 패밀리 유전자 자료수집을 토대로 가상 단백질 DKFZP686I21167을 세포 수용체의 B7 패밀리의 구성원으로서 확인하였다. 유전자 구조 프로필은 신호-2-IgV-2-IgC-2-TMD-0-LgEx이다 (도 7). 이 프로필의 세포외재성 영역은 B7 유전자 구조 모델과 매치되며, 첫 번째 엑손이 리더 서열을 코드화하고, 두 번째 엑손이 IgV 도메인을 코드화하며, 세 번째 엑손이 IgC 도메일을 코드화하는 특징적인 엑손 패턴을 포함한다. B7 패밀리 유전자 구조의 다른 특징적인 특징은 엑손의 페이싱(phasing)이다: 세포외재성 도메인에 상응하는 영역에서 B7 패밀리 구성원은 엑손 1과 4 사이의 2의 보존된 페이싱을 나타낸다 (상기 참조). 부분적으로는 B7 패밀리 구성원으로서의 DKFZP686I21167의 확인을 토대로 이 단백질은 내부적으로 zB7H6으로 표시되는 것으로 승인받았다. zB7H6의 세포질 영역은 Gag 폴리단백질과 상동성이며, 그때의 동일성은 44%이고, 신호화 모티프, 예를 들면 SaYtpL (ITIM), YqIQ (SH2), 및 PdaPilPvsP (SH3)를 함유한다 (도 7). 그러므로 pNKp30을 야기하는 것 외에 다른 기능도 가질 수 있다.
공개된 EST 데이터베이스의 검색은 zB7H6에 상응하는 최소한 20개의 사람 EST를 확인하였지만, 마우스 EST나 mRNA는 확인하지 못하였다. 단지 다른 모든 종 (예컨대 마우스, 쥐, 개, 소)에 대해서는 서열을 예측하였다. 사람과 유인원을 제외한 다른 종으로부터의 예상된 펩티드 사이의 세포내 영역은 유사하지 않다.
실시예 6: 사람 zB7H6 발현 구성물
DKFZp686O24166 (zB7H6으로 표시됨)에 상응하는 zDNA 클론 CT#102296을 German Cancer Research Center (Heidelberg, Germany)로부터 구입하였다.
전체 길이의 사람 zB7H6 (SEQ ID NO:2)을 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 플라스미드를 PCR, 제한 소화 및 결찰을 통하여 구성하였다. 사람 zB7H6 cDNA의 단편을 사람 zB7H6 삽입 지점 양 옆의 벡터 서열에 상응하는 5' 및 3' 단부에는 프라이머 zc58067 (SEQ ID NO:9) 및 zc58401 (SEQ ID NO:10)을 사용하여 플랭킹 영역이 있는 CT#102296을 주형으로서 사용하는 PCR에 의해 분리하였다.
PCR 반응 혼합물을 1%의 아가로오스 겔 상에서 작동시키고 관심의 크기에 상 응하는 밴드를 QIAquickTM Gel 추출 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 겔에서 추출한다. 그 결과의 정제된 PCR 생성물을 EcoRI과 XhoI으로 2시간 동안 37℃에서 소화시키고, 상기에서 설명된 것과 같이 밴드 정제를 위해 1%의 아가로오스 겔 상에서 작동시켰다. 플라스미드 pZP-7NX를 EcoRI 및 XhoI으로 2시간 동안 37℃에서 소화시키고, 상기에서 설명된 것과 같이 밴드 정제를 위해 1%의 아가로오스 겔 상에서 작동시켰다. 2㎕의 PCR 생성물과 1㎕의 절단된 pZP-7NX를 2㎕의 10X 결찰 완충액, 14㎕의 H20 및 1㎕의 T4 DNA 결찰효소 (Promega, Madison, WI)와 함께 총 부피 20㎕ 중에서 2시간 동안 실온에서 결찰시켰다. 1㎕의 결찰물을 25μF, 300Ω, 및 2100 볼트에서 설정된 Gene Pulser II 일렉트로포레이터 (BioRad, Hercules, CA)를 사용하여 Electromax DH10B (Invitrogen, Carlsbad, CA)안에 일렉트로포레이션하였다. 100㎕의 형질전환물을 하나의 LB AMP 플레이트 (LB 육즙 (Lennox), 1.8%의 BactoTM 아가 (Difco), 100mg/L의 암피실린)상에 플레이트하였다.
각가의 콜로니를 2ml의 LB 100mg/L 암피실린 성장 배지 중에서 밤새 성장시키고, 플라스미드 미니 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 분리된 플라스미드 DNA를 BamHI 및 BglII로 소화시켜서 정확한 1.152 kB가 삽입된 클론에 대해서 DNA 서열화를 하였다. 정확한 구성물을 pZP-7NX hzB7H6으로 표시하였다.
실시예 7: P815 및 BaF3 세포에서 전체 길이의 zB7H6 의 발현: zB7H6 은 NKp30 에 특이적으로 결합하고 NK 세포 활성을 야기할 수 있다
서열이 정확한 것으로 증명된 zB7H6 클론 (pZP-7NX hzB7H6)을 다시 electromax DH10B에 넣은 후 200ml의 LB+amp로 밤새 배양함으로써 확대시키고, 그것으로부터 Qiagen 키트#12183을 사용하여 DNA를 정제하였다. 40㎍의 DNA를 HindIII로 소화시켜서 선형화하고 에탄올로 침전하였다. 이 DNA를 P815 및 BaF3 세포로 다음의 프로토콜을 사용하여 일렉트로포레이트하였다. P815 세포를 Optimem 혈청 유리 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 2회 세척하고, 1×107 세포/ml로 Optimem에 재현탁하였다. 800㎕의 세포를 상기에서 얻은 선형화된 DNA를 함유하는 튜브에 옮기고 15분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. DNA/세포 혼합물을 4mm의 일렉트로포레이션 큐벳에 옮기고 800μF 및 300볼트에서 충격을 주었다. 1분 동안 인큐베이션한 후에 세포를 다시 1180μF 및 300볼트에서 충격을 주었다. 세포를 밤새 37℃에서 인큐베이션한 후에 1mg/ml의 제네티신 (Invitrogen 1013-027)에서 선택한 다음, 클론을 0.3세포/웰로 제한 희석함으로써 제조하였다. 무작위로 선택한 클론을 가용성 형태의 NKp30 (NKp30/VASP, SEQ ID NO:11)에의 결합에 대해 FACS에 의해 선별하였다. 가장 많이 선택된 클론에 대해 FACS 결합 경합 분석 및 세포용해 분석을 수행하였다.
FACS 결합 경합 분석은, 3×106/ml로 재현탁되고 300,000 세포/샘플의 최종 계수를 위해 100㎕/샘플로 나뉘어진 BaF3 세포를 사용하여 수행하였다. 샘플당 1㎕의 전체 마우스 IgG (Jackson 015-000-003)를 첨가한 후 NKp30/mFc2-A647 표지된 프로브를 2㎍/ml로 첨가하였다. 경합을 포함하기 위한 샘플에서 미표지 프로브는 100배 과량으로 첨가하였고, 샘플을 1시간 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 샘플을 저온 PBS로 1회 세척하고 샘플을 가용성 NKp30/mFc-A647의 결합에 대해 FACSCalibur 상에서 분석하였다.
FACS 결합 경합 분석의 결과를 도 8a 및 8b에 도시한다. 가용성 NKp30/VASP-A647은 hzB7H6 발현 벡터로 일렉트로포레이션된 세포에 결합하였지만, 빈 벡터 대조표준을 함유하는 대조 세포에는 결합하지 않았다. NKp30/VASP-A647로의 염색은 100배 과량의 미표지 NKp30/VASP의 존재하에서는 관찰되지 않았지만 (도 8a), 100배 과량의 미표지 무관 VASP 단백질의 존재하에서는 관찰되었다 (도 8b).
세포용해 분석은 P815 표적에 대한 이펙터로서 NK-92를 사용하여 수행하였다. NK-92 세포를 HBSSF (행크 완충 식염수 (Ca, Mg 유리)+5% FBS)로 1회 세척하고, HBSSF에 1.35×106/ml로 (27:1의 비율을 이루기 위하여) 재현탁하였다. 150㎕의 세척된 세포를 U-자형 바닥의 96-웰 플레이트의 상부 줄에 플레이트하고 HBSSF로 연속적으로 희석하였다 (1:3). P815 표적 세포를 HBSSF로 1회 세척하고, 10μM 칼세인 AM 분자 프로브 #C1430 (DMSO중의 4mM 스톡 2.5㎕/ml, 4mM=4mg/ml) 중에 1×106세포/ml로 60분 동안 37℃에서 표지하였다. 표지된 세포를 HBSSF로 2회 세척하고 1×106 세포를 20ml의 HBSSF에 재현탁하였다 (5000세포/100㎕). 100㎕의 현탁된 표적 세포를 희석된 이펙터에 총 부피 200㎕에 대해 첨가하였다 (이펙터:표적 비율은 27:1, 9:1, 3:1, 및 1:1이다). 활성화 항-NKp30 단클론성 항체를 또한 일부 세트의 연속 희석된 웰에 2㎍/ml의 농도로 첨가하였다.
이펙터와 표적 세포를 500rpm에서 2분 동안 회전시키고, 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하고, 1500rpm에서 5분 동안 회전시킨 후 100㎕의 상층액을 바닥이 평평한 새로운 96-웰에 옮겼다. 전달된 상층액을 함유하는 평평한 바닥의 플레이트를 1초 동안 485nm의 여기 파장 및 535nm의 발광 파장에서 형광계상에서 판독하였다.
NK-92 세포는 야생형 P815 또는 두 개의 비-야기 대조 단백질 (hIgSFl (SEQ ID NO:14) 및 hB7Hl (SEQ ID NO:15))로 트랜스펙션된 P815를 용해하지 못한 반면, 활성화 항-NKp30 단클론성 항체는 재지시된 용해를 야기하였다. hCD86 (Azuma et al., Nature 366:76, 1993) 또는 zB7H6의 트랜스펙션은 P815 세포의 직접적인 죽음을 야기하였다.
이들 데이터는 zB7H6이 특이적으로 NKp30에 결합하고 세포용해 활성을 야기할 수 있음을 증명한다.
실시예 8: 사람 zB7H6 / mFc2 의 클로닝 및 구성
사람 zB7H6의 세포외재성 도메인 및 마우스 Fc 부분을 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 플라스미드를 PCR 증폭, 제한 소화 및 결찰에 의해 구성하였다. 사람 zB7H6의 세포외재성 도메인의 DNA 단편을, 사람 zB7H6 삽입 지점 양 옆의 벡터 서열에 상응하는 5' 및 3' 단부에는 프라이머 zc50437 (SEQ ID NO:20) 및 zc50438 (SEQ ID NO:21)을 사용하여 플랭킹 영역이 있는 CT#102296을 주형으로서 사용하는 PCR에 의해 분리하였다.
PCR 반응 혼합물을 1%의 아가로오스 겔위에서 작동시키고 삽입물 크기에 상응하는 밴드를 QIAquickTM Gel 추출 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 겔에서 추출한다. 사용한 초기 플라스미드는 기초 벡터로서 pZMP21이고 마우스 Fc2 부분이 그 안에 구성되었다. 플라스미드 pZMP21은 MPSV 프로모터, 코딩 서열의 삽입에 대한 다중 제한 부위, 중지 코돈, 대장균 복제 기원을 가지는 발현 카세트; SV40프로모터, 인핸서 및 복제 기원, DHFR 유전자, 및 SV40 터미네이터를 포함하는 포유류 선택가능한 마커 발현 유닛; 및 맥주효모균에서의 선택 및 복제에 필요한 URA3 및 CEN-ARS 서열을 함유하는 포유류 발현 벡터이다. 그것은 pZP9 (아메리칸 타입 컬춰 콜렉션 (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209)에 승인 번호 98668로 기탁됨)로부터 구성되는데, 이때 효모 유전자 요소들은 pRS316 (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209)에 승인 번호 77145로 기탁됨)으로부터 가져오고, 내부 리보솜 유입 부위 (IRES) 요소는 폴리오바이러스, 및 경막 도메인의 C-말단 단부에서 절단된 CD8의 세포외재성 도메인으로부터 가져온다. 플라스미드 hBTLA mFc2 pZMP21을 EcoRI/BglII로 소화시켜서 사람 BTLA를 절단해내어 PCR 삽입물과의 결찰에 사용하였다.
2㎕의 절단된 PCR 생성물과 1㎕의 절단된 pZMP21을 2㎕의 10X 결찰 완충액, 14㎕의 H2O 및 1㎕의 T4 DNA 리가아제 (Promega, Madison, WI)가 포함된 총 20㎕의 부피중에서 2시간 동안 실온에서 결찰시켰다. 1㎕의 결찰물을 25μF, 300Ω, 및 2100 볼트에서 설정된 Gene Pulser II 일렉트로포레이터 (BioRad, Hercules, CA)를 사용하여 Electromax DH10B (Invitrogen, Carlsbad, CA)안에 일렉트로포레이션하였다. 100㎕의 형질전환물을 하나의 LB AMP 플레이트 (LB 육즙 (Lennox), 1.8%의 BactoTM 아가 (Difco), 100mg/L의 암피실린)상에 플레이트하였다. 콜로니를 EcoRI과 KpnI으로의 제한 소화에 의해 선별하고, 예상되는 1.596kB 삽입물을 나타내는 클론에 대해 DNA 서열화를 수행하였다. 서열이 정확한 구성물을 hB7H6mFc2pZMP21로 표시한다. hzB7H6/mFc2를 코드하는 DNA 서열을 SEQ ID NO:16으로 도시되고, hzB7H6/mFc2에 대한 아미노산 서열은 SEQ ID NO:17로 도시된다.
실시예 9: zB7H6 / VASP 의 클로닝 및 구성
사람 혈관확장제-활성화된 인단백질 (VASP)은 문헌에서 설명된다 (Kuhnel, et al.. Proc . Nat'l . Acad . Sci . USA 101:17027, 2004). VASP 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 SEQ ID NO:3 및 4로서 제공한다. 사람 VASP 단백질의 사량체화 도메인의 센스 및 안티센스 가닥을 코드화하는 두 개의 중첩하는 올리고뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드 zc50629 (SEQ ID NO:22) 및 올리고뉴클레오티드 ZC50630 (SEQ ID NO:23)을 사용하여 고체상 합성에 의해 합성하였다. 이들 올리고뉴클레오티드를 55℃에서 아닐링하고, 올리고뉴클레오티드 프라이머 zc50955 (SEQ ID NO:24) 및 zc50956 (SEQ ID NO:25)을 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다.
증폭된 DNA를 1.5%의 아가로오스 겔상에서 분획화한 후, Qiagen 겔 분리 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜 (Qiagen, Valiencia, CA)을 따라 분리하였다. 분리된 DNA를 효모 재조합에 의해 BglII 절단된 pzmp21 벡터안에 삽입하였다. DNA 서열화로 벡터의 예상된 서열을 확인하였고, 그것을 pzmp21VASP-His6으로 표시하였다.
사람 zB7H6의 세포외재성 도메인을 올리고 zc58284 (SEQ ID NO:26) 및 zc58419 (SEQ ID NO:27)을 포함한 CT#102296으로부터 PCR 증폭에 의해 생성하였다. PCR 반응 혼합물을 1% 아가로오스 겔상에서 작동시켰고 삽입물의 크기에 상응하는 밴드를 QIAquickTM Gel 추출 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 겔에서 추출한다. 그 결과의 정제된 PCR 생성물을 EcoRI 및 BglII로 2시간 동안 37℃에서 소화시키고 상기에서 설명한 바와 같이 밴드 정제를 위해 1% 아가로오스 겔상에서 작동시켰다. 분리된 단편을 EcoRI/BglII 절단된 pZMP21VASP-His6 벡터에 결찰에 의해 삽입하였다. 2㎕의 PCR 생성물과 1㎕의 절단된 pZMP21VASP-His6을 2㎕의 10X 결찰 완충액, 14㎕의 H2O 및 1㎕의 T4 DNA 리가아제 (Promega, Madison, WI)가 포함된 총 20㎕의 부피 중에서 2시간 동안 실온에서 결찰시켰다. 1㎕의 결찰물을 25μF, 300Ω, 및 2100 볼트에서 설정된 Gene Pulser II 일렉트로포레이터 (BioRad, Hercules, CA)를 사용하여 Electromax DH10B (Invitrogen, Carlsbad, CA)안에 일렉트로포레이션하였다. 100㎕의 형질전환물을 하나의 LB AMP 플레이트 (LB 육즙 (Lennox), 1.8%의 BactoTM 아가 (Difco), 100mg/L의 암피실린)상에 플레이트하였다.
각각의 콜로니를 2ml의 LB AMP 성장 배지에서 밤새 성장시키고 플라스미드 미니 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 분리된 플라스미드 DNA를 BamHI 및 BglII로 소화시켜서 정확한 1.152 kB가 삽입된 클론에 대해서 DNA 서열화를 하였다. 정확한 구성물을 pZMP21 hzB7H6 VASP-His6으로 표시하였다. hzB7H6 VASP-His6을 코드하는 DNA 서열은 SEQ ID NO:18로 표시하고, hzB7H6 VASP-His6에 대한 아미노산 서열은 SEQ ID NO:19로 표시한다.
실시예 10: CHO 세포에서 zB7H6 / mFc2 의 안정한 트랜스펙션 및 발현
50㎍의 hB7H6mFc2pZMP21 구성물의 3개의 세트를 각각 25유닛의 PvuI으로 37℃에서 3시간 동안 소화시킨 후, IPA로 침전시키고 1.5mL의 마이크로원심분리 튜브에서 회전시켰다. 상층액을 펠릿에서 제거하고 펠릿을 0.5mL의 70% 에탄올로 세척하였다. 튜브를 마이크로원심분리에서 15분 동안 13,000 RPM에서 회전시키고 상층액을 펠릿으로부터 제거하였다. 그런 다음 펠릿을 멸균 환경에서 1ml의 ZF1 배지에서 재현탁하고, 60℃에서 15분 동안 인큐베이션한 다음, 실온으로 냉각시켰다. 5E6 5xSA APFDXB11 CHO 세포를 세 개의 튜브 각각에서 회전시키고 DNA-배지 용액을 사용하여 재현탁하였다. DNA/세포 혼합물을 4mm 갭 큐벳에 넣고 다음의 매개변수를 사용하여 일렉트로포레이션하였다: 950μF, 고용량, 및 300V. 그런 다음 큐벳의 내용물을 제거하고 모아서 ZF1 배지로 25mL로 희석하고 125mL 진동 플라스크에 넣었다. 플라스크를 37℃, 6% CO2에서의 진동기 상의 인큐베이터에 넣고 120 RPM에서 진동시켰다.
셀라인에 대해 영양 선택을 수행하였고, 이어서 200nM 메토트렉세이트 (MTX)로 증폭한 후 500nM MTX로 단계별 증폭하였다. 발현을 항-마우스 IgG2a 항체 및 항-마우스 IgG H+L 항체로 프로브된 웨스턴 블롯에 의해 확인하고, 생산을 확대한 후 단백질을 정제하였다.
실시예 11: CHO 세포에서의 zB7H6 / VASP 의 안정한 트랜스펙션 및 발현
50㎍의 pZMP21 hzB7H6 VASP-His6 구성물의 3개의 세트를 각각 25유닛의 PvuI으로 37℃에서 3시간 동안 소화시킨 후, IPA로 침전시키고 1.5mL의 마이크로원심분리 튜브에서 회전시켰다. 상층액을 펠릿에서 제거하고 펠릿을 0.5mL의 70% 에탄올로 세척하였다. 튜브를 마이크로원심분리에서 15분 동안 13,000 RPM에서 회전시키고 상층액을 펠릿으로부터 제거하였다. 그런 다음 펠릿을 멸균 환경에서 1ml의 ZF1 배지에서 재현탁하고, 60℃에서 15분 동안 인큐베이션한 다음, 실온으로 냉각시켰다. 5E6 5xSA APFDXB11 CHO 세포를 세 개의 튜브 각각에서 회전시키고 DNA-배지 용액을 사용하여 재현탁하였다. DNA/세포 혼합물을 4mm 갭 큐벳에 넣고 다음의 매개변수를 사용하여 일렉트로포레이션하였다: 950μF, 고용량, 및 300V. 그런 다음 큐벳의 내용물을 제거하고 모아서 ZF1 배지로 25mL로 희석하고 125mL 진동 플라스크에 넣었다. 플라스크를 37℃, 6% CO2에서의 진동기 상의 인큐베이터에 넣고 120 RPM에서 진동시켰다.
셀라인에 대해 영양 선택을 수행하였고, 이어서 200nM 메토트렉세이트 (MTX)로 증폭한 후 500nM MTX로 단계별 증폭하였다. 발현을 항-6-His 항체로 프로브된 웨스턴 블롯에 의해 확인하고, 셀라인의 생산을 확대한 후 단백질을 정제하였다.
실시예 12: zB7H6 은 사람 일차 NK 세포에서 세포용해 활성을 야기한다
세포용해 분석을 P815 표적에 대한 이펙터로서 사람 일차 NK 세포를 사용하여 수행하였다. NK 세포를 자기 비드 표지화 Niltenyi #130-092-657이 포함된 네거티브 선택을 사용하여 사람 말초혈로부터 정제하였다. 이들 정제된 NK 세포를 밤새 10ng/ml의 사람 IL-2 (R&D #202-IL-010)이 첨가된 RPMI/10% FBS에서 배양하였다. 그런 다음 NK 세포를 HBSSF (행크 완충 식염수 (Ca, Mg 유리)+5% FBS)로 1회 세척하고, HBSSF에 1.35×106/ml로 (27:1의 비율을 이루기 위하여) 재현탁하였다. 150㎕의 세척된 세포를 U-자형 바닥의 96-웰 플레이트의 상부 줄에 플레이트하고 HBSSF로 연속적으로 희석하였다 (1:3). P815 표적 세포를 HBSSF로 1회 세척하고, 10μM 칼세인 AM 분자 프로브 #1430 (DMSO중의 4mM 스톡 2.5㎕/ml, 4mM=4mg/ml) 중에 1×106세포/ml로 60분 동안 37℃에서 표지하였다. 표지된 세포를 HBSSF로 2회 세척하고 1×106 세포를 20ml의 HBSSF에 재현탁하였다 (5000세포/100㎕). 100㎕의 현탁된 표적 세포를 희석된 이펙터에 총 부피 200㎕에 대해 첨가하였다 (이펙터:표적 비율은 27:1, 9:1, 3:1, 및 1:1이다). 활성화 항-NKp30 단클론성 항체를 또한 일부 세트의 연속 희석된 웰에 2㎍/ml의 농도로 첨가하였다. NKp30의 가용성 mFc 버전을 연속적으로 희석된 웰의 일부 세트에 2㎍/ml로 첨가하고 미관련 단백질, HHLA2/mFc2FMF 동일한 농도에서 상이한 세트에 첨가하였다.
이펙터 및 표적 세포를 500rpm에서 2분 동안 회전시키고 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션한 후 1500rpm에서 5분 동안 회전시킨 후 100㎕의 상층액을 새로운 평평한 바닥의 96-웰에 옮겼다. 전달된 상층액을 함유한 평평한 바닥 플레이트를 485nm의 여기 파장 및 535nm의 방출 파장에서 1초 동안 형광계상에서 판독하였다.
NK 세포는 저수준에서 야생형 P815 세포를 용해했지만 zB7H6으로 형질전환된 P815 세포는 활성화 항-NKp30 단클론성 항체에 의해 야기된 죽음을 재-지시하는 수준과 가까운 수준에서 용해되었다. 가용성 NKp30은 zB7H6 형질전환된 P815의 용해를 거의 바탕값 수준으로까지 억제하였지만 HHLA2/mFc2의 첨가는 아무 영향을 미치지 않았다.
실시예 13: 마우스 항- zB7H6 다클론성 항체의 생성
면역화
5마리의 3달 된 암컷 BALB/c 마우스 (Charles River Laboratories, Wilmington, MA)를 사람 zB7H6으로 면역시켰다. 마우스를 처음에, 제조업체의 지시에 따라 Emulsigen®-P 보조제 (MVP Laboratories INC, Omaha, NE)와 조합하여 VASP, 6His, 및 포합된 BSA (SJAS 9Aug07)에 융합된 약 50㎍의 정제된, 재조합 사람 zB7H6 (CHO DXB 11 5SA, Lot # A1980F에서 생성된 ZGI)을 피하 주사함으로써 면역시켰다. 초기 면역화에 이서 9주 기간 동안 격주마다 피하 경로를 통해 Emulsigen®-P 보조제 중의 추가의 50㎍의 사람 zB7H6을 마우스들에게 주었다. 세 번째 및 네 번째 면역화를 한 지 7일 후에 안와정맥총을 통해 출혈시키고 혈청을 그것의 사람 zB7H6에의 결합 능력의 분석을 위해 혈액으로부터 분리하였따.
직접 분석
항혈청 중의 항-사람 zB7H6 항체의 사람 zB7H6 (로트 번호 A1980F)에 결합하는 능력을 다이렉트 스타일 (direct style) ELISA 분석을 사용하여 평가하였다. 이 분석에서 96-웰 폴리스티렌 ELISA 플레이트의 웰을 먼저 100μL/웰의 사람 zB7H6 (로트 번호 A1980F)으로 코팅 완충액 (0.1MNa2CO3, pH 9.6)중의 1㎍/mL의 농도로 코팅하였다. 플레이트를 밤새 4℃에서 인큐베이션한 후 미결합 수용체를 흡인제거한 후 플레이트를 300μL/웰의 세철 완충액 (0.137M NaCl, 0.0022M KCl, 0.0067M Na2HPO4, 0.0020M KH2PO4, 0.05% v/w 폴리소르베이트 20, pH 7.2로서 규정된 PBS-트윈)으로 2회 세척하였다. 웰을 200μL/웰의 차단 완충액 (PBS-트윈 = 1% w/v 소혈청 알부민 (BSA))으로 1시간 동안 차단한 후, 플레이트를 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 연속적으로 10배 희석한 (PBS-트윈 중의 1% BSA로) 혈청을 초기 희석을 1:100으로 하여 1:100,000까지의 범위로 제조하였다. 정상 마우스 혈청을 대조표준으로 사용하였다. 그런 다음 각 희석의 이중 샘플을, 사람 zB7H6에 결합시키기 위하여 100μL/웰로 분석 플레이트에 옮겼다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후에 웰을 흡인하고 플레이트를 상기에서 설명된 것과 같이 2회 세척하였다. 그런 다음 1:50,000 희석률의 서양고추냉이 과산화효소 표지된 염소 항 마우스 카파 항체 (SouthernBiotech, Brimingham, Alabama)를 각 웰에 100μL/웰로 첨가하고, 플레이트를 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 미결합 HRP 포합된 항체를 제거한 후에 플레이트를 2회 세척하고, 100μL/웰의 테트라 메틸 벤지딘 (TMB)(BioFX Laboratories, Owings Mills, MD)을 각 웰에 첨가한 다음 플레이트를 2.5분 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 색 발생을 100μL/웰의 TMB 중지 시약 (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD)을 첨가함으로써 중지시키고, 웰의 흡수값을 450nm에서 분자 장치 스펙트라 MAX 340 기기상에서 판독하였다.
모든 마우스로부터의 면역 혈청은 강력한 항-VASP 및 항-zB7H6 반응을 나타냈다. 혈청을 모으고 항-zB7H6 항체를 아래에서 설명한 것과 같이 정제하였다.
zB7H6 다클론성 항체의 정제
zB7H6 C (VASP)H6으로 도전된 마우스로부터 얻은 혈청을 모아서 35mM NaPO4, 120mM NaCl, pH 7.2로 1:1 (v/v)로 희석하고, 0.2㎛ 멸균 여과한 후에 zB7H6 (mFc2)와 결합된 CNBr-활성화 세파로오스TM 4B (GE Healthcare, Piscataway, NJ)위에 (배치 방법을 통해) 로딩하였다. 희석된 칼럼에 로딩하기 전에 CNBr-활성화 세파로오스TM 4B 수지를 20 칼럼 부피 (대략 50ml)의 35mM NaPO4, 120mM NaCl, pH 7.2로 사전에 평형시켰다. 희석된 혈청의 결합된 수지에 대한 비율은 2.8:1 (v/v)이었다.
크로마토그래피 과정을 5℃ 및 주변 온도에서 수행하였다. 구체적으로 희석된 혈청을 zB7H6 (mFc2) 결합된 CNBr-활성화 세파로오스TM 4B 수지 위에 로딩 (포획 단계)하는 것은 진동 플랫폼을 사용하여 5℃에서 수행하였다. 세척 단계와 후속 용출 단계를 주변 실온 (대략 22℃)에서 수행한 후 혈청/수지 슬러리를 빈 유리 Econo-칼럼 (Bio-Rad, Hercules, CA)에 부었다. 칼럼을 15 칼럼 부피 (대략 37.5ml)의 35mM NaPO4, 120mM NaCl, pH 7.2로 세척하였다 (중력 흐름을 통해서). 그런 다음 결합된 항체를 100mM 글리신, pH 2.7로 pH 용출하였다 (중력 흐름을 통해서). 0.5ml의 분획을 수집하고 즉시 0.05ml의 2.0M 트리스-HCl, pH 8.0으로 중화하였다. 분획을 수집하고 NanoDrop (Thermo Scientific, Fremont, CA)으로부터 A280 판독을 기초로 모았다. 그런 다음 보유된 병류를 다시 칼럼 재생/평형화후에 zB7H6 (mFc2) 결합된 CNBr-활성화 세파로스TM 4B 수지상에 적용하였다. 이 배치/용출 주기를 2회 반복하였다.
상응하는 정제의 모아진 분획을 모은 후 35mM NaPO4, 120mM NaCl, pH 7.2에 대하여 사전 충전된 세파덱스TM G-25 슈퍼파인 칼럼, HiTrapTM 칼럼 (GE Healthcare, Piscataway, NJ)을 사용하여 탈염시켰다 (완충제-교환). 이들 분획을 모은 것은 AKTA Explorer상에서 A280 판독에 의해 측정하였다. 모아지고 탈염한 분획을 0.22㎛ 멸균 필터를 통해 여과한 후 일정액으로 나누고 -80℃에서 보관한다.
실시예 14: 마우스 항- zB7H6 다클론성 항체 활성 및 특이성의 확인
마우스 항-zB7H6 친화성 정제된 다클론성 항체를 Alexafluor-A647 항체 표지화 키트 (Invitrogen A30009)를 사용하여 제조업체의 지시를 따라 Alexa-647 형광 마커와 포합시켰다. 150,000 세포/샘플 야생형 또는 zB7H6-트랜스펙션된 P815 세포를 100배 과량의 미표지 경합제가 포함되거나 포함되지 않은 1㎍/ml의 항-zB7H6-A647로 프로브하였다. 세포를 1시간 동안 얼음 위에서 인큐베이션하고, 2ml의 빙냉 PBS로 1회 세척한 후 유세포분석에 의해 FACSCalibur 기기상에서 판독하였다. 결합을 평균 형광 세기 (MFI)로서 기록하였다. 이 연구 결과 항-zB7H6-A647 항체는 zB7H6-트랜스펙션된 P815 세포에 결합되지만 (MFI ~ 600), 야생형 (트랜스펙션되지 않은 ) P815 세포에는 결합하지 않은 (MFI ~ 25)것으로 나타났다. 이 결합은 100배 과량의 미표지된 항-zB7H6 (MFI ~ 40)와 경합하였지만, 100배 과량의 이소타입 대조 항체와는 경합하지 않았다 (MFI ~ 500).
마우스 항-zB7H6 다클론성 항체를 또한 P815 형질전환체에 대한 NKp30/mFc2-비오틴 결합의 경합 결합 분석에 사용하였다. 150,000개의 야생형 또는 zB7H6-형질전환된 P815 세포를 100㎕의 PBS/2% FBS중의 1㎍/ml로 NKp30/mFc2-비오틴으로 프로브하였다. 미표지된 항-zB7H6 다클론성 항체 또는 다른 대조 항체 또는 가용성 수용체를 100배 과량으로 첨가하였다. 세포를 1시간 동안 얼음 위에서 염색하고, 2ml의 빙냉 PBS로 1회 세척한 후 1㎍/ml (BD:554061)의 스트렙트아비딘-PE로 15분 동안 염색하였다. 세포를 다시 저온 PBS로 세척한 후 유세포분석에 의해 FACSCalibur 기기 상에서 판독하였다. 결합을 평균 형광 세기 (MFI)로서 기록하였다. 이 연구 결과 NKp30/mFc2-비오틴은 zB7H6-형질전환된 세포에는 결합했지만 (MFI~825), 야생형 P815 세포에는 결합하지 않았다 (MFI<15). 표지된 NKp30/mFc2의 결합은 미표지된 항-zB7H6 항체 및 NKp30/mFc2 두 가지에 의해 모두 경합되었지만 (MFI ~ 25), 이소타입 대조 항체에는 경합하지 않았다 (MFI ~ 775).
실시예 15: 가용성 단백질을 사용한 K562 및 P815 zB7H6 표적에 대한 NK -92 세포용해 활성의 억제
세포용해 활성을 K562 및 P815 zB7H6 표적에 대한 이펙터로서 NK-92를 사용하여 수행하였다.
NK-92 세포를 HBSSF (행크 완충 식염수 (Ca, Mg 유리)+5% FBS)로 1회 세척하고, HBSSF에 1.35×106/ml로 (27:1의 비율을 이루기 위하여) 재현탁하였다. 150㎕의 세척된 세포를 U-자형 바닥의 96-웰 플레이트의 상부 줄에 플레이트하고 HBSSF로 연속적으로 희석하였다 (1:3).
K562 및 P815 zB7H6 표적 세포를 HBSSF로 1회 세척하고, 10μM 칼세인 AM 분자 프로브 #C1430 (DMSO중의 4mM 스톡 2.5㎕/ml, 4mM=4mg/ml) 중에 1×106세포/ml로 60분 동안 37℃에서 표지하였다. 표지된 세포를 HBSSF로 2회 세척하고 1×106 세포를 20ml의 HBSSF에 재현탁하였다 (5000세포/100㎕). 100㎕의 현탁된 표적 세포를 희석된 이펙터에 총 부피 200㎕에 대해 첨가하였다 (이펙터:표적 비율은 27:1, 9:1, 3:1, 및 1:1이다). 가용성 형태의 NKp30 (NKp30/VASP 사량체 수용체), VASP 대조표준 (B7H3/VASP; SEQ ID NO:[28]),항-zB7H6 다클론성 항체 (E10607), 또는 무관한 대조 항체를 또한 일부 세트의 연속 희석된 웰에 5㎍/ml의 농도로 첨가하였다.
이펙터와 표적 세포를 500rpm에서 2분 동안 회전시키고, 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하고, 1500rpm에서 5분 동안 회전시킨 후 100㎕의 상층액을 바닥이 평평한 새로운 96-웰에 옮겼다. 전달된 상층액을 함유하는 평평한 바닥의 플레이트를 1초 동안 485nm의 여기 파장 및 535nm의 발광 파장에서 형광계상에서 판독하였다.
도 10에서 알 수 있는 것과 같이, 가용성 NKp30/VASP 및 항-zB7H6 다클론성 항체는 9:1의 이펙터 대 표적 비율에서 K562 및 P815 zB7H6에 대한 NK-92 세포의 세포용해 활성을 억제하였다 (도 10). 이런 억제는 또한 27:1 및 3:1의 표적 대 이펙터 비율에서도 찾아볼 수 있다. VASP 및 무관한 항체 대조표준은 아무 영향도 미치지 않았다. 이들 데이터는 NK-92의 K562 및 P815 zB7H6 표적을 용해하는 능력이 NKp30-중재되고 나아가 zB7H6에 의존적이라는 것을 시사한다.
실시예 16: 가용성 NKp30 은 K562 , P815 zB7H6 및 293F 세포에 특이적으로 결합한다
K562, P815 zB7H6 및 293F 세포를 FACS에 의해, NKp30의 세포외재성 도메인과 쥐의 Fc 단편을 함유하는 비오티닐화된 가용성 형태의NKp30 (NKp30/mFc2)로 프로브하였다. 세포를 PBS/2% FBS중에 1.5×106 세포/ml (150,000 세포/샘플)의 농도로 재현탁하였다. 100㎕의 샘플을 Fc 수용체 차단을 위해 포함된 100㎍/ml의 전체 사람 IgG (Jackson #009-000-003)으로 일정액으로 나누었다. NKp30/mFc2-비오틴 프로브를 2㎍/ml의 농도로 첨가하고 100배 과량의 VASP 단백질 (NKp30/VASP 또는 사람 zB7H6/VASP) 또는 대조 VASP 단백질 (B7H3/VASP)의 과량을 첨하였다. 세포를 1시간 동안 얼음 위에서 인큐베이션하고 2ml의 저온 PBS로 세척하였다. 세척된 세포를 스트렙트아비딘-PE (BD:554061)이 첨가된 100㎕의 PBS/2% FBS에 1㎍/ml로 재현탁하고 15분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 1ml의 저온 PBS로 세척하고, 250㎕의 PBS에 재현탁한 후, PE 염색에 대해 FACSCalibur 상에서 분석하였다.
도 11에서 알 수 있는 것과 같이, NKp30/mFc2-비오틴은 K562, 293F 및 P815 zB7H6 세포에 결합하였다 ("경합 없음"). 이 결합은 NKp30/VASP 및 zB7H6/VASP와 경합하였지만, 대조 VASP 단백질 (B7H3/VASP)과는 경합하지 않았는데, 그것은 K562, P815 zB7H6 및 293F 세포에 대한 NKp30/mFc2의 결합이 특이적이라는 것을 시사한다. MCF-7, Aspc-1, A549, 및 HL-60 종양 셀라인에 대해서는 결합이 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다.
실시예 17: 항- zB7H6 은 K562 , P815 zB7H6 및 293F 세포에 특이하게 결합한다
K562, P815, P815 zB7H6 및 293F 세포를 항-zB7H6 마우스 다클론성 항체 (E10607)의 A647 포합된 형태로 프로브하였다. 세포를 PBS/2% FFBS중에 1.5×106 세포/ml (150,000 세포/샘플)의 농도로 재현탁하였다. 100㎕의 샘플을 Dc 수용체를 차단하기 위해 포함된 100㎍/ml의 전체 사람 IgG (Jackson #009-000-003)로 일정액으로 나누었다. 항-zB7H6-A647 항체를 2㎍/ml의 농도로 첨가하고 100배 과량의 VASP 단백질 (zB7H6/VASP 또는 대조 VASP 단백질 (B7H3/VASP))을 첨가하였다. 세포를 1시간 동안 얼음 위에서 인큐베이션하고, 2ml의 PBS로 세척하였다. 그런 다음 세포를 250㎕의 PBS에 재현탁하고 APC 염색에 대해 FACSCalibur 상에서 분석하였다.
도 12에 도시된 것과 같이, 항-zB7H6은 K562, P815 zB7H6 및 293F 세포에 결합하였지만, 형질전환되지 않은 P815 세포에는 경합하지 않았다 ("경합 없음"). 이 결합은 zB7H6/VASP와 경합할 수 있지만, 대조 VASP 단백질 (B7H3/VASP)과는 경합할 수 없는데, 이것은 항-zB7H6-A647이 K562, P815 zB7H6 및 293F 세포에 대한 결합이 특이적이라는 것을 시사한다. MCF-7, Aspc-1, A549, 및 HL-60 종양 셀라인에 대해서는 결합이 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다. 이들 데이터는 NKp30/mFc2-비오틴 결합 데이터와 함께 zB7H6 발현과의 NKp30/mFc-비오틴 결합의 상응성을 나타낸다.
실시예 18: 정상인 조직의 정량적 실시간 PCR 분석
정량적인 실시간 중합효소 사슬 반응 (qRT-PCR)을 사용하여 정상인 조직에서 zB7H6 mRNA 메시지 수준을 분석하였다. zB7H6 프라이머와 프로브를 게놈 DNA로부터의 증폭을 피하기 위해 엑손/인트론 경계를 회전하도록 디자인된 FAM 리포터 염료가 포함된 프라이머를 생성하는 등록상표의 소프트웨어를 사용하여 ABI로부터 구입하였다. 이 프라이머 (ABI:Hs02340611_m1)를 100ng에서 시작하는 5 로그 희석 시리즈에서 293F cDNA상에서의 하우스키핑(housekeeping) 유전자 HPRT1 (ABI:4333768-0712016)에 대한 프라이머로 조합하여 확인 실험에서 사용하였다. 293F cDNA 농도 대 델타 사이클 한계점 (델타Ct)의 로그의 도표는 식 Y = -0.02571x+3.504와 통계학적으로 맞는 선을 제공하며, 이것은 zB7H6 프라이머와 프로브 세트의 효율이 Log2 Ct 계산을 타당하게 만드는 HPRT1의 그것과 맞먹는것을 나타낸다 (통과 확인 실험은 0.1보다 작은, 델타Ct 대 로그 유입 cDNA의 기울기의 절대 값으로서 규정된다). 역전사효소 (-RT) 대조표준은 게놈 DNA로부터의 증폭의 부재를 증명하기 위하여 293F 희석 시리즈에서 각각의 농도에 대해 수행하지 않았다. 정상 조직 qPCR 배열을 Origene (Origene HMRT102)로부터 구입하였다. 이 배열에서 폴리-A RNA로부터의 첫 번째 가닥 cDNA를 제조업체에 의해 GAPDH에 대해 규준화하였다. 동결건조된 샘플을 30㎕의 DiH20에 재현탁하고, 그 중 13.5㎕를 두 개의 반응으로 나누어 하나는 HPRT1에 대해, 그리고 하나는 zB7H6 RT-PCR에 대해 사용하였다. 10㎕의 반응액중에서 프라이머를 900nM에서 사용하고 프로브는 250nM로 사용하며, ABI 7900HT RT-PCR 기기상에서 3개 한 벌로 실험하였다. 모든 샘플에서 증폭하는 HPRT1 하우스키핑 유전자의 증폭에도 불구하고, 48개의 정상 조직 샘플 중에서 어느 것에서도 zB7H6 프라이머로의 증폭은 관찰되지 않았다. 또한 293F 포지티브 대조표준 cDNA는 zB7H6 증폭을 나타냈는데, 이것은 qRT-PCR 반응이 적절하게 작용했음을 가리킨다.
실시예 19: 종양 셀라인의 정량적인 실시간 PCR 분석
qRT-PCR을 또한 사용하여 다양한 기원의 종양 셀라인의 패널로부터 zB7H6 mRNA를 평가하였다. 총 RNA를 제조업체의 지시에 따라 RNeasy 미디 칼럼 (Qiagen 75142)을 사용하여 세포로부터 제조하였다. 첫 번째 가닥 cDNA를 Invitrogen Superscript III 키트 (Invitrogen 11752-250)를 사용하여 제조업체의 지시에 따라 1㎍의 RNA의 역전사에 의해 합성하였다. 상기 실시예 18에서 설명한 것과 동일한 프라이머와 프로브 세트를 종양 라인으로부터 19.3ng의 첫 번째 가닥 cDNA를 분석하는 데 사용하였다. NKp30/mFc2 및 항-zB7H6의 낮은 결합 수준을 가지는 지에 대해 관찰되었던 다우디 세포는 3가지 상이한 날에 이중으로 작동한 3개의 상이한 반응으로부터 0.079의 Log2 Ct 평균값을 제공하며, 따라서 0.07을 qRT-PCR 분석에서 zB7H6 명료성을 규정하기 위한 한계점으로서 사용하였다. 분석한 118 셀라인 중 23개의 셀라인이 zB7H6 메시지를 발현하는 것으로 나타났다. zB7H6을 발현하는 종양 셀라인을 아래의 표 8에 나타낸다.
Figure pct00005
실시예 20: 종양 성장에 대한 항- zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체의 효능을 평가하기 위한 BxPC3 췌장 암종 모델
항-zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체가 마우스에서 종양 성장에 대한 활성을 가지는지를 시험하기 위해 마우스 그룹에 제 0일에 BxPC3 VNP장 종양을 피하 주사하였다. 일단 종양이 150 내지 200mm3으로 성장하면, 마우스 군 (n=10/그룹)의 마우스에게 1mg/kg 내지 30mg/kg의 대조 시약, 항-zB7H6 항체, 또는 항-zB7H6 항체-약물 포합체를 1주일에 1회 내지 3회, 3주 동안 주사하였다. 종양 부피를 5주 동안 1주일에 3회 모니터하였다. 마우스의 상당히 더 작은 종양에는 항-zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체를 주사하고, 대조 시약을 주사한 마우스와 비교하였고, 그 결과 종양 성장의 억제에 대한 길항체의 효능을 나타냈다.
연구 디자인: 8 내지 10-주 된 암컷 C.B-17 SCID 마우스 (Charles River Lboratories)의 오른쪽 옆구리에 2×106 BxPC-3 세포를 제 0일에 피하 주사하였다. 150 내지 200mm3의 종양 크기로 출발하여 그룹의 마우스 (n=10/군)에게 1mg/kg 내지 30mg/kg의 대조 시약, 항-zB7H6 항체, 또는 항-zB7H6 항체-약물 포합체를 1주일에 1회 내지 3회, 3주 동안 주사하였다. 종양 성장을 캘리퍼스 측정을 사용하여 5주 동안 1주일에 3회 모니터하였다. 종양 부피를 식 1/2*(B)2*L(mm3)을 사용하여 계산한다.
실시예 21: 항- zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체를 사용한 생체 내 사람 간세포 암종 세포 성장의 억제
생체 내에서 사람 간세포 암종 세포에 대한 항-zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체의 항-종양 활성을 평가하기 위하여, BALB/c 누드 마우스 그룹에 HuH7 또는 C3A 간세포 암종 세포를 제 0일에 주사하였다. 종양 내포 마우스 그룹 (n=10/군)에 5 내지 75㎍의 항-zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체를, 제 5일부터 33일까지 격일로 (EOD) 복강 내 또는 종양주변 주사에 의해 주입하였다. 종양 부피를 6주 동안 1주일에 3회 모니터하였다. 항-zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체에 의한 종양 성장의 억제는 각각의 단백질이 생체 내에서 사람 간세포 암종에 대한 억제 효과를 가지는 것을 가리킨다.
연구 디자인: 8-주 된 암컷 BALB/c 누드 마우스 (Charles River Lboratories)의 오른쪽 옆구리에 6×106 HuH7 또는 C3A 세포를 제 0일에 피하 주사하였다. 그룹의 마우스 (n=10/군)에게 5㎍ 내지 75㎍의 항-zB7H6 항체 또는 항-zB7H6 항체-약물 포합체를 제 5일부터 33일까지 복강 내 또는 종양 주변에 주사하였다. 주사는 총 200㎕의 부피로 제공한다. 종양 성장을 캘리퍼스 측정을 사용하여 6주 동안 1주일에 3회 모니터하였다. 종양 부피를 식 1/2*(B)2*L(mm3)을 사용하여 계산한다.
실시예 22: 항- zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체를 사용한 시험관 내 사람 전립선 암종 세포 성장의 억제
생체 내에서 사람 전립선 암종 세포에 대한 항-zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체의 항-종양 활성을 평가하기 위해, BALB/c 누드 마우스 그룹에 PC-3 또는 DU-145 전립선 암종 세포를 제 0일에 주사하였다. 종양 내포 마우스 그룹 (n=10/군)에 5 내지 75㎍의 항-zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체를, 제 5일부터 33일까지 격일로 (EOD) 복강 내 또는 종양주변 주사에 의해 주입하였다. 종양 부피를 6주 동안 1주일에 3회 모니터하였다. 항-zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체에 의한 종양 성장 (부피 또는 체중)의 억제는 각각의 단백질이 생체 내에서 사람 전립선 암종에 대한 억제 효과를 가지는 것을 가리킨다.
연구 디자인: 8-주 된 암컷 BALB/c 누드 마우스 (Charles River Lboratories)의 오른쪽 옆구리에 또는 전립선 엽에 오르토토픽칼하게 (orthotopically) 10×106의 PC-3 또는 10×106의 DU-145 세포를 제 0일에 피하 주사하였다. 그룹의 마우스 (n=10/군)에게 5 내지 75㎍의 항-zB7H6 항체 또는 항-zB7H6 항체-약물 포합체를 제 5일부터 33일까지 복강 내 또는 종양 주변에 (s.c 모델만) 주사하였다. 주사는 총 200㎕의 부피로 제공한다. s.c 종양에 대해서는 종양 성장을 캘리퍼스 측정을 사용하여 6주 동안 1주일에 3회 모니터하였다. 종양 부피를 식 1/2*(B)2*L(mm3)을 사용하여 계산한다. 오르토토픽 종양에 대해서는 마우스를 연구 종결시에 종료하고 종양의 무게를 측정하여 종양 부하를 평가하였다.
실시예 23: 항- zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체를 사용한 생체 내 사람 결장 암종 세포의 억제
생체 내에서 사람 결장 암종 세포에 대한 항-zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체의 항-종양 활성을 평가하기 위해, BALB/c 누드 마우스 그룹에 DLD-1 또는 HCT-116 결장 암종 세포를 제 0일에 주사하였다. 종양 내포 마우스 그룹 (n=10/군)에 5 내지 75㎍의 항-zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체를, 제 5일부터 33일까지 격일로 (EOD) 복강 내 또는 종양주변 주사하였다. 종양 부피를 6주 동안 1주일에 3회 모니터하였다. 항-zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체에 의한 종양 성장 (부피 또는 체중)의 억제는 각각의 단백질이 생체 내에서 사람 결장 암종에 대한 억제 효과를 가지는 것을 시사한다.
연구 디자인: 8-주 된 암컷 BALB/c 누드 마우스 (Charles River Lboratories)의 오른쪽 옆구리에 또는 결장 벽에 오르토토픽칼하게 6×106의 DLD-1 또는 HCT-116 세포를 제 0일에 피하 주사하였다. 그룹의 마우스 (n=10/군)에게 5 내지 75㎍의 항-zB7H6 항체 또는 항-zB7H6 항체-약물 포합체를 제 5일부터 33일까지 복강 내 또는 종양 주변에 (s.c 모델에 대해서만) 주사하였다. 주사는 총 200㎕의 부피로 제공한다. s.c 종양에 대해서는 종양 성장을 캘리퍼스 측정을 사용하여 6주 동안 1주일에 3회 모니터하였다. 종양 부피를 식 1/2*(B)2*L(mm3)을 사용하여 계산한다. 오르토토픽 종양에 대해서는 마우스를 연구 종결시에 종료하고 종양의 무게를 측정하여 종양 부하를 평가하였다.
실시예 24: 항- zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체를 사용한 생체 내 사람 췌장 암종 세포의 억제
생체 내에서 사람 결장 암종 세포에 대한 항-zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체의 항-종양 활성을 평가하기 위해, BALB/c 누드 마우스 그룹에 BxPC-3 또는 HPAF-II 췌장 암종 세포를 제 0일에 주사하였다. 종양 내포 마우스 그룹 (n=10/군)에 5 내지 75㎍의 항-zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체를, 제 5일부터 33일까지 격일로 (EOD) 복강 내 또는 종양주변 주사하였다. 종양 부피를 6주 동안 1주일에 3회 모니터하였다. 항-zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체에 의한 종양 성장 (부피 또는 체중)의 억제는 각각의 단백질이 생체 내에서 사람 췌장 암종에 대한 억제 효과를 가지는 것을 시사한다.
연구 디자인: 8-주 된 암컷 BALB/c 누드 마우스 (Charles River Lboratories)의 오른쪽 옆구리에 또는 췌장엽에 오르토토픽칼하게 6×106의 BxPC-3 또는 HPAF-II 세포를 제 0일에 피하 주사하였다. 그룹의 마우스 (n=10/군)에게 5 내지 75㎍의 항-zB7H6 항체 또는 항-zB7H6 항체-약물 포합체를 제 5일부터 33일까지 복강 내 또는 종양 주변에 (s.c 모델에 대해서만) 주사하였다. 주사는 총 200㎕의 부피로 제공한다. s.c 종양에 대해서는 종양 성장을 캘리퍼스 측정을 사용하여 6주 동안 1주일에 3회 모니터하였다. 종양 부피를 식 1/2*(B)2*L(mm3)을 사용하여 계산한다. 오르토토픽 종양에 대해서는 마우스를 연구 종결시에 종료하고 종양의 무게를 측정하여 종양 부하를 평가하였다.
실시예 25: 항- zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체를 사용한 생체 내 B-세포 림프종의 억제
사람 B-림프종 셀라인을 시험관 내에서 성장 배지중에서의 계대에 의해 유지한다. 세포를 PBS로 철저하게 세척하여 배양 성분을 제거한다.
SCID 마우스에 (전형적으로) 1×106 사람 림프종 세포를 꼬리 정맥을 통해 100㎕의 부피로 주사한다. 주사된 세포의 최적 수는 원하는 동역학과 일관되게 작용하는 종양을 산출하기 위해 파일럿 연구에서 실험적으로 측정한다. 항-zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체 처리를, ALZET® 삼투압 미니-펌프 (ALZET, Cupertino, CA)의 피하 이식에 의해 또는 매일 항-zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체 또는 비히클의 복강 내 주사에 의해 다음날부터 시작한다. 초기 체중의 20% 이상의 체중 손실을 나타내는 마우스들을 희생시키고, 뒷다리 마비와 같은 실질적인 운동성을 나타내는 마우스도 희생시켰다. 사용된 림프종 셀라인에 따라 미처리 마우스는 전형적으로 3 내지 6주 안에 죽었다. IgG 또는 IgM을 분비하는 B 세포 림프종에 대해 질병 진전은 또한 주마다 혈액 샘플링 및 ELISA에 의한 혈청 사람 면역글로불린 수준을 측정함으로써 모니터될 수 있다.
항- zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체 용량 의존성 IM -9 모델
마우스에 1×106의 IM-9 세포를 주사하고, 그 다음 날 28일 삼투압 미니 펌프를 이식하였다. 펌프에 다음 농도의 zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체를 부하하였다: 용량 그룹당 8마리의 마우스에게 매일 0, 0.12, 1.2, 또는 12 마이크로그램. 항체 또는 항체-약물 포합체의 증가된 용량으로부터 마우스의 보호가 증가된 것은 항-zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체의 효과가 용량 의존적이라는 것을 가리킨다. 실험의 종결시에 생존하는 마우스는 질병의 신호를 나타내지 않았고 그들의 혈청에서 사람 IgG는 검출되지 않았다.
이들 데이터는 SCID 마우스 림프종 모델에서 항-zB7H6 항체 또는 항-zB7H6 항체-약물 포합체의 효능이 생체 내에서 림프종 셀라인의 성장을 억제하는 능력과 상관관계가 있음을 증명한다.
실시예 26: 항- zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체를 사용한 생체 내 B-세포 유도된 종양의 억제
미니-삼투압 펌프를 통한 일정한 주입에 의한 항-zB7H6 항체 또는 항-zB7H6 항체-약물 포합체의 투여는 펌프에 함유된 항체 또는 항체-약물 포합체의 농도에 비례하여 일정한 상태의 혈청 농도를 초래한다. 인산연 완충 식염수 (pH 6.0)에 2mg/ml 또는 0.2mg/ml 농도로 함유된 0.22ml의 항-zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체를 Alzet 미니-삼투압 펌프 (모델 2004; Alza corporation Palo Alto, CA)안에 멸균 조건하에서 로딩한다. 펌프를 등에 있는 피부의1cm 절개부를 통해 마우스에 피하 이식하고, 피부를 멸균 상처 붕대로 덮는다. 이들 펌프는 시간당 0.25㎕의 속도로 28일의 주기에 걸쳐서 그것의 내용물을 전달하도록 디자인된 것이다. 이 투여 방법은 종양 세포로 주사된 마우스에서 생존시 상당한 증가를 초래한다 (아래 참조).
생체 내에서 B-세포 유도된 종양에 미치는 항- zB7H6 항체 또는 항체 약물 포 합체의 효과
항-zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체의 효과를 본원에 설명된 마우스 종양 이종이식 모델을 사용하여 생체 내에서 시험한다. 시험하고자 하는 이종이식 모델은 사람 림프아종 셀라인 IM-9 (ATCC No. CRL159)이다. C.B-17 SCID 마우스 (암컷 C.B-17/IcrHsd-scid; HarlanM Indianapolis, Indiana)를 4그룹으로 나눈다. 제 0일에, IM-9 세포 (ATCC No. CRL159)를 배양물로부터 수득하여 꼬리 정맥을 통해 모든 마우스에 정맥내 주사한다 (마우스 당 약 1,000,000 세포). 제 1일에 시험 물질 또는 대조 물질이 함유되어 있는 미니-삼투압 펌프를 마우스에 피하 이식한다. 1 내지 3 그룹의 마우스 (n=9/그룹)에게 항-zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체를 전달한다: 그룹 1은 2.0mg/mL의 항체 또는 항체-약물 포합체를 함유하고 하루에 12㎍을 받은다; 그룹 2는 0.20mg/mL을 함유하고 하루에 1.2㎍을 받는다; 그룹 3은 0.02mg/mL을 함유하고, 하루에 0.12㎍을 받는다. 그룹 4의 마우스 (n=9)는 대조표준이고 비히클 (PBS pH 6.0)로 처리한다.
처리 그룹의 증가된 생존 (예컨대 12㎍/1일 또는 1.2㎍/1일)을 비히클로 처리한 마우스와 비교한 결과, 항-zB7H6 항체 또는 항체-약물 포합체가 생체 내에서 B-세포 종양 세포의 효과를 감소시키는 것으로 나타났다.
전술한 설명으로부터, 본 발명의 구체적인 구체예가 예시의 목적으로 설명되긴 하였지만, 다양한 변형들이 본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어남이 없이 이루어질 수 있다는 것이 인지될 것이다. 따라서 본 발명은 첨부되는 청구범위에 의한 것을 제외하고 제한되지 않는다. 본원에 삽입된 모든 공보, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적에 대해 그것들의 전체 내용이 참조로 삽입된다.
SEQUENCE LISTING <110> Brandt, Cameron S. Kennedy, Jacob J. Xu, Wenfeng Yi, Eugene C. Fox, Brian A. Gao, Zeren Sivakumar, Pallavur V. <120> B7 FAMILY MEMBER zB7H6 AND RELATED COMPOSITIONS AND METHODS <130> 07-20PC <160> 34 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1365 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgacgtgga gggctgccgc ctccacgtgc gcggcgctcc tgattctgct gtgggcgctg 60 acgaccgaag gtgatctgaa agtagagatg atggcagggg ggactcagat cacacccctg 120 aatgacaatg tcaccatatt ctgcaatatc ttttattccc aacccctcaa catcacgtct 180 atgggtatca cctggttttg gaagagtctg acgtttgaca aagaagtcaa agtctttgaa 240 ttttttggag atcaccaaga ggcattccga cctggagcca ttgtgtctcc atggaggctg 300 aagagtgggg acgcctcact gcggctgcct ggaatccagc tggaggaagc aggagagtac 360 cgatgtgagg tggtggtcac ccctctgaag gcacagggaa cagtccagct tgaagttgtg 420 gcttccccag ccagcagatt gttgctggat caagtgggca tgaaagagaa tgaagacaaa 480 tatatgtgtg agtcaagtgg gttctaccca gaggctatta atataacatg ggagaagcag 540 acccagaagt ttccccatcc catagagatt tctgaggatg tcatcactgg tcccaccatc 600 aagaatatgg atggcacatt taatgtcact agctgcttga agctgaactc ctctcaggaa 660 gaccctggga 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Sequence <220> <223> Fc6 <400> 33 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 225 230 <210> 34 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc7 <400> 34 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Glu Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230

Claims (74)

  1. SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열과 최소한 90%의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 절편을 포함하는 분리된 가용성 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 사람 NKp30에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드.
  2. 제 1항에 있어서, 폴리펩티드 절편은 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  3. 제 1항에 있어서, 가용성 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  4. 제 3항에 있어서, 폴리펩티드 절편은 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  5. 제 3항에 있어서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  6. 제 5항에 있어서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 Fc 단편인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  7. 제 5항에 있어서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 IgG, IgM, IgE, IgA, 및 IgD로 이루어지는 군으로부터 선택되는 이소타입인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  8. 제 7항에 있어서, IgG 이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  9. 제 3항에 있어서, VASP 도메인을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 절편을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  11. 제 10항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  12. 다음의 작동가능하게 연결된 요소를 포함하는 발현 벡터:
    전사 개시 영역;
    제 1항 내지 9항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 절편; 및
    전사 종결 영역.
  13. 제 12항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  14. 가용성 zB7H6 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서,
    폴리펩티드가 발현되는 조건하에서 제 13항의 숙주세포를 배양하는 단계; 및
    발현된 폴리펩티드를 회수하는 단계
    를 포함하는 방법.
  15. SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 절편에 특이적으로 결합하는 분리된 항체.
  16. 제 15항에 있어서, 항체는 zB7H6과 사람 NKp30의 상호작용을 억제하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  17. 제 15항에 있어서, 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  18. 제 17항에 있어서, 사람 또는 사람화된 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  19. 제 17항에 있어서, 단일 사슬 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  20. 제 16항 내지 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 ADCC 활성 및 CDC 활성 중 최소한 하나의 활성을 가지는 Fc 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 Fc 영역은 단일 사슬 Fc (scFc)인 것을 특징으로 하는 항체.
  22. 제 16항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 항체; 및
    약제학적으로 허용되는 담체
    를 포함하는 약제학적 조성물.
  23. 사람 천연 킬러 (NK) 세포 활성을 증강시키는 방법으로서,
    사람 NK 세포를 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열과 최소한 90%의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드 절편을 포함하는 재조합, 막-결합된 zB7H6 폴리펩티드를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계를 포함하며,
    이때 상기 zB7H6 폴리펩티드는 사람 NKp30에 특이적으로 결합할 수 있는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 폴리펩티드 절편은 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. zB7H6을 발현하는 세포에 대하여 사람 천연 킬러 (NK) 세포 활성을 감소시키는 방법으로서,
    기능성 zB7H6을 발현하는 세포를 사람 NK 세포의 존재하에, SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 절편에 특이적으로 결합하는 항체의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하며,
    이때 상기 항체는 zB7H6과 사람 NKp30의 상호작용을 억제하는 방법.
  26. 대상에서 골수 세포 (BMC) 이종이식 거부반응을 치료하는 방법으로서,
    NK 세포 활성을 억제하여 급성 BMC 이종이식 거부반응을 치료하기에 유효한 양으로, SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 절편에 특이적으로 결합하는 항체를 대상에게 투여하는 단계를 포함하며,
    이때 상기 항체는 zB7H6과 사람 NKp30의 상호작용을 억제하는 방법.
  27. 제 25항 또는 제 26항에 있어서, 항체는 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 항체는 사람 또는 사람화된 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 27항에 있어서, 항체는 단일 사슬 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. zB7H6과 NKp30의 상호작용의 길항체에 대한 선별방법으로서,
    (a) NKp30 폴리펩티드의 존재하에 제제를 zB7H6 폴리펩티드와 접촉시키는 단계;
    (b) zB7H6 폴리펩티드와 NKp30 폴리펩티드의 상호작용의 정도를 검출하는 단계; 및
    (c) 단계 (b)에서 측정된 zB7H6/NKp30 상호작용의 수준이 제제의 부재시에 대조 zB7H6 및 NKp30 폴리펩티드에 대해 측정된 상호작용의 수준과 비교하여 유의있게 더 적은지를 측정하고, 그로써 만약 zB7H6/NKp30 상호작용의 수준이 더 적다면 제제는 zB7H6과 NKp30의 상호작용의 길항체로서 확인되는 단계
    를 포함하는 방법.
  31. zB7H6과 NKp30의 상호작용의 아고니스트에 대한 선별방법으로서,
    (a) NKp30 폴리펩티드의 존재하에 제제를 zB7H6 폴리펩티드와 접촉시키는 단계;
    (b) zB7H6 폴리펩티드와 NKp30 폴리펩티드의 상호작용의 정도를 검출하는 단계;
    (c) 단계 (b)에서 측정된 zB7H6/NKp30 상호작용의 수준이 제제의 부재시에 대조 zB7H6 및 NKp30 폴리펩티드에 대해 측정된 상호작용의 수준과 비교하여 유의있게 더 큰지를 측정하고, 그로써 만약 zB7H6/NKp30 상호작용의 수준이 더 크다면 제제는 zB7H6과 NKp30과의 상호작용의 아고니스트로서 확인되는 단계
    를 포함하는 방법.
  32. SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 절편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하며, 상기 항체는 세포독성제에 포합된 항체-약물 포합체(conjugate).
  33. 제 32항에 있어서, 항체는 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 항체-약물 포합체.
  34. 제 33항에 있어서, 항체는 사람 또는 사람화된 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 항체-약물 포합체.
  35. 제 33항에 있어서, 항체는 단일 사슬 항체인 것을 특징으로 하는 항체-약물 포합체.
  36. 제 32항에 있어서, 세포독성제는 항-튜불린제, DNA 마이너 그루브 결합제, DNA 마이너 그루브 알킬화제, 듀오카르마이신, 및 퓨로마이신으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체-약물 포합체.
  37. 제 36항에 있어서, 항-튜불린제는 돌라스타틴, 빈카 알카로이드, 포도필라톡신, 탁산, 박카틴 유도체, 크립토파이신, 마이탄시노이드, 및 콤브레타스타틴으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체-약물 포합체.
  38. 제 32항에 있어서, 항체는 세포독성제에 링커를 통해 포합된 것을 특징으로 하는 항체-약물 포합체.
  39. 제 38항에 있어서, 링커는 세포내 조건하에서 절단가능한 것을 특징으로 하는 항체-약물 포합체.
  40. 제 39항에 있어서, 절단가능한 링커는 세포내 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩티드 링커인 것을 특징으로 하는 항체-약물 포합체.
  41. 제 40항에 있어서, 세포내 프로테아제는 리소솜 프로테아제 또는 엔도솜 프로테아제인 것을 특징으로 하는 항체-약물 포합체.
  42. 제 40항에 있어서, 펩티드 링커는 디펩티드 링커인 것을 특징으로 하는 항체-약물 포합체.
  43. 제 42항에 있어서, 디펩티드 링커는 val-cit 링커 또는 phe-lys 링커인 것을 특징으로 하는 항체-약물 포합체.
  44. 제 39항에 있어서, 절단가능한 링커는 5.5 미만의 pH에서 가수분해가능한 것을 특징으로 하는 항체-약물 포합체.
  45. 제 44항에 있어서, 가수분해가능한 링커는 히드라존 링커인 것을 특징으로 하는 항체-약물 포합체.
  46. 제 39항에 있어서, 절단가능한 링커는 이황화 링커인 것을 특징으로 하는 항체-약물 포합체.
  47. 제 32항 내지 제 46항 중 어느 한 항의 항체-약물 포합체; 및
    최소한 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  48. zB7H6-발현 세포를 포함하는 세포 집단 내에서 zB7H6-발현 세포의 성장을 격감시키거나 억제하는 방법으로서,
    상기 zB7H6-발현 세포를 유효량의 제 32항 내지 제 46항 중 어느 한 항의 항체-약물 포합체와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  49. 대상에서 zB7H6-발현 암을 치료하는 방법으로서,
    대상에게 유효량의 제 32항 내지 제 46항 중 어느 한 항의 항체-약물 포합체를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  50. 제 49항에 있어서, zB7H6-발현 암은 결장암, 간암, 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 또는 전립선암인 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 49항에 있어서, zB7H6-발현 암은 원시혈구 백혈병, B-세포 림프종, 단핵 림프종, 적혈구성 백혈병, 버킷 림프종, 또는 만성 골수성 백혈병인 것을 특징으로 하는 방법.
  52. zB7H6-발현 세포에 대하여 항체 의존성 세포의 세포독성 (ADCC)을 유도하는 방법으로서,
    상기 zB7H6-발현 세포를 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 절편에 특이적으로 결합하는 항체의 유효량과 접촉시키는 것을 포함하고,
    이때 상기 접촉은 ADCC 활성을 가지는 Fc 수용체를 발현하는 NK 세포 또는 CD8+ T 세포의 존재하에 이루어지며,
    항체는 상기 Fc 수용체에 결합할 수 있는 Fc 영역을 포함하는 방법.
  53. 제 52항에 있어서, 항체는 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 53항에 있어서, 항체는 사람 또는 사람화된 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 53항에 있어서, 상기 항체는 단일 사슬 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 52항 내지 제 55항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역은 단일 사슬 Fc (scFc)인 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 52항 내지 제 56항 중 어느 한 항에 있어서, zB7H6-발현 세포는 암세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 57항에 있어서, 암세포는 결장암 세포, 간암 세포, 자궁경부암 세포, 폐암 세포, 췌장암 세포, 또는 전립선암 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 57항에 있어서, 암세포는 원시혈구 백혈병 세포, B-세포 림프종 세포, 단핵 림프종 세포, 적혈구성 백혈병 세포, 버킷 림프종 세포, 또는 만성 골수성 백혈병 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  60. zB7H6-발현 세포에 대하여 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 유도하는 방법으로서,
    zB7H6-발현 세포를 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 절편에 특이적으로 결합하는 항체의 유효량과 접촉시키는 것을 포함하고,
    이때 상기 접촉은 보체의 존재하에 이루어지며,
    항-zB7H6 항체는 CDC 활성을 가지는 Fc 영역을 포함하는 방법.
  61. 제 60항에 있어서, 항체는 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제 61항에 있어서, 항체는 사람 또는 사람화된 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제 61항에 있어서, 항체는 단일 사슬 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 60항 내지 제 63항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역은 단일 사슬 Fc (scFc)인 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 60항 내지 제 64항 중 어느 한 항에 있어서, zB7H6-발현 세포는 암세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제 65항에 있어서, 암세포는 결장암 세포, 간암 세포, 자궁경부암 세포, 폐암 세포, 췌장암 세포, 또는 전립선암 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제 65항에 있어서, 암세포는 원시혈구 백혈병 세포, B-세포 림프종 세포, 단핵 림프종 세포, 적혈구성 백혈병 세포, 버킷 림프종 세포, 또는 만성 골수성 백혈병 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 대상에서 zB7H6-발현 암을 치료하는 방법으로서,
    대상에게 SEQ ID NO:2의 잔기 25 내지 266에 표시된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 절편에 특이적으로 결합하는 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하고,
    이때 항체는 ADCC 활성 및 CDC 활성 중 최소한 하나의 활성을 가지는 Fc 영역을 포함하는 방법.
  69. 제 68항에 있어서, 항체는 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제 69항에 있어서, 항체는 사람 또는 사람화된 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제 69항에 있어서, 항체는 단일 사슬 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 제 68항 내지 제 71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 영역은 단일 사슬 Fc (scFc)인 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 제 68항 내지 제 72항 중 어느 한 항에 있어서, zB7H6-발현 암은 결장암, 간암, 자궁경부암, 폐암, 췌장암 또는 전립선암인 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 제 68항 내지 제 72항 중 어느 한 항에 있어서, zB7H6-발현 암은 원시혈구 백혈병, B-세포 림프종, 단핵 림프종, 적혈구성 백혈병, 버킷 림프종, 또는 만성 골수성 백혈병인 것을 특징으로 하는 방법.
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