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KR20080012825A - 표적 세포가 치료적 및 예방적 핵산에 지속 노출되게 하는국소 투여 - Google Patents

표적 세포가 치료적 및 예방적 핵산에 지속 노출되게 하는국소 투여 Download PDF

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KR20080012825A
KR20080012825A KR1020077019150A KR20077019150A KR20080012825A KR 20080012825 A KR20080012825 A KR 20080012825A KR 1020077019150 A KR1020077019150 A KR 1020077019150A KR 20077019150 A KR20077019150 A KR 20077019150A KR 20080012825 A KR20080012825 A KR 20080012825A
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KR
South Korea
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nucleic acid
pharmaceutical composition
vector
cancer
promoter
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Withdrawn
Application number
KR1020077019150A
Other languages
English (en)
Inventor
피터 클라크
서닐 채다
케르스틴 메난더
로버트 소벌
슈유안 장
Original Assignee
인트로겐 테라페티스, 인코퍼레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 인트로겐 테라페티스, 인코퍼레이티드 filed Critical 인트로겐 테라페티스, 인코퍼레이티드
Publication of KR20080012825A publication Critical patent/KR20080012825A/ko
Withdrawn legal-status Critical Current

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Abstract

고체 또는 반고체 제형에 포함되거나 경피 또는 피부통과 전달 장치에 포함된 핵산을 포함하는, 피험체의 과다증식 병변의 성장을 예방 또는 억제하는 조성물 및 방법이 개시된다. 또한, 접착제를 포함하는, 피험체의 과다증식 병변의 성장을 예방 또는 억제할 수 있는 핵산 조성물이 개시된다. 또한, 핵산 흡수 증강제를 포함하는, 피험체의 과다증식 병변의 성장을 예방 또는 억제할 수 있는 핵산의 조성물이 개시된다. 이러한 치료적 조성물 및 장치를 수반하는 피험체의 과다증식 병변의 성장을 예방 또는 억제하는 방법도 개시된다.
국소 투여, 치료적 핵산, 진단적 핵산, 경피 전달, 과다증식 병변

Description

표적 세포가 치료적 및 예방적 핵산에 지속 노출되게 하는 국소 투여{Topical administration permitting prolonged exposure of target cells to therapeutic and prophylactic nucleic acids}
본 출원은 전문이 모두 본 발명에 참고인용되는, 2005년 1월 21일 출원된 미국 가특허출원 60/645,826, 및 2005년 6월 21일 출원된 미국 가특허출원 60/692,481에 관련된 것이다.
본 발명은 일반적으로 유전자 전달, 유전자 요법, 약리학 및 약학 분야에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 피험체의 질환을 검출, 예방 또는 치료하기 위해 투여될 수 있는 핵산의 신규 약제학적 조성물, 및 이러한 약제학적 조성물을 이용하여 질환을 검출, 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 약제학적 조성물은 피험체의 신체 표면, 예컨대 피부 표면이나 점막 표면에 국소 적용하기 위해 액체, 반고체 또는 고체로 제형화된다. 또한, 본 발명은 진단적 또는 치료적 핵산을 전달하는 경피 또는 피부통과 전달 장치, 및 이러한 장치를 이용하여 피험체의 질환을 진단, 예방 및 치료하는 방법에 관한 것이다.
유전자 전달은 피험체의 특정 표적 세포로 특정 유전자를 전달하는 것을 수반하는 비교적 새로운 기법이다. 치료적 목적의 유전자 전달(즉, 유전자 요법)은 피험체의 표적 세포에 치료적 유전자의 전달을 수반한다. 처음에는 단일 유전자 장애의 치료법으로서 계획되었지만, 유전자 요법 시도의 대부분은 암 및 혈관 질환의 치료에 관한 것이다.
암은 미국 등에서 사망의 주요 원인이기 때문에 암의 유전자 요법의 동정은 지대한 관심을 받고 있다. 암과 관련된 높은 이환율 및 사망률의 주요 원인은 현행 진단 및 치료적 방법에 상당한 제한이 있다는 사실이다.
많은 진단적 방법이 이용가능하며, 그 예에는 육안 조사(예, 피부 병변을 확인하는 신체 검사 및 결장암을 확인하는 결장내시경술), 유방조영술, CT 및 MRI와 같은 조영 연구, 및 혈액 검사(예, 전립선암의 마커로서 PSA)가 있다. 이러한 방법들은 질환의 작은 병소를 종종 확인하지 못하는 경우가 있다. 다른 경우에는 질환이 진단 시기에 너무 진행되어 있기도 한다.
통상적인 암 치료법에는 수술, 화학요법 및/또는 방사선 조사가 있다. 이러한 치료법들은 종종 성공적이지 않다: 수술은 모든 암을 제거할 수 없고; 일부 암은 화학요법과 방사선요법에 내성이 있으며; 화학요법 내성 종양이 흔히 발생하기도 한다.
유전자요법은 암 치료의 희망을 제시했다. 암 치료에서 유전자요법의 목표는 세포 증식의 정상적인 제어의 복구 또는 이상 증식을 겪는 세포의 제거이다. 생체내 유전자 변형이 치료적 이점을 유도할 수 있는 전략은 다양하다. 이러한 전략의 예에는 이상 세포에 대한 면역원성의 증강, 이상 표현형을 유도하는 유전자 결함의 교정, 및 수용체 세포에 독성이거나 독성이 될 수 있는 산물을 생산하는 유전자의 전달이 있다.
암의 유전자 요법으로 간주될 수 있는 치료 유전자 부류의 예로는 종양 억제인자 유전자가 있다. 종양 억제인자 유전자는 정상적으로는 세포 증식을 억제하지만, 돌연변이로 불활성화되거나 소실되면 세포가 통제 없이 증식할 수 있게 하는 유전자이다. 가장 잘 알려진 종양 억제인자 유전자의 하나는, DNA 손상에 대한 반응으로 회복이나 아폽토시스가 일어날 수 있도록 증식을 저지하는, 세포 주기 진행에서 중추적인 역할을 하는 p53이다. 또한, DNA 손상이 회복될 수 없는 것으로 입증되면 아폽토시스를 개시시킬 수도 있다.
세포 주기 진행의 제어를 복원시키는데 사용되는 유전자에 관계없이, 이 시도의 이론적 근거 및 실제 적용능은 동일하다. 즉, 치료적 함량의 재조합 산물을 발현시키기 위해 높은 유전자 전달 효율을 달성하는 것이다.
암이나 다른 질환의 성공적인 유전자 요법의 1가지 관점은 이상 세포의 상당한 비율에 영향을 미치는 능력이다. 이러한 목적에는 바이러스 벡터가 이용된다. 재조합 아데노바이러스는 레트로바이러스 및 다른 유전자 전달 방법에 비해 독특한 장점을 갖고 있다(Siegfried, 1993). 아데노바이러스는 사람에서 종양을 유도하는 것으로 밝혀진 적이 없어서, 생백신으로서 안전하게 사용되고 있다(Straus, 1984). 복제 결손성 재조합 아데노바이러스는 복제에 필수적인 E1 영역을 표적 유전자로 치환시켜 제조할 수 있다. 아데노바이러스는 감염의 일반적인 결과로서 사람 게놈 에 통합되지 않아서, 삽입 돌연변이유발의 위험을 크게 감소시킨다. 안정한 고역가 재조합 아데노바이러스는, 대규모 환자 집단을 치료하는데 충분한 물질이 생산되도록 제조될 수 있다. 더욱이, 아데노바이러스 벡터는 광범위한 조직 및 종양 세포 종류에 매우 효율적인 생체내 유전자 전달을 수행할 수 있다.
바이러스 벡터가 다른 방식의 유전자 전달 매체보다 여러 가지 장점을 제공하기는 하지만, 생체내에서 효율적인 사용을 제한하는 몇가지 특징을 나타낸다. 이러한 제한들은 주로 치료 유전자를 이상 세포로 효율적으로 전달하고 표적화하는 벡터의 능력을 제한한다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 표적 세포를 포함하는 영역에 다량의 바이러스 벡터를 직접 주사하는 시도가 이루어졌다. 현재 사용되는 바이러스 벡터의 국소 투여는 표적 세포 영역에 약 1 x 1012 바이러스 입자를 주사한다. 그러나, 불행히도 이러한 물질의 많은 비율은 주사 영역에 보유되지 않고 순환계 및 림프계를 통해 빠르게 제거되므로, 표적 세포의 감염이 이루어지지 않는다.
바이러스 매개의 유전자 전달 시스템 외에도, 여러 가지 비-바이러스적 유전자 전달 방식이 있다. 비바이러스적 시도 중 하나는 치료적 유전자를 운반할 리포좀의 사용을 수반한다. 또 다른 시도는, 용도가 제한적이기는 하나, 표적 세포에 치료적 DNA를 직접 도입하는 것이다.
치료법 형태로서의 유전자 전달 외에도, 조영술에서 유전자 전달을 적용한 몇 가지 연구도 있다. 지난 10년 동안 개발된 조영술의 새로운 형태는 리포터 유전자의 원위치(in situ) 또는 생체내(in vivo) 조영술을 수반한다. 리포터 유전자 기 술은 조직 절편의 원위치 조영술에 최초로 적용되었다(Blasberg et al., 2003). 예를 들어, 후퍼 등(1990)은 단일 포유동물 세포에서 루시퍼라제 유전자 발현의 조영술에 대해 개시했다. 리포터 조영술은 자기 공명, 핵 조영술(PET, 감마 카메라) 및/또는 생체내 광학 조영 시스템을 기반으로 하는 것으로 설명되어 있다(Blasberg et al., 2003). 예를 들어, 헤르페스 단순 바이러스-1 티미딘 키나제 또는 도파민 수용체 타입-2의 전달은 양전자방출단층촬영술(PET)로 검출되었다(Alauddin et al., 1996; Alauddin and Conti, 1998; Gambhir et al., 1998; MacLaren et al., 1999; Tjuvajev et al., 1998). 이에 반해, 요오드화나트륨 공동수송인자(symporter)의 전달(Mandell, 1999), 도파민 수송인자(Auricchio et al., 2003), 또는 소마토스타틴 수용체 타입-2(Kundra, 2002; Sun et al., 2001)의 전달은 감마 카메라 조영술로 검출되었다. 하지만, 아직도 이러한 방법 중 어느 방법이 사람 질환을 진단하는데 적용될 수 있는지를 결정해야 하는 것이 과제로 남아있다.
따라서, 암과 같은 질환의 진단 및 치료에서 유전자 전달을 위한 새롭고 개선된 조성물 및 방법은 여전히 필요한 상황이다. 예를 들어, 적당한 표적 세포와 핵산을 장기간 접촉시키는 치료적 핵산 조성물은 제형의 치료 효능을 향상시킬 수 있다. 피험체의 질환 세포에 리포터 유전자를 전달하는 방법은 질환 세포를 표적화하고 검출하는 더욱 개선된 능력을 제공할 수 있을 것이다.
발명의 개요
본 발명자들은 핵산의 특정 신규 제형 및 이 조성물을 질환의 진단, 치료 및 예방에 적용하는 방법을 동정했다. 본 명세서에 제시된 제형의 핵산은 질환의 진단, 예방 또는 치료에 사용될 수 있는 임의의 핵산일 수 있다. 예를 들어, 핵산은 피험체의 과다증식 병변의 증식을 치료하거나 상처 치유를 촉진할 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산일 수 있다.
이러한 핵산의 신규 제형은 피험체의 표적 세포로 당해 핵산의 더욱 효과적 전달 및 표적화를 촉진한다. 예를 들어, 조성물의 일부는 당해 표적 세포와 치료적 핵산이 장기간 접촉될 수 있도록 접착제(adhesive)와 배합되기도 한다.
또한, 본 발명자들은 진단적 또는 치료적 핵산 서열을 전달하기 위한 새로운 경피 또는 피부통과 전달 장치를 발견했다. 예를 들어, 이러한 장치는 피험체의 과다증식 병변의 증식을 억제할 수 있는 단백질을 암호화하는 핵산을 전달하도록 설계될 수 있다.
또한, 유전자 요법으로 처리될 수 있는 질환의 진단, 예방 또는 치료에 상기 신규 제형 및 장치를 적용하는 방법도 발견했다.
더 상세하게는, 본 발명의 특정 양태는 일반적으로 피험체의 표면에 적용하기 위해 배합되는 치료적 핵산 및/또는 진단적 핵산을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 피험체는 포유동물 또는 조류 종과 같은 임의의 피험체일 수 있다. 특정 양태에 따르면, 피험체는 암을 보유한 사람과 같은 사람일 수 있다.
피험체의 표면은 임의의 표면일 수 있다. "표면"이란 용어는 생물학적 유기체의 상황에서 일상적이고 명백한 의미에 따라 사용된 것으로서, "동물 신체의 외측 또는 이의 임의의 일부; 외피의 외측 경계; 중공 또는 관형 부분의 내측 경계" 를 의미한다. 예를 들어, 표면은 피부 표면, 점막 표면, 병변 표면, 상처 표면 또는 속빈 내장 표면일 수 있다. 피부 표면은 정상 피부이거나 또는 피부 병변, 예컨대 피부암(예, 기저세포 암종, 편평세포 암종)의 표면일 수 있다. 점막 표면은 신체의 임의의 점막 표면, 예컨대 구강 표면, 식도 표면, 폐점막 표면, 위, 십이지장, 소장, 대장, 결장, 직장, 질 또는 방광의 표면일 수 있다. 점막 표면은 정상 점막이거나 또는 구강 백색판증, 결장 용종 또는 종양과 같은 점막 병변의 표면일 수 있다. 병변 표면은 양성, 전암성 또는 악성 여부에 관계없이 임의의 병변일 수 있다. 표면은 외상 상처 또는 종양의 수술 절제 후의 상처와 같은 수술후 상처의 상처 표면일 수 있다. 표면은 내부 기관의 표면, 예컨대 위장관 표면, 방광, 질, 경부 또는 자궁의 표면일 수 있다. 표면은 이하에 상세히 설명되는 바와 같이 기저 조직으로의 더욱 효과적인 전달을 위해 연마와 같이 전처리된 것일 수 있다. 표면에 적용하기 위한 제형은 이 제형이 이후에 정맥내 투여와 같은 다른 수법으로 적용하기에 적합하지 않은 것으로 밝혀질 수 있는 것을 의미하지는 않는다. 또한, 본 명세서에 제시된 특정 핵산 제형은 상처 표면과 같은 한 표면에 그 제형을 적용하기에 적합하고, 위장 표면과 같은 다른 표면에는 적용하기에 적합하지 않을 수 있는 것으로 생각되어야 한다.
핵산은 임의의 종류가 본 명세서에 제시된 조성물 및 장치에 포함되는 것으로 생각되어야 하며, 그 예로는 DNA, RNA의 모든 종류, 예컨대 siRNA, RNAi, 마이크로RNA, 리보자임 및 CpG 올리고뉴클레오타이드가 있다.
본 명세서에 정의된 "치료적 핵산"은 질환 또는 건강 관련 상태의 치료 또는 예방에 유익한 것으로 공지되거나 생각되는 핵산을 의미한다. 예를 들어, "치료적 핵산"은 질환이나 건강 관련 상태의 치료 또는 예방에 유익한 것으로 공지되거나 생각되는 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산일 수 있다. 또한, "치료적 핵산"의 정의에는 질환이나 건강 관련 상태의 치료에 유익한 것으로 공지되거나 생각되는 제2 핵산을 전사시키는 핵산이다(예, 리보자임 또는 siRNA로 전사되는 DNA). 대안적으로, "치료적 핵산"은 전사 없이 치료적 이점을 제공하는 것으로 공지되거나 생각되는 것일 수 있다(예, siRNA 또는 리보자임).
치료적 이점은 예를 들어, 핵산에 의해 특정 유전자 또는 유전자들의 발현 변경의 결과로서 나타날 수 있다. 특정 유전자 또는 유전자들의 발현 변경은 특정 유전자의 발현 억제 또는 증대일 수 있다. 본 발명의 특정 양태에 따르면, 치료적 핵산은 피험체의 질환 또는 건강 관련 상태의 치료 또는 예방에 적용될 수 있는 1종 이상의 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화한다.
"질환"은 감염, 유전자 결함 또는 환경적 스트레스와 같은 임의의 원인 유래의 신체 부분 또는 기관 또는 시스템의 병리학적 상태로서 정의된다. 본 명세서에서 정의되는 "건강 관련 상태"란 용어는 병리학적이지는 않지만, 치료가 추구되어야 하는 신체 부분, 기관 또는 시스템의 상태를 의미한다. 그 예에는 미용 요법이 추구되는 상태로서, 예컨대 피부 주름, 피부 결점 등이 있다. 질환은 임의의 질환일 수 있고, 이의 비제한적 예에는 암 및 전암성 병변와 같은 과다증식 질환, 상처 및 감염 등이 있다.
"예방" 및 "예방하는"이란 용어는 "앞서 작용하는" 또는 그러한 작용을 의미 하는 통상적이고 명백한 의미에 따라 사용된다. 특정 질환 또는 건강 관련 상태의 상황에서, 상기 용어들은 질환 또는 건강 관련 상태의 발생을 차단하기 위한 목적으로 피험체에 제제, 약물 또는 치료의 투여 또는 적용하거나, 또는 피험체에 절차 또는 기법을 수행하는 것을 의미한다.
치료적 핵산은 치료적 단백질, 예컨대 종양 억제인자, 아폽토시스 유도(proapoptotic) 단백질(아폽토시스를 촉진하는 단백질을 의미), 사이토카인, 성장인자, 호르몬, 종양 항원 또는 효소를 암호화할 수 있다. 종양 억제인자 유전자의 예에는 mda7, APC, CYLD, HIN-I, KRAS2b, pl6, p19, p21, p27, p27mt, p53, p57, p73, PTEN, Rb, 우테로글로빈(Uteroglobin), Skp2, BRCA-I, BRCA-2, CHK2, CDKN2A, DCC, DPC4, MADR2/JV18, MENl, MEN2, MTSl, NFl, NF2, VHL, WRN, WTl, CFTR, C-CAM, CTS-1, zacl, ras, MMACl, FCC, MCC, FUS1, Gene 26 (CACNA2D2), PL6, Beta*(BLU), Luca-1(HYAL1), Luca-2(HYAL2), 123F2(RASSFl), 101F6, Gene 21(NPRL2) 또는 SEM A3 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자가 있다. 특정 양태에 따르면, 종양 억제인자는 p53 및/또는 FUS1이다. 아폽토시스 유도 유전자의 예에는 CD95, 카스파제-3, Bax, Bag-1, CRADD, TSSC3, bax, hid, Bak, MKP-7, PARP, bad, bcl-2, MSTl, bbc3, Sax, BIK, 및 BID가 있다. 사이토카인의 예에는 GM-CSF, G-CSF, IL-lα, IL-lβ, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-IO, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TGF-β, TNF-α, TNF-β, PDGF, TGF-α, TGF- β, VEGF 및 mda7이 있다. 특정 양태에 따르면, 사이토카인은 mda7이다.
핵산은 종양 항원을 암호화할 수 있다. 종양 항원은 당업자에게 공지된 임의의 종양 항원일 수 있다. 종양 항원의 예에는 MelanA (MART-I), gplOO(Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pl5(58), CEA, RAGE, NY-ESO(LAGE), SCP-I, Hom/Mel-40, PRAME, p53, H-Ras, HER-2/neu, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, 엡스타인 바 바이러스 항원(Epstein Barr virus antigens), EBNA, 사람 유두종바이러스(HPV) 항원 E6 및 E7, TSP-180, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6 및 MAGE 유전자 패밀리의 다른 멤버, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, mn-23H1, PSA, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, β-카테닌, CDK4, Mum-1, pl6, TAGE, PSMA, PSCA, CT7, 텔로머라제, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아단백질(alpha-fetoprotein), β-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3(CA 27.29＼BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼KP1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733(EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90(Mac-2 결합 단백질＼사이클로필린 C 연관 단백질), TAAL6, TAG72, TLP, TPS, INGl, 마마글로빈, 사이클린 B1, SlOO, BRCA1, BRCA2, 종양 면역글로불린 이디오타입(idiotype), 종양 T-세포 수용체 클론형(clonotype), MUC-1, 또는 표피 성장인자 수용체, 종양 억제인자, 또는 전술한 종양 연관 항원 중 임의의 항원의 펩타이드, 종양유전자 또는 pep가 있다. 핵산은 종양 억제인자 유전자, 또는 종양유전자 또는 종양억제인자 유전자의 야생형 또는 돌연변이 형태를 포함할 수 있다. 종양 항원의 예에는 염색체 전위 또는 종양유전 자/종양 억제인자 유전자 돌연변이에 의해 형성된 항원(예, bcr/abl, ras); 발달/분화 항원(예, MUC-1, MAGE, 티로시나제, melan-A 및 gp75); 악성 형질전환에서 상향조절된 항원(종양태아성 항원-암배아 항원/CEA, 알파-태아단백질/AFP, 성장인자 수용체-Her2/neu, 테롤머라제 및 p53) 및 종양 발병기전과 연관 있는 바이러스 항원(간염, 유두종 및 엡스타인 바 바이러스) 및 디(MUC-1, Melan-A)가 있다.
성장인자의 예에는 표피 성장인자, 각질세포 성장인자 및 간세포 성장인자가 있다. 또 다른 치료적 단백질, 예컨대 호르몬 및 효소의 예는 이하 상세한 설명에서 논한다. 특히 본 문단에 제시된 임의의 단백질은 본 발명의 일부로 간주될 수 있는 것으로 생각되어야 하고; 또한 이러한 단백질의 하나 이상은 일부 양태에서는 본 발명의 일부로 간주되지 않아야 하는 것으로 생각되어야 한다.
"진단적 핵산"은 질환 또는 건강 관련 상태의 존재 또는 부재를 확인하는 데 있어서 유익한 것으로 공지되거나 생각되는 핵산, 또는 특정 질환 또는 건강 관련 상태를 발생시킬 위험이 있는 피험체를 동정하는데 있어서 유익한 것으로 공지되거나 생각되는 핵산이다. 또한, "진단적 핵산"의 정의에는 1 이상의 리포터 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 포함된다. "리포터 단백질"은 세포 또는 조직에 존재할 때, 세포에 존재하는 다른 유전자 서열 또는 암호화된 폴리펩타이드로부터 구별될 수 있고 검출될 수 있는 아미노산 서열을 의미한다. 리포터 단백질은 자연발생의 단백질 또는 자연발생이 아닌 단백질일 수 있다. 자연발생인 경우, 이 단백질은 유전자 전이 후 발현 양의 결과로서 검출할 수 있거나, 또는 검출성 태그가 부착될 수 있는 단백질일 수 있다. 이러한 리포터 단백질의 예에는 형광성 단백질, 예컨대 녹색 형광성 단백질(gfp), 청록색 형광성 단백질(cfp), 적색 형광성 단백질(rfp) 또는 청색 형광성 단백질(bfp), 또는 이러한 단백질들의 유도체, 또는 효소 단백질, 예컨대 β-갈락토시다제, 화학발광성 단백질, 예컨대 루시퍼라제, 소마토스타틴 수용체 아미노산 서열, 요오드화나트륨 공동수송인자 아미노산 서열, 루시퍼라제 아미노산 서열 및 티미딘 키나제 아미노산 서열이 있다. 이러한 리포터 단백질 및 다른 리포터 단백질은 이하 상세한 설명에서 더 상세히 논의된다.
본 명세서에서 제시되는 신규 약제학적 조성물의 일부는 제제가 수성 제형인 치료적 핵산 및/또는 진단적 핵산의 조성물에 속한다. 수성 제형의 예에는 구강청정제(mouthwash), 구강세정제(mouthrinse), 세척제, 관장제, 분무제 및 에어로졸이 있다.
또 다른 제형에는 분산제, 에멀젼, 마이크로에멀젼, 현탁제, 매트릭스, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 에멀젼, 마이크로에멀젼 또는 분산제가 있다.
다른 조성물은 고체 또는 반고체로서 제형화된다. 고체 및 반고체 제형은 수성 제형 외에 다른 임의의 제형을 의미한다. 특정 양태에 따르면, 고체 또는 반고체는 경구 투여용과 같은 환제 또는 정제는 아닌 것으로 생각되어야 한다. 그 예에는, 겔, 매트릭스, 포옴, 크림, 연고, 로젠지(lozenge), 롤리팝(lollipop), 팝시클(popsicle), 검(gum), 분말, 겔 스트립, 필름, 하이드로겔, 용해성 스트립, 페이스트, 치약 또는 고형 스틱이 있다. 특정 양태에 따르면, 본 발명은 로젠지, 롤리팝, 팝시클, 검, 겔 스트립, 필름, 하이드로겔, 용해성 스트립 또는 고형 스틱 중 하나 이상을 특별하게 포함하는 것은 아니다.
고체 또는 반고체 제형과 관련하여, 고체 또는 반고체인 본 발명의 약제학적 조성물의 임의의 제형은 본 발명에 포함되는 것으로 간주되어야 한다. 이것은 본 명세서의 다른 부분에서 상세히 설명되고 있다. 제형은 이하에 상세히 논의되는 바와 같은 임의의 수의 추가 부형제를 포함할 수 있다. 그 예에는 콜라겐, 글리세린, PEG, 수화 실리카, 셀룰로스, 크산툼 검(xanthum gum), 글리칸 카보머(glycan carbomer) 956, Tween 80, 불소화물, 카라기난(Carrageenan), 접착제 및/또는 핵산 흡수 증강제가 있다. 일부 양태에 따르면, 부형제는 또한 이하에 상세히 논의되는 바와 같은 미용 성분을 포함할 수도 있다.
이하에 상세히 논의되는 바와 같이, 본 명세서에 제시된 약제학적 조성물은 추가적인 치료제 및/또는 진단제를 임의의 수로 포함할 수 있다. 그 예에는 추가 치료제, 제산제 및 알긴산염 래프트(raft) 형성 성분이 있다.
임의의 특정 양태에 따르면, 약제학적 조성물은 이 조성물이 로젠지, 롤리팝, 팝시클, 검, 겔 스트립, 필름, 하이드로겔, 용해성 스트립, 크림, 고약, 좌약 또는 고형 스틱으로 제형화된 치료적 및/또는 진단적 핵산을 포함한다.
본 명세서에 제시된 치료적 및/또는 진단적 핵산의 약제학적 조성물은 추가로 1종 이상의 접착제를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 정의된 "접착제"는 일반적으로 핵산과 표면의 접촉을 촉진 또는 용이하게 하거나, 또는 한 표면과 다른 표면의 접촉을 촉진하거나 용이하게 하는 제제 또는 제제의 조합을 의미한다. 약제학적 목적으로 적합한 당업자에게 공지된 임의의 접착제는 본 발명의 약제학적 조성물 및 장치에 포함될 수 있는 접착제로서 생각되어야 한다. 예를 들어, 접착제는 아크 릴레이트, 하이드로콜로이드, 하이드로겔, 폴리아크릴산계 겔 매트릭스, 폴리이소부틸렌, 실리콘 중합체 또는 이의 혼합물일 수 있다. 접착제는 이하 상세한 설명에 상세히 설명된다. 아크릴레이트 접착제의 예로는 시아노아크릴레이트, 메타크릴레이트 또는 알킬 아크릴레이트가 있다.
당업자에게 공지된 임의의 핵산 흡수 증강제는 본 명세서에 제시된 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 것으로 생각되어야 한다. 본 명세서에서 정의된 "핵산 흡수 증강제"는 세포 표면에 적용될 수 있거나, 또는 세포 외부에 있는 핵산의 흡수를 촉진하기 위해 세포 표면에 접촉할 수 있는 임의의 제제 또는 1종 이상의 제제의 조성물을 의미한다. 양이온성 지질의 예에는 4급 사이토펙틴, 비스-구아니디늄-트렌-콜레스테롤 및 1,2-디올레오일-3-(트리메티암모늄)프로페이트(DOTAP)가 있다. 이러한 제제는 이하 상세한 설명에서 더 자세히 설명된다.
일부 양태에 따르면, 고체 또는 반고체 약제학적 조성물은 미용품으로서 제형화된다. 미용품은 립스틱, 고약, 크림, 페이스트, 겔 또는 로션의 형태일 수 있다. 또 다른 부형제, 예컨대 착색제도 포함될 수 있으며, 그 예로는 왁스, 오일, 습윤제, 보존제, 항산화제, 자외선 흡수제, 자외선 산란제, 중합체, 표면활성제, 착색제, 안료, 분말, 약물, 알콜, 용매, 향료 또는 향미제가 있다.
약제학적 조성물은 치약으로 제형화될 수 있고, 이때 치약에 일반적으로 존재하는 불소화물, 착향제, 미백제와 같은 1종 이상의 추가 제제를 포함할 수 있다.
일부 다른 양태에 따르면, 약제학적 조성물은 검으로 제형화될 수 있다. 검은 츄잉검일 수 있다. 또 다른 부형제, 예컨대 감미제 및 착향제도 제형에 포함될 수 있다. 일부 양태에 따르면 검은 크산툼 검을 포함한다.
본 발명의 일부 양태에 따르면, 약제학적 조성물은 동결건조된 것이다. 당업자는 동결건조를 잘 알고 있을 것이다.
핵산은 이 핵산에 작동가능하게 결합된 프로모터를 포함하고, 이 프로모터가 피험체의 세포에서 활성인 발현 카세트에 포함될 수 있다. 발현 카세트는 바이러스 벡터에 운반될 수 있다. 당업자는 이용할 수 있는 많은 종류의 바이러스 벡터를 잘 알고 있을 것이다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 파르보바이러스 벡터, 세밀리키 포레스트(semiliki forest) 바이러스 벡터, 알파 바이러스 벡터, 파르보바이러스 벡터, 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 또는 폭스 바이러스(pox virus) 벡터일 수 있다. 특정 양태에 따르면, 바이러스 벡터는 p53, mda7 또는 FUS1을 암호화하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터와 같은 아데노바이러스 벡터이다. 일부 양태에 따르면, 바이러스 벡터는 종양분해성(oncolytic) 바이러스이다. 종양분해성 바이러스는 이하 상세한 설명에 자세히 설명된다. 종양분해성 바이러스의 예에는 ADP를 과발현하는 바이러스, 및 Ad5, dl327, pm734.1, dl309, dl01/07, KD1, KD2, KD3, dl1520 및 VRX-007와 같은 바이러스가 있다. 바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물은 동결건조되거나 동결건조되지 않을 수 있다.
또 다른 양태에 따르면, 치료적 및/또는 진단적 핵산을 포함하는 약제학적 조성물은 1종 이상의 전달 제제를 포함한다. 본 발명에서 정의되는 "전달 제제"는 바이러스 벡터외에, 당해 표적 세포에 핵산의 전달을 촉진하는 임의의 제제 또는 물질을 의미한다. 당업자는 이용할 수 있는 다양한 종류의 전달 제제를 잘 알고 있을 것이다. 예를 들어, 전달 제제는 지질일 수 있다. 지질은 리포좀으로 구성되거나 구성되지 않을 수 있다. 리포좀 제형은 당업계에 잘 알려져 있다. 일부 양태에 따르면, DOTAP:콜레스테롤 나노입자가 전달 제제이다.
본 발명의 조성물 및 장치의 발현 카세트는 그 프로모터가 피험체의 세포 내에서 활성인 한, 임의의 종류의 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 억압성 프로모터 또는 조직 선택적 프로모터일 수 있다. 본 명세서에서 정의되는 조직 선택적 프로모터는 다른 조직 종류에 비해 특정 조직 종류에서 비교적 더욱 활성인 임의의 프로모터를 의미한다. 따라서, 예를 들어, 간 특이적 프로모터는 신체의 다른 조직에 비해 간에서 더욱 활성인 프로모터일 수 있다. 조직 선택적 프로모터의 한 종류는 종양 선택적 프로모터이다. 본 명세서에서 정의되는 종양 선택적 프로모터는 다른 조직 종류에 비해 종양 조직에서 더욱 활성인 프로모터를 의미한다. 이 프로모터는 다른 조직 종류에서도 약간의 기능이 있을 수 있지만, 다른 조직 종류에 비해 종양 조직에서 비교적 더욱 활성이다. 종양 선택적 프로모터의 예에는 hTERT 프로모터, CEA 프로모터, PSA 프로모터, 프로바신(probasin) 프로모터, ARR2PB 프로모터 및 AFP 프로모터가 있다.
본 발명의 일부 양태에 따르면, 약제학적 조성물은 치료적 핵산 및/또는 진단적 핵산을 포함하고 겔, 페이스트, 포옴, 슬러리, 크림, 고약, 좌약 또는 분말로 제형화된 비-아데노바이러스성 조성물이다. 특정 관점에 따르면, 이 조성물은 p53, mda7 및/또는 FUS1을 암호화하는 핵산을 포함한다.
약제학적 조성물은 경피 패치, 스트립, 붕대, 테이프, 드레싱 또는 인조 피부를 통해 투여되도록 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 이하에 더 상세히 설명된다.
또한, 본 발명은 일반적으로, 리포터 단백질, 종양 억제인자, 아폽토시스 유도 단백질, 성장인자, 또는 사이토카인을 암호화하는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물과 패치를 포함하고, 이때 상기 약제학적 조성물이 상기 패치의 적어도 하나의 표면에 적용되어 있는, 피험체에 치료적 또는 진단적 제제를 전달하기 위한 경피 또는 피부통과 전달 장치에 관한 것이다. 상기 약제학적 조성물에 관한 설명은 이러한 경피 전달 장치에도 적용된다. 종양 억제인자, 아폽토시스 유도 단백질, 성장인자, 리포터 및 사이토카인의 예는 본 명세서의 다른 부분에 설명된 것이다. 전술한 바와 같이, 핵산은 이 핵산에 작동가능하게 결합되고 피험체의 세포에서 활성인 프로모터를 포함하는 발현 카세트에 포함될 수 있다. 상기 발현 카세트에 관한 설명도 본 장치에도 적용된다. 특정 양태에 따르면, 발현 카세트는 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스 벡터이다. 일부 양태에 따르면, 핵산은 p53, mda7 또는 FUS1을 암호화하는 치료적 핵산이다.
본 발명의 양태는 또한 전술한 임의의 약제학적 조성물을 피험체에게 투여함을 포함하는 피험체의 질환을 검출, 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 또 다른 양태는 본 명세서에 기술된 경피 전달 장치 중 하나 이상을 피험체의 신체 표면에 적용함을 포함하는, 피험체 질환의 검출, 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
일부 예에서, 핵산은 리포터 단백질을 암호화할 수 있고, 상기 방법은 피험체의 병변을 검출하는 방법으로 정의될 수도 있다.
질환은 임의의 질환일 수 있다. 예를 들어, 질환은 과다증식 병변일 수 있다. 과다증식 병변의 예에는 전암성 병변, 암 및 종양이 있다. 과다증식 병변, 전암성 병변 또는 암은 유방암, 폐암, 전립선암, 난소암, 뇌암, 간암, 경부암, 경부형성이상, 결장암, 신장암, 피부암, 형성이상 모반, 두경부암, 골암, 식도암, 과다각화증, 척추후만증, 지루각화증, 방광암, 자궁암, 림프암, 위암, 췌장암, 고환암, 림프종, 백혈병 또는 이와 같은 조직 또는 기관의 형성이상 병변일 수 있다. 다른 질환에는 당뇨성 궤양, 정맥 울혈궤양, 욕창궤양, 화상, 상처 및 점막염이 있다.
특정 양태에 따르면, 과다증식성 병변은 피험체의 구강에 영향을 미칠 수 있는 질환이다. 그 예에는 백색판증, 편평세포 과다형성 병변, 전암성 상피 병변, 경구 형성이상, 상피내 종양 병변, 국소 상피 과다형성 및 편평암종 병변이 있다.
피험체는 포유동물과 같은 임의의 피험체일 수 있다. 특정 양태에 따르면, 포유동물은 사람이다. 예를 들어, 사람은 전암성 병변을 보유한 환자 또는 암 환자일 수 있다. 특정 양태에 따르면, 피험체는 과다증식성 병변의 2차 치료, 예컨대 2차 항암요법을 받고 있는 피험체이다. 이러한 요법은 이하에 더 상세히 설명될 것이며, 그 예에는 수술 요법, 화학요법, 방사선요법 및 면역요법이 있다.
핵산은 치료적 핵산, 예컨대 종양 억제인자, 아폽토시스 유도 단백질, 사이 토카인 또는 성장인자를 암호화하는 핵산일 수 있다. 이 핵산은 앞에서 그리고 본 명세서의 다른 부분에서 상세히 설명한 바와 같다. 이러한 핵산은 추가로 진단적 핵산, 예컨대 전술한 바와 같은 리포터 단백질을 암호화하는 핵산일 수 있다. 다른 양태에 따르면, 치료적 핵산은 구체적으로 종양 억제인자, 아폽톱시스 유도 단백질, 사이토카인 또는 성장인자, 또는 본 명세서에서 논한 그러한 임의의 특정 단백질을 암호화하지 않는 것인 경우도 생각되어야 한다.
일부 양태에 따르면, 방법은 또한 피험체의 상처 치유를 촉진하는 방법으로서 정의되기도 한다. 이러한 양태에서, 예컨대 핵산은 전술한 바와 같은 성장인자를 암호화할 수 있다. 또 다른 양태에 따르면, 핵산은 치료적 핵산이고, 방법은 피험체의 과다증식 병변의 성장을 예방하거나 억제하는 방법으로서 정의될 수도 있다. 예를 들어, 과다증식성 병변은 피험체의 구강 형성이상 또는 백색판증일 수 있다. 방법은 추가로 질환 또는 건강 관련 상태의 검출, 치료 또는 예방을 필요로 하는 피험체의 확인 방법을 포함한다. 위험이 있는 피험체를 동정하는 방법의 예에는 이력 또는 검사를 기반으로 한 임상 선별, 의사와의 면담 또는 그러한 위험 인자를 확인하는 질문서 완성이 있다.
전술한 바와 같이, 핵산은 이 핵산에 작동가능하게 결합되어 있고 피험체의 세포에서 활성인 프로모터를 포함하는 발현 카세트에 포함될 수 있다. 특정 양태에 따르면, 발현 카세트는 아데노바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터로 운반되고, 핵산은 p53, mda7 또는 FUS1을 암호화한다.
당업자에게 공지된 약제학적 조성물을 투여하는 임의의 방법은 본 발명에 고 려될 수 있다. "투여하는"은 약제학적 조성물을 피험체에게 제공하는 것을 포함한다. 당업자라면, 약제학적 조성물이 투여될 수 있는 다양한 방식을 잘 알고 있을 것이다. 예를 들어, 투여는 피험체의 신체 표면에 제형을 국소 적용함을 포함할 수 있다. 예를 들어, 겔이나 페이스트를 적용하기 위해, 면 말단의 어플리케이터 (applicator)및 스페출러(spatula)와 같은 어플리케이터를 이용할 수 있다. 어플리케이터는 일회용이거나 아닐 수 있다. 조성물은 의료 전문가 또는 조성물이 투여되는 환자와 같은 임의의 개개인에 의해 적용될 수 있다. 또한, "투여하는"이란 용어의 정의에는 의료 전문가에 의한 처방과 같이 약제학적 조성물을 처방하는 것도 포함된다. 본 명세서에 제시된 약제학적 조성물은 일회용 또는 재활용 어플리케이터 및 약제학적 조성물을 포함하는 키트 형태일 수 있다. 이러한 키트는 의료진이나 환자가 약제학적 조성물을 적용할 수 있도록 설계될 수 있다.
본 명세서에 정의된 치료 방법은 1종 이상의 2차 치료 형태를 피험체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 2차 치료 형태는 당업자에게 공지된 임의의 형태를 포함하고, 주로 질환 과정에 따라 달라진다. 그 예는 이하 상세한 설명에 제시될 것이다.
본 명세서에 제시된 특정 핵산은 본 명세서에 제시된 모든 제형에 각각 사용할 수 없는 경우도 있다. 따라서, 예를 들어, 크림과 같은 제형에 적합한 특정 핵산은 로젠지와 같은 제형에 반드시 적합한 것은 아니다.
본 발명의 일 관점과 관련하여 논의된 모든 양태는 본 발명의 다른 관점에도 적용된다.
실시예 섹션의 양태들은 본 발명의 모든 관점에 적용가능한 본 발명의 양태인 것으로 이해되어야 한다.
청구의 범위에 사용된 용어 "또는"은 명세서에서 대안과 "및/또는" 만을 의미하는 정의가 지지될지라도, 대안만을 언급하는 분명한 표시가 없거나 대안이 상호 배타적이지 않는 한, "및/또는"을 의미하는 것이다.
본 명세서를 통해 사용된 "약"이란 용어는 값을 측정하는데 이용된 장치 또는 방법에 의한 그 값의 오류 표준편차를 포함한다는 것을 나타내는 것이다.
본 명세서에 사용된 단수적 표현은 하나 이상을 의미할 수 있다. 본 발명의 청구범위에 사용된, "포함하는"이란 용어와 함께 사용된 단수적 표현은 하나 또는 하나 보다 많은 것을 의미할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "다른"이란 용어는 적어도 제2 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 이하 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 하지만, 상세한 설명과 특정 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 나타내지만, 단지 예시를 위해 제시된 것뿐이며, 당업자에게는 본 발명의 취지와 범주에 속하는 다양한 변화 및 변경이 이하 상세한 설명으로부터 명백해질 것임을 알고 있어야 한다.
이하 도면은 본 명세서의 일부를 구성하며, 본 발명의 특정 관점을 상세히 증명하기 위한 것이다. 본 발명은 본 명세서에 제시된 특정 양태들의 상세한 설명 과 함께 이러한 하나 이상의 도면을 참고로 하여 자세히 이해될 수 있을 것이다.
도 1. 재조합 p53 아데노바이러스 제조 도식. p53 발현 카세트를 pXCJL.1의 XbaI와 ClaI 부위 사이에 삽입했다. p53 발현 벡터(pEC53)와 재조합 플라스미드 pJM17로 293 세포를 공동형질감염시켰다. 형질감염된 세포는 세포병변 효과의 개시가 나타날 때까지 배지에서 생육시켰다. CPE 상청액을 프로테이나제 K 및 페놀 추출로 처리하여 준비한 DNA 주형을 이용하는 DNA의 PCR 분석을 통해 새로 제조된 p53 재조합 아데노바이러스(AdCMV-p53)을 확인했다.
본 발명자들은 피험체의 질병을 진단, 치료 및/또는 예방하는데 사용할 수 있는 핵산의 특정 신규 조성물을 확인했다. 이러한 조성물은 예컨대 피험체의 신체 표면, 예컨대 피부, 병변 표면, 점막 표면, 상처 표면, 종양 표면 또는 위(胃)와 같은 속빈 내장 내막에 적용하기 위해 제형화된 핵산을 포함한다. 일부 양태에 따르면, 핵산은 질병의 진단에 적용될 수 있는 리포터 유전자를 암호화한다. 또한, 본 발명은 전술한 핵산의 신규 제형의 사용을 수반하여 피험체의 질환을 진단 및 치료하는 신규 방법을 제공한다. 본 명세서에 제시된 신규 조성물 및 방법은 다수의 질환 및 건강 관련 상태 중 임의의 질환의 검출, 예방 또는 치료에 적용될 수 있다. 이러한 질환의 예에는 암, 감염 및 상처 치유가 있다. 질환의 진단, 치료 및 예방에 상기 신규 조성물의 적용은 기존 유전자 요법 기술의 개선을 나타낸다.
A. 핵산
1. 핵산 개요
본 발명의 약제학적 조성물 및 방법은 피험체의 질환 또는 건강 관련 상태의 진단, 치료 또는 예방에 유익한 것으로 공지되거나 생각되는 핵산을 수반한다.
"핵산"이란 용어는 당업계에 공지되어 있다. 본 명세서에 사용된 "핵산"은 일반적으로 DNA 한 분자(즉, 한 가닥), RNA(예컨대, RNAi, siRNA 및 리보자임) 및 올리고뉴클레오타이드, CpG 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 핵염기를 포함하는 이의 유도체 또는 유사체를 의미한다. "핵산"은 각각 이 용어의 아속인, "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"라는 용어를 포함한다. "올리고뉴클레오타이드"란 용어는 길이가 약 3개 내지 약 100개 핵염기의 분자를 의미한다. "폴리뉴클레오타이드"란 용어는 약 100개 핵염기보다 많은 길이의 적어도 하나의 분자를 의미한다.
이러한 정의는 일반적으로 일본쇄 분자를 의미하지만, 특정 양태에서는 추가적 가닥을 포함할 수도 있다. 추가적 가닥은 상기 일본쇄 분자에 부분적으로, 실질적으로 또는 전적으로 상보적일 수 있다. 즉, 핵산은 특정 서열을 포함하는 분자의 1 이상의 상보성 가닥(들) 또는 "상보체(들)"를 포함하는 이본쇄 분자 또는 삼본쇄 분자를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 일본쇄 핵산은 접두사 "ss"로, 이본쇄 핵산은 접두사 "ds"로, 삼본쇄 분자는 접두사 "ts"로 표시할 수 있다.
a. 핵염기
본 명세서에 사용된 바와 같이, "핵염기"는 적어도 하나의 자연 발생의 핵산(즉, DNA 및 RNA)에서 발견되는 자연 발생의 핵염기(즉, A, T, G, C 또는 U), 및 이러한 핵염기의 자연 또는 비자연 발생의 유도체(들) 및 유사체와 같은 헤테로사이클릭 염기를 의미한다. 핵염기는 일반적으로 자연 발생의 핵염기 쌍(예, A와 T, G와 C, A와 U 사이의 수소 결합)을 치환할 수 있는 방식으로 적어도 하나의 자연 발생의 핵염기와 1 이상의 수소 결합("어닐" 또는 "하이브리드화")을 형성할 수 있다.
"퓨린" 및/또는 "피리미딘" 핵염기(들)는 자연 발생의 퓨린 및/또는 피리미딘 핵염기 및 이의 유도체(들) 및 유사체(들), 예컨대 알킬, 카르복시알킬, 아미노, 하이드록시, 할로겐(즉, 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도), 티올 또는 알킬티올 잔기 중 하나 이상이 치환된 퓨린 또는 피리미딘(이에 국한되지 않는다)을 포함한다. 바람직한 알킬(예, 알킬, 카르복시알킬 등) 잔기는 약 1개, 약 2개, 약 3개, 약 4개, 약 5개에서부터 약 6개까지의 탄소 원자를 포함한다. 다른 퓨린 또는 피리미딘의 비제한적 예에는 데아자퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 5-플루오로우라실, 크산틴, 하이포크산틴, 8-브로모구아닌, 8-클로로구아닌, 브로모티민, 8-아미노구아닌, 8-하이드록시구아닌, 8-메틸구아닌, 8-티오구아닌, 아자구아닌, 2-아미노퓨린, 5-에틸사이토신, 5-메틸사이토신, 5-브로모우라실, 5-에틸우라실, 5-요오도우라실, 5-클로로우라실, 5-프로필우라실, 티오우라실, 2-메틸아데닌, 메틸티오아데닌, N,N-디메틸아데닌, 아자아데닌, 8-브로모아데닌, 8-하이드록시아데닌, 6-하이드록시아미노퓨린, 6-티오퓨린, 4-(6-아미노헥실/사이토신) 등이 있다. 표 1은 퓨린 및 피리미딘 유도체 및 유사체의 비제한적 예를 보여준다.
퓨린 및 피리미딘 유도체 또는 유사체
약어 변형 염기 설명
ac4C 4-아세틸시티딘
Chm5u 5-(카르복시하이드록시메틸)우리딘
Cm 2'-O-메틸시티딘
Cmnm5s2u 5-카르복시메틸아미노-메틸-2-티오리딘
Cmnm5u 5-카르복시메틸아미노메틸우리딘
D 디하이드로우리딘
Fm 2'-O-메틸슈도우리딘
Gal q 베타,D-갈라토실퀘오신
Gm 2'-O-메틸구아노신
I 이노신
I6a N6-이소펜테닐아데노신
m1a 1-메틸아데노신
m1f 1-메틸슈도우리딘
m1g 1-메틸구아노신
m1I 1-메틸이노신
m22g 2,2-디메틸구아노신
m2a 2-메틸아데노신
m2g 2-메틸구아노신
m3c 3-메틸시티딘
약어 변형 염기 설명
m5c 5-메틸시티딘
m6a N6-메틸아데노신
m7g 7-메틸구아노신
Mam5u 5-메틸아미노메틸우리딘
Mam5s2u 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘
Man q 베타,D-만노실퀘오신
Mcm5s2u 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오우리딘
Mcm5u 5-메톡시카르보닐메틸우리딘
Mo5u 5-메톡시우리딘
Ms2i6a 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신
Ms2t6a N-((9-베타-D-리보푸라노실-2-메틸티오퓨린-6-일)카르바모일)트레오닌
Mt6a N-((9-베타-D-리보푸라노실퓨린-6-일)N-메틸-카르바모일)트레오닌
Mv 우리딘-5-옥시아세트산 메틸에스테르
o5u 우리딘-5-옥시아세트산(v)
Osyw 와이부톡소신
P 슈도우리딘
Q 퀘오신
s2c 2-티오시티딘
s2t 5-메틸-2-티오우리딘
s2u 2-티오우리딘
s4u 4-티오우리딘
T 5-메틸우리딘
t6a N-((9-베타-D-리보푸라노실퓨린-6-일)카르바모일)트레오닌
Tm 2'-O-메틸-5-메틸우리딘
Um 2'-O-메틸우리딘
Yw 와이부토신
X 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우리딘,(acq3)u
핵염기는 본 명세서에 기술되거나 당업자에게 공지된 임의의 화학적 또는 자연 합성법을 이용하여 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드에 포함될 수 있다.
b. 뉴클레오사이드
본 명세서에 사용된, "뉴클레오사이드"는 핵염기가 핵염기 링커 잔기에 공유 결합된 것을 포함하는 개별적인 화학적 단위를 의미한다. "핵염기 링커 잔기"의 비제한적 예는 5-탄소 원자를 포함하는 당(즉, "5탄소 당")으로서, 그 예로는 데옥시리보스, 리보스, 아라비노스 또는 5탄소 당의 유도체 또는 유사체가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 5-탄소 당의 유도체 또는 유사체의 비제한적 예에는 당 고리에서 산소 원자 대신에 탄소가 치환된 탄소고리 당 또는 2'-플루오로-2'-데옥시리보스가 있다.
핵염기 링커 잔기에 대한 핵염기의 다른 종류의 공유 결합(들)은 당업계에 공지되어 있다. 일 예로서(이에 국한되지 않는다), 퓨린(예, A 또는 G) 또는 7-데아자퓨린 핵염기를 포함하는 뉴클레오사이드는 일반적으로 5-탄소 당의 1'-위치에 퓨린이나 7-데아자퓨린의 9번 위치가 공유 결합되어 있다. 또 다른 비제한적 예로서, 피리미딘 핵염기(즉, C, T 또는 U)를 포함하는 뉴클레오사이드는 일반적으로 5-탄소 당의 1'-위치에 피리미딘의 1번 위치가 공유 결합되어 있다(Kornberg and Baker, 1992).
c. 뉴클레오타이드
본 명세서에 사용된 바와 같이, "뉴클레오타이드"는 "주쇄 잔기"를 추가로 포함하는 뉴클레오사이드를 의미한다. 주쇄 잔기는 일반적으로 하나의 뉴클레오타이드를, 하나의 뉴클레오타이드를 포함하는 다른 분자에 공유 결합시키거나 또는 다른 뉴클레오타이드에 공유 결합시켜 핵산을 형성한다. 자연 발생의 뉴클레오타이드에서 "주쇄 잔기"는 일반적으로 5-탄소 당에 공유 결합되는 인 잔기를 포함한다. 주쇄 잔기의 부착은 일반적으로 5-탄소 당의 3'- 또는 5'-위치에서 일어난다. 하지만, 당업계에는 특히 뉴클레오타이드가 자연 발생의 5-탄소 당 또는 인 잔기의 유도체 또는 유사체를 포함하는 경우에는 다른 종류의 결합도 알려져 있다.
d. 핵산 유사체
핵산은 자연 발생의 핵산에 존재할 수 있는 핵염기의 유도체 또는 유사체, 핵염기 링커 잔기 및/또는 주쇄 잔기를 포함하거나, 이들로 전부 구성될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "유도체"란 용어는 자연 발생 분자의 화학적 변형 또는 변경 형태를 의미하는 반면, "모방체" 또는 "유사체"란 용어는 유사한 기능을 보유하지만, 자연 발생 분자 또는 잔기와 구조적으로 유사하거나 유사하지 않을수 있는 분자를 의미한다. 본 명세서에 사용된 "잔기"란 용어는 일반적으로 큰 화학적 또는 분자적 구조 중의 작은 화학적 또는 분자적 성분을 의미한다. 핵염기, 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체는 당업계에 공지되어 있고, 기술되어 있다(예컨대, 본원에 참고인용된 Scheit, 1980 참조). 당업자에게 공지된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드의 임의의 유도체 또는 유사체는 본 발명의 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 비제한적 예로는 "폴리에테르 핵산" 및 "펩타이드 핵산"이 있다.
e. 핵산의 제조
핵산은 당업자에게 공지된 임의의 기술로 제조할 수 있다. 그 예에는 화학적 합성, 효소적 생산 또는 생물학적 생산이 있다. 합성 핵산(예, 합성 올리고뉴클레오타이드)의 비제한적 예에는 포스포트리에스테르, 포스파이트, 포스포아미다이트 화학 및 고상 기술을 이용한 시험관내 화학적 합성으로 제조한 핵산이 있다. 효소적으로 생산된 핵산의 비제한적 예에는 PCR™과 같은 증폭 반응 및 당업자에게 공지된 다른 기술들(예컨대, 본원에 참고인용되는 미국 특허 4,683,202 및 미국 특허 4,682,195 참조)에서 효소들에 의해 생산되는 것, 또는 본원에 참고인용된 미국 특허 5,645,897에 기술된 올리고뉴클레오타이드의 합성에 의해 생산된 것이 있다. 생물학적으로 생산된 핵산의 비제한적 예에는 살아 있는 세포에서 생산(즉, 복제)된 재조합 핵산, 예컨대 세균에서 복제된 재조합 DNA 벡터(예컨대, Sambrook et al., 2001, 본원에 참고인용됨)가 있다.
f. 핵산 상보체
본 발명은 또한 피험체의 질환을 진단, 치료 또는 예방할 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산에 상보적인 핵산을 포함한다. 다른 핵산에 "상보성"이거나 "상보체"인 핵산은 표준 왓슨-크릭, 후그스틴(Hoogsteen) 또는 역 후그스틴 결합 상보성 규칙에 따라 다른 핵산과 염기쌍을 형성할 수 있는 것이다. 본 명세서에 사용된 "다른 핵산"은 별개의 분자 또는 동일 분자의 공간적으로 분리된 서열을 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "상보성" 또는 "상보체"란 용어는 특히 전체 핵염기보다 적은 핵염기가 대응 핵염기와 염기쌍을 형성하지 않는 경우에도 다른 핵산 가닥 또는 이중체에 하이브리드화할 수 있는 연속 핵염기 또는 반연속 핵염기(예, 하나 이상의 핵염기 잔기가 분자 내에 존재하지 않는 경우)의 서열을 포함하는 핵산을 의미한다. 특정 양태에서, "상보성" 핵산은 핵염기 서열의 약 70% 내지 약 100%, 및 여기에서 유도될 수 있는 임의의 범위가 하이브리드화 동안에 일본쇄 또는 이본쇄 핵산 분자와 염기쌍을 형성할 수 있는 서열을 포함한다. 특정 양태에 따르면, "상보성"이란 용어는 당업자라면 잘 알고 있을 엄중 조건 하에서 다른 핵산 가닥 또는 이중체에 하이브리드화할 수 있는 핵산을 의미한다.
특정 양태에 따르면, "부분 상보성" 핵산은 낮은 엄중 조건 하에서 일본쇄 또는 이본쇄 핵산에 하이브리드화할 수 있는 서열, 또는 하이브리드화 동안에 핵염기 서열의 약 70% 미만이 일본쇄 또는 이본쇄 핵산 분자와 염기쌍을 형성할 수 있는 서열을 포함한다.
2. 치료적 핵산
본 명세서에 제시된 제형의 일부 양태에 따르면, 핵산은 치료적 핵산이다. 본 명세서에 정의된 "치료적 핵산"은 질환을 치료 또는 예방하기 위한 목적으로 피험체에게 투여할 수 있는 핵산을 의미한다. 이러한 핵산은 피험체의 질환 또는 건강 관련 상태의 치료에 유익한 것으로 공지되거나 생각되는 것이다. 질환 및 건강 관련 상태는 본 명세서의 다른 부분에서 충분히 설명한 것이다.
치료적 이점은 예컨대 핵산에 의한 특정 유전자 또는 유전자들의 발현이 변경된 결과로서 일어날 수 있다. 특정 유전자 또는 유전자들의 발현 변경은 특정 유전자의 발현 억제 또는 증강일 수 있다. 본 발명의 특정 양태에 따르면, 치료적 핵산은 피험체의 질환 또는 건강 관련 상태의 치료 또는 예방에 적용될 수 있는 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화한다. "단백질" 및 "폴리펩타이드"란 용어는 본 명세서에서 호환적으로 사용된다. 두 용어는 2 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 의미한다.
질환 또는 건강 관련 상태의 치료 또는 예방에 유익한 것으로 공지되거나 생각되는 당업자에게 공지된 임의의 핵산은 치료적 핵산으로서 본 발명에 포함된다. 본 명세서를 통해 제시된 "~을 암호화하는 핵산"이란 표현은 특정 단백질 또는 펩타이드의 발현을 유도하는 핵산을 의미한다. 이러한 핵산 서열에는 RNA로 전사되는 DNA 가닥 서열 및 단백질로 해독되는 RNA 서열이 포함된다. 일부 양태에 따르면, 핵산은 치료적 유전자를 포함한다. "유전자"란 용어는 기능적 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 암호화 단위를 암호화하는 핵산 서열을 의미한다.
당업자라면 잘 알고 있듯이, "치료적 핵산"이란 용어는 단백질, 폴리펩타이드, 도메인, 펩타이드, 융합 단백질 및 돌연변이체를 발현하거나, 또는 발현하도록 조정될 수 있는 게놈 서열, cDNA 서열, 및 이보다 작은 유전자조작된 유전자 분절을 포함한다. 이러한 핵산은 약 5개 내지 약 12000개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드 또는 염기쌍의 연속 핵산 서열을 포함할 수 있다.
"치료적 핵산"의 정의에는 질환 또는 건강 관련 상태의 치료 또는 예방에 유익한 것으로 입증된 치료적 핵산의 "생물학적 기능적 등가물"도 포함된다. 따라서, 공지된 핵산과 약 70% 내지 약 99% 상동성이 있는 서열은 본 발명에서 예상한 것이다.
a. 종양 억제인자와 아폽토시스 유도 단백질을 암호화하는 핵산
일부 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물의 핵산은 암 또는 다른 과다증식 질환의 치료 또는 예방에 적용될 수 있는 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 단백질의 예에는 Rb, CFTR, p16, p21, p27, p57, p73, C-CAM, APC, CTS-I, zacl, scFV ras, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCAl, VHL, MMACl, FCC, MCC, BRCA2, IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-Il IL-12, IL-13, GM-CSF, G-CSF, 티미딘 키나제, mda7, fus, 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ, ADP, p53, ABLI, BLC1, BLC6, CBFAl, CBL, CSFIR, ERBA, ERBB, EBRB2, ETSl, ETS2, ETV6, FGR, FOX, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MDM2, MLL, MYB, MYC, MYCLl, MYCN, NRAS, PIMl, PML, RET, SRC, TALI, TCL3, YES, MADH4, RB1, TP53, WTl, TNF, BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, ApoAI, ApoAIV, ApoE, Rap1A, 사이토신 탈아미노효소, Fab, ScFv, BRCA2, zacl, ATM, HIC-1, DPC-4, FHIT, PTEN, ING1, NOEY1, NOEY2, OVCA1, MADR2, 53BP2, IRF-1, Rb, zac1, DBCCR-1, rks-3, COX-1, TFPI, PGS, Dp, E2F, ras, myc, neu, raf, erb, fms, trk, ret, gsp, hst, abl, E1A, p300, VEGF, FGF, 트롬보스폰딘, BAI-I, GDAIF, 또는 MCC가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
"종양 억제인자"는 세포에 존재할 때, 세포의 종양원성, 악성 또는 과다증식성 표현형을 감소시키는 폴리펩타이드를 의미한다. 종양 억제인자 유전자 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열은 종양 억제인자 유전자의 전장의 핵산 서열뿐만 아니라 전장 서열 유래의 전장이 아닌 임의의 길이의 서열도 포함한다. 이러한 서열은 또한 특정 숙주 세포에서 코돈 선호성을 갖도록 도입될 수 있는 천연 서열 또는 서열들의 축퇴성 코돈을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
종양 억제인자를 암호화하는 핵산은 일반적으로 세포의 종양원성, 악성 또는 과다증식성 표현형을 감소시키는 핵산 서열을 의미한다. 따라서, 건강한 세포에서 종양 억제인자 유전자의 정상적인 발현의 부재, 돌연변이 또는 붕괴는 종양 상태에 이르는 세포의 가능성을 증가시키거나 그러한 세포를 초래한다. 이에 반해, 기능적인 종양 억제인자 유전자 또는 단백질이 존재하면, 그 존재는 숙주 세포의 종양원성, 악성 또는 과다증식성 표현형을 억제한다. 종양 억제인자의 예에는 APC, CYLD, HIN-1, KRAS2b, pl6, pl9, p21, p27, p27mt, p53, p57, p73, PTEN, Rb, 우테로글로빈, Skp2, BRCA-1, BRCA-2, CHK2, CDKN2A, DCC, DPC4, MADR2/JV18, MEN1, MEN2, MTS1, NF1, NF2, VHL, WRN, WT1, CFTR, C-CAM, CTS-1, zac1, scFV, ras, MMAC1, FCC, MCC, Gene 26 (CACNA2D2), PL6, Beta* (BLU), Luca-1 (HYAL1), Luca-2 (HYAL2), 123F2 (RASSF1), 101F6, Gene 21 (NPRL2), 또는 SEM A3 폴리펩타이드 및 FUS1을 암호화하는 유전자가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 다른 종양 억제인자 유전자의 예는 종양 억제인자 유전자 데이터베이스, www.cise.ufl.edu/~yy1/HTML-TSGDB/Homepage.html에 기술되어 있다. 이러한 데이터베이스는 본 출원의 본 섹션 및 여타 다른 섹션에도 구체적으로 참고인용되었다. 앞에서 논의한 바와 같은 종양 억제인자 유전자를 암호화하는 핵산에는, 종양 억제인자 유전자 또는 이로부터 유도된 핵산(예, cDNA, cRNA, mRNA 및 이러한 각 종양 억제인자 아미노산 서열의 활성 단편을 암호화하는 부분서열), 뿐만 아니라 이러한 서열을 포함하는 벡터가 포함된다. 당업자라면, 본 발명에 적용될 수 있는 종양 억제인자 유전자를 잘 알고 있을 것이다.
가장 잘 알려진 종양 억제인자 유전자의 하나는 p53이다. p53은 세포의 많은 항암 기작에 중요하다. 이것은 증식 정지, 아폽토시스 및 세포 노쇠를 유도할 수 있다. 정상 세포에서, p53은 보통 이의 작용을 차단하고 그 분해를 촉진하는 단백질 MDM-2에 결합되어 불활성인 상태이다. 활성 p53은 각종 암 유발 인자, 예컨대 UV 조사, 종양유전자 및 일부 DNA 손상 약물의 영향 후 유도된다. DNA 손상은 세포 주기의 '체크포인트(checkpoint)'에 의해 감지되고, ATM, Chk1 및 Chk2와 같은 단백질을 유발하여, p53을 이의 MDM2 결합 영역에 가까운 부위에서 인산화시킨다. 또한, 종양유전자는 단백질 p14ARF에 의해 매개되는 p53 활성화를 자극한다. 종양유전자는 또한 MDM2에 결합하고 이의 활성을 억제하는 단백질의 전사를 자극할 수 있다. 일단 활성화된 p53의 항암 기작은 다수가 있고, 보고된 가장 우수한 기작은 DNA 영역에 결합하여 세포 주기 억제, 아폽토시스, 유전자 안정성 및 혈관형성의 억제에 중요한 유전자의 전사를 활성화하는 능력이다(Vogelstein et al., 2000). p53과 pRB 종양 억제인자 경로를 단백질 p14ARF를 통해 연계시킨 연구는 이 경로들이 서로 조절될 수 있다는 가능성을 제기한다(Bates et al., 1998).
아폽토시스 유도 단백질을 암호화하는 핵산은 아폽토시스를 활성 형태로 유도하거나 지속시키는 단백질을 암호화한다. 본 발명은 당업자에게 공지된 아폽토시스 유도 단백질을 암호화하는 임의의 핵산의 포함을 예상하고 있다. 아폽토시스 유도 단백질의 예에는 CD95, 카스파제-3, Bax, Bag-1, CRADD, TSSC3, bax, hid, Bak, MKP-7, PERP, bad, bcl-2, MST1, bbc3, Sax, BIK, BID 및 mda7이 있다. 당업자는 본 명세서에 구체적으로 제시되지 않은 것을 비롯한 아폽토시스 유도 단백질을 잘 알고 있을 것이다.
아폽토시스 유도 아미노산 서열을 암호화하는 핵산에는 예컨대 각각의 아폽토시스 유도 아미노산 서열의 활성 단편을 암호화하는 cDNA, cRNA, mRNA 및 이의 부분서열이 포함된다.
당업자는 본 명세서에서 구체적으로 제시되지 않은 질환 또는 건강 관련 상태의 치료에 적용할 수 있는 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 다른 핵산이 있다는 것을 알고 있을 것이다. 또한, 본 명세서의 다른 부분에서 언급한 임의의 치료적 핵산, 예컨대 사이토카인을 암호화하는 핵산이 암의 치료 및 예방에 적용될 수 있다는 것을 이해하고 있어야 한다.
b. 사이토카인을 암호화하는 핵산
본 명세서에 기술된 약제학적 조성물의 일부 양태에서, 핵산은 사이토카인을 암호화한다. "사이토카인"이란 용어는 세포간 매개인자로서 다른 세포에 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질의 일반적인 명칭이다. 핵산 서열은 사이토카인의 전장의 핵산 서열뿐만 아니라, 이러한 전장의 서열에서 유래된 전장이 아닌 임의의 길이의 서열을 암호화할 수 있다. 또한, 앞에서 논한 바와 같이, 이 서열은 특정 숙주 세포에서 코돈 선호성을 구비하도록 도입될 수 있는 천연 서열 또는 서열들의 축퇴성 코돈을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
이러한 사이토카인의 예에는 림포카인, 모노카인, 증식인자 및 통상의 폴리펩타이드 호르몬이 있다. 사이토카인 중에는 사람 성장 호르몬, N-메티오닐 사람 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬과 같은 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴랙신; 프로릴랙신; 당단백질 호르몬, 예컨대 여포자극호르몬(FSH), 갑상선자극호르몬(TSH) 및 황체형성호르몬(HL); 간성장인자; 프로스타글란딘, 섬유아세포성장인자(FGF), 예컨대 FGF-α 및 FGF-β; 프로락틴; 태반 락토겐, OB 단백질; 종양괴사인자-α 및 -β; 뮬러(mullerian) 억제 물질; 마우스 고나도트로핀 관련 펩타이드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); 신경성장인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판성장인자; 형질전환성장인지(TGF), 예컨대 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린유사 성장인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도 인자; 인터페론, 예컨대 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 자극 인자(CSF), 예컨대 대식세포-CSF(M-CSF); 과립세포-대식세포-CSF(GM-CSF); 및 과립세포-CSF(G-CSF); 인터루킨(IL), 예컨대 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, 키트-리간드 또는 FLT-3이 있다.
상처 치유에 관여하는 성장인자 사이토카인의 비제한적 예에는 표피 성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 각질세포 성장인자, 간세포 성장인자, 형질전환 성장인자(TGF), 예컨대 TGF-α 및 TGF-β, 및 혈관내피성장인자(VEGF)가 있다. 이러한 성장인자들은 Ras, MAPK, PI-3K/Akt, PLC-감마 및 Rho/Rac/액틴 시그널전달을 이용하는 유사분열, 운동원성 및 생존 경로를 자극한다. 저산소증은 HIF를 통해 혈관형성유도 (pro-angiogenic) 유전자(예, VEGF, 안지오포이에틴)를 활성화시키는 반면, 혈청 반응 인자(SRF)는 VEGF 유도 혈관형성, 재상피화 및 근육 복원에 중요하다. EGF, 이의 수용체, HGF 및 Cox2는 상피세포 증식, 이동 재상피화 및 위샘의 재건에 중요하다. VEGF, 안지오포이에틴, 산화질소, 엔도텔린 및 메탈로프로테이나제는 혈관형성, 혈관 재모델링 및 궤양 내의 점막 재생에 중요하다(Tarnawski, 2005).
사이토카인의 다른 예는 IL-10이다. IL-10은 면역계 세포뿐만 아니라 일부 종양 세포에 의해 생산되는 다면발현성(pleiotropic) 동종이량체 사이토카인이다(Ekmekcioglu et al., 1999). 이의 면역억제 기능에는 염증촉진성(proinflamnatory) 사이토카인, 예컨대 IFNγ, TNFα 및 IL-6 등의 합성의 강력한 억제가 포함된다(De Waal et al., 1991). IL-10 유사 사이토카인의 패밀리는 염색체 1q32 상의 작은 195kb 유전자 클러스터에서 암호화되며, IL-10과 구조적 및 서열 상동성이 있는 다수의 세포 단백질(IL-10, IL-19, IL-20, MDA-7)로 구성된다(Kotenko et al., 2000; Gallagher et al., 2000; Blumberg et al., 2001; Dumoutier et al., 2000; Knapp et al., 2000; Jiang et al., 1995a; Jiang et al., 1996).
최근 발견된 사이토카인 패밀리의 추정 멤버는 MDA-7이다, MDA-7은 IL-10 패밀리 멤버로 분류되었고, IL-24라고도 알려져 있다. 염색체 위치, 전사 조절, 쥐 및 래트 동족체 발현 및 추정상의 단백질 구조는 모두 MDA-7이 사이토카인임을 암시한다(Knapp et al., 2000; Schaefer et al., 2000; Soo et al., 1999; Zhang et al., 2000). 급속 분해를 위해 3'-UTR 표적화 mRNA에 AU-풍부 인자를 포함하는 GM-CSF, TNFα 및 IFNγ 전사체와 유사하게, MDA-7은 이의 3' UTR에 3개의 ARE를 보유한다17. Mda-7 mRNA는 사람 PBMC에서 동정되었고(Ekmekcioglu, et al., 2001), 종래 사람 MDA-7 단백질의 사이토카인 기능은 보고된 바 없지만, MDA-7은 유전자 및 단백질 서열 특징에 기초하여 IL-24로 지정되어 있다(NCBI 데이터베이스 수탁번호 XM_001405).
c. 효소를 암호화하는 핵산
치료적 핵산의 다른 예에는 효소를 암호화하는 핵산이 있다. 그 예에는 ACP 데세추라제(desaturase), ACP 하이드록실라제(hydroxylase), ADP-글루코스 파이로포릴라제, ATPase, 알콜 데하이드로게나제, 아밀라제, 아밀로글루코시다제, 카탈라제, 셀룰라제, 사이클로옥시게나제, 데카르복실라제, 덱스트리나제, 에스테라제, DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 히알루론 신타제, 갈락토시다제, 글루카나제, 글루코스 옥시다제, GTPase, 헬리카제, 헤미셀루라제, 히알루로니다제, 인테그라제, 인버타제, 이소머라제, 키나제, 락타제, 리파제, 리폭시레나제, 리아제, 리소자임, 펙틴에스터라제, 퍼옥시다제, 포스파타제, 포스포리파제, 포스포릴라제, 폴리갈락투로나제, 프로테이나제, 펩티데아제, 풀라나제, 리콤비나제, 역전사효소, 토포이소머라제, 자일라나제, 리포터 유전자, 인터류킨 또는 사이토카인이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 하지만, 본 발명의 특정 양태에 따르면, 본 발명은 특별하게 앞에 제시하거나 이하 문단에 제시한 하나 이상의 효소를 포함하지 않는 경우도 생각되어야 한다.
치료적 유전자의 또 다른 예에는 카르바모일 신테타제 I, 오르니틴 트란스카르바밀라제, 아르기노숙시네이트 신테타제, 아르기노숙시네이트 리아제, 아르기나제, 푸마릴아세토아세테이트 하이드롤라제, 페닐알라닌 하이드록실라제, 알파-1 안티트립신, 글루코스-6-포스파타제, 저밀도 지단백 수용체, 포르포빌리노겐 데아미나제, VIII 인자, IX 인자, 시스타티온 베타-신타제, 분지쇄 케토산 데카르복실라제, 알부민, 이소발레릴-CoA 데하이드로게나제, 프로피오닐 CoA 카르복실라제, 메틸 말로닐 CoA 뮤타제, 글루타릴 CoA 데하이드로게나제, 인슐린, 베타-글루코시다제, 피루베이트 카르복실라제, 간 포스포릴라제, 포스포릴라제 키나제, 글리신 데카르복실라제, H-단백질, T-단백질, 곱슬머리병(Menkes disease) 구리 수송 ATPase, 윌슨씨병(Wilson's disease) 구리 수송 ATPase, 사이토신 데아미나제, 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트란스퍼라제, 갈락토스-1-포스페이트 우리딜트란스퍼라제, 페닐알라닌 하이드록실라제, 글루코세르브로시다제, 스핑고미엘리나제, α-L-이두로니다제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 글루코실트란스퍼라제, HSV 티미딘 키나제 또는 사람 티미딘 키나제를 암호화하는 유전자가 있다.
본 발명의 치료적 핵산은 수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)를 암호화할 수 있다. 여러 아형(isoform)으로 존재하는 SOD는 수퍼옥사이드 라디칼을 과산화수소로 제독시키는 금속효소이다. 2개의 아형은 다음과 같은 세포내 효소이다: 세포질에서 발현되는 Cu/Zn-SOD, 및 미토콘드리아에서 발현되는 Mn-SOD(Linchey and Fridovich, 1997). Mn-SOD는 MnSOD cDNA로 형질감염된 조혈 종양세포주에서 방사선에 대한 내성을 증가시키는 것으로 입증되었다(Suresh et al., 1993). Cu/Zn-SOD의 아데노바이러스 전달은 에탄올에 의해 유도된 간 손상에 대하여 보호하는 역할을 하는 것으로 입증되었다(Wheeler et al., 2001). 또한, Mn-SOD와 Cu/Zn-SOD의 동시 아데노바이러스 매개 유전자 전달은 열허혈(warm ischemia)-재관류 모델에서 산화적 스트레스에 대한 보호 작용에 있어서 동일하게 효과적이었다(Wheeler et al., 2001).
d. 호르몬을 암호화하는 핵산
치료적 핵산에는 호르몬을 암호화하는 핵산도 포함된다, 그 예에는, 성장 호르몬, 프로락틴, 태반 락토겐, 황체형성 호르몬, 여포자극호르몬, 융모생식선자극호르몬, 갑상선자극 호르몬, 렙틴, 아드레노코르티코트로핀, 안지오텐신 I, 인지오텐신 II, β-엔돌핀, β-멜라닌세포자극호르몬, 콜레시스토키닌, 엔도텔린 I, 갈라닌, 위 억제 펩타이드, 글루카곤, 인슐린, 리포트로핀, 뉴로피신, 소마토스타틴, 칼시토닌, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드, β-칼시토닌 유전자 관련 펩타이드, 암 인자의 고칼슘혈증, 부갑상선 호르몬 관련 단백질, 부갑상선 호르몬 관련 단백질, 글루카곤 유사 펩타이드, 판크레아스타틴, 췌장 펩타이드, 펩타이드 YY, PHM, 세크레틴, 혈관작용 창자 펩타이드, 옥시토신, 바소프레신, 바소토신, 엔케팔린아미드, 메토르핀아미드, 알파 멜라닌세포자극 호르몬, 심방나트륨이뇨인자, 아밀린, 아밀로이드 P 성분, 코르티코트로핀 분비 호르몬, 성장호르몬 분비 인자, 황체형성호르몬 분비 호르몬, 뉴로펩타이드 Y, 물질 K, 물질 P 및 갑상선자극호르몬 분비호르몬이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
치료적 유전자의 다른 예에는 자가면역에 관여하는 면역 효과기(effector) 또는 병원균에 존재하는 항원을 암호화하는 유전자가 있다. 이러한 유전자들은 예컨대 감염 질환 및 자가면역 질환의 면역 요법이나 면역 예방을 위한 백신접종에 적용될 수 있는 제형에 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 리포터 유전자는 단독으로 또는 치료적 유전자와 함께 사용된다. 리포터 유전자의 예에는 gfp, rfp 또는 bfp와 같은 형광 단백질, β-gal과 같은 효소적 단백질, 또는 루시퍼라제와 같은 화학발광 단백질을 암호화하는 유전자가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
"리포터 유전자"의 정의에는 "생물학적 등가" 치료적 유전자가 포함된다. 따라서, 리포터 유전자의 아미노산과 동일하거나 또는 기능적으로 등가인 아미노산의 약 70% 내지 약 99% 상동성을 보유한 서열은 단백질의 생물학적 활성이 유지되는 한 생물학적 기능적 등가인 서열이다.
e. 항원을 암호화하는 핵산
본 명세서에 제시된 약제학적 조성물은 하나 이상의 항원을 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 치료적 유전자는 종양, 병원균, 또는 자가면역에 관여하는 면역 효과기에 존재하는 항원을 암호화할 수 있다. 이러한 유전자들은 예를 들어 종양, 감염성 질환 및 자가면역질환의 면역요법 또는 면역예방을 위해 백신접종에 적용될 수 있는 제형에 사용될 수 있다.
i. 종양 항원
특정 양태에 따르면, 치료적 핵산은 종양 항원을 암호화한다. 종양 항원은 당업자에게 공지되어 있다. 그 예에는 전문이 참고인용되는 문헌[Dalgleish(2004), Finn(2003) 및 Hellstrom and Helstrom(2003)]에 각각 기술된 것이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 다른 예는 본원에 특별히 참고인용된 사이트(http://www.bioinfo.org.cn/hptaa/search.php)에서 찾아볼 수 있다.
ii. 미생물 항원
일부 양태에 따르면, 핵산은 미생물 항원을 암호화한다. "미생물"이란 용어에는 바이러스, 세균, 미시적 진균, 원생동물 및 다른 미시적 기생충이 포함된다. "미생물 항원"은 항원 제공 세포(APC)에 의해 세포 표면에 제공될 때 면역 반응을 유도하는 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 반응은 세포독성 T 세포 반응 또는 항체 생산 또는 이 두 반응 모두를 포함할 수 있다.
미생물 항원이 유도될 수 있는 바이러스의 예에는 사람 헤르페스 바이러스(HHV)-1 내지 8; 헤르페스 B 바이러스; HPV-16, 18, 31, 33 및 45; A형, B형, C형, δ형 간염바이러스; 폴리오바이러스; 로타바이러스; 인플루엔자; 렌티바이러스; HTLV-1; HTLV-2; 말 감염성 빈혈 바이러스; 동부 말 뇌염 바이러스; 서부 말 뇌염 바이러스; 베네주엘라 말 뇌염 바이러스; 리프트 밸리(rift valley) 열병 바이러스; 웨스트나일 바이러스; 황열병; 크림-콩고 출혈열 바이러스; 뎅기열 바이러스; SARS 코로나바이러스; 천연두 바이러스; 원숭이 바이러스 및/또는 등이 있다.
바이러스 미생물의 예에는, 레트로비리데, 플라비리데, 코로나비리데, 피코나비리데, 토가비리데, 랩도비리데, 파라믹소비리데, 오르토믹소비리데, 부니아비리데, 아레나비리데, 레오비리데, 폴리오마비리데, 파필로마비리데, 헤르페스비리데 및 헤파드나비리데가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
레트로비리데의 예에는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, Visna, CAEV, BIV 및 EIAV와 같은 렌티바이러스가 있다. 렌티바이러스에 의해 암호화된 유전자에는 gag, pol, env, vif, vpr, vpu, nef, tat, vpx 및 rev가 포함될 수 있다. 레트로바이러스의 다른 예에는 조류 백혈증 바이러스, 조류 골수아구증 바이러스, 조류 육종 바이러스, 후지나미 육종 바이러스 및 루스 육종 바이러스와 같은 알파 레트로바이러스가 있다. 알파 레트로바이러스에 의해 암호화된 유전자는 gag, pol 및 env를 포함할 수 있다. 레트로바이러스의 다른 예에는 자아그시엑테(jaagsiekte) 양 레트로바이러스, 랑구르원숭이 바이러스, 메이슨-파이저(Mason-Pfizer) 원숭이 바이러스, 마우스 유방암 바이러스, 유인원 레트로바이러스 1 및 유인원 레트로바이러스 2와 같은 베타 레트로바이러스가 있다. 베타 레트로바이러스에 의해 암호화된 유전자에는 gag, pol, pro 및 env가 포함될 수 있다. 또 다른 레트로바이러스의 예에는 HTLV-1, HTLV-2, 소 백혈병바이러스 및 비비원숭이 T 세포 백혈병 바이러와 같은 델타 레트로바이러스가 있다. 델타 레트로바이러스에 의해 암호화된 유전자에는 gag, pol, env, tax 및 rex가 있다. 또 다른 레트로바이러스의 예에는 소, 고양이, 말, 유인원 및 사람의 포말상 바이러스와 같은 스푸마바이러스(spumavirus)가 있다. 스푸마바이러스에 의해 암호화된 유전자는 gag, pol, env, bel-1, bel-2 및 bet를 포함할 수 있다.
플라비리데(flaviridae)의 예에는 C형 간염 바이러스, 모기 유래 황열바이러스, 뎅기열바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 세인트루이스 뇌염 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 바이러스, 웨스트나일 바이러스, 쿤진 바이러스, 중유럽 진드기 유래 바이러스, 극동부 진드기 유래 바이러스, 키아사누르 포레스트 바이러스, 루핑(louping) III 바이러스, 포와산 바이러스, 옴스크 출혈열 바이러스, 루비바이러스 속(루벨라 바이러스) 및 페스티바이러스 속(점막 질환 바이러스, 돼지 콜레라, 보르데병 바이러스)이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 플라비바이러스에 의해 암호화된 유전자에는 모든 플라비바이러스 단백질이 유래되는 플라비바이러스 다단백질이 있다. 이러한 플라비바이러스 다단백질을 암호화하는 핵산 서열은 C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5와 같은 최종 처리된 플라비바이러스 단백질 산물을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
코로나비리데의 예에는 사람 호흡기 코로나바이러스, 예컨대 SARS 및 소 코로나바이러스가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 코로나비리데에 의해 암호화된 유전자는 pol, S, E, M 및 N을 포함할 수 있다.
피코나비리데의 예에는 엔테로바이러스 속(폴리오바이러스, 콕사키 바이러스 A 및 B, 에코(ECHO) 바이러스, A형 간염 바이러스, 유인원 장바이러스, 쥐 뇌척수염(ME) 바이러스, 폴리오바이러스 뮤리스, 소 엔테로바이러스, 돼지 엔테로바이러스, 카디오바이러스 속(뇌심근염 바이러스(EMC), 멩고바이러스), 리노바이러스 속(적어도 113개의 아형을 포함하는 사람 리노바이러스; 다른 리노바이러스) 및 압토바이러스 속(구제역(FMDV))이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 피코나비리데에 의해 암호화된 유전자는 피코나바이러스 다단백질을 포함할 수 있다. 피코나바이러스 다단백질을 암호화하는 핵산 서열은 Vpg, VPO, VP3, VP1, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C 및 3D와 같은 최종 처리된 피코나바이러스 단백질을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
토가비리데의 예에는 알파바이러스 속에 속하는 바이러스(동부 말 뇌염 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 신드비스 바이러스, 치컨군야(Chikungunya) 바이러스, 오'뇽-뇽(O'Nyonh-Nyong) 바이러스, 로스 리버 바이러스, 베네주엘라 말 뇌염 바이러스, 서부 말 뇌염 동부 말 뇌염 바이러스)가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 토가비리데에 의해 암호화된 유전자의 예에는 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4, C, E1 및 E2를 암호화하는 유전자가 포함될 수 있다.
랩도비리데의 예에는 베시큘로바이러스(VSV)속, 찬디퓨라(chandipura) 바이러스, 플랜더스-하트 파크(Flanders-Hart Park) 바이러스 속, 및 리사바이러스 속(광견병 바이러스)이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 랩도비리데에 의해 암호화된 유전자의 예에는 N, P, M, G 및 L이 포함될 수 있다.
필로비리데의 예에는 에볼라 바이러스 및 마르부르크병 바이러스가 있다. 필로바이러스에 의해 암호화된 유전자의 예에는 NP, VP35, VP40, GP, VP35, VP24 및 L이 포함될 수 있다. 파라믹소바이러스의 예에는, 파라믹소바이러스 속(파라인플루엔자 바이러스 타입 1, 센다이 바이러스, 혈구흡착 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 타입 2 내지 5, 뉴캣슬병 바이러스, 볼거리 바이러스), 모르빌리바이러스 속(홍역 바이러스, 아급성 경화범뇌염, 디스템퍼 바이러스, 우역(Rinderpest) 바이러스), 뉴모바이러스 속(호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 소 호흡기 세포융합 바이러스 및 마우스의 폐렴 바이러스), 파라믹소비리데 과, 예컨대 파라믹소바이러스 속(파라인플루엔자 바이러스 타입 1, 센다이 바이러스, 혈구흡착 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 타입 2 내지 5, 뉴캣슬병 바이러스, 볼거리 바이러스), 모르빌리바이러스 속(홍역 바이러스, 아급성 경화범뇌염, 디스템퍼 바이러스, 우역 바이러스), 뉴모바이러스 속(호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 소 호흡기 세포융합 바이러스 및 마우스의 폐렴 바이러스)이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 파라믹소비리데에 의해 암호화된 유전자의 예에는 N, P/C/V, P/C/V/R, M, F, HN, L, V/P, NS1, NS2, SH 및 M2가 포함될 수 있다.
오르토믹소비리데의 예에는 인플루엔자 바이러스가 있다. 오르토믹소비리데에 의해 암호화된 유전자의 예에는 PB1, PB2, PA, HA, NP, NA, M1, M2, NS1 및 NS2가 포함될 수 있다.
분야바이러스의 예에는, 분니바이러스 속(분얌웨라 및 관련 바이러스, 캘리포니아 뇌염 그룹 바이러스), 플레보바이러스(모래파리 열병 시실리아 바이러스, 리프트밸리 열병바이러스), 나이로바이러스 속(크림-콩고 출혈열 바이러스, 나이로비 양 질환 바이러스) 및 우우쿠바이러스 속(우우쿠니에미 및 관련 바이러스)이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 분야바이러스에 의해 암호화된 유전자의 예는 N, G1, G2 및 L을 포함할 수 있다.
아레나바이러스의 예에는 림프구 맥락수막염 바이러스, 라사열병 바이러스, 아르헨티나 출혈열 바이러스, 볼리비아 출혈열 바이러스 및 베네주엘라 출혈열 바이러스가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 아레나바이러스에 의해 암호화된 유전자의 예에는 NP, GPC, L 및 Z가 포함될 수 있다.
레오바이러스의 예에는 오르토레오바이러스 속(포유동물 및 조류 레트로바이러스의 다수 혈청형), 오르비바이러스 속(청설(Bluetongue) 바이러스, 유제난지(Eugenangee) 바이러스, 케네로보 바이러스, 아프리카 말 병 바이러스 및 콜로라도 진드기 열병 바이러스) 및 로타바이러스 속(사람 로타바이러스, 네브라스카 송아지 설사 바이러스, 쥐 로타바이러스, 유인원 로타바이러스, 소 또는 양 로타바이러스, 조류 로타바이러스)이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 레오바이러스에 의해 암호화된 유전자의 예에는 대응하는 단백질 산물, 예컨대 VP1, VP2, VP3, VP4, NSP1, NSP3, NPS2, VP7, NSP4, NSP5 및 NSP6의 이름을 딴 게놈 분절을 포함할 수 있다.
폴리오마비리데의 예에는 BK 및 JC 바이러스가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 폴리오마바이러스에 의해 암호화된 유전자의 예에는 Agno, P2, VP3, VP2, VP1, 대형 T 및 소형 t가 포함될 수 있다.
파필로마비리데의 예에는 HPV-16 및 HPV-18이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 파필로마바이러스에 의해 암호화된 유전자의 예에는 E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, L1 및 L2가 포함될 수 있다.
헤르페스비리데의 예에는 사람 헤르페스 바이러스(HHV) 1, HHV2, HHV3, HHV4, HHV5, HHV6, HHV7 및 HHV8이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 헤르페스바이러스에 의해 암호화된 유전자의 예에는 γ134.5, ORF P, ORFO, αO, UL1 내지 UL56, α4, α22, US2 내지 US12, OriSTU 및 LATU가 포함될 수 있다.
헤파드나바이러스의 예에는 B형 간염 바이러스가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 헤파드나바이러스에 의해 암호화된 유전자의 예에는 S, C, P 및 X가 포함될 수 있다.
미생물 항원이 유래될 수 있는 진균의 예에는 히스포플라스마 캡슐라텀(histoplasma capsulatum); 아스퍼질러스(aspergillus); 액티노마이세스(actinomyces); 캔디다(candida), 스트렙토마이세스(streptomyces) 등이 있다.
항원이 유래될 수 있는 원생동물 또는 다른 미생물의 예에는 플라스모듐 팔시파럼, 플라스모듐 비박스, 플라스모듐 오발레, 플라스모듐 말라리에 등이 있다. 플라스모듐 종 유래의 유전자는 PyCSP, MSP1, MSP4/5, Pvs25 및 Pvs28을 포함할 수 있다.
미생물 항원이 유래될 수 있는 세균의 예에는 마이코박테리움 투베르큘로시스(mycobacterium tuberculosis); 예르시니아 페스티스(yersinia pestis); 리켓챠 프로와제키(rickettsia prowazekii); 리켓챠 리켓치(rickettsia rickettsii); 프란시셀라 투라렌시스(francisella tularensis); 바실러스 안트라시스(bacillus anthracis); 헬리코박터 피롤리(helicobacter pylori); 살모넬라 티피(salmonella typhi); 보렐리아 버그도페리(borrelia burgdorferi); 스트렙토코커스 뮤탄스(streptococcus mutans) 등이 있다. 마이코박테리움 튜베르큘로시스 유래의 유전자는 85A, 85B, 85C 및 ESAT-6을 포함할 수 있다. 예르시니아 페스티스 유래의 유전자는 lcrV 및 caf1을 포함할 수 있다. 리켓챠 종 유래의 유전자는 ospA, invA, ompA, ompB, virB, cap, tlyA 및 tlyC를 포함할 수 있다. 프란시셀라 툴라렌시스 유래의 유전자는 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, Hfq 및 ClqB를 포함할 수 있다. 바실러스 안트라시스 유래의 유전자는 PA, BclA 및 LF를 포함할 수 있다. 헬리코박터 피롤리 유래의 유전자는 hpaA, UreB, hspA, hspB, hsp60, VacA 및 cagE를 포함할 수 있다. 살모넬라 티피 유래의 유전자는 mpC, aroC, aroD, htrA 및 CS6을 포함할 수 있다. 보렐리아 부르도페리 유래의 유전자는 OspC를 포함할 수 있다.
미생물 항원이 유래될 수 있는 진균의 예에는 히토플라스마; 시시디스; 임미티스; 아스파질러스; 액티노마이세스; 블라스토마이세스; 캔디다, 스트렙토마이세스 등이 있다.
항원이 유래될 수 있는 원생동물 또는 다른 미생물의 예에는 플라스모듐 팔시파럼(plasmodium falciparum); 플라스모듐 비박스(plasmodium vivax); 플라스모듐 오발레(plasmodium ovale); 플라스모듐 말라리에(plasmodium malariae); 기아다리아 인테스티날리스(giadaria intestinalis) 등이 있다.
미생물 항원은 스트렙토코커스 뮤탄스 유래의 글루코실트란스퍼라제일 수 있다. 글루코실트란스퍼라제는 치아의 표면에 에스.뮤탄스의 축적을 매개할 수 있다. 글루코실트란스퍼라제의 불활성화는 충치를 감소시키는 것으로 입증된 바 있다(Devulapalle and Mooser, 2001).
스트렙토코커스 뮤탄스 유래 항원의 또 다른 예는 PAc 단백질이다. PAc는 스트렙토코커스 뮤탄스의 콜로니형성에 관여하는 190kDa 표면 단백질 항원으로서, 치아 표면에 이 미생물의 최초 부착을 매개한다. 최근에는 에스.뮤탄스의 글루코실트란퍼라제-B에 의해 암호화된 아미노산 잔기 1185-1475와 에스.뮤탄스의 PAc 유전자에 의해 암호화된 아미노산 잔기 222-965의 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드 DNA의 생체내 투여가 상기 각 유전자 산물에 대한 면역반응을 유도한다고 보고되었다(Guo et al., 2004).
f. 항체를 암호화하는 핵산
본 명세서에 제시된 핵산은 항체를 암호화할 수 있다. "항체"란 용어는 항원결합 영역을 보유한 임의의 항체 유사 분자를 나타내는데 사용되며, 항체 단편, 예컨대 Fab', Fab, F(ab')2, 단일 도메인 항체(DAB), Fv, scFv(일본쇄 Fv) 등을 포함한다. 각종 항체계 작제물 및 단편을 제조 및 이용하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 항체를 제조 및 특성분석하는 방법도 당업계에 공지되어 있다. "항체"란 용어는, 본 명세서에 사용된 바와 같이, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE와 같은 임의의 면역학적 결합 인자를 포괄적으로 나타내기 위한 것이다. 일반적으로, IgG 및/또는 IgM은 생리학적 상태에서 가장 일반적인 항체이고 실험 장비로 가장 쉽게 만들어지기 때문에 바람직하다.
본 발명의 특정 양태에서, 본 명세서에 제시된 약제학적 조성물의 핵산은 일본쇄 항체를 암호화한다. 일본쇄 항체는, 각각 참고인용된 미국 특허 4,946,778 및 5,888,773에 기술되어 있다.
g. 리보자임
본 발명의 특정 양태에 따르면, 본 명세서에 제시된 약제학적 조성물의 핵산은 리보자임을 암호화하거나 포함한다. 통상, 단백질이 핵산의 촉매작용에 사용되었지만, 다른 부류의 거대분자도 상기 촉매작용에 유용한 것으로 밝혀지고 있다. 리보자임은 부위 특이적 방식으로 핵산을 절단하는 RNA-단백질 복합체이다. 리보자임은 엔도뉴클레아제 활성을 보유하는 특이적인 촉매성 도메인을 갖고 있다(Kim and Cook, 1987; Gerlach et al., 1987; Forster and Symons, 1987). 예를 들어, 다수의 리보자임은 높은 특이도로 포스포에스테르 전달 반응을 촉진하고, 종종 올리고뉴클레오타이드 기질의 여러 포스포에스테르 중 하나만을 절단한다(Cook et al., 1981; Michel and Westhof, 1990; Reinhold-Hur다 and Shub, 1992). 이러한 특이성은 화학적 반응 전에 리보자임의 내부 가이드 서열("IGS")에 기질이 특이적인 염기쌍 상호작용을 통해 결합해야 한다는 조건때문인 것으로 생각된다.
리보자임 촉매작용은 주로 핵산을 수반하는 서열 특이적 절단/결찰(ligation) 반응의 일부로서 관찰되었다(Joyce, 1989; Cook et al., 1981). 예를 들어, 미국 특허 5,354,855는 특정 리보자임이 공지의 리보뉴클레아제보다 서열 특이성이 크고 DNA 제한 효소와 비슷한 엔도뉴클레아제로서 작용할 수 있다. 따라서, 유전자 발현의 서열 특이적 리보자임 매개 억제는 치료적 용도에 특히 적합할 수 있다(Scanlon et al., 1991; Sarver et al., 1990). 최근에는 리보자임이 적용된 일부 세포주에서 리보자임이 유전자 변화를 유도하며; 변경된 유전자에는 종양유전자 H-ras, c-fos 및 HIV의 유전자가 있다는 보고가 있었다. 이 연구의 대부분은 특정 리보자임에 의해 절단된 특정 돌연변이 코돈을 기초로 한 표적 mRNA의 변경을 수반했다.
h. RNAi
본 발명의 특정 양태에 따르면, 본 명세서에 제시된 약제학적 조성물의 치료적 핵산은 RNAi 이다. RNA 간섭("RNA 매개 간섭" 또는 RNAi로도 불림)은 유전자 발현이 축소되거나 제거되는 기전이다. 이본쇄 RNA(dsRNA)는 다단계 과정인 축소를 매개하는 것으로 관찰되었다. dsRNA는 바이러스 감염 및 트란스포손 활성으로부터 세포를 방어하는 기능을 나타내는 해독후 유전자 발현 감시 기전을 활성화시킨다(Fire et al., 1998; Grishok et al., 2000; Ketting et al., 1999; Lin and Avery et al., 1999; Montgomery et al., 1998; Sharp and Zamore, 2000; Tabara et al., 1999). 이러한 기전의 활성화는 파괴할 성숙 dsRNA-상보성 mRNA를 표적으로 만든다. RNAi는 유전자 기능의 연구를 위한 주요 실험의 장점을 제공한다. 이러한 장점에는 매우 높은 특이성, 세포막을 따라 이동의 용이성 및 표적화된 유전자의 장기간의 하향조절이 있다(Fire et al., 1998; Grishok et al, 2000; Ketting et al., 1999; Lin and Avery et al., 1999; Montgomery et al., 1998; Sharp and Zamore, 2000; Tabara et al., 1999). 더욱이, dsRNA는 식물, 원생동물, 진균, C.엘레간스, 트립파나소마, 드로소필라 및 포유동물을 비롯한 다양한 생물계의 유전자를 침묵시키는 것으로 밝혀졌다(Grishok et al., 2000; Sharp et al., 1999; Sharp and Zamore, 2000; Elbashir et al., 2001). 일반적으로, RNAi는 전사후 작용하여 분해할 RNA 전사체를 표적화한다. 핵 및 세포질 RNA가 표적화될 수 있는 것으로 보인다(Bosher and Labouesse, 2000).
RNAi 기술분야의 당업자는 본 발명에 추가로 유사하게 사용될 수 있는 마이크로RNA(이에 국한되지 않는다)를 비롯한 다른 형태의 RNAi가 있음을 잘 알고 있다. 마이크로RNA는 본원에 전문이 구체적으로 참고인용된 문헌[Du and Zamore, 2005]에 기술되어 있다.
엔도리보뉴클레아제 Dicer는 유전자 발현을 조절하는 2종의 작은 조절 RNA, 즉 작은 간섭 RNA(siRNA) 및 마이크로RNA(miRNA)를 생산하는 것으로 알려져 있다(Bernstein et al., 2001; Grishok et al., 2001; Hutvagner et al., 2001; Ketting et al., 2001; Knight and Bass, 2001). 동물에서 siRNA는 표적 mRNA 절단을 유도하고(Elbashir et al., 2001), 이에 반해 miRNA는 표적 mRNA 해독을 차단한다(Reinhart et al., 2000; Brennecke et al., 2003; Xu et al., 2003). 최근의 데이터들은 siRNA와 miRNA가 유사한, 아마도 특히 동일한 단백질 복합체에 혼입되며, mRNA 파괴의 중요한 결정인자는 작은 RNA와 이의 mRAN 표적 사이의 서열 상보성 정도라는 것을 암시하고 있다(Hutvagner and Zamore, 2002; Mourelatos et al., 2002; Zeng et al., 2002; Doench et al., 2003; Saxena et al., 2003). 공지된 많은 miRNA 서열과 게놈 또는 염색체 내의 이들의 위치는 사이트 http:://www. Sanger. ac.uk/Software/Rfam/mirna/help/summary. shtml에서 찾아볼 수 있다.
siRNA는 당해 유전자의 발현을 억제하는데 특이적이고 효과적이도록 설계되어야 한다. 표적 서열, 즉 siRNA가 분해 기작을 유도할 당해 유전자 또는 유전자들에 존재하는 서열을 선택하는 방법은, 그 유전자 또는 유전자들에 특이적인 서열은 포함하는 반면 siRNA의 가이드 기능을 방해할 수 있는 서열은 피하도록 유도된다. 통상, 뉴클레오타이드 길이가 약 21 내지 23개인 siRNA 표적 서열이 가장 효과적이다. 이 길이는 앞에서 기술한 바와 같은 훨씬 긴 RNA의 프로세싱에 의한 분해 산물의 길이를 반영한다(Montgomery et al, 1998).
siRNA의 제조는 주로 직접 화학 합성을 통해; 초파리 배아 용해물에 노출시킨 더 긴 이본쇄 RNA의 프로세싱을 통해; 또는 S2 세포 유래의 시험관내 시스템을 통해 수행되었다. 세포 용해물의 사용이나 시험관내 프로세싱은 추가로 후속되는 용해물로부터의 짧은, 즉 21 내지 23개 뉴클레오타이드 siRNA의 분리를 수반하여, 공정을 다소 까다롭고 비용이 들게 만든다. 화학적 합성은 2개의 일본쇄 RNA-올리고머를 제조한 뒤, 2개의 일본쇄 올리고머를 이본쇄 RNA로 어닐링하여 진행시킨다. 화학적 합성 방법은 다양하다. 이의 비제한적 예는 분명하게 참고인용된 미국 특허 5,889,136, 4,415,723 및 4,458,066, 및 Wincott et al.(1995)에 제시되어 있다.
siRNA 서열의 안정성 변경 또는 그 효과 개선을 위하여, siRNA에 대한 여러 가지 추가 변경에 대해서도 제안되어 있다. 디뉴클레오타이드 오버행(overhang)을 보유한 합성 상보성 21량체 RNA(즉, 19개의 상보성 뉴클레오타이드 + 3' 비상보성 이량체)는 최대 억제 수준을 제공할 수 있는 것으로 제안되어 있다. 이들 프로토콜은 주로 디뉴클레오타이드 오버행으로서 2개의 (2'-데옥시) 티미딘 뉴클레오타이드의 서열을 이용한다. 이러한 디뉴클레오타이드 오버행은 RNA에 혼입되는 전형적인 뉴클레오타이드와 구별하기 위해 종종 dTdT라 쓰이기도 한다. 문헌에서는 dT 오버행의 사용이 주로 화학적으로 합성된 RNA의 비용을 줄이기 위한 필요에 의해 시도된 것이라고 나타내고 있다. 또한, dTdT 오버행은 이용가능한 데이터에서 UU 오버행을 보유한 siRNA에 비해 dTdT 오버행의 개선이 미약(<20%)할지라도 UU 오버행보다 더욱 안정적인 것으로 생각되고 있다.
화학적으로 합성된 siRNA는 세포 배양물에 25 내지 100nM의 농도로 존재할 때 최적의 작업성을 나타내는 것으로 밝혀져 있지만, 포유동물 세포에서의 발현의 효과적인 억제는 약 100nM의 농도에서 달성되었다. siRNA는 약 100nM에서 포유동물 세포 배양물에 가장 효과적이었다. 하지만, 몇몇 경우에는 화학적으로 합성된 siRNA가 저농도로 사용되었다(Caplen et al., 2000; Elbashir et al., 2001).
WO 99/32619 및 WO 01/68836은 siRNA에 사용하기 위한 RNA가 화학적 또는 효소적으로 합성될 수 있다고 제안한다. 이 두 명세서는 전문이 본원에 참고인용되었다. 이 문헌들에서 생각되는 효소적 합성은 당업계에 공지된 바와 같은 발현 작제물의 사용과 생산을 통한 세포 RNA 폴리머라제 또는 박테리오파지 RNA 폴리머라제(예, T3, T7, SP6)에 의해서이다(예컨대, 미국 특허 5,795,715 참조). 여기서 생각된 작제물들은 표적 유전자의 일부와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA를 생산하는 주형을 제공한다. 이 문헌들에 의해 제공된 동일한 서열의 길이는 적어도 25개 염기이며, 길이가 400개 이상의 많은 염기일 수도 있다. 이 문헌의 중요한 관점은 이의 저자들이 긴 dsRNA를 생체내에서 siRNA로 전환시키는 내인성 뉴클레아제 복합체를 이용하여 긴 dsRNA를 21 내지 25량체의 길이로 분해하는 것을 기획한 점이다. 그러나, 이들은 시험관내 전사된 21 내지 25량체 dsRNA의 합성 및 사용에 대한 데이터를 설명하거나 제시하지는 않았다. 화학적 또는 효소적으로 합성된 dsRNA가 RNA 간섭에 사용될 때의 예상 성질 간에는 어떠한 차이도 없었다.
이와 유사하게, 본원에 참고인용된 WO 00/44914는 RNA의 일본쇄가 효소적 또는 부분/전체 유기 합성에 의해 생산될 수 있음을 암시한다. 일본쇄 RNA는 DNA 주형의 PCR™ 산물로부터 효소적으로 합성되는 것이 바람직하고, 클로닝된 cDNA 주형과 RNA 산물은 수백개의 뉴클레오타이드를 함유할 수 있는 cDNA의 완전한 전사체인 것이 바람직하다. 본원에 참고인용된 WO 01/36646은 RNA가 수동 및/또는 자동 절차에 의해 시험관내 또는 생체내에서 합성될 수 있기만 하다면 siRNA가 합성되는 방식에 어떠한 제한을 두지 않는다. 또한, 이 문헌은 시험관내 합성이, 예를 들어 내인성 DNA(또는 cDNA) 주형의 전사를 위해 클로닝된 RNA 폴리머라제(예, T3, T7, SP6)를 이용하는 효소적 합성 또는 화학적 합성이거나, 또는 이 둘의 복합 방법일 수 있음을 제공한다. 또한, 화학적 또는 효소적으로 합성된 siRNA 간에는 RNA 간섭에 사용하는데 필요한 성질에 어떠한 차이가 없다.
미국특허 5,795,715는 2개의 전사체가 직접 하이브리드화되는 단일 반응 혼합물에서 2개의 상보성 DNA 서열 가닥의 동시 전사에 대해 보고한다. 사용된 주형은 각 말단에 프로모터 서열이 장착된 40 내지 100개 염기쌍인 것이 바람직하다. 이러한 주형은 고체 표면에 부착된 것이 바람직하다. RNA 폴리머라제를 이용한 전사 후, 수득되는 dsRNA 단편은 핵산 표적 서열을 검출 및/또는 분석하는데 사용될 수 있다.
미국 특허 출원번호 20050203047은 전사 RNA(tRNA) 암호화 서열에 siRNA 또는 miRNA 서열을 혼입시켜 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 제어하는 방법을 보고한다. siRNA 또는 miRNA 서열을 포함하는 tRNA는 발현된 tRNA에 상기 서열이 스플라이싱되도록 핵산 발현 작제물에 도입될 수 있다. siRNA 또는 miRNA 서열은 프로세싱되지 않은 tRNA 전사체와 결합된 인트론 내에 위치하거나 또는 tRNA 전사체의 어느 한 말단에 위치할 수 있다.
i. 다른 치료적 핵산
치료적 핵산의 다른 예에는 CpG 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오타이드("CpG 올리고뉴클레오타이드")가 있다. 세균 DNA는 시험관내에서 말초 혈액 단핵 세포에 대해 직접적인 면역자극 효과가 있다는 것이 입증되어 있다(Messina et al., 1991). 이러한 효과에는 B 세포의 증식과 면역글로불린 Ig 분비 증가가 포함된다(Krieg et al., 1995). 또한, 이러한 효과들에는 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포의 활성화를 통한 IL-12를 비롯한 Th1 사이토카인 분비가 있다(Klinman, et al., 1996; Halpern et al., 1996; Cowdery et al., 1996). 분비된 Th1 사이토킨은 천연 킬러(NK) 세포를 자극하여 γ-인터페론을 분비하고, 증가된 용해 활성을 나타낸다(Klinman et al., 1996, 상기 문헌설명 참조; Cowdery et al., 1996, 상기 문헌 설명 참조; Yamamoto et al., 1992). 이러한 자극 효과는 종종 특정 서열 환경(CpG-S) 중의 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오타이드의 존재때문이다(Krieg et al., 1995).
CpG-S 서열에 의한 B 세포 활성화는 T 세포 독립적이고 항원 비특이적이다. 그럼에도 불구하고, CpG-S 서열은 B 세포 항원 수용체를 통해 전달된 시그널과 강한 상승작용을 나타낸다. B 세포 항원 수용체와의 상호작용은 항원 특이적 반응을 촉진하여, 면역 자극 보강제로서 CpG 서열의 바람직성을 암시한다.
CpG-S 서열은 사이토신-구아닌 디뉴클레오타이드를 포함하고, 일반적으로 크기가 2 내지 100개 염기쌍이다. 컨센서스 CpG-S 서열은 화학식 5'X1X2CGX3X4 3'로 표시되고, 여기서 X1, X2, X3 및 X4는 뉴클레오타이드이며, 5' 및 3' 말단이나 그 부근에는 GCG 트리뉴클레오타이드 서열이 존재하지 않는다. CpG-S 서열의 예에는 GACGTT, AGCGTT, AACGCT, GTCGTT 및 AACGAT가 있다.
이에 반해, 아데노바이러스 혈청형 2와 같은 일부 미생물들은 면역 중화성인 것으로 보이는 CpG 서열을 포함한다. 이러한 바이러스에서, 대부분의 CpG 서열은 직접 반복체의 클러스터에서 발견되거나 5' 측에 C를 또는 3' 측에 G를 보유한다. 이러한 CpG 서열은 시험관내에서 CpG-S 서열에 의한 Th1형 면역 활성화를 차단한다는 점에서 면역 중화성(CpG-N)이다. 이와 유사하게, CpG-N과 CpG-S 서열을 항원과 함께 투여할 때, 항원 특이적 면역 반응은 CpG-S 서열만을 사용한 경우에 비해 무디어진다. CpG-N 서열만이 항원과 함께 생체내에 투여될 때에는, Th2 유사 항원 특이적 면역 반응이 발생한다.
GpG-N 서열도 역시 사이토신-구아닌 디뉴클레오타이드를 함유하고, 일반적으로 길이가 2 내지 100개 염기쌍 사이이다. 컨센서스 CpG-N 서열은 식 5'GCGXnGCG3' 로 표시되며, 여기서 X는 임의의 뉴클레오타이드이고 n은 0 내지 50의 범위이다.
따라서, 핵산 작제물 중의 뉴클레오타이드 서열은 CpG-S 서열의 수를 증가시키도록 처리될 수 있다. 이러한 작제물은 또한 CpG-N 서열의 수를 감소시키도록 처리될 수 있다. 예를 들어, 당업자는 CpG 모티프를 하나 이상 보유한 바람직한 핵산 서열을 제조하기 위해 부위 지시된 돌연변이유발을 이용할 수 있다. 대안적으로, 특정 CpG 서열은 합성하여 핵산 작제물에 삽입할 수 있다. 이의 비제한적 예는 본원에 분명하게 참고인용되는 미국 특허 5,889,136, 4,415,723 및 4,458,066에 제시되어 있다.
미국 특허 6,194,388 및 미국 특허 6,207,646은 면역 자극에 사용되는 GpG 올리고뉴클레오타이드가 분해에 대한 내성을 제공하는 안정화가 이루어질 수 있음을 제안한다. 두 명세서는 모두 전문이 본 발명에 참고인용되었다. 이러한 문헌들에서 고찰된 안정화 과정은 포스페이트 주쇄 변경을 통해 달성된다. 바람직한 안정화 올리고뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 변경된 주쇄를 보유한다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드의 약동학은 설치류에서의 전신 반감기가 48시간임을 입증한다(Agrawal et al., 1991). 이러한 포스포로티오에이트는 포스포아미데이트 또는 H 포스포네이트 화학을 이용한 자동화 기술을 이용하여 합성할 수 있다. 아릴- 및 알킬- 포스포네이트는 미국 특허 4,469,863에 기술되 바와 같이 제조할 수 있고, 하전을 띤 산소 잔기가 알킬화된 알킬포스포트리에스테르는 미국 특허 5,023,243에 기술되어 있다. 이 문헌들은 각각 전문이 본원에 참고인용되었다. DNA 주쇄 변경과 치환을 실시하는 다른 방법도 개시되어 있다(Uhlmann, E. and Peyman, A., 1990 and Goodchild, 1990).
미국 특허 6,206,646은, 포스포로티오에이트 주쇄를 보유한 비메틸화된 CpG 함유 핵산은 B-세포 활성을 우선적으로 활성화시키는 반면, 포스포디에스테르 주쇄를 보유한 비메틸화된 CpG 함유 핵산 분자는 대식세포, 수지상 세포, 단핵구 및 NK 세포를 우선적으로 활성화시키는 것으로 밝혀졌음을 보고하고 있다. 변경은 우선적으로 핵산 분자의 5' 및/또는 3' 말단에서 또는 그 부근에서 일어난다.
미국 특허 6,339,068은 면역 자극을 위한 DNA 벡터가 CpG-N 서열을 제거함으로써 개량될 수 있고, CpG-S 서열을 첨가함으로써 추가 개량될 수 있음을 보고하고 있다. 또한, 발현 수준을 장기 지속적으로 높은 수준으로 유지하기 위해, 최적화된 벡터는 면역자극성 CpG 서열에 의해 유도된 사이토카인에 의해 하향조절되지 않는 프로모터/인핸서를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, B형 간염 표면 항원 유전자를 암호화하는 플라스미드계 DNA 벡터의 제조방법에 대해서도 보고되었다. 하지만, 동 문헌은 CpG-S 서열이 면역 자극 효과를 위해서 동일한 위치(즉, 항원 암호화 플라스미드 위에) 또는 동시에 투여되어야 한다고 지적한다. 따라서, 변경이 항원 서열 자체에 이루어져야 한다는 것을 나타내지는 않는다.
미국 특허 6,399,068은 또한 NFκB가 CpG 효과의 매개인자임을 보고한다. 예를 들어, CpG 서열로 B 세포 또는 단핵구를 처리한 지 15분 이내에 NFκB 결합 활성의 수준은 증가하는 한편, 상기 서열을 포함하지 않는 DNA로 처리된 동일한 종류의 세포도 변화를 나타낸다. 이 문헌은 또한 NFκB 활성화 억제가 CpG 서열에 의한 림프구 자극을 차단한다는 것을 보고하고 있다. 또한, B 세포 및 단핵구 세포에 의한 반응성 산소 종의 생산에 급속한 유도를 유발하는 CpG DNA는 문헌[Royall and Ischiropoulos, 1993]에 기술된 바와 같이 민감한 형광염료 디하이드로로다민 123에 의해 검출되었다. 또한, CpG DNA로 B 세포를 처리한 후의 반응성 산소 종의 생성에는 엔도솜 내에서 DNA의 산성화 단계가 이루어져야 한다. CpG 모티프를 보유하거나 보유하지 않은 5' 방사능 표지된 올리고뉴클레오타이드를 이용한 전기영동적 이동성 변경 분석(EMSA)에 의거할 때, CpG 서열을 보유한 일본쇄 올리고뉴클레오타이드에 특이적으로 단백질 결합을 나타내는 것으로 보이는 밴드가 발견되었다. 이러한 결합은 NFκB 결합 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 첨가되면 차단되는 것으로 보고되었다.
본 명세서에 구체적으로 제시되지 않은 질환 또는 건강 관련 상태의 치료 또는 예방에 유익한 것으로 고찰되는 임의의 다른 핵산도 역시 본 발명의 조성물 및 방법에 포함되는 것으로 생각되어야 한다. 본 명세서에 제시된 치료적 핵산은 추가로 리포터 서열을 포함하거나 암호화할 수 있다. 리포터 서열은 이하에 더 상세히 논한다.
3. 진단적 핵산
본 발명의 약제학적 조성물은 진단적 핵산인 핵산을 포함할 수 있다. "진단적 핵산"은 질환 또는 건강 관련 상태의 진단에 적용될 수 있는 핵산이다. 또한, "진단적 핵산"에는 하나 이상의 리포터 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 포함된다. "리포터 단백질"은 세포 또는 조직에 존재하는 다른 유전자 서열 또는 암호화된 폴리펩타이드로부터 검출할 수 있고 구별할 수 있는 아미노산 서열을 의미한다. 일부 양태에 따르면, 치료적 유전자는 리포터로서 융합될 수도 있고, 또는 별도의 단백질로서 생산될 수도 있다. 예를 들어, 당해 유전와 리포터는 별도의 전달 매개제에서 별도의 프로모터에 의해, 공동형질감염(공동감염)에 의해 유도되거나 또는 동일한 전달 매개제에서 별도의 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 또한, 두 유전자는 동일한 프로모터에, 예컨대 내부 리보솜 진입 부위에 의하여 결합되거나 또는 양방향 프로모터에 결합될 수 있다. 이러한 기술을 사용할 때, 당해 유전자와 리포터의 발현은 상관성이 있다. 따라서, 당해 유전자의 발현 위치, 함량 및 지속 기간을 측정할 수 있다. 당해 유전자는 예를 들어 항암 유전자, 예컨대 종양 억제인자 유전자 또는 아폽토시스 유도 유전자일 수 있다.
세포는 리포터 유전자로 형질감염될 수 있기 때문에, 리포터는 세포 교섭(trafficking)에 사용될 수 있다. 예를 들어, 시험관내에서 특정 세포는 리포터로 형질감염한 다음, 동물에게 다시 투입하여 회귀성을 평가할 수 있다. 다발성 경화증에 대한 자가면역 뇌척수염 실험 모델에서, 코스타 등(2001)은 IL-12 p40 및 루시퍼라제를 발현하도록 형질도입된 미엘린 염기성 단백질 특이적 CD4+ T 세포를 전달했다. 루시퍼라제는 생체내에서 중추신경계와의 교섭을 입증하기 위해 사용되었다. 또한, IL-12 p40은 염증을 억제했다. 양전자 방출 단층촬영술(PET)을 이용하는 다른 시스템에서, 코엔(Koehne) 등(2003)은 헤르페스 단순 바이러스-1 티미딘 키나제(HSV-TK)를 발현하는 엡스타인 바 바이러스(EBV) 특이적 T 세포가 T 세포의 제한성 HLA 대립유전자(allele)를 발현하는 EBV+ 종양과 선택적으로 교섭한다는 것을 생체내에서 입증했다. 또한, 이러한 T 세포들은 표적화된 종양을 제거하는 능력을 유지한다. 더베이 등(2003)은 순차 조영술에 투자하여, HSV-TK를 발현하는 T 세포가 쥐 육종 바이러스/몰로니 쥐 백혈병 바이러스(M-MSV/M-MuLV)에 의해 유도된 종양에 항원 특이적 국재화됨을 입증했다. 조직 특이적 프로모터는 또한 분화, 예컨대 줄기 세포 분화 또는 간세포와의 융합을 평가하고 분화된 세포의 특징, 예컨대 타입 II 폐세포에서 계면활성 프로모터의 활성화 등을 규명하는데 사용될 수 있다.
바람직하게는, 리포터 서열은 그 존재, 검출성 잔기와의 결합 또는 검출성 시그널을 생성시키는 활성에 의해 쉽게 검출할 수 있는 단백질을 암호화한다. 특정 관점에서, 검출성 잔기는 방사선핵종, 플루오로포어, 루미노포어, 마이크로입자, 마이크로스피어, 효소, 효소 기질, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 나노입자 및/또는 나노스피어를 포함할 수 있고, 이들 모두 리포터를 인식 및/또는 상호작용하는 리간드 또는 항체에 커플링될 수 있다.
다양한 양태에 따르면, 본 발명의 핵산 서열은 리포터 핵산 서열을 포함하거나 또는 검출성 폴리펩타이드를 유발하는 산물을 암호화한다. 리포터 단백질은 검출성 시그널을 직접 또는 간접적으로 생성할 수 있다. 리포터 유전자는 반드시 필요한 것은 아니지만, 일반적으로 세포에 의해 생산되지 않는 핵산 서열을 포함하고(하거나) 검출성 폴리펩타이드를 암호화한다. 많은 리포터 유전자에 대해서는 개시되어 있고, 일부는 유전자 조절 연구에 상업적으로 이용되고 있다(예, Alam and Cook, 1990, 이 명세서는 본 발명에 참고인용되었다). 검출될 수 있는 시그널로는 색, 형광, 발광, 동위원소 또는 방사성동위원소 시그널, 세포 표면 태그, 세포 생육성, 세포 영양 요구성의 경감, 세포 증식 및 약물 내성이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 리포터 서열에는 β-락타마제, β-갈락토시다제(LacZ), 알칼리 포스파타제, 티미딘 키나제, 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제(CAT), 루시퍼라제, 막결합 단백질, 예컨대 G 단백질 커플링된 수용체(GPCR), 소마토스타틴 수용체, CD2, CD4, CD8, 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질, 공동수송인자(예, NIS) 및 이들에 대한 높은 친화성 항체 또는 리간드가 존재하거나 통상적인 방법으로 생산될 수 있는 당업계에 공지된 기타 물질, 및 막결합 단백질이 특히 헤마글루티닌 또는 Myc 유래의 항원 태그 도메인에 적당하게 융합되어 있는 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이 있으나, 이에 국한되지는 않는다. 쿤드라 등(2002)은 생체분포 연구 및 감마 카메라 조영술을 이용하여 시험관내 및 생체내에서 소마토스타틴 수용체 타입 2 키메라 유전자 전달의 비침습적 모니터링에 대해 입증했다.
일부 양태에 따르면, 리포터 서열은 형광 단백질을 암호화한다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 형광 단백질의 예에는 녹색 형광 단백질(GFP), 증강된 녹색 형광 단백질(EGFP), 레닐라 레니포미스(Renilla Reniformis) 녹색 형광 단백질, GFPmut2, GFPuv4, 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 증강된 청록색 형광 단백질(ECFP), 증강된 청색 형광성 단백질(EBFP), 디스코소마 유래의 담황색 및 적색 형광 단백질(dsRED)이 있다.
각종 양태에 따르면, 적어도 하나의 리포터 서열의 목적하는 발현 수준은 진단적 핵산의 기본 전사 수준과 비교했을 때, 리포터 서열 발현 수준의 증가, 감소 또는 무변화이다. 특정 양태에 따르면, 리포터 서열 중 하나의 목적하는 발현 수준은 리포터 서열의 기본 전사 수준과 비교했을 때 리포터 서열의 발현 수준의 증가이다.
각종 양태에 따르면, 리포터 서열은 독립적으로, 동시에 또는 독립적이면서 동시에 분석될 수 있는 고유한 검출성 단백질을 암호화한다. 다른 양태에 따르면, 숙주 세포는 진핵생물 세포 또는 원핵생물 세포일 수 있다. 진핵생물 세포의 예에는 효모 및 포유동물 세포가 있다. 포유동물 세포에는 사람 세포 및 병리학적 표현형을 나타내는 각종 세포, 예컨대 암 세포가 있다.
예를 들어, 일부 리포터 단백질은 가시광선 및/또는 자외선 하에서 쉽게 관찰할 수 있는 세포의 색 변화를 유도한다. 리포터 단백질은 당업자에게 공지된 임의의 리포터 단백질일 수 있다. 그 예에는 gfp, rfp, bfp 및 루시퍼라제가 있다.
리포터 단백질을 암호화하는 핵산에는 각 리포터 아미노산 서열의 활성 단편을 암호화하는 DNA, cRNA, mRNA 및 이의 부분서열, 뿐만 아니라 이 서열들을 포함하는 벡터가 있다.
리포터 단백질의 조영화 방법의 예에는 감마 카메라 조영술, CT, MRI, PET, SPECT, 광학조영술 및 초음파가 있다. 일부 양태에 따르면, 진단적 핵산은 1가지보다 많은 기법을 이용하는 조영술, 예컨대 CT와 MRI, PET 및 SPECT 등에 적합하다.
조영술에 사용되는 리포터의 예에 속하는 추가 정보에 대해서는 본 발명에 전문이 참고인용된 Kumar, 2005; Kundra et al., 2005; Kundra et al., 2002에 제시되어 있다.
4. 안티센스 작제물
본 명세서에 제시된 일부 양태에 따르면, 핵산은 안티센스 작제물을 암호화한다. 안티센스 방법론은 핵산이 "상보성" 서열과 쌍을 이루는 경향이 있다는 사실을 이용한다. 상보성이란, 폴리뉴클레오타이드가 표준 왓슨-크릭의 상보성 규칙에 따라 염기쌍을 형성할 수 있는 것을 의미한다. 즉, 큰 퓨린은 작은 피리미딘과 염기쌍을 이루어, 사이토신과 쌍을 이룬 구아닌(G:C) 및 DNA의 경우에는 티민과 쌍을 이룬 아데닌(A:T) 또는 RNA의 경우에는 우라실과 쌍을 이룬 아데닌(A:U)의 조합을 형성한다. 하이드리드화 서열에 덜 일반적인 염기, 예컨대 이노신, 5-메틸사이토신, 6-메틸아데닌, 하이포크산틴 등의 포함은 쌍 형성을 방해하지 않는다.
폴리뉴클레오타이드로의 이본쇄(ds) DNA의 표적화는 삼본쇄 형성을 유도하고, RNA 표적화는 이본쇄 형성을 유도할 것이다. 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 표적 세포에 도입되면, 특이적으로 표적 폴리뉴클레오타이드에 결합하여, 전사, RNA 프로세싱, 수송, 해독 및/또는 안정성을 방해한다. 안티센스 RNA 작제물 또는 이러한 안티센스 RNA를 암호화하는 DNA는 사람 피험체를 비롯한 숙주 동물 내에서와 같은 시험관내 또는 생체 내의 숙주 세포 내에서 유전자 전사 또는 해독, 또는 이 둘 모두를 억제하는데 이용될 수 있다.
안티센스 작제물은 유전자의 프로모터 및 다른 조절 영역, 엑손, 인트론 또는 심지어 엑손-인트론 경계에 결합하도록 설계될 수 있다. 가장 효과적인 안티센스 작제물은 인트론/엑손 스플라이스 접합부에 상보적인 영역을 포함하는 것으로 생각된다. 따라서, 바람직한 양태는 인트론-엑손 스플라이스 접합부의 50 내지 200개 염기 내의영역에 상보성이 있는 안티센스 작제물을 포함한다. 일부 엑손 서열은 이의 표적 선택성에 크게 영향을 미침이 없이 작제물에 포함될 수 있는 것으로 관찰되었다. 포함된 엑손성 물질의 양은 사용된 특정 엑손과 인트론 서열에 따라 달라질 것이다. 당업자는 너무 많은 엑손 DNA가 포함되었는지의 여부를, 작제물이 정상 세포 기능에 영향을 미치는지를 측정하거나 또는 상보성 서열을 보유한 관련 유전자의 발현에 영향을 미치는지를 측정하게 위해 작제물을 간단히 시험관내에서 검사함으로써 쉽게 확인할 수 있다.
전술한 바와 같이, "상보성" 또는 "안티센스"는 전체 길이 상에서 실질적으로 상보성이고 극소수의 염기 부정합이 있는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 예를 들어, 염기 길이가 15개인 서열은 13개 또는 14개 위치들에 상보성 뉴클레오타이드를 보유한 경우에 상보성이라 할 수 있다. 본래, 완전히 상보성인 서열은 전체 길이 상에서 완전히 상보성이고 어떠한 염기 부정합도 없는 서열일 것이다. 이보다 상동성 정도가 낮은 서열도 고려될 수 있다. 예를 들어, 높은 상동성의 제한된 영역을 보유하지만, 비상동성 영역(예, 리보자임; 이하 참조)도 포함하는 안티센스 작제물을 설계할 수 있다. 이러한 분자들은 상동성이 50%보다 낮지만, 적당한 조건 하에서 표적 서열에 결합할 것이다.
특이적인 작제물을 제조하기 위해, 게놈 DNA의 일부를 cDNA 또는 합성 서열과 조합하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 최종 작제물에 하나의 인트론이 바람직한 경우에는 게놈 클론이 사용되어야 한다. cDNA 또는 합성된 폴리뉴클레오타이드는 작제물의 나머지 일부를 위해 더욱 편리한 제한 부위를 구비하여, 서열의 나머지를 위해 사용될 수 있는 것이다.
B. 발현 카세트
1. 개론
본 발명의 특정 양태에 따르면, 본 명세서에 제시된 약제학적 조성물 및 방법은 치료적 또는 진단적 핵산을 수반하고, 이 때 핵산은 "발현 카세트"에 포함된다. 본 명세서에 전반에서, "발현 카세트"란 용어는 핵산 암호화 서열의 일부 또는 전부가 전사될 수 있는, 유전자 산물을 암호화하는 핵산을 포함하는 임의의 종류의 유전자 작제물을 포함하는 것을 의미한다.
2. 프로모터 및 인핸서
발현 카세트가 전사체의 발현을 실시하도록 하기 위해, 진단적 또는 치료적 유전자를 암호화하는 핵산은 프로모터의 전사 조절 하에 위치할 수 것이다. "프로모터"는 전사 개시 및 속도가 조절되는 핵산 서열의 영역인 조절 서열이다. RNA 폴리머라제 및 다른 전사 인자와 같은 조절 단백질과 분자가 결합할 수 있는 유전 인자를 함유할 수 있다. "작동적으로 위치된", "작동적으로 결합된", "조절 하에" 및 "전사 조절 하에"란 표현은 프로모터가 핵산 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 조절하기 위해 상기 핵산 서열에 대해 정확한 위치 및/또는 배향으로 존재하는 것을 의미한다. 프로모터는 핵산 서열의 전사 활성화에 관여하는 시스 작용성 조절 서열을 의미하는 "인핸서"와 함께 사용되거나 사용되지 않을 수 있다.
피험체 내의 임의의 세포 중의 한 세포에서 활성일 수 있는 당업자에게 공지된 임의의 프로모터는 본 발명의 방법과 조성물에서 적용될 수 있는 프로모터로서 생각되어야 한다. 다른 부분에서 논한 바와 같이, 피험체는 사람 및 다른 포유동물을 비롯한 임의의 피험체, 예컨대 마우스 또는 실험용 동물일 수 있다. 당업자는 본 발명의 방법과 조성물에 적용될 수 있는 수많은 종류의 프로모터를 잘 알고 있을 것이다. 특정 양태에 따르면, 예컨대 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 또는 억압성 프로모터이다. 또한, 프로모터는 조직 선택적 프로모터일 수 있다. 본 명세서에서 정의되는 조직 선택적 프로모터는 다른 조직 종류에 비해 특정 조직 종류에서 비교적 더욱 활성인 임의의 프로모터를 의미하는 것이다. 따라서, 예를 들어, 간 특이적 프로모터는 신체의 다른 조직에 비해 간에서 더욱 활성인 프로모터일 수 있다. 조직 선택적 프로모터의 한 종류는 종양 선택적 프로모터이다. 본 명세서에서 정의되는 종양 선택적 프로모터는 다른 조직 종류에 비해 종양 조직에서 더욱 활성인 프로모터를 의미하는 것이다. 이 프로모터는 다른 조직 종류에서도 약간의 기능이 있을 수 있지만, 다른 조직 종류에 비해 종양 조직에서 비교적 더욱 활성적이다. 종양 선택적 프로모터의 예에는 hTERT 프로모터, CEA 프로모터, PSA 프로모터, 프로바신(probasin) 프로모터, ARR2PB 프로모터 및 AFP 프로모터가 있다.
프로모터는 특정 표적 세포에서 활성인 것일 수 있다. 예를 들어, 표적 세포가 각질세포인 경우에, 프로모터는 각질세포에서 활성이 있는 것일 것이다. 이와 유사하게, 세포가 상피세포, 피부세포, 점막세포 또는 유두종바이러스에 의해 형질전환을 겪을 수 있는 임의의 다른 세포인 경우에, 이러한 양태에서 사용된 프로모터는 그러한 특정 세포 종류에서 활성이 있는 것일 것이다.
프로모터는 암호화 분절 및/또는 엑손의 상류에 위치한 5' 비암호화 서열을 분리하여 수득할 수 있는 바와 같은 유전자 또는 서열과 자연적으로 결합된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"이라고 말할 수 있다. 이와 유사하게, 인핸서는 핵산 서열에 이 서열의 상류 또는 하류에 위치하여 자연적으로 결합된 것일 수 있다. 대안적으로, 자연 환경에서 핵산 서열과 일반적으로 결합되어 있지 않은 프로모터를 의미하는 재조합 또는 이종 프로모터의 조절 하에 암호성 핵산 분절을 위치시키면 특정한 장점이 수득될 수도 있다. 재조합 또는 이종 인핸서는 또한 자연 환경에서 핵산 서열과 일반적으로 결합되어 있지 않은 인핸서를 의미한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 및 임의의 다른 원핵생물, 바이러스 또는 진핵생물 세포에서 분리된 프로모터 또는 인핸서, 및 "자연 발생"이 아닌, 즉 발현을 변경시키는 돌연변이 및/또는 다른 전사 조절 영역 다른 인자를 포함하는 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생산하는 것 외에도, 서열은 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술, 예컨대 PCR™을 본 명세서에 제시된 조성물과 관련하여 생산될 수 있다(미국 특허 4,683,202 및 미국 특허 5,928,906 참조, 모두 본원에 참고인용됨). 또한, 비핵 소기관, 예컨대 미토콘드리아 등 내에서 서열의 전사 및/또는 발현을 유도하는 조절 서열도 사용될 수 있는 것으로 생각되어야 한다.
물론, 발현을 위해 선택한 세포 종류, 소기관 및 유기체 내에서 DNA 분절의 발현을 효과적으로 유도하는 프로모터 및/또는 인핸서를 이용하는 것이 중요할 것이다. 분자생물학계의 당업자는 일반적으로 단백질 발현을 위한 프로모터, 인핸서 및 세포 종류의 조합 사용을 잘 알고 있으며, 그 예는 본원에 참고인용된 문헌[Sambrook et al.(2001)]을 참고할 수 있다. 사용된 프로모터는 도입된 DNA 분절의 고도 발현 수준을 유도하기에, 예컨대 재조합 단백질/또는 펩타이드의 대량 생산에 유리한 적당한 조건 하에서 구성적, 조직 특이적, 유도성이고/이거나 유용한 것일 수 있다. 프로모터는 이종성 또는 내인성일 수 있다.
당해 핵산의 발현을 조절하는데 사용되는 특정 프로모터는 표적화된 세포 중의 폴리뉴클레오타이드를 충분한 수준으로 발현할 수 있는 한, 중대한 것이라 생각하지는 않는다. 즉, 사람 세포가 표적화되는 경우, 폴리뉴클레오타이드 암호 영역은 사람 세포에서 발현될 수 있는 프로모터의 조절하에 인접하게 위치시키는 것이 바람직하다. 일반적으로 말하면, 이러한 프로모터는 사람 또는 바이러스 프로모터를 포함할 수 있다.
각종 양태에 따르면, 사람 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉 조기(immediate early) 유전자 프로모터, SV40 조기 프로모터 및 루스 육종 바이러스 장말단 반복체가 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 발현을 달성하는 것으로 당업자에게 공지된 다른 바이러스 또는 포유동물의 세포 또는 세균의 파지 프로모터도 역시 증식 억제 효과를 제공하기에 충분한 발현 수준이기만 하다면 고려될 수 있다.
공지된 성질을 가진 프로모터의 사용 시, 형질감염 후 폴리뉴클레오타이드의 발현 수준 및 패턴은 최적화될 수 있다. 예를 들어, 특정 세포에서 활성인 프로모터, 예컨대 타이로신(흑색종), 알파태아단백질 및 알부민(간 종양), CC10(폐 종양) 및 전립선 특이적 항원(전립선 종양)의 선택은 본 명세서에 제시된 치료적 핵산을 조직 특이적 발현시킬 것이다. 표 2에는 본 발명의 상황에서 항암 유전자의 발현을 조절하기 위해 이용될 수 있는 프로모터/인자의 다른 예를 정리했다. 이 리스트는 가능한 모든 프로모터와 인핸서 인자를 배타적으로 설명하기 위한 것으로 간주되어서는 아니되고 단지 예시하기 위한 것이다.
Figure 112007060525920-PCT00001
Figure 112007060525920-PCT00002
인핸서는 처음에는 DNA의 동일한 분자에서 원거리 위치에 존재하는 프로모터로부터 전사를 증가시킨 유전 인자로서 검출되었다. 원거리 상에서 작용하는 이러한 능력은 고전적인 원핵생물 전사 조절의 연구에서 전례가 거의 없었다. 이후 연구에서, 인핸서 활성을 보유한 DNA 영역은 조직화된 매우 유사한 프로모터인 것으로 밝혀졌다. 즉, 이들은 다수의 개별적 인자들로 구성되고, 각각 하나 이상의 전사 단백질에 결합한다.
인핸서와 프로모터의 기본적인 차이는 작동성이다. 인핸서 영역은 대체로 일정 거리에서 전사를 자극할 수 있어야 하고, 이것은 프로모터 영역이나 이의 구성 인자에서는 필요하지 않은 것이다. 한편, 프로모터는 특정 부위에서 특정 배향으로 RNA 합성의 개시를 유도하는 하나 이상의 인자를 보유해야 하는 반면, 인핸서는 이러한 특이성이 없다. 프로모터와 인핸서는 종종 중첩되고 인접하여, 종종 매우 유사한 분자 기구인 것으로 보이기도 한다.
또한, 임의의 프로모터/인핸서 조합(Eukaryotic Promoter Data Base EPDB에 에 따라서)은 진단적 또는 치료적 유전자의 발현을 유도하는데 사용될 수 있다. T3, T7 또는 SP6 세포질 발현 시스템의 사용은 가능한 또 다른 양태이다. 진핵생물 세포는 적당한 박테리오파지 폴리머라제가 전달 복합체의 일부로서 또는 추가 발현 벡터로서 제공된다면 특정 박테리오파지 프로모터로부터 세포질 전사를 유도할 수 있다.
특정 생리적 시그널에 대한 반응으로 조절되는 프로모터의 추가 선택은 작제물의 유도성 발현을 허용할 수 있다. 예를 들어, 사람 PAI-1 프로모터의 조절 하의 폴리뉴클레오타이드인 경우에, 발현은 종양 괴사 인자에 의해 유도될 수 있다. 표 3은 특정 자극에 대한 반응으로 활성화될 수 있는 핵산 서열의 영역들인 유도성 인자의 예를 제공한다.
인자 유도인자 참조문헌
MT II 포르볼 에스테르(TFA) 중금속 Palmiter et al., 1982; Haslinger et al., 1985; Searle et al., 1985; Stuart et al., 1985; Imagawa et al., 1987, Karin et al., 1987; Angel et al., 1987b; McNeall et al., 1989
MMTV(마우스 유방암 바이러스) 글루코코르티코이드 Huang et al., 1981; Lee et al., 1981; Majors et al., 1983; Chandler et al., 1983; Ponta et al., 1985; Sakai et al., 1988
β-인터페론 폴리(rI)x 폴리(rc) Tavernier et al., 1983
아데노바이러스 5 E2 E1A Imperiale et al., 1984
콜라게나제 포르볼 에스테르(TPA) Angel et al., 1987a
스트로멜리신 포르볼 에스테르(TPA) Angel et al., 1987b
SV40 포르볼 에스테르(TPA) Angel et al., 1987b
쥐 MX 유전자 인터페론, 뉴캣슬병 바이러스 Hug et al., 1988
GRP78 유전자 A23187 Resendez et al., 1988
α-2-마크로글로불린 IL-6 Kunz et al., 1989
비멘틴 혈청 Rittling et al., 1989
MHC 클래스 I 유전자 H-2kb 인터페론 Blanar et al., 1989
HSP70 E1A, SV 40 라지 T 항원 Taylor et al., 1989, 1990a, 1990b
프롤리페린 포르볼 에스테르-TPA Mordacq et al., 1989
종양 괴사 인자 Hensel et al., 1989
갑상선자극호르몬α 유전자 갑상선 호르몬 Chatterjee et al., 1989
3. 리포터 유전자
본 발명의 특정 양태에 따르면, 발현 카세트의 전달은 발현 벡터 내에 리포터 유전자의 함유에 따라 시험관내 또는 생체내에서 확인할 수 있다. 리포터 유전자는 형질감염된 세포에 식별가능한 변화를 초래하여 용이한 발현 확인을 허용한다. 보통, 약물 선택 마커의 함유는 클로닝 및 형질감염체의 선발에 도움을 준다. 대안적으로, β-갈락토시다제(β-gal) 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제(tk)(진핵생물) 또는 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제(CAT)(원핵생물)와 같은 효소가 사용될 수 있다. 형광 및 화학발광성 마커 역시 고려된다. 면역학적 마커도 사용될 수 있다. 이용된 선택성 리포터 유전자는 치료적 핵산과 함께 발현될 수 있는 한, 중요한 것이 아닌 것이라 생각된다. 선택성 리포터 유전자의 또 다른 예는 당업자에게 공지되어 있다.
4. 개시 시그널
암호 서열의 효과적인 해독에는 또한 특정 개시 시그널이 필요할 수 있다. 이러한 시그널에는 ATG 개시 코돈 또는 인접 서열이 있다. ATG 개시 코돈을 비롯한 외인성 해독 조절 시그널은 구비될 필요가 있을 수 있다. 당업자라면, 이것을 쉽게 결정하여 필요한 시그널을 구비할 수 있을 것이다. 개시 코돈은 삽입체 전체의 해독을 보장하기 위해, 원하는 암호 서열의 리딩 프레임과 "프레임-일치(in-frame)" 하여야 한다. 외인성 해독 조절 시그널과 개시 코돈은 천연이거나 합성일 수 있다. 발현 효능은 적당한 전사 증강인자의 함유로 증강될 수 있다.
5. IRES
본 발명의 특정 양태에 따르면, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 인자의 사용은 다유전자 또는 폴리시스트론 메시지를 생성시키기 위한 것이다. IRES 인자는 5' 메틸화된 Cap 의존적 해독의 리보솜 스캐닝 모델을 우회할 수 있고 내부 부위에서 해독을 개시할 수 있다(Pelletier and Sonenberg, 1988). 피코나바이러스과의 두 멤버(폴리오 및 뇌척수염) 유래의 IRES 인자(Pelletier and Sonenberg, 1988)는 포유동물의 메시지 유래의 IRES(Macejak and Sarnow, 1991)와 함께 개시되어 있다. IRES 인자는 이종성 오픈 리딩 프레임에 결합될 수 있다. IRES에 의해 각각 분리되어 있는 복수의 오픈 리딩 프레임은 함께 전사되어 폴리시스트론성 메시지를 생성할 수 있다. IRES 인자에 의거하여, 각 오픈 리딩 프레임은 효과적인 해독을 위해 리보솜에 쉽게 접근할 수 있다. 복수의 유전자는 단일 메시지를 전사하기 위해 단일 프로모터/인핸서를 이용하여 효과적으로 발현될 수 있다(미국 특허 5,925,565 및 5,935,819 참조). 당업자라면, 유전자요법에 IRES가 적용되는 경우를 잘 알고 있을 것이다.
6. 다중 클로닝 부위
발현 카세트는 벡터를 분해하는 표준 재조합 기술과 관련하여 사용될 수 있는 복수의 제한효소 부위를 포함하는 핵산 영역인 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함할 수 있다[Carbonelli et al.(1999); Levenson et al. (1998); Cocea (1997)]. "제한 효소 분해"는 핵산 분자 내의 특정 위치에서만 작용하는 효소를 이용한 핵산 분자의 촉매 절단을 의미한다. 이러한 제한효소들은 다수가 시판되고 있다. 이러한 효소의 사용은 당업자에게 충분히 알려져 있다. 흔히, 벡터는 외인성 서열을 이 벡터에 결찰시키기 위해 MCS 내부를 절단하는 제한 효소를 이용하여 선형화하거나 단편화한다. "결찰"은 서로 인접하거나 인접하지 않을 수 있는 두 핵산 단편 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 과정을 의미한다. 제한 효소 및 제한 반응을 수반하는 기술은 재조합 기술의 당업자에게 공지되어 있다.
대부분 전사된 진핵생물의 RNA 분자는 1차 전사체로부터 인트론을 제거하기 위해 RNA 스플라이싱(splicing)을 일으킬 것이다. 단백질 발현을 위해 이러한 전사체가 적당히 프로세싱되도록 하기 위해서는 게놈 진핵생물 서열을 포함하는 벡터에 공여체 및/또는 수용체 스플라이싱 부위가 있어야 한다(Chandler et al., 1997 참조).
7. 폴리아데닐화 시그널
전사체는 발현 시에 적당한 폴리아데닐화를 실시하기 위해 통상 폴리아데닐화 시그널을 포함한다. 폴리아데닐화 시그널의 본성은 본 발명의 성공적인 수행에 중요한 것이라고는 생각되지 않으며, 이러한 임의의 서열이 이용될 수 있다. 바람직한 양태에는 각종 표적 세포에서 잘 작용하는 것으로 공지되고(되거나) 사용하기 편리한 SV40 폴리아데닐화 시그널 및/또는 소 성장호르몬 폴리아데닐화 시그널이 있다. 또한, 전사 종결 부위도 발현 카세트의 인자로서 고려된다. 이러한 인자들은 메시지 수준을 증가시키고(시키거나) 카세트로부터 다른 서열로의 판독을 최소화하는 작용을 할 수 있다.
8. 다른 발현 카세트 성분
본 발명의 특정 양태에 따르면, 발현 카세트는 바이러스 게놈 유래의 유전자 조작된 작제물 또는 바이러스를 포함한다. 특정 바이러스가 수용체 매개 세포내이입(endocytosis)을 통해 세포로 반입되고, 일부 경우에는 숙주 세포 염색체로 통합되는 능력은 포유동물 세포로 유전자를 전달하는 후보로서 바람직하게 만든다. 하지만, 나출형 DNA의 직접 흡수 뿐만 아니라 DNA 복합체의 수용체 매개 흡수에서, 발현 벡터는 바이러스성일 필요는 없고, pUC 또는 Bluescript™ 플라스미드 시리즈와 같이, 포유동물 세포에서 암호화된 유전자의 발현을 지지할 수 있는 임의의 플라스미드, 코스미드 또는 파지 작제물일 수 있다.
숙주 세포에서 벡터를 전파하기 위해서, 복제가 개시되는 특정한 핵산 서열인 복제 부위의 1 이상의 오리진(종종 "ori"라 부른다)을 함유할 수 있다. 대안적으로, 자율적 복제 서열(ARS)은 숙주 세포가 효모인 경우에 이용될 수 있다.
본 발명의 특정 양태에 따르면, 처리된 세포는 발현 벡터에 리포터 유전자를 포함함으로써 시험관내 또는 생체내에서 확인될 수 있다. 이러한 리포터 유전자는 그 발현 벡터를 포함하는 세포를 쉽게 확인할 수 있게 하기 위해 세포에 식별가능한 변화를 부여할 수 있다. 일반적으로, 선택성 리포터는 선택을 가능하게 하는 성질을 부여하는 것이다. 양성 선택성 리포터는 리포터 유전자의 존재가 선택을 가능하게 하는 것인 반면, 음성 선택성 리포터는 그 존재가 선택을 저지하는 것이다. 양성 선택성 마커의 예는 약물 내성 마커이다.
일반적으로, 약물 선택 마커의 함유는 형질전환체의 클로닝 및 동정에 도움을 주는 것으로서, 예컨대 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 대한 내성을 부여하는 유전자는 유용한 선택성 마커이다. 조건의 충족에 기초하여 형질전환체의 판별을 허용하는 표현형을 부여하는 마커외에도, GFP 또는 루시퍼라제와 같은 선별성 리포터를 비롯한 다른 종류의 리포터도 고려되어야 한다. 대안적으로, 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제(tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제(CAT)와 같은 선별성 효소도 이용할 수 있다. 또한, 당업자는 면역학적 리포터를, 가능하다면 FACS 분석과 관련하여 이용하는 방법을 알 것이다. 사용되는 마커는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한, 중대한 것인 아닌 것이라 생각된다. 선택성 및 선별성 리포터의 또 다른 예는 당업자라면 잘 알고 있다.
본 발명의 특정 양태에 따르면, GFP와 같은 리포터 유전자 산물이 고찰된 조직 종류의 세포에서만 발현되도록 리포터 유전자가 조직 특이적 프로모터에 작동적으로 결합되는 것이 고려되어야 한다. 예를 들어, gfp 리포터 유전자는 복제 선택성 아데노바이러스 벡터 내의 hTERT 프로모터에 작동적으로 결합되어, 텔로머라제 특이적 GFP 발현을 나타내는 과다증식성 병변을 검출할 수 있다(Umeoka et al., 2004).
C. 바이러스 벡터
바이러스 벡터는 적용 지점에서부터 당해 표적 세포까지와 같이 한 위치에서 다른 위치로 유전 물질을 전달할 수 있는 바이러스이다. 본 발명의 특정 양태에 따르면, 본 명세서에 제시된 조성물의 핵산은 바이러스 벡터 또는 전달 인자, 예컨대 지질 또는 리포좀에 포함되어 있지 않은 "나출형" 핵산 서열이다. 또 다른 본 발명의 양태에 따르면, 핵산은 바이러스 벡터 내에 포함되어 있다. 당업자라면, 당해 표적 세포로 유전자 전달에 사용할 수 있는 다양한 종류의 벡터를 잘 알고 있을 것이다. 이러한 각 바이러스는 본 발명의 벡터로서 고찰된다. 벡터의 예는 이하에서 논한다.
1. 바이러스 벡터
"바이러스 벡터"는 (a) 치료적 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트의 패키징을 지지하고 (b) 결과적으로 클로닝된 재조합 유전자 작제물을 발현시키기에 충분한 바이러스 서열을 포함하는 작제물을 포함하는 것이다.
a. 아데노바이러스 벡터
본 발명의 약제학적 조성물 및 방법은 치료적 핵산을 전달하기 위해 아데노바이러스 벡터에 포함된 치료적 핵산의 발현 작제물을 수반할 수 있다. 아데노바이러스 벡터가 게놈 DNA에 통합되는 능력은 낮은 것으로 알려져 있지만, 이러한 특징은 이 벡터에 의해 제공되는 높은 유전자 전달 효능에 의해 상쇄되어진다.
아데노바이러스는 현재 임상 실험에서 유전자 전달에 가장 일반적으로 사용되는 벡터이다. 이 바이러스의 장점 중에는 비분열 및 분열 세포 모두에 유전자를 전달하기에 효과적이며 다량으로 생산될 수 있다는 점이 있다. 암에 대한 많은 임상적 시도 중에서, 현행 벡터가 종양으로 우선적 전달되기 위한 기전이 없는 때문에 질환 부위에 벡터를 도입시키기 위해 종양내 국소 주사가 사용되고 있다. 생체내 실험에서는 아데노바이러스 벡터의 전신 투여가 구강 점막 내의 발현을 초래하는 것을 입증했다(Clayman et al., 1995). 기관형적 래프트(organotypic raft) 배양물에 대한 Ad-βgal 및 Ad-p53-FLAG의 국소 적용에서는 효과적인 유전자 도입 및 세포 다중층을 통한 심부세포층으로의 침투가 입증되었다(Eicher et al., 1996). 따라서, 아데노바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달 전략은 p53에 유전자 변경을 수반하는 병변 및 암에 걸릴 위험이 있는 환자에서 실현가능성이 높다.
이 벡터는 아데노바이러스의 유전자 조작된 형태를 포함한다. 유전자 구성 또는 아데노바이러스, 즉 36kb 선형 이본쇄 DNA 바이러스의 인식은 아데노바이러스 DNA의 큰 조각을 최고 7kb까지 이종 서열로 치환할 수 있게 해준다(Grunhaus and Horwitz, 1992). 레트로바이러스와는 달리, 숙주 세포의 아데노바이러스 감염은 아데노바이러스 DNA가 잠재적인 유전자독성없이 에피좀 방식으로 복제할 수 있기 때문에 염색체 통합을 초래하지는 않는다. 또한, 아데노바이러스는 구조적으로 안정하여, 대량 증폭 후에도 게놈 재배열은 검측되지 않았다.
아데노바이러스는 중간 크기의 게놈, 처리 용이성, 높은 역가, 넓은 표적 세포 범위 및 높은 감염도로 인해 유전자 전달 벡터로서 사용하기에 특히 적합하다. 바이러스 게놈의 양 말단은 바이러스 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 cis 인자인 100개 내지 200개 염기쌍의 역위 반복체(ITR)를 포함한다. 게놈의 조기(E) 및 후기(L) 영역은 바이러스 DNA 복제의 개시에 의해 분할되는 여러 전사 단위를 포함한다. E1 영역(E1A 및 E1B)은 바이러스 게놈의 전사 조절 및 몇몇 세포 유전자의 전사 조절에 역할을 하는 단백질을 암호화한다. E2 영역(E2A 및 E2B)의 발현은 바이러스 DNA 복제를 위한 단백질의 합성을 초래한다. 이러한 단백질들은 DNA 복제, 후기 유전자 발현 및 숙주 세포 차단(shut-off)에 관여한다(Renan, 1990). 바이러스 캡시드 단백질의 대부분을 포함하는 후기 유전자의 산물은 주요 후기 프로모터(MLP)에 의해 발생된 단일 1차 전사체의 상당한 프로세싱 후에만 발현된다. MLP(16.8 m.u.에 위치)는 특히 감염 후기 단계 동안에 효과적이며, 이 프로모터로부터 발생된 모든 mRNA는 해독에 바람직한 mRNA를 만드는 5'-3원성 리더(TPL) 서열을 보유한다.
현행 시스템에서, 재조합 아데노바이러스는 셔틀 벡터와 프로바이러스 벡터 사이에 상동성 재조합에 의해 생성된다. 두 프로바이러스 벡터 사이에 재조합 가능성으로 인해, 이 과정으로부터 야생형 아데노바이러스가 생성될 수 있다. 따라서, 개개의 플라크로부터 바이러스의 단일 클론을 분리하고 이의 게놈 구조를 조사하는 것이 중요한 일이다.
복제 결손형인 현행 아데노바이러스 벡터의 생성과 전파는 사람 배아 신장 세포로부터 Ad5 DNA 단편에 의해 형질전환되고, E1 단백질을 구성적으로 발현하는 독특한 헬퍼 세포주(293으로 지칭됨)에 따라 달라진다(Graham et al., 1977). E3 영역은 아데노바이러스 게놈으로부터 제거될 수 있기 때문에(Jones and Shenk, 1978), 293 세포의 도움을 받는 현행 아데노바이러스 벡터는 E1, D3 또는 이 두 영역에 함께 이종 DNA를 보유한다(Graham and Prevec, 1991). 본래, 아데노바이러스는 야생형 게놈의 약 105%를 패키지할 수 있고(Ghosh-Choudhury et al., 1987), 따라서 약 2kb가 넘는 DNA에 대한 수용력이 있다. E1과 E3 영역에서 치환가능한 약 5.5kb의 DNA와 함께, 현행 아데노바이러스 벡터의 최대 수용력은 7.5kb 이하, 또는 벡터 총 길이의 약 15% 이하이다. 80%가 넘는 아데노바이러스의 바이러스 게놈은 벡터 주쇄 내에 남는다.
헬퍼 세포주는 사람 배아 신장 세포, 근육 세포, 조혈 세포 또는 다른 사람 배아 중간엽 또는 상피 세포와 같은 사람 세포에서 유래될 수 있다. 또는, 헬퍼 세포는 사람 아데노바이러스에 대해 허용적인 다른 포유동물 종의 세포에서 유래될 수 있다. 이러한 세포에는 예컨대 Vero 세포 또는 다른 원숭이 배아 중간엽 또는 상피 세포가 있다. 전술한 바와 같이, 바람직한 헬퍼 세포주는 293이다.
라처 등(1995)은 293 세포를 배양하고 아데노바이러스를 전파시키는 개선된 방법을 개시했다. 하나의 형식으로서, 1리터 규소처리된 스피너 플라스크(Techne, Cambridge, UK)에 100 내지 200ml의 배지를 담고, 여기에 각각의 세포를 접종하여 자연 세포 응집물을 증식시켰다. 40rpm으로 교반한 후, 트립판 블루를 이용하여 세포 생육도를 평가했다. 다른 형식으로서, Fibra-Cel 마이크로캐리어(Bibby Sterlin, Stone, UK)(5g/l)를 다음과 같이 이용한다. 배지 5ml에 재현탁된 세포 접종물을 250ml 어얼렌메이어 플라스크 중의 담체(50ml)에 첨가하고, 가끔 진탕하면서 1 내지 4시간 동안 방치했다. 그 다음 배지를 새로운 배지 50ml로 교체하고 진탕을 개시했다. 바이러스 생산을 위해, 세포를 약 80% 컨플루언스(confluence)까지 증식시킨 다음, 배지를 교체하고(최종 부피의 25%까지) 아데노바이러스를 0.05의 MOI로 첨가했다. 부피를 100%까지 증가시킨 후 배양물을 하룻밤 동안 방치하고, 다시 72시간 동안 진탕을 개시했다.
아데노바이러스 벡터는 복제 결손형이거나, 적어도 조건 결손형일 수 있다. 아데노바이러스 벡터의 성질은 본 발명의 성공적인 수행에 중대한 것으로 생각되지 않는다. 아데노바이러스는 42종의 다른 공지된 혈청형 또는 하위그룹 A-F 중 임의의 종류일 수 있다. 하위그룹 C의 아데노바이러스 타입 5는 본 발명에 사용되는 조건적 복제 결손형 아데노바이러스를 수득하기 위한 바람직한 출발 물질이다. 이것은 아데노바이러스 타입 5가 상당한 생화학적 및 유전자 정보가 알려진 사람 아데노바이러스이기 때문이며, 역사적으로 아데노바이러스를 벡터로서 이용하는 대부분의 작제 시에 사용되었기 때문이다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 전형적인 벡터는 복제 결손형으로서, 아데노바이러스 E1 영역을 보유하지 않을 것이다. 따라서, E1 암호 서열이 제거된 위치에 형질전환 작제물을 도입시키기에 가장 편리할 것이다. 하지만, 아데노바이러스 서열 내에 작제물의 삽입 위치는 본 발명에 중대한 것은 아니다. 당해 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 문헌[Karlsson et al.(1986)]에 기술된 바와 같이 E3 치환 벡터 중의 결실된 E3 영역 대신에 삽입되거나, 헬퍼 세포주 또는 헬퍼 바이러스가 E4 결함을 보완하는 E4 영역에 삽입될 수 있다.
아데노바이러스 증식 및 처리는 당업자에게 공지되어 있고 시험관내 및 생체 내에서 광의의 숙주 범위를 나타낸다. 이 그룹의 바이러스들은 고 역가, 예컨대 1ml 당 109 내지 1011 플라크 형성 단위로 수득될 수 있고, 매우 감염성이다. 아데노바이러스의 생활 주기는 숙주 세포 게놈 내로 통합될 필요가 없다. 아데노바이러스 벡터에 의해 전달된 이종 유전자는 에피솜형이고, 따라서 숙주 세포에 대한 유전자독성이 낮다. 야생형 아데노바이러스를 이용한 백신접종 연구에서는 어떠한 부작용에 대한 보고가 없는 바, 생체내 유전자 전달 벡터로서의 안정성 및 치료 효능을 논증한다.
아데노바이러스 벡터는 진핵생물 유전자 발현(Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992) 및 백신 개발(Grunhaus and Horwitz, 1992; Graham and Prevec, 1992)에 사용되었다. 동물 연구는 재조합 아데노바이러스가 유전자 요법에 사용될 수 있음을 암시했다(Stratford-Perricaudet and Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993). 재조합 아데노바이러스를 다른 조직들에 투여한 연구로는 기관 점적 주사(Rosenfeld et al., 1991; 깬둘딩 et al., 1992), 근육 주사(Ragot et al., 1993), 말초 정맥내 주사(Herz and Gerard, 1993) 및 뇌 정위 주입(Le Gal La Salle et al., 1993)이 있다.
b. 레트로바이러스 벡터
레트로바이러스는 감염된 세포에서 자신의 RNA를 이본쇄 DNA로 역전사 과정에 의해 전환시키는 능력을 특징으로 하는 일본쇄 RNA 바이러스의 그룹이다(Coffin, 1990). 수득된 DNA는 그 다음 프로바이러스로서 세포 염색체 내에 안정하게 통합되고 바이러스 단백질의 합성을 유도한다. 통합은 수용체 세포와 이의 자손들에서 바이러스 유전자 서열을 유지시킨다. 레트로바이러스 게놈은 캡시드 단백질, 폴리머라제 효소 및 엔벨로프 성분을 각각을 암호화하는 3개의 유전자, gag, pol 및 env를 포함한다. gag 유전자의 상류에서 발견된 서열은 게놈을 비리온 내로 패키징시키는 시그널을 포함한다. 바이러스 게놈의 5' 및 3' 말단에는 2개의 장말단 반복체(LTR) 서열이 존재한다. 이 서열들은 강한 프로모터와 인핸서 서열을 포함하고, 숙주 세포 게놈의 통합에 필요한 서열이다(Coffin, 1990).
레트로바이러스 벡터의 작제를 위해, 당해 유전자를 암호화하는 핵산은 복제 결손형인 바이러스를 생산하는 특정 바이러스 서열 위치의 바이러스 게놈 내로 삽입된다. 비리온을 생산하기 위해서는, LTR 및 패키징 성분없이 gag, pol 및 env 유전자를 포함하는 패키징 세포주를 작제한다(Mann et al., 1983). 이러한 세포주 내로 레트로바이러스 LTR 및 패키징 서열과 함께 cDNA를 포함하는 재조합 플라스미드가 도입될 때(예컨대 인산칼슘 침전에 의해), 패키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체가 바이러스 입자 내로 패키징되게 하며, 그 후 입자는 배양 배지로 분비된다(Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). 그 다음, 재조합 레트로바이러스를 포함하는 배지는 수거되고, 경우에 따라 농축된 다음, 유전자 전달에 사용된다. 레트로바이러스 벡터는 다양한 종류의 세포를 감염시킬 수 있다. 하지만, 통합과 안정한 발현은 숙주 세포의 분열을 필요로 한다(Paskine et al., 1975).
결손형 레트로바이러스 벡터 사용 시의 문제점은 패키징 세포에서 야생형 복제능이 있는 바이러스의 출현 가능성이다. 이러한 가능성은 숙주 세포 게놈에 통합된 gag, pol, env 서열 상류에 재조합 바이러스 유래의 온전한 서열이 통합되는 재조합 결과에 의해 일어날 수 있다. 그러나, 패키징 세포주는 재조합 가능성을 크게 감소시켜야 이용가능하다 (Markowitz et al., 1988; Hersdorffer et al., 1990).
c. AAV 벡터
아데노관련 바이러스(AAV)는 높은 통합 빈도를 나타내고 비분열 세포를 감염시킬 수 있어, 조직 배양에서 포유동물 세포에 유전자를 전달하기에 유용한 바, 본 발명에 사용하기에 바람직한 벡터 시스템이다(Muzyczka, 1992). AAV는 감염 숙주 범위가 광범위한 바(Tratschin et al., 1984; Laughlin et al., 1986; Lebkowski et al., 1988; McLaughlin et al., 1988), 본 발명에 사용하기에 적절하다는 것을 의미한다. rAAV 벡터의 생성과 사용에 관한 세부사항은 본 발명에 참고인용된 미국 특허 5,139,941 및 미국 특허 4,797,368에 기술되어 있다.
유전자 전달에서 AAV의 사용을 입증하는 연구로는 다음과 같은 것이 있다: LaFace et al. (1988); Zhou et al. (1993); Flotte et al. (1993); 및 Walsh et al. (1994). 재조합 AAV 벡터는 마커 유전자(Kaplitt et al., 1994; Lebkowski et al., 1988; Samulski et al., 1989; Shelling and Smith, 1994; Yoder et al., 1994; Zhou et al., 1994; Hermonat and Muzyczka, 1984; Tratschin et al., 1985; McLaughlin et al., 1988) 및 사람 질환에 관여하는 유전자(Flotte et al., 1992; Ohi et al., 1990; Walsh et al., 1994; Wei et al., 1994)의 시험관내 및 생체내 형질도입에 성공적으로 사용된 바 있다. 최근, AAV 벡터는 낭포성 섬유증의 치료를 위한 I기 인체 실험에 승인을 받았다.
AAV는 배양 세포에서 증식 감염을 일으키는 다른 바이러스(아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스 패밀리의 멤버)와의 공동감염을 필요로 한다는 점에서 의존적 파르보바이러스이다(Muzyczka, 1992). 헬퍼 바이러스로 공동감염되지 않으면, 야생형 AAV 게놈은 게놈의 말단을 통해 사람 염색체 19 내로 통합되어, 프로바이러스로서 잠복 상태로 거주한다(Kotin et al., 1990; Samulski et al., 1991). 하지만, rAAV는 AAV Rep 단백질이 또한 발현되지 않는다면 통합이 염색체 19에만 국한되지 않는다(Shelling and Smith, 1994). AAV 프로바이러스를 운반하는 세포가 헬퍼 바이러스로 중복감염될 때, AAV 게놈은 염색체로부터 또는 재조합 플라스미드로부터 "구조(rescue)"되고 정상적인 증식적 감염이 확립된다(Samulski et al., 1989; McLaughlin et al., 1988; Kotin et al., 1990; Muzyczka, 1992).
통상, 재조합 AAV(rAAV) 바이러스는 2개의 AAV 말단 반복체에 인접시킨 당해 유전자를 포함하는 플라스미드(McLaughlin et al, 1988; Samulski et al, 1989; 각각 본원에 참고인용됨)와 말단 반복체 없이 야생형 AAV 암호 서열을 포함하는 발현 플라스미드, 예컨대 pIM45(McCarty et al., 1991; 본원에 참고인용됨)를 공동형질감염시켜 제조한다. 이러한 세포들은 AAV 헬퍼 기능에 필요한 아데노바이러스 유전자를 운반하는 플라스미드 또는 아데노바이러스로 감염되거나 형질감염되기도 한다. 이와 같은 방식으로 제조된 rAAV 바이러스 스톡은 rAAV 입자로부터 물리적으로 분리되어야 하는 아데노바이러스로 오염된다(예컨대, 염화세슘 밀도 원심분리에 의해). 대안적으로, AAV 암호 영역을 포함하는 아데노바이러스 벡터 또는 AAV 암호 영역과 일부 또는 전체 아데노바이러스 헬퍼 유전자를 포함하는 세포주가 사용될 수 있다(Yang et al., 1994; Clark et al., 1995). rAAV DNA를 통합된 프로바이러스로서 운반하는 세포주도 사용될 수 있다(Flotte and Carter, 1995).
d. 헤르페스바이러스 벡터
헤르페스 단순 바이러스(HSV)는 신경세포에 대한 친화성으로 인해 신경계 장애를 치료하는데 상당한 유익을 제공했지만, 이 벡터는 광의의 숙주 범위가 제공되기만 한다면 다른 조직에도 이용될 수 있을 것이다. HSV를 바람직한 벡터로 만드는 또 다른 요인은 게놈의 크기와 구성이다. HSV는 크기 때문에 다른 작은 바이러스 시스템에서보터 다중 유전자 또는 발현 카세트의 혼입이 문제가 덜 된다. 또한, 다양한 성능(시간, 강도 등)의 여러 바이러스 조절 서열의 유용성은 다른 시스템에서보다 발현 조절이 더욱 더 잘 이루어질 수 있게 한다. 또한, 이 바이러스는 스플라이싱된 메시지의 수가 비교적 적기 때문에 유전자 처리가 더욱 용이하다는 장점이 있다.
HSV는 또한 처리하기가 비교적 쉽고 높은 역가로 증식할 수 있다. 따라서, 충분한 MOI를 달성하는데 필요한 부피 및 반복 투여의 필요성 감소 측면에서 전달에 문제가 없다. 유전자치료 벡터로서 HSV에 대한 논의는 문헌[Glorioso et al.(1995)]을 참조할 수 있다.
아형 1 및 2로 지칭되는 HSV는 사람에게 가장 흔한 감염 인자 중 하나인 엔벨로프형 바이러스로서, 세계적으로 수백만명의 사람 환자를 감염시키고 있다. 크고 복잡한 이본쇄 DNA 게놈은 수십개의 다른 유전자 산물을 암호화하고, 이 중 일부는 스플라이싱된 전사체에서 유래하는 산물이다. 비리온 및 엔벨로프 구조 성분 외에, 바이러스는 프로테아제, 리보뉴클레오타이드 리덕타제, DNA 폴리머라제, ssDNA 결합 단백질, 헬리카제/프리마제, DNA 의존적 ATPase, dUTPase 등을 비롯한 수많은 다른 단백질을 암호화한다.
HSV 유전자는 발현이 대등하게 조절되고 캐스캐이드 방식으로 순차적으로 일어나는 몇 개의 그룹을 형성한다(Honess and Roizman, 1974; Honess and Roizman 1975). 감염 후 발현될 유전자의 제1 세트인 α 유전자의 발현은 비리온 단백질 번호 16 또는 α-형질전환 인자에 의해 증강된다(Post et al., 1981; Batterson and Roizman, 1983). β 유전자의 발현은 기능적인 α 유전자 산물, 특히 α4 유전자에 의해 암호화되는 ICP4를 필요로 한다(DeLuca et al., 1985). 주로 비리온 구조 단백질을 암호화하는 유전자의 이종성 그룹인 γ 유전자는 최적 발현에 바이러스 DNA 합성의 개시를 필요로 한다(Holland et al, 1980).
게놈의 복잡성에 따라 HSV의 생활 주기는 다소 관련성이 있다. 바이러스 입자를 합성시키고 결과적으로 세포사를 초래하는 용균 주기 외에, 이 바이러스는 현재 아직 규명되지 않은 일부 시그널이 용균 사이클의 재발을 일으킬 때까지 게놈이 신경절에 유지되어 있는 잠복 상태에 돌입하는 능력을 갖고 있다. HSV의 무독성 변형체가 개발되었고, 유전자 치료 상황에 사용하기 쉽게 입수용이하다(미국 특허 5,672,344).
e. 백시니아 바이러스 벡터
백시니아 바이러스 벡터는 작제 용이성, 수득되는 비교적 높은 발현 수준, 광의의 숙주 범위 및 DNA를 운반하는 대용량성으로 인해 광범위하게 사용되고 있다. 백시니아는 현저한 "A-T" 선호성을 나타내는 약 186kb의 선형 이본쇄 DNA 게놈을 포함한다. 이 게놈 옆에는 약 10.5kb의 역위 말단 반복체가 존재한다. 필수 유전자의 대부분은 폭스바이러스 중에서 가장 보존성이 큰 중심 영역 내에 위치하는 것으로 나타난다. 백시니아 바이러스에서 추정되는 오픈 리딩 프레임은 150개 내지 200개이다. 두 가닥이 암호성일지라도 리딩 프레임이 일반적으로 광범위하게 중첩되지는 않는다.
백시니아 바이러스 게놈 내에는 적어도 25kb가 삽입될 수 있다(Smith and Moss, 1983). 원형적 백시니아 벡터는 바이러스 티미딘 키나제 유전자에 상동성 재조합을 통해 삽입된 전이유전자(transgene)를 포함한다. 벡터는 tk-표현형에 의거하여 선택된다. 뇌척수염 바이러스의 미해독 리더 서열의 혼입은 발현 수준을 종래 벡터보다 높으며, 전이유전자는 24h이 경과하면 감염된 세포의 10% 이상으로 축적된다 (Elroy-Stein et al., 1989).
f. 종양분해성 바이러스 벡터
종양분해성 바이러스는 또한 본 발명의 벡터로서 생각된다. 본 명세서에서 정의되는 종양분해성 바이러스는 일반적으로 정상 세포를 사멸시키기 보다는 종양이나 암세포를 더 잘 사멸시키는 바이러스를 의미한다. 종양분해성 바이러스의 예에는 ADP를 과발현하는 아데노바이러스가 있다. 이러한 바이러스들은 본 출원의 이 섹션과 다른 모든 섹션들에서 전문이 참고인용된 미국 특허 출원 공개번호 20040213764, 미국 특허출원 공개번호 20020028785 및 미국 특허출원 일련번호 09/351,778에서 상세히 논의된다. 종양분해성 바이러스의 예는 본 명세서의 다른 부분에서 논의된다. 당업자는 본 발명의 약제학적 조성물과 방법에서 적용될 수 있는 다른 종양분해성 바이러스들을 잘 알고 있을 것이다.
g. 다른 바이러스 벡터
본 발명에 벡터로서 이용될 수 있는 다른 바이러스 벡터에는 백신 분야 또는 백신과 면역요법 양 분야에 적용될 수 있는 바이러스 벡터가 있다. 바이러스 벡터와, 이 바이러스 벡터를 이용한 백신접종 및 면역요법의 기술에 대해서는 본 출원의 이 섹션과 그 외 섹션들에서 전문이 참고인용되는 PCT 출원 WO0333029, WO0208436, WO0231168 및 WO0285287에 상세히 설명되어 있다. 백신접종 기술 및 면역요법/백신접종 이중 기술에 적용될 수 있는 또 다른 벡터에는 앞에서 언급한 종양분해성 바이러스가 있다.
다른 바이러스 벡터에는 또한 바큘로바이러스 벡터, 파르보바이러스 벡터, 피코나바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 세미리키 포레스트 바이러스벡터, 신드비스 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터가 있다. 폭스바이러스와 같은 바이러스 유래의 벡터가 사용될 수 있다. 베네주엘라 말 뇌염(VEE) 바이러스의 분자 클로닝된 균주는 일반적으로 이종 바이러스 단백질의 발현을 위한 복제능이 있는 백신 벡터로서 유전자적으로 규명되었다(Davis et al., 1996). VEE 감염이 강력한 CTL 반응을 자극한다는 연구가 입증되어 있고, VEE가 면역화에 극히 유용한 벡터일 수 있음이 암시되었다(Caley et al., 1997). 본 발명에서는 VEE 바이러스가 수지상 세포를 표적화하는데 유용할 수 있음이 고찰되었다.
결손형 B형 간염 바이러스에 대한 최근의 인식과 함께, 여러 바이러스 서열의 구조-기능 관계에 새로운 통찰이 수득되었다. 시험관내 연구는 게놈의 최고 80%가 결손됨에도 불구하고 바이러스가 헬퍼 의존적 패키징 및 역전사의 능력을 유지할 수 있다는 것을 밝혀냈다(Horwich et al., 1990). 이것은 대부분의 게놈이 이종 유전자 물질로 치환될 수 있음을 암시했다. 창(Chang) 등은 최근 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제(CAT) 유전자를 오리의 B형 간염 바이러스 게놈 내 폴리머라제 표면 및 전구표면 암호 서열의 위치에 도입시켰다. 그 다음, 야생형바이러스와 함께 조류 간암 세포주를 공동형질감염시켰다. 높은 역가의 재조합 바이러스를 포함하는 배양 배지를 원발성 새끼오리 간세포의 감염에 사용했다. 형질감염 후 적어도 24일 동안 안정된 CAT 유전자 발현이 검출되었다 (Chung et al., 1981)
본 발명의 조성물과 방법에 적용하기 위한 다른 바이러스 벡터에는 본 출원의 이 섹션과 여타 섹션에서 전문이 참고인용된 문헌[Tang et al., 2004]에 기술된 벡터가 있다.
i. 변경된 바이러스를 이용한 유전자 전달
진단적 또는 치료적 핵산은 특정 결합 리간드를 발현하도록 유전자조작된 바이러스 벡터내에 수용될 수 있다. 따라서, 이 바이러스 입자는 표적 세포의 동족 수용체에 특이적으로 결합하여 그 함유물을 세포로 전달할 것이다. 레트로바이러스 벡터의 특이적 표적화를 허용하도록 설계된 새로운 시도는 바이러스 엔벨로프에 락토스 잔기의 화학적 첨가에 의한 레트로바이러스의 화학적 변경을 기초로 하여 개발되었다. 이러한 변경은 시알로글리코프로테인 수용체를 통해 간세포 특이적 감염을 일으킬 수 있다.
재조합 레트로바이러스를 표적화하는 또 다른 시도는 레트로바이러스 엔벨로프 단백질 및 특정 세포 수용체에 대한 비오틴화된 항체가 사용되도록 설계되었다. 이러한 항체들은 스트렙타비딘을 이용하여 비오틴 성분을 통해 커플링되었다(Roux et al., 1989). 주조직적합성 복합체 클래스 I 및 클래스 II 항원에 대한 항체를 이용하여 표면 항원을 보유하는 각종 사람 세포의 동종숙주역 바이러스에 의한 시험관내 감염을 증명했다(Roux et al., 1989).
D. 전달 제제
본 발명의 특정 양태에 따르면, 아미노산 서열을 암호화하는 핵산은 추가로 전달 제제를 함유할 수 있다. 본 명세서에서 정의되는 전달 제제는 바이러스 벡터 외에, 당해 표적 세포에 핵산의 전달을 촉진하는 임의의 제제 또는 물질을 의미한다. 전달 제제의 예에는 지질 및 지질 제형, 예컨대 리포좀이 있다. 특정 양태에 따르면, 지질은 나노입자에 포함되어 있다. 본 명세서에 사용된 나노입자는 서브마이크론 입자로 정의된다. 예를 들어, 나노입자는 직경이 약 1 내지 약 500나노미터인 것일 수 있다. 이러한 입자는 임의의 물질 또는 화합물로 구성될 수 있다. 본 발명의 상황에서, 예를 들어 "나노입자"는 직경이 약 1 내지 약 500나노미터 범위인 특정 리포좀을 포함할 수 있다.
당업자는 핵산 서열을 포착(entrap)하기 위한 리포좀 또는 지질 제형의 사용에 대해 잘 알고 있을 것이다. 리포좀은 인지질 이중층 막과 내부 수성 매질을 특징으로 하는 소포 구조이다. 다중층 리포좀은 수성 매질이 개재되어 있는 복수의 지질 층이다. 이것은 과량의 수용액 내에 인지질이 현탁되어 있을 때 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 밀폐 구조를 형성하기 전에 자기재배열을 일으키고 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용질을 포착한다(Ghosh and Bachhawat, 1991).
외래 DNA의 지질 매개의 핵산 전달 및 발현은 시험관내에서 매우 성공적으로 이루어졌다(Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987). Wong 등(1980)은 배양된 병아리 배아 세포, HeLa 세포 및 간암 세포에서 외래 DNA의 지질 매개의 전달 및 발현의 가능성을 입증했다.
지질 기반의 비바이러스성 제형은 아데노바이러스 유전자 요법에 대한 대안을 제공한다. 많은 세포 배양 연구들이 지질계 비바이러스 유전자 전달을 증명하고 있지만, 지질계 제형을 통한 전신 유전자 전달은 제한적이었다. 비바이러스성 지질계 유전자 전달의 주요 단점은 비바이러스성 전달 매개제를 포함하는 양이온성 지질의 독성이다. 리포좀의 생체내 독성은 시험관내 유전자 전달 결과와 생체내 유전자 전달 결과 간에 불일치를 부분적으로 설명하는 것이다. 이러한 모순된 데이터에 기여하는 또 다른 요인은 혈청 단백질의 존재 및 부재 하에서의 리포좀 안정성의차이이다. 리포좀과 혈청 단백질 사이의 상호작용은 리포좀의 안정성 특징에 극적인 영향을 미친다(Yang and Huang, 1997). 양이온 리포좀은 음하전을 띤 혈청 단백질을 유인하여 결합한다. 혈청 단백질로 코팅된 리포좀은 대식세포에 의해 용해되거나 흡수되어 혈행으로부터 제거된다. 현행 생체내 리포좀 전달 방법들은 혈행 중의 양이온성 지질과 관련된 독성 및 안정성 문제를 피하기 위해 피하, 피내, 종양내 또는 두개내 주사를 이용한다. 리포좀과 혈장 단백질의 상호작용은 시험관내(Felgner et al., 1987) 및 생체내 유전자 전달(Zhu et al., Solodin et al., 1995; Liu et al., 1995; Thierry et al., 1995; Tsukamoto et al., 1995; Aksentijevich et al., 1996)의 효율 사이에 불균형에 책임이 있다.
리포좀 제형의 최근 진보는 생체내 유전자 전달 효능을 향상시켰다(WO 98/07408). 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸 암모니오)프로판(DOTAP)과 콜레스테롤의 등몰 비로 구성된 신규 리포좀 제형은 전신 생체내 유전자 전달을 크게, 약 150배 증가시킨다. DOTAP:콜레스테롤 지질 제형은 "샌드위치 리포좀"이라 불리는 독특한 구조를 형성한다고 한다. 이 제형은 함입된 이중층 또는 '꽃병(vase)' 구조 사이에서 DNA를 "샌드위치"시키는 것을 보고되었다. 이러한 리포좀의 유익한 특징에는 콜레스테롤에 의한 양성 ρ 콜로이드 안정성, 2차원 DNA 패킹 및 혈청 안정성 증가가 있다.
지질 제형의 생산은 종종 (I) 역상 증발, (II) 탈수-재수화(III) 계면활성제 투석 및 (IV) 박막 수화 후에 리포좀 혼합물의 초음파처리 또는 연속 압출을 통해 수행된다. 일단 제조되면, 지질 구조물은 혈행 중에서 독성이거나(화학치료제) 또는 불안정한(핵산) 화합물을 캡슐화하는데 사용될 수 있다. 리포좀 캡슐화는 상기 화합물들에 대해 더 낮은 독성과 더 긴 혈청 반감기를 초래했다(Gabizon et al., 1990). 다수의 질환 치료는 종래 치료법을 향상시키거나 또는 신규 치료법, 특히 과다증식 질환을 치료하는 치료법을 확립시키기 위해서 지질계 유전자 전달 전략을 이용하고 있다.
리포좀은 적혈구응집성 바이러스(HVJ)와 복합체를 형성할 수 있다. 이것은 세포막과 융합을 촉진하고 리포좀 캡슐화된 DNA의 세포 돌입을 촉진하는 것으로 밝혀져 있다(Kaneda et al., 1989). 다른 양태에 따르면, 리포좀은 핵의 비히스톤 염색체 단백질(HMG-1)과 함께 복합체를 형성하거나 함께 이용될 수 있다(Kato et al., 1991). 또 다른 양태에 따르면, 리포좀은 HVJ 및 HMG-1과 함께 복합체를 형성하거나 함께 이용될 수 있다.
또한, 당업자라면 유전자 전달에 적합한 다른 나노입자 제형을 잘 알고 있을 것이다. 그 예에는 각각 전문이 본원에 참고인용된 문헌[Bianco(2004), Doerr(2005) 및 Lang et al.(2005)]에 기술된 나노입자 제형이 있다.
E. 치료법
1. 정의
본 명세서에 사용된 "치료적 핵산"은 질환 또는 건강 관련 상태의 치료 또는 예방에 유익한 것으로 공지되거나 생각되는 핵산을 의미한다. "치료적 핵산"의 정의에는 질환 또는 건강 관련 상태의 치료에 유익한 것으로 공지되거나 생각되는 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 및 더 직접적으로 리보자임과 같은 핵산을 포함된다. 또한, 치료적 핵산은 질환 또는 건강 관련 상태의 치료에 유익한 것으로 공지되거나 생각되는 핵산을 전사하는 핵산일 수 있다(예, 리보자임을 전사하는 핵산).
본 출원을 통해 사용된 바와 같은 "치료적" 또는 "요법"이란 용어는 질환 또는 건강 관련 상태에 관하여 피험체의 안녕을 촉진하거나 증강시키는 것으로 공지되거나 생각되는 모든 것을 의미한다. 따라서, "치료적 핵산"은 질환 또는 건강 관련 상태에 관하여 피험체의 안녕을 촉진하거나 향상시키는 것으로 공지되거나 생각되는 핵산이다. 이러한 치료적 이점의 비배제적 예로는 임의의 시간 기간까지의 피험체 생명의 연장 또는 질환 발달의 감소 또는 지연을 포함한다. 암인 경우에, 치료적 이점은 과다증식의 저하, 종양 성장 감소, 전이 지연 또는 전이 수의 감소, 암세포 또는 종양 세포 증식 속도의 감소, 전암성 상태로부터 종양 발달 진행의 감소 또는 지연, 및 피험체 상태가 원인일 수 있는 피험체에 대한 통증 감소가 있다.
"질환"은 감염, 유전자 결함 또는 환경 스트레스 등의 임의의 원인에 의한 일부 신체, 기관 또는 시스템의 병리학적 상태로서 정의된다.
본 명세서에서 정의되는 "건강 관련 상태"란, 병리학적이지는 않으나 치료가 요구되는 신체 일부, 기관 또는 시스템의 상태를 의미한다. 그 예에는 미용적 요법이 추구되는 상태, 예컨대 피부 주름, 피부 결점 등이 있다.
"예방" 및 "예방하는"이란, "앞서 작용하는" 또는 그러한 행위를 의미하는 통상적이고 평범한 의미에 따라 사용된다. 특정 질환 또는 건강 관련 상태의 상황에서, 이 용어들은 질환 또는 건강 관련 상태의 개시를 차단하기 위한 목적으로 제제, 약물 또는 치료제를 피험체에게 투여 또는 적용하거나, 또는 피험체에 처치 또는 기법을 수행하는 것을 의미한다. 본 발명의 특정 양태에 따르면, 이 방법은 피험체의 질환 또는 건강 관련 상태를 예방하기 위해 치료적 단백질을 암호화하는 핵산의 전달을 수반한다. 질환 또는 건강 관련 상태를 예방하기에 적합한 약제학적 조성물의 함량은 질환 또는 건강 관련 상태의 개시를 차단하는 것으로 공지되거나 생각되는 함량이다.
본 출원을 통해 사용된 "진단적" 또는 "진단"은 피험체의 질환 또는 건강 관련 상태의 존재 또는 부재를 동정하는데 유익한 것으로 공지되거나 생각되는 모든 것을 의미한다. 또한, 이 정의에는 특정 질환 또는 건강 관련 상태의 발생 위험이 있는 피험체의 동정에 유익한 것으로 공지되거나 생각되는 모든 것이 포함된다. 즉, 진단적 핵산은 질환 또는 건강 관련 상태의 존재 또는 부재를 동정하는데 유익한 것으로 공지되거나 생각되는 핵산, 또는 특정 질환 또는 건강 관련 상태의 발생 위험이 있는 피험체를 동정하는데 유익한 것으로 공지되거나 생각되는 핵산이다. 예를 들어, 진단적 핵산은 검출가능한 리포터 단백질을 암호화하는 핵산일 수 있다. 이러한 단백질은 예컨대 조영기법에 사용될 수 있다.
2. 진단, 예방 또는 치료되는 질환
본 발명은 피험체의 질환을 예방 또는 억제할 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산의 투여로 피험체의 질환을 검출, 예방, 억제 또는 치료하는 방법을 제공한다. 앞에서 제시한 바와 같이, 질환의 검출, 예방, 억제 또는 치료를 위해 피험체에 적용하거나 투여할 수 있는 임의의 핵산 서열은 본 명세서에 제시된 약제학적 조성물에 포함되는 것이라 생각한다.
특정 양태에 따르면, 질환은 피험체에 핵산 서열의 투여를 통해 검출, 치료 또는 예방하기 용이할 수 있는 피험체에 영향을 미칠 수 있는 과다증식 질환일 수 있다. 예를 들어, 질환은 과다증식 질환일 수 있다. 과다증식 질환은 세포의 비정상적 성장 또는 증식과 관련 있는 질환이다. 과다증식 질환은 피험체에서 병변로서 명백히 나타나는 질환일 수 있다. 과다증식 병변의 예에는 다음과 같은 것이 있다: 편평세포 암종, 기저세포 암종, 선종, 선암종, 증식위벽염, 인슐린종, 글루카곤종, 가스트린종, 비포마, 담관암종, 간세포 암종, 선낭암종, 유암종양, 프로락틴분비종양, 호산성세포종, 허슬세포 선종, 신장세포 암종, 자궁내막유사 선종, 낭선종, 복막 가성점액종, 와르틴(Warthin) 종양, 흉선종, 난포막종, 과립막세포 종양, 남성배세포종, 세르토리-레이딕(Sertoli-Leydig) 세포 종양, 부신경절종, 크롬친화세포종, 사구종양, 흑색종, 연조직 육종, 결합조직형성 소원형세포 종양, 섬유종, 섬유육종, 점액종, 지방종, 지방육종, 평활근종, 평활근육종, 근종, 근육종, 횡문근종, 횡문근육종, 다형태 선종, 신장모세포종, 브레너 종양, 윤활막 육종, 중피종, 미분화세포종, 생식세포 종양, 배아세포 암종, 난황낭 종양, 기형종, 피부모양 기형낭종, 융모막암종, 중신종, 혈관종, 맥관종, 혈관육종, 맥관육종, 혈관내피종, 혈관내피종, 카포스육종, 혈관주위세포종, 림프관종, 낭성 림프관종, 골종, 골육종, 골연골종, 연골 뼈돌출증, 연골종, 연골육종, 거대세포 종양, 유잉(Ewing) 육종, 치원성 종양, 백악아세포종, 법랑질아세포종, 두 개인두종, 신경교종 혼합핍지성상세포종, 뇌실막세포종, 성상세포종, 아교모세포종, 핍지교종, 신경상피종, 신생물, 신경모세포종, 망막모세포종, 수막종, 신경섬유종, 신경섬유종증, 신경집종, 신경초종, 신경종, 과립세포종양, 폐포연부육종, 림프종, 비호지킨 림프종, 림프육종, 호지킨병, 소림프구 림프종, 림프형질세포 림프종, 외투세포 림프종, 원발성 삼출액 림프종, 세로칸(가슴샘) 대세포 림프종, 광범위 대형 B-세포 림프종, 혈관내 대형 B-세포 림프종, 버킷 림프종, 비장 가장자리구역 림프종, 난포림프종, 점막 관련 림프양 조직의 림프절외 가장자리 구역 B-세포 림프종(MALT-림프종), 결절 가장자리 구역 B-세포 림프종, 균상 식육종, 세자리(Sezary) 증후군, 말초 T-세포 림프종, 혈관면역모 T-세포 림프종, 피하 지방층염 유사 T-세포 림프종, 역형성 대세포 림프종, 간비장 T-세포 림프종, 장질환형 T-세포 림프종, 림프종양 구진증, 일차 피부 역형성 대세포 림프종, 결절외 NK/T 세포 림프종, 아구성 NK 세포 림프종, 형질세포종, 다발골수종, 비만세포종, 비만세포 육종, 비만세포증, 비만세포 백혈병, 랑게르한스 세포 조직구증, 조직구성 육종, 랑게르한스 세포 육종 수지상 세포 육종, 여포 수지상 세포 육종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 림프종양 육아종증, 급성 백혈병, 림프구성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 급성림프구 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 성인 T-세포 백혈병/림프종, 원형질세포 백혈병, T-세포 대과립 림프구 백혈병, B-세포 전구림프구 백혈병, T-세포 전구림프구 백혈병, 전구체 B 림프모구 백혈병, 전구체 T 림프모구 백혈병, 급성 적혈구 백혈병, 림프육종 세포 백혈병, 골수양 백혈병, 골수원성 백혈병, 급성 골수원성 백혈병, 만성 골수원성 백혈병, 급성 전구골수세포 백혈병, 급성 전구골수세포 백혈병, 급성 골수단핵구 백혈병, 호염기성 백혈병, 호산성 백혈병, 급성 호염기성 백혈병, 급성 골수양 백혈병, 만성 골수원성 백혈병, 단핵구 백혈병, 급성 단핵모구 및 단핵구 백혈병, 급성 거대핵모세포 백혈병, 급성 골수양 백혈병 및 골수형성이상 증후군, 녹색종 또는 골수양 육종, 골수섬유증에 의한 급성범골수증, 털세포백혈병, 소아골수단핵구백혈병, 공격성 NK 세포 백혈병, 진성적혈구증가증, 골수증식병, 만성특발성골수섬유증, 본태성전구혈증, 만성신경친화 백혈병, 만성호산성 백혈병/과다호산성 증후군, 이식후 림프증식 장애, 만성골수증식 질환, 골수형성이상/골수증식 질환, 만성 골수단핵구 백혈병 및 골수형성이상 증후군이 있다. 특정 양태에 따르면, 과다증식 병변은 피험체의 구강에 영향을 미칠 수 있는 질환이다. 그 예에는 백색판증, 편평세포 과다형성 병변, 전암성 상피 병변, 상피내 종양 병변, 국소 상피 과다형성 및 편평암종 병변이 있다.
다른 특정 양태에 따르면, 과다증식 병변은 피험체의 피부에 영향을 미칠 수 있는 질환이다. 그 예에는 편평세포 암종, 기저세포 암종, 흑색종, 유두종(사마귀) 및 건선이 있다. 바이러스 관련 암종의 치료도 있으며, 그 예에는 두경부암이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 병변은 각질세포, 상피세포, 피부세포 및 점막세포와 같은 세포를 포함할 수 있다. 이러한 질환은 또한 폐점막에 영향을 미치는 질환일 수 있다.
질환은 전암성 병변, 예컨대 구강의 백색판증, 또는 피부의 광선 각화증 등일 수 있다.
치료 또는 예방되는 질환의 다른 예에는 감염성 질환 및 염증성 질환, 예컨대 자가면역 질환이 있다. 본 발명의 방법 및 조성물은 질환의 면역요법 또는 면역 예방에 적용될 수 있는 항원을 전달하는데 사용될 수 있다. 다른 질환의 예에는 상처, 화상, 피부 궤양, 척주후만증, 피부병(Burns et al., 2004), 치아 질환, 예컨대 치은염(Neville et al., 2001) 및 눈병(Yanoff et al., 2003)이 있다. 상처의 유전자 요법은 전문이 본 발명에 참고인용되는 문헌[Eriksson and Vranckx, 2004; Atiyeli et al., 2005; Ferguson and O'Kane, 2004; Waller et al., 2004; Simon et al., 2004; and Bok and Bok, 2004]에 논의되어 있다. 당업자라면 본 명세서에 제시된 약제학적 조성물과 방법을 이용하여 예방 또는 치료하기 용이할 수 있는 다수의 실재 질환을 잘 알고 있을 것이다.
3. 증식 억제 정의
과다증식 병변의 "증식 억제"는 광범위하게 정의되는 것으로서, 예컨대 병변의 증식 지연 또는 정지를 포함한다. 병변의 증식 억제는 또한 병변 크기 감소 또는 병변 세포의 아폽토시스 유도를 포함할 수도 있다. 아폽토시스 유도는 약물, 독소, 화합물, 조성물 또는 생물학적 실재가 세포에 아폽토시스 또는 프로그램된 세포사를 제공하는 상황을 의미한다. 특정 양태에 따르면, 세포는 종양 세포이다. 다른 양태에 따르면, 종양 세포는 두경부 암세포, 편평세포 암종, 경부 암세포 또는 항문성기 사마귀의 세포이다. 또 다른 양태에 따르면, 세포는 각질세포, 상피세포, 피부세포, 점막세포 또는 유두종바이러스에 의한 형질전환을 일으킬 수 있는 임의의 다른 세포이다. 병변의 증식은 병변 세포에 대한 면역반응의 유도로 억제될 수 있다.
F. 약제학적 조성물
1. 정의
"약제학적 조성물" 및 "제형화된"이란 표현은 포유동물 또는 사람에게 적당한 경우에 투여했을 때 부작용, 알러지 반응 또는 다른 부적당한 반응을 산출하지 않는 분자 실재 및 조성물을 의미한다. 본 명세서에 사용된, "약제학적 조성물"은 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질에 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 성분과 비상용성이지 않는 한, 치료적 조성물에의 이용은 고려되어야 한다. 또한, 보충성 활성 성분도 조성물에 첨가될 수 있다. 또한, 조성물은 보충성 비활성 성분도 포함할 수 있다. 예를 들어, 치약으로 사용되는 조성물은 향미제를 포함할 수 있고, 또한 조성물은 제형을 지효성으로 만드는 보충 성분을 함유할 수 있다. 제형은 이하 섹션에서 더 상세히 논의된다.
본 발명의 일부 약제학적 조성물은 경구 전달용으로 제형화된다. 경구 전달에는 적당한 경우, 동물이나 다른 포유동물의 구강을 통한 투여가 포함된다. 경구 전달은 또한 구강의 임의의 부분, 예컨대 잇몸, 치아, 구강 점막 또는 구강내 병변, 예컨대 전구종양 또는 종양 병변로의 국소 투여 등을 포함한다. 또한, 경구 전달은 구강 상처 또는 구강내 종양 층으로의 전달을 포함한다.
본 발명 중에서, "국소 투여"는 피부, 구강 점막, 위장 점막, 눈, 항문, 경부 또는 질과 같은 신체 표면으로의 투여 또는 이러한 임의의 영역에서 절제된 병변 층(즉, 절제된 인두 HNSCC 또는 절제된 경부 암종의 수술 층) 표면으로의 투여, 또는 방광과 같은 속빈 내장 표면으로의 투여를 포함한다.
또 다른 본 발명의 양태에 따르면, 약제학적 조성물은 장용 제형이다. 장용 제형은 환약, 보호 코팅된 캡슐 또는 위장의 낮은 pH를 견딜 수 있도록 설계된 현탁제를 포함한다. 이러한 장용 제형은 소장이나 대장으로 치료적 또는 진단적 유전자를 전달시켜 줄 것이다.
2. 고체 또는 반고체 제형
본 발명의 약제학적 조성물은 고체 또는 반고체로 제형화될 수 있다. 고체 및 반고체 제형은 수성 제형외의 다른 임의의 제형을 의미한다. 당업자라면, 고체 또는 반고체인 제제의 제형을 잘 알고 있을 것이다.
그 예에는 겔, 매트릭스, 포옴, 크림, 연고, 로젠지, 롤리팝, 검, 분말, 겔 스트립, 필름, 하이드로겔, 용해성 스트립, 페이스트, 치약 또는 고형 스틱이 있다. 이러한 제형 중 일부는 이하에 더 상세히 논의된다.
a. 겔
겔은 콜로이드성 용액으로부터 형성되는 분명히 고체인 젤리류의 물질로서 정의되는 것이다. 콜로이드성 용액은 미분 입자가 쉽게 여과되거나 빠르게 침강되지 않게 하는 방식으로 연속 배질 내에 미분 입자를 분산시킨 용액이다.
겔 제형에 관한 방법은 본원에 전문이 참고인용되는 문헌[미국 특허 6,828,308, 미국 특허 6,280,752, 미국 특허 6,258,830, 미국 특허 5,914,334, 미국 특허 5,888,493 및 미국 특허 5,571,314]에 제시되어 있다.
i. 국소용 겔
본 명세서에 제시된 약제학적 조성물의 일부는 국소용 겔로서 제형화된다. 예를 들어, 핵산 발현 작제물은 소수성 겔계 약제학적 제형으로서 제형화될 수 있다. 소수성 겔은 예컨대 5량체 사이클로메타콘 성분(Dow Corning 245 fluid™)을 핵산 발현 작제물의 액체 현탁액, 수소화된 피마자유, 옥틸팔미테이트 및 8:2 비율의 사이클로메티콘과 디메티코놀의 혼합물을 혼합하여 제형화할 수 있다. 5량체 사이클로메티콘 성분은 겔의 약 40%이고, 액체 핵산 발현 작제물 성분은 겔의 약 30.0%이며, 수소화된 피마자유 성분은 겔의 약 10%이고, 옥틸 팔미테이트 성분은 겔의 약 10.0%이고, 사이클로메티콘/디메티코놀 성분은 겔의 약 10.0%인 것이 바람직하다. 앞에 열거한 각 성분은 진공 하에 약 80 내지 90℃의 온도로 가열하면서 함께 혼합할 수 있다. 그 다음, 온도를 예컨대 37℃로 낮춘 즉시, 핵산 발현 작제물 성분을 첨가할 수 있고, 최종 겔 조성물은 상온까지 냉각시켜야 한다. 소수성 겔 제형에 핵산 발현 작제물의 최종 농도는 이용된 작제물의 종류 및 투여 목적에 따라 달라질 것이다.
ii. 경구용 겔 제형
핵산 발현 작제물을 전달하기 위한 경구용 겔 약제학적 제형은 당업자에게 공지된 임의의 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 이러한 약제학적 제형은 구강에 적용될 수 있다. 이러한 겔은 예컨대 물, 소르브산칼륨, 벤조산나트륨, EDTA 이나트륨, 히알루론산 및 말토덱스트린을 혼합하여 제조할 수 있다. 전술한 성분들을 용해한 후, 폴리비닐피롤리돈을 완전히 용매화될 때까지 교반 및 진공, 예컨대 30mmHg 하에 첨가할 수 있다. 하이드록시에틸셀룰로스 및 사카린나트륨과 같은 감미제 등의 기타 성분도 완전히 용매화될 때까지 진공하에서 혼합물에 교반 첨가할 수 있다. 이러한 혼합물에 그 다음 수소화된 피마자유, 염화벤즈알코늄 및 프로필렌 글리콜과 글리시르레틴산의 혼합물을, 동일한 조건 하에 아래에 열거된 순서대로 첨가하여 그 성분들이 완전히 용해될 때까지 교반할 수 있다. 이혼합물을 추가 30분 동안 진공하에 교반하여 겔을 만들 수 있다. 표 4는 전술한 성분들과 바람직한 농도를 열거한 것이다.
또는, 전술한 성분들을 포함하는 시판되는 경구용 겔 제형, 예컨대 Gelclair®(Helsinn Healthcare, Switzerland)을 이용할 수 있다.
성분 중량%
히알루론산나트륨 0.1
글리시르레틴산 0.06
폴리비닐피롤리돈 9.0
말토덱스트린 6.00
프로필렌 글리콜 2.94
소르브산칼륨 0.3
하이드록시에틸 셀룰로스 1.5
수소화된 피마자유 PEG-40 0.27
EDTA 이나트륨 0.1
염화벤즈알코늄 0.5
사카린 나트륨 0.1
정제수 78.60
이어서, 겔은 본 발명에 따른 1종 이상의 핵산 발현 작제물과 배합될 수 있다. 예를 들어 전술한 겔 15ml는 핵산 발현 작제물의 액체 현탁액 30 내지 50ml와 혼합될 수 있다. 액체 현탁액 및 겔 제형 중의 핵산 발현 작제물의 농도는 사용된 발현 작제물의 종류 및 치료 용도에 따라 달라질 것이다.
iii. 안과용 겔 제형
이 겔은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 따라 안구 전달용으로 제형화할 수 있다. 예를 들어, 안과용 겔은 제1 용액과 제2 용액을 제조한 다음 각 용액을 혼합하여 핵산 발현 작제물을 피험체에게 국소 전달하는 용도로 제조할 수 있다.
제1 용액의 일 예는 대략 정제수 200g, 붕산 906g, 붕산나트륨 0.13g, 에데트산 이나트륨 1.0g, 염화벤즈알코늄 0.1g, 염화나트륨 4.0g 및 핵산 발현 작제물 동결건조물 또는 액체 현탁물 0.26g을 포함한다. 제1 용액 중의 핵산 발현 작제물의 구체적인 농도는 발현 작제물의 종류 및 치료법과 치료 목적에 따라 결정할 수 있다.
제2 용액은 예컨대 정제수 760g과 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스 35g을 함유할 수 있다. 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스는 물을 약 90℃까지 가열하여 균일한 분산액이 형성될 때까지 정제수에 용해할 수 있다.
제2 용액의 혼합 시, 온도는 저하시켜 핵산 발현 작제물의 불활성화 없이 제1 용액이 무균 첨가될 수 있도록 한다. 이 방법은 단지 예시적인 것이다.
b. 매트릭스
매트릭스는 주변 물질로서, 이 안에 다른 어떤 물질, 예컨대 약제학적 성분이 함유되는 물질을 의미한다. 전도성 실리콘 매트릭스의 제형에 관한 방법은 전문이 본 발명에 참고인용된 미국 특허 6,119,036에 기술되어 있다. 또한, 콜라겐계 매트릭스의 제형에 관한 방법, 예컨대 문헌[Doukas et al., 2001, 및 Gu et al., 2004]에 기술된 방법을 참고한다.
c. 포옴
본 명세서에 제시된 포옴은 액체에 다수의 기포를 포집하여 만든 조성물이다. 포옴의 제형 및 투여에 관한 방법은 본 발명에 전문이 참고인용된 미국 특허 4,112,942, 미국 특허 5,652,194, 미국 특허 6,140,355, 미국 특허 6,258, 374 및 미국 특허 6,558,043에 제시되어 있다.
전형적인 포옴 약제학적 제형은 예컨대 기포가 약제학적 조성물에 존재하도록 겔이나 수성 약제학적 조성물에 기체를 첨가하여 제조할 수 있다.
가압 기체의 사용을 수반하는 포옴 약제학적 제형의 일 예는 다음과 같다. 간략히 설명하면, 본 발명의 핵산(12% w/v)은 광유와 약한 진공하에 약 30분 동안 교반하여 혼합함으로써 제1 혼합물을 만든다. 이 제1 혼합물에 같은 조건 하에서 광유 중의 세틸 스테아릴 알콜 용액(6% w/v)을 첨가하여 최종 혼합물을 만든다. 이 최종 혼합물을 이어서 추가 10분 동안 교반할 수 있다. 그 다음, 최종 혼합물을 적당한 캐니스터에 주입하고 추진용 기체를 압입한다. 이 캐니스터는 최종 혼합물을 분배하는 기구를 보유할 수 있고, 그 예로는 가압된 캐니스터에서 흔히 발견되는 종류의 폴리에틸렌 밸브가 있다. 이 방법은 단지 예시적인 방법이다.
d. 크림 및 로션
크림은 본 명세서에서 정의된 반고체 에멀젼으로 정의되는 것으로서, 1종 이상의 오일과 물의 혼합물을 포함하는 조성물을 의미한다. 로션과 크림은 동일한 종류의 제형을 나타내는 것으로 간주한다. 크림 제형에 관한 방법은 본 발명에 전문이 참고인용된 미국 특허 6,333,194, 미국 특허 6,620,451, 미국 특허 6,261,574, 미국 특허 5,874,094 및 미국 특허 4,372,944에 각각 제시되어 있다.
e. 연고
연고는 다양한 신체 표면에 국소적으로 사용된 점성 반고체 제제로서 정의되어진다. 연고 제형에 관한 방법은 본 발명에 전문이 참고인용된 미국 특허 5,078,994, 미국 특허 4,868,168 및 미국 특허 4,526,899에 제시되어 있다.
예를 들어, 연고의 약제학적 제형은 대략 23.75w/v% 이소스테아릴 벤조에이트, 23.85w/v% 비스(2-에틸헥실) 말레이트, 10.00w/v% 사이클로메티콘, 5.00w/v% 스테아릴 알콜, 10.00w/v% 미세다공성 셀룰로스, 15.00w/v% 에틸렌/비닐 아세테이트 공중합체, 0.1w/v% 부틸파라벤, 0.1w/v% 프로필파라벤 및 2.20w/v% 핵산 발현 작제물을 포함할 수 있다. 제1 용액 중에 핵산 발현 작제물의 구체적인 농도는 발현 작제물의 종류, 치료법 및 투여 목적에 따라 결정될 것이다.
f. 분말
분말은 임의의 무수 물질이 파운딩, 분쇄(grinding) 또는 마쇄(triturating)에 의해 축소된 미세 입자로서 정의되어진다.
g. 겔 스트립
겔 스트립은 탄성 성질을 보유한 겔의 박층으로서 정의되어진다. 이러한 겔은 접착제와 함께 제형화하거나 제형화하지 않을 수 있다. 이 겔은 경시적으로 서서히 용해하도록 제형화할 수 있다. 예를 들어, 경구용으로 설계된 겔은 적용 후 용해하도록 설계할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기에 적합한 다른 경구 전달 시스템은 용해성 스트립이다. 이러한 구조의 일 예는 Listerine® Antiseptic에 존재하는 성분(티몰, 유칼립톨, 메틸 살리실레이트, 멘톨)이 함침된 마이크로씬 전분계 필름인 Cool Mint Listerine PocketPaks® Strips이다. 비활성 스트립 성분에는 풀루란, 풍미제, 아스파탐, 포타슘 아세설팜, 구리 글루코네이트, 폴리소르베이트 80, 카라기난, 글리세릴 올레이트, 로커스트 빈 검, 프로필렌 글리콜 및 크산툼 검이 있다.
h. 필름
필름은 선택된 약학 성분이 코팅된 셀룰로스 유도체 또는 열가소성 수지 등의 가요성 물질의 박막 시트 또는 스트립으로서 본 명세서에서 정의되는 것이다. 롤리팝은 손잡이로 사용된 스틱의 한쪽 말단에 로젠지가 부착된 것이다.
본 발명의 약제학적 필름, 로젠지 또는 롤리팝은 예컨대 크산툼 검, 로커스트빈 검, 카라기난 및 풀루란을 포함할 수 있는 성분으로 구성될 수 있다. 성분들은 정제수에서 수화된 다음 4℃에서 하룻밤 동안 저장한 후, 이 혼합물에 착색제, 구리글루코네이트, 감미제, 향미제 및 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 예컨대 폴리소르베이트 80 및 Atmos 300™(ICI Co.) 및 핵산 발현 작제물을 첨가할 수 있다.
본 발명의 필름 제제는 예컨대 전술한 혼합물을 주형에 붓고 필름으로 주조한 뒤, 건조하고, 약제학적 조성물의 바람직한 투약량에 따라 바람직한 크기로 절단하여 제조할 수 있다. 또한, 필름은 감미제 또는 향미제 첨가 없이도 제형화할 수 있는데, 이러한 경우는 예컨대 제형이 경구 투여용이 아닌 경우이다.
i. 로젠지
고체 로젠지는 약물 전달 분야에 공지된 것이다. 로젠지는 피험체 구강에 놓았을 때 서서히 용해하도록 설계된, 치료제와 다른 제제, 예컨대 결합제 및 감미제로 이루어진 작은 고체이다. 로젠지는 이러한 투약 형태에 공지된 다른 성분, 예컨대 산도 조절제, 불투명화제, 안정제, 완충제, 향미제, 감미제, 착색제 및 보존제와 같은 성분을 함유할 수 있다. 예를 들어, 고체 제형은 로젠지 기제(예, 당과 액체 글루코스의 혼합물)를 진공 하에 가열하여 과량의 물을 제거한 뒤, 이 혼합물에 나머지 성분을 블렌딩하여 로젠지로서 제조할 수 있다. 그 다음, 수득되는 혼합물을 연속적인 원형체로 뽑아내고, 이로부터 각각의 로젠지를 형성한다. 그 다음, 로젠지를 냉각하고, 육안 검사한 뒤, 적당한 패키징에 포장한다.
적당한 패키징의 1가지 형태는 금속 호일로 밀봉된 수불침투성 플라스틱 재질(예, 폴리비닐클로라이드)의 블리스터 팩이다. 환자는 로진지를 분리하기 위해, 로진지를 파쇄하고 금속 호일 밀봉을 통해 통과할 정도로 블리스터에 압력을 가한다. 로젠지는 보통 환자가 입으로 빨 때 약물을 방출한다. 저작할 수 있는 고체 용량 제형은 씹을 수 있는 캔디 제품 또는 츄잉검의 제조에 사용된 방법으로 만들 수 있다. 예를 들어, 씹을 수 있는 고체 투약 형태는 선택적으로 첨가되는 위핑제, 습윤제, 윤활제, 향미제 및 착색제와 함께 약물이 첨가되는 당과 글루코스 시럽의 압출 혼합물로 제조할 수 있다[Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Vol. 1, 2nd Ed., Lieberman et al.(Eds.), 1989].
j. 롤리팝
다른 양태에 따르면, 핵산은 "롤리팝" 또는 "서커(sucker)" 형태로 경구 전달될 수 있다. 일반적으로, 롤리팝과 서커는 약물이 분산된 고체 매트릭스로 정의되어진다. 이들은 실온에서 고체 또는 반고체이며, 수성 환경, 예컨대 구강에 접촉 시 용해된다. 매트릭스의 용해(이에 따른 약물의 방출)는 구강의 증가된 온도(상온 또는 실온에 비해)로 인해 향상될 수 있다. 롤리팝은 환자에게 약물을 투여하는 편리한 매개제일 수 있고, 환자의 구강에서 일시적으로 제거할 수 있다는 점에서 로젠지와 다르다. 롤리팝은 필요한 경우에 환자가 구강으로 전달하고, 전달 기관 및 정도를 조절할 수 있다.
본 발명의 롤리팝(또는 필름 또는 로젠지)은 예컨대 크산툼 검, 로커스트빈 검, 카라기난 및 풀루란을 포함할 수 있는 성분으로 구성될 수 있다. 성분들을 예컨대 정제수에 수화시킨 다음 4℃에서 하룻밤 동안 보관한 후, 이 혼합물에 착색제, 구리 글루코네이트, 감미제, 향미제 및 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 예컨대 폴리소르베이트 80 및 Atmos 300™(ICI Co.) 및 핵산 발현 작제물을 첨가할 수 있다.
본 발명의 롤리팝 또는 로젠지 제제는 예컨대 전술한 혼합물을 원하는 크기의 주형에 부은 다음 건조시켜 제조할 수 있다. 건조하기 전에, 주형에 롤리팝 제제용의 통상적인 롤리팝 수용 스틱을 삽입할 수 있다.
k. 하이드로겔
하이드로겔은 때로는 물이 분산 매질인 콜로이드성 겔로서 제공되는 중합체 사슬의 망상구조로서 정의되는 것이다. 본 명세서의 교시와 당업자의 지식을 이용하여, 약제학적 제형은 피험체에게 국소 전달하기 위한 핵산 발현 작제물과 착물을 형성할 수 있도록 하이드로겔로 제형화할 수 있다. 바이러스 벡터 중의 핵산을 전달하기 위한 하이드로겔 제형의 일 예는 다음과 같다.
예를 들어, 소의 타입 I 콜라겐(예컨대, Collagen Corporation, Fremont, Calif.에서 입수용이함), 알긴산나트륨 및 바이러스 벡터의 액체 현탁액을 함께 혼합하여 하이드로겔 전구체를 만든다. 콜라겐:알긴산염의 무수 중량 기준의 비율은 약 7:3 내지 약 4:6 범위일 수 있다. 하이드로겔 전구체 혼합물을 제조한 뒤, 이 혼합물을 고화시켜 하이드로겔 매트릭스를 제조한다. 이 혼합물은 다가 양이온, 예컨대 Ca2+와 접촉하면 고화되어 하이드로겔을 형성할 수 있다. Ca2+ 용액은 적어도 2.5밀리몰인 것이 바람직하다. 핵산 발현 작제물의 농도는 사용된 작제물의 종류 및 투여 목표에 따라 달라질 것이다.
l. 용해성 스트립
용해성 스트립은 체강과 같은 수성 환경의 존재 하에서 용해되도록 안출된 필름으로서 정의된다.
m. 페이스트 및 치약
페이스트는 충분히 큰 부하 또는 스트레스가 적용될 때까지 고체로서 행동하고, 이 시점에서 유체처럼 유동하는 물질로서 정의된다. 치약은 치아의 미적 외관을 청결히 하고 개선시키기 위해 사용된 페이스트 또는 겔로서 정의되는 것이다. 페이스트 치분은 물, 결합제, 연마제, 풍미제, 발포제 및 습윤제를 포함할 수 있다. 치약의 제형에 관한 방법은 전문이 본 발명에 참고인용된 미국 특허 4,627,979, 미국 특허 6,508,647, 미국 특허 출원 20020045148 및 미국 특허 출원 20040018155에 제시되어 있다.
본 명세서의 교시와 당업자의 지식을 이용하여, 피험체의 구강으로 핵산 발현 작제물을 전달하기 위한 치약 약제학적 제형을 작제하는 방법을 선택할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 치약의 제형은 예를 들어 다음과 같다: 실리카 또는 탄산칼슘과 같은 연마 물질 1중량%, 글리세롤 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올 20 내지 75중량%, 중탄산나트륨 20 내지 55중량%, 나트륨 라우릴 설페이트 0.001 내지 40중량%, 이산화티탄 0.001 내지 20중량%, 구아 검 또는 펙틴과 같은 점증제 0.1 내지 10중량%, 사카린나트륨 0.001 내지 5중량% 및 액체 제형의 핵산 발현 작제물 10 내지 30중량%. 제1 용액 중의 핵산 발현 작제물의 구체적인 농도는 발현 작제물의 종류, 치료법 및 치료 목표에 따라 결정될 것이다.
n. 좌약 및 페서리
다른 투여 방식에 적합한 또 다른 제형에는 질 좌약 및/또는 페서리가 있다. 직장 페서리 및/또는 좌약이 또한 사용될 수 있다. 좌약은 보통 직장, 질 및/또는 요도로 삽입할 수 있도록 약제첨가된 각종 중량 및/또는 형태의 고체 투약 형태이다. 삽입 후, 좌약은 체강액 내에서 연화, 용융 및/또는 용해한다. 일반적으로, 좌약용의 통상적인 결합제 및/또는 담체는 예컨대 폴리알킬렌 글리콜 및/또는 트리글리세라이드를 포함할 수 있고, 이러한 좌약은 활성성분을 0.5% 내지 10% 범위, 바람직하게는 1 내지 2% 범위로 포함하는 혼합물로 제조할 수 있다. 좌약의 약제학적 제형에 관한 방법은 본 발명에 전문이 참고인용된 미국 특허 6,982,091에 제시되어 있다.
본 발명에 따른 좌약 제형은 예컨대 선택된 핵산, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 친지성 담체 및 침투 향상제를 배합하여 제형화할 수 있다. 예를 들어, 좌약은 하이드록시프로필 메틸셀룰로스(예, DOW CHEMICAL(미시간주 미드랜드 소재)에서 입수한 METHOCEL K, HPMC K15M(8wt%); 및 침투 향상용 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르(예, Gattefosse에서 입수한 TRANSCUTO® (17wt%))를 친지성 담체 SUPPOCIRE CS2(Gatteofosse 제품, 뉴저지 웨스트우드 소재)(75wt%)에 용해시켜 제형화할 수 있다. 선택된 핵산은 혼합물에 넣고 교반한 후, 적당한 좌약용 주형에 붓고, 국소 적용하기 전에 고화시킨다.
o. 검
또한, 본 발명은 피험체에게 핵산의 경구 전달용으로 작제할 수 있는 본 발명의 검계(gum-based) 약제학적 제형을 제공한다.
예를 들어, 검 기제 펠릿은 경도 증가를 위해 동결하고 분말 형태로 기계적으로 분쇄한다. 이어서, 검 분말은 실온으로 승온시키고, 조성물의 약 20 내지 65중량%를 구성하는 프럭토스 또는 아스파탐과 같은 감미제와 혼합할 수 있다. 그 다음, 검-감미제 조성물에는 본 발명의 핵산의 액체 현탁액이 보충될 수 있다. 예를 들어, 핵산의 액체 현탁액 함량은 검-감미제 조성물의 2중량%와 대략 동일할 수 있다. 검-감미제 조성물과 핵산의 혼합물은 그 다음 원하는 형태로 압착한 후, 피험체에 투여할 수 있다. 본 발명은 치료제를 검에 제형화하는 다른 방법도 생각할 수 있으며, 이러한 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있다.
3. 희석제 및 담체
일정한 특정 양태에 따르면, 경구용 약제학적 조성물은 불활성 희석제 및/또는 동화성 식용 담체를 포함할 수 있고(있거나), 경질 및/또는 연질 외피 겔라틴 캡슐 에 담아 밀봉할 수 있고(있거나) 정제로 압착할 수 있고(있거나) 직접 식사용 음식에 첨가할 수도 있다. 경구 치료 투여 시, 활성 화합물은 부형제와 혼합되고(되거나) 소화가능한 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁제, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.
국소 사용하기 전에 액체인 용액이나 현탁액에 적합한 고체 형태도 본 발명에 고찰되는 것이다.
본 발명의 고체 및 반고체 제형은 다음과 같은 성분을 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대 트라가칸트, 아카시아, 옥수수전분 및/또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 인산이칼슘; 붕해제, 예컨대 옥수수전분, 감자전분, 알긴산 등; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트; 방향제 및/또는 감미제, 예컨대 슈크로스, 락토스 및/또는 사카린, 및/또는 풍미제, 예컨대 페퍼민트, 살리실산메틸, 및/또는 체리 향료. 투약 단위 형태가 캡슐인 경우에, 캡슐은 전술한 종류의 재료 외에 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 다른 재료가 코팅재로서 제공되고(되거나) 다른 방식으로 투약 단위의 물리적 형태를 변경시키기 위해 제공될 수 있다. 예를 들어, 정제, 환약 및/또는 캡슐은 셀락, 당 및/또는 이의 혼합물로 코팅될 수 있다. 보존제, 염료 및 향료는 당업자에게 공지된 것이 고찰될 수 있다.
피부 표면에 사용하기 위해 고찰된 본 발명의 고체 및 반고체 제형은 미용 용도로 조성물에 통상 배합되는 다른 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 미용 성분에는 왁스, 오일, 습윤제, 보존제, 항산화제, 자외선 흡수제, 자외선 산란제, 중합체, 표면 활성제, 착색제, 안료, 분말, 약물, 알콜, 용매, 방향제, 풍미제 등이 있다. 미용 조성물의 구체예에는 메이크업 화장품, 예컨대 립스틱, 립글로스, 립밤, 피부 결점 콘실러 및 로션 등이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 약제학적 담체로서 사용하기 위해 설계된 미용 제형에 관한 방법은 전문이 본 발명에 참고인용되는 미국 특허 6,967,023, 미국 특허 6,942,878, 미국 특허 6,881,776, 미국 특허 6,939,859 및 미국 특허 6,673,863에 제시되어 있다.
4. 수성 제형
본 발명의 특정 약제학적 조성물은 수성 조성물로서 제형화될 수 있다. 본 발명의 수성 조성물은 약제학적 허용성 담체 또는 수성 매질에 용해되거나 분산된 핵산의 유효량을 포함한다.
본 명세서에 제시된 약제학적 조성물의 특정 구체예의 투여는 표적 조직이 투여된 경로를 통해 이용할 수 있는 한, 일반적인 모든 경로를 통해 이루어질 수 있다. 그 예에는 식도, 위, 구강, 코, 협측, 항문, 직장, 질, 국소 안구 또는 피부 적용이 있다. 이러한 조성물은 보통 생리적 허용성 담체, 완충제 또는 다른 부형제를 포함하는 약제학적 허용성 조성물로서 투여될 수 있다. 다른 부형제의 예에는 방향제 및 풍미제가 있다.
이 제형은 액체 형태이거나 또는 현탁액일 수 있다. 이러한 목적에 일반적인 조성물은 약제학적 허용성 담체를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 인산염완충식염수 1ml당 사람 혈청 알부민 10mg, 25mg, 50mg 또는 최고 약 100mg을 함유할 수 있다. 다른 약제학적 허용성 담체에는 수성 용액, 비독성 부형제, 예컨대 염, 보존제, 완충액 등이 있다. 비수성 용매의 예에는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 및 주사성 유기 에스테르, 예컨대 에틸올레이트가 있다. 수성 담체에는 물, 알콜성/수성 용액, 식염수 용액, 비경구 매개제, 예컨대 염화나트륨, 링거 덱스트로스 등이 있다. 보존제에는 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 기체가 있다. 약제학적 조성물의 각종 성분의 pH 및 정확한 농도는 공지된 매개변수에 따라 조정된다.
경구 투여용 수성 조성물의 예에는 구강청정제, 구강세정제, 어플리케이터를 통한 구강 적용용 코팅, 또는 구강 스프레이가 있다. 구강청정제 제형은 당업자에게 공지되어 있다. 구강청정제 및 구강세정제에 관한 제형은 예컨대 본 명세서의 이 섹션과 그외 섹션에서 참고인용된 문헌들[미국 특허 6,387,352, 미국 특허 6,348,187, 미국 특허 6,171,611, 미국 특허 6,165,494, 미국 특허 6,117,417, 미국 특허 5,993,785, 미국 특허 5,695,746, 미국 특허 5,470,561, 미국 특허 4,919,918, 미국 특허 출원 20040076590, 미국 특허 출원 20030152530 및 미국 특허 출원 20020044910]에 상세히 논의되어 있다.
경구용 제형은 예컨대 약제학적 등급의 만니톨, 전분, 마그네슘스테아레이트, 사카린나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같이 통상적으로 이용되는 부형제를 포함한다. 이러한 조성물은 구강청정제 및 구강세정제와 같은 용액 형태일 수 있다. 이러한 조성물 및/또는 제제는 적어도 0.1%의 활성 화합물을 함유해야 한다. 조성물 및/또는 제제의 비율은 물론 변동될 수 있고(있거나) 편리하게는 단위 중량의 약 2 내지 약 75% 사이, 및/또는 바람직하게는 25 내지 60% 사이일 수 있다. 이러한 치료적으로 유용한 조성물 중의 활성 화합물의 함량은 적당한 투약량이 수득될 정도이다.
본 발명의 발현 카세트는 경구 투여를 위해 부형제와 혼합되어 비섭취성 구강청정제 및 치분 형태로 사용될 수 있다. 구강청정제는 활성 성분을 적당한 용매, 예컨대 붕산나트륨 용액(Dobell's Solution)에 필요한 양만큼 첨가하여 제조할 수 있다. 또는, 활성 성분은 붕산나트륨, 글리세린 및 중탄산나트륨을 포함하는 방부성 세척제에 혼합될 수 있다. 또한, 활성 성분은 겔, 페이스트, 분말 및 슬러리 등의 치분에 분산될 수 있다. 본 발명의 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적 허용성 염에는 염산, 인산과 같은 무기산이나, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산에 의해 형성되는 산부가 염(단백질의 유리 아미노기에 의해 형성됨)이 있다. 또한, 유리 카르복시기에 의해 형성된 염은 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 철 수산화물과 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다.
본 발명의 발현 카세트는 또한 경구 투여를 위해 과다증식성 병변의 검출을 돕기 위한 염료, 예컨대 톨루이덴 블루 O 염료와 혼합되어, 비소화성 구강청정제, 구강세정제 및 치분 형태로 사용될 수 있다. 구강청정제는 필요한 함량의 활성 성분을 구강 투여용 염료 조성물, 예컨대 톨루이덴 블루 O 염료, 완충액, 향미제, 보존제, 아세트산, 에틸 알콜 및 물의 조성물에 첨가하여 제조할 수 있다. 전암성 및 암성 병변의 염색에 톨루이덴 블루 O 염료의 사용에 관한 방법 및 제형은 예컨대 전문이 본 발명에 참고인용된 미국 특허 4,321,251, 미국 특허 5,372,801, 미국 특허 6,086,852 및 미국 특허 출원 20040146919에서 찾아볼 수 있다.
국소 표면에 적용하기 위한 수성 조성물의 예는 유리 염기 또는 약리학적 허용성 염으로서의 활성 화합물을 물 및 계면활성제와 혼합한 용액, 및 에멀젼과 같은 에멀젼 또는 약제학적 허용성 담체를 포함한다. 에멀젼은 보통 1종의 액체가 다른 액체에 보통 0.1㎛ 직경이 넘는 소적 형태로 분산되어 있는 불균질 시스템이다(Idson, 1988; Rosoff, 1988; Block, 1988; Higuchi et al., 1985). 에멀젼은 종종 2가지 불혼화성 액체상이 충분히 혼합되어 서로 분산되어 있는 2상 시스템이다. 일반적으로, 에멀젼은 유중수(w/o) 또는 수중유(o/w) 형태일 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 에멀젼에 관한 방법은 전문이 본 발명에 참고인용되는 미국 특허 6,841,539 및 미국 특허 5,830,499에 제시되어 있다. 피부에 적용하기 위한 수성 조성물은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물 중의 분산액을 포함할 수 있다. 보관 및 사용의 통상적인 조건 하에서, 이러한 제제들은 미생물 증식을 억제하기 위해 보존제를 포함한다.
리포좀 및/또는 나노입자의 사용도 본 발명에서 고찰되는 것이다. 리포좀의 형성 및 사용은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있으며, 이하에도 기술된다. 리포좀은 또한 본 명세서의 다른 부분에서도 논의되고 있다.
나노캡슐은 일반적으로 안정하고 재현가능한 방식으로 화합물을 포착할 수 있다. 세포내 중합체 과부하로 인한 부작용을 피하기 위해 그러한 초미세 입자(약 0.1㎛ 크기)는 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 이용하여 설계되어야 한다. 그러한 조건을 충족시키는 생체분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자는 본 발명에서 고찰되는 것으로서, 이러한 입자는 쉽게 제조된다. 본 발명의 방법과 조성물에 사용될 수 있는 나노입자의 사용에 관한 방법은 전문이 본 발명에 참고인용되는 미국 특허 6,555,376, 미국 특허 6,797,704, 미국 특허출원 20050143336, 미국 특허출원 20050196343 및 미국 특허출원 20050260276에 제시되어 있다.
인두 또는 위 전달을 위한 수성 조성물의 예에는 액체 제산제 및 액체 알긴산염-래프트 형성 조성물이 있다. 액체 제산제 및 액체 슈크랄페이트 또는 알긴산염-래프트 형성 조성물은 당업자에게 공지되어 있다. 알긴산염은 일반적으로 안전한 것으로 간주되고 있는 약학 부형제로서, 각종 특허 문헌, 예컨대 본 명세서의 이 섹션과 다른 모든 섹션에서 참고인용되고 있는 미국 특허 6,348,502, 미국 특허 6,166,084, 미국 특허 6,166,043, 미국 특허 6,166,004, 미국 특허 6,165,615 및 미국 특허 5,681,827에 잘 보고되어 있는 각종 약학 시스템을 제조하는데 사용된다.
인두 또는 위 전달을 위한 경구 제형은 여기에 일반적으로 이용되는 부형제, 예컨대 약제학적 등급의 하이드록시에틸 셀룰로스, 물, 시메티콘, 탄산나트륨, 사카린나트륨, 소르비탈 등을 포함한다. 향미제도 이용될 수 있다. 이러한 조성물 및/또는 제제는 적어도 0.1%의 활성 화합물을 함유해야 한다. 조성물 및/또는 제제의 비율은 물론 변동될 수 있고(있거나) 편리하게는 단위 중량의 약 2 내지 약 75% 사이 및/또는 바람직하게는 25 내지 60% 사이일 수 있다. 이와 같은 치료적으로 유용한 조성물 중의 활성 화합물의 함량은 적당한 투약량이 수득될 수 있을 정도이다.
또한, 투여를 위한 용액 및/또는 스프레이, 하이포스프레이, 에어로졸 및/또는 흡입제를 사용할 수 있다. 일 예는 호흡소화관에 투여하는 스프레이이다. 이 스프레이는 등장성이고(이거나) pH 5.5 내지 6.5를 유지하도록 약하게 완충화된 것이다. 또한, 필요하다면, 안과용 제제에 사용되는 것과 유사한 항미생물성 보존제 및/또는 적당한 약물 안정화제가 제형에 첨가될 수 있다. 스프레이 투여에 관한 방법은 본 명세서의 이 섹션과 다른 모든 섹션들에서 참고인용된 미국 특허 6,610,272, 미국 특허 6,551,578, 미국 특허 6,503,481, 미국 특허 5,250,298 및 미국 특허 5,158,761에 제시되어 있다.
본 명세서에 제시된 수성 약제학적 조성물의 특정 양태의 투여는 표적 조직이 선택된 경로를 통해 이용할 수 있는 한, 일반적인 임의의 경로를 통해 이루어질 수 있다. 그 예에는, 경구, 비측, 협측, 항문, 직장, 질 또는 국소 안구 경로가 있다. 이러한 조성물은 보통 생리적 허용성 담체, 완충액 또는 다른 부형제를 포함하는 약제학적 허용성 조성물로서 투여될 수 있다. 다른 부형제의 예에는 방향제 및 향미제가 있다.
a. 구강청정제 제형
본 명세서의 교시와 당업자의 지식을 사용하여, 구강으로 적용되는 구강청정제로서 핵산 발현 작제물을 전달하는 약제학적 제형을 제조할 수 있다. 예를 들어, 구강청정제 제형은 선택된 핵산 발현 작제물의 전형적인 구강청정 용액 및 현탁액을 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 이용될 수 있는 전형적인 구강청정 용액의 제형 중 하나는 다음 표 5에 제시한 바와 같다.
성분 중량
염화칼슘 탈수물 1.39g
염화나트륨 11.42g
벤조산나트륨 0.050g
인산이나트륨 0.634g
인산일나트륨 0.200g
향료 0.1ml
증류수 2000ml까지의 적당량
구강청정제 제형은 핵산 발현 작제물, 예컨대 아데노바이러스 벡터와 혼합될 수 있다. 핵산 발현 작제물의 농도는 사용된 특정 작제물 및 치료 목표에 따라 달라질 수 있다. 이어서, 제형은 피험체의 구강으로 적용될 수 있다. 예를 들어, 적용은 면봉, 가글링 또는 스위싱에 의해 이루어질 수 있다. 적용은 한번 또는 여러번 반복할 수 있다.
대안적으로, 본 명세서의 교시와 당업자의 지식을 이용하여, 구강으로 핵산 발현 작제물을 전달하기 위해 전암성 및 암성 병변 검출용 염료를 포함하는 구강청정용 약제학적 제형을 제조할 수 있다. 예를 들어, 핵산 작제물은 염료 함유 구강청정제와 혼합할 수 있다. 구강에 전암성 및 암성 병변을 검출할 수 있는 염료를 포함하는 구강청정제를 수반하는 방법 및 제형은 다음과 같다.
톨루이덴 블루 O 염료(1w/v%), 향미제(0.2w/v%) 및 아세트산나트륨 3수화물 완충 용액은 예를 들어, 물, 빙초산 및 에탄올 용액에 용해시켜 염료 함유 구강청정 용액을 제조할 수 있다. 그 다음, 본 발명에 따른 핵산을 적당한 함량으로 상기 구강청정 용액에 첨가할 수 있다. 구강청정제에 핵산의 농도는 이용된 핵산 작제물의 종류와 투여 목표에 따라 달라질 것이다.
예를 들어, 약제학적 제형은 다음과 같은 단계를 이용하여 피험체에 투여할 수 있다: 1) 피험체는 물에 1% 아세트산과 벤조산나트륨 보존제를 포함하는 세정 용액 약 15ml를 20초 동안 가글 및 스위시한 다음, 가래를 뱉는다, 2) 피험체는 물 약 15ml를 20초 동안 가글 및 스위시한 다음, 가래를 뱉는다, 3) 피험체는 60초 동안 약제학적 제형 약 30ml를 가글 및 스위시한 다음 가래를 뱉는다, 4) 단계 1을 2번 반복한다, 5) 단계 2를 2회 반복한다. 이러한 조성물을 투여하는 다른 방법도 있으며, 당업자라면 잘 알고 있는 방법이다.
구강의 관찰은 염색된 전암성 세포 및 암성 세포의 존재에 대해 구강을 조사하기 위해 약제학적 제형을 적용한 직후 적당한 배율 및 적당한 광 하에서 수행할 수 있다. 차후 구강 관찰은 구강 세포를 본 발명의 핵산으로 형질도입시키기 위한 일정 시간 후 수행할 수 있다. 이러한 관찰들은 적당한 배율과 적당한 광 하에서 수행할 수 있다.
b. 관주 및 관장 제형
핵산은 관주제 또는 관장제로서 제형화될 수도 있다. 예를 들어, 선택된 핵산 발현 작제물은 당업자에게 공지된 통상의 관주 또는 관장 조성물과 혼합될 수 있다. 전형적인 관주 또는 관장 제형은 다음 표 6에 제시했다.
성분 중량
카르복시메틸 셀룰로스 500g
소르비톨 5g
증류수 60ml
본 명세서의 교시와 당업자의 지식에 따르면, 전형적인 관주 또는 관장 제형, 예컨대 표 6에 제시한 제형은 선택된 핵산 작제물과 혼합될 수 있다. 관주 또는 관장 제형에 핵산 발현 작제물의 농도는 이용된 발현 작제물의 종류 및 투여 목표에 따라 달라질 수 있다. 제형은 이어서 피험체에게 항문, 질 또는 카테터를 통해 투여될 수 있다.
5. 비이온성 계면활성제 제형
약제학적 제형은 국소 전달하기 위한 비이온성 계면활성제일 수 있다. 이러한 제형은 예컨대 3가지 별도 성분으로 구성될 수 있다. 제1 성분은 비이온성 라멜라층 형성 계면활성제일 수 있다. 제2 성분은 다른 계면활성제일 수 있다. 마지막 성분은 아데노바이러스 벡터와 같은 핵산 발현 작제물일 수 있다. 핵산 발현 작제물은 예컨대 증류된 인산염완충 식염수 및 10% 글리세롤(pH 7.4)에 첨가되어 현탁되거나 동결건조될 수 있다. 사용될 수 있는 라멜라층 형성 계면활성제의 예는 다음 표 7과 같다.
상표명 화학명 HLB 제조업체
L-595 슈크로스 라우레이트 에스테르(30% 모노 70% 디/트리/폴리) 5 Ryoto
Tween®81 POE(5) 소르비탄 모노올레이트 10.0 ICI
Tween®85 POE(2) 소르비탄 트리올레이트 11.0 ICI
Span®20 소르비탄 모노라우레이트 8.6 Sigma
Span®80 소르비탄 모노올레이트 4.3 ICI
Span®85 소르비탄 트리올레이트 1.8 Sigma
Serdox® NOG POE(4.5)올레이에스테르 8.7 Servo, Delden
C12EO3 POE(3) 도데실에테르 904 Servo, Deldan
제2 계면활성제의 예는 다음 표 8과 같다.
상표명 화학명 HLB 공급업체
C12E07 POE(7) 도데실에테르 12.9 Servo, Delden
Brij®96 POE(10) 올레일에테르 12.4 ICI
L-1695 슈크로스 라우레이트 16 Ryoto
Peg-8-라우레이트 POE(8) 도데실에스테르 13.5 Diopeg
Serdox® NOG S-440 POE(10) 올레일에스테르 12.4 Servo, Delden
Serdox NOG® S-440 소르비탄 트리올레이트 1.8 Sigma
아데노바이러스 벡터 국소 전달을 위한 비이온성 계면활성제의 제형은 예컨대 슈크로스 라우레이트 에스테르(L-595)와 POE(7) 도데실 에테르(C12EO7)를 최종적으로 5wt%를 포함하는 수성 분산액을 수득하는데 필요한 함량으로 혼합하여 제형화할 수 있다. 혼합물은 예컨대 제1 계면활성제와 제2 계면활성제의 혼합비가 각각 0.3:0.7 또는 0.2:0.8 또는 0.1:0.9인 혼합물일 수 있다. 이러한 계면활성제들은 먼저 예컨대 3:1의 클로로포름 대 메탄올 용액에 용해시킬 수 있고, 그 후 용매를 증발시킬 수 있다. 나머지 무수 필름은 핵산 발현 작제물의 액체 현탁액을, 예컨대 상기 현탁액 약 5ml를 첨가하여 수화시킬 수 있다.
6. 제산제 제형
본 발명의 일부 양태에 따르면, 약제학적 조성물은 추가로 1종 이상의 제산제를 포함한다. 제산제를 이용한 제형의 임의의 방법은 본 발명에 포함되는 것이다. 본 명세서의 교시와 당업자의 지식에 따라 제산제 제형을 제조하는데 있어서, 먼저 핵산 발현 작제물을 액체 제형에 현탁시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 벡터는 증류된 인산염 완충 식염수와 10% 글리세롤(pH 7.4)의 수성 제형에 현탁될 수 있다. 아데노바이러스 벡터 또는 임의의 핵산 발현 작제물의 함량은 치료 목표에 따라 달라질 것이다. 이러한 액체 제형의 추가 성분은 제산제로서, 피험체에게 투여 시 위점막의 pH를 일시적으로 증가시킬 수 있다. 제산제는 예컨대 수산화알루미늄 또는 수산화마그네슘과 같은 성분을 포함할 수 있다. 또한, 시중에서 입수할 수 있는 액체 제산제 제형에서 종종 발견되는 다른 성분들도 이러한 약제학적 제형에 첨가될 수 있다. 이러한 성분에는 종종 부틸파라벤, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 미세결정형 셀룰로스, 프로필파라벤, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 사카린나트륨, 소르비톨, 증류수 및 풍미제가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
7. 알긴산염 래프트 제형
알긴산염 래프트 제형도 본 발명에 포함된다. 본 명세서에서 정의되는 알긴산염 래프트는 위산의 존재 하에 알긴산의 침전에 의해 제조되는 기체 포착된 겔을 의미하는 것이다. 예를 들어, 핵산 발현 작제물은 아데노바이러스 벡터에 포함되어 있을 수 있다.
본 명세서의 교시와 당업자의 지식에 따라 알긴산염 래프트 제형을 제조하는데 있어서, 핵산 발현 작제물은 예컨대 알긴산염 래프트 형성 액체 조성물에 현탁될 수 있다. 이러한 알긴산염 래프트 형성용 약제학적 조성물에 포함되는 상기 핵산 발현 작제물의 일 예는 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 알긴산염 래프트 형성 액체와 혼합될 수 있다. 이러한 알긴산염 래프트 형성 액체는 시중에서 입수할 수 있는 이러한 종류의 제형에서 발견되는 성분, 예컨대 수산화알루미늄, 탄산마그네슘, 중탄산나트륨 및 알긴산을 함유할 수 있다. 시중에서 입수할 수 있는 알긴산 래프트 제형 Gaviscon®(Glaxo Smith Kline)이 바람직한 예이다. 위산의 존재 하에, 알긴산염은 침전하여 겔을 형성한다. 또한, 알긴산염 래프트 형성 조성물은 중탄산나트륨 또는 칼륨을 함유할 수 있다. 위산의 존재 하에서, 중탄산염은 겔 침전물 내에 포착된 이산화탄소로 전환되어, 위 내용물의 표면 위에 "뜨는" 포옴으로 변환된다. 주입 수초 내에 래프트 형성이 일어나고, 이 래프트는 수시간 동안 위에서 유지될 수 있다.
알긴산염 래프트 형성 조성물은 예컨대 알긴산나트륨(500mg), 중탄산나트륨(250mg), 탄산칼슘(150mg), 메틸파라벤(40mg), 프로필파라벤(6mg) 및 가교된 폴리아크릴산, 예컨대 Carbopol®(Noveon)을 혼합하여 제형화할 수 있다. 성분들은 함께 혼합하여, 아데노바이러스 벡터 함유 수성 제형에 최종 부피 10ml로 용해될 수 있다. 본 발명의 알긴산염 래프트 약제학적 제형은 이어서 피험체가 삼킬 수 있다. 알긴산염 래프트 형성 제형의 다른 예는 본 명세서에의 이 섹션과 다른 모든 섹션들에서 참고인용된 미국 특허 6,348,502, 미국 특허 5,681,827 및 미국 특허 5,456,918에서 찾아볼 수 있다.
8. 바이러스 벡터를 이용한 조성물
본 발명에 따른 바이러스 발현 벡터가 임상 용도로 생각하고 있다면, 목적 용도에 적당한 약제학적 조성물로서 복합체를 제조해야만 할 것이다. 일반적으로, 이것은 발열원, 및 사람과 다른 포유동물에게 유해할 수 있는 임의의 다른 불순물이 거의 없는 약제학적 조성물의 제조를 수반할 수 있다. 또한, 일반적으로 복합체를 안정화시키고 복합체가 표적 세포에 의해 흡수되게 하기 위해 적당한 염 및 완충액을 이용하는 것이 바람직할 것이다.
9. 에멀젼 제형
본 명세서의 교시와 당업자의 지식을 이용하여, 핵산 발현 작제물의 국소 전달을 위한 에멀젼으로서 약제학적 제형을 제조할 수도 있다. 예를 들어, 핵산 발현 작제물은 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터로 핵산을 전달하기 위한 에멀젼 제형의 일 예는 다음과 같다:
폴리(락트-글리콜)산(PLGA)은 디클로로메탄에 용해하고 바이러스 벡터의 수성 현탁액과 혼합할 수 있다. 예를 들어, 디클로로메탄 1ml와 바이러스 수성 현탁액 0.05ml를 사용할 수 있다. 이 용액을 그 다음 약 30초 동안 볼텍싱하여 유중수 에멀젼을 만들 수 있다. 그 다음, 이 에멀젼에 1% 폴리비닐알콜 1ml를 첨가하고, 이어서 추가 30초 동안 볼텍싱할 수 있다. 2차 볼텍싱 후, 에멀젼을 그 다음 0.1% 폴리비닐알콜 용액 100ml에 첨가하고 추가 30분 동안 교반할 수 있다. 그 다음, 2.5시간 동안 교반하면서 에멀젼에 진공을 가하여 디클로로메탄올을 제거할 수 있다. 디클로로메탄을 제거한 후, 그 다음 에멀젼을 0.2㎛ 나일론 필터로 여과하고 인산염완충식염수 500ml로 세척할 수 있다. 바이러스를 포함하는 에멀젼의 경우에, 보호제를 이용하여 바이러스 단백질의 변성을 예방할 수 있다. 전형적인 보호제로는 글리세롤, 슈크로스 및 소혈청알부민이 포함될 수 있다.
10. 나노입자 리포좀 제형
또한, 본 발명은 핵산 발현 작제물의 국소 전달을 위한 나노립자 리포좀 제형을 포함한다. 예를 들어, 리포좀 제형은 DOTAP 및 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 이러한 핵산 발현 작제물 함유 제형의 예는 다음과 같다.
양이온성 지질(DOTAP)은 등몰 농도의 중성 액체 콜레스테롤(Chol)(Avanti Lipids)과 혼합할 수 있다. 분말화된 지질의 혼합물을 1L 둥근바닥 플라스크에서 HPLC 등급의 클로로포름(Mallinckrodt, Chesterfield, Mo.)에 용해할 수 있다. 용해 후, 용액은 Buchi 회전 증발기에서 30℃하에 30분 동안 회전시켜 박막을 제조했다. 지질 박막을 포함하는 플라스크를 그 다음 진공 하에 15분 동안 건조할 수 있다. 건조가 완료된 즉시, 필름은 5% 덱스트로스 수용액(D5W)에서 수화시켜 최종 농도의 20mM DOTAP 및 20mM 콜레스테롤(20mM DOTAP:Chol 이라 부름)을 수득했다. 수화된 지질 박막은 50℃의 수조에서 45분 동안 회전시킨 다음 35℃에서 10분 동안 회전시킨다. 이 혼합물을 그 다음 파라필름 도포된 플라스크에서 실온에서 하룻밤 동안 방치한 뒤, 50℃에서 5분 동안 저주파수(Lab-Line, TranSonic 820/H)의 초음파로 처리했다. 초음파처리 후, 혼합물을 튜브로 옮긴 다음, 50℃에서 10분 동안 가열하고, 그 다음 주사기를 이용하여 1.0㎛, 0.45㎛, 0.2㎛ 및 0.1㎛로 크기가 감소하는 와트만(Kent, UK) 필터를 통해 순차 압출시켰다. 와트만 Anotop 필터, 0.2㎛ 및 0.1㎛를 사용할 수 있다. 압출하자 마자, 리포좀은 아르곤 기체 하에 4℃에서 보관할 수 있다.
플라스미드 형태의 핵산 발현 작제물, 예컨대 150㎍은 D5W에 희석할 수 있다. 또한, 보관된 리포좀도 별도의 D5W 용액에 희석할 수 있다. DNA 용액과 리포좀 용액을 그 다음 동일한 부피로 혼합하여 예컨대 150㎍ DNA/300㎕ 부피(2.5㎍/5㎕)의 최종 농도를 수득했다. 희석과 혼합은 실온에서 수행할 수 있다. DNA 용액은 그 다음 피펫만 피펫 팁을 이용하여 리포좀 용액의 표면에 빠르게 첨가할 수 있다. 그 다음, DNA:리포좀 혼합물은 피펫 팁으로 위아래로 빠르게 2회 혼합하여 DOTAP:콜레스테롤 핵산 발현 작제물 복합체를 수득했다.
본 명세서의 교시와 당업자의 지식을 이용하여 DOTAP:Chol-핵산 발현 복합체의 입자 크기를 측정하는 검사를 수행할 수 있다. 예를 들어, DOTAP:Chol-핵산 발현 작제물 복합체의 입자 크기는 N4-쿨터 입자 크기 분석기(Beckman-Coulter)를 이용하여 측정할 수 있다. 이 측정 시, 입자 크기 측정에 앞서 새로 제조된 복합체 5㎕가 물 1ml에 희석되어야 한다. 또한, O.D.400nm에서 복합체의 분광학적 판독을 이 분석에 이용할 수도 있다. 이 분석을 위해, 샘플 5㎕는 D5W 95㎕에 희석하여 최종 부피를 100㎕로 만들 수 있다. 상기 크기 분석 방법과 함께 전술한 제형 기술을 사용하면 374 내지 400nm 사이의 복합체 크기가 수득되는 것으로 확인된다.
11. 팝시클 제형
본 명세서의 교시와 당업자의 지식을 이용하여 구강 또는 위장관에 적용하기 위한 팝시클로서 핵산 발현 작제물 전달용 약제학적 제형을 제조할 수 있다. 팝시클은 스틱이나 외장(sheath)과 같은 휴대용 어플리케이터를 구비하는 동결된 액체 제형으로서 정의되는 것이다. 예를 들어, 팝시클 제형은 선택된 핵산 발현 작제물의 팝시클 제형 및 현탁액을 포함할 수 있다. 따라서, 팝시클 제형은 당(20w/v%), 향미제(1.0w/v%), 착색제(0.5w/v%)의 동결 용액 및 본 발명의 핵산을 포함하는 수용액(80w/v%)으로 구성될 수 있다. 제형의 성분은 액체 형태로 함께 혼합될 수 있고, 이어서 팝시클 주형에서 동결될 수 있다. 팝시클 제형의 다른 예는 본원에 전문이 참고인용되는 미국 특허 5,194,269 및 미국 특허 5,660,866에서 찾아볼 수 있다.
12. 경피 또는 피부통과 전달 장치
본 발명의 특정 양태는 피험체의 과다증식 병변의 증식과 같은 피험체의 질환을 예방 또는 억제할 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산과 패치를 포함하는, 치료제 전달용 경피 전달 장치에 관한 것이다. 여기서 치료제는 패치의 표면과 접촉되어 있다. 전술한 바와 같이, 치료제에는 과다증식 병변의 증식과 같은 피험체의 질환을 예방 또는 억제할 수 있는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
패치는 당업자에게 공지된 임의의 재료로 제조될 수 있다. 또한, 패치는 패치를 피험체의 신체 표면, 예컨대 피부 표면, 구강 점막의 표면, 상처 표면 또는 종양 층의 표면에 적용하여 치료제를 전달하도록 설계할 수 있다. 또한, 패치는 임의의 모양이나 형태로 설계될 수 있고, 그 예로는 스트립, 붕대, 테이프, 드레싱(예, 상처 드레싱) 또는 인공 피부 등이 있다. 경피 패치에 관한 제형은 본 섹션 및 다른 섹션에 참고인용된 미국 특허 5,770,219, 미국 특허 6,348,450, 미국 특허 5,783,208, 미국 특허 6,280,766 및 미국 특허 6,555,131에서 상세히 논의되고 있다.
일부 양태에 따르면, 장치는 치료제의 액체 또는 반고체 제형이 피부를 통해 혈류로 통과할 수 있는 속도를 조절하는 막으로 설계될 수 있다. 장치의 성분은, 예컨대 저장기 또는 불활성 중합체 매트릭스에 용해 또는 분산된 치료제; 종이, 플라스틱 또는 호일의 외측 백킹 필름; 및 패치를 피부에 고착시키는 감압 접착제를 포함할 수 있다. 접착제는 패치를 피부에 적용하기 전에 박리시켜야 하는 이형 라이너가 피복되거나 피복되어 있지 않을 수 있다. 일부 양태에 따르면, 치료제는 하이드로겔 매트릭스에 함유되어 있다.
일부 양태에 따르면, 피부를 통해 치료제(들)를 수송하는 것이 바람직하다. 따라서, 국소 패치 제형은 다음과 같은 피부 침투 기전을 포함할 수 있다: 하이드록사이드 방출제 및 친지성 공동증강제; 전기침투용 경피성 흡수촉진제; 투과 증강제 및 수성 보강제; 모노글리세라이드 및 에틸 팔미테이트를 포함하는 피부 침투 증강제; 자포동물문, 쌍편모충류 및 점액포자충문 등 유래의 자세포 등. 피부 침투 기전에 관한 제형은 본 섹션 및 다른 모든 섹션들에 참고인용된 미국 특허 6,835,392, 미국 특허 6,721,595, 미국 특허 6,946,144, 미국 특허 6,267,984 및 미국 특허 6,923,976에 상세히 논의되어 있다. 또한, Bramson et al.(2003)에 언급된 바와 같은 피부에 작은 저항 부재의 이용을 통한 피부의 마이크로포레이션 및 그 다음 아데노바이러스 벡터를 포함하는 패치 적용; Tuqan et al.(2005)에 언급된 바와 같은 한제 스프레이 냉각을 통한 피부 침투성 증가 방법; Baxter et al.(2005)에 언급된 바와 같은 제트 유도된 피부 천자; Akomeah et al.(2004)에 언급된 바와 같은 피부의 열처리; 및 침투성 증가를 위한 피부 찰과 방법 등도 있다.
다른 양태에 따르면, 패치는 피부를 통해 치료제를 수송하기 위해 저전력 전류를 이용하도록 설계한다. 다른 양태에 따르면, 패치는 피부 또는 점막을 통해 약물을 수동 수송하도록 설계된다. 다른 양태에 따르면, 장치는 치료제를 전달하기 위해 이온삼투요법을 이용하도록 설계된다.
장치는 치료제의 전달 속도를 조절하는 막과 백킹 층 사이에 용액이나 현탁액에 치료제가 포함되어 있는 저장기를 구비할 수 있다. 일 양태에 따르면, 장치는 치료제를 포함하는 매트릭스를 포함하며, 여기서, 치료제는 용액이나 현탁액으로서, 치료제를 피부와 접촉시키는 콜라겐 매트릭스, 중합체 또는 면 패드 내에 분산되어있다. 일부 양태에 따르면, 접착제는 피험체의 표면에 부착시키기 위해 전달 시스템의 외측 가장자리에 적용한다.
일부 양태에 따르면, 장치는 일정 시간 후 피험체의 표면에 용해할 수 있는 물질로 구성된다. 예를 들어, 피험체는 구강의 점막 표면에 적용될 수 있는 파일 또는 피부일 수 있고, 여기서 장치는 일정 시간 후 구강에 용해된다. 이러한 양태에서, 치료제는 장치의 단일 표면(즉, 피험체와 접촉하는 표면)에 적용되거나, 장치를 구성하는 재료에 함침되어 있을 수 있다.
일부 양태에 따르면, 장치는 1종보다 많은 치료제를 포함하도록 설계된다. 이러한 장치는 각 치료제의 별도의 저장기를 포함하거나 또는 단일 저장기에 복수의 치료제를 포함할 수 있다.
또한, 장치는 피험체의 신체 변화, 예컨대 온도 또는 땀을 기초로 하여 치료제 전달 속도가 변동되도록 설계할 수 있다. 예를 들어, 특정 제제는 온도 변화에 반응하여 막을 통해 통과하는 약물의 수준을 변동시킬 수 있는 치료제를 덮고 있는 막에 포함될 수 있다. 다른 양태에 따르면, 치료제의 경피 전달은 장치에 온도 조절 장치를 도입시켜 패치의 온도 변동을 통해 변동시킬 수 있다.
당업자는 패치를 이용한 경피 전달의 방법 및 기술을 잘 알고 있을 것이다.
본 명세서의 교시와 당업자의 지식을 이용하면, 경피 전달 패치로 핵산 발현 작제물을 국소 전달하는 방법을 선택할 수 있다. 본 명세서의 교시와 당업자의 지식에 따른 경피 패치, 핵산 발현 작제물, 접착제 및 침투 증강제는 함께 혼합하여 실리콘처리된 폴리에스테르 방출 라이너 위에 분배할 수 있다(Release Technologies, Inc., W.Chicago, Ill.). 예를 들어, 경피 패치 제형은 약 88%의 아크릴 공중합체 접착제 조성물, 핵산 발현 작제물 2% 및 ARACEL 80™(ICI Americas, Wilmington, Del.)과 같은 소르비탄 모노올레이트 침투 증강제 10%로 구성될 수 있다. 이 혼합물은 그 다음 건조한 뒤, 피험체 치료를 위해 보관할 수 있다.
13. 접착제
일부 양태에 따르면, 약제학적 조성물은 1종 이상의 접착제를 포함한다. 본 명세서에 정의된 접착제는 일반적으로 표면과 핵산의 접촉을 촉진하거나 용이하게 하는 제제 또는 제제의 조합, 또는 한 표면과 다른 표면의 접촉을 촉진하거나 용이하게 하는 제제 또는 제제의 조합을 의미한다.
약제 및 의약에 사용되는 접착제는 당업자에게 공지되어 있고, 멸균, 액체 아교와 같은 국소 피부 접착제 뿐만 아니라 고체 또는 반고체 접착제를 포함한다. 본 발명에 사용하기 위한 접착제에는 적용 시에는 액체이지만 고체 점조도로 빠르게 건조하는 접착제가 있다.
본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 접착제의 예에는 아크릴레이트, 예컨대 시아노아크릴레이트, 메타크릴레이트 및 알킬 아크릴레이트가 있다. 다른 예시적인 접착제에는 하이드로콜로이드, 하이드로겔, 폴리이소부틸렌 및 겔 매트릭스를 주성분으로 하는 접착제, 예컨대 폴리아크릴산계 겔 매트릭스 접착제가 있다.
조직 접착제도 본 발명의 약제학적 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 조직 접착제에 관한 조성물은 본 발명에 참고인용되는 미국 특허 출원번호 20040199207, 미국 특허출원 20030119985, 미국 특허출원 20020116026, 미국 특허출원 20020037323, 미국 특허 6,723,114, 미국 특허 6,596,318, 미국 특허 6,329,337, 미국 특허 6,310,036, 미국 특허 6,299,631 및 미국 특허 6,251,370에 각각 상세히 논의되어 있다.
본 명세서의 교시와 당업자의 지식을 사용하면, 접착제 약제학적 제형과 함께 핵산 발현 작제물을 국소 전달할 수 있다. 예를 들어, 접착제 약제학적 제형은 시아노아크릴레이트계 접착제, 예컨대 메톡시프로필 시아노아크릴레이트를 공중합체와 혼합하여 작제할 수 있다. 예를 들어, 공중합체는 ε-카프로락톤-글리콜라이드/락타이드-글리콜라이드 공중합체일 수 있다.
ε-카프로락톤-글리콜라이드/락타이드-글리콜라이드 공중합체는 예컨대 글리콜라이드 0.13몰을 ε-카프로락톤 1.18몰과 촉매량의 주석 옥토에이트(0.262mmol) 및 1-데칸올(3.275mmol)을 혼합하여 제조할 수 있다. 이 혼합물은 170℃의 온도까지 가열하고 약 30분 동안 교반한 뒤, 120℃의 온도까지 냉각하여 약 0.65몰의 글리콜라이드와 0.52몰의 dl-락타이드를 첨가한다. 이 혼합물을 다시 170℃의 온도까지 재가열하고 추가 6.5시간 동안 교반한다. 임의의 미반응 단량체는 혼합물을 예컨대 130℃의 온도에서 감압하에 1.5시간 동안 교반하여 공중합체 용액으로부터 제거할 수 있다.
메톡시 프로필 시아노아크릴레이트, 공중합체 및 핵산 발현 작제물의 약제학적 제형은 함께 혼합하고 피험체의 국소 표면에 적용할 수 있다. 예를 들어, 혼합물은 약 90% 메톡시 프로필 시아노아크릴레이트, 5% 공중합체 및 5% 핵산 발현 작제물일 수 있다. 하지만, 당업자는 발현 작제물의 정확한 농도가 사용된 발현 작제물의 종류, 예컨대 아데노바이러스 벡터, 및 적용 투여 목표에 따라 달라질 수 있음을 잘 알고 있을 것이다.
본 명세서의 교시와 당업자의 지식을 사용하면, 접착제 붕대를 이용하여 핵산 발현 작제물을 국소 전달하는 방법을 선택할 수 있다. 접착제 붕대 제형에 이용할 수 있는 핵산 발현 작제물의 일 예는 아데노바이러스 벡터이다. 붕대로 피부를 형질도입시키기 위해, 액체 현탁액인 핵산 발현 작제물 제형은 접착제 붕대의 패드에 피펫팅될 수 있다.
국소 표면은 발현 작제물 전달을 증강시키기 위해 전처리될 수 있다. 예를 들어, 국소 표면은 면도하여 털을 제거하거나, 열, 마이크로포레이션, 전기침투, 찰과 또는 화학적 방법으로 전처리할 수 있다. 붕대는 예컨대 치료 목표를 달성하기 위해 필요하다면 18시간 또는 그 이상 동안 피부와 접촉시켜 둘 수 있다.
14. 핵산 흡수 증강제
본 명세서에 정의된 "핵산 흡수 증강제"는 세포에 대해 외래성인 핵산의 흡수를 용이하게 하기 위해 세포의 표면에 적용하거나 또는 세포 표면과 접촉시킬 수 있는 임의의 제제 또는 1종보다 많은 제제의 조성물을 의미한다. 제제의 예에는 양이온성 지질이 있다. 핵산 흡수 증강제로서의 양이온성 지질은 전문이 참고인용된 미국 특허 6,670,332, 미국 특허 6,399,588, 미국 특허 6,147,055, 미국 특허 5,264,618, 미국 특허 5,459,127, 미국 특허 5,994,317 및 미국 특허 5,861,397에 각각 상세히 논의되어 있다. 본 발명의 방법 및 조성물에 적용될 수 있는 양이온성 지질의 예에는 4급 사이토펙틴이 있다(미국 특허 5,994,317 및 미국 특허 5,861,397 참조).
15. 투약량
치료제 또는 예방제의 유효량은 의도한 목표, 예컨대 (i) 과다형성 병변의 증식 억제 또는 (ii) 과다형성 병변에 대한 면역 반응의 유도에 기초하여 결정된다.
당업자는 생체내 및 생체외 상황에서 유전자를 전달하는 방식을 잘 알고 있다. 바이러스 벡터인 경우에는 일반적으로 바이러스 벡터 스톡을 제조한다. 바이러스의 종류와 달성할 수 있는 역가에 따라, 환자에게 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010, 1×1011 또는 1×1012 감염성 입자를 전달한다. 리포좀이나 다른 비바이러스성 제형의 경우에는 상대적 흡수 효율을 비교하여 유사한 숫자를 추정할 수 있다. 약제학적 허용성 조성물로서의 제형에 대해서는 이하에 논한다.
치료 회수 및 용량에 따라 투여되는 함량은 치료받는 피험체, 피험체의 상태 및 원하는 보호 정도에 따라 달라진다. 치료 조성물의 정확한 함량은 또한 의사의 판단에 따라 달라지고 각 개체마다 다르다.
특정 양태에 따르면, 치료 조성물은 환자에게 연속 공급하는 것이 바람직하다. 국소 투여 시, 반복 적용을 이용할 수 있다. 각종 시도에서, 장기적인 시간 기간 동안 제한적이나 일정한 양의 치료제를 제공하는 지연 방출 제형이 사용될 수 있다. 내부 적용 시에는, 당해 영역의 연속 관류가 바람직할 수 있다. 이것은 몇몇 경우에는 수술후에 카테터삽입술을 실시한 뒤, 치료제를 연속 투여하여 달성할 수 있다. 관류의 시간 기간은 특정 환자 및 상황에 따라 임상가에 의해 선택될 수 있지만, 약 1 내지 2시간에서부터 2 내지 6시간까지, 약 6 내지 10시간까지, 약 10 내지 24시간까지, 약 1 내지 2일까지, 약 1 내지 2주까지 또는 그 이상까지의 범위일 수 있다. 일반적으로, 연속 관류를 통한 치료 조성물의 용량은 이 용량들이 투여되는 시간 기간에 대해 조정된, 일회 주사 또는 다회 주사로 제공하는 용량과 동일할 수 있다.
J. 피험체 표면 치료
본 발명의 특정 약제학적 조성물은 피험체의 표면에 적용하기 위한 목적으로 제조된다. 예를 들어, 표면은 피부 표면, 병변 표면, 병변 절제 후의 수술 층, 상처 표면, 점막 표면 또는 속빈 내장 표면, 예컨대 위장관 내면일 수 있다.
암은 수술 절제로 제거하면, 표면이 있는 "강"을 창출한다. 본 발명의 치료 조성물은 수술 시 또는 그 후에 투여될 수 있다. 이것은 본질적으로 체강 표면의 "국소" 치료의 일 예이다. 조성물의 부피는 체강의 전체 표면이 발현 카세트와 접촉할 정도로 충분해야 한다.
본 명세서에 제시된 방법의 일부 양태에 따르면, 약제학적 조성물은 어플리케이터를 이용하여 적용한다. 어플리케이터의 예에는 스폰지, 면봉, 면 말단 어플리케이터 등이 있다. 일부양태에 따르면, 경피 전달 장치를 통한 기계적 적용이 바람직할 수 있다. 면봉을 통한 적용은 면봉과 국소 표면 사이에 1 이상의 상호작용이 있어야 한다. 본 발명의 약제학적 제형은 면역이나 스폰지를 통해, 이 면봉이나 스폰지를 국소 표면에 반복 접촉시키거나 또는 면봉이나 스폰지를 직선, 원형 움직임이나 이의 조합으로 표면을 따라 이동시켜 국소 표면에 적용할 수 있다. 또한, 면봉, 스폰지, 경피 전달 장치는 일정 기간 동안 국소 표면 위에 놓아 둘 수 있다. 이러한 시도 중 임의의 시도는 수술 개시 동안 뿐만 아니라 종양 제거 후에도 사용될 수 있다. 또 다른 양태에 따르면, 카테터는 시술 부위를 봉합하기 전에 체강 내에 삽입하기도 한다. 체강은 그 다음 바람직한 시간 기간 동안 지속적으로 관류될 수 있다. 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 약제학적 제형은 질이나 직장과 같은 국소 표면에 탐폰과 유사한 어플리케이터 또는 포옴 분산액 어플리케이터를 이용하여 적용할 수 있다. 약물 전달을 위해 탐폰과 유사한 어플리케이터를 이용하는 것에 관한 방법은 미국 특허 6,588,043에 제시되어 있고, 포옴 분산액 어플리케이터를 이용하는 것에 관한 방법은 미국 특허 4,112,942에 제시되어 있으며, 이 문헌들은 각각 전문이 참고인용되었다.
이러한 치료의 다른 형태에서는 진단적 또는 치료적 조성물의 "국소" 적용이 구강, 인두, 식도, 후두, 기관, 흉강, 복강 또는 중공 기관 강, 예컨대 방광, 결정, 식도, 위장 또는 다른 내장 기관과 같은 자연 체강에 표적화되어 있다. 각종 방법들은 이러한 내장 기관 또는 체강 표면에 "국소" 적용을 수행하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 인두 중의 구강은 단순히 구강청정제 또는 구강세정제를 이용한 구강 스위싱 및 가글링에 의해 영향을 받을 수 있다. 일부 용도에서는 구강 스위싱이나 가글링이 1회보다 많이 반복되어야 한다. 특정 용도에서는 피험체는 구강청정제 또는 구강세정제를 일정 시간 동안 구강 중에 담고 있다가, 뱉거나 삼킬 수 있다. 위장 내의 치료는 그렇지 않다면 산성 환경인 pH를 상승시켜야만 할 수 있다. 하지만, 후두와 기관 내의 국소 치료는 내시경 가시화와 치료 조성물의 국소 전달 또는 스프레이 또는 에어로졸 제형을 통한 투여를 필요로 할 수 있다. 방광이나 결장 점막과 같은 내장 기관은 주입을 위한 내재 카테터 또는 방광경 또는 다른 내시경 기구를 이용한 직접 가시화를 필요로 할 수 있다. 또한, 체강은 병변에 접근하게 하는 내재 카테터 또는 수술 시도를 통해 접근할 수 있다.
다른 양태에 따르면, 국소 표면은 핵산 흡수/바이러스 감염도를 향상시키기 위해 침투성 증가 및/또는 차단 세포 층의 제거를 목적으로 한 처리 또는 전처리가 수행될 수 있다. 이러한 처리에는 아세트산과 같은 세정제의 사용 또는 다른 막 침투제의 사용이 포함될 수 있다. 다른 제제로는 저장성 용액, 이온 킬레이터, 양이온성 펩타이드, 오클루딘(occludin) 펩타이드, 연접 복합체의 세포외 부분을 붕괴시키도록 설계된 펩타이드, 세포골격 붕괴제, 항체, 에테르, 신경전달인자, 글리세롤, FCCP, 산화제 및 염증 매개인자가 있다. 또 다른 특정 양태에 따르면, 이온 킬레이트는 EGTA, BAPTA 또는 EDTA일 수 있고; 양이온성 펩타이드는 폴리-L-리신일 수 있고; 세포골격 붕괴제는 사이토칼라신 B 또는 콜히친일 수 있으며; 신경전달인자는 캡시아노사이드일 수 있고; 산화제는 과산화수소 또는 오존일 수 있으며; 염증 매개인자는 TNFα일 수 있다. 항체는 항-E-캐드헤린 항체일 수 있다.
또는, 기계적 수단으로 동일한 효과를 달성할 수도 있다. 특정 양태에 따르면, 치료는 차단 세포 층을 제거하는 찰과를 포함할 수 있다. 찰과는 예컨대 0.1mm 내지 3mm보다 큰 차단 세포의 제거를 수반할 수 있다. 차단 세포를 제거하기 위한 국소 표면의 찰과는 예컨대 의학용 스페출라, 주사바늘, 치과용 사출기(dental pick), 외과용 메스, 나이프, 박피 장치 또는 박피에 적합한 입자 제형 등, 이에 국한되지 않는 다양한 장치를 이용하여 수행할 수 있다. 피부 찰과용 박피 장치의 예는 본원에 전문이 참고인용된 미국 특허 6,629,091에 제시되어 있다.
일부 양태에 따르면, 처리는 차단 세포의 국소 표면을 제거하는 레이저의 사용을 포함할 수 있다. 특정 양태에 따르면, 이러한 처리는 국소 표면으로서 차단 세포를 제거하기 위한 전극의 사용을 포함할 수 있다. 다른 양태에 따르면, 처리는 플라즈마 기체 전극을 통한 차단 세포의 제거를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에 따르면, 처리는 연마 클렌저, 냉동처리 또는 열을 이용한 전처리를 포함할 수 있다. 레이저를 이용하여 국소 표면으로부터 차단 세포를 제거하는 것에 관한 방법 및 예는 미국 특허 5,423,803 및 미국 특허 6,273,884에 제시되어 있고, 전극을 통한 차단 세포 제거에 관한 예는 미국 특허 6,024,733 및 미국 특허 6,309,387에 있으며, 플라즈마 기체 전극을 통한 차단 세포 제거에 관한 예는 미국 특허 6,629,974에 제시되어 있고, 각 문헌들은 전문이 본 발명에 참고인용되었다. 약물 전달을 위해 피부 침투성을 증가시키기 위한 열의 사용에 관한 방법은 미국 특허 4,898,592에서 찾아볼 수 있다.
특정 양태에 따르면, 폐 점막의 처리는 스프레이 형태의 흡입성 약제학적 제형의 사용을 필요로 할 수 있다. 일부 양태에 따르면, 스프레이는 분무기 장치를 통해 폐 점막에 전달될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 제형의 전달은 피험체 폐로 전달하기 위한 인터페이스, 예컨대 마우스피스, 마스크, 기관내 튜브, 코 튜브 등을 포함할 수 있다. 인터페이스는 흡입용 튜브에 연결될 수 있다. 흡입용 튜브는 여과된 대기가 내재되어 있는 약제학적 제형의 박동 양을 제공하는 장치와 연결될 수 있다. 이 장치는 박동 공기의 입구를 보유한 분무기, 확산기 배플을 보유한 플리넘 챔버(plenum chamber) 및 대기에 대한 필터가 구비된 연결기를 포함할 수 있다. 분무기를 통해 약제학적 제형을 전달하는 것에 관한 방법은 본 발명에 전문이 참고인용된 미국 특허 6,269,810 및 미국 특허 6,705,316에서 찾아볼 수 있다.
K. 예방적 치료법
본 명세서에 제시된 방법의 특정 양태는 피험체의 질환 또는 건강 관련 상태를 예방하는 방법에 관한 것이다. 예방 전략은 오늘날 의약에 주된 중요성이 있다. 에를 들어, HNSCC 환자는 치유된 후, 제2의 원발성 종양을 가질 유의적인(30 내지 40%) 가능성이 있다(Khuri et al., 1997). 상부 호흡소화관(UADT)의 점막은 미량대사(Be야 et al., 1996) 또는 영역 암화(field cancerization)(Lydiatt et al., 1998)에 의해 제2의 원발성 종양을 발생시킬 위험이 있다. 조직학적 및 임상적으로 정상으로 보이는 점막 조직에서 유전자 변이가 발견되기 때문에, 이러한 세포들은 발달하여 제2의 원발성 종양을 형성할 수 있다. 따라서, 이러한 전암성 세포는 치료 유전자 전달의 표적이다. 전암성 세포의 세포 주기에서 G1기 정지는 세포 발달을 정지시킨다.
예방 치료법의 또 다른 예는 방사선 치료에 의해 유도되는 것과 같은 반응성산소 종의 효과로 인해 일어날 수 있는 정상 조직의 감염이나 염증의 예방이다. 예를 들어, 수퍼옥사이드 디스뮤타제는 수퍼옥사이드 라디칼을 과산화수소로 제독시키는 것으로 알려져 있다. 수퍼옥사이드 디스뮤타제를 암호화하는 핵산의 전달에 관한 방법 및 조성물은 전문이 각각 참고인용되는 미국 특허 5,599,712, 미국 특허 6,221,712 및 미국 특허 6,887,856에 제시되어 있다.
이와 동일한 전략은 다른 질환들에도 적용할 수 있다. 위험이 있는 집단은 이전에 치료을 받은 질환의 이력이나 위험 인자가 있는 피험체를 포함할 수 있다.
용량, 치료 회수 및 치료 기간에 따라 투여될 약제학적 조성물의 함량은 치료받는 피험체, 피험체의 상태, 예방되는 질환의 성질 및 예방 목표에 따라 달라진다. 또한, 치료 조성물의 정확한 함량은 의사의 판단에 따라 달라지고 각 개인마다 다르다. 예를 들어, 조성물의 적용 빈도는 1일 1회, 1일 2회, 1주에 1회, 1주에 2회 또는 한달에 1회일 수 있다. 치료 기간은 1개월부터 1년 또는 그 이상일 수 있다. 또한, 정확한 예방 방법은 피험체, 위험 인자의 성질 및 의사의 판단에 따라 매우 달라질 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 피험체 질환의 면역예방용으로, 백신접종과 면역요법의 조합이나 백신접종을 통해 적용될 수도 있다. 이 제형은 당업자에게 공지된 면역 스케줄에 따라 적용될 수 있다. 면역예방 및 백신접종에 관한 방법은 각각 참고인용되는 문헌[Robinson et al.(2003) 및 Plotkin et al.(2003)]에 제시되어 있다.
L. 면역 반응의 증강
본 명세서에 제시된 방법의 일부 양태에서 치료 반응은 피험체의 면역 반응을 증강시킴으로써 수득된다. 면역 반응의 증강은 질환의 발달이나 진행을 예방하기 위한 질환의 면역 치료 또는 면역예방을 목적으로 할 수 있다. 특정 양태에 따르면, 예컨대 질환은 암이다. 다른 양태에 따르면, 질환은 감염성 질환 또는 염증성 질환, 예컨대 자가면역 질환이다.
따라서, 특정 양태에서, 약제학적 제형은 면역 반응의 증강 또는 유도를 위해 피험체에게 투여될 수 있다. 특정 양태에 따르면, 치료용 핵산은 항원 보강제 및 다른 면역제어제(이에 국한되지 않는다)와 같은 1종 이상의 면역자극제(들)를 암호화하거나 또는 다른 방식으로 소유할 수 있다.
표적 피험체내에 포함된 1종 이상의 세포는 피험체에게 치료적 핵산을 투여한 후 그 핵산에 의해 암호화된 서열을 발현할 수 있다. 이러한 프로토콜의 예는 각각 참고인용되는 문헌[Robinson et al.(2003) 및 Plotkin et al.(2003)]에 제시되어 있다.
다른 특정 양태에 따르면, 약제학적 제형 자체는 1종 이상의 추가 면역자극제를 포함할 수 있다. 또 다른 일부 양태에 따르면, 1종 이상의 추가 제제(들)는 항원이나 다른 면역자극제에 임의의 조합으로 공유결합되어 있다.
항원은 예컨대 종양유전자, 종양 억제인자 유전자, 다른 자기 유전자로부터 유도된 폴리펩타이드 서열, 예컨대 효소 및 미생물 유래의 유전자일 수 있다. 각종 유전자에 대한 뉴클레오타이드 및 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드 암호화 서열은 이미 개시되어 있고, 당업자에게 공지된 전산 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다. 이러한 데이터베이스 중 하나는 National Center for Biotechnology Information's Genbank and GenPept 데이터베이스(www.ncbi.nlm.nih.gov/)이다. 이러한 공지된 유전자의 암호 영역은 본 명세서에 개시된 기술 또는 당업자에게 공지된 임의의 기술(예, Sambrook et al., 2001)을 이용하여 증폭, 조합 및/또는 발현시킬 수 있다. 핵산이 시험관내 발현 시스템에서 발현될 수 있을지라도, 바람직한 양태는 핵산이 생체내 복제 및/또는 발현을 위한 벡터를 구성하는 것이다.
적당한 보강제는 허용되는 모든 면역자극 화합물, 예컨대 사이토카인, 독소 또는 합성 조성물을 포함한다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 보강제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: MDA-7, IL-1, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, γ-인터페론, GMCSP, BCG, 수산화알루미늄, MDP 화합물, 예컨대 thur-MDP 및 nor-MDP, CGP (MTP-PE), 지질 A, 및 모노포스포릴 지질 A(MPL). 세균에서 추출된 3가지 성분, MPL, 트레할로스 디마이콜레이트(TDM) 및 세포벽 골격(CWS)을 2% 스쿠알렌/Tween 80 에멀젼에 포함하는 RIBI, MHC 항원, 완전 프로인트 보강제(사멸된 마이코박테리움 튜베르큘로시스를 포함하는 면역 반응의 비특이적 자극제), 불완전 프로인트 보강제, 수산화알루미늄, Adjumer™ (즉, PCPP 염; 폴리포스파젠); Adju-Phos (즉, 알루미늄 포스페이트 겔); Algal Glucan (즉, b-글루칸; 글루칸); Algammulin (즉, 감마 인슐린/명반 복합체 보강제); Alhydrogel (즉, 수산화알루미늄 겔; 명반); 항원 제형(즉, SPT, AF); Avridine®(즉, N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)프로판디아민; CP20,961); BAY R1005 (즉, N-(2-데옥시-2-L-류실아미노-b-D-글루코피라노실)-N-옥타데실도데카노일아미드 하이드로아세테이트); 칼시트리올(즉, 1a, 25-디하이드록시비타민 D3; 1,25-디(OH)2D3; 1,25-DHCC; 1a, 25-디하이드록시콜레칼시페롤); 인산칼슘 겔(즉, 인산칼슘); 콜레라 홀로톡신(CT) 및 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB)(즉, CT; CTB 서브유닛; CTB); 콜레라 독소 A1-서브유닛-프로테인A D-단편 융합 단백질(즉, CTA1-DD 융합 단백질); CRL1005 (즉, 블록 공중합체 P1205); 사이토카인 함유 리포좀(즉, 사이토카인 함유 탈수 재수화 소포); DDA (즉, 디메틸 디옥타데실암모늄 브로마이드; 디메틸 디스테아릴암모늄 브로마이드(CAS 등록번호 3700-67-2)); DHEA(즉, 데하이드로에피안드로스테론; 안드로스테놀론; 프라스테론); DMPC(즉, 디미리스토일 포스파티딜콜린; 1,2-디미리스토일-sn-3-포스파티딜 콜린; (CAS 등록 번호 18194-24-6)); DMPG(즉, 디미리스토일 포스파티딜글리세롤; sn-3-포스파티딜 글리세롤-1, 2-디미리스토일, 나트륨염(CAS 등록번호 67232-80-8)); DOC/명반 복합체(즉, 데옥시콜린산 나트륨염; DOC/A1(OH)3/무기 담체 복합체); 프로인트 완전 보강제(즉, CIA; FCA); 프로인트 불완전 보강제(즉, IFA;FIA); 감마 이눌린; Gerbu 보강제; GM-CSF(즉, 과립세포-대식세포 콜로니 자극 인자; Sargramostim(효모 유래 rh-GM-CSF)); GMDP(즉, N-아세틸글루코사미닐-(b1-4)-N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(CAS 등록번호 70280-03-4)); Imiquimod(즉, l-(2-메티프로필)-IH-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민; R-837; S26308); ImmTherTM(즉, N-아세틸글루코사미닐-N-아세틸뮤라밀-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-글리세롤 디팔미테이트; DTP-GDP); 공동자극 분자에 대한 항체를 포함하는 면역리포좀(즉, 탈수-재수화 소포(DRV)로부터 제조된 면역리포좀(DRVs)); 인터페론-g(즉, Actimmune®(rhIFN-감마, Genentech, Inc.); 면역 인터페론; IFN-g; 감마-인터페론); 인터루킨-1b(즉, IL-10; IL-1; 사람 인터루킨 1b 성숙 폴리펩타이드 117-259); 인터루킨-2(즉, IL-2; T-세포 증식인자; 알데스루킨(데스-알라닐-1, 세린-125 사람 인터루킨 2); Proleukin®; Teceleukin®); 인터루킨-7 (즉, IL-7); 인터루킨-12(즉, IL-12; 자연 킬러세포 자극인자(NKSF); 세포독성 림프구 성숙 인자(CLMF)); ISCOM(s)TM(즉, 면역자극 복합체); Iscoprep 7.0.3.TM; 리포좀(즉, 리포좀(L) 함유 단백질 또는 Th-세포 및/또는 B-세포 펩타이드, 또는 공동포착된 인터루킨-2, BisHOP 또는 DOTMA를 보유하거나 보유하지 않은 미생물; A, [L(항원)]); 록소리빈(즉, 7-알릴-8-옥소구아노신); LT-OA 또는 LT 경구 보강제(즉, 대장균 불안정 내독소 전구독소); MF59; MONTANIDE ISA 51(즉, 정제된 IFA; 불완전 프로인트 보강제); MONTANIDE ISA 720(즉, 대사가능한 오일 보강제); MPLTM (즉, 3-Q-데스아실-4'-모노포스포릴 지질 A; 3D-MLA); MTP-PE (즉, N-아세틸-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-(하이드록시-포스포릴옥시))에틸아미드, 일나트륨 염); MTP-PE 리포좀(즉, MTP-PE 항원 전달 리포좀); 뮤라메티드(Murametide, 즉 Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3); 뮤라팔미틴(즉, Nac-Mur-L-Thr-D-isoGIn-sn-글리세롤 디팔미토일); D-뮤라팔미틴(즉, Nac-Mur-D-Ala-D-isoGln-sn-글리세롤 디팔미토일); NAGO(즉, 뉴라미니다제-갈락토스 옥시다제); 비이온성 계면활성제 소포(즉, NISV); 플루란(Pleuran, 즉 b-글루칸; 글루칸); PLGA, PGA, 및 PLA(즉, 락트산과 글리콜산의 단독중합체 및 공중합체; 락타이드/글리콜라이드 중합체; 폴리-락틱-코-글리콜라이드); Pluronic L121 (즉, Poloxamer 401); PMMA(즉, 폴리메틸 메타크릴레이트); PODDSTM(즉, 유단백질 미소구); 폴리 rA:폴리 rU (즉, 폴리-아데닐산-우리딜산 복합체); Polysorbate 80 (즉, Tween 80; 소르비탄 모노-9-옥타데세노에이트 폴리(옥시-l,2-에탄디일) 유도체); 단백질 공동킬레이트; QS-21(즉, Stimulon™ QS-21 Adjuvant); Quil-A(즉, Quil-A 사포닌, Quillaja 사포닌); Rehydragel HPA(즉, 고 단백질 흡광성 수산화알루미늄 겔; 명반); Rehydragel LV(즉, 저점도 수산화알루미늄 겔; 명반); S-28463 (즉, 4-아미노-otec,-디메틸-2-에톡시메틸-lH-이미다조[4,5-c]퀴놀린-l-에탄올); SAF-1(즉, SAF-m; Syntex Adjuvant Formulation); Sclavo 펩타이드(즉, IL-1b 163-171 펩타이드); 센다이 프로테오리포좀, 센다이-함유 지질 매트릭스(즉, 센다이 당단백질 함유 소포; 융합생성 프로테오리포좀; FPLs); Span 85 (즉, Arlacel 85, 소르비탄 트리올레이트); Specol; 스쿠알렌(즉, Spinacane;Robane®; 2,6,10,15,19,23-헥사메틸테트라코산); 스쿠알렌(Spinacene; Supraene; 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22 테트라코사헥사엔); 스테아릴 타이로신(즉, 옥타데실 타이로신 하이드로클로라이드); Theramide™(즉, N-아세틸글루코사미닐-N-아세틸이누라밀-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-디팔미톡시 프로필아미드(DTP-DPP)); 트레오닐-MDP(즉, Termurtide™; [thr1]-MDP; N-아세틸뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민); Ty 입자(즉, Ty-VLPs(바이러스 유사 입자)); Walter Reed 리포좀(즉, 수산화알루미늄에 흡착된 지질 A를 포함하는 리포좀[L(지질 A + 항원) + 명반]).
보강제 외에, T 세포 면역성을 상향조절하거나 억제인자 세포 활성을 하향조절하는 것으로 밝혀진 생물학적 반응 개량제(BRM) 및 Cpg 모티프를 암호화하는 핵산, RNAi, 안티센스 RNA와 같은 면역제어제를 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 BRM에는, 시메티딘(CIM; 1200mg/d)(Smith/Kline, PA); 또는 저용량 사이클로포스파미드(CYP; 300mg/m2)(Johnson/Mead, NJ) 및 g-인터페론, IL-2 또는 IL-12와 같은 사이토카인, 또는 B-7과 같은 면역 헬퍼 기능에 관여하는 단백질을 암호화하는 유전자가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태에 1종 이상의 면역자극제를 암호화하거나 또는 다른 방식으로 소유하는 핵산은 피험체에게 투여되어, 이 핵산의 발현으로 피험체 중의 체액 또는 세포 매개 면역반응을 유도하도록 할 수 있다.
면역 반응은 능동 또는 수동 면역반응일 수 있다. 대안적으로, 면역 반응은 이후에 항원 조성물을 포함하는 조성물로 펄스(pulse)가 가해지는, 동물(예, 환자)로부터 림프구(들)를 수득하는 입양 면역요법 시도의 일부일 수 있다. 이러한 양태에 따르면, 항원 조성물은 추가 면역자극제 또는 이러한 제제를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 림프구(들)는 피험체의 혈액으로부터 수득하거나, 또는 종양 침윤성 림프구를 얻기 위해서는 본원에 참고인용되는 문헌(Rosenberg et al., 1986)에 개시된 바와 같이 종양 조직으로부터 수득할 수 있다. 구체적인 양태에서, 림프구(들)는 말초혈액 림프구(들)이다. 다른 일 양태에 따르면, 림프구(들)는 동일하거나 다른 동물(예, 동일하거나 다른 공여자)에게 투여할 수 있다. 예를 들어, 동물(예, 환자)은 유방암이나 전립선암과 같은 암에 걸린 동물이거나 암에 걸린 것으로 생각되는 동물일 수 있다. 다른 양태에 따르면, 면역반응을 증강시키는 방법은 암 치료, 예컨대 이하에 더 상세히 논의되는 암 백신 치료와 함께 수행한다.
표적 피험체 내에 함유된 1종 이상의 세포는 핵산을 피험체에게 투여한 후 핵산에 의해 암호화된 서열을 발현할 수 있다. 이러한 프로토콜의 예는 각각 참고인용된 문헌[Robinson et al.(2003) 및 Plotkin et al.(2003)]에 제시되어 있다.
적당한 종양 항원의 예는 당업자에게 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Dalgleish, 2004; Finn, 2003; 및 Hellstrom and Hellstrom, 2003]에 기술된 것이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이 문헌들 각각은 본 발명에 전문이 참고인용되었다.
종양 항원을 암호화하는 핵산을 점막 표면에 국소 적용하는 방법도 예방적 또는 방어적 치료법으로서 생각될 수 있다. 따라서, 이러한 점막 적용은 차후 암과 같은 과다증식 질환의 발생에 대항하여 면역보호 효과를 일으킬 수 있다.
일부 양태에 따르면, 종양 항원을 암호화하는 핵산은 암과 같은 과다증식 질환이 발생하기 전에 점막 표면에 적용할 수 있는 것으로 생각된다. 미생물 유래의 1종 이상의 항원(들)을 포함하는 조성물의 점막 적용은 이미 보고되어 있다. 이 연구들은 상기 항원의 점막 적용이 그 표면을 감염시키는 미생물에 대항한 예방적 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 시사한다(Gallichan et al., 1993; Gallichan and Rosenthal, 1995; Gallichan and Rosenthal, 1996). 이에 반해, 감염이 정착된 후에 상기 항원의 점막 적용은 유의적인 치료적 이점을 감소시키거나 폐지시킬 수 있다고 보고되어 있다. 예를 들어, 감염 정착 후 투여된 현재 이용할 수 있는 폴리오 및 폐렴구균 백신은 이러한 미생물에 노출되기 전의 투여에 비해 치료적 효과가 없을 수 있다.
M. 2차 치료 형식
1. 개요
본 발명의 특정 양태에 따르면, 본 발명의 방법은 1종 이상의 2차 치료 형식으로 처리하여 피험체의 질환을 검출, 치료 또는 예방하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 특정 양태는 사람과 같은 피험체에게 사람 ACC의 조정인자를 투여하는 방법에 관한 것이다. 이러한 조성물은 사람 ACC의 조정인자(modulator)의 투여가 당업자에게 유익한 것으로 공지되거나 생각되는 질환의 예방 또는 치료에 적용될 수 있다.
예를 들어, 앞에서 제시한 바와 같이, 치료 또는 예방되는 질환이나 건강 관련 상태는 비만, 과다증식 질환, 심혈관 질환, 당뇨 또는 인슐린 내성일 수 있다. 사람 ACC의 조정인자는 다른 제제 또는 치료 방법과 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 사람 피험체의 진성당뇨병을 치료하기 위한 목적의 사람 ACC 조정인자의 투여는 다른 당뇨병 치료법, 예컨대 경구 혈당강하 산 또는 인슐린 요법과 함께, 이 요법에 앞서, 또는 이후에 수행할 수 있다. 급성 심근경색을 치료하기 위한 목적의 사람 ACC 조정인자의 투여는 예컨대 혈관성형술 또는 관상동맥우회술 후에 투여될 수 있다. 다른 예로서, 비만 치료 또는 예방 목적의 사람 ACC 조정인자의 투여는 비만 치료를 위한 식이 변화 또는 위 수술 이전이나 이후에 수행될 수 있다.
환자에 대한 사람 ACC 조정인자의 투여는 치료제 투여의 일반 프로토콜에 따라 수행할 수 있고, 다른 매개변수, 예컨대 환자의 다른 의학적 상태 및 환자가 받고 있는 다른 치료법(이에 국한되지 않는다) 등을 고려해야 한다. 치료 주기는 필요하다면 반복할 수 있을 것으로 생각된다.
본 발명의 사람 ACC의 조정인자로의 치료는 수분 내지 수주 범위의 간격을 두고 다른 치료법 전 또는 후에 실시할 수 있다. 다른 제제가 투여되는 양태인 경우, 일반적으로 각 전달 시간 사이에 유의적인 시간 간격이 지나지 않도록 하고, 제제가 계속하여 세포에 유리한 복합 효과를 발휘할 수 있도록 해야 한다. 예를 들어, 본 발명의 조성물과 거의 동시에(즉, 약 1분 미만 이내) 한 제제의 2회, 3회, 4회 또는 그 이상의 용량을 투여할 수 있는 경우도 생각할 수 있다. 다른 관점에 따르면, 치료제 또는 치료방법은 본 발명에 따른 조성물의 치료량을 투여하기 전 및/또는 후 약 1분 내지 약 48시간 이상 이내에 투여하거나, 또는 여기에 제시되지 않은 임의의 시간 전 및/또는 후에 처치할 수 있다. 다른 특정 양태에 따르면, 본 발명에 따른 사람 ACC 조정인자는 수술이나 의학적 치료와 같은 다른 치료적 방식을 처치하기 전 및/또는 후, 약 1일 내지 약 21일 범위 안에 투여할 수 있다. 하지만, 일부 상황에서는 치료 시간 기간을 현저하게 확대하여, 각 처치 사이에 수주(예컨대, 약 1 내지 8주 또는 그 이상)가 경과하는 것이 바람직할 수 있다.
다음과 같은 다양한 조합이 이용될 수 있으며, 사람 ACC의 조정인자는 "A"로, 임의의 다른 치료제 또는 치료 방법일 수 있는 2차 치료 인자는 "B"로 표시했다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
2. 2차 항암 치료
당업자에게 공지된 다양한 암 치료는 본 발명의 조성물과 함께 사용될 수 있다. 기존 암 치료 및 화학치료제의 몇 가지를 이하에 설명한다. 당업자는 본 발명의 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있는 다른 항암 치료의 존재 및 최신 방법을 잘 알고 있을 것이며, 이하에 제시된 치료법의 형태에만 국한되는 것은 아니다.
치료 핵산의 효과를 증가시키기 위해서는 과다증식 질환의 치료에 효과적인 1종 이상의 다른 제제 또는 방식과 조합시키는 것이 바람직할 수 있다. 치료 조성물은 혼합하거나 별도로 투여할 수 있다. 치료 목표는 암성 세포의 증식을 소멸시키거나 억제하는 것이다. 이 방법은 세포를 발현 작제물 및 제제(들) 또는 제2 인자(들)와 동시에 접촉시키는 것을 수반할 수 있다. 이것은 세포를 단일 조성물 또는 두 제제를 포함하는 약리학적 제형과 접촉시키거나 또는 한 조성물은 발현 작제물을 포함하고 다른 조성물은 제2 제제를 포함하는 2가지 다른 조성물 또는 제형과 세포를 동시에 접촉시켜 달성할 수 있다.
대안적으로, 핵산 요법은 수분 내지 수주 범위의 간격을 두고 다른 제제 또는 방식에 앞서 또는 이후에 수행할 수 있다. 다른 제제 및 발현 작제물이 별도로 적용되는 양태에서는, 각 전달 시간 사이에 상당한 시간 기간이 지나지 않도록 하고, 제제와 발현 작제물이 계속하여 복합 치료 효과를 유리하게 발휘할 수 있도록 해야 한다. 이러한 경우에, 세포는 두 치료 형식과 서로 약 12 내지 24시간 이내에 접촉할 수 있고, 더욱 바람직하게는 서로 약 6 내지 12시간 이내에 접촉할 수 있다. 하지만, 몇몇 상황에서는 치료 시간 기간을 상당히 확대시켜, 각 투여 사이에 수일(2,3,4,5,6 또는 7일) 내지 수주(1,2,3,4,5,6,7 또는 8주)를 경과시키는 것이 바람직할 수도 있다.
다음과 같은 다양한 조합이 이용될 수 있으며, 사람 ACC의 조정인자는 "A"로, 임의의 다른 치료제 또는 치료 방법일 수 있는 2차 치료 인자는 "B"로 표시했다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
환자에 대한 본 발명의 치료 핵산의 투여는 벡터의 가능한 독성을 고려하여 화학치료제의 투여에 일반적인 프로토콜에 따라 수행할 수 있다. 치료 주기는 필요하다면 반복할 수 있을 것으로 생각된다. 또한, 본 발명에 개시된 과다증식 세포 치료법과 함께 다양한 표준 치료법, 및 수술 시술을 수행할 수 있을 것으로 생각된다.
a. 방사선요법
방사선요법에는 DNA 손상을 유도하는 방사선 및 파동이 있고, 그 예로는 γ-조사, X선, UV 조사, 마이크로파, 전자 방출, 방사능동위원소 등이 있다. 치료는 상기 방사선 종류로 국소 종양 부위를 조사하여 달성할 수 있다. 이러한 인자들은 모두 광범위한 손상 DNA, DNA 전구체, DNA의 복제 및 회복, 및 염색체 조립 및 유지에 영향을 미칠 가능성이 가장 크다.
X선의 조사량 범위는 장기적인 시간 기간 동안 매일 50 내지 200 뢴트겐 범위에서부터 1일 조사량 2000 내지 6000 뢴트겐 범위이다. 방사능동위원소의 용량 범위는 다양하게 변하며, 동위원소의 반감기, 방출된 방사선의 강도 및 종류, 및 종양 세포에 의한 흡수에 따라 달라진다.
본 발명의 정황에서, 방사선요법은 본 명세서에 제시된 치료 핵산 중 하나에 의한 치료 전, 치료 중 또는 치료 후에 수행될 수 있고, 표준 프로토콜에 따라 반복할 수 있다.
b. 수술
암 증식의 제거를 위한 수술 치료는 일반적으로 종양 및 암을 치료하는 표준 절차이다. 수술은 전체 암 증식을 제거하려고 한다. 하지만, 수술은 임의의 잔류 종양 또는 악성 세포의 파괴를 확실하게 하기 위해 화학요법 및/또는 방사선요법과 조합되는 것이 일반적이다. 다라서, 본 발명의 정황에서, 수술은 세포 특이적인 암 치료를 위한 본 발명에 따른 종양 세포 특이적 펩타이드의 사용에 부가적으로 사용될 수 있다.
수술 시술 시, 본 발명의 조성물은 수술불가능한 종양이 절제될 수 있게 하기 위해 수술 전에 사용할 수 있다. 또는, 본 발명은 잔류 또는 전이 질환을 검출 또는 치료하기 위해, 수술 시 및/또는 수술 후에 사용할 수도 있다. 예를 들어, 피험체의 구강에서 절제된 종양 층은 본 발명에 따른 약제학적 조성물 중 하나를 적용하여 검출하거나 치료할 수 있다. 이러한 적용은 절제 후에도 계속될 수 있다. 주기적인 수술후 치료도 생각될 수 있다.
특정 양태에 따르면, 치료되는 종양은 적어도 처음에는 절제할 수 없다. 진단적 또는 치료적 바이러스 작제물을 이용한 치료는 외연(margin)의 수축 또는 특히 침습적인 특정 부위의 제거로 인하여 종양의 절제가능성을 증가시킬 수 있다. 더욱이, 특정 조직 종류에서 색 변화의 유발능이 있는 리포터 유전자를 포함하는 바이러스 작제물은 과다증식 세포의 수술 제거에 도움을 줄 수 있다. 이러한 치료 후에는 절제가 가능할 것이다. 절제 후의 추가 치료는 종양 부위에서 미시적인 잔류 질환을 제거하는 작용을 할 것이다.
원발성 종양이나 절제 후 종양 층에 대한 전형적인 치료 과정은 복수 용량을 수반할 것이다. 전형적인 원발성 종양 치료는 2주 기간 동안에 6회 용량 적용을 수반한다. 2주 투약방법은 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 또는 7회 이상 반복할 수 있다. 치료 과정 동안에 계획된 용량투여를 종결할 필요성은 재평가할 수 있다.
치료는 각종 "단위 용량"을 포함할 수 있다. 단위 용량은 치료 조성물의 소정 함량을 포함하는 용량으로서 정의된다. 투여될 함량 및 특정 경로와 제형은 임상 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 단위 용량은 단일 주사제로서 투여될 필요는 없고, 일정 시간 기간 동안의 연속 주입을 포함할 수 있다. 본 발명의 단위용량은 편리하게는 바이러스 작제물의 플라크 형성 단위(pfu)로 나타낼 수 있다. 단위 용량은 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 pfu 및 그 이상 범위이다.
c. 화학치료제
암 치료는 또한 화학적 및 방사선 기반 치료와 함께 각종 조합 치료를 포함한다. 조합 화학요법에는 예컨대 시스플라틴(CDDP), 카르보플라틴, 프로카바진, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 캄포테신, 이포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 비설판, 니트로스우레아, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 블레오마이신, 플리코마이신, 미토마이신, 에토포사이드(VP16), 타목시펜, 탁솔, 트란스플라티늄, 5-플루오로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 벤즈이미다졸, 및 메토트렉세이트 또는 임의의 유사체 또는 유도체 변형체가 있다. 본 명세서에 사용된 "화학요법"이란 용어는 암 치료용으로 사용되는 약물, 독소, 화합물, 조성물 또는 생물학적 실체의 사용으로서 정의된다. 이것은 예컨대 DNA를 직접 가교시키는 제제, DNA에 개재하는 제제, 미세관계를 붕괴시킬 수 있는 제제, 종양 억제인자 단백질의 축적을 유발하는 약물 및 핵산 합성에 영향을 미쳐 염색체 및 유사분열 변이를 유도하는 제제일 수 있다.
핵산, 구체적으로 DNA를 직접 가교시키는 제제는 결과적으로 DNA 손상을 일으키는 것으로 생각되는 것으로 본 명세서에 제시되었고, 그 결과 상승적 항종양제 조합물이 된다. 시스플라틴과 같은 제제 및 다른 DNA 알킬화제도 사용될 수 있다.
또한, DNA를 손상시키는 제제에는 DNA 복제, 유사분열 및 염색체 분리를 방해하는 화합물이 있다. 이러한 화합물의 예에는 아드리아마이신(또한, 독소루비신으로도 알려져 있다), VP-16(에토폽사이드로도 알려져 있다), 베라파밀, 포도필로톡신 등이 있다. 종양 치료의 임상 환경에서 널리 사용되는 이러한 화합물들은 아드라이마이신의 경우에는 21일 간격으로 25 내지 75mg/㎡ 범위 용량이 볼러스 주사를 통해 정맥내로 투여되고, 에토포사이드의 경우에는 35 내지 100mg/㎡ 용량이 정맥내 또는 경구 투여된다.
세포의 미세관계를 붕괴시키는 제제에는 예컨대 벤즈이미다졸이 있다. 벤즈이미다졸은 기생 선충류에 대하여 우수한 활성을 나타내고, 이보다 적게는 촌충류 및 흡충강에 대하여 활성을 나타내는 광범위 구충제이다. 벤즈이미다졸은 또한 항진균 활성이 있는 매우 효과적인 항원생생물제인 것으로 밝혀져 있다. 현재, 베즈이미다졸의 세포독성 효과는 미세관계에 결합하여 그 기능을 붕괴시켜 나타나는 것으로 생각되고 있다(Lacey, 1988; Friedman and Platzer, 1980). 튜불린이 벤즈이미다졸의 표적이라는 제안은 기생충 및 포유동물 튜불린의 농축 추출물을 이용한 약물 결합 연구 결과에 의해 지지되고 있다(Lacey, 1988). 더욱이, 포유동물의 튜불린을 이용한 경쟁적 약물 결합 연구는 벤즈이미다졸이 콜히친 결합과 경쟁하고 시험관내에서 L1210 쥐 백혈병 세포의 증식을 억제한다는 것을 보여주었다(Friedman and Platzer, 1978; Lacey and Watson, 1989). 하지만, 벤즈이미다졸은 구충제로서 투여했을 때 선충류에는 선택적으로 독성이지만, 숙주에는 독성이 아니다. 이에 반해, 벤즈이미다졸은 포유동물 튜불린의 시험관내 중합을 억제한다. 벤즈이마다졸에 대한 숙주와 기생충 거대분자 사이의 친화성의 차이(Russell et al., 1992; Kohler and Bachmann, 1981) 및 숙주와 기생충 사이의 벤즈이미다졸의 약동학의 차이는 벤즈이미다졸의 선택적 독성에 원인이 되는 것으로 암시되었지만(Gottschall et al., 1990), 이러한 선택적 독성의 실제 분자적 기본은 불명료한 상태이다.
메벤다졸 또는 5-벤조일-2-벤즈이미다졸 카르밤산 메틸 에스테르는 벤즈이미다졸계 화합물의 일원이다. 최근, 메벤다졸은 비소세포 폐암세포에서 튜불린을 해중합시켜 유사분열 정지 및 아폽토시스를 유도하는 것으로 밝혀져 있다(Sasaki et al., 2002). 또한, 메벤다졸은 시험관내 및 생체내에서 사람 암세포주에 강력한 항종양 효과를 유도해 내는 것으로 밝혀졌다(Mukhopadhyay et al., 2002).
메벤다졸은 브루그만스 등(1971)에 의해 수행된 연구의 결과로서 회충 감염 치료에 처음으로 소개되었다. 메벤다졸은 동물 및 인체용의 광범위 구충제(Van den Bossche et al., 1982)로서 동물과 사람에 널리 사용되는 일련의 광범위 구중제의 원형이다(Michiels et al., 1982). 구충성이 있는 벤즈이미다졸의 관련 유도체에는 알벤다졸 및 플루벤다졸이 있다. 대안적인 벤즈이미다졸은 펜벤다졸, 알벤다졸, 알벤다졸 설폰, 옥시벤다졸, 라이코벤다졸, 티아벤다졸, 옥스펜다졸, 플루벤다졸 및 카르벤다짐이다.
메벤다졸은 침범한 기생충의 외피 세포 및 장 세포의 세포질 미세관을 선택적으로 소실시킨다. 분비 물질은 골지 영역에서 축적하고, 아세틸콜린에스터라제의 분비 및 글루코스의 흡수가 손상되고, 글리코겐이 고갈된다. 이러한 메벤다졸의 효과는 숙주 세포에서는 나타나지 않는다. 메벤다졸은 시험관내에서 기생충 튜불린에 대해서는 높은 친화성이 있지만, 숙주 튜불린에도 결합한다. 따라서, 선택적 작용에 대한 생화학적 기준이 명확하지 않다(Van den Bossche, 1981; Watts et al., 1982).
메벤다졸은 매우 친지성이어서, 수용해도가 1㎍/ml 미만이다. 결과적으로, MZ 정제는 저조하게 일정치 않게 흡수되고, 혈장내 약물의 농도가 낮고 투여한 투약량을 반영하지 못한다(Witassek et al., 1981). 따라서, 메벤다졸의 통상적인 제형은 약물의 생체이용율이 낮고 위장관에서의 흡수율이 일정치 않다. 다른 많은 벤즈이미다졸 및 벤즈이미다졸 유도체도 역시 매우 친지성이어서, 위장관에서 일정치 않게 흡수된다. 결과적으로, 벤즈이미다졸은 경구 또는 국소 적용을 고려한 약학 제형에 유리할 수 있다.
본 명세서에 기술된 각종 화학요법의 투여 경로는 다양한 경로를 통해 투여될 수 있으며, 그 예로는 피내, 비경구적, 정맥내, 근육내, 비측내 및 경구 및 국소적 경로가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
d. 면역요법
면역요법은 일반적으로 암세포를 표적화하고 파괴하는 면역 효과기 세포 및 분자의 사용에 의존하는 방법이다. 면역 효과기는 예를 들어 종양 세포의 표면에 존재하는 일부 마커에 대해 특이적인 항체일 수 있다. 항체는 단독으로 치료의 효과기로서 작용하거나 또는 세포 사멸에 실제 영향을 미치기 위해 다른 세포를 모집하기도 한다. 또한, 항체는 약물 또는 독소(화학치료제, 방사선핵종, 리신 A 사슬, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 접합될 수 있고 단지 표적화제로서 작용할 수 있다. 또는, 효과기는 종양 세포 표적에 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 운반하는 림프구일 수 있다. 각종 효과기 세포에는 세포독성 T 세포 및 NK 세포가 있다.
따라서, 면역요법은 본 명세서에 제시된 방법들과 함께 복합 요법의 일부로서 사용될 수 있다. 복합 요법의 일반적인 시도는 이하에 논한다. 일반적으로, 종양 세포는 표적화하기 쉬운, 즉 대다수 다른 세포에는 존재하지 않는 일부 마커를 보유해야 한다. 많은 종양 마커가 존재하며, 이 중 임의의 마커는 본 발명의 정황에서 표적화하기에 적합할 수 있다. 일반적인 종양 마커에는 암배아성 항원, 전립성 특이 항원, 비뇨기 종양 관련 항원, 태아 항원, 티로시나제(p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원, MucA, MucB, PLAP, 에스트로겐 수용체, 라미닌 수용체, erb B 및 p155가 있다.
e. 유전자
또 다른 양태에 따르면, 2차 치료는 치료핵산의 추가 형태(예, 정맥내 전달용 핵산 제형)가 본 명세서에 제시된 약제학적 조성물 이전, 이후 또는 동시에 투여되는 또 다른 유전자 요법이다. 즉, 예컨대 본 발명은 치료적 또는 에방적 핵산 서열을 전달하기 위해 본 명세서에 제시된 1 이상의 방법을 이용하여 피험체를 치료하는 방법을 포함한다. 일부 양태에 따르면, 두 유전자를 암호화하는 단일 벡터가 사용될 수도 있다.
f. 다른 암 치료법
다른 암 치료법의 예에는 광선요법, 동결요법, 독소 요법 또는 호르몬 요법이 있다. 당업자라면, 이러한 예가 암 및 다른 과다형성 병변에 이용할 수 있는 치료 방식의 비배타적 종류임을 잘 알고 있을 것이다.
이하 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 입증하기 위한 것이다. 당업자라면, 이하 실시예에 개시된 기술들이 본 발명의 수행에 있어서 기능성이 양호한 것으로 본 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내는 것임을 잘 알고 있을 것이며, 따라서 수행에 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주할 수 있다. 하지만, 당업자는 본 발명의 견지에서 개시된 특정 양태들에 다양한 변화가 이루어질 수 있고, 그래도 본 발명의 취지와 범주 내에서 같거나 유사한 결과가 수득될 수 있다는 것을 잘 알 것이다.
실시예 1
p53 발현 벡터의 작제
본 실시예는 p53 발현 벡터 작제의 예시적 기술에 관한 것이다. 이 벡터는 제시된 바와 같이 작제되어, 아데노바이러스 균주 AdS 게놈의 E1 영역(1.3-9.2m.u.)을 치환시키는데 사용되고 이하 실시예 2에 제시된 아데노바이러스 비리온의 작제에 이용된다.
도 1에 제시한 바와 같이, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(Boshart et al., 1985), p53 cDNA 및 SV40 조기 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 p53 발현 카세트는 pXCJL1(캐나다 맥마스터 유니버시티에 근무하는 프랭크 엘. 그래햄 박사로부터 제공받음)의 XbaI 및 ClaI 부위 사이에 삽입했다. 게놈 크기는 100 맵 유닛(1m.u.=0.35kb)로 나누면 약 35.4kb이다. p53 발현 카세트는 Ad5 게놈의 E1 영역(1.3-9.2 m.u.)에 치환되었다.
프라이머 1은 서열 5'-GGCCCACCCCCTTGGCTTC-3'(서열번호 1)을 갖고 있고, 사람 CMV 주요 IE 유전자 프로모터의 하류에 있는 제1 인트론에 위치해 있다(Boshart et al., 1985). 프라이머 2는 서열 5'-TTGTAACCATTATAAGCTGC-3' (서열번호 2)를 갖고 SV40 조기 폴리아데닐화 시그널에 위치해 있다. 양 말단에서 p53 cDNA 삽입체로부터 15 내지 20bp 이격되어 있는 상기 두 프라이머는 1.40kb PCR 산물을 제공한다. 프라이머 3은 서열 5'-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3'(서열번호 3)을 갖고, 프라이머 4는 서열 5'-CATCTGAACTCAAAGCGTGG-3'(서열번호 4)을 갖고 있으며, 각각 Ad5 게놈의 11m.u.와 13.4m.u.에 위치하여, 0.86kb 바이러스-게놈 특이적 PCR 산물을 제공한다. 이러한 벡터를 작제하는 방법으로서, 본 방법의 변형을 이용하는 다른 방법들도 p53 발현 벡터의 작제에 사용될 수 있다.
실시예 2
재조합 p53 아데노바이러스의 생성 및 전파
본 실시예는 p53을 발현하는 헬퍼 비의존적 재조합 아데노바이러스의 생성에 적합한 방법의 일 예이다. 재조합 아데노바이러스를 생산하는데 이용된 분자 전략은 아데노바이러스의 패키징 제한으로 인해, pJM17이 스스로 바이러스를 형성할 수 없다는 사실에 바탕을 두고 있다. 따라서, 형질감염된 세포 내에서 p53 발현 벡터 플라스미드와 pJM17 사이의 상동성 재조합은 필수적인 아데노바이러스 단백질을 발현하는 세포 내에서만 패키징될 수 있는 생육성 바이러스를 산출한다.
본 실시예의 방법은 E1 또는 E3 영역에 이종성 DNA 발현 카세트의 치환을 포 함하는 바이러스를 전파시키기 위해 숙주 세포로서 293 세포를 이용한다. 이 방법은 293 세포 내로 DNA의 공동형질감염을 필요로 한다. 형질감염은 주로 바이러스 전파 효율을 결정한다. 본 발명 이전에 사용된 293 세포에 DNA 형질감염 방법은 보통 인산칼슘/DNA 공침전법이었다(Graham and van der Eb, 1973). 하지만, 이 방법은 플라크 검정과 함께 비교적 어렵고, 일반적으로 바이러스 전파 효율이 낮다. 본 실시예에서 예시한 바와 같이, 감염된 세포의 형질감염 및 후속 동정은 형질감염된 세포를 세포변성 효과(CPE)로 동정할 때, 리포좀 매개 형질감염을 이용함으로써 현저하게 향상되었다.
293 세포주는 10% 열불활성화된 말 혈청이 보충된 둘베코 변형 최소 필수 배지에서 유지시켰다. 상동성 재조합을 위해 p53 발현 벡터와 플라스미드 pJM17(McGrory, et al., 1988)을 DOTAP 매개 형질감염법으로 제조자의 프로토콜(Boehringer Mannheim Biochemicals, 1992)에 따라 293 세포에 공동형질감염시켰다. 이의 모식도는 도 1에 제시했다.
293 세포(35회 계대배양, 60% 컨플루언스)는 60mm 접시 또는 24웰 평판에서 형질감염하기 24시간 전에 접종했다. 각 웰 중의 세포는 30㎕ DOTAP, 2㎍ p53 발현 벡터 및 3㎍ 플라스미드 pJM17로 형질감염시켰다. 형질감염 후, CPE 개시 때까지 세포에 2 내지 3일마다 MEM 배지를 공급했다. 재조합 아데노바이러스 벡터를 생성 및 전파시키는 방법으로서, 이러한 기술의 변형 및/또는 당업자에게 공지된 다른 기술을 이용하는 다른 방법도 이용할 수 있다.
실시예 3
전달된 녹색 형광성 단백질 유전자의 텔로머라제 특이적 증폭에 의거한 광학 조영술에 의한 종양의 생체내 검출
본 실시예는 쥐 모델 중의 종양을 검출하기 위한 목적으로, 녹색 형광 단백질 유전자(gfp)와 같은 리포터 유전자를 암호화하는 핵산 발현 작제물의 능력을 측정하는데 사용할 수 있는 생체내 연구의 프로토콜을 예시한 것이다. 생체내 실험의 1차 단계에서는 사람 폐암과 결장암이 피하 주사된 BALB/c nu/nu 마우스(Umeoka et al., 2004)를 사용할 수 있다. 예를 들어, 사람 암 세포의 >85%에서 활성적이나, 대부분의 정상 세포에서는 비활성인 사람 텔로머라제 역전사효소를 발현하는 세포에서만 발현할 수 있는 gfp를 암호화하는 핵산 발현 작제물로 동물을 처리할 수 있다. 따라서, hTERT 프로모터는 hTERT 발현의 정상 산물이 사람 텔로머라제 역전사효소인 경우에, gfp의 발현을 유도하는 조직 선택적 프로모터로서 바람직할 수 있다.
예를 들어, hTERT 프로모터에 의한 작동적 조절 하에 gfp를 암호화하는 핵산 발현 작제물은 사람 폐암 및 결장암이 피하 주사된 BALB/c nu/nu 마우스에서 항종양 활성 하에 종양을 검출하기 위해 생체내 검사될 수 있다.
그 다음, hTERT 프로모터에 의한 작동적 조절 하에 gfp를 암호화하는 핵산 발현 작제물의 효과는 형광 현미경, 예컨대 Eclipse TS-100 형광 현미경(Nikon, Tokyo, Japan) 하에서 종양 조직 샘플을 광학 조사하여 평가할 수 있다.
실시예 4
종양 억제인자 유전자를 암호화하는 핵산 발현 작제물을 이용한 위장 종양 발생의 생체내 예방
본 실시예는 쥐 모델에서 암을 억제하는 종양 억제인자 유전자를 발현하는 핵산 발현 작제물의 능력을 측정하기 위해 수행할 수 있는 생체내 연구를 예시한 것이다. 생체내 실험의 1차 단계로서, 사람 위 및 식도암의 마우스 모델(Dumon et al., 2001)을 사용할 수 있다. 예를 들어, Fhit -/- 마우스는 발암물질인 N-니트로소메틸벤질아민(NMBA)에 노출된 후 식도와 앞위에서 발암물질에 의해 유도된 종양 발생을 일으키기 쉽다. 이 동물들은 종양 발생의 억제에 대해 측정하기 위해 사람 FHIT 종양 억제인자 유전자를 암호화하는 핵산 발현 작제물로 처리할 수 있다.
예를 들어, 사람 FHIT 종양 억제인자 유전자를 암호화하는 핵산 발현 작제물은 NMBA에 노출된 Fhit -/- 마우스 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 쥐 암 모델에서 항종양 활성에 대해 생체내에서 검사할 수 있다. 이러한 연구와 함께, 사람 FHIT 종양 억제인자 유전자를 암호화하는 핵산 발현 작제물의 항종양 활성은 쥐 모델에서 평가할 수 있다.
간략히 설명하면, 적당한 암 모델의 여러 마우스 그룹은 NMBA와 같은 발암물질로 전처리한 후 사람 FHIT 종양 억제인자 유전자를 암호화하는 핵산 발현 작제물의 용량으로 처리할 수 있다. 사람 FHIT 종양 억제인자 유전자를 암호화하는 핵산 발현 작제물의 여러 조합 및 농도를 검사할 수 있다. 대조용 마우스는 NMBA로만 전 처리해야 한다.
그 다음, 처리된 마우스 대 대조용 그룹에서의 암 발달에 대한 사람 FHIT 종양 억제인자 유전자를 암호화하는 핵산 발현 작제물의 효과는 헤마톡실린 및 에오신 염색된 종양 조직의 조직병리학적 검사 및 종양 크기 검사로 비교할 수 있다. 또한, 면역조직화학적 검사는 샘플 조직을 사람 Fhit 단백질의 C 말단에 대한 토끼 항사람 Fhit 항체와 항온배양한 다음, 비오틴화된 염소 항토끼 항체와 항온배양하여 수행할 수 있다.
실시예 5
AdCMV - p53 : 2주 관찰 기간 동안 경구 단일 용량의 마우스내 생체분포 연구
절차
AdCMV-p53의 생체분포는 위관영양법으로 단일 경구 용량의 8.3x1010(그룹 2), 8.3x1011(그룹 3) 또는 8.3x1012(그룹 4)vp/kg을 투여한 후의 C57BL/6N 마우스에서 평가했다. 각 처리 그룹은 마우스 수컷 6마리, 암컷 6마리로 구성했다. 동일한 크기의 대조군(그룹 1)에는 비히클만을 투여했다. 처치 후 4일 또는 15일째, 조직 샘플을 다음과 같은 순서대로 수집했다: 난소/고환, 간, 신장, 부신, 비장, 위, 림프절, 회장, 직장, 심장, 폐, 식도, 근육, 대퇴골, 뇌 및 척수. 조직들은 액체 질소 하에서 순간 동결시키고, -70±10℃에 보관했다. 혈액 샘플은 안와뒤 굴에서 채취하여 멸균 EDTA 혈액수집관에 담아, 4±2℃에 보관하고, 3일 이내에 DNA 추출 처 리했다.
게놈 DNA는 동결 조직 샘플로부터 분리했다. DNA 추출의 각 세트는 한 동물 유래의 모든 조직을 포함한다. 추출은 먼저 그룹 1(대조군) 동물 유래의 조직에 대해 수행한 다음 그룹 2, 3 및 4 유래의 조직을 추출했다. 조직 및 혈액 DNA 샘플은 260nm에서의 흡광도로 정량분석하고 사용할 때까지 -15℃ 이하에서 보관했다.
정량적 PCR 분석은 실시간 PCR(Taqman® PCR)을 이용하여 수행했다. 프라이머는 CMV 프로모터와 미해독 p53 5' 영역 사이에 연접부를 포함하는 70bp 증폭 산물을 생산했다.
PREYF: 5' TTAGCGACGGATCCCGTAA 3'(서열번호 5)
PREYR: 5' GCGTGTCACCGTCGTACGTA 3'(서열번호 6)
프로브: 5' CTTCGAGGTCCGCGGCCG 3'(서열번호 7)
분석 감도는 마우스 게놈 DNA 0.5㎍당 100개 벡터 DNA 카피였고, 100 내지 105 카피 범위의 주형에 대해 직선적이었다. 각 96웰 PCR 반응 플레이트는 오염의 부재를 입증하기 위해 DNA를 포함하지 않는 음성 대조군, 및 표준 곡선을 작도하기 위한 AdCMV-p53 DNA의 일련의 10배 희석물을 포함했다. 각 PCR 반응은 2반복으로 수행했고, 이중 하나에는 PCR 억제제의 부재를 입증하기 위해 AdCMV-p53 DNA를 혼입시켰다.
양성 샘플의 정량분석은 혼입되지 않은 샘플을 표준 곡선에 플롯팅하여 수행했다. PCR 분석의 결과는 마우스 조직 DNA 0.5㎍당 카피수로서 기록했다. 10카피보 다 큰 값을 보유한 샘플은 양성으로 간주했다. 하지만, 10카피의 검출이 일정하게 달성되지 않는 바, 표준 곡선에 기초하여 ABI 7700에 의해 삽입된 값이기 때문에 10 내지 100 카피 사이의 값은 정확하지 않을 수 있다.
결과
실시간 PCR 분석은 0.5㎍ DNA 중의 100 카피의 AdCMV-p53 DNA를 일정하게 검출했다. 10 내지 100카피/0.5㎍ DNA의 벡터 DNA 수준은 낮은 수준이며(따라서 일정하게 검출되지 않았다), 100 내지 1000카피/0.5㎍ DNA는 중간 수준이고, 1000 카피 초과/0.5㎍ DNA는 높은 수준이었다. 10카피/0.5㎍ DNA 미만의 Ad5CMV-p53 DNA 수준은 샘플내 소수 카피가 무작위적 분할로 인해 거짓 음성이 나타날 수 있는 바, 정량할 수 없는 것으로 정의되었다.
고용량 그룹(8.3x1012vp/kg)의 경우, 용량투여 4일 후에 수집한 조직 및 혈액 샘플은 AdCMV-p53 DNA가 적어도 한 동물의 간, 위, 폐, 식도, 근육, 뇌, 척수 및 혈액에서 중간 수준 또는 높은 수준(0.5㎍ DNA 당 100카피 이상)으로 검출되었다(표 9). 15일경, 고용량 그룹의 폐 샘플만이 중간 수준 또는 그 이상으로 양성을 유지했다.
중간 용량 그룹(8.3x1011 vp/kg)은 4일째, 위, 폐, 식도 및 혈액 샘플에서 중간 수준 또는 그 이상으로 AdCMV-p53 DNA 양성이었다. 중간 수준 또는 그 이상으로 AdCMV-p53 DNA가 존재하는 중간 용량 동물 유래의 샘플은 15일경 부신, 심장, 폐, 식도, 근육 및 척수에서 발견되었다.
낮은 용량 그룹(8.3x1010 vp/kg)은 폐 및 혈액 유래의 샘플에서만 4일째 중간 수준 또는 그 이상으로 AdCMV-p53 DNA에 대해 양성이었다. 폐, 식도 및 뼈 유래의 샘플에서는 낮은 용량 AdCMV-p53 이후 15일째 중간 수준 또는 그 이상으로 양성이었다. 어떠한 대조군 샘플에서도 정량가능한 시그널은 검출되지 않았다. 이하 표에는 각종 기관 및 조직에 존재하는 AdCMV-p53 DNA의 평균 함량, 및 마우스 게놈 DNA 0.5㎍당 AdCMV-p53 10카피 초과로 양성인 샘플의 수를 게시했다.
양성 샘플의 대다수는 산발성이었다. 제시된 용량과 시점에서 모든 샘플이 양성인 유일한 기관은 중간 용량 동물의 혈액이었다(약 200카피/0.5㎍). 6 샘플 중 4개 이상이 양성인 기관은 높은 용량 그룹 전체, 즉 폐(240,000카피/0.5㎍), 식도(900카피/0.5㎍), 혈액(250카피/0.5㎍) 및 위(110 카피/0.5㎍)였다.
결론
AdCMV-p53의 단일 경구 투여 후, AdCMV-p53 DNA는 주로 폐와 식도에 위치한다. AdCMV-p53 DNA의 출현은 4일째 혈액, 폐 및 식도를 제외한 대부분의 기관에서 산발성이거나 음성이었다. 15일째, 낮은 용량 및 중간 용량 동물에서는 더 많은 기관이 4일째보다 Ad5CMV-p53 DNA 양성이었다. 높은 용량 동물에서는 양성 기관의 수 및 기관내 AdCMV-p53 DNA의 절대적 역가가 4일부터 15일까지 감소했다.
이러한 연구에서 AdCMV-p53 DNA PCR 시그널 강도의 용량 및 시간 의존성은 다른 생체분포 연구의 대부분에서 관찰되는 경향(높은 용량과 짧은 시간일 때 더 큰 시그널 강도)을 따르지 않았다. 먼저, AdCMV-p53 DNA는 4일째보다 15일째 더 많은 기관에서 검출되어(낮은 용량 및 중간 용량 그룹에서), 경구 투여 경로에 의한 지연 보급을 암시한다. 둘째, AdCMV-p53 DNA의 수준 및 보급은 4일째는 용량 의존적이나 15일째에는 그렇지 않았다. 15일째, AdCMV-p53 DNA의 함량은 중강 용량 동물 유래의 기관에서보다 높은 용량 동물 유래의 기관에서 더 낮았고(폐 제외), 심지어 낮은 용량 동물 유래의 기관에서보다 높은 용량 동물 유래의 많은 기관에서 더 낮았다.
Figure 112007060525920-PCT00003
Figure 112007060525920-PCT00004
실시예 6
치료적 또는 진단적 핵산 제형의 효능을 평가하는 분석법
본 명세서의 교시와 당업자의 지식을 이용하여, 각종 핵산 제형의 효능을 평가하는 연구를 수행할 수 있다. 당업자는 특정 핵산 제형의 치료제 또는 검출성 제제로서의 효능이 다양한 요인, 예컨대 핵산 농도, pH, 제형의 온도, 제형의 다른 구성 등에 따라 달라진다는 것을 잘 알고 있을 것이다.
예를 들어, 이러한 요인들의 임의의 요인 또는 모든 요인이 변동되는 특정 핵산의 각종 제형은 당업자에게 공지된 임의의 많은 기술을 이용하여 치료적 효능에 대해 조사할 수 있다. 예를 들어, 치료 또는 예방될 질환이 암과 같은 과다증식 질환인 경우에, 이러한 제형들의 치료 효능은 종양 세포가 이식된 누드 마우스와 같은 사람 암의 적당한 생체내 모델을 이용하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 특정 제형이 동물 모델의 종양 크기를 감소시키는 효능을 나타내는지를 측정할 수 있다. 제형의 적용 빈도 및 방법은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 치료적 반응 및 부작용의 존재 여부는 당업자에게 공지된 정보를 이용하여 평가할 수 있다.
리포터 단백질을 암호화하는 핵산과 같은 진단적 핵산과 관련하여, 동물 모델의 세포에서 검출성 단백질의 존재 여부를 평가하는 연구는 당업자에게 공지된 임의의 많은 기술을 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 실시예 4에 제시된 바와 같은 기술을 이용한 광학 조영술을 수행할 수 있고 적당한 대조군과 비교할 수 있다.
실시예 7
질환 치료 시 국소 전달용 핵산 제형을 사용한 임상 실험- 일반적 고찰
본 실시예는 일반적으로 본 발명의 핵산 제형을 이용한 사람 치료 프로토콜의 개발에 관한 것이다. 구체적으로, 이러한 치료는 핵산 투여가 유익한 것으로 공지되거나 생각되는 각종 질환의 치료에 사용될 수 있다. 이러한 질환의 예에는 암, 상처 치유 및 감염 치료와 같은 과다증식 질환의 치료가 있다. 암에 관한 더 상세한 예는 다음 실시예에 논한다.
환자 치료 및 모니터링을 비롯한 임상 실험 수행의 각종 요소들은 본 명세서에 비추어 볼 때, 당업자라면 잘 알고 있을 것이다. 다음 정보는 임상 실험에서 핵산 제형의 확립된 용도에서 사용되는 일반적 가이드라인으로서 사용될 수 있다.
표적 질환을 보유한 환자는 처음 진단을 받은 환자이거나 기존 질환을 보유한 환자일 수 있다. 기존 질환을 보유한 환자는 적어도 하나의 종래 치료 과정에 반응하지 않은 환자를 포함할 수 있다.
핵산 제형은 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 치료적 핵산은 본 명세서에 제시된 임의의 방법, 예컨대 국소 적용 및 경구 투여 등에 따라 투여될 수 있다. 제제는 질환 조직을 제거하기 위한 수술 절제와 같은 절차의 과정 동안 투여될 수 있다.
시초 용량은 예컨대 0.5mg/kg 체중일 수 있다. 3명의 환자는 일정 수준의 독성이 없는 각 용량 수준으로 치료할 수 있다. 단계적 용량 상승은 약물 관련 독성이 특정 수준에 이를 때까지 100% 증가량(예, 0.5mg, 1mg, 2mg, 4mg)씩 수행될 수 있다. 그 다음, 단계적 용량 상승은 25% 증가량씩 진행될 수 있다. 투여된 용량은 분수적으로 감소될 수 있다.
핵산 제형은 예컨대 한번에 또는 일정 기간(수일 또는 수주) 동안 복수 횟수로 투여될 수 있다. 투여는 단독 투여 또는 다른 제제와의 조합 투여일 수 있다.
신체 검사, 실험실 검사 및 치료되는 질환에 특이적인 다른 임상적 연구는 예컨대 치료 전과 약 3 내지 4주 간격으로 수행될 수 있다. 실험실 연구는 CBC, 감별 및 혈소판 계수, 소변검사, SMA-12-100(간 및 신장 기능 검사), 응집 프로필 및 질환 정도를 측정하거나 기존 증후군의 원인을 측정하는 임의의 다른 적당한 화학 연구를 포함할 수 있다.
치료법에 대한 반응은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 따라 검사될 수 있고, 주로 치료되는 질환에 따라 달라진다. 예를 들어, 질환이 암인 경우에 반응은 종양의 크기 감소를 통해 평가할 수 있다. 상처 치유는 상처 크기 및/또는 임상적 외관을 측정하여 평가할 수 있다.
실시예 8
암 치료 시 국소 또는 경구 전달용 핵산 제형을 사용한 임상 실험
본 실시예는 본 명세서에 제시된 핵산 제형을 이용하여 사람 암환자의 치료에 적용할 수 있는 프로토콜을 예시한 것이다. 환자는 이전에 화학, 방사선 또는 유전자 요법 치료를 받은 적이 있는 환자일 수 있으나, 반드시 그럴 필요는 없다. 가장 적합하게는, 환자는 적당한 골수 기능(예, 말초절대 과립세포 수 >2,000/㎣ 및 혈소판 수 100,000/㎣), 적당한 간 기능(빌리루빈 1.5mg/dl), 및 적당한 신장 기능(예, 크레아티닌 1.5mg/dl)을 나타내는 환자일 수 있다.
핵산 제형은 본 명세서에 제시된 임의의 제형, 예컨대 국소 또는 경구 투여에 적당한 제형일 수 있다. 제형은 앞에 제시된 임의의 담체, 보강제 및 비히클을 포함하는 투약 단위 제형 중에 1종 이상의 치료적 핵산을 함유할 수 있다. 조성물은 경구 섭취하거나 어플리케이터 등을 이용하여 국소 적용할 수 있다. 복합 치료를 생각하는 경우에, 조성물은 다른 항암 제제 이전, 이후 또는 동시에 투여할 수 있다.
일 예로서, 치료 과정은 7일 내지 21일 기간 동안에 약 6회 용량의 전달을 포함할 수 있다. 임상가의 선택에 따라, 투약방법은 3주마다 또는 이보다 적은 빈도(1개월 단위, 2개월 단위, 4개월 단위 등) 기준으로 지속적인 6회 용량일 수 있다. 물론, 이러한 투약방법은 치료의 예시적인 횟수이며, 당업자는 다른 가능한 많은 시간 과정을 잘 알고 있을 것이다.
일부 양태에 따르면, 투여는 피부 또는 점막 표면에 핵산 조성물의 국소 적용을 수반할 수 있다. 다른 양태에 따르면, 종양 절제 후 수술후 상처 부위에 카테터를 삽입하여 목적하는 시간 동안 체강에 지속적으로 관류 주입할 수 있다.
임상 반응은 당업자에게 공지된 허용가능한 척도에 의해 정의될 수 있다. 예를 들어, 완전한 반응은 적어도 1개월 동안 측정가능한 모든 질환의 소실로 정의될 수 있다. 이에 반해, 부분 반응은 1개월 이상 종양 부위 무 확대 또는 모든 평가가능한 종양 결절의 수직 직경의 곱의 합에 50% 이상의 감소로 정의될 수 있다. 이와 유사하게, 혼합 반응은 1 이상의 부위에서 진행되는 모든 측정가능한 병변의 수직 직경의 곱에 감소로 정의될 수 있다. 당업자는 본 명세서에 제시된 정보를 취하여 치료 방법을 최적화할 수 있다.
실시예 9
상처 치료에 핵산 제형을 사용한 임상 실험
본 명세서의 교시와 당업자의 지식을 이용하여, 성장인자를 암호화하는 핵산을 포함하는 제형과 같은 본 명세서에 제시된 핵산 제형의 하나를 이용하여 사람 피험체의 상처 치료를 용이하게 하는데 사용될 수 있는 프로토콜을 설계할 수 있을 것이다. 상처는 예를 들어 수술후 상처(예컨대 종양 절제 후 상처) 또는 외상 상처일 수 있다.
본 발명의 조성물은 앞에서 제시한 바와 같은 담체, 보강제 및 비히클을 포함하는 투약 단위 제형으로 상처에 통상적으로 국소 투여될 수 있다. 특정 경우에, 이 제형은 성장인자 외에, 종양 억제인자 유전자와 같은 항암제를 암호화하는 핵산을 함유할 수 있다. 또한, 치료용 핵산은 항생제 요법과 같은 상처 치료의 다른 표준 요법과 함께 처치될 수도 있고 처치되지 않을 수도 있다. 복합 요법을 생각하는 경우에, 치료용 핵산은 임의의 2차 치료제 이전, 이후 또는 동시에 투여될 수 있다. 상처가 수술 상처인 경우, 치료법은 수술 절차 이전, 이후 또는 동시에 처치될 수 있다.
예를 들어, 치료 과정은 1 내지 6일 기간 동안 전달되는 약 6회 용량을 포함할 수 있다. 임상가의 선택에 따라, 투약방법은 다소 빈번한 기준으로 지속될 수 있다. 물론, 이 투약방법은 치료의 예시적 횟수로서, 당업자라면 다른 많은 시간 과정이 가능하다는 것을 잘 알고 있을 것이다. 치료법에 대한 반응은 투약 방법을 결정하는 주요 요인일 것이다.
일 양태에 따르면, 투여는 단순히 상처에 치료적 조성물의 국소 적용을 수반할 수 있다. 다른 양태에 따르면, 카테터를 상처에 삽입하고, 바람직한 시간 기간 동안 상처에 지속적으로 관류 주입될 수 있다.
임상적 반응은 당업자에게 공지된 모든 허용되는 측정법, 예컨대 치유 징후에 대한 상처의 육안 조사, 상처 크기 감소, 염증 감소 등을 통해 정의될 수 있다.
본 명세서에 개시되고 청구된 모든 조성물과 방법은 본 명세서에 비추어서 지나친 실험없이 제조 및 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물과 방법은 바람직한 양태에 의거하여 설명되었지만, 당업자라면 본 발명의 개념, 취지 및 범위를 벗어남이 없이 본 명세서에 기술된 조성물과 방법, 그리고 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변경을 줄 수 있다는 것을 잘 알고 있을 것이다. 더 상세하게는, 화학적 및 생리학적으로 관련이 있는 특정 제제는 본 명세서에 기술된 제제로 치환되면서 동일하거나 유사한 결과를 달성할 수 있다. 이러한 유사한 치환 및 변형은 모두 당업자에게 자명한 것으로서, 첨부되는 청구의 범위에 의해 한정되는 본 발명의 취지, 범주 및 개념에 속하는 것으로 간주되어야 한다.
참고문헌
다음 참고문헌들은 본 명세서에 제시된 예시적 절차 또는 이에 부가적인 다른 세부내용을 제공하는 것인 점에서, 본 발명에 참고인용된 것이다.
미국 특허 6,348,502
미국 특허 4,112,942
미국 특허 4,321,251
미국 특허 4,372,944
미국 특허 4,415,723
미국 특허 4,458,066
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미국 특허 4,526,899
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미국 특허 4,797,368
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미국 특허 4,946,778
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미국 특허 5,139,941
미국 특허 5,158,761
미국 특허 5,194,269
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미국 특허 5,264,618
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미국 특허 5,695,746
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미국 특허 5,783,208
미국 특허 5,795,715
미국 특허 5,830,499
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미국 특허 5,888,493
미국 특허 5,888,773
미국 특허 5,889,136
미국 특허 5,914,334
미국 특허 5,925,565
미국 특허 5,928,906
미국 특허 5,935,819
미국 특허 5,993,785
미국 특허 5,994,317
미국 특허 6,024,733
미국 특허 6,086,852
미국 특허 6,117,417
미국 특허 6,119,036
미국 특허 6,140,355
미국 특허 6,147,055
미국 특허 6,165,494
미국 특허 6,165,615
미국 특허 6,166,004
미국 특허 6,166,043
미국 특허 6,166,084
미국 특허 6,171,611
미국 특허 6,194,388
미국 특허 6,206,646
미국 특허 6,207,646
미국 특허 6,221,712
미국 특허 6,251,370
미국 특허 6,258,374
미국 특허 6,258,830
미국 특허 6,261,574
미국 특허 6,267,984
미국 특허 6,269,810
미국 특허 6,273,884
미국 특허 6,280,752
미국 특허 6,280,766
미국 특허 6,299,631
미국 특허 6,309,387
미국 특허 6,310,036
미국 특허 6,329,337
미국 특허 6,333,194
미국 특허 6,339,068
미국 특허 6,348,187
미국 특허 6,348,450
미국 특허 6,348,502
미국 특허 6,387,352
미국 특허 6,399,588
미국 특허 6,503,481
미국 특허 6,508,647
미국 특허 6,551,578
미국 특허 6,555,131
미국 특허 6,555,376
미국 특허 6,558,043
미국 특허 6,588,043
미국 특허 6,596,318
미국 특허 6,610,272
미국 특허 6,620,451
미국 특허 6,629,091
미국 특허 6,629,974
미국 특허 6,670,332
미국 특허 6,673,863
미국 특허 6,705,316
미국 특허 6,721,595
미국 특허 6,723,114
미국 특허 6,797,704
미국 특허 6,828,308
미국 특허 6,835,392
미국 특허 6,841,539
미국 특허 6,881,776
미국 특허 6,887,856
미국 특허 6,923,976
미국 특허 6,939,859
미국 특허 6,942,878
미국 특허 6,946,144
미국 특허 6,967,023
미국 특허 6,982,091
미국 출원 20020028785
미국 출원 20020037323
미국 출원 20020044910
미국 출원 20020045148
미국 출원 20020116026
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미국 출원 20040018155
미국 출원 20040076590
미국 출원 20040146919
미국 출원 20040199207
미국 출원 20040213764
미국 출원 20050143336
미국 출원 20050196343
미국 출원 20050203047
미국 출원 20050260276
미국 출원 09/351,778
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Claims (179)

  1. 치료적 핵산 및/또는 진단적 핵산을 포함하고, 로젠지(lozenge), 롤리팝(lollipop), 팝시클(popsicle), 검(gum), 겔 스트립, 필름, 하이드로겔, 용해성 스트립 또는 고형 스틱으로서 제형화된 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 조성물이 치료적 핵산을 포함하는 약제학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 치료적 핵산이 치료적 단백질을 암호화하는 약제학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 치료적 단백질이 종양 억제인자, 아폽토시스 유도(proapoptotic) 단백질, 사이토카인, 성장인자, 호르몬, 종양 항원 또는 효소인 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 조성물이 리포터 단백질을 암호화하는 진단적 핵산을 포함하는 약제학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 리포터 단백질이 소마토스타틴 수용체, 요오드화나트륨 공동수송인자(symporter), 진핵생물 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 루시퍼라 제, β-갈락토시다제 또는 티미딘 키나제인 약제학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 치료적 핵산이 siRNA, 리보자임, mRNA, 올리고뉴클레오타이드 또는 CpG 올리고뉴클레오타이드를 포함하거나 암호화하는 약제학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 제형이 추가로 콜라겐, 글리세린, PEG, 수화 실리카, 셀룰로스, 크산툼 검(xanthum gum), 글리칸 카보머(glycan carbomer) 956, Tween 80, 불소화물, 카라기난(Carrageenan), 접착제 또는 핵산 흡수 증강제를 포함하는 약제학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 접착제가 아크릴레이트, 하이드로콜로이드, 하이드로겔, 폴리아크릴산계 겔 매트릭스, 폴리이소부틸렌, 실리콘 중합체 또는 이의 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 아크릴레이트가 시아노아크릴레이트, 메타크릴레이트 또는 알킬 아크릴레이트를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 핵산 흡수 증강제가 양이온성 지질을 포함하는 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 양이온성 지질이 비스-구아니디늄-트렌-콜레스테롤 또는 1,2-디올레오일-3-(트리메티암모늄)프로페이트(DOTAP)인 약제학적 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 핵산이 로젠지(lozenge)로서 제형화된 약제학적 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 핵산이 용해성 스트립으로서 제형화된 약제학적 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 조성물이 하이드로겔로서 제형화된 약제학적 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 제형이 크산툼 검을 포함하는 검인 약제학적 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 조성물의 일부 또는 전부가 동결건조된 약제학적 조성물.
  18. 제4항에 있어서, 종양 억제인자가 mda7, APC, CYLD, HIN-1, KRAS2b, p16, p19, p21, p27, p27mt, p53, p57, p73, PTEN, Rb, 우테로글로빈(Uteroglobin), Skp2, BRCA-1, BRCA-2, CHK2, CDKN2A, DCC, DPC4, MADR2/JV18, MEN1, MEN2, MTS1, NF1, NF2, VHL, WRN, WT1, CFTR, C-CAM, CTS-1, zacl, ras, MMAC1, FCC, MCC, FUS1, Gene 26 (CACNA2D2), PL6, Beta*(BLU), Luca-1(HYAL1), Luca-2(HYAL2), 123F2(RASSF1), 101F6, Gene 21(NPRL2) 또는 SEM A3 폴리펩타이드인 약제학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 종양 억제인자가 p53인 약제학적 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 종양 억제인자가 FUS1, Gene 26 (CACNA2D2), PL6, Beta*(BLU), Luca-1(HYAL1), Luca-2(HYAL2), 123F2(RASSFl), 101F6, Gene 21(NPRL2) 또는 SEM A3 폴리펩타이드인 약제학적 조성물.
  21. 제4항에 있어서, 아폽토시스 유도 단백질이 CD95, 카스파제-3, Bax, Bag-1, CRADD, TSSC3, bax, hid, Bak, MKP-7, PARP, bad, bcl-2, MST1, bbc3, Sax, BIK 또는 BID인 약제학적 조성물.
  22. 제4항에 있어서, 사이토카인이 GM-CSF, G-CSF, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-IO, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TGF-β, TNF-α, TNF-β, PDGF, TGF-α, TGF-β, VEGF 또는 mda7인 약제학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 사이토카인이 mda7인 약제학적 조성물.
  24. 제4항에 있어서, 종양 항원이 MelanA (MART-I), gplOO(Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15(58), CEA, RAGE, NY-ESO(LAGE), SCP-1, Hom/Mel-40, PRAME, p53, H-Ras, HER-2/neu, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, 엡스타인 바 바이러스 항원(Epstein Barr virus antigens), EBNA, 사람 유두종바이러스(HPV) 항원 E6 및 E7, TSP-180, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, mn-23H1, PSA, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, β-카테닌, CDK4, Mum-1, pl6, TAGE, PSMA, PSCA, CT7, 텔로머라제, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아단백질(alpha-fetoprotein), β-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3(CA 27.29＼BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼KP1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733(EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90(Mac-2 결합 단백질＼사이클로필린 C 연관 단백질), TAAL6, TAG72, TLP, TPS, ING1, 마마글로빈, 사이클린 B1, S1OO, BRCA1, BRCA2, 종양 면역글로불린 이디오타입(idiotype), 종양 T-세포 수용체 클론형(clonotype), MUC-1, 또는 표피 성장인자 수용체인 약제학적 조성물.
  25. 제5항에 있어서, 리포터 단백질이 형광 단백질을 포함하는 약제학적 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 형광 단백질이 청색 형광 단백질, 청록색 형광 단백질, 녹색 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 적색 형광 단백질 또는 이의 생물학적 활성 유 도체인 약제학적 조성물.
  27. 제1항에 있어서, 핵산이 이 핵산과 작동적으로 커플링된 프로모터를 포함하는 발현 카세트 내에 포함되고, 상기 프로모터가 피험체의 세포 내에서 활성인 약제학적 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 발현 카세트가 바이러스 벡터로 운반되는, 약제학적 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 파르보바이러스 벡터, 세밀리키 포레스트(semiliki forest) 바이러스 벡터, 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 피코나바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터 또는 폭스 바이러스(poxvirus) 벡터인 것인 약제학적 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터인 약제학적 조성물.
  31. 제28항에 있어서, 바이러스 벡터가 종양분해성(oncolytic) 바이러스인 약제학적 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 종양분해성 바이러스가 ADP를 과발현하는, 약제학적 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 종양분해성 바이러스가 Ad5, dl327, pm734.1, dl309, dl01/07, KD1, KD2, KD3, dl1520 및 VRX-007로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 바이러스인 약제학적 조성물.
  34. 제30항에 있어서, p53을 암호화하는 치료적 핵산을 포함하는 약제학적 조성물.
  35. 제30항에 있어서, mda7을 암호화하는 치료적 핵산을 포함하는 약제학적 조성물.
  36. 제30항에 있어서, FUS1을 암호화하는 치료적 핵산을 포함하는 약제학적 조성물.
  37. 제1항에 있어서, 전달 제제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 전달 제제가 지질인 약제학적 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 지질이 리포좀 내에 포함되는 약제학적 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 리포좀이 DOTAP:콜레스테롤 나노입자로 추가로 한정되는 약제학적 조성물.
  41. 제27항에 있어서, 프로모터가 구성적(constitutive) 프로모터, 유도성 프로모터, 억압성 프로모터 또는 조직 선택적 프로모터인 약제학적 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 조직 선택적 프로모터가 과다증식성 세포에서 선택적으로 활성인 약제학적 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 프로모터가 hTert 프로모터, CEA 프로모터, PSA 프로모터, 프로바신(probasin) 프로모터, ARR2PB 프로모터 및 AFP 프로모터로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 약제학적 조성물.
  44. 제8항에 있어서, 핵산 흡수 증강제가 양이온성 지질인 약제학적 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 양이온성 지질이 비스-구아니디늄-트렌-콜레스테롤 또는 1,2-디올레오일-3-(트리메티암모늄)프로페이트(DOTAP)인 약제학적 조성물.
  46. 제44항에 있어서, 양이온성 지질이 4급 사이토펙틴인 약제학적 조성물.
  47. 치료적 핵산 및/또는 진단적 핵산을 포함하고, 겔, 페이스트, 포옴, 슬러리, 크림, 고약, 좌약 또는 분말로서 제형화된 비-아데노바이러스성 약제학적 조성물.
  48. 제47항에 있어서, 핵산이 이 핵산과 작동적으로 커플링된 프로모터를 포함하는 발현 카세트 내에 포함되고, 상기 프로모터가 피험체의 세포 내에서 활성인 약제학적 조성물.
  49. 제48항에 있어서, 발현 카세트가 바이러스 벡터로 운반되는, 약제학적 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 바이러스 벡터가 바큘로바이러스 벡터, 파르보바이러스 벡터, 세밀리키 포레스트(semiliki forest) 바이러스 벡터, 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 피코나바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터 또는 폭스 바이러스 벡터인 것인 약제학적 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터인 약제학적 조성물.
  52. 제51항에 있어서, p53을 암호화하는 치료적 핵산을 포함하는 약제학적 조성물.
  53. 제51항에 있어서, mda7을 암호화하는 치료적 핵산을 포함하는 약제학적 조성물.
  54. 제51항에 있어서, p53을 암호화하는 치료적 핵산을 포함하는 약제학적 조성물.
  55. 제51항에 있어서, FUS1을 암호화하는 치료적 핵산을 포함하는 약제학적 조성물.
  56. 제47항에 있어서, 페이스트로서 제형화된 약제학적 조성물.
  57. 제56항에 있어서, 페이스트가 치약으로서 추가로 한정된 약제학적 조성물.
  58. 치료적 및/또는 진단적 핵산과 접착제를 포함하는 약제학적 조성물.
  59. 제58항에 있어서, 조성물이 치료적 핵산을 포함하는 약제학적 조성물.
  60. 제59항에 있어서, 치료적 핵산이 종양 억제인자, 아폽토시스 유도 단백질, 사이토카인, 성장인자, 호르몬, 종양 항원 또는 효소를 암호화하는 약제학적 조성물.
  61. 제60항에 있어서, 종양 억제인자가 mda7, APC, CYLD, HIN-1, KRAS2b, p16, p19, p21, p27, p27mt, p53, p57, p73, PTEN, Rb, 우테로글로빈(Uteroglobin), Skp2, BRCA-1, BRCA-2, CHK2, CDKN2A, DCC, DPC4, MADR2/JV18, MEN1, MEN2, MTS1, NF1, NF2, VHL, WRN, WT1, CFTR, C-CAM, CTS-1, zacl, ras, MMAC1, FCC, MCC, FUS1, Gene 26 (CACNA2D2), PL6, Beta*(BLU), Luca-1(HYAL1), Luca-2(HYAL2), 123F2(RASSF1), 101F6, Gene 21(NPRL2) 또는 SEM A3 폴리펩타이드인 약제학적 조성물.
  62. 제60항에 있어서, 아폽토시스 유도 단백질이 CD95, 카스파제-3, Bax, Bag-1, CRADD, TSSC3, bax, hid, Bak, MKP-7, PARP, bad, bcl-2, MST1, bbc3, Sax, BIK 또는 BID인 약제학적 조성물.
  63. 제60항에 있어서, 사이토카인이 GM-CSF, G-CSF, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-IO, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TGF-β, TNF-α, TNF-β, PDGF, TGF-α, TGF-β, VEGF 또는 mda7인 약제학적 조성물.
  64. 제60항에 있어서, 종양 항원이 MelanA (MART-I), gplOO(Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15(58), CEA, RAGE, NY-ESO(LAGE), SCP-1, Hom/Mel-40, PRAME, p53, H-Ras, HER-2/neu, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, 엡스타인 바 바이러스 항원(Epstein Barr virus antigens), EBNA, 사람 유두종바이러스(HPV) 항원 E6 및 E7, TSP-180, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, mn-23H1, PSA, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, β-카테닌, CDK4, Mum-1, pl6, TAGE, PSMA, PSCA, CT7, 텔로머라제, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아단백질(alpha-fetoprotein), β-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3(CA 27.29＼BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼KP1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733(EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90(Mac-2 결합 단백질＼사이클로필린 C 연관 단백질), TAAL6, TAG72, TLP, TPS, ING1, 마마글로빈, 사이클린 B1, S1OO, BRCA1, BRCA2, 종양 면역글로불린 이디오타입, 종양 T-세포 수용체 클론형, MUC-1 또는 표피 성장인자 수용체인 약제학적 조성물.
  65. 제58항에 있어서, 핵산이 형광 단백질을 암호화하는 진단적 핵산인 약제학적 조성물.
  66. 제65항에 있어서, 형광 단백질이 청색 형광 단백질, 녹색 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 청록색 형광 단백질 또는 이의 생물학적 활성 유도체인 약제학적 조성물.
  67. 제58항에 있어서, 핵산이 이 핵산과 작동적으로 커플링된 프로모터를 포함하는 발현 카세트 내에 포함되고, 상기 프로모터가 피험체의 세포 내에서 활성인 약제학적 조성물.
  68. 제67항에 있어서, 발현 카세트가 바이러스 벡터로 운반되는, 약제학적 조성물.
  69. 제68항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 파르보바이러스 벡터, 세밀리키 포레스트(semiliki forest) 바이러스 벡터, 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 또는 폭스 바이러스 벡터인 약제학적 조성물.
  70. 제69항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터인 약제학적 조성물.
  71. 제70항에 있어서, p53을 암호화하는 치료적 핵산을 포함하는 약제학적 조성물.
  72. 제70항에 있어서, mda7을 암호화하는 치료적 핵산을 포함하는 약제학적 조성물.
  73. 제70항에 있어서, FUS1을 암호화하는 치료적 핵산을 포함하는 약제학적 조성물.
  74. 제68항에 있어서, 바이러스 벡터가 종양분해성 바이러스인 약제학적 조성물.
  75. 제74항에 있어서, 종양분해성 바이러스가 Ad5, dl327, pm734.1, dl309, dl01/07, KD1, KD2, KD3 및 dl1520으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 바이러스인 약제학적 조성물.
  76. 제67항에 있어서, 발현 카세트가 전달 제제 내로 운반되는 약제학적 조성물.
  77. 제76항에 있어서, 전달 제제가 지질인 약제학적 조성물.
  78. 제77항에 있어서, 지질이 리포좀 내에 포함되는 약제학적 조성물.
  79. 제78항에 있어서, 리포좀이 DOTAP:콜레스테롤 나노입자로 추가로 한정되는 약제학적 조성물.
  80. 제67항에 있어서, 프로모터가 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 억압성 프로모터 또는 조직 선택적 프로모터인 약제학적 조성물.
  81. 제80항에 있어서, 조직 선택적 프로모터가 과다증식성 세포에서 선택적으로 활성인 약제학적 조성물.
  82. 제81항에 있어서, 프로모터가 hTert 프로모터, CEA 프로모터, PSA 프로모터, 프로바신(probasin) 프로모터, ARR2BP 프로모터 및 AFP 프로모터로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 약제학적 조성물.
  83. 제58항에 있어서, 접착제가 아크릴레이트, 하이드로콜로이드, 하이드로겔, 폴리아크릴산계 겔 매트릭스, 폴리이소부틸렌, 실리콘 중합체 또는 이의 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물.
  84. 제83항에 있어서, 아크릴레이트가 시아노아크릴레이트, 메타크릴레이트 또는 알킬 아크릴레이트를 포함하는 약제학적 조성물.
  85. 제58항에 있어서, 경피 패치, 스트립, 붕대, 테이프, 드레싱 또는 인조 피부를 통해 투여되도록 제형화된 약제학적 조성물.
  86. 제58항에 있어서, 액체, 반고체 또는 고체로서 제형화된 약제학적 조성물.
  87. 제58항에 있어서, 핵산 흡수 증강제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  88. 제87항에 있어서, 핵산 흡수 증강제가 양이온성 지질인 약제학적 조성물.
  89. 제88항에 있어서, 양이온성 지질이 비스-구아니디늄-트렌-콜레스테롤 또는 1,2-디올레오일-3-(트리메티암모늄)프로페이트(DOTAP)인 약제학적 조성물.
  90. a) 패치; 및
    b) 상기 패치의 적어도 한 면에 적용되는, 리포터 단백질, 종양 억제인자, 아폽토시스 유도 단백질, 성장인자, 종양 항원 또는 사이토카인을 암호화하는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물
    을 포함하는, 피험체에게 치료적 또는 진단적 제제를 전달하기 위한 경피 또는 피부통과 전달 장치.
  91. 제90항에 있어서, 핵산이 mda7, APC, CYLD, HIN-1, KRAS2b, p16, p19, p21, p27, p27mt, p53, p57, p73, PTEN, Rb, 우테로글로빈(Uteroglobin), Skp2, BRCA-1, BRCA-2, CHK2, CDKN2A, DCC, DPC4, MADR2/JV18, MEN1, MEN2, MTS1, NF1, NF2, VHL, WRN, WT1, CFTR, C-CAM, CTS-1, zacl, ras, MMAC1, FCC, MCC, FUS1, Gene 26 (CACNA2D2), PL6, Beta*(BLU), Luca-1(HYAL1), Luca-2(HYAL2), 123F2(RASSF1), 101F6, Gene 21(NPRL2) 또는 SEM A3 폴리펩타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 종양 억제인자를 암호화하는 장치.
  92. 제91항에 있어서, 종양 억제인자가 FUS1, Gene 26 (CACNA2D2), PL6, Beta*(BLU), Luca-1(HYAL1), Luca-2(HYAL2), 123F2(RASSFl), 101F6, Gene 21(NPRL2) 또는 SEM A3 폴리펩타이드인 장치.
  93. 제91항에 있어서, 핵산이 CD95, 카스파제-3, Bax, Bag-1, CRADD, TSSC3, bax, hid, Bak, MKP-7, PARP, bad, bcl-2, MST1, bbc3, Sax, BIK 및 BID로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아폽토시스 유도 단백질을 암호화하는 장치.
  94. 제90항에 있어서, 핵산이 사이토카인을 암호화하고, 이 사이토카인이 GM-CSF, G-CSF, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-IO, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TGF-β, TNF-α, TNF-β, PDGF, TGF-α, TGF-β, VEGF 및 mda7로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 장치.
  95. 제90항에 있어서, 핵산이 종양 항원을 암호화하는 장치.
  96. 제90항에 있어서, 핵산이 이 핵산과 작동적으로 커플링된 프로모터를 포함하는 발현 카세트 내에 포함되고, 상기 프로모터가 피험체의 세포 내에서 활성인 장치.
  97. 제96항에 있어서, 발현 카세트가 바이러스 벡터로 운반되는 장치.
  98. 제97항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 파르보바이러스 벡터, 세밀리키 포레스트(semiliki forest) 바이러스 벡터, 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 또는 폭스 바이러스 벡터인 장치.
  99. 제98항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터인 장치.
  100. 제99항에 있어서, 치료적 핵산이 FUS1을 암호화하는 장치.
  101. 제99항에 있어서, 치료적 핵산이 mda7을 암호화하는 장치.
  102. 제99항에 있어서, 치료적 핵산이 p53을 암호화하는 장치.
  103. 제90항에 있어서, 약제학적 조성물이 추가로 핵산 흡수 증강제를 포함하는 장치.
  104. 제103항에 있어서, 핵산 흡수 증강제가 양이온성 지질인 장치.
  105. 제104항에 있어서, 양이온성 지질이 비스-구아니디늄-트렌-콜레스테롤 또는 1,2-디올레오일-3-(트리메티암모늄)프로페이트(DOTAP)인 장치.
  106. 제104항에 있어서, 양이온성 지질이 4급 사이토펙틴인 장치.
  107. 제1항 또는 제58항에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 피험체에게 투여함을 포함하여, 피험체의 질환을 검출, 치료 또는 예방하는 방법.
  108. 제107항에 있어서, 핵산이 리포터 단백질을 암호화하고, 피험체의 병변을 검출하는 방법으로서 추가로 한정되는 방법.
  109. 제108항에 있어서, 병변이 과다증식 병변인 방법.
  110. 제109항에 있어서, 과다증식 병변이 암인 방법.
  111. 제110항에 있어서, 암이 유방암, 폐암, 전립선암, 난소암, 뇌암, 간암, 경부암, 결장암, 신장암, 피부암, 두경부암, 골암, 식도암, 방광암, 자궁암, 림프암, 위암, 췌장암, 고환암, 림프종 또는 백혈병인 방법.
  112. 제107항에 있어서, 핵산이 치료적 핵산인 방법.
  113. 제112항에 있어서, 치료적 핵산이 종양 억제인자, 아폽토시스 유도 단백질, 사이토카인 또는 성장인자를 암호화하는 방법.
  114. 제113항에 있어서, 종양 억제인자가 mda7, APC, CYLD, HIN-1, KRAS2b, p16, p19, p21, p27, p27mt, p53, p57, p73, PTEN, Rb, 우테로글로빈(Uteroglobin), Skp2, BRCA-1, BRCA-2, CHK2, CDKN2A, DCC, DPC4, MADR2/JV18, MEN1, MEN2, MTS1, NF1, NF2, VHL, WRN, WT1, CFTR, C-CAM, CTS-1, zacl, ras, MMAC1, FCC, MCC, FUS1, Gene 26 (CACNA2D2), PL6, Beta*(BLU), Luca-1(HYAL1), Luca-2(HYAL2), 123F2(RASSF1), 101F6, Gene 21(NPRL2) 또는 SEM A3 폴리펩타이드인 방법.
  115. 제112항에 있어서, 종양 억제인자가 FUS1, Gene 26 (CACNA2D2), PL6, Beta*(BLU), Luca-1(HYAL1), Luca-2(HYAL2), 123F2(RASSFl), 101F6, Gene 21(NPRL2) 또는 SEM A3 폴리펩타이드인 방법.
  116. 제113항에 있어서, 아폽토시스 유도 단백질이 CD95, 카스파제-3, Bax, Bag-1, CRADD, TSSC3, bax, hid, Bak, MKP-7, PARP, bad, bcl-2, MST1, bbc3, Sax, BIK 또는 BID인 방법.
  117. 제113항에 있어서, 사이토카인이 GM-CSF, G-CSF, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-IO, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TGF-β, TNF-α, TNF-β, PDGF, TGF-α, TGF-β, VEGF 또는 mda7인 방법.
  118. 제112항에 있어서, 치료적 핵산이 종양 항원을 암호화하는 방법.
  119. 제112항에 있어서, 점막 표면의 면역반응을 유도하는 방법으로서 추가로 한정되고, 약제학적 조성물이 피험체의 점막 표면에 적용되는 방법.
  120. 제107항에 있어서, 조성물이 리포터 단백질을 암호화하는 진단적 핵산을 포함하는 방법.
  121. 제120항에 있어서, 리포터 단백질이 형광 단백질인 방법.
  122. 제121항에 있어서, 형광 단백질이 청색 형광 단백질, 녹색 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 청록색 형광 단백질 또는 이의 생물학적 활성 유도체인 방법.
  123. 제107항에 있어서, 조성물이 성장인자를 암호화하는 치료적 핵산을 포함하는 방법.
  124. 제123항에 있어서, 성장인자가 표피 성장인자, 각질세포 성장인자 또는 간세포 성장인자인 방법.
  125. 제107항에 있어서, 피험체 상처의 치유를 촉진하는 방법으로서 추가로 한정되는 방법.
  126. 제107항에 있어서, 핵산이 치료적 핵산이고, 피험체의 과다증식 병변의 성장을 예방하거나 억제하는 방법으로서 추가로 한정되는 방법.
  127. 제126항에 있어서, 피험체의 구강 형성이상 또는 백색판증을 예방 또는 억제하는 방법으로서 추가로 한정되는 방법.
  128. 제107항에 있어서, 핵산이 이 핵산과 작동적으로 커플링된 프로모터를 포함하는 발현 카세트 내에 포함되고, 상기 프로모터가 피험체의 세포 내에서 활성인 방법.
  129. 제128항에 있어서, 발현 카세트가 바이러스 벡터로 운반되는 방법.
  130. 제129항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 파르보바이러스 벡터, 세밀리키 포레스트(semiliki forest) 바이러스 벡터, 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 또는 폭스 바이러스 벡터인 것인 방법.
  131. 제130항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터인 방법.
  132. 제131항에 있어서, 치료적 핵산이 FUS1을 암호화하는 방법.
  133. 제131항에 있어서, 치료적 핵산이 mda7을 암호화하는 방법.
  134. 제131항에 있어서, 치료적 핵산이 p53을 암호화하는 방법.
  135. 제107항에 있어서, 피험체가 포유동물인 방법.
  136. 제135항에 있어서, 포유동물이 사람인 방법.
  137. 제136항에 있어서, 사람이 암환자 또는 전암성 병변을 보유한 환자인 방법.
  138. 제107항에 있어서, 약제학적 조성물의 투여가 어플리케이터(applicator)를 이용하여 피험체의 신체 표면에 약제학적 조성물을 적용하는 것을 포함하는 방법.
  139. 제107항에 있어서, 질환의 검출, 예방 또는 치료가 필요한 피험체를 동정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  140. 제139항에 있어서, 핵산이 치료적 핵산이고, 피험체에게 1종 이상의 2차 치료 형태를 투여함을 추가로 포함하는 방법.
  141. 제47항에 기재된 약제학적 조성물을 피험체에게 투여함을 포함하여, 피험체 의 질환을 검출, 치료 또는 예방하는 방법.
  142. 제141항에 있어서, 핵산이 리포터 단백질을 암호화하고, 피험체의 병변을 검출하는 방법으로서 추가로 한정되는 방법.
  143. 제142항에 있어서, 병변이 과다증식 병변인 방법.
  144. 제143항에 있어서, 과다증식 병변이 암인 방법.
  145. 제144항에 있어서, 암이 유방암, 폐암, 전립선암, 난소암, 뇌암, 간암, 경부암, 결장암, 신장암, 피부암, 두경부암, 골암, 식도암, 방광암, 자궁암, 림프암, 위암, 췌장암, 고환암, 림프종 또는 백혈병인 방법.
  146. 제141항에 있어서, 핵산이 치료적 핵산인 방법.
  147. 제146항에 있어서, 치료적 핵산이 종양 억제인자, 아폽토시스 유도 단백질, 사이토카인 또는 성장인자를 암호화하는 방법.
  148. 제147항에 있어서, 종양 억제인자가 mda7, APC, CYLD, HIN-1, KRAS2b, p16, p19, p21, p27, p27mt, p53, p57, p73, PTEN, Rb, 우테로글로빈(Uteroglobin), Skp2, BRCA-1, BRCA-2, CHK2, CDKN2A, DCC, DPC4, MADR2/JV18, MEN1, MEN2, MTS1, NF1, NF2, VHL, WRN, WT1, CFTR, C-CAM, CTS-1, zacl, ras, MMAC1, FCC, MCC, FUS1, Gene 26 (CACNA2D2), PL6, Beta*(BLU), Luca-1(HYAL1), Luca-2(HYAL2), 123F2(RASSF1), 101F6, Gene 21(NPRL2) 또는 SEM A3 폴리펩타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  149. 제148항에 있어서, 종양 억제인자가 FUS1, Gene 26 (CACNA2D2), PL6, Beta*(BLU), Luca-1(HYAL1), Luca-2(HYAL2), 123F2(RASSFl), 101F6, Gene 21(NPRL2) 또는 SEM A3 폴리펩타이드인 방법.
  150. 제147항에 있어서, 아폽토시스 유도 단백질이 CD95, 카스파제-3, Bax, Bag-1, CRADD, TSSC3, bax, hid, Bak, MKP-7, PARP, bad, bcl-2, MST1, bbc3, Sax, BIK 또는 BID인 방법.
  151. 제147항에 있어서, 사이토카인이 GM-CSF, G-CSF, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-IO, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TGF-β, TNF-α, TNF-β, PDGF, TGF-α, TGF-β, VEGF 또는 mda7인 방법.
  152. 제146항에 있어서, 치료적 핵산이 MelanA (MART-I), gplOO(Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15(58), CEA, RAGE, NY-ESO(LAGE), SCP-1, Hom/Mel-40, PRAME, p53, H-Ras, HER-2/neu, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, 엡스타인 바 바이러스 항원(Epstein Barr virus antigens), EBNA, 사람 유두종바이러스(HPV) 항원 E6 및 E7, TSP-180, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, mn-23H1, PSA, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, β-카테닌, CDK4, Mum-1, pl6, TAGE, PSMA, PSCA, CT7, 텔로머라제, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아단백질(alpha-fetoprotein), β-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3(CA 27.29＼BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼KP1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733(EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90(Mac-2 결합 단백질＼사이클로필린 C 연관 단백질), TAAL6, TAG72, TLP, TPS, ING1, 마마글로빈, 사이클린 B1, S1OO, BRCA1, BRCA2, 종양 면역글로불린 이디오타입, 종양 T-세포 수용체 클론형, MUC-1 및 표피 성장인자 수용체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 종양 항원을 암호화하는 방법.
  153. 제146항에 있어서, 점막 표면의 면역반응을 유도하는 방법으로서 추가로 한정되고, 약제학적 조성물이 피험체의 점막 표면에 적용되는 방법.
  154. 제141항에 있어서, 조성물이 리포터 단백질을 암호화하는 진단적 핵산을 포함하는 방법.
  155. 제154항에 있어서, 리포터 단백질이 형광 단백질인 방법.
  156. 제155항에 있어서, 형광 단백질이 청색 형광 단백질, 녹색 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 청록색 형광 단백질 또는 이의 생물학적 활성 유도체인 방법.
  157. 제141항에 있어서, 조성물이 성장인자를 암호화하는 치료적 핵산을 포함하고, 피험체의 상처 치유를 촉진하는 방법으로서 추가로 한정되는 방법.
  158. 제157항에 있어서, 성장인자가 표피 성장인자, 각질세포 성장인자 또는 간세포 성장인자인 방법.
  159. 제141항에 있어서, 핵산이 치료적 핵산이고, 피험체의 과다증식 병변의 성장을 예방 또는 억제하는 방법으로서 추가로 한정되는 방법.
  160. 제159항에 있어서, 과다증식 병변이 구강의 백색판증 또는 구강의 암종인 방법.
  161. 제141항에 있어서, 핵산이 이 핵산과 작동적으로 커플링된 프로모터를 포함하는 발현 카세트 내에 포함되고, 상기 프로모터가 피험체의 세포 내에서 활성인 방법.
  162. 제161항에 있어서, 발현 카세트가 바이러스 벡터로 운반되는 방법.
  163. 제162항에 있어서, 바이러스 벡터가 바큘로바이러스 벡터, 파르보바이러스 벡터, 세밀리키 포레스트(semiliki forest) 바이러스 벡터, 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 또는 폭스 바이러스 벡터인 방법.
  164. 제163항에 있어서, 치료적 핵산이 FUS1을 암호화하는 방법.
  165. 제163항에 있어서, 치료적 핵산이 mda7을 암호화하는 방법.
  166. 제163항에 있어서, 치료적 핵산이 p53을 암호화하는 방법.
  167. 제141항에 있어서, 피험체가 포유동물인 방법.
  168. 제167항에 있어서, 포유동물이 사람인 방법.
  169. 제168항에 있어서, 사람이 암환자 또는 전암성 병변을 보유한 환자인 방법.
  170. 제141항에 있어서, 약제학적 조성물의 투여가 어플리케이터를 이용하여 피험체의 신체 표면에 약제학적 조성물을 적용하는 것을 포함하는 방법.
  171. 제141항에 있어서, 질환의 검출, 예방 또는 치료가 필요한 피험체를 동정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  172. 제141항에 있어서, 핵산이 치료적 핵산이고, 피험체에게 1종 이상의 2차 치료 형태를 투여함을 추가로 포함하는 방법.
  173. 제90항에 기재된 경피 또는 피부통과 전달 장치를 피험체의 표면에 적용함을 포함하여, 피험체의 질환을 검출, 치료 또는 예방하는 방법.
  174. 제173항에 있어서, 발현 카세트가 바이러스 벡터로 운반되는 방법.
  175. 제174항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 파르보바이러스 벡터, 세밀리키 포레스트(semiliki forest) 바이러스 벡터, 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 또는 폭스 바이러스 벡터인 방법.
  176. 제175항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터인 방법.
  177. 제176항에 있어서, 치료적 핵산이 FUS1을 암호화하는 방법.
  178. 제176항에 있어서, 치료적 핵산이 mda7을 암호화하는 방법.
  179. 제176항에 있어서, 치료적 핵산이 p53을 암호화하는 방법.
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Patent event code: PA01051R01D

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