KR20060125675A

KR20060125675A - 항원 전달 시스템

Info

Publication number: KR20060125675A
Application number: KR1020067001753A
Authority: KR
Inventors: 디르크 베를링
Original assignee: 더 로얄 베터러네리 칼리지
Priority date: 2003-08-05
Filing date: 2004-08-05
Publication date: 2006-12-06
Also published as: AU2004262980B2; ATE443525T1; AU2004262980A1; US20070142312A1; NZ544965A; WO2005014040A3; DE602004023311D1; CN1867356A; ES2356344T3; BRPI0413290A; WO2005014040A2; EP1667715A2; RU2006106738A; NO20060395L; MXPA06001416A; JP2007501009A; GB0318247D0; ZA200601024B; CA2533550A1; EP1667715B1

Abstract

(i) 동물에서 수지상 세포에 선택적으로 결합하나, 상기 동물에서 자연적으로 발생하지 않는 모이어티 및 (ii) 항원을 포함하는 동물의 예방접종용 화합물. 전형적으로, 상기와 같이 선택적으로 결합하는 모이어티는 DC-SIGN에 결합한다. 상기 모이어티는 HIV-1 gp120 일 수 있다. 본 발명의 화합물은 동물을 예방접종하기 위해 이용될 수 있으며, 예방접종에 따라, 자연적으로 감염된 동물로부터 구별될 수 있다.

Description

항원 전달 시스템{Antigen delivery system}

본 발명은 항원 전달 시스템에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 질환에 대해 동물을 예방접종하고, 예방접종된 동물 및 자연적으로 감염된 동물을 구별하기 위해 이용될 수 있는 시스템에 관한 것이다.

동물에서 자연적인 선천 및 적응의 면역계의 이해 및 선택적인 조작은 가축뿐만 아니라 반려 동물을 질환으로부터 보호하는 관점, 및 모든 종에서 증가하는 중요성의 화제인 항생제 내성의 증가하는 위험으로 인한 질환 제어의 항생제 중재에 대한 의존성의 감소 관점에서 매우 바람직하다.

항생제는 다양한 병원균에 대해 농가 가축 및 반려 동물 종의 보호를 위해 무차별 기준으로 종종 이용된다. 부적당한 항생제 이용의 문화가 방어면역에 대한 병원균 항원의 불량한 수행을 통해 생성되었다.

그러므로, 동물 행복 관심 및 감소된 항생제 잔류물을 갖는 고품질 고기에 대한 소비자의 증가하는 요구에 의해, 병원균 방어에서 숙주 적응 면역의 역할의 우리의 이해를 개발 및 개선할 필요성이 일어나고 있다.

지금, 백신 제품에 이의 이용에 의해 동물 종에서 방어를 유도할 목적으로 분자 항원에 관한 증가하는 연구가 존재한다. 그러나, 상기 제품은 질환으로부터 동물의 방어에 대한 세포 면역계의 준비에 대한 조건을 거의 고려하지 않으므로, 이는 많은 경우에 제한된 효능을 가졌다.

질환 제어 수단으로서 예방접종의 제한 중의 하나는 자연적으로 감염된 동물 및 예방접종된 동물 사이를 구별하는 어려움이다. 예를 들면, 이는 UK에서 최근의 발입병(FMD) 발생과 관련하여 주요 이슈였는데, 여기에서 한 나라의 소 무리가 예방접종된다면, 특정 나라는 상기 무리로부터 소의 수입을 허용하지 않을 것이라는 이유로 예방접종이 부분적으로 이용되지 않았다. 현재의 예방접종 방법은 또한 감염된다면 동물의 시체가 처리되어야 하며, 존재할 수 있는 임의의 바이러스를 사멸하기 위해 더 오랫동안 매달려 있어야 하기 때문에, 고기의 시장 가치를 낮춘다. FMD에 대해, 청정 무리를 유지하는 것을 강조하고 있으나, 전파가 문제이기 때문에 (예를 들면, 래트, 오소리 등) 청정 무리를 유지하는 것은 거의 불가능하다. 예방접종된 동물에 이질의 면역원을 포함하는 마커 백신이 자연적으로 감염된 및 예방접종된 동물을 구별하는 방식으로서 제안되어 왔다.

동물 질환에 관련된 것과 같은 항원과 조합하여 수지상 세포에 선택적으로 결합하는 모이어티를 이용하여 수지상 세포를 표적화하는 것, 및 상기와 같이 선택적으로 결합하는 모이어터가 상기 동물 종에서 자연적으로 발생하지 않는 것은 항원 전달(예방접종)의 새로운 개념을 제공할 뿐만 아니라, 예방접종된 및 자연적으로 감염된 동물 사이의 구별을 허용한다고 제안한다.

본 발명의 제 1 양태는 (i) 동물에서 수지상 세포에 선택적으로 결합하나, 동물에서 자연적으로 발생하지는 않는 모이어티 및 (ii) 항원을 포함하는 동물의 예방접종용 화합물을 제공한다.

"수지상 세포에 선택적으로 결합하는 모이어티"는 수지상 세포에 결합하나, 기타 유형의 항원제시세포에는 실질적으로 결합하지 않는 임의의 적당한 모이어티를 의미한다. 모이어티가 상기와 같이 선택적으로 결합하는 가는 예를 들면, 형광으로 표지된 결합 모이어티를 이용하고, 수지상 세포 및 기타 항원제시세포와 관련된 형광을 측정하여, 기타 항원제시세포에 대한 결합과 비교하여 수지상 세포에 대한 모이어티의 결합을 측정함으로써 결정될 수 있다. 대안적으로, 항-모이어티 항체는 수지상 세포에 대한 이의 선택성을 측정하기 위해, 모이어티가 어느 세포에 결합하는지를 결정하기 위해 이용될 수 있다.

수지상 세포는 매우 강력한 항원제시세포이며, 예방 또는 치료 면역을 유도하기 위한 생리학적 보조제로서 효과적이라는 것을 보여주었다. 이는 말초 점막 조직에 들어간 후, 이차 림프계 기관을 이동하는 미생물을 포획하는데, 여기에서 이는 휴지 T 세포에게 항원 형태의 미생물을 제시하므로, 적응 면역 반응을 개시한다.

수지상 세포에 선택적으로 결합하는 모이어티는 임의의 적당한 모이어티일 수 있다. 특히, 수지상 세포가 선택적으로 발현되며, 수지상 세포에 대한 표적으로 이용될 수 있는 전형적으로 수용체를 이의 표면 단백질 상에 제공한다는 것이 알려져 있다. 그리하여, 편리하게는, 상기 모이어티는 자체로 수지상 세포 상에서 선택적으로 발현되는 수용체에 결합한다. 전형적으로, 수지상 세포 상에서 선택적으로 발현되는 수용체는 기타 항원제시세포보다 수지상 세포 상에서 10배, 바람직하게는 100배, 또는 더욱 바람직하게는 1000배 더 높은 수준으로 존재하는 것이다.

바람직하게는 상기 모이어티는 수지상 세포 상에서 패턴 인식 수용체에 결합한다. 패턴 인식 수용체는 병원균 관련된 분자 패턴에 결합하는 수용체이다. 전형적으로, 패턴 인식 수용체는 렉틴에 결합하는 것이다. 적당한 패턴 인식 수용체는 DC-SIGN, DEC-205 (예를 들면, Steinman et al (1997) Immunol. Rev. 156, 25-37 참고) 및 TOLL 유사 수용체 (예를 들면, Werling & Jungi (2003) Vet. Immunol. Immunopathol. 91, 1-12 참고)를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 모이어티는 수지상 세포의 표면 상에서 매우 발현되는 세포 특이적인 세포간 부착 분자인 3-그래빙(grabbing) 비인테그린 C형 렉틴인 DC-SIGN에 결합한다. DC-SIGN은 또한 종종 CD209라 불린다.

DC-SIGN은 N-말단 세포질 도메인, 막횡단 도메인, 목 영역, 직열반복 영역 및 이의 C-말단에 C형 (칼슘 의존성) 만노스 결합 렉틴 도메인을 형성하는 II 형 막횡단 단백질이다. 인간 및 마우스에서, DC-SIGN은 직장, 자궁 및 경부와 같은 점막 조직의 고유판인 진피, 및 편도, 림프절 및 비장의 T 세포 영역에 존재하는 수지상 세포에 의해 발현된다. 인간에서, DC-SIGN은 404개의 아미노산을 가진다.

DC-SIGN은 인간, 침팬지, 고릴라, 원숭이에서 발견되어 왔으며, 여기에서 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA가 클로닝되었다. DC-SIGN에 대한 cDNA 및 아미노산 서열은 하기 GenBank 등록 번호 AF391086 (히말라야원숭이), AY078913 (침팬지), NM_021155 (인간) 및 NM_133238 (Mus)에서 발견된다. 도 1은 소 DC-SIGN의 하나의 변이체의 부분적인 cDNA 서열을 보여준다. 침팬지, 원숭이 및 인간 유래의 DC-SIGN과 함께 정렬된 변이체 1 소 DC-SIGN의 연역된 아미노산 서열을 도 3에 보여준다. 도 6은 소 DC-SIGN의 제 2 변이체의 부분적인 cDNA 서열을 보여준다. 마우스, 인간 및 변이체 1 소 DC-SIGN와 함께 정렬된 변이체 2 소 DC-SIGN의 연역된 아미노산 서열을 도 7에서 보여준다 (cDNA 클로닝의 자세한 것에 대해 실시예 7 참고).

인간, 마우스 및 소 (변이체 2) DC-SIGN의 SMART 단백질 도메인 분석은 상기 단백질 각각이 C형 렉틴 수용체 모티프를 포함하면서, 구조적 상동성을 공유한다는 것을 보여주었다. 인간 DC-SIGN에서, 가상적인 C-렉틴 도메인은 잔기 256 및 378 사이에 있으며; 마우스에서, 가상적인 C-렉틴 도메인은 잔기 108 및 229 사이에 있으며; 소 (변이체 2) DC-SIGN에서, 가상적인 C-렉틴 도메인은 잔기 129-248 사이에 있다.

DC-SIGN은 수지상 세포의 표면 상에서 선택적으로 발현되는 것으로 믿어지며, 면역계에서 이의 역할 때문에 종 사이에 보존되는 것으로 믿어진다. 그리하여, 예를 들면, 인간 및 마우스 DC-SIGN의 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA는 도면 설명에 기재된 컴퓨터 프로그램에 의해 평가될 때, 44% 서열 유사성을 공유한다.

그리하여, DC-SIGN I은 폴리펩티드 서열을 코딩하는 cDNA가 도 2에 보여준 인간 또는 마우스 뉴클레오티드 서열과 40% 이상의 유사성을 갖는 임의의 단백질을 포함한다.

게다가, DC-SIGN 분자는 전형적으로 예를 들면, [Geijtenbeek et al (2002) J Biol. Chem. 277, 11314-11320]에 기재된 분석법에 의해 측정될 수 있는 ICAM-3 또는 ICAM 패밀리의 기타 멤버에 결합할 수 있는 것이다.

하기 논문은 DC-SIGN 및 HIV-1 또는 ICAM-3 사이의 상호작용을 기재하며, 모두 본원에 참고로 포함된다: Geijtenbeek et al (2002) J. Leukoc. Biol. 71, 921-931; Geijtenbeek et al (2002) J. Biol. Chem. 277, 11314-11320; Geijtenbeek et al (2000) Cell 100, 575-585; 및 Kooyk & Geijtenbeek (2002) Immunol. Rev. 186, 47-56.

게다가, 이의 폴리펩티드가 이의 서열이 GenBank 등록 번호 AF391086, AY078913, NM_021155 또는 NM_133238 중의 임의의 하나에 제공된 폴리뉴클레오티드에 스트린전트 조건하에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 임의의 단백질을 포함한다.

"스트린전트 조건"은 1시간 이상 동안 60℃에서 6xSSC에서 혼성화한 후, 30분 동안 60℃에서 3xSSC에서 세정하는 것을 의미한다. 1xSSC는 O.15M NaCl/0.015M 소듐 시트레이트이다.

또한, 인간 또는 마우스 DC-SIGN와 면역학적으로 교차 반응성인 임의의 단백질을 포함한다. 전형적으로, 이는 인간 또는 마우스 DC-SIGN에 대한 다클론 항혈청을 이용하여 평가될 수 있다.

바람직하게는 수지상 세포에 선택적으로 결합하는 상기 모이어티는 단백질이다.

상기 화합물은 전형적으로 동물의 예방접종에 이용된다. 전형적으로, 선택적으로 결합하는 상기 모이어티는 동물에 대한 외래 또는 이질적인 분자의 전부 또는 부분이다. 이는 사람과 같은 또 다른 동물 유래일 수 있으며, 동물에서 면역원성이며, 동물에서 항체 반응을 야기하는 것이다. 그리하여, 상기와 같이 선택적으로 결합하는 모이어티는 항원을 수지상 세포에 표적화할 뿐만 아니라, 그 자체로 또한 예방접종의 마커로서 이용되는 면역 (항체) 반응을 야기한다는 것을 알 수 있을 것이다. 게다가, 선택적으로 결합하는 상기 모이어티는 또한 전형적으로 Th1 반응을 준비함으로써 면역계를 촉진하는데 작용할 수 있으며, 보조제로서 작용한다.

다양한 모이어티가 결핵균의 LAM 단백질 (예를 들면, Tailleux et al (2003) J. Exp. Med. 197, 1-5 참고), 에볼라 바이러스의 당단백질 및 HIV-1 외피 당단백질 gpl20 (예를 들면, Geijtenbeek et al (2002) J. Biol. Chem. 277, 11314-11320 참고)를 포함하는 DC-SIGN에 결합하는 것으로 나타났다. 상기 결합 모이어티가 고 친화성으로 DC-SIGN에 결합할 수 있는 것이 바람직하다. 상기 분자의 단지 부분이 수지상 세포에 대한 결합을 수행하는데 필요하다는 것을 인식할 것이다. 상기 부분은 용어 "수지상 세포에 결합하는 모이어티"에 포함된다. 그러나, 분자의 전체 또는 실질적으로 전체가 결합 모이어티로서 이용된다면 바람직하다.

수지상 세포에 선택적으로 결합하는 모이어티가 HIV-1 외피 당단백질 gpl20 이라면 특히 바람직하다. 자연적으로 발생하는 감염 하에, DC-SIGN은 점막 표면(HIV에 대한 노출 자리)에서 2차 림프계 기관(HIV에 의한 감염 자리)으로 수지상 세포에 의한 HIV 전달을 매개한다. 상기 전달은 HIV가 분해로부터 보호되고, 이의 감염성을 보유하는 동안 수 일이 소요될 수 있다. 하나의 잠재적인 기작은 림프절에서 수지상 세포의 도착 및 T-세포와의 상호작용 후에 세포 표면으로 되돌아오기 위해 단지 DC-SIGN을 결합시 HIV의 세포내이입을 통해서이다. 상기 내재화 가설은 DC-SIGN의 세포질 도메인에서 2개의 잠재적인 세포내이입 모티프인 LL 및 YXXL의 존재에 의해 지지된다. 상기 모티프는 다양한 상황에서 세포내이입 및 재순환을 매개하는 것으로 나타났다. 293T-세포에서 일시적으로 발현된 DC-SIGN에 결합된 HIV-1은 몇 일 동안 이의 감염성을 보유하나, 트립신 처리에 감수성이다. 이는 DC-SIGN-발현 293T-세포의 HIV-1을 세포내이입하지 못하는 능력을 지적할 수 있다. 그러나, HIV-1 내재화가 수지상 세포에서 HIV-1 방어의 현저한 기작이 될 수 있는 것이 가능하다.

상기 LL 및 YXXL 모티프는 종 사이에 보존되는데, 이는 인간 DC-SIGN 분자의 동족체가 상기 모티프를 포함하는 마우스에서 발견되었기 때문이다.

HIV-1의 초기 결합은 수지상 세포 상에서 발현된 DC-SIGN에 대한 gpl20 외피 단백질에 의해 매개되며, T-세포에 대한 HIV 흡수, 수송 및 전달에서 DC-SIGN의 중요성이 제공되므로, gpl20 분자에 연결된 항원은 매우 높은 효율로 수지상 세포를 직접 표적화하기 위해 이용될 수 있으므로, 본원에 기재된 신규 예방접종의 예를 제공한다.

그리하여, HIV gpl20 단백질을 이용하여 DC-SIGN을 표적화하는 것은 하기일 수 있다: (a) 가장 강력한 항원제시세포를 표적화함으로써 숙주의 선천 면역 반응을 촉진하여, 백신의 적용의 횟수, 예방접종당 필요한 양을 잠재적으로 제한할뿐만 아니라 항생제 잔류물 또는 내성 박테리아 균주의 증식의 공포를 제거하며; (b) 시판되는 시험 시스템을 이용하여, 예방접종된 동물에서 자연적으로 발생하지 않는 단백질인 HIV gpl20 분자에 대한 항체 반응을 분석함으로써 예방접종된 및 자연적으로 감염된 동물의 구별을 가능하게 한다.

본 발명은 또한 구체적으로 (i) 임의의 HIV gpl20, 결핵균의 LAM 단백질 또는 에볼라 바이러스의 당단백질, 또는 이의 부분, 및 (ii) 항원을 포함하는 동물의 예방접종용 화합물을 포함한다.

바람직하게는, 이의 부분은 수지상 세포, 전형적으로 DC-SIGN에 결합할 수 있다. 전형적으로, 이의 부분은 길이가 10개 아미노산 잔기 초과, 더욱 전형적으로 길이가 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60 또는 70개 아미노산 잔기 초과이다.

미코박테리아 LAM 단백질이 DC-SIGN에 결합하고, 본 발명의 실시예 유용할 수 있지만, 일부 자유 탐색(free-ranging) 동물, 예를 들면, 소, 양, 말, 염소, 사슴 등이 미코박테리아와 접촉하여 감염될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 미코박테리아 LAM 단백질이 동물이 자유 탐색 동물(또는 미코박테리아로 감염될 수 있는 기타 동물)일 때, 수지상 세포에 결합하는 모이어티로서 이용되지 않는 것이 바람직하다.

바람직하게는, 상기 화합물은 상기 세포에 대한 결합에 따라 수지상 세포에 의해 세포내이입되는 것이다.

"항원"은 체액성 또는 세포 매개성이든지 간에, 예를 들면, 항체 생성, 및 CD8 매개, 및 NK 세포 매개 반응을 통해 면역 반응을 유도할 수 있는 임의의 모이어티를 포함한다. 상기 항원은 개개의 분자 또는 항원 분자의 균일 또는 불균일 집단을 언급할 수 있다. 다양한 거대분자는 단백질 또는 폴리펩티드 또는 기타 담체에 부착된다면, 핵단백질, 지질단백질을 포함하는 모든 단백질 (올바른 상황에 존재한다면), 대부분의 다당류 (특히 큰 다당류), 및 다양한 소분자 (통상 합텐이라 불림)를 포함하여 항원으로서 작용할 수 있다. 용어 "항원"은 또한 복수의 에피토프를 갖는 다가, 또는 단지 하나의 에피토프를 갖는 1가인 항원 분자를 포함한다.

백신 생산의 내용에서, 항원은 질환과 관련된 분자, 또는 이의 부분, 또는 이의 변이체이다. 특히, 동물 백신의 내용에서, 상기 항원은 예방접종되는 동물의 질환과 관련된 분자, 또는 이의 부분이다. 항원은 병원균을 포함하는 질환, 특히 감염성 질환과 관련되며, 상기 항원이 병원균, 예를 들면 감염성 미생물의 성분의 항원 또는 면역원성 부분이라면 특히 바람직하다.

병원균은 하기 질환과 관련된 것을 포함한다: 발입병, 돼지 혈관질환, 가성우역(peste des petits ruminants), 럼피스킨병, 블루텅(bluetongue), 아프리카 말병, 돼지 콜레라, 뉴캐슬병, 소수포구내염, 우역, 전염성 소 흉막폐렴, 리프트 계곡열, 양두 및 산양두, 아프리카 돼지 콜레라 및 매우 병원균성 조류 인플루엔자. 상기는 국가 경계에 무관하게 매우 심각하고, 신속한 전이에 대한 잠재력을 가지며, 심각한 사회 경제적 또는 공중보건 결과이며, 동물 및 동물 제품의 국제 무역에서 중요하며, OIE (Office International des Epizooties ; www.oie.int)의 List A 질환인 전염성 질환이다.

병원균은 또한 하기와 관련된 것을 포함한다: 탄저병, 오제스키병, 포충증/포충병, 심수병, 렙토스피라병, 신대륙 나사벌레(Cochliomyia hominivorax), 구대륙 나사벌레(Chrysomya bezziana), 파라결핵, Q열, 공수병, 선모충증을 포함하는 복수의 종 질환; 소 아나플라즈마증, 소 바베스열원충증, 소 브루셀라증, 소 낭미충증, 소 생식기 캄필로박터증, 소 해면뇌병증, 소 결핵, 피부방선균증, 동물토착 소 백혈증, 출혈성패혈증, 감염성 소 비기관염/감염성 외음질염, 악성카타르열, 타일레리아병, 트리코모나스증, 트리파노소마증(tsetse-borne)을 포함하는 소 질환; 염소 및 양 브루셀라증 (B. ovis 제외), 염소 관절염/뇌염, 전염성무유증, 전염성 염소 흉막폐렴, 암양의 동물토착 낙태 (양 클라미디아증), 매디비스나(maedivisna), 나이로비 양역, 양 부고환염(브루셀라균), 양 폐선종증, 살모넬라증(S. abortusovis), 면양떨림병을 포함하는 양 및 염소 질환; 전염성 말 자궁근염, 구역, 동물유행림프관염, 말 뇌척수염(동부 및 서부), 말 감염성 빈혈, 말 인플루엔자, 말 이형열원충증, 말 비폐렴, 말 바이러스성 동맥염, 마비저, 말 옴, 말 종두, 일본뇌염, 수라(에반스파동편모충), 베네주엘라형 마뇌척수염을 포함하는 말 질환; 돼지의 위축비염, 엔테로바이러스 뇌척수염, 돼지 브루셀라증, 돼지 낭미충증, 돼지 생식 및 호흡기 증후군, 전염성 위장염을 포함하는 돼지 질환; 및 점액종증, 토끼 출혈증 및 야생토끼병을 포함하는 토끼 질환.

상기는 OIE의 List B 질환의 일부이며; 국가 내에서 사회 경제적 및/또는 공중보건 중요성으로 고려되며, 동물 및 동물 제품의 국제 무역에서 중요한 전염성 질환이다.

특정 병원균은 발입병 바이러스, FeLV (고양이 백혈병바이러스), FIV (고양이 면역결핍바이러스), CDV (개 홍역바이러스), 파보바이러스, 코로나바이러스, 소 호흡기세포융합바이러스 및 소 바이러스성 설사바이러스를 포함한다.

게다가, 그러나, 항원은 예를 들면, 종양 항원이 질환과 관련되는 암을 포함하는 병원균과 반드시 관련되지는 않는 질환과 관련된다. 전형적으로, 종양 항원은 암에서 비정상적으로 과발현되거나 또는 비정상적, 예를 들면, 돌연변이체에서 발현되며, 암에서 형성되는 단백질이다.

프리온 또는 이의 부분은 본 발명의 실시에 이용될 수 있으며, 병원성 생물체와 관련되지 않는 것으로 생각되는 항원이다. 프리온은 해면뇌병증, 예를 들면 소 해면뇌병증 (BSE) 및 양에서 면양떨림병과 관련된다.

본 발명의 명세서에 이용하기 위한 백신 항원은 동물에서 질환의 예방을 위해 의도되거나 또는 동물에서 질환에 대한 방어를 제공하는 미생물의 항원 또는 면역원성 성분, 예를 들면, 바이러스, 박테리아, 진균 및 장내기생충을 포함하는 기생충, 또는 상기 성분의 부분을 포함한다.

적당한 항원은 예를 들면, 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV)의 E2 단백질, 소 백혈병 바이러스의 gp51 단백질, 및 호흡기세포융합바이러스 (RSV)의 F 또는 G 단백질을 포함한다. 상기 단백질에 대한 아미노산 서열은 바이러스 게놈에서 코딩된다. 상기 바이러스 게놈에 대한 GenBank 등록 번호는 하기이다: NC_001781(인간 RSV), NC_001989(소 RSV), AF033818(소 백혈병 바이러스), AF091605(I형 BVDV) 및 AF145967(II형 BVDV).

기타 적당한 질환 관련 항원은 당업자에 의해 선택될 수 있으며, 전형적으로, 많은 상기 항원에 대해, 이의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 cDNA 서열은 GenBank에 유용하다.

상기 항원은 전형적으로 질환과 관련된 폴리펩티드의 전부 또는 부분, 예를 들면, 병원균의 폴리펩티드 성분 또는 종양 항원이다. 폴리펩티드의 부분은 항체 반응과 같은 면역 반응을 유도할 수 있는 폴리펩티드의 임의의 부분일 수 있다. 전형적으로 더 큰 펩티드가 이용되지만, 5개 만큼 적은 아미노산을 갖는 펩티드가 항체 반응을 유도할 수 있다는 것이 알려져 있다. 그리하여, 상기 항원이 폴리펩티드인 경우에, 5개 이상의 아미노산, 전형적으로 5 내지 1000개 아미노산, 예를 들면, 5 내지 500개, 5 내지 200개, 5 내지 100개, 5 내지 50개, 5 내지 40개, 5 내지 30개, 5 내지 20개, 예를 들면 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산을 가질 수 있다.

본 발명의 화합물의 항원은 질환에 대해 방어적인 면역 반응을 유도할 수 있다면, 질환과 관련된 분자의 변이체일 수 있다는 것을 인식할 것이다. 상기 변이체는 질환과 관련된 천연 항원과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 및 5% 만큼 많은 치환을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 전형적으로, 상기 치환은 보존 치환이며, 여기에서, 예를 들면, "변이체"는 변화가 이의 기본적 특성, 예를 들면, 효소 활성(유형 및 비활성), 열안정성, 특정 pH 범위에서 활성(pH 안정성)이 현저하게 변하지 않는 단백질을 초래한다면, 하나 이상의 위치에서, 보존적 또는 비보존적인 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환이 있었던 단백질을 말한다. 상기 명세서에서 "현저하게"는 당업자가 변이체의 특성이 여전히 상이할 수 있으나, 원래 단백질의 것에 대해 비자명하지 않을 것이라고 말할 수 있는 것을 의미한다.

"보존 치환"은 의도된 조합, 예를 들면, Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; 및 Phe, Tyr이다.

상기 변이체는 단백질 공학의 표준 방법 및 자리지정 돌연변이유발을 이용하여 제조될 수 있다.

바람직하게는, 수지상 세포 및 항원에 선택적으로 결합하는 모이어티는 공유적으로 연결된다. 상기 모이어티 및 항원이 각각 폴리펩티드인 경우에, 2개의 부분은 폴리펩티드를 가교하는 임의의 통상적인 방식에 의해 연결될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화합물의 2개의 부분은 폴리펩티드를 가교하는 임의의 통상적인 방식, 예를 들면, [O'Sullivan et al Anal. Biochem. (1979) 100, 100-108]에 일반적으로 기재된 것에 의해 연결된다. 예를 들면, 제 1 부분은 티올기가 풍부하며, 제 2 부분은 상기 티올기와 반응할 수 있는 2 작용기성 물질, 예를 들면, 요오도아세트산의 N-히드록시숙신이미드 에스테르(NHIA) 또는 콘쥬게이티드 종 사이에 디설피드 브리지를 혼입하는 이형2작용기성 가교제인 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP)와 반응한다. 예를 들면 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르를 이용하여 달성된 아미드 및 티오에테르 결합은 일반적으로 디설피드 결합보다 생체 내에서 더욱 안정하다.

추가의 유용한 가교제는 부드러운 조건하에 설프히드릴기의 탈보호를 허용하는 일차 아민에 대한 티올화제인 S-아세틸티오글리콜산 N-히드록시숙신이미드 에스테르(SATA)(Julian et al (1983) Anal. Biochem. 132, 68), 디메틸수베르이미데이트 디히드로클로라이드 및 N,N'-o-페닐렌디말레이미드를 포함한다.

대안적으로, 상기 화합물은 재조합 DNA 기술에 의해 융합 화합물(또는 융합 폴리펩티드)로서 제조될 수 있으며, 여기에서 DNA의 길이는 수지상 세포에 선택적으로 결합하는 모이어티의 폴리펩티드 부분 및 서로 인접하거나 또는 상기 화합물의 원하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 분리된 항원을 코딩하는 각각의 영역을 포함한다.

본원에 이용된, 융합 폴리펩티드는 본 발명의 화합물의 항원인 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 융합된 수지상 세포에 결합하는 모이어티의 폴리펩티드 부분인 폴리펩티드를 포함하는 것이다. 상기 융합 폴리펩티드를 수득하는 간단한 방식은 폴리뉴클레오티드 서열의 인프레임 융합, 즉 하이브리드 유전자의 번역에 의해서이다. 상기 융합 폴리펩티드를 코딩하는 하이브리드 유전자는 숙주 세포를 형질전환 또는 트랜스펙션하기 위해 이용되는 발현 벡터 내로 삽입된다. 전사 및 번역 조절 영역은 전형적으로 발현 벡터에 존재한다. 이어서, DNA를 적당한 숙주에서 발현하여 본 발명의 제 1 양태에 따른 화합물을 포함하는 폴리펩티드를 제조한다.

상기 항원이 동물의 질환과 관련된 2 이상의 분자, 또는 상기 분자의 부분 또는 변이체를 포함할 것이라는 것을 인식할 것이다.

상기 방식으로, 본 발명의 화합물은 하나의 질환 이상에 대해 예방접종하기 위해 이용될 수 있다. 그리하여, 예를 들면, 상기 화합물은 하나의 질환 물질 유래의 항원 (예를 들면, BVDV의 E2 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 부분) 및 제 2 질환 물질 유래의 항원 (예를 들면, RSV의 F 단백질 또는 이의 면역원성 물질)을 수지상 세포에 결합하는 모이어티로서 동일한 폴리펩티드 사슬에 포함할 수 있다. 기타 변이가 당업자에게 명백할 것이다.

본 발명의 제 2 양태는 본 발명의 제 1 양태의 융합 화합물을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다.

적당한 핵산 분자는 [Sambrook, J. and Russell, D.(2001) "Molecular Cloning: a laboratory manual" 3rd ed. Vol 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 포함하는 클로닝 메뉴얼에 기재된 것과 같은 통상적인 방법을 이용하여 당업자에 의해 용이하게 합성 또는 구축될 수 있다. 전형적으로, 상기 핵산은 DNA이나, RNA 일 수 있다. 하기에서, DNA가 이용된 경우에, 반대로 표시하지 않는다면, RNA가 또한 포함된다.

본 발명의 제 1 양태의 화합물의 항원을 코딩하는 DNA 서열은 DNA 서열의 데이타베이스, 예를 들면, GenBank 등을 탐색함으로써 확인될 수 있다. 적당한 항원에 대한 DNA 코딩 서열의 예는 상기에 제공된다. 선택된 항원을 코딩하는 DNA 서열이 공지되면, 예를 들면, 싸워야 하는 질환과 관련된 병원균으로부터 상기 항원을 코딩하는 DNA 또는 cDNA 서열의 특정 분리에 유용한 프라이머 및/또는 프로브를 디자인하기 위해 이용될 수 있다. DNA 서열이 공지된다면, 프라이머 및 프로브는 시판되는 소프트웨어를 이용하여 디자인될 수 있으며, 자동화된 합성에 의해 합성될 수 있다. 일반적으로, 상기 항원을 코딩하는 DNA 서열은 적당한 공급원, 예를 들면, 선택된 병원균으로부터 생성된 cDNA 또는 DNA 서열의 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 상기 라이브러리는 바람직하게는 높은 스트린전시 조건하에, 선택된 항원을 코딩하는 공지된 DNA 서열에 상보적인 프로브를 이용하여 목적 DNA 서열에 대해 스크리닝할 수 있다. 프로브에 혼성화하는 DNA 서열을 서브클로닝하고, 상기 DNA 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 DNA 서열 분석 및/또는 폴리펩티드의 시험관 내 번역, 발현 및 검출 또는 분석에 의해 확인할 수 있다. 그러나, 전형적으로, 항원을 코딩하는 적당한 DNA 서열은 당업계에 주지된 코딩 영역의 5' 및 3' 말단에 지정된 적당한 프라이머 및 PCR을 이용하여 합성될 수 있다.

선택된 항원을 코딩하는 DNA 서열이 분리되면, 수지상 세포에 결합하는 모이어티, 예를 들면, 수지상 세포의 DC-SIGN에 선택적으로 결합하는 HIV gpl20을 코딩하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 항원 및 수지상 세포에 결합하는 모이어티를 코딩하는 DNA 서열은 전사 및 번역 조절 영역에 동일한 해독틀로 작동가능하게 연결된다. 전사 및 번역 조절 영역은 프로모터, 인핸서, cis 조절 원소, 폴리아데닐화 서열, 전사 및 번역 개시 영역, 및 전사 종결 서열을 포함한다.

이어서, 상기 DNA를 적당한 숙주에서 발현하여 본 발명의 제 1 양태의 화합물인 폴리펩티드를 제조한다. 그리하여, 본 발명의 화합물을 구성하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 발현 벡터를 구축하기 위해 본원에 포함된 교시의 면에서 적당하게 변형된 공지된 기술에 따라 이용되며, 상기 발현 벡터는 본 발명의 폴리펩티드의 발현 및 제조를 위해 적당한 숙주 세포를 형질전환하기 위해 이용된다.

그리하여, 본 발명의 화합물을 구성하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 적당한 숙주 내로의 도입을 위해 다양한 기타 DNA 서열에 연결될 수 있다. 동반 DNA는 숙주의 특성, 숙주 내로의 DNA의 도입 방식, 및 에피좀 유지 또는 통합을 원하는가에 따라 의존할 것이다.

일반적으로, 상기 DNA는 발현을 위한 적당한 방향 및 올바른 해독틀로 플라스미드와 같은 발현 벡터 내로 삽입된다. 필요하다면, DNA는 제어가 일반적으로 발현 벡터에서 유용하지만, 원하는 숙주에 의해 인지된 적당한 전사 및 번역 조절 제어 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있다. 상기 벡터는 이어서 표준 기술을 통해 숙주 내로 도입된다. 일반적으로, 숙주의 모두가 벡터에 의해 형질전환되지는 않을 것이다. 그러므로, 형질전환된 숙주 세포를 선발하는 것이 필요할 것이다. 하나의 선발 기술은 발현 벡터 내에 형질전환된 세포에서 선택성 특성, 예를 들면, 항생제 내성을 코딩하는 임의의 필요한 조절 원소를 갖는 DNA 서열을 혼입하는 것을 포함한다. 대안적으로, 상기 선택성 특성에 대한 유전자는 원하는 숙주 세포를 동시 형질전환하기 위해 이용된 또 다른 벡터 상에 있을 수 있다.

본 발명의 재조합 DNA에 의해 형질전환된 숙주 세포는 이어서 회수될 수 있는 폴리펩티드의 발현을 허용하기 위해 본원에 개시된 교시의 면에서 당업자에게 공지된 적당한 조건하에 충분한 시간 동안 배양된다.

박테리아 (예를 들면 대장균 및 바실러스 서브틸리스), 효모 (예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애), 사상균 (예를 들면, 아스퍼질러스), 식물 세포, 동물 세포 및 곤충 세포를 포함하는 많은 발현 시스템이 공지되어 있다.

상기 벡터는 다른 비원핵 세포 유형에서 발현을 위해 이용된다 할지라도, 원핵세포에서 증식을 위해, 원핵세포 레플리콘, 예를 들면, ColEl ori를 포함한다. 상기 벡터는 또한 적당한 프로모터, 예를 들면, 형질전환된 대장균과 같은 박테리아 숙주 세포에서 유전자의 발현(전사 및 번역)을 지시할 수 있는 원핵세포 프로모터를 포함할 수 있다. 전형적으로, 상기 벡터는 숙주 세포에서 안정하게 통합되고/되거나 화합물의 고발현을 제공할 수 있는 것이다. 적당한 벡터는 Invitrogen사 시판의 pcDNA 3.1 (+/-His tag)를 포함한다.

"프로모터"는 RNA 중합효소의 결합을 허용하고, 전사를 발생하는 DNA 서열에 의해 형성된 발현 조절 원소를 의미한다. 전형적인 숙주와 상용성인 프로모터 서열은 전형적으로 본 발명의 DNA 절편의 삽입을 위해 편리한 제한효소 자리를 포함하는 플라스미드 벡터에 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태는 그러므로 본 발명의 제 1 양태에 따른 화합물을 코딩하는 핵산으로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.

본 발명의 화합물의 발현에 특히 바람직한 숙주 세포는 단백질을 글리코실화할 수 있는 COS 및 CHO 세포를 포함한다. 대장균 세포가 이용될 수 있으며, 이 경우에, 화합물의 최종 생성물에 존재할 수 있는 지질다당류는 그 자체로 면역촉진제일 수 있다. 이는 특정 환경에서 유리할 수 있으나, 면역 반응의 측정을 손상시킬 수 있는 기타 환경에서 바람직하지 않을 수 있다.

DNA 중합체의 발현을 허용하는 조건하에 숙주 세포의 배양은 통상적으로 수행된다. 산물은 숙주 세포 및 발현 산물의 위치화(세포내 또는 배양 배지 또는 세포 원형질막공간 내로 분비)에 따라 통상적인 방법에 의해 회수될 수 있다. 그리하여, 숙주 세포가 대장균과 같은 박테리아인 경우에, 예를 들면, 물리적으로, 화학적으로 또는 효소학적으로 용해될 수 있으며, 단백질 산물은 생성된 용해물로부터 분리될 수 있다. 숙주 세포가 포유류인 경우에, 산물은 일반적으로 영양 배지 또는 무세포 추출액으로부터 분리될 수 있다. 숙주 세포가 사카로마이세스 세레비지애 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastors)와 같은 효모인 경우에, 산물은 일반적으로 용해된 세포 또는 배양 배지로부터 분리된 후, 추가로 통상적인 기술을 이용하여 정제될 수 있다. 발현 시스템의 특이성은 목적 폴리펩티드에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 평가될 수 있다.

통상적인 단백질 분리 기술은 선택적인 침전 흡착 크로마토그래피, 및 단클론 항체 친화성 칼럼을 포함하는 친화성 크로마토그래피를 포함한다.

본 발명은 용이하게 "카세트 발현" 벡터를 제공하는데, 여기에서 수지상 세포에 결합하는 모이어티, 예를 들면, 카세트 발현 벡터에서 적당한 위치에 삽입된 선택된 항원에 대한 코딩 영역에 용이하게 융합될 수 있는 HIV-1 gpl20에 대한 코딩 서열을 포함하는 벡터가 제조된다는 것을 인식할 것이다.

그리하여, 본 발명의 여전히 추가의 양태는 (i) 수지상 세포에 선택적으로 결합하는 모이어티를 코딩하는 부분 및 (ii) 폴리뉴클레오티드가 삽입 지점에 삽입될 때, 핵산 분자는 본 발명의 제 1 양태에 따른 화합물을 코딩하는, 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위한 삽입 지점을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

전형적으로, 상기 핵산 분자는 항원 코딩 영역이 삽입 지점 내로 삽입되면, 융합 폴리펩티드의 발현을 허용하는 적당한 전사 및 번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터의 형태를 취한다. 당업계에 주지된 바와 같이, "카세트 발현" 벡터에서 삽입 지점은 인프레임 융합이 생성되도록 적당한 코딩 서열의 삽입을 용이하게 허용하는 것이다(이 경우에 항원을 코딩하는 것). 전형적으로, 상기 삽입 지점은 핵산 내에 유일한 제한효소 자리이다.

전형적으로, 상기 벡터는 숙주 세포에서 안정하게 혼입되고/되거나 화합물의 고 발현 수준을 제공할 수 있는 것이다. 이는 편리하게는 Invitrogen 사에서 시판하는 pcDNA3.1(+/-His tag) 벡터에 기초할 수 있다.

상기 항원은 이의 N-말단 또는 C-말단의 결합 모이어티에 융합될 수 있으므로, 삽입 지점은 결합 모이어티에 대한 코딩 서열의 5'말단 또는 3'말단에 있을 수 있으며, 적당하게 위치한 적당한 전사 및 번역 신호가 당업자에게 공지될 것이다.

본 발명의 제 1 양태의 화합물은 동물에서 질환에 대한 면역화, 및 치료에 유용하다. 그리하여, 상기 화합물은 백신에 유용하다.

본 발명의 추가의 양태는 의약에 이용하기 위한 본 발명의 제 1 양태에 따른 화합물을 제공한다. 전형적으로, 상기 화합물은 동물에 이용하기 위한 약물로서 포장 및 제공된다.

본 발명의 여전히 추가의 양태는 본 발명의 제 1 양태에 따른 화합물을 포함하는 백신을 제공하는데, 바람직하게는 본 발명의 백신 제형물에서 보조된다. 적당한 보조제는 명반 및 Quil A와 같이 시판된다.

바람직하게는 상기 보조제 조성물은 Thl 유형의 면역 반응을 우세하게 유도한다. 높은 수준의 Th1-유형 시토카인 (예를 들면, IFN-γ, TNFα, IL-2 및 IL-12)은 투여된 항원에 대한 세포 매개 면역 반응의 유도를 지지하는 경향이 있다. 바람직하게는, 상기 화합물은 Thl 및 Th2 반응을 야기할 수 있다.

본 발명의 여전히 추가의 양태는 본 발명의 제 1 양태에 따른 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

상기 담체(들)은 본 발명의 화합물과 상용성인 면에서 "허용가능해야" 하며, 이의 수용자에게 해로워서는 안된다. 전형적으로, 상기 담체는 멸균 및 무발열원인 물 또는 염수일 것이다. 그러나, 기타 허용가능한 담체가 이용될 수 있다.

전형적으로, 본 발명의 약학 조성물 또는 제형물은 비경구 투여용, 더욱 특히 정맥내 투여용이다. 상기 조성물 또는 제형물은 하기 경로에 의해 투여될 수 있다: 근육내, 피하, 피부내, 비강내, 정맥내, 경구, 및 복막내. 근육내는 수의사에 대한 가장 실제적인 방식이므로 가장 바람직하다.

비경구 투여에 적합한 제형물은 항산화제, 완충액, 정균제 및 제형물을 의도된 수용자의 혈액과 등장이게 하는 용질을 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사액; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 제 1 양태에 따른 화합물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 질환에 대해 동물을 면역화하는 방법을 제공한다.

투여된 화합물이 (i) 면역화되는 동물(동물에 외래인 적당한 결합 모이어티가 선택될 수 있도록) 및 면역화되는 질환(적당한 항원이 선택될 수 있도록)에 기초하여 선택된다는 것을 인식할 것이다.

그리하여, 본 발명의 특히 바람직한 구현예는 (i) 동물에서 수지상 세포에 선택적으로 결합하나, 상기 동물에서 자연적으로 발생하지는 않는 모이어티 및 (ii) 상기 질환과 관련된 항원을 포함하는 화합물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 질환에 대해 동물을 면역화하는 방법이다.

상기 방법 및 조성물은 동물, 바람직하게는 암소, 양, 염소, 돼지, 말 및 토끼와 같은 가축 및 고양이 및 개와 같은 반려 동물을 포함하는, 경제적으로 중요한 동물을 면역 및 보호하는 것일 수 있다. 이용된 항원의 유형에 의존하여, 상기 항원을 이용한 동물의 면역화는 감염의 예방, 증상의 개량, 사망률의 감소 및/또는 중화 항체의 유도를 초래할 수 있다.

그리하여, 본 발명은 또한 본 발명의 제 1 양태에 따른 화합물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 동물에서 질환과 싸우는 방법을 제공한다.

특히 바람직한 구현예는 (i) 동물에서 수지상 세포에 선택적으로 결합하나, 상기 동물에서 자연적으로 발생하지는 않는 모이어티 및 (ii) 상기 질환과 관련된 항원을 포함하는 화합물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 동물에서 질환과 싸우는 방법이다.

전형적으로, 상기 화합물은 면역원성 조성물로서 투여된다.

본 발명의 방법에 따라 면역화되거나 싸울 수 있는 질환은 BVDV, RSV 및 소 백혈병 바이러스를 포함하며, 적당한 항원이 예를 들면, BVDV E2 단백질, RSV F 및 G 단백질 및 소 백혈병 바이러스의 gp51로부터 선택될 수 있다. 그리하여, 본 발명의 화합물은 예방적으로 또는 치료적으로 이용될 수 있다.

전형적으로, 치료되는 질환은 병원균에 의해 야기된 것이다. 그러나, 종양이 또한 치료될 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 종양은 흑색종을 포함한다 (예를 들면, Nestle, F.O. (2002) Clinical & Experimental Dermatology 27(7), 597-601 참고). 전형적으로, 하나의 항원 이상이 효과적이기 위해 필요할 수 있다. 이는 예방접종을 위해 동일한 화합물 또는 별개의 상기 화합물에서 조합될 수 있다. 전형적으로, 상기 항원은 [Nestle (2002) 이하 동일]에 기재된 돌연변이된 항원 (예를 들면, 돌연변이된 pl6 (CDKN2A)), 공유된 종양 특이적 항원 (예를 들면, MAGE-1, MAGE-3 및 NY-ESO-1), 분화 항원 (예를 들면, 티로시나아제, gplO0 및 MelanA/MART-1) 또는 세포 표면 강글리오시드 (예를 들면, GM2, GD2 및 GD3)일 수 있다.

용어 "종양"은 폐, 간, 혈액 세포, 피부, 췌장, 위, 직장, 전립선, 자궁, 유방, 림프샘 및 방광의 종양을 포함하는 종양 세포 성장의 모든 형태를 언급하는 것으로 이해되어야 한다. 고형 종양은 특히 적합하다.

본 발명의 여전히 추가의 양태는 동물에서 질환과 싸우기 위한 약물의 제조시; 또는 동물을 면역화하기 위한 백신의 제조시 본 발명의 제 1 양태에 따른 화합물의 용도를 제공한다.

특히 바람직한 구현예는 동물에서 질환과 싸우기 위한 약물의 제조시 (i) 동물에서 수지상 세포에 선택적으로 결합하나, 상기 동물에서 자연적으로 발생하지는 않는 모이어티 및 (ii) 상기 동물에서 상기 질환과 관련된 항원을 포함하는 화합물의 용도; 및 동물을 면역화하기 위한 백신의 제조시 (i) 동물에서 수지상 세포에 선택적으로 결합하나, 상기 동물에서 자연적으로 발생하지는 않는 모이어티 및 (ii) 상기 동물에서 질환과 관련된 항원을 포함하는 화합물의 용도를 포함한다.

본 발명은 특히 항원과 관련된 질환과 싸우기 위한 약물의 제조시 또는 상기 항원과 관련된 질환에 대한 동물을 면역화하기 위한 백신의 제조시 (i) 임의의 HIV gpl20, 결핵균의 LAM 단백질 또는 에볼라 바이러스의 당단백질, 또는 이의 부분으로부터 선택된 모이어티, 및 (ii) 항원을 포함하는 동물의 예방접종용 화합물의 용도를 포함한다.

본 발명의 방법을 이용하여 예방접종된 동물은 본 발명의 화합물의 항원이 관련된 질환 물질로 자연적으로 감염된 동물과 구별될 수 있는데, 이는 예방접종된 동물이 수지상 세포에 결합하는 모이어티에 대한 면역 반응을 가지는 반면, 자연적으로 감염된 동물은 가지지 않을 것이기 때문이다.

그리하여, 본 발명의 추가의 양태는 동물이 본 발명의 제 1 양태에 따른 화합물이 투여되었는지를 결정하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 동물이 수지상 세포에 선택적으로 결합하는 모이어티에 대한 면역 반응을 가지는지를 결정하는 단계를 포함한다. 또한 동물이 화합물에 존재하는 항원에 대한 면역 반응을 가지는지를 결정하는 것이 유용할 수 있다.

전형적으로, 항체 함유 시료를 상기 동물로부터 취하고, 상기 모이어티에 지정된 항체가 존재하는지를 결정한다. 상기 항원에 지정된 항체가 존재하는가가 또한 결정될 수 있다. 전형적으로, 상기 시료는 혈액 시료이다. 전형적으로, 상기 혈액 시료는 동물의 목정맥 또는 꼬리 정맥으로부터 수득된다.

본 발명은 또한 자연적으로 감염된 동물 및 본 발명의 제 1 양태의 화합물로 투여된 동물 사이를 구별하기 위해 이용될 수 있는 부품 키트를 제공한다.

부품의 하나의 키트는 (i) 본 발명의 제 1 양태에 따른 화합물 및 (ii) 수지상 세포에 선택적으로 결합하는 화합물에 존재하는 모이어티에 대한 면역 반응을 검출하는 수단, 및/또는 (iii) 상기 화합물에서 항원에 대한 면역 반응을 검출하는 수단을 포함한다.

부품의 추가의 키트는 (i) 동물 질환 항원에 대한 면역 반응을 검출하는 수단 및 (ii) 수지상 세포에 선택적으로 결합하는 모이어티에 대한 면역 반응을 검출하는 수단을 포함한다.

바람직한 구현예에서, 상기 결합 모이어티는 HIV-1 gpl20, 또는 이의 부분이다.

전형적으로, 면역 반응은 동물 유래의 시료가 적절한 항체(즉, 항원 및/또는 결합 모이어티에 대한)를 포함할지 여부를 결정함으로써 검출된다.

그리하여, 면역 반응(들)을 검출하는 적당한 수단은 항체 반응을 측정하기 위해 ELISA를 이용하는 것을 포함한다. gpl20 항체 반응을 측정하는 ELISA는 시판되는데, 예를 들면, Advanced BioSciences Laboratories Ltd 또는 ImmunoDiagnostics Inc 사 유래이다.

본원에 언급된 모든 문헌은 전체적으로 참고로 포함된다. 본 명세서에서 이전 공개된 문헌의 열거 또는 논의는 상기 문헌이 선행 기술의 부분 또는 통상적인 일반 지식이라는 인식으로서 반드시 고려되어서는 안된다.

도 1은 소 DC-SIGN 변이체 1을 코딩하는 부분적인 cDNA 서열(서열번호 1)을 보여준다. 문자 "n"은 임의의 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 A, G, C 또는 T를 의미한다.

도 2는 Scientific and Educational Software 사의 SE Central 서열 분석 패키지 (Align Plus and Clone Manager)를 이용하여 침팬지, 팬(Pan), 인간, 원숭이 및 마우스 (각각 서열번호 2-5) 유래의 DC-SIGN을 코딩하는 cDNA 서열의 정렬을 보여준다.

정렬, 변수 및 세팅을 표시한다. 대시 기호는 뉴클레오티드가 없다는 것을 나타낸다.

도 3은 침팬지, 인간 및 원숭이 유래의 DC-SIGN의 아미노산 서열(서열번호 7-9)에 대한 소 DC-SIGN 변이체 1의 연역된 부분적인 아미노산 서열(서열번호 6)의 정렬을 보여준다. 대시 기호는 아미노산이 없다는 것을 나타낸다. 소 DC-SIGN 아미노산 서열에서 별표는 할당되지 않은 아미노산이다. SE Central 서열 분석 패키지를 이용하여 정렬을 수행하였다. 상기 정렬 변수는 하기이다: 기준 분자에 대한 Global 단백질 정렬; 변수: 스코어링 매트릭스: BLOSUM 62; 기준 분자 가상적인 boDC-SIGN, 영역 1-577; 정렬 4에 대한 서열 수. 가상적인 boDC-SIGN 192 아미노산; 침팬지_DC-SIGN 404 아미노산; huDC_SIGN_CDS 405 아미노산; 히말라야원숭이_CDS 405 아미노산.

도 4는 소 DC에 대한 HIV gpl20-FITC의 결합을 보여주는 그래프이다. 세포를 미처리 상태로 두거나 또는 60분 동안 gpl20-FITC를 이용하여 4℃ 또는 37℃에서 인큐베이션하고, 유세포 검사로 분석하였다.

도 5는 인간 DC-SIGN 분자에 대해 생성된 다클론 항체를 이용한 인간 단핵구 유래 대식세포, 인간 단핵구 유래 수지상 세포 및 소 단핵구 유래 수지상 세포의 염색 패턴을 보여준다.

도 6은 소 DC-SIGN, 변이체 2을 코딩하는 부분적인 cDNA 서열(서열번호 10)을 보여준다.

도 7은 인간 DC-SIGN, 뮤린 DC-SIGN, 및 소 DC-SIGN의 2개의 변이체의 아미노산 서열 (각각 서열번호 11-14)의 CLUSTAL W (1.7) 정렬을 보여준다. 대시 기호는 부합하는 잔기가 없다는 것을 나타낸다.

실시예 1: 소 세포 상에 DC-SIGN에 결합하는 gpl20 단백질의 능력

HIV gp120-FITC 단백질 (Cat No 1021-F 및 1001-F, Immuno Diagnostic Inc., Woburn, USA)이 소 DC에 결합한다는 것을 유세포 검사에 의해 보여주었다. 1시간 동안 4℃에서 HIV gp120-FITC의 인큐베이션은 낮은 수준의 결합을 유도하였으나, 이는 37℃에서 인큐베이션에 의해 증가하였다 (도 4).

더욱이, 인간 DC-SIGN 분자에 대해 생성된 토끼 항-인간 다클론 항체(Dr. T. Geijtenbeck 에 의해 친절하게 제공됨(Department of Molecular Cell Biology, Medical Faculty, Vrije Universiteit Amsterdam))는 공초점 레이저 주사현미경 검 사에 의해 인간 DC(도 5)보다 더 적은 정도로 소 DC(도 5)를 염색하는 것으로 나타났다.

소 세포 상에서 DC-SIGN에 결합하는 HIV-1 gp120 단백질의 능력을 평가하기 위해, 상기 단백질을 코딩하는 cDNA를 His-tag (즉, 올리고 히스티딘 태그)를 포함하는 발현 벡터 내로 클로닝한다. 대조군으로서, DC-SIGN에 결합하지 않는 것으로 알려진 무관한 His-태깅된 단백질, 예를 들면, FITC-표지된 오발부민(OVA)을 이용한다. DC에 의한 gp120-His의 흡수를 추적하기 위해, DC 배양물을 제조하고, 4개 그룹의 세포로 나누었다. 제 1 (실험군) 및 제 2 (대조군) 그룹을 2시간 동안 gpl20-His 또는 무관한 His-태깅된 단백질을 이용하여 펄스하고, 세정하였다. 제 3 (음성 대조군) 그룹을 단지 성장 배지로 처리한 반면, 제 4 그룹 (흡수 대조군)을 항원을 흡수하는 DC의 능력에 대한 기능적 대조군으로서 FITC-표지된 항원 (이 경우에 OVA)을 흡수하는 DC의 능력을 입증하기 위해 이용한다. 이어서, 모든 그룹의 세포를 FITC-표지된 항-His 항체를 이용한 공초점 형광 현미경 관찰에 의해 단백질의 세포 위치화 패턴을 관찰하기 위해 이용한다. 최종적으로, 다클론 항체를 DC-SIGN을 봉쇄하기 위해 상기 항체와 DC를 미리 인큐베이션함으로써 DC-SIGN을 통한 gpl20-His 흡수의 특이성을 보여주기 위해 소 DC-SIGN 분자에 대해 생성한다. DC-SIGN의 봉쇄는 gpl20-His의 흡수를 감소시켜야 하나, 임의의 다른 분자 또는 대조군은 아니다.

부가적으로 또는 대안적으로, 소 세포 상에서 DC-SIGN에 결합하는 gpl20 단백질의 능력을 평가하기 위해, 상기 단백질을 코딩하는 cDNA를 RT-PCR 및 NIH AIDS 시약 프로그램으로부터 수득된 구축물을 이용한 방향성 클로닝 접근을 이용하여 His-tag를 포함하는 발현 벡터 내로 클로닝한다. 생성된 플라스미드를 이용하여 COS-7 세포를 트랜스펙션하고, 발현된 단백질을 분자량 컷오프 스핀 칼럼 또는 His-tag 정제 칼럼을 이용하여 세포 상층액 및/또는 세포 용해액으로부터 농축한다. gpl20-His의 존재는 항-His 항체을 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 평가한다. 소 DC에 의한 gpl20-His의 흡수를 추적하기 위해, DC 배양액을 제조하고, 3개 그룹의 세포로 나누었다. 제 1 (실험군) 및 제 2 (대조군) 그룹을 gpl20-His 또는 빈 플라스미드로 트랜스펙션된 COS-7 세포로부터 유래된 상층액으로 2시간 동안 펄스하고, 세정한다. 제 3 그룹 (흡수 대조군; 이 경우에 FITC-OVA)은 항원을 흡수하는 DC의 능력을 입증할 기능적 대조군으로서 이용될 것이다 (Werling, D et al (1999) J Leukoc Biol 66: 50-58). 이어서, 모든 그룹의 세포를 흡수된 단백질의 양을 관찰하거나 또는 유세포 검사 및 공초점 형광 현미경 검사에 의한 단백질의 세포 위치화를 확인하기 위해 이용한다. FITC-표지된 항 His 항체를 이용하여 gpl20-His를 검출한다. 게다가, 인간 DC-SIGN 분자로 안정하게 트랜스펙션된 COS-7 세포를 양성 대조군으로서 이용한다.

결과

공개된 DC-SIGN 서열에 대한 현재의 유사성에 기초하여, gpl20-His이 결합하고, 이어서 소 DC-SIGN 분자를 통해 내재화되며, 상기 결합/흡수는 다클론 항체에 의해 봉쇄되는 반면, 이는 이용된 대조군에는 영향이 없다는 것을 기대한다.

논의

결합된 및 내재화된 gp120-His 사이를 구별하기 위해, 상기 세포에 의해 흡수된 gp120-His의 양을 측정할 수 있으며, 세포는 표면에 결합되나, 내재화되지 않는 gpl20-His를 분해하기 위해 EDTA-트립신 용액으로 처리될 것이다. 그 후에, 세포 및 세포질 추출액을 His-tag 또는 직접 gpl20 단백질에 대한 단클론 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 gpl20-His의 존재에 대해 분석할 수 있다. gpl20-His의 성공적인 흡수시, gpl20은 추가의 연구에 이용될 모델-항원(즉, 소 호흡기세포융합바이러스의 외피 단백질 또는 소 바이러스성 설사 바이러스 E2 단백질)과 함께 발현된다(단순화를 위해, 상기 생성물을 gpl20-Ag으로 명명한다).

실시예 2: 항원- 펄스된 DC에 의한 Th1 -유형 면역 반응의 증진된 발생

최근의 데이타는 Toll 유사 수용체 (TLR) 또는 DC-SIGN과 같은 패턴 인식 수용체를 통한 항원의 흡수는 항원-펄스된 DC에 의해 방출되는 IFNα 및 IL-12와의 면역 반응의 Thl-유형의 발생을 강하게 증진시킨다는 것을 강조한다. 상기 시토카인의 방출은 세포 매개 면역의 발생을 지지한다.

TLR에 결합하는 것으로 알려진 하나의 항원은 호흡기세포융합바이러스 (RSV)의 F 단백질이며, 상기 결합은 IL-12의 유도를 초래한다 (Haeberle, HA et al (2002) J Infect Dis 186: 1199-1206; Haynes, LM et al (2001) J Virol 75: 10730-10737; 및 Kurt-Jones, EA et al (2000) Nat Immunol 1: 398-401). RSV는 소 및 인간을 포함하는 수 개의 종의 신생아에서 하기도 감염의 주요 원인이므로, RSV F 단백질은 모델 항원으로서 상기 실험에 이용될 것이다.

HIV gpl20 (실험 1에서 생성됨), RSV F 단백질 (Dr Geraldine Taylor가 친절하게 제공함, Institute for Animal Health, Compton), 또는 gpl20/F 단백질의 융합 단백질(실험 1에서 생성됨)을 포함하는 His-태깅된 발현 벡터를 이용하여 COS-7 세포를 트랜스펙션한다. 72 시간 후에, His-태깅된 단백질을 니켈-아가로오스를 이용하여 세포 상층액뿐만 아니라 용해된 세포로부터 수확하며, 이의 존재를 항-His-항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석한다.

소 DC에 대한 gpl20-His, F-단백질-His 또는 gpl20-Ag의 효과를 증명하기 위해, 세포를 상이한 투여량의 각각의 정제된 단백질로 2시간 동안 인큐베이션한다. 상기 시간 후에, 상층액을 수확하고, ELISA-시스템을 이용하여 IFNα, IL-10 및 IL-12의 존재에 대해 분석한다 (Werling, D et al (2004) Immunology 111: 41-52).

결과

gpl20-His 또는 gpl20-Ag에 노출된 DC에 의해 방출된 IFNα 및 IL-12의 양은 gpl20-His에 동일한 시간 및 양에 노출된 말초혈 림프구 또는 대식세포에 의해 제조된 것보다 커야 한다는 것이 기대된다. 더욱이, gpl20-His 단독으로 IL-10의 생산을 초래하며, F-단백질-His는 주로 IL-12의 생산을 초래하며, gpl20-Ag는 IL-12의 매우 강한 방출을 초래할 것이라는 것이 기대된다.

실시예 3: DC에 의한 신생 T-세포의 촉진

대식세포 및 B 세포와 같은 기타 항원 제시 세포 (APC)와 대조적으로, DC는 신생 T 세포를 촉진하며, 더 강한 기억 T 세포 반응을 촉진하는 독특한 능력을 가 진다 (Werling et al (1999); Werling, D et al(2002) J Leukoc Biol 72: 297-304). gpl20-Ag 펄스된 DC의 촉진 능력을 평가하기 위해, 신생뿐만 아니라 기억 T 세포를 촉진할 수 있는지를 평가하기 위해, 상이한 서브셋의 APC를 생성하고 (Werling et al (2002)), 상이한 시간(0-6h) 동안 gpl20-Ag와 인큐베이션하였다. 상기 시간 후에, DC를 미토마이신-D에 노출에 의해 불활성화하고, 동일한 공여자의 분류된 CD4+ T 세포에 다양한 비율로 첨가한다. 배양에서 5일 후에, gpl20-Ag 펄스된 DC, 대식세포 및 B 세포의 촉진 능력을 베타-계수기를 이용한 액체 섬광 계수법에 의해 증식하는 T 세포의 DNA에 혼입된 [³H]-표지된 티미딘의 양을 측정함으로써 평가한다.

유사한 실험을 BRSV-면역화된 소로부터 생성된 APC 및 T 세포를 이용하여 수행하여, 기억 T 세포 반응을 촉진하는 APC 서브셋의 특성을 평가한다 (면역화된 동물에 대한 접근은 Dr Geraldine Taylor, Institute for Animal Health, Compton을 통해 존재한다).

결과

강한 T 세포 증식은 단지 DC의 존재하에 관찰되나, 대식세포 또는 B 세포에서는 관찰되지 않는다는(10배 더 낮은 반응을 보여줌) 것을 기대한다.

또한, 단지 gpl20-Ag으로 펄스된 DC는 신생 T 세포의 증식을 촉진하고, BRSV 면역화된 동물 유래의 T 세포와 함께 배양될 때 기타 APC보다 10배 강한 증식 반응을 유도할 것이라는 것을 기대한다.

실시예 4: HIV-1 결합의 결과로서 DC-SIGN의 세포내이입

인간 시스템에서, HIV-1 결합의 결과로서 DC-SIGN의 세포내이입은 DC 표면 상의 DC-SIGN 분자의 수를 감소시킨다. 특이적인 단클론 항-DC-SIGN 항체를 표준 방법에 의해 마우스에서 생성하거나 또는 다클론 항-DC-SIGN 항체를 표준 방법에 의해 토끼에서 생성하고, DC-SIGN에 대한 gpl20-Ag 또는 gpl20-His 결합을 방해하는지를 시험한다. 비방해 항체 및 형광-태깅된 이차 항-마우스 항체를 이용하여 형광 활성 세포 선별 (FACS)의 도움으로 DC의 표면 상에 DC-SIGN 발현을 정량한다 (음성 대조군으로서, 빈 플라스미드로 트랜스펙션된 COS-7 세포의 상층액 또는 gpl20-Ag 배지로 펄스됨). 상기 측정을 2시간 동안 gpl20-Ag 또는 gpl20-His로 펄스 후에 유사한 그룹의 DC 상에서 반복한다 (실험군).

충분한 양의 gpl20-Ag는 DC-SIGN 결합의 가능성 및 내재화를 증가시키기 위해 이용되어야 한다.

결과

실험군에서 표면 DC-SIGN의 양이 대조군의 것과 유사하다면, 아마도 DC-SIGN의 어떤 현저한 세포내이입도 일어나지 않으므로, DC-SIGN 결합된 항원이 분해로부터 보호되며, 가공되지 않는다는 이론을 지지한다는 것을 기대한다. 표면 DC-SIGN 발현이 gpl20-Ag 결합시 감소된다면, DC-SIGN은 DC에 의해 가장 세포내이입되므로, MHC 클래스 II (및 MHC 클래스 I) 분자를 통한 T 세포에 대한 제시를 위해 단백질의 가공을 허용하는 세포 내의 세포내이입 구획으로 전달될 것이다. 이는 T 세포 의 증식 반응을 초래할 것이다.

면역 반응이 일어나는 것이 세포내이입에 필요하다.

DC-SIGN의 봉쇄는 gpl20-His의 흡수를 감소시켜야 하나, 기타 분자에 대해서는 아니다.

잠재적으로 유용한 대조군은 예를 들면, 간단한 트립신 처리의 결과로 표면 DC-SIGN이 없는 DC, 및 DC-SIGN의 세포내이입을 야기하는 물질(양성 대조군)을 포함한다.

실시예 5: 동물에서 gpl20 - Ag 면역화의 효과

동물에서 gpl20-Ag 면역화의 효과를 증명하기 위해, 소를 상이한 투여량의 gpl20-Ag로 면역화하고, F-단백질 또는 gpl20과 같은 항원에 대한 항체 반응의 발생을 특이적인 Ag에 대해 유용한 ELISA-시스템을 이용하여 분석한다. 적당한 ELISA 시스템은 gpl20 및 RSV-F 단백질에 대해 시판된다. 4 그룹의 동물을 담체 용액 단독, 정제된 gp120-His, 정제된 F-단백질-His, 또는 gp120-Ag로 면역화한다. 혈액 시료를 면역화 전후로 주간 단위로 취하고, 항체 역가를 혈청 시료에서 측정한다.

결과

gpl20-Ag로 면역화된 동물이 F 단백질과 같은 목적 Ag뿐만 아니라 gpl20 양자에 대한 항체를 발생할 것이라는 것을 기대한다. Ag-특이적 항체 및 gpl20-특이적 항체 사이의 관계를 평가하기 위해, gpl20-His로 면역화된 동물의 항체-역가를 대조군으로 이용하여, 흡수되고 제시된 gpl20-Ag 의 효율을 증명하는 데이타를 확립한다.

전형적으로, gpl20-Ag로 면역화된 동물에서 gpl20에 대한 항체 역가는 개개 동물의 성공적인 면역화에 대한 직접적인 지표로서 이용될 수 있으며, 또한 자연적으로 감염된 동물에 대한 면역화된 동물의 구분을 허용할 것이다.

실시예 6: 항원으로 성공적으로 면역화된 동물의 챌린징

동물의 성공적인 면역화를 확립하였으므로, 동일한 그룹의 동물을 RSV F 단백질 (또는 전체 RSV)과 같은 항원으로 챌린지하고, 임상 징후의 발생을 모니터링하였다.

결과

F 단백질이 RSV의 주요 항원 중의 하나이므로, 면역화된 동물이 이은 챌린지에 대해 방어를 가져야 하며, 임의의 임상 증상을 발생해서는 안되는 반면, gpl20-His 또는 담체 용액이 제공된 동물은 그렇게 해야한다는 것을 기대한다.

실시예 7: 소 DC-SIGN cDNA 서열의 수득

소 수지상 세포를 [Werling et al (2002) J. Leukoc. Biol. 72, 297-304]의 절차에 따라 분리하고, mRNA를 분리하였다. Becton Dickinson 사의 SMART^TM RACE cDNA 증폭 키트 (Cat. No. K1811-1)를 이용하고, 프라이머 TAGCTGACTCCTTGTCCAAGTG 를 이용하여 cDNA를 증폭하였다. 변이체 1로서 언급된 증폭된 cDNA를 시퀀싱하고, 뉴클레오티드 서열을 도 1에 제공한다.

변이체 2로서 언급된 추가의 부분적인 소 DC-SIGN cDNA 서열을 뮤린 및 인간 DC-SIGN 분자(각각 GenBank 등록 번호 AF373408 및 NM_021155) 사이에 공유된 유사성에 기초한 축퇴 프라이머를 이용하여 수득하였다. 소 DC-SIGN의 변이체 2의 부분적인 cDNA 서열을 도 6에 제공한다.

변이체 소 DC-SIGN cDNA 서열의 양자는 C-유형 렉틴 수용체를 코딩하며, 염기쌍 및/또는 아미노산 서열에 대해 해당하는 뮤린 및 인간 서열과 89% 이하의 유사성을 공유한다 (도 7).

도 7은 인간 DC-SIGN(NM_021155_AA), 뮤린 DC-SIGN(muDC-SIG_AA), 및 소 DC-SIGN의 2개의 변이체 (boDC-SIGN 변이체1/2_AA)의 아미노산 서열의 Clustal W 정렬을 보여준다. 대시 기호는 부합하는 잔기가 없다는 것을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> THE ROYAL VETERINARY COLLEGE <120> ANTIGEN DELIVERY SYSTEM <130> RVCV/P31262PC <140> PCT/GB2004/003386 <141> 2004-08-05 <150> GB 0318247.4 <151> 2003-08-05 <160> 14 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 577 <212> DNA <213> Bos taurus <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> N can be A, C, G or T <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> N can be A, C, G or T <220> <221> misc_feature <222> (189)..(189) <223> N can be A, C, G or T <220> <221> misc_feature <222> (258)..(258) <223> N can be A, C, G or T <220> <221> misc_feature <222> (289)..(289) <223> N can be A, C, G or T <220> <221> misc_feature <222> (357)..(357) <223> N can be A, C, G or T <400> 1 ctccttgtcc aagtgtccaa ggtccccagc tccntaagtc aggaacaatc cangcaagac 60 gcgatctacc agaacctgac ccagcttaaa gctgcagtgg gtgagctctc agagaaatcc 120 aagctgcagg agatctacca ggagctgacc cagctgaagg ctgcagtggg tgagcttcca 180 gagaaatcna agcagcagga gatctaccag gagctgaccc ggctgaaggc tgcagtgggt 240 gagcttccag agaaatcnaa 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tgctgacatc cagccacacc aggcactcca tcaaaggctt 120 tggcttccaa acaaattctg gattcagtag cttcacaggg tgcctggtcc acagtcaagt 180 ccccttggca ctgcaggtgc tcttcctagc tgtttgttct gtgctgctgg ttgtcatcct 240 tgtcaaagtc tacaaaatac ccagttctca ggaagaaaac aatcagatga atgtctacca 300 agaactgacc cagttgaagg ctggcgtaga tcgactgtgc cgctcctgcc cctgggactg 360 gacgcacttc caaggaagct gttacttctt ctctgtggcc cagaagtcct ggaatgattc 420 tgccactgcc tgccacaatg tgggggctca acttgtggtc atcaagagtg atgaagagca 480 gaactttcta caacaaactt ctaagaagag aggctacact tggatggggc tcattgacat 540 gagcaaggag tctacatggt actgggtaga tggttcacct ctgactctca gtttcatgaa 600 gtattggagt aaaggagaac ctaacaacct gggagaggaa gactgtgcag agttcagaga 660 tgacggctgg aatgacacca aatgtactaa caagaaattc tggatctgca aaaagctttc 720 aacttcctgc cctagcaagt gatggccaac tccctccacc atctccacag tcccaaaacc 780 ctgccaaatg gcagaacttt acccatagct atgccagttt attctacttg tctgtgacca 840 ttgataacct tgacaagatc tgtaagactt tattctggca ggtagcttgt ctcctgcatt 900 gctcctaggt ccagtttgtc tcctggacca ttaatgtata gtctcctgat gtctgcaggt 960 tctctttggg ttagtggttg tggctctggt ccacctttga catttaatga agtaaacaga 1020 catgaggtgt ccttaaatgg gttcctttca tctcctctgt cttcctttct gagtagagac 1080 cacatattgc catgtgcaat tgatcctgag tactcacacc tactaaattt taattcatct 1140 accctgcaca cctttttatg ggacccttct ttgatttcag gagctcaccc tatagactaa 1200 aagcacaaga gacccaattc cttaactatt agtcatgatc agaaattatt gtgttaattc 1260 tctgactcca tctctacccc tgggtggaca tggtgagcct caatgttata gacctcccaa 1320 attttttgga ggatttataa tttttattga acttactcat taacaattgt atacatatgt 1380 atgtataaat ataagtataa ataaccattt tgatttttgc catcctccaa aaaaaaaaaa 1440 aaaaaaaaaa 1450 <210> 6 <211> 192 <212> PRT <213> Bos taurus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Unalloacted amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Unalloacted amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (63)..(63) <223> Unalloacted amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (86)..(86) <223> Unalloacted amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(97) <223> 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Ser Lys Met Gln 130 135 140 Glu Ile Tyr Gln Glu Leu Thr Arg Leu Lys Ala Ala Val Gly Glu Leu 145 150 155 160 Pro Glu Lys Ser Lys Met Gln Glu Ile Tyr Gln Glu Leu Thr Arg Leu 165 170 175 Lys Ala Ala Val Gly Glu Leu Pro Glu Lys Ser Lys Gln Gln Glu Ile 180 185 190 Tyr Gln Glu Leu Thr Arg Leu Lys Ala Ala Val Gly Glu Leu Pro Glu 195 200 205 Lys Ser Lys Gln Gln Glu Ile Tyr Gln Glu Leu Thr Arg Leu Lys Ala 210 215 220 Ala Val Gly Glu Leu Pro Glu Lys Ser Lys Gln Gln Glu Ile Tyr Gln 225 230 235 240 Glu Leu Thr Gln Leu Lys Ala Ala Val Glu Arg Leu Cys Arg Arg Cys 245 250 255 Pro Trp Glu Trp Thr Phe Phe Gln Gly Asn Cys Tyr Phe Met Ser Asn 260 265 270 Ser Gln Arg Asn Trp His Asp Ser Ile Thr Ala Cys Lys Glu Val Gly 275 280 285 Ala Gln Leu Val Val Ile Lys Ser Ala Glu Glu Gln Asn Phe Leu Gln 290 295 300 Leu Gln Ser Ser Arg Ser Asn Arg Phe Thr Trp Met Gly Leu Ser Asp 305 310 315 320 Leu Asn Glu Glu Gly Thr Trp Gln Trp Val Asp Gly Ser Pro Leu Leu 325 330 335 Pro Ser Phe Asn Gln Tyr Trp Asn Arg Gly Glu Pro 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Glu Glu Asp Cys Ala Glu Phe Ser Gly Asn Gly Trp Asn Asp Asp Lys 355 360 365 Cys Asn Leu Ala Lys Phe Trp Ile Cys Lys Lys Ser Ala Ala Ser Cys 370 375 380 Ser Arg Asp Glu Glu Gln Phe Leu Ser Pro Ala Pro Ala Thr Pro Asn 385 390 395 400 Pro Pro Pro Ala <210> 9 <211> 404 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 9 Met Ser Asp Ser Lys Glu Pro Arg Leu Gln Gln Leu Asp Leu Leu Glu 1 5 10 15 Glu Glu Gln Leu Gly Gly Val Gly Phe Arg Gln Thr Arg Gly Tyr Lys 20 25 30 Ser Leu Ala Gly Cys Leu Gly His Gly Pro Leu Val Leu Gln Leu Leu 35 40 45 Ser Phe Thr Leu Leu Ala Gly Leu Leu Val Gln Val Ser Lys Val Pro 50 55 60 Ser Ser Leu Ser Gln Gly Gln Ser Lys Gln Asp Ala Ile Tyr Gln Asn 65 70 75 80 Leu Thr Gln Leu Lys Val Ala Val Ser Glu Leu Ser Glu Lys Ser Lys 85 90 95 Gln Gln Glu Ile Tyr Gln Glu Leu Thr Arg Leu Lys Ala Ala Val Asp 100 105 110 Glu Leu Pro Glu Lys Ser Lys Gln Gln Glu Ile Tyr Glu Glu Leu Thr 115 120 125 Arg Leu Lys Ala Ala Val Gly Glu Leu Pro Glu Lys Ser Lys Leu Gln 130 135 140 Glu Ile Tyr Gln Glu Leu 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tgtccaactc agcttctgga aaaaagggga gcccaacaac 660 cacggagatg aggactgtgt ggaactgcac aacgatggct ggaatgatgg cagatgtgtt 720 acagaaaacc cctggatctg tgagaagccc tcg 753 <210> 11 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Trp Gly Asp Met Ser Asp Ser Lys Glu Pro Arg Leu Gln Gln Leu Gly 1 5 10 15 Leu Leu Glu Glu Glu Gln Leu Arg Gly Leu Gly Phe Arg Gln Thr Arg 20 25 30 Gly Tyr Lys Ser Leu Ala Gly Cys Leu Gly His Gly Pro Leu Val Leu 35 40 45 Gln Leu Leu Ser Phe Thr Leu Leu Ala Gly Leu Leu Val Gln Val Ser 50 55 60 Lys Val Pro Ser Ser Ile Ser Gln Glu Gln Ser Arg Gln Asp Ala Ile 65 70 75 80 Tyr Gln Asn Leu Thr Gln Leu Lys Ala Ala Val Gly Glu Leu Ser Glu 85 90 95 Lys Ser Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Gln Glu Leu Thr Gln Leu Lys Ala 100 105 110 Ala Val Gly Glu Leu Pro Glu Lys Ser Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Gln 115 120 125 Glu Leu Thr Arg Leu Lys Ala Ala Val Gly Glu Leu Pro Glu Lys Ser 130 135 140 Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Gln Glu Leu Thr Trp Leu Lys Ala Ala Val 145 150 155 160 Gly Glu Leu Pro Glu Lys Ser Lys 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Claims

(i) 동물에서 수지상 세포에 선택적으로 결합하나, 상기 동물에서 자연적으로 발생하지 않는 모이어티 및 (ii) 항원을 포함하는 동물의 예방접종(vaccination)용 화합물.
제 1 항에 있어서,

상기 모이어티는 수지상 세포 상의 패턴 인식 수용체에 선택적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 2 항에 있어서,

상기 패턴 인식 수용체는 DC-SIGN인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

선택적으로 결합하는 상기 모이어티는 단백질인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 4 항에 있어서,

선택적으로 결합하는 상기 모이어티는 HIV gpl20, 결핵균의 LAM 단백질 또는 에볼라 바이러스의 당단백질, 또는 이의 부분 중의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화합물.
(i) HIV gpl20, 결핵균의 LAM 단백질 또는 에볼라 바이러스의 당단백질, 또는 이의 부분으로부터 선택된 모이어티 및 (ii) 항원을 포함하는 동물의 예방접종용 화합물.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 항원은 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 항원은 동물의 질환과 관련된 분자 또는 상기 분자의 부분 또는 변이체인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 항원은 동물의 질환과 관련된 2 이상의 분자 또는 상기 분자의 부분 또는 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,

상기 항원은 병원균의 항원 성분 또는 종양 또는 상기 성분의 항원 부분 또는 변이체인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 10 항에 있어서,

상기 병원균은 임의의 박테리아, 바이러스, 진균, 원생동물 또는 연충인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 11 항에 있어서,

상기 항원은 OIE 리스트 A 질환과 관련된 병원균으로부터 선택된 병원균의 항원 성분, 또는 상기 성분의 부분 또는 변이체인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 모이어티 및 항원은 공유적으로 연결된 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 선택적으로 결합하는 모이어티 및 상기 항원은 각각 폴리펩티드를 포함하며, 양자는 동일한 폴리펩티드 사슬에 존재하는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 14 항에 따른 화합물을 코딩하는 핵산 분자.
제 15 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
제 15 항에 따른 핵산 분자 또는 제 16 항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙 주 세포.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제 15 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 백신.
제 18 항에 있어서,

보조제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
의약에 이용하기 위한 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제 15 항에 따른 핵산 분자.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제 15 항에 따른 핵산 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제 15 항에 따른 핵산 분자를 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 질환에 대해 동물을 면역화하는 방법.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제 15 항에 따른 핵산 분자를 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 동물에서 질환과 싸우는 방법.
제 22 항 또는 제 23 항에 있어서,

상기 질환은 병원균에 의해 야기된 것인 것을 특징으로 하는 방법.
제 24 항에 있어서,

상기 병원균은 임의의 박테리아, 바이러스, 진균, 원생동물 또는 연충인 것을 특징으로 하는 방법.
제 25 항에 있어서,

상기 병원균은 OIE List A 질환과 관련된 것인 것을 특징으로 하는 방법.
제 22 항 또는 제 23 항에 있어서,

상기 동물은 포유류인 것을 특징으로 하는 방법.
제 22 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 동물은 반려 동물 또는 가축인 것을 특징으로 하는 방법.
제 27 항 또는 제 28 항에 있어서,

상기 동물은 암소, 양, 말, 돼지, 염소, 개, 고양이 또는 토끼인 것을 특징으로 하는 방법.
동물에서 질환과 싸우기 위한 약물의 제조시 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제 15 항에 따른 핵산 분자의 용도.
동물을 면역화하기 위한 백신의 제조시 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제 15 항에 따른 핵산 분자의 용도.
제 30 항 또는 제 31 항에 있어서,

상기 질환은 병원균에 의해 야기된 것인 것을 특징으로 하는 용도.
제 32 항에 있어서,

상기 병원균은 임의의 박테리아, 바이러스, 진균, 원생동물 또는 연충인 것을 특징으로 하는 용도.
제 33 항에 있어서,

상기 병원균은 OIE List A 질환과 관련된 것인 것을 특징으로 하는 용도.
제 30 항 또는 제 31 항에 있어서,

상기 동물은 포유류인 것을 특징으로 하는 용도.
제 30 항 또는 제 31 항에 있어서,

상기 동물은 반려 동물 또는 가축인 것을 특징으로 하는 용도.
제 35 항 또는 제 36 항에 있어서,

상기 동물은 암소, 양, 말, 돼지, 염소, 개, 고양이 또는 토끼인 것을 특징으로 하는 용도.
상기 모이어티 및 상기 항원을 연결하는 것을 포함하는 제 1 항 또는 제 6 항에 따른 화합물의 제조 방법.
(i) 폴리펩티드를 발현하는 제 17 항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계 및 (ii) 상기 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 포함하는 제 14 항에 따른 화합물의 제조 방법.
수지상 세포에 선택적으로 결합하는 모이어티를 코딩하는 핵산 분자 및 항원을 코딩하는 핵산 분자를 연결하는 것을 포함하는 제 15 항에 따른 핵산의 제조 방법.
(i) 수지상 세포에 선택적으로 결합하는 모이어티를 코딩하는 부분 및 (ii) 폴리뉴클레오티드가 삽입 지점에 삽입될 때, 핵산 분자는 제 14 항에 따른 화합물 을 코딩하는 것을 특징으로 하는, 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위한 삽입 지점을 포함하는 핵산 분자.
제 41 항에 있어서,

상기 핵산은 수지상 세포 상에서 패턴 인식 수용체에 선택적으로 결합하는 모이어티를 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산.
제 42 항에 있어서,

상기 인식 수용체는 DC-SIGN인 것을 특징으로 하는 핵산.
제 41 항 또는 제 42 항에 있어서,

선택적으로 결합하는 상기 모이어티는 HIV gpl20, 결핵균의 LAM 단백질 또는 에볼라 바이러스의 당단백질 중의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 핵산.
동물이 제 1 항에 따른 화합물이 투여되었는지를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은 동물이 수지상 세포에 선택적으로 결합하는 모이어티에 대한 면역 반응을 가지는지를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
제 45 항에 있어서,

동물이 상기 화합물에 존재하는 항원에 대한 면역 반응을 가지는지를 결정하 는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
(i) 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제 15 항에 따른 핵산 분자 및 (ii) 수지상 세포에 선택적으로 결합하는 화합물에 존재하는 모이어티에 대한 면역 반응을 검출하는 수단, 및/또는 (iii) 상기 화합물에 존재하는 항원에 대한 면역 반응을 검출하는 수단을 포함하는 부품 키트.
제 47 항에 있어서,

존재한다면 부품 (ii)가 상기 모이어티에 대해 생성된 항체에 결합하는 모이어티의 전부, 또는 부분을 포함하며, 부품 (iii)이 상기 항원에 대해 생성된 항체에 결합하는 항원의 전부, 또는 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 부품 키트.
(i) 동물 질환 항원에 대한 면역 반응을 검출하는 수단 및 (ii) 수지상 세포에 선택적으로 결합하는 모이어티에 대한 면역 반응을 검출하는 수단을 포함하는 부품 키트.
제 47 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서,

면역 반응을 검출하는 수단이 ELISA인 것을 특징으로 하는 부품 키트.
예방 접종된 동물이 본원에 기재된 자연적으로 감염된 동물과 구별될 수 있 는 것을 특징으로 하는 동물을 예방접종하는 신규 방법.