DK179025B1 - Fiskevaccine - Google Patents

Abstract

Den foreliggende opfindelse angår veterinærimmunologi, nemlig det immunologiske respons fra fisk over for en virus. Mere specifikt tilvejebringer opfindelsen en epitop fra lakse-a-vira, hvilken epitop er i stand til at fremkalde et virusneutraliserende immunrespons. I særdeleshed angår opfindelsen et polypeptid omfattende en vis aminosyresekvens, et protein omfattende et sådant polypeptid, en bærer omfattende et sådant protein og en fremgangsmåde til at producere antistoffer. Ydermere angår opfindelsen en nukleinsyre, som koder for et sådant polypeptid eller et sådant protein, og en bærer omfattende en sadan nukleinsyre. Opfindelsen angår også en vaccine og et diagnostisk kit omfattende et sådant polypeptid, protein, bærer eller nukleinsyre.

Description

Titøl: Fiskevaccine Døn forøliggøndø opfindølsø angår vøtørinær immunologi, nømlig døt immunologisk© respons fra fisk over for en virus. Mere specifikt tilvejebringer opfindelsen en epitop af lakse-a-vira, hvilken epitop er i stand til at fremkalde et virusneutraliserende immunrespons.

Især angår opfindelsen et polypeptid omfattende en vis aminosyresekvens, et protein omfattende et sådant polypeptid, en bærer omfattende sådant protein og en fremgangsmåde til at producere antistoffer. Yderligere angår opfindelsen en nukleinsyre, som koder for et sådant polypeptid eller et sådant protein og en bærer omfattende en sådan nukleinsyre. Opfindelsen angår også en vaccine og et diagnostisk kit omfattende et sådant polypeptid, protein, bærer eller nukleinsyre.

Fiskeviraene, lakse-pancreas-sygdomsvirus (SPDV) og sovesygevirus (SDV) er blevet beskrevet at tilhøre slægten α-virus i familien Togaviridae (Villoing et al., 2000, J. of Virol., bind 74, side 173-183). De to aquatiske vira er tæt beslægtet og danner en gruppe, som fandtes at være adskilt fra grupperne omkring de Sindbis-lignende og encephalitis-typen af α-vira (Powers et al., 2001, J. of Virol, bind 75, side 10118-10131). De er derfor blevet klassificeret som varianter af arterne lakse-a-vira (SAV) (Weston et al., 2002, J. of Virol., bind 76, side 6155-6163). SDV er blevet isoleret fra ørred i Frankrig og i England (UK) og SPDV fra laks i Irland og England. Også i ørreder og laks fra Norge er SPDV-lignende vira blevet isoleret. Gennem genomisk karakterisering fandtes disse norske isolater imidlertid at være en distinkt undergruppe. Derfor er en underinddeling af SAV-arterne blevet foreslået for nylig (Weston et al., 2005, Dis of Aq. Organ., bind 66, side 105-111; Hodneland et al., 2005, Dis. of Aq. Organ., bind 66, side 11 ΟΙ 20), hvor SAV undertype 1 udgøres af viraene med lighed med SPDV-isolater fra Irland og England, undertype 2 udgøres af SDV-isolaterne, og undertype 3 udgøres af de norske isolater af SPDV.

De tre SAV-undertyper er karakteriseret ved deres referencestamme: for undertype 1: SPDV-isolat F93-125; den genomiske sekvens er tilgængelig under GenBankadgangsnummeret AJ316244, og dets kappeprotein 2 (E2) som: CAC87722, for undertype 2: SDV-isolat S49P; den genomiske sekvens er tilgængelig under GenBankadgangsnummeret: AJ316246 og det E2-protein som: CAB59730, aminosyrerne 357-794, for undertype 3: SPDV-isolat N3; den genomiske sekvens er tilgængelig under GenBankadgangsnummeret: AY604237 og dets E2-protein som:AAU01400, aminosyrerne 353-790.

De strukturelle proteiner i SAV og de gener, som koder disse proteiner, er beskrevet i PCT patentansøgning WO 99/58639.

De tre SAV-undertyper forårsager alle en alvorlig sygdom i laks og ørred om end de specifikke symptomer og deres alvorlighed kan variere med undertypen og fiskearterne. De forskellige isolater er krydsbeskyttende i nogen udstrækning, og antistof mod en af undertyperne viser krydsreaktion med de andre undertyper.

En omfattende oversigt over fiskevacciner til aquakultur er af Sommerset et al., (2005, Expert Rev. Vaccines, bind, 4, side 89-101). Aquakulturindustrien, som producerer laks og ørred, lider betragteligt fra udbrud af SAV, som bevirker reduceret vækst og en mortalitet mellem 10 og 60% af dyrene. Forskning har ført til udvikling af vacciner (EP 712.926), og Norvax® Compact PD, en aktiveret SAV-undertype 1-virusvaccine, er nu kommercielt tilgængelig til immunisering af laks med SPDV. Vacciner baseret på SAV-virale proteiner er også blevet beskrevet (EP 1.075.523).

Disse beskrevne SAV-vacciner, hvor effektive de end er, fordrer imidlertid omhyggelig selektering af en proces til inaktivering af virussen, som ikke formindsker den virale immunogenicitet. Også omhyggelig kvalitetskontrol af den virale inaktiveringsproces fordres for at sikre, at ingen levende virus bliver tilbage. Det samme gælder for underenhedsvacciner baseret på hele proteiner fra en virus, som er isoleret fra virale kulturer. Som følge heraf er produktion af sådanne vacciner noget dyrere.

En forbedring er produktionen af underenhedsvacciner i et rekombinant ekspressionssystem, hvor der ikke anvendes patogene vira. Ikke desto mindre er ekspression af de ofte store virale proteiner en tung byrde på ekspressionssystemets kapacitet, hvilket gør ekspressionen mindre effektiv. Dette er også ineffektivt, da det meste af det udtrykte protein ikke bidrager til den aktuelle immunaktivering. Tværtimod har mange antigener immundominante regioner, som ikke er involverede i immunbeskyttelse, men endog kan maskere regioner, som er immunbeskyttende. Som et resultat heraf er immunisering med protein omfattende sådanne regioner ikke effektiv: en organismes humorale og/eller cellulære immunsystem aktiveres mod disse dele af antigenet, men dette interfererer ikke med infektionen eller replikationen af patogent eller med sygdomssymptomerne. Følgelig er der behov for alternative SAV-vacciner, som er forbedrede og mere effektive derved, at de er placeret på små, men relevante immunogene dele af de SAV-virale proteiner per se: de beskyttende epitoper.

Som det vides er stimuleringen af en organismes immunsystem via T- og B-lymfocytter baseret på den molekylære genkendelse af en epitop af T- eller B-cellereceptoren. Hvis epitoper er lineære, eksisterer de på et antigen som en kontinuert sekventiel struktur og er relativt små, f.eks. for protein kan regionere på 8 til 15 aminosyrer være bundet af MHC I- eller Il-molekyler til præsentation for lymfocytreceptorerne (sammenfattet eksempelvis af Germain & Margulies, 1993, Annu. Rev. Immunol., bind 11, side 403-450). Epitoper kan imidlertid også være dannet som et resultat af den tredimensionelle foldning af et antigen; sådanne epitoper er diskontinuerte og samles eksempelvis fra aminosyrer som ikke er sekventielle i proteinets aminosyresekvens. Som et resultat heraf er regionen af et antigen, der strækker sig over en diskontinuert epitop, almindeligvis større end for en lineær epitop.

En epitop er beskyttende, hvis den kan fremkalde et immunrespons, som er i stand til effektivt at interferere med graden eller progressionen af infektion eller sygdom.

Af alle mulige beskyttende epitoper, såvel lineære som konformationelle, er de, som forårsager virusneutralisering (VN) mest effektive; sådanne epitoper fremkalder et humoralt immunrespons, som neutraliserer viral ineffektivitet og/eller et cellulært immunrespons, som forårsager lysering af virusinficerede celler. Virusneutralisering finder eksempelvis sted ved at forhindre viral fastgørelse og/eller indtrængen i værtsceller.

Virale VN-epitoper er almindeligvis lokaliseret på molekyler involveret i væsentlige virale processer, såsom binding til eller indtrængen i værtsceller. Deres tilstedeværelse er derfor relevant for virussen, hvilket fører til deres bevarelse. Dette gør VN-epitoper meget effektive i vacciner, såvel som i diagnostiske assays.

Identifikationen af en epitop i et antigen er en kompleks proces, selvom moderne teknikker nogle gange kan bidrage med deres forudsigelse: computerbaseret forudsigelse kan tilvejebringe en indikation af relevante områder. Sådanne forudsigelser benytter algoritmer, der beskriver form og ladning af et protein, og er eksempelvis udviklet af Hopp & Woods (1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, bind 78, side 3824-3828), og Shou & Fassman (1978, Advances in Enzymology, bind 47, side 45-148). Sådanne forudsigelser er imidlertid næsten udelukkende af nytte ved lineære epitoper. Computerforudsigelse af diskontinuere epitoper med nogen grad af nøjagtighed er blevet beskrevet (Kulkarni-Kale et al., 2005, Nucl. Acids Res., bind 33, side W158-W171), men denne teknik er kun anvendelig på proteiner for hvilke 3D-krystalstrukturen er blevet bestemt. Kritisk ved alle forudsigelsesmetoder er det at følge op med verificering, hvorvidt den for-udsagte epitop overhovedet er immunogen og har beskyttende evne.

Tilsvarende kan den såkaldte Pepscan-teknik benyttes til at identificere lineære epitoper med et automatiseret screeningsassay (Geysen et al., 1984, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, bind 81, side 3998-4002). Igen er dette ikke til nogen nytte med diskontinuerte epitoper.

Mapping og karakterisering af lineære epitoper i α-vira er blevet beskrevet f.eks. for Semliki skovvirus E2: regionerne fra aminosyre (aa) 227-243 og 297-310 (Grofeld et al., 1991, Vaccine, bind 9, side 451-456); regionerne 166-185 og 286-305 (Ariel, et al., 1990, Arch. Virol, bind 113, side 99-106); og region 297-352 (Grosfeld et al., 1992, J. of Virol., bind 66, side 1084-1090).

Epitoper i a-virale proteiner, som kan fremkalde et VN-immunrespons er også blevet beskrevet: aa 170-220 i Sindbis-virus E2-protein (Strauss & Strauss, 1994, Microbiol. Reviews, bind 58, side 491-562). Pence et al. (1990, Virology, bind 175, side 41-49) omtaler en diskontinuert VN-epitop af Sindbis-virus E2-protein: E2c, som dækker arealet fra aminosyrer 62-159.

Grundet den lave sekvenshomologi mellem SAV og de øvrige α-vira kunne ingen af disse epitoper imidlertid lokaliseres på SAV-proteinerne. Homologier mellem strukturelle proteinsekvenser af SAV og andre α-vira er af størrelsesordenen 31-33% (Weston, 2002, supra).

For SAV i sig selv, er VN-antistoffer og deres anvendelse i serologisk assay blevet beskrevet (Graham et al., 2003, J. of Fish Dis., bind 26, side 407-413), men disse var polyklonale antistoffer. Om end effektive i det beskrevne assay er sådanne antistoffer ikke anvendelige ved identifikation afen specifik VN-epitop, da sådanne antistoffer i et dyreserum dækker en lang række epitoper.

Med henblik på at identificere VN-epitoper på virale proteiner fordres monoklo-nale antistoffer. Om end monoklonale antistoffer mod SAV-proteiner er blevet beskrevet (f.eks. Graham et al., 2003, supra), var disse ikke virusneutraliserende. Følgelig er hidtil ingen VN-epitop på SAV-virale proteiner blevet beskrevet. Til anvendelse i vaccineområdet og til diagnose for SAV vil det ikke desto mindre være meget fordelagtigt at have en VN-epitop fra et SAV-viralt protein.

Det er derfor genstanden for den foreliggende opfindelse at tilvejebringe for første gang en virusneutraliserende epitop fra et lakse-a-virusprotein, som tillader udvikling af vacciner og diagnostika, som forbedrer effektiviteten og specificiteten af de hidtil kendte.

Det blev overraskende fundet, at et polypeptid, der dækkede aminosyreregionen mellem aa158 og 252 i SAV E2-proteinet har indbygget en konformations-mæssig virusneutraliserende epitop af SAV E2-proteinet.

Grosfeld. H. et al, beskrev en algoritme til identifikation af lineære beskyttende epitoper i E2-kappen i Semliki skovvirus (Vaccine 9: 451-456 (1991)).

Dog blev det overraskende, og i modsætning til de neutraliserende epitoper i Grosfeld, fundet, at den neutraliserende epitope i α-vira lakse-pancreas-sygdomsvirus, var en non-lineær epitope, som omfatter et stræk af 95 aminosyrer fra aminosyrer 158 til 252. Denne epitope hverken kunne eller ville være blevet fundet ved brug af algoritmen i Grosfeld et al.

Denne VN-epitop kan nu anvendes til generering af effektive vacciner og diagnostiske assays. Hovedfordelen er, at VN-epitopen er meget lille i forhold til det fuldstændige SAV E2-protein, som er 438 aa i størrelse, mens den fortsat har indbygget den væsentlige immunogene del af SAV E2-proteinet.

Dette har en række fordelagtige virkninger; ekspressionen af SAV E2 VN-epitopen i et rekombinant ekspressionssystem er meget mere effektiv end for det komplette SAV E2 ved ikke unødigt at basere sig på evnen og ressourcerne til ekspression af protein i stor skala, hvilket protein ikke er direkte knyttet til at tilvejebringe det essentielle immunrespons. I kvantitative termer forbedres effek tiviteten af ekspression af VN-epitopen i forhold til hele E2 4,6 gange (95 aminosyrer mod 438); tilsvarende opnås en kvalitativ forbedring: ved ikke at overbelaste ekspressionssystemets kapacitet til ekspression og posttranslatorisk forarbejdning og derfor ikke fremkalde prematur cellelysering og efterfølgende proteolyse, er VN-epitopproteinet produceret af bedre kvalitet end E2-proteinet ville være blevet.

Sagt på en anden måde: når prøver af SAV E2 VN-epitopprotein og SAV E2-proteinet i fuld længde af samme mængde sammenlignes, så er den immunogene styrke af prøven af VN-epitopproteinet mere end 5 gange højere end for E2-proteinet. Dette er overraskende og en stærkt relevant forbedring af effektiviteten af ekspression af SAV E2-underenheder.

En anden væsentlig fordel stammende fra den lille størrelse af SAV E2 VN-epitopen ifølge opfindelsen er dens forbedrede mulighed for at blive udtrykt af en levende rekombinant bærer (LRC); sådanne LRC'er replikerer i den vaccinerede vært og kan ofte kun inkorporere en begrænset mængde fremmed nukleinsyre i deres genom. Med fordel kan en nukleinsyre, som koder for VN-epitopen ifølge opfindelsen, som måler mindre end 300 nukleotider, indbygges i de fleste sådanne levende rekombinante bærere, mens en nukleinsyre, som koder for et E2-protein i fuld længde, som måler mere end 1300 nukleotider, giver anledning til problemer i replikering, transkription og samling og f.eks. formindsker den replikerende evne af LRC.

Alternativt når LRC ikke tillader større fremmede inserteringer, tillader den lille størrelse af SAV E2 VN-epitopen nu insertering af et antal inserteringer. Sådanne multiple inserteringer kan inserteres i fusion, dvs. alle bag en promotor, eller hver insertering med sin egen promotor.

Forbedret effektivitet af sådan LRC er meget relevant vedrørende vaccinering i aquakultur: grundet de husdyrsholdsmetoder, der benyttes og det store antal dyr til vaccine er individuel håndtering af dyr upraktisk og meget arbejdskrævende. Anvendelsen af et selvreplikerende immunogen, såsom LRC, som gør effektive massevaccinationsprocedurer mulige, er derfor en vigtig effektivitetsforbedring. I et første aspekt angår opfindelsen derfor et polypeptid omfattende en amino-syresekvens med mindst 90% aminosyreidentitet i forhold til en vilkårlig af SEQ ID NO 1-3 over deres fulde længde, og hvor aminosyresekvensen er i stand til at inducere et neutraliserende immunrespons overfor lakse-a-virus, kendetegnet ved, at polypeptidet er mindst 95 og højst 166 aminisyrer i størrelse. SEQ ID NO: 1-3 repræsenterer aa-region 158-252 i SAV E2-proteinet for referencestammerne henholdsvis F93-125, S49P og N3.

For opfindelsen skal udtryk som indikerer en aminosyresekvensregion af SAV E2-proteinet, såsom 158-252, opfattes at betyde: start med aa 158 op til og med aa 252.

Ved at indbygge en af sekvenserne fra SEQ ID NO: 1-3 omfatter polypeptidet ifølge opfindelsen regionen af aminosyrer 158-252 fra SAV E2-protein, hvilken region indbygger den diskontinuerte VN-epitop af SAV E2-proteinet. Længden og placeringen af SEQ ID NO'erne beskrevet her er vist grafisk i fig. 1 i forhold til SAV E2 i fuld længde. I opfindelsen er betegnelsen "polypeptid" benyttet alene med henblik på refe-rencetydelighed og er lig med "protein". Et "protein" betyder en molekylkæde af aminosyrer. Et protein i sig selv er ikke af en bestemt længde, struktur eller form, og kan såfremt det fordres modificeres in vivo eller in vitro ved f.eks. gly-cosylering, amidering, carboxylering, phosphorylering eller ændringer i rumlig foldning. Også proteinsalte, -amider og -estere (især C-terminale estere) og N-acylderivater er inden for rammerne af opfindelsen. Blandt andet indbefattes peptider, oligopeptider og polypeptider i definitionen af protein såvel som præ-cursor-, præ-pro- og modne former af proteinet. Et protein kan være af biologisk og/eller syntetisk oprindelse. Et protein kan være et kimæreprotein eller et fusi onsprotein, dannet ved fusion med biologiske, fysiske eller kemiske processer af to eller flere proteinfragmenter.

Betegnelsen "aminosyreidentitet" henviser til graden af identitet mellem amino-syresekvenserne af to eller flere proteiner. Procent aminosyreidentitet af et protein med et protein ifølge opfindelsen skal bestemmes ved aminosyreorientering af regionen af proteinet, som svarer til aminosyresekvensen af en vilkårlig af SEQ ID NO: 1-3.

Til opfindelsen skal sådanne aminosyreorienteringer bestemmes med computerprogrammet "BLAST 2 SEQUENCES" ved at vælge underprogrammet "BlastP" (Tatusova & Madden, 1999, FEMS Microbiol. Lettes, bind 174, side 247-250), som kan opnås via internetadressen www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html. Sammenligningsmatricen til anvendelse er: "Blosum62" med default-værdierne: open gap penalty: 11; extension gap penalty: 1 og gap x_dropoff: 50. Dette computerprogram angiver procenten af aminosyrer, som er identiske, dvs. tæller kun nøjagtige overensstemmelser som "identiteter". SAV E2-fragmenter indeholdende denne region af aa 158-252 fra SAV E2 fandtes at indeholde VN-epitopen ifølge opfindelsen. Dette er åbenbart for de opnåede eksperimentelle resultater: De positive VN-vurderinger er også indikeret i fig. 1, og disse og andre resultater er beskrevet i den eksperimentelle del.

Det blev nu fundet, at ved multipel orientering af aminosyreregionen 158-252 fra mange SAV E2-proteiner omfattende isolater fra hver af de tre SAV-undertyper fandtes aminosyreidentitetsniveauet at variere mellem 90 og 100%. Dette er vist i tabel 1 nedenfor og i fig. 2. Den meget høje grad af bevarelse indikerer, at variationer i aminosyresekvensidentitet på 90% er inden for den naturlige variation af aminosyresekvenser, som findes i denne region af SAV E2-proteinet. Proteiner med aminosyreidentiteter i dette område på 90-100% i forhold til polypepti-der ifølge opfindelsen er derfor tilsyneladende naturlige varianter og derfor inden for rammerne af opfindelsen.

Tabel 1: Procent aminosyreidentitet af aminosyregionerne 158-252 fra SAV E2-proteiner sammenlignet med en referencesekvens:

Resultater blev bestemt ved at benytte Align+®-programmet (SE Central) med indstillingerne "global alignment against a reference sequence", benytte nøjagtige overensstemmelser, en værdiansættelsesmatrix = Biosum 62 og andre parametre sat til default-værdien. Referencesekvensen var den fra SAV-isolatet N3 (adgangsnr. AAU01400.1) I en foretrukken udførelsesform omfatter polypeptidet ifølge dette aspekt ved opfindelsen en aminosyresekvens med mindst 91% aminosyresekvensidentitet i forhold til en vilkårlig af SEQ ID NO: 1-3. Mere foretrukket er et polypeptid med 92, 93, 94, 96, 96, 97, 98, 99 eller endog 100% aminosyresekvensidentitet i forhold til en vilkårlig af SEQ ID NO: 1-3 i nævnte rækkefølge.

Fortrinsvis overstiger størrelsen af et polypeptid ifølge af dette aspekt ved opfindelsen ikke 166 aminosyrer. Dette svarer til længden af regionen fra aa 139-304 i SAV E2-proteinet.

Som et resultat heraf kan polypeptider ifølge dette aspekt ved opfindelsen være afledt fra SAV E2-proteinet fra hvor som helst mellem aa 87 (som er 252 minus 166) og aa 323 (som er 158 plus 166) under forudsætning af, at de har en mak- simal længde på 166 aminosyrer. Sådanne polypeptider indbygger fortsat en aminosyresekvensregion svarende til SAV E2-regionen aa 158-252, som indeholder VN-epitopen ifølge opfindelsen, og grundet den naturlige variation som eksisterer i SAV E2-sekvenser i denne region er deres aminosyreidentitetspro-cent i forhold til SEQ ID NO: 1-3 mellem 90 og 100%.

Teknikker til at opnå polypeptider ifølge opfindelsen er velkendte inden for området. Fortrinsvis benyttes gensplejsningsteknikker og rekombinante DNA-ekspressionssystemer til nøjagtigt at udtrykke de ønskede fragmenter.

Nukleinsyresekvenserne, som kan benyttes til at kode et polypeptid ifølge opfindelsen er beskrevet her og/eller er offentligt tilgængelige. Sådanne sekvenser kan opnås, manipuleres og udtrykkes ved hjælp af molekylære standardbioteknikker, som er velkendte for fagmanden og som er forklaret detaljeret i standardlærebøger, såsom: Molecular cloning: a laboratory manual (Sambrook & Russell: 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN: 0879695773) og: Current protocols in molecular biology (Ausubel et al., 1988 + opdateringer, Greene Publishing Assoc., New York; ISBN: 0471625949).

For at konstruere en nukleinsyre, som koder for et polypeptid ifølge opfindelsen benyttes fortrinsvis DNA-fragmenter i form af plasmider. Sådanne plasmider er nyttige f.eks. til at fremme mængden af et DNA-insert, til anvendelse som en probe og som et værktøj til yderligere manipuleringer. Eksempler på sådanne plasmider til kloning er plasmiderne fra plasmidrækken pET, pBR, pUC, pGEM og pcDNA, idet alle disse er let tilgængelige fra adskillige kommercielle leverandører.

For at opnå det ønskede polypeptid konstrueres de passende nukleinsyrese-kvenser f.eks. ved at benytte restriktionsenzymfordøjelse, ved stedsrettede muteringer eller fortrinsvis ved polymerasekædereaktionsteknikker (PCR). Standardteknikker og protokoller til at udføre PCR er f.eks. omfattende beskrevet i: PCR primers: a laboratory manual (Dieffenbach & Dveksler, 1995, CSHL Press. ISBN 879694473). Ved f.eks. at vælge en PCR-primer, som hybridiserer til et bestemt sted på et SAV E2-kodende gen, produceres rec DNA-fragmenter, som koder for polypeptider som begynder eller ender ved den ønskede aminosyre på SAV E2.

Med henblik på kloning, proteinoprensning, påvisning eller forbedring af ekspressionsniveau kan yderligere sekvenser tilføres fortrinsvis allerede indbygget i de anvendte PCR-primere. DNA'et som koder for polypeptidet ifølge opfindelsen kan f.eks. være klonet fra PCR-produktet i en ekspressionsvektor. I sådanne ekspressionsvektorer forbindes nukleinsyren, som koder for det ønskede fragment af SAV E2, operativt til en transkriptionel regulatorisk sekvens således, at den er i stand til at kontrollere transkriptionen af nukleinsyresekvensen. Egnede ekspressionsvektorer er blandt andet plasmider, cosmider, vira og YAC'er (Yeast Artificial Chromosomes), som omfatter de nødvendige kontrolregioner til replikation og ekspression.

Transkriptionelle regulatoriske sekvenser er velkendte inden for området og omfatter blandt andet promotorer og enhancere. Fagfolk inden for området ved, at valget af en promotor udstrækker sig til en vilkårlig eukaryotisk, prokaryotisk eller viral promotor i stand til at styre gentranskription under forudsætning af, at promotoren er funktionsdygtig i ekspressionssystemet, som skal benyttes.

Transkriptionelle regulatoriske sekvenser, som er egnede til anvendelse i et ek-spressions-DNA-plasmid omfatter promotorer, såsom den umiddelbart tidlige (humane) cytomegaloviruspromotor og Rous sarcomavirus LTR promotoren (Ulmer et al., 1993, Science, vol. 259, side 1745-1748) og den større sene promotor fra Adenovirus 2 og β-actin-promotoren (Tang et al., 1992, Nature, bind 356, p. 152-154). De regulatoriske sekvenser kan også indbefatte terminator-og polyadenyleringssekvenser, såsom den velkendte bovine væksthormons po-lyadenyleringssekvens, SV40-polyadenyleringssekvensen og den humane cy-tomegalovirusterminator- og -polyadenyleringssekvens.

Bakterielle, gær-, svampe-, insekt- og hvirveldyrscelleekspressionssystemer benyttes meget ofte. Sådanne ekspressionssystemer er velkendte inden for området og generelt til rådighed f.eks. gennem Invitrogen (Holland).

En værtscelle benyttet til ekspression af et polypeptid eller protein (som skitseret ovenfor) ifølge opfindelsen kan være en celle af bakteriel oprindelse f.eks. fra Escherichia coli, Bacillus subtilis, Lactobacillus sp. eller Caulobacter crescentus eller de aquatiske bakterier Yersinia ruckeri og Vibrio anguillarum alle sammen ved anvendelse af bakterieafledte plasmider eller bakteriofager til at udtrykke sekvensen som koder for polypeptidet eller proteinet (som anført ovenfor) ifølge opfindelsen. Værtscellen kan også være af eukaryotisk oprindelse, f.eks. gærceller (f.eks. Saccharomyces eller Pichia) sammen med gærspecifikke vektormolekyler; insektceller sammen med rekombinante baculovirale vektorer, f.eks. Sf9 og pVL1393 (Luckow et al., 1988, Bio-technology, bind 6, side 47-55); planteceller sammen med f.eks. Ti-plasmidbaserede vektorer eller plantevi-rale vektorer (Barton et al., 1983, Cell, bind 32, side 1033-1043); eller pattedyrsceller også med passende vektorer af rekombinante vira, såsom Hela-celler, CHO-, CRFK- eller BHK-celler eller fiskeceller såsom Chinook-lakseembryo(CHSE-214)-celler, atlantiske laksecellelinier og regnbueørredcellelinier.

Ud over disse ekspressionssystemer er ekspression i organismer, såsom i alger eller planter, attraktive ekspressionssystemer, da disse kan indbygges i foderet og benyttes som oral vaccine. Ved at føde sådanne materialer til fisk, der skal vaccineres, opnås en effektiv massevaccinering.

Teknikken ved homolog rekombinering in vivo, som er velkendt, kan benyttes til at indføre en rekombinant nukleinsyresekvens i genomet på en bakterie, virus eller en organisme efter eget valg.

Ekspression kan også udføres i såkaldte cellefrie ekspressionssystemer. Sådanne systemer omfatter alle væsentlige faktorer til ekspression af en passende rekombinant nukleinsyre, operativt forbundet til en promotor, som er i stand til ekspression i dette bestemte system. Eksempler er E.coli-lysatsystemet (Roche, Basel, Schweiz) eller kanin-reticulocyt-lysat-systemet (Promega corp., Madicon, USA). I en anden udførelsesform angår opfindelsen et protein omfattende polypeptidet ifølge opfindelsen, hvor nævnte protein ikke omfatter en del af et SAV E2-protein omfattende nævnte polypeptid og er større end 166 aminosyrer i størrelse. Sådanne proteiner ifølge opfindelsen er fusions- og bærerproteiner omfattende polypeptidet ifølge opfindelsen.

Et fusions- eller bærerprotein dannes ved en samling af to eller flere strenge aminosyrer, som giver en kombination, som ikke findes naturligt. Strengene kan være af ens eller forskellig længde. Kombinationen af strengene kan opnås på adskillige måder, f.eks. kemisk; ved kobling, konjugering eller tværbinding, ved dehydrering, esteri-ficering osv. af aminosyresekvenserne enten direkte eller gennem en mellemforbindelsesstruktur, fysisk; ved kobling ved indfangning i eller på en makromolekylær struktur, ved molekylærbiologisk fusion; ved kombinationen af rekombinante nukle-insyremolekyler, som udgør fragmenter af nukleinsyre i stand til at kode hver af de to, således at et enkelt kontinuert ekspressionsprodukt til slut produceres.

Teknikker til at benytte disse koblinger og fusioner er velkendte inden for området og er f.eks. beskrevet i håndbøgerne fra Sambrook & Russel og fra Ausubel som beskrevet tidligere.

Anvendelsen af sådanne fusions- eller bærerproteiner har adskillige fordele, eksempelvis: lettere håndtering; f.eks. ved oprensning og påvisning, forøget immunogenecitet; f.eks. ved almen immunstimulering sammenlignelig med en adjuvans eller ved specifik manipulering af immunsystemet i en bestemt retning (f.eks. Th1 eller Th2) til et vist responsniveau (højere eller lavere end ellers) eller for at opnå et bestemt tidsforløb af immunresponset, forøget ekspressionsniveau; f.eks. ved at forøge ekspressionsniveauet per se ved f.eks. at forøge transkriptions- eller translateringsniveauerne i et bestemt ekspressionssystem eller ved at forbedre stabiliteten af det producerede mRNA eller af proteinet enten intra- eller ekstracellulært, at tilvejebringe en linker- eller spacer-region for endnu et fusions- eller bærerprotein osv.

Eksempler på sådanne bærer- eller fusionsproteiner er velkendte eksempelvis: til oprensning eller påvisning: His-tag, v-Myc-tag, β-galactosidase (β-gal), maltosebindende protein, grønfluorescerende protein (GFP), gluthation-S-transferase, streptavidin, biotin, immunoglobulinafledte domæner (f.eks. Fab-fragmenter) osv. til forbedret eller tilpasset immunrespons: bovint eller ovint serumalbumin, keyhole limpet haemocyanin, hsp70, tetanustoxoid og interleukiner, cytoki-ner og hormoner, som er biologisk aktive i laksefisk.

Adskillige af disse eksempler har mere end en enkelt virkning, f.eks. ved at tilknytte GFP forbedres både påvisning og ekspression. I et alternativt aspekt angår opfindelsen et polypeptid omfattende en del af SAV E2-proteinet kendetegnet ved, at nævnte del har mindst de 95 aminosyrer af aminosyresekvensen fra SEQ ID NO: 4 og højst de 194 aminosyrer af aminosy-resekvensen fra SEQ ID NO: 6. SEQ ID NO: 4 er konsensussekvensen afledt fra den multiple orientering af fragmenterne aa 158-252 fra SAV E2-proteiner tidligere beskrevet ovenfor i tabel 1. Orienteringen og konsensussekvensen af afbildet i fig. 2. SEQ ID NO: 5 og 6 er konsensussekvenser afledt på tilsvarende vis fra SAV E2-proteiner dækkende henholdsvis aa 139-290 og 111-304. De underliggende multiple orienteringer er afbildet i henholdsvis fig. 3 og 4.

Et sådant polypeptid ifølge opfindelsen omfatter en del af SAV E2-proteinet, som er lig med eller større end SEQ ID NO: 4, men ikke større end SEQ ID NO: 6. Sådanne polypeptider omfatter fortsat den diskontinuerende VN-epitop af SAV E2-proteinet ved indbygning af SEQ ID NO: 4.

Polypeptider ifølge opfindelsen har en størrelse mellem 95 og 194 aminosyrer (henholdsvis længden af SEQ ID NO: 4 og 6) og er valgt fra sekvensen for denne region i SAV E2.

Fordi SEQ ID NO: 4 og 6 er konsensussekvenser er et vist variationsniveau i aminosyresekvens af polypeptiderne ifølge dette aspekt ved opfindelsen inden for rammerne af opfindelsen. Disse konsensussekvenser har mindst 85% ami-nosyreidentitet med regionen aa 158-252 fra en vilkårlig af de tre SAV-undertyper.

Et eksempel på et protein ifølge denne aspekt ifølge opfindelsen er SEQ ID NO: 5, som løber fra aa 139-290 i forhold til sekvensen i SAV E2. I en foretrukken udførelsesform omfatter polypeptidet ifølge dette aspekt ved opfindelsen SEQ ID NO: 4 med en forøget grad af aminosyresekvensidentitet opnået ved at erstatte en eller flere af de variable aminosyrer (indikeret med symbolet X eller Xaa repræsenterende en vilkårlig aminosyre) ved en bestemt position i SEQ ID NO: 4 svarende til en vis position i SAV E2 af en af aminosy-rerne anført for denne position i tabel 2:

Tabel 2: Foretrukne udførelsesformer for SEQ ID NO: 4; aminosyrer til at erstatte de variable aminosyrer i SEQ ID NO: 4.

En tilsvarende tabel kan sættes op for hver af SEQ ID NO: 5 og 6 ved at aflede de foretrukne aminosyrer fra de multiple orienteringer i henholdsvis fig. 3 og 4.

For begge alternativer af polypeptidet ifølge opfindelsen gælder, at de nøjagtige grænser for VN-epitopen af SAV E2 yderligere kan defineres af fagfolk baseret på informationen tilvejebragt her ved at benytte velkendte teknikker. De nuværende grænser indikeret ifølge opfindelsen er sat ved aa 158-252, mens det fandtes, at fragmenterne aa 139-242 (SEQ ID NO: 7 fra SAV-undertype 3, isolat N3) og aa 170-252 (SEQ ID NO: 8, fra SAV-undertype 3, isolat N3) begge ikke besidder en funktionel VD-epitop. Følgelig er grænserne for den strengeste region omfattende VN-epitopen på den N-terminale side mellem aa 158 og 170 og på den C-terminale side mellem 242 og 252. I en udførelsesform af polypeptidet ifølge dette aspekt ved opfindelsen angår opfindelsen et protein omfattende polypeptidet ifølge opfindelsen, hvor nævnte protein ikke omfatter en del af SAV E2-proteinet omfattende nævnte polypeptid, og som er større i størrelse end nævnte polypeptid.

Tilsvarende vedrørende de fordelagtige anvendelser i proteinet ifølge det alternative aspekt ifølge opfindelsen tilvejebringer disse proteiner nu fusions- eller bærerproteiner omfattende VN-epitopen af SAV E2-protein, som tillader eksempelvis lettere håndtering, forøget immunogenicitet eller et forøget ekspressionsniveau af VN-epitopen ifølge opfindelsen.

Teknikker til at producere sådanne fusions- eller bærerproteiner er beskrevet tidligere og er velkendte inden for området.

Udførelsesformer af bærerproteiner omfatter stort set de samme eksempler som beskrevet ovenfor og tilvejebringer nu eksempelvis lettere håndtering, forøget immunogenicitet eller et forøget ekspressionsniveau af proteiner omfattende et polypeptid ifølge opfindelsen.

Carbohydrater og lipider som bærer for et protein ifølge opfindelsen er f.eks. lectiner, glucaner, glycaner og liposaccharider, såsom lipid A. Teknikker til kobling af et protein ifølge opfindelsen med sådanne molekyler er velkendte inden for området (f.eks. Kubier et al., 2005, J. Org. Chem., bind 70, side 6987-6990; Alving, 1991, J. Immunol. Methods, bind 140, side 1-13). Bærervesikler tjener flere formål f.eks. som stabilisatorer, som tilførselsvehikel og som immunstimulerende middel. F.eks. er ISCOM velkendte som immunsti-mulerende partikler (WO 96/11711) bestående af en blanding af saponin, et phospholipid og cholesterol, i hvilken et antigen, såsom et protein ifølge opfin delsen kan indbygges. Alternativt kan ISCOM-matrixpartikler produceres. Disse er ISCOM-lignende partikler, i hvilke underenhedsantigenet ikke er integreret men adsorberet. Bærere til anvendelse ved oral vaccinering tilvejebringer både tilførsel og immunstimulering. Eksempler er metaboliserbare stoffer, såsom α-cellulose eller forskellige olier af vegetabilsk eller animalsk oprindelse. En attraktiv vej er også anvendelsen af levende organismer som bærere; når sådanne organismer har optaget eller adsorberet proteinet ifølge opfindelsen, kan de fodres til målfiskene. Særligt foretrukne bærere til oral tilførsel af protein ifølge opfindelsen er levende organismer, som er i stand til at indkapsle proteinet. Egnede levende organismer indbefatter planktonlignende ikke-selektive filterfoderorganismer, fortrinsvis fra Rotifera, Artemia og tilsvarendeog eksempelvis saltvandsrejen Arte-mia sp..

En foretrukken fremgangsmåde til at fremstille en bærer er at fodre værtsceller eller celler fra et ekspressionssystem omfattende proteinet ifølge opfindelsen til planktonlignende ikke-selektive filterfoderorganismer fortrinsvis Rotifera, Artemia og tilsvarende. Proteinet optages af den levende bærer, såsom planktonlignende ikke-selektive filterfoderorganismer og disse administreres dernæst oralt til fisk, der skal beskyttes mod SAV-infektion og sygdom.

En levende rekombinant bærer (LRC) er en mikroorganisme, såsom eksempelvis bakterier, parasitter og vira, i hvilke yderligere genetisk information er blevet inserteret, i dette tilfælde en nukleinsyre, et DNA-fragment eller et rekombinant DNA-molekyle i stand til at kode for et protein ifølge opfindelsen (som vil blive omtalt nedenfor). Grundet LRC-replikeringerne in vivo i måldyret behøves blot relativ lidt podemateriale at blive tilført sammenlignet med mængden af antigent protein nødvendigt til en "klassisk" vaccination. På denne måde udtrykker LRC det valgte antigen direkte i måldyret eller dets celler. Dette tilvejebringer en gunstig præsentation over for værtens immunsystem. Alternativt kan LRC'er tjene som en bærer for den genetiske information, som koder for det ønskede antigen, med andre ord: som en tilføringsvehikel for en nukleinsyrevaccine til cellerne i måldyret. Målorganismer podet med sådan LRC producerer et immunogent respons over for bærerens immunogener såvel som mod det eller de heterologe proteiner, for hvilke den genetiske kode yderligere er klonet i LRC'en, f.eks. en nukleinsyre i stand til at kode for en SAV E2 VN-epitop omfattet i et polypeptid eller et protein ifølge opfindelsen. Immunresponset fremkaldt mod antigener fra bærermikroorganismen forstærkerresponset over for proteinet ifølge opfindelsen. LRC med en insertering danner også effektivt en kombinationsvaccine og tilvejebringer multipel beskyttelse i en vaccination. Når LRC er en virus, kaldes sådanne vira også bærer- eller vektorvira. Vira, som med fordel kan anvendes som LRC til opfindelsen er vira i stand til at repli-kere i laksefisk, for hvilke tilstrækkelig molekylærbiologisk information er til rådighed til at tillade kloning og manipulering. Foretrukne virale LRC'er er a-vira og vira fra genus Novirhabdo-virus, især arterne viral hæmoragisk septicaemia-virus og infektiøs hæmatopoietisk necrose-visus (IHNV). IHNV er eksempelvis et ørredpatogen, for hvilket et svækket viralt ekspressions- og tilførselssystem til anvendelse i laksefisk er blevet beskrevet. (WO 03/097090: Biacchesi et al., 2000, J. of Virol., bind 74, side 11247-112539). Deletering af NV-proteinet fra IHNV-genomet svækker virussen og skaber plads for insertering af et fremmet gen. En foretrukken LRC er en rekombinant IHNV, som bærer en nukleinsyre-konstruktion i stand til at kode for et polypeptid eller protein ifølge opfindelsen. En sådan LRC administreres dernæst til målfisk, f.eks. ved neddypningsvacci-nering.

En værtscelle omfattende et polypeptid, protein, nukleinsyre eller LRC ifølge opfindelsen kan også benyttes som bærer. Cellerne for ekspressionssystemet, som f.eks. blev benyttet til at producere polypeptidet eller proteinet ifølge opfindelsen, eller cellerne anvendt til at producere LRC ifølge opfindelsen, kan formuleres til en farmaceutisk sammensætning, såsom en vaccine, og administre- res til fisken. Som med LRC vil antigener for værtscellen tilvejebringe nogen yderligere immunstimulering og således have en bidragende virkning.

Uorganiske bærere kan overtrækkes med eller kan adsorbere et peptid eller protein ifølge opfindelsen ved at benytte velkendte teknikker. Sådanne ladede bærere benyttes dernæst i vaccineformuleringer til anvendelse over for fisk eller til anvendelse i diagnostisk assays. Eksempelvis er aluminiumhydroxid en velkendt vaccineadjuvans. Partikler af silica (glasperler) eller guld er tilsvarende almindeligt benyttet i diagnostiske assays. Bærere omfattende et polypeptid eller et protein ifølge opfindelsen kan også benyttes i diagnostiske assays. F.eks. kan membraner eller strimler af passende materiale, såsom nylon, PVDF, nitrocellulose eller papir, produceres ved at adsorbere, overtrække eller pådryppe polypeptidet eller proteinet ifølge opfindelsen. Teknikker til f.eks. at pletpåføre ved anvendelse afen væskestrøm eller elektrisk strøm er velkendt inden for området. Sådanne membraner indbygges dernæst i en testanordning eller et diagnostisk kit. Genstande kan også fungere som bærer: f.eks. en siliciumchip til anvendelse i BlAcore-udstyr eller en mikro-titreringsanordning med brønde overtrukket med polypeptidet eller proteinet ifølge opfindelsen kan med fordel benyttes.

Et diagnostisk assay med anvendelse af en sådan bærer er meget gunstig til den specifikke bestemmelse af SAV. I særdeleshed fordi VN-epitopen af SAV E2 omfattet i et polypeptid, protein eller bærer ifølge opfindelsen tillader specifik påvisning af alle tre undertyper af SAV; som beskrevet her er VN-epitopen af SAV E2 meget bevaret mellem tre undertyper med aminosyreidentiteter mellem 90 og 100%. Sådan specifik identifikation af SAV er f.eks. meget nyttig ved bestemmelse af årsagen til sygdom; den aquatiske Birnavirus infektiøs pancreatisk necrose-virus (IPNV) forårsager f.eks. også sygdom og død i laksefisk. Da symptomerne for SPDV og IPNV kan være vanskelige at skelne, forbedrer det at have en føl som og specifik diagnostiktest for SAV til rådighed kraftigt mulighederne for at tage de korrekte foranstaltninger over for husdyrsholdet og sundheden.

En af fordelene ved opfindelsen er, at polypeptidet, proteinet eller bæreren ifølge opfindelsen også kan benyttes til at producere specifikke antistoffer mod SAV E2 VN-epitopen. Som et resultat heraf er det nu for første gang muligt at producere antistoffer, monoklonale eller polyklonale, som er næsten udelukkende rettet mod SAV E2 VN-epitopen. Sådanne antistoffer er stærkt specifikke over for SAV og meget effektive i eksempelvis passive immuniseringer og diagnostiske assays (som det vil blive omtalt nedenfor). Sådanne antistoffer anvendes dernæst f.eks. til terapi, til diagnostika eller med henblik på kvalitetssikring. I en udførelsesform angår opfindelsen derfor en fremgangsmåde til at producere lakse-a-virusneutraliserende antistoffer omfattende podning af polypeptidet eller proteinet ifølge opfindelsen af et dyr og isolering af antistoffer.

Fremgangsmåder til at fremkalde og producere antistoffer eller antisera omfattende antistoffer såvel som konceptet med "specifik binding" med et antistof er velkendt inden for området. F.eks. kan antistoffer eller antiserum mod polypeptidet, proteinet eller bæreren ifølge opfindelsen opnås hurtigt og let ved vaccinering af f.eks. svin, fjerkræ eller kaniner med polypeptidet, proteinet eller bæreren ifølge opfindelsen i f.eks. en vand-i-olie-emulsion efterfulgt efter 2-6 uger af blodtapning, centrifugering af det koagulerede blod og dekantering af seraene.

En anden kilde til antistoffer er blodet eller serum fra ørred eller laks, som (naturligt) er blevet inficeret med SAV.

Andre fremgangsmåder til fremstilling af antistoffer, som kan være polyklonale, monospecifikke eller monoklonale (eller derivater heraf), er velkendte inden for området. Såfremt polyklonale antistoffer ønskes, er teknikker til at producere og bearbejde polyklonale sera velkendte inden for området (f.eks. Mayer and Walter eds., 1987, Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, London).

Monoklonale antistoffer reaktive over for polypeptidet eller proteinet ifølge opfindelsen kan fremstilles ved at immunisere indavlede mus med teknikker også velkendte inden for området (Kohier & Milstein, 1975, Nature, bind 256, side 495-497). I et yderligere aspekt angår opfindelsen en nukleinsyre, som koder for polypeptidet eller proteinet ifølge opfindelsen.

Med betegnelsen "nukleinsyre" menes at indbefatte en molekylkæde af desoxy-eller ribonukleinsyrer. En nukleinsyre er ikke af specifik længde, hvorfor polynu-kleotider, gener, åbne læserammer (ORF), prober, primere, linkere, spacere og adaptorer bestående af DNA og/eller RNA er indbefattet i definitionen af nukleinsyre. En nukleinsyre kan være af biologisk og/eller syntetisk oprindelse. Nukleinsyren kan være i enkeltstrenget eller dobbeltstrenget form. Den enkelte streng kan være sense eller antisense. Modifikationer i baserne i nukleinsryen kan foretages, og baser, såsom inosin, kan indbygges. Andre modifikationer kan eksempelvis involvere modifikationer af rygraden.

Med betegnelsen "koder for" menes: at tilvejebringe muligheden for proteinekspression blandt andet ved transskription og/eller translatering i den rigtige sammenhæng. Den rigtige sammenhæng henviser til promotoren, celler, buffer, reaktionsbetingelser osv.

En nukleinsyre ifølge opfindelsen i den rigtige sammenhæng, er i stand til at kode for et polypeptid eller et protein ifølge opfindelsen. Eksempler på nukleinsyrer ifølge opfindelsen er blevet beskrevet ovenfor.

Fremgangsmåder til at isolere en nukleinsyre i stand til at kode for et polypeptid eller et protein ifølge opfindelsen er blevet beskrevet ovenfor, og er velkendt inden for området. F.eks. kan SAV E2 VN-epitopen indeholdt i polypeptiderne som afbildet i SEQ ID NO: 1-3 benyttes til at fremstille eller isolere prober eller primere. Disse anvendes dernæst til at screene biblioteker med genomiske se kvenser eller mRNA-sekvenser med PCR eller hybridiseringsselektering. Fra en positiv klon eller koloni isoleres dernæst fragmentet indeholdende VN-epitopen, der subklones og anvendes f.eks. i et ekspressionssystem.

Alternativt kan E2 VN-epitoper ifølge opfindelsen fra andre SAV-isolater nu bekvemt identificeres ved computeriserede sammenligninger af SEQ ID NO: 1-3 in silico med andre SAV-sekvenser, som kan være indeholdt i en computerdatabase. Til dette formål er mange computerprogrammer offentligt tilgængelige. F.eks. kan rækken af BLAST-programmer (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res., bind 25, side 3389-3402) benyttes til at sammenligne SEQ ID NO: 1-3 med udtrykte sekvenstags (EST) og genomiske sekvensdatabaser.

Nukleinsyrer ifølge opfindelsen indbefatter også nukleinsyrer med variationer i nukleotidsekvensen sammenlignet med SEQ ID NO: 1-4 og 6. "Variant"-nukleinsyrer kan være naturlige eller ikke-naturlige varianter. Naturlige varianter eksisterer i de forskellige isolater af SAV; ikke-naturlige varianter kan skabes med rec DNA-teknikker.

Det er velkendt inden for området, at mange forskellige nukleinsyrer kan kode for et og samme protein. Dette er et resultat, hvad der inden for molekylær biologi kendes som "wobble" eller "degenerering af den genetiske kode", hvor adskillige forskellige codoner eller tripletter af mRNA vil bevirke, at den samme aminosyre bliver bundet til kæden af aminosyrer voksende i ribosomet under translatering. Det er mest forekommende i den anden og især den tredje base af hver triplet, som koder for en aminosyre. Dette fænomen kan resultere i en heterologi på ca. 30% for to forskellige nukleinsyrer, som fortsat vil kode for det samme protein. To nukleinsyrer med en nukleotidsekvensidentitet på ca. 70% kan fortsat kode for et og samme protein.

Nukleinsyrer, som koder for et polypeptid eller protein ifølge opfindelsen, kan opnås, manipuleres og udtrykkes med standardteknikker inden for molekylær biologi som beskrevet ovenfor. Redskaberne til sådanne manipuleringer og ekspressioner er bærere af nukleinsyren ifølge opfindelsen.

Et yderligere aspekt ved opfindelsen angår derfor en bærer omfattende en nukleinsyre ifølge opfindelsen, hvor nævnte bærer er valgt fra gruppen bestående af et DNA-fragment, et rekombinant DNA-molekyle, en levende rekombinant bærer og en værtscelle. Disse er beskrevet mere detaljeret nedenfor.

En foretrukken bærer er et DNA-plasmid.

Den foretrukne fremgangsmåde til at opnå et DNA-fragment er ved revers transkription af isoleret mRNA ved at benytte RT-PCR. PCR-teknikker er almindeligt kendte som beskrevet ovenfor.

En isoleret cDNA-sekvens kan være ufuldstændig grundet ufuldstændig transkription fra den tilsvarende mRNA, eller kloner kan være opnået indeholdende fragmenter af det komplette cDNA. Forskellige teknikker er kendte inden for området til at fuldføre sådanne delvise cDNA-sekvenser, såsom RACE (rapid amplification of cDNA ends).

Et rekombinant DNA-molekyle omfattende en nukleinsyre eller et DNA-fragment kan være funktionelt forbundet til en promotor.

Til at konstruere et rekombinant DNA-molekyle kan med fordel DNA-plasmider, som bærer promotorer, benyttes. I endnu en foretrukken udførelsesform angår opfindelsen en levende rekombinant bærer (LRC) omfattende en nukleinsyre, et DNA-fragment eller et rekombinant DNA-molekyle ifølge opfindelsen. LRC'er er blevet beskrevet i detaljer ovenfor.

Et DNA-fragment, et rekombinant DNA-molekyle eller LRC kan yderligere omfatte nukleotidsekvenser, såsom immunstimulerende oligonukleotider med umethylerede CpG-dinukleotider eller nukleotidsekvenser, som koder for andet antigent protein eller adjuverende cytokiner.

En værtscelle kan omfatte en nukleinsyre, et DNA-fragment, et rekombinant DNA-molekyle eller LRC.

En værtscelle kan omfatte f.eks. en nukleinsyre, DNA-fragment, rekombinant DNA-molekyle eller LRC stabilt integreret i dens genom eller på et ekstrakro-mosomalt legeme, der replikerer autonomt.

Eksempler på værtsceller som bærer eller med henblik på ekspression af et po-lypeptid eller et protein ifølge opfindelsen er blevet beskrevet ovenfor. Ved anvendelse som en vaccine kan værtscellen være levende eller inaktiveret afhængig af den ønskede virkning. Mange fysiske og kemiske inaktiveringsmetoder af celler er velkendte inden for området; eksempler på fysisk inaktivering er opvarmning eller stråling, f.eks. med UV, røntgenstråler eller γ-bestråling. Eksempler på inaktiverende kemikalier er β-propiolacton, glutaraldehyd, β-ethylenimin og formaldehyd. Når en inaktiveringsmetode skal benyttes, ved fagmanden, at dette fordrer optimering for ikke at forstyrre immunogeniciteten af polypeptidet, proteinet, bæreren eller nukleinsyren omfattet i værtscellen, som skal tilføres til dyret.

Foretrukken anvendelse af en nukleinsyre, et DNA-fragment, et rekombinant DNA-molekyle, LRC eller en værtscelle ifølge opfindelsen er ekspression og tilførsel af SAV E2 VN-epitopen. En måde at opnå dette er ved DNA-vaccinering. En nukleinsyre, et DNA-fragment eller et rekombinant DNA-molekyle ifølge opfindelsen kan administreres til en laksefisk som beskrevet ovenfor. Sådanne fremgangsmåder er velkendte inden for området.

Nukleinsyrevacciner (eller genvacciner eller genetiske vacciner, som de kaldes) kan fordre en målvehikel eller tilførselsvehikel ud over LRC til at målrette den ellre beskytte den eller til at medvirke i dens optagelse i (cellerne i) værten. Sådanne vehikler kan være biologiske eller syntetiske, og er eksempelvis bakterio- fager, viruslignende partikler, liposomer eller mikropartikler, pulverpartikler eller nanopartikler. DNA-vacciner kan let administreres ved intradermal påføring f.eks. med en nåleløs injektor, såsom GeneGun®. Denne administreringsvej tilfører DNA direkte i cellerne på dyret til vaccination. En mængde nukleinsyre, DNA-fragment eller rekombinant DNA-molekyle omfattende en farmaceutisk sammensætning) er i området mellem 10 pg og 1000 pg. Mængder i området mellem 0,1 og 100 pg anvendes fortrinsvis. Alternativt kan fisk neddyppes i opløsninger omfattende f.eks. 10 pg og 1000 pg/ml af DNA til administrering. Alt dette er velkendt inden for området.

Tilsvarende er et DNA-fragment eller et rekombinant DNA-molekyle ifølge opfindelsen inden for rammerne af en bærer ifølge opfindelsen.

Disse anvendelser vil resultere i, at en nukleinsyre vil blive tilført eller et protein bliver udtrykt inde i målorganismen eller dens celler.

De medicinske anvendelser af et polypeptid, protein, bærer eller nukleinsyre ifølge opfindelsen er blevet beskrevet ovenfor. Sammenfattet af dette vacinering af fisk mod SAV for at forhindre eller mindske infektion eller sygdom ved at interferere med etableringen og/eller med progressionen af en SAV-infektion eller med progressionen af kliniske symptomer for SAV-induceret sygdom.

Disse medicinske anvendelser bruges i praksis ved sundhed hos aquatiske dyr, f.eks. ved til en laksefisk at administrere et polypeptid, protein, bærer eller nukleinsyre ifølge opfindelsen.

En farmaceutisk sammensætning kan omfatte et polypeptid, protein, bærer eller nukleinsyre og en farmaceutisk acceptabel bærer. I en udførelsesform angår den farmaceutiske sammensætning ifølge opfindelsen en vaccine omfattende et polypeptid, et protein eller en nukleinsyre ifølge opfindelsen og en farmaceutisk acceptabel bærer.

Et polypeptid, protein, bærer eller nukleinsyre kan anvendes som et lægemiddel for fisk. et polypeptid, protein, bærer eller nukleinsyre kan anvendes til fremstilling af et lægemiddel for fisk.

En fremgangmåde til vaccinering af fisk er ved til en sådan organisme at administrere et polypeptid, protein, bærer eller nukleinsyre i en farmaceutisk effektiv mængde og i en farmaceutisk acceptabel bærer.

En "farmaceutisk effektiv mængde" er beskrevet detaljeret nedenfor.

En fremgangsmåde til at producere en vaccine til fisk er ved at blande polypep-tidet, proteinet, bæreren eller nukleinsyren ifølge opfindelsen med en farmaceutisk acceptabel bærer.

En "farmaceutisk acceptabel bærer" kan f.eks. være vand, salt eller en buffer egnet til formålet. I en mere kompleks form kan formuleringen omfatte en emulsion, som i sig selv omfatter andre forbindelser, såsom et cytokin, en adjuvans, et yderligere antigen osv.

Vaccinen ifølge opfindelsen kan benyttes både til profylaktisk og til terapeutisk behandling.

En adjuvans er et immunstimulerende stof, som forstærker immunresponset af værten på ikke-specifik vis. Mange forskellige adjuvanser er velkendte inden for området. Eksempler på adjuvanser ofte benyttet ved fisk er muramyldipeptider, lipopolysaccharider, adskillige glucaner og glycaner og Carbopol® (en homopo lymer). En omfattende oversigt over adjuvanser egnede til fiskevacciner er givet i oversigtsartiklen af Jan Raa (1996, Reviews in Fisheries Science, bind 4, side 229-288).

Egnede adjuvanser er f.eks. vand-i-olie-emulsioner (w/o), o/w-emulsioner og w/o/w-emulsioner. Olieadjuvanser egnet til anvendelse i w/o-emulsioner er f.eks. mineralske olier eller metaboliserbare olier. Mineralske olier er f.eks. Bay-ol®, Marcol® og Drakeol®; metaboliserbare olier er f.eks. vegetabilske olier, såsom jordnøddeolie og sojabønneolie, eller animalske olier såsom fiskeolierne squalan og squalen. Alternativt kan et E-vitamin-(tocopherol)-solubilisat som beskrevet i EP 382.271 med fordel anvendes.

Meget egnede o/w-emulsioner er f.eks. opnået ud fra 5-50 vægt% vandfase og 95-50 vægt% olieadjuvans, mere foretrukket 20-50 vægt% vandfase og 80-50 vægt% olieadjuvans. Mængden af tilsat adjuvans afhænger af arten af adjuvansen, og information med henblik på sådanne mængder tilvejebragt af producenten.

En stabilisator kan sættes til en vaccine ifølge opfindelsen f.eks. for at beskytte den mod nedbrydning, til at øge dens længertid eller til at forbedre frysetørringseffektiviteten. Anvendelige stabilisatorer er bl.a. SPGA (Bovarnik et al., 1950, J. Bacteriology, bind 59, side 509), skummetmælk, gelatine, bovin serumalbumin, carbonhydrater f.eks. sorbitol, mannitol, trehalose, stivelse, saccharose, dextran eller glucose, proteiner såsom albumin eller casein eller nedbrydningsprodukter heraf og buffere, såsom alkalimetalphosphater.

Herudover kan vaccinen omfatte en eller flere egnede overfladeaktive forbindelser eller emulgatorer f.eks. Span® eller Tween®.

Vaccinen kan også omfatte en såkaldt "vehikel". En vehikel er en forbindelse, hvorpå polypeptidet eller proteinet ifølge opfindelsen klæber uden at være cova- lent bundet til den. Sådanne vehikler er bl.a. bio-mikrokapsler, mikroalginater, liposomer og makrosole, og er alle kendt inden for området. En speciel form for en sådan vehikel er en ISCOM, som beskrevet ovenfor.

Det er unødvendigt at tilføje, at iblanding af andre stabilisatorer, bærere, fortyndingsmidler, emulsioner og tilsvarende til vacciner ifølge opfindelsen også er inden for området af opfindelsen. Sådanne additiver er f.eks. beskrevet i velkendte håndbøger såsom: Remington: the science and practice of pharmacy" (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472) og "Veterinary vaccinology" (P. Pastoret et al., ed., 1997, Elsevier Amsterdam ISBN: 0444819681).

Af hensyn til f.eks. stabilitet eller økonomi kan en sammensætning ifølge opfindelsen være frysetørret. I almindelighed vil dette muliggøre forlænget lagring ved temperaturer over 0°C f.eks. ved 4°C. Fremgangsmåder til frysetørring er kendte af fagfolk inden for området, og udstyr til frysetørring i forskellig skala er kommercielt tilgængeligt.

En vaccin kanderfor være i en frysetørret form.

For at rekonstituere en frysetørret sammensætning opslæmmes den i et fysiologisk acceptabelt fortyndingsmiddel. Et sådant fortyndingsmiddel kan f.eks. være så enkelt som sterilt vand eller en fysiologisk saltopløsning. I en mere kompleks form kan den frysetørrede vaccine opslæmmes i en emulsion f.eks. som beskrevet i EP 1.140.152.

En vaccine ifølge opfindelsen kan antage en vilkårlig form, som er egnet til administrering i forbindelse med aqua-kulturdyrkning, og som passer til den ønskede tilførselsvej og den ønskede virkning. Fremstilling afen vaccine ifølge opfindelsen udføres ved konventionelle midler af fagmanden.

Fortrinsvis formuleres vaccinen ifølge opfindelsen i en form egnet til injicerings-vaccination eller neddypningsvaccination, såsom en opslæmning, opløsning, dispergering, emulsion og tilsvarende. Almindeligvis fremstilles sådanne vacciner sterilt.

Dyret, der sigtes på til vaccinen ifølge opfindelsen er en fisk, fortrinsvis en laksefisk, mere foretrukket en regnbueørred (Oncorhynchus mykiss) eller en atlan-terhavslaks (Salmo salar L).

Doseringsskemaet for tilførsel af en vaccine ifølge opfindelsen til målorganismen kan være i enkelte eller multiple doser, som kan gives samtidigt eller sekventielt på en vis, der er forligelig med dosering og formulering, og i en sådan mængde, at den vil være immunologisk effektiv.

En fagmand kan nemt bestemme, hvorvidt en behandling er "immunologisk effektiv" f.eks. ved at administrere en eksperimentel provokeringsinfektion til vaccinerede dyr og dernæst bestemme et måldyrs kliniske tegn på sygdom, serologiske parametre eller ved at måle genisolering af patogenet.

Hvad der udgør en "farmaceutisk effektiv mængde" af en vaccine ifølge opfindelsen, som er baseret på et polypeptid, et protein, en bærer eller en nukleinsyre ifølge opfindelsen, afhænger af den ønskede virkning på målorganismen. Bestemmelse af den effektive mængde ligger inden for rutinepraksis.

En foretrukken mængde af et polypeptid eller en protein er mellem 1 ng og 1 mg per dyredosis. Mere foretrukket er mængden mellem 10 ng og 100 pg/dosis, og endog mere foretrukket mellem 100 ng og 10 pg/dosis. En dosis ud over 1 mg om end immunologisk meget passede, vil være mindre attraktiv af kommercielle årsager.

En foretrukken mængde nukleinsyre, DNA-fragment eller rekombinant DNA-molekyle er blevet beskrevet ovenfor.

En foretrukken mængde af en levende rekombinant bærer ifølge opfindelsen omfattet i en vaccine ifølge opfindelsen er afhængig af karakteristikaene af den anvendte mikroorganismebærer. En sådan mængde udtrykkes f.eks. som plakdannende enheder (pfu), kolonidannende enheder (cfu) eller vævskulturinficerende dosis 50% (TCID50), afhængig af, hvad der er en bekvem måde at kvantificere LRC-organismen på. For en levende viral vektor kan eksempelvis et dosisområde mellem 1 og 1010 plakdannende enheder (pfu) per dyredosis med fordel benyttes; fortrinsvis et område mellem 102 og 106 pfu/dosis.

En foretrukken mængde af en værtscelle i en vaccine er mellem 1 og 109 værtsceller per dyredosis. Mere foretrukket benyttes mellem 10 og 107 cel-ler/dosis.

Mange administreringsveje kan benyttes, alle kendte inden for området. Vaccinerne ifølge opfindelsen administreres fortrinsvis til fisk via injicering, neddyp-ning, nedsænkning eller oralt. Protokollen for administreringen kan optimeres ifølge standardvaccineringspraksis. Et overblik over fiskevaccinering af Bowden et al (Fischeries Research Service Marine Laboratory, Aberdeen, Skotland) er tilgængelig som en Industry Report of 27-3-2003, fra www.intrafish.com.

Fortrinsvis administreres vaccinen via immersion eller oralt. Dette er særligt effektivt i tilfælde af anvendelsen af sådanne vacciner i forbindelse med kommerciel aqua-kulturdyrkning.

Foretrukne udførelsesformer vedrørende anvendelse af bærere ved oral vaccinering er blevet beskrevet ovenfor.

Alderen, og derfor vægten af fisken til vaccinering er ikke kritisk om end det åbenbart er fordelagtigt at vaccinere mod SAV så tidligt som muligt for at undgå infektion. Unge laksefisk kan vaccineres allerede ved 0,2 g og før de når 5 g. Fisk med en vægt mindre end 0,5 g antages imidlertid at være utilstrækkeligt immunkompetente. I praksis vil man derfor forsøge at vaccinere fisk med en vægt mellem 0,5 og 5 g. Eftersom det er en af fortjenesterne ved den foreliggende opfindelse, at det nu er muligt at udføre tidlig diagnose af SAV, kan der udvikles kontrolforanstaltninger, såsom hygiejnisering for at udskyde eller reducere udbrud i det geografiske område, indtil fiskene er blevet vaccinerede.

Det er meget effektivt at formulere en vaccine ifølge opfindelsen som en kombinationsvaccine, dvs. ved at kombinere et polypeptid, protein, en bærer eller nukleinsyre ifølge opfindelsen med mindst en anden fiskepatogen mikroorganisme eller virus med et antigen af en sådan mikroorganisme eller virus eller med en nukleinsyre, som koder for at sådant antigen.

En vaccine kan derfor være en kombinationsvaccine.

Fordelen ved en sådan kombinationsvaccine er, at ikke blot tilvejebringes beskyttelse mod SAV, men også mod andre sygdomme, mens kun en vaccine-ringsmanipulation er fordret, hvorfor der undgås unødvendig belastning af dyrene såvel som omkostninger i forbindelse med tid og arbejdskraft.

En kombinationsvaccine kan omfatte mindst en anden mikroorganisme eller virus, som er patogen over for fisk, fortrinsvis laks, eller et andet antigen fra en virus eller mikroorganisme, som er patogen over for fisk, eller en nukleinsyre, der koder for nævnte antigen. I En kombinationsvaccine er den anden mikroorganisme eller virus eller antigenet eller nukleinsyre, som koder for nævnte antigen derfor valgt fra gruppen bestående af Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida, Vibrio anguillarum, V. anguillarum serovar 01 og serovar 02, V. salmonicida, Moritella viscosa (=V. viscosus), Photobacterium damselae underarter piscididae, Tenacibaculum ma-ritimum, Yersinia ruckeri, Piscirickettsia salmonis, Renibacterium salmoninarum, Lactococcus garvieae, Flavobacterium sp., Flexibacter sp., Streptococcus sp., Lactococcus garviae, Edwardsiella tarda, E. ictaluri. Infektiøs pancreatisk necrosevirus, Infectøs lakseanæmivirus, Nervøs Necrosevirus og hjerte- og skeletmuskelinflammation.

Sygdommen hjerte- og skeletmuskelinflammation (HSMI) er en nyligt beskrevet laksesygdom af viral oprindelse (Kongtorp et al., 2005, J. of Fish diseases, bind 27, side 351-358).

Vaccinerne ifølge opfindelsen beskrevet ovenfor bidrager til aktiv vaccinering, dvs. de initierer værtens forsvarssystem. Alternativt kan virusneutraliserende antistoffer dannes mod polypeptidet, proteinet eller bæreren ifølge opfindelsen som anført ovenfor. Sådanne V-antistoffer kan dernæst administreres til fisken. Denne fremgangsmåde for vaccinering, såkaldt passiv vaccinering, er den foretrukne vaccinering, når et dyr allerede er inficeret, og der ikke er tid til at tillade det naturlige immunrespons at blive igangsat. Det er også den foretrukne fremgangsmåde til at vaccinere dyr, som er tilbøjelige til at få et højt og pludseligt infektionstryk. De administrerede VN-antistoffer neutraliserer SAV, hvilket har den store fordel, at den nedsætter eller standser etableringen eller progressionen af en SAV-infektion næsten med det samme uafhængigt af fiskens immunstatus.

En vaccine kan omfatte lakse-a-virusneutraliserende antistoffer.

En vaccine kan også fremstilles ved at benytte antistoffer fremstillet fra æg fra høns, som er blevet vaccineret med en vaccine ifølge opfindelsen (IgY-antistoffer).

Fortrinsvis fremstilles en vaccine til oral administrering af antistofferne, i hvilken antistofferne er blandet med en spiselig bærer, såsom fiskefoder. I et andet aspekt angår opfindelsen et diagnostisk testkit omfattende en po-lypeptid, et protein, en bærer eller en nukleinsyre ifølge opfindelsen.

Som nævnt ovenfor kan mortaliteten efter SAV-infektion være op til 60%. Til effektiv beskyttelse og kontrolformål mod SAV og dets fremkaldte sygdomme er således en hurtig og specifik diagnose af SAV af betydning.

Det er et andet mål med den foreliggende opfindelse derfor at tilvejebringe diagnostiske redskaber egnede til påvisning af SAV.

Et diagnostisk testkit til påvisning af antigene materialer omfattende en SAV E2 VN-epitop ifølge opfindelsen er egnet og specifik til påvisning af alle SAV-undertyper. En sådan test kan f.eks. omfatte en standardantigen-ELISA-test, hvor brøndene i en ELISA-plade er overtrukket med et antistof rettet mod SAV E2 VN-epitopen. Sådanne antistoffer er reaktive med SAV E2 VN-epitopen som omfattet i polypeptidet, proteinet eller bæreren ifølge opfindelsen, og kan opnås som beskrevet ovenfor. Efter inkubering vil materialet blive testet, idet mærkede antistoffer reaktive over for SAV E2 VN-epitopen tilsættes brøndene. En farvereaktion afslører dernæst tilstedeværelsen af bundet antigent materiale fra SAV. Protokol til mærkning af antistoffer ved kobling af en fluorescerende gruppe til immunoglobuliner eller en anden markør er velkendt inden for området. Se f.eks. http://www.ihcworld.com/protocol_database.htm.

Et diagnostisk kit til påvisning i en prøve eller i et dyreserum af antistoffer reaktive med SAV E2 VN-epitopen ifølge opfindelsen er også egnet og specifik til påvisning af et immunrespons over for SAV eller en vilkårlig af undertyperne.

En sådan test kan eksempelvis omfatte en standard antistof-ELISA-test. I en sådan test kan brøndene på en ELISA-plade f.eks. være overtrukket med SAV E2 VN-epitopen omfattet i et polypeptid, et protein eller en bærer ifølge opfindelsen. Efter inkubering med materialet til afprøvning sættes mærkede antistoffer reaktive med immunoglobulinerne i testprøven (såfremt de er til stede) til brøndene. En farvereaktion afslører dernæst tilstedeværelsen i prøven af antistoffer reaktive med SAV E2 VN-epitopen ifølge opfindelsen. I en udførelsesform angår opfindelsen derfor diagnostiske testkits til påvisning af antistoffer reaktive med SAV E2 VN-epitopen. Sådanne testkits omfatter polypeptidet, proteinet eller bæreren ifølge opfindelsen.

Konstruktionen af et sådant immunoassay kan variere. F.eks. kan immunoas-sayet også være baseret på konkurrence i stedet for direkte binding. Ydermere kan sådanne tests også benytte partikelformet eller cellulært materiale i stedet for den faste bærer på anordningen. Påvisningen af antistof/antigen-komplekset dannet ved testen kan involvere anvendelsen af mærkede antistoffer, hvor mærkerne eksempelvis kan være enzymer eller fluorescerende, luminesceren-de eller radioaktive molekyler eller farvestoffer.

Egnede fremgangsmåder til påvisning af antistoffer reaktive med SAV E2 VN-epitopen ifølge opfindelsen i en prøve indbefatter det enzymforbundne im-munosorbentassay (ELISA), immunfluorescenstest (IFT) og Western blotanalyse.

En hurtig og let diagnostisk test til at diagnosticere tilstedeværelsen eller fraværet af SAV er en PCR-test som beskrevet ovenfor omfattende primere, der specifikt hybridiserer til en nukleinsyre i en testprøve, som er tilsvarende en nukleinsyre ifølge opfindelsen. Sådanne primere er eksempelvis følgende to, som giver et produkt på 188 nukleotider inde fra SAV E2 VN-epitopen ifølge opfindelsen: FWD: 5'-TTGACGTGTACGACGCTCTG-3' (SEQ ID NO: 9) REV: 5'-AACCGGCTCCTCACACGTAAAC-3' (SEQ ID NO: 10)

Nukleinsyren, DNA-fragmentet, rec DNA-molekylet eller bæreren ifølge opfindelsen kan med fordel anvendes i en sådan PCR-test som positiv standard.

Alternativt kan en sådan diagnostisk test benytte nukleinsyren, DNA-fragmentet, rec DNA-molekylet eller bæreren ifølge opfindelsen i en opsætning med hybri-disering uden amplificering til eksempelvis en membran eller en anordning.

Opfindelsen skal nu yderligere beskrives med reference til de følgende eksempler.

Eksempler Eksempel 1: Kloning

En SPDV E3E2-sekvens blev opnået fra et SAV-undertype 3-isolat: en SPDV-inficeret atlantisk laks fik taget som prøve fra en akvakulturfarm i Norge (Mølsvik). Fra dets hjertevæv blev fremstillet et totalt RNA-ekstrakt ved anvendelse af "Absolutely RNA-miniprep kit" (Stratagene), ifølge producentens anvisninger. Fra det fremstillede cDNA blev hele den E3E2-kodende region amplifi-ceret med RT-PCR-primere. De anvendte primere var:

Til den reverse transkription blev følgende primer benyttet: RTE2: 5'-CCGCGCGAGCCCCTGGTATGCAACACAGTGC-3' (SEQ ID NO: 11)

Dernæst blev high fidelity PCR-amplificering udført ved anvendelse af pfu-turbopolymerase (Stratagene) med primersættet: RT-E2 Xhol: 5'-ATACCAGGGGCTCGCGCCTCGAGACCCTACTTG-3' (SEQ ID NO: 12) PCR-E3 Hindlll: 5'-GATGCCATAAGCTTGACACGCGCTCCGGCCCTC-3' (SEQ ID NO: 13)

Endelig blev sekvensen af E2E2-genet bestemt ved sekvensbestemmelse med disse to PCR-primere og to interne primere: PD5: 5'-CGTCACTTTCACCAGCGACTCCCAGACG-3' (SEQ ID NO: 14) PD3: 5'-GGATCCATTCGGATGTGGCGTTGCTATGG-3' (SEQ ID NO: 15)

Sekvensbestemmelse blev udført med Big Dye 3.1® (Applied Biosystems) ifølge producentens anvisninger.

Den fuldstændige nukleotidsekvens for den E2-kodende region af Mølsvik SAV-isolatet vil blive offentliggjort under adgangsnummeret DQ 195447, men til opfindelsen er alle relevante sekvenser blevet anført her.

Efter at være blevet verificeret ved sekvensbestemmelse blev E2E2-PCR-produktet fordøjet natten over med restriktionsenzymerne Xhol og Hindlll og klonet i de tilsvarende unikke steder på pET30a(+)-vektoren (Novagen), hvilket førte til konstruktionen pET30a/E3E2.

Subkloninq af regioner stammende fra SAV E2:

Fra Mølsvik SAV E2-sekvensen blev opnået forskellige kortere sekvenser med en subkloningsstrategi, i hvilken PCR med et sæt primere, der er hybridiseret til forskellige stillinger på E2-genet blev benyttet. Primerne anvendt til at amplifice-re fragmenterne af den SAV E2-kodende region (med konstruktionen pET30a/E3E2 som templat) er anført i tabel 3 og blev konstrueret som følger: forward-primere begynder med 3-5 tilfældige A eller T nukleotider efterfulgt af et Ndel-restriktionssted. Dernæst kommer 16 til 20 tilsvarende nukleotider, og længden optimeres afhængig af den specifikke lokale sekvens og selekteres til at begynde PCR-fragmentet ved et ønsket nukleotid. Primere er i alt på 24 til 30 nukleotider. reversprimere omfatter også 3-5 tilfældige A- eller T-nukleotider, men efterfølges af et Ncol-restriktionssted og dernæst 16-20 specifikke nukleotider.

Tabel 3: Primere anvendt her til at fremstille fragmenter af SAV E2.

Fragmenter produceret i PCR blev fordøjet natten over med Ndl og Ncol og klonet i de pET30a(+)-bakterielle ekspressionsplasmider (Novagen).

Fordi Ndel-restriktionsstedet indbygger en ATG-startcodon begyndte ekspression på dette methionin.

Klonede sekvenser blev verificeret ved DNA-sekvensbestemmelse med standard pET-T7-promotorprimeren: 5'-AATACGACTCACTATAGGG-3' (SEQ ID NO: 25) og standard T7-terminatorprimeren: 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3' (SEQ ID NO: 26) for at opnå overlappende contigs, som dækker hele den klonede sekvens.

Subklonede fragmenter af SAV E2 blev udtrykt i E. coli, og proteinfragmenterne produceret blev anvendt i eksperimenter in vivo og in vitro for at teste SAV E2 VN-epitopen ifølge opfindelsen.

Rekombinante proteiner blev også udtrykt som fusionsproteiner med pET30a(+)-plasmiderne ved at klone disse i en ramme med en 6 x His-tag eller et β-gal-gen (LacZ) inserteret i et pET30a(+)-plasmid.

For at konstruere pET30a/LacZ-vektoren blev lacZ-genet indeholdt i vektoren pVAX1/LacZ (Invitrogen) amplificeret med PCR ved anvendelse af primerne:

LacZ'Ncol: 5'-GTATGCCCATGGAACGTCGTTTTACAACGTCGTG-3' SEQ ID NO: 27

LacZ'_Xhol: 5'-GTCTCGCTCGAGTTATTTTTGACACCAGACCAACTGG-3' SEQ ID NO: 28

Efter fordøjelse natten over med Ncol og Xhol blev det fordøjede PCR-produkt klonet i de pågældende restriktionssteder på pET30a(+)-plasmidet. Fordøjelse af denne pET30a/LacZ-konstruktion med Ndel/Ncol tillod inserteringen i ramme af de beskrevne E2-subfragmenter fordøjet med Ndel/Ncol.

Eksempel 2: Ekspression

Ekspression af de forskellige E2-fragmenter blev foretaget i BL21 Rosetta 2 E.coli-celler. pET3a-plasmiderne indeholdende de forskellige E2-genfragmenter blev benyttet til at transformere Rosetta 2-celler (Novagen) ifølge leverandørens anvisninger. En forkultur (20 ml) natten over af transformerede E. coli blev benyttet næste dag til at kode 800 ml kulturer med 5 ml prækultur. Da OD600 var ca. 0,7, blev IPTG sat til en 1 mM slutkoncentration til fremkaldelse af ekspression. Denne blev dyrket i yderligere 2 timer. Derpå blev kulturerne centrifugeret ved 7000 o/m i 5 min og den bakterielle cellepellet blev holdt ved -80°C indtil anvendelse.

Oprensning

For at oprense inklusionslegemerne blev benyttet to buffere: buffer A: 50 mM tris/HCI, pH 8,0 + 2 mM EDTA buffer B: buffer A + 1% (slutkoncentration) Triton X-100

Dernæst vedrørende cellepelletten af en 800 ml kultur: cellepelletten blev gen-opslæmmet i 50 ml buffer A og der blev tilsat frisk fremstillet lysozym (fra en stamopløsning med 10 mg/ml) til en slutkoncentration på 100 pg/ml. 25 ml buffer B blev dernæst tilsat og 10 pi Benzonase® (MERCK). Dette blev inkuberet ved 30°C i 15 min med svag rysten til fjernelse af DNA.

Dernæst blev 100 ml buffer B tilsat, og blandingen blev ultralydsbehandlet i 4 x 30 sek. Det ultralydsbehandlede blev centrifugeret ved 12.000 x g i 20 min ved 4°C. Inklusionslegemepelletten blev vasket med 250 ml buffer B og med 200 ml PBS. Til slut blev pelletten, som indeholdt rec E2-protein-fragmenterne, gen-opslæmmet i 40 ml (4 x 10 ml) PBS og holdt ved -80°C indtil anvendelse.

Rekombinante E.coli-proteiner blev kvantificeret ved scanning og analyse af prøver kørt på SDS-PAA-geler, som var blevet farvede med Coomassie bb., i forbindelse med spor med mærkeprotein ifølge standardprocedurer.

Eksempel 3: Afprøvning oa anvendelse

Monoklonalt antistof

Til at teste de rekombinante SAV E2-proteinfragmenter blev anvendt et SAV-neutraliserende monoklonalt antistof. Dette var blevet produceret ved at immunisere Balb/c-mus med 1010 SAV virusstamme S49P i Freunds fuldstændige adjuvans opnået fra en polyethylenglycolkoncentreret CHSE-214 cellekultursu-pernatant. Der blev givet Booster-injiceringer med Freunds ufuldstændige adjuvans og uden adjuvans ved anvendelse af standardteknikker. Miltceller fra mus blev fusioneret med Sp20-tumorceller og de resulterende hybridomer blev selekteret i FIAT-medium. Monoklonale antistoffer (Mab) produceret blev udvalgt for binding til SAV-virus på SAV-inficerede CFISE-214-celler ved hjælp af immunofluorescens ved anvendelse af standardteknikker. Positive blev testet i virusneutraliseringsassay. Flybridomacellerne, der producerede VN-positive Mab, blev opskalerede ved at fremstille ascites i mus ved standardfremgangsmåder.

Immunofluorescensassav (IFA): IFA biøv udført på SAV-inficørødø CHSE-214-cøllør og på pET-plasmid-transfekterede E.coli-cøllør, som udtryktø røc-protøinøt af intørøssø, mød pas-sende positiv© og negative kontroller. Cellerne blev fikseret i 96% ethanol:acetone 1:1 ved -20°C i 30 min og skyllet 3 gange med PBST (PBS 1 x + 0,05% Tween 20). Det primære antistof fortyndet i PBST blev sat til og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur. Dernæst blev pladerne skyllet med PBST, og det andet antistof blev påført: et FITC-konjugeret antimuseantistof. Efter inkube-ring og vask blev hver brønd bedømt ved observation med immunfluorescens-mikroskop og et passende UV lysfilter. De inficerede celler, som reagerede positivt med det primære antistof, sås at fluorescere.

Immunblottinq

Til Western blot-prøver blev der kørt på 10% SDS/PAA-geler (NuPAGE®· No-vex) og blottet nitrocellulose ifølge producentens instruktioner. Til dot-blot blev 5 pi prøver anbragt direkte på membraner med en pipette og efterladt til tørring i 5-10 min. Dernæst blev membranen blokeret med Tris-bufret saltvand + 0,05% Tween 20 (TBST) + 5% skummetmælk, natten over ved 4°C. Membranen inkuberes med det primære antistof, fortyndes til den passende konstruktion i TBST + 1% skummetmælk i 1 time ved stuetemperatur. Derpå efter 3 vaske i TBST inkuberes membranen med det sekundære antistof, en alkalisk phosphatase konjugeret gede-anti-mus-lgG i TBST. Efter vask med TBST blev udført en alkalisk phosphatasefarvereaktion med Alkaline Phosphatase Conjugate Substrate Kit ifølge producentens anvisninger (BioRad). Reaktionen blev standset med destilleret vand, og membranerne blev tørret og digitaliseret.

Resultater af immunblot med polypeptiderne og proteinerne ifølge opfindelsen er vist i fig. 5 og 6:

Fig. 5 viser et dot-blot af forskellige polypeptider og proteinerne ifølge opfindelsen farvede med et SAV-neutraliserende monoklonalt [antistof].

Positiv genkendelse fandtes for: den positive kontrol SAV E2-protein i fuld længde, polypeptiderne F1R1, F1R2, F1R3 og F2R3*

Negativ respons blev detekteret for den negative kontrol SAV E1-protein, polypeptiderne F1R4 og F3R3

Forholdet mellem positiv og negativ blev observeret både når prøverne var blevet denaturerede i en prøvebuffer indeholdende β-mercaptoethanol og dithio-threitol og blev kogt før pletanbringelse (øverst) såvel som når prøverne blev taget op i en ikke-denaturerende prøvebuffer og ikke var kogt (nederste del).

Fig. 6 viser et Western-blot af et polypeptid ifølge opfindelsen fremstillet med primere F1 og R3, der således dækker delen af SAV E2 fra aa 139-290, og af et protein ifølge opfindelsen, hvor SAV E2-fragmentet er fremstillet med primerne F2 og R3 og således dækker aa 158-252, i en fusionskonstruktion med β-gal-protein. Blottet blev inkuberet med et SAV-neutraliserende Mab og adskillige specifikke bånd blev påvist. Bånd påvist i F1R3-sporene er ved 22 og 44 kDa og er sandsynligvis en monomer og dimer form af polypeptidet. NB: Om end den udregnede vægt af polypeptidet kun er 15 kDa løb dette bånd på gelen langsommere sandsynligvis grundet tilstedeværelsen af disulfbroer, som ikke var fuldstændigt denaturerede i prøveforberedelsen. T2R3-3-gal-sporene viser et bånd med ca. 126 kDa, som repræsenterer fusionsproteinet af F2R3 (10 kDa) og β-gal (116 kDa). VN-assav

Lige volumener af en fortynding af det SAV-neutraliserende Mab og 100 TCIDso af en SAV-prøve i EMEM-kulturmedie med 2% serum blev blandet i en mikroti-terplade og inkuberet 2 timer ved 20°C. SAV-isolater fra alle undertyper blev anvendt i VN-assayet (F93-125 [undertype 1], S49P [2] og PD03-08 [3]). Dernæst blev CFISE-214-celler i EMEM-kulturmedie med 5% serum sat til med en tæthed på 2,5 x 105/ml. Pladerne blev inkuberet i C02-inkubatorer 5-7 dage ved 15°C.

Efter 5-7 dage blev pladerne aflæst med lysmikroskopi, idet cellerne med cy-topatisk effekt (cpe) blev identificeret, hvilket indikerede fortynding af Mab, som ikke var i stand til fuldstændigt at neutralisere testvirussen. Cpe var positiv, når klumper af celler blev observeret, som var blevet afrundet og blev mere refrakti-ve.

Alternativt blev celler fikseret i ethanol/acetone, skyllet med PBST og farvet i IFA som beskrevet ved anvendelse som primært antiserum af et polyklonalt ka-ninantiserum mod SPDV E1-protein (serum AB06). I et typisk eksperiment viste resultaterne af en VN-test på F93-195 og PD03-08 aflæst med cpe fuldstændig viral neutralisering af den SAV-neutraliserende Mab-ascites op til en fortynding på 32.000. Dette blev bekræftet med IFA.

Dyreforsøg: I et dyreforsøg blev unge atlanterhavslaks vaccineret med proteiner ifølge opfindelsen. Anvendte proteiner var F2R3 fusioneret med β-gal og F1R3 fusioneret til en 6 x histidin-mærke.

Kort fortalt:

Proteiner blev udtrykt i E. coli og oprenset som beskrevet. Protein blev formuleret til en 30% vand-i-olie-emulsion med Montanide ISA 763A. Dyrene blev vaccineret med 150 pg/dosis og boostet med 100 pg/dosis. Positiv kontrol var den kommercielle inaktiverede SPDV-vaccine Norvax® Compact PD. Negative kontroller var: saltvand, emulsion uden protein og β-gal uden fusion.

Test-dyrene var atlantiske smålaks på ca. 40 g, som var akklimatiserede i forsøgsomgivelserne i 1 uge, og dernæst blev vaccineret intraperitonealt ved anvendelse af en standardprocedure. Normal blodprøvetagning blev benyttet. Efter 5 uger fik fisken boostervaccineringen og efter yderligere 3 uger blev fisken provokeret med en dosis på 103 TCIDso/dyr af PD03-08 (SAV undertype 3). Beskyttende evne vil blive værdisat ved at analysere kliniske tegn for sygdom serologi, overordnet patologi og histologi.

Antistof-ELISA:

En ELISA-test blev sat op til at påvise anti-SAV-antistoffer i lakseserum. Den almene procedure var som beskrevet ovenfor. Kort fortalt: et SAV-neutraliserende Mab blev overtrukket mikrotitreringsbrønde, inkuberet med en standard SPDV-prøve og vasket. Lakseserum blev tilført i PBST + 1 % skummetmælk i en seriel fortynding som dobbeltbestemmelser. Passende positive og negative kontroller blev benyttet. Inkubering var natten over ved 4°C, hvorpå pladerne blev vasket og inkuberet med en polyklonal antilakseserum fra en kanin. Endelig inkuberedes et tredje antistof: gede-anti-kanin konjugeret til HRP. Endelig kolorimetrisk påvisning blev foretaget ved at benytte et HRP-substrat og H2O2 ifølge producentens anvisninger.

Typisk kunne SAV-antistoffer påvises med god specificitet og følsomhed i sera fra SPDV-inficerede laks.

Forklaring til figurerne

Fig. 1:

Grafisk repræsentation af længden og positionen af de forskellige proteinsekvenser beskrevet heri i forhold til de tilsvarende regioner i SAV E2-proteinet i fuld længde.

Fig. 2, 3, 4:

Multipel orientering af regionerne aa henholdsvis 158-252, 139-290 eller 111-304 af adskillige SAV E2-proteiner. Indgange er identificeret ved adgangsnumre og er beskrevet i tabel 1. Referencestammen er SPDV-isolat N3 (adgangs-nummer AAU01400.1). Konsensussekvensen fra den multiple orientering af disse regioner er lig med SEQ ID NO: 4, 5 eller 6.

Tal over sekvenserne indikerer antallet af aminosyrer svarende til SAV E2; tal under konsensussekvenserne indikerer den totale længde af polypeptiderne.

Fig. 5:

Dot-blot af forskellige polypeptider og proteiner farvet med et SAV-neutraliserende monoklonalt antistof. Øverst: denaturerede prøver, nederst: ik-ke-denaturerede prøver.

Fig. 6:

Western-blot af polypeptidet F1R3 og proteinet F2R3-p-gal farvet med et SAV-neutraliserende monoklonalt antistof.

Claims (9)

1. Polypeptid omfattende en aminosyresekvens med mindst 90% aminosyre-identitet i forhold til en vilkårlig af SEQ ID NO: 1-3 over deres fulde længde, og hvor aminosyresekvensen er i stand til at inducere et neutraliserende immunrespons overfor lakse-a-virus kendetegnet ved, at polypeptidet er mindst 95 og højst 166 aminosyrer i størrelse.

2. Protein omfattende et polypeptid ifølge krav 1, hvor nævnte protein ikke omfatter en del, der er større end 166 aminosyrer i størrelse af et lakse-a-virus (SAV) E2-protein omfattende nævnte polypeptid

3. Polypeptid omfattende en del af et SAV E2-protein, kendetegnet ved, at nævnte del har mindst de 95 aminosyrer af aminosyresekvensen fra SEQ ID NO: 4 og højst de 194 aminosyrer af aminosyresekvensen fra SEQ ID NO: 6.

4. Protein omfattende et polypeptid ifølge krav 3, hvor nævnte protein ikke omfatter en del, som er større end nævnte polypeptid, af et SAV E2-proteinomfattende nævnte polypeptid.

5. Fremgangsmåde til at producere lakse-a-virus-neutraliserende antistoffer omfattende trinnene: a) podning af et polypeptid ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 3, et protein ifølge et vilkårligt af kravene 2 eller 4 i et ikke-humant dyr og b) isolering af antistoffer fra nævnte podede ikke-humane dyr.

6. Nukleinsyre, der koder for et polypeptid ifølge et vilkårligt af kravene 1 eller 3, eller et protein ifølge et vilkårligt af kravene 2 eller 4.

7. Bærer omfattende en nukleinsyre ifølge krav 6, hvor nævnte bærer er valgt fra gruppen bestående af et DNA-fragment, et rekombinant DNA-molekyle, en levende rekombinant bærer og en værtscelle.

8. Vaccine omfattende et polypeptid ifølge et vilkårligt af kravene 1 eller 3, et protein ifølge et vilkårligt af kravene 2 eller 4, en bærer ifølge krav 7, eller en nukleinsyre ifølge krav 6 og en farmaceutisk acceptabel bærer.

9. Diagnosekit omfattende et polypeptid ifølge et vilkårligt af kravene 1 eller 3, et protein ifølge et vilkårligt af kravene 2 eller 4, en bærer ifølge krav 7 eller en nukleinsyre ifølge krav 6.