KR20040086480A - 감압/가압의 이용을 포함한 일렉트로포레이션법 - Google Patents
감압/가압의 이용을 포함한 일렉트로포레이션법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명의 목적은 통상의 기술보다 더욱 간단하고 더욱 빠른 형질전환 방법을 수립하는 것이다. 본 목표는 a) 대기압과 다른 압력 하에서 세포를 유지시키고, b) 일렉트로포레이션을 유도할 수 있는 조건 하에 세포 및 핵산을 놓는 단계로 구성된 방법에 의해 해결될 수 있다. 본 발명은 유전자 도입 후 통상적으로 요구되는 배양의 필요성을 제거한다. 따라서 본 발명은 통상적인 기술에 의해 형질전환하는 것이 불가능하거나 매우 어려운 종의 형질전환체를 수득하는 것을 가능하게 한다. 본 발명의 간단한 형질전환 방법은 당분야의 연구 및 개발에 대한 대규모 처리 및 대규모 분석을 쉽게 가능하게 한다. 더욱이 본 발명은 연구의 극적인 진보를 야기시키고 잠재적으로는 혁신적인 재조합체의 개발을 이끈다.
Description
인간은 그들의 생존을 위해 밀, 보리, 쌀, 옥수수, 대두 등과 같은 주요 곡류에 매우 의존적이다. 전세계적인 인구 생장에 상충하는 식량의 생산을 증가시키기 위해 통상적인 농작물 보다 더 높은 산출량을 지닌 농작물을 개발할 필요가 있다. 재조합 DNA 기술은 더 높은 산출량을 지닌 품종 개량을 위한 수단으로서 형질전환 농작물을 개발하는데 사용되었다.
예를 들어 중국 양배추, 토마토, 오이 등과 같은 채소는 우리의 음식물을 풍성하게 하고 영양면에서 중요한 농작물이다. 그러나 이들 채소는 다양한 질병 또는 병원균 손상에 대해 민감하다. 재조합 유전공학 기술이 질병 또는 병원균 손상에 대한 저항성을 부여하는데 사용되면 안정한 산출량을 달성하는 것이 가능하다. 이러한 요구에 상충하기 위해 유용한 유전자의 분리 및 유전자를 포함한 형질전환 방법이 개발되어 왔다.
식물을 형질전환하기 위해 일반적으로 2가지 방법이 있다 : 유전자가 식물 내로 직접적으로 도입되는 직접적인 도입 방법; 및 유전자가 식물 내로 간접적으로 도입되는 간접적인 도입 방법.
현재 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용한 간접적인 유전자 도입 방법이 널리 이용되고 있다. 예를 들어 쌀 숙성 종자가 배양되고 3주 후 수득된 캘러스가 아그로박테리움으로 감염되고(Hiei et al., Plant Journal, 6:271-282, 1994); 또는 발아 4∼5일 후 종자가 아그로박테리움으로 감염되어 형질전환체가 빠르게 수득될 수 있다(Tanaka et al., 일본특허 제3141084).
직접적인 유전자 도입 방법의 예는 입자총법(Christou P. et al., Bio/Technology, 9:957-962, 1991), 폴리에틸렌글리콜 방법(Datta S. K. et al., Bio/Technology, 8:736-740, 1990), 일렉트로포레이션법(Shimamoto K. et al., Nature, 338:274-276, 1989) 등을 포함한다. 이들 기술은 형질전환체의 생성에이용된다. 일렉트로포레이션은 세포가 원하는 유전자(즉 DNA)를 함유한 용액 내에 놓이고 유전자가 전기적 자극에 의해 세포 내로 도입되는 유전자 도입 방법이다.
직접적인 유전자 도입 방법은 간접적인 유전자 도입 방법에 비해 조직 배양 및 아그로박테리움의 제조를 필요로 하지 않는 장점을 지닌다. 그러나 직접적인 유전자 도입 방법인 입자총법은 형질전환된 조직으로부터의 형질전환체(즉 형질전환된 전체 식물)의 재생 효율이 일반적으로 낮다는 결점을 지닌다(Hagio, JARQ, 32(4):239-247, 1998). 일렉트로포레이션법은 적용가능한 세포 및 조직이 한정적이라는 결점을 지닌다. 따라서 직접적인 유전자 도입 방법은 제한된 적용을 지닌다.
통상의 일렉트로포레이션법은 본래 세포벽을 지니지 않는 세포 및 세포벽이 인공적으로 제거된 세포(즉, 원형질체)에만 적용가능하다. 반대로 일렉트로포레이션은 세포벽을 지닌세포에는 불가능하다고 여겨졌다(즉, 식물(종자와 같은 휴면상태의 조직을 포함)). 사실상 일렉트로포레이션에 의한 종자로의 핵산 도입 방법이 보고가 없었다. 따라서 핵산-도입된 물질(특히, 전체 형질전환체 식물)을 수득하는 통상의 일렉트로포레이션법을 이용하기 위해 핵산이 원형질체와 같은 조직 내로 도입된 후 원형질체 배양, 조직 배양(즉, 재분화) 또는 다른 단계가 불가피하게 요구된다. 따라서 일렉트로포레이션은 항상 용이한 방법은 아니고 비용,시간, 노동을 요구한다.
유전자를 밀 내로 도입시키기 위해 미숙성 배아가 이용되었다(Week J. T. et al., Plant. Physiol., 102:1077-1084, 1993). 그러나 식물은 미숙성 배아를 수득하기 위해 들판 또는 비닐하우스에서 생장될 필요가 있다. 들판에서는 6∼7개월이 소요된다. 비닐하우스에서는 3∼5개월이 소요된다.
따라서 아그로박테리움의 배양 및 제조가 필요하지 않고, 핵산이 도입되는 표본이 용이하게 제조되고, 핵산 도입 후 핵산-도입된 물질(특히, 형질전환체)가 용이하게 수득될 수 있는 유용하고 간단하며 빠른 핵산 도입 방법이 없다(특히, 형질전환 방법).
간단하고 빠른 핵산 도입 방법(특히, 식물 형질전환 방법)이 수립되어 있지 않다는 상기-기술된 상황을 고려하여 본 발명의 목적은 하기 특징을 지닌 간단하고 빠른 핵산 도입 방법(특히, 식물 형질전환 방법)을 제공하는 것이다 : (ⅰ) 아그로박테리움의 배양 및 제조가 필요하지 않고; (ⅱ) 핵산이 도입되는 표본의 제조가 간단하고; (ⅲ) 핵산-도입된 물질이 핵산 도입 후 용이하게 수득될 수 있다.
본 발명의 간단하고 빠른 방법은 대량의 핵산-도입된 물질(특히, 전체 형질전환체 식물)을 빠르게 수득하는 것을 가능하게 한다. 따라서 본 발명은 대규모처리 및 대규모 분석을 용이하게 하기 위한 식물을 이용한 연구 및 개발뿐만 아니라 식물 형질전환을 필요로 하는 산업 분야에 이용될 수 있다. 더욱이 본 발명은 연구의 극적인 진보를 야기시키고 잠재적으로는 혁신적인 재조합 농작물의 개발을 이끈다.
발명의 개요
본 발명의 상기-기술된 목적은 :
a) 대기압과 다른 압력 하에서 세포를 유지시키고;
b) 일렉트로포레이션을 유도하는 것이 가능한 조건 하에 세포 및 핵산 분자를 놓는 단계로 구성된
세포 내로 핵산 분자를 도입시키는 방법에 의해 달성된다.
하나의 실시태양에서 본 발명의 방법은 :
1) 대기압과 다른 압력 하에서 세포를 유지시키고;
2) 일렉트로포레이션을 이용하여 원하는 유전자를 식물 내로 도입시키는 단계에 의해 수행된다.
특히, 식물 내에서 성공적인 일렉트로포레이션을 달성하기 위해 핵산이 세포 내로 용이하게 도입되도록 세포를 처리하는 다양한 방법이 본 발명자에 의해 시도되었다. 통상적으로 (ⅰ) 식물이 진공상태에 놓이는 아그로박테리움을 이용한 핵산 도입 방법은 애기장대(Arabidopsis) 이외의 식물에는 효과적이지 않고; (ⅱ) 아그로박테리움을 이용하여 핵산을 도입시키기 위해 진공상태에 식물을 유지시킬 필요가 없다고 간주되었다(Bent, Plant Physiology, 124:1540-1547, December, 2000). 반대로 하기 실시예에 나타난 바와 같이 본 발명자는 일렉트로포레이션에 의한 식물 핵산 도입은 대기압과 다른 압력 하에 식물 조직을 유지시키는 단계를 첨가함으로서 최적화됨을 발견하였다. 본 발명의 방법은 식물 세포 이외에 다른 세포에도 적용될 수 있고, 일렉트로포레이션에 의한 핵산 도입의 효율이 유의적으로 증가될 수 있다.
본 발명의 방법은 매우 간단하다. 더욱이 본 발명의 방법은 핵산 도입 후 통상적으로 필요한 배양을 필요로 하지 않는다. 따라서 본 발명은 핵산 형질전환 물질이 어떠한 소마클로날(somaclonal) 변이도 없다는 이점을 지닌다. 소마클로날 변이는 통상의 핵산 도입 후 요구되는 배양에서 불가피하게 발생하는 것으로 알려져 있다. 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같이 소마클로날 변이는 배양시 발생하는 유전적 돌연변이 즉, 핵산이 도입되는 세포 및/또는 도입된 핵산 서열에 의해 본래 소유된 핵산 서열 내에서 배양시 발생하는 서열 변화(즉, 치환, 삭제, 삽입, 전좌, 역위, 중복 등)이다. 의도되지 않은 소마클로날 변이는 종종 핵산-도입된 물질에 원하지 않은 특성을 부여한다. 따라서 소마클로날 변이 없이 원하는 핵산-도입된 물질이 수득될 수 있기 때문에 본 발명의 방법은 매우 유용하다.
또한 본 발명은 통상의 유전자 도입 기술에 의해 형질전환되는 것이 불가능하거나 매우 어려운 식물 종의 형질전환을 가능하게 하는 이점을 제공한다. 특히, 하기 실시예에 사용된 Norin 61(밀 품종)은 일본 내 주요한 밀 품종 중 하나이다. 본 품종을 조직 배양에 의해 전체 식물로 재생시키는 것이 불가능하다 즉, 통상의 기술에 의해 형질전환체를 수득하는 것이 매우 어렵다(Machii et al., Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 53:67-74, 1998). 또한 예를 들어 재분화 기술은 실시예 4에 사용된 대두에 대해서는 잘 수립되어 있지 않았다. 대두의 형질전환체를 수득하는 것이 매우 어려웠다. 그러나 하기 실시예에 기술된 바와 같이 본 발명은 형질전환체로 만드는 것이 통상적으로 불가능하거나 매우 어려운 식물 종을 형질전환시키는 것을 가능하게 한다. 본 발명의 방법은 형질전환체로 만드는 것이 통상적으로 불가능하거나 매우 어려운 다른 종에도 적용될 수 있다.
따라서 본 발명은 하기를 제공한다.
1. a) 대기압과 다른 압력 하에서 세포를 유지시키고;
b) 일렉트로포레이션을 유도하는 것이 가능한 조건 하에 세포 및 핵산 분자를 놓는 단계로 구성된
세포 내로 핵산 분자를 도입시키는 방법
2. 제 1항목에 있어서, 상기 대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키는 단계는 세포를 감압시키는 단계임을 특징으로 하는 방법
3. 제 1항목에 있어서, 상기 대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키는 단계는 세포를 가압시키는 단계임을 특징으로 하는 방법
4. 제 1항목에 있어서, 상기 대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키는 단계는 일렉트로포레이션을 유도하는 것이 가능한 조건 하에 세포 및 핵산을 놓는 단계 전에 수행됨을 특징으로 하는 방법
5. 제 2항목에 있어서, 상기 감압 단계는 대기압으로부터 약 0.096 MPa까지 감소된 압력 하에서 수행됨을 특징으로 하는 방법
6. 제 1항목에 있어서, 상기 단계 b)는 적어도 2 이상의 방향에서 세포 및 핵산에 높은 전압 펄스를 적용하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법
7. 제 1항목에 있어서, 상기 세포는 식물 세포임을 특징으로 하는 방법
8. 제 7항목에 있어서, 상기 식물 세포는 휴면상태의 식물 조직의 세포임을특징으로 하는 방법
9. 제 8항목에 있어서, 상기 휴면상태의 식물 조직은 종자임을 특징으로 하는 방법
10. 제 7항목에 있어서, 상기 식물은 단자엽 식물임을 특징으로 하는 방법
11. 제 10항에 있어서, 상기 단자엽 식물은 벼과(Gramineae) 식물임을 특징으로 하는 방법
12. 제 11항목에 있어서, 상기 벼과 식물은 밀(Triticum aestivumL.)임을 특징으로 하는 방법
13. 제 11항목에 있어서, 상기 벼과 식물은 쌀(Oryza sativaL.)임을 특징으로 하는 방법
14. 제 11항목에 있어서, 상기 벼과 식물은 옥수수(Zea maysL.)임을 특징으로 하는 방법
15. 제 7항목에 있어서, 상기 식물은 쌍자엽 식물임을 특징으로 하는 방법
16. 제 15항목에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 겨자과(Cruciferae) 식물임을 특징으로 하는 방법
17. 제 16항목에 있어서, 상기 겨자과 식물은 중국 양배추(Brassica rapaL.)임을 특징으로 하는 방법
18. 제 16항목에 있어서, 상기 겨자과 식물은 유채(Brassica napusL.)임을 특징으로 하는 방법
19. 제 15항목에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 콩과(Leguminosae) 식물임을 특징으로 하는 방법
20. 제 19항목에 있어서, 상기 콩과 식물은 대두(Glycine maxMerr)임을 특징으로 하는 방법
21. 제 15항목에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 가지과(Solanaceae) 식물임을 특징으로 하는 방법
22. 제 21항목에 있어서, 상기 가지과 식물은 토마토(LycopersicumesculentumMill)임을 특징으로 하는 방법
23. 제 15항목에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 박과(Cucurbitaceae) 식물임을 특징으로 하는 방법
24. 제 23항목에 있어서, 상기 박과 식물은 일본 캔털루프(cantaloupe)(Cucumis meloL.)임을 특징으로 하는 방법
25. 제 15항목에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 메꽃과(Convolvulaceae) 식물임을 특징으로 하는 방법
26. 제 25항목에 있어서, 상기 메꽃과 식물은 나팔꽃(Pharbitis nilChoisy)임을 특징으로 하는 방법
27. a) 대기압과 다른 압력 하에서 세포를 유지시키고;
b) 일렉트로포레이션을 유도하는 것이 가능한 조건 하에 세포 및 핵산 분자를 놓는 단계로 구성된
핵산 분자가 식물의 세포 내로 도입됨을 특징으로 하는 식물의 생성 방법
28. 제 27항목에 있어서, 세포를 분화시키고, 생장시키고 및/또는 번식시키는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법
29. 제 27항목 또는 제 28항목에 있어서, 상기 단계 a)는 대기압과 다른 압력 하에 세포를 포함한 종자를 유지시키는 단계를 포함함을 특징으로 하고, 단계 b)는 일렉트로포레이션을 유도하는 것이 가능한 조건 하에 세포 및 핵산을 함유한 종자를 놓는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법
30. 제 29항목에 있어서, 상기 종자는 단자엽 식물 종자임을 특징으로 하는 방법
31. 제 30항목에 있어서, 상기 단자엽 식물 종자는 벼과(Gramineae) 종자임을 특징으로 하는 방법
32. 제 31항목에 있어서, 상기 벼과 종자는 밀(Triticum aestivumL.) 종자임을 특징으로 하는 방법
33. 제 31항목에 있어서, 상기 벼과 종자는 쌀(Oryza sativaL.) 종자임을 특징으로 하는 방법
34. 제 31항목에 있어서, 상기 벼과 종자는 옥수수(Zea maysL.) 종자임을특징으로 하는 방법
35. 제 29항목에 있어서, 상기 종자는 쌍자엽 식물 종자임을 특징으로 하는 방법
36. 제 35항목에 있어서, 상기 쌍자엽 식물 종자는 겨자과(Cruciferae) 종자임을 특징으로 하는 방법
37. 제 36항목에 있어서, 상기 겨자과 종자는 중국 양배추(Brassica rapaL.) 종자임을 특징으로 하는 방법
38. 제 36항목에 있어서, 상기 겨자과 종자는 유채(Brassica napusL.) 종자임을 특징으로 하는 방법
39. 제 35항목에 있어서, 상기 쌍자엽 식물 종자는 콩과(Leguminosae) 종자임을 특징으로 하는 방법
40. 제 39항목에 있어서, 상기 콩과 종자는 대두(Glycine maxMerr) 종자임을 특징으로 하는 방법
41. 제 35항목에 있어서, 상기 쌍자엽 식물 종자는 가지과(Solanaceae) 종자임을 특징으로 하는 방법
42. 제 41항목에 있어서, 상기 가지과 종자는 토마토(Lycopersicum esculentumMill) 종자임을 특징으로 하는 방법
43. 제 35항목에 있어서, 상기 쌍자엽 식물 종자는 박과(Cucurbitaceae) 종자임을 특징으로 하는 방법
44. 제 43항목에 있어서, 상기 박과 종자는 일본 캔털루프(cantaloupe)(Cucumis meloL.) 종자임을 특징으로 하는 방법
45. 제 35항목에 있어서, 상기 쌍자엽 식물 종자는 메꽃과(Convolvulaceae) 종자임을 특징으로 하는 방법
46. 제 45항목에 있어서, 상기 메꽃과 종자는 나팔꽃(Pharbitis nilChoisy) 종자임을 특징으로 하는 방법
47. 제 27항목 내지 제 46항목의 어느 한 항목에 따른 방법에 의해 생성된 식물
48. 제 47항목에 있어서, 소마클로날(somaclonal) 변이를 포함하지 않음을 특징으로 하는 식물
49. a) 대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키기 위한 섹션; 및
b) 일렉트로포레이션을 위한 섹션을 포함한
세포 내로 핵산을 도입시키는 기구
50. 제 49항목에 있어서, 상기 대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키기 위한 섹션은 대기압 보다 낮은 압력으로 유지할 수 있는 능력을 지님을 특징으로 하는 기구
51. 제 49항목에 있어서, 상기 세포는 식물 세포임을 특징으로 하는 기구
52. 상기 b)의 일렉트로포레이션 섹션은 :
양극으로 기능하는 첫 번째 전극; 및
음극으로 기능하는 두 번째 전극을 포함하고,
첫 번째 전극과 두 번째 전극 사이의 거리는 식물 종자를 수용하기에 충분히 긴 것임을 특징으로 하는 기구
53. 제 52항목에 있어서, 상기 첫 번째 전극과 두 번째 전극 사이의 거리는 적어도 약 5 mm 이상임을 특징으로 하는 기구
54. 제 52항목에 있어서, 상기 첫 번째 전극과 두 번째 전극 사이의 거리는 약 1 cm 이상임을 특징으로 하는 기구
55. 제 52항목에 있어서, 상기 첫 번째 전극 및 두 번째 전극은 백금 전극임을 특징으로 하는 기구
56. 제 49항목에 있어서, 상기 b)의 일렉트로포레이션 섹션은 양극으로 기능하는 첫 번째 전극; 및 음극으로 기능하는 두 번째 전극을 포함하고, 첫 번째 전극과 두 번째 전극 사이의 거리가 변화 가능하여 식물 종자가 첫 번째와 두 번째 전극 사이에 수용될 수 있음을 특징으로 하는 기구
57. 제 56항목에 있어서, 상기 첫 번째 전극 및 두 번째 전극은 백금 전극임을 특징으로 하는 기구
58. 대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키는 것과 결합하여
양극으로 기능하는 첫 번째 전극; 및
음극으로 기능하는 두 번째 전극을 포함하고,
첫 번째 전극과 두 번째 전극 사이의 거리는 식물 종자를 수용하기에 충분히 긴 것임을 특징으로 하는 세포 내로 핵산을 도입시키는 일렉트로포레이션 기구
59. 제 58항목에 있어서, 상기 첫 번째 전극과 두 번째 전극 사이의 거리는 적어도 약 5 mm 이상임을 특징으로 기구
60. 제 58항목에 있어서, 상기 첫 번째 전극과 두 번째 전극 사이의 거리는 약 1 cm 이상임을 특징으로 하는 기구
61. 제 58항목에 있어서, 상기 첫 번째 전극 및 두 번째 전극은 백금 전극임을 특징으로 하는 기구
62. 대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키는 것과 결합하여
양극으로 기능하는 첫 번째 전극; 및
음극으로 기능하는 두 번째 전극을 포함하고,
첫 번째 전극과 두 번째 전극 사이의 거리가 변화 가능하여 식물 종자가 첫 번째와 두 번째 전극 사이에 수용될 수 있음을 특징으로 하는 세포 내로 핵산을 도입시키는 일렉트로포레이션 기구
63. 제 62항목에 있어서, 상기 첫 번째 전극 및 두 번째 전극은 백금 전극임을 특징으로 하는 기구
64. 대기압과 다른 압력에 저항하고 식물 종자를 수용하기에 충분한 크기를 지니는 것이 가능한 일렉트로포레이션 챔버
65. 제 64항목에 있어서, 상기 일렉트로포레이션 챔버의 내벽 상의 적어도 3개 이상의 포인트에 접하는 가장 큰 내접원의 직경이 적어도 약 5 mm 이상임을 특징으로 하는 일렉트로포레이션 챔버
66. 제 64항목에 있어서, 상기 일렉트로포레이션 챔버의 내벽 상의 적어도 3개 이상의 포인트에 접하는 가장 큰 내접원의 직경이 약 1 cm 이상임을 특징으로 하는 일렉트로포레이션 챔버
67. 제 64항목에 있어서, 상기 챔버는 사각형의 수평 섹션을 지니고 챔버의 내부 용적은 1 cm x 2 cm x 2 cm임을 특징으로 하는 일렉트로포레이션 챔버
68. 제 64항목에 있어서, 상기 챔버는 원형의 수평 섹션을 지니고 챔버의 용적은 약 1 cm x 4 cm임을 특징으로 하는 일렉트로포레이션 챔버
69. 챔버의 크기가 변화 가능하여 식물 종자가 챔버 내에 수용될 수 있음을 특징으로 하는 대기압과 다른 압력에 저항하는 것이 가능한 일렉트로포레이션 챔버
70. a) 핵산 및 세포를 함유한 혼합물을 놓기 위한 컨테이너;
b) 컨테이너 a) 내의 핵산 분자를 놓기 위한 섹션;
c) 컨테이너 a) 내의 세포를 놓기 위한 섹션;
d) 대기압과 다른 압력에 저항하는 것이 가능한, 대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키기 위한 컨테이너;
e) 컨테이너 d) 내의 세포를 놓기 위한 섹션;
f) 대기압과 다른 압력에서 컨테이너 d)의 내부 구역을 유지시키기 위한 섹션;
g) 핵산 및 세포를 함유한 혼합물에 높은 전압 펄스를 적용하기 위한 컨테이너;
h) 컨테이너 g) 내의 핵산 및 세포를 함유한 혼합물을 놓기 위한 섹션;
i) 컨테이너 g) 내의 핵산 및 세포를 함유한 혼합물에 높은 전압 펄스를 적용하기 위한 섹션; 및
j) 섹션 b), c), e), f), h) 및 i)를 자동으로 수행하기 위한 섹션으로 구성되고,
섹션 b) 및 섹션 c)는 서로 동일하거나 다르고; 섹션 e) 및 섹션 h)는 서로 동일하거나 다르고; 컨테이너 a) 컨테이너 d) 및 컨테이너 g)는 서로 동일하거나다름을 특징으로 하는 일렉트로포레이션을 자동으로 수행하는 기구
본 발명은 핵산-도입된 물질(형질전환체를 포함)을 생성하기 위해 감압 또는 가압으로의 일렉트로포레이션을 이용한 세포 또는 조직(식물 조직을 포함) 내로 원하는 핵산을 도입시키는 방법에 관한 것이다.
도 1은 pWI-H5K의 제한 맵이다.
도 2는 펄스 폭이 50 μsec이고, 펄스 수는 50이고, 압력은 대기압의 0.096 MPa 이하이고, 적용된 전압은 100 V(A), 50 V(B), 20 V(C) 또는 0 V(D)인 조건 하에서 일렉트로포레이션된 밀 종자(Norin 61)의 결과를 나타낸다.
도 3은 1 : 감압 및 일렉트로포레이션된 밀 종자; 2 : 일렉트로포레이션만 된 밀 종자; 3 : 대조군 밀 종자의 GUS 염색의 결과를 나타낸다.
도 4는 A : 플라스미드를 지닌 표본 및 B : 플라스미드가 없는 대조군인 2000 ppm 제네티신(geneticin)을 지닌 형질전환된 밀 종자 스크리닝 결과를 나타낸다.
도 5는 형질전환된 밀 식물로부터의 DNA의 PCR 분석의 결과를 나타낸다. 레인 1 내지 8 : 형질전환된 밀 식물로부터의 DNA 표본, M : 마커, P : 양성 대조군, N : 음성 대조군. 우측 화살표는 목적 생성물의 위치를 나타낸다(약 0.75 kb).
도 6은 형질전환된 밀 식물로부터의 서던 블럿팅 DNA 분석의 결과를 나타낸다. 레인 1 내지 8 : 형질전환된 밀 식물로부터의 DNA 표본, P1 : 양성 대조군, P2 : 양성 대조군, N : 음성 대조군. 상단으로부터의 우측 화살표는 약 4.0 kb, 약 2.0 kb, 약 1.5 kb 및 약 1.0 kb를 나타낸다.
도 7은 종자 수정 능력을 지닌 밀 형질전환체의 사진을 나타낸다. 사진 내의 식물은 도 6의 서던 블럿팅 분석 내에서 양성인 레인 1 및 2의 식물에 상응한다.
도 8은 형질전환된 밀 식물의 다음 세대 개체(T1)로부터의 DNA의 PCR 분석 결과를 나타낸다. 레인 1 내지 6 : 형질전환된 밀 식물의 다음 세대 개체(T1)로부터의 DNA 표본, M : 마커, P : 양성 대조군, N : 음성 대조군. 우측의 화살표는 목적 생성물의 위치를 나타낸다(약 0.75 kb).
도 9는 펄스 폭이 50 μsec이고, 펄스 수는 99이고, 압력은 대기압의 0.096 MPa 이하이고, 적용된 전압은 50 V(A), 20 V(B), 10 V(C) 또는 0 V(D)인 조건 하에서 일렉트로포레이션된 쌀 종자(자포니카(Japonica))의 결과를 나타낸다.
도 10은 1 : 감압 및 일렉트로포레이션된 자포니카 쌀 종자; 2 : 일렉트로포레이션만 된 자포니카 쌀 종자; 3 : 대조군 자포니카 쌀 종자의 GUS 염색의 결과를 나타낸다.
도 11은 A : 플라스미드를 지닌 표본 및 B : 플라스미드가 없는 대조군인 2000 ppm 제네티신(geneticin)을 지닌 형질전환된 자포니카 쌀 종자 스크리닝 결과를 나타낸다.
도 12는 형질전환된 자포니카 쌀 식물로부터의 DNA의 서던 블럿팅 분석 결과를 나타낸다. 레인 1 내지 6 : 형질전환된 자포니카 쌀 식물로부터의 DNA 표본, P : 양성 대조군(약 5 카피에 상응), N : 음성 대조군. 우측 화살표는 목적 생성물의 위치를 나타낸다(약 0.8 kb).
도 13은 종자 수정 능력을 지닌 자포니카 쌀 형질전환체의 사진을 나타낸다. 사진 내의 식물은 도 12의 서던 블럿팅 분석 내에서 양성인 레인 5의 식물에 상응한다.
도 14는 형질전환된 자포니카 쌀 식물의 다음 세대 개체(T1)로부터의 DNA의 PCR 분석 결과를 나타낸다. 레인 1 내지 8 : 형질전환된 자포니카 쌀 식물의 다음 세대 개체(T1)로부터의 DNA 표본, M : 마커, P : 양성 대조군, N : 음성 대조군. 우측의 화살표는 목적 생성물의 위치를 나타낸다(약 0.75 kb).
도 15는 A : 감압 및 일렉트로포레이션된 인디카(Indica) 쌀 종자; B : 일렉트로포레이션만 된 인디카 쌀 종자; 및 C : 대조군 인디카 쌀 종자의 GUS 염색 결과를 나타낸다.
도 16은 1 : 감암 및 일렉트로포레이션된 대두 종자; 및 2 : 대조군 대두 종자의 GUS 염색 결과를 나타낸다.
도 17은 A : 감압 및 일렉트로포레이션된 중국 양배추 종자; 및 B : 대조군 중국 양배추 종자의 GUS 염색 결과를 나타낸다.
도 18은 A : 감압 및 일렉트로포레이션된 토마토 종자; 및 B : 대조군 토마토 종자의 GUS 염색 결과를 나타낸다.
도 19는 A : 감압 및 일렉트로포레이션된 나팔꽃 종자; 및 B : 대조군 나팔꽃 종자의 GUS 염색 결과를 나타낸다.
도 20은 전압이 100 V이고, 펄스 폭은 50 μsec이고, 펄수 수는 50이고, A : 대기압의 0.096 MPa 이하, B : 대기압의 0.06 MPa 이하, C : 감압이 없고 또는 D : 대조군(DNA 및 감압이 없는)인 일렉트로포레이션된 밀 종자의 결과를 나타낸다.
도 21은 전압이 50 V이고, 펄스 폭은 50 μsec이고, 펄수 수는 99이고, A : 대기압의 0.096 MPa 이하, B : 대기압의 0.06 MPa 이하, C : 감압이 없고 또는 D : 대조군(DNA 및 감압이 없는)인 일렉트로포레이션된 자포니카 쌀 종자의 결과를 나타낸다.
도 22는 본 발명의 일렉트로포레이션 기구의 실시태양을 나타낸다.
도 23은 본 발명의 일렉트로포레이션 기구의 또다른 실시태양을 나타낸다.
도 24는 본 발명의 일렉트로포레이션 기구의 또다른 실시태양을 나타낸다.
도 25는 본 발명의 직사각형 평행육면체 형태의 일렉트로포레이션 챔버의 실시태양을 나타낸다.
도 26은 본 발명의 마이크로튜브 형태의 일렉트로포레이션 챔버의 실시태양을 나타낸다.
도 27은 본 발명의 예시된 일렉트로포레이션 챔버의 내벽 상의 적어도 3개 이상의 포인트에 접하는 가장 큰 내접원의 예를 나타낸다.
도 28은 본 발명의 자동 일렉트로포레이션 기구의 도표를 나타낸다.
도 29는 본 발명의 자동 일렉트로포레이션 기구의 실시태양을 나타낸다.
이하, 본 발명을 도면을 참조하여 실시예를 통해 상세히 설명한다.
본 명세서는 단일 형태의 관사는 언급이 없는 경우 복수의 개념을 포함함이 이해되어야 한다. 또한 여기에 사용된 용어는 언급이 없는 경우 당분야에 일반적으로 사용되는 정의를 지님이 이해되어야 한다.
본 개시 내에 사용된 하기 용어는 하기에 속하는 의미를 지닌다.
여기에 사용된 "핵산 도입"이라는 용어는 인공적인 수단으로 세포 또는 조직 내로 핵산을 도입시키는 것을 나타낸다. "핵산 도입"에 의해 핵산이 도입된 세포 또는 조직의 표현형은 변화하거나 그렇지 않다. 여기에 사용된 "유전자 도입"이라는 용어는 인공적인 수단으로 유전적 특성을 결정하는 인자인 유전자를 포함한 핵산을 세포 또는 조직 내로 도입시키는 것을 나타낸다. "유전자 도입"에 의해 유전자가 도입된 세포 또는 조직의 표현형은 변화하거나 그렇지 않다. 여기에 사용된 "형질전환"이라는 용어는 유전자를 포함한 핵산의 세포 또는 조직 내로의 도입에 의한 세포 또는 조직 표현형의 변화를 나타낸다. 특정환 상황에서 "핵산 도입", "유전자 도입" 및 "형질전환"이라는 용어는 여기에서 상호교환가능하게 사용됨을 주지해야 한다. 이들 각 용어의 의미는 본 명세서의 문맥상 당업자에 의해 명확히 이해된다.
"핵산-도입된 물질", "유전자-도입된 물질" 및 "형질전환체"라는 용어는 각각 핼산 도입, 유전자 도입 및 형질전환을 겪은 세포 또는 조직으로부터 생성된 생물체의 정체 또는 일부를 나타낸다. 특정한 상황에서 "핵산-도입된 물질", "유전자-도입된 물질" 및 "형질전환체"라는 용어는 여기에서 상호교환가능하게 사용됨을 주지해야 한다. 이들 각 용어의 의미는 본 명세서의 문맥상 당업자에 의해 명확히 이해된다. 핵산-도입된 물질, 유전자-도입된 물질 및 형질전환체는 예를 들어 원핵세포 및 진핵세포(즉, 식물 세포 등) 또는 조직으로부터 생성된 생물체를 포함한 어떠한 생물체도 된다. 또한 형질전환체는 무엇이 형질전환되느냐에 따라 다르게 형질전환된 세포, 형질전환된 조직, 형질전환 숙주 등을 나타낸다. 여기에 사용된 "형질전환체"라는 용어는 이들 형태 모두를 포함하고 특정한 환경 내의 특정한 형태를 나타낸다. "핵산-도입된 물질" 및 "유전자-도입된 물질"이라는 용어에도 동일하게 적용된다.
"세포"라는 용어는 어떠한 생물체로부터의 세포도 나타낸다(즉, 다세포 생물체(즉, 동물(척추동물 및 무척추동물), 식물(즉, 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물 등), 진균 등), 단세포 생물체(즉, 박테리아 등)의 어떠한 형태). 바람직하게는 본발명에 사용되는 세포는 세포벽을 지니는 것, 특히 바람직하게는 식물 세포이다.
여기에 사용된 "조직"은 다세포 생물체 내의 실질적으로 동일한 기능 및/또는 형태를 지닌 세포의 집합을 나타낸다. 조직은 일반적으로 동일한 기원으로부터 유도된 세포의 집합이거나 세포가 실질적으로 동일한 기능 및/또는 형태를 지니는 경우 다른 기원으로부터 유도된 세포의 집합이다. 일반적으로, 조직은 기관의 일부이다. 식물에서 조직은 예를 들어 요소 세포의 발달 상태에 따라 분열 조직 및 영구 조직으로; 요소 세포의 형태에 따라 단순 세포 및 복합 세포로 다양한 형태로 대략적으로 분류된다. 동물 세포는 형태, 기능 또는 유전적 근거에 따라 상피 조직, 연결 조직, 근육 조직, 신경 조직 등으로 분류된다.
여기에 사용된 "조직"이라는 용어는 생물체로부터 유도된 어떠한 조직도 나타낸다(즉, 다세포 생물체(즉, 동물(척추동물 및 무척추동물), 식물(즉, 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물 등), 진균 등), 단세포 생물체(즉, 박테리아 등)의 어떠한 형태). 바람직하게는 본 발명에 사용된 조직은 세포벽을 지니는 것, 특히 바람직하게는 식물 조직이다. 식물 조직의 예는 휴면상태 조직, 생식세포질, 생장점 및 꽃눈을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 휴면상태 조직의 바람직한 예는 숙성 종자, 미숙성 종자, 겨울눈 및 괴경을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 특히 바람직한 휴면상태 조직은 숙성 종자이나 이에 한정적인 것은 아니다.
여기에 사용된 "기관"이라는 용어는 생물체 개체의 특정 기능이 국부적으로 수행되는 생물체 개체의 특정 부위이고 형태학적으로 독립적인 구조를 나타낸다. 일반적으로 다세포 생물체(즉, 동물, 식물, 진균)에서 기관은 특정한 공간적 배열 내의 일부 조직으로 이루어지고 조직은 다수의 세포로 이루어진다. 식물 기관의 예는 뿌리, 잎, 줄기, 꽃을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 동물 기관의 예는 피부, 심장, 혈관, 각막, 망막, 신장, 간, 췌장, 창자, 태반, 탯줄 도관, 폐, 뇌, 신경, 말단 사지(peripheral limb) 등을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
여기에 사용된 "스크리닝"이라는 용어는 항생제-저항성 시험 및/또는 유전공학 기술(즉, PCR, 서던 블럿팅, 노던 블럿팅 등)에 의해 비-핵산-도입된 물질로부터 핵산-도입된 물질을 구별하는 것을 나타낸다. 특히, "스크리닝"이라는 용어는 형질전환된 생물체가 저항성을 지니게 하는 약물의 존재시 이들 생물체를 배양하고/또는 생장시킴으로서 형질전환되지 않은 생물체로부터 도입된 약물-저항성을 지닌 형질전환된 생물체를 구별하는 단계를 나타낸다.
여기에 사용된 "일렉트로포레이션"이라는 용어는 핵산이 세포 내로 들어가게 하는 구멍(pore)을 개방하기 위해 DC 높은 전압 펄스가 세포에 적용되는 세포(즉, 식물 세포) 내로 핵산(즉, 유전자 함유 핵산)을 도입시키는 기술을 나타낸다. 일렉트로포레이션의 조건은 종, 조직, 세포에 따라 다르게 당업자에 의해 적당히 선택된다. 일렉트로포레이션에 사용되는 일반적인 전압은 10 V/cm ∼ 200 V/cm, 바람직하게는 20 V/cm ∼ 150 V/cm, 더욱 바람직하게는 30 V/cm ∼ 120 V/cm, 더욱 더 바람직하게는 40 V/cm ∼ 100 V/cm, 가장 바람직하게는 50 V/cm ∼ 100 V/cm이나 이에 한정적인 것은 아니다. 일렉트로포레이션의 일반적인 펄스 폭은 1 μsec ∼ 90 μsec, 바람직하게는 10 μsec ∼ 90 μsec, 더욱 바람직하게는 20 μsec ∼ 80 μsec, 더욱 더 바람직하게는 30 μsec ∼ 80 μsec, 훨씬 더 바람직하게는 40 μsec ∼ 70 μsec, 가장 바람직하게는 5 μsec ∼ 60 μsec이나 이에 한정적인 것은 아니다. 일렉트로포레이션의 일반적인 펄스 수는 1∼200, 바람직하게는 10∼150, 더욱 바람직하게는 20∼120, 더욱 더 바람직하게는 30∼110, 가장 바람직하게는 40∼100이나 이에 한정적인 것은 아니다.
여기에 사용된 "일렉트로포레이션을 유도하는 것이 가능한 조건 하에 세포(또는 조직) 및 핵산을 놓는 것"이라는 구절은 일렉트로포레이션을 유도하기 위해 필수적인(즉, 핵산의 세포(또는 조직) 내로의 도입) 모든 조건(전압, 펄스 폭, 펄스 수, 세포(또는 조직)와 핵산 사이의 위치 상호관계, 일렉트로포레이션의 작동 시간 등)을 지닌 상태에 세포(또는 조직) 및 핵산을 놓는 것을 나타낸다. 일렉트로포레이션에 필수적인 조건은 당업자에게 명확히 알려져 있고 당업자에 의해 적당히 결정된다.
본 발명에서 일렉트로포레이션은 적어도 2 이상의 방향에서 세포(또는 조직) 및 핵산에 높은 전압 펄스를 적용함으로서 바람직하게 수행된다. 이러한 기술은미리결정된 기간 동안 세포(또는 조직) 및 핵산에 높은 전압 펄스를 적용하고 양극 전극 및 음극 전극의 위치를 교환하고 다시 높은 전압 펄스를 적용함으로서 가장 간단히 달성된다. 또한 이러한 기술은 일렉트로포레이션 챔버 내 다른 위치에 배치된 전극 쌍을 이용하여 달성된다. 적어도 2 이상의 방향에서 높은 전압 펄스를 적용함으로서 핵산의 도입 효율이 유의적으로 증가될 수 있다. 예를 들어 본 발명자는 높은 전압 펄스가 2 방향으로 겨자과 식물 종자 및 핵산에 적용될 때 종자 내로의 핵산 도입 효율은 높은 전압 펄스가 한 방향에서만 적용되었을 때 보다 약 2 이상의 인자에 의해 증가되었음을 발견하였다.
일렉트로포레이션이 본 발명에서 수행될 때 사용된 일렉트로포레이션 챔버는 핵산 도입되는 세포 및/또는 조직을 수용할 수 있는 정도의 용적을 지닌다. 특히 바람직하게는, 일렉트로포레이션 챔버는 식물 조직(즉, 식물 종자)이 수용되게 하는 크기를 지닌다. 본 발명의 일렉트로포레이션 챔버는 어떠한 형태도 된다. 이러한 형태의 예는 정육면체, 직사각형 평행육면체, 원통, 튜브(즉, 몸체가 균일하거나 균일하지 않은 수평 섹션을 지니고, 몸체가 바닥을 향해 가늘어 지거나 그렇지 않음)를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 본 발명의 일렉트로포레이션 챔버가 식물 종자를 수용하기 위해 본 발명의 챔버의 내벽 상의 적어도 3 이상의 포인트에 접하는 가장 큰 내접원의 직경은 예를 들어 적어도 약 5 mm 이상, 바람직하게는 적어도 약 6 mm 이상, 바람직하게는 적어도 약 7 mm 이상, 바람직하게는 적어도 약 8 mm 이상, 바람직하게는 적어도 약 9 mm 이상, 바람직하게는 적어도 약 1cm 이상, 바람직하게는 적어도 약 2 cm 이상, 바람직하게는 적어도 약 3 cm 이상, 바람직하게는 적어도 약 4 cm 이상, 바람직하게는 적어도 약 5 cm 이상, 바람직하게는 적어도 약 6 cm 이상, 바람직하게는 적어도 약 7 cm 이상, 바람직하게는 적어도 약 8 cm 이상, 바람직하게는 적어도 약 9 cm 이상, 바람직하게는 적어도 약 10 cm 이상, 바람직하게는 적어도 약 15 cm 이상, 바람직하게는 적어도 약 20 cm 이상이다. 본 발명의 일렉트로포레이션 챔버 내벽 상의 적어도 3 이상의 포인트에 접하는 가장 큰 내접원 직경의 상한선은 예를 들어 약 25 cm, 약 20 cm, 약 15 cm, 약 10 cm, 약 9 cm, 약 8 cm, 약 7 cm, 약 6 cm, 약 5 cm, 약 4 cm, 약 3 cm, 약 2 cm, 약 1 cm, 약 9 mm, 약 8 mm, 약 7 mm, 약 6 mm이나 이에 한정적인 것은 아니다. 길이는 이들 명백하게 기술된 수치(즉, 1.5 cm 등) 사이의 중간 수치이다. 여기에 사용된 "내접원"이라는 용어는 챔버 컨테이너 내벽 상의 적어도 3 이상 무작위 포인트에 접하는 원을 나타낸다. 여기서 챔버 내에 제공된 전극도 컨테이너의 일부로 간주된다. 따라서 챔버 컨테이너의 내벽은 전극의 표면을 포함한다. 일반적으로 전극의 두께는 무시할 수 있도록 작다(즉, 0.1 mm).
본 발명의 관점에 따라 본 발명의 일렉트로포레이션 챔버는 사각형 수평 섹션 및 내부 용적, 1 cm x 2 cm x 2 cm(즉, 길이 x 폭 x 높이)를 지닌다. 본 발명의 또다른 관점에 따라 일렉트로포레이션 챔버는 원형 수평 섹션 및 내부 용적 1 cm x 4 cm(즉, 지름 x 높이)를 지닌다. 전극이 차지하는 구역은 챔버의 용적이 포함되지 않는다. 여기에 사용된 "수평 섹션"이라는 용어는 챔버의 세로 방향에수직인 횡단 섹션을 나타낸다. 여기에 사용된 "내부 용적"이라는 용어는 챔버 컨테이너 내벽 상의 2개의 무작위 포인트 사이의 거리를 나타낸다. 챔버가 사각형 수평 섹션을 지니면 내부 용적은 수평 섹션의 길이 또는 폭 또는 높이를 나타낸다. 챔버가 원형 수평 섹션을 지니면 내부 용적은 수평 섹션의 직경 또는 높이를 나타낸다.
하나의 실시태양에서 본 발명의 일렉트로포레이션 챔버는 챔버가 식물 종자를 수용하게 하는 크기로 변화될 수 있다. 챔버의 크기는 어떠한 수단에 의해서도 변화된다. 예를 들어 챔버의 크기는 나사에 의해 적당한 용적(들)으로 조정된다.
본 발명의 일렉트로포레이션 챔버는 어떠한 물질로도 형성된다. 일렉트로포레이션 챔버의 물질은 고형체를 형성할 수 있는 어떠한 물질도 된다. 이러한 물질의 예는 유리, 실리카, 실리콘, 세라믹, 이산화실리콘, 플라스틱, 금속(합금 포함), 천연 및 합성 폴리머(즉, 폴리스티렌, 셀룰로스, 키토산, 덱스트란 및 나일론) 등을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 챔버는 다른 물질로 이루어진 층으로 형성된다. 예를 들어 유리, 석영 유리, 알루미나, 사파이어, 고토감람석(forsterite), 산화실리콘, 탄화실리콘, 질화실리콘 등과 같은 무기 절연 물질이 사용될 수 있다. 폴리아마이드, 폴리카보네이트, (변성된)산화폴리페닐렌, 폴리부틸렌테레프탈레이트, 강화폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리에테르술폰, 황화폴리에틸렌, 폴리아릴레이트, 폴리에테르이미드, 폴리에테르에테르케톤, 폴리이미드, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리이소부틸렌, 불포화폴리에스테르, 플루오로수지, 염화폴리비닐, 염화폴리비닐리덴, 폴리비닐아세테이트, 폴리비닐알코올, 폴리비닐아세탈, 아크릴레신, 폴리아그릴로니트릴, 폴리스티렌, 아세탈수지, 페놀수지, 우레아수지, 에폭시수지, 멜라민수지, 스티렌-아크릴로니트릴 공중합체, 아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌 공중합체, 실리콘수지, 폴리술폰 등과 같은 유기 물질이 사용된다. 더욱이 바람직하게는 본 발명의 일렉트로포레이션 챔버는 대기압과 다른 압력에 저항할 수 있다(즉, 대기압과 다른 압력이 챔버에 적용될 때 챔버는 파열되거나 틀어지거나 변형되지 않는다). 특히 바람직하게는 챔버는 감압에 저항하는 것이 가능하다. 특히 바람직하게는 본 발명의 일렉트로포레이션 챔버는 폴리프로필렌, 실리콘수지 및 유리로 형성되고, 백금 또는 스테인레스스틸로 이루어진 전극이 제공된다.
바람직하게는 본 발명의 일렉트로포레이션 챔버는 온도 조절 섹션이 제공된다. 예를 들어 온도 조절 섹션은 센서를 이용하여 온도 변화를 감지하고 챔버의 온도를 수동으로 또는 자동으로 조절한다. 온도 조절 섹션은 대표적으로 챔버의 온도를 감소시키기 위한 냉각 섹션이다. 냉각 섹션은 예를 들어 얼음, 냉각 겔 등을 이용하는 수단이다.
본 발명의 일렉트로포레이션 챔버는 적어도 한 쌍(2) 이상의 전극이 제공된다. 따라서 특정한 실시태양에서 본 발명의 챔버는 한 쌍(2) 이상의 전극이 제공된다(즉, 두 쌍(4)의 전극, 세 쌍(6)의 전극, 네 쌍(8)의 전극, 다섯 쌍(10)의 전극 또는 다섯 쌍 이상의 전극). 예를 들어 사각형 수평 횡단 섹션을 지닌 챔버의 경우 전극이 각각의 내측벽에 접하여 제공되면 두 쌍(4)의 전극이 챔버에 부착될 수 있다. 또한 육각형 횡단 섹션을 지닌 챔버의 경우 각각 내측벽에 접하는 전극이 제공되면 세 쌍(6)의 전극이 챔버에 부착될 수 있다. 따라서 무작위 수의 전극 쌍이 본 발명의 챔버에 제공된다. 또한 전극은 무작위의 공간적 위치 관계를 지닌다.
본 발명의 일렉트로포레이션 챔버 내에 제공된 전극 사이의 거리는 어떠한 길이도 되고, 핵산 도입되는 세포 및/또는 조직의 크기에 따라 다르게 변한다. 특히 바람직하게는 전극 사이의 거리는 식물 조직(즉, 식물 종자)을 수용하기에 충분하다. 식물 종자를 수용하기 충분한 전극 사이의 거리는 예를 들어 적어도 약 5 mm 이상, 바람직하게는 적어도 약 6 mm 이상, 바람직하게는 적어도 약 7 mm 이상, 바람직하게는 적어도 약 8 mm 이상, 바람직하게는 적어도 약 9 mm 이상, 바람직하게는 적어도 약 1 cm 이상, 바람직하게는 적어도 약 2 cm 이상, 바람직하게는 적어도 약 3 cm 이상, 바람직하게는 적어도 약 4 cm 이상, 바람직하게는 적어도 약 5 cm 이상, 바람직하게는 적어도 약 6 cm 이상, 바람직하게는 적어도 약 7 cm 이상, 바람직하게는 적어도 약 8 cm 이상, 바람직하게는 적어도 약 9 cm 이상, 바람직하게는 적어도 약 10 cm 이상, 바람직하게는 적어도 약 15 cm 이상, 바람직하게는 적어도 약 20 cm 이상이다. 전극 사이의 거리의 상한선은 예를 들어 약 25 cm, 약 20 cm, 약 15 cm, 약 10 cm, 약 9 cm, 약 8 cm, 약 7 cm, 약 6 cm, 약 5 cm, 약 4 cm, 약 3 cm, 약 2 cm, 약 1 cm, 약 9 mm, 약 8 mm, 약 7 mm, 약 6 mm이나 이에 한정적인 것은 아니다. 길이는 이들 명백하게 기술된 수치(즉 1.5 cm 등) 사이의 중간 수치이다.
하나의 실시태양에서 전극 사이의 거리는 변화 가능하여 식물 종자가 전극 사이에 수용될 수 있다. 전극 사이의 거리는 어떠한 수단으로도 변화된다. 예를 들어 전극 사이의 거리는 나사에 의해 적당한 거리로 조정된다.
전극은 물질이 전기를 전도할 수 있는 능력을 지닌 한 어떠한 물질로도 이루어진다. 전극 물지의 예는 백금, 금, 스테인레스스틸, 탄소 및 전도성 폴리머를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 특히 바람직하게는 전극은 백금으로 이루어진다.
예시적인 일렉트로포레이션 챔버는 길이 1 cm x 폭 2 cm x 높이 2 cm의 직사각형 평행육면체 형태이고, 백금 전극 사이의 거리가 약 1 cm인 백금 전극이 제공된다. 이러한 일렉트로포레이션 챔버는 중간 크기(약 5∼15 mm)의 식물 종자(즉, 밀, 쌀, 옥수수 등)에 특히 유용하다. 이러한 챔버로 많은(즉, 약 10∼30 낟알) 중간-크기 식물 종자가 동시에 처리될 수 있다.
또다른 예시적인 일렉트로포레이션 챔버는 내직경 1 cm x 높이 4 cm의 마이크로튜브 형태이고, 스테인레스 전극 사이의 거리가 약 1 cm인 스테인레스 전극이 제공된다. 이러한 마이크로튜브 형태 챔버는 통상으로 사용되는 마이크로튜브의 내벽에 접착제로 스테인레스 포일(즉, 약 5 x 40 mm(두께 : 약 0.1 mm))을 부착시킴으로서 용이하게 제조된다. 마이크로튜브 형태 챔버는 원심분리될 수 있어서 세포, 조직 및/또는 종자가 챔버의 바닥에 침전될 수 있다. 따라서 용액의 교환이 용이하게 수행될 수 있다. 마이크로튜브 형태 챔버는 작은 크기(약 0.1∼5 mm) 식물 종자(즉, 애기장대 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 등)가 처리될 때 특히 유용하다. 이러한 챔버로 많은 수의 작은-크기 식물 종자가 동시에 처리될 수 있다.
여기에 사용된 "대기압과 다른 압력 하에 세포/조직(식물 조직 포함)을 유지시키는 것"은 대기압(일반적으로 1 대기압 = 101.325 kPa = 약 0.1 MPa) 보다 높은 압력(가압) 또는 낮은 압력(감압) 하에 세포/조직(식물 조직 포함)을 유지시키는 단계를 나타낸다.
특정한 이론에 한정되기를 원하지 않으나 대기압과 다른 압력 하에 세포/조직(식물 조직 포함)을 유지시킴으로서 세포/조직에 적용된 주위 압력이 변화하여 DNA 등과 같은 핵산을 포함한 완충액이 조직 또는 세포 사이의 공동(cavity)으로투과할 수 있고; 그 결과로서 통상적으로 불가능하게 여겨진 세포벽을 지닌 세포 및 조직 내로의 일렉트로포레이션에 의한 핵산 도입/형질전환을 착수하는 것이 가능하게 되는 것으로 여겨진다.
여기에 사용된 "감압"이라는 용어는 핵산 도입/형질전환을 위해 대기압보다 낮은 압력 하에 세포/조직(식물 조직 포함(즉, 종자))을 유지시키는 단계를 나타낸다. 본 발명에서 감압은 대기압보다 0.02 MPa까지 낮은 압력, 바람직하게는 대기압보다 0.04 MPa까지, 더욱 바람직하게는 0.06 MPa까지, 더욱 더 바람직하게는 0.08 MPa까지, 가장 바람직하게는 0.096까지 낮은 압력 하에서 수행되나 이에 한정적인 것은 아니다. 감압의 작동 시간은 1∼120분, 바람직하게는 10∼100분, 더욱 바람직하게는 15∼90분, 더욱 더 바람직하게는 30∼70분, 가장 바람직하게는 60분이나 이에 한정적인 것은 아니다.
여기에 사용된 "가압"이라는 용어는 핵산 도입/형질전환을 위해 대기압보다 높은 압력 하에 세포/조직(식물 조직 포함(즉, 종자))을 유지시키는 단계를 나타낸다.
본 발명의 관점에 따라 일렉트로포레이션 기구가 제공된다. 본 발명의 일렉트로포레이션 기구는 유의적으로 높은 효율로 세포 또는 조직 내로 핵산을 도입시킬 수 있고, 특히 일렉트로포레이션에 의한 핵산 도입이 통상적으로 불가능한 세포벽을 지닌 세포 또는 조직(즉, 식물 세포 또는 식물 조직) 내로의 핵산 도입에 유용하다. 하나의 실시태양에서 본 발명의 일렉트로포레이션 기구는 a) 대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키기 위한 섹션 및 b) 일렉트로포레이션 섹션 모두를 포함한다.
대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키기 위한 섹션은 감압 및/또는 가압을 수행하는 것이 가능한 수단이다. 통상적으로 사용가능한 감압 기구(즉, 진공 건조기 등) 및/또는 가압 기구도 사용된다. 어떠한 일렉트로포레이션 수단도 사용된다. 통상적으로 사용가능한 일렉트로포레이션 수단(즉, CUY21EDIT 유전자 도입 기구, Nepagene, Ichikawa-shi, Chiba-ken, Japan)이 이용된다. 바람직하게는 일렉트로포레이션 섹션 내에 제공된 2개의 전극(첫 번째 전극과 두 번째 전극) 사이의 거리는 상기 논의된 바와 같이 식물 종자를 수용하기에 충분하다.
본 발명의 또다른 실시태양에서 2개의 전극을 포함한 일렉트로포레이션 기구가 제공되고, 이들 사이의 거리는 식물 종자를 수용하기에 충분하다. 일렉트로포레이션 기구는 대기압과 다른 압력 하에 세포/조직을 유지시키는 수단과 결합하여 사용된다. 이러한 실시태양에서 일렉트로포레이션 기구 및 대기압과 다른 압력 하에 세포/조직을 유지시키기 위한 섹션은 항상 동일한 하우징 내에 존재할 필요는 없다.
통상적인 일렉트로포레이션 기구는 매우 작은 세포에 높은 전압 펄스를 적용하는 것이 목적이다. 따라서 챔버의 내부 용적 및 전극 사이의 거리가 가능한 한 작게 최소화될 필요가 있다. 따라서 통상적인 일렉트로포레이션 기구 내의 챔버 내부 용적 및 전극 사이의 거리는 일반적으로 최대한 약 1 mm 또는 2 mm 또는 4 mm이다. 따라서 여기에 나타난 바와 같이 식물 종자를 수용하기에 충분한 공간을 지닌 챔버 및 식물 종자를 수용하기에 충분한 거리를 지닌 전극을 포함한 일렉트로포레이션 기구는 지금까지 알려져 있지 않다.
또한 본 발명의 일렉트로포레이션 기구는 자동으로 작동된다. 본 발명의 자동 일렉트로포레이션 기구에서 완충액의 주입 및/또는 교환은 자동 투여 기계에 의해 수행된다. 자동 투여 기계로서 예를 들어 통상적으로 사용가능한 epMotion5070 워크스테이션(Eppedorf Co., Ltd., Higashi-Kanda 3, Chiyoda-ku, Tokyo, Japan)이 사용된다. 자동 투여 기계는 이에 한정적이지 않다. 특히, 자동 투여 기계는 핵산 및 세포를 포함한 혼합물을 놓기 위한 컨테이너 내에 핵산 및/또는 세포를 놓기 위한 섹션으로 유리하게 사용된다.
핵산 및 세포를 포함한 혼합물을 놓기 위한 첫 번째 컨테이너, 대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키기 위한 두 번째 컨테이너 및 핵산 및 세포를 포함한 혼합물에 높은 고압 펄스를 적용하기 위한 세 번째 컨테이너는 어떠한 컨테이너도 된다. 이들 컨테이너는 서로 동일하거나 다르다. 이들 컨테이너의 물질은 고형체를 형성하는 것이 가능한 어떠한 물질도 된다. 이러한 물질의 예는 유리, 실리카, 실리콘, 세라믹, 이산화실리콘, 플라스틱, 금속(합금 포함), 천연 및 합성 폴리머(즉, 폴리스티렌, 셀룰로스, 키토산, 덱스트란 및 나일론) 등을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 컨테이너는 다른 물질로 이루어진 층으로 형성된다. 예를 들어 유리, 석영 유리, 알루미나, 사파이어, 고토감람석(forsterite), 산화실리콘, 탄화실리콘, 질화실리콘 등과 같은 무기 절연 물질이 사용될 수 있다. 폴리아마이드, 폴리카보네이트, (변성된)산화폴리페닐렌, 폴리부틸렌테레프탈레이트, 강화폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리에테르술폰, 황화폴리에틸렌, 폴리아릴레이트, 폴리에테르이미드, 폴리에테르에테르케톤, 폴리이미드, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리이소부틸렌, 불포화폴리에스테르, 플루오로수지, 염화폴리비닐, 염화폴리비닐리덴, 폴리비닐아세테이트, 폴리비닐알코올, 폴리비닐아세탈, 아크릴레신, 폴리아그릴로니트릴, 폴리스티렌, 아세탈수지, 페놀수지, 우레아수지, 에폭시수지, 멜라민수지, 스티렌-아크릴로니트릴 공중합체, 아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌 공중합체, 실리콘수지, 폴리술폰 등곽 같은 유기 물질이 사용된다.
바람직하게는 본 발명의 첫 번째 컨테이너는 매우 투명하고 표본의 관찰을 용이하게 하는 물질(즉, 폴리스티렌)으로 제조된다. 바람직하게는 본 발명의 두 번째 컨테이너는 대기압과 다른 압력에 저항하는 것이 가능한 물질(즉, 폴리이미드, 폴리카보네이트, (변성된)산화폴리에틸렌, 강화폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리에테르술폰, 황화폴리에틸렌, 폴리아릴레이트, 폴리에테르이미드, 폴리에테르에테르케톤, 폴리이미드 및 에폭시수지), 더욱 바람직하게는 매우 투명하고 표본의 관찰을 용이하게 하는 물질(즉, 아크릴수지)로 제조된다. 바람직하게는 본 발명의 세 번째 컨테이너는 세포에 대한 친화력을 지닌 물질(즉, 폴리프로필렌, 실리콘수지 및 유리)로 제조되고, 백금, 금, 스테인레스스틸, 탄소 또는 전도성 폴리머로 이루어진 전극이 제공된다. 이들 물질은 원하는 특성(즉, 컨테이너의 절연, 전극의 증가된 전도율)을 제공하기 위해 적당한 물질로 코팅된다.
더욱이 바람직하게는 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 컨테이너는 대기압과 다른 압력에 저항하는 것이 가능하다. 특히 바람직하게는 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 컨테이너는 감압에 저항하는 것이 가능하다. 예를 들어 첫 번째 컨테이너는 두 번째 및/또는 세 번째 컨테이너 내에 하우스된다. 대안으로 핵산 및 세포를 포함한 혼합물은 첫 번째 컨테이너로부터 두 번째 컨테이너(또는 그 안에 하우스된 또다른 컨테이너) 및/또는 세 번째 컨테이너(또는 그 안에 하우스된 또다른 컨테이너)로 주입된다.
두 번째 컨테이너에 세포를 놓기 위한 섹션 및 세 번째 컨테이너에 핵산 및 세포를 포함한 혼합물을 놓기 위한 섹션으로서 벨트 컨베이어가 유리하게 사용된다. 본 발명은 이에 한정적인 것은 아니다. 어떠한 수단도 사용된다. 첫 번째 컨테이너, 두 번째 컨테이너 및 세 번째 컨테이너 내에 놓인 액체는 자동 펌프를 이용하여 흡입/배수에 의해 이동된다. 본 발명의 자동 일렉트로포레이션 기구는 다앙한 작동 수단을 자동화하기 위한 조절 기구를 포함한다. 본 발명의 일렉트로포레이션 기구는 전원 공급 기구를 포함한다. 조절 기구 및 전원 공급 기구는 일렉트로포레이션 기구를 포함한 동일한 하우징 내에 설치되거나 또는 일렉트로포레이션 기구와 분리되고 일렉트로포레이션 기구와 연결된다.
종자가 일렉트로포레이션되면 바람직하게는 종자는 감압 또는 가압 전에 물(수돗물)에 침수된다. 종자가 처리 전에 물에 침수되는 시간은 6∼48시간, 바람직하게는 12∼36시간, 더욱 바람직하게는 18∼30시간, 더욱 더 바람직하게는 20∼26시간, 가장 바람직하게는 약 24시간이나 이에 한정적인 것은 아니다.
본 발명의 핵산 도입을 위한 예시적인 조건은 하기에 기술된 바와 같다. 종자는 25℃에서 밤새 수돗물에 침수된다. 다음날 종자는 진공 기구에 놓이고 대기압보다 0.096 MPa까지 낮은 압력 하에서 감압된다. 이후 높은 전압 펄스(100 V, 50 μsec, 전극 사이의 거리 : 1 cm)가 일렉트로포레이션 즉, 핵산 도입/유전자 도입을 위해 감압에 의해 처리된 종자에 약 50회 적용된다. 펄스의 전압 및 수는 농작물에 따라 다르다. 일렉트로포레이션 조건은 필요한 경우 당업자에 의해 적당히 선택된다. 이후 세포 또는 조직은 항생제를 함유한 배지 내에서 스크린되고 화분에 심어져서 정상적인 전체 식물체를 수득할 수 있게 한다.
여기에 사용된 "식물"이라는 용어는 특징적으로 엽록체를 포함하고, 단단한세포벽을 지니고 많은 배아 조직을 영구적으로 생산하고 이동 능력이 부재한 식물계에 속하는 생물체를 포함하는 포괄적인 용어이다. 식물은 예를 들어 "Genshoku Makino Shokubutsu Daizukan [Unabridged Makino's Original Color Illustrated Reference Book of Plants], Hokuryukan(1982), Japan) 내에 분류되어 있다. 여기에 기술된 모든 식물은 본 발명에 사용된다. 대표적으로 식물은 세포벽을 형성하고 엽록체에 의한 동화작용을 지닌 개화 식물을 나타낸다. "식물"은 어떠한 단자엽 및 쌍자엽 식물도 포함한다. 단자엽 식물의 예는 벼과(Gramineae) 식물을 포함한다. 바람직한 단자엽 식물의 예는 옥수수, 쌀, 오트, 보리, 사탕수수, 호밀 및 기장, 더욱 바람직하게는 옥수수, 밀 및 쌀을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 밀의 예는 통상적인 방법에 의해 형질전환하는 것이 어려운 밀 품종 Norin 61을 포함한다. 쌍자엽 식물의 예는 겨자과(Cruciferae), 콩과(Leguminosae), 가지과(Solanaceae), 박과(Cucurbitaceae) 및 메꽃과(Convolvulaceae) 식물을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 겨자과 식물의 예는 중국 양배추, 유채, 양배추 및 콜리플라워를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 바람직한 겨자과 식물은 중국 양배추 및 유채이다. 특히 바람직한 가지과 식물은 유채이다. 콩과 식물의 예는 대두, 팥, 강낭콩 및 동부를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 바람직한 콩과 식물은 대두이다. 가지과 식물의 예는 토마토, 가지 및 감자를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 바람직한 가지과 식물은 토마토이다. 박과 식물의 예는 일본 캔털루프, 오이, 메론 및 수박을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 바람직한 박과 식물은 일본 캔털루프이다.메꽃과 식물의 예는 나팔꽃, 고구마 및 벨빈드(bellbind)를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 바람직한 메꽃과 식물은 나팔꽃이다. 식물은 특별히 명시되지 않는 한 전체 식물, 식물 기관, 식물 조직, 식물 세포 및 종자의 어떠한 것도 의미한다. 식물 기관의 예는 뿌리, 잎, 줄기, 꽃을 포함한다. 식물 세포의 예는 캘러스 및 배양된 세포의 현탁액을 포함한다. 특정한 실시태양에서 식물은 전체 식물을 나타낸다.
본 발명의 또다른 실시태양에서 예를 들어 가지과, 겨자과, 장미과(Rosaceae), 콩과, 박과, 꿀풀과(Lamiacea), 백합과(Liliaceae), 명아주과(Chenopodiaceae), 산형과(Umbelliferae), 메꽃과, 국화과(Compositae) 식물이 사용된다. 본 발명에 사용된 식물 종의 예는 교목 종, 과수목 종, 뽕나무과(Moraceae) 식물(즉, 고무목) 및 아욱과(Malvaceae) 식물(즉, 면)의 어떠한 것도 포함한다.
본 발명의 간단한 방법에서 식물 조직(휴면상태 조직(숙성 종자, 미숙성 종자, 겨울눈 및 괴경), 생식세포질, 생장점 및 꽃눈 포함)이 일렉트로포레이션된다. 가장 간단한 방법에서 종자가 일렉트로포레이션된다. 핵산이 본 발명의 일렉트로포레이션법으로 도입된 종자를 재배를 위해 토양 내에 직접 심음으로서 종자는 핵산-도입된 물질/형질전환체로 용이하게 발달된다. 종자는 일반적으로 세 부분 즉, 배, 배유 및 종피로 구성된다(Yakichi Noguchi and Shinichiro Kawata,supervisors, Nogaku-Daijiten [Unabridged Dictionary of Agriculture], Yokendo(1987), p.896(Hideo Chizaka에 의해 제조된 부분에 상응)). 배는 식물의 모든 유전적 정보를 포함하고 전체 식물로 생장한다. 모든 단자엽 식물 및 모든 쌍자엽 식물은 배를 지닌다. 핵산 도입이 본 발명의 일렉트로포레이션법에 의해 수행되면 도입된 핵산이 배 내에서 발현되었음이 확인되었다. 따라서 본 발명의 가장 간단한 방법은 배를 포함한 종자를 지닌 어떠한 식물에서도 핵산 도입된 전체 식물/형질전환체를 용이하게 수득하는데 사용될 수 있다.
겨자과 식물의 예는 무속(Raphanus), 배추속(Brassica), 애기장대속(Arabidopsis), 고추냉이속(Wasabia) 및 냉이속(Capsella)을 포함한다. 특이적인 예는 일본 백색 무, 평지씨, 애기장대(Arabidopsis thaliana), 일본 양고추냉이 및 셰퍼드 펄스(Shepherd's purse)를 포함한다.
벼과 식물의 예는 쌀속(Oryza), 밀속(Triticum), 보리속(Hordeum), 호밀속(Secale), 사탕수수속(Saccharum), 수수속(Sorghum), 옥수수속(Zea)을 포함한다. 특정한 예는 쌀, 보리, 호밀, 사탕수수, 수수 및 옥수수를 포함한다.
여기에 사용된 "동물"이라는 용어는 식물과 달리 이동 능력을 지닌 산소 및 유기 식량 및 미네랄을 필요로 하는 동물계의 생물체를 집합적으로 나타낸다. 동물은 척추동물 및 무척추동물로 분류된다. 척추동물로서 먹장어목(Myxiniformes), 칠성장어목(Petromyzontiformes), 연골어강(Chondrichthyes), 경골어강(Osteichthyes), 양서류, 파충류, 조류, 포유류 등이 사용된다. 더욱 바람직하게는 포유류(즉, 단공류(Monotremata), 유대류(Marsupialia), 빈치류(Edentate), 피익목(Dermoptera), 익모류(Chiroptera), 육식동물(Carnivore), 식충동물(Insectivore), 장비류(Proboscidea), 기제류(Perissodactyla), 우제류(Artiodactyla), 관치목(Tubulidentata), 유린류(Pholidota), 바다소목(Sirenia), 고래류(Cetacean), 영장류(Primates), 설치목(Rodentia), 토끼목(Lagomorpha) 등)가 이용된다. 더욱 더 바람직하게는 영장류(즉, 침팬지, 일본 짧은꼬리원숭이, 인간)가 이용된다. 무척추동물로서 갑각류(Crustacea), 노래기류(Diplopoda), 소각류(Pauropoda), 순각류(Chilopoda), 결합류(Symphyla), 곤충류(Insecta) 등이 이용된다. 더욱 바람직하게는 곤충(즉, 누에(Bombyx moriLinnaeus)를 포함한 인시류(Lepidoptera))이 이용된다.
여기에 사용된 "형질전환 생물체"라는 용어는 특정 유전자가 통합된 생물체를 나타내고; "형질전환 식물"이라는 용어는 특정 유전자가 통합된 식물을 나타내고; "형질전환 동물"이라는 용어는 특정 유전자가 통합된 동물을 나타낸다.
본 발명의 방법에 의해 핵산 도입/형질전환된 세포 및 조직은 당분야에 알려진 방법에 의해 분화되고, 생장되고/또는 번식된다. 식물 종의 경우 세포 또는 조직을 분화시키고, 생장시키고/또는 번식시키는 단계는 예를 들어 식물 세포 또는식물 조직 또는 세포 또는 조직을 포함한 전체 식물을 배양함으로서 달성된다. 식물은 당분야에 알려진 어떠한 방법에 의해서도 배양될 수 있다. 식물 배양의 방법은 예를 들어 "Moderu shokubutsu no Jikken Purotokoru, Ine ·Shiroinunazuna : Saibo kogaku Bessatsu Shokubutsu Saibo Kogaku Sirizu 4; Ine no Saibaiho [Experimental Protocol for Model Plants For Rice andArabidopsis thaliana: Cellular Engineering, Special Issue, Plant Cellular Engineering Series 4; Rice Cultivating Methods]"(Kazutoshi Okuno) pp. 28-32 및 "Shiroinunazuna no saibaiho [Cultivating Methods forArabidopsis]"(Yasuo Niwa) pp. 33-40(Supervised by Ko Shimamoto and Kiyotaka Okada)에 기술되어 있고, 당업자가 용이하게 수행할 수 있다. 따라서 이들 각 방법은 여기에 상세히 기술되어 있지 않다. 예를 들어 애기장대(Arabidopsis thaliana)는 토양 배양, 암면 배양 또는 수경법에 의해 배양될 수 있다. 애기장대 종자가 뿌려지고 연속적인 조명(약한 백색형광등(약 6000 룩스)) 하에서 배양되면 첫 번째 꽃은 씨뿌리기 약 4주 후에 피어나고 종자는 개화 후 약 16일 후 성숙한다. 하나의 씨드팟(seedpot)은 약 40∼50개의 종자를 포함한다. 약 10,000개의 종자가 씨뿌리기 약 2∼3개월 후 식물이 시들어 죽기 전에 수득된다. 밀의 배양시 예를 들어 밀이 씨뿌리기 후 낮은 온도 및 단일 처리에 노출되지 않으면 식물은 이삭이 패고 개화하지 않는다고 잘 알려져 있다. 따라서 예를 들어 밀이 인공적 환경(즉 비닐하우스 또는 그로스 챔버) 하에서 배양되면 초기 발달 단계의 밀 식물을 낮은 온도 및 단일 처리(즉, 광 기간: 20℃, 8시간(약 2000 룩스) 및 암 기간: 8℃, 16시간)가 수행될 필요가 있다. 이러한 처리는 춘화처리라고 불린다. 각 식물에 요구되는 배양 조건은 일반적으로 당분야에 잘 알려져 있으므로 여기에 상세시 기술되지 않는다.
식물 이외 종의 경우(즉, 동물 종) 본 발명의 방법에 의해 핵산 도입/형질전환된 세포 및 조직은 당분야에 알려진 어떠한 방법으로도 분화되고, 생장되고 및/또는 번식된다(예를 들어 Yoshiharu Izumi et al., eds., "SeibutsuKagaku Jikken no Tebiki 4. Dobutsu ·Soshiki Jikkenho [Guidelines for Biochemical Experiments 4. Experimental Protocol for Animal ·Tissue], Kagaku Dojin, 1987 등) 참조). 예를 들어 일렉트로포레이션에 의해 핵산이 도입된 세포 및/또는 조직은 상온(약 25℃)에서 통상적으로 이용가능한 사료로 생장된다.
여기에 사용된 도입되는 유전자는 폴리뉴클레오타이드로 형성된다.
여기에 사용된 "폴리뉴클레오타이드", "올리고뉴클레오타이드" 및 "핵산"이라는 용어는 동일한 의미를 지니고 어떠한 길이의 뉴클레오타이드의 폴리머이다. 또한 이들 용어는 "올리고뉴클레오타이드 유도체" 또는 "폴리뉴클레오타이드 유도체"를 포함한다. "올리고뉴클레오타이드 유도체" 및 "폴리뉴클레오타이드 유도체"라는 용어는 뉴클레오타이드의 유도체를 포함하거나 뉴클레오타이드 사이의 정상 결합과 다른 결합을 지닌 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 나타내는데 상호교환가능하게 사용된다. 특히 이러한 올리고뉴클레오타이드의 예는 2'-O-메틸-리보뉴클레오타이드, 포스포디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 전환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 포스포디에스테르 결합이 N3'-P5' 포스포르아미데이트 결합으로 전환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 포스포디에스테르 결합이 펩타이드 핵산 결합으로 전환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 우라실이 C-5 프로피닐 우리실로 치환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 우라실이 C-5 티아졸 우라실로 치환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 시토신이 C-5 프로피닐 시토신으로 치환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 시토신이 페녹사진-변형된 시토신으로 치환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 리보스가 2'-O-프로필리보스로 치환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 리보스가 2'-메톡시에톡시리보스로 치환된 올리고뉴클레오타이드 유도체를 포함한다. 나타내지 않은 경우 특정한 핵산 서열도 명백하게 나타난 서열뿐만 아니라 그의 보존적으로 변형된 변이체(즉 퇴보성 코돈 치환) 및 그의 상보적 서열을 함축적으로 포함한다. 특히, 퇴보성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합된-염기 및/또는 디옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로서 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260:2605-2608, 1985; Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8:91-98, 1994). "핵산"이라는 용어는 "유전자", "cDNA", "mRNA", "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"와 상호교환가능하게 사용된다. 또한 특정한 핵산 서열은 "스플라이스(splice) 변이체"를 함축적으로 포함한다. 유사하게는, 핵산에 의해 인코드된 특정 단백질은 핵산의 스플라이스 변이체에 의해 인코드된 어떠한 단백질도 함축적으로 포함한다. 전사후 개시 핵산 전사체가 스플라이스되어 다른(대안의) 핵산 스플라이스 생성물이 다른 폴리펩타이드를 인코드하게 된다. 스플라이스 변이체의 생성 메카니즘은 변화하나 엑손의 다른 스플라이싱을 포함한다. 또한 리드-쓰루(read-through) 전사에 의해 동일한 핵산으로부터 유도된 또다른 폴리펩타이드는 이러한 정의에 의해 포함된다. 스플라이스 생성물의 재조합 형태를 포함한 스플라이싱 반응의 생성물은 이러한 정의에 포함된다.
여기에 사용된 "유저자"는 유전적 특성을 정의하는 인자를 나타낸다. 유전자를 일반적으로 염색체 상에 미리결정된 순서로 배열된다. 단백질의 초기 구조를 정의하는 유전자는 구조 유전자라고 불린다. 구조 유전자의 발현을 제어하는 유전자는 조절 유전자로 불린다. 또한 여기에 사용된 "유전자"는 "폴리뉴클레오타이드" "올리고뉴클레오타이드" 및 "핵산"을 포함한다. 여기에 사용된 유전자의 "상동성"은 2 이상의 유전자 서열 사이의 동일성 규모를 나타낸다. 따라서 2개 유전자 사이의 상동성이 클수록 그들 서열 사이의 동일성 또는 유사성이 크다. 2개 유전자가 상동성을 지니는지 여부는 핵산의 경우 직접적으로 서열을 비교함으로서 또는 스트린전트(stringent) 조건 하에서의 하이브리디제이션 방법에 의해 결정된다. 2개 유전자 서열이 서로 직접 비교될 때 유전자는 유전자의 DNA 서열이 서로 각각 적어도 50% 이상, 바람직하게는 적어도 70% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 지니면 상동성을 지닌다.
염기 서열 사이의 동일성 비교 및 염기 서열 사이의 상동성 계산은 디폴트 파라미터로의 서열 분석 기구 BLAST를 이용하여 계산된다.
여기에 사용된 유전자, 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드의 "발현"은 유전자가 생체 내에서 특정한 작용이 수행되고 다른 형태로 전환됨을 나타낸다. 바람직하게는 유전자, 폴리뉴클레오타이드 등은 폴리펩타이드 형태로 전사되고 번역되나 전사에 의한 mRNA이 생성은 발현의 실시태양이다. 더욱 바람직하게는 이러한 폴리펩타이드의 형태는 번역후 처리에 의해 수득된다.
여기에 사용된 "뉴클레오타이드"는 자연발생적 또는 비자연발생적이다. "뉴클레오타이드 유도체" 또는 "뉴클레오타이드 아날로그"는 자연발생적 뉴클레오타이드과 다르나 자연발생적 뉴클레오타이드와 유사한 기능을 지닌 뉴클레오타이드를 나타낸다. 이러한 뉴클레오타이드 유도체 및 뉴클레오타이드 아날로그는 당분야에 잘 알려져 있다. 이러한 뉴클레오타이드 유도체 및 뉴클레오타이드 아날로그의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트, 메틸-포스포네이트, 키랄 메틸-포스포네이트, 2-O-메틸-리보뉴클레오타이드 및 펩타이드 핵산(PNA)을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
여기에 사용된 "단편"이라는 용어는 전체-길이 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 대해(그의 길이는 n) 1 내지 n-1의 서열 길이를 지닌 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. 단편의 길이는 목적에 따라 적당히 변한다. 예를 들어 폴리펩타이드 길이의 하한선은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 이상의 아미노산이다. 여기에 명확하게 나타나있지 않은 정수(즉, 11 등)도 하한선으로 적당하다. 폴리뉴클레오타이드의 하한선은 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 이상의 뉴클레오타이드이다. 여기에 명확하게 나타나있지 않은 정수(즉, 11 등)도 하한선으로 적당하다.
본 발명에 사용된 일반적인 분자생물학적 기술은 Ausubel F. A. et al. eds., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, Newr York NY, 1988; Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1987 등을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다.
유전자가 여기에 논의될 때 "벡터"는 타겟 세포 내로의 목적 폴리뉴클레오타이드 서열을 도입시키는 것이 가능한 매체를 나타낸다. 이러한 벡터는 원핵세포, 효모 세포, 동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 동물 및 식물 개체와 같은 숙주 세포, 바람직하게는 식물 세포 내에서 자가-복제가 가능하거나 그의 염색체 내로 통합되는 것이 가능하고, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 전사에 적당한 사이트에위치한 플라스미드를 지니는 것이 가능한 벡터를 포함한다.
여기에 사용된 "발현 벡터"라는 용어는 구조 유전자 및 그의 발현을 조절하기 위한 프로모터 및 이에 더하여 숙주 세포 내에서 작용할 수 있게 하는 상태의 다양한 조절 요소를 포함한 핵산 서열을 나타낸다. 조절 요소는 바람직하게는 터미네이터, 약물-저항성 유전자와 같은 선택가능 마커 및 인핸서를 포함한다. 생물체(즉, 식물) 발현 벡터의 형태 및 조절 요소의 형태는 숙주 세포에 따라 달라짐이 당업자에게 잘 알려져 있다. 스크리닝을 위한 선택가능 마커의 예는 항생제 카나마이신에 대한 저항성을 부여하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 효소를 인코드하는 neo 유전자(Beck et al., Gene, 19:327, 1982); 항생제 하이그로마이산에 대한 저항성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 효소를 인코드하는 hyg 유전자(Gritz and Davies, Gene, 25:179, 1983); 제초제 포스피노트리신에 대한 저항성을 부여하는 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제를 인코드하는 bar 유전자(EP 242236); 스트렙토마이신 포스포트랜스퍼라제를 인코드하는 spt 유전자; 스트렙토마이신 저항성 유전자; 및 스펙티노마이신 저항성 유전자(H. S. Chawla, Introduction to Plant Biotechnology 2nd:363, Science Publishers, Inc., hard cover, 2002)와 같은 약물-저항성 유전자; β-글루쿠로니다제를 인코드하는 GUS 유전자(Jefferson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 6:3901, 1986); 루시페라제 유전자(Ow et al., Science, 234:856, 1986) 및 GFP(녹색 형광 단백질) 코딩 유전자(Funakoshi Co., Ltd, Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan사)와 같은 선택가능 마커 유전자를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
본 발명의 스크리닝을 위한 약제의 예는 카나마이신, 하이그로마이신, 제네티신(geneticin), 젠타미신, 스트렙토마이신 및 스펙티노마이신을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
"재조합 벡터"는 타겟 세포의 목적 폴리뉴클레오타이드 서열을 도입시킬 수 있는 벡터를 나타낸다. 이러한 벡터의 예는 자가 복제하는 것이 가능하거나 숙주 세포(즉, 식물 세포 및 전체 식물) 내의 염색체 내로 통합되는 것이 가능한 벡터를 포함하고, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 전사에 적당한 사이트에서 프로모터를 포함한다.
식물 세포의 "재조합 벡터"의 예는 Ti 플라스미드, 토마토 바이러스 벡터 및 제미니(Gemini) 바이러스 벡터를 포함한다.
"터미네이터"는 유전자의 단백질-인코딩 구역의 다운스트림에 위치하고 DNA가 mRNA로 전사될 때 전사의 종결 및 폴리 A 서열의 첨가에 관련된 서열이다. 터미네이터는 mRNA의 안정성에 기여하고, 유전자 발현량에 영향을 미친다고 알려져 있다. 이러한 터미네이터의 예는 CaMV35S 터미테이터, 노팔린 신타제 유전자(Tnos)의 터미네이터, 담배 PR1a 유전자의 터미테이터를 포함하나 이에 한정적인것은 아니다. 여기에 사용된 "프로모터"라는 용어는 유전자의 전사 개시 사이트를 결정하는 염기 서열이고 전사 빈도를 직접 조절하는 DNA 구역이다. 전사는 프로모터에 결합하는 RNA 중합효소에 의해 시작된다. 프로모터 구역은 일반적으로 추정되는 단백질 코딩 구역의 첫 번째 엑손의 약 2 kbp 업스트림 내에 위치한다. 따라서 DNA 분석 소프트웨어를 이용하여 게놈 염기 서열 내 단백질 코딩 구역을 예측함으로서 프로모터 구역을 추정하는 것이 가능하다. 추정되는 프로모터 구역은 일반적으로 구조 유전자의 업스트림에 위치한다. 바람직하게는 추정되는 프로모터 구역은 첫 번째 엑손의 번역 개시 사이트의 약 2 kbp 업스트림 내에 위치한다.
본 명세서 내의 유전자 발현을 논의할 때 "사이트 특이성"은 일반적으로 생물체(즉, 식물) 내 사이트(즉, 식물의 경우; 뿌리, 잎자루, 줄기, 잎, 꽃, 종자, 생식세포, 배, 열매 등)에 대한 유전자의 발현 특이성을 나타낸다. "시기적 특이성"은 생물체(즉, 식물)의 발단 단계(즉, 식물의 경우 생장 단계 및 발아 후 몇 일)에 대한 유전자 발현 특이성을 나타낸다. 이러한 특이성은 적당하게 선택된 프로모터를 이용하여 원하는 생물체 내로 도입될 수 있다.
여기에 사용된 본 발명의 프로모터 발현의 "구성적(constitutive)"이라는 용어는 생물체의 생장 단계가 연소기(Juvenile phase) 또는 성체기인 것에 관계없이 프로모터가 생물체의 모든 조직 내에 실질적으로 일정한 양으로 발현되는 프로모터의 특성을 나타낸다. 특히 노던 블럿팅 분석이 본 명세서의 실시예에 기술된 것과 동일한 조건 하에서 수행될 때 실질적으로 동일한 발현양이 어떤 시간(즉, 2 이상의 시간 포인트(즉, 5일 및 15일))에 동일하거나 상응하는 사이트에서 발현되면 발현은 본 발명의 정의에 따라 구성적인 것으로 간주된다. 구성적 프로모터는 정상 생장 환경에서 생물체의 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 여기에 사용된 프로모터 발현에 대한 "스트레스 반응성"은 적어도 하나 이상의 스트레스가 생물체에 의해 경험될 때 프로모터의 발현양이 변화되는 프로모터의 특성을 나타낸다. 특히 발현양의 증가 특성은 "스트레스 유도성"으로 표현된다. 발현양 감소 특성은 "스트레스 억제성"으로 표현된다. "스트레스 억제성" 발현은 발현이 정상 상태에서 관찰되는 전제 하에 기초한다. 따라서 이러한 개념은 "구성적" 발현과 중복된다. 이들 특성은 생물체의 어떤 부부능로부터 RNA를 추출하고 노던 블럿팅에 의해 RNA 양을 분석하거나 웨스턴 블럿팅에 의해 발현된 단백질을 정량화함으로서 측정될 수 있다. 식물 또는 그의 일부(특히 세포/조직)가 스트레스 유도성 프로모터 및 목적 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산을 포함한 벡터로 형질전환될 때 프로모터를 유도하는 능력을 지닌 자극제는 특정 유전자가 미리결정된 조건 하에서 발현되도록 유발할 수 있다.
여기에 사용된 "인핸서"라는 용어는 목적 유전자의 발현 효율을 강화시키기 위해 사용되는 서열을 나타낸다. 식물에 사용되는 인핸서로서 CaMV35S 프로모터 내 업스트림 서열을 포함한 인핸서 구역이 바람직하다. 하나 이상의 인핸서가 사용되거나 어떠한 인핸서도 사용되지 않기도 한다.
여기에 사용된 "실시가능하게 결합된"이라는 용어는 그의 발현(작용)이 전사 및 번역 조절 서열(즉, 프로모터, 인핸서 등) 또는 번역 조절 서열의 조절 하에 있도록 원하는 서열이 위치하는 것을 나타낸다. 프로모터가 유전자에 실시가능하게 결합되기 위해 일반적으로 프로모터는 유전자의 바로 인접한 업스트림에 위치한다. 그러나 간섭 서열이 프로모터와 구조 유전자 사이에 존재하여 프로모터가 구조 유전자에 항상 인접한 것은 아니다.
도입된 유전자의 존재는 서던 블럿팅 또는 PCR에 의해 확인된다. 또한 도입된 유전자의 전사는 노던 블럿팅 또는 PCR에 의해 검출된다. 유전자 생성물인 단백질의 발현은 필요한 경우 예를 들어 웨스턴 블럿팅에 의해 확인된다.
이후 본 발명은 실시예를 통해 설명된다. 하기 실시예는 설명의 목적을 위한 것이다. 따라서 본 발명의 범위는 추가된 청구항을 제외하고 상기-기술된 설명 또는 하기 실시예에 한정적이지 않다.
(방법 및 물질)
(1) 도입된 유전자
본 발명에서 항생제 저항성 유전자 및/또는 GUS 유전자를 포함한 플라스미드 DNA가 주로 사용되었다. 본 발명은 이에 한정적이지 않다. 하기 실시예에서 3개의 플라스미드가 사용되었다. pBI221(Clontech)은 콜리플라워 모자이크 바이러스(CMV)의 35S 프로모터, β글루쿠로니다제(GUS) 유전자 및 노팔린 신타제 유전자(NOS)의 터미네이터를 포함한다. 본 플라스미드는 GUS 활성에 기초한 유전자 도입의 모니터링의 목적에 주로 사용되었다. pWI-H5K(제한 맵은 도 1에 나타남)는 pWI-GUS로부터 GUS 유전자를 제거하고(Masashi Ugaki et al., Nucleic Acids Res., 19:371-377, 1991) 이에 NPTⅡ 유전자를 삽입시킴으로서 구조되었다. pWI-H5K는 hpt(하이그로마이신 저항성 유전자), CMV의 터미네이터, NPTⅡ(카나마이신 및 젠타미신 저하성 유전자) 및 CMV의 35S 프로모터 및 터미테이터를 포함한다. pBC1은 미국 코넬대학 Fromm 박사에 의해 개발되었다(현재 Fromm 박사는 Monsanto 회사의 일원임). pBC1은 옥수수 탈수소효소 유전자의 프로모터 및 알코올의 인트론 일부, GUS 유전자, NOS의 터미네이터, CMV의 35S 프로모터 및 hpt(하이그로마이신 저항성 유전자), NOS의 터미네이터를 포함한다(Hagio et al., Plant Cell Rep., 14:329-334, 1995). 플라스미드 DNA로서 pWI-GUS 플라스미드 내의 GUS 유전자가 GFP(녹색 형광 단백질) 유전자로 치환된 플라스미드, pigA3GFP 플라스미드(TamuraJournal of Sericultural Science of Japan, 69:1-12, 2000) 등이 사용된다.
(2) 종자이 전처리(제 1일)
실시예에 사용된 종자는 본 발명자에 의해 생성되었고 종자 및 묘목 회사로부터 구입되었다. 약 10∼30개의 적당한 숙성 종자가 시각 검사(크기별 분류)에 의해 선택되었고, 종자가 물을 흡수하도록 25℃에서 밤새 수돗물에 침수되었다. 바람직하게는 물 흡수에 사용된 수돗물은 다양한 박테리아의 번식을 방지하기 위해 차아염소산나트륨 수용액(약 0.01%의 유효 염소 농도로 조정됨)을 포함한다. 밀 형질전환체의 생성 목적을 위한 실험에서 물 흡수는 이틀 밤 동안 10℃에서 수행되었다.
(3) 일렉트로포레이션 기구
본 발명에 사용된 일렉트로포레이션 기구는 통상적으로 사용가능한 일렉트로포레이션 기구이다(즉, CUY21EDIT 유전자 도입 기구, Nepagene Co., Ltd., Ichikawa-shi, Chiba-ken, Japan).
본 실험에서 일렉트로포레이션에 사용되는 일렉트로포레이션 챔버는 형질전환되는 식물 조직을 수용할 수 있는 크기를 지닌 어떤 것도 된다. 냉각될 수 있는 챔버가 바람직하다. 본 실험에서 백금 전극을 지니고 길이 1 cm x 폭 2 cm x 높이 2 cm의 용적을 지닌 제작된 일렉트로포레이션 챔버가 사용되었다.
(4) 완충액의 제조(제 2일)
각 실험에서 1.5 ml 이하의 완충액 및 150 ㎍의 플라스미드 DNA가 사용되었다. 완충액은 250 mM 염화칼슘, 12.5 mM 스페르미딘(spermidine), 0.5% 폴리비닐 피롤리돈 및 0.3% Tween20으로 구성되었다.
(5) 감압
완충액 및 싹을 틔우기 시작한 종자가 지름 35 mm x 높이 10 mm의 페트리디쉬에 놓였고 1시간 동안 대기압의 0.096 MPa 또는 0.06 MPa 이하의 압력을 이용하여 감압되었다.
(6) 일렉트로포레이션
감압 후 종자 및 완충액이 페트리디쉬에서 챔버로 옮겨져서 1분간 얼음 위에 유지되었다. 이후 50 μsec의 펄스 폭을 지닌 100 V 또는 50 V의 펄스 전압(즉, 전압이 50μsec 동안 적용되고 전압 적용이 75 μsec 동안 중지되고 이러한 서클이 반복되는 직사각형 전압 파장)이 전극 사이의 거리가 1 cm인 전극 사이에 적용되었다. 펄스 수는 50 또는 99이었다. 챔버는 2분간 얼음 위에 유지되었다. 이후 완충액이 제거되었고 종자는 본래의 페트리디쉬에 다시 놓였다. 2 ml의 0.5% 폴리비닐피롤리돈(PVP) 수용액이 종자를 포함한 페트리디쉬로 첨가되었다. PVP 수용액은 다양한 박테리아의 번석을 방지하기 위해 약 0.01%의 유효 염소 농도로 조정된 차아염소산트륨 수용액을 포함하였다.
페트리디쉬는 약 1시간 동안 4℃에서 보존되었고 25℃에서 밤새 정치되었다.
(7) 종자의 후처리(제 3일)
다음날 완충액이 제거되었고 동일한 조성물을 지닌 2 ml의 새로운 완충액이 페트리디쉬에 첨가되었다. 페트리디쉬는 25℃에서 밤새 정치되었다.
(8) GUS 분석(제 4일)
다음날 완충액이 제거되었고 2 ml의 X-Gluc 용액(100 mM 인산 완충액, pH 7.0, 0.05% X-Gluc(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-글루쿠로니다제시클로헥실암모늄염), 0.5 mM 페리시안칼륨, 0.5 mM 페로시안칼륨, 0.3% Triton X-100, 20% 메탄올)이 페트리디쉬에 첨가되었다. 페트리디쉬는 25℃에서 밤새 정치되었다. GUS 유전자 발현은 제 5일 이후에 염색에 의해 확인되었다.
(9) 항생제-함유 배지를 이용한 스크리닝(제 4일 이후)
종자는 하기와 같이 GUS 분석없이 생장되었다.
a) 종자는 여과자 조각이 놓인 9 cm x 15 mm의 페트리디쉬에 옮겨졌다.
b) 10 ml의 항생제 함유 증류수 용액이 페트리디쉬에 첨가되었다. 밀 종자가 제네티신(geneticin)으로 스크린되면 그의 농도는 2000 ppm 또는 1200 ppm이었다. 쌀 종자가 제네티신으로 스크린되면 그의 농도는 200 ppm이었다.
c) 종자는 조건: (광 기간: 25℃, 16시간, 약 2000 룩스; 및 암 기간: 25℃, 8시간) 또는 (광 기간: 20℃, 8시간, 약 2000 룩스; 및 암 기간: 8℃, 16시간)하에서 배양식에서 생장되었다.
(10) 형질전환체의 생장(제 11일 이후)
항생제-함유 배지로의 스크리닝 후 식물은 조건: (광 기간: 15℃, 8시간, 약 50000 룩스(나트륨 램프); 및 암 기간: 15℃, 16시간) 또는 (광 기간: 20℃, 8시간, 약 2000 룩스; 및 암 기간: 8℃, 16시간) 하의 분리된 그로스 챔버 내에서 원예 토양(New Magic Soil; Sakata Seed Corporation, Tsuzuki-ku, Yokohama-shi, Japan)을 포함한 지름 8.5 cm x 높이 5.5 cm의 단지(화분)에 심어졌다.
(11) DNA 추출
유전자 도입은 하기와 같이 PCR에 의해 확인되었다. 입 및 줄기는 형질전환된 식물로부터 수집되었고 DNA는 잎 및 줄기로부터 추출되었다. DNA 추출은 잘 알려진 기술에 의해 달성된다. 일반적인 DNA 추출 기술은 CTAB 기술이다(Hirofumi Uchimiya, "Shokubutsu Idenshi Sosa Manyuaru Toransugenikku Shokubutsu no Tsukurikata [Manual of Plant Genetic Engineering; How To Produce Transgenic Plants]", Kodansha Scientific, pp. 71-74, hardcover,1989).
(12) PCR 분석
일렉트로포레이션후 DNA는 제 14일에 식물 개체의 잎으로부터 추출되었다. 한 쌍의 프라이머(5'-ctgcgtgcaatccatcttg-3'(서열번호: 1), 5'-actcgtcaagaaggc gatagaag-3'(서열번호: 2))가 NPTⅡ 유전자 검출용 PCR에 사용되었다. 또다른 한 쌍의 프라이머(5'-catgattgaacaagatggattgcacgcaggttctc-3'(서열번호: 3), 5'-cag aagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcgat-3'(서열번호: 4))도 사용되었다. 본 프라이머 쌍은 더욱 특이적인 방식으로 NPTⅡ 유전자를 검출하는데 더욱 바람직하게 사용될 수 있다. 중합효소로서 AmpliTaqGold(등록상표)가 제조사의 지침에 따라 사용되었다(Perkin Elmer Japan Co., Ltd.(Nishi-ku, Yokohama-shi, Japan)). 증폭에 사용되는 열 사이클러는 하기의 셋팅 조건 하에서 사용되었다 :
(a) 95℃ 10분 (1 사이클);
(b) 95℃ 1분, 64℃ 2분, 72℃ 2분 (50 사이클);
(c) 72℃ 7분 (1 사이클); 및
(d) 4℃에서 보존
(13) 서던 블럿팅 분석
일렉트로포레이션후 서던 블럿팅 분석은 (12)의 PCR 분석에 의해 도입된 유전자를 지닌 것으로 확인된 식물 개체로부터 유도된 DNA에 대해 수행되었다. 서던 블럿팅은 당분야에 잘 알려져 있고 이를 위한 조건은 필요한 경우 당업자에 의해 적당히 선택된다. 서던 블럿팅 분석에서 도입된 NPTⅡ 유전자에 특이적인 서열(서열목록 내 서열번호 5)이 프로브로 사용되었다.
(14) 유전적 분석
서던 블럿팅 분석에 의해 도입된 유전자를 지닌 것으로 확인된 식물은 더욱 생장되어 자가-수분되었다. 그 결과로서 많은 숙성 종자가 수득되었다. 종자들 중에 약 10개 종자가 무작위로 선택되었고 토양을 포함한 화분에서 배양되었다. DNA는 어린 식물의 잎으로부터 추출되었다. DNA는 (12)에 기술된 바와 같은 조건 하에서 PCR을 수행하기 위해 주형으로서 사용되었다.
(실시예 1)
(밀의 형질전환)
밀 숙성 종자(품종: Norin 61)가 실험되었다. 종자는 25℃에서 밤새 물을 흡수하도록 하였다. 싹을 틔우기 시작한 30개 종자 및 pWI-GUS(GUS 분석용) 또는 pWI-H5K(생장용)의 플라스미드 DNA(200 ㎍/2 ml)를 포함한 2 ml의 일렉트로포레이션 완충액이 페트리디쉬에 놓였다. 감압은 대기압의 0.096 MPa 이하로 1시간 동안 수행되었다. 이후 종자 및 완충액은 페트리디쉬로부터 챔버로 옮겨졌다. 챔버는 1분간 얼음위에 놓였다. 이후 전기 펄스가 하기 조건 하에서 적용되었다 : 펄스 폭은 50 μsec, 펄스 수는 50이었다. 챔버는 얼음 위에서 2분간 더 정치되었다. 이후 종자 및 완충액은 본래의 페트리디쉬에 다시 놓였다. 페트리디쉬는 4℃에서 1시간 동안 보존된 후 25℃에서 밤새 정치되었다. 다음날 완충액이 제거되었다. 2 ml의 증류수가 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다. 그 다음날 증류수가 제거되었다. 2 ml의 X-Gluc 용액이 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다. 유전자 발현 수준은 인덱스로서 GUS 활성을 이용하여 측정되었다. 결과는 표 1에 나타나 있다.
| 전압 (V/cm) | 유전자 발현 수준 | 주목 |
| 0 | - | |
| 10 | - | |
| 20 | - | |
| 50 | ± | |
| 75 | ± | |
| 100 | + | |
| 150 | - | 종자는 갈변 또는 사멸 |
| 200 | - | 종자는 갈변 또는 사멸 |
상기-기술된 결과에 따라 형질전환은 100 V의 전압이 적용될 때 가장 높은 효율로 수행됨이 이해될 것이다(주지 : 전극 사이의 거리는 1 cm임).
유사한 결과가 도 2에 나타나 있다. 도 2는 하기 조건 하에서의 일렉트로포레이션 결과를 나타낸다 : 펄스 폭은 50 μsec, 펄스 수는 50, 압력은 대기압의 0.096 MPa 이하(감압), 적용된 전압은 100 V(A), 50 V(B), 20 V(C) 또는 0 V(D)임. 적용된 전압이 100 V일 때 형질전환 효율이 가장 높았다.
도 3은 1: 조건 (전압: 100 V, 펄스 폭: 50 μsec, 펄스 수: 50, 압력: 대기압의 0.096 MPa 이하(감압)) 하에서의 형질전환된 밀 종자; 2: 조건 (전압: 100 V, 펄스 폭: 50 μsec, 펄스 수: 50, 감압 없음) 하에서 일렉트로포레이션만된 밀 종자; 3: 대조군 밀 종자의 사진을 나타낸다. 도 3에 나타난 바와 같이 형질전환은 감압 및 일렉트로포레이션이 결합될 때만 달성된다.
생장을 위한 종자는 GUS 활성 실험되지 않았고, 감압 후 종자는 2000 ppm 제네티신을 함유한 증류수에서 생장되었다((7) 종자 후처리, (9) 항생제-함유 배지를 이용한 스크리닝 및 (10) 형질전환체의 생장에 나타난 바와 같이). 결과는 도 4에 나타나 있다. DNA는 묘목으로부터 추출되었고 도입된 유전자의 존재를 확인하기 위해 PCR되었다((11) DNA 추출 및 (12) PCR 분석에 나타난 바와 같이).
서열번호 1 및 2는 PCR을 수행하는데 사용되었다. 그 결과로서 NPTⅡ가 전체 식물 내로 도입되었음이 확인되었다.
상기-기술된 실험의 재현성은 실질적으로 동일한 방식으로 실험을 반복함으로서 조사되었다. 그 결과로서 실질적으로 동일한 결과가 수득되었다. 이러한 반복 실험의 특정한 절차의 상세한 설명은 하기에 기술된다. 먼저 7 cm의 직경을 지닌 여과지 조각이 90 x 15 mm의 페트리디쉬에 놓였다. 밀 Norin 61의 150개 종자가 여과지 상에 놓였다. 10 ml의 물이 페트리디쉬에 첨가되었고 2일간 10℃의 암실에 놓여 종자가 물을 흡수할 수 있게 하였다. 첨가된 물은 다양한 박테리아 번식을 방지하기 위해 차아염소산나트륨 용액을 함유하였다(약 0.01%의 유효 염소 농도로 조정됨). 제 2일에 어린 뿌리 및 어린 슈트가 종피를 탈피하였다. 따라서 종자는 싹을 틔우기 시작한 것으로 확인되었다. 제 2일에 종자는 수돗물로 잘 세척되었다. 세척 직후 본 발명의 핵산 도입 처리가 수행되었다. 30개 밀 종자 및 pWI-H5K DNA(200 ㎍/2 ml)를 포함한 2 ml의 일렉트로포레이션 완충액이 페트리디쉬에 놓였다. 감압은 대기압의 0.096 MPa 이하로 1시간 동안 수행되었다. 이후 종자 및 완충액은 페트리디쉬에서 챔버로 옮겨졌고 얼음 위에서 1분간 정치되었다. 이후 전기 펄스가 하기 조건 하에서 적용되었다 : 전압은 100 V, 전극 사이의 거리는 1 cm; 펄스 폭은 50 μsec; 펄스 수는 50이었음. 챔버는 2분간 더 얼음 위에서 놓였다. 이후 종자 및 완충액은 본래의 페트리디쉬에 다시 놓였다. 페트리디쉬는 약 1시간 동안 4℃에서 보존되었고 25℃에서 밤새 정치되었다. 다음날 완충액이 제거되었고 2 ml의 증류수가 페트리디쉬에 첨가되었고 25℃에서 밤새 정치되었다. 이러한 과정은 총 5회 수행되어 총 150개 밀 종자가 본 발명의 핵산 도입 처리되었다.
다음으로, 10 ml의 0.5% 폴리비닐피롤리돈(PVP) 수용액이 90 x 15 mm 페트리디쉬 내 갈변 방지제로서 첨가되었다. 핵산 도입 처리된 밀 종자는 페트리디쉬에 놓였다. PVP 수용액은 다양한 박테리아의 번식을 방지하기 위해 차아염소산나트륨을 용액 함유하였다(약 0.01%의 유효 염소 농도로 조정됨). 페트리디쉬는 10℃에서 2일간 암실에 놓였다. 2일 후 10 ml의 1200 ppm 제네티신을 함유한 수용액이 새로운 90 x 15 mm 페트리디쉬에 첨가되었고 상기-기술된 밀 종자가 본 페트리디쉬로 옮겨졌다. 제네티신 수용액은 다양한 박테리아의 번식을 방지하기 위해 차아염소산나트륨을 용액 함유하였다(약 0.02%의 유효 염소 농도로 조정됨). 다음으로, 페트리디쉬 내 종자는 배양실에서 춘화처리를 위한 조건 하에서 2주간 생장되었다(광 기간: 20℃, 8시간, 약 2000 룩스; 암 기간: 8℃, 16시간).
또한 제네티신 항생제를 이용한 상기-기술된 스크리닝 처리시 싹을 틔운 생존 밀 식물이 토양을 포함한 화분으로 이식되었고 약 3∼4개월간 생장되었다. 이러한 생장은 하기 조건 하에 상기 기술된 바와 동일한 배양실에서 수행되었다(광 기간: 20℃, 8시간, 약 2000 룩스; 및 암 기간: 8℃, 16시간). 화분에 심고 약 1개월 후에 잎이 생장된 밀 식물로부터 수집되었다. DNA는 수집된 잎으로부터 추출되었다. 추출된 DNA는 PCR을 수행하기 위해 주형으로 사용되었다. 그 결과로서 도입된 유전자의 존재가 확인되었다. 이러한 PCR 분석은 (12) PCR 분석에서 기술된 프라이머 쌍 및 증폭 조건을 이용하여 수행되었다. 결과는 도 5에 나타나 있다.
약 5,000개 밀 종자가 유사하게 처리되었다. 그 결과로서 제네티신 저항성을 지닌 205개의 개체 식물이 제네티신 저항성을 수득하였다. 이들 중 87 개체가PCR 분석시 도입된 유전자의 존재를 나타내었다. 도입된 유전자의 존재를 나타내는 이들 87 개체는 생장되었고 이후 서던 블럿팅 분석되었다. 87 개체로부터 8개 개체가 무작위로 선택되었다. DNA가 8 개체로부터 추출되었고 서던 블럿팅 분석되었다. 그 결과로서 도입된 NPTⅡ 유전자의 존재는 8 개체 모두에서 확인되었다. 결과는 도 6에 나타나 있다.
서던 블럿팅 분석시 도입된 유전자의 존재를 나타내는 이들 8 개체는 더욱 생장되었다. 그 결과로서 8 개체 모두 종자 번식력을 지니는 것으로 나타났다. 종자 번식력을 지닌 이들 밀 형질전환체의 사진이 도 7에 나타나 있다. 이들 밀 형질전환체(첫 번째 세대: T0 세대)로부터 수득된 종자(두 번째 세대: T1 세대)가 토양에 씨뿌려졌다. 종자는 어린 식물로 생장되었다. DNA는 6개 어린 식물의 잎으로부터 추출되었고 PCR 분석되었다. 그 결과로서 도입된 유전자의 존재는 6개 어린 식물에 대해 확인되었다. 이러한 PCR 분석은 (12) PCR 분석에 기술된 프라이머 쌍 및 증폭 조건을 이용하여 수행되었다. 결과는 도 8에 나타나 있다. 도 8에 나타난 바와 같이 6개 어린 식물 모두는 도입된 NPTⅡ 유전자의 존재를 나타냄이 확인되었다. 따라서 본 발명의 핵산 도입 방법은 목적 외생 유전자가 안정한 방식으로 게놈 내로 통합될 수 있게 하고 도입된 외생 유전자가 다음 세대로 전달될 수 있게 함이 증명되었다.
(실시예 2)
자포니카 쌀(품종: Koshihikari)의 숙성 종자가 재료로 사용되었다.
종자는 25℃에서 밤새 물을 흡수하게 되었다. 싹을 틔우기 시작한 30개 종자 및 pWI-GUS 또는 pWI-H5K의 플라스미드 DNA(200 ㎍/2 ml)를 포함한 2 ml의 일렉트로포레이션 완충액이 페트리디쉬에 놓였다. 감압은 대기압의 0.096 MPa 이하에서 1시간 동안 수행되었다. 이후 종자 및 완충액은 페트리디쉬로부터 챔버로 옮겨졌다. 챔버는 1분간 얼음 위에 놓였다. 이후 전기 펄스가 하기 조건 하에서 적용되었다 : 전극 사이의 거리는 1 cm, 펄스 폭은 50 μsec, 펄스 수는 99인 전압이 50 V이었다. 챔버는 얼음 위에서 2분간 더 정치되었다. 이후 종자 및 완충액은 본래의 페트리디쉬에 다시 놓였다. 페트리디쉬는 4℃에서 1시간 동안 보존된 후 25℃에서 밤새 정치되었다. 다음날 완충액이 제거되었다. 2 ml의 증류수가 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다. 그 다음날 증류수가 제거되었다. 2 ml의 X-Gluc 용액이 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다. 유전자 발현 수준은 인덱스로서 GUS 활성을 이용하여 측정되었다. 결과는 표 2에 나타나 있다.
| 전압 (V/cm) | 유전자 발현 수준 | 주목 |
| 0 | - | |
| 10 | - | |
| 20 | ± | |
| 50 | + | |
| 75 | ± | 종자는 갈변 또는 사멸 |
| 100 | - | 종자는 갈변 또는 사멸 |
| 150 | - | 종자는 갈변 또는 사멸 |
| 200 | - | 종자는 갈변 또는 사멸 |
상기-기술된 결과에 따라 형질전환은 50 V의 전압이 적용될 때 가장 높은 효율로 수행됨이 이해될 것이다(주지 : 전극 사이의 거리는 1 cm임).
유사한 결과가 도 9에 나타나 있다. 도 9는 하기 조건 하에서의 일렉트로포레이션 결과를 나타낸다 : 펄스 폭은 50 μsec, 펄스 수는 99, 압력은 대기압의 0.096 MPa 이하(감압), 적용된 전압은 50 V(A), 20 V(B), 10 V(C) 또는 0 V(D)임. 적용된 전압이 50 V일 때 형질전환 효율이 가장 높았다.
도 10은 1: 조건 (전압: 50 V, 펄스 폭: 50 μsec, 펄스 수: 99, 압력: 대기압의 0.096 MPa 이하(감압)) 하에서의 형질전환된 쌀 종자; 2: 조건 (전압: 50 V, 펄스 폭: 50 μsec, 펄스 수: 99, 감압 없음) 하에서 일렉트로포레이션만된 쌀 종자; 3: 대조군 쌀 종자의 사진을 나타낸다. 도 10에 나타난 바와 같이 형질전환은 감압 및 일렉트로포레이션이 결합될 때만 달성된다.
생장을 위한 종자는 GUS 활성 실험되지 않았고, 감압 후 종자는 200 ppm 제네티신을 함유한 증류수에서 생장되었다((7) 종자 후처리, (9) 항생제-함유 배지를 이용한 스크리닝 및 (10) 형질전환체의 생장에 나타난 바와 같이). 결과는 도 11에 나타나 있다.
상기-기술된 실험의 재현성은 실질적으로 동일한 방식으로 실험을 반복함으로서 조사되었다. 그 결과로서 실질적으로 동일한 결과가 수득되었다. 이러한 반복 실험의 특정한 절차의 상세한 설명은 하기에 기술된다. 먼저 7 cm의 직경을 지닌 여과지 조각이 90 x 15 mm의 페트리디쉬에 놓였다. 100개 쌀(현미) 종자가 여과지 상에 놓였다. 10 ml의 물이 페트리디쉬에 첨가되었고 16시간의 광 기간으로 1일간 25℃에 놓여 종자가 물을 흡수할 수 있게 하였다. 첨가된 물은 다양한 박테리아 번식을 방지하기 위해 차아염소산나트륨 용액을 함유하였다(약 0.01%의 유효 염소 농도로 조정됨). 다으날 종자는 수돗물에 잘 세척되었다. 세척 직후 본 발명의 핵산 도입 처리가 수행되었다. 20개 쌀 종자 및 pWI-H5K DNA(100 ㎍/2 ml)를 포함한 1 ml의 일렉트로포레이션 완충액이 페트리디쉬에 놓였다. 감압은 대기압의 0.096 MPa 이하로 1시간 동안 수행되었다. 이후 종자 및 완충액은 페트리디쉬에서 챔버로 옮겨졌고 얼음 위에서 1분간 정치되었다. 이후 하기 조건 하에서 일렉트로포레이션에 의해 전기 펄스가 적용되었다 : 전압은 50 V, 전극 사이의 거리는 1 cm; 펄스 폭은 50 μsec; 펄스 수는 99이었음. 챔버는 2분간 더 얼음 위에서 놓였다. 이후 종자 및 완충액은 본래의 페트리디쉬에 다시 놓였다. 페트리디쉬는 약 1시간 동안 4℃에서 보존되었고 25℃에서 밤새 정치되었다. 다음날 완충액이 제거되었고 2 ml의 증류수가 페트리디쉬에 첨가되었고 25℃에서 밤새 정치되었다. 이러한 과정은 총 5회 수행되어 총 100개 쌀 종자가 본 발명의 핵산 도입 처리되었다.
다음으로, 10 ml의 0.5% 폴리비닐피롤리돈(PVP) 수용액이 90 x 15-mm 페트리디쉬 내 갈변 방지제로서 첨가되었다. 핵산 도입 처리된 쌀 종자는 페트리디쉬에 놓였다. PVP 수용액은 다양한 박테리아의 번식을 방지하기 위해 차아염소산나트륨을 용액 함유하였다(약 0.01%의 유효 염소 농도로 조정됨). 페트리디쉬는 25℃에서 16시간이 광 기간으로 2일간 놓였다. 2일 후 10 ml의 200 ppm 제네티신을 함유한 수용액이 새로운 90 x 15-mm 페트리디쉬에 첨가되었고 상기-기술된 쌀 종자가 본 페트리디쉬로 옮겨졌다. 제네티신 수용액은 다양한 박테리아의 번식을 방지하기 위해 차아염소산나트륨을 용액 함유하였다(약 0.02%의 유효 염소 농도로 조정됨). 다음으로, 페트리디쉬 내 종자는 25℃에서 16시간의 광 기간으로 2주간 생장되었다.
또한 제네티신 항생제를 이용한 상기-기술된 스크리닝 처리시 싹을 틔운 생존 쌀 식물이 토양을 포함한 화분으로 이식되었고 약 3∼4개월간 생장되었다. 이러한 생장은 25℃에서 일반적인 배양 조건 하에 밀폐된 비닐하우스에서 수행되었다. 화분에 심고 약 1개월 후에 잎이 생장된 쌀 식물로부터 수집되었다. DNA는 수집된 잎으로부터 추출되었다. 추출된 DNA는 PCR을 수행하기 위해 주형으로 사용되었다. 그 결과로서 도입된 유전자의 존재가 확인되었다. 이러한 PCR 분석은 (12) PCR 분석에서 기술된 프라이머 쌍 및 증폭 조건을 이용하여 수행되었다. PCR 분석은 NPTⅡ 유전자의 존재를 확인하였다.
약 2,000개 쌀 종자가 유사하게 처리되었다. 그 결과로서 제네티신 저항성을 지닌 55개의 개체 식물이 제네티신 저항성을 수득하였다. 이들 중 33 개체가 PCR 분석시 도입된 유전자의 존재를 나타내었다. 도입된 유전자의 존재를 나타내는 이들 33 개체는 생장되었고 이후 서던 블럿팅 분석되었다. 33 개체로부터 6개 개체가 무작위로 선택되었다. DNA가 6 개체로부터 추출되었고 서던 블럿팅 분석되었다. 그 결과로서 도입된 NPTⅡ 유전자의 존재는 2 개체에서 확인되었다. 결과는 도 12에 나타나 있다.
서던 블럿팅 분석시 도입된 유전자의 존재를 나타내는 쌀 개체는 더욱 생장되었다. 그 결과로서 쌀 개체가 종자 번식력을 지니는 것으로 나타났다. 종자 번식력을 지닌 이들 쌀 형질전환체의 사진이 도 13에 나타나 있다. 이들 쌀 형질전환체(첫 번째 세대: T0 세대)로부터 수득된 종자(두 번째 세대: T1 세대)가 토양에 씨뿌려졌다. 종자는 어린 식물로 생장되었다. DNA는 8개 어린 식물의 잎으로부터 추출되었고 PCR 분석되었다. 그 결과로서 도입된 유전자의 존재가 측정되었다. 이러한 PCR 분석은 (12) PCR 분석에 기술된 프라이머 쌍 및 증폭 조건을 이용하여 수행되었다. 결과는 도 14에 나타나 있다. 도 14에 나타난 바와 같이8개 어린 식물 모두는 도입된 NPTⅡ 유전자의 존재를 나타냄이 확인되었다. 따라서 본 발명의 핵산 도입 방법은 목적 외생 유전자가 안정한 방식으로 게놈 내로 통합될 수 있게 하고 도입된 외생 유전자가 다음 세대로 전달될 수 있게 함이 증명되었다.
(실시예 3)
인디카 쌀(품종: IR24)의 숙성 종자가 재료로 사용되었다.
종자는 25℃에서 밤새 물을 흡수하게 되었다. 싹을 틔우기 시작한 30개 종자 및 pWI-GUS의 플라스미드 DNA(200 ㎍/2 ml)를 포함한 2 ml의 일렉트로포레이션 완충액이 페트리디쉬에 놓였다. 감압은 대기압의 0.096 MPa 이하에서 1시간 동안 수행되었다. 이후 종자 및 완충액은 페트리디쉬로부터 챔버로 옮겨졌다. 챔버는 1분간 얼음 위에 놓였다. 이후 전기 펄스가 하기 조건 하에서 적용되었다 : 전극 사이의 거리는 1 cm, 펄스 폭은 50 μsec, 펄스 수는 99인 전압이 50 V이었다. 챔버는 얼음 위에서 2분간 더 정치되었다. 이후 종자 및 완충액은 본래의 페트리디쉬에 다시 놓였다. 페트리디쉬는 4℃에서 1시간 동안 보존된 후 25℃에서 밤새 정치되었다. 다음날 완충액이 제거되었다. 2 ml의 증류수가 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다. 그 다음날 증류수가 제거되었다. 2 ml의 X-Gluc 용액이 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다. 결과는 도 15에 나타나 있다. 도 15에 나타난 바와 같이 형질전환은 감압과 일렉트로포레이션이 결합될 때만 달성되었다.
(실시예 4)
대두의 숙성 종자(품종: Oosuzu)가 재료로 사용되었다. 종자는 25℃에서 밤새 물을 흡수하게 되었다.
싹을 틔우기 시작한 10개 종자 및 pBC1 또는 pWI-GUS의 플라스미드 DNA(100 ㎍/2 ml)를 포함한 2 ml의 일렉트로포레이션 완충액이 페트리디쉬에 놓였다. 감압은 대기압의 0.096 MPa 이하에서 1시간 동안 수행되었다. 이후 종자 및 완충액은 페트리디쉬로부터 챔버로 옮겨졌다. 챔버는 1분간 얼음 위에 놓였다. 이후 전기 펄스가 하기 조건 하에서 적용되었다 : 전극 사이의 거리는 1 cm, 펄스 폭은 50 μsec, 펄스 수는 50인 전압이 100 V이었다. 챔버는 얼음 위에서 2분간 더 정치되었다. 이후 종자 및 완충액은 본래의 페트리디쉬에 다시 놓였다. 페트리디쉬는 4℃에서 1시간 동안 보존된 후 25℃에서 밤새 정치되었다. 다음날 완충액이 제거되었다. 2 ml의 증류수가 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다. 그 다음날 증류수가 제거되었다. 2 ml의 X-Gluc 용액이 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다. 형질전환이 성공적인 결과는 도 16에 나타나 있다.
(실시예 5)
옥수수의 숙성 종자(품종: Petercorn)이 재료로 사용되었다. 종자는 25℃에서 밤새 물을 흡수하게 되었다. 싹을 틔우기 시작한 3개 종자 및 플라스미드 DNA(100 ㎍/2 ml)를 포함한 2 ml의 일렉트로포레이션 완충액이 페트리디쉬에 놓였다. 감압은 대기압의 0.096 MPa 이하에서 1시간 동안 수행되었다. 이후 종자 및 완충액은 페트리디쉬로부터 챔버로 옮겨졌다. 챔버는 1분간 얼음 위에 놓였다. 이후 전기 펄스가 하기 조건 하에서 적용되었다 : 전극 사이의 거리는 1 cm, 펄스 폭은 50 μsec, 펄스 수는 50인 전압이 100 V이었다. 챔버는 얼음 위에서 2분간 더 정치되었다. 이후 종자 및 완충액은 본래의 페트리디쉬에 다시 놓였다. 페트리디쉬는 4℃에서 1시간 동안 보존된 후 25℃에서 밤새 정치되었다. 다음날 완충액이 제거되었다. 2 ml의 증류수가 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다. 그 다음날 증류수가 제거되었다. 2 ml의 X-Gluc 용액이 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다.
(실시예 6)
중국 양배추의 숙성 종자(품종: Muso)가 재료로 사용되었다. 종자는 25℃에서 밤새 물을 흡수하게 되었다. 싹을 틔우기 시작한 30개 종자 및 플라스미드 DNA(100 ㎍/2 ml)를 포함한 2 ml의 일렉트로포레이션 완충액이 페트리디쉬에 놓였다. 감압은 대기압의 0.096 MPa 이하에서 1시간 동안 수행되었다. 이후 종자 및 완충액은 페트리디쉬로부터 챔버로 옮겨졌다. 챔버는 1분간 얼음 위에 놓였다. 이후 전기 펄스가 하기 조건 하에서 적용되었다 : 전극 사이의 거리는 1 cm,펄스 폭은 50 μsec, 펄스 수는 50인 전압이 100 V이었다. 챔버는 얼음 위에서 2분간 더 정치되었다. 이후 종자 및 완충액은 본래의 페트리디쉬에 다시 놓였다. 페트리디쉬는 4℃에서 1시간 동안 보존된 후 25℃에서 밤새 정치되었다. 다음날 완충액이 제거되었다. 2 ml의 증류수가 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다. 그 다음날 증류수가 제거되었다. 2 ml의 X-Gluc 용액이 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다. 형질전환이 성공적인 결과가 도 17에 나타나 있다.
생장을 위한 종자는 GUS 활성 실험되지 않았고, 감압 후 종자는 적당한 양의 제네티신을 함유한 증류수에서 생장되었다((7) 종자 후처리, (9) 항생제-함유 배지를 이용한 스크리닝 및 (10) 형질전환체의 생장에 나타난 바와 같이). DNA는 묘목으로부터 추출되었고 도입된 유전자의 존재를 확인하기 위해 PCR되었다((11) DNA 추출 및 (12) PCR 분석에 나타난 바와 같이). PCR시 도입된 유전자의 존재를 나타내는 개체는 더욱 생장된 후 서던 블럿팅되었다. DNA는 무작위로 선택된 생장된 개체로부터 추출되었고 서던 블럿팅 분석되었다.
(실시예 7)
토마토의 숙성 종자(품종: Minicarol)가 재료로 사용되었다. 종자는 25℃에서 밤새 물을 흡수하게 되었다. 싹을 틔우기 시작한 30개 종자 및 플라스미드 DNA(100 ㎍/2 ml)를 포함한 2 ml의 일렉트로포레이션 완충액이 페트리디쉬에 놓였다. 감압은 대기압의 0.096 MPa 이하에서 1시간 동안 수행되었다. 이후 종자 및 완충액은 페트리디쉬로부터 챔버로 옮겨졌다. 챔버는 1분간 얼음 위에 놓였다. 이후 전기 펄스가 하기 조건 하에서 적용되었다 : 전극 사이의 거리는 1 cm, 펄스 폭은 50 μsec, 펄스 수는 50인 전압이 100 V이었다. 챔버는 얼음 위에서 2분간 더 정치되었다. 이후 종자 및 완충액은 본래의 페트리디쉬에 다시 놓였다. 페트리디쉬는 4℃에서 1시간 동안 보존된 후 25℃에서 밤새 정치되었다. 다음날 완충액이 제거되었다. 2 ml의 증류수가 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다. 그 다음날 증류수가 제거되었다. 2 ml의 X-Gluc 용액이 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다. 형질전환이 성공적인 결과가 도 18에 나타나 있다.
(실시예 8)
일본 캔털루프의 숙성 종자(품종: Kinsho melon)가 재료로 사용되었다. 종자는 25℃에서 밤새 물을 흡수하게 되었다. 종자는 싹을 틔우기 시작했다.
40개 종자 및 플라스미드 DNA(100 ㎍/2 ml)를 포함한 2 ml의 일렉트로포레이션 완충액이 페트리디쉬에 놓였다. 감압은 대기압의 0.096 MPa 이하에서 1시간 동안 수행되었다. 이후 종자 및 완충액은 페트리디쉬로부터 챔버로 옮겨졌다. 챔버는 1분간 얼음 위에 놓였다. 이후 전기 펄스가 하기 조건 하에서 적용되었다 : 전극 사이의 거리는 1 cm, 펄스 폭은 50 μsec, 펄스 수는 50인 전압이 100 V이었다.
챔버는 얼음 위에서 2분간 더 정치되었다. 이후 종자 및 완충액은 본래의 페트리디쉬에 다시 놓였다.
페트리디쉬는 4℃에서 1시간 동안 보존된 후 25℃에서 밤새 정치되었다. 다음날 완충액이 제거되었다. 2 ml의 증류수가 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다. 그 다음날 증류수가 제거되었다. 2 ml의 X-Gluc 용액이 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다.
(실시예 9)
나팔꽃의 숙성 종자(품종: "Sun Smile" 및 "Youzirotairin")가 재료로 사용되었다. 종자는 25℃에서 밤새 물을 흡수하게 되었다. 싹을 틔우기 시작한 10개 종자 및 플라스미드 DNA(100 ㎍/2 ml)를 포함한 2 ml의 일렉트로포레이션 완충액이 페트리디쉬에 놓였다. 감압은 대기압의 0.096 MPa 이하에서 1시간 동안 수행되었다. 이후 종자 및 완충액은 페트리디쉬로부터 챔버로 옮겨졌다. 챔버는 1분간 얼음 위에 놓였다. 이후 전기 펄스가 하기 조건 하에서 적용되었다 : 전극 사이의 거리는 1 cm, 펄스 폭은 50 μsec, 펄스 수는 50인 전압이 100 V이었다. 챔버는 얼음 위에서 2분간 더 정치되었다. 이후 종자 및 완충액은 본래의 페트리디쉬에 다시 놓였다. 페트리디쉬는 4℃에서 1시간 동안 보존된 후 25℃에서 밤새정치되었다. 다음날 완충액이 제거되었다. 2 ml의 증류수가 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다. 그 다음날 증류수가 제거되었다. 2 ml의 X-Gluc 용액이 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다. 형질전환이 성공적인 결과가 도 19에 나타나 있다.
(실시예 10)
애기장대(Arabidopsis thaliana)의 종자(품종: Col-0)가 재료로 사용되었다. 종자는 25℃에서 밤새 물을 흡수하게 되었다. 싹을 틔우기 시작한 1000개 종자 및 플라스미드 DNA(100 ㎍/2 ml)를 포함한 2 ml의 일렉트로포레이션 완충액이 페트리디쉬에 놓였다. 감압은 대기압의 0.096 MPa 이하에서 1시간 동안 수행되었다. 이후 종자 및 완충액은 페트리디쉬로부터 챔버로 옮겨졌다. 챔버는 1분간 얼음 위에 놓였다. 이후 전기 펄스가 하기 조건 하에서 적용되었다 : 전극 사이의 거리는 1 cm, 펄스 폭은 50 μsec, 펄스 수는 50인 전압이 100 V이었다. 챔버는 얼음 위에서 2분간 더 정치되었다. 이후 종자 및 완충액은 본래의 페트리디쉬에 다시 놓였다. 페트리디쉬는 4℃에서 1시간 동안 보존된 후 25℃에서 밤새 정치되었다. 다음날 완충액이 제거되었다. 2 ml의 증류수가 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다. 그 다음날 증류수가 제거되었다. 2 ml의 X-Gluc 용액이 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다.
생장을 위한 종자는 GUS 활성 실험되지 않았고, 감압 후 종자는 적당한 양의제네티신을 함유한 증류수에서 생장되었다((7) 종자 후처리, (9) 항생제-함유 배지를 이용한 스크리닝 및 (10) 형질전환체의 생장에 나타난 바와 같이). DNA는 묘목으로부터 추출되었고 도입된 유전자의 존재를 확인하기 위해 PCR되었다((11) DNA 추출 및 (12) PCR 분석에 나타난 바와 같이). PCR시 도입된 유전자의 존재를 나타내는 개체는 더욱 생장된 후 서던 블럿팅되었다. DNA는 무작위로 선택된 생장된 개체로부터 추출되었고 서던 블럿팅 분석되었다.
서던 블럿 분석시 도입된 유전자를 나타내는 애기장대 개체는 더욱 생장되어 종자 번식력을 지닌 애기장대 개체를 생성하였다. 이들 애기장대 형질전환체(첫 번째 세대: T0 세대)로부터 수득된 종자(두 번째 세대: T1 세대)가 토양에 씨뿌려졌다. 종자는 어린 식물로 생장되었다. DNA는 어린 식물의 잎으로부터 추출되었고 PCR 분석되었다. 그 결과로서 도입된 유전자의 존재가 측정되었다. 이러한 PCR 분석은 (12) PCR 분석에 기술된 프라이머 쌍 및 증폭 조건을 이용하여 수행되었다.
(실시예 11)
일본 캔털루프의 숙성 종자(품종: Kinsho melon)가 재료로 사용되었다. 종자는 25℃에서 밤새 물을 흡수하게 되었다. 싹을 틔우기 시작한 30개 종자 및 플라스미드 DNA(100 ㎍/2 ml)를 포함한 2 ml의 일렉트로포레이션 완충액이 페트리디쉬에 놓였다. 종자는 감압처리되지 않고, 대기압의 0.06 MPa 이하의 감압으로 1시간 동안 감압처리되고, 대기압의 0.096 MPa 이하의 감압으로 1시간 동안 감압처리되었다. 이후 종자 및 완충액은 페트리디쉬로부터 챔버로 옮겨졌다. 챔버는 1분간 얼음 위에 놓였다. 이후 전기 펄스가 하기 조건 하에서 적용되었다 : 전극 사이의 거리는 1 cm, 펄스 폭은 50 μsec, 펄스 수는 50인 전압이 100 V이었다. 챔버는 얼음 위에서 2분간 더 정치되었다. 이후 종자 및 완충액은 본래의 페트리디쉬에 다시 놓였다. 페트리디쉬는 4℃에서 1시간 동안 보존된 후 25℃에서 밤새 정치되었다. 다음날 완충액이 제거되었다. 2 ml의 증류수가 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다. 그 다음날 증류수가 제거되었다. 2 ml의 X-Gluc 용액이 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다. 결과는 표 3에 나타나 있다.
| 감압(MPa) | 유전자 발현 수준 |
| 0 | -1 |
| 0.06 | -1 |
| 0.96 | +2 |
-1: 핵산 도입된 종자의 어떤 것도 X-Glu 염색이 확인되지 않음.
+2: 핵산 도입된 30개 종자 중 15개 이상의 종자가 X-Glu 염색 확인됨.
표 3에서 유전자 발현 수준은 X-Glu 용액의 염색 정도에 기초하여 평가되었다. 표 3의 결과에 나타난 바와 같이 약 0.096-MPa 감압이 일본 캔털루프에 바람직하다.
다음으로, 일본 캔털루프의 형질전환에 대한 바람직한 전압이 조사되었다. 일본 캔털루프는 하기 전압 조건을 제외하고는 상기 기술된 동일한 조건 하에서 핵산 도입되었다(0.096-MPa 감압). 결과는 표 4에 나타나 있다.
| 전압(V/cm) | 유전자 발현 수준 |
| 0 | -1 |
| 10 | -1 |
| 20 | -1 |
| 50 | +2 |
| 75 | +2 |
| 100 | +3 |
| 150 | +2 |
| 200 | +2 |
-1: 핵산 도입된 종자의 어떤 것도 X-Glu 염색이 확인되지 않음.
+2: 핵산 도입된 30개 종자 중 1∼14개의 종자가 X-Glu 염색 확인됨.
+3: 핵산 도입된 30개 종자 중 15개 이상의 종자가 X-Glu 염색 확인됨.
상기-기술된 결과에 따라 약 100 V의 전압이 전극 사이 길이가 약 1 cm인 곳에 적용될 때 형질전환이 가장 효율적으로 수행될 수 있음이 증명되었다.
(실시예 12)
밀 숙성 종자(품종: Norin 61)가 감압 조건이 비교되는 실험이 수행되었다. 종자는 25℃에서 밤새 물을 흡수하도록 하였다. 싹을 틔우기 시작한 30개 종자 및 플라스미드 DNA(100 ㎍/2 ml)를 포함한 2 ml의 일렉트로포레이션 완충액이 페트리디쉬에 놓였다. 플라스미드 DNA를 포함하지 않은 2 ml의 일렉트로포레이션 완충액 내에 놓인 싹을 틔운 종자가 대조군으로 사용되었다. 종자는 감압처리되지 않고, 대기압의 0.06 MPa 이하의 감압으로 1시간 동안 감압처리되고, 대기압의 0.096 MPa 이하의 감압으로 1시간 동안 감압처리되었다(주지 : 대조군 종자는 감압되지 않음). 이후 종자 및 완충액은 페트리디쉬로부터 챔버로 옮겨졌다. 챔버는 1분간 얼음 위에 놓였다. 이후 전기 펄스가 하기 조건 하에서 적용되었다 : 전극 사이의 거리는 1 cm; 펄스 폭은 50 μsec; 펄스 수는 50인 전압이 100 V이었다. 챔버는 얼음 위에서 2분간 더 정치되었다. 이후 종자 및 완충액은 본래의 페트리디쉬에 다시 놓였다. 페트리디쉬는 4℃에서 1시간 동안 보존된 후 25℃에서 밤새 정치되었다. 다음날 완충액이 제거되었다. 2 ml의 증류수가 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다. 그 다음날 증류수가 제거되었다. 2 ml의 X-Gluc 용액이 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다. 결과는 도 20에 나타나 있다. 유전자 발현 수준은 인덱스로서 X-Gluc 용액으로의 염색 정도를 이용하여 측정되었다. 도 20에 나타난 바와 같이 밀의 경우 대기압의 0.096 MPa 이하에서의 감압이 바람직하였다. 또한 대기압의 약 0.06 MPa 이하에서의 감압의 경우 X-Gluc 염색이 밀 종자에서 확인되었다.
(실시예 13)
자포니카 쌀 숙성 종자(품종: Koshihikari)가 감압 조건이 비교되는 실험이 수행되었다. 종자는 25℃에서 밤새 물을 흡수하도록 하였다. 싹을 틔우기 시작한 30개 종자 및 플라스미드 DNA(100 ㎍/2 ml)를 포함한 2 ml의 일렉트로포레이션 완충액이 페트리디쉬에 놓였다. 플라스미드 DNA를 포함하지 않은 2 ml의 일렉트로포레이션 완충액 내에 놓인 싹을 틔운 종자가 대조군으로 사용되었다. 종자는 감압처리되지 않고, 대기압의 0.06 MPa 이하의 감압으로 1시간 동안 감압처리되고, 대기압의 0.096 MPa 이하의 감압으로 1시간 동안 감압처리되었다(주지 : 대조군 종자는 감압되지 않음). 이후 종자 및 완충액은 페트리디쉬로부터 챔버로 옮겨졌다. 챔버는 1분간 얼음 위에 놓였다. 이후 전기 펄스가 하기 조건 하에서 적용되었다 : 전극 사이의 거리는 1 cm; 펄스 폭은 50 μsec; 펄스 수는 50인 전압이 100 V이었다. 챔버는 얼음 위에서 2분간 더 정치되었다. 이후 종자 및 완충액은 본래의 페트리디쉬에 다시 놓였다. 페트리디쉬는 4℃에서 1시간 동안 보존된 후 25℃에서 밤새 정치되었다. 다음날 완충액이 제거되었다. 2 ml의 증류수가 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다. 그 다음날 증류수가 제거되었다. 2 ml의 X-Gluc 용액이 페트리디쉬에 첨가되었고 이후 25℃에서 밤새 정치되었다. 결과는 도 21에 나타나 있다. 유전자 발현 수준은 인덱스로서 X-Gluc 용액으로의 염색 정도를 이용하여 측정되었다. 도 21에 나타난 바와 같이 쌀의 경우 대기압의 0.096 MPa 이하에서의 감압이 바람직하였다. 또한 대기압의약 0.06 MPa 이하에서의 감압의 경우 X-Gluc 염색이 쌀 종자에서 확인되었다.
(실시예 14)
(누에의 형질전환)
누에의 난(절지동물문의Bombyx moriLinnaeus)이 사용되었다. 냉장고에 보관된 휴면상태 난으로부터 무작위로 선택된 50개의 누에 난 또는 산란 후 0일과10일 사이의 비-휴면상태 난으로부터 무작위로 선택된 50개 누에 난 및 플라스미드 DNA(200 ㎍/2 ml)를 포함한 2 ml의 일렉트로포레이션 완충액이 페트리디쉬에 놓였다. 플라스미드 DNA로서 pWI-GUS 플라스미드 내 GUS 유전자가 GFP(녹색 형광 단백질) 유전자로 치환된 플라스미드가 사용되었다. 대안으로, pigA3GFP 플라스미드(Tamura, Journal of Sericultural Science of Japan, 69:1-12, 2000)이 사용되었다. GFP(녹색 형광 단백질) 코딩 유전자(예를 들어 Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan사)가 사용되었다. 감압은 대기압의 0.096 MPa 이하에서 5분간 수행되었다. 이후 난 및 완충액은 페트리디쉬로부터 챔버로 옮겨졌다. 챔버는 얼음 위에 1분가 놓였다. 이후 전기 펄스가 하기 조건 하에서 적용되었다 : 전극 사이의 거리는 1 cm, 펄스 폭은 50 μsec, 펄스 수는 5인 전압이 50 V이었다. 챔버는 얼음 위에서 2분간 더 정치되었다.
이후 일렉트로포레이션된 난만 여과지를 지닌 페트리디쉬로 옮겨졌다. 난은 25℃에서 2∼3주간 생장되었다. 사료로 통상적으로 사용가능한 인공 사료(Katakura Kygyo, K.K., Okufu, Sayam-shi, Saitama, Japan)가 사용되었다. 부화된 유충은 핵산-도입된 물질로부터 방출되는 녹색 형광을 확인하기 위해 자외선 또는 청색 광으로 조사되었다.
녹색 형광을 방출하는 것으로 확인된 유충은 성체로 더욱 생장되었다. 성체는 동일한 핵산이 도입된 개체와 교미되었다. 다음 세대 개체는 그로부터 방출되는 녹색 형광의 존재에 의해 도입된 유전자의 유전을 확인하기 위해 자외선 또는 청색 광으로 조사되었다.
(실시예 15)
(E. coli의 형질전환)
E. coli(원핵 생물체)가 사용되었다.E. coli(약 106∼108세포/ml) 및 pBC1 플라스미드 DNA(10 ng/ml)를 포함한 2 ml의 일렉트로포레이션 완충액이 페트리디쉬에 놓였다. 감압은 대기압의 0.096 MPa 이하에서 1분간 수행되었다. 이후E. coli및 완충액은 페트리디쉬로부터 챔버로 옮겨졌다. 챔버는 얼음 위에 1분간 놓였다. 이후 전기 펄스가 하기 조건 하에서 적용되었다 : 전극 사이의 거리는 1 cm, 펄스 폭은 2 μsec, 펄스 수는 1인 전압이 200 V이었다. 챔버는 얼음 위에서 2분간 더 정치되었다.
이후 일렉트로포레이션된E. coli가 100 ppm 암피실린이 보충된 LB 한천 배지로 옮겨진 후 37℃에서 밤새 인큐베이트되었다(통상적으로 사용되는 실험 교재 참조, Molecular Cloning, ver. 2 for LB agar medium). 플라스미드 DNA 및 게놈 DNA는E. coli로부터 추출되었다. 암피실린 저항성 유전자의 존재는 PCR에 의해 확인된다.
(실시예 16) 일렉트로포레이션 기구 및 챔버
이후 본 발명의 일렉트로포레이션 기구 및 챔버가 도면을 참조하여 설명될 것이다. 설명의 위해 사용된 도면은 단지 설명을 위한 목적이다. 본 발명의 범위는 이들 도면에 한정적인 것은 아니다.
도 22는 본 발명의 실험에 따른 일렉트로포레이션 기구를 나타낸다. 본 기구는 대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키기 위한 섹션 및 일렉트로포레이션 섹션을 포함한다. 서로 면하고 있는 적어도 한 쌍 이상의 전극(104, 105)이 컨테이터(106) 내에 제공된다. 한 쌍(2개)의 전극(104, 105)이 도 22에 묘사되었으나 한 쌍 이상의 전극이 컨테이너(106)에 제공됨을 주지해야 한다. 선택적으로 컨테이너(106)는 온도 조절 섹션(128)이 제공된다. 핵산 도입되는 세포(109) 및 도입되는 핵산 분자(110)는 선택적으로 완충액(111)을 따라 컨테이너(106)에 놓인다. 하나의 실시태양에서 컨테이너(106)는 다른 컨테이너(108) 내부에 놓인다. 컨테이너(108) 내에서 대기압과 다른 압력을 유지하는 것이 가능하다. 컨테이너(108)의 내부 압력은 대기압과 다른 압력을 유지시키기 위한 섹션(126)을 이용하여 공기 구멍(107)을 통해 컨테이너(108)로 공기를 주입시키거나(가압) 그로부터 공기를 비움으로서(감압) 변화된다. 컨테이너가 밀봉되는 것이 가능한 리드(lid) 및 대기압과 다른 압력을 유지시키기 위한 색션의 공기 구멍을 더욱 포함하는 경우 컨테이너(106) 및 컨테이너(108)는 동일한 것이 된다(즉, 컨테이너(106)는 컨테이너(108)의 대용물이다). 기구는 높은 전압 펄스를 생성시키기 위한 섹션(101)을 더욱 포함한다. 높은 전압 펄스 생성 섹션(101)은 2개의 코드(102, 103)를 통해 한 쌍의 전극(104, 105)에 각각 연결된다. 높은 전압 펄스 생성 섹션(101)이 높은 전압 펄스를 생성시키기 위해 켜지면 이에 연결된 전극(104) 및 전극(105)은 각각 양극 및 음극 또는 음극 및 양극으로 기능한다. 바람직하게는 높은 전압 펄스 생성 섹션(101)은 항상 필요한 것은 아니나 전류의 방향을 전환시키기 위한 극성 스위칭 섹션(127)을 포함한다. 극성 스위칭 섹션(127)을 켜거나/끔으로서 두 방향으로 세포 및 핵산에 높은 전압 펄스를 적용시키는 것이 가능하다.
도 23은 본 발명의 또다른 실시태양에 따른 일렉트로포레이션 기구를 나타낸다. 본 기구는 대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키기 위한 섹션 및 일렉트로포레이션 섹션을 포함하고, 이는 단독 컨테이너(212) 내에 별도로 설치된다. 본 기구에서 대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키기 위한 섹션은 컨테이너(206-a)를 포함한다. 핵산 도입되는 세포(209)는 컨테이너(206-a) 내에 놓인다. 도입되는 핵산 및/또는 완충액은 선택적으로 세포(209)에 더하여 컨테이너(206-a)에 놓인다. 하나의 실시태양에서 컨테이너(206-a)는 또다른 컨테이너(208) 내에 놓인다. 컨테이너(208)의 내부는 대기압과 다른 압력에서 유지될 수 있다. 컨테이너(208)의 내부 압력은 대기압과 다른 압력을 유지시키기 위한 섹션(226)을 이용하여 공기 구멍(207)을 통해 컨테이너(208)로 공기를 주입시키거나(가압) 그로부터 공기를 비움으로서(감압) 변화된다. 컨테이너(206-a)가 밀봉되는 것이 가능한 리드(lid) 및 대기압과 다른 압력을 유지시키기 위한 색션의 공기 구멍을 더욱 포함하는 경우 컨테이너(206-a) 및 컨테이너(208)는 동일한 것이 된다(즉, 컨테이너(206-a)는 컨테이너(208)의 대용물이다).
상기-기술된 섹션에 의해 감압 및/또는 가압된 세포는 일렉트로포레이션 섹션에 의해 처리된다. 일렉트로포레이션 섹션은 컨테이너(206-b)를 포함한다. 컨테이너(206-b)는 컨테이너(206-a)와 동일하거나 다르다. 즉, 감압 및/또는 가압에 사용되는 컨테이너(206-a)는 컨테이너(206-b)로 사용된다. 선택적으로 컨테이너(206-a, 206-b)는 온도 조절 섹션(228-a/228-b)이 제공된다. 서로 면하고 있는 적어도 한 쌍 이상의 전극(204, 205)이 컨테이너(206-b) 내부에 제공된다. 한 쌍(2개)의 전극(204, 205)이 도 23에 묘사되었으나 한 쌍 이상의 전극이 컨테이너(206-b) 내부에 제공됨을 주지해야 한다. 핵산 도입되는 세포(209) 및 도입되는 핵산 분자(210)는 선택적으로 완충액(211)을 따라 컨테이너(206-b)에 놓인다. 기구는 높은 전압 펄스를 생성시키기 위한 섹션(201)을 더욱 포함한다. 높은 전압 펄스 생성 섹션(201)은 2개의 코드(202, 203)를 통해 한 쌍의 전극(204, 205)에 각각 연결된다. 높은 전압 펄스 생성 섹션(201)이 높은 전압 펄스를 생성시키기 위해 켜지면 이에 연결된 전극(204) 및 전극(205)은 각각 양극 및 음극 또는 음극 및 양극으로 기능한다. 바람직하게는 높은 전압 펄스 생성 섹션(201)은 항상 필요한 것은 아니나 전류의 방향을 전환시키기 위한 극성 스위칭 섹션(227)을 포함한다. 극성 스위칭 섹션(227)을 켜거나/끔으로서 두 방향으로 세포(209) 및 핵산(210)에 높은 전압 펄스를 적용시키는 것이 가능하다.
도 24는 본 발명의 또다른 실시태양에 따른 일렉트로포레이션 기구를 나타낸다. 본 기구는 핵산을 세포 내로 도입시키기 위한 일렉트로포레이션 섹션만을 포함한다. 본 기구는 대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키기는 것과 결합하여 사용된다. 본 기구는 컨테이너(306)를 포함한다. 적어도 한 쌍 이상의 전극(304, 305)이 컨테이너(306) 내에 제공된다. 한 쌍(2개)의 전극(304, 305)이 도 24에 묘사되었으나 한 쌍 이상의 전극이 컨테이너(306) 내부에 제공됨을 주지해야 한다. 핵산 도입되는 세포(309) 및 도입되는 핵산 분자(310)는 선택적으로 완충액(311)을 따라 컨테이너(306)에 놓인다. 기구는 높은 전압 펄스를 생성시키기 위한 섹션(301)을 더욱 포함한다. 높은 전압 펄스 생성 섹션(301)은 2개의 코드(302, 303)를 통해 한 쌍의 전극(304, 305)에 각각 연결된다. 높은 전압 펄스 생성 섹션(301)이 높은 전압 펄스를 생성시키기 위해 켜지면 이에 연결된 전극(304) 및 전극(305)은 각각 양극 및 음극 또는 음극 및 양극으로 기능한다. 바람직하게는 높은 전압 펄스 생성 섹션(301)은 항상 필요한 것은 아니나 전류의 방향을 전환시키기 위한 극성 스위칭 섹션(327)을 포함한다. 극성 스위칭 섹션(327)을 켜거나/끔으로서 두 방향으로 세포(309) 및 핵산(310)에 높은 전압 펄스를 적용시키는 것이 가능하다. 본 기구에서 전극(304)과 전극(305) 사이의 거리(α)는 식물 종자를 수용하기에 충분하다. 본 거리는 상기 기술된 바와 같이 정의된다.
도 25는 본 발명의 하나의 실시태양에 따른 사각형 평행육면체 일렉트로포레이션 챔버를 나타낸 것이다. 본 챔버는 대기압과 다른 압력에 저항할 수 있는 물질로 이루어진다(즉, 폴리프로필렌). 서로 면하고 있는 적어도 한 쌍의 전극(413, 414)이 일렉트로포레이션 챔버 내부에 제공되어 전극이 챔버 내벽에 가까이 부착된다. 한 쌍(2개)의 전극(413, 414)이 도 25에서 묘사되었으나 한 쌍 이상의 전극이 컨테이너(406) 내에 제공된다. 전극(413, 414)은 바람직하게는 서로 면하는 2개의 내벽을 따라 배열된 플레이트의 형태이다. 전극(413, 414)과 동일하거나 다른 물질로 이루어진 라인(404) 및 라인(405)이 선택적으로 전극(413)과 전극(414)으로부터 확장된다. 라인(404) 및 라인(405)은 각각 높은 전압 생성 섹션(401)에 연결된 코드(402) 및 코드(403)에 연결된다. 라인(404) 및 라인(405)가 제공되지 않기도 한다. 그렇지 않은 경우 높은 전압 펄스 생성 섹션(401)에 연결된 코드(402) 및 코드(403)가 직접 전극(413) 및 전극(414)에 연결된다. 높은 전압 펄스 생성 섹션(401)이 높은 전압 펄스로 켜지면 연결된 전극(413) 및 전극(414)은 각각 양극 및 음극 또는 음극 및 양극의 기능을 한다. 챔버는 식물 종자를 수용하기 충분한 크기를 지닌다. 챔버의 크기는 내부 용적 즉, 길이(a) x 그의 수평횡단면의 폭(b) x 높이(c)에 의해 표현된다. 식물 종자가 수용되게 하는 크기는 상기 기술된 바와 같이 정의된다. 바람직하게는 식물 종자를 수용하는 것이 가능한 챔버의 크기는 길이 1 cm x 폭 2 cm x 높이 2 cm이다. 핵산 도입되는 세포 및 도입되는 핵산 분자는 컨테이너(406) 내에 완충액을 따라 선택적으로 놓인다. 선택적으로는 컨테이너(406)는 온도 조절 섹션(428)이 제공된다.
도 26은 본 발명의 하나의 실시태양에 따른 마이크로튜브 형태의 일렉트로포레이션 챔버를 나타낸다. 본 챔버(506-a)는 대기압과 다른 압력에 저항할 수 있는 물질로 이루어진다(즉, 폴리프로필렌). 서로 면하고 있는 적어도 한 쌍의 전극(504, 505)이 일렉트로포레이션 챔버 내부에 제공되어 전극이 챔버 내벽에 가까이 부착된다. 한 쌍(2개)의 전극(504, 505)이 도 26에서 묘사되었으나 한 쌍 이상의 전극이 컨테이너(506-a) 내에 제공된다. 전극(504, 505)은 바람직하게는 접착제로 마이크로튜브의 내벽에 스테인레스 포일(foil)(dir 5 x 40 mm(두께: 약 0.1 mm)을 부착시킴으로서 제작된다. 특정한 실시태양에서 각 전극(504, 505)의 말단은 마이크로튜브(506-a)로부터 돌츨된다. 전극(504) 및 전극(505)의 말단은 각각 높은 전압 생성 섹션(501)에 연결된 코드(502) 및 코드(503)에 연결된다. 높은 전압 펄스 생성 섹션(501)이 높은 전압 펄스로 켜지면 연결된 전극(504) 및 전극(505)은 각각 양극 및 음극 또는 음극 및 양극의 기능을 한다. 챔버는 식물 종자를 수용하기 충분한 크기를 지닌다. 챔버의 크기는 내부 용적 즉, 그의 수평횡단면의 직경(e) x 높이(c)에 의해 표현된다. 식물 종자가 수용되게 하는 크기는 상기 기술된 바와 같이 정의된다. 바람직하게는 식물 종자를 수용하는 것이 가능한 챔버의 크기는 직경 1 cm x 높이 4 cm이다. 핵산 도입되는 세포 및 도입되는 핵산 분자는 컨테이너(506-a) 내에 완충액을 따라 선택적으로 놓인다. 마이크로튜브는 선택적으로 마이크로튜브를 밀봉하여 폐쇄시키기 위한 리드(lid)를 포함한다. 선택적으로는 컨테이너(506-a)는 온도 조절 섹션(528)이 제공된다.
상기-기술된 실시예에서 마이크로튜브(506-a)는 도 26에 나타난 바와 같이 균일한 수평 섹션을 지니고 바닥까지 점점 가늘어진다. 본 발명의 마이크로튜브 형태의 일렉트로포레이션 챔버는 어떠한 형태도 된다. 예를 들어 마이크로튜브 챔버는 비-균일 수평 횡단 섹션을 지닌 몸체 및 바닥을 향해 점점 가늘어지는 형태(506-b)를 지닌다. 또다른 실시태양에서 챔버는 상단에서 바닥까지 균일한 수평 횡단 섹션을 지닌 몸체(506-c)를 지닌다. 또다른 실시태양에서 506-d에 나타난 바와 같이 비-균일 수평 횡단 섹션을 지닌 몸체를 지닌다.
본 발명의 챔버는 식물 종자를 수용할 수 있게 하는 한 어떠한 형태도 된다. 챔버가 식물 종자를 수용할 수 있게 하는 크기를 지니는지 여부는 챔버의 내벽에 접하는 내접원의 직경을 측정함으로서 확인된다. 내접원은 챔버의 내벽 상의 적어도 3개 이상의 무작위 포인트에 접한다. 예를 들어 도 27에 나타난 바와 같이 챔버가 삼각형 프리즘(606)의 형태인 경우 도 27에 나타난 바와 같이 3개 포인트에 접하는 가장 큰 내접원(616)의 직경(f)은 챔버가 식물 종자를 수용할 수 있게 하는크기이다. 예를 들어 도 27에 나타난 바와 같이 적어도 한 쌍 이상의 전극(604-a, 605-a)이 삼각형 프리즘 챔버에 제공된다. 한 쌍(2개)의 전극(604-a, 605-a)이 도 27의 삼각형 프리즘에서 묘사되었으나 한 쌍 이상의 전극이 컨테이너(606) 내에 제공됨을 주지해야 한다. 유사하게는 도 27에 나타난 바와 같이 챔버가 오각형 프리즘(607)인 경우 도 27에 나타난 바와 같이 5개 포인트에 접하는 가장 큰 내접원(617)의 직경(g)은 챔버가 식물 종자를 수용할 수 있게 하는 크기이다. 예를 들어 도 27에 나타난 바와 같이 적어도 한 쌍 이상의 전극(604-b, 605-b)이 오각형 프리즘 챔버에 제공된다. 한 쌍(2개)의 전극(604-b, 605-b)이 도 27의 오각형 프리즘에서 묘사되었으나 한 쌍 이상의 전극이 컨테이너(607) 내에 제공됨을 주지해야 한다. 다른 형태를 지닌 챔버의 경우 가장 큰 내접원의 크기(직경)는 챔버가 식물 종자를 수용할 수 있게 하는 크기이다.
도 28은 본 발명에 따른 자동 일렉트로포레이션 기구를 나타내는 개략도이다. 기구는 :
a) 핵산 분자 및 세포를 함유한 혼합물을 놓기 위한 컨테이너(706-a);
b) a)의 컨테이너 내에 핵산 분자를 놓기 위한 섹션(724);
c) a)의 컨테이너 내에 세포를 놓기 위한 섹션(725);
d) 대기압과 다른 압력에 저항할 수 있는, 대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키기 위한 컨테이너(708);
e) d)의 컨테이너 내에 세포를 놓기 위한 섹션(718-a);
f) 대기압과 다른 압력 하에서 d)의 컨테이너를 유지시키기 위한 섹션(726);
g) 핵산 분자 및 세포를 함유한 혼합물에 높은 전압 펄스를 적용하기 위한 컨테이너(720);
h) g)의 컨테이너 내에 핵산 분자 및 세포를 함유한 혼합물을 놓기 위한 섹션(718-b);
i) g)의 컨테이너 내에 핵산 분자 및 세포를 함유한 혼합물에 높은 전압 펄스를 적용하기 위한 섹션(701); 및
j) 섹션 b), c), e), f), h) 및 i)를 자동으로 작동시키기 위한 섹션(719)
을 포함한다.
먼저, 컨테이너(706-a)가 제조된다. 세포는 섹션(725)으로부터 컨테이너(706-a)로 주입된다. 선택적으로는 핵산 분자는 섹션(724)으로부터 동일한 컨테이너(706-a)로 세포의 주입 전에, 실질적으로 동시에 또는 그 후에 주입된다. 세포(및, 선택적으로는 핵산 분자) 또는 주입된 세포를 포함한 컨테이너(706-a)가 섹션(718-a)의 작용에 의해 컨테이너(708) 내에 놓인다. 컨테이너(708)는 대기압과 다른 압력에 저항할 수 있는 물질로 이루어진다(즉, 폴리프로필렌). 주입된 세포(및, 선택적으로는 핵산 분자)를 지닌 컨테이너(706-b)는 컨테이너(708) 내에 설치된다. 일부의 경우 컨테이너(708) 및 컨테이너(706-b)는 동일한 것이 된다. 세포가 컨테이너(708) 내에 놓인 후 섹션(726)이 활성화된다. 섹션(726)으로 컨테이너(708)의 내부가 대기압과 다른 압력에서 유지된다. 따라서 컨테이너(708) 내에 놓인 세포(및, 선택적으로는 핵산 분자)가 감압 및/또는 가압된다. 감압 및/또는 가압된 세포는 배치 섹션(718-b)에 의해 컨테이너(708)로부터 컨테이너(720)(컨테이너(720) 내에 놓인 세포를 포함한 컨테이너는 706-c로 나타냄(여기서 컨테이너(720) 및 컨테이너(706-c)는 동일한 컨테이너가 됨))로 옮겨진다. 핵산 분자가 컨테이너(706-b/706-c) 내에 포함되지 않으면 핵산 분자는 섹션(724)으로부터 컨테이너(706-b/706-c)로 배치 섹션(718-b)의 작용 전 또는 후에 주입된다. 선택적으로는 완충액은 컨테이너(706-b/706-c) 내로 핵산 분자와 동시에 또는 연속적으로 주입된다. 세포 및 핵산 분자를 함유한 혼합물이 컨테이너(720) 내에 놓이면 섹션(701)이 작용된다. 섹션(701)으로 컨테이너(720) 내에 세포 및 핵산 분자를 함유한 혼합물에 높은 전압 펄스가 적용된다. 그 결과로서 일렉트로포레이션이 세포와 핵산 분자 사이에서 발생한다. 본 발명의 일렉트로포레이션 기구는 상기-기술된 섹션을 자동으로 제어하기 위한 제어 섹션(719)을 포함한다(724, 725, 718-a, 726, 718-b 및 701). 조절 섹션(719)은 도 28에 나타난 바와 같이 코드(721-a, 721-b, 721-c, 721-d, 721-d, 721-e 및 721-f)를 통해 섹션(724, 725, 718-a, 726, 718-b 및 701)에 연결된다. 조절 신호는 이들 코드를 통해 전달된다. 본 발명의 자동 일렉트로포레이션 기구에서 섹션(724) 및 섹션(725)은 서로 동일하거나 다르다. 섹션(718-a) 및 섹션(718-b)은 서로 동일하거나 다르다. 컨테이너(706-a), 컨테이너(706-b) 및 컨테이너(706-c)는 서로 동일하거나 다르다. 또한 본 발명의 일렉트로포레이션 기구에서 컨테이너(708) 내의 감압 및/또는 가압 및 컨테이너(720) 내의 일렉트로포레이션은 어떠한 순서로도 수행된다. 바람직하게는 컨테이너(720) 내의 일렉트로포레이션은 컨테이너(708) 내 감압 및/또는 가압 후 수행된다.
도 29는 본 발명의 자동 일렉트로포레이션 기구의 더욱 특정한 실시태양을 나타낸다. 도 29의 실시태양에서 세포는 섹션(825)으로부터 컨테이너(806-a)에 먼저 놓이다. 선택적으로는 세포 주입 시간에서 핵산 분자는 섹션(824)으로부터 컨테이너(806-a)에 놓인다. 선택적으로는 컨테이너(806-a)는 전극(804-a, 804-b)을 포함한다. 주입된 세포(및, 선택적으로는 핵산 분자)를 포함한 컨테이너(806-a)는 벨트 컨베이어와 같은 섹션(818-a)에 의해 컨테이너(808)의 입구(8220a)를 통해 컨테이너(808) 내로 옮겨진다. 컨테이너(808) 내에 놓인, 주입된 세포(및, 선택적으로는 핵산 분자)를 포함한 컨테이너는 806-b로 표시된다(및, 컨테이너(806-b)에 제공된 전극은 804-b, 805-b로 표시됨). 세포가 컨테이너(808) 내에 놓이면 컨테이너(808)의 입구(822-a) 및 출구(822-b)가 폐쇄되어 컨테이너(808)가 밀봉하여 폐쇄된다. 밀봉하여 폐쇄된 컨테이너(808)에서 섹션(826)이 작용하여 컨테이너(808)의 내부가 대기압과 다른 압력에서 유지된다. 대기압과 다른 압력은 섹션(826)의 작용에 의해 공기 구멍(807)을 통해 컨테이너(808) 내로 공기를 주입시키거나(가압) 그로부터 공기를 비움으로서(감압) 생성된다. 상기 기술된 바와 같이 감압 및/또는 가압된, 세포(및, 선택적으로는 핵산 분자)를 포함한 컨테이너(806-b)가 벨트 컨베이어와 같은 섹션(818-b)에 의해 컨테이너(808)의 출구(822-b)를 통해 컨테이너(820) 내로 옮겨졌다. 이때 컨테이너(806-b/806-c)가 핵산 분자를 포함하지 않으면 핵산 분자는 이러한 도입 단계 동안 컨테이너(806-b/806-c) 내로 주입된다. 컨테이너(820) 내에 놓인, 주입된 세포 및 핵산 분자를 포함한 컨테이너는 806-c로 표시된다(및 컨테이너(806-c) 내에 제공된 전극은 804-c, 805-c로 표시됨). 세포 및 핵산 분자가 컨테이너(820) 내에 놓인 후 바람직하게는 컨테이너(820)의 입구(823-a) 및 출구(823-b)가 폐쇄된다. 컨테이너(820)는 높은 전압 펄스를 생성하기 위한 섹션(801)을 포함한다. 높은 전압 펄스 생성 섹션(801)은 2개의 코드(802, 803)를 통해 전극(804-c) 및 전극(805-c)에 각각 연결된다. 높은 전압 펄스 생성 섹션(801)이 높은 전압 펄스를 생성시키기 위해 켜지면 이에 연결된 전극(804-c) 및 전극(805-c)은 각각 양극 및 음극 또는 음극 및 양극으로 기능한다. 바람직하게는 높은 전압 펄스 생성 섹션(801)은 항상 필요한 것은 아니나 전류의 방향을 전환시키기 위한 극성 스위칭 섹션(827)을 포함한다. 극성 스위칭 섹션(827)을 켜거나/끔으로서 두 방향으로 세포(809) 및 핵산 분자(810)에 높은 전압 펄스를 적용시키는 것이 가능하다. 또한 본 발명의 자동 일렉트로포레이션 기구는 상기-기술된 섹션을 자동으로 제어하기 위한 제어 섹션(819)을 포함한다(824, 825, 818-a, 826, 818-b 및 801). 조절 섹션(819)은 도 29에 나타난 바와 같이 코드(821-a, 821-b, 821-c, 821-d, 821-d, 821-e, 821-f)를 통해 섹션(824, 825, 818-a, 826, 818-b, 801)에 연결된다. 조절 신호는 이들 코드를 통해 전달된다. 도 29에서 섹션(824, 825)이 동일한 것이 될 수 있으나(즉, 컨테이너(806-a) 내로 세포 및 핵산 분자를 놓기 위한 단독 섹션) 컨테이너(806-a) 내로 핵산 분자를 놓기 위한 섹션(824) 및 컨테이너(806-a)에 세포를 놓기 위한 섹션(825)이 별도의 섹션으로 묘사되었음을 주지해야 한다. 한 쌍(2개)의 전극(804-a, 805-a; 804-b, 805-b; 804-c, 805-c)이 도 29에 묘사되었으나 한 쌍 이상의 전극이 컨테이너(818-a, 818-b))에 제공됨을 주지해야 한다. 또한 도 29에서 배치 섹션(818-a, 818-b)이 별도의 섹션일 수 있으나 배치 섹션(818-a, 818-b)은 단독 벨트 컨베이어로 묘사된다. 또한 압력을 변화시키기 위한 컨테이너(808) 및/또는 일렉트로포레이션을 수행하기 위한 컨테이너(820)는 핵산 분자 및/또는 세포를 포함한 컨테이너의 이동과 동시에 또는 그 대신 벨트 컨베이어 상으로 이동된다. 대안으로, 배치 섹션은 벨트 컨베이어가 없는 자동 펌프를 이용한 흡입/배수에 의해 컨테이너(806-a), 컨테이너(806-b) 및 컨테이너(806-c)에 놓인 물질/현탁액을 도입시킨다. 컨테이너(806-a), 컨테이너(806-b) 및 컨테이너(806-c)는 서로 동일하거나 다르다. 이들이 다른 컨테이너인 경우 내용물(즉, 세포 및/또는 핵산 분자)은 컨테이너(806-a)에서 컨테이너(806-b)로 및/또는 컨테이너(806-b)에서 컨테이너(806-c)로와 같이 각 컨테이너 사이로 도입된다. 도입은 예를 들어 단순하게 컨테이너를 기울이거나; 자동 디스펜서/자동 피펫/자동 펌프 등을 이용하여 흡입/배수함으로서 수행된다. 선택적으로는 컨테이너(806-a, 806-b, 806-c)는 온도 조절 섹션(828-a, 828-b, 828-c)이 제공된다.
상기 기술된 바와 같이 본 발명은 바람직한 실시태양으로 기술되었다. 본 발명의 범위는 청구항에 의해서만 한정됨이 이해되어야 한다. 본 명세서 내에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 공부는 여기에 상세히 기술된 바와 동일한 정도로참고문헌에 통합된다.
간단하고 빠른 핵산 도입 방법이 제공된다.
본 발명의 간단하고 빠른 핵산 도입 방법은 당분야의 연구 및 개발에 사용될 수 있어서 대규모 처리 및 대규모 분석에 용이하게 한다. 더욱이 본 발명은 혁신적인 재조합체의 개발을 잠재적으로 이끄는 연구의 극적인 진보를 야기시킨다.
<110> National Institute of Agrobiological Sciences
<120> Electroporation method including the use of
depressurization/pressurization
<150> JP 2002-207611
<151> 2002-07-16
<160> 5
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
ctgcgtgcaa tccatcttg 19
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
actcgtcaag aaggcgatag aag 23
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
catgattgaa caagatggat tgcacgcagg ttctc 35
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
cagaagaact cgtcaagaag gcgatagaag gcgat 35
<210> 5
<211> 882
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 5
tctagaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct 60
tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc 120
gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc 180
ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcccggctat cgtggctggc cacgacgggc 240
gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg 300
ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc 360
atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac 420
caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat 480
caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc 540
aaggcgcgca tgcccgacgg cgacgatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg 600
aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg 660
gcggaccgct atcatgacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc 720
gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc 780
gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg 840
accaagcgac gatgaattcg gcggccgcgg ggatcctcta ga 882
Claims (70)
- a) 대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키고;b) 일렉트로포레이션을 유도하는 것이 가능한 조건 하에 세포 및 핵산 분자를 놓는 단계로 구성된세포 내로 핵산 분자를 도입시키는 방법
- 제 1항에 있어서, 상기 대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키는 단계는 세포를 감압시키는 단계임을 특징으로 하는 방법
- 제 1항에 있어서, 상기 대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키는 단계는 세포를 가압시키는 단계임을 특징으로 하는 방법
- 제 1항에 있어서, 상기 대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키는 단계는 일렉트로포레이션을 유도하는 것이 가능한 조건 하에 세포 및 핵산을 놓는 단계 전에 수행됨을 특징으로 하는 방법
- 제 2항에 있어서, 상기 감압 단계는 대기압으로부터 약 0.096 MPa까지 감소된 압력 하에서 수행됨을 특징으로 하는 방법
- 제 1항에 있어서, 상기 단계 b)는 적어도 2 이상의 방향에서 세포 및 핵산에 높은 전압 펄스를 적용하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법
- 제 1항에 있어서, 상기 세포는 식물 세포임을 특징으로 하는 방법
- 제 7항에 있어서, 상기 식물 세포는 휴면상태의 식물 조직의 세포임을 특징으로 하는 방법
- 제 8항에 있어서, 상기 휴면상태의 식물 조직은 종자임을 특징으로 하는 방법
- 제 7항에 있어서, 상기 식물은 단자엽 식물임을 특징으로 하는 방법
- 제 10항에 있어서, 상기 단자엽 식물은 벼과(Gramineae) 식물임을 특징으로 하는 방법
- 제 11항에 있어서, 상기 벼과 식물은 밀(Triticum aestivumL.)임을 특징으로 하는 방법
- 제 11항에 있어서, 상기 벼과 식물은 쌀(Oryza sativaL.)임을 특징으로 하는 방법
- 제 11항에 있어서, 상기 벼과 식물은 옥수수(Zea maysL.)임을 특징으로 하는 방법
- 제 7항에 있어서, 상기 식물은 쌍자엽 식물임을 특징으로 하는 방법
- 제 15항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 겨자과(Cruciferae) 식물임을 특징으로 하는 방법
- 제 16항에 있어서, 상기 겨자과 식물은 중국 양배추(Brassica rapaL.)임을 특징으로 하는 방법
- 제 16항에 있어서, 상기 겨자과 식물은 유채(Brassica napusL.)임을 특징으로 하는 방법
- 제 15항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 콩과(Leguminosae) 식물임을 특징으로 하는 방법
- 제 19항에 있어서, 상기 콩과 식물은 대두(Glycine maxMerr)임을 특징으로 하는 방법
- 제 15항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 가지과(Solanaceae) 식물임을 특징으로 하는 방법
- 제 21항에 있어서, 상기 가지과 식물은 토마토(Lycopersicum esculentumMill)임을 특징으로 하는 방법
- 제 15항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 박과(Cucurbitaceae) 식물임을 특징으로 하는 방법
- 제 23항에 있어서, 상기 박과 식물은 일본 캔털루프(cantaloupe)(Cucumis meloL.)임을 특징으로 하는 방법
- 제 15항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 메꽃과(Convolvulaceae) 식물임을 특징으로 하는 방법
- 제 25항에 있어서, 상기 메꽃과 식물은 나팔꽃(Pharbitis nilChoisy)임을 특징으로 하는 방법
- a) 대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키고;b) 일렉트로포레이션을 유도하는 것이 가능한 조건 하에 세포 및 핵산 분자를 놓는 단계로 구성된핵산 분자가 식물의 세포 내로 도입됨을 특징으로 하는 식물의 생성 방법
- 제 27항에 있어서, 세포를 분화시키고, 생장시키고 및/또는 번식시키는 단계를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법
- 제 27항 또는 제 28항에 있어서, 상기 단계 a)는 대기압과 다른 압력 하에 세포를 포함한 종자를 유지시키는 단계를 포함함을 특징으로 하고, 단계 b)는 일렉트로포레이션을 유도하는 것이 가능한 조건 하에 세포 및 핵산을 함유한 종자를 놓는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법
- 제 29항에 있어서, 상기 종자는 단자엽 식물 종자임을 특징으로 하는 방법
- 제 30항에 있어서, 상기 단자엽 식물 종자는 벼과(Gramineae) 종자임을 특징으로 하는 방법
- 제 31항에 있어서, 상기 벼과 종자는 밀(Triticum aestivumL.) 종자임을 특징으로 하는 방법
- 제 31항에 있어서, 상기 벼과 종자는 쌀(Oryza sativaL.) 종자임을 특징으로 하는 방법
- 제 31항에 있어서, 상기 벼과 종자는 옥수수(Zea maysL.) 종자임을 특징으로 하는 방법
- 제 29항에 있어서, 상기 종자는 쌍자엽 식물 종자임을 특징으로 하는 방법
- 제 35항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물 종자는 겨자과(Cruciferae) 종자임을 특징으로 하는 방법
- 제 36항에 있어서, 상기 겨자과 종자는 중국 양배추(Brassica rapaL.) 종자임을 특징으로 하는 방법
- 제 36항에 있어서, 상기 겨자과 종자는 유채(Brassica napusL.) 종자임을 특징으로 하는 방법
- 제 35항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물 종자는 콩과(Leguminosae) 종자임을 특징으로 하는 방법
- 제 39항에 있어서, 상기 콩과 종자는 대두(Glycine maxMerr) 종자임을 특징으로 하는 방법
- 제 35항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물 종자는 가지과(Solanaceae) 종자임을 특징으로 하는 방법
- 제 41항에 있어서, 상기 가지과 종자는 토마토(Lycopersicum esculentumMill) 종자임을 특징으로 하는 방법
- 제 35항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물 종자는 박과(Cucurbitaceae) 종자임을 특징으로 하는 방법
- 제 43항에 있어서, 상기 박과 종자는 일본 캔털루프(cantaloupe)(Cucumis meloL.) 종자임을 특징으로 하는 방법
- 제 35항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물 종자는 메꽃과(Convolvulaceae) 종자임을 특징으로 하는 방법
- 제 45항에 있어서, 상기 메꽃과 종자는 나팔꽃(Pharbitis nilChoisy) 종자임을 특징으로 하는 방법
- 제 27항 내지 제 46항의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된 식물
- 제 47항에 있어서, 소마클로날(somaclonal) 변이를 포함하지 않음을 특징으로 하는 식물
- a) 대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키기 위한 섹션; 및b) 일렉트로포레이션을 위한 섹션을 포함한세포 내로 핵산을 도입시키는 기구
- 제 49항에 있어서, 상기 대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키기 위한 섹션은 대기압 보다 낮은 압력을 유지할 수 있는 능력을 지님을 특징으로 하는 기구
- 제 49항에 있어서, 상기 세포는 식물 세포임을 특징으로 하는 기구
- 상기 b)의 일렉트로포레이션 섹션은 :양극으로 기능하는 첫 번째 전극; 및음극으로 기능하는 두 번째 전극을 포함하고,상기 첫 번째 전극과 두 번째 전극 사이의 거리는 식물 종자를 수용하기에 충분히 긴 것임을 특징으로 하는 기구
- 제 52항에 있어서, 상기 첫 번째 전극과 두 번째 전극 사이의 거리는 적어도 약 5 mm 이상임을 특징으로 하는 기구
- 제 52항에 있어서, 상기 첫 번째 전극과 두 번째 전극 사이의 거리는 약 1cm 이상임을 특징으로 하는 기구
- 제 52항에 있어서, 상기 첫 번째 전극 및 두 번째 전극은 백금 전극임을 특징으로 하는 기구
- 제 49항에 있어서, 상기 b)의 일렉트로포레이션 섹션은 양극으로 기능하는 첫 번째 전극; 및 음극으로 기능하는 두 번째 전극을 포함하고,상기 첫 번째 전극과 두 번째 전극 사이의 거리가 변화 가능하여 식물 종자가 첫 번째와 두 번째 전극 사이에 수용될 수 있음을 특징으로 하는 기구
- 제 56항에 있어서, 상기 첫 번째 전극 및 두 번째 전극은 백금 전극임을 특징으로 하는 기구
- 대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키는 것과 결합하여양극으로 기능하는 첫 번째 전극; 및음극으로 기능하는 두 번째 전극을 포함하고,상기 첫 번째 전극과 두 번째 전극 사이의 거리는 식물 종자를 수용하기에 충분히 긴 것임을 특징으로 하는 세포 내로 핵산을 도입시키는 일렉트로포레이션(electroporation) 기구
- 제 58항에 있어서, 상기 첫 번째 전극과 두 번째 전극 사이의 거리는 적어도 약 5 mm 이상임을 특징으로 기구
- 제 58항에 있어서, 상기 첫 번째 전극과 두 번째 전극 사이의 거리는 약 1 cm 이상임을 특징으로 하는 기구
- 제 58항에 있어서, 상기 첫 번째 전극 및 두 번째 전극은 백금 전극임을 특징으로 하는 기구
- 대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키는 것과 결합하여양극으로 기능하는 첫 번째 전극; 및음극으로 기능하는 두 번째 전극을 포함하고,상기 첫 번째 전극과 두 번째 전극 사이의 거리가 변화 가능하여 식물 종자가 첫 번째와 두 번째 전극 사이에 수용될 수 있음을 특징으로 하는 세포 내로 핵산을 도입시키는 일렉트로포레이션 기구
- 제 62항에 있어서, 상기 첫 번째 전극 및 두 번째 전극은 백금 전극임을 특징으로 하는 기구
- 대기압과 다른 압력에 저항하고 식물 종자를 수용하기에 충분한 크기를 지니는 것이 가능한 일렉트로포레이션 챔버
- 제 64항에 있어서, 상기 일렉트로포레이션 챔버의 내벽 상의 적어도 3개 이상의 포인트에 접하는 가장 큰 내접원의 직경이 적어도 약 5 mm 이상임을 특징으로 하는 일렉트로포레이션 챔버
- 제 64항에 있어서, 상기 일렉트로포레이션 챔버의 내벽 상의 적어도 3개 이상의 포인트에 접하는 가장 큰 내접원의 직경이 약 1 cm 이상임을 특징으로 하는일렉트로포레이션 챔버
- 제 64항에 있어서, 상기 챔버는 사각형의 수평 섹션을 지니고 챔버의 내부 용적은 1 cm x 2 cm x 2 cm임을 특징으로 하는 일렉트로포레이션 챔버
- 제 64항에 있어서, 상기 챔버는 원형의 수평 섹션을 지니고 챔버의 용적은 약 1 cm x 4 cm임을 특징으로 하는 일렉트로포레이션 챔버
- 챔버의 크기가 변화 가능하여 식물 종자가 챔버 내에 수용될 수 있음을 특징으로 하는, 대기압과 다른 압력에 저항하는 것이 가능한 일렉트로포레이션 챔버
- a) 핵산 및 세포를 함유한 혼합물을 놓기 위한 컨테이너;b) 컨테이너 a) 내의 핵산 분자를 놓기 위한 섹션;c) 컨테이너 a) 내의 세포를 놓기 위한 섹션;d) 대기압과 다른 압력에 저항하는 것이 가능한, 대기압과 다른 압력 하에 세포를 유지시키기 위한 컨테이너;e) 컨테이너 d) 내의 세포를 놓기 위한 섹션;f) 대기압과 다른 압력에서 컨테이너 d)의 내부 구역을 유지시키기 위한 섹션;g) 핵산 및 세포를 함유한 혼합물에 높은 전압 펄스를 적용하기 위한 컨테이너;h) 컨테이너 g) 내의 핵산 및 세포를 함유한 혼합물을 놓기 위한 섹션;i) 컨테이너 g) 내의 핵산 및 세포를 함유한 혼합물에 높은 전압 펄스를 적용하기 위한 섹션; 및j) 섹션 b), c), e), f), h) 및 i)를 자동으로 수행하기 위한 섹션으로 구성되고,섹션 b) 및 섹션 c)는 서로 동일하거나 다르고; 섹션 e) 및 섹션 h)는 서로 동일하거나 다르고; 컨테이너 a) 컨테이너 d) 및 컨테이너 g)는 서로 동일하거나 다름을 특징으로 하는 일렉트로포레이션을 자동으로 수행하는 기구
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