CN117925618A - 杜仲srpp5基因的启动子、包含srpp5基因启动子的植物表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了杜仲SRPP5基因的启动子、包含SRPP5基因启动子的植物表达载体及其应用。本发明在拟南芥中研究了启动子EuSRPP5的表达模式，启动子EuSRPP5在拟南芥特定的细胞、组织或器官中显示特异的活性；本发明对启动子EuSRPP5在茉莉酸甲酯(MeJA)，赤霉素(GA3)，干旱处理下的表达活性进行了分析，证明了杜仲EuSRPP5基因启动子活性受到激素和干旱通路的调控作用。本发明的启动子EuSRPP5对杜仲SRPP基因表达的研究具有重要意义。

Description

杜仲SRPP5基因的启动子、包含SRPP5基因启动子的植物表达 载体及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及杜仲SRPP5基因的启动子、包含SRPP5基因启动子的植物表达载体及其应用。

背景技术

杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)属于杜仲属，为杜仲科植物，是原产于我国的稀有名贵药用树种。杜仲除了有丰富的药理价值外，还含有一种特殊的白色丝状物质—杜仲胶(Eucommia ulmoides Gum,EUG)，其独特的分子结构可应用在生物医疗，航空航天，工业生产，环境资源等领域，从而带来巨大的经济效益。小橡胶粒子蛋白(SRPP)是橡胶生物合成中的关键酶之一，对于橡胶颗粒的生物合成和稳定性非常重要。先前的研究表明，SRPP基因在杜仲中高表达，并且同源基因表达情况与杜仲胶含量密切相关，因此杜仲中的SRPP基因具有重要的研究价值。

启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游，启动子本身不被转录。但有一些启动子(如tRNA启动子)位于转录起始点的下游，这些DNA序列可以被转录。启动子的特性最初是通过能增加或降低基因转录速率的突变而鉴定的。启动子(Promoters)就像“开关”，决定基因表达的起始和程度，启动子本身并不控制基因活动，而是通过与转录(transcription)因子结合而控制基因活动、驱动和/或调节其3’下游核酸序列的表达。但目前对于杜仲SRPP5(EuSRPP5)基因启动子调控元件的研究未有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供杜仲SRPP5基因的启动子、包含SRPP5基因启动子的植物表达载体及其应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了杜仲SRPP5基因的启动子，所述启动子为EuSRPP5，所述EuSRPP5的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的，影响所述启动子调控的因素包括植物激素和干旱。

优选的，所述植物激素包括茉莉酸甲酯和赤霉素。

本发明还提供了用于扩增EuSRPP5的引物，上游引物PrimerF的序列如SEQ ID NO:2所示；下游引物PrimerR的序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供了一种植物表达载体，包含所述启动子。

优选的，所述植物表达载体的初始载体为pCAMBIA1300-GUS。

本发明还提供了所述植物表达载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)扩增EuSRPP5的序列；

(2)以EcoRI/SalI为酶切位点对载体pCAMBIA1300-GUS进行酶切，然后与EuSRPP5的序列连接，获得所述植物表达载体。

本发明还提供了EuSRPP5在启动和/或调节杜仲SRPP5基因表达中的应用。

本发明还提供了所述的植物表达载体在启动和/或调节杜仲SRPP5基因表达中的应用。

通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：本发明已在拟南芥中研究了启动子EuSRPP5的表达模式，启动子EuSRPP5在拟南芥特定的细胞、组织或器官中显示特异的活性；本发明对启动子EuSRPP5在茉莉酸甲酯(MeJA)，赤霉素(GA3)，干旱处理下的表达活性进行了分析，证明了杜仲EuSRPP5基因启动子活性受到激素和干旱通路的调控作用。本发明的启动子EuSRPP5对杜仲SRPP基因表达的研究具有重要意义。

附图说明

图1为启动子EuSRPP5克隆后的凝胶电泳成像图。

图2为pCAMBIA1300-EuSRPP5-GUS重组载体图谱。

图3为阳性克隆检测凝胶电泳成像图。

图4为启动子EuSRPP5转基因拟南芥株系凝胶电泳成像图；

M：DNAmarker DL6000；a：阳性对照；b：阴性对照；c：水对照。

图5为启动子EuSRPP5转基因拟南芥不同发育时期的GUS染色图；

a：子叶期幼苗整株；b：真叶期整株；c：有性生殖期花序；d：有性生殖期种荚。

图6为MeJA，GA3，PEG6000处理后，启动子EuSRPP5的GUS酶活性。

注：误差线代表平均值的标准误差；**代表与处理前相比的极显著差异，p<0.01；*代表与处理前相比的极显著差异，p<0.05；ns代表无显著差异。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明对杜仲启SRPP5基因的上游调控序列进行了克隆，得到其启动子基本元件的完整序列。随后对其进行了生物信息学分析，通过构建植物表达载体，连接目的片段启动GUS报告基因表达，用其重组植物载体遗传转化拟南芥，从而验证启动子的活性。对EuSRPP5基因的表达模式进行了分析，测定了其在植物激素(MeJA茉莉酸甲酯、GA3赤霉素)及干旱调控下的GUS活性，为研究启动子EuSRPP5的表达调控模式奠定基础。

本发明实施例所用主要试剂：

(1)大肠杆菌固体培养基(LB)：10g/L胰蛋白胨+10g/L氯化钠+5g/L酵母提取物+7.5g/L琼脂粉；

(2)大肠杆菌液体培养基(LB)：10g/L胰蛋白胨+10g/L氯化钠+5g/L酵母提取物；

(3)YEP固体培养基：10g/L蛋白胨+10g/L酵母提取物+5g/L氯化钠+7.5g/L琼脂粉；

(4)YEP液体培养基：10g/L酵母提取物+10g/L蛋白胨+5g/L氯化钠；

(5)潮霉素(Hyg)筛选培养基：1/2MS+30g/L蔗糖+30mg/L潮霉素+7.5g/L琼脂；

pCAMBIA1300-GUS质粒购买于武汉伯远生物科技有限公司。

实施例1目的基因启动子序列的获得

CTAB法提取杜仲基因组DNA，根据在杜仲基因组数据库GenomeWarehouse(https://bigd.big.ac.cn/gwh/Assembly/13/show)得到的EuSRPP5启动子候选序列(ID：GWHTAAAL003925)，设计特异性引物，通过PCR扩增实验获得EuSRPP5启动子的扩增序列，由北京擎科生物科技有限公司合成引物。以杜仲基因组DNA为模板，使用高保真聚合酶，进行扩增，扩增体系和程序如表1和表2所示。

表1启动子EuSRPP5 PCR扩增体系

表2基因启动子PCR反应程序

其中，两条特异性引物为：

PrimerF：

GAAACAGCTATGACATGAATTCGGGCTACGTGTGGTTCTC(SEQ ID NO:2)；

PrimerR：

CTACAGGACGTAACATGTCGACTCTTGTTCTTCTTCCTCTTCAC(SEQ ID NO:3)。

将PCR扩增产物于1％琼脂糖凝胶中分离时间40min，电压为220V，得到大小为1475bp的条带，如图1所示。使用OMEGA琼脂糖DNA回收试剂盒进行纯化回收。

实施例2EuSRPP5基因启动子序列的分析

利用植物顺式作用元件数据库PlantCARE进行相关预测，发现该启动子含有参与植物激素如茉莉酸甲酯响应的TGACG-motif(茉莉酸响应元件)，赤霉素响应的TATC-box，脱落酸响应元件ABRE；参与植物干旱应答影响的MYB元件；厌氧诱导所必需的元件ARE；光响应元件G-Box；参与防御和应激反应的顺式作用元件TC-rich repeats以及大量的TATA-box和CAAT-box等。

实施例3pCAMBIA1300-EuSRPP5-GUS重组载体构建

1.融合表达载体的构建

根据载体pCAMBIA1300-GUS(武汉伯远生物科技有限公司)的图谱设计EcoRI/SalI为插入位点，然后将载体进行酶切，获得载体pCAMBIA1300-GUS的线性片段。将扩增获得的启动子序列与酶切后的载体pCAMBIA1300-GUS的线性片段进行同源重组体外连接，酶切体系见表3，连接体系见表4。

表3载体的酶切体系

表4同源重组体系

2.连接产物的转化

超净工作台灭菌30min，从-80℃超低温冰箱中取出100μL的DH5α感受态细胞，放于冰上，预冷10min；取出一个Ep管，标上记号，置于冰上，加入80μL的感受态细胞(冰上操作)；然后加入10μL的连接产物，用移液枪吸打混匀后冰浴30min；冰浴结束后，放在42℃的恒温水浴锅中热激90s，然后迅速放入冰块中，冰浴2min；吸500μL不含kan(卡那霉素)的LB液体培养液到Ep管中，混匀，置于摇床中160rpm，37℃摇1h；取出摇床结束的Ep管，2000～3000rmp离心5min，弃上清300μL，剩余的菌液轻柔吸打混匀后加在含Kan的LB固体培养皿中，用无菌涂布器涂匀，涂干后放置37℃恒温培养箱中培养16～20h。

3.融合表达载体的鉴定

将转化出来的单菌落通过摇菌后用进行菌液PCR鉴定。菌液PCR体系及反应条件见表5和表6。然后将经过菌液PCR鉴定的阳性菌液进行测序，测序正确的菌液混入50％无菌甘油储存于-80℃超低温冰箱。

表5单菌落检测PCR体系

表6单菌落检测PCR反应条件

菌落PCR的上游引物为：PG215F2，下游引物为PBI121-GUS-R，序列如下所示：

PG215F2：5’-ACAACGATTCAAGTTTTGTTTG-3’(SEQ ID NO:4)

PBI121-GUS-R：5’-CGCGATCCAGACTGAATGC-3’(SEQ ID NO:5)。

测序结果如SEQ ID NO：1所示，测序结果表明，获得的pCAMBIA1300-EuSRPP5-GUS克隆载体中启动子序列正确。重组载体图及琼脂糖凝胶电泳验证如图2所示。

SEQ ID NO:1：

>PG251-24_M1300R_TSS20210426-027-05356_F09,PG251-24_PG215F2_TSS20210426-027-05356-01_C06,PG251-24_PBI121GUS-R_TSS20210426-027-05356_A10

GCCTTGCTCAGTGTGTGGATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACATGA

ATTCGGGCTACGTGTGGTTCTCATTCATCGTCCAAACCGTCACCCTTATAAATATCTTTTTTATTTT

ATTTTATATATATATATATATATCAGCGTTGTCCTATCCAAAAAAATTAGTTTATTCGGAATGCGTTCT

TCTCAACAAATACTTTTCCGCAGATTCGAACTCCGAATTTTATAAATTCCTCAACTGCTTTAATTA

AAATATATGTTGCCGCTGAGTATAAAATATGTATTTTGGTTTATCAACTTTTTTTTTTAAGGAAGGT

AAATGTATTATAAAATTTCTCTAGCTTTTCTAACTTTAAAACAAATATTGGAAAAAACATTTAAGTT

ATTATTATTATTTTTTTTACTAAATAAGGACATGTTGAAGAAGAAATTGTATTCTAGATCTTGCAAA

AAAATGGGCTACAAATCTCGAGATTCGAACTTGAGATTCACTTTTAAGTTACTAATAATGTAACTC

CAAATATGGTCAAGATTAGGAAAAATTATATTTTCGTCCCTATAATATAGGGTGGGTTTGCATGTGC

CCTCTAATTATACATTTAATTTCTCAAATTTTATATATATTTTAATTCTTTAAAATTAAAATATTATTA A

TAATTTTAGATAAATATTGAATTTTTTCAACGTGCGGCCTTTCAATGTAGATATTTTTGTTATTTTAT

TACTTCAATAAATATAATGTTTATTTTTTTAACAACGATTCAAGTTTTGTTTGTTTATCATTATTAATT

AGAGAAATAGTTAATGTTAAAAAAATATTAAGAAAAAATATTTTAGATTTAGAGGAATGATAAAA

CGACAAAATATACTTATTAAAAGGTTGGTTGAGCATTGTTCATGTTTTTTGATCTAAAATTATTAAT

ATTTTTATTTTTTATTTTATAGAATTGAAATAAATGTGAAATTTGAGATGACGTTTATTTGTACTCCC

AATAAAATGGGAAATAAATTTTATTTTCGTTATGGAATATTTTGAAAATAGAATCGCATTTGCTAAC

GATAATATTTTAAAAATATTTTAATAATTTAAGCTTGAAATATATATAGGGGAAGAGAGAAGAAAAT

AAAGTTGTTTACGGTTGGTGGCTATCGTGGTGGTTGTTCTTAATTTTATGGGAGCAAAGATTTTTT

TATTTCTCAAATTCTTAAAAAGTTACAGAATTATTCTTAAGACATTAAAAATATTGGAGAATAGAA

ATATCTTACCAAACATATATTTGTATATTAATTCTGAGACGAAGAATAAAAAAGTAAGTTGTGAAAT

ACAAATGTGTCATTGTTTAAATATTATGAACCAATTAAACACCCAAATTATTTGTGAGGACCAAAA

ATGTCGTTATCCCATAAATCAATACTATAACATTGATTAGTGCCGAAGCCTACGAAGGGGGAGTGA

GAGAGTTAGAGAGAAGAAGAAGAGAGAGAGAGAGAGAGCGAGTTAGAGAGTGAAGAGGAAG

AAGAACAAGAGTCGACATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACCCGGAATAAGGGTCATGTC

此步骤中，引物合成由北京擎科生物科技有限公司完成，测序由武汉转导生物实验室有限公司完成。

实施例4pCAMBIA1300-EuSRPP5-GUS重组质粒导入农杆菌

取100μL储存于-80℃超低温冰箱的LBA4404农杆菌感受态细胞，置于冰上融化；向感受态细胞中加入20～40μLpCAMBIA1300-EuSRPP5-GUS的重组质粒，用移液枪轻轻混匀；将含有重组质粒的感受态细胞放于冰上静置30min，随即转移至液氮中冷冻5min；然后置于37℃水浴5min，融解细胞；向管中加入1mL不含任何抗生素的YEP液体培养基，然后置于恒温振荡培养箱震荡培养5h(28℃，200rpm/min)。

培养后的菌液于4℃，5000rpm/min离心1min，弃除上清，再加入0.1mL YEP液体培养基(Rif-100mg/L和Kan-100mg/L)回融菌体；

将上述菌体用灭菌的涂布器均匀地涂布于含有Rif(50mg/L)和Kan(100mg/L)的YEP固体平板上，静置数分钟至菌液完全被吸收后，用封口膜将培养皿封口，随后放入28℃生化培养箱中培养2～3天；挑取单菌落，保种备用。

实施例5农杆菌介导的目的基因启动子EuSRPP5遗传转化拟南芥

1.种植哥伦比亚型野生型拟南芥

把野生型拟南芥种子均匀的平铺在含有湿润滤纸的培养皿中，然后放置在4℃冰箱中2天，春化种子。将春化后的种子播撒于花盆中，用营养土进行栽培，浇水湿润后放置人工气候室中，在23℃，湿度为65％，光周期为16h/8h光照/黑暗的培养条件下进行培养，每4～5天浇一次水。待拟南芥植株长出3～4cm的顶生花序时，将顶生花序剪掉促使叶生花序生长，大量花序长出后，可进行侵染实验。侵染前将已抽薹的拟南芥的荚果以及授粉完的花朵剪掉，只留下含苞待放的花朵。

2.农杆菌侵染野生型拟南芥

在超净工作台中用移液枪吸取15～20μL含有重组质粒的LBA4404的农杆菌菌液(储存于-80℃超低温冰箱中)滴在含有Rif(50mg/L)和Kan(100mg/L)的固体YEP培养基上，使用无菌接种环进行平板划线接种，随后用封口膜封口培养皿，倒放于28℃生化培养箱中避光培养2～3天；

挑选单菌落接种到10mL YEP液体培养基(含Rif50 mg/L、Kan 100mg/L)中，置于恒温震荡培养箱中避光培养24h(28℃，200rpm/min)；

取1mL上述菌液接种于30～40ml YEP液体培养基(含Rif50 mg/L、Kan 100mg/L)中扩大培养，置于恒温震荡培养箱中避光培养4～5h(28℃，200rpm/min)后用紫外分光光度计测定OD值，直至OD600值达到0.8～1.2；

在超净台中把扩大培养好的菌液转移置50mL无菌离心管中，离心10min(4℃，5000rpm/min)弃掉上清液；

用加入了silwet-77的MS重悬液充分重悬菌体沉淀，silwet-77在MS重悬液中的浓度为0.02％；

将野生型拟南芥材料的全部花序在菌液中侵染30～60s，然后用保鲜膜覆盖植株保持湿度大于90％，先在25℃下避光培养24h。暗培结束后揭掉保鲜膜，然后继续在23℃，湿度为65％，光周期为16h/8h光照/黑暗的培养条件下进行培养；

浸染周期为7天，共浸染3次，期间侵染步骤和条件均和第一次相同。全部侵染流程结束后，将拟南芥苗继续置于23℃16h/8h光照/黑暗培养，待其结种；

将成熟的果荚轻揉到干净的白纸上，将收取的干净种子放入干燥离心管中于4℃冰箱中保存。

3.筛选转基因阳性拟南芥植株

在超净工作台中将收取的种子中用75％乙醇消毒30s，无菌水清洗2～3次，1min/次；然后用10％次氯酸钠溶液表面消毒30s，用无菌水清洗4～5次，1min/次，随后将种子均匀铺于含有潮霉素(30mg/L)抗性的筛选培养基上，然后4℃冰箱放置2～3天春化种子。春化后将平板拿出放置于23℃，16h/8h光照/黑暗培养10-14天，观察幼芽叶片颜色，绿色叶片为转基因拟南芥阳性植株；

将筛选存活的阳性植株移栽至营养土中，23℃，16h/8h光照/黑暗培养。待植株长20天左右，采用CTAB法提取拟南芥基因组DNA，进行PCR检测；

通过PCR检测后获得的T0代转基因拟南芥阳性植株，使用相同的培养条件进行培养，收集T0代种子。T0代种子通过30mg/L潮霉素抗性培养基进行筛选，获得T1代转基因拟南芥阳性植株；

T1代植株经PCR检测无误后继续培养，然后单株收集T1代种子，使用浓度为30mg/L潮霉素抗性筛选培养基进行筛选，同样经PCR检测获得T2代转基因拟南芥阳性植株；

将T2代拟南芥阳性植株进行单株收种，获得T3代种子，然后每个株系分别取50粒种子进行在潮霉素抗性培养基上进行筛选，记录T3代拟南芥阳性植株筛选情况；

在30mg/L的潮霉素抗性筛选培养基上T3代拟南芥阳性植株全部正常生长并且不发生分离，且经PCR检测无误后，则得到T3代纯合转基因阳性植株；

获得启动子EuSRPP5的T3代纯合转基因拟南芥阳性株系后，继续培养，作为后续实验材料。

实施例6转基因拟南芥植株的鉴定

提取转基因拟南芥植株的DNA，使用PCR进行检测，以潮霉素抗性基因设计特异性引物：

F-GAGCATATACGCCCGGAGTC，(SEQ ID NO:6)

R-CAAGACCTGCCTGAAACCGA。(SEQ ID NO:7)

PCR扩增反应体系和反应程序同表1和2。PCR反应产物使用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，以野生型拟南芥植株DNA和水为对照，凝胶电泳结果如图3所示。根据图3结果可知，共获得11株转基因阳性拟南芥株系。

实施例7启动子EuSRPP5的表达模式分析

对pCAMBIA1300-EuSRPP5-GUS转化的T3拟南芥进行染色。将转化的拟南芥抗性根、茎、叶、花、种荚于适量的GUS染色液中，37℃过夜。之后将组织浸泡于75％酒精中至组织绿色褪去，利用体视显微镜进行拍照，结果如图4所示。

图4显示，在子叶期的转基因植株幼苗GUS染色明显；随着植株的生长，真叶的GUS染色也很深，并且子叶也继续稳定表达出活性，但根中GUS表达不稳定；当有性生殖器官发育后，花序及其侧生叶都表达出GUS活性，同时成熟种荚，种子都有GUS表达活性。

根据图4的实验结果，可以推断出含有重组载体pCAMBIA1300-EuSRPP5-GUS的根癌农杆菌介导转化的拟南芥茎、叶、花、种荚均呈现蓝色，根中几乎无蓝色。说明本发明的启动子可以启动GUS基因在拟南芥除了在根部表达不稳定，而在茎、叶、花、种荚组织中表达稳定，且染色程度无明显差异，表明启动子EuSRPP5在拟南芥中具有一定的组织特异性。

实施例8启动子EuSRPP5在茉莉酸甲酯(MeJA)，赤霉素(GA3)，干旱处理下的表达活性分析

首先选取生长到30天左右的并且GUS染色较为一致的T3代纯合转基因拟南芥植株进行处理实验。使用1mmol/L MeJA溶液，1mmol/L GA3溶液和20％PEG6000溶液喷施植株(PEG6000处理模拟干旱胁迫)，喷施至使植株叶面完全湿润，并且叶面有水滴滴落为止。在23℃，16h/8h光照/黑暗的人工气候室培养，然后分别在0h，3h，6h，12h，24h时取样，样品经液氮速冻后放置-80℃超低温冰箱保存，后用β-GUS酶联免疫分析试剂盒(购置上海酶联生物有限公司)提取GUS酶，测定活性，进而分析启动子EuSRPP5的表达活性，结果如5所示。图5显示，EuSRPP5的表达活性在以上三种处理6h时活性最强，6h后降低。以0h为对照，经MeJA和GA3处理后酶活性分别显著增加了1.68倍和2.30倍；经20％PEG6000诱导干旱胁迫后，EuSRPP5的表达在6h显著增加了1.57倍。

以上结果说明了内源激素MeJA，GA3和干旱调控三者都能驱动EuSRPP5的GUS活性表达，进一步说明了杜仲EuSRPP5基因启动子活性受到激素和干旱通路的调控作用。

由以上实施例可知，本发明提供了杜仲SRPP5基因的启动子、包含SRPP5基因启动子的植物表达载体及其应用。本发明的启动子EuSRPP5对杜仲SRPP基因表达的研究具有重要意义。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.杜仲SRPP5基因的启动子，其特征在于，所述启动子为EuSRPP5，所述EuSRPP5的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，影响所述启动子调控的因素包括植物激素和干旱。

3.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述植物激素包括茉莉酸甲酯和赤霉素。

4.用于扩增EuSRPP5的引物，其特征在于，上游引物PrimerF的序列如SEQ ID NO:2所示；下游引物PrimerR的序列如SEQ ID NO:3所示。

5.一种植物表达载体，其特征在于，包含权利1所述的启动子。

6.根据权利要求5所述的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体的初始载体为pCAMBIA1300-GUS。

7.权利要求5所述植物表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)扩增EuSRPP5的序列；

(2)以EcoRI/SalI为酶切位点对载体pCAMBIA1300-GUS进行酶切，然后与EuSRPP5的序列连接，获得所述植物表达载体。

8.EuSRPP5在启动和/或调节杜仲SRPP5基因表达中的应用。

9.权利要求3所述的植物表达载体在启动和/或调节杜仲SRPP5基因表达中的应用。