CN116023453A - 蛋白质IbRING在调控植物耐盐抗旱性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了IbRING蛋白或调控所述IbRING蛋白含量或活性的物质在调控植物耐盐行和/或抗旱性中的应用。本发明发现了IbRING蛋白及其编码基因，将该基因导入拟南芥中得到过表达IbRING基因的转基因拟南芥植株。将转基因拟南芥植株进行逆境胁迫处理，发现过表达转基因拟南芥株系与野生型拟南芥相比，耐盐性和抗旱性增强，在提高植物抗逆性研究中具有重要的应用价值。

Description

蛋白质IbRING在调控植物耐盐抗旱性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中蛋白质IbRING在调控植物耐盐抗旱性中的应用。

背景技术

甘薯是一种重要的粮食、饲料以及工业原料用作物，并且在当今世界上作为一种新型能源植物，其地位显得尤为重要。据不完全统计，世界范围内存在8亿hm²盐渍化土地，约占总陆地面积的6％，约20％灌溉农业用地的土壤盐渍化，其盐分大都在0.6％～10％，严重影响了甘薯的产量和品质。甘薯虽然是耐旱作物，但缺水时，同其它作物一样，生长发育、生理和产量均会受到影响。通过对植物耐盐抗旱机理的深入研究，挖掘耐盐抗旱基因资源，培育耐盐抗旱甘薯新品种是利用盐碱地、干旱半干旱资源最经济、有效的措施之一。

蛋白质的泛素化是一种广泛存在于真核生物中的翻译后修饰。该系统在植物的许多重要生物学过程中都起到了十分重要的作用。研究发现，泛素化参与了植物对多种逆境胁迫的响应。目前，有关泛素化修饰在甘薯的正常生长以及对逆境胁迫的响应过程中的作用还未见报道，因此克隆甘薯中的泛素化过程相关基因，通过基因工程手段克隆、鉴定得到具有抗旱、耐盐功能基因，将其转入植物体内提高植物抗旱、耐盐的能力具有重要的研究和应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗逆性，尤其是耐盐性和抗旱性。

IbRING蛋白或调控所述IbRING蛋白含量或活性的物质的如下任一种或多种的应用：

B1)提高植物耐盐性；

B2)制备提高植物耐盐性的产品；

B3)提高植物耐旱耐性；

B4)制备提高植物耐旱性的产品；

B5)提高盐和/或干旱胁迫条件下植物的发芽率；

B6)制备提高盐和/或旱胁迫条件下植物的发芽率的产品；

B7)提高盐和/或旱胁迫条件下植物的长势；

B8)制备提高盐和/或旱胁迫条件下植物的长势的产品；

B9)增加盐和/或旱胁迫条件下植物的根长；

B10)制备增加盐和/或旱胁迫条件下植物的根长的产品；

B11)提高盐和/或旱胁迫条件下植物的存活率；

B12)制备提高盐和/或旱胁迫条件下植物的存活率的产品；

B13)提高盐和/或旱胁迫条件下植物的SOD酶活性；

B14)制备提高盐和/或旱胁迫条件下植物的SOD酶活性的产品；

B15)降低盐和/或旱胁迫条件下植物的丙二醛(MDA)含量；

B16)制备降低盐和/或旱胁迫条件下植物的丙二醛(MDA)含量的产品；

B17)降低盐和/或旱胁迫条件下植物的活性氧(H₂O₂)含量；

B18)制备降低盐和/或旱胁迫条件下植物的活性氧(H₂O₂)含量的产品；

所述IbRING蛋白是如下A1、A2或A3的蛋白质：

A1、氨基酸序列是SEQ ID NO.中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的蛋白质；

A2、将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与植物耐盐性和/或抗旱性相关的蛋白质；

A3、在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

上述应用中，SEQ ID No.2由534个氨基酸残基组成。

上述应用中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述应用中，所述80％以上的同一性可为至少81％、85％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述应用中，所述IbRING蛋白可来源于甘薯。

上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；进一步的，所述单子叶植物可为旋花科植物；更进一步，所述旋花科植物可为甘薯属植物；具体的，所述甘薯属植物可为甘薯。

上述应用中，所述调控所述IbRING蛋白含量或活性的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：B1)在所述基因转录水平上进行的调控；B2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；B3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；B4)对所述基因的翻译进行的调控；B5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；B6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

上述应用中，所述调控所述IbRING蛋白含量或活性的物质为与所述的IbRING蛋白相关的生物材料；所述生物材料为下述C1-C3中的任一种：

C1、编码所述IbRING蛋白的核酸分子；

C2、提高所述IbRING蛋白表达的核酸分子；

C3、含有C1或C2所述的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。

上述应用中，C1或C2所述的核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述应用中，C1所述核酸分子具体可为编码链的编码序列是SEQ ID NO.中SEQ IDNo.2第1-1605位的核酸分子。

上述应用中，所述调控所述IbRING蛋白含量或活性的物质可为提高所述IbRING蛋白含量或活性，具体可通过提高所述IbRING蛋白的编码基因表达量实现。

本发明还提供蛋白质，为IbRING蛋白，是如下A1、A2或A3的蛋白质：

A1、氨基酸序列是SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的蛋白质；

A2、将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与植物抗逆性相关的蛋白质；

A3、在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

上述蛋白质中，所述抗逆性为耐盐性和/或抗旱性。

本发明还提供与所述的IbRING蛋白相关的生物材料；所述生物材料为下述C1-C3中的任一种：

C1、编码所述IbRING蛋白的核酸分子；

C2、提高所述IbRING蛋白表达的核酸分子；

C3、含有C1或C2所述的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。

为了解决上述技术问题，本发明提供了增强抗逆性的植物试剂，所述植物试剂的活性成分为促进编码所述IbRING蛋白的基因的表达、提高所述IbRING蛋白的丰度的物质。所述活性成分具体可为所述IbRING蛋白和/或IbRING蛋白相关的生物材料。

上述植物试剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述植物试剂的其他活性成分本领域技术人员可根据植物的抗逆性效果确定。

上述植物试剂中，所述抗逆性为耐盐性和/或抗旱性。

为了解决上述技术问题，本发明的还提供一种提高植物抗逆性的方法，包括如下步骤：促进受体植物中所述IbRING蛋白的表达或提高所述IbRING蛋白的丰度，得到抗逆性强于所述受体植物的目的植物。

其中，促进受体植物中所述IbRING蛋白的表达或提高所述IbRING蛋白的丰度具体可通过将所述IbRING蛋白的编码基因导入所述受体植物实现。

上述方法中，所述抗逆性为耐盐性和/或抗旱性。

本文中，所述植物可为下述任一种植物：

E1)单子叶植物纲植物；

E2)十字花科植物；

E3)拟南芥(Arabidopsis thaliana)；

E4)单子叶植物纲植物；

E5)旋花科植物；

E6)甘薯属植物；

E7)甘薯。

本发明中，所述调控可为上调或增强或提高。

本发明发现了IbRING蛋白及其编码基因，将该基因导入拟南芥中，得到过表达IbRING基因的转基因拟南芥植株。将转基因拟南芥植株进行逆境胁迫处理，发现过表达转基因拟南芥株系与野生型拟南芥相比，耐盐性和耐旱性增强，具体体现在发芽率提高、根长提高、长势提高，SOD酶活性提高，丙二醛含量和活性氧含量降低。结果表明，IbRING基因及其所编码的蛋白在植物对抗逆境过程中起着重要的作用。本发明所提供的IbRING蛋白及其编码基因在提高植物抗逆性研究中具有重要的应用价值。本发明将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

图1为本发明实施例2中转基因拟南芥植株的PCR扩增结果；其中，M为DNA分子Marker，W为阴性对照水，P为阳性对照，WT为野生型拟南芥植株的基因组DNA，L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8和L9均为转IbRING基因拟南芥植株。

图2为本发明实施例2中IbRING基因在转IbRING基因拟南芥阳性植株和野生型拟南芥植株中的表达；其中，WT为野生型拟南芥的cDNA，L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8和L9均转IbRING基因拟南芥阳性植株的cDNA。图中所示数据为平均值±标准差，重复数为3，**代表显著性分析结果为P<0.01。

图3为本发明实施例2中过表达IbRING转基因拟南芥阳性植株和野生型拟南芥植株的种子耐盐性及抗旱性鉴定；其中，图3的A图为发芽情况；图3的B图为发芽率统计结果；WT为野生型拟南芥，L5、L6、L7和L9为过表达IbRING转基因拟南芥株系。图中所示数据为平均值±标准差，重复数为3，*代表显著性分析结果为P＜0.05。

图4为本发明实施例2中过表达IbARING转基因拟南芥阳性植株和野生型拟南芥植株的耐盐性及抗旱性离体鉴定；其中，图4的A图为在正常1/2MS培养基上的长势情况，图4的B图为在含有100mM氯化钠的1/2MS培养基上的长势情况，图4的C图为在含300mM甘露醇的1/2MS培养基上的长势情况；图4的D图为根长统计结果；WT为野生型拟南芥，L5、L6、L7、L9均为过表达IbRING转基因拟南芥株系。图中所示数据为平均值±标准差，重复数为3，*代表显著性分析结果为P＜0.05。

图5为本发明实施例2中过表达IbRING转基因拟南芥阳性植株和野生型拟南芥植株的耐盐性和抗旱性盆栽鉴定；其中，图5的A图为对照组、盐胁迫组(标为氯化钠)，以及干旱胁迫组(干旱和复水)植株的长势情况；图5的B图为存活率、SOD酶活性、丙二醛和过氧化氢含量的统计结果；WT为野生型拟南芥，L5、L6、L7和L9为过表达IbRING转基因拟南芥株系。图中所示数据为平均值±标准差，重复数为3，**代表显著性分析结果为P<0.01。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

甘薯品种鲁薯3号记载于如下文献中：王飞兵.过表达IbMIPS1和IbMVD基因甘薯植株的获得及特性鉴定，博士学位论文，中国农业大学，2015。公众可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验。

拟南芥哥伦比亚野生型(Col-0)为上海唯地生物技术有限公司产品。

载体pCAMBIA3301为优宝生物公司产品，产品编号为VT1386。

根癌农杆菌GV3101记载于如下文献中：“Bing Du,Nan Nie,Sifan Sun,YuanfengHu,Yidong Bai,Shaozhen He,Ning Zhao,Qingchang Liu,Hong Zhai*.A novelsweetpotato RING-H2 type E3 ubiquitin ligase gene IbATL38 enhances salttolerance in transgenic Arabidopsis.Plant Science 304(2021)110802”。公众可从中国农业大学获得该材料以验证本发明的试验。

载体pBI121为优宝生物公司产品，产品编号为VT1388。

总RNA提取试剂盒为全式金(TransGen Biotech，北京)的Transzol Up植物总RNA提取试剂盒，产品目录号为ET111。

pEASY-Blunt simple载体为北京全式金生物技术有限公司的产品，产品目录号为CB111-01。

QuantScript RT Kit Quant cDNA第一链合成试剂盒为天根(TIANGEN，北京)限公司的产品，产品目录号为KR103。

1/2霍格兰营养液记载于如下文献中：“刘德高.过表达IbP5CR、IbERD3、IbELT、IbNFU1基因的甘薯植株的获得及耐盐性鉴定.北京.2014年.中国农业大学博士毕业论文”。公众可从中国农业大学获得以验证本发明的试验。

下述实施例采用SPSS 23.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用t检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异。

实施例1、IbRING基因的获得

一、IbRING基因的获得的步骤如下：

1、用植物总RNA提取试剂盒提取甘薯品种鲁薯3号的幼嫩叶片的总RNA，将该总RNA用QuantScript RT Kit Quant cDNA第一链合成试剂盒反转录出第一链cDNA。

2、设计并人工合成引物F1和F2，具体序列如下：

F1：5’-ATGGACAGGGAAAAGAAAGAAAC-3’；

F2：5’-CTAGCTCCCACTAAATGTTTCGG-3’。

以F1和F2为引物，以步骤1获得的cDNA为模板，进行PCR扩增，获得约534bp的PCR扩增产物并测序。

结果表明，PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1自5’末端起第1至1605位所示，将该序列所示的基因命名为IbRING基因，其编码的蛋白命名为IbRING，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由534个氨基酸残基组成。

SEQ ID NO.1如下所示：

SEQ ID NO.2如下所示：

实施例2、IbRING蛋白在调控拟南芥耐盐性和抗旱性中的应用

一、重组质粒的构建

A、重组质粒pCB-IbRING的构建

1、人工合成SEQ ID NO.1自5’末端起第1至1605位所示的双链DNA分子。以该双链DNA分子为模板，以F3和F4为引物进行PCR扩增，引物具体序列如下：

F3：5’-GAAGATCTATGGACAGGGAAAAGAAAGAAAC-3’(下划线为限制性内切酶BglII的识别序列)；

F4：5’-GCCACGTGCTAGCTCCCACTAAATGTTTCGG-3’(下划线为限制性内切酶PmlI的识别序列)。

回收扩增产物，得到一端含有限制性内切酶BglII识别序列和另一端含有限制性内切酶PmlI识别序列的双链DNA分子。

2、将一端含有限制性内切酶BglII识别序列和另一端含有限制性内切酶PmlI识别序列的双链DNA分子连接至pEASY-Blunt simple载体，得到重组质粒pEASY-IbRING。

3、完成步骤2后，用限制性内切酶BglII和PmlI双酶切重组质粒pEASY-IbRING，回收约1605bp的片段1。

4、用限制性内切酶BglII和PmlI双酶切重组质粒pCBGUS，回收约12388bp的载体骨架2。

5、将片段1与载体骨架2连接，得到重组质粒pCB-IbRING。

根据测序结果，对重组质粒pCB-IbRING进行结构描述如下：将重组质粒pCBGUS的限制性内切酶BglII和PmlI识别序列间的小片段替换为SEQ ID NO.1自5’末端起第1至1605位所示的双链DNA分子，保持重组质粒pCBGUS的其它序列不变，得到的重组质粒pCB-IbRING。重组质粒pCB-IbRING表达SEQ ID NO.1所示的IbRING蛋白。

所述重组质粒pCBGUS为将pBI121载体上HindIII酶和EcoRI酶识别位点间含35S启动子序列和GUS基因序列的DNA片段替换pCAMBIA3301载体的HindIII酶和EcoRI酶识别位点间的小片段，保持pCAMBIA3301载体其它序列不变，得到的重组质粒，具体通过如下方法构建得的：

(1)将pCAMBIA3301载体(购自CAMBIA公司)经过HindIII和EcoRI双酶切，回收载体大片段(约11256bp)；

(2)将pBI121载体(购自Clontech公司)经过HindIII和EcoRI双酶切，回收包含含35S启动子序列和gusA基因的片段(约3032bp)；

(3)将步骤(1)中回收的载体大片段与步骤(2)中回收的包含gusA基因的片段连接，得到重组载体pCBGUS。

二、转IbRING拟南芥植株的获得

1、将重组质粒pCB-IbRING转化根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌甲，将重组农杆菌甲命名为GV3101/pCB-IbRING。

2、种子消毒处理：取适量拟南芥哥伦比亚野生型(Col-0；以下简称为野生型拟南芥)种子装入1.5mL离心管中，用1％次氯酸钠溶液消毒10min，上下颠倒充分混匀，低速离心后倒掉次氯酸钠，加入无菌蒸馏水充分洗涤5-6次；将处理好的种子均匀地铺在1/2MS固体培养基的平板上。

3、春化：将铺好种子的1/2MS固体培养基平板密封置于4℃环境中3-4天。

4、将春化后的平板放置在22±1℃的光照培养室(光照强度：5500lx±300lx光照每日光照时间：12h)中培养，待幼苗长出3-5片真叶后，用镊子小心的将幼苗从培养基中取出，尽量除净幼苗上的培养基，然后移栽至营养土和蛭石(1:1)中，用塑料薄膜盖住保湿1周左右，得到带花序的拟南芥植株。

5、农杆菌的培养：在抗性平板(含有100μg mL-1Kan的LB培养基中)上活化农杆菌，挑取单菌落接种于5mL的已加入对应抗生素(100μg mL-1Kan)的LB液体培养基中，28℃下200rpm振荡培养，直到OD600值在0.8～1.0范围内。5000rpm离心并去上清液，用等体积的含有3％的蔗糖的1/2MS液体培养基重悬菌体，在菌液中加入0.05％的SilwetL-77混匀，农杆菌菌悬液OD₆₀₀约为0.8，即得到GV3101/pCB-IbRING菌悬液。

6、花序侵染：将步骤5获得的农杆菌GV3101/pCB-IbRING菌悬液放入口径约为9cm的玻璃培养皿中，用于侵染。将步骤4获得的带花序的拟南芥植株倒转，使花序全部侵润在农杆菌重悬液中15s左右。侵染过的植株放置于黑暗条件下24h，此时保持土壤湿润，每周重复侵染一次，一共侵染3次，待种子成熟后收获，即得到T₀种子。

7、抗性种子的筛选：T₀种子表面消毒并统一发芽后，将种子播种于含12.5mg/L的PPT(phosphinothricin，草甘膦)的1/2MS固体培养基上筛选阳性植株，将阳性植株移栽到土中继续生长，单株收种获得T₁代种子。之后将T₁代种子消毒后播种于含12.5mg/L的PPT的1/2MS固体培养基上继续筛选阳性植株，统计分离比，在筛选培养基上阳性植株和非阳性植株符合3:1比例的株系即为单拷贝插入的株系，繁种，获得T₂代种子。重复如此，获得T₃代种子。将T₃代种子消毒后播种于含12.5mg/L的PPT的1/2MS固体培养基上，所有种子均能正常生长的株系即为单拷贝插入纯合植株，保存种子，记作T₃代拟转IbRING基因拟南芥。

8、转基因植株的鉴定与再生：

T₃代拟转IbARING基因拟南芥的鉴定使用PCR检测方法。具体方法如下：

提取T₃代拟转IbRING拟南芥植株和野生型拟南芥植株的叶片基因组DNA，用引物F1和F2进行PCR检测，同时以pCB-IbRING载体质粒DNA为阳性对照，水和野生型拟南芥植株DNA为阴性对照。

将扩增得到的PCR产物在1％(w/v)的琼脂糖凝胶中进行电泳分离，PCR阳性植株应该具有一条特异的1605bp的电泳条带，记录下PCR阳性植株的株系号。

结果如图1所示，结果显示T₃代转IbRING拟南芥植株L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8和L9在1605bp附近均出现了电泳条带，野生型拟南芥和阴性对照没有出现条带，进一步确定了本发明获得了转基因拟南芥植株L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8和L9。将T₃代转IbRING基因拟南芥株系上收获的种子保存。

3)qRT-PCR

将T₃代转IbRING基因拟南芥株系提取RNA，反转录得到cDNA，进行qRT-PCR,以未转化的野生型为对照。

Atactin基因为内参：

Atactin-F：5’-GCACCCTGTTCTTCTTACCGA-3’；

Atactin-R：5’-AGTAAGGTCACGTCCAGCAAGG-3’。

IbRING引物序列为:

F5：5’-ACGCCTCGCATTAAGAGGAC-3’；

F6：5’-AAAGGGAACGAGGTATGCGG-3’。

结果如图2所示，表明IbRING在转基因拟南芥植株L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8和L9中均有不同程度的表达。选取过表达IbRING转基因拟南芥植株L5、L6、L7和L9的种子进行后续试验。

三、过表达IbRING转基因拟南芥植株抗逆性鉴定

1、转基因拟南芥种子耐盐性和抗旱性鉴定

T₃代过表达IbRING转基因拟南芥植株L5、L6、L7和L9的种子与野生型拟南芥(WT)种子消毒后点播于不同的培养基中，培养基设置如下：

对照：1/2MS固体培养基；

盐胁迫(100mM氯化钠)：含有100mM NaCl的1/2MS固体培养基(即以1/2MS固体培养基为基础培养基，向该基础培养基中添加NaCl，使得NaCl的浓度为100mM，得到的培养基)；

干旱胁迫(300mM甘露醇)：含有100mM NaCl的1/2MS固体培养基(即以1/2MS固体培养基为基础培养基，向该基础培养基中添加甘露醇，使得甘露醇的浓度为300mM，得到的培养基)。

置于22℃温室，从第二天起，每天计数发芽情况(以露白为准)。

结果如图3所示，在正常的1/2MS固体培养基上，过表达IbRING转基因拟南芥株系L5、L6、L7和L9与野生型拟南芥(WT)在发芽情况上无显著差异。在含有100mM或300mM甘露醇的1/2MS培养基上，转基因拟南芥种子在盐胁迫和干旱胁迫条件下的发芽情况均优于野生型植株。说明IbRING基因的过表达能够增强种子的耐盐性和抗旱性。

2、转基因拟南芥耐盐性和抗旱性离体鉴定

(1)转基因拟南芥耐盐性和抗旱性离体鉴定

T₃代过表达IbRING转基因拟南芥植株L5、L7的种子与野生型拟南芥(WT)种子消毒后点播于1/2MS固体培养基中，获得转基因拟南芥株系L1、L4、L9和野生型拟南芥，待子叶完全展开后，每个株系选取3株长势一致的转基因拟南芥植株和野生型植株分别培养到如下培养基中：

对照：1/2MS培养基；

盐胁迫(100mM氯化钠)：含有100mM NaCl的1/2MS培养基(即以1/2MS培养基为基础培养基，向该基础培养基中添加NaCl，使得NaCl的浓度为100mM，得到的培养基)；

干旱胁迫(300mM甘露醇)：含有100mM NaCl的1/2MS培养基(即以1/2MS培养基为基础培养基，向该基础培养基中添加甘露醇，使得甘露醇的浓度为300mM，得到的培养基)。

10天后观察植株生长情况，并测量其根长。

结果如图4的A图所示，在正常的1/2MS培养基生长10天后，过表达IbRING转基因拟南芥株系L5、L7与野生型拟南芥(WT)在生长状态和生根情况上无显著差异。而在含有100mMNaCl或300mM甘露醇的1/2MS培养基上，过表达IbRING基因转基因拟南芥植株的根长显著优于野生型(图4的B图、图4的C图)。根长测定结果见图4的D图，初步说明IbRING基因的过表达提高了拟南芥植株的耐盐性和抗旱性。

3、转基因植株耐盐性和抗旱性盆栽鉴定

T₃代过表达IbRING转基因拟南芥植株L5、L6、L7、L9的种子与野生型拟南芥(WT)种子消毒后点播于1/2MS固体培养基中，正常生长7天后，将转基因拟南芥株系L5、L6、L7、L9和野生型拟南芥移栽至8cm的营养钵。设置如下处理组：

a对照组，即无胁迫处理：移栽至8cm的营养钵后正常条件生长4周，用1/2霍格兰营养液每2天灌溉1次，观察植株生长情况；

b盐胁迫组，即氯化钠处理：移栽至直径8cm的营养钵后正常条件生长1周，用含有300mM NaCl的1/2霍格兰营养液(即向1/2霍格兰营养液中添加NaCl，使NaCl的浓度为300mM，得到的营养液)每2天灌溉1次，处理2周，观察植株生长情况，并统计存活率；

c干旱胁迫组：移栽至直径8cm的营养钵后正常条件生长1周，对拟南芥幼苗进行自然干旱胁迫，至WT幼苗失水死亡时进行复水，复水1天后观察转基因株系和WT幼苗的生长状况，并统计存活率。

结果如图5的A图和图5的B图所示，可以看出，对照组中所有植物长势基本相同；而用300mM NaCl溶液处理2周之后，野生型植株叶片大面积变黄萎蔫，植株死亡。而转基因株系总体生长状况较好，叶片绿色部分较多，存活率显著高于对照。干旱胁迫处理后，野生型拟南芥出现萎蔫死亡，而大多数转基因拟南芥在覆水一天后，叶片恢复绿色，存活下来。统计各株系的存活率，结果显示转基因株系存活率显著高于对照。盆栽实验结果表明过表达IbRING基因能显著提高拟南芥植株对高盐胁迫和干旱的抵抗能力。

4、转基因植株物质含量测定

(1)SOD活性测定

SOD活性可以作为植物抗逆性的一项生化指标。SOD的活性越低，植物遭受逆境伤害的程度越大。

用超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(苏州科铭生物，目录号：SOD-2-Y)来检测拟南芥植株的SOD活性。拟南芥植株为采用上述步骤3中a、b和c处理后获得的拟南芥植株。拟南芥植株包括过表达IbRING转基因拟南芥植株L5、L6、L7、L9与野生型拟南芥(WT)的株系。实验需重复三次，结果取平均值。

结果如图5的B图所示，表明在盐胁迫下，过表达IbRING转基因拟南芥株系L5、L6、L7、L9的SOD活性显著高于野生型拟南芥的SOD活性；在干旱胁迫下，转基因拟南芥株系L5、L6、L7的SOD活性显著高于野生型拟南芥的SOD活性。

(2)丙二醛(MDA)含量的测定

植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，MDA是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度，即MDA的含量越高，植物遭受逆境伤害的程度越大。

用丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司，目录号：MDA-2-Y)来检测拟南芥植株的MDA含量。拟南芥植株为采用上述步骤3中a、b和c处理后获得的拟南芥植株。拟南芥植株包括过表达IbRING转基因拟南芥植株L5、L6、L7、L9与野生型拟南芥(WT)的株系。实验需重复三次，结果取平均值。

结果如图5的B图所示，结果表明，在盐和干旱胁迫下，4个拟南芥转基因株系的MDA含量均极显著低于对照植株。

(3)过氧化氢(H₂O₂)含量测定

植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H₂O₂发生累积。H₂O₂可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。因此，H₂O₂的含量越高，植物遭受逆境伤害的程度越大。

过氧化氢(H₂O₂)试剂盒(苏州科铭生物，目录号：H₂O₂-2-Y)来检测拟南芥植株的H₂O₂积累量。拟南芥植株为采用上述步骤3中a、b和c处理后获得的拟南芥植株。拟南芥植株包括为过表达IbRING转基因拟南芥植株L5、L6、L7、L9与野生型拟南芥(WT)的株系。实验需重复三次，结果取平均值。

结果如图5的B图所示，结果表明，在盐和干旱胁迫下，4个拟南芥转基因株系的H₂O₂含量均极显著低于对照植株。

上述结果表明，过表达IbRING基因可提高拟南芥的抗逆性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.IbRING蛋白或调控所述IbRING蛋白含量或活性的物质的如下任一种或多种的应用：

B1)提高植物耐盐性；

B2)制备提高植物耐盐性的产品；

B3)提高植物耐旱耐性；

B4)制备提高植物耐旱性的产品；

B5)提高盐和/或干旱胁迫条件下植物的发芽率；

B6)制备提高盐和/或旱胁迫条件下植物的发芽率的产品；

B7)提高盐和/或旱胁迫条件下植物的长势；

B8)制备提高盐和/或旱胁迫条件下植物的长势的产品；

B9)增加盐和/或旱胁迫条件下植物的根长；

B10)制备增加盐和/或旱胁迫条件下植物的根长的产品；

B11)提高盐和/或旱胁迫条件下植物的存活率；

B12)制备提高盐和/或旱胁迫条件下植物的存活率的产品；

B13)提高盐和/或旱胁迫条件下植物的SOD酶活性；

B14)制备提高盐和/或旱胁迫条件下植物的SOD酶活性的产品；

B15)降低盐和/或旱胁迫条件下植物的丙二醛含量；

B16)制备降低盐和/或旱胁迫条件下植物的丙二醛含量的产品；

B17)降低盐和/或旱胁迫条件下植物的活性氧含量；

B18)制备降低盐和/或旱胁迫条件下植物的活性氧含量的产品；

所述IbRING蛋白是如下A1、A2或A3的蛋白质：

A1、氨基酸序列是SEQ ID NO.中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的蛋白质；

A2、将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与植物耐盐性和/或抗旱性相关的蛋白质；

A3、在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述IbRING蛋白来源于甘薯。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述调控所述IbRING蛋白含量或活性的物质为与权利要求1所述的IbRING蛋白相关的生物材料；所述生物材料为下述C1-C3中的任一种：

C1、编码权利要求1所述IbRING蛋白的核酸分子；

C2、提高所述蛋白表达的核酸分子；

C3、含有C1或C2所述的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：C1所述核酸分子为编码链的编码序列是SEQ ID No.2第1-1605位的核酸分子。

5.权利要求1中所述的IbRING蛋白。

6.权利要求3或4中所述的IbRING蛋白相关的生物材料。

7.一种增强抗逆性的植物试剂，其特征在于：所述植物试剂的活性成分为促进编码所述IbRING蛋白的基因的表达、提高所述IbRING蛋白的丰度的物质。

8.根据权利要求7所述的植物试剂，其特征在于：所述活性成分为权利要求5所述的蛋白和/或权利要求6所述的生物材料。

9.一种提高植物抗逆性的方法，其特征在于：包括如下步骤：促进受体植物中权利要求5所述IbRING蛋白的表达或提高权利要求5所述IbRING蛋白的丰度，得到抗逆性强于所述受体植物的目的植物。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述促进受体植物中权利要求5所述IbRING蛋白的表达或提高权利要求5所述IbRING蛋白的丰度通过将权利要求5所述IbRING蛋白的编码基因导入所述受体植物实现。

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