KR20030094412A - 폴리뉴클레오티드 서열화 방법 - Google Patents

Abstract

(ⅰ) 지정된 위치에 고정화된 폴리뉴클레오티드 진행반응성 효소를 효소활성을 유도하기에 충분한 조건하에서 표적 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 단계, (ⅱ)효소 및 폴리뉴클레오티드의 상호작용의 결과로서의 효과를 검출하는 단계로, 상기 효과는 비-선형 광학 시그널 또는 비-선형 시그널에 연결된 선형 시그널의 측정에 의해 검출되는 단계를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 서열 결정 방법.

Description

폴리뉴클레오티드 서열화 방법 {Polynucleotide sequencing method}

폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 능력은 인간 게놈에 암호화되어 있는 DNA의 30억개 염기를 지도화하는 인간 게놈 프로젝트에서 본 바와 같이 과학적으로 대단히 중요하다.

대규모 DNA서열 결정에 일반적으로 사용되는 중요한 방법은 사슬 종결 방법(chain termination method)이다. 이 방법은 Sanger 및 Coulson에 의해 최초 개발되었으며(Sangeret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977;74: 5463-5467), 폴리머라제 반응에서 발생 초기의(nascent) 폴리뉴클레오티드 사슬에 병합되는(incorporated) 4개의 뉴클레오시드 트리포스페이트의 디데옥시 유도체의 사용에 의존한다. 병합 후, 디데옥시 유도체들은 폴리머라제 반응을 종결시키고, 그 후 생성물은 겔 전기영동으로 분리되고, 특정 디데옥시 유도체들이 사슬에 병합된 위치를 밝히기 위해 분석된다.

비록 상기 방법이 널리 이용되고 믿을 만한 결과를 제공하지만, 상기 방법은느리고 노동집약적이며 비싸다.

형광 표지는 폴리머라제 반응(WO91/06678 참조)을 이용하는, 성장하는 발생초기의 DNA 분자의 뉴클레오티드 결합을 동정하는 데 이용되어 오고 있다. 그러나, 이 기술들은 형광단(fluorophores)으로부터의 배경 간섭이 증가하는 단점을 갖고 있다. DNA 분자가 성장함에 따라, 배경 '노이즈'가 증가하고 각 뉴클레오티드 결합을 검출하는데 요구되는 시간이 길어진다. 이것은 상기 방법이 큰 뉴클레오티드의 배열에 사용되는 것을 엄격히 제한한다. 그러나, 형광 염료를 둘러싼 폴리뉴클레오티드 서열분석 시스템의 가장 심각한 제한은 광표백(photobleaching)의 문제이다.

광표백은 형광 염료 시스템에서 잘 증명된 현상이며, 염료가 여기 파장(excitation wavelength)에 노출된 결과 나타난다. 모든 염료 시스템은 광표백이 일어나기 전에 제한된 수의 양자를 흡수하는 능력을 갖고 있다. 일단 광표백이 일어나면 형광 염료는 더이상 관찰자에게 보이지 않으므로, 만일 분자에 결합되면(conjugated) 이는 검출될 수 없을 것이다.

그러므로, 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 개선된 방법으로, 서열화된 폴리뉴클레오티드의 비율 및 단편 크기가 상당히 증가하며, 바람직하게는 검출에 형광 표지된 뉴클레오티드에 의존하지 않는 방법이 요구된다. 나아가, 그 방법은 자동화된 과정으로 수행되며, 기존 방법과 관련하여 복잡성과 비용을 감소시킬 수 있어야 한다.

본 발명은 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하기 위한 방법과 관련이 있다.

본 발명은 수반되는 도와 관련하여 설명되는 데:

도 1은 2차 조화파 발생을 이용한 이미지화 시스템의 개략적인 도해이다; 그리고

도 2는 특수한 폴리뉴클레오티드의 병합에서 폴리머라제에 의해 발생된 2차 조화파 시그널을 보여준다.

발명의 요약

본 발명은 효소가 표적 뉴클레오티드와 결합하여 그리고 표적 뉴클레오티드를 따라서 이동할 때 일어나는, 뉴클레오티드 진행반응성(processive) 효소에서의 구조적, 및/또는 질량 및/또는 에너지 분포 변화는 2차 및 3차 조화파 발생(second or third harmonic generation)에 기초한 것을 포함하는 비-선형 광학 이미지화를 이용해 검출될 수 있다.

본발명에 따르면, 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 방법은 하기 단계를 포함한다:

(ⅰ) 지정된(fixed) 위치에 고정화된(immobilised) 폴리뉴클레오티드 진행반응성 효소를, 효소 활성을 위해 충분한 조건하에서 표적 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 단계; 및

(ⅱ) 효소 및 폴리뉴클레오티드의 상호작용의 결과로서의 효과를 검출하는 단계로, 상기 효과는 비-선형 광학 시그널 또는 비-선형 시그널에 연결된 선형 시그널의 측정에 의해 검출되는 단계.

많은 장점이 본 발명에 의해 얻어진다.

서열 결정은 단일 폴리뉴클레오티드 분자의 서열결정 능력으로 소량의 폴리뉴클레오티드로도 이루어질 수 있으므로 서열결정을 개시하기 전에 증폭시킬 필요를 감소시킨다. 긴 서열 해독 길이(sequence read length)를 얻을 수 있고 2차 구조 고려도 줄어든다. 긴 해독 길이를 얻는 것은 컴퓨터를 사용한 광범위한 단편 재조합의 필요성을 없앤다. 나아가, 발명이 형광적으로 표지된 뉴클레오티드나 어떤 형광의 측정에 대한 필요에 의존하지 않기 때문에, 광표백 또는 다른 예측불가능한 형광 효과의 기능으로 단일 분자 수준에서 해독 길이의 제한이 피해진다. 본발명은 또한 동일한 효소 시스템에 의해 순차적으로 읽어지는 긴 폴리뉴클레오티드 단편을 가능케 한다. 이는 재생되고 재사용되어 많은 다른 폴리뉴클레오티드 주형(template) 서열을 결정되게 하는 단일 효소 시스템이 사용되도록 한다는 이점을 갖고 있다. 마지막으로, 2차 또는 3차 조화파 발생의 이용은 광손상 및 광표백이 없다는 장점을 제공한다. 이는 비-공명 방사선에 의해 유도된 시그널이 한정된 수명을 갖는 여기 상태와 관계되지 않기 때문에, 심지어 초점면(focal plane)에서도 어떤 광화학 반응도 일어나지 않는 사실에 기인한 것이다.

본 발명의 두번째 국면에 의하면, 고형 지지 물질은 적어도 하나의 폴리머라제 및 폴리머라제 상에 또는 인접하여 위치하는 적어도 하나의 2극성(dipolar) 분자를 포함한다.

본 발명의 세번째 국면에 의하면, 비-선형 광학 시그널을 검출하기 위해 셋업된 이미지화 시스템은 폴리뉴클레오티드와 상호작용하는 효소위에 고정화된 고형 지지체와 상기 효소 위에 또는 인접하여 위치하는 2극성 분자를 포함한다.

본 발명은 폴리뉴클레오티드 진행반응성 (processive) 효소가 표적 뉴클레오티드 상의 개개의 염기와 반응하거나 발생 초기의 폴리뉴클레오티드 분자에 뉴클레오티드를 병합할 때 구조적, 및/또는 질량 및/또는 에너지 분포 변화 발생을 동정하기 위한 통상적인 비-선형 광학 측정법을 이용한다.

이미징 분자에 대한 비-선형 광학 방법의 이용은 알려져 있다. 인정되어 오지 않은 것은 이 방법들이 고정화되거나 지정된(fixed) 효소를 이용한 폴리뉴클레오티드의 서열 결정에 적용될 수 있다는 것이다.

다른 구현례에서는, 선형 시그널이 비-선형 시그널에 더하여 만들어지고 선형 시그널이 검출된다. 두 시그널은 연결되어 증대된 검출에 이른다고 말해진다.

본 명세서에서 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 넓게 해석되며, 변형된 DNA 및 RNA, DNA/RNA 하이브리드를 포함하는 DNA 및 RNA 뿐만 아니라, 예를 들어 펩티드 핵산(peptide nucleic acid, PNA) 같은 다른 하이브리드하는(hybridising) 핵산-유사 물질들을 포함한다.

본 명세서에서 "폴리뉴클레오티드 진행반응성 효소(polynucleotide processive enzyme)"는 넓게 해석되며, 폴리뉴클레오티드와 상호작용하고 폴리뉴클레오티드를 따라 연속적으로 이동하는 어떤 효소에 관한 것이다. 효소는 바람직하게는 폴리머라제 효소이며 어떤 알려진 형태도 될 수 있다. 예를 들어, 폴리머라제는 어떤 DNA-의존 DNA 폴리머라제가 될 수 있다. 만일 표적 폴리뉴클레오티드가 RNA 분자라면, 폴리머라제는 RNA-의존 DNA 폴리머라제, 즉 역전사효소, 또는 RNA-의존 RNA 폴리머라제, 즉 RNA 복제효소가 될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 폴리머라제는 T4 폴리머라제이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 폴리머라제는E. Coli폴리머라제 III 홀로엔자임 (McHenry, Ann. Rev. Biochem, 1988; 57: 519); T7 폴리머라제 (Schwageret al., Methods in Molecular and Cellular Biology, 1989/90; 1(4) :155-159) 또는E. coli티오레독신(Thioredoxin)과 복합된 박테리오파지 T7 유전자 5 폴리머라제 (Taboret al., J. Biol. Chem., 1987; 262: 1612-1623)이다. 이들 폴리머라제 효소들 각각은 대단히 진행반응성 높(고 충실하)게 표적 폴리뉴클레오티드와 결합하므로 심지어 중합반응이 활발히 일어나지 않을 때에도 폴리머라제-폴리뉴클레오티드 복합체를 유지한다.

폴리뉴클레오티드와 상호작용하는 다른 효소들은 헬리카제(helicase), 프리마제(primase), 홀로엔자임, 토포아이소머라제 또는 기라제(gyrase) 효소를 포함한다. 이러한 효소들은 또 다른 장점을 제공한다. 예를 들어 헬리카제를 이용하는 것은 헬리카제들이 그들의 자연 환경 내에서 이들 구조들을 만나고 극복하므로, 폴리뉴클레오티드 분자 내에 존재하는 2차 구조의 문제를 감소시킨다. 다음으로, 헬리카제는 필수적인 반응들이 실온에서 이중 나선 DNA상에서 수행될 수 있도록 한다.

효소가 폴리뉴클레오티드에서 연속적인 염기들과 상호작용하므로, 그 구조(conformation)는 만나게 되는 표적에서 염기 (또는 뉴클레오티드)에 따라 변할 것이다. 따라서, 반응하는 동안 염기쌍 첨가의 시간 순서가 핵산의 단일 분자에 대해 측정된다. 즉 서열 결정되는 주형 폴리뉴클레오티드에 대한 효소 시스템의 활성이 실시간으로 주시된다. 서열은 어떤 염기 (뉴클레오티드)가 효소의 촉매적 활성을 통해 표적 폴리뉴클레오티드의 성장하는 상보적 가닥에 병합되어지는지를 동정함으로써 추론된다.

본 발명의 중요한 국면은 이미지화 시스템에 관련된 지정된 위치에서의 효소의 고정화이다. 이는 바람직하게는 효소가 그 생물학적 활성을 보유하면서, 효소를 고형 지지체에 고정화함으로써 수행된다. 고형 지지체에 대해 적절한 효소의 고정화 방법은 알려져 있다. 예를 들어, WO-A-99/05315에서는 고형 지지체에 폴리머라제 효소의 고정화를 기술하고 있다. 지지체에 단백질을 고정화하기 위한 일반적인 방법들이 적당하다.

본 발명에 사용된 광학적 검출 방법은 단일 분자 수준에서 이미지하도록, 즉 하나의 효소에 대한 분명한 이미지/시그널을 발생시키도록 의도된 것이다. 대다수 효소들은 단일 효소 분해능을 가능토록 하는 밀도에서 고형 지지체에 고정화된다. 그러므로, 한 구현예에서, 하나의 고형 지지체 상에 고정화된 다수의 효소들이 있으며, 본 발명의 방법은 이들 상에서 동시에 진행될 수 있다. 이는 다른 폴리뉴클레오티드 분자들이 함께 서열결정되도록 한다.

당업자가 효소 활성을 증진시키기 위해 적절한 조건 하에서 이미지화 방법을 수행하는 것은 자명할 것이다. 예를 들어 폴리머라제 효소와 관련하여, 폴리머라제 반응이 진행되기 위해 필요한 다른 성분들도 요구될 것이다. 이 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 프라이머 분자 및 각 뉴클레오시드 트리포스페이트 dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP가 요구될 것이다. 뉴클레오시드 트리포스페이트는 다음 뉴클레오시드 트리포스페이트의 도입 전에 비-결합 뉴클레오티드를 제거하면서, 연속적으로 첨가될 수 있다. 대신으로, 모든 트리포스페이트가 동시에 존재할 수도 있다. 펄스된 단색광에 의해 선택적으로 제거됨으로써 비-조절된 병합을 방지하는 1종 이상의 차단기(blocking group)을 갖는 트리포스페이트를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 적절한 차단된 트리포스페이트들은 WO-A-99/05315에 개시되어 있다.

고-분해능 비-선형 광학적 이미지화 시스템은 기술분야에서 알려져 있다. 일반적으로, 물질에 대한 비-선형 편광(polarisation)은 다음과 같이 표현될 수 있다:

P=X⁽¹⁾E¹+ X⁽²⁾E²+ X⁽³⁾E³+ .....

상기에서 P는 유도된 편광, X⁽ⁿ⁾은 n-차 비-선형 감수율(susceptibility)이고, E는 전기장이다. 첫 항(term)은 정상 흡수 및 빛의 반사를 설명하고; 두번째는 2차 조화파 발생(SHG), 합 및 차 주파수 발생(sum and difference frequency generation)을 설명하고; 세번째는 광 산란, 유도 라만 과정(stimulated Raman processes), 3차 조화파 발생(TGH), 및 2차- 및 3차- 양자(photon) 흡수 둘다를 설명한다.

본 발명의 바람직한 이미지화 시스템은 2차 또는 3차 조화파 발생으로부터 야기되는 시그널의 검출에 좌우된다.

2차 또는 3차 조화파 발생 (이하,SHG라 함)을 이용한 단일-분자 분해능은 당해 기술분야에서 알려져 있다(Peleget al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999; 95: 6700-6704 및 Peleget al., Bioimaging, 1996; 4: 215-224).

이미지화 시스템의 일반적인 셋업(set-up)은 Peleget al., 1996,supra에서 기재된 대로 및 도 1에 나타난 대로 일 수 있다. 도 1에 관하여, 레이저(1)가 그 후 편광기(polarizer, 2)를 통과하게 되는 레이저 빔을 발생시키는 광원으로 이용된다. 레이저 빔의 일부는 레이저 빔의 정렬을 보조하는 그린 빔(green beam)을 만들기 위해 비-선형 크리스탈(crystal, 3)을 통해 향하게 될 수 있다. 광다이오드(4)는 발생된 근-적외선(NIR) 강도를 모니터하는 수단을 제공하기 위해 광행로에아주 근접하여 위치된다. 필터(5)는 2차 조화파가 현미경으로 들어가는 것을 방지하기 위해 현미경의 입구 포트 (entrance port) 앞에 위치된다. 레이저 빔은 고정화된 효소를 포함하는 고형 지지체에 촛점맞춰 지고, 비-선형 시그널은 렌즈들(7)에 의해 모아지며 단색화분광기(monochromator, 8)를 이용해 검출된다. 기본 강도(fundamental intensity)는 IR 필터를 이용해 차단된다. 광전자증배기 (photomultiplier)로 부터의 시그널은 박스카 평균기 (boxcar averager) 및 채널 적분기(channel integrator, 9)에 의해 증폭되고, 평균되고, 적분된다. 그 후 발생된 시그널은 이미지를 발생하기 위해 컴퓨터(10)로 옮겨진다.

2차 또는 3차 조화파를 발생시키기 위해, 적절한 표지를 고정화된 효소 위 또는 아주 근접하게 위치시키는 것이 필수적이다 (Lewiset al., Chem. Phys., 1999; 245; 133-144). 적절한 분자의 예는 염료, 특히 (Molecular Probes에 의해 공급되는 막(membrane) 염료 JPW 1259 같은) 스티릴(styryl) 염료들이다. 녹색 형광 단백질 (Green Fluorescent Protein, GFP)은 SHG를 통한 이미지에 이용될 수 있는 "염료" 또는 "표지"의 다른 예이다. 본 명세서에 사용된 대로, GFP는 야생형 단백질 및 그것의 분광적으로 이동된 변이 둘다를 말한다 (Tsien, Ann. Rev. Biochem., 1998; 67; 509 및 US 5,777,079 및 US 5,625,048). 다른 적절한 염료는 di-4-ANEPPS, di-8-ANEPPS 및 JPW2080(Molecular Probes)을 포함한다.

2극성 분자들은 폴리뉴클레오티드의 각각의 염기 상에 (또는 2극성 분자가 뉴클레오시드 트리포스페이트에 붙어있거나 폴리머라제 반응에 이용된다면 그 상보체(complement)에) 위치할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 효소, 예를 들어 폴리머라제는 GFP와 재조합 융합으로 만들어진다. GFP는 효소의 N- 또는 C- 말단 (C-말단은 폴리머라제가 "활주 클램프 (sliding clamp)"와 함께 사용된다면 바람직하다)에 위치될 수 있다. 대신으로, GFP 분자는 효소 활성이 보유된다면, 효소 내 어디에도 위치될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, 비-선형 광학적 이미지화 시스템은 라만 분광광도법 (Raman Spectroscopy) 또는 표면 증강 라만 분광광도법 (surface enhanced Raman spectroscopy, SERS)이다. 라만 분광광도법의 개관은 McGilp, Progress in Surface Science, 1995; 49(1): 1-106에 포함되어 있다.

라만 시스템을 여기시키기 위해 사용된 광방사(optical radiation)는 바람직하게는 근적외선 방사(NIR)이다. NIR 여기는 형광 및 배경 매체 또는 용매의 라만 시그널을 감소시키는 장점을 갖고 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, 비-선형 시그널은 금속 나노입자 및/또는 거칠게 된 금속 표면을 이용함으로써 증강시킬 수 있다(Boyedet al.,Phys Rev., 1984; B. 30: 519-526, Chenet al., Phys. Rev. Lett., 1981; 46: 1010-1012 및 Peleget al., 1996,supra). 시그널 증대 금속 나노입자는 효소에 결합되거나(예: 나노입자 결합된 항체로, Lewiset al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999; 96: 6700-6704), 고정화/국부화(localized)된 효소 근처에 고정화되거나 SHG염료/효소에 매우 근접하게 옮겨질 수 있다.

금속 나노입자는 특히 나노미터 영역으로부터의 SHG와 관련한 분광광도적 이미지화를 증대시킴으로써 단일 분자 수준에서 향상된 이미징을 제공한다. 라만 산란에 기초한 분광광도적 이미지화는 또한 금속 나노입자를 이용하여 향상될 수도 있다. 적절한 금속 나노입자들이 알려져 있으며 금 및 은 나노입자를 포함한다. 나노입자들은 일반적으로 직경 5nm~100nm이며, 바람직하게는 10nm~60nm이다. 나노입자들은 폴리뉴클레오티드에 (또는 만일 나노입자들이 뉴클레오시드 트리포스페이트에 결합되고 폴리머라제 반응에 이용된다면 그 상보체에) 결합될 수 있다.

거칠게 된 금속 표면은 또한 SHG 과정의 감도(sensitivity)를 향상시키는 것으로 알려져오고 있으며(Chenet al.,1981,supraand Peleget al.,1996,supra) 또한 SERS를 위해 요구된다. 금속 표면은 일반적으로 은 또는 다른 노벨(nobel) 금속이다. 서브-파장 공간 분해능(sub-wavelength spatial resolution)에서 금속 표면의 초기 선택적 변형은 원자력 현미경(atomic force microscopy, AFM)의 이용을 포함하는 다양한 기술을 이용해 수행될 수 있다. 백금-코팅된 AFM 팁(tip)이 더 파생화(derivatisation)를 받기 쉬운 아미노기에 말단 아지드(azide)의 수소화를 촉매하는 데 이용될 수 있다(Mulleret al., Science, 1995; 268: 272-273). 그 후 효소들은 고 국부장(local field)이 광학적 모드가 국부화되어 있는 부분에 위치하는 "열점(hot spots)"에 위치될 수 있다 (Shalaevet al., Phys. Rep., 1996; 272:61)

본 발명의 다른 구현예에서, 나노 입자는 AFM 캔티레버(cantilever) 팁/탐침을 이용하여 효소에 매우 근접하게 가져갈 수 있으며, 이로 인해 비-선형 시그널을 증강시킨다.

AFM은 최근 단백질 구조 변화의 동적 이미지화에 적용할 수 있는 시간 분해능 및 감도를 가질 수 있는 것으로 알려져 오고 있다 (Roussoet al., J. Struc. Biol., 1997; 119: 158-164). 이는 본 발명의 바람직한 구현예에서 이용되는 데, AFM 탐침/팁은 효소 위에 위치하며, 비-선형 광학 정보 (예:SHG)와 함께, 효소가 표적 폴리뉴클레오티드를 따라 이동하므로 효소와 뉴클레오티드 서열 사이의 상호작용으로 인한 단백질의 구조적 변화를 검출하는 데 이용된다. 그 정보는 통상적인 공초점 광학(confocal optics)을 이용해서 원장(far-field)에서, 또는 내부 전 반사(total internal reflection)와 관련하여 사용된다면 반사 모드에서 모아질 수 있다.

다른 구현예에서, 비-선형 시그널(예:SHG)은 근접장 주사 광학 현미경 (Near-Field Scanning Optical Microscopy, NSOM)을 이용하여 근접장(near field)에서 모니터 된다. NSOM은 공간적으로 분해된(resolved) 광학적 정보를 얻기 위해 (AFM에서 사용되는 대로의) 나노스코픽(nanoscopic) 팁과 샘플 사이의 광학적 상호작용을 이용한 주사탐침현미경(scanning probe microsropy)의 한 형태이다. SHG와 공동으로의 근접장 현미경은 광범위하게 연구되며 원자 단계에서 표면 민감한 것으로 알려져 있다(McGilp, 1995,supra). 이미지화 시스템의 일부로 NSOM을 이용하는 주된 장점은 서브-파장 차원에서 분해능의 큰 증가를 가져온다는 것이다. 본 발명은 단일 효소, 예를 들어 폴리머라제 효소의 구조 모니터링에 관한 것이므로, 폴리뉴클레오티드와 상호작용할 때, 서브-파장 공간 분해능은 대단히 바람직하다. 본 발명의 이러한 국면의 관계에 있어서, 어퍼쳐리스(apertureless) 근접장 주사 현미경으로 AFM 캔티레버 팁이 이용되는 것이 바람직하다(Sangohdaret al., J.Opt. A: Pure Appl. Opt., 1999; 523-530). 이는 국부장(local field) 증강원으로 금속 나노입자를 사용하는 것과 비슷하다. 팁은 노벨 금속 또는 국부 전자기장을 증가시키도록 작용하는 금속으로 만들어지거나 코팅되는 것이 바람직하다. 대신, 금속 나노입자가 캔티레버 팁에 직접 연결될 수도 있다. 이는 이미 단일 분자 수준에서 구조적 변화를 모니터링하는 데 적용될 수 있다고 알려져 있다(Rousso,et al. supra).

본 발명의 다른 별도의 구현예에서, 독립적으로 발생된 표면 플라즈몬 (또는 전자기파, polariton)/에버네센트 장(evanescent field)이 비-선형 시그널의 시그널 대 노이즈 비(signal-to-noise ratio)를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 에버네센트파 증대된 이미지화 기술(evanescent wave enhanced imaging technique)은 예를 들어 SHG 이미징 단독 보다 더 큰 시그널 대 노이즈 비를 갖는다. 본 구현예에서, 표지된 효소로 부터의 에버네센트하게 증대된 SHG 필드 시그널은 동시에 AFM 구조적 자료를 얻는 동안 NSOM 섬유(fibre)에 의해 근접장에서 모아질 수 있으며, 동시에 흡수된 에버네센트 방사의 양이 에버네센트 장 및 표지된 폴리머라제/SHG 장 사이의 결합의 양에 대한 정보를 얻는 데 모니터될 수 있다.

본 구성(NSOM 컬렉션 모드)에서 시스템은 광자 주사 터널링 현미경(photon scanning tunnelling microscope)으로 작동하며, 에버네센트 또는 표면 플라즈몬 필드는 NSOM 섬유 탐침 팁에 연결된다. 폴리머라제에 의해 팁에 도달하는 시그널의 장 세기(field strength)에서 감쇠(attenuation)가 팁 말단에 위치한 검출기를 통해 모니터될 수 있다.

표면 플라즈몬 공명은 당해 기술분야에 알려져 있고, 입사(incident) 광빔을 프리즘에 적용함으로써 에버네센트 파의 발생에 의존한다. 본 구현예에서 이용을 위한 전형적인 셋업은 효소가 그 위에 고정화된 금속 코팅된 유리 커버슬립 (coverslip)에 광학적으로 연결된 프리즘으로 구성된다. 커버슬립은 고정화된 효소에로 리간드(뉴클레오타이드)를 도입하기 위한 입구를 갖는 마이크로유동 플로우 셀 시스템(microfluidic flow cell system)의 일부이다. 효소는 또한 비-선형 효과가 발생되도록 하기 위해 표지화된다. 입사 광 빔은 표면 플라즈몬 필드를 발생하기 위해 프리즘에 적용된다. 동시에, 비-선형 시그널 (예:2차 조화파 장)은 편광기 및 반파장판(half wave plate)을 통한 펄스된 근 적외선 레이저를 광학적 2차 조화 노이즈를 제거하기 위해 필터를 통한 빔 컨트롤을 위한 광학적 스캐너로 향하게 한 후 샘플로 보냄으로써 발생된다. 비-선형 광학 시그널은 렌즈 및 필터로 모아졌고, 단색화분광기로 보내지고, 검출을 위해 광전자증배관을 통하고 난 후 증폭되고 컴퓨터 시스템을 통해 기록된다.

비-선형 광학이 에버네센트 장을 발생시키는 것과 연결될 때, 검출된 시그널은 또한 선형(에버네센트) 시그널이 될 수 있다. 본 구현예에서, NSOM은 선형 시그널을 검출하기 위해 만들어진 컬렉션(collection)에 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 국면에서는, 폴리뉴클레오티드 서열결정은 세포 내에서 수행될 수 있다.

자연의 세포 환경 내에서, DNA 폴리머라제 및 그 관련된 레플리좀 (replisome) 복합체는 세포 내 장소에 고정된다 (또는 장소에 국부화된다)(Newportet al., Curr. Opin. Cell Biol., 1996; 8: 365; 및 Lemonet al., Science, 1998; 282: 1516-1519). 이 자연의 고정된 복제 복합체는 고형 지지체에의 효소의 고정화와 유사하다.

이는 DNA 복제 및/또는 세포 분열 동안 실시간으로 수행되는 단일 분자 수준에서 레플리좀-관련 분자들의 구조적 및 주형 염기서열-관련 변화의 생체내 모니터링을 가능하게 한다.

본 국면을 수행하기 위해, 비-선형 광학 검출 기술을 이용해 이미지화 될 수 있도록 하기 위해 효소를 변형하는 것이 필수적이다. 이는 예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP)과 효소를 유전자적으로 융합시킴으로써 얻어질 수 있다. 세포도 또한 검출이 일어나도록 하기 위해서는 고정화되어야 한다.

발현된 융합 단백질은 비-선형 광학 검출(2차 조화파 발생)의 적용을 통해 그것의 고정된 세포 위치에서 모니터될/검출될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 예증한다.

본 실험에서, 녹색 형광 단백질(GFP)과 폴리머라제의 융합 단백질은 당해 기술분야에서 잘 알려진 재조합 기술을 통해 만들었다.

수정 칩(Quartz chip, 직경 14mm, 두께 0.3mm)은 50nm두께의 금 층으로 스핀-코팅한 후 평면 덱스트란 층으로 코팅하였다. 그 후 이 금 코팅된 수정 칩을 주문 생산된 근접장 주사 광학 현미경(NSOM)의 플루이드 셀로 도입시켰다. 금-코팅된 수정 칩은 굴절률 결합유(index matching oil)를 통해 수정 프리즘에 광학적으로 연결시켰다. 그 후 플루이드 셀을 밀봉한 후 폴리머라제 완충액이 칩 위에 흐르도록 하였다.

칩 표면에 대한 폴리머라제의 고정화를 Jonssonet al., Biotechniques, 1991; 11: 620-627에 따라 수행하였다. 칩 환경은 러닝 완충액(10mM hepes, 10mM MgCl₂150mM NaCl, 0.05% surfactant P20, pH 7.4)로 평형을 유지하였다. N-히드록시숙신이미드 (물 중에 0.1M) 및 N-에틸-N'-(디메틸아미노프로필)카르보이미드 (EDC)(물 중에 0.1M) 동일 부피를 함께 혼합하고, 카르복시메틸화된 덱스트란을 활성화하기 위해, 칩 표면을 거쳐 주입하였다. 폴리머라제-GFP 융합 단백질(150㎕)을 10mM 초산 나트륨 (100㎕, pH5)와 혼합하고 활성화된 표면을 거쳐 주입하였다. 마지막으로 잔여의 팁 표면의 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 에탄올아민 (35㎕, 물 중에 1M, pH 8.5)과 반응시키고 비결합 폴리머라제를 표면으로부터 세척했다. 고정화 과정을 25℃에서 러닝 완충액(5㎕/분)의 연속적인 흐름으로 실시하였다.

항체 결합 완충액 50㎕(10mM MES pH6.0, 150mM NaCl, 3mM EDTA)를 25℃에서5㎕/분의 속도로 칩 표면에서 고정화된 폴리머라제/GFP 위로 흘려보냈다. 1차 항체 (GFP (B-2)B 비오틴 결합된, 200㎕ ml-1, Santa Cruz Biotechnology)를 항체 결합 완충액 중에 1: 3000으로 희석하고 30분간 5㎕/분의 유속으로 칩 표면에 흘려보냈다. 그 후 과량의 항체는 30분간 5㎕/분의 유속으로 칩에 항체 결합 완충액을 흘려보냄으로써 표면을 세척하였다 .

2차 항체 (면역금이 결합된(immunogold conjugated) EM 염소 항마우스 IgG (H+L) 40nm, British Biocell International)로 항체 결합 완충액 중에서 1:1000으로 희석하고, 30분간 5㎕/분의 유속으로 칩에 흘려보냈다. 그 후 과량의 항체는 30분간 5㎕/분의 유속으로 칩에 항체 결합 완충액을 흘려보냄으로써 표면을 세척하였다 . 그 후 완충액은 러닝 완충액으로 돌려보낸 후 다음 단계를 개시하기에 앞서 30분간 5㎕/분의 유속으로 칩에 흘려보냈다.

두 올리고뉴클레오티드를 표준 포스포라미디트 화학(phosphoramidite chemistry)을 이용해 합성하였다. SEQ ID NO.1로 정의되는 올리고뉴클레오티드를 표적 폴리뉴클레오티드로 이용하였고, SEQ ID NO. 2로 정의되는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로는 이용하였다.

SEQ ID NO. 1

SEQ ID NO. 2

두 올리고뉴클레오티드를 표적-프라이머 복합체를 형성하기 위해서 하이브리드 조건 하에 반응시켰다. 그 후 프라임화된(primed) DNA를, 프라이머 DNA 주위에 활주 클램프 복합체를 형성하는 β-서브유니트 150㎕를 포함하는 완충액(20mM Tris-HCl, pH 7.5, 8mM MgCl₂, 4% (v/v) 글리세롤, 5mM 디티오트레이톨(DDT)에 현탁시켰다. 이 과정은 개시전(pre-initiation) 과정으로 알려져 있다.

폴리머라제의 구조적 변화를 검출하기 위해, 탭핑 모드 (tapping mode)에서, 뽑아진(pulled) 수정 멀티 모드 100㎛ 긴 섬유 캔티레버로, 변형된 NSOM을 이용하였다. 캔티레버는 그 공명 주파수 근처로 움직였고, 초기 영역 주사(initial area scan)를 고정화된 항체를 포함하는 칩의 표면에서 수행하였다. 2차 조화파 시그널을 펄스된 근적외선 레이저원으로부터 초기 방사를 통해 플로우 셀에서 고정화된 폴리머라제로부터 발생시켰다. 그 후 NSOM 팁을 폴리머라제와 관련된 플로우 셀에서 40nm 금 입자의 이미지를 얻기 위해 플로우 셀에서 칩 표면위에 주사하였다. 그 후 팁은 폴리머라제 상에 고정된 상태로 두었다.

그 후 개시전(pre-initiated) 프라임화되기전(pre-primed) 복합체를 프라이머-주형 분자 주위에 "클램프"가 고정화된 폴리머라제와 복합체를 형성하도록 하기 위해 5㎕/분의 유속으로 플로우 셀로 주입하였다. 플로우 셀은 플로우 셀 내에 있는 냉각 장치로 25℃를 유지하였다.

그 후 러닝 버퍼를 연속적으로 500㎕/분의 유속으로 플로우 셀을 통해 씻어보냈다. 10분 후 서열 결정 반응을 0.4mM dATP(8㎕)를 완충액에 500㎕/분의 유속으로 주입하여 개시하였다. 4분 후에 0.4mM dTTP(8㎕)를 플로우 셀에 주입하였다. 그 후 또 4분 후에 0.4mM dGTP(8㎕)를 주입하고, 또 4분 후에 0.4mM dCTP(8㎕)를 주입하였다. 그 후 본 싸이클을 10회 반복하였다. 전 시간에 걸쳐 멀티모드 섬유를 통해 전달된 2차 조화파 시그널을 단색화분광기로 통과시킨 후 광전자증배기를 통과시켰다. 그 후 광전자증배기로부터의 시그널을 증폭시키고 처리 및 저장을 위해 컴퓨터로 보냈다.

그 후 각 주입의 시작으로 부터 10초 동안 폴리머라제 복합체로 부터 발생한 2차 조화파 시그널의 강도 변화를 계산하고 플로우 셀로 주입된 뉴클레오티드에 대해 플롯하였다.

서열결정 반응의 결과를 도2에 나타내었다. 그래프에서 보는 바와 같이 큰 강도 변화 (각각에 인접한 동일한 뉴클레오티드를 설명하는 큰 강도 변화)는 SEQ ID NO. 1의 그것의 상보체에 상응한다 (프라이머 서열에 하이브리드 하는 부분을 빼며, 오른쪽에서 왼쪽으로 읽음).

Claims (25)

1. 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 방법으로, 하기의 단계:

   (ⅰ) 지정된 위치에 고정화된 폴리뉴클레오티드 진행반응성(processive) 효소를 효소활성을 유도하기에 충분한 조건하에서, 표적 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 단계;

   (ⅱ) 효소 및 폴리뉴클레오티드의 상호작용의 결과로 일어나는 효과를 검출하는 단계로 이루어지고,

   상기 효과는 비-선형 광학 시그날 또는 비-선형 시그날에 연결된 선형 시그날의 측정에 의해 검출되는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 효과는 비-선형 시그날의 측정에 의해 검출되는 방법.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 비-선형 광학적 검출은 2차 또는 3차 조화파 발생 이미지화(second or third harmonic generaton imaging)인 방법.
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 비-선형 광학 검출은 라만 분광광도법 또는 표면 증강 라만 분광광도법인 방법.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2극성 분자는 효소 상에 또는 효소에 근접하여 위치하는 방법.
6. 제 5항에 있어서, 상기 분자는 스티릴 염료 분자인 방법.
7. 제 5항에 있어서, 상기 분자는 녹색 형광 단백질인 방법.
8. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 상기 2극성 분자는 폴리뉴클레오티드의 개별적인 염기에 부착되는 방법.
9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 폴리머라제인 방법.
10. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 헬리카제 또는 프리마제 효소인 방법.
11. 제 10항에 있어서, 상기 단계 (ⅰ)은 뉴클레오시드 트리포스페이트 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP의 첨가를 포함하는 방법.
12. 제 11항에 있어서, 상기 뉴클레오시드 트리포스페이트는 펄스된 단색광에 의해 선택적으로 제거될 수 있는 하나 이상의 차단기를 포함하는 방법.
13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금속 나노입자는 효소 상에 또는 효소에 근접하여 위치하는 방법.
14. 제 13항에 있어서, 상기 나노입자는 금 또는 은 나노입자인 방법.
15. 제 13항 또는 제 14항에 있어서, 상기 나노입자는 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 개별적인 염기에 병합되어 있는 방법.
16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 고형 지지체에 고정화되어 있는 방법.
17. 제 16항에 있어서, 고형 지지체에 고정화된 복수의 효소가 존재하는 방법.
18. 제 16항 또는 제 17항에 있어서, 상기 고형 지지체는 거칠게 된 금속 표면을 갖는 방법.
19. 제 16항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지지체는 은 또는 금인 방법.
20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출은 원자력 현미경 또는 근접장 주사 광학 현미경과 결부되어 실행되는 방법.
21. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 국지화된 표면 플라즈몬 공명의 적용을 추가로 포함하는 방법.
22. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 세포 안에서의 지정된 위치에 고정화되는 방법.
23. 하나 이상의 고정화된 폴리머라제와 폴리머라제 상에 또는 폴리머라제에 근접하여 위치한 하나 이상의 2극성 분자를 포함하는 고형 지지체 물질.
24. 그 위에 고정된 세포를 포함하고, 상기 세포는 세포안에서의 지정된 위치에서 유지되는 폴리머라제 효소를 포함하는 고형 지지체 물질.
25. 그 위에 폴리뉴클레오티드와 상호작용하는 고정화된, 효소 및 효소 상에 또는 효소에 근접하여 위치한 2극성 분자를 갖는 고형 지지체를 포함하는 비-선형 광학 시그날을 검출하기 위해 셋업된 이미지화 시스템.