CN110511991A - 大规模dna芯片技术 - Google Patents

Abstract

一种大规模DNA芯片技术。基于分子生物分析技术、纳米材料和电镜扫描等技术相结合对DNA、RNA和其他生物分子碱基序列直接检测方法。其主要原理是利用dNTP即脱氧核苷酸三磷酸碱基单体与金属银Ag纳米粒子进行吸附使两种粒子互相耦合，四种不同碱基先后分别直接与被测DNA样板片段的碱基杂交，对每次杂交反应测试的结果可直接读出纳米粒子出现的位置和顺序，然后由电镜扫描的结果通过计算机分析处理，得到DNA或RNA片段上碱基位置和出现的顺序。特点是检测通量大，一次可快速检测几百万或几千万的位点，测序时读长的长度取决于其被测片段的大小，这使得可以测序非常长的全长转录本。可以使测序具有高效率、高准确率和低成本。

Description

大规模DNA芯片技术

本发明专利涉及生物基因芯片即一种DNA和RNA测序芯片技术，具体为一种大规模DNA芯片。

背景技术

DNA分子是生物和动植物的重要生物形态表现物质，它包含了重要遗传信息，是现代生命科学、分子生物学和遗传基因工程等能够检测、分析、病理检测、以及制药等提供关键信息。高效准确测定DNA分子碱基序列，特别是精准、高通量检测DNA中的碱基序列变化，具有重要现实意义，同时也具有临床、病理及药理等实际应用价值，以及基因工程中不可或缺的重要工具。

目前DNA分子或RNA分子测序已经发展有三代DNA芯片技术，这些现有测定DNA 或RNA序列的技术方法：其主要原理是用生成探针(Probe)、碱基(Base)的杂交配对、以及荧光标记显示等进行DNA碱基序列的检测。这些技术手段和方法都有其缺陷和局限性，体现在检测周期长，效率很低，成本昂贵，各种技术方案都无法在市场大规模推广和普及，更重要的是，序列检测的准确性不高，特别是对已知DNA或RNA序列进行验证性重复检测的一致性和准确率更低。而且目前的技术方法和技术手段都属于DNA序列非直接检测的方式，就不可避免会出现准确率不高，成本过高和检测周期长等弊端。

第一代至第三代DNA测序方法，主要存在的一些缺陷在于技术复杂成本昂贵，检测灵敏度较低，重复性差，分析范围较狭窄，无法进行高通量检测。

用合成寡核苷酸序列以及原位合成技术在作为基板芯片上生成探针的检测方式，主要弊病和缺陷是探针灵敏性(Sensitivity)和特异性(Specificity)，以及不可避免地会出现非特异性杂交干扰结果，另外，基于考虑GC含量以及退火反应温度，无法保证整个芯片、或全部的芯片可以在相同条件下进行的杂交实验，造成检测结果准确率低，误差较大且成本高。

受上述这些检测方式的局限性，新的DNA序列检测技术正在被开发应用，其与已经存在的三代DNA芯片技术和路线相比，最大和最明显的特征是开始采用直接测序的方式，即不需要在测试芯片上生成探针，不需要使用PCR方式，也不需要涉及到使用引物(Primer)等一系列复杂且难以保证检测精度，特别是可以完全不需要使用荧光标记显示其检测结果，这也是前三代技术通用的方法。

本发明是一种DNA，RNA或其他生物分子的碱基序列直接检测技术，属于高通量测序技术 (High-Throughput Sequencing)。主要原理是利用dNTP即脱氧核苷酸三磷酸单体与银纳米粒子进行吸附结合即两种粒子相耦合结合在一起，基于碱基互补配对原理，通过直接与被测 DNA样板片段的碱基配对，从银纳米粒子在最终检测结果中的先后顺序和位置进行碱基读序，实现DNA的序列检测和分析。

这种DNA和RNA直接测序技术，是一项技术上领先、检测结果准确可靠、经济上有成本优势，且非常有前景和市场的新技术，除包含有通常的DNA和RNA测序和其他一些蛋白质生物分析等基本功能外，可以一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长，还可以用来研究全长异构体，等位基因特异性表达，poly-A尾长度估算，当然也可以用来研究RNA修饰和编辑等。

本发明主要的一些特点就是：高效率，高准确率，低成本，简便易于操作，能够产生超长读长，而且可以对全长转录本进行测序。本发明专利四个单体核苷酸碱基A、C、G、和 T，分别进行四次杂交反应，每进行一次的结果系统进行银纳米粒子的位置记录也同步进行，四次杂交反应结束，各碱基位置和测序也就即刻得到确定。

采用本发明的技术每次进行DNA或RNA测序时，读长的长度仅仅取决于取样并固化在基板上的DNA或RNA片段的大小，这就使得本发明可以测序非常长的全长转录本成为可以实现的手段。根据测算直接RNA测序可以处理的最长转录本长度能够超过40kb或者更多。同样，对全长cDNA完全可以作为单个的片段进行测序，从时间、效率和成本上有效地大幅度减少了几种传统方法的后续多位点比对中的问题，以及荧光标记显示分析时光谱所造成的准确率问题等。可以对DNA或RNA从10Mb到1Gb以上的高精确度序列测定。

发明内容

本发明主要内容和目的是针对目前已有的三代DNA和RNA序列检测技术存在的上述问题和缺陷从而开发一种新的DNA测序技术并提供有效解决这些问题缺陷的实施方法。其中包括主要特征的：采用直接检测方法，不需要生成DNA碱基探针，不需要使用引物，不需要进行原位合成，不需要使用荧光标记显示；这种直接检测DNA序列的技术是采用分子生物学基本原理和纳米材料技术相结合，加上高分辨率扫描电镜显示技术，大幅度提高了 DNA序列检测精度的准确性，其检测周期和效率也比其他检测方法有大幅提升，检测成本等却大幅度的下降；本发明的技术为这种DNA序列检测的直接方法提供了广阔市场的前景，以及更多相关领域的使用的可能。

本发明是一种基于分子生物技术、纳米材料技术和高分辨率电子扫描显示技术等合成的方法实施，有效地对DNA、RNA和其他生物分子进行碱基测序和量化分析。其中包括：具体实施是通过一次添加一种与银纳米粒子吸附耦合的单体dNTP即脱氧核苷酸三磷酸(腺嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶，鸟嘌呤之一)，并使这种已经与纳米粒子耦合的单体dNTP与芯片上已经固化的被测样板片段DNA片段进行碱基杂交配对反应。

为实施与芯片上已固化的DNA分子片段杂交反应能够顺利进行，其5'端位点上碱基反应性被保护基团如二甲氧基三苯甲基(DMT)覆盖，这些保护基团具有暴露于紫外光下时有可被除去的性质。因此：

当芯片置于且UV光入射到其上时，光作用将去除保护基团并暴露反应性5'端位点。然后加入特定单体dATP如腺嘌呤的溶液充满芯片。当腺嘌呤分子结合，其余的溶液就会被洗掉。

第一次杂交配对反应完成，并对这种耦合银粒子与基板上DNA片段反应的结果进行扫描，包括：

记录银纳米粒子在与DNA片段杂交后出现的先后顺序，以及所处的相对位置，就可以确定与之相对应DNA链上的碱基位置和种类，其依据是取决于第一次参加杂交反应的dNTP的种类，如果第一次加入的是dATP(碱基A，腺嘌呤)，则与之对应在DNA链上的碱基就是T，按照同样方法重复余下三次杂交反应。

一次DNA片段的序列检测完整过程是一个循环检测的四个步骤构成，包括：

4次四种与银粒子耦合的碱基dATP，dTTP，dGTP和dCTP参加反应是每次一种dNTP碱基杂交反应结束后，扫描并记录银粒子所在位置，并读出相对应DNA链上的碱基。

在一个循环内的序列检测过程中，其固化在基板上被测DNA片段样板片段，包括：以DNA片段的3’端固定在基板上。

固定在基板上DNA片段的检测方向四次杂交反应时必须保持一致。

与dNTP碱基吸附耦合的纳米粒子材料是Ag，即金属银纳米粒子，在本发明技术的实施例中这种纳米材料也可以是包括银在内的其他材料，其粒径为1nm。

本发明实施例所采用的是高分辨率扫描电镜成像技术和方法。

上述实施例与目前现有的三代DNA序列检测技术相比较，本发明所具有的技术特点，包括：

生物分子技术与纳米材料技术相结合，检测的流程简化，检测结果序列读取直观明了，准确率高，并行检测或重复检测的均能保持一致性、高准确性。能够产生超长读长，而且可以对全长转录本进行测序，属于典型的高通量测序技术，能够一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，每个样板片段DNA或RNA测序费用低廉。

附图说明

图1为本发明原理框图。

图2为本发明实施例1中，所述被测DNA样板片段片段序列说明四次单体核苷酸碱基杂交配对。

图3为本发明实施例1中，所述被测DNA样板片段片段与四次单体核苷酸碱基杂交配对后，以3’端为起始点的序列，其四种碱基所处不同的位置。

图4为本发明实施例1中，所述被测DNA样板片段在基板上的位置以及检测结果，以及在四次碱基配对反应时每一次的顺序和位置。

图5为本发明被测DNA样板片段固定在基板的结构示意图。

图6为本发明的一个实施例中，纳米粒子在扫描显示结果，体现出不同碱基出现的先后顺序和相关的位置。

图7为本发明的一个实施例中，与扫描后纳米粒子位序图相对应的样板DNA片段的序列。

附图标记说明：

图3中的①表示固定在基板上的样板DNA片段。

图3中的②表示第一次加入吸附有纳米粒子的单体碱基A。

图3中的③表示第二次加入吸附有纳米粒子的单体碱基T。

图3中的④表示第三次加入吸附有纳米粒子的单体碱基C。

图3中的⑤表示第四次加入吸附有纳米粒子的单体碱基G。

图5所示，10表示被测DNA单链。

图5所示，11表示在被测DNA单链上碱基。

图5所示，101表示基板，被测DNA固定在其上。

具体实施方式

本发明具体实施例中如下各项所陈述的相关步骤和具体内容，应理解为是对本发明各种技术项所做的进一步详细说明和陈述，在具体实施方式中的各项描述只是对本发明的解释，并不是对本发明所做出的任何形式的限定。

本发明主要涉及到三种不同学科的结合，即分子生物学，纳米材料技术，和高分辨率扫描电镜技术。

本发明具体实施例方式中，用一种包括四种单体脱氧核苷酸三磷酸碱基单体dATP, dTTP,dGTP,dCTP与银纳米粒子进行吸附反应使其两种粒子的耦合结合在一起：

其中，在具体实施方式中纳米粒子颗径为不大于或约等于1nm。

其纳米粒子分别对应的四种核苷酸碱基单体，包括：

核苷酸碱基腺嘌呤A(Adenine)+Ag⁺(金属银纳米粒子)。

核苷酸碱基胸腺嘧啶T(Thymine)+Ag⁺(金属银纳米粒子)。

核苷酸碱基鸟嘌呤G(Guanine)+Ag⁺(金属银纳米粒子)。

核苷酸碱基胞嘧啶C(Cytosine)+Ag⁺(金属银纳米粒子)。

这种核苷酸单体与纳米粒子结合是为参与被测DNA片段测序并基于碱基互补配对原理，可以从碱基互补的测序结果得到DNA序列。

参考图1，实施例1方式中包括基于碱基互补配对原理的几个相关步骤：

四种核苷酸碱基分别与银纳米粒子相互吸附地耦合结合在一起，其中：

纳米粒子在一个实施例中是使用金属银Ag，在具体地纳米材料上可以有多样性的考虑使用其他的选择，包括：

(1)这种多样纳米材料选择主要从其光学特性；

(2)电子特性等其他主要技术特性。

满足其在高分辨率扫描电镜时清晰成像的可以达到DNA测序的基本要求；

在实施例1方式中，环氧硅基的玻璃基板实施相应的钝化处理，保证被测单链DNA片段在基板上进行固化时抗非特异性的效果优异，其中：

选择被测DNA片段的3’端羟基固化在基板上。

且已经是分解为单链待测DNA样板片段固化在基板上。

在实施例1方式中，待测DNA样板片段是在DNA聚合酶催化作用下分解为单链，包括：

本发明除可对未知序列DNA采用单链测序外，也可以对已知DNA序列可采用双链测序。

在本发明具体实施例中，对DNA测序需要的反应液基本的，包括：

反应缓冲液。

DNA聚合酶。

Mgcl2。

纯水。

在实施例1中，固化在基板上被测DNA单链片段与四种核苷酸碱基吸附有银纳米粒子进行碱基杂交反应，具体地包括：

第一步，加入核苷酸单体碱基A，杂交反应后得到的结果，如表1所示。

其扫描电镜的结果由计算机软件按照预先设定的程序进行分析测定其银粒子所在位置，因此，可以判断出该位置所对应的被测DNA片段上的碱基T，以及该碱基T所在的位置和排序。

第二步，加入核苷酸单体碱基A，杂交反应后得到的结果，如表2所示。

其扫描电镜的结果由计算机软件按照预先设定的程序进行分析测定其银粒子所在位置，因此，可以判断出该位置所对应的被测DNA片段上的碱基A，以及该碱基A所在的位置和排序。

第三步，加入核苷酸单体碱基C，杂交反应后得到的结果，如表3所示。

其扫描电镜的结果由计算机软件按照预先设定的程序进行分析测定其银粒子所在位置，因此，可以判断出该位置所对应的被测DNA片段上的碱基G，以及该碱基G所在的位置和排序。

第四步，加入核苷酸单体碱基G，杂交反应后得到的结果，如表4所示。

其扫描电镜的结果由计算机软件按照预先设定的程序进行分析测定其银粒子所在位置，因此，可以判断出该位置所对应的被测DNA片段上的碱基C，以及该碱基C所在的位置和排序。

在实施例1中，四个步骤的单体核苷酸碱基A，T，G，C按先后顺序加入被测DNA 样板片段中进行碱基互补，在每一个步骤之后都进行一次扫描并记录结果。四次碱基互补的最终检测结果。

具体的还包括：

其中的碱基配对出现的顺序和位置，包括：

序列标记从3’-端开始至5’-端结束。

检测结果与被测样板DNA片段的结果。

C-1,G-2,C-3,A-4,G-5,T-6,A-7,G-8,T-9,A-10,G-11,T-12,A-13,T-14,C-15,G-16,A-17, A-18,T-19,C-20,T-21,G-22,A-23,G-24,G-25,C-26。

该DNA样板片段序列。

3’-CGCAGTAGTAGTATCGAATCTGAGGC-5’。

在本发明的一个实施例中，对一个序列长度为48的DNA碱基序列测定。

扫描检测结果纳米粒子分布以及出现的顺序，如图6所示。

如图7所示，则对应的被测DNA样板片段的序列。

3’-AGGCGATCATTGCCTTTCGAACGTTACGACTCTGACCGTGCTGGACAG- 5’。

在本发明的一个实施例中，每次检测的四个步骤，都是由计算机软件预先设定程序对每一步检测其纳米粒子出现在扫描结果中的位置和顺序自动记录，检测完毕，其DNA序列结果也自动生成。

上述实施例方式的详细描述和说明为本发明的公开具体实施方式。

上述文字详细说明并包括附图所示是针对发明实施例具体技术方案和方法描述，应当理解为具体实施方式并非局限并限制发明专利的保护范围。特别地：实施方式中与纳米材料粒子耦合所使用的金属银Ag不仅限于纳米银，事实上，本发明实施例可以包括且覆盖的材料根据权利要求8所述。

在没有脱离本发明宗旨和权利要求的保护范围所作的等效实施方式或变更其他很多形式，这些都属于本发明专利的保护范围之内。

序列表

<110> 胡志刚

<120> 大规模DNA芯片技术

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

cgcagtagta gtatcgaatc tgaggc 26

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

aggcgatcat tgcctttcga acgttacgac tctgaccgtg ctggacag 48

Claims (9)

1.一种大规模DNA芯片技术，其特征在于，包括：

四种脱氧核苷酸三磷酸碱基单体分别是，dATP, dTTP, dGTP, dCTP ：

其中，这四种dNTP碱基单体分别对应与银纳米粒子进行吸附，使即两种粒子互相耦合，其中纳米粒子颗径为1nm, 耦合后对应的四种核苷酸碱基单体，A+Ag⁺, T+ Ag⁺, G+Ag⁺, C+Ag⁺ ；

以及待测DNA样板片段在DNA聚合酶催化下分解为单链，或者：

本发明可对未知序列DNA采用单链测序，对已知DNA序列可采用双链测序，包括：

将已经分解待测样板单链DNA片段固化在基板上；

本发明测序反应液的组成：反应缓冲液、DNA聚合酶、Mgcl2、和纯水；

纳米粒子，颗粒直径为1nm，分别加入四个反应管中与脱氧核苷酸三磷酸单体与其进行吸附使其互相耦合结合在一起；

四种与银纳米粒子偶合的单体碱基依次先后顺序分别加入基板上与待测样板片段DNA单链进行杂交反应包括：

每次dNTP杂交反应后，其结果由计算机依据纳米粒子：（1）出现的先后顺序，（2）所在位置，进行记录并与获得被测样板DNA片段的碱基杂交的位置，基于图像传感器测定其银纳米粒子的相对位置。

2.四种dNTP即脱氧核苷酸三磷酸单体分别与银纳米粒子进行吸附耦合处理，其特征在于：

分别是在四个不同容器内进行，并标示其将与样板片段DNA进行杂交反应的顺序。

3.待测样板DNA片段的3’端固定在有环氧硅基玻璃基底的基板上，其特征在于：固化在基板上片段的长度完全满足高通量测序技术要求，能够一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长：

其中，包括每次进行DNA或RNA测序时，读长的长度仅仅取决于取样并固化在基板上的DNA或RNA片段的大小，使得这种技术可以测序非常长的全长转录本成为可以实现的手段：

其中，除可以完成对DNA、RNA多肽等生物分子检测外，也包括蛋白质等多种生物物质的检测。

4.固定被测DNA样板片段的基板进行序列测定时，采用高分辨率扫描电镜技术且至少保证扫描DNA分子片段碱基杂交后附带银纳米粒子的成像其像素分辨率需达到1.0 Å -5.0 Å（在电子束能量 keV满足其分辨率条件或类似条件下）。

5.四次测序中的每一次，是将被测样板DNA片段的3’端固定在基板，进行四个步骤的碱基杂交配对反应时保证是从3’端开始，单体核苷酸碱基 用二对甲氧三苯甲基DMT保护，

碱基上的氨基用苯甲酸保护，进行杂交时，吸附有银纳米粒子的单个碱基与从3’端开始的碱基配对形成亚磷酸三脂：

其中，在首先加入单体碱基dATP，则杂交配对后与3’端开始的单链上的所有碱基T杂交，即 A=T，扫描成像由计算机处理记录其每次dNTP附带的银纳米粒子出现的顺序和位置后，依次分别进行余下的另外三次杂交配对，即dTTP 为 T=A， dCTP为C=G，dGTP为G=C。

6.本发明采用被测单链DNA样板片段在基板上的固化主要方式采用以3’端在基板上共价键链接方式，以保证其进行四次杂交反应并且四次扫描读取过程的链接稳定性和有足够的连接强度、使得在整个测序过程中基板上固化的单链DNA不致脱落。

7.DNA分子序列测定的结果分析，在其结果记录表现为dNTP吸附的银纳米粒子的位置，因此，确定DNA分子序列时与成像记录的结果与之相对：

其中，成像结果是碱基A，则DNA片段链上对应的碱基则为T；成像结果是C，则DNA链上对应的碱基则为G，DNA碱基序列最终排序的结果，其余步骤按同样方法实施。

8.根据权利要求2所述的四种dNTP即脱氧核苷酸三磷酸单体分别与金属银纳米粒子进行吸附耦合处理，其特征在于金属纳米粒子可以选用材料金属银元素，也可以是其他元素的材料纳米粒子：

其中，该纳米材料的光学特性和电子特性需满足测序要求，并包括：

至少保证其粒子与dNTP即脱氧核苷酸三磷酸单体的吸附性和扫描成像结果具有可读性和可分析。

9.根据权利要求5所述，其特征在于：对固定于基板DNA 3’端开始用吸附有银纳米粒子的单个碱基进行杂交反应，本发明操作方法，以及其测序过程的控制：

其中，包括有四种dNTP与纳米粒子的吸附反应即两种粒子的耦合，且与DNA分子碱基进行杂交配对反应，以及成像结果与图像输出。